KR900008950B1 - 야로위아 리포리티카 형질전환체에 의한 이종 단백질의 발현 및 분비 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

야로위아 리포리티카 형질전환체에 의한 이종 단백질의 발현 및 분비
제1도는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)균주 DL 112로부터 분리된 중첩 플라스미드 pLD 57, pLD 58 및 pLD 62의 부분 선형 제한 지도이다.
제2도는 XPR2유전자에 대한 합성 올리고 뉴클레오타이드 프로브(probe)이다[여기에서, 완전프로테아제의 첫번째 25개의 아미노산 잔기 대부분에 대한 공개된 서열로부터(참조 : Ogrydziak et al.,1982, J. Gem. Microbiol.128,1225), 2개의 영역 표지 Ⅰ및 Ⅱ는 32배 이하의 축퇴에 의해 14-머(mer) 올리고 뉴클레오타이드 프로브를 작제할 수 있다는 가능성을 제공한다.
2개의 영역은 각각 아미노산 7 및 18에서 시작한다. 4개의 상이한 8배 축퇴 혼합 프로브는 각각의 영역에 대해 제조되며 도면에서 볼 수 있는 바대로 170과 186 사이에서 번호를 매겼다. 도면에서 볼 수 있는 예상된 헥산 서열에서, "X"는 4개의 염기 모두를 의미하며, "U"는 퓨린 염기 둘다를 의미하며, "Y"는 피라미딘 염기 둘다를 의미한다].
제3도는 프로모터(promoter), 프리(pre)(-157 내지 -136), 프로(pro) 1(-135 내지 198), 프로 2(-97 내지 1), 세포의 알칼리성 프로테아제(alkaline extracellular protease) 및 터미네이터(terminator) 서열을 보여주는 XPR2 유전자의 뉴클레오 타이드 서열이다.
제4도는 터미네이터 벡터 pterm 4의 작제 순서이다.
제5도는 플라스미드 pLS -3의 작제 순서 및 제한 지도이다.
제6도는 플라스미드 pXX -33의 작제 순서 및 제한 지도이다.
제7도는 플라스미드 pXX -22의 작제 순서 및 제한 지도이다.
제8도는 플라스미드 pXX -11의 작제 순서 및 제한 지도이다.
제9도는 인체 아나필라톡신(anaphylatoxin) C5a의 아미노산 서열이다.
제10도는 플라스미드 pC5a -48의 제한 지도이다.
제11도는 플라스미드 pC5aX -3의 작제 순서 및 제한 지도이다.
제12도는 LEU2 유전자의 뉴클레오타이드 서열이다.
제13도는 플라스미드 pLX-34의 작제 순서 및 제한 지도이다.
본 발명은 효모 단백질 분비 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 포유동물 단백질(예 : 프로키모신) 및 다른 폴리펩다이드의 발현 및 분비를 위해 코드화하는 이종 DNA로 이루어진 재조합 야로위아 리포리티카 클로닝 비히클(cloning vehicles); 및 야로위아 리포리티카 유전자 프로모터(예 : XRR2 또는 LEU2), 알칼리성 프로테아제 시그널(또는 프리)서열, 프로영역, 및 XPR2 터미네이터 영역으로 이루어진 발현 벡터, 및 유전 코드의 축퇴(degeneracy) 또는 다른 야로위아 리포리티카 유전자 성분의 사용으로 생성된 그의 변종(variant) 또는 작용성 등가물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 발현 및 분비 벡터를 함유하는 효모형질전환체, 그들의 본래의(native)작용성 상태에서 이종 단백질을 생성하는 그들의 용도; 및 상기 사항을 수행하는 방법에 관한 것이다.
본원을 미합중국 특허원 제789,206호(1985. 10. 18출원)의 연속출원이다.
공업용(예 : 프로레닌, 소의 성장 호르몬) 또는 의약 목적(예 : 우로가스트론, 조직 플라스미노겐 활성화제, 인체 아나필라톡시 C5a) 및, 특히 쉽게 재생가능한 작용성 형태에서 고질(high quality)의 생성물을 제공하는 공급원에 유용한 여러종류의 단백질 또는 폴리펩타이드의 확실하고 충분한 공급의 경제적인 이점으로 많은 연구자들은 "공장 규모(factories)"로 이종 단백질을 생성하도록 미생물에 재조합 DNA 기술을 적용하고 있다.
광범위한 연구는 재조합 숙주 세포에서 세포내축적으로부터, 특히 에스케리키아 콜라이(Escherichiacoli)로부터의 생물학적 활성 형태에서 외생 또는 이종(외래) 단백질을 회수하는데 부닥치는 문제점에 대한 효과적인 해결책으로서 단백질 분비에 집중하고 있다. 이, 콜라이에서, 이종 단백질은 종종 굴절성 봉입체의 형태로 세포내에 생성된다.
상기 단백질은 일반적으로 수용해성이 낮으며 생물학적 활성은 거의 없거나 전혀 없다. 굴절성 봉입체로부터 상기 단백질의 추출은 일반적으로, 비용이 많이들며 원하는 본래의 생물학적 활성 형태로 단백질을 거의 회수할 수 없거나 전혀 회수할 수 없는 거친 화학적 처리를 포함한다. 또한, 이, 콜라이로부터 생성된 원치않는 물질로 상기 단백질이 오염될 가능성은 굴절성 체를 방출시키기 위해 세포를 파괴시켜야 하는 문제로 인하여 심화된다. 이, 콜라이 이외의 다른 유기체도 역시 불용성 세포내 형태의 이종 단백질을 생성한다. 예를 들어, 영국 특허 제2,091,271호(1982년 7월 28일 공개)에는, 사카로마이세스 세레비지애(S.cerevisiae)를 재조합 DNA 기술로 유전적으로 변형시켜 송아지의 레닌 또는 키모신(이들 용어는 본 명세서에서는 상호 교환적으로 사용된다)을 발현시킴에 관한 내용이 기술되어 있다. 이들 어려운 문제로, 숙주 유기체로부터 상기 단백질의 분비는 본래의 활성 배위에서 단백질을 생성 하고자 하는 시도로 바뀌고 있다.
주어진 유기체로부터 분비되는 이종 단백질을 포함한 특정 단백질, 또는 폴리펩타이드는 단백질에 따라 달라짐이 명백하다. 대부분의 진핵 세포에서, 일부의 단백질, 또는 폴리펩타이드는 단백질에 따라 달라짐이 명백하다. 대부분의 진핵 세포에서, 일부의 단백질 합성 장치는 원형질 내부 세망 막(endoplasmic reticulum membrane), 및 단백질을 막에 가교되게 유도하는 초기 폴리펩타이드 쇄의 아미노 말단 근처의 아미노산 서열(소위 "시그널 서열")에 연관되어 있다. 시그널 서열은 계속해서 활성이 있는 완전 단백질을 제공하는 분비 과정 동안 단백질 분해적으로 절단된다. 여러 가지 시도로 미생물[예 : 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevistae)], 및 배양물중의 포유동물 세포에서 시그널 서열을 사용하여 이종 단백질을 분비시키는 방법이 발달되었다. 그러나, 상기 유기체는 이상적이라고는 입증되지 않았다.
바실러스 서브틸리스의 고유의 특성(예 : 분비된 이종 단백질을 분해시키는 경향이 있는 수 많은 프로테아제를 포함한 많은 단백질의 분비 : 이종 DNA의 손실로 생성된 형질전환된 균주의 불안전성)은 바실러스 서브틸리스의 개발을 방해하고 있다.
포유동물 세포는 유전적으로 처리되어 이종 단백질을 발현시키고 분비하는 데에는 성공적이지만, 이들 계는 기술적인 면을 필요로 하며 작동에 비용이 많이들고 생성물로서의 대부분의 단백질을 상업적으로 생성함에 있어 비실용성 문제가 남아 있다.
단백질 분비에 관한 연구가 바이러스 서브틸리스를 사용하는 경우보다 사카로마이세스 세레비지애를 사용하는 경우 더욱 성공적이지만, 사카로마이세스 세레비지애도 단백질 분비 계로서는 약간의 고유의 한계점을 가지고 있는 것으로 나타났다. 유럽 특허원 제0123544호(1984년 10월 31일 공개)에는, 사카로마이세스 세레비지애 알파-인자 유전자의 분리; 및 세포 배양에 따라 별도의 완전 단백질을 생성할 수 있는 효모 세포의 형질전환을 위해 플라스미드에서 효모에 대해 이종인 단백질을 코드화하는 DNA와 함께 그의 프로모터 및/또는 시그널 펩타이드 부위를 사용함에 관한 내용이 기술되어 있다.
유럽 특허원 제0088632호(1983년 9월 14일 공개)에는, 사카로마이세스 세레비지애에서 이종 단백질을 발현시키고 분비하는 방법이 기술되어 있다. 그러나, 사카로마이세스 세레비지애가 이들 및 다른 분비 계로 효과적으로 분비하는 단백질의 크기는 약 20,000달톤으로 한정된다. 분비유기체로서 사카로마이세스 세레비지애의, 이 일반적인 비효율성의 극복은 하기 문헌에 기술된 바와 같이 다중 돌연변이 교번(alternation)을 필요로 한다[참조 : Smith et al., Science 229; 1219-1224(1985)]. 이 경향의 한 예외는 20,000 이상의 아스퍼질러스(Aspergillus)효소가 확실회 사카로마이세스 세레비지애에 의해 분비될 수 있지만, 이들 효소가 사카로마이세스 세레비지애에 의해 고도로 글리코실화 되어 분비의 효율성에 영향을 미칠 수 있다는 점에 관한 관찰이다.
야로위아 리포리티카(공업적으로 중요한 효모 종)에서 특히 중요한 잔기는 시트로산 및 단일 세포 단백질(single cell protein)을 생성하는데 사용된다. 이것은 또한 에리트리톨(erythritol), 만니톨(mannitol) 및 이소프로필말산을 생성하는데도 사용된다. 사카로마이세스 세레비지애와 비교해서, 야로위아 리포리티카는 고분자량 단백질(알칼리성 프로테아제, 산성 프로테아제 및 RNAse)을 그의 성장 배지내에 효율적으로 분비하여, 본래의 상태에서 생성되는 세포를 파괴시킬 필요없이 이종 단백질을 효과적으로 회수할 수 있게 할 수 있다는 점에서, 특히 중요하고 유용하다. 또한, 야로위아 리포리티카는 극소수의 단백질을, 성장 배지에서 원하는 이종 단백질을 주요 단백질 종으로 생성하는데 효과적으로 하는 양으로 분비하여 상기 이종 단백질 생성물의 회수를 간단하게 한다.
야로위아 리포리티카는 고 농도의 세포의 프로테아제를 생성한다. 이 세포의 프로테아제는 야로위아 리포리티카에 의해 분비되는 주요 단백질이다. 특정의 프로테아제(알칼리성, 산성 또는 중성)는 사용되는 야로위아 리포리티카의 균주에 따라 달라진다[참조 : Ogrydziak et al., J.Gen.Microbiol.(1982)128, 1225-1234]. 세포의 알칼리성 프로테아제의 N-말단 아미노산 서열의 부분 서열 분석은 하기 문헌에 기술되어 있다[참조 : Ogrydziak et al., (loc.cit)].
계류중인 미합중국 특허원 제634,505호(1984년 7월25일 출원)에는, 야로위아 리포리티카의 형질전화방법, 및 돌연변이를 보충시켜 야로위아 리포리티카 유전자를 클로닝시키는 방법이 기술되어 있다. 상기 특허원에는 분비된 알칼리성 프로테아제를 코드화하는 XPR2 유전자를, 야로위아 리포리티카의 Xpr2 돌연변이의 보충으로 클로닝시킴에 관한 내용이 기술되어 있다. 이 방법에서는 벡터 PLD40에 야로위아 리포리티카 유전자 도선과의 Bgl Ⅱ부분 분해물로 숙주인 야로위아 리포리티카를 형질전환시키는 방법도 포함된다[참조 : 유럽 특허원 제0138508호(1985년 4월 24일 공개), 및 상기 미합중국 특허원의 상응부].
본 발명은 야로위아 리포리티카 숙주에 도입되는 경우 상기 숙주에, 공급원으로부터, 특히 진핵 및 합성 DNA로부터의 이종 DNA에 의해 코드화되는 특정의 단백질을 배지내에 생성하고 분비하는 능력을 부여하는 벡터; 야로위아 리포리티카 숙주의 형질전환에 적절한 플라스미드를 포함한 포유동물 단백질 및 다른 폴리펩타이드의 발현을 위해 코드화하는 이종 DNA로 이루어진 재조합 야로위아 리포리티카 클로닝 비히클, 및특히 LEU2 유전자 프로모터, XPR2 유전자 프로모터, 알칼리성 프로테아제 프리프로 영역 및 XPR2 터미네이터 영역으로 이루어진 통합(integratove)발현 벡터; 및 그들로 형질전환된 야로위아 리포리티카에서 이종 단백질을 발현시키고 분비할 수 있는 LEU2 프로모터의 하향인 XPR2 분비시그널을 함유하는 이종 코드화 서열을 갖는 발현 플라스미드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 야로위아 리포리티카의 유전적으로 변환된 세포 배양물로부터 이종 완전 단백질, 및 특히 프로레닌 및 인체 아나필라톡시 C5a를 발현 및 분비시킴에 관해 설명한다. 야로위아 리포리티카의 세포외 알칼리성 프로테아제에 대한 아미노산 서열 및 DNA 서열의 정확한 규명으로, 이종 단백질을 세포 배양물에서 생성하기 위해 재조합 DNA 기술로 발현시키고 분리시킬 수 있다는 결정이 가능하게 되었다. 프로레닌의 경우, 지모겐(Zymogen; 레닌 전구체)의 완전 형태가 발현되고 분비된다.
이제, 야로위아 리포리티카가 재조합 DNA기술로 유전적으로 변형되어, 그들의 본래의 형태에서 이종 단백질을 발현시키고 분비할 수 있는 형질전환체를 생성할 수 있음이 밝혀졌다. 이것은 분비되기를 원하는 이종 단백질의 구조성 유전자 서열에 연결된 XPR2 유전자의 시그널, 또는 시그널과 제1프로(프로1) 또는 프로서열 둘다(프로1+프로2)를 함유하는 벡터를 제조함으로써 달성된다.
유전자의 양 말단에서 조절 또는 구조성 성분을 상실한 XPR2 유전자 단편으로 이루어진 벡터 DNA의 XPR2 좌에서 통합시킴에 의해 생성된 형질전환체는, 이종 단백질 분비에 바람직할 뿐만 아니라 추정의 형질전환체를 선별하는데 사용될 수 있는 특징인 알칼리성 프로테아제를 더 이상 생성하지 않는다.
또한, XPR2 프로모터, 및 알칼리성 프로테아제 분비 시그널 서열에 대한 서열을 함유하는 벡터는 형질 전환된 야로위아 리포리티카 세포에서 이종 완전 단백질을 분비할 수 있다. 이 형태의 재조합 DNA 벡터 일부는 효모 제놈(genome)의 독립적인 통합위치에서 발현/분비를 달성할 수있다. 일반적으로, 충분한 5' 및 3' 플랭킹(flanking) DNA를 함유하는 벡터는 통합 위치에 관계없이 생성물의 발현을 제공한다.
또한 놀랍게도, pBR 322 유도 플라스미드를 야로위아 리포리티카 염색체 DNA에 통합시키면 위치-방향 통합 형질전환을 더 촉진시킬 수 있는 동종(homology)영역이 제공됨이 밝혀졌다. 이렇게 하여 pBR 322의 통합 복제본은 형질전환되는 DNA의 도입을 위한 "도킹 프랫폼(docking platform)"으로서 제공된다. pBR 322의 내재 복제본을 야로위아 리포리티카 염색체 DNA에 통합시키면, pBR 322가 본래의 야로위아 리포리티카 DNA가 아님에도 불구하고, 통합에 공지된 표적이 생성된다.
이러한 위치에 함유하는 야로위아 리포리티카 형질전환 수령체는 이러한 위치가 결여된 수량체 상에 두가지의 주요 이점; 즉, 위치-방향 통합을 위한 표적으로 제공될 공지의 서열 및 공지의 제한 지도를 갖는 영역의 존재; 및, 유입 플라스미드가 단지 원하는 유전자의 부위에만 반대인 완전한 작용성 단위 또는 유전자를 함유하는 경우, 통합 표적으로 pBR 322를 사용함에 의해 측정할 기회를 제공한다, 예를 들어, XPR2 유전자의 3'단면만을 함유하는 플라스미드가 야생형(wild type)코돈을 함유하고 XPR 2좌에서 통합되는 경우 상기 플라스미드는 XPR 2-1002 수령체를 형질전환시킬 수 있다. 그러나. 동일한 플라스미드가 완전한 작용성 단위가 결여되어 pBR 322에 통합되는 경우 상기 플라스미드는 XPR 2-1002숙주를 프로테아제 양성 표현형(phenotype)으로 형질전환시키지 않는다.
따라서, 이종 벡터 DNA에 대한 동종 영역을 함유하는 야로위아 리포리티카 형질 전환체에서, 외생 DNA로 이루어진 상기 영역은 상기 야로위아 리포리티카의 통합 형질전환 동안 수령 부위로 제공한다. pBR 322 및 그의 유도체외에, 코스미드(cosmid), 박테리오파지(예 : M 13 및 람다), 합성적으로 유도된 DNA 및 통상의 플라스미드(예 : pUC 13)를 사용하여 도킹 플랫폼을 갖는 야로위아 리포리티카 형질전환체를 생성할 수 있다.
"LEU2"프로모터 서열은 발현에 필요한 특징(featurea)을 전부는 아니라 하더라도 대부분 함유하는 ATG의 상향인 해독되지 않은 영역 상향을 의미한다.
"XPR2"프로모터 서열은 발현에 필요한 시그널(또는 프리) 서열 앞의 해독되지 않은 영역 상향을 의미한다. 또한, 프로 서열 존재 또는 부재하에 XPR2 유전자로부터의 시그널을 사용하여 XPR2 유전자의 발현 조직 이외의 야로위아 리포리티카 프로모터의 발현 조절하에 단백질을 분비시킬 수 있다. 즉, LEU2 프로모터, 및 알칼리성 프로테아제 분비 시그널에 대한 서열을 함유하는 벡터는 형질전환된 야로위아 리포리티카 세포에서 이종 완전 단백질을 분비할 수있다.
인체 상보 단백질 C5a(인체 C5a)로서 공지된 인체아나필라톡신 C5a는 생체내에서 상보활성화의 결과 생성된 생활성 폴리펩타이드 단편이다. 이것은 체액 및 세포의 면역 반응의 특정 관점을 조절함에 있어 면역 조절제(immunomodulator)로서 작용한다.
이의 주요 구조, 및 다른 아나필라톡신의 주요 구조도 밝혀졌다. 화학적, 물리적 및 생물학적 특성의 개요는 하기 문헌에 기술되어 있다[참조 : Hugli, "Complement", 발행인 : H.J.Muller-Eberhard 및 P.A.Miescher, 73 내지 99페이지, 1985, Springer-Verlag, New york].
본 분야의 숙련자라면 실질적으로 공지의 아미노산 서열을 코드화하는 이종 DNA가 본 발명에서 뮤타티스 뮤탄디(mutatis mutandi)를 이용할 수 있음을 인지할 수 있을 것이다. 본 명세서에 기술된 방법은 공지의 이종 단백질의 생성 및 분비에 뮤타티스 뮤탄디를 적용하며, 이중에서 대표적인 요소는 미합중국 특허 제4,532,207호(1985년 7월 30일 특허 허여)에 기술되어 있다. 또한, 리보뉴클레아제 및 산성 프로테아제 유전자와 같은 야로위아 리포리티카 분비 단백질의 다른 유전자는 XPR2 유전자 대신 사용되어 상기 유전자 2개 이상(예 : XPR2 유전자의 시그널 서열 및 리보뉴클레아제 유전자의 프로모터 서열)의 단편을 합하여 하이브리드(hybrid) 유전자를 생성할 수 있다.
또한, 본 발명의 범주내에 포함되는 것은 본 명세서에 기술된 DNA또는 뉴클레오타이드 서열의 작용성 등가물이다. 유전 코드의 축퇴로 특정의 코돈이 동일한 아미노산을 명시하여 동일한 단백질을 생성하는 다른 코돈으로 치환될 수 있다. 메티오닌 및 트립토판을 제외한 공지의 아미노산이 하나 이상의 코돈에 의해 코드화 될 수 있으므로, DNA 또는 뉴클레오타이드 서열은 변화될 수 있다. 따라서, XPR2 유전자의 일부 또는 전부는 합성되어 제3도에서 볼 수 있는 DNA 서열과 상당히 다른 DNA 서열을 생성할 수있다.
그러나, 코드화된 그의 아미노산 서열은 보존된다. 이러한 주어진 DNA 또는 뉴클레오타이드 서열의 작용성 교번으로 여기에 융합된 외래 DNA 서열에 의해 코드화되는 이종 단백질의 분비 및/또는 진행을 촉진시키는 기회가 제공한다. 그러므로, 유전 코드에 의해 허용되는 XPR2 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 그의 단련의 모든 변화는 본 발명내에 포함된다. 또한, 코돈을 결손시키거나 축퇴 코돈 이외의 다른 코돈으로 하나 이상의 코돈을 치환시켜 구조적으로 변형된 폴리펩타이드(그러나 이 폴리펩타이드는 변형되지 않은 DNA분자에 의해 생성된 폴리펩타이드와 거의 동일한 용도 또는 활성을 갖는다)를 생성할 수 있다. 상기 DNA 분자들간의 차이가 유전코드의 축퇴에 관련되어 있지 않더라도, 상기 2개의 폴리펩타이드는, 그들을 생성하는 2개의 DNA분자와 마찬가지로, 작용적으로 등가물이다. 이것의 가장 간단한 예를 프로레닌 A 및 프로레닌 B에서 밝혀졌는데, 프로레닌의 2개의 대립형질 형태는 프로레닌 A의 경우 286 위치에 아프파르테이트 잔기 및 프로레닌 B의 경우 상기 위치에 글리신 잔기가 존재하는 경우에만 다르다.
이 방법을 이용하여, 이종 포유동물 단백질 프로레닌 및 인체 아나필라톡신 C5a의 발현 및 분비는 야로위아 리포리티카에서, 야로위아 리포리티카 XPR2 및/또는 LEU2 유전자로부터의 발현 및 분비 시그널을 사용하여 성취할 수 있다. 프로레닌 및 인체 아나필라톡시 C5a에 대한 DNA 서열은 합성 올리고 뉴클레오타이드를 통해 추정 위치에서 XPR2 유전자 서열에 연결되어 프로테아제 시그널 펩타이드 또는 프로테아제 전구체 진행부위(본 발명에서는 프로1 및 프로2로 표기)를 코드화하며, 상기 DNA 서열을 사용하여 유전자 구성물을 생성하여 통합 형질전환에 의해 야로위아 리포리티카에 삽입한다. 재조합 배양물은, 프로레닌 및 인체 아나필라톡신 C5a의 분자량 및 면역반응성을 갖는 성장 배지 이종 단백질에서 발현되어 배출된다. 이렇게 하여 생성된 프로레닌은, 다음 과정의 프로펩타이드의 제거로 이 프로레닌이 완전한 효소 활성을 나타내므로, 본래의 배위에서 배가되는 것으로 생각된다.
본 발명에 사용되는 "재조합 DNA물질"이란 용어에는 적어도 하기 성분중 하나로 이루어진 물질이 포함된다 : 야로위아 리포리티카의 XPR2 유전자, 그의 시그널(또는 프리), 프로 1-, 및 프로 2-(이들은 함께 프로 영역을 이룸), 프로모터 또는 터미네이터 서열; LEU2 프로모터; 및 유전 코드의 축퇴로 가능한 상기 언급한 서열의 작용성 등가물, 상기 재조합 DNA물질의 대표적인 것은 상기 언급한 서열의 일부 또는 전부를 함유하는 DNA 단편, 플라스미드 또는 벡터 또는 형질 전환체이다.
[물질]
제한 엔도뉴클레아제 및 T4리가제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 사 제품이고, 세균성 알칼리성 포스파타제는 베데스다 리서치 래보러토리스(Bethesda Reseach Laboratories)사 제품이며, T4폴리뉴클레오타이드 키나제는 PL-바이오케미칼스(PL-Biochemicals)사 제품이고, [감마-32P]ATP는 뉴 잉글랜드 뉴클리어(New England Nuclear)사 제품이다. 모든 효소는 공급자가 추천하는 조건하에서 사용한다.
[배지]
GPP배지-(1l당)하기 성분들이 함유되어 있는 글리세롤/프로테오스-펩톤 배지 : 40mM-인산염 완충액(pH 6.8)중의 글리세롤 6.7ｇ, 디프코 프로테오스-펩톤 1.6ｇ, 아미노산 및 황산 암모늄이 존재하지 않는 디프코 효모 질소 염기 1.7ｇ, 우라실 30㎎ 및 0.5㎖/ℓ폴리프로필렌 글리콜 분자량 2000(폴리사이언스). (레닌 효소 분석에서 사용하기위해 성장시킨 배양물에 사용하는 경우 폴리프로필렌 글리콜은 생략된다). 프로테오스-펩톤은 인산염 완충액중에서 별도로 오오토클레이브시킨다.
YEPD 배지-(1l당) 하기 성분들의 함유되어 있는 효모 추출액/펩톤/댁스트로즈 배지 : 효모 추출액 5ｇ, 펩톤 10ｇ 및 댁스트로즈 20ｇ.
이 콜라이는 37℃의 LB 배지에서 성장시킨다. LB 배지는 (1l당)하기 성분들을 함유한다 : 박토트립톤 10ｇ, 박토 효모 추출액 10ｇ, 염화나트륨 10ｇ : 수산화나트륨으로 pH 7.5로 조절.
[DNA 서열 분석]
본 명세서에 기술한 여러 플라스미드로부터의 DNA 단편들은 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리시킨 다음 하기 문헌에 기술된 방식으로 서열화한다[참조: Maxam et al., Methods in Enzymology, 65, 499(1980)].
[연결방법]
절단된 벡터 플라스미드를 포함한 DNA 단편들은 원하는 성분들(정확한 짝짓기를 제공하도록 적절히 제조된 말단을 갖는 DNA단편)을 T4DNA 리가제와 혼합함으로써 연결시킨다. 벡터 및 삽입 단편 ㎍량에 대해 리가제 약10단위를 가한다. 생성된 연결 반응 혼합물을 이 콜라이 K12주 MM 294(ATCC 33625) 또는 HB101(ATCC 33694)의 적절한 세포내로 형질전환시킨다.
[화학적 합성 DNA의 제조]
제네틱 디자인(Genetic Design) 6500 (Watertown, MA) 자동조작 DNA 합성기 상에서 하기 문헌에 기술된 변형된 포스포라미디트 방법으로 합성한 다음, 6M 우레아-20% 폴리알크릴아미드 겔로부터 정제하여, 프로레닌의 8개 올리고뉴클레오타이드의 발현 및 분비용 하이브리드 유전자를 제조한다[참조 : Sinha et al., Tetrahedron Letters 24, 5843(1983)]. 상보성 올리고뉴클레오타이드 분취량을 혼합하여 서로 4℃에서 TE(10mM 트리스-염산, pH 8.0; 1mM NaEDTA)에서 밤새 어니일링시킨다. 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 분취량 (약 2㎍)을 37℃에서 반응 혼합물[70mM 트리스(pH 7.6), 10mM MgCl2, 5mM 디티오트레이톨, 5mM ATP 함유] 20㎕에서, T4폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 인산화한다.
[플리스미드 DNA의 제조]
대규모의 플라스미드 DNA는 하기 문헌에 기술된 홈즈등의 방법 및 이어서 에티디윰 브로마이드-CSCl 부력 밀도 구배 원심분리법(buoyant density gradient centrifugation)에 의해 제조한다[참조 : Holmes et al., Anal. Biochem., 114, 195-197(1981)]. 미니프레프(miniprep)량의 플라스미드 DNA는 하기 문헌에 기술된 알칼리-SDS 방법에 의해 제조한다.[참조 : Birnboim et al., NAR 1, 1513(1979)].
[프로레닌용 발현/ 분비 벡터의 제조]
일련의 상이한 제조 방식으로 최종의 발현 벡터를 수득한다. 모든 단계는 첨부 도면에 도식화하였다. 일반적으로, DNA 단편은 겔 전기영동법으로 분리하여 4℃에서 반응 혼합물[50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl2, 20mM 디티오트레이톨, 1mM ATP 및 T4리가제 200단위 함유] 20㎕중에서, 다른 단편 또는 절단된 플라스미드 DNA에 연결시킨다. DNA를 제한 엔도뉴클레아제로 부분 분해시키고자 하는 경우, 최적 절단시간은 실험적으로 확립되어 있다.
[배양액중에서 프로레닌의 확인]
발현 벡터를 함유하는 효모 형질전환체를 GPP 배지(상기 참조)에서 밤새 성장시킨다. 원심분리로 효모 세포를 제거한 후, 50% TCA 1㎖를 배양액 각 5㎖ 분취량에 가하여, 4℃에서 60분 동안 유지시킨다. 원심분리로 펠렛을 수득하여 냉 아세톤 2㎖로 2회 세척한다. 침천된 단백질을 SDS시료 완충액 100㎕에 용해시켜 분취량을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동 시킨다[참조 : Laemmli, U.K., (1970) Nature 227, 680]. 겔 용해된 단백질을 전기영동적으로 니토로 셀룰로오즈(schleicher 및 schuell, 0.22㎛)에 옮긴 다음 프로레닌을 하기 문헌에 기술된 슬라브 겔의 면역-반점 분석으로 확인한다[참조 : Hawkes, R. et al., (1982) Anal Biochem. 119,142]. 여과기는 토끼의 항 프로레닌 항체로 도말하여 과산화 효소가 결합된 염소의 항-토끼 IｇG항체(Cappel, Malvern, Pa)와 함께 배양한다. 결합된 항체는 4-클로로-1-나프톨 및 과산화 수소를 염색하여 탐지한다.
[배양액중에서 프로레닌의 우유 응고 활성]
여러 가지 야로위아 리포리티카 형질전환체의 배양약을 하기 문헌에 기술된 방법의 수정 방법에 따라 우유 응고 활성에 대해 분석한다[참조 : Ernstrom, J.Dairy Sci. 41, 1664(1958)]. 간단히 말하자면, 분석은 활성화된 배양 상등액중에서 레닌이 완충된 탈지유를 응고시키는 필요한 시간을 측정하여, 이들 값과 정제된 표준 레닌과의 상관관계를 알아보는 것으로 이루어진다. 효모 배양물(25㎖)을 GPP배지에서 밤새 성장 시킨다. 원심분리하여 세포를 제거한 후, 배양 상등액 5㎖ 분취량을 진공하에서 동결건조시킨다. 각 동결 건조 상등액을 증류수 300㎕에 재현탁시킨다. 정제된 송아지 프로레닌의 일련의 희석액을 대조용 표준으로서 제조한다. 배지중의 프로레닌을 농축시키고 대조용은, 농 염산 약 5내지 10㎕를 가하여 pH 약 2로 만든 다음 22℃에서 1시간 동안 배양시킴에 의해 활성화한다. 탈지유는 건조 탈지유 분말(Difco) 60ｇ을 41.5mM 나트륨 아세테이트(pH 6.3) 및 13.6mM CaCl2500㎖에 가하여 4℃ 에 20분 동안 교반시킴으로써 제조한다. 기질은 제조한 후 즉시 분석에 서용한다. 각 효소 제품 60㎕ 분취량(배양 상등액 1mM와 동등)을 37℃에서 탈지유 1㎖ 분취량에 가하여, 응고시간을 기록한다.
[c5a유전자용 합성 올리고뉴클레오타이드의 제조]
c5a 구조성 유전자 합성에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 제네틱 디자인 6500 (Watertown, MA) 자동조작 DNA 합성기 상의 조절 세공 유리 지지체(controlled pore glss support)를 사용하여 하기문헌에 기술된 변형된 포스포라미디트 방법에 의해 화학적으로 제조한다[참조 : Shiha et al., 상기 참조]. 탈트리틸화를 위해 아세토니트릴중의 포화 테트라졸로 포스포라미티드를 라인 활성화함에 있어 디-에톡시포스핀 테트라졸라이드로 도말하여, 수성 요오드/THF로 산화시켜, 디클로로 메탄중의 3%(W/V) 디클로로 아세트산을 이용한다[참조 : Matteucci et al., 1981, J.Amer, Chem.Soc. 105, 3183]. 추가 사이클당 전체 시간은14분이다. 10개의 47-머(mer), 즉, 제9도의 단편 A-J는 마테치(Mateucci)등의 방법으로 차단해제하고, 0.3M 나트륨 아세테이트로부터 에탄올 침전시킨 다음, 어니일링시키기 전에 10% 폴리아크릴아미드-우레아 변성 겔 상에서 에비 겔 전기영동으로 분리시킴에 의해 98.8% 평균 수율/단계(트리틸 분석에 의해)로 수득한다.
[인체 c5a 유전자의 집결, 클로닝 및 서열화]
제9도는 원하는 단백질의 아미노산 서열 및, 인체 c5a 단백질을 코드화하는 유전자를 만드는데 필요한 합성 올리고뉴클레오타이드의 배열을 보여준다. A 및 F를 제외한 모든 올리고머는 T4는 폴리노클레오타이드 키나제를 사용하여 그들의 5'말단에서 인산화된다. 유전자의 집결은 하기 성분들을 함유하는 두가지의 주요 어니일링/연결 반응 혼합물을 포함한다; 올리고머 A, B, I, 및 J ; 및 올리고머 C, D, E, F, G, 및 H 생성된 94bp 및 141bp 이중 가닥 DNA의 단편을 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동시킨 후 분리하여 함께연결시키고, 그들의 235bp 생성물을 겔 전기영동으로 분리한다. c5a를 코드화하는 구조 유전자를 함유하는 235bp DNA 단편을 pBR 322 벡터 DNA의 EcoR I와 Hind Ⅲ 부위사이에 삽입하여 이 콜라이 K-12 균주 HB 101의 적절한 세포내에 형질전환시킨다. 6개의 형질전환체로부터 분리된 플라스미드 DNA의 제한분석으로 6개의 클톤중 5개가 정확한 크기의 EcoR I/Hind III 단편을 함유함을 알 수 있다. 이들 플라스미드 각각의 c5a유전자 영역의 뉴클레오타이드 서열은 하기 문헌에 기술된 방법으로 측정한다[참조 : Maxam et al., Methods Enzymol. 65, 499(1980)].
[이 콜라이에 대한 c5a 발현 플라스미드의 제조 및 특징화]
DNA 단편 분리방법 및 연결 반응 조건은 하기 문헌에 기술된 바와 같다[참조 : Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]. 이 콜라이 trp(트립토판) 프로모터-오퍼레이터는 원래 ptrpL 1로부터 수득된 것이다[참조 "Edman et al., (1981) Nature 291, 503], c5a 발현 플라스미드(pc5a-48)에 사용되는 trp프로모터-오퍼레이터 서열을 함유하는 360bp EcoR I 단편은 유럽 특허원 제0147178호(1985년 7월 3일 공개)에 기술되어 있는 바와 같이, 프로레닌 발현 플라스미드 pPFZ-R2로부터 분리된 것이다.
[야로위아 리포리티카 배양액중에서 c5a의 확인]
염소의 항-c5a 및 토기의 항-염소 IgG(Cappel)를 면역반점에 사용하는 것을 제외하고는, 프로레닌에 대해 상기 기술된 바와 동일한 방법으로 사용한다. 염소의 항-인체 c5a 항체는 하기 문헌에 기술된 방법으로 제조한다[참조 : Manderino et al., J,Immunol.Methods 53, 41-50(1982)].
[벡터]
pLD 40-1985년 4월 24일에 공개된 유럽 특허원 제0138508호에 기술되어 있다.
[미생물 : ]
ATCC 20774[기탁번호 : KFCC-10324, 기탁일 : 1987. 3. 4. 기탁기관 : 한국종균협회] 야로위아 리포리티카 PC 30869
ATCC 20781[기탁번호 : KFCC-10331, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회] XPR2로 형질전환된 야로위아 리포리티카 DL-112-PC-30869 형질전환체
ATCC 20776[기탁번호 : KFCC-10326, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회] 야로위아 리포리티카 DL-148. SnaBI으로 분해된 pLS-3으로 형질전환된 야로위아 리포리티카 ATCC 20688[기탁번호 : KFCC-10334, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]의 형질전환체.
ATCC 20775[기탁번호 : KFCC-10325, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회] 야로위아 리포리티카 DL-144, 절단되지 않은 pLS-3으로 형질전환된 야로위아 리포리티카 ATCC 20688[기탁번호 : KFCC-10334, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]의 형질전환체.
ATCC 20777[기탁번호 : KFCC-10327, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회] SnaB I으로 절단된 pC5aX-3으로 형질전환된 야로위아 리포리티카 PC-30869의 형질전환체.
ATCC 20778[기탁번호 : KFCC-10328, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회] SnaB I으로 절단된 pXX-11로 형질전환된 야로위아 리포리티카 PC-30869의 형질전환체.
ATCC 20779[기탁번호 : KFCC-10329,기탁일 : 1987.3.4, 기탁기관 : 한국종균협회]SnaB I으로 절단된 pXX-22로 형질전환된 야로위아 리포리티카 PC-30869의 형질전환체.
ATCC 20780[기탁번호 : KFCC-10330, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회] SnaB I으로 절단된 pXX-33으로 형질전환된 야루위아 리포리티카 PC-30869의 형질전환체.
APCC 20794[기탁번호 : KFCC-10332, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]pLD 56으로 형질전환된 야로위아 리포리티카 PC-30869의 형질전환체.
ATCC 20795[기탁번호 : KFCC-10333, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회] Nru I으로 절단된 pLX-34로 형질전환된 야로위아 리포리티카 ATCC 20794[기탁번호 : KFCC-10332, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]의 형질전환체.
이들은 부다페스트 조약(Budapest Treaty)하에 메릴랜드 록크빌 소재의 아메리칸 타입 컬취 콜렉션(ATCC)(본 특허원의 특허가 인정되면 기탁이 영구적으로 되며, 대중의 이용가능성이 쉬운 공인 기탁기관)에 기탁되어 있다. 기탁은 37CFR 1.14 및 35USC 122하에 권한이 있는 미합중국 특허 및 상표청장에 의해 결정된 자에게 본 특허원이 소송되어 있는 기간 동안, 및 본 특허원의 상응부 또는 본 특허원에 따른 다음 특허원이 출원된 나라에서는 외국 특허법에 따라 이용가능하다. 기탁된 미생물에 대한 대중의 이용가능성상의 모든 제한은 특허가 인정되면 결정적으로 제거된다.
야로위아 리포리티카 ATCC 20774[기탁번호 : KFCC-10324, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회](PC 30869로서 화이자 인코포레이티드의 배양기관에 기탁된 것과 동일)의 분류학적 연구는 하기에 상세히 설명하는 바대로 제이.알.디지위(J.R.Dezeeuw)에 의해 수행되었다. 사용된 방법은 하기 문헌에 기술되어 있다[참조 : J.L.Lodder, "The Yeasts", Second edition, N.Holland Publishing Co., Amsterdam, 1970].
CBS 599, 즉 캔디다 리포리티카(Candida lipolytica)종의 표준 배양물[참조 : "The Yeasts", Second Edition, N.Holland Publishing Co., Amsterdam, 1970]와 CBS 6124, 즉 사카로마이코프시스 리포리티카(Saccharomycopsis lipolytica)의 표준 배양물[참조 : "The Yeasts", Third Edition]을 비교해본다. 초기에는 그 종을 엔도마이코프시스 리포리티카(Endomycopsis lipolytica)로 언급했다. 이것의 불완전한 상태는 캔디다 리포리티카이다. 종의 분류학적 위치는 하기 문헌에 기술된 바로 정착되었다[참조 : Van der Walt and von Arx, Antonie van Leeuwenhoek, 46, 517-521(1980)]. 현재 바람직한 명칭은 야로위아 리포리티카이다.
균주 PC-30869의 배양학적, 형태학적 및 생리학적 특성은 사카로마이코프시스 리포리티카로서 기술된 종의 표준 설명과 일치한다[참조 : "The Yeasts", Third Edition, 발행인 : Kreger-Van Rij. 406 내지 408페이지, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1984].
[표 1]
[야로위아 리포리티카 균주의 비교]
Figure kpo00001
PC-30869는 야로위아 리포리티카 PC-22208(화이자 토양 분리물) 및 야로위아 리포리티카 PC-30026(NRRL Y-1094의 아배양물)의 적절한 돌연변이체를 유전적으로 재조합해서 제조한 것이다. PC-30869는 그의 야생형 모체와는(1) 활성이 있는 세포의 알칼리성 프로테아제를 생성하지 않는 점, (2) 성장에 바이오틴을 요구하는 점 및 (3) L-로이신의 공급원을 요구하는 점에서 다르다.
효모 추출액-펩톤-글루코오즈(YEPD)배지중의 PC-30869의 대수 상(log phase) 성장동안에, 출아 세포는 난형이며 2.6×5.5 마이크론의 평균 크기를 갖는다. YEPD 아가 상에서, 슈도-및 정(true)-균사가 두드러진다. 분아포자(blastospore)는 주로 흉막 위치에서 단일 형태로 존재한다. 카로테노이드 색소는 뚜렷하지 않는다. 배양물은 종에 대한 진정한 시험 균주와 교차되어 "B" 교배 반수체로서 작용한다(표 5). 통상적인 낭포자형성(ascosporulation)은 V8 아가 상에서 관찰된다. 탄소 동화 패턴은 첨부된 표 2에서 볼수 있다. 암모늄 이온 및 우레아(질산염 제외)는 유일한 질소 공급원으로 이용된다.(표 3) 균주 PC-30869는 비타민 티아민 및 D-바이오틴을 요구한다 (표 4). 배양물의 야생형 모체는 티아민만 요구한다. 37℃에서 성장은 관찰되지 않는다.
[표 2]
[탄소 동화성[a]]
Figure kpo00002
(a) 기초 배지는 L-로이신 100㎎/ℓ에 추가로 D-바이오틴 10mcg/ℓ및 L- 로이신 에틸 에스테르·HCl 149㎎/ℓ을 보충시킨 박토-효모 질소 염기이다.
(b) Kerger-Van Rij. (상기 참조).
[표 3]
[질소 동화성(a)]
Figure kpo00003
(a) 기초 배지는 L-로이신 등가물 100㎎/ℓ을 제공하도록 나트륨 케토-이소카프로에이트 116㎎/ℓ를, 그리고 추가로 D-바이오틴 10mcg/ℓ을 보충시킨 박토-효모 탄소 염기이다.
(b) Kreger-Van Rij. (상기 참조).
[표 4]
[비타민 요구(a)]
Figure kpo00004
(a) 기초 배지는 L-로이신 100mg/ℓ을 제공하도록 L-로이신 에틸 에스테르·HCl 149mg/ℓ을 가한 박토-비타민이 없는 효모 염기이다.
(b) Kreger-Van Rij. (상기 참조).
(c) 지시간 바대로 티아민·HCl 200mcg/ℓ및/또는 D-바이오틴 10mcg/ℓ.
[표 5]
[낭포자 형성]
Figure kpo00005
(a) 배양물 30264 및 30267은 L.J.Wickerham에 의해 제공된 교배형과 상반된 반수체 균주이다. 이들은 형식적으로 하기 문헌에 기술되어 있다[참조 : Science 167, 1141(1970)].
(b) 30264는 Wickerham의 캔디다 리포리티카 YB -421이다.
(c) 30267은 Wickerham의 캔디다 리포리티카 YB -423-12이다.
[표 6]
[기타 특징]
Figure kpo00006
(A) Kerger-Van Rij. (상기 참조).
PC-30869는, 그들의 표현형의 비교로 명백해진 바대로, 특허 문헌에 기술된 야로위아 리포리티카의 다른 균주와는 다르다(표7 및 8).
ATCC 20228(Nubel et al., 미합중국 특허 제 4,155,811호)는 종 CBS 599 및 CBS 6124에 대한 표준 균주와 같이 작용하는 야생형 영양 형태를 나타낸다. 특히 이것은 성장에 우라실, 로이신 또는 바이오틴을 요구하지 않으며 젤라틴을 액화시킨다.
ATCC 20628(Dezzeeuw et al., 미합중국 특허 제 4,407,953)는 ATCC 20228과는 달리 성장에 보충의 로이신을 요구한다. 이것은 ATCC 20228과 같이 우라실 또는 바이오틴을 요구하지 않는다. 이것은 또한 젤라틴을 액화시킨다.
ATCC 20688[기탁번호 : KFCC-10334, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회](유럽 특허원 제0138508호)은 배지에 우라실 및 로이신 둘다를 보충시킨 경우에만 성장한다. 우라실에 대한 요구성은 ATCC 20688[기탁번호 : KFCC-10334, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]을 ATCC 20228 및 ATCC 20628과 구별시켜 준다. ATCC 20688[기탁번호 : KFCC-10334, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]은 바이오틴을 요구하지 않으며 젤라틴을 액화시킨다.
배양물 PC-30869는 상기 모든 것과 다르다. 이것은 성장에 바이오틴 및 로이신을 요구하지만 우라실은 요구하지 않는다. 이것은 젤라틴을 액화시키지 않는다.
[표 7]
[영양 요구성]
Figure kpo00007
전체 배지는 박토-비타민이 없는 효모 염기 16.7g/ℓ+우라실 100mg/ℓ, L-로이신 100mg/ℓ, D-바이오틴 10mcg/ℓ및 200mcg/ℓ티아민, HCl을 함유한다.
[표 8]
[젤라틴 액화성]
Figure kpo00008
배지는 젤라틴 120g/ℓ및 박토-비타민이 없는 효모 염기 16.7g/ℓ+우라실 100㎎/ℓ, L-로이신 100㎎/ℓ, D-바이오틴 10mcg/ℓ, 및 티아민 HCl 200mcg/ℓ을 함유한다.
[XPR2 유전자의 서열 분석]
클로닝된 XPR2 유전자의 DNA 서열 분석은 플라스미드 pLD 57, pLD 58, pLD 62(제1도) 및 pLD 84 및 pLD 86(하기 참조)으로 부터 제조된 중첩 제한 단편 상에서 하기 문헌에 기술된 화학적 분해 방법에 의해 수행한다[참조 : Maxam et al., 1980, Methods Enzymol. 65,499]. 이 결과 클로닝된 효모 제놈의 DNAS가 실로 세포의 알칼리성 프로테아제에 대한 유전자를 함유함을 알 수 있다. XPR2 유전자의 뉴클레오타이드 서열, 및 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 그의 시그널 서열을 갖는 알칼리성 프로테아제 전구체의 아미노산 서열은 제3도에 나타내었다. 세포의 프로테아제의 아미노산 서열의 큰 부분은 알려져 있지 않으며(참조 : Ogryziak et al., 상기 참조), 본 명세서 처음으로 나타내다. 또한, 세포의 프로테아제의 발현 및 분비에 필요한 서열도 본 명세서에 처음으로 기술한다. 알칼리성 프로테아제, 그의 전구체 및 시그널 서열을 코드화하는 DNA 서열은 1362개의 염기 쌍으로 이루어진다(제3도). 이 폴리펩타이드 쇄의 1차구조는 454개의 아미노산 잔기가 되는 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된다. 알칼리성 프로테아제는 단백질 분해적으로 진행되어 분비 또는 완전 형을 이루는 전구체 형태의 세포에서 합성된다. 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 N-말단 아미노산 서열의 분석으로 전구체 분자에서 추정의 시그널 펩타이드가 존재함을 알 수 있다.
상기 시그널 펩타이드는 22개의 아미노산 잔기를 함유하며 그의 구조적 특징으로 고등의 진핵 및 원핵 시그널 펩타이드의 특징과 유사하다[참조 : Pelman et al., 1983, J. Mol, Biol. 167, 391]. 완전 알칼리성 프로테아제의 공지의 25 N-말단 아미노산과 일반적으로 일치하는 예상된 아미노산 서열에서의 영역은 시그널 펩타이드 및 2개의 트립신-형 절단 부위(Lys-Arg)를 함유하는 157개의 아미노산 잔기에 의해 진행 된다[참조 : Ogrydziak et al., 1982, J. Gen. Microbiol.128, 1225].
상기 절단 부위를 사용하여 프로 영역을 프로 1(-135 내지 -98)과 프로 2(-97 내지 -1)로 분할한다[참조 : 제3도]. 완전 알칼리성 프로테아제는 뉴클레오타이드 서열로부터 추론한 바대로 297개의 아미노산을 갖는다. 뉴클레오타이드 서열로부터 프로테아제의 여러형태에 대해 예상한 아미노산 서열은 효소의 정제 형태의 크기와 일치한다. 알칼리성 프로테아제 전구체 구조 서열외에, 약 700bp의 5'-플랭킹 서열 및 600bp의 3'-플랭킹 서열도 측정된다. 이들 영역의 분석으로 이들이 다른 진핵세포의 프로모터 및 터미네이터와 유사한 서열을 함유하며 알칼리성 프로테아제 발현에 필수적임을 알 수 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 분비된 알칼리성 프로테아제를 코드화하는 XPR2 유전자를 XPR2 돌연변이를 보충시킴에 의해 클로닝시키는 것을 포함하며, 야로위아 리포리티카를 형질전환시키는 방법 및 돌연변이를 보충시킴에 의해 야로위아 리포리티카 유전자를 클로닝시키는 방법은 유럽 특허 제 0138508호에 기술 되어 있다. 상기 특허에 기술된 방법은 야로위아 리포리티카 숙주 균주를 벡터 pLD 40에서 야로위아 리포리티카 유전자 도서관의 Bgl II부분 분해물로 형질전환시키는 방법을 포함한다(여기에서, 상기 벡터는 야로위아 리포리티카의 LEU 2 영역, 및 3 EcoR I, 4 EcoR V, 6 Ava I, 1 Bgl II, 1 Nco I, 1 Apa I, 2 Xho XI 엔도뉴클레아제 제한 부위를 함유하는 소 단편을 함유하는 특징이 있다.) 야로위아 리포리티카 XPR2 형질전환체중 하나를 사용하여 야로위아 리포리티카 NRRL Y-1094로부터 야생형 유전자(pLD 84 및 pLD 86)를 회수하여 실시예 1에 기술한 바와 같이 발현/분비 벡터 제조에 사용한다.
[LEU2 유전자의 서열 분석]
pLD 25(유럽 특허 제 0138508호)에서 클로닝된 LEU2 유전자의 DNA 서열 분석은 중첩 제한 단편상에서 하기 문헌에 기술된 화학적 분해 방법에 의해 측정한다[참조 : Maxam et al., 1980, Methods Enzymol. 65, 499]. 베타-이소프로필-말레이트(IPM) 데하이드로게나제 코드화 영역 및 적절한 판독 프레임(reading frame)을 위치시키기 위해, 유리한 점은 사카로마이세스 세레비지에의 LEU2 유전자에 대해 미리 측정한 예상된 아미노산 서열을 취하는 것이다[참조 : Andreadis et al., 1984, J. Biol. Chem. 259,8059]. 사카로마이세스 세레비지에 단백질 서열의 영역에 동종인 아미노산 서열을 코드화하는 야로위아 리포리티카 제놈 서열의 영역은 확인되었다. 2.8Kb LEU 2 유전자의 뉴클레오타이드 서열, 및 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 베타-IPM 데하이드로게나제의 아미노산 서열은 제12도에 나타내었다. 또한, 야로위아 리포리티카 베타-IPM데하이드로게나제의 발현에 필요한 서열은 본 명세서에 처음으로 기술한다. 이 405개의 아미노산 단백질을 코드화하는 DNA 서열은 1215개의 염기쌍으로 이루어진다(제12도). 베타-IPM 데하이드로게나제 코드화 서열외에, 약 798bp의 5'-플랭킹 서열 및 797bp의 3'-플랭킹 서열(TAA 해독 종결 코돈 포함)도 측정되었다. 이들 영역의 분석으로 이들이 다른 진행의 프로모터 및 터미네이터와 동일한 서열을 함유하며, 발현에 필요한 것임을 알 수 있다.
야로위아 리포리티카 LEU2 유전자의 5'-상향 영역은 해독 출발 코돈의 78bp 앞에, 및 제안된 mRNA 출발 코돈의 30bp 앞에 TATATATA 서열을 함유한다. 진행 세포에서 전사 개시에 중요한 두번째 서열은, LEU2 유전자에서 ATG로 부터-48bp인 가정된 전사 개시 부위 앞에 위치한 74bp인 CAAT 박스이다(제 12도).
3'-하향 영역은 사카로마이세스 세레비지애에서 전사 종결에 중요하다고 제안된 5'-TAG…TA(T)GT…TTT-3' 서열과 동종인 정지 코돈(TAA) 다음의 72 내지 120 뉴클레오타이드에서의 서열을 갖는다[참조 : Zaret et al., Cell 28, 563(1982)].
[실시예 1]
사용되는 숙주 균주는 야로위아 리포리티카 ATCC 20774[MATB leu2-40 bio-6 xpr2-1002; 기탁번호 : KFCC-10324, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]이다. XPR2 형질전환체, 즉, 야로위아 리포리티카 ATCC 20781[기탁번호 : KFCC-10331, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]은 로이신 결핍 판(leucinedeficient plate)으로부터 복제 도말하면 탈지유 지시판 상에서 띠(zone)을 형성하는 콜로니(colony)로서 관찰된다. 염색체 DNA는 유럽 특허원 제 0138508호에 기술된 방법에 의해 형질전환체로 부터 제조한 다음, 이 염색체 DNA를 사용하여 분비된 프로테아제에 대한 유전자를 회수한다. 염색체 DNA를 Bgl II 효소로 부분 분해시켜, 이를 벡터로부터의 이 콜라이 레플리콘(replicon) 및 앰피실린 내성 유전자 둘다를 함유하는 단편에 연결시켜 환상화한 다음, 이를 사용하여, 이 콜라이를 형질전환시킨다. 염색체 DNA를 sal I 효소로 분해시켜 사우던(southern) 실험에 사용하면, 형질전환체의 정상적인 LEU2 영역이 교란되어 있지 않음을 알수 있다(pLD 40)에 함유되어 있는 LEU2 단편의 5' 영역인 LEU2의 520 bp sal I 내지 EcoR I 단편을 프로브로서 사용한다). 그러므로, 도서관 플라스미드를 야로위아 리포리티카에 통합시키는데 동종이 필요하므로, XPR2 영역은 통합 부위을 가져야만 한다. 중첩되었지만 상이한 플라스미드인 세개의 pLD57, pLD 58 및 pLD 62를 야로위아 리포리티카 ATCC 20781[기탁번호 : KFCC-10331, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]로부터 초기에 회수한다.
이들은 제1도에 나타내었다. 분비된 완전 프로테아제 단백질의 첫번째 25개의 아미노산 잔기의 공지의 서열을 기준으로 하여 XPR2 유전자에 대한 합성 올리고뉴클레오타이드 프로브로 하이브리드화시키면(제2 및 3도), 분비된 프로테아제에 대한 유전자가 클로닝됨을 알 수 있다. 야로위아 리포리티카 수령 균주를 pLD 58로 형질전환시켜, 회수된 유전자가 야생형 복제 또는 돌연변이 복제를 나타내는 지를 측정한다. 로이신과 무관한 형질전환체로부터는 프로테아제 양성 형질 전환체가 생성되지 않으므로, pLD 58이 유전자의 돌연변이 대립형질을 함유한다는 결론을 내릴 수 있다.
야생형 균주 NRRL Y-1094에 존재하는 XPR2 유전자 형태는 이 콜라이 콜로니 하이브리드화 실험으로 수득한다. 서열화 데이터로부터 완전 구조성 유전자를 함유한다고 예상된 2Kb Pvu I 내지 EcoR I 단편을 프로브로서 사용한다. pLD 40에서 NRCL Y-1094 DNA의 Sau 3A 부분-분해 단편의 원래의 도서관으로부터(참조 : 유럽 특허원 제 0138508호), 프로브로 하이브리드화되는 여러가지 콜로니가 수득된다. 이들 콜로니중 2개는 발현 벡터를 성장시키는데 사용되는 매우 유사한 플라스미드 pLD 84 및 pLD 86을 함유한다. 이들 2개의 플라스미드 모두는 제3도에서 서열이 시작되는 위치로부터 동일한 XPR2 영역의 5'말단-Sau 3A 부위(이는 연결되어 벡터의 BamH I부위를 생성한다)를 함유한다. 각각은 프로테아제에 대한 구조성 유전자 모두 및 추정의 전사 터미네이터를 함유하며, 균주 NRRL Y-1094의 XPR2 영역으로 부터의 약 4 내지 5Kb전체 삽입물을 포함한다. pLD 86에서의 삽입물은 3'말단 외부에 수백개의 염기쌍을 함유한다. 발현 벡터작제시 3' 영역을 Bgl II부위(염기쌍 2655)까지 사용하므로, 2개의 플라스미드는 제 3도의 서열과 작용적으로 동일한, 동일한 DNA를 제공한다.
[발현/분비 벡터의 작제]
야로위아 리포리티카에서 프로레닌의 발현 및 분비를 성취하도록 고안된 계획을 통합 클로닝 벡터에서 여러 가지 하이브리드 유전자의 작제에 이용한다. 이러한 접근으로, 통상의 DNA 서열의 광대한 영역을 나누는 여러개의 상이한 플라스미드가 생성된다. 사실, 기준의 제조도식를 사용하여 예상된 XPR2 시그널 펩타이드 진행 부위, 추정의 프로 1-진행 부위, 및 완전 알칼리성 프로테아제를 생성한다고 알려진 절단 부위에 3'로 삽입된 프로레닌 유전자를 함유하는 벡터를 집결시킨다. 일반적으로, 발현을 위해 이종 유전자를 효모의 프로모터 서열과 터미네이터 서열 사이에 삽입시키는 것이 바람직하다. 하이브리드 유전자 서열의 N-말단 부위는 상이한 플라스미드 작제시 변화될 수 있지만, 프로레닌의 구조 유전자 서열, XPR2 터미네이터 서열 및 셔틀 벡터(shuttle vactor)DNA는 각각의 발현 플라스미드 제조시 동일함을 알수 있다. 동일한 프로레닌 구조 유전자 단편 및 터미네이터/벡터 플라스미드가, 하기에 기술하는 바대로, 각각의 발현 플라스미드 제조에 사용되도록 계획되어 있다. 상이한 프로레닌 발현/분비 플라스미드 작제는 프로레닌 유전자 서열을 진행시키는 N-말단 알칼리성 프로테아제 전구체 서열의 길이에서 XPR2유전자 프로모터 서열로부터 바로 하향인 영역에서 변화된다. 그러므로, 각 발현 플라스미드의 프로모터 단편 성분은 XPR2-프로레닌 연결 영역에서 변화될 수 있는 서열로 고안되어 있다. 모든 발현/분비 벡터는 3개의 성분 단편을 함유하는 유사한 연결 반응 생성물에 의해 집결된다.
터미네이터 벡터 pterm 4를 작제하는데 사용되는 실험 단계는 제4도에 나타내었다. 먼저, 합성 링커(linker)를 전사 종결 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 XPR2유전자의 3'말단을 함유하는 단편에 연결시킨다. 간단히 말하자면, 플라스미드 pLD84를 엔도뉴클레아제 Kpm I으로 절단하여 합성의 이중가닥 링커 DNA에 연결시킨다(제 4도). 연결 반응 생성물은 엔도뉴클레아제 Hind III 및 Bgl II로 전달하고 760bp단편을동일한 2개의 엔도뉴클레아제로 선형화된 플라스미드 pLD41에 삽입시켜 pterm4를 수득한다. 플라스미드 pterm4는 그의 제한 지도로 확인된다. EcoR V, EcoR I, Kpn I, Bgl II-Hind III 및 Bgl II-Bcl I을 사용하여 일련이 제한 엔도뉴클레아제 분해시킨 결과를 분석한다. 분해하여 셔틀 플라스미드 pLD 41에서 합성 링커 및 XPR2 유전자의 "완전(complete)"3'-말단의 존재를 확인시켜 주는 적절한 단편을 제공한다(참조 : 유럽특허원 제 0138508호). 이 7.3Kb 터미네이터 벡터의 부분 지도는 제4도에 나타내었다.
[발현/분비 플라스미드 pLS-3의 제조]
제5도는 야로위아 리포리티카에서 프로레닌의 분비에 사용되는 초기 플라스미드 작제방법의 개요이다. 이의 제한 지도는 제 5도에 나타내었다. 프로레닌 분비 플라스미드의 작제는 대부분의 프로레닌 구조 유전자 서열을 함유하는 단편을 제조함으로써 시작한다. 프로레닌 잔기 6 내지 365에 대한 코드화 서열을 함유하는 1080bp Bcl I-BamH I(부분) DNA 단편을 이.콜라이 프로레닌 발현 플라스미드 pPFZ-84A로부터 분리시킨다[플라스미드 pPFZ-84A는 프로레닌 발현 플라스미드 pPFZ-R2의 유도체이고, 이의 작제 방법은 1985년 7월 3일 공개된 유럽 특허원 제 0147178호에 기술되어 있으며, 이는 제한 단편을 대체시킴에 의해 합성의 올리고뉴클레오타이드 지시 돌연변이로 생성된다. 특히, pPFZ-84A는 pPFZ-R2와는 프로레닌 A대립 형질을 코드화하는 프로레닌 아미노산 잔기 214(Asp-Gly)에서의 2개의 염기쌍에서만 다르지만, 그러나 양 플라스미드는 프로레닌에 대해 원하는 서열을 함유하며 이 실시예에서는 작용성 등가물이다]. 알칼리성 프로테아제 전구체 1 내지 157 및 프로레닌 1 내지 5에 대한 코드회 서열을 함유하는 프로모터 성분 단편은 하기 기술하는 바와 같이 제조한다. 프로모터 영역 및 알칼리성 프로테아제 유전자의 5'말단을 함유하는 870 bp Hind III-Ava I DNA 단편은 XPR2 아클론 플라스미드 pLD 90으로부터 분리시킨다. 이 단편은 하기 구조를 갖는 합성 단편과 연결시킨다.
Figure kpo00009
[판독 방향]
이 서열은 Ava I 접착 말단, 및 이어서 알칼리성 프로테아제 프로-펩타이드이 마지막 9개 코돈을 코드화하는 서열, 및 이어서 프로레닌의 첫번째 4개의 아미노산을 코드화하는 서열을 함유하며, BamH I 부위에서 종결된다. 프로모터 성분 단편은, 합성 단편과 870bp Hind III-Ava I 단편을 T4리가제를 사용하여 표준 연결 반응시킨 다음 Hind III 및 BamH I로 절단함으로써 제조된다. 생성된 연결 서열은 적절한 916bp Hind III-BamH I DNA 단편을 위해 선택된 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 정제한다. 하이브리드 유전자의 3'-말단은, 상기 기술한 바와같이, 터미네이터/벡터 플라스미드 pterm 4로부터 수득된다. 플라스미드 pterm 4는 Hind III 및 Bcl I으로 분해시키고, XPR₂터미네이터, LEU2 선택 표지물 및 pBR 322를 함유하는 약 7.3Kb Hind III-Bcl I 터미네이터/벡터 DNA 단편을 아가로오즈 겔로부터 분리시킨다.
프로레닌 발현/분비 플라스미드 pLS-3은 세개의 성분 DNA 단편(Hind III-Bcl I의 절단된 pterm 4플라스미드를 916bp Hind III-BamH I 프로모터 및 1080bp BamH I-Bcl I프로레닌 유전자와 함께 함유하는 단편)을 배양시킴에 의해 집결시켜, T4리가제 존재하에 상기 기술한 바와 같이 작제한다(참조 : 제 5도). 연결 반응 혼합물을 사용하여 하기 문헌에 기술된 CaCl2방법에 의해 이 콜라이 K 12 균주 MM294를 형질전환시킨다[참조 : Dagert et al., Gene 6, 23-28 91979)].
플라스미드는 앰피실린 내성으로 선별된 형질전환체로부터 분리시키고, 이 플라스미드 pLS-3은 그의 제한지도로 확인된다(참조 : 제6A도). 이 플라스미드의 XPR 2-프로레닌 영역을 서열화하여 합성 DNA의 적절한 연결을 확인한다.
pLD 90의 제조-이 플라스미드는 pLD 84로부터의 아클론을 함유한다. XPR 2의 프로모터 영역에서의 Pvu I부위로부터 터미네이터 영역에서의 EcoR I 부위까지의 DNA 영역을 하기 기술하는 바와 같이 pBR 322의 Hind III 부위로 아클로닝시킨다. pLD 84수 ㎍을 상기 명명한 2개의 효소로 분해시킨다. 그다음, 분해된 DNA 분자의 "접착(sticky)"말단을 DNA 폴리머라제 I의 클레노우(Klenow) 단편으로 채운다. 그 다음, 분해된 키나제 처리된 Hind Ⅲ 말단을 Hind Ⅲ 효소로 계속해서 분해시켜 생성시킨다. DNA 분자의 혼합물을 예비 아가로오즈 겔 상에서 처리하여, 목적하는 2kb 밴드(band)를 절단하여 정제한 다음, Hind III 로 분해되고 세균성 알칼리성 포스파타제로 처리된 벡터 pBR 322를 사용하여 연결 반응 혼합물에 가한다. 연결 반응 혼합물을 사용하여 적절한 이 콜라이를 형질전환 시킨다. pBR 322의 EcoR I 부위에 가장 근접된 XPR 2 터미네이터의 EcoR I 부위를 갖는 배향을 90이라 명명하고 반대 배향을 pLD 91이라 명명한다.
pLS-3에 포함되어 있는 XPR2 프로모터 영역의 5' 말단은 Pvu I 부위, 즉, 제3도에서 서열화된 영역이 시작되기 전의 약 280bp이다. 이 대부분의 프로모터의 조절하에서 야생형 프로테아제 유전자를 함유하는 플라스미드가, 내재의 XPr 2 좌로부터 떨어진 부위에서 제놈에 통합되는 경우, 형질전환체로 하여금 다량의 프로테아제를 생성(탈지유 판상의 맑은 띠로 판단)하게 할 수 없다는 것을 알수 있다.
pLS-3이 단쇄화되어 "결핍(deficient)"프로모터를 함유하는 경우, 플라스미드와 내재 야생형 XPR 2 유전자 사이의 재조합에 의해 생성된 통합체는 프로키모신 융합 생성물을 발현시키는 완전 프로모터만 생성하고, 프로테아제를 발현시키는 결핍 프로모터는 생성하지 않음을 알 수 있다. 유사한 유전자 파괴형 실험을 하기 문헌에 기술된 바대로 사카로마이세스 세레비지에 액틴 유전자를 사용하여 수행한다[참조 : Shortle et al., Science 217; 371-373, 1982]. 본 발명자의 기대에 부응하여, pLS-3으로 형질전환된 일부의 로이신과 무관한 형질전환체는, 사실, 현재 프로테아제 결핍이다. 프로테아제 결핍 형질전환체는 Leu 2에서 유전자 전환물과 같은 원치 않는 부산물보다 XPR 2 좌에서 원하는 통합체로 되기 쉽다. 수령 균주 ATCC 20688[기탁번호 : KFCC-10334,기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]을 사용하여, 절단되지 않은 pLS-3은 6.5% 프로테아제-결핍 형질전환체를 생성하는 반면, SnaB I으로 절단된 플라스미드는 약70%의 프로테아제 결핍 형질전환체를 생성한다는 것이 판명되었다. 이 형질 전환의 유전자 파괴라는 측면을 다수의 사우던 블롯(Southern blot) 실험에 필요한 우회로 (by-pass)로 사용하여 모든 형질전환체 중에서 정확한 통합체를 찾아낸다.
XPR 2 프로모터(제3도에서 서열화되는 데서 시작)의 조절하에 야생형 프로테아제 구조 유전자를 함유하는 플라스미드는, XPR 2좌 이외의 다른 위치에서 야로위아 리포리티카 세포에 통합되는 경우 상당한 양의 프로테아제의 발현을 허용한다. 그러나, 이러한 종류의 통합체로부터 이종 유전자의 효율적인 발현은 추가로 이 조절 영역 DNA의 변화를 필요로 할 수 있다.
[프로레닌의 분비]
야로위아 리포리티카 균주 ATCC 20688[기탁번호 : KFCC-10334, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]을 절단되지 않은 pLS-3 DNA 및 SnaB I으로 분해되 pLS-3DNA로 형질전환시켜, 각각, Xpr-leu+형질전환체 ATCC 20775[DL 144; 기탁번호 : KFCC-10325, 기탁일 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회] 및 ATCC 20776[DL 148; 기탁번호 : KFCC-10326, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]을 수득한다. 이들 형질 전환체 균주를 YEPD배지를 함유하는 시험관에서 접종한다. 세포를 28℃에서 밤새 성장시킨다.
이들 배양물 분취량(250㎕)을 GPP 배지 25㎖에서 1:100으로 회석한다. 세포를 28℃의 진탕 플라스크에서 16 내지 18시간 동안 600㎜에서의 생성 흡광도가 5.0 내지 7.0이 되도록 성장시키고, 원심분리하여 회수한다. 생성된 배양액 또는 상등액을, 상등액을 농축시키고 농축물을 SDS-PAGE로 처리함으로써 프로레닌의 존재에 대해 분석한다.
슬라브 겔을 500m amp에서 20mM 트리스 염기, 150mM 글리신, 20% 메탄올 존재하에 니트로 셀룰로오즈 종이에 4℃에 2시간 동안 전기 역동적으로 이동시킨다. 슬라브 겔로부터 단백질의 제거는 쿠마시 블루(coomassie blue)로 염색하여 확인한다.
니트로셀룰로오즈 종이를 37℃에서 건조시켜, 65℃에서 1시간 동안 구운 다음, TBS(20mM NaCl, 50mM 트리스-HCl 7.5)에서 세척한다. 다음, 종이를 10% 말 혈청을 함유하는 TBS(Gibco, chagrin Falls, Ohio)중에서 실온에서 30분동안 배양한 다음 10% 말 혈청 및 프로레닌 항체의 적절한 희석액을 함유하는 TBS에서 실온에서 16시간 동안 배양한다. 종이를 TBS에서 10분 동안 3회 세척하여, 10% 말 혈청을 함유하는 TBS에서 배양한 다음, 10% 말 혈청 및 호오스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제에 결합된 염소의 항-래빌 IgG 항체의 적절한 희석액을 함유한 TBS에서 2시간 동안 배양한다. 종이를 TBS에서 10분 동안 3회 세척한 다음 4-클로로-1-나프톨(메탄올중의 3㎎/㎖l) 존재하에 전개시켜, 0.01% 과산화수소를 함유하는 TBS에서 0.5㎎/㎖의 농도로 가한다. 양 상등액에서 분자량 40,000의 프로레닌의 존재가 확인된다.
농축된 배양 상등액을 산성 활성화시킨 후(상기 참조), pLS-3을 함유하는 형질전환체 배양물 ATCC 20775[기탁번호 : KFCC-10325, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관: 한국종균협회] 및 ATCC 20776[기탁번호 : KFCC-10326, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]으로부터 제조된 시료에 상당한 정도의 우유 응고 활성이 존재한다. 기대한 바대로, 수령 균주 야로위아 라포리티카 ATCC 20688[기탁번호 : KFCC-10334, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]의 조절 배양 상등액에서는 우유 응고 활성이 관찰되지 않았다.
[발현/분비 플라스미드 pXX-33의 작제.]
pLS-3을 증진된 발현 플라스미드 pXX-33으로 전환시키는 변화를 제6도에 간략히 나타내었다. 이러한 변화는 XPR 2 프로모터 영역을 280bp만큼 증가시킨다. pLS-3의 경우에서와 마찬가지로, 발현 플라스미드 pXX-33은 프로레닌의 완전한 구조 유전자 서열에 연결된 알칼리성 프로테아제의 완전한 프리프로-펩타이드(157개의 아미노산 잔기)를 코드화하는 하이브리드 유전자를 함유한다.
pLS-3에서보다 XPR 2 프로모터 서열이 280bP 많은 프로레닌 발현/분리 플라스미드를 제조하기 전에, 완전한 알칼리성 프로테아제 유전자를 함유하는 제한 단편을 Hind III 부위에 아클로닝시킴이 필요하다. 이아클론은 합성 링커를 XPR 2 제놈 도서관 클론 pLD 86으로부터 분리된 제한 단편에 가함으로써 집결된다. 상향 Hind III 부위를 갖는 이 XPR 2 아클론의 제조는 알칼리성 프로테아제 유전자 모두를 함유하는 DNA 단편을 제조함으로써 시작된다. XPR 2 클론 pLD-86의 재놈 영역으로부터의 2.3kb EcoR I-BamH I(부분) 단편을 아가로오즈 겔 전기 영동에 의해 정제하여, 하기 서열을 갖는 합성 단편에 연결시킨다.
5' GATCGAAGCTTG 3'
3' TTCGAACTTAA 5'
이 링커 서열은 BamH I 접착 말단(그러나 BamH I부위를 생성하지는 않는다). 및 이어서 Hind III부위, 및 이어서 EcoR I 접착 말단을 함유한다. 연결 반응 생성물을 Hind III로 분해시켜 pBR 322의 Hind III 부위에 삽입한다. 플라스미드 pXHP-24는 그의 제한 지도로 확인하는데, 이 플라스미드는 앞으로의 발현 구성물에 대한 XPR 2 프로모터 단편의 공급원이 된다.
플라스미드 pXHP-24에서 아클로닝된 XPR 2 유전자는 pLS-3에 함유되어 있는 XPR 2 프로모터 서열보다 염기쌍이 약 280개 많은 5' XPR 2 프로모터 서열을 함유한다. 먼저, 프로모터 성분 단편은, 합성 DNA 단편 (pLS-3에 대해 상기 기술한 바와 같음)과 pXHP-24로부터의 1150bp Hind III-Ava I 단편을 T4리가제를 사용하여 표준 연결 반응시킨 다음 Hind III 및 BamH I로 절단함에 의해 생성시킨다. 생성된 연결 서열은 약 1196bp Hind III-BamH I 단편에 대해 선택한 겔 전기영동에 의해 정제한다. 프로레닌 아미노산 잔기 6 내지 151을 코드화하는 서열을 함유하는 두번째, 단편은 pLS-3을 BamH I 및 Xma I으로 절단한 다음 생성된 440bp BamH I I-Xma I DNA 단편을 겔 정제함으로써, pLS-3으로 부터 제조한다. 프로레닌 유전자의 나머지 부분, XPR 2 테미테이터, 및 벡터 서열을 함유하는 세번째 단편은, pLS-3을 Hind III 및 XMa I으로 절단한 다음 약 8.0kb Hind III-Xma I 벡터 단편을 겔 정제함으로서, pLS-3으로부터 제조한다. 다음, 세개의 단편을 상기 기술한 표준 방법으로 연결시킨다. 연결반응 생성물을 사용하여 이 콜라이 k12 균주 MM 294를 형질전환시킨다. 엠피실린 내성을 기준으로 하여 선별된 형질전환체로부터 플라스미드를 분리한 다음, 이 플라스미드 pXX-33을 그의 제한 지도로 확인한다(제6도). 이 플라스미드의 프로테아제-프로레닌 영역을 서열화하여 원하는 단편의 적절한 연결을 확인한다.
야로위아 리포리티카 ATCC 20774[기탁번호 : KFCC-10324, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]를 SnaB I으로 절단된 pXX-33로 형질전환시켜 야로위아 리포리티카 ATCC-20780[기탁번호 : KFCC-10330, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]를 제조한 다음, 형질 전환된 배양물에 대해 배양액에 분비된 프로레닌을 pLS-3의 경우 상기 기술한 바대로 분석한다. 배양 상등액중에서 프로레닌의 존재가 확인된다.
농축된 배양 상등액을 산성 활성화시킨 후(상기 참조), 형질 전환된 배양물 야로위아 리포리티카 ATCC 20779[기탁번호 : KFCC-10330, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]으로부터 제조된 시료에서 상당한 정도의 우유 응고 활성이 관찰된다.
[발현/분비 플라스미드 pXX-22의 제조]
발현/분비 플라스미드 pXX-22를 작제하는데 사용된 실험 단계는 제7도에 나타내었다. 이 발현 벡터는 두가지 관점에서 pLS-3과 다르다. 첫째로, pXX-33과 마찬가지로, 이 발현 벡터는 추가의 280bp 단편 XPR 2 프로모터 서열을 함유한다. 둘째로, 이 발현 벡터는 알칼리성 프로테아제 시그널 펩타이드 및 프로펩타이드의 단자 38개의 아미노산 잔기(프로 1)를 코드화하는 서열을 함유한다.
pXX-22에 대한 작제 계획은 pXX-33에 대해 사용한 것과 유사하다. 먼저, 프로모터 성분 단편은, pXHP-24로부터의 890bp Hind Ⅲ-Bal Ⅱ 단편과 하기 서열을 갖는 합성 단펴을 T4가제를 사용하여 표준 연결 반응시킨 다음 Hind Ⅲ 및 BamH I로 분해시켜 생성된다.
5' GATCTTGCTGAGATCACTAG 3'
3' AACGACTCTAGTGATCCTAG 5'
생성된 연결 서열을 920bp Hind Ⅲ-BamH I DNA 단편을 겔 전기영동 분리하여 정제한다. 프로레닌 잔기 6 내지 151을 코드화하는 두번째 단편은, PLs-3을 BamH I 및 Xam I으로 절단한 다음, 생성된 440bp BamH I DNA 단편을 겔 정제함으로써, pLS-3으로부터 분리시킨다. 프로레닌 유전자의 나머지 부분, XPR 2 터미네이터, 및 벡터 서열을 함유하는 세번째 단편은, pLS-3을 Hind Ⅲ 및 Xma I으로 절단한 다음, 약 8.0kb 벡터 단편을 겔 정제함으로써 pLS-3으로부터 제조한다. 그 다음, 세개의 DNA 단편을 상기 기술한 표준 방법을 사용하여 연결시킨다. 연결 반응 생성물을 사용하여 이 콜라이 K12 균주 MM 294를 형질전환시킨다. 선별된 형질전화체로부터 플라스미드를 분리시키고, 이 플라스미드 pXX-22는 그의 제한 지도록 확인한다(제7도).
야로위아 리포리티카 ATCC 20774[기탁번호 : KFCC-103247, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]를 SnaB I으로 절단된 pXX-22로 형질전환시켜 야로위아 리포리티카 ATCC-20779[기탁번호 : KFCC-10329, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]를 제조한 다음, 형질 전환된 배양물에 의해 배양액에 분비된 프로레니을 pLS-3의 경우 상기 기술한 바대로 분석한다. 배양 상등액중에서 프로레닌의 존재는 상기 기술된 방법에 따라 확인한다. 농축된 배양 상등액을 산성 활성화시킨 후 (상기 참조), 형질 전환된 배양물 야로위아 리포리티카 ATCC 20779[기탁번호 : KFCC-10329, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]로부터 제조된 시료에서 상당한 정도의 우유 응고 활성이 관찰된다.
[발현/분비플라스미드 pXX-11의 작제]
프로레닌 발현/분비 플라스미드 pXX-11의 작제에 대한 실험 단계는 제8도에 개략적으로 나타내었다. 이 플라스미드는 프로레니을 코드화하는 서열에 연결된 XPR 2 프로모터 및 22개의 아미노산 잔기 시그널 펩타이드에 대한 서열을 함유한다. pXX-11에 대해 사용되는 작제 계획은 pXX-22 및 pXX-33에 대해 사용된 것과 유사하다. 간단히 말하자면, 프로모터 성분 단편은, pXHP-24로부터의 약 750bp Hind Ⅲ-Bal Ⅱ DNA 단편과 하기 서열을 갖는 합성 단편을 T4리가제를 사용하여 표준 연결 반응시킨 다음 Hind Ⅲ 및 BamH I로 절단하여 제조한다.
Figure kpo00010
생성된 연결 서열을 790bp Hind III-BamH I DNA 단편을 선별하기 위해 겔 전기 영동에 의해 정제한다. 프로레닌 잔기 6 내지 151을 코드화하는 두번째 단편은, pLS-3을 BamH I 및 Xma I으로 절단한 다음 생성된 440bp BamH I-Xma I DNA 단편을 겔 정체함으로써, pLS-3으로부터 분리시킨다. 프로레닌 구조 유전자의 나머지 부분, XPR 2 터미네이터, 및 셔틀 벡터 서열을 함유하는 세번째 단편은, pLS-3을 Hind III 및 Xma I으로 절단한 다음 약 8.0kb 벡터 단편을 겔 정제함으로서, pLS-3으로부터 제조한다. 그 다음, 세개의 DNA단편을 상기 기술한 표준 방법을 사용하여 연결시킨다. 연결반응 생성물을 사용하여 이 콜라이 K12 균주 MM 294를 형질전환시킨다. 선별된 형질전환체로부터 플라스미드를 분리시키고, 이 플라스미드 pXX-11을 그의 제한 지도로 확인한다(제8도). 이 플라스미드의 XPR 2-프로레닌 영역을 서열화하여 합성 DNA의 적절한 서열 및 원하는 단편의 적절한 연결을 확인한다.
야로위아 리포리티카 ATCC 20774[기탁번호 : KFCC-10324, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]를 SnaB I으로 절단된 pXX-11으로 형질전환시켜 야로위아 리포리티카 20778[기탁번호 : KFCC-10328, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]을 제조한 다음, 형질전환된 배양물에 의해 배양 배지에 분비된 프로레닌을 pLS-3의 경우 상기 기술한 바대로 분석한다. 배양 상등액중에서 프로레닌의 존재는 상기 기술한 방법에 따라 확인한다.
우유 응고 분석(상기 참조)으로, pXX-11을 함유하는 형질전환체 ATCC 20778[기탁번호 : KFCC-10328, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]의 배양 상등액에 상당한 정도의 우유 응고 활성이 있음을 알 수 있다.
[실시예 2]
[도킹 플랫폼의 제조]
ATCC 20774[기탁번호 : KFCC-10324, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]에서 bio-6대립 형질에 상응하는 야생형 BIO유전자는 하기 기술하는 바대로 보충시키에 의해 클로닝시킨다. pLD-40의 BamH I부위에 삽입된, Sau3A로 부분 분해된 야로위아 리포리티카 염색체 DNA의 유전자 도서관(즉, pBR 322+EcoR I 부위의 LEU 2)을 제조하고, 상당한 양의 도서관 DNA를 혼합 배양된 이 콜라이 플리스미드 제품(이것은 XPR 2 유전자를 클로닝시키는데 사용된 것과 동일한 도서관이다)으로서 제조한다. 도서관 DNA 수 ㎍을 효소 Apa I(이것은 LEU 2-영역에서 1회 절단한다)으로 분해시킨다. 그 다음, 이 DNA를 사용하여 ATCC 20774[기탁번호 : KFCC-10324, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회](leu 2 xpr 2 bio)를 형질전환시키고, 형질전환 혼합물을 로이신이 결합된 합성 배지상에서 도말한다. 로이신과 무관한 형질전환체 10,000개가 수득한다. 콜로니가 BIO 유전자를 포함하는 도서관 플라스미드를 함유하는 가를 확인하기 위해, 로이신과 무관한 형질전환체를 바이오틴 선택 배지(1당 조성: 데스티오 바이오틴 25㎎, 글루코오즈 20g, 황산 암모늄 5g, KH2PO4lg, MgSO4·7H2O 0.5g, CaCl2 0.1g, NaCl 0.1g, 붕산 500㎍, 티아민·HCl 400㎍, ZnSO4·7H2O 400㎍, Na2M0O4·2H2O 200㎍, FeCl3·6H2O 200㎍, K I 100㎍ 및 CuSO4·5H2O 40㎍)를 함유하는 아가판에 복제 도말한다.
바이오틴 선택 배지상에서 성장하는 야로위아 리포리티카 BIO+형질전환체중 하나를 DL 31이라 명명한다. 이를 더 진행시켜 야로위아 리포리티카 균주 DL 31로부터의 BIO 유전자를 함유하는 유전자 도서관 플라스미드를 회수한다. 균주 DL 31의 배양물로부터 염색체 DNA를 제조한다. 이 염색체 DNA 수 ㎍을 제한효소 Apa I으로 분해시켜 도서관 플라스미드를 절단한다. 분해된 DNA 분취량을 연결 반응에 사용하여 공지되지 않은 도서관 플라스미드를 환상화시킨다. 다음, 연결 반응 혼합물을 사용하여 앰피실린 내성에 대해 이 콜라이 배양물을 형질전환시켜 공지되지 않은 BIO-함유 플라스미드를 이 콜라이로 회수한다. 몇 개의 이 콜라이 앰피실힌 내성 형질전환체가 수득된다. 조그만 크기의 플라스미드는, 이 콜라이 형질전환체상에서 제조한다. 이렇게 하여 수득된 플라스미드 DNA의 제한 분해로, 이 공지되지 않은 BIO-함유 플라스미드는 기대한 바대로 BamH I 부위에 삽입물을 갖는 pLD 40과 동등함을 알 수 있다. 이 플라스미드는 원래 본 발명의 유전자 도서관으로부터 생성됨이 분명하며 pLD 51이라 명명한다.
플라스미드 pLD 56은 하기 기술하는 바와 같이 pLD 51로부터 LEU 2 유전자를 제거함에 의해 pLD 51의 아클론으로서 생성된다. 플라스미드 pLD 51의 분취량을 효소 EcoR I로 분해시켜 LEU 2 영역을 제거한다. 분해된 DNA를 DNA 연결 반응에 사용하여 플라스미드를 재환상화시킨다. 다음, 이 콜라이를 형질 전환시켜 더 작은 BIO-함유 플라스미드를 아클로닝시킨다. 앰피실린-내성 이 콜라이 형질전환체중 하나는 기대한 더 작은 플라스미드(pLD 56이라 명명)를 함유한다고 알려졌다. pLD 56을 여러 가지로 제한 분해 시킨다.
pLS 56의 BIO-함유 단편(pBR 322의 BamH I 부위에서 삽입)은 약 3.6kb 길이이다.
pBR 322의 BamH I 부위에 삽입시킨 야로위아 리포리티카 DNA의 3.6kb 삽입물(pLD 56으로 이루어짐)의 매우 개략적인 제한 지도는 괄호에 지시한 삽입의 시작으로부터 염기쌍에 일정한 거리를 두고 하기에 기술한다. 크기 평가는 몇개의 아가로오즈 겔로부터 수행하며 비교적 상당한 량의 오차가 발생한다 : PvuII (800), PvuII (1200), Pst I (1800), Mlu I (2000), Pst I (2300), EcoRV (2700), Nco I (3200), (배향을 위해, pBR 322의 Sal I 부위가 기술한 부위들을 진행시키겨 Hind III 부위가 이들 뒤에 있다).
균주 ATCC 20774[MATB Leu 2-40 BIO-6 xpr 2-1002 ; 기탁번호 : KFCC-10324, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]는 완전 pLD 56(pBR 322+BIO 유전자를 함유하는 야로위아 리포리티카 염색체 DNA 약 3.6kb)으로 형질전환시킨다. 세개의 상이한 바이오틴과 무관한 형질전환체를, BIO-영역에 통합된 내재 pBR 322를 함유하는지를 측정하기 위해, 모 균주와 비교해서 Nru I으로 절단된(pBR 322에 표지된) pLD 40(pBR 322상의 LEU 2)의 고형질전환 빈도수에 대해 시험한다. 세개 모두는 내재 pBR 322에 pLD 40이 통합됨으로 인해 고 형질전환 빈도수를 나타낸다. 이것은 사우던 블롯 하이브리드화 실험으로 확인된다. 세개의 원래의 야로위아 리포리티카 BIO 형질전환체중 하나를 DL 118이라 명명하고, 이를 DNA 수령체로서 사용한다. 상기 제한 지도는 ⅰ) BIO-특이성 하이브리드화 프로브로 무엇을 사용할지(Nco I-Pvu II 단편), ii) pLD 56플라스미드를 정확하게 절단하기 위해서는 어느 효소가 필요한지(Mlu I), iii) 어느 효소가 pBR 322 부위에서만 1회 절단하는지(Cla I) 및 iv) 어느 효소가 플라스미드를 모든 부위에서 절단하지 않는지 (Apa I)를 측정하기 위해 필요하다. ATCC 20774[기탁번호 : KFCC-10324, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회] 및 DL 118로부터의 DNA의 Cla I 및 Apa I 분해물의 사우던 하이브리드화(BIO-단편을 프로브로 사용)로, 기대한 바대로, DL 118의 바이오틴 영역{ATCC 20774[기탁번호 : KFCC-10324, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]의 BIO 영역과 비교하는 경우}이 약pLD 56크기의 DNA를 가함에 의해 파괴함을 알 수 있다. DL 118 DNA의 Mlu I 분해(pBR 322를 프로브로 사용)에 의해 첨가는 완전 pLD 56으로서 동일한 크기임을 더 알 수 있다.
[발현/분리 플라스미드 pLX-34의 제조.]
발현 플라스미드는 LEU 2 프로모터의 하향에 XPR 2 분비 시그널을 갖는 프로레닌 코드화 서열(157개의 아미노산 프리프로 서열)이 위치하도록 작제한다. 이 발현 플라스미드는 XPR 2 프로모터 이외의 다른 프로모터를 사용하여 이종 단백질을 분비시킬 수 있음을 설명해준다. 또한, 이 발현 벡터는 야로위아 리포리티카 제놈에서 통합 부위와는 관계없이 독립적으로 발현/분비시킬 수 있다. XPR 2 프로모터 이외의 다른 프로모터를 사용하여 프로레닌을 성공적으로 분비시킬 수 있음은 야로위아 리포리티카에서 다른 새로운 강 프로모터를 확인하기 위해 발현 벡터를 작제할 수 있다는 가능성을 설명해준다. 또한, 이러한 접근을 이용해서 두개의 별도의 하이브리드 프로레닌 유전자를 함유하는 발현 배양물(즉, 하나는 LEU 2 프로모터에 의해 발현된 것이고 다른 하나는 XPR 2 프로모터에 의해 발현된 것으로 숙주 제놈의 상이한 부위에서 통합된 것임)을 수득할 수 있다.
LEU 2 프로모터 서열에 의해 발현된 알칼리성 프로테아제 분비 시그널(157개의 아미노산 XPR 2 프리프로 서열)을 갖는 프로레닌 유전자를 함유하는 발현 벡터 작제시 사용되는 실험 단계는 제13도에 개략적으로 나타내었다. 이 플라스미드의 작제는 베타-이소프로필말레이트 데하이드로게나제 유전자(제12도)의 ATG 해독 개시 코돈을 진행시키는 5'-해독되지 않은 서열의 약 300 염기쌍을 함유하는 LEU 2 프로모터 단편을 제조함으로써 시작된다. LEU 2 프로모터 서열의 270bp 영역을 코드화하는 300bp Hind III-Fok I DNA 단편을 셔틀 벡터 pLD 40으로부터 분리시킨다. 이 단편은 T4리가제를 사용하여 하기 서열을 갖는 54bp합성 링커에 연결시킨 다음 Hind III로 분해시킨다.
………………Leu 2…
Fok I
5'-ATACAACCACACACATCCACAATG
3'- TTGGTGTGTGTAGGTGTTAC
………………………………Xpr 2…
Bgl I
AAGCTCGCTACCGCCTTTACTATTCTCACTGCCGTTC-3'
TTCGAGCGATGGCGGAAATGATAAGAGTGACGGC -5'
생성된 연결 서열은 360bp Hind III-Bg I DNA 단편을 겔 전기영동 분리하여 정제한다. XPR 2 프리프로 서열의 나머지 부분 및 프로레닌의 첫번째 152개의 아미노산 잔기를 코드화하는 두번째 성분 단편은, 발현 플라스미드 pXX-33(제6도)를 Bgl I 및 Xma I으로 절단한 다음 생성된 887bp DNA 단편을 겔 정제함으로써, pXX-33으로부터 분리시킨다. 프로레닌 유전자의 나머지 부분, XPR 2 터미네이터, 및 벡터 서열을 함유하는 세번째 단편은, pXX-33으로부터 제조한다. 세개의 DNA 단편을 상기 기술한 표준 방법을 사용하여 연결시킨다. 연결 반응 생성물을 사용하여, 이 콜라이 K12 균주 HB 101을 형질전환시킨다. 앰피실린 내성을 기초로 하여 선별된 형질전환체로부터 플라스미드를 분리시키고, 이 플라스미드 pLX-34를 그의 제한 지도로 확인한다(제13도).
야로위아 리포리티카 ATCC 20794[DL 118 ; 기탁번호 : KFCC-10324, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]를 Nru I으로 절단된 pLX-34 DNA로 형질전환시켜 야로위아 리포리티카 ATCC 20795[DL 251; 기탁번호 : KFCC-10333, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]를 제조하고, 로이신과 무관한 형질전환체 배양물에 의해 배향액에 분비된 프로레닌은 pLX-34를 숙주 염색체내의 bio 좌에 도입시키기 전에 pBR 322서열에 통합시키는 것을 지시한다(상기 참조). 이 부위에서의 pLX-34 통합은 사우던 분석으로 확인한다.
[수령체로 DL 118사용]
사우던 하이브리드화 실험은 하기와 같이 수행한다 : DL 118의 형질전환체로부터의 DNA의 Nru I 분해(예를 들어, 도입 플라스미드가 프로키모신 발현 플라스미드인 경우, 프로키모신 프로브로 하이브리드화됨)로 도입 플라스미드를 정확하게 절단한다. Nru I 으로 분해된 형질전환 플라스미드 수 ng을 사용하여 하이브리드화 밴드의 정확한 크기를 체크한다. 이들 형질전환체로부터의 DNA의 Mlu I 분해(Mlu I은 형질전환 플라스미드에서는 절단하지 않음)(32P-표지 pBR 322를 프로브로 사용)로, DL 118의 내지 pBR 322 서열은 형질전환 플라스미드 1몰 이상을 가함에 의해 파괴됨을 알 수 있다. 이것은 통합이 원하는 부위에서 발생했음을 설명해준다.
형질전환체 배양물 야로위아 리포리티카 ATCC 20795[DL 251; 기탁번호 : KPCC-10333, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]를 TEPD배지중 22℃에서 성장시켜 LEU 2 프로모터에 의한 발현을 쉽게 한다. 배양 상등액에서 프로레닌의 존재는 산성 활성화 배양 상등액의 우유 응고 분석(상기 참조)에 의해 확인하고 면역 반점 분석(상기 참조)에 의해 입증한다. 이들 결과 이 하이브리드 유전자가 XPR 2 또는 LEU 2 이외의 부위에서 통합되는 경우 발현/분비시킬 수 있는 독립된 발현 단위임을 알 수 있다. 이 특징은 향상된 수준으로 세포의 프로레닌을 효율적으로 수득할 수 있는 다중 하이브리드 유전자를 함유하는 발현 배양물을 제조할 수 있게 해준다.
[실시예 3]
[인체 C5a에 대한 합성 유전자의 서열]
인체 아나필라톡신 C5a의 세균성 생성을 달성하도록 고안된 계획은 EGF의 합성 및 발현시 사용된 상기 방법과 유사하다(참조 : 유럽 특허원 제0147178호). 이 방법으로, 활성화된 상보 성분 C5a에 대한 코드화 서열을 합성적으로 제조하는 유전자를 작제할 수 있다. 인체 C5a의 공지의 아미노산 서열을 사용하여, 그의 74개의 아미노산에 대한 정보를 코드화하는 DNA 단편을 계획할 수 있다(제9도). 합성 유전자 서열은 이 콜라이 및 사카로마이세스 세레비지애의 바람직한 코돈 이용을 최대화하도록 하고 여러개의 제한 엔도뉴클레아제 부위가 용이하게 특징화되도록 선택한다. 이 접근 방법으로 C5a 폴리펩타이드의 첫번째 아미노산을코드화하는 삼중자(triplet) 앞에 단백질 합성을 위한 ATG 개시 코돈을 도입시킴으로써 이 콜라이에서 아나필라톡신이 발현되도록 한다. 원하는 배양으로 플라스미드 pBR 322에 도입시키는 것을 용이하게 하기위해, 합성C5a 유전자는 그의 말단에서 EcoR I 및 Hind III 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위을 함유하도록 고안되어 있다. 생성된 C5a유전자 서열을 생성시키기 위해, 10개의 47-머를 포스포라미디트 방법으로 합성하여 235bp 이중 가닥 DNA 단편에 집결시킨다. C5a유전자 단편을 적절히 절단된 pBR 322에 삽입하여, 클로닝된 유전자를 임의로 선택된 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA를 제한 절단된 pBR 322에 삽입하여, 클로닝된 유전자를 임의로 선택된 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA를 제한 절단 분석하여 확인한다. 다음, 몇개의 C5a클론을 DNA 서열화로 분석하여 정확한 서열을 갖는 클론을 확인한다. C5a유전자 영역에 대해 의도하는 뉴클레오타이드 서열은 검사한 5개의 클론 중 2개에서 발견되었다.
[인체 C5a의 세균성 발현]
C5a 발현 플라스미드의 작제는 C5a 아클론을 제한 엔도뉴클레아제 EcoR I로 절단한 다음 세균성 알칼리성 포스파타제로 처리하여 탈인산화시켜 시작한다. trp 프로모터-오퍼레이터 및 리보좀 결합 부위 서열을 함유하는 pPFZ-R2로부터의 360bp EcoR I DNA 단편을 사용하여, C5a발현 플라스미드를 제조한다. 연결 반응 생성물로 이 콜라이 균주 HB 101의 적절한 세포를 형질전환시킨다. 각 형질전환으로부터 몇개의 약제-내성 콜로이를 정제한 다음 그들의 플라스미드 DNAS를 제한 엔도뉴클레아제 지도 분석하여 C5a 유전자의 전사를 일으키는 배향으로 trp 프로모터를 함유하는 것들을 확인한다. 이 연결 반응 생성물로부터의 다중 분리물은 C5a를 발현시키는데 요구되는 배위에서 세균성 프로모터 서열에 인접한 아나필라톡신 유전자를 함유하는 플라스미드로 확인된다. C5a 발현 플라스미드 pC5a-48의 제한 지도는 제10도에 나타내었다.
[야로위아 리포리티카에서 인체 아나필라톡신의 발현 및 분비]
인체 아나필라톡신 C5a의 분비를 위해 코드화되는 발현/분비 벡터 pC5X-3은 pXX-33에 대해 실시예1에 기술한 기법을 사용하여 제조한다. 야로위아 리포리티카 ATCC 20774[기탁번호 : KFCC-10324, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]를 이 분비 벡터에 의해 형질전환시킨 다음, 이 형질전환된 배양물에 의해 생성된 인체 C5a를, 염소의 항-C5a 및 토끼의 항-염소 IgG를 면역반점 방법에 사용하는 것을 제외하고는 상기 기술한 바대로 분석한다. 이 실시예에 기술된 플라스미드의 경우, 배양 상등액에서 플라스미드의 존재를 확인한다.
[발현/분비 플라스미드 pC5aX-3의 작제]
아나필라톡신 발현/분비 플라스미드 pC5aX-3의 제조에 관한 실험 단계는 제11도에 개략적으로 나타내었다. 이 플라스미드는 C5a의 74개 아미노산 잔기를 코드화하는 합성 서열에 연결된 "완전" XPR 2 프로모터 및 157개의 아미노산 잔기 시그널 및 프로-펩타이드에 대한 서열을 함유한다. pC5aX-3을 위해 사용되는 작제 계획은 pXX-33에 대해 사용된 것과 유사하다. 먼저, 플라스미드 pXHP-24(또는 원하는 서열을 함유하는 다른 플라스미드)를 Hind ⅢI 및 Ava I으로 절단하여 XPR 2 프로모터를 함유하는 1150bp 단편을 겔 정제한다. XPR 2 프로-펩타이드의 3' 말단 및 C5a구조성 유전자 서열을 함유하는 두번째 단편은 이 콜라이 발현 플라스미드 pC5a-48로부터의 약 220bp Hinf I-Hind III DNA 단편과 하기 서열을 갖는 합성 단편을 T4리가제를 사용하여 표준 연결 반응시킨 다음 Ava I 및 Hind III로 절단하여 제조한다.
5' CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCCA 3'
3' CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTTGA 5'
생성된 연결 서열은 약 250bp Ava I-Hind III 단편을 선별하는 겔 전기영동으로 정제한다. 프로모터를 함유하는 Hind III-Ava I 단편과 C5a를 코드화하는 Ava I-Hind III 단편을 T4리가제를 사용하여 연결시킨 다음 Hind III 로 분해시킨다. 약 1.4kb 단편을 겔 정제하여, Hind III로 절단된 pterm 4(상기 기술)과의 연결 반응에 사용한다. 연결 반응 생성물을 사용하여 이 콜라이 K12 균주 MM 294를 형질전환시킨다. 앰피실린-내성에 대해 선별한 플라스미드를 선별된 형질전환체로부터 분리시키고, 이 플라스미드 pC5aX-3을 그의 제한 지도로 확인한다. 아로위아 리포리티카 주 PC-30869(ATCC 20774)[기탁번호 : KFCC-10324, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]를 SnaB I으로 절단된 pC5aX-3으로 형질 전환시킨 다음, 형질전환된 배양물에 의해 배양 배지에 분비된 아나필라톡신을 상기 기술한 바대로 분석한다. 배양 상등액에서 C5a의 존재를 상기 기술한 방법으로 확인한다.
원형질 내부 세망에 결합된 리보좀에 의해 합성된 많은 단백질이 글리코프로테인으로서 생성됨을 알 수 있다. 사실, 글리코실화는 주어진 단백질의 분비에 영향을 미칠 수있다. 진핵 세포 단백질의 N-연결 글리코실화는 트리펩타이드 서열 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-세린(여기에서, X는 아스파르테이트 이외의 아미노산일 수 있다)에서 발생한다[참조 : Hubbard, S., et al., 1981, Ann Rev.Biochem.50; 555]. 프로레닌의 아미노산 서열에는 이러한 트리펩타이드 서열 두개가 포함되어 있지만, 아로위아 리포리티카 배양물에 분비된 프로레닌의 겔 전기영동 분석으로는 글리코실화가 밝혀지지 않는다. 다른 분비된 진핵세포 단백질에서, 모든 아스파라긴- X-트레오닌/세린 부위가 글리코실화되는 것은 아니다. 트리펩타이드 서열내의 특정의 아스파라긴은 글리코실화 효소에 접근할 수 없기 때문에 이 아스파라긴은 글리코실화 되지 않는 것 같다.
인체 C5a의 경우, 아미노산 서열에는 단일 글리코실화 부위 또는 트리펩타이드 서열(Asn-Ile-ser)이 함유되어 있는데, 이는 통상적으로 아스파라긴에 결합된 복합 올리고사카라이드를 함유한다[참조 : Fernandez, H.,et al., J.Immunol.117, 1688]. 야로위아 리포리티카 배양 배지에 분비된 C5a 분자의 일부는 글리코실화되는 경향이 있는데, 이는 항원 활성화의 광범위한 영역이 면역반점의 고분자량 부위에 나타나기 때문이다. 이 이종의 전기영동적 유동성은 다른 분비된 단백질을 사용하여 관찰된 것과 유사하며 이는 아마 탄수화물의 첨가 정도를 변화시킴에 따른 것이다. 본 발명에서, 특정의 분비된 이종 단백질의 명확한 글리코실화는 야로위아 리포리티카 발현 및 분비가 통상적으로 글리코실화된 많은 진핵 세포 단백질의 생성에 유용하리라는 것을 제시해준다.

Claims (23)

  1. 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)의 LEU 2 유전자, 그의 프로모터 또는 터미네이터 서열, 야로위아 리포리티카의 XPR 2 유전자, 그의 시그널, 프로1-, 프로2-, 프로모터 또는 터미네이터 서열 중 적어도 하나를 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
  2. (ⅰ)
    Figure kpo00011
    (ⅱ) 5' GATCTTGCTGAGATCACTAG 3'
    3' AACGACTCTAGTGATCCTAG 5'
    (ⅲ) 5'-ATACAACCACACACATCCACAATGAACGTCG-3'
    3'-CTACCGCCTTTACTATTCTCACTGCCGTTC
    TTGGTGTGTGTAGGTGTTACTTCGAGCGAT -5'
    GGCGGAAATGATAAGAGTGACGGC
    을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
  3. (i) 야로위아 리포리티카에, 야로위아 리포리티카에 대해 이종인 단백질을 코드화하는 DNA 서열, 야로위아 리포리티카 유전자, 또는 야로위아 리포리티카 프로모터, 야로위아 리포리티카 유전자의 시그널 및 전사 터미네이터 DN A서열을 포함하는 발현 벡터를 도입시키고; (ii) 이렇게 하여 생성된 (i)의 야로위아 리포리티카 형질전환체를 적절한 영양 배지에서 배양한 다음; (iii) 이종 단백질을 회수함을 특징으로 하여, 야로위아 리포리티카 배양물에 의해 이종 단백질을 생성하고 분비시키는 방법.
  4. (i) 야로위아 리포리티카에, 야로위아 리포리티카에 대해 이종인 단백질을 코드화하는 DNA 서열, 및 LEU 2 유전자, 그의 프로모터 또는 터미네이터 서열, XPR 2 유전자, XPR 2 유전자의 프로모터, 시그널, 프로 1-, 프로 2-또는 터미네이터 DNA 서열중 적어도 하나를 포함하는 발현 벡터를 도입시키고 ; (ii) 이렇게 하여 생성된 (i)의 야로위아 리포리티카 형질전화체를 적절한 영양배지에서 배양한 다음; (iii) 이종 단백질을 회수함을 특징으로 하여, 야로위아 리포리티카 배양물에 의해 이종 단백질을 생성하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 유전자가 XPR 2 유전자 또는 LEU 2 유전자인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 이종 단백질 DNA 서열이 프로레닌 또는 인체 아나필라톡신 C5a 서열인 방법.
  7. ATCC 20780[기탁번호 : KFCC-10330, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]과 동일한 특징을 갖는 야로위아 리포리티카 형질전환체를 적절한 영양배지에서 배양함을 특징으로 하여, 이종 단백질을 생성하는 방법.
  8. ATCC 20779[기탁번호 : KFCC-10329, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]와 동일한 특징을 갖는 야로위아 리포리티카 형질전환체를 적절한 영양배지에서 배양함을 특징으로 하여, 이종 단백질을 생성하는 방법.
  9. ATCC 20778[기탁번호 : KFCC-10328, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]과 동일한 특징을 갖는 야로위아 리포리티카 형질전환체를 적절한 영양배지에서 배양함을 특징으로 하여, 이종 단백질을 생성하는 방법.
  10. ATCC 20777[기탁번호 : KFCC-10327, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]과 동일한 특징을 갖는 야로위아 리포리티카 형질전환체를 적절한 영양배지에서 배양함을 특징으로 하여, 이종 단백질을 생성하는 방법.
  11. 제5항에 있어서, 이종 단백질에 대한 유전자를 XPR 2 유전자의 프로모터 서열과 터미네이터 서열 사이에 삽입시키는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 이종 단백질에 대한 유전자가 프로레닌 또는 인체 아나필라톡신 C5a 유전자인 방법.
  13. 야로위아 리포리티카의 XPR+균주를 XPR발현 작제물로 형질전환시킴를 특징으로하여, 알칼리성 플로테아제를 생성하지 않는 야로위아 리포리티카 형질 전환체를 제조하는 방법.
  14. (i) 야로위아 리포리티카의 XPR+균주를 XPR발현 작제물로 형질전환시킨 다음; (ii), (i)에서 생성된 형질전환체를 알칼리성 프로테아제 활성의 손실에 대해 선별함을 특징으로 하여, XPR 2 유전자에서 통합된 벡터 DNA를 갖는 야로위아 리포리티카 형질전환되는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 XPR+야로위아 리포리티카 균주가, 절단되지 않은 플라스미드 pLS-3 DNA 또는 SnaB I으로 분해된 pLS-3 DNA로 형질전환되는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 야로위아 리포리티카가, 야로위아 리포리티카 ATCCA 20688[기탁번호 : KFCC-10334, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]과 동일한 특징을 갖는 방법.
  17. 발현 벡터를, 이종 벡터 DNA에 대해 동종인 영역(이 영역은 야로위아 리포리티카의 통합 형질전환동안 수령 부위로서 제공되는 외생 DNA를 포함한다)를 포함하는 야로위아 리포리티카 형질전환체에 통합시킴을 특징으로 하여, 야로위아 리포리티카 형질전환체를 제조하는 방법.
  18. ATCC 20795[기탁번호 : KFCC-10333, 기탁일 : 1987. 3. 4, 기탁기관 : 한국종균협회]와 동일한 특징을 갖는 야로위아 리포리티카 형질전환체를 적절한 영양배지에서 배양함을 특징으로 하여, 이종 단백질을 생성하는 방법.
  19. 이종 벡터 DNA에 대해 동종인 영역(이 영역은 야로위아 리포리티카의 통합 형질전환 동안 수령 부위로서 제공되는 외생 DNA를 포함한다)를 포함하는 야로위아 리포리티카 형질전환체를 배양함을 특징으로 하여, 이종 단백질을 생성하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 동종 영역이 pBR 322 또는 그의 유도체로부터 유도된 이종 단백질을 생성하는 방법,
  21. 플라스미드 pXHP-24를 Hind III-Ava I 으로 절단하여 1150bp 단편을 생성시키고 ; 단편을 분리시키고; 단편을 T4리가제의 존재하에 합성 DNA 단편
    Figure kpo00012
    과 연결시킨 다음; 이렇게 하여 생성된 연결 반응 생성물을 Hind III-BamH I로 절단하여 1196bp 단편을 생성시키고; 1196bp 단편을 분리시키고; 1196bp 단편을, T4리가제의 존재하에, 플라스미드 pLS 3을BamH I-Xma I 으로 절단하여 수득한 44bp 단편 및 플라스미드 pLS 3을 HindIII-XmaI 으로 절단하여 수득한 ∼8.0kd 단편과 연결시킨 다음; 이렇게 하여 생성된 연결 반응 생성물로 이 콜라이를 형질전환시키고; 앰피실린-내성 형질전환체를 선별하고; 이어서 형질전환체로부터 플라스미드 pXX 33을 분리시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pXX 33을 제조하는 방법.
  22. 플라스미드 pXHP 24를 HindIII-BglII로 절단하여 890bp 단편을 생성시키고; 단편을 분리시키고; 단편을 T4리가제의 존재하에 합성 DNA 단편
    5' GATCTTGCTGAGATCACTAG 3'
    3' AAGCACTCTAGTGATCCTAG 5'
    과 연결시킨 다음; 이렇게 하여 생성된 연결 반응 생성물을 HindIII-BamH I로 절단하여 920bp 단편을 생성시키고; 920bp 단편을 분리시키고; 920bp 단편을, T4리가제의 존재하에, 플라스미드 pLS 3을 BamH I-Xma I으로 절단하여 수득한 440bp 단편 및 플라스미드 pLS 3을 HindⅢ-Xma Ⅰ으로 절단하여 수득한 ∼0.8kb 단편과 연결시킨 다음; 이렇게 하여 생성된 연결 반응 생성물로 이 콜라이를 형질전환시키고; 앰피실린-내성 형질전환체를 선별하고; 이어서 형질전환체로부터 플라스미드 pXX 22를 분리시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pXX 22를 제조하는 방법.
  23. 플라스미드 pHXP 24를 HindⅢ-BglⅡ로 절단하여 750bp 단편을 생성시키고; 단편을 분리시키고; 단편을 T4리가제의 존재하에 합성 DNA 단편
    Figure kpo00013
    과 연결시킨 다음; 이렇게 하여 생성된 연결 반응 생성물을 HindIII-BamH I로 절단하여 790bp 단편을 생성시키고; 790bp 단편을 분리시키고; 790bp 단편을, T4리가제의 존재하에, 플라스미드 pLS 3을 BamH I-Xma I으로 절단하여 수득한 440bp 단편 및 플라스미드 pLS 3을 HindIII-Xma I으로 절단하여 수득한 ∼0.8Kb 단편과 연결시킨 다음; 이렇게 하여 생성된 연결 반응 생성물로 이 콜라이를 형질전환시키고; 앰피실린-내성 형질전환체를 선별하고; 이어서 형질전환체로부터 플라스미드 pXX11을 분리시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pXX 11을 제조하는 방법.
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