KR970001564B1 - 우로키나제-형 플라스미노겐 활성체 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

우로키나제-형 플라스미노겐 활성체

제1도는 인간 u-PA cDNA의 제한 엔도뉴클레아제 지도이다.

제2도는 인간 u-PA cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 유추된 아미노산 서 열을 도해한 것이다(완전한 단백질의 1번 아미노산에 밑줄이 그어져 있다).

제3도는 플라스미드 pCS 16의 작제도이다.

제4도는 u-PA cDNA를 포함한 플라스미드 pCS 16/UPA의 작제 도이다.

제5도는 플라스미드 pJDB 207/PHO5-1-UPA의 작제도(약어 ss는 시그널 서열; t는 전사 터미네이터; p는 프로모터; L은 링커이다)이다.

제6도는 GAPDH의 프로모터 영역의 DNA 서열을 나타낸 것이다.

제7도는 플라스미드 p31 GAPDL-IT의 작제도이다.

제8도는 본 발명에서 사용된 GAPDH 유전자의 프로모터 요소를 나타낸 것 이다.

제9도는 플라스미드 pJDB 207/GAPDL-I-UPA의 작제도이다.

제10도는 플라스미드 pJDB 207/GAPDL-I-UPA의 작제도이다.

제11 및 12도는 플라스미드 pDP 33을 통한 플라스미드 pDP 38의 작제도 이다.

제13도는 돌연변이된 u-PA 유전자의 DNA 서열 및 본 발명에 따른 돌연변이 scu-PA 단백질의 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1 : 연속주조기 2,5 : 재단기

3 : 박슬랩 4 : 균열로

6 : 유도가열기 7 : 신더세정기

8 : 조압연(변형)기 9 : 재결정화구열

10 : 권취장치 11 : 해권장치

12 : 열보존로 13 : 냉각장치

14 : 다듬질열 15 : 냉각구역

16 : 권취기 17 : 수송체

18 : 대차 19 : 축열로

본 발명은 단백질, 더욱 특히 우로키나제(urokinase)-형의 세린 프로테아제의 신규한 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 유전공학적으로 조작된 효모균주를 사용한다. 본 발명은 또한 신규한 우로키나제-형 단백질, 이들 단백질의 암호화 DNA, 이들 DNA를 함유하는 하이브리드 벡터, 상기의 유전자 조작된 효모균주, 및 언급된 DNA, 하이브리드 벡터 및 효모 균주의 제조방법에 관한 것이다.

우로키나제 또는 우루키나제-형 플라스미노겐 활성체(이하에서 u-PA로 언급함)는 단백질 분해를 통해 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시키는 세린 프로테아제이다. 플라스민은 혈괴의 섬유소 망을 분해시켜 용성 분해 생성물이 형성되도록 하는 강력한 프로테아제이다.

u-PA는 인간의 뇨에서 최초로 분리되었으며, 또한 배양된 산장세포 및 몇종의 종양세포주에서 분비되는 것으로 알려져 있다. u-PA는 처음에 단일쇄 분자(이하에서 scu-PA로 언급함)로서 생성되며 이어서 플라스민의 작용에 의해 단백질 분해가 이루어지면서 두개의 쇄가 다른 디설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 이중쇄형(이하에서 tcu-PA로 언급함)으로 전환될 수 있다. u-PA는 Asn 302에 독특한 당화부위를 갖는다.

scu-PA는 저분자량의 합성기질에 대해 단지 불량한 아미드 분해 활성을 나타내기 때문에, 최근까지 활성효소 tcu-PA의 진정한 단백질 분해적 불활성 전구체로서 간주되어 왔다. 그러나 가장 최근에 이르러 scu-PA는 플라스미노겐을 플라스민으로 효능적으로 활성화시키며 tcu-PA 보다 피브린에 대해 훨씬 더 고도의 선택성을 나타내는 것으로 입증되었다참조 : H. R. Lihnen et al., J. Biol. Chem. 261, 1253(1986)]. 상당한 피브린 분해 활성의 기작 및 scu-PA의 혈괴 특이성이 연구되어 왔다[참조 : 상기의 Lihnen et al., J. Biol. Chem. 261, 1253(1986)]. scu-PA는 불활성 효소원은 아니지만 tcu-PA로 전환되지 않고도 플라스미노겐을 활성화시키는 것으로 입증되었다. tcu-PA와는 달리, scu-PA는 아직 밝혀지지 않은 혈장성분에 의해 경쟁적으로 억제되며 이의 억제는 피브린 또는 피브린 단편에 의해, 즉 혈괴에서 역전된다. scu-PA의 피브린 분해활성은 그의 적합한 표적에만 국한된다. 대조적으로, tcu-PA는 순환계내의 어떠한 위치에서도 플라스미노겐을 활성화시킬 수 있음에 따라 출혈과 같은 바람직하지 못한 부작용을 유발한다. scu-PA는 상기 특성으로 인해 바람직한 프로테아제-형 플라스민 활성체이다.

오늘날 재조합 DNA 기술이 도래함에 따라, scu-PA와 같은 단백질을 산업적 규모로 생산하는 것은 가능하다. 게놈성 u-PA DNA의 알려진 구조[참조 : A. Riccio et al., Nucleic Acids Research 13, 2759(1985)] 및 u-PA cDNA[참조 : W. E. Holmes at al., Biotechnology 3, 923(1985)]를 기본으로 하여 재조합 DNA기술을 이용한 scu-PA의 제조방법은 문헌에 기술되어 있다. 따라서, 더블유. 이. 홀륨스 등(상기 참조), 피. 쟈콥스 등[참조; DNA 4, 139(1985)], 엠. 이. 윈클러 등[참조; Biochemistry 25, 4041(1986)] 및 엠.나가이 등[참조; Gene 36, 183(1985)]에 의해 이. 콜라이 내에서의 발현은 이미 달성되었다; 기타 참조문헌[벨기에 특허 제900 826호], [일본국 특허 제61 181 377호] 및 유럽 특허원 제92 182호]. 유럽 특허원 제92182호 및 제154 272호에는 동물세포내에서의 scu-PA의 발현이 기술되어 있다. 그러나, 상기한 공지 방법은 모두 심각한 결함을 지니고 있다 : 동물세포에 의해 생산된 단백질을 값싸고 경제적으로 유리하게 제품화하기 위하여 필수적 요건인 대규모 생산을 할만큼 동물세포를 증식시키는 것은 어려운 것으로 판명되었다. 동물세포의 세대시간은 미생물에 비해 상당히 더 길기 때문에, 충분한 고세포 밀도를 얻기 위해서는 장기간의 발효시간이 요구된다. 또한, 동물세포를 배양하여 수득할 수 있는 세포밀도는 미생물의 대규모 배양에 의해 일반적으로 수득되는 세포밀도에 비해 상당히 더 낮다. 또한 균주개발면에서 미생물에 비하여 어렵다. 한편, 이. 콜라이를 사용하여 얻은 단백질 제제에는 흔히 내독소 오염물이 발견된다. 이들 내독소는 경비의 지출 및 시간의 소요를 요구하는 정제단계에 의해 제거되어야 한다. 이. 콜라이는 단백질 분자내의 적절한 부위에 탄수화물 쇄를 연결시켜 줄 수 있는 효소 시스템이 결여되어 있기 때문에 이.콜라이에 의해 생성된 단백질은 반드시 비당화 상태이다. 따라서 천연 scu-PA와는 달리 이.콜라이에 의해 생성된 재조합 scu-PA는 비당화 상태이다.

이.콜라이에 의해 생성된 scu-PA는 디설파이드 가교의 불완전한 배열 및 단백질이 불완전한 폴딩(folding)으로 인해 무정형 불용성 중합체로서 존재하는 것으로 보고되었다. 따라서 생물학적 활성 단백질을 수득하기 위해서는 다량의 용매를 이용하는 것과 같은 적어도 1회의 추가적인 리폴딩(refolding) 단계가 필요하다[참조 ; 상기의 M. E. Winkler et al.].

공지 방법의 결함을 고려할 때, 생물학적으로 활성인 scu-PA를 대규모로 생산 가능케 해주는 개선된 방법이 끊임없이 요구되고 있다. 본 발명의 목적은 이러한 방법을 제공하는데 있다.

효모 유전자의 시그널 서열에 연결된 인간 u-PA 암호화 서열을 포함한 하이브리드 벡터에 의해 형질전환된 효모세포는 천연 scu-PA와 동등한 생물학적 활성을 가지며 효모-특이적으로 당화된 scu-PA를 생성함이 놀랍게도 밝혀졌다. 효모 scu-PA는 시험관내에서 어떠한 리폴딩 과정을 필요로 하지 않으면서 완전히 활성적이라는 점이 주목할만한 사실이다. 따라서, 본 발명은 효모발현 조절 서열, 시그널 펩타이드를 암호화한 제 1DNA서열이 상부에 판독 프레임으로 완전한 우로키나제-형 플라스민 활성체 또는 이의 돌연변이체를 암호화한 제2DNA 서열과 함께 존재하여 이루어진, 상기 발현 조절 서열에 의해 전사 조절되는 DNA 절편, 및 효모 유전자의 전사 종결 시그널을 포함한 DNA 서열을 포함한 하이브리드 벡터에 의해 형질전환된 효모균주를 적합한 영양 조건하에서 배양하고, 언급된 우로키나제-형 플라스민 활성체 또는 이의 돌연변이체를 분리시킴을 특징으로 하여, 인간 단일쇄 우로키나제-형 플라스미노겐 활성체 또는 이의 돌연변이체를 생산하는 방법을 제공한다.

용어 완전한 우로키나제-형 플라스민 활성체의 암호화 DNA 서열은 인간 게놈에 존재하는 것으로 알려져 있거나 인간 게놈으로부터 분리될 수 있는 모든 대립형질형을 포함한다. 이들 DNA 서열에는 어떠한 프리-및/또는 프로-서열도 없다.

scu-PA의 돌연변이체는 특히 단백질 프로테아제-내성인 돌연변이체이다. 이러한 scu -PA 돌연변이체는 트롬빈 또는 플라스민과 같은 혈중 프로테아제에 의해 단백질 분해 부위에서 공유적으로 변형됨으로써, 이들 돌연변이체는 더 이상 변형부위에서 프로테아제 가수분해에 민감하지 않다. 표적 부위는 Lys 135-Lys 136(이 부위에서의 절단으로 인해 소위 저분자량 형태의 scu-PA 또는 LUK가 형성된다; 첨부된 도면중 제2도 참조), Arg 156-Phe 157(트롬빈 공격에 민감함) 및 Lys 158-Ile 159(이 부위는 플라스민에 의해 절단되어 tcu-PA가 형성된다)이다. 적합한 scu-PA 돌연변이체는 상기 표적 부위중 하나 또는 그 이상의 위치에서 아미노산 잔기가 부위특이적 치환, 삽입 또는 결실을 나타낸다. 표적부위를 형성하는 한 개의 아미노산 잔기 또는 두 개의 아미노산 잔기가 결실되었거나, 이들 아미노산 잔기중 적어도 한 개가 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되어 생성된 돌연변이체가 단백질 분해 공격에 저항성이 있는 돌연변이체가 특히 바람직하다.

scu-PA의 또다른 돌연변이체로서, Asn³⁰²에서 발생하는 독특한 N-당화 부위(Asn³⁰²-Ser-Thr)가 변형되어 이 부위에서는 당화가 일어날 수 없다. 포유동물 세포에서 N-연결된 당화를 위한 필수요건은 트리펩타이드 서열-Asn-L-Thr(or Ser)-(여기서, Asn은 수용체이고 L은 당화를 방해하는 프롤린 또는 아스파트산을 제외한 유전적으로 암호화된 20개의 아미노산중 어떠한 것일 수 있다)이 존재해야 한다는 것은 널리 알려져 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 scu-PA 단백질은 scu-PA뿐만 아니라 이의 돌연변이체도 포함한다.

본 발명은 특히 하기의 아미노산 서열(I)을 갖는 scu-PA 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

아미노산 서열(I)

여기에서, X₁및 X₂는 각각 독립적으로 Lys, 염기성 아미노산 잔기가 아닌 아미노산 잔기, 또는 화학결합이고, Y₁은 Arg, 염기성 아미노산 잔기가 아닌 아미노산 잔기, 또는 화학결합이며, Y₂는 Phe, 산성 아미노산 잔기, 또는 화학결합이고, Y₃은 Lys, 염기성 아미노산 잔기가 아닌 아미노산 잔기, 또는 화학결합이며, Z₁은 효모-특이적으로 당화된 Asn, 또는 다른 아미노산 잔기이고, Z₂는 Thr, 또는 Ser이외의 아미노산 잔기이다.

용어 아미노산 잔기는 유전적으로 암호화된 모든 아미노산 잔기, 예를들면 산성 아미노산 잔기(예, 글루탐산 및 아스파트산의 잔기), 염기성 아미노산 잔기(예, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘의 잔기), 중성 아미노산 잔기(예, 아르파라긴, 굴루타민, 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 세린, 트레오닌, 티로신 또는 프롤린의 잔기)를 포함한다.

N-당화 부위에서의 당화를 억제하기 위해, N-당화를 위한 시그널로서 인지된 트리펩타이드 서열은 변형되어야 한다. 상기 트리펩타이드 서열에서 Asn(Z₁) 및 또는 Thr(Z₂) 잔기가 어떠한 다른 아미노산으로 치환되면 이 부위에 글리코사이드 결합은 형성되지 않는다. 편의상, N-당화 부위의 변형은 단백질 수준에서 이루어지지 않는다. 대신에, 숙주내에서 변형된 유전자가 발현됐을 때 당화가 일어날 수 없도록 N-당화부위가 변형된 돌연변이 scu-PA가 생성되도록 scu-PA의 암호화 유전자를 변형시킴이 유리하다. 특히, 아스파라긴은 발린, 루이신, 이소루이신, 알라닌 또는 특히 글루타민으로 치환되고 트레오닌은 발린, 메티오닌 또는 특히 알라닌으로 치환된다.

바람직한 태양은, 본 발명은 X₁이 Lys, Gly 또는 Ser이고, X₂는 Lys이며, Y₁은 Arg이고, Y₂는 Phe, Asp 또는 Glu이며, Z₁은 Asn 또는 Z₂는 Thr인 아미노산 서열(I)의 화합물을 생산하는 방법을 제공한다.

특히, 본 발명은 Asn³⁰²가 효모-특이적으로 당화된 scu-PA, [Gly¹³⁵]-scu-PA, [Ser 135]-scu-PA, [Asp 157]-scu-PA, [Ser 135, Asp 157]-scu-PA 및 [Gly 135, Asp 157]-scu-PA, 또한 [Gln 302]-scu-PA,[Gly 135, Asp 157, Gln 302]-scu-PA 및 [Ser 135, Asp 157, Gln 302]-scu-PA의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 형질전환 효모균주는 동화가능한 탄소원, 질소원 및 무기염을 함유한 액체배지중에서 배양한다.

여러 가지 탄소원이 사용된다. 바람직한 탄소원의 예로서는 글루코즈, 말토즈, 만니톨 또는 락토즈와 같은 동화가능한 탄수화물, 또는 나트륨 아세테이트와 같은 아세테트를 들 수 있으며, 이들은 단독으로 또는 적합한 혼합물로 사용될 수 있다. 적합한 질소원의 예로서는 카사미노산과 같은 아미노산, 펩타이드 및 단백질 및 이들의 분해산물(예, 트립톱, 펩톤, 또는 쇠고기 추출액, 또한 효모 추출액, 맥아 추출액, 옥수수침지액), 뿐만 아니라 염화암모늄, 황산암모늄 또는 질산암모늄과 같은 암모늄염을 들 수 있으며 이들은 단독으로 또는 적합한 혼합물로 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 무기염을 예로 들면 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 설페이트, 클로라이드, 포스페이트 및 카보네이트가 있다. 추가로, 영양 배지에는 또한 성장 촉진제가 함유될 수 있다. 성장 촉진제의 예로는 철, 아연, 망간 등과 같은 미량원소, 또는 개개의 아미노산을 들 수 있다.

구성 프로모터(예, ADHI, GAPDH)를 포함한 하이브리드 플라스미드를 함유한 효모세포는 유도없이 언급된 프로모터에 연결된 u-PA 유전자를 발현한다. 그러나, u-PA 유전자가 조절 프로모터(예, PGK 또는 PHO5)에 의해 조절될 경우, mRNA 전사물의 최대량을 얻기 위해서는 성장배지의 조성을 적절히 조정해야 하는데, 다시 말해서 PHO5 프로모터를 사용할 경우, 성장배지에는 본 프로모터의 탈억제를 위해 저농도의 무기인산염이 함유되어야 한다.

배양은 통상의 기술을 이용하여 수행한다. 온도, 배지의 pH 및 발효시간과 같은 배양조건은 scu-PA 단백질이 최대량으로 생성될 수 있는 조건을 선택한다. 선정된 효모균주는 통기조건하에 약 25。 내지 35℃, 바람직하게는 약 28℃의 온도 및 4 내지 7의 pH(예, 약 pH 5)에서 약 20 내지 50 시간동안, 바람직하게는 scu-PA단백질의 최대수율이 도달될때까지 액침 배양으로 성장시킴이 바람직하다.

생성된 scu-PA 단백질은 효모세포내에 축적되거나 세포막의 주변 공간(Periplasmic Space)내로 분비될 수 있다. scu-PA 단백질이 세포내에 축적된 경우에, scu-PA 단백질을 분리하기 위한 제1단계는 세포내부로부터 단백질을 방출시키는 것이다. 대부분의 방법에서, 가장 먼저 글루코시다제를 이용한 효소분해로 세포벽을 제거한다(하기 참조). 이어서, 생성된 스페로프라스트(spheroplast)를 세제(예, 트리톤

X-100로 처리한다. 다른 방도로, 전단력과 같은 기계력(예, 엑스-프레스, 프렌치-프레스), 또는 유리 비드와의 진탕 방법이 세포를 파괴하는데 적합하다. 생성된 혼합물을 폴리에틸렌이민의 처리에 의해 대부분의 비-단백질성 물질제거, 황산암모늄을 이용한 단백질의 침전, 겔 전기 영동, 투석, 크로마토그래피(예, 이온교환 크로마토그래픽, 크기-배제 크로마토그래피, HPLC 또는 역상 HPLC), 적합한 세파덱스

컬럼상의 분자 크기별 분리 등과 같은 통상의 방법으로 scu-PA 단백질에 대해 중량한다. 정제전 생성물의 최종정제는 예를들면 항체 친화성 크로마토그래피, 특히 당해 공지 방법에 따라 불용성 매트릭스상에 고정된 모노클로날 항-u-PA 항체를 사용한 모노클로날 항체 친화성 크로마토그래피와 같은 친화성 크로마토그래피의 방법으로 수행한다. 유리하게는, 용기 표면에 scu-PA 단백질이 흡착을 방지하고 안정성을 향상시키기 위하여 세제, 특히 비이온성 세제(예, 트립톤 X-100

또는 트윈 80

)를 정제 단계에서 사용된 모든 완충 용액에 가한다. 세제는 0.01 내지 1%의 최종농도로 가할 수 있다.

scu-PA 단백질이 효모세포에 의해 세포막외 주변 공간내로 분비된 경우에, 간단한 초안을 사용할 수 있다 : 세포를 용해시키지 않고 세포벽을 효소로 제거하거나 티올 시약 또는 EDTA와 같은 화학물질을 처리하여 세포벽에 손상을 입혀 생성된 scu-PA 단백질이 방출되도록 함으로써 본 단백질을 분리한다. scu-PA 단백질이 배양물 육즙내로 분비된 경우엔, 이 배양물로부터 본 단백질을 직접 수거할 수 있다.

사용된 숙주 균주 및 적용된 정제방법에 따라, 본 발명에 따른 scu-PA 단백질은 숙주세포로부터 방출된 단백질 분해 활성에 의해 야기된 소량의 상응하는 2중쇄 형태에 의해 오염될 수 있다. 목적하는 단일쇄 형태(scu-PA)로부터 2중쇄 형태의 분리는 당계 공지방법, 예를들면 벤즈아미딘-세파로즈

상에서의 크로마토그래피[참조 : M. E. Winkler et al. Biochemistry 25, 4041(1986)]로 수행한다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 scu-PA 단백질은 필요로 되는 어떠한 리폴딩 과정을 거치지 않고도 천연 인간 scu-PA의 생물학적 활성을 나타내며, Asn 302에서 효모-특이적으로 당화되어 있다는 점에서 이. 콜라이로부터 수득된 scu-PA와는 다른 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 따른 scu-PA 단백질은 효모 특이적 당화로 인해 배양되었거나 형질전환된 동물세포로부터 분리된 scu-PA와는 구별됨으로써 신균한 물질이다.

따라서, 본 발명은 또한 효모-특이적으로 당화되고, 특히 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에 있어 특이적으로 당화된 scu-PA 및 이의 돌연변이체를 제공한다.

당화 부위에서 당화가 일어날 수 없도록 이의 부위가 변형된 scu-PA 및 이의 돌연변이체도 마찬가지로 신규하며 본 발명의 또다른 목적이다.

따라서, 본 발명은 또한 Z₁이 Asn을 제외한 유전적으로 암호화된 아미노산의 잔기이고, Z₂는 Thr이며, X₁, X₂, Y₁, Y₂및 Y₃은 아미노산 서열(I)에서 정의한 바와같은 서열(I)의 화합물, 및 Z₁은 Asn이고, Z₂는 Thr 및 Ser을 제외한 유전적으로 암호화된 아미노산의 잔기이며, X₁, X₂, Y₁, Y₂및 Y₃은 아미노산 서열(I)에서 정의한 바와 같은 서열(I)의 화합물을 포함한다.

특히, 본 발명은 X₁이 Lys Gly 또는 Ser이고, X₂가 Lys이며, Y₁은 Arg이고, Y₂가 Phe, Asp 또는 Glu이며, Y₃가 Lys이고, Z₁이 Gln이며, Z₂가 Thr인 서열(I)의 화합물을 제공한다.

본 발명 바람직한 화합물 Asn³⁰²가 효모특이적으로 당화된 scu-PA,[Gly 135]-scu-PA,[Ser135]-scu-PA,[Asp 157]-scu-PA,[Ser 135, Asp 157]-scu-PA 및 [Gly 135, Asp 157]-scu-PA, 및 또한 [Gln 302]-scu-PA[Gly 135, Asp 157, Gln 302]-scu-PA 및 [Ser 135, Asp 157, Gln 302]-scu-PA이다.

본 발명에 따른 형질전환 효모균주는 scu-PA 또는 이의 돌연변이체를 암호화한 구조유전자를 제조하는 단계, 수득된 구조 유전자를 적합한 벡터내에 삽입시키는 단계, 생성된 하이브리드 벡터로 적합한 숙주 유기체를 형질전환시키는 단계, 및 형질전환된 숙주를 비형질전환 숙주로부터 선별해내는 단계들을 포함하는 재조합 DNA 기술로 제조할 수 있다.

u-PA cDNA 및 게놈성 u-PA DNA의 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있다.[참조 : W. E. Holmes et al., Biotechnology 3, 923(1985); A. Riccio et al. Nucleic Acids Research 13, 2759(1985)]. u-PA의 cDNA 및 게놈성 DNA 서열이 공지되어 있기 때문에 u-PA 또는 이의 돌연변이체의 암호화 구조 유전자는 당해 공지 방법으로 제조할 수 있다. 이들 DNA의 제조방법은 인간 암 세포 또는 인간배 신장세포와 같은 scu-PA 생성 인간 세포로부터 mRNA를 분리하고, 예를들면 적합한 DNA 탐침과 하이브리드화시켜 목적 mRNA를 선별하며, 이 mRNA에 상보적인 일본소 DNA를 제조하고, 이것으로부터 이본쇄 상보 DNA(ds cDNA)를 제조하거나, 인간세포로부터 게놈성 DNA를 분리하고 적합한 DNA 탐침을 사용하여 목적 DNA를 선별하며, 필요한 경우 수득된 cDNA 또는 게놈성 DNA를 돌연변이시키거나, 구조 유전자를 화학합성 방법으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 구조 유전자가 mRNA 경로를 통하여 제조하고 돌연변이체가 바람직한 경우 일차로 수득된 u-PA cDNA를 돌연변이시켜 제조한다. 따라서, u-PA의 돌연변이체를 암호화한 구조는 유전자는 불필요한 아미노산 잔기(들)에 대한 코돈을 포함한 DNA의 일부를 완전한 모 u-PA 유전자로부터 절단하고 그 절단부위를 목적하는 아미노산 잔기(들)의 암호화 코든(들)으로 치환된 DNA 절편으로 대체시키거나 부위-지시된 돌연변이유발[참조; M. J. Zoller et al. Methods Enzymol. 100, 468(1983), D. Botstein et al. Sceince 229, 11936(1985)]으로 데옥시리보뉴클레오타이드 치환을 수행하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 하이브리드 벡터는 효모발현 조절 서열, 완전한 우로키나제-형 플라스미노겐 활성체 또는 이의 돌연변이체를 암호화한 제2DNA 서열의 상부에 이와의 판독 프레임으로 시그널 펩타이드를 암호화한 제1DNA 서열로 구성되며 언급된 발현조절 서열에 의해 전사가 조절되는 DNA 단편, 및 효모 유전자의 전사종결 시그널을 포함한 DNA 서열을 포함한다.

효모발현 조절서열은 효모, 특히 삭카로마이세스 세레비지애의 게놈성 DNA로부터 유도된다. scu-PA의 발현을 위해 바람직하게 사용되는 것은 고도로 발현된 효모 유전자의 발현 조절서열이다. 따라서, TRP 1유전자, ADHI 또는 ADHII 유전자 또는 산 포스파타제(PHO5) 유전자의 프로모터, 에놀라제, 글라이세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH), 3-포스포글라이세레이트 키나제(PGK), 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제 포스포프락토 키나제, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글라이세레이트 뮤타제, 피루베이트키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코즈 이소머라제 및 글루코키나제 유전자의 프로모터, α- 또는 ａ-인자를 암호화한 효모 접합 페로모 유전자의 프로모터가 사용될 수 있다. 하나의 효모 유전자의 상부 활성서열( UAS) 및 다른 종류의 효모 유전자의 작용성 TATA 박스를 포함한 하부 프로모터 요소로 구성된 하이브리드 프로모터, 예를들면 효모 PHO5 유전자의 UAS(들) 및 효모 GAPDH 유전자의 작용성 TATA 박스를 포함한 하부 프로모터 요소를 포함한 하이브리드 프로모터를 사용하는 것도 또한 가능하다. 본 발명의 바람직한 벡터는 전사를 조절하는 프로모터를 포함한다. 이러한 종류의 프로모터, 예를들면 PHO5 유전자의 프로모터 및 PHO5-GAPDH 하이브리드 프로모터는 변화되는 생장조건에 의해 작동개시(on) 또는 작동정지(off)될 수 있다. 예를들면, PHO5 프로모터는 단지 배지중에 무기인산염의 농도를 높여줌으로써 목적하는 바대로 억제시킬 수 있다. 본 발명에 따른 또다른 바람직한 프로모터는 GAPDH 유전자의 프로모터, 특히 GAPDH 유전자의 -550 내지 -180 사이의 뉴클레오타이드, 특히 뉴클레오타이드 -540,-263 또는 -198에서 출발하고 뉴클레오타이드 -5에서 종결되는 GAPDH 유전자 프로모터의 작용성 단편이다.

시그널 펩타이드의 암호환 DNA 서열(시그널 서열)은 바람직하게는 보통 분비되는 폴리펩타이드를 암호화한 진핵생물(예, 인간 또는 효모)유전자로부터 유도된다. 적합한 시그널 서열은 예를들면 게놈성 인간 DNA로부터 수득될 수 있는 u-PA 시그널 서열, 효모 시그널 서열(예, 효모 인버타제, α-인자, 페로몬 펩티다제(KEX1), 킬러 독소 및 억제성 산 포스파타제(PHO5) 유전자의 시그널 및 프리프로서열) 및 아스퍼질러스 아와모리(Asperigillus awamori)의 글루코아밀라제 시그널 서열을 들 수 있다. 다른 방도로, 사용된 프로모터에 천연적으로 연결된 유전자의 시그널 서열(존재하는 경우) 일부를 u-PA 시그널 서열 일부와 연결시켜 융합된 시그널 서열을 작제할 수 있다. 이들 융합물은 시그널 서열과 완전한 scu-PA 아미노산 서열간에 정확한 절단을 제공하는데 유리하다. 특정 프로쎄싱 시그널을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 프로- 또는 스페이서-서열과 같은 추가의 서열이 또한 전구체 분자의 정확한 프로쎄싱을 용이하게 촉진하기 위해 작제물 내에 포함될 수도 있다. 달리는, 생체내에서 또는 시험관내에서 적절한 성숙을 허용하는 내부 프로쎄싱 시그널이 포함된 융합된 단백질을 제조할 수 있다. 예를들면, 프로쎄싱 시그널은 골지막에 위치한 효모 엔도펩티다제에 의해 인지되는 Lys -Arg 잔기를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 시그널 서열은 아미노산 서열 Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Ala Phe Ala Ala Lys Ile Ser Ala을 갖는 시그널 펩타이드의 암호화 효모 인버타제 유전자, 및 아미노산 서열 Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser Asp Ser Lys Gly을 갖는 시그널 펩타이드의 암호화 인간 u-PA 유전자의 서열이다.

효모 전사종결 시그널을 포함한 DNA 서열은 전사 종결 및 폴리아데닐화에 적절한 시그널을 포함한 효모 유전자의 3' 플랭킹 서열이 바람직하다. 적합한 3' 플랭킹 서열을 예로들면 사용된 발현조절 서열에 천연적으로 연결된 효모 유전자의 서열을 들 수 있다. 바람직한 플랭킹 서열은 효모 PHO5 유전자의 서열이다.

본 발명에 따른 하이브리드 플라스미드는 프로모터, 시그널 서열, u-PA 또는 이의 돌연변이체의 암호환 DNA 서열 및 3' 플랭킹 서열 이외에도 예를들면 언급된 하이브리드 플라스미드에 의해 형질전환된 세포가 증식하는데 중요한 기능을 하는 DNA 서열(들)을 추가로 포함한다. 추가의 DNA 서열(들)은 원핵세포 및/또는 진핵세포로부터 유도될 수 있으며 염색체성 및/또는 염색체외성 DNA 서열(들)이 포함될 수 있다. 예를들면, 추가의 DNA 서열은 세균성 또는 진핵성 플라스미드 DNA와 같은 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA 및/또는 염색체성 DNA(예, 세균, 효모 또는 고등 진핵 염색체성 DNA)로부터 유래되거나 구성될 수 있다. 바람직한 하이브리드 플라스미드는 세균, 플라스미드, 특히 에스케리키아 콜라이 플라스미드 pBR 322 또는 pUC 19 관련 플라스미드, 박테리오파아지 λ, 효모 2μ 플라스미드, 및/또는 효모 염색체 DNA로부터 유도된 추가의 DNA서열을 포함한다.

본 발명에 따른 바람직한 하이브리드 플라스미드에서, 추가의 DNA 서열은 효모 복제원 및 효모에 대한 선택성 유전 표식자를 포함한다. 효모 복제원(예, 자가 복제 단편(ars))을 포함한 하이브리드 플라스미드는 형질전환후 효모세포내에 염색체외적으로 유지되며 유사분열시 자가복제한다. 효모 2μ플라스미드 DNA에 상동인서열을 포함한 하이브리드 서열도 또한 사용될 수 있다. 이들 하이브리드 플라스미드는 세포내에 이미 존재하고 있는 효모 2μ 플라스미드와 재결합하거나 복제원이 존재하는 경우 그 자체적으로 자가복제할 것이다. 고-빈도 형질전환 플라스미드를 위해 2μ 서열이 특히 적합하며 이 서열은 많은 복제수를 유도한다.

효모의 선택적 유전자 표식자에 있어서, 표식자의 표현형 발현으로 형질전환체를 선택하는데 용이하게 해줄 수 있는 표식 유전자이면 어떠한 것도 사용될 수 있다. 효모에 적합한 우성 표식자는 특히 항생물질 내성을 나타내는 표식자이건, 효모의 영양요구 변이주인 경우엔 숙주 병소(lesion)를 보충해주는 유전자이다. 상응하는 유전자는 예를들면 항생물질 G418 또는 하이그로마이신에 내성을 제공하거나, 예를들면 URA 3, LEU 2, HIS 3, TRP 1 유전자로서 효모의 영양요구 변이주를 보충하여 원영양균주로 만든다.

유리하게는, 본 발명에 따른 하이브리드 플라스미드 내에 존재하는 추가의 DNA 서열은 또한 세균숙주, 특히 에스케리키아 콜라이의 복제원 및 선택적 유전자 표식자를 포함한다. 효모 하이브리드 플라스미드 내에 이. 콜라이 복제원 및 이. 콜라이 표식자의 존재와 관련된 몇가지 유용한 특징이 있다. 첫째, 다량의 하이브리드 플라스미드 DNA를 이. 콜라이 내에서 성장 증폭시켜 수득할 수 있고, 둘째, 이. 콜라이를 기본으로 한 모든 콜로닝 기술을 이용하여 하이브리드 플라스미드의 작제를 이. 콜라이 내에서 용이하게 수행할 수 있다는 점이다. pBR322 등과 같은 이.콜라이 플라스미드는 이. 콜라이 복제원 및 항생물질(예, 테트라사이클린 및 앰피실린)에 내성을 제공하는 이. 콜라이 유전자 표식자를 포함하며, 유리하게는 효모 하이브리드 벡터의 일부로서 사용한다.

예를들면 효모 및 세균숙주의 복제원 및 유전자 표식자(상기 참조)를 함유하는 추가의 DNA 서열은 효모 프로머터 및 scu-PA 단백질 암호화 영역과 함께 본 발명에 따른 하이브리드 플라스미드를 형성하는 벡터 DNA로서 이하에서 언급될 것이다.

바람직한 태양으로, 본 발명은 효모 숙주 균주내에서 자가복제할 수 있으며 효모발현 조절서열, 및 완전한 우로키나제-형 플라스미노겐 활성체 또는 이의 돌연변이체를 암호화한 제2DNA 서열 상부에 이와의 판독프레임으로 시그널 펩타이드를 암호화한 제1DNA 서열로 구성되며, 형질전환된 효모균주 내에서 발현되면 언급된 우로키나제 -형 플라스미노겐 활성체 또는 이의 돌연변이체가 생성되도록 전사출발 및 종결 시그널 뿐만 아니라 암호화된 해독 출발 및 정지 시그널과 함께 하이브리드 벡터내에 위치하는 DNA 단편을 포함하여, 동정용 표식자를 갖는 하이브리드 플라스미드를 제공한다.

본 발명의 하이브리드 벡터는 당해 공지 방법에 따라, 예를들면 효모발현 조절서열, 시그널 펩타이드 암호화 영역 및 u-PA 또는 이의 돌연변이체의 암호화 DNA 서열로 구성된 DNA 단편, 효모 유전자의 3' 플랭킹 서열 및 벡터 DNA를 연결시켜 제조한다.

하이브리드 플라스미드의 제조를 위하여, 적어도 한 개의 제한부위, 바람직하게는 두개 또는 그 이상의 제한부위를 갖는 용이하게 지도화된 원형 벡터 DNA, 예를들면 세균 플라스미드는 DNA 등(상기 참조)를 사용할 수 있다. 벡터 DNA는 효모 및/또는 세균 숙주의 복제원 및 유전자 표식자를 미리 포함함이 유리하다. 벡터 DNA는 적합한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 절단한다. 제한된 DNA는 효모발현 조절서열, 언급된 DNA 단편, 및 전사종결 시그널을 포함한 언급된 DNA 서열을 포함한 DNA 단편(들)(fragment)에 연결시킨다. 효모 또는 세균 숙주의 복제원 및/또는 표식자는 언급된 DNA 단편(들)을 연결시키기 전이나 후에(또는 동시에) 삽입시킬 수 있다. 모든 경우에 있어서, 제한 및 연결조건은 벡터 DNA 및 발현 조절서열의 필수기능이 방해를 받지 않는 상태로 선택되어야 한다. 하이브리드 벡터는 연속적으로 또는 모든 관련서열을 포함한 두 개의 DNA 단편을 연결시켜 작제할 수 있다.

DNA 단편을 시험관내에서 연결시키는데는 여러 가지기술을 사용할 수 있다. 특정 제한 엔도뉴클레아제에 의해 생성된 평활말단(완전 염기쌍 DNA 이중체)은 T4 DNA 리가제를 이용하여 직접 연결시킬 수 있다. 보통, DNA 단편은 이들의 일본쇄 점착말단을 통해 연결되며 DNA 리가제(예, T4 DNA 리가제)를 사용하여 공유결합적으로 패쇄시킨다. 언급된 일본쇄 점착 말단은 스태거된 말단(DNA 이중체의 두 가닥이 소수 뉴클레오타이드의 거리를 두고 상이한 지점에서 절단된다)을 생성하는 다른 종류의 엔도뉴클레아제로 DNA를 절단시켜 형성할 수 있다. 일본쇄도 또한 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 평활말단 또는 스태거된 말단에 뉴클레오타이드를 가하여(단독 중합체성 테일링) 형성하거나 평활 말단 DNA 부분의 한가닥을 적합한 엑소뉴클라에제(예, λ 엑소뉴클레아제)로 간단하게 분해시켜 형성할 수 있다. 스태거된 말단의 또다른 제조방법은 평활말단 DNA 부분에 스태거된-말단 형성 엔도뉴클레아제의 인지부위를 포함하는 화학적으로 합성된 링커 DNA를 연결시키고 생성된 DNA를 각각의 엔도뉴클레아제로 분해시킴으로써 수득하는 방법이다.

효모 프로모터, 시그널 서열을 포함한 u-PA 또는 이의 돌연변이체의 구조유전자, 전사 터미네이터, 복제 시스템과 등과 같은 본 발명에 따른 하이브리드 벡터의 성분은 알맞은 기능을 보장할 수 있는 예정된 순서대로 함께 연결시킨다. 성분들은 이들의 알맞은 방향과 순서가 보장되도록 공통 제한부위를 통해서거나 합성 링커분자를 사용하여 연결시킨다.

본 발명에 따른 형질전환 효모균주는 당계의 공지 방법에 따라 효모발현 조절서열, 판독 프레임내의 상부에 시그널 펩타이드를 암호화한 제1DNA 서열 및 완전한 우로키나제-형 플라스미노겐 활성체 또는 이의 돌연변이체를 암호화한 제2DNA 서열로 이루어지며 언급된 발현 조절 서열에 의해 전사조절되는 DNA 단편, 및 효모 유전자의 전사종결 시그널을 포함한 DNA 서열을 포함하는 하이브리드 벡터로 효모균주로 형질전화시켜 제조한다.

적합한 효모숙주 유기체는 클루이베로마이세스 속(Kluyveromyces), 캔디다 속(Cnadida), 피키아 속(Pichia), 삭카로마이세스 속(Saccharomyces), 야로비아 속(Yarrowia), 토룰롭시스 속(Torulopsis) 및 관련속(참조 ; J. Lodder, The Yeasts, Amsterdam 1971), 특히 삭카로마이세스 세레비지애의 균주를 포함한다.

효모숙주 세포의 형질전환은 당해 분야의 공지방법에 따라 수행한다. 예를들면, 문헌[Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929(1978)]에 기술된 방법에 따라 형질전환시킬 수 있다. 이 방법은 세단계로 구분된다. : (1)효모 세포벽 또는 이의 일부를 제거, (2) 세포벽 제거된 효모세포(스페로플라스트)를 (폴리에틸렌글리콜) 및 Ca²⁺이온의 존재하에 형질전환 DNA로 처리, (3) 세포벽의 재생 및 한천의 고체층에서 형질전환 세포를 선택 바람직한 방법 : (1)과 관련하여; 달팽이 창자즙과 같은 여러종류의 글루코시다제 제제(예, Gluselase

또는 Helicase

) 또는 삼투압적으로 안정된 용액(예, 1M 솔리톨)중에서 미생물로부터 얻은 효소 혼합물(예, Zymolyase

)을 사용하여 효모 세포벽을 효소적으로 제거한다. (2)와 관련하여; PEG의 존재하에 효모 스페로플라스트 응집체 및 원형질 막의 국부적 융합을 유도한다. 융합-유사 조건의 형성이 결정적으로 중요한 요건이며 많은 형질전환 효모 세포는 형질전환 과정동안에 이핵체 또는 삼핵체까지도 된다. 융합된 스페로플라스트의 동장방법으로 형질전환체를 증식하는데 사용될 수 있는데, 다시 말해서, 미리 동정한 융합 생성체 가운에 형질전화 세포주를 쉽게 선택할 수 있다. (3)과 관련하여; 세포벽이 없는 효모세포는 분열하지 않기 때문에 세포벽은 재생되어야 한다. 이의 재생은 스펠로플라스트를 한천에 봉매시켜 수행함이 편리하다. 예를들면, 녹인 한천(약 50℃)를 스페로플라스트와 혼합한다. 용액을 효모생장온도(약 30℃)로 냉각시키며, 고체층이 형성된다. 이러한 한천층은 스페로플라스트로부터 필수 고분자의 급속한 확산 및 상실을 방지해 붐으로써 세포벽의 재생을 촉진시켜 준다. 그러나, 세포벽 재생은 또한 스페로플라스트를 미리 형성된 한천층의 표면상에 플레이팅하여 얻을 수도 있다(그러나 효율은 낮음).

재생 한천은 형질전환 세포의 재생과 선별을 동시에 허용하는 방법으로 제조함이 바람직하다. 아미노산 생합성 경로의 효소를 암호화한 효모 유전자는 일반적으로 선택성 표식자(상기 참조)로서 사용되고 있기 때문에, 재생은 효모의 최소 배지 한천에서 수행함이 바람직하다. 매우 고도의 재생 효율이 요구되는 경우, 다음의 두가지 단계 방법이 유리하다 : (1) 최대 복합 배지 중에서의 세포벽의 재생, (2) 세포층을 선택적 한천 평판상으로 레플리카 플레이팅 함으로써 형질전환 세포의 선택.

하이브리드 벡터가 어떠한 표식 유전자도 포함하고 있지 않을지라도, 형질전환 세포는 또한 다른 방법으로 동정할 수 있다. 이와 같은 방법의 예로서는, 하이브리드 벡터의 서열과 상동인 표지된 DNA 단편과의 동일반응계내 하이브리드화 방법[예, 상기한 Hinnen et al], 도입된 유전자의 생성물에 대한 항체를 이용함을 전제조건으로 하는 동일반응계내 면역 검정법, 또는 형질전환 플라스미드(들)에 의해 암호화된 유전자 생성물을 측정하는 기타의 선별방법을 들 수있다.

다른 방도로서, 효모는 본 발명에 따른 하이브리드 벡터 및 효모의 동정용 유전자 표식자를 포함한 제2벡터로 공동-형질전환시킬 수 있다. 만일 두개의 상이한 벡터가 공통의 DNA 서열(이들은 세균 서열일 수 있다)을 갖는다면, 재조합이 일어나 융합된 선별성 하이브리드 분자를 형성할 것이다.

본 발명에 따른 하이브리드 플라스미드를 하유한 형질전환 효모균주는 scu-PA 또는 이의 돌연변이체를 생성하는데 있어서, 당해 공지된 돌연변이 방법 및 동정 방법을 이용하여 향상시킬 수 있다. 예를들면, 돌연변이는 U. V 조사 또는 적합한 화학물질로 유도할 수 있다. 특히, 프로테아제-결핍 돌연변이체, 특히 효모 돌연변이체를 제조하여 생성된 scu-PA 또는 이의 돌연변이체가 세포내에서 단백질 분해효소에 의해 분해되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 적합한 돌연변이체는 통상의 방법으로 선택하거나 분리할 수 있다.

본 발명에 따라 수득가능한 scu-PA 단백질, 특히 신균의 scu-PA 단백질은 가치있는 약물학적 특성을 나타낸다. 이들은 공지된 플라스미노겐 활성체와 유사하게 플라스미노겐 활성화의 기전을 통해 국부적인 피브린 분해 또는 단백질 분해 활성의 생성을 필요로 하는 혈전증 또는 기타 증세(예, 동맥경화증, 심근 및 뇌경색증, 정맥혈전증, 혈전색전증, 수술후 혈전증, 혈전성 정액염 및 당뇨성 혈관증)을 예방하거나 치료하는데 인간에 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 치료 유효량의 활성 성분(scu-PA 또는 이의 돌연변이체)을 비경구(예, 정맥내) 투여에 적합하여 활성성분과 바람직하게 상호작용하는 약제학적으로 허용되는 유기 또는 무기, 고체 또는 액체 담체와 함께 함유하는 약제학적 조성물은 제공한다.

특히 적합한 조성물은 주사 용액, 바람직하게는 수용액 또는 현탁액으로서 이들은 사용하기 전에 활성성분만을 또는 만니톨, 락토즈, 글루코즈, 일부민 등과 같은 담체와 함께 함유하는 동결건조된 제재로부터 제조할 수 있다. 약제학적 조성물은 멸균시킬 수 있으며, 필요한 경우 방부제, 안정화제, 유화제, 가용화제, 완충액 및/또는 삼투압 조절용 염(예, NaCl)과 같은 보조제와 혼합시킬 수 있다. 멸균은 작은 기공 크기(직경 0.45㎛ 이하)의 필터를 필요한 경우 동결건조시킬 수 있다. 또한 멸균상태를 안전하게 보존하기 위하여 항생물질을 가할 수도 있다. 예를들면, 본 발명에 따른 scu-PA 단백질은 5% 글루코즈, 및 임의의 안정화제 및 염을 함유한 멸균 수성 액제로 제형할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 단위 용량형(예, 앰플)으로 분산되어 단위 용량당 1 내지 2000㎎의 약제학적으로 허용되는 담체 및 단위용량당 약 1 내지 20㎎, 바람직하게는 약 3 내지 15㎎의 활성성분(scu-PA 또는 이의 돌연변이체)을 함유한다.

질병종류, 연령 및 환자 상태에 따라, 체중이 약 70㎏인 환자를 치료하기 위한 일일투여량은 24시간당 20 내지 150㎎, 바람직하게는 45 내지 100㎎이다.

본 발명은 또한 본 발명의 생물학적 활성 단백질을 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합시킴을 특징으로 하여, 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

신규한 단백질의 인체의 예방 및 치료제로서의 용도도 또한 본 발명의 목적이다.

본 발명은 또한 신규한 하이브리드 플라스미드, 이에 의해 형질전환된 효모균주 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 특히 scu-PA 단백질, 하이브리드 벡터, 형질전환된 효모숙주 및 실시예에 기술된 이의 제조방법을 제공한다.

하기의 실험부에서 본 발명의 여러 태양이 첨부된 도면을 참고로 기술될 것이다.

하기의 실시예는 본 발명을 좀더 상세히 설명하여 주는 것이지만, 본 발명의 범위를 이들 실시예로 제한하고자 하는 것은 아니다.

실험부

[실시예 1]

u-PA 암호화 영역을 포함한 플라스미드 pCS 16UPA의 작제

A) 플라스미드 pCS 16의 작제(제3도 참고)

파아지 람다의 CI 유전자 및 테트라사이클린 내성 유전자의 일부를 포함한 플라스미드 pUN121[참조 : B. Nilsson et al. Nucl. Acids Res. 11, 8019~8030(1983)

]의 1.5kb PstI-BamHI 단편을 pstI 및 BamHI으로 절단된 pUC[J. Norrander et al., GEne 26, 101~106(1983)]내로 클로닝시킨다. 생성된 클론을 PstI으로 분해시킨다. 3' 돌출말단을 T4DNA 폴리머라제[T. Maniatis et al., Molecular Cloning(1982), p. 395]와 반응시켜 제거하고 Xho I 링커(5'-CCTGGAGG-3', Biolabs)를 평활말단에 연결시킨다. Xho I으로 분해시킨후 분자를 연결시켜 다시 환형화한다. 연결 혼합물 분취량을 사용하여 Ca⁺⁺-처리된 이. 콜라이 HB101 세포를 형질전환시킨다. 각각의 앰피실린 내성 형질전환 클론의 DNA를 분석한다. 몇몇 정확한 클론주의 하나를 선정하고 이것을 pCS 16으로 명명한다.

B) 플라스미드 pCS 16UPA의 작제(제4도 참고)

인간 Hep³세포[참조 : T. Maniatis et al., p 188~246]로부터 수득한 mRNA로 우로키나제 cDNA를 제조한다. u-PA cDNA의 1.3kb Smal-BamHI 단편 및 1kb BamHI-ECoRI 단편을 pUN 121[B. Nilson et al., Nucl. Acids Res. 11, 8019~8030(1983)]의 Smal, ECoRI 부위내로 클로닝시켜 플라스미드 pCUK176을 수득한다. 인간 u-PA cDNA 삽입체의 제한 엔도뉴클레아제 지도가 제1도에 도시되어 있다. u-PA 삽입체의 뉴클레오타이드 서열 및 유추된 아미노산 서열은 제2도에 나타나 있다. u-PA cDNA 삽입체를 플라스미드 pCS16내로 클로닝시킨다. 이클로닝된 cDNA는 5' 비해독된 영역(제1도)내의 Smal 부위로부터 3' 비해독된 영역내의 뉴클레오타이드 위치 1439~1444인 PvuⅡ 부위(제2도)까지 확장된다.

15㎍의 플라스미드 pCUK176을 PvuⅡ로 분해시킨다. 379bp PvuⅡ 단편을 트리스-보레이트 -EDTA 완충액(pH 8.3)중의 1.5% 아가로즈겔 상에서 다른 단편으로부터 분리시킨다. DNA를 DE 52(와트만) 이온 교환 크로마토그래피로 전기용출시켜 정제하고 에탄올로 침강시킨다. 1.2㎍의 일본쇄된 Xho I 링커(5'-CCTGGAGG-3')를 이의 5'에서 인산화시켜 75℃로 10분동안 가열한 다음, 실온으로 냉각시키면 이때 자가어닐링된다. 이것을 -20℃에 저장한다. 0.9μG의 키나제화 이본쇄 링커를 15℃하 20㎕의 60mM트리스 - HCI(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 5mM DTT, 3.5mM ATP 및 T₄DNA 리가제 (biolabs) 400단위 중에서 16시간동안 pCUK 176(상기 참조)의 379bp Pvu Ⅱ 단편의 평활말단에 80배 물량으로 연결시킨다. 혼합물을 85℃로 10분간 가열한다. 과량의 링커분자를 10mM EDTA 및 300mM 나트륨 아세테이트(pH 6.0)의 존재하에서 이소프로판을 0.54 용량으로 30분동안 실온에서 침강시켜 제거한다. DNA를 Xho I 단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액(pH 8.3)중의 1.5% 아가로즈겔 상에서 분리시킨다. 대부분의 u-PA 암호화 서열을 포함한 1.3kb Smal-BamHI 단편을 분리한다. 6㎍의 플라스미드 pCS16을 Smal 및 Xho I 으로 분해시킨다. 2.7kb 벡터 단편을 분리한다. DNA 단편을 겔로부터 전기용출시키고 에탄올로 침강시킨다. 1.3kb Smal-BamHI 단편 0.2pmole, 121bp BamHI-Xho I 단편 0.2pmole(양 단편은 함께 전체 u-PA 암호화 서열을 포함한다) 및 2.7kb 벡터 단편 0.1pmole을 15℃하, 10㎕의 60mM 트리스 HCI(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 5mM DTT, 3.5mM ATP 및 T₄DNA 리가제 400단위중에서 연결시킨다. 연결 혼합물의 1 및 3㎕ 분취량을 100㎕의 Ca⁺⁺처리된 이. 콜라이 HB 101 세포에 가한다. 형질전환은 문헌[A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929(1978)]에 따라 수행한다. 12개의 앰피실린 내성 콜로니를 10㎎/l 앰피실린이 함유된 LB 배지에서 생장시킨다. DNA 문헌[Holmes et al., Anal. Biochem, 114, 193(1981)]에 따라 분리하고 ECoRI, PvuⅡ 및 Xho I 제한 분해물로 분석한다. 예상된 제한 단편을 포함한 한개의 클론의 플라스미드 DNA를 pCS 16/UPA로 명명한다.

유사한 방법으로, Sma I 부위(뉴클레오타이드 위치 1 내지 6, 제2도)에서 Pst I 부위(뉴클레오타이드 위치 1637 내지 1642, 제2도)까지의 우로키나제 cDNA를 플라스미드 pCS 16내로 이클로닝시킨다. 플라스미드 pCUK 176을 Pst I으로 분해시킨다. 점착 말단을 문헌[상기한 Maniatis et al., p395]에 기술된 바와같이 T4DNA 폴리머라제와 반응시켜 평활말단으로 전환시킨다. 1.2kb DNA 단편을 분리한다. Xho I 링커를 상술한 바와같이 가한다. DNA를 BamHI 및 XhoI으로 분해시키고 315bp BamHI-XhoI 단편을 분리한다. 0.2pmole의 이 단편을 1.3kb Smal-BamHI 단편 및 2.7kb 벡터 단편에 연결시킨다(상기 참조). 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB101 CA⁺⁺세포를 형질전환시킨다. 예상된 제한 단편을 포함한 한개의 클론의 플라스미드 DNA를 pCS 16/UPA-13으로 명명한다. 이 플라스미드는 5' 비해독된 영역내의 Smal 부위 (제1도)로부터 3' 비해독된 영역내의 뉴클레오타이드 위치 1641 PstI 부위(제2도)까지의 u-PA cDNA 삽입체를 함유한다. 플라스미드 pCS 16/UPA와의 유일한 차이점을 연장된 3' 비해독 영역이다.

[실시예 2]

PHO5 프로모터 및 인버타제 시그널 서열을 함유한 플라스미드 P31 RIT-12의 작제

A) 인버타제 시그널 서열을 위한 올리고데옥시리보뉴클레오타이드의 합성

4개의 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 : I-1, I-2, I-3, I-4를 DNA 합성기(모델 380B Applied Biosystems)로 합성한다. 탈블록킹시킨 후, 합성 단편을 8M 요소가 함유된 12% 폴리아크릴아미드겔 상에서 정제시킨다. 순수한 탈염 올리고데옥시리보뉴클레오타이드를 Sep. Pak(Waters Associates)로 수득한다. 이들 단편은 흔히 사용된 효모 코돈과 함께 인버타제 시그널 서열을 암호화한 이중체를 구성한다.

B)플라스미드 p31내로 인버타제 시그널 서열의 이클로닝

a) 벡터의 제조 :

1.5㎍의 p31R/SS-TRA△2(유럽 특허원 제143,081)호를 50㎕의 10mM 트리스 HCI(pH7.5), 6mM MgCl₂, 100mM NaCl, 6mM 머캅토에탄올중에서 ECoRI(베링거) 10U로 37℃하에 1시간동안 분해시킨다. 2.5M NaCl ㎕를 가한 후, XhoI(베링거) 10μ를 가하여 37℃에서 1시간 배양한다. 4.5kb 벡터를 0.8%예비 아가로즈겔상에서 분리시킨다. 겔 슬라이스를 마이크로 콜로이도 튜브(살토리우스 게엠베하)에 옮겨 TE 200㎕로 덮고 전기용출(90mA에서 50분동안 전기영동)시킨다. TE 용액을 수거하고 0.1용량 10 X TNE를 가한 후 무수 에탄올 2.5용량으로 침전시킨다. DNA 펠렛을 냉 80% 에탄올로 세척하고 진공하에서 건조시킨다. DNA를 6㎕ TE(40pmole/㎕)중에 재현탁시킨다.

b)올리고데옥시리보뉴클레오타이드(I-1, I-2, I-3, I-4)의 어닐링, 인산화 및 벡터와의 연결

10㎕의 0.5M 트리스 HCI(pH 8)중에 각각 10pmole씩 함유된 4개의 데옥시리보뉴클레오타이드의 용액을 수욕상에서 95℃로 5분간 배양한다. 수욕을 5시간에 걸쳐 30℃로 서서히 냉각시킨다. 이렇게 어닐링된 혼합물에 각각 2㎕의 0.1M MgCl₂, 0.1M NaCl, 30mM DTT, 4mM ATP 및 폴리뉴클레오타이드 키나제(베링거) 8U(1㎕)를 가한다. 키나제화(kination)는 37℃에서 1시간동안 수행한다. 어닐링된 인산화 올리고데옥시리보뉴클레오타이드와 60pmol의 p31R/SS-TRA△2 ECoRI-XhoI 절단 벡터(1.5㎕)를 14℃에서 17시간동안 T₄DNA 리가제(바이오랩스) 400U(1㎕)로 연결시킨다. 65℃에서 10분동안 배양시켜 반응을 중단시킨다. 10㎕의 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB101 Ca⁺⁺세포[참조 ; M. Degert and S. D. Ehrlich. Gene 56, 23~28(1979)]를 형질전환시킨다. 20amp^R콜로니를 취한다. 간단한 분리방법[참조 : D. S. Holmes and M. Quigley Anal. Biochem. 114, 193~197(1981)]으로 DNA를 제조한다. DNA를 ECoRI 및 XhoI으로 분해시켜 ECoRI 말단에서 방사능 표지시키고 표식자로서 방사능표지된 pBR 322 HaeⅢ 절단 DNA를 사용하여 8M 요소가 함유된 6% 폴리아크릴아미드겔 상에서 분석한다. 모든 20개의 클론으로부터 수득된 DNA에 대한 정확한 크기 밴드를 관찰한다. 한개의 클론을 100㎍/㎖의 앰피실린이 함유된 100㎖ LB 배지 중에서 생장시킨다. 플라스미드 DNA를 분리하고 이것을 p31 RIT-12로 명명한다.

[실시예 3]

플라스미드 pJDB 207/PHO5-I-UPA의 작제(제5도)

pJDB 207/PHO5-I-UPA는 pJDB 207 효모 발현 벡터내에 탠덤 배열로 클로닝된 PHO5 프로모터, 인버타제 시그널 서열, 완전한 우로키나제의 암호화 서열 및 PHO5 전사 터미네이터를 함유한다.

20㎍의 플라스미드 pCS16/UPA를 40단위의 ECoRI으로 분해시킨다. 페놀로 추출하고 에탄올로 침전시킨후, ECoRI-분해된 DNA를 65℃에서 TaqI으로 절단시킨다. 생성된 단편을 예비 1.2% 아가로즈겔 상에서 분리시킨다. 462bpTaqI-ECoRI 단편을 전기용출시켜 겔로부터 분리시킨 다음 에탄올로 침전시킨다. 염기서열(I) 5'- CTGCAAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT-3' (Ⅱ ) 3'-TCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGG-5'의 올로고데스옥시리보뉴클레오타이드 링커를 DNA 단편의 TaqI 부위에 연결시킨다. 링커로 완전한 u-PA의 암호화 서열의 5'말단(뉴클레오타이드 130 내지 154, 제2도)은 복구되고 인버타제 시그널 서열에 프레임 융합된다. 링커의 5'-CTGCA 서열은 Hgal 절단에 의해 형성된 인버타제 시그널 서열의 상응하는 3'함요(recessed) 말단을 채워준다.

각각 300pmole의 올리고데스옥시뉴클레오타이드 I 및 Ⅱ를 인산화되고 어닐링시킨다. 인산화된 이본쇄 링커 DNA 5.25㎍(600pmole)을 175㎍의 60mM 트리스 HCI(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 1mM ATP, 5mM DTT T₄DNA 리가제 800단위중에서 15℃하에 16시간동안 462bp TaqI-ECoRI 단편(상기 참조) 1.7㎍(5.6pmole)에 연결시킨다. T₄리가제를 85℃에서 10분동안 불활성시킨다. 10mM EDTA 300mA 나트륨 아세테이트 pH 6.0 및 이소프로판을 0.54용량의 존재하에서 과량의 링커를 침강시켜 제거한다. DNA를 PstI으로 분해시킨다. u-PA를 암호화한 뉴클레오타이드 436 이하의 DNA 서열(PstI 부위, 제2도 참조)에 연결된 링커를 포함하는 독특한 312bp 단편을 분리한다. DNA 단편을 전기용출시켜 정제하고 에탄올로 침강시킨다.

플라스미드 pCS 16/UPA를 XhoI 및 PstI으로 분해시킨다. 1007bp PstI-XhoI 단편을 분리시키고 정제한다. 이 단편은 대부분의 우로키나제 암호화 서열을 포함한다.

플라스미드 p31RIT-12(실시예 2 참조)를 SalI 및 XhoI으로 분해시킨다. 882bp Sall-XhoI 단편을 전기용출시켜 겔로부터 분리하고 에탄올로 침강시킨다. 단편을 BamHI 및 Hgal으로 좀더 분해시킨다. 591bp BamIH-Hgal 단편을 분리한다. 이 단편은 PHO5 프로모터 영역 및 인버타제 시그널 서열을 포함한다.

플라스미드 PpJDB207/PHO5-TPA 18 (유럽 특허원 제143,081호 참조)을 BamHI 및 XhoI으로 분해시킨다. 6.8kb 벡터 단편을 트리스 아세테이트 완충액(pH 8.2)중의 예비 0.6% 아가로즈겔 상에서 분리한다. DNA를 전기용출시키고 에탄올로 침강시킨다.

모든 DNA 단편을 0.1pmole/㎕의 농도로 H₂O 중에 재현탁시킨다. 591bp BamHI-Hgal 단편 0.2pmole, 312bp Hgal-PstI 단편 0.2pmole, 1007bp PstI-XhoI 단편 0.2pmole 및 6.8kb BamHI-XhoI 벡터 단편 0.1pmole 10㎕의 50mM 트리스·HCI(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 5mM DTT, 1mM ATP 및 T₄DNA 리가제 400단위중에서 15℃하에 15시간동안 연결시킨다. 연결 혼합물 1㎕를 사용하여 이. 콜라이 HB 101 CA⁺⁺세포를 형질전환시킨다. 12개amp

콜로니를 취하고 100㎎/ℓ의 앰피실린이 함유된 LB 배지에서 생장시킨다. DNA를 간단한 분리방법[참조 : D. S. Holmes et al., Anal. Biochem. 114, 193(1981)]으로 제조한다. 플라스미드 DNA를 Hind Ⅲ 및 ECoRI으로 제한 분해시켜 예상된 제한 단편을 관찰한다. 단일 클론의 플라스미드 DNA를 선별하고 이것을 pJDB 207/PHO5-I-UPA로 명명한다.

[실시예 4]

플라스미드 pJDB 207/PHO5-uPA의 작제

이 작제물은 pJDB 207 효모벡터내에 클로닝된 PHO5 프로모터, 완전한 우로키나제의 암호환 서열에 프레임 연결된 PHO5 시그널 서열, 및 PHO5 전사 터미네이터를 포함한다

염기서열

(I) 5'- CCAATGCAAGCAACTGAACTTCAAGTTCCAT-3'

(Ⅱ ) 3'-GGTTACGTTCGTTACTTGAAGTTCAAGGTAGC-5'

의 올리고데속시리보뉴클레오타이드 링커는 PHO5 시그널 서열의 8개의 뉴클레오타이드(5'-CCAATGA)(내부의 Ball 부위에서 이의 프로세씽 부위까지)를 제공하여 완전한 u-PA의 암호화 서열(뉴클레오타이드 위치 130~154, 제2도)에 프레임 융합된다. 링커는 pCS 16/UPA의 462bp TaqI-ECoRI 단편의 TaqI 부위에 연결된다(실시예 3 참조). 인산화, 어닐링 및 연결은 실시예 3에 따라 수행한다. DNA를 Ball 및 PstI으로 분해시킨다. 315bp 단편을 분리한다. DNA 단편은 PstI 부위 위치 436(제2도) 이하의 u-PA 유전자 DNA서열을 포함한다.

플라스미드 p31(유럽 특허원 제100,561호)을 Ball 및 BamHI으로 분해시킨다. PHO5 프로모터 및 대부분의 PHO5 시그널 서열을 포함하는 584bp BamHI-Ball 단편을 분리한다. DNA 단편을 전기용출 및 DE 52 크로마토그래피로 정제하여 에탄올로 침강시키고 0.1pmole/㎕의 농도로 H₂O 중에 재현탁시킨다.

584bp BamHI-Ball 단편 0.2pmole, 315bp Ball-PstI 단편 0.2pmole, 1007bp PstI-XhoI 단편(실시예 3 참조) 0.2pmole 및 6.8kb BamHI-XhoI 벡터 단편 0.1pmole(실시예 3 참조)을 연결시키고 이를 사용하여 이. 콜라이 HB101을 형질전환시킨다. 6개 amp^R콜로니를 취하여 100㎎/ℓ의 앰피실린이 함유된 LB 배지에서 생장시킨다. 간편한 DNA 방법으로 플라스미드 DNA를 제조하고 BamHI/PstI로 이중분해하여 분석한다. 예상된 제한 단편을 포함한 한 개의 클론을 선택하고 이 플라스미드를 pJDB 207/PHO5-UPA로 명명한다.

[실시예 5]

플라스미드 pJDB 207/PHO5-SSUPA의 작제

이 플라스미드는 효모발현 벡터 pJDB 207내에 PHO5 프로모터의 조절하의 자체 시그널 서열을 갖는 우로키나제 유전자를 포함한다.

20㎍의 플라스미드 pCS 16/UPA-13(실시예 1 참조)을 Ball(뉴클레오타이드 위치 76~86, 제2도) 100단위로 분해시킨다. 생성된 세 개의 단편을 트리스보레이트 -EDTA 완충액(pH 8.3)중의 예비 1% 아가로즈겔 상에서 분리한다. 1.7kb Ball 단편을 전기용출시키고 에탄올로 침강시킨다.

염기서열

(I) 5'-AATTCGATTACCAATGAGAGCCCTGC-3'

(Ⅱ ) 3'-GCTAATGGTTACTCTCGGG-5'

의 올리보데속시리보뉴클레오타이드는 ATG앞에 8개 뉴클레오타이드의 PHO5 5' 비암호화 영역 및 ATG를 포함한 뉴클레오타이드 70 내지 82(제2도)의 u-PA 암호화 서열을 갖는다. 링커를 실시예 3에 기술된 바와같이 DNA의 Ball 점착 말단에 연결시킨다.

u-PA 시그널 서열 및 뉴클레오타이드 436 이하의 완전한 u-PA 암호화 서열의 일부(PstI 부위, 제2도)를 포함한 380bp 단편을 분리한다.

플라스미드 p31(유럽 특허원 제100,561호 참조)을 BamHI 및 ECoRI으로 분해시키고 PHO5 프로모터를 포함한 534bp BamHI-ECoRI 단편을 분리한다. DNA 단편을 아가로즈겔로부터 전기용출시키고 DE 52 크로마토그래피로 정제하여 에탄올로 침강시키고 0.1pmole/㎕의 농도로 H₂O 중에 재현탁시킨다.

534bp BamHI-ECoRI 단편 0.2pmole, 380bp ECoRI-PstI 단편 0.2pmole, 1007bp PstI-XhoI 단편(실시예 3 참조) 0.2pmole 및 6.8kb BamHI-XhoI 벡터 단편(실시예 3 참조) 0.1pmole을 연결시키고 이를 사용하여 이. 콜라이 HB101 Ca⁺⁺세포를 형질전환시킨다. 12개 amp^R콜로니를 독립적으로 100㎎/ℓ의 앰피실린이 함유된 LB 배지에서 생장시킨다. 간단한 DNA 방법으로 DNA를 제조하고 BamHI 및 ECoRI으로 분석한다.

한 개 클론의 플라스미드 DNA를 선택하고 이것을 pJD 207/PHO5-SSUPA로 명명한다.

[실시예 6]

플라스미드 pJDB 207R/PHO5-UPA의 작제

완전한 우로키나제의 암호화 서열을 PHO5 프로모터에 연결시킨다. 대조 목적으로 제조한 본 작제물에서는 시그널 서열이 포함되어 있지 않다.

염기서열

(I) 5'-AATTCATGAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT-3'

(Ⅱ ) 3'-GTACTCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5'

의 올리고데속시리보뉴클레오타이드는 링커는 ATG 및 완전한 우로키나제의 아미노산 Serl 내지 Ser9을 암호화한 u-PA의 뉴클레오타이드 130 내지 154(제1도 참조)를 포함한다. 올리고 뉴클레오타이드를 인산화시키고 어닐링시켜 pCS 16/UPA의 462bp TaqI-ECoRI 단편(실시예 3 참조)에 연결시킨다. DNA를 ECoRI 및 PstI으로 분해시킨다. PstI 부위의 위치 436(제2도) 이하의 완전한 u-PA 암호화 서열 및 ATG를 포함한 315bp ECoRI-PstI 단편을 분리한다.

플라스미드 p31(유럽 특허원 제100,561호 참조)을 BamHI 및 ECoRI으로 분해시키고 예비 1.5% 아가로즈겔 상에서 534bp BamHI-ECoRI 단편을 분리한다. 이 단편은 PHO5 프로모터를 함유한다.

모든 DNA 단편을 전기용출시켜 DE 52 크로마토그래피로 정제하고 에탄올로 침강시킨 다음 0.1pmole/㎕의 농도로 H₂O 중에서 재현탁시킨다. 각각 0.2pmole의 534bp BamHI-ECoRI 단편, 315bp ECoRI-PstI 단편 및 1007bp PstI-XhoI 단편(실시예 3 참조) 및 0.1pmole의 6.8kb BamHI-XhoI 벡터 단편(실시예 3 참조)을 연결시키고 통상적으로 이. 콜라이 HB101 CA⁺⁺세포를 형질전환시킨다. 8개의 amp^R콜로니를 취하여 100㎎/ℓ의 앰피실린이 함유된 LB 배지에서 생장시킨다. 플라스미드 DNA를 제조하고 BamHI 및 ECoRI 제한 분해물로 분석한다. 예상된 제한 패턴을 갖는 한개의 클론의 플라스미드 DNA는 pJD B 207R/PHO5-UPA로 명명한다.

[실시예 7]

구조적 프로모터를 갖는 GAPDH 유전자의 콜로닝

a)효모 유전자 라이브러리의 작제

야생형 삭카로마이세스 세레비지애 균주 S288C로부터 얻은 30㎍의 고분자량 효모 DNA[참조 : M. V. Olsen et al., J. Mol. Biol. 132, (1989)]를 제공자가 추천하는 바와같이 ECoRI 메틸화 완충액 250㎕ 중에서 ECoRI 메틸라제(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 2단위와 함께 37℃에서 30분동안 배양한다. DNA를 에탄올로 침강시키고 500㎕의 25mM 트리스·HCI(pH 8.5), 2mM MgCl₂(ECoRI^*완충액)[참조 : H. Meyer. FEBS Lett, 90, 341(1979)] 중에 재현탁시킨 다음 DNA 단편의 크기가 30~50kb범위에서 최대량이 될 때까지 ECoRI(베링거)으로 분해시킨다. (λ DNA의 XhoI 분해는 적절한 33kb 및 17kb 표식자를 제공한다). ECoRI^*조건하에서 분해된 효모 DNA를 SW 40 회전기의 38,000rpm하에 6시간동안 자당구배(10mM 트리스·HCI(pH 7.5), 1mM EDTA 중의 5 내지 20% 자당)상에서 크기별로 분별시킨다. 구배의 상부로부터 각각 0.4㎖의 30개 분획을 수거한다. 분획 16은 크기가 30 내지 40kb인 DNA 단편을 함유한다. 이 분획의 DNA(3㎍)을 에탄올로 침강시키고 15℃에서 16시간동안 총 15㎕의 용적으로 ECoRI에 의해 직선으로 된 1㎍의 코스미드 벡터 pYCI[참조 : B. Hohn et al. in Genetic Engineering, Vol. 2. p. 169, New York 1980]에 연결시킨다. 연결은 제공업체가 기술하는 완충액 시스템을 사용하여 300u T₄DNA 리가제(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 수행한다. DNA를 시험관내에서 박테리오파아지 λ내로 도입시키고[참조 ; B. Hohn in Methods in Enzymology', Vol. 68, p. 299, New York 1979] 어셈블된 파아지를 사용하여 이. 콜라이 균주 HB 101(rk

, mk

, leu

, pro

, rec A)를 형질 도입시킨다. 형질도입 효율은 pYCI 벡터 1㎍당 약 5000 앰피실린-내성 콜로니이다. 3000개 amp

콜로니를 취하여 각각 100㎕/㎖ 앰피실린이 함유된 LB 배지[10g 박토-트립톤(디프코), 5g 박토 효모 추출액(디프코), 10g NaCl]중의 미세역가 디쉬의 웰에서 생장시킨다.

b)효모 GAPDH 유전자의 분리

상술한 유전자 라이브러리를 하기 구조의 합성 올리고뉴클레오타이드[포스포트리에스테르 방법을 사용하여 제조함 : K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 97, 7327(1975) ; J. F. M. de Rooij et al., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 98, 537(1979)]로 분별한다 : 5'-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-3'. 10㎍의 올리고뉴클레오타이드를 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor lab., 1982, page 125]에 기술된 바와같이 총용량 50㎕ 중의 T₄폴리뉴클레오타이드 키나제(베링거)와 함께 r-³²P-ATP(3000Ci/mmole, 10μ Ci/㎕ Amersham) 10㎕로 키나제 처리한다. 상기 문헌 저자가 기술한 바대로(페이지 312) 콜로니 하이브리드화를 수행한다. 코닥 X-5X-선 필름을 사용한 자가방사법으로 양성 클론을 검출한다. 플라스미드 DNA 분리(유럽 특허원 제100,561호 참조)로 GAPDH의 암호화 2100bp Hind Ⅲ 단편[참조 : J. P. Hooland et al., J. BoiO. Cehm. 254. 9839(1979)]을 함유하는 하이브리드 클론을 얻는다. 클론닝된 DNA의 사실성에 대한 최종증거는 이본쇄 DNA에 대한 디에옥시 서열분석 초안[참조 ; G. F. Hong, Biosceince Reports 1, 243(1981)]과 혼용하여 상기 언급된 올리고뉴클레오타이드를 사용한 DNA 서열분석 실험으로 확인한다. 클로닝된 GAPDH 유전자는 문헌[Holland et al., J. Biol. Chem. 255, 2596(1980)]에 의해 공개된 pgap 491과 동일한 서열을 갖는다.

c) GAPDH 프로모터의 제조

상기 언급된 하이브리드 플라스미드를 TaqI(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 분해시키고, 이 DNA 단편을 1.2% 연질 아가로즈겔 상에서 분리한 다음 이 DNA를 뜨거운 페놀로 추출하여 GAPDH 유전자의 ATG로부터 위치 -27 내지 -675(제6도 참조)를 포함한 649bp TaqI 단편을 pBR 322의 ClaI 부위내로 클로닝시킨다. : 1㎍의 pBR 322를 제공업체가 기술한 바와같이 ClaI 3 단위(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 절단시킨다. 페놀화된 절단 벡터 300ng을 총용량 20㎕ 중의 T₄DNA 리가제 200U를 사용하여 약 3000ng의 삽입체 DNA(649bp TaqI 단편)에 연결시킨다. 이것으로 앰피실린 내성을 위해 이. 콜라이 HB 101을 형질전화시키고, 플라스미드 DNA를 제조한 다음 제한 효소[TaqI, Dral]로 분석한다. 제한 엔도뉴클레아제 Dral을 사용하여 플라스미드의 BamHI 부위에 맞게 TaqI 단편의 방향을 설정하고, pBR 322의 Hind Ⅲ 부위 옆의 위치 -675의 TaqI 부위를 갖는 플라스미드를 동정한다. pBR 322/GAPDH로 지칭된 이 플라스미드를 BamHI(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 처리하여 직선으로 만든다. DNA를 0.5㎍/㎖의 농도로 10mM 트리스(pH 8.0)중에서 재현탁시킨다. 16㎍의 SalI-절단된 DNA를 100㎕의 20mM 트리스 (pH 8.0), 199mM NaCl, 12mM MgCl₂, 12mM CaCl₂, 및 1mM EDTA 중에서 2U의 엑소뉴클레아제 Bal31(BRL)로 분해시킨다. 30℃에서 1, 2, 3, 4, 5 및 6분간 배양한 후, 각각 2㎍ DNA의 분취량을 수거한 다음 5㎕ 페놀 및 60㎕ TNE와 즉시 혼합시킨다. 페톨/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침강시킨 후, DNA를 100㎍/㎖의 농도로 10mM 트리스(pH 8.0)중에 재현탁시킨다. Bal 31에 의한 엑소뉴클레아제 절단량을 분석하기 위하여, 각각의 시간이 경고하여 얻은 DNA 0.5㎍을 엔도뉴클레아제 BamHI으로 분해하고 트리스-보레이트 완충액(pH 8.3)(90mM 트리스·HCI pH 8.3, 90mM 붕산, 2.5mM EDTA)중의 1.5% 아가로즈겔 상에서 분석한다. 각단편의 말단으로부터 Bal 31 분해에 의해 1분당 평균 100bp가 제거된다.

Bal Ⅱ 링커(5'-GGAGATCTCC-3')을 인산화하고 어닐링한 다음 Bal 31처리된 DNA 단편에 연결시킨다. 과량의 링커를 이소프로판올로 침강시켜 제거한다. DNA를 Bgl Ⅱ로 분해시키고 총용량 20㎕ 중에서 5㎍/㎖의 농도로 직접 고리화한다. Bal 31 단축된 TaqI 단편의 크기를 제한 분석(Bal Ⅱ, Hind Ⅲ을 사용)으로 측정한다. 세개의 클론을 선택한다. 이들은 ATG 상부로부터 GAPDH 프로모터까지 각각 약 200bp, 265bp 및 540bp가 연장된 DNA 단편을 함유한다. 세개의 단편 모두는 약 -140bp에서 추정된 TATA 박스를 포함한다. 이들 클론은 여전히 pBR 322-유도된 DNA의 일부중에 복제원을 포함하므로 각각 PGAPDH-F, PGAPADH-E 및 PGAPDK-D로 칭한다.

GAPDH 프로모터 요소를 TaqI 부위의 위치 -27로부터 GAPDH 유전자의 ATG에 바로 인접한 위치까지 확장하기 위하여 하기 구조를 갖는 두개의 합성 상보 올리고뉴클레오타이드를 합성한다 :

5' CGAATAAACACACATAAATAAAG 3'

3' TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA 5'

이들 올리고뉴클레오타이드는 말단 ECoRI 부위의 생성과 함께 위치 -26 내지 -5의 진정한 GAPDH 프로모터 서열을 제공한다. 2㎍의 플라스미드 PGAPDH-F, PGAPDH-E, 및 PGAPDH-D를 각각 50㎕중의 TaqI 6단위로 분해시키고 생성된 혼합물을 페놀화하여 에탄올로 침강시키고 10㎕ 물중에 재현탁시킨다. 2㎕의 각 일본쇄를 10mM 트리스·HCI(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 50mM NaCl, 이 함유된 용액 100㎕ 중에서 혼합하고 90℃로 3분간 가열한 다음 이 용액을 실온으로 서서히 냉각시켜(약 3시간 이내)합성 올리고뉴클레오타이드를 어닐링한다. 1㎍의 TaqI 분해된 플라스미드를 20㎕의 용량으로 약 20배몰 과량의 어닐링된 올리고뉴클레오타이드와 혼합시키고 800U의 T₄DNA 리가제를 사용하여 약 18시간 동안 연결시킨다. 리가제를 불활성화 시킨 후, 전체 혼합물을 Bal Ⅱ(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 3단위로 분해시킨다. 각각 약 200bp, 265bp 및 540bp 인 Bal Ⅱ-ECoRI 단편을 1.5% 연질 아가로즈겔 상에서 분리하고 겔로부터 추출한 다음 에탄올로 침강시킨다.

플라스미드 p31 RIT-12(실시예 2 참조)를 BamHI 및 ECoRI으로 분해시킨다. 3.6kb 거대 벡터 단편을 분리한다. 이 단편을 사용하여 200bp, 265bp 및 540bp인 Bal Ⅱ-ECoRI GAPDH-프로모터 단편을 클로닝시킨다. 연결, 형질전환 및 플라스미드 분리조건은 상술한 바와 같다. 정확한 삽입체를 갖는 플라스미드를 각각 p31 GAPEL-IT, p31 GAPEL-IT 및 p31 GAPDL-IT로 칭한다(제7도).

플라스미드 p31 GAPEL-IT, p31 GAPEL-IT 및 p31 GAPDL-IT의 Bal Ⅱ-ECoRI 단편의 DNA 서열은 제8도에 나타나 있다. 이들 한편의 정확한 크기는 각각 약 202bp, 267p 및 544p이다.

[실시예 8]

플라스미드 pJDB 207/GAPDL-I-UPA의 작제(제9도)

이 플라스미드는, 셔틀 벡터 pJDB 207에 직렬 배열로 GAPDH-D 프로모터, 인버타제 시그널 서열, 완전한 우로키나제의 암호화 서열 및 PHO5 전사 터미네이터를 포함한다.

p31 GAPDL-IT의 플라스미드 DNA를 Sall 및 Hind Ⅲ으로 분해시킨다. 0.8kb Sall-Hind Ⅲ 단편을 예비 1% 아가로즈겔상에서 분리한다. 이 단편은 GAPDH-D 프로모터 및 인버타제 시그널 서열의 일부를 포함한다.

프라스미드 pJDB 207/PHO5-I-UPA을 Hind Ⅲ 및 BamHI으로 분해시킨다. 1239bp Hind Ⅲ-BamHI 단편은 인버타제 시그널 서열의 잔여부분 및 대부분의 u-PA 암호화 서열을 포함한다. pJDB 207/PHO5-I-UPA를 또한 Sall 및 BamHI으로 분해시킨다. 거대한 6.6kb 벡터 단편을 트리스-아세테이트 완충액(pH 8.2)중의 예비 0.6% 아가로즈겔상에서 분리한다.

DNA 단편을 전기용출시켜 겔로부터 분리하고 DE 52크로마토그래피로 정제한 다음 에탄올로 침강시킨다. 0.8kb Sall-Hind Ⅲ 단편, 1239bp Hind Ⅲ -BamHI 단편 및 6.6kb Sall-BamHI 벡터 단편을 연결시키고 이를 사용하여 이. 콜라이 HB 101 CA⁺⁺세포를 형질전환시킨다. 6개 amp^R형질전화체의 플라스미드 DNA를 Hind Ⅲ 및 SalI 제한효소로 분석한다. 예상된 제한단편을 갖는 한개의 클론의 플라스미드 DNA는 pJDB 207/GAPDL-I-UPA로 명명한다.

유사한 작제방법으로 플라스미드 p31GAPEL-IT의 493bp Sall-Hind Ⅲ 단편(실시예 7 참조)을 분리하고 이를 연결용으로 사용한다. 생성된 플라스미드 DNA는 pJDB 207/GAPDL-I-UPA의 명명한다.

유사한 방법으로 pJDB 207/GAPDL-I-UPA를 작제한다.

[실시예 9]

플라스미드 pJDB 207/GAPDL-I-UPA의 작제(제10도)

GAPDH-D 프로모터, PHO5 시그널 서열, 우로키나제의 암호화 서열 및 PHO5 전사 터미네이터를 포함하는 직렬 배역을 효모의 셔틀 벡터 pJDB 207내로 클로닝시킨다.

20㎍의 플라스미드pJDB 207/PHO5-I-UPA를 Bgl Ⅱ 및 Sall으로 분해시킨다. 생성된 2개의 단편을 트리스-아세테이트 완충액(pH 8.2)중의 0.8% 아가로즈겔상에서 분리시킨다. 7.6kb 및 1.1kb Bgl Ⅱ-Sall 단편이 분리된다. 1.1kb 단편을 DraI 좀더 분해시킨다. 페놀/크로로포름으로 추출하고 에탄올로 침강시킨후, DNA 3.5pmole을, ATG 앞에 EcoRI 부위 및 8개 뉴클레오타이드의 PHO5 5'비암호화영역 및 Dral 인지서열의 일부와 함께, 100배량의 하기 염기서열을 갖는 인산화되고 어닐링된 올리고데스옥시리보뉴클레오타이드 링커와 연결시킨다 :

5'-AATTCGATTACCAATGTTT-3'

3'-GCTAATGGTTACAAA-5'

15℃에서 16시간동안 연결시킨 후 리가제를 불활성화시키고, 과량의 링커를 300mM 나트륨 아세테이트(pH 6.0) 및 10mM EDTA의 존재하에 이소프로판올(0.54 용량)로 침강시켜 제거한다. DNA를 Bgl Ⅱ 및 EcoRI로 분해시킨다. 326 bp EcoRi-Bgl Ⅱ 단편을 분리한다.

플라스미드 p31 GAPDL-IT를 Sall 및 EcoRI으로 분해시킨다. 0.75kb Sall-EcoRI 단편을 분리한다.

DNA 단편을 전기용출시켜 아가로즈겔로부터 분리시키고 DE 52 크로마토그래피로 정제한 다음 에탄올로 침강시킨다. 0.75kb SalI-EcoRI 단편 0.2 pmole, 326bp EcoRI-Bgl Ⅱ 단편 0.4pmole 및 7.6kb SalI-Bal Ⅱ 벡터 0.1pmole을 15℃에서 5.5시간 동안 연결시킨다. 1㎕의 연결혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB101 CA⁺⁺세포를 형질전환시킨다.

10개 amp^R형질전환체를 생장시키고 플라스미드 DNA를 제조한다. 플라스미드 DNA를 EcoRI 제한효소로 분석한다. 예상된 제한패턴을 갖는 한 개 클론의 플라스미드 DNA를 pJDB 207/GAPDL-UPA로 명명한다.

유사한 방법으로, 플라스미드 pJDB 207/GAPFL-UPA 및pJDB207/GAPEL-

UPA를 작제한다.

[실시예 10]

삭카로마이세스 세레비지애 균주 S 288C에 5㎍/㎖ 지몰라제 100,000단위/㎍를 37℃에서 20분동안 처리하여 세포벽을 분해시킨 다음 세포를 2% SDS로 용해시켜 2μ의 공유결합으로 폐환된 원형 DNA를 분리한다. 이어서, EDTA를 25mM의, 염화세슘에 1.5g/㎖의 최종밀도로, 및 브롬화 에티듐을 1㎎/㎖로 가한다음 전체를 초원심분리 튜브에 옮긴다. 플라스미드 DNA를 15℃하에 42000rpm으로 42시간 동안 초원심분리하여 염색체 DNA로부터 분리시킨다. 2μ의 플라스미드 DNA를 시린지를 이용하여 구배로부터 절단한다. NaCl 포화 이소프로판올로 브롬화 에티듐을 제거하고 마지막으로 에탄올로 플라스미드 DNA를 침강시킨다. 이어서, 정제된 플라스미드 DNA를 PstI으로 직선화하고 pUC 19의 PstI 부위[J. Norrander et al., Gebe 26, 101 (1983)]내로 클로닝시켜 플라스미드 pDP 31을 수득한다. 플라스미드 pJDB 207을 효소 KpnI 및 HpaI로 분해시킨다. 생성된 0.55kb 단편을 정제하고 플라스미드 pUC 7/LEU2[플라스미드 pUC 7(J. Viera et al., Gene 19, 259(1982)]의 SalI 부위내로 클로닝된 효모 게놈성 2.2kb XhoL-SalI LEU2 유전자(A.Andreadis et al., Cell 31, 319 (1982)]을 포함한 플라스미드]의 4.25kb KpnI-HpaI 단편내로 클로닝시킨다. 이에 의해 플라스미드 pJDB 207에서와 같이 본래의 2μ/LEU2 융합체가 LEU2 유전자+완전한 터미네이터의 앞에 위치하는 플라스미드 pDP30이 수득되었다. pDP30을 HpaI 및 SalI으로 분해시키고 완전한 LEU2 유전자가 포함된 1.85kb 단편을 정제하고 플라스미드 pDP31의 8.7kb HpaI-SalI 단편내로 클로닝시킨다. 생성된 플라스미드 pDP33을 50㎍/㎖ 브롬화 에티듐의 존재하에 HInd Ⅲ으로 직선화되고[M. Oesterlund et al, Gene 20, 121 (1982)] URA3 유전자[M. Rose et al, Gene 29, 113 (1984)]가 포함된 1.17kb HInd Ⅲ 단편과 연결시킨다. 이것으로 이. 콜라이 균주 pyrf[참조 : 상기한 M. Rose et al.]를 형질전환시켜 URA 3 유전자의 양성 삽입물을 선택한다. 이에 의해 플라스미드 pDP34를 수득한다. pDP34를 효소 SphI으로 분해시킨다. 8.4kb 단편을 정제하고 자가 연결시켜 플라스미드 pDP38을 수득한다.

[실시예 11]

플라스미드 pDP 38/GAPDL-I-UPA 및 pDP 38/GAPDL-UPA의 작제

벡터 pDP 38(실시예 10 참조)은 LEU2 및 URA 3 유전자, pBR 322의 서열 및 효모의 2μ DNA의 일부를 포함한다. 플라스미드 pDP 38을 BamHI으로 직선화한다. 생성된 점착 말단을 클레노우 DNA 폴리머라제(상기한 Maniatis et al., p. 113 상기)와 반응시켜 채운다. DNA를 SalI으로부터 좀더 분해시키고 거대한 8.4kb 단편을 분리한다.

10㎍의 플라스미드 pJDB 207/GAPDL-I-UPA를 10㎍/㎖의 브롬화 에티듐의 존재하에 37℃에서 28분 동안 Hind III(1단위/μg DNA)로 부분분해시킨다. EDTA를 10mM의 최종농도로 가하여 반응을 정지시킨다. DNA의 점착말단에 클레노우 DNA 폴리머라제를 반응시켜 채운다. DNA를 SalI으로 좀더 분해시킨다. 2.2kb SalI-[Hind Ⅲ]/평활 말단 단편을 분리한다.

정제된 DNA 단편을 연결시키고 이를 사용하여 이. 콜라이 HB 101 CA⁺⁺세포를 형질전환시킨다. 24개 amp^R콜로니를 생장시킨다. 플라스미드 DNA를 제조하고 EcoRI 및 SalI/Hind Ⅲ 제한 효소로 분석한다. 예상된 제한 단편을 갖는 한개 클론의 플라스미드 DNA를 pDP 38/GAPDL-I-UPA로 명명한다.

유사한 작제방법으로, pJDB 207/GAPDL-UPA를 Hind Ⅲ로 완전히 분해시키고, 클레노우 DNA 폴리머라제와 반응시킨 다음 SalI으로 분해시킨 후 2.2kb SalI-[Hind Ⅲ]/평활 말단 단편을 분리한다. 이 단편을 상술한 바와 같이 pDP 38내로 연결시킨다. 한 개의 클론을 pDP 38/GAPDL-UPA로 명명한다.

유사한 방법으로, pJDB 207/GAPEL-I-UPA, pJDB 207/GAPFL-I-UPA, pJDB-207/GAPEL-UPA, 및 pJDB 207/GAPFL-UPA로부터 2.2kb SalI-[Hind Ⅲ]/평활 말단 단편을 분리한다. 정제된 단편을 pDP 38 내에 연결시킨다. 연결혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB101을 형질전환시킨다.

한 개 클론의 플라스미드 DNA는 각각 pDP 38/GAPEL-I-UPA, pDP 38/GAPFL-I-UPA 및 pDP 38/GAPFL-UPA로 명명한다.

[실시예 12]

삭카로마이세스 세레비지애 균주 HT 246 및 GRF 18의 형질전환

삭카로마이세스 세레비지애 균주 HT 246(leu 2~3, leu 2~112, prb)[Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. UPA 75, 1929 (1978)]에 기술된 형질전화 초안에 따라 다음의 플라스미드로 형질전환시킨다. :

pJDB 207/PHO5-UPA

pJDB 207/PHO5-I-UPA

pJDB 207/PHO5-SSUPA

pJDB 207R/PHO5-UPA

pJDB 207/GAPDL-UPA

pJDB 207/GAPFL-UPA

pJDB 207/GAPDL-I-UPA

형질전환된 효모세포를 루이신이 결핍된 효모의 최소배지 평판상에서 선별한다. 단독의 형질전환된 효모 클로니를 분리하고 이들은 다음으로 간주된다.

삭카로마이세스 세레비지애 HT 246/pJDB 207/PHO5-UPA

삭카로마이세스 세레비지애 HT 246/pJDB 207/PHO5-I-UPA

삭카로마이세스 세레비지애 HT 246/pJDB 207/PHO5-SSUPA

삭카로마이세스 세레비지애 HT 246/pJDB 207R/PHO5-UPA

삭카로마이세스 세레비지애 HT 246/pJDB 207/GAPDL-UPA

삭카로마이세스 세레비지애 HT 246/pJDB 207/GAPFL-UPA

삭카로마이세스 세레비지애 HT 246/pJDB 207/GAPDL-I-UPA

유사한 방법으로, 삭카로마이세스 세레비지애 균주 GRF 18(DSM 3665)를 상기 언급된 플라스미드로 형질전환시킨다. 생성된 형질전환 효모 균주를 다음과 같이 칭한다.

삭카로마이세스 세레비지애 GRF 18/pJDB 207/PHO5-UPA

삭카로마이세스 세레비지애 GRF 18/pJDB 207/PHO5-I-UPA

삭카로마이세스 세레비지애 GRF 18/pJDB 207/PHO5-SSUPA

삭카로마이세스 세레비지애 GRF 18/pJDB 207R/PHO5-UPA

삭카로마이세스 세레비지애 GRF 18/pJDB 207/GAPDL-UPA

삭카로마이세스 세레비지애 GRF 18/pJDB 207/GAPFL-UPA

삭카로마이세스 세레비지애 GRF 18/pJDB 107/GAPDL-I-UPA

[실시예 13]

삭카로마이세스 세레비지애 균주 HT 350의 형질전환

삭카로마이세스 세레비지애 균주 HT 350은 균주 HT 350의 유전형 (α, his 3~11. his 3~15, leu 2~3, leu 2~112, ura 3, prb, pep 4~3)을 생성하는 삭카로마이세스 세레비지애 HT 285의 형질전환 (α, his 3~11. his 3~15, leu 2~3, leu 2~112, ura 3, pep 4~3)와 같은 ura-3 결핍 균주와 균주 삭카로마이세스 세레비지애 균주 HT 246을 교배시켜 수득한다. 균주 350을 상기한 Hinnen 등의 형질전환 초안에 따라 각각 플라스미드 pDP 38/GAPDL-I-UPA, pDP 38/GAPFL-I-UPA, pDP 38/GAPEL-I-UPA, pDP 38/GAPDL-UPA, pDP 38/GAPFL-UPA 및 pDP 38/GAPEL-UPA로 형질전환시킨다. 형질전환된 효모세포를 우라실이 결핍되고 루이신이 보충되어 효모의 최소 배지 평판상에서 선별한다. 단독의 형질전환 효모 콜로니를 분리하고 이들은 다음으로 명명한다.

삭카로마이세스 세레비지애 HT 350/pDP 38/GAPLD-I-UPA

삭카로마이세스 세레비지애 HT 350/pDP 38/GAPFL-I-UPA

삭카로마이세스 세레비지애 HT 350/pDP 38/GAPEL-I-UPA

삭카로마이세스 세레비지애 HT 350/pDP 38/GAPDL-UPA

삭카로마이세스 세레비지애 HT 350/pDP 38/GAPFL-UPA

삭카로마이세스 세레비지애 HT 350/pDP 38/GAPEL-UPA

[실시예 14]

형질전환 효모 균주의 발효

삭카로마이세스 세레비지애 HT 246/pJDB 207/PHO5-UPA, 삭카로마이세스 세레비지애 HT 246/pJDB 207/PHO5-I-UPA 및 삭카로마이세스 세레비지애 HT 246/pJDB 207R/PHO5-I-UPA은 전체 길이의 PHO5 프로모터를 갖는 플라스미드를 함유하며 scu-PA의 발현을 위해 프로모터의 탈억제를 필요로 한다. 삭카로마이세스 세레비지애 HT 246 형질전환체의 세포를 각각 50㎖ 삼각 플라스크내의 효모 최소 배지(아미노산이 없고 2% 글루코즈와 20㎎/g L-히스티딘이 첨가된 디프코 효모 질소 최소 배치) 10㎖ 중에서 5 내지 7×10⁷세포/㎖의 밀도체 도달될때까지 30℃에서 24시간동안 진탕시켜 증식시킨다. 이어서 전배양물의 세포를 0.9% NaCl 중에서 세척하고 20%의 전배양 세포를, 디스코의 효모 질소 최소 배지(아미노산 결핍)의 제조방법에 따라 (NH₄)₂SO₄, 20g/ℓ 글루코즈 1g/ℓ L-히스티딘 대신에 0.03g/ℓ KH₂PO₄, 10g/ℓ L-아스파라진을 함유하도록 제조된 낮은 pi 값을 갖는 최소 배지 50㎖를 접종시킨다. 배양물을 30℃하에 180 회전/분으로 48시간 이하 동안 진탕시킨다. 수득된 최종 밀도는 1×10⁸세포/㎖(*OD 600*4~5)이다.

상이한 길이의 GAPDH 프로모터를 갖는 플라스미드를 포함한 효모 형질전환체는 구조적으로 scu-PA를 발현한다. pJDB 207-유도된 플라스미드를 함유한 상응하는 형질전환체를 효모 최소 배지 전배양물(상기함)중에서 생장시킨다. 세척된 전배양물의 20%를 다음으로 구성된 복합 주요 배양배지 50㎖에 접종시킨다. (g/ℓ) : 펩톤 5, 효모추출액 10, 글루코즈 20, 자당 40, (NH4)₂SO₄3, KH₂PO₄2, MgSO₄0.5, NaCl 0.1, CaCl₂0.1, 바이오틴 10㎍/ℓ. 30℃에서 48시간동안 200회전/분으로 배양하고 약 1×10⁹세포/㎖(*OD 600 40내지 45)를 수득한다. pDP 38-유도된 플라스미드를 함유한 상응하는 형질전환체를 우라실 선별하에 배양시킨다. 세포를 다음으로 구성된 전배양 배지중에서 30℃ 및 180 회전/분하에 24시간 동안 생장시킨다.( g/ℓ) : 카사미노산 4.5, 효모추출액 6.5, 자당 20, 글루코즈 20, (NH₄)₂SO₄3.6, KH₂PO₄1, MgSO₄0.2, CaCl₂0.013, 및 미량원소.

10%의 세척된 전배양세포를 사용하여 다음의 성분으로 구성된 선별성 배양배지 50㎖에 접종시킨다(g/ℓ) : 효모 질소 기본 배지(디프코, 아미노산 없음) 5, L-아스파라긴 7.5, 카사미노산 8.5, 메틸-에틸설포네이트 10, 아데닌 0.05, L-히스티딘 0.04, L-루이신 0.1, L-트립토판 1, Ca-판토테네이트 0.03, 글루코즈 30, 30℃ 및 200회전/분에서 48시간 동안 배양시킨 후 약 8×10⁸세포/ℓ(*OD 600 약 35)를 수득한다.

팔콘 2070 튜브에서 10분 동안 3000rpm으로 원심 분리하여 2㎖의 세포를 24시간 및 48시간 후에 각각 수거한다. 세포를 0.9% NaCl로 일회 세척하고 원심분리한다. 세포 펠렛을 용해 완충액[66mM 인산칼륨(pH 7.4), 4mM 쯔비터시약(칼바이오켐)]중에 현탁시킨다. 세포현탁액에 8g의 유리 비드(직경 0.5 내지 0.75㎜)를 가하고 현탁액을 볼텍스 믹서[사이언티픽 인스트루먼트 인코포레이티드, 미합중국]상에서 4 내지 5×2분의 속도로 진탕시킨다. 90% 이상의 세포가 이 방법에 의해 마쇄된다. 세포 조각 및 유리 비드를 4℃에서 3000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 침전시킨다. 생물학적 활성을 시험하기 바로 직전, 상등액을 0.1M 트리스-HCI(pH 7.4), 0.05% 트윈 80, 0.1% 소의 혈청 알부민중에서 500배 이하까지 희석시킨다.

[실시예 15]

생물학적 활성의 측정

scu-PA의 아미드분해 활성은 카비(Kabi-Vitrum, 스웨덴 스톡홀름) 합성 트리펩타이드 색소원 기질 S-2444(Pyro-Glu-Gly-Arg-pNA)를 사용하여 직접 측정할 수 있다. Lys 158 및/또는 Lys 136에서 절단된 tcu-PA의 양을 측정하기 위한 검정은 제조업체의 추천(플라스미드 활성화 없음)에 따라 수행한다. scu-PA는 아미드분해 활성을 측정하기 전에 플라스민 활성화를 필요로 하여 직접 검정법에 있어서 하기 변형을 초래한다. 100㎕ scu-PA 함유 샘플(실시예 14 참조)를 37℃에서 60분 동안 0.01μ 인간 플라스민(베링거 만하임, 독일연방공화국)과 함께 예비배양시킨다. 5 i.u. 아프로티닌(베링거 만하임, 독일연방공화국)을 가하고 혼합물을 100m 온도에서 10분간 더 배양한 다음 색소원 기질 S-2444(상기함)를 가한다.

활성 정량은 WHO 우로키나제 표준물과 비교하여 수행하고(로트 66/46) 국제단위(I.U.)로 나타낸다. 시판용 제제 유키단

(Serono, 독일연방공화국 프라이부르그)에 따라, 인간 뇨로부터 분리되어 고도로 정제된 우로키나제는 70,000~100,000 I.U./㎎ 단백질의 특이활성을 갖는다.

scu-PA 양은 또한 합성 트리펩타이드 기질 S-2251(Kabi itrum, 스웨덴 스톡홀름)을 사용하여 플라스미노겐 활성화를 통해 측정할 수 있다. 스트렙토키나제 대신에 플라스미노겐 활성체로서 scu-PA 함유 샘플을 제조업체의 추천(상기한 Kabi itrum)에 따라 검정한다.

돗트 블롯팅 방법(미합중국 리치몬드 소재의 Bio-Rad)을 사용하여 효모 바라효 브로쓰에 존재하는 항원양을 측정한다. 폴리클로날 토끼 항-인간 뇨 우로키나제 항체를 검출용으로 사용한다.

샘플을 24시간 발효물로부터 취하고 실시예 14에 기술된 바와 같이 예비처리한다. 2종류의 상이한 균주내에 존재하는 상이한 플라스미드에 의한 플라스미노겐 활성화(기질로서 S-2251) 활성을 표 1에 요약하였다.

사용된 세개의 검정법에서 측정된 활성을 비교하여 표 2에 나타내었다. 플라스미드 pJDB 207/GAPDL-I-UPA를 사용한 균주 HT 246을 48시간 발효시킨 후 수득된 총 용량 역가(배양 브로쓰 1㎖당)을 나타낸다.

이의 결과에서, DNA 작제물을 PHO5 또는 인버타제 시그널 서열과 같은 효모 시그널 서열을 포함할 경우 scu-PA가 가장 양호하게 수득되는 것으로 나타났다. 또한 상기 결과는 scu-PA는 상이한 효모 숙주 배경에서 발현함으로써 선택적인 조건(pi 저농도 최소배지 또는 우라실 선택)하에서의 발효는 OD 당 비교적 높은 특이 생산성을 초래함을 나타내준다. 플라스민 활성을 요하거나 요하지 않고 S-2444에 대해 활성을 측정하여 나타난 바와같이 발현 생성물의 약 90%가 scu-PA이다. 돗트-블롯팅은 존재하는 항원의 양이 측정된 생물학적 활성양을 현저하게 초과하지 않음을 나타낸다. 따라서, 효모 재조합 scu-PA는 천연 scu-PA와 마찬가지로 정확하게 폴딩된다.

[실시예 16]

효모세포(30ℓ 발효육즙)로부터의 scu-PA의 분리

삭카로마이세스 세레비지애 균주 HT246/pJDB 207/GAPDL-I-UPA를 히루딘의 생성을 위한 삭카로마이세스 세레비지애 균주 GRF18/pJDB 207/GAPEL-HIR의 증식방법(참조 : 유럽 특허원 제225633호)과 동일하게 증식시킨다. 세포내의 scu-PA 양(붕괴 후, 실시예 14 참조)은 기질 S-2251을 사용한 간접 아미드 분해검정법으로 측정한다.(실시예 15 참조). 48시간동안 배양한 후, 샤플 원심 분리기(프랑스 투에일 소재의 Apparelis Centrifuges)에서 원심분리하여 세포를 수득하고 동일 용량의 용해 완충액[200mM KPHO4, 0.2% 트윈 80]중에 현탁시킨다. 이어서 세포를 유리비드 마쇄기(바슬 바코펜 아크티엔게젤샤프트 KDL 소재의 Dyno-Mill; 4500rpm, 18ℓ/h)에서 붕괴시킨다. 현탁액을 150mM NaCl, 0.05% 트윈 80으로 5회 희석시키고 0.6% 폴리에틸렌이민의 존재하에 4℃에서 웨스트팔리아 분리기 SB7-47로 원심분리하여 세포조각을 침전시킨다. 약간 혼탁한 상등액을 제타포 카드리지(기공 너비 0.22㎛)에 통과시켜 여과하고 1N HCI을 가하여 pH를 6.05로 조정한다. 침전된 효모세포 ㎏당 양이온 교환기 S-세파로즈 패스트 플로우(파머시아) 1ℓ를 가하고 현탁액을 4℃에서 1시간 동안 교반시킨다. 이어서, 비드를 직경 9㎝의 칼럼에 옮겨 50mM 인산나트륨(pH 7.0), 150mM NaCl, 0.05% 신페로닉으로 세척한다. 250mM NaCl이 함유된 동일 완충액을 사용하여 scu-PA를 30㎖/분의 유속으로 용출시킨다. scu-PA가 함유된 분획(직접 아미드 분해 검정법으로 측정 ; 실시예 15 참조)에 콘카나발린 A 세파로즈(파마시아)를 가하고 (0.2㎎ scu-PA당 1㎖ 겔), 현탁액을 4에서 45분 동안 교반시킨다. 1M NaCl, 10mM 인산나트륨(pH 7.0), 0.05% 신페로닉으로 세척한 후, 비드를 직경 4.4㎝의 칼럼에 옮겨 0.8M 메틸-α-D-만노피라노시드, 150mM NaCl, 20mM 나트륨 아세테이트(pH 4.0), 0.05% 신페로닉을 사용하여 1ℓ/h의 유속으로 scu-PA를 용출시킨다. scu-PA가 함유된 분획에, 안티우로키나제 IgG-세파로즈[인간 뇨 우로키나제에 대해 발생되어 정제된 폴리클로날 토끼 항체(IgG-분획)]를 가한 다음 현탁액을 4℃에서 45분 동안 교반시킨다. 그런 다음, 비드를 직경 2.2㎝의 컬럼에 옮겨 1M NaCl, 10mM 인산나트륨(pH 7.0), 0.05% 신페로닉으로 세척한다. 0.1M 글라이신-HCI(pH 2.4), 0.05% 신페로닉을 사용하여 1㎖/분의 유속으로 scu-PA를 용출시킨다. scu-PA가 함유된 분획에 1N NaOH를 가하여 pH를 6으로 조정한다.

이 단계에서, 직접 아미드분해 검정법(실시예 15 참조)에 의해 확인된 바와같이 총활성중 약 25 내지 30%가 tcu-PA로 이루어진다.

항체 칼럼으로부터의 배출물을 50mM 인산나트륨 (pH 6.0), 0.05% 신페로닉으로 평형된 모노 S 칼럼(1㎖ 베드 용적; 파마시아)에 가한다. 평형완충액으로 세척한 후, 평형완충액 및 50mM NaCl 50mM 인산나트륨(pH 7.0), 0.05 신페로닉으로 구성된 완충액 B의 단계별 구배를 사용하여 1㎖/분의 유속으로 scu-PA를 용출시킨다. 이의 용출에 의해, 두 종류의 활성 피크가 관찰되며, 한종의 피크는 완충액 B의 30%인 제1단계에서 용출된 것이며 다른 피크는 완충액 B의 50%인 제2단계에서 용출된 것이다. 직접 아미드분해 검정법에 의해 30% B에서 용출된 분획은 상당량의 tcu-PA를 나타낸 반면에 55% B에서 용출된 분획은 1 내지 3% tcu-PA정도의 적은 양으로 나타내는 것으로 밝혀졌다.

이 방법에 의해 생산된 효모 scu-PA를 비-환원 조건하의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 약 51KD 분자량의 단독밴드로서 이동한다. 수득된 scu-PA는 직접 아미드분해 검정법(실시예 15 참조) 및 환원 조건하의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정한 결과 약 95% 이상의 순도를 갖는다.

[실시예 17]

효모 scu-PA의 당화 상태

겔 전기영동후 I-콘카나발린 A 오벌이(overlay)검정법으로 당화를 측정한다. 콘카나발린 A는 만노즈 잔기를 특이적으로 인지하는 식물성 렉틴이다. 효모로부터 정제된 scu-PA 뿐만 아니라 u-PA 표준 유키단

(독일연방공화국 프라이부르그 소재의 Serono)을 10% 겔상에서 겔 전기 영동시킨다. 이어서, 단백질을 30분 동안 7% 아세트산 중의 겔에 고착시킨다. 겔을 하기 성분으로 조성된 렉틴 완충액 중에서 세척한다 :

0.15M NaCl

50mM 트리스-HCI(pH 7.4)

0.5mM CaC₂

0.5mM MnC₂

pH가 약 7.3에 도달할때까지 계속해서 세척한다. 이어서, 겔을 3㎎ 헤모글로빈, 100㎍ 콘카나발린 A 및 2μCi¹²⁵I-콘카나발린 A가 함유된 2ml 렉틴 완충액으로 조심시럽게 덮는다. 한편, 다른 동일한 겔을 상기 완충액에 0.2 Mα-메틸-만노시드가 보충된 혼합물로 덮는다. 습도조절된 방에서 3시간 배양한 후, 겔을 렉틴 완충액중에 세척하고 건조시킨 다음 X-선 필름에 노출시킨다. α-메틸-만노시드 없이, 유키단

및 효모 scu-PA는 둘다¹²⁵I-콘카나발린으로 염색시킨다. 이들의 분자량은 본질적으로 동일하다. α-메틸-만노시드의 존재하에, 렉틴-결합 인간 뇨 우로키나제의 경쟁적 억제제는 사라지는 반면에, 효모 scu-PA는 여전히 나타나 있다. 이것은 scu-PA는 당화되어 있으며 인간 뇨 우로키나제와 비교하여 상이한 형태로 당화되어 있음을 나타내는 것이다.

[실시예 18]

scu-PA의 추가 정제

0.05M 트리스-HCI(pH 8.0), 0.05% 트윈 80, 0.05M NaCl에 대해 투석된 scu-PA의 용액(실시예 16 참조)을 벤즈아미딘-세파로즈 칼럼(스웨덴 업살라 소재의 파마시아) 3㎖상에 로딩시키고 1M NaCl이 함유된 트리스-HCI(pH 8.0) 완충액으로 세척한다. scu-PA는 유출물(flow-thorugh) 및 세척용액 중에서 완전히 회수되는 반면에 부산물 tcu-PA는 1M L-아르기닌이 함유된 0.05M 트리스-HCI(pH 8.0) 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용출시킬 수 있다. 수득된 scu-PA는 약 98% 이상의 순도를 갖는다.

우로키나제 B-쇄의 당화 부위[Asn302]에서의 돌연변이 :

a) U-PA의 PstI-BamHI 단편을 M13mp18내로 클로닝 : 플라스미드 pJDB207/PHO5-I-UPA(실시예 3 참조)는 우로키나제의 완전한 암호영역을 포함한다. DNA를 PstI 및 BamHI으로 절단한다. 우로키나제 유전자의 886bp PstI-BamHI 단편은 뉴클레오타이드 위치 1033-1041에 당화 부위(Asn302)를 포함한다. 유사한 크기의 다른 단편을 BstE Ⅱ로 추가 절단한다. 예비 0.8% 아가로즈겔상에서 886bp PstI-BamHI 단편을 분리한다. M13mp18RF-DNA를 PstI 및 BamHI으로 절단한다. 예비 0.8% 아라로즈겔상에서 7.3kb 단편을 분리한다.

M13mp18RF-DNA를 PstI-BamHI으로 절단한다. 예비 0.8% 아라로즈겔상에서 7.3kb 단편을 분리한다. DNA 단편을 아가로즈겔로부터 전기 용출시키고 DE52 크로마토그래피로 정제한 다음 에탄올로 침강시킨다.

7.3kb PstI-BamHI 절단벡터 0.1pmole와 886bp PstI-BamHI u-PA 단편 0.2pmole을 연결시킨다. 연결 혼합물 1㎕ 및 3㎕를 사용하여 문헌[M 13 cloning and sequencing handbook published by Amersham]에 따라 이. 콜라이 JM 109 Ca²⁺세포를 형질전환시킨다. 12개의 무색 플라크를 취하고 일본쇄 DNA를 제조한다[J. Messing, Methods in Enzymology 101, 21-78(1983)]. 일본쇄 DNA를 어닐링시키고 이것에 클레노우 폴리머라제로 M13 표준 프라이머를 연결시켜 부분 이본쇄 DNA를 제조한다. 반응 생성물을 페놀/클로로포름으로 추출하고 DNA를 에탄올로 침강시킨다. DNA를 PstI 및 BamHI으로 절단한다. 886bp 단편은 u-PA 단편이 M13mp18 벡터내로 클로닝 되었을 나타낸다. 한 개 클론을 좀더 분석하고 정확한 삽입물을 서열분석으로 확인한다. 클론은 M13mp/18UPA로 명명된다.

b) 당화 부위 Asn302의 돌연변이 :

어플라이드 바이오시스템 모델 380 B 합성기 상에서 포스포르 아미다이트 방법[M. H. carcthers, in : Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments, (ed. H. G. Gassen and A. Lang) Verlag Chemie, Weinheim, Federal Reprbic of Germany]을 사용하여 돌연변이 유발원 프라이머 및 서열분석 프라이머를 합성한다.

일본쇄 주형 DNA상의 시험관내 돌연변이 유발은 문헌[T. A. Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 488-492(1985)]에 기술된 바에 따라 수행하다. 이. 콜라이 균주 RZ 1032(dut-, ung-)의 1회 생장주기에 의해 우라실-함유 일본쇄 주형 DNA가 생성된다.

100pmole의 돌연변이 유발원 올리고뉴클레오타이드 플라이머 W를 20㎕의 50mM의 트리스-HCI(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 5mM ATP 및 T₄폴리뉴클레오타이드 키나제(베링거) 20단 뒤 중에서 인산화시킨다. 37℃에서 30분 경과한후, 70℃로 10분간 가열하여 반응을 종결시킨다.

우라실-함유 M13mp18/UPA 주형 DNA 0.3pmole을 30㎕의 10mM 트리스-HCI(pH 7.5) 10mM MgCl₂중에서 인산화된 돌연변이 유발원 올리고데속시리보뉴클레오타이드 프라이머 W 10pmole 및 M13 표준서열 분석 프라이머 10pmole과 함께 배양한다. 샘플을 80℃로 가열하고 작은 수욕에서 실온으로 냉각시킨다.

c)확장-연결 반응 : 상기의 어닐링된 샘플에 1mMdNTPs 10mM 트리스-HCI(pH 8.0), 10mM MgCl₂, 20mM, 1mM ATP, T4 리가제(바이오랩스, 400μ/㎕)400단위, 클레노우 DNA 폴리머라제(베링거, 6μ/㎕) 6단위가 함유된 10㎕의 효소 -d NTP 혼합물을 가한다. 15℃에서 밤새 배양한다.

d)이. 콜라이 BMH71 세포의 형질전환 : 연결 혼합물에 TE를 가하여 200㎕로 희석시킨다. 0.1㎕, 1㎕, 10 및 μ의 확장-연결 혼합물을 컴피턴트 이. 콜라이 BMH 71Ca²⁺세포 (상기한 Kunkel)에 가한다. 빙상에서 30분 방치한 후, 세포를 42℃에서 3분 동안 열-쇼크 처리한 다음 빙상에 보관한다. 세포를 상부 한천과 이. 콜라이 JM101 지시 세포와 함께 플레이팅한다.

6개의 플라크를 위치 이. 콜라이 JM109를 감염시킨다. PEG 침강법으로 상등액으로부터 파아지를 분리한다. 일본쇄 DNA를 페놀로 추출하고 에탄올로 침강시켜 제조한다. 주형 DNA를 TE중에서 재현탁시킨다.

AAT 코돈(Asn302)의 CAA 코돈(Gln 302)으로의 돌연변이는 쇄종결정방법[F. sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 5463-67(1977)]을 사용하여 상기 언급된 서열분석 프라이머를 갖는 DNA 서열을 결정함으로써 한개 클론에 대해 확인한다. 돌연변이 결과 u-PA의 아미노산 위치 302에서 Asn이 Gln으로 치환됨으로써, 우로키나제에 한개의 당화부위가 제거된다. W는 u-PA B-쇄내의 당화 부위 돌연변이(Asn302→Gln302)를 나타낸다. u-PA 암호화 서열에서 다른 돌연변이는 발견되지 않았다. 양성클론은 M13mp18/uPA-W로서 명명된다.

[실시예 20]

[Lys135]→Gly의 돌연변이:

scu-PA의 Lys135-Lys136 결합을 단백질 분해 절단하면 저분자량의 우로키나제가 형성된다. 이 염기성 절단부위는 [Lys135]의 글라이신으로 시험관내 돌연변이에 의해 제거된다.

시험관내 돌연변이 유도방법은 실시예 19에 기술되어 있다. 돌연변이된 일본쇄 센스 본쇄를 제조한다. AAA 코돈(Lys135)이 GGT 코돈(Gly)으로 돌연변이된 여부는 M13 표준 프라이머(바이오 랩스)를 사용한 DNA 서열분석으로 확인한다. [Lys135]→Gly의 돌연변이 결과 우로키나제 A쇄 내의 단백질 분해 절단부위인 아미노산 135가 제거된다. 돌연변이된 DNA를 갖는 한개의 클론이 M13mp18/uPA-LG로 명명된다.

[실시예 21]

[Lys135]→Ser의 돌연변이:

실시예 20과 유사한 방법으로 아미노산[Lys135]를 세린으로 돌연변이시킨다.

AAA 코돈(Lys135)이 AGT 코돈(Ser)로 돌연변이된 여부는 M13 표준 프라이머를 사용한 일본쇄 주형 DNA를 서열분석함으로써 확인한다. 정확히 돌연변이된 한 개의 클론이 M13mp18/UPA-LS로 간주한다.

[실시예 22]

[Phe157]→Asp의 돌연변이 :

단일쇄 u-PA에 플라스민을 처리하여 단백질 분해시켜 Lys158-Ile159 결합이 이중쇄 u-PA로 전환시킨다. 트롬빈은 Arg156-Phe157 결합을 절단한다. 플라스민 및 트롬빈에 의한 scu-PA의 단백질분해 절단을 막기 위하여 [Phe157]을 Asp로 돌연변이시킨다.

TTT 코돈(Phe157)이 GAC 코돈(Asp157)로된 돌연변이는 M13 표준 프라이머(비오랩스)를 사용한 DNA 서열분석으로 확인한다. [Phe157]→Asp의 돌연변이에 의해 단일쇄 우로키나제내에 존재하는 트롬빈에 대한 단백질분해 절단부위인 아미노산 위치 156 및 플라스민에 의한 부위인 아미노산 위치 158이 제거된다. 돌연변이된 DNA를 갖는 한 개의 클론을 M13mp18/UPA-P로 명명한다.

[실시예 23]

M13 클론의 돌연변이 [Gln302]를 효모 발현 카세트로 전달

M13mp18/uPA-W는 우로키나제 B-쇄내에 당화 부위를 제거하는 한 개의 변형 아미노산(Gln302)를 갖는 아미노산 서열의 암호화 돌연변이 DNA 삽입체를 포함한다. 돌연변이된 DNA 단편을 효모발현 플라스미드 pJDB207/PHO5-I-UPA를 SalI 및 BamHI으로 절단한다.

플라스미드 pJDB207/PH05-I-UPA를 Sall 및 BamHI으로 절단한다.

6.6kb 벡터 단편을 분리한다. 이 단편은 u-PA 유전자의 3'부분중 뉴클레오타이드 위치 1323의 BamHI 부위(제1도) 내지 뉴클레오타이드 위치 1441(첨가된 XhoI 링커를 갖는 PvuⅡ 부위), 및PHO5 전사 종결 시그널을 포함한다.

pJDB207/PHO5-I-UPA를 SalI 및 PstI으로 분해시킨다. 1.2kb SalI-PstI 단편을 분리하고 겔로부터 전기용출시킨다. DNA 단편은 pBR322의 SalI-BamHI서열, PHO5 프로모터, 인버타제 시그널 서열 및 PstI 부위까지의 u-PA 암호화 서열을 포함한다.

간편한 DNA 분리방법(D. S. Holmes et al., Analy, Biochem. 114(1981), 193-197]으로 M13mp18/UPA-W(실시예 19 참조)를 위해 RF-DNA를 제조한다. 5㎍의 DNA를 BamHI 및 PstI으로 분해시킨다. RNase(Serva) 2μ을 가하여 5분동안 37℃에서 배양한 후, 예비 0.8% 아가로즈겔상에서 886bp PstI-BamHI 단편을 분리한다. DNA 단편을 전기용출시키고 에탄올로 침강시킨다. 단편은 우로키나제 B-쇄내의 뉴클레오타이드 위치 1033-1035(Asn302→Gln)인 돌연변이 AAT→CAA를 포함한다. 각각 0.2pmole의 1.2kb SalI-PstI 단편 및 886bp PstI-BamHI 단편과 0.1pmole의 6.6kb SalI-BamHI 벡터 단편을 연결시킨다. 컴피턴트 이. 콜라이 HB 101 Ca²⁺세포를 형질전환시킨다. 12개 앰피실린 내서 형질전환체를 증식시킨다. 플라스미드 DNA를 분리하고 EcoRI 및 HindⅢ 제한효소로 절단하여 분석한다. 당화 부위에서의 돌연변이(W)로 뉴클레오타이드 위치 1032 내지 1037의 EcoRI 부위가 파괴된다. 돌연변이 여부는 DNA 서열분석으로 확인한다. 돌연변이된 한 개의 플라스미드 DNA가 pJDB207/PHO5-I-UPA-W로 명명된다.

유사한 방법으로, M13mp18/UPA-P, M13mp18/UPA-LG 및 M13mp18/U

PA-LS의 PstI-BamHI 단편을 사용하여 각각 pJDB207/PHO5-I-UPA-P, pJDB2

7/PHO5-I-UPA-LG, pJDB207/PHO5-I-UPA-LS를 작제한다.

[실시예 24]

플라스미드 pJDB207/PHO5-I-UPA-LGP의 작제

scu-PA의 단백질 분해 절단을 방지하기 위하여, 아미노산 서열위치 135(Lys→Gly) 및 위치 157(Phe→Asp)에서 돌연변이를 결합하고 플라스미드 pJDB207/PHO5-I-LGP 내로 암호화시킨다.

플라스미드 pJDB207/PHO5-I-UPA-LG(실시예 23 참조)를 SalI 및 BalI으로 절단한다. 1.3kb SalI-BalI 단편은 PBR322의 SalI-BamHI 서열, PHO5 프로모터, 인버타제 시그널 서열 및 Gly135의 돌연변이를 갖는 BalI 부위 이하의 u-PA 암호화 서열을 포함한다.

플라스미드 pJDB207/PHO5-I-UPA-P(실시예 23 참조)를 BalI 및 BamHI으로 분해시킨다. 0.7kb BalI-BamHI 단편은 Asp157의 돌연변이를 갖는 u-PA 암호화 서열의 내부단편이다.

1.3kb SalI-BalI 단편, 0.7kb BalI-BamHI 단편 및 6.6kb SalI-BamHI로 벡터 단편(실시예 23)를 연결시킨다. 컴피턴트 이. 콜라이 HB101를 형질전환시킨다. 형질전환체의 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소 및 DNA 서열분석법으로 분석한다. 돌연변이 Gly135 및 Asp157을 암호화하는 예상된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 한 개의 클론을 선별하여 이를 pJDB207/PHO5-I-LGP로 명명한다.

유사한 방법으로, pJDB207/PHO5-I-UPA-LS의 SalI-BalI 단편을 사용하여 pJDB207/PHO5-I-UPA-LSP를 작제한다.

위치 135(Lys→Gly) 및 위치 157(Phe→Asp)에서 돌연변이를 결합하고 플라스미드 pJDB207/PHO5-I--UPA-LGP 내로 암호화시킨다.

플라스미드 pJDB207/PHO5-I-LG(실시예 23 참조)를 SalI 및 BalI으로 절단한다. 1.3kb SalI-BalI 단편은 pBR322의 SalI-BamHI 서열, PHO5 프로모터, 인버타제 시그널 서열 및 Gly135의 돌연변이를 갖는 BalI 부위 이하의 u-PA 암호화 서열을 포함한다.

플라스미드 pJDB207/PHO5-I-UPA-P(실시예 23 참조)를 BalI 및 BamHI으로 분해시킨다. 0.7kb BalI-BamHI 단편은 Asp157의 돌연변이를 갖는 u-PA 암호화 서열의 내부단편이다.

1.3kb SalI-BalI 단편, 0.7kb BalI-BamHI 단편 및 6.6kb SalI-BamHI로 벡터단편(실시예 23)를 연결시킨다. 컴피턴트 이. 콜라이 HB101를 형질전환시킨다, 형질전환체의 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소 및 DNA 서열분석법으로 분석한다. 돌연변이 Gly135 및 Asp157을 암호화하는 예상된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 한 개의 클론을 선별하여 이를 pJDB207/PHO5-I-LGP로 명명한다.

유사한 방법으로, pJDB207/PHO5-I-UPA-LS의 SalI-BalI 단편을 사용하여 pJDB207/PHO5-I-UPA-LSP를 작제한다.

[실시예 25]

[Gly135, Asp 157, Gln302]-u-PA의 암호화 플라스미드 pJDB207/PHO5-I-LGPW의 작제

u-PA의 아미노산 서열 위치 135, 157 및 302에서의 세 돌연변이를 조합하여 [Gly135, Asp157, Gln302]-u-PA를 수득한다. 이러한 신규의 우로키나제분자는 돌연변이에 의해 제거되는 단백질 분해 절단부위 위치 135(Lys→Gly) 및 157(Phe→Asp) 뿐만 아니라 당화 부위 위치 302(Asn→Gln)를 갖는다.

플라스미드 pJDB207/PHO5-I-LGPW는 우로키나제 돌연변이체를 암호화하며 이것은 다음의 방법으로 작제한다. :

플라스미드 pJDB207/PHO5-I-UPA-LGP를 SalI 및 XhoI으로 분해시킨다. 2.2kb SalI-XhoI 단편을 분리하고 아가로즈겔로부터 전기용출시킨 다음 DE52 크로마토그래피로 정제하고 에탄올로 침강시킨다. 이 DNA 단편은 PHO5 프로머터 및 u-PA 서열내에 세개의 MstI 부위를 포함한다. 3㎍의 2.2kb SalI-XhoI 단편을 MstI 3단위로 37℃에서 1시간 동안 부분분해시킨다. 예비 0.8% 아가로즈 겔상에서 반응생성물을 분리하고 1.7kb SalI-MstI 단편을 분리한 다음 겔로부터 전기용출시킨다. DNA 단편은 PBR 322의 SalI-BamHI 서열, PHO5 프로모터, 인버타제 시그널 서열, 및 뉴클레오타이드 위치 935의 MstI 부위까지의 u-PA 암호화 서열을 포함한다.

M13mp18/UPA-W(실시예 9 참조)의 RF-DNA 5㎍을 BamHI 및 MstI으로 분해시킨다. RNase(Serva) 2㎍을 가하고 37℃에서 5분간 배양한후, 예비 0.8% 아가로즈겔상에서 387bp MstI-BamHI 단편을 분리한다. DNA 단편을 전기용출시키고 에탄올로 침강시킨다. 단편은 우로키나제B-쇄내의 뉴클레오타이드 위치 1033~1035(

Asn302→Gln)에서의 돌연변이 AAT→CAA를 포함한다.

1.7kb SalI-MstI 단편, 387bp MstI-BamHI 단편 및 6.6kb SalI-BamHI 벡터 단편(실시예 23)을 연결한다. 컴피턴트 이. 콜라이 HB101을 연결혼합물의 분취량으로 형질전환시킨다. amp^R형질전환체의 플라스미드 DNA를 분리하고 HindⅢ 및 EcoRI 제한효소 및 DNA 서열분석으로 분석한다. 돌연변이 Gly135, Asp157, Gln302를 암호화하는 u-PA 삽입체의 예상된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 한 개의 클론을 선별하고 이를 pJDB207/PHO5-I-LGPW로 명명한다.

유사한 방법으로, pJDB207/PHO5-I-LSPW를 작제한다.

[실시예 26]

삭카로마이세스 세레비지애 균주 HT246 및 GRF18의 형질전환 및 형질전환 균주의 배양

삭카로마이세스 세레비지애 균주 HT246 및 GRF18을 문헌[Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929(1978)]에 기술된 형질전환 초안을 사용하여 다음의 플라스미드로 형질전환시킨다 :

pJDB207/PHO5-I-UPA-W

pJDB207/PHO5-I-UPA-P

pJDB207/PHO5-I-UPA-LG

pJDB207/PHO5-I-UPA-LGP

pJDB207/PHO5-I-UPA-LSP

pJDB207/PHO5-I-UPA-LGPW

pJDB207/PHO5-I-UPA-LSPW

형질전환 효모 세포를 루이신이 결핍된 효모의최소 배지 평판상에서 선별한다. 단독 형질전환된 효모 콜로니를 분리하고 이는 다음으로 명명된다 :

삭카로마이세스 세레비지애 HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA-W

삭카로마이세스 세레비지애 HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA-P

삭카로마이세스 세레비지애 HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA-LG

삭카로마이세스 세레비지애 HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA-LS

삭카로마이세스 세레비지애 HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA-LGP

삭카로마이세스 세레비지애 HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA-LSP

삭카로마이세스 세레비지애 HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA-LGPW

삭카로마이세스 세레비지애 HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA-LSPW

삭카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/PHO5-I-UPA-W

삭카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/PHO5-I-UPA-P

삭카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/PHO5-I-UPA-LG

삭카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/PHO5-I-UPA-LS

삭카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/PHO5-I-UPA-LGP

삭카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/PHO5-I-UPA-LSP

삭카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/PHO5-I-UPA-LGPW

삭카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/PHO5-I-UPA-LSPW

균주를 실시예 14에 기술된 방법과 유사하게 배양한다. scu-PA 돌연변이 단백질을 실시예 16 또는 18에 기술된 방법과 유사하게 분리한다.

[실시예 27]

비경구투여용 제1약제학적 조성물

정제된 scu-PA 3㎎, 만니톨 25㎎, 및 염화나트륨 45㎎을 멸균수 5㎖ 중에 용해시키고 생성된 용액을 적합한 용량의 5% 글루코즈 용액과 혼합시켜 비경구투여용 용액을 제조한다. 용액을 0.22㎛ 막필텅 통과시켜 여과로 멸균한다.

[실시예 28]

비경구투여용 제2약제학적 조성물(주사용 분산액)

169.3㎎ 대두 레씨틴(대두 포스파티드 NC 95, 제조업체 : 독일연방공화국 콜로네 소재의 Nattermann ; 순도 90 내지 96%; 지방산의 조성 : 리놀레산 61 내지 71%; 리놀렌산 4 내지 7%, 올레산 6 내지 13%, 팔미트산 10 내지 15%, 스테아르산 1.5 내지 3.5%) 및 92.7㎎ 순수한 나트륨 글리코콜레이트를 멸균수 752.5㎖ 중에 용해시킨다. 이 용액에 1N NaOH를 가하여 pH를 7.4로 조정한다. 10㎎의 동결건조된 scu-PA를 가한다. 등명액이 수득될때까지 혼합물을 교반시킨다. 용액을 0.22㎛ 막필터에 통과시켜 여과로 멸균시키고 앰플내에 충진시킨다.

실시예 27 및 28에 기술된 방법에 따라 유사하게 활성성분으로서 scu-PA 돌연변이체가 함유된 약제학적 조성물을 제조한다.

미생물 기탁

하기의 미생물 균주는 하기 소재의 도이취 삼룽 본 미크로오르가니스멘(DSM)에 기탁되어 있다 : * 데-3400 괴팅엔그리세바크스트라세 8, 및 ** 데 -3300 브라운슈바이그 마쉐로도 베그 1베(기탁일 및 기탁번호) : * 삭카로마이스세 세레비지애 HT246 : 1987년 4월 15일 : DSM4084 : ** 에스케리키아콜라이 HB101/pCS16 : 1987년 10월 23일 : DSM4294 : ** 에스케리키아콜라이 HB101/P31R/SS-TRA△2 : 1987년 10월 23일 : DSM4295 : ** 에스케리키아콜라이 HB101/pCUK176 : 1987년 10월 23일 : DSM42900 : ** 에스케리키아콜라이 JM109/pDP38 : 1988년 2월 19일 : DSM4414.

Claims (14)

1. 효모발현 조절서열, 제2DNA 서열과의 판독 프레임으로 상부에 시그널 펩타이드 서열을 암호화한 제1DNA 서열 및 완전한 우로키나제-형 플라스미노겐 활성체를 암호화한 제2DNA 서열로 구성되며 언급된 발현조절서열에 의해 전사 조절되는 DNA 단편, 및 효모 유전자의 전사 종결시그널을 포함한 DNA 서열을 포함하는 하이브리드 벡터에 의해 형질 전환된 효모균주를 적합한 영양조건하에서 배양하고, 언급된 우로키나제-형 플라스미노겐 활성체를 분리시킴을 특징으로 하여, 인간 단일쇄 우로키나제-형 플라스미노겐 활성체를 생산하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 하기한 아미노산 서열(I)의 단백질을 생산하는 방법.

   

   상기 식에서, X₁및 X₂는 각각 독립적으로 Lys이고, Y₁은 Arg이며, Y₂는 Phe이고, Y₃은 Lys이며, Z₁은 효모-특이적으로 당화된 Asn이고, Z₃는 Thr이다.
3. 제1항에 있어서, Asn³⁰²가 효모-특이적으로 당화된 천연 인간 단일쇄 우로키나제-형 플라스미노겐 활성체의 아미노산 서열을 갖는 플라스미노겐 활성체의 생산 방법.
4. 제1항에 있어서, 효모균주가 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주인 방법.
5. 효모-특이적으로 당화된 인간 단일쇄 우로키나제-형 플라스미노겐 활성체.
6. 제5항에 있어서, 삭카로마이세스 세레비지애에 대해 특이적 당화를 갖는 플라스미노겐 활성체.
7. 제5항에 있어서, 하기한 아미노산 서열(I)을 갖는 플라스미노겐 활성체.

   

   상기 식에서, X₁및 X₂는 각각 독립적으로 Lys이고, Y₁은 Arg이며, Y₂는 Phe이고, Y₃은 Lys이며, Z₁은 효모-특이적으로 당화된 Asn이고, Z₃는 Thr이다.
8. 효모 발현 조절 서열, 제2DNA 서열과의 판독 프레임으로 상부에 시그널 펩타이드 서열을 암호화한 제1DNA서열 및 완전한 우로키나제-형 플라스미노겐 활성체를 암호화한 제2DNA 서열로 구성되며 언급된 발현 조절 서열에 의해 전사 조절되는 DNA 단편, 및 효모 유전자의 전사 종결 시그널을 포함한 DNA 서열을 포함하는 효모 하이브리드 벡터.
9. 제8항에 있어서, 효모 PHO5 또는 GAPDH 프로모터를 포함하는 효모 하이브리드 벡터.
10. 제8항에 있어서, 시그널 서열이 효모 PHO5 유전자, 효모 인버타제 유전자 또는 인간 우로키나제 유전자로부터 유도됨을 포함하는 효모 하이브리드 벡터.
11. 제8항에 있어서, 효모 PHO5 유전자의 전사 종결 시그널을 포함하는 효모 하이브리드 벡터.
12. 효모 발현 조절 서열, 제2DNA 서열과의 판독 프레임으로 상부에 시그널 펩타이드 서열을 암호화한 제1DNA 서열 및 완전한 우로키나제-형 플라스미노겐 활성체를 암호화한 제2DNA 서열로 구성되며 언급된 발현 조절 서열에 의해 전사 조절되는 DNA 단편, 및 효모 유전자의 전사 종결 시그널을 포함한 DNA 서열을 포함하는 효모 하이브리드 벡터를 함유하는 형질전환된 효모 숙주.
13. 인체를 치료하기 위한 방법에서 예방제 또는 치료제로서 사용하기 위한 제5항에 따른 인간 단일쇄 우로키나제-형 플라스미노겐 활성체.
14. 치료유효량의 제5항에 따른 플라스미노겐 활성체를 약학적으로 허용하는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물.

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