HU218731B - Élesztőtörzs és eljárás az élesztőre heterológ fehérjék előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya: élesztőtörzs és új eljárás erre heterológfehérjék, elsősorban deszulfatohirudinszármazékok fermentációs útonvaló előállítására, amelynek során a proteáz-deficiens transzformáltélesztőtörzseket alkalmazzák. Az eljárás segítségével olyan terméketállítanak elő, amelyben C-terminális aminosavként Lys, Arg, Tyr, Ala,Leu, Gln, Glu, Asp, Asn vagy Ser van jelen. Az élesztőtörzset hibridvektorral transzformálják, amely egy élesztőpromotert működőképesenösszekapcsolva a heterológ fehérjét kódoló második DNS-szekvenciáhozmegfelelő leolvasókeretben kapcsolt, egy szignálpeptidet kódoló elsőDNS-szekvenciával, valamint egy élesztő transzkripciós terminációsszignált hordozó DNS-szekvenciát tartalmaz. ŕ

Description

A találmány a rekombináns DNS-technológia területével foglalkozik, és javított eljárást nyújt heterológ fehérjék előállítására genetikailag manipulált élesztősejtek segítségével, ismerteti az említett, genetikailag manipulált élesztősejteket, és eljárásokat nyújt az említett élesztősejtek előállítására.

Jelenleg már nagyszámú heterológ fehérjét fejeznek ki élesztőben élesztősejtek transzformálása után megfelelő kifejező vektorokkal, amelyek az említett fehérjéket kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazzák; ilyen fehérjék például az α-interferon [IFNa; Hitzeman és munkatársai: Natúré 294, 717-722 (1981)], a lizozim (Oberto és munkatársai: Gene 40, 57-65 (1985), az aamiláz [Sato és munkatársai: Gene 50, 247-257 (1986), szöveti típusú plazminogénaktivátor (t-PA; 143081 számú közzétett európai szabadalmi leírás) vagy a deszulfatohirudin (225633 számú közzétett európai szabadalmi leírás). Sok esetben azonban a heterológ fehérje nem tiszta formában szintetizálódik, hanem keverékként, amely részben le van bontva; ilyenek például a C-terminálisukon lerövidített fehérjék. így például a humán szívpitvari nátriuretikus peptid (hANP) kifejezése élesztőben az érett hANP két formájának kifejezését eredményezi, amelyek C-terminálisukban különböznek [Vlasuk és munkatársai: J. Bioi. Chem. 261, 4798-4796 (1986)]. A többséget jelentő formából a fehérje két utolsó aminosava (Arg 150 és Tyr 151) hiányzik, míg a kisebb részt jelentő forma a teljes hosszúságú anyag. Hasonló eredményeket kaptak az epidermális növekedési faktor (EGF) kifejezése után is élesztőben [George-Nascimento és munkatársai: Biochemistry 27, 797-802 (1988)], ahol a kiválasztott kifejezési termékek olyan értelemben heterogének, hogy az utolsó (Arg 53) vagy a két utolsó (Leu 52 és Arg 53) aminosav hiányzik, és teljes hosszúságú EGF nem is termelődik.

Hirudinvariánsokat kódoló cDNS-eket és szintetikus géneket már klónoztak és fejeztek ki mikrobiológiai gazdaszervezetekben. Bár a kifejezett termékből hiányzik a szulfát-monoészter-csoport a Tyr^-nál - ezért ezeket deszulfatohirudinoknak nevezzük -, ezekről kiderült, hogy közel azonos biológiai aktivitást mutatnak, mint a természetes, szulfátéit hirudinok. A HV1 deszulfatohirudinvariánst kifejezték már Escherichia coliban (158 564 és 168 342 számú közzétett európai szabadalmi leírás) és Saccharomyces cerevisiae-ban (168 342; 200 655; 225 633 és 252 854 számú közzétett európai szabadalmi leírás). Hasonlóképpen HV2 deszulfatohirudint fejeztek már ki Escherichia coliban (158 564 számú közzétett európai szabadalmi leírás) és Saccharomyces cerevisiae-ban (200 655 számú közzétett európai szabadalmi leírás és 86/01224 számú PCT szabadalmi bejelentés), valamint de-(Val)₂-deszulfatohirudint is fejeztek már ki Escherichia coliban (158 986 számú közzétett európai szabadalmi leírás).

Általában a kifejezési hatékonyság és kitermelés magasabb, amikor gazda mikroorganizmusként S. cerevisiae-t választunk. Az alkalmazott speciális élesztőtörzstől függetlenül kiderült azonban, hogy a kifejeződési termék deszulfatohirudinfajták heterogén keveréke, amelyek egymástól a C-terminális szekvenciákban különböznek. így például a tenyésztett élesztőtörzsekből, amelyek a HV1 hirudinvariáns génjét tartalmazzák, kapott tenyészlevek deszulfato-HVl-hirudint tartalmaznak, de jelentős mennyiségű olyan analóggal együtt, amelyből hiányzik a Glu⁶⁵ C-terminális aminosav vagy a Leu⁶⁴ és Glu⁶⁵ C-terminális aminosavak.

A teljes hosszúságú fehéqéket, például deszulfatohirudint, hANP-t vagy EGF-et, valamint ezek C-terminálison rövidített származékait tartalmazó keverékek elválasztása és ezeknek a komponenseknek homogénné tisztítása munkaigényes és időt rabló. Az ezzel járó költségeket figyelembe véve szükség van olyan javított eljárásokra, amelyek lehetővé teszik homogén fehéqék, például deszulfatohirudin gazdaságos előállítását élesztőben. A jelen találmány egyik tárgya tehát eljárásokat nyújtani homogén heterológ fehérjék előállítására élesztőben.

Bár nyilvánvaló, hogy a heterológ fehérjék C-terminálison megrövidített származékainak izolálása az említett fehérjéket kódoló, megfelelő DNS-szekvenciát tartalmazó transzformált élesztőtörzsek tenyészközegeiből endogén élesztőproteázok transzláció utáni tevékenységének eredménye a primer kifejezési termékre, például teljes deszulfatohirudinra, azokat a fajlagos proteázokat, amelyek felelősek a C-terminális lebomlásért, eddig még nem azonosították. A legfontosabb, fehérjelebontásban érdekelt élesztőproteázok általában az yscA és yscB endopeptidázok és az yscY és yscS karboxiexopeptidázok. Az olyan élesztőtörzsek alkalmazása, amelyek hiányosak az A, Β, Y és/vagy S aktivitásban, részlegesen csökkentheti az idegen géntermékek, például a deszulfatohirudin véletlenszerű proteolízisét. Mégis jelentős mennyiségű olyan fehérje figyelhető meg, amelyből hiányzik egy vagy két aminosav a Cterminálisról.

Meglepő módon úgy találtuk, hogy az ysca karboxipeptidáz-aktivitást nélkülöző élesztőmutáns törzsek nem képesek aminosavakat eltávolítani heterológ fehérjék C-terminálisáról, és ennek megfelelően teljes (autentikus) fehérjéket hoznak létre. Az ysca karboxipeptídáz membránnal társult exopeptidáz, és - amint ez jól ismert - fontos szerepet játszik az ölő (killer) faktor és a párosodási (mating) faktor érésében [Wagner J. C. és Wolf D. H.: FEBS Letters 221, 423 (1987)]. Ez a KEX1 gén kifejezési terméke. A publikált adatok szerint [Rendueles P. S. és Wolf D. H.: FEMS Microbiol. Rév. 54, 17 (1988)] az ysca tevékenysége erősen behatárolódik a C-terminális bázisos aminosavgyökökre (Arg, Lys). Ezeknek az adatoknak a tükrében, és annak a ténynek a birtokában, hogy a deszulfatohirudin C-terminális aminosavai nem bázisosak (a HV1 deszulfatohirudinváltozatban például Gin és Leu), nagymértékben meglepő és nem várt eredmény, hogy az ysca karboxipeptidáz-aktivitást nélkülöző élesztőmutáns törzsek alkalmazása lehetővé teszi homogén deszulfatohirudin előállítását anélkül, hogy C-terminálison rövidített deszulfatohirudinanalógok munkaigényes elválasztására lenne szükség.

Ugyanez az észrevétel igaz más heterológ fehérjékre is, például hANP-re, EGF-re vagy a III. kötőszöveti

HU 218 731 Β aktiválópeptidre [CTAP-llI, Mullenbach és munkatársai: J. Bioi. Chem. 261, 719-722 (1986)]; ezeket is elő lehet állítani teljes hosszúságú formában, amikor ysca karboxipeptidáz-aktivitást nélkülöző élesztőmutáns törzset alkalmazunk egy megfelelő vektorral való transzformáláshoz.

Következésképpen a találmány élesztőkre heterológ fehérjék homogén formában való, javított előállítási eljárására vonatkozik; az eljárás abból áll, hogy olyan élesztőt tenyésztünk, amelynek nincs ysca karboxipeptidáz-aktivitása, és olyan hibrid vektorral van transzformálva, amely egy, az említett heterológ fehérjét kódoló DNS-szekvenciához működőképesen kötődő élesztőpromotert tartalmaz, és az említett heterológ fehérjét izoláljuk.

Pontosabban a találmány javított eljárással foglalkozik élesztőre heterológ fehérje homogén formában való előállítására: az eljárás abból áll, hogy az említett törzset, amely egy, az említett heterológ fehérjét kódoló második DNS-szekvenciát, ehhez a megfelelő leolvasókeretben kapcsolt, szignálpeptidet kódoló első DNSszekvenciát, és ehhez működőképesen kapcsolt élesztőpromotert és élesztő átírásterminációs szignálokat tartalmazó DNS-szekvenciát tartalmazó hibrid vektorral van transzformálva, tenyésztjük, és az említett heterológ fehérjét izoláljuk.

A heterológ fehérjék, amelyeket a jelen találmány szerinti javított eljárással előállítottunk, olyan fehérjék, amelyek fogékonyak a transzláció utáni C-terminális-lebontásra ysca karboxipeptidázzal az élesztőben történő kifejeződés után. Az ilyen heterológ fehérjéket két Cterminális aminosavval jellemezzük az alábbi aminosavak közül: Lys, Arg, Tyr, Alá, Leu, Gin, Glu, Asp, Asn és Ser. Ezek a heterológ fehérjék a deszulfatohirudin származékai.

A jelen találmány legelőnyösebb szempontja javított eljárásra vonatkozik deszulfatohirudin előállítására; az eljárás abból áll, hogy olyan élesztőtörzset tenyésztünk, amelynek nincs ysca karboxipeptidáz-aktivitása, és amely egy deszulfatohirudint kódoló második DNS-szekvenciát és ehhez megfelelő leolvasókeretben kapcsolt, szignálpeptidet kódoló első DNS-szekvenciát és működőképesen kapcsolt élesztőpromoterból és élesztő átírásterminációs szignálokat tartalmazó DNSszekvenciából álló deszulfatohirudinkifejező kazettát tartalmazó hibrid vektorral van transzformálva, és a deszulfatohirudint izoláljuk.

A „deszulfatohirudin” kifejezés körülöleli mindazokat a deszulfatohirudinvegyületeket, amelyeket az irodalomban leírtak, és amelyek deszulfatohirudint kódoló DNS-t tartalmazó transzformált mikroorganizmustörzsekből kinyerhetők. Az ilyen deszulfatohirudinok például a HV1, HV1 (módosított a, b), HV2, HV2 (módosított a, b, c), PA, PA variánsai és de(Val)₂-deszulfatohirudin.

Előnyös deszulfatohirudinok azok, amelyek az alábbi (I) képlettel bírnak:

Xj Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn X₂ Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu X₃ Asn Gin

Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro X₄ Pro Gin Ser X₅

Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu X₆ amelyben

a) Xj jelentése Val-Val és X₂, X₃ és X₄ jelentése Lys,

X₅ jelentése His és X₆ jelentése Glu-Tyr-Leu-Gln peptidgyök (HV1), vagy

b) X₂ jelentése Ile vagy Glu és X_b valamint X₃-X₆ jelentése azonos az a) pontban megadottal [HV1 (módosított a)], vagy

c) X₃ jelentése Ile vagy Glu és X_b X₂ és X₄-X₆ jelentése azonos az a) pontban megadottal [HV1 (módosított a)], vagy

d) X₄ jelentése Ile vagy Glu és X| -X₃, valamint X₅ és X₆ jelentése azonos az a) pontban megadottal [HV1 (módosított a)], vagy

e) X₅ jelentése Leu vagy Asp és X, -X₄ és X₆ jelentése azonos az a) pontban megadottal [HV1 (módosított a)], vagy

f) X₆ jelentése Glu-Tyr, Glu-Tyr-Leu, Glu-Asp-LeuGlu, Glu-Glu-Leu-Gln, Glu-Tyr-Lys-Arg, GluAsp-Lys-Arg, Glu-Lys-Leu-Gln, Ser-Phe-Arg-Tyr, Trp-Glu-Leu-Arg, Glu-Tyr-Leu-Gln-Pro vagy GluTyr-Leu-Gln-Arg, és X1-X5 jelentése azonos az a) pontban megadottal [HV1 (módosított b)], vagy

g) X, jelentése Thr és X₂-X₆ jelentése azonos az a) pontban megadottal, vagy amelyek az alábbi (II) képlettel bírnak:

Yj Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu

Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gin Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Y₂ Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Y₃ Leu Gin amelyben

a) Y! jelentése Ile-Thr N-terminális dipeptid, Y₂ jelentése Asn és Y₃ jelentése Tyr (HV2), vagy

b) Y₂ jelentése Lys, Arg vagy His és Yj és Y₃ jelentése azonos az a) pontban megadottal [HV2 (módosított a)], vagy

c) Y₃ jelentése Glu vagy Asp és Y, és Y₂ jelentése azonos az a) pontban megadottal [HV2 (módosított b)], vagy

d) Yj jelentése Val-Val N-terminális dipeptid és Y₂ és Y₃ azonos az a) pontban megadottal [HV2 (módosított c)], vagy amelyek az alábbi (III) képlettel bírnak:

Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Gly Ser Gly Glu Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Gin Gly Lys Asp Asn Gin Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Gin Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Gin Asp Alá Tyr Asp Glu, (ez a PA), valamint ennek a PA-nak a variánsai, amelyeket az jellemez, hogy a primer szerkezet meg van rövidítve 1 vagy 2 aminosavval az N-terminálisnál vagy 18; 10; 9; 6; 4 vagy 2 aminosavval a C-terminálisnál.

A legelőnyösebb deszulfatohirudinvegyület az olyan I általános képletű vegyület, amelyben az X,-X₆ az a) pont szerint van meghatározva.

HU 218 731 Β

Az élesztőgazdasejteket és a hibrid vektorok alkotórészeit az alábbiakban pontosítjuk.

A transzformált élesztősejteket olyan eljárással tenyésztjük, amely a szakterületen ismert.

így a jelen találmány szerinti transzformált élesztőtörzseket asszimilálható szén-, nitrogén- és szervetlensó-forrást tartalmazó folyékony tápközegen növesztjük.

Különböző szénforrások alkalmazhatók. Előnyös szénforrásra példák az asszimilálható szénhidrátok; például a glükóz, maltóz, mannit, fruktóz vagy laktóz, vagy valamely acetát, például nátrium-acetát, amelyeket alkalmazhatunk egyedül vagy megfelelő keverékekben. Megfelelő nitrogénforrások lehetnek például az aminosavak, például kazaminosav, peptidek és fehéijék és lebomlási termékeik, például tripton, pepton vagy húskivonat, továbbá az élesztőkivonat, malátakivonat, kukoricalekvár, valamint ammóniumsók, például ammónium-klorid, -szulfát vagy -nitrát, amelyeket alkalmazhatunk egyedül vagy megfelelő keverékekben. Azok a szervetlen sók, amelyeket alkalmazhatunk, lehetnek például nátrium, kálium, magnézium és kalcium szulfátjai, kloridjai, foszfátjai és karbonátjai. A tápközeg tartalmazhat továbbá növekedést elősegítő anyagokat. Azok között az anyagok között, amelyek elősegítik a növekedést, találjuk például a nyomelemeket, például a vasat, cinket, mangánt és hasonlókat vagy bizonyos aminosavakat.

Az endogén kétmikronos DNS és a replikonját hordozó hibrid vektorok közötti összeférhetetlenség következtében az ilyen hibrid vektorokkal transzformált élesztősejtek hajlamosak arra, hogy a hibrid vektorokat elveszítsék. Az ilyen élesztősejteket szelektív körülmények között kell tenyészteni, azaz olyan körülmények között, amely egy plazmid által kódolt gén kifejeződését igényli a növekedéshez. A legszelektívebb markerek, amelyek jelenleg használatban vannak és jelen vannak a jelen találmány szerinti hibrid vektorokban, az olyan gének, amelyek az aminosav- vagy purinbioszintézis enzimeit kódolják. Ez szükségessé teszi szintetikus minimáltápközegek alkalmazását, amelyek hiányosak a megfelelő aminosavakban vagy purinbázisban.

A komplett kétmikronos DNS-t tartalmazó (beleértve egy funkcionális replikációs origót) hibrid vektorok stabilan fenntarthatok olyan Saccharomyces cerevisiae törzsön belül, amely mentes az engodén kétmikronos plazmidoktól (ezek az úgynevezett cir° törzsek) úgy, hogy a tenyésztést végezhetjük nem szelektív növekedési körülmények között is, vagyis komplex körülmények között.

Konstitutív promoterrel (például ADHI, GAPDHI) bíró hibrid plazmidokat tartalmazó élesztősejtek kifejeznek egy heterológ fehérjét kódoló DNS-t az említett promoter szabályozása alatt indukció nélkül. Ha azonban az említett DNS egy szabályozott promoter (például PGK vagy PH05) szabályozása alatt van, a növesztő tápközeg összetételét adaptálni kell abból a célból, hogy az mRNS-átiratok maximális szintjét érjük el, vagyis amikor PH05 promotert alkalmazzuk, a növesztő tápközegnek kis koncentrációban kell tartalmaznia szervetlen foszfátot ennek a promotemek a derepresszálásához.

A tenyésztést hagyományos technikákat alkalmazva hajtjuk végre. A tenyésztési körülményeket, például a hőmérsékletet a tápközeg pH-ját és a fermentációs időt úgy választjuk meg, hogy a heterológ fehéijék maximális szintje termelődjék. Egy kiválasztott élesztőtörzs előnyösen aerob körülmények közt növekszik rázatás vagy kevertetés közben süllyesztett tenyészetben, 25°-35 °C közti, előnyösen 28 °C hőmérsékleten 4 és 7 pH-értékek között, például mintegy 5 pH-nál, és legalább 1-3 napig, előnyösen annyi ideig, amíg a fehérje kielégítő termelését elérjük.

Az élesztőben kifejezett heterológ fehérjéket a sejten belül akkumulálhatjuk, vagy kiválaszthatjuk a tenyészközegbe. A deszulfatohirudin esetében, tekintet nélkül az alkalmazott élesztőtörzsre, promoterra és szignálpeptidre, a termelt fehérje legnagyobb része a tenyészközegbe választódik ki, míg csupán egy kis rész marad a sejttel társulva. A pontos arány (kiválasztott anyag/sejttel társult anyag) a fermentációs körülményektől és az alkalmazott kinyerési munkamenettől függ. Ez általában több mint 8:1 arányt tesz ki. Következésképpen a kiválasztott deszulfatohirudin mindig erősen dominál.

A heterológ fehérjét a tenyészközegből hagyományos módon izolálhatjuk. így például az első lépés általában a sejt elkülönítéséből áll a tenyészfolyadéktól centrifugálás segítségével. Az így létrejövő felülúszót a heterológ fehérjében dúsíthatjuk polietiléniminnel végzett kezeléssel úgy, hogy a nem fehérjeszerű anyagok legnagyobb részét eltávolítsuk, és a fehérjék kicsapásával az oldat ammónium-szulfátos telítésével. A gazdafehérjéket, ha vannak jelen, szintén kicsaphatjuk ecetsavas savanyítás segítségével (például 0,1% ecetsav, pH 4-5). A heterológ fehérje további dúsítását érhetjük el az ecetsavas felülúszó extrahálásával n-butanollal. A további tisztítási lépések közt találjuk a sómentesítést, kromatográfiás eljárásokat, mint az ioncserélő kromatográfíát, gélszüréses kromatográfíát, megoszlásos kromatográfiát, HPLC-t, fordított fázisú HPLC-t és hasonlókat. A fehérjekeverék alkotórészeinek elkülönítését elvégezhetjük dialízissel, a töltés alapján gélelektroforézissel vagy hordozómentes elektroforézissel, a molekulaméret alapján megfelelő Sephadex-oszlop segítségével, affinitáskromatográfiával, például antitestekkel, főleg monoklonális antitestekkel, vagy affínitáskromatográfiához megfelelő hordozóhoz kapcsolt trombinnal, vagy más munkamenetekkel, elsősorban olyanokkal, amelyek a szakterületen ismeretesek.

Deszulfatohirudin esetében az antihirudin vagy antideszulfatohirudin antitestekkel (például hibridómasejtekből kapott monoklonális antitestek) végzett vizsgálatot, a trombinvizsgálatot [Bergmeyer M. U. (szerkesztő): Methods in Enzymatic Analysis, II. kötet, 314-316, Verlag Chemie, Weinheim (NSZK) (1983)], vagy a véralvadási vizsgálatot [Markwardt és munkatársai: Thromb. Haemost. 47, 226 (1982)] alkalmazhatjuk, hogy kimutassuk a hirudinaktivitást a tisztítási folyamat során kapott frakciókban. A szakirodalomból is4

HU 218 731 Β mert analóg eljárásokat alkalmazhatunk más heterológ fehérje kimutatására.

A jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazott transzformált élesztógazdasejteket rekombináns DNStechnikákkal lehet előállítani, amely eljárás az alábbi lépésekből áll:

- hibrid vektor előállítása, amely egy heterológ fehérét kódoló DNS-szekvenciához működőképesen csatlakozó élesztőpromoterből áll. Elsősorban olyan hibrid vektorra van szükség, amely egy heterológ fehérjét kódoló második DNS-szekvenciához megfelelő leolvasókeretben csatlakozó, szignálpeptidet kódoló első DNSszekvenciához működőképesen csatlakozó élesztőpromoterből és élesztő transzkripciós terminációs szignálokat tartalmazó DNS-szekvenciából áll;

- olyan mutáns élesztőtörzs előállítása, amelyből hiányzik az ysca-aktivitás;

- az említett hibrid vektorral a kapott mutáns élesztőtörzs transzformálása;

- a transzformált élesztősejtek elválasztása a nem transzformált élesztősejtektől.

Kifejező vektorok

A jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazott élesztőhibrid vektorok egy heterológ fehérjét kódoló DNS-szekvenciához működőképesen kötött élesztőpromotert tartalmaznak. Az előnyös hibrid vektorok heterológ fehérjeként deszulfatohirudint kódoló második DNS-szekvenciához megfelelő leolvasókeretben csatlakozó, szignálpeptidet kódoló első DNS-szekvenciához működőképesen csatlakozó élesztőpromoterből és élesztő transzkripciós terminációs szignálokat tartalmazó DNS-szekvenciából állnak.

Az élesztőpromoter szabályozott promoter, mint például a PH05, MFal vagy GÁLI promoter, vagy konstitutív promoter. Deszulfatohirudin kifejezése esetében egy konstitutív promoter előnyös. A konstitutív élesztőpromoter előnyösen egy nagymértékben kifejezett génből származik, például egy glikolitikus enzimet kódoló génből; ilyen például az enoláz, gliceraldehid-3foszfát-dehidrogenáz (GAPDH). 3-foszfoglicerát-kináz (PGK), hexokináz, piruvát dekarboxiláz, foszfoffuktokináz, glükóz-6-foszfát-izomeráz, 3-foszfoglicerátmutáz, piruvát-kináz, trióz-foszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz és glükokináz gén promoteije, továbbá az ADHI vagy TRPI promoter és egy megrövidített FH05 savas foszfatázpromoter, amely meg van fosztva aktivációs helyeitől. Különösen előnyös a GAPDH promoter és funkcionális fragmentumai, amelyek a -550. és -180. nukleotidok között, elsősorban a -540., -263. vagy -198. nukleotidoknál kezdődnek, és a GAPDH gén -5. nukleotidjánál végződnek, valamint a megrövidített konstitutív PH05 promoterek, amelyek a -200. és -150. nukleotidok között, elsősorban a -173. nukleotidnál kezdődnek, és a PH05 gén -9. nukleotidjánál végződnek.

Egy szignálpeptidet kódoló DNS-szekvencia („szignálszekvencia”) előnyösen egy olyan polipeptidet kódoló élesztőgénből származik, amely rendszerint kiválasztódik. A piócagenom DNS-ből kapott hirudin szignálszekvenciák vagy heterológ fehéijék, amelyek rendszerint kiválasztódnak, más szignálszekvenciái szintén választhatók. Élesztő-szignálszekvenciák például az élesztőin vertáz, α-faktor, feromon-peptidáz (KEX1), „gyilkos toxin” és represszálható savas foszfatázgének szignál- és preproszekvenciái, és az Aspergillus awamoriból származó glukamiláz szignálszekvencia. Egy másik eljárás szerint fúziós szignálszekvenciákat hozhatunk létre az alkalmazott promoterhez (például PH05), természetben kapcsolt gén szignálszekvenciájának (ha van jelen) egy részét ligáivá a hirudin vagy más heterológ fehérje szignálszekvenciájának egy részéhez. Azok a kombinációk kedvezőek, amelyek pontos hasítást tesznek lehetővé a szignálszekvencia és például a deszulfatohirudin aminosavszekvencia között. A konstrukcióban további szekvenciák, például pro- vagy térköztartó (spacer) szekvenciák, amelyek hordozhatnak speciális feldolgozószignálokat is, a prekurzor molekulák pontos feldolgozása megkönnyítésére. Egy másik eljárás szerint olyan fúziós fehérjéket alakíthatunk ki, amelyek lehetővé teszik a megfelelő érést in vivő vagy in vitro. így például a feldolgozószignálok egy Lys-Arg gyököt tartalmaznak, amelyet egy, a Golgi-membránokban elhelyezkedő élesztőendopeptidáz felismer. A jelen találmány szerinti eljárásban előnyös szignálszekvenciák az élesztő PH05 génnek azok a szekvenciái, amelyek az alábbi képletű szignálpeptidet kódolják:

Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala, valamint az élesztőinvertáz génnek azok a szekvenciái, amelyek az alábbi képletű szignálpeptidet kódolják:

Met Leu Leu Gin Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys Ile Ser Ala

Heterológ fehérjét kódoló genom DNS-szekvenciák izolálhatok természetes forrásokból, vagy másolatDNS (cDNS) állítható elő a megfelelő komplementer mRNS-ből vagy kémiai és enzimes folyamatokkal önmagában ismert módon.

így a deszulfatohirudint kódoló DNS-szekvencia ismert vagy genom pióca-DNS-ből izolálható, vagy kettős szálú komplementer deszulfatohirudin DNS (deszulfatohirudin ds cDNS) állítható elő deszulfatohirudin mRNS-ből, vagy a deszulfatohirudin aminosavszekvenciáját kódoló gén kémiai és enzimatikus eljárásokkal állítható elő.

Az élesztő átírás terminációs szignáljait tartalmazó DNS-szekvencia előnyösen egy olyan élesztőgén 3’ szegélyezőszekvenciája, amely megfelelő szignálokat tartalmaz az átírásbefejezéshez és poliadenilezéshez. Megfelelő 3’ szegélyezőszekvenciák például az alkalmazott promoterhez természetesen kötött élesztőgén szegélyezőszekvenciái. Az alkalmazott szegélyezőszekvencia az élesztő PH05 gén szegélyezőszekvenciája.

Az élesztőpromoter kívánt esetben a szignálpeptidet kódoló DNS-szekvencia, egy heterológ fehérjét kódoló DNS-szekvencia és az élesztő transzkripciós terminációs szignálokat tartalmazó DNS-szekvencia működőképesen vannak egymáshoz kapcsolva; azaz olyan módon vannak egymáshoz rendelve, hogy normá5

HU 218 731 Β lis működésük fennmaradjon. Az elrendezés olyan, hogy a promoter hat a heterológ gén (amelyet kívánt esetben szignálszekvencia előz meg) megfelelő kifejeződésére, a transzkripciós terminációs szignálok hatnak az átírás befejezésére és a poliadenilezésre, és a kívánt esetben jelen levő szignálszekvencia a megfelelő leolvasókeretben kapcsolódik a heterológ génhez olyan módon, hogy a szignálszekvencia utolsó kodonja közvetlenül kapcsolódik a heterológ fehérjét kódoló gén első kodonjához, így a fehérje kiválasztódása következik be. Ha a promoter és a szignálszekvencia különböző génekből származik, a promoter előnyösen a promoterhez természetesen kapcsolt gén ATG-je és a nagyobb mRNS start között csatlakozik a szignálszekvenciához. A szignálszekvenciának rendelkeznie kell saját ATG-val a transzláció beindításához. Ezeknek a szekvenciáknak a csatlakozását szintetikus oligonukleotid kapcsolók segítségével hajthatjuk végre, amelyek egy endonukleáz felismerő szekvenciáját hordozzák.

A kifejező kazettán kívül a találmány szerinti eljárásban alkalmazott hibrid vektorok tartalmaznak egy élesztőreplikációs origót. Következésképpen a hibrid vektorok a kétmikronos DNS-ből származó, a replikációs origót tartalmazó DNS-szegmenst tartalmazzák, vagy ha egy kétmikronos DNS-től mentes élesztőtörzset alkalmazunk, a teljes kétmikronos DNS-t tartalmazzák. A vektorok utóbbi típusa előnyös. A jelen találmány szerinti előnyös hibrid vektorok a teljes kétmikronos DNS-t tartalmazzák meg nem szakított formában, vagyis a kétmikronos DNS-t először valamely restrikciós endonukleázzal elhasítjuk, és a linearizált DNS-t az újból körré zárás előtt összekapcsoljuk a vektor további komponenseivel. A restrikciós helyet úgy választjuk ki, hogy a kétmikronos DNS REP1, REP2 és FLP génjeinek és ŐRI, STB, IRI és IR2 helyeinek normális fünkciója fennmaradjon. Kívánt esetben a restrikciós helyet úgy választjuk meg, hogy a kétmikronos DNS D génje ép maradjon. Az előnyös restrikciós helyek a D génen belül elhelyezkedő egyedi Pstl hely és az összes említett géneken és helyeken kívül elhelyezkedő egyedi Hpal és SnaBI helyek.

A jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazott hibrid vektorok előnyösen magukban foglalnak egy vagy több, előnyösen egy vagy két, élesztőre vonatkozó szelektív genetikai markert, és bakteriális gazdaszervezethez, elsősorban Escherichia colihoz tartozó markért és replikációs origót.

Ami az élesztőhöz szolgáló szelektív génmarkereket illeti, bármilyen marker gén alkalmazható, amely megkönnyíti a transzformánsok szelekcióját a marker gén fenotípusos kifejeződése következtében. Megfelelő markerek élesztőhöz például azok, amelyek antibiotikumrezisztenciát fejeznek ki, vagy auxotróf élesztőmutánsok esetében azok a gének, amelyek kiegészítik a gazdaszervezet hiányosságait. A megfelelő gének például rezisztenciát hordoznak G418 antibiotikumokra, higromicinre vagy bleomicinre, vagy prototrófiát adnak auxotróf élesztőmutánsoknak; ilyenek például az URA3, LEU2, LYS2 vagy TRP1 gének.

Mivel a hibrid vektorok sokszorozását megfelelően el lehet végezni E. coliban, előnyös, ha a hibrid vektorban van valamely E. coli genetikai marker és E. coli replikációs origó. Ezeket E. coli plazmidokból, például pBR322-ből vagy valamely pUC plazmidból, például pUC18-ból vagy pUC19-ből kapjuk, amelyek tartalmaznak mind E. coli replikációs origót, mind valamely antibiotikumra, például ampicillinre rezisztenciát átadó E. coli genetikai markert.

A jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazott hibrid vektorokat a szakterületen ismert eljárásokkal állítok elő, például a kifejező kazettát, amely egy élesztőpromotert tartalmaz működőképesen összekapcsolva egy heterológ fehérjét kódoló DNS-szekvenciával, és olyan DNS-fragmentum összekapcsolásával, amelyek előre meghatározott sorrendben szelektív genetikai jellemzőket tartalmaznak élesztőhöz és bakteriális gazdaszervezetekhez, továbbá replikációs origókat tartalmaznak élesztőhöz és bakteriális gazdaszervezetekhez.

ysca karboxipeptidáz-aktivitást nélkülöző élesztőtörzsek

A jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazott élesztőtörzsek ysca-aktivitás nélküliek. Az élesztőtörzsek előnyösen kettős, hármas vagy négyes mutánsok, vagyis hiányosak további élesztőpeptidáz-aktivitásokban is.

Proteinátok széles választékát (például azokat, amelyeket már említettünk) jellemezték már Saccharomyces cerevisiae élesztőben [Achstetter T. és Wolf D. H.: Yeast 1, 139-157 (1985)]. Ezen proteázok többségének aktivitását nélkülöző mutánsokat izoláltak és tanulmányoztak már biokémiai úton. Bizonyos proteázok távollétének következményeit megvilágították, és néhány tulajdonság alkalmasnak bizonyult proteázhiányos mutánsok de novo izolálására. Mivel a spontán mutációk gyakorisága alacsony, az élesztőket általában mutagénekkel kezelik, például röntgensugárral vagy UV-besugárzással, vagy kémiai mutagénekkel, amelyek szerfölött hatékonyak és 1 χ ΙΟ^-4—10³ arányban indukálhatnak mutációkat génenként nagymértékű pusztulás nélkül. Azok a proteázok, amelyek a jelen találmány szerinti élesztőtörzsekből hiányoznak, nem végeznek nélkülözhetetlen tevékenységet a sejt metabolizmusában; ennek megfelelően azok a mutációk, amelyek teljes mértékben elroncsolják ezeknek a fehérjéknek az aktivitását, nem letálisak. Az említett proteázok (ysca, yscB, yscA, yscY és yscS) egyes mutáns típusait külön-külön izolálhatjuk mutagenezis után. Az izolálás és szelekció telepátvizsgálási vizsgálatokon alapul, amelyek jól ismertek a szakterületen.

Egy második és hatékonyabb eljárás a kívánt egyes vagy többszörös proteázhiányok bevezetésére az élesztőgenomba a helyspecifikus mutagenezis vagy génszéttördelés vagy génhelyettesítés [Rudolph H. és munkatársai: Gene 36, 87-95 (1985)]. Amikor a genetikai szekvencia ismert, mint például az yscB proteáz, yscY karboxipeptidáz és ysca karboxipeptidáz esetében, a genom proteáz gént beiktatással, helyettesítéssel vagy kiiktatással lehet hiányossá tenni, a jól ismert helyspecifikus mutagenezises eljárást alkalmazva [lásd például Zoller M. J. és Smith H.: Methods Enzymol. 100, 468 (1983)], amely magában foglalja egy megfelelően meg6

HU 218 731 Β tervezett mutagén oligodezoxiribonukleotid primer előállítását. Egy másik módszer szerint a genomiális proteázgén idegen DNS-sel helyettesíthető, vagy az említett idegen DNS a proteázgén megfelelő restrikciós helyébe iktatható. így például olyan élesztőmutáns előállítására, amelyből hiányzik az ysca peptidázaktivitás (kex mutáns), idegen DNS-t iktatnak be a genom KEX1 génjében levő megfelelő restrikciós helybe. Abban az esetben, ha az alkalmazott élesztőtörzs aminosavdeficiens vagy purinbioszintézis valamely enzimét kódoló kromoszomális géndeficiens, egy megfelelő ép gén iktatható be a kromoszomális KEX1 génbe, így idézve elő prototrófiát az auxotróf élesztőtörzsben, és a genotípus megváltoztatható ugyanakkor KEX 1-ről kex 1-re. A génhelyettesítéses vagy irányított mutagenezises munkamenetek általánosan alkalmazottak a szakterületen és teljes mértékben reprodukálhatók.

Az eddigi eljárás többszörös proteázhiányos törzsek előállításához, például olyan törzsekhez, amelyből hiányzik az ysca és yscB aktivitás, meiotikus keresztezésből és ezt követő tetrádelemzésből áll. A tetrádok, amelyek a diploid sejtekből származnak, standard genetikai technikák szerint vannak szétdarabolva. A véletlenszerű kiválogatás egy tetrád négy spórája között lehetővé teszi kettős vagy többszörös mutánsok megalkotását egymás utáni keresztezésekben. A véletlenszerű spóraelemzést szintén lehet alkalmazni egy másik rendszerként.

Mivel egyes proteázoktól mentes, ráadásul kettős mutánsok rendelkezésre állnak genetikai törzsgyűjteményekből, háromszoros és négyszeres mutánsokat reprodukálhatóan kombinálhatunk ismert, egymást követő meiotikus keresztezési technikákkal.

A Saccharomyces cerevisiae megfelelő kiindulótörzsei között találjuk például a 96. kexl törzset, amely a Yeast Genetic Stock Centertől (Berkeley) szerezhető be, az élesztő A peptidáz (yscA) negatív AB 103 (ATCC 20673) és ABI 10 (ATCC 20796) törzseket, az élesztőpeptidáz B(yscB) negatív HT246, H426 és H449 törzseket (ez utóbbi ráadásul cir° is), amelyeket a Deutsche Sammlung von Mikroorganismennél deponáltunk (Braunschweig, Német Szövetségi Köztársaság) 4084, 4231, illetve 4413 deponálási számon, a Β, Y és B élesztőpeptidáz (yscB, yscY és yscS) negatív BYS232-31-42 törzset és az A, Β, Y és S élesztőpeptidáz (yscA, yscB, yscY és yscS) negatív ABYS törzset.

Amint fentebb említettük, a jelen találmány szerinti eljárásban előnyös élesztőtörzsek mentesek az endogén kétmikronos DNS-től. A kétmikronos plazmid nagy kópiaszámú, önreplikáló, extrakromoszomális DNS-elem, amelyet a Saccharomyces cerevisiae legtöbb törzse tartalmaz. A kétmikronos plazmid legfeltűnőbb szerkezeti jellemvonása a két 559 bp-s fordított ismétlődése (IR1 és IR2), amelyek a plazmidot két különböző hosszúságú DNS-területté osztják. A homológ rekombináció e között a két azonos IR-szekvencia között két molekuláris izomer (A forma és B forma) képződését eredményezi. A kétmikronos plazmid stabilitását három funkciókat kódoló plazmid adja meg. A REP1 és REP2 géntermékek transz-helyzetben ható fehéijék, amelyek a kétmikronos plazmid stabil szétválasztásához szükségesek. E közül a kettő közül a REP1 valószínűleg a legfontosabb annyiban, hogy a szétválasztás hatékonysága függ a REP1 géntermék adagolásától [Cashmore A. és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 203, 154 (1986)]. Ez a két fehérje az STB (REP3) helyen keresztül és azon hat, ez a hely fontos cisz-helyzetben ható elem a plazmidban [Jagaram M. és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 5, 2466-2475 (1985); Viet B. és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 5, 2190-2196 (1985)].

A Saccharomyces cerevisiae ilyen cir° törzsei ismeretesek vagy a szakterületen ismert módon állíthatók elő [lásd például Hollenberg C. P.: Curr. Top. Microbiol. Immun. 96, 119 (1982)]. Az alábbi alternatív munkamenet cir° törzsek előállítására azon a feltételezésen alapul, hogy a kétmikronos plazmid kezelése egy másik plazmiddal magával vonja az STB hely adagjának növekedését a REP1 és REP2 fehéijék kárára. A REP1 és REP2 fehérjék relatív csökkenése az endogén kétmikronos plazmid instabilitásához vezethet.

Az alkalmazott második plazmid előnyösen hibás a REP1 génben, vagy ez hiányzik belőle. Az ilyen plazmidra példa a pDP38, amelyből a REP1 génen kívül egy fordított ismétlődés (IR2) is hiányzik. Ez ennek nagy kópiaszámú kifejeződését függővé teszi a REP1 fehérjekomplementációtól az endogén kétmikronos plazmid révén. Ez két szelektív markert tartalmaz: az URA3-at, amelyet alkalmazunk mind nagy, mind kis kópiaszámú szituációkban, és a dLEU2-t, amely csak nagy kópiaszámú szituációkban alkalmazható [Erhart E. és munkatársai: J. Bacteriol. 625 (1968)].

Egy élesztőtörzset, amely Ura- és Leu- típusú, pDP38 plazmiddal transzformáinak, és szelektálják Ura- telepekre. A szelekció uracilmentes lemezeken (Ura-szelekció) sokkal jobb transzformációs gyakoriságot ad, mint a szelekció leucinmentes lemezeken (Leu-szelekció), mivel az URA3 gén sokkal jobban kifejeződik, mint a hiányos dLEU2 gén. Egy egyedi telepet kiválasztanak és Leu-szelekciós lemezre szélesztenek, amely különböző méretű és alakú telepeket ad. A legkisebb telepek közül néhányat újra szélesztenek Ura-szelekciós lemezekre, és erről replikalemezeket készítenek Leu szelekciós lemezekre. Olyan telepeket választanak ki, amelyek növekednek Ura-szelekcióra, de csak nagyon lassan növekednek Leu-szelekcióra. A növekedés Ura-szelekciós lemezeken azt mutatja, hogy a pDP38 plazmid még jelen van, és hogy a csupán lassú növekedés Leu-szelekcióra nem plazmid elvesztésének következménye, és a hiba a növekedésben Leu-szelekciós körülmények között arra utal, hogy a pDP38 nem képes kiegészíteni ezt a markert. Az utóbbi tényt kétféleképpen lehet megmagyarázni: A. a LEU2 gén a pDP38-on mutálódott, vagy B. a plazmid nem tudja komplementálni a leu2-t, mert nem tudja emelni a kópiaszámát, arra utalva, hogy a kétmikronos plazmid nem áll rendelkezésre (vagyis elveszett), hogy komplementálja a REP1 génterméket.

Ez a két lehetőség nagyon könnyen megkülönböztethető. Az első esetben az említett telepeknél látott minimális növekedés (ami nem azonos a pDP38 nélküli sej7

HU 218 731 Β tek abszolút nulla növekedésével) azt mutatja, hogy bizonyos LEU2 kifejeződés van jelen. A második pont közvetlenül vizsgálható, mivel a kétmikronos plazmid hiányában a pDP38 plazmid csupán ARS típusú plazmidként működik, vagyis olyannyira labilis, hogy a telepek legtöbbje néhány generáció alatt elvész. Következésképpen, amikor egyedi telepeket szélesztünk YPD lemezre, és egyedi telepeket viszünk át és készítünk róluk replikalemezeket uracilmentes lemezekre, akkor csak néhány növekszik Ura szelekció körülményei között. Nem növekvő telepeket vizsgálunk át pUC-ra és kétmikronos szekvenciákra való hibridizálással. Azok a telepek, amelyek nem mutatnak hibridizálási jeleket, mentesek a pDP38 plazmidtól és az endogén kétmikronos plazmidtól (cir° törzsek). A kapott cir° törzseket a fentebb leírtak szerint kezeljük, hogy olyan élesztőmutáns törzseket alakítsunk ki, amelyekből hiányzik a peptidáz, elsősorban az ysca-aktivitás, és ezenkívül hiányzik belőlük a kétmikronos DNS is.

Az ysca-aktivitás hiányán kívül a jelen találmány szerinti eljárásban előnyös élesztőtörzsből hiányoznak még további peptidázok is az yscA, yscB, yscY és yscS peptidázok közül, és hiányzik a kétmikronos DNS is. A legelőnyösebb élesztőtörzsekből, hiányzik az yscaés yscY-aktivitás, és kívánt esetben hiányozhat az yscB- és yscS- vagy yscA- és yscB-aktivitás, és hiányzik a kétmikronos DNS.

A jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazott élesztőtörzsek, amelyek egy, az élesztőre heterológ fehérjét kódoló gént tartalmazó hibrid vektort hordoznak, az említett fehérjét homogén formában termelik, azaz bármiféle C-terminálison rövidített melléktermék nélkül. Transzformált élesztőtörzsek

A találmány szerinti eljárásban olyan élesztősejteket tenyésztünk, amelyekből hiányzik az ysca karboxipeptidáz-aktivitás, és amelyek olyan hibrid vektorral vannak transzformálva, amely egy heterológ fehérjét kódoló DNS-szekvenciát és ehhez működőképesen kapcsolt élesztőpromotert tartalmaz.

A megfelelő élesztőgazdasejtek között találjuk azokat a Saccharomyces cerevisiae sejteket, amelyekből hiányzik az ysca karboxipeptidáz-aktivitás és hiányoznak kívánt esetben további peptidázaktivitások is, és amelyekből ki vannak emelve az endogén kétmikronos plazmidok (lásd fentebb).

Az élesztő transzformálását a hibrid vektorral a Hinnen és munkatársai által leírt [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)] eljárással hajthatjuk végre. Ez az eljárás három lépésre osztható fel:

(1) Az élesztősejtfalnak vagy részeinek eltávolítása különböző glükozidázkészítményeket alkalmazva, például csigabélnedveket (például Glusulase vagy Helicase gyártmánynevű készítményeket) vagy mikroorganizmusokból nyert enzimkeverékeket (például Zymolase gyártmánynevű készítményt) alkalmazva ozmotikusán stabilizált oldatokban (például 1 mol/literes szorbitoldatban).

(2) A „meztelen” (csupasz) élesztősejtek (szferoplasztok) kezelése a DNS-vektorral PEG (polietilénglikol) és Ca²⁺-ionok jelenlétében.

(3) A sejtfal regenerálása és a transzformált sejtek kiválasztása szilárd agarrétegen. A regenerálást hagyományosan úgy végezzük, hogy a szferoplasztokat agarba ágyazzuk. így például olvadt agart (mintegy 50 °C) összekeverünk a szferoplasztokkal; az oldat hűtésekor a növesztési hőmérsékletre (mintegy 30 °C) szilárd réteget kapunk. Ez az agarréteg arra szolgál, hogy megakadályozza a gyors diffúziót és az esszenciális makromolekulák elvesztését a szferoplasztokból, és ezáltal megkönnyítse a sejtfal regenerálását. A sejtfal regenerálását elérhetjük azonban (bár kisebb hatékonysággal) a szferoplasztok szélesztésével is előre elkészített agarrétegek felszínére.

A regeneráló agart előnyösen olyan módon készítjük el, hogy lehetővé váljék egyidejűleg a transzformált sejtek regenerálása és szelekciója. Mivel az aminosavvagy nukleotid bioszintetikus utak enzimjeit kódoló élesztőgéneket alkalmazzuk általában szelektív markerként (lásd fentebb), a kialakítást előnyösen élesztő minimáltápagaron végezzük. Ha a regenerálásnak nagyon nagy hatékonysága szükséges, az alábbi kétlépéses munkamenet az előnyös: (1) a sejtfal regenerálása gazdag komplex tápközegben, és (2) a transzformált sejtek szelekciója a sejtréteg replika telepképzésével szelektív agarlemezekre.

A jelen találmány szerinti eljárással ugyancsak előállítható a (IV) általános képletű deszulfatohirudin

Xj Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn X₃ Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu X₃ Asn Gin Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro X₄ Pro Gin Ser X₅ Asn Asp Gly Asp Phe Gin Glu Ile Pro Gin X₆ ahol X] jelentése Val-Val dipeptid, X₂, X₃ és X₄ jelentése Lys, X₅ jelentése His és X₆ jelentése Glu-Tyr-LysArg, vagy Ser-Phe-Arg-Tyr, vagy Trp-Glu-Leu-Arg.

A jelen találmány szerinti eljárással kapható ismert heterológ fehérjéket önmagában ismert módon alkalmazhatjuk például emberi és állati betegségek kezelésében és megelőzésében. így például a humán ANP natriuretikus, diuretikus és érgörcsoldó aktivitásokat mutat, és alkalmazható szív- és érrendszeri homeosztázis szabályozásában.

A deszulfatohirudinvegyületeket, a természetes hirudinnal analóg módon, alkalmazhatjuk trombózis gyógyításához és megelőzéséhez, akut sokkterápiához, pusztító koagulopátia terápiájához és hasonlókhoz, amint ez a 168 342 számú európai szabadalmi bejelentésben le van írva.

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.

Az alábbi kísérleti részben a jelen találmány különböző kiviteli módjait írjuk le hivatkozással a mellékelt ábrákra.

Az 1. ábra S. cerevisiae transzformált KEX1 és kexl törzseiből kinyert deszulfatohirudinok kromatogramjait mutatja be.

A 2. ábra a hirudin HV1 gén - beleértve a PH05 szignálszekvenciát - in vitro szintézisét bemutató vázlatos diagram az előnyös élesztőkodonokkal. Az alkalmazott 21 oligonukleotidot számozott, illetve pontozott vonalakkal jelöljük.

HU 218 731 Β

A 3. ábra vázlatosan bemutatja a pDP33 plazmid megalkotását.

A 4. ábra vázlatosan bemutatja a pDP34 és pDP38 megalkotását.

Az 5. ábra vázlatosan bemutatja a pDP34/GAPFL-YHIR kifejező plazmid megalkotását.

A 6. ábra vázlatosan bemutatja pDP34/PH05(-173)-YHIR kifejező plazmid megalkotását.

A 7. ábra vázlatosan bemutatja a pDP92 plazmid megalkotását.

A 8. ábra S. cerevisiae BYSKEX1 és BYSkexl tenyészetekből származó vad típusú hirudin és HV1-KR, HV1-WQLP és HV1-SFRY hirudinmutánsok kromatogramjait mutatja be.

1. példa

96. S. cerevisiae kexl mutáns törzs keresztezése

BYS S. cerevisiae törzzsel, és a spórák elemzése a-faktor-kiválasztási kapacitásra és ysca (KEX1 gén) karboxipeptidáz-aktivitásra A 96. S. cerevisiae kexl mutáns törzset (a, kexl, ade2, thrl), amelyet a Yeast Genetic Stock Centertől (Berkeley, Amerikai Egyesült Államok) kapunk, BYS232-31-42 S. cerevisiae törzsbe (a, prbl-1, prcl-1, cpsl-3, lys2, leu2, his7) [Achstetter T. és Wolf D. H.: EMBO J. 4, 173-177 (1985); Wolf D. H. és Ehmann C.: J. Bacteriol. 147, 418-426 (1981)] keresztezzük, amely törzs hordozza a vad típusú KEX1 alléit. kexl/KEXl genotípusú diploid heterozigóta sejteket izolálunk ebből a keresztezésből. A tetrádokat, amelyek a diploid sejtekből származnak, standard genetikai technikák szerint szétválasztjuk [Hawthorne D. C. és Mortimer R. K.: Genetics 45, 1085-1110 (1960); Methods in Yeast Genetics (szerkesztők: Sherman F. és munkatársai), Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1986)].

Az egyes tetrádok négy spóráját megvizsgáljuk arra a képességükre, hogy α-faktort választanak-e ki. Abból a célból, hogy megkülönböztessük a KEX1 vad típusú és kexl mutáns telepeket, a feromon-szuperérzékeny S. cerevisiae RC629 vizsgálótörzset (a, sst-2, ade2-l, ural, his6, metl, canl, cyh2, rme) alkalmazzuk [Chan R. K. és Otte C. K.: Mól. Cell. Bioi. 2, 11-20 (1982); Chan R. K. és Otte C. K.: Mól. Cell. Bioi. 2, 21-29 (1982)]. Amint az egyedi nukleáris gének által kódolt jellemvonásokból várható, az összes vizsgált tetrádból az egyes tetrádok két spórája választja ki az a-faktort, míg a másik két spóra α-faktort választ ki. Az α-párosodó típusú, vad típusú KEX1 telepek nagymértékben gátolják a vizsgálótörzs növekedését, és így nagy körgyűrűt alakítanak ki maguk körül, mivel ezek képesek teljes mértékben feldolgozni az afaktor prekurzort és négy aktív α-faktormolekulát termelni egy prekurzor molekulából. Ezzel ellentétben, a kexl mutáns telepek kisebb mértékben gátolják a vizsgálótörzs növekedését, és így kis körgyűrűt alakítanak ki maguk körül, mivel ezek csupán egy érett a-faktormolekulát képesek kialakítani egy prekurzor molekulából.

Számos komplett tetrádot, amelyet a fentebb leírt feromonvizsgálat szerint a kexl génben hiányosnak azonosítunk, végül megvizsgálunk ysca karboxipeptidáz fajlagos aktivitásra. Sejteket növesztünk, ezek membránjait előállítjuk és megvizsgáljuk ysca-aktivitásra, szubsztrátumként Cbz-Tyr-Lys-Arg-ot alkalmazva, amint ezt Wagner J. C. és Wolf D. H. leírták [FEBS Lett. 221, 423-426 (1987)]. Az a tény, hogy a karboxipeptidáz ysca-aktivitás hiányzik a kexl mutáns sejtekben, azt jelzi, hogy a KEX1 ennek az enzimnek a strukturgénje. Ez maga után vonja azt, hogy az ysca karboxipeptidáz valóban érdekelt az α-faktor karboxiterminális feldolgozásában.

2. példa.

Igazolt kexl mutánsok osztályozása további, yscB, yscY és yscS proteázhiányosságokra A S. cerevisiae kexl mutánsokat más proteázokra (yscB proteináz, yscY karboxipeptidáz és yscS karboxlpeptidáz) való hiányosságok és további növekedésifaktor-igények szerint osztályozzuk.

Kexl mutánsok sejtanyagát, amelyet YPD (Difco) tápközegben levő stacionárius fázisból állítunk elő, szuszpendáljuk 200 pl 20 mmol/literes trisz-HCl pufferban (pH 7,2), Eppendorf-mikrocentrifugában, és üveggyöngyöket (0,4 mm átmérő) adunk hozzá a térfogat kétharmadáig. A szuszpenziót erőteljesen rázatjuk háromszor 1 percig Vortex-keverőben, miközben jégen hűtjük.

Az 5 perces centrifugálás lehetővé teszi nyers felülúszó-kivonat kinyerését. Ezeket az extraktumokat 0,1 mol/1 imidazol.HCl pufferral, amely 0,1 mmol/1 ZnCl₂-ot is tartalmaz, szemben dializáljuk abból a célból, hogy aktiváljuk a proteázokat, és eltávolítsuk a szabad aminosavakat a kivonatokból.

Az yscB-aktivitásokat az Azocoll-vizsgálat szerint mérjük [Ulane R. E. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 251, 3367 (1976); Cahib E. és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 50, 180 (1973); Saheki T. és munkatársai: Eur. J. Biochem. 42, 621 (1974). A fehérjekoncentráció-mérések után az egyes minták aliquotjait 0,1 mol/1 nátrium-foszfát-pufferral (NaPi; pH 7,0) úgy töltjük fel 100 μΐ-re, hogy ezzel beállítsuk a kívánt fehérjemennyiséget. A fehérjeoldathoz 500 μΐ Azocoll-szuszpenziót (240 mg 10 ml 0,1 mol/l-es NaPi-pufferban, pH 7,0) adunk. Ezeket a keverékeket 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy órán át kevertetés mellett. 500 μΐ 10%-os triklór-ecetsav hozzáadása után, amely leállítja a reakciót, a keveréket kétszer centrifugáljuk, és a felülúszók abszorpciós spektrumait 520 nm-nél mérjük.

Az yscY és yscS karboxipeptidázok aktivitását a Cbz-Gln-Leu kromogén szubsztrátumot alkalmazva mérjük [Wolf D. H. és munkatársai: FEBS Lett. 91, 59 (1978); Wolf D. H. és munkatársai: Eur. J. Biochem. 73, 553 (1977)]. A dializált extraktumokat három részre osztjuk, és ezekből kettőhöz fenil-metil-szulfonilfluoridot adunk 1 mmol/1 végső koncentrációban, vagy EDTA-t adunk 5 mmol/1 végső koncentrációban, hogy szelektíven gátoljuk a két proteázaktivitást. Nevezetesen

HU 218 731 Β a PMSF gátolja az yscY karboxipeptidáz-aktivitást és az EDTA gátolja az yscS karboxipeptidáz-aktivitást. A keverékeket az inhibitorokkal egyenként inkubáljuk 25 °C hőmérsékleten egy órán át, hogy a gátlás teljessé váljon. A fehéijekoncentráció meghatározása után az egyes mintákból két aliquotot inhibitorral és egy aliquotot mint kontrollt inhibitor nélkül 0,1 mol/1 NaPi-pufferral (pH 7,4) 50 μΐ-re töltünk fel abból a célból, hogy azonos fehéijemennyiségeket állítsunk be. Ezekhez a fehéijeoldatokhoz az alábbi vizsgálóoldatokat adjuk:

500 pl I. vizsgálóoldat:

L-aminosav-oxidáz 0,24 mg/ml torma-peroxidáz 0,40 mg/ml

0,01 mmol/1 MnCl₂,

0,1 mol/1 NaPi-pufferban (pH 7,4) pl II. vizsgálóoldat:

o-dianizidin, vízben 2 mg/ml

500 pl III. vizsgálóoldat:

mmol/1 Cbz-Gly-Leu

0,2 mol/1 kálium-foszfát-pufferban (pH 7,4).

A keverékeket 28 °C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk, és 100 pl 20%-os Triton X-100 hozzáadása után (amely a reakció leállításához szükséges) az abszorpciót 405 nm-nél méijük.

Az ezt követő transzformálás céljából egy aminosav-auxotróf markert értékelünk leucinra replikatechnikával olyan minimállemezeken, amelyekhez adunk adenint, treonint, lizint és hisztidint, és vagy adunk, vagy nem adunk leucint.

A fentebb leírt vizsgálatok segítségével izoláljuk a S. cerevisiae BYSkexl nevű mutánsokat, amelyek négyszeres proteázhiányt (a, prb-1, prc-1, cps-3, kexl), továbbá leucinigényt mutatnak.

3. példa

Saccharomyces cerevisiae négyszeres proteázhiányos mutáns transzformálása A pJDB207/PH05-HIR plazmidot (225 633 számú európai szabadalmi bejelentés) bevezetjük a BYSkexl (a, prb-1, prc-1, cps-3, kex-1, leu2) négyszeres proteázhiányos mutánsba és BYS232-31-42 (a, prb-1, prc-1, cps-3, lys2, leu2, his7) KEX1 vad típusú törzsbe mint kontrollba, a Hinnen és munkatársai által leírt transzformációs munkamenetet [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)] alkalmazva.

Két különböző élesztőtörzset kapunk a korai logaritmikus fázisban 100 ml YPD tápközegben (00^=0,2), mossuk 25 ml 0,8 mol/literes szorbitoldattal, és újraszuszpendáljuk 5 ml azonos szorbitoldatban. Ezekhez 5 ml sejtszuszpenziót és 30 ml zimolázt (ZYMOLASE-100T Arthobacter luteusból, Seikagaku Kogyo Co. LTD; 10 mg/ml 0,8 mol/1 szorbitban) adunk. A keverékeket egyenként gyengéden kevertetjük 100 ml-es rázólombikban rázógépen (110 fordulat/perc), 30 °C hőmérsékleten mintegy 30 percig. 5 perces időközökben 100 pl-es aliquotokat veszünk ki, hígítjuk 10 ml desztillált vízzel, és a hígított minta abszorbanciáit 600 nm-nél méijük, hogy ellenőrizzük a szferoplasztképződés folyamatos előrehaladását. Abból a célból, hogy jó szferoplasztképződést kapjunk, a különbségnek az abszorbanciában a zimolázzal végzett kezelés előtt vagy után nagyobbnak kell lennie, mint 10 szorzófaktor. A szferoplaszttá alakított sejteket 0,8 mol/literes szorbitoldattal kétszer mossuk, újraszuszpendáljuk 25 ml HE30 tápközegben (2 mol/1 szorbit YPD tápközegben), és inkubáljuk 100 ml-es rázólombikban gyengéd kevertetés mellett rázógépen (110 fordulat/perc) 30 °C hőmérsékleten 1 órán át. A sejteket centrifugáljuk (3000 fordulat/perc, 5 perc) és óvatosan újraszuszpendáljuk 1 ml HE 31 oldatban [10 mmol/1 triszHCl (pH 7,5), 10 mmol/1 CaCl₂, 0,9 mol/1 szorbit]. Ezekhez a 100 pl-es szuszpenziókhoz 4 pg plazmid DNS-t adunk. A keveréket 15 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. 1 ml 20%-os polietilénglikol 4000-t (PEG4000) adunk az egyes csövekbe, és további 30 percen át inkubálunk szobahőmérsékleten, majd centrifugálunk (3000 fordulat/perc, 3 perc), és az így kapott anyagot újraszuszpendáljuk 500 pl 0,8 mol/l-es szorbitoldattal. A szferoplasztot a DNS-sel összekeveijük 10 ml regeneráló agarral [1 mol/1 mannit, 6,8 g/1 élesztő nitrogénbázis (w/o AA, Difco), 10 g/1 L-aszparagin, 1,0 g/1 L-hisztidin, 1,0 g/1 adenin, 1,0 g/1 treonin, 1,0 g/1 lizin és 3% agart], és fedőrétegként olyan lemezekre öntjük, amelyek azonos összetételű alapagarréteget tartalmaznak. A lemezeket 30 °C hőmérsékleten 96 órán át inkubáljuk, amíg a transzformáns telepek megjelennek.

Egy egyedi transzformáns élesztőtelepet kiemelünk, és élesztő szintetikus minimáltápközegen növesztünk [8,4 g/1 élesztő nitrogénbázis (w/o AA), 10 g/1 Laszparagin, és 1,0 g/1 L-hisztidint, amely tápközeg szolgáltat adenint, treonint, lizint és hisztidint, de nem szolgáltat leucint. A BYSkexl négyszeres proteázhiányos mutáns telepét és a háromszoros proteázhiányos BSKEX1 kontrolltörzsből származó telepet

Saccharomyces cerevisiae BYSkexl/pJDB207/PH05-HIR-nek, illetve Saccharomyces cerevisiae

BYSKEXl/pJDB207/PH05-HIR-nek nevezzük.

4. példa

Saccharomyces cerevisiae pJDB207/PH05-HIR-rel transzformált törzseinek tenyésztése Saccharomyces cerevisiae

BYSkexl/pJDB207/PHO-HIR és

BYSKEXl/pJDB207/PH05-HIR transzformánsok sejtjeit előtenyészetként rázatjuk 10 ml H41 élesztő komplett tápközegben [4,5 g/1 kazaminosav, 4 g/1 élesztőkivonat, 20 g/1 szacharóz; 20 g/1 glükóz; 3,6 g/1 (NH₄)₂SO₄; 0,2 g/1 MgSO₄.7H₂O; 0,013 g/1 CaCl₂.H₂O és 1 ml/1 nyomelemkeverék (10 g/1 FeSO₄.7H₂O; 50 g/1 ZnSO₄.7H₂O; 3,3 g/1 CuSO₄.5H₂O; 3 g/1 MnSO₄.H₂O; 2 g/1 CoCl₂.6H₂O és 1 g/1 (NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O) 28 °C hőmérsékleten, és 48 órán át tenyésztjük, amíg eléri a stacionárius fázist. A kinyert sejteket mossuk 0,9% NaCl-ban. 50 ml fentebb leírt élesztő szintetikus tápközeget inokulálunk 5% inokulummal. A tenyészeteket OD₆o₀=0,3 sejtsűrűségig inokuláljuk, és 28 °C hőmérsékleten kevertetjük 72 órán át 250 fordulat/perccel.

HE 41 élesztő komplett tápközeget alkalmazunk abból a célból, hogy eltávolítsuk a háttérabszorpciót a HPLC-elemzésben.

HU 218 731 Β

5. példa

BYSkexl/pJDB207/PH05-HIR és

B YSKEX1 /pJDB207/PH05-H1R Saccharomyces cerevisiae transzformánsok fermentációs tenyészeteiből származó hirudin—65-nek és ennek hirudin-64 és hirudin—63 karboxiterminális lebomlási termékeinek elemzése fordított fázisú HPLC-vel

Folyékony élesztőtenyészetekből mintákat készítünk centrifugálással, hogy tiszta oldatot kapjunk; ezt 1:10 (térfogat/térfogat) arányban hígítjuk 1 mol/l-es ecetsavval, és HPLC-elemzésnek vetjük alá az alábbi feltételek mellett.

HIBAR (MERCK) oszlopot (4x125 mm) megtöltünk fordított fázisú, széles pórusú kovasavanyaggal (71852 típus, 300-5-C18, MACHEREY-NAGEL), amelynek szférikus stacionárius fázisában a részecskeátmérő 5 pm és porozitása 300 A. Az oszlopvégződések rozsdamentes acélzárókkal vannak ellátva. Az „A” mozgó fázis vízből áll, amely 0,1% (térfogat/térfogat) trifluor-ecetsavat tartalmaz (Nanopure, BARNSTEAD). A „B” mozgó fázis 20% „A” mobil fázisból és 80 (térfogat/térfogat) acetonitrilből (HPLC-minőség, FLUKA) áll, és tartalmaz még 0,08% (térfogat/térfogat) trifluorecetsavat.

A kromatográfiás elkülönítést 1,5 ml/perc áramlási sebességnél végezzük az alábbi gradienst futtatva; az eluált anyagokat 216 nm-nél mért abszorpcióval figyeljük.

ő (perc)	% „A”	%„B”
0	90	10
1	79	21
9	79	21
17	67	33
20	0	100
22	0	100
24	90	10
32/0	90	10

Úgy készítünk standard oldatot a rendszer kalibrálásához, hogy feloldunk 1 mg tiszta deszulfatohirudint 1 ml vízben. Ebből a standard oldatból 50 pl-t injektálunk az oszlopra és kromatografáljuk, amint leírtuk, hogy a rendszert kalibráljuk.

Az 1. ábrán S. cerevisiae BYBkexl/pJDB207/PH05HIR és S. cerevisiae BYBKEXl/pJDB207/PH05-HIR tenyészeteiből kinyert hirudinok analitikai fordított fázisú folyadékkromatogramjait mutatjuk be. A kromatográfiás feltételek azonosak azzal, amelyet fentebb leírtunk. Nyilvánvaló, hogy ellentétben a BYSKEXl/pJDB207/PH05HIR törzzsel, az ysca peptidáz negatív BYSkexl/pJDB207/PH05-HIR törzs olyan deszulfatohirudinterméket („HÍR 65”) termel, amely lényegében mentes a C-terminálison rövidített HÍR-64 deszulfatohirudin-mellékterméktől, amelyből hiányzik a C-terminális Gin aminosav, és a HIR-63 mellékterméktől, amelyből hiányzik a C-terminális Leu és Gin.

6. példa

Hirudin HV1 gén in vitro szintézise előnyös élesztőkodonokkal

A hirudinkifejező kazetta kódolószekvenciáját előnyös élesztőkodonokkal szerkesztjük meg [Hall B.: J. Bioi. Chem. 257, 3026 (1982)], hogy biztosítsuk a hirudin mRNS optimális transzlációját. A kódolószekvencia tartalmazza a PH05 szignálszekvenciát a HV1 deszulfatohirudin kódolószekvenciájával megfelelő keretben fuzionálva. A szintetikus DNS 5’-vége tartalmazza az EcoRI restrikciós hely tapadós végeit.

A 3’-végnél a TAG stopkodont közvetlenül követik a BamHI hely tapadós végei. A 257 bp-s EcoRIBamHI DNS-fragmentum szekvenciáját a 2. ábrában mutatjuk be.

A 2. ábra jelzi a kettős szálú DNS-fragmentum in vitro szintéziséhez szolgáló stratégiát. 21 oligonukleotidot szintetizálunk a foszfor-amidit eljárást alkalmazva [Caruthers Μ. H.: a „Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments” című kiadványban (szerkesztők: Gassen H. G. és Láng A.), Verlag Chemie, Weinheim, Német Szövetségi Köztársaság (1982)], Applied Biosystems Model 380B szintetizálóberendezésen. Az egyes oligonukleotidok szekvenciáját a 2. ábrában mutatjuk be. Az átfedések egyediek. A liofilezett oligonukleotidokat újra oldjuk 50 mmol/1 trisz-HCl-ben (pH 8,0) 10 pmol/1 koncentrációnál. A 21 oligonukleotidot két csoportba osztályozzuk: (A) az 1-11. számúak a DNS-fragmentumot 5’ felét képviselik; (B) a 12-21. számúak a 3’ felét. A két csoportot külön kezeljük. Egy csoport egyes oligonukleotidjaiból 10-10 pikomólnyit keverünk össze. Az oligonukleotidokat 25 pl olyan oldatban foszforilezzük, amely 25 mmol/1 trisz-HCl-t (pH 8,0), 10 mmol/1 MgCl₂-ot, 10 mmol/1 NaCl-ot, 3 mmol/1 DTT-t, 0,4 mmol ATP-t és 8 egység polinukleotidkinázt (Boehringer) tartalmaz, 1 órán át 37 °C hőmérsékleten. 30 perces szobahőmérsékleten állás után mindkét keveréket (A és B) egyenként melegítjük 5 percig 95 °C hőmérsékleten vízfürdőben. A mintákat hagyjuk lassan lehűlni szobahőmérsékletre vízfürdőben egy éjszakán át. Az összeforrasztott A és B keverékeket azután jégen tároljuk.

pBR322 plazmidot hasítunk teljességig EcoRIgyel és BamHI-gyel. A nagy, 4 kb-s fragmentumot 0,6%-os preparatív agarózgélen izoláljuk. A DNS-t elektroelúcióval nyerjük ki, és DE52 ioncserélő kromatográfiával és etanolos kicsapással tisztítjuk, amint ezt a 7. példában bemutatjuk. A DNS-t újraoldjuk H₂Oban 0,4 pmol/l-nél.

pl összeforrasztott oligonukleotid A keveréket (5-5 pmol az 1-11. oligonukleotidokból), 9,5 pl B keveréket (5-5 pmol a 12-21. oligonukleotidokból), 0,4 pmol, pBR322 eredetű, 4 kb-s EcoRI-BamHl fragmentumot és 400 egység T4-DNS-ligázt (Biolabs) inkubálunk 16 órán át 15 °C hőmérsékleten.

pl-es aliquotokat alkalmazunk kompetens E. coli HB 101 Ca⁺⁺-sejtek (forgalmazza: Invitrogen) transzformálására. 12 transzformált, ampicillinrezisztens telepet növesztünk egyenként olyan LB tápközegben, amely 100 pg/ml ampicillint is tartalmaz. Plazmid DNS-t állítunk elő Holmes és munkatársai eljárásával [Anal. Biochem. 114, 193 (1981), és elemezzük EcoRI és BamHI restrikciós emésztésekkel. A 257 bp-s

HU 218 731 Β

EcoRl-BamHl beiktatással rendelkező plazmid DNSeket tovább elemezzük DNS-szekvencia-elemzéssel mindkét szálon. A 3., 11., 12., 14. és 20. oligonukleotidokat (lásd a 2. ábrát) alkalmazzuk szekvenciaelemző primerként. Egy kiónt választunk ki, amelynek korrekt szekvenciája van mindkét DNS-szálon, ezt pBR322/YHIR-nek nevezzük el.

7. példa

A pJDB2017/GAPEL-YHIRplazmid megalkotása

A pJDB207/GAPEL-YHIR élesztőplazmid a HV1 deszulfatohirudinvariáns kifejezésére az élesztő gliceraldehid-3-foszfát dehidrodenáz (GAPDH) gén rövid, konstitutív promoterjének szabályozása alatt. A deszulfatohirudin kódolószekvenciája előnyösen élesztőkodonokból áll.

pg pBR322/YHIR plazmidot emésztünk BamHI és EcoRI restrikciós endonukleázokkal. A 257 bp-s EcoRI-BamHI fragmentumot elkülönítjük a többi DNS-ífagmentumoktól 1,2%-os preparatív agarózgélen. A DNS-csíkokat etidium-bromiddal festjük meg, és UV-fény alatt 360 nm-nél tesszük láthatóvá. A 257 bp-s DNS-csíkot kihasítjuk a gélből, és elektroeluáljuk 0,2xTBE-pufferban [TBE: 90 mmol/1 trisz-bázis, 90 mmol/1 bórsav, 2,5 mmol/1 EDTA (pH 8,3)] 45 percig 100 mA-nél. A polaritás 45 másodperces megváltoztatása után a DNS-oldatot összegyűjtjük és beállítjuk 0,15 mol/1 NaCl-koncentrációra. A DNS-t 100 pl DE52 ioncserélő ágyra (Whatman) adszorbeáljuk és eluáljuk 400 pl nagy sótartalmú pufferban [10 mmol/1 trisz-HCl (pH 8,0), 1 mmol/1 EDTA, 1,5 mol/1 NaCl], A DNS-t etanollal kicsapjuk és újraszuszpendáljuk H₂O-ban 0,1 pmol/1 koncentrációban.

A pJDB207/GAPEL-HIR plazmid (225 633 számú európai szabadalmi bejelentés) tartalmazza a deszulfatohirudinhoz tartozó szintetikus gént (E. coli kodon alkalmazásra alapozva) élesztő savas foszfatáz (PH05) szignálszekvenciával megfelelő keretben. A gén a pJDB207 ingázóvektoron fejeződik ki az élesztő rövid konstitutív gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPEL) promoterjának szabályozása alatt. 10 pg pJDB207/GAPEL-HIR plazmidot emésztünk Sall-gyel és EcoRI-gyel. A 478 bp-s Sall-EcoRI fragmentum tartalmazza a Sal-Bam pBR322 részt és a GAPEL promotert. A DNS-fragmentumot 0,8%-os preparatív agarózgélen izoláljuk, elektroeluáljuk, és tisztítjuk DE52 kromatográfiával és etanolos kicsapással. A DNS-t újraszuszpendáljuk H₂O-ban 0,1 pmol/1 koncentrációban. 5 pg pJDB207/GAPEL-HIR-t emésztünk Sall-gyel és BamHI-gyel. A nagy 6,7 kb-s vektorfragmentumot izoláljuk, amint fentebb leírtuk.

0,2 pmol 478 bp-s Sall-EcoRI promoter fragmentumot, 0,2 pmol 257 bp-s, a PH05 szignálszekvenciát tartalmazó 257 bp-s EcoRI-BamHI fragmentumot, szintetikus hirudingént (élesztőkodonok) és 0,1 pmol 6,7 kbs vektorfragmentumot Egálunk 10 pl oldatban, amely 60 mmol/1 trisz-HCl-ot (pH 7,5), 10 mmol/1 MgCl₂-ot, 5 mmol/1 DTT-t, 1 mmol/1 ATP-t és 200 egység T4-DNS-ligázt (Biolabs) tartalmaz, 6 órán át 15 °C hőmérsékleten. A ligálási keverék 1 pl-es alikvotját alkalmazzuk kompetens E. coli HB101 sejtek transzformálására.

transzformált, ampicillinrezisztens telepet egyenként növesztünk 100 pg/ml ampicillint is tartalmazó LB tápközegben. Plazmid DNS-t állítunk elő Holmes és munkatársai (fentebb idézett munka) eljárásával, és Sall/HindlII kettős emésztéssel elemezzük. Egy egyedi kiónt, amely a várt restrikciós eloszlást mutatja, pJDB207/GAPEL-YHIR-nek nevezünk.

Analóg módon hozunk létre konstrukciót pJDB207/GAPEL-HIR (125 633 számú közzétett európai szabadalmi leírás) 543 bp-s Sall-EcoRI promoter fragmentumával. Az így létrejövő új plazmidot pJDB207/GAPEL-YHIR-nek nevezzük.

8. példa

A pJDB207/PH05(-173)-HIR plazmid megalkotása

A pJDB207/PH05(-173)-HIR élesztőplazmid HV1 deszulfatohirudinvariáns kifejeződéséhez egy rövid PH05 promoterszekvencia szabályozása alatt. A PH05(-173) promoterelem tartalmazza az élesztő PH05 promoter nukleotidszekvenciáját a -9. helytől a -173. helyig (BstEII restrikciós hely), de nincsen fölfelé levő szabályozószekvenciája (UAS). A PH05(-173) promoter ennek megfelelően úgy viselkedik, mint egy konstitutív promoter.

A pJDB207/PH05(Eco)-HIR plazmid (225 633 számú közzétett európai szabadalmi leírás) tartalmazza a teljes hosszúságú, szabályozott PH05 promotert a PH05 szignálszekvencia ATG-jéhez viszonyított -8. helynél bevezetett EcoRI hellyel, és a deszulfatohirudin kódolószekvenciáját, amelyet a PH05 transzkripciós termanációs fragmentum követ. Ez a példa a szabályozott PH05 promoter helyettesítését írja le a rövid PH05(-173) promoterelemmel.

pg pJDB207/PH05(Eco)-HIR plazmidot emésztünk BstEII-vel. A restrikciós fragmentumok tapadós végeit betöltjük Klenow-DNS-polimerázzal (1 egység/pg DNS) 30 percig szobahőmérsékleten végzett reakcióval 200 pl olyan oldatban, amely 60 mmol/1 trisz-HCl-ot (pH 7,5), 10 mmol/1 MgCl₂-ot, 0,1-0,1 mmol/1 dATP-t, dCTP-t, dGTP-t és TTP-t tartalmaz. Fenolos extrakció után a DNS-t etanollal kicsapjuk.

4,16 pg BamHI kapcsolót (5’-CGGATCCG-3’, Biolabs) foszforilezünk 100 pl, 60 mmol/l-es triszHCl-t (pH 7,5), 10 mmol/1 MgCl₂-ot, 5 mmol/1 DTT-t, 0,5 mmol/1 ATP-t és 18 egység T4 polinukleotidkinázt (Boehringer) tartalmazó oldatban 45 percig 37 °C hőmérsékleten. 10 perc után 75 °C hőmérsékleten a reakciókeveréket lassan lehűtjük szobahőmérsékletre. Az összeforrasztott oligonukleotid kapcsolókat -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

pmol-t a pJDB207/PH05(Eco)-HIR plazmid (BstEII)/tompa vég fragmentumából inkubálunk 16 órán át 15 °C hőmérsékleten 100-szoros fölöslegű foszforilezett és összeforrasztott BamHI kapcsolóval 208 pl olyan oldatban, amely 60 mmol/1 trisz-HCl-ot (pH 7,5), 10 mmol/1 MgCl₂-ot, 5 mmol/1 DTT-t, 3,5 mmol/1 ATP-t és 800 egység T4-ligázt (Biolabs) tar12

HU 218 731 Β talmaz. A ligáz 10 perces, 85 °C hőmérsékleten végzett inaktiválása után a fölösleges kapcsolókat a DNS kicsapásával eltávolítjuk, a kicsapást 10 mmol/1 EDTA, 300 mmol/1 nátrium-acetát (pH 6,0) és 0,54 térfogat izopropanol jelenlétében végezve. A DNS-t BamHIgyel és EcoRI-gyel emésztjük. A DNS-fragmentumokat 0,8%-os preparatív agarózgélen elkülönítjük. A 172 bp-s BamHI-EcoRI promoter fragmentumot a gélről elektroelúcióval eltávolítjuk és etanollal kicsapjuk. A DNS-t 0,1 pmol/μΐ koncentrációnál újraszuszpendáljuk.

A pJDB207/PH05(Eco)-HIR plazmidot EcoRI-gyel és HindlII-mal emésztjük. A 643 bp-s EcoRI-HindlII fragmentumot a fentebb leírtak szerint izoláljuk. A DNS-fragmentum tartalmazza a PH05 szignálszekvenciát megfelelő keretben fuzionálva a deszulfatohirudin kódolószekvenciájához és a PH05 transzkripciós terminációs fragmentumhoz. A plazmidot hasítjuk HindlII-mal és BamHI-gyel is. A 6,6 kb-s vektorfragmentumot izoláljuk.

0,2-0,2 pmol 172 bp-s BamHI-EcoRI fragmentumot és a 643 bp-s EcoRI-HindlII fragmentumot, valamint 0,1 pmol 6,6 kb-s vektorfragmentumot ligálunk 10 pl, 60 mmol/1 trisz-HCl-ot. (pH 7,8), 10 mmol/1 MgCl₂-ot, 5 mmol/1 DTT-t, 1 mmol/l ATP-t és 400 egység T4-DNS-ligázt (Biolabs) tartalmazó oldatban, 6 órán át 18 °C hőmérsékleten. A ligálási keverék 1 μΐ-es alikvotját hozzáadjuk 100 pl, kalciummal kezelt, transzformáláshoz kompetens E. coli HB101 sejthez.

transzformált, ampicillinrezisztens telepet növesztünk LB tápközegben, amely 100 pg/ml ampicillint is tartalmaz. Plazmid DNS-t állítunk elő és elemzőnk BamHI és Sall/HindlII emésztésekkel. Egy kiónt, amely a várt restrikciós fragmentumokkal rendelkezik, kiválasztunk, és pJDB207/PH05(-173)-HIR-nek nevezzük.

9. példa

A pDP34 plazmid megalkotása

Élesztő kétmikronos, kovalensen kötött, kör alakú DNS-t izolálunk Saccharomyces cerevisiae S288C törzsből. Az élesztősejteket 5 pg/ml Zymolase-val (100 000 egység/pg) inkubáljuk 20 percen át 37 °C hőmérsékleten, hogy a sejtfalakat emésszük. A szferoplasztokat 2% SDS-sel lizáljuk. Ezután EDTA-t adunk hozzá 25 mmol/1 koncentráció eléréséig, etidium-bromidot 1 mg/ml koncentráció eléréséig és céziumkloridot 1,55 g/ml végső sűrűség eléréséig. A plazmid DNS-t a kromoszomális DNS-től ultracentrifugálással különítjük el, az ultracentrifugálást 42 órán át 42 000 fordulat/percnél 15 °C hőmérsékleten végezve. A kétmikronos plazmid DNS-t a gradiensből injekciós tűvel emeljük ki. Az etidium-bromidot NaCl-dal telített izopropanollal végzett extrahálással távolítjuk el, és a plazmid DNS-t végül etanollal kicsapjuk. A tisztított kétmikronos plazmid DNS-t azután Pstl-gyel linearizáljuk, és a pUC19 PstI helyébe [Norrander J. és munkatársai: Gene 26, 101 (1983)] klónozzuk, hogy megkapjuk a pDP31 plazmidot.

A pJDB207 plazmidot KpnI és Hpal restrikciós enzimekkel emésztjük. Az így létrejövő 0,55 kb-s Hpal-KpnI fragmentum tartalmazza a csatlakozást a kétmikronos szekvencia és a dLEU2 gén hiányos promotere között.

A pUC7/LEU2 plazmid tartalmazza a LEU2 gén [Andreadis A. és munkatársai: Cell 31, 319 (1982)] élesztőgenom 2,2 kb-s Xhol-Sall fragmentumát a pUC7 plazmid [Vieira és munkatársai: Gene 19, 259 (1982)] Sáli helyébe klónozva. A pUC7/LEU2 plazmidot KpnI-gyel és Hpal-gyel hasítjuk. A 4,25 kb-s KpnI-Hpal fragmentumot a pJDB207 0,55 kb-s HpalKpnl fragmentumába ligáljuk. Ez a pDP30 plazmidot eredményezi, ahol az eredeti kétmikronos/dLEU2 fúziós termék, akárcsak a pJDB207 plazmidban, a LEU2 gén előtt van elhelyezve teljes terminátorával. A pDP30-at Hpal-gyel és Sall-gyel emésztjük és az 1,85 kb-s, a komplett LEU2 gént tartalmazó fragmentumot tisztítjuk és a pDP31 plazmid 8,7 kb-s Sall-Hpal fragmentumába klónozzuk. Az így létrejövő plazmidot, a pDP33-at (lásd a 3. ábrát) linearizáljuk HindlII-mal végzett részleges emésztéssel 50 pg/ml etidium-bromid jelenlétében [Oesterlund M. és munkatársai: Gene 20, 121 (1982)], és ligáljuk az URA3 gént [Rose M. és munkatársai: Gene 29, 113 (1984)] tartalmazó 1,17 kb-s HindlII fragmentummal. Az URA3 gén beiktatását szelektáljuk E. coli pyrF törzsbe való transzformálással (Rose M. és munkatársai, fentebb idézett munka). Egy pozitív kiónt pDP34 plazmidnak nevezünk el (lásd a 4. ábrát).

A pDP34 élesztő E. coli „ingázó” vektor ampicillinrezisztencia markerrel E. colinál, URA3 és dLEU2 élesztő szelektív markerekkel. Ez tartalmazza a teljes 2 mikronos szekvenciát az „A” formában, és REP1, REP2, valamint FLP típusú.

10. példa

Humán kifejező kazetták klónozása pDP34-be

A pDP34-et BamHI-gyel emésztjük. A restrikciós hely tapadós végeit Klenow-DNS-polimerázzal végzett reakcióval betöltjük [Maniatis T. és munkatársai: a „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” című szakkönyvben, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. A DNS-t tovább hasítjuk Sall-gyel, és a 11,8 kb-s vektorfragmentumot izoláljuk 0,6%-os preparatív agarózgélen. A DNS-t elektroelúcióval és etanolos kicsapással nyerjük ki. Különböző kifejező kazettákat klónozunk a pDP34 vektorfragmentumba a Sáli és (BamHI)/tompa vég helyek közé.

A pJDB207/GAPEL-YHIR plazmidot HindlII-mal emésztjük. A tapadós végeket tompa végekké alakítjuk át Klenow-DNS-polimerázzal. A DNS-t etanollal kicsapjuk és tovább emésztjük Sall-gyel. Az 1,1 kb-s SalI-(HindIII)/tompa vég fragmentum tartalmazza a teljes kifejező kazettát pBR322 szekvenciákkal, a GAPEL promotort, a PH05 szignálszekvenciát megfelelő keretben fuzionálva a deszulfatohirudin kódolószekvenciájához (előnyösen élesztőkodonok), és a PH05 transzkripciós terminációs fragmentumot. Az 1,1 kb-s fragmentumot 0,8%-os preparatív agarózgélen izoláljuk, a gélről elektroelúcióval kinyerjük és DE52 ioncserélő kromatográfiával, valamint etanolos kicsapással tisztítjuk. 0,2 pmol 1,1 kb-s fragmentumot és 0,1 pmol 11,8 kb-s

HU 218 731 Β vektor fragmentumot ligálunk 10 pl, 60 mmol/1 trisz-HCl-ot (pH 7,5), 10 mmol/1 MgCl₂-ot, 5 mmol/1 DTT-t, 3,5 mmol/1 ATP-t és 400 egység T4-DNS-ligázt (Biolabs) tartalmazó oldatban, 16 órán át 15 °C hőmérsékleten. 1 μΐ-es alikvotot alkalmazunk E. coli HB101 Ca²⁺-sejtek transzformálására. 5 transzformált, ampicillinrezisztens telepet elemzünk. Plazmid DNS-t emésztünk BamHI-gyel és Sall/BamHI-gyel. Egy kiónt, amely a korrekt restrikciós fragmentumokkal rendelkezik, kiválasztunk, és ezt pDP34/GAPEL-YHIRnek nevezzük el (lásd az 5. ábrát).

Hasonló módon a pJDB207/GAPEL-YHIR (lásd a 7. példát) 1,2 kb-s SalI-(HindIII)/tompa vég fragmentumát a pDP34 vektorba klónozzuk, amely a pDP34/GAPELYHIR plazmidot eredményezi.

A pJDB207/PH05(-173)-HIR plazmidot Sall-gyel és EcoRI-gyel emésztjük. A 448 bp-s Sall-EcoRI fragmentumot úgy izoláljuk, amint korábban leírtuk. A DNS-fragmentum tartalmazza a pBR322 SallBamHI részét és a rövid PH05(-173) konstitutív promotert (lásd a 8. példát). A pJDB207/GAPEL-YHIR plazmidot HindlII-mal emésztjük. A tapadós végeket tompa végekké alakítjuk át Klenow-DNS-polimerázzal. A DNS-t tovább emésztjük EcoRI-gyel. A 642 bps EcoRI-(HindIII)/tompa vég fragmentumot izoláljuk. Ez tartalmazza a PH05 szignálszekvenciát, a deszulfatohirudin kódolószekvenciát (előnyösen élesztőkodonokkal) és a PH05 transzkripciós terminációs fragmentumokat. 0,2-0,2 pmol 448 bp-s Sall-EcoRI fragmentumot és 642 bp-s EcoRI-tompa vég fragmentumot, valamint 0,1 pmol 11,8 kb-s SalI-(BamHI)/tompa vég fragmentumot ligálunk. A ligálási keverékből alikvotokat alkalmazunk E. coli HB101 Ca⁺⁺-sejtek transzformálására. 12 transzformáns plazmid DNS-ét elemezzük BamHI és Sall/BamHI emésztéssel. Egy kiónt, amely a korrekt plazmiddal bír, kiválasztunk, és ezt pDP34/PH05(-173)-YHIR-nek nevezzük (lásd a 6. ábrát).

11. példa

További kifejező plazmidok hirudingénhez, E. coli kodonokkal

HV1 deszulfatohirudinvariánshoz tartozó szintetikus gént, amely E. coli kodon alkalmazáson alapul, tartalmazó kifejező plazmidokat alkotunk meg olyan módon, amely a 10. példa leírásával analóg. A pJDB207/GAPEL-HIR (225 633 számú közzétett európai szabadalmi leírás 1,1 kb-s SalI-(HindIII)/tompa vég fragmentumait izoláljuk és pDP34 vektorba klónozzuk. Az így létrejövő kifejező plazmid a pDP34/GAPEL-HIR, amely a deszulfatohirudinhoz tartozó, előnyös E. coli kodonokon alapuló szintetikus gént tartalmazza, a konstitutív GAPEL promoter szabályozása alatt fejez ki. Egy hasonló konstrukcióhoz a pJDB207/PH05(-173)-HIR (lásd a 8. példát) 1,1 kb-s SalI-(HindIII)/tompa vég fragmentumot pDP34-be klónozzuk. Az így létrejövő pDP34/PH05(-173)-HIR plazmid tartalmazza a deszulfatohirudinhoz tartozó szintetikus gént (E. coli kodonok) a rövid PH05(-173) konstitutív promoter szabályozása alatt.

12. példa

A pDP92 plazmidba klónozott hirudinkifejező kazetta

A teljes kétmikronos szekvenciát tartalmazó vektorok nem szükségszerűen fejezik ki az eredeti kétmikronos kör összes funkcióját. A klónozással nyitott leolvasókeretek roncsolódhatnak. Mivel eddig nem volt ismeretes a „D” leolvasókeret géntermékéhez funkció, az ezen a génen belül levő Pstl helyet alkalmazták a dLEU2 gén klónozásához [Beggs J. D.: Natúré 275, 104-109 (1978)], vagy a pU019 vektorrész beiktatásához, mint a pDP31-ben (lásd a 9. példát). Csak nemrégiben valószínűsítették, hogy a D géntermék az FLP géntermék kifejeződését szabályozza [Murray és munkatársai: EMBO J. 6, 4205 (1987)]. Abból a célból, hogy a kétmikronos kör minden előnyét megragadjuk, olyan vektort alkotunk meg, amely előnyös az összes ismert kétmikronos funkció szempontjából, beleértve a D génterméket is.

a) A pDP92 plazmid megalkotása (lásd a 7. ábrát)

A pDP31 plazmidot (9. példa) emésztjük Pstl-gyel és Hpal-gyel, ez három fragmentumot eredményez. pK19 plazmidot [amely kanamicinrezisztenciát visz át, lásd Pridmore R. D.: Gene 56, 309-312 (1987)] linearizálunk Smal-gyel. Mindkét emésztmény DNS-fragmentumait fenollal extraháljuk és etanollal csapjuk ki. A DNS-fragmentumokat összekeverjük és ligáljuk. A ligálási keveréket transzformáljuk [Hanahan D. J.: Mól. Bioi. 166, 557-580 (1983)] kompetens E. coli JM109 sejtekbe [Yanisch-Perron C. és munkatársai: Gene 33, 103-119 (1985)], kifejezzük 8 órán át 37 °C hőmérsékleten LB tápközegben, majd 90 pg/ml kanamicinnel, 30 pg/ml XGal-lal és 7 pg/ml IPTG-vel kiegészített LB agarlemezekre szélesztjük.

fehér, kanamicinrezisztens telepet növesztünk. Plazmid DNS-t elemzünk Xbal és BamHI/KpnI emésztésekkel. Egy egyedi kiónt, amely elvesztette a pDP31 pUC19 vektorrészét, helyreállítva a Pstl hely újraligálásával a kétmikronos D leolvasókeretet, és amelyben a pK19 plazmid tompa vég a Hpal helybe van beiktatva, pDP91-nek nevezünk. A plazmid tartalmazza a kétmikronos plazmid nagy Hpal-PstI és a kis Pstl-Hpal fragmentumait a pK19 Smal helyébe klónozva. A Pstl helyek újraligálásával a D leolvasókeret helyreáll.

Az URA3 gént egy 1,17 kb-s Hindlll fragmentumban izoláljuk a pDP34 plazmidból (lásd a 9. példát) és a pUC12 plazmid egyedi Hindlll helyébe klónozzuk. Egy kiónt, amelyben az URA3 gén ugyanabban az orientációban van beiktatva, mint az ampicillinrezisztencia gén, pUC12/URA3-nak nevezünk. Mind a pDP91, mind a pUC12/URA3 plazmidokat Sacl-gyel és BamHI-gyel emésztjük, így két-két fragmentumot kapunk. A DNS-fragmentumokat összekeverve ligáljuk, és ezt használjuk kompetens E. coli JM109 sejtek transzformálására. A sejteket 100 pg/ml ampicillinnel, 30 pg/ml XGal-lal és 7 pg/ml IPTG-vel kiegészített LB agarlemezekre szélesztjük.

fehér, ampicillinrezisztens telepet növesztünk. Plazmid DNS-t elemzünk Hindlll és Pvull emésztés14

HU 218 731 Β sel. Egy egyedi kiónt pDP92-nek nevezünk; ez tartalmazza a teljes kétmikronos szekvenciát minden ismert funkciójával együtt, és tartalmazza az URA3 gént a pUC vektorba klónozva.

b) Hirudinkifejezö kazetták klónozása pDP92-be

A 10. példa analógiájára pDP92-t temésztünk BamHI-gyel. A tapadós végeket Klenow-DNS-polimerázzal végzett reakcióval betöltjük. A DNS-t tovább hasítjuk Sall-gyel. A 10,2 kb-s vektorfragmentumot izoláljuk. A pJDB207/GAPEL-YHlR plazmid 1,1 kb-s SalI(HindIII)/tompa vég fragmentumát izoláljuk, és a vektorfragmentumba ligáljuk.

transzformált, ampicillinrezisztens telepet elemzünk. Plazmid DNS-t emésztünk BamHI-gyel, Pstlgyel és Sall/BamHI-gyel. Egy kiónt, amely a várt restrikciós fragmentumokkal rendelkezik, kiválasztunk, ezt pDP92/GAPEL-YHIR-nek nevezzük. Hasonlóképpen kapjuk meg a pDP92/GAPEL-YHIR plazmidot, a pJDB207/GAPEL-YHIR 1,2 kb-s SalI-(HindIII)/tompa vég fragmentumát alkalmazva (lásd a 7. példát).

A pDP92/PH05(-173)-YHIR plazmidot úgy alkotjuk meg, amint ezt a 10. példában leírtuk, a 10,2 kb-s SalI-(BamHI)/tompa vég, pDP92 vektorfragmentumot alkalmazva (lásd fentebb).

13. példa

Kétmikronos DNS-től mentes Saccharomyces cerevisiae gazdatörzsek megalkotása

Abból a célból, hogy az endogén kétmikronos plazmidot eltávolítsuk, első lépésként kiiktatást hajtunk végre a HT246 törzs (DSM 4084; a, leu 2-3, leu 2-112, prb) URA3 génjében, hogy a törzset uracilra auxotróffá tegyük. HT246 törzset 1 pg YeP13 plazmiddal [Broach J. R., Strathem J. N., Hicks J. B.: Gene 8, 121-123 (1979)] transzformálunk, a Hinnen és munkatársai által leírt transzformációs munkamenetet alkalmazva [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)]. 10 pg pUC12ura3A plazmidot, amelyben kiiktatás van az URA3 génben [Sengstag Ch., Hinnen A.: Nucleic Acids Research, 15, 233-246 (1987)] adunk az YEP13 plazmiddal együtt. Durván 3000 leucin-prototróf transzformánst újraszuszpendálunk 5 ml minimáltápközegben („Difco Yeast Nitrogén Base” aminosavak nélkül, amelyhez 2% glükózt, 0,1% leucint, 0,1% uracilt és 0,25% fluor-orotsavat adunk) kis rázólombikban, és 60 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten 180 fordulat/percnél. Azok a transzformánsok, amelyek növekednek, rezisztensek a toxikus fluor-orotsav analógra, és ennek megfelelően helyettesítést hordoznak a kromoszomális URA3 génben ura3A-ra. A kinőtt sejteket teljes tápközegre szélesztjük, amely 20 g/1 peptonból, 10 g/1 élesztőkivonatból és 20 g/1 glükózból áll, és 48 órán át 30 °C hőmérsékleten végzett növesztés után replikalemezeket készítünk Difco minimáltápközegre (amely élesztő nitrogénbázis aminosavak nélkül, kiegészítve 2% glükózzal és 0,1% leucinnal), hogy kimutassuk az uracilauxotrófokat. Számos auxotrófot kiemelünk és megvizsgáljuk YEP13 plazmid elvesztésre, amely leucinauxotrófiát ad. Egy egyedi telepet (amelyet Tr 889-nek nevezünk), amely leucint is és uracilt is igényel, kiemelünk és további kísérletekhez alkalmazunk.

Tr 889-et transzformálunk pDP38 plazmiddal (ezt a pDP34 plazmidból kapjuk SphI-gyel végzett emésztéssel és az így létrejövő 8,4 kb-s fragmentum újraligálásával; lásd a 4. ábrát), amely hordozza mind a LEU2, mind az URA3 marker géneket (a transzformációs munkamenetet illetően lásd a korábban leírtakat). A transzformáit élesztősejteket úgy választjuk ki, hogy uracilban hiányos, de leucinnal kiegészített élesztő minimáltápközegen növesztünk, majd replikalemezeket készítünk olyan minimáltápközegre, amely leucinban hiányos és uracillal van kiegészítve. 10 gyengén növő telepet kiemelünk, és egyénileg növesztjük ezeket folyékony teljes tápközegben (lásd korábban) mintegy 100 generáción keresztül. Ezzel azt érjük el, hogy a sejtek elveszítik a pDP38 plazmidot és - bizonyos százalékban - ugyanakkor elveszítik az endogén kétmikronos plazmidot is.

uracil- és leucinigényes telepet veszünk fel, DNS-t állítunk elő belőlük, a DNS-t teljességig emésztjük Pstl-gyel, és átvizsgáljuk ³²P-jelzett élesztő kétmikronos DNS-sel vagy Southem-foltképzéssel. Egy izolátumot, amely semmilyen hibridizációs szignált nem mutat, H449-nek nevezünk (a, leu2-3, leu2-112, ura3A, prb, cir°), ez a HT246 élesztőtörzs izogén, kétmikronos DNS-mentes (cir°) származéka.

14. példa

S. cerevisiae kexl variánsának előállítása a genom

KEX1 gén szétzúzásával

A S. cerevisiae H449 (prb, leu2, ura3, cir°) törzsből az ysca karboxipeptidáz-aktivitást eltüntetjük a genom

K.EX1 gén szétzúzásával. Ebből a célból a KEX1 gént azonosítjuk egy élesztőgenom könyvtárban és megfelelő vektorba klónozzuk. Az URA3 gént, amely szeletív markerként szolgál, a KEX1 struktúrgénbe iktatjuk be, hogy szétzúzzuk leolvasókeretét. A hibrid plazmid DNS-t, amely az URA3 gént olyan formában tartalmazza, hogy mindkét oldalán szegélyezi, az Ura- típusú H449 élesztőbe vezetjük be. A KEX1 gén szekvenciahomológiája a plazmidon és a kromoszómán lehetővé teszi az in vivő rekombinációt, amely az élesztősejteket Ura--ból Ura⁺-szá transzformálja, következésképpen a KEXl-et kexl-gyé. A szétzúzott kexl génnel bíró törzsek nem szintetizálnak funkcionális ysca fehérjét.

A KEXl-et kódoló gént egy élesztőgenom könyvtárból klónozzuk [pCS19 centroméra ingázó vektorban; Sengtag C. és munkatársai: Nucl. Acids Rés. 15, 233 (1987)] KEX1 fajlagos oligonukleotid vizsgálómintával végzett telephibridizálással. Az alábbi szekvenciájú oligonukleotid ’-GTCGAATCCGGCCCTTTTAGGGTGAATTC A-3 ’ a már publikált KEX1 szekvenciából [Dmochowska A. és munkatársai: Cell, 50, 573 (1987)] származik, és az egész szekvenciából az yscY szekvenciához való különösen kis homológiája alapján választottuk ki. Ez a KEX1 DNS-hez az EcoRV restrikciós helytől fölfelé hibridizál, amely helyet az URA3 gén beiktatásához al15

HU 218 731 Β kalmazunk. Ugyanezt az oligonukleotidot alkalmazhatjuk szekvenciaelemző primerként is az URA3 fragmentum beiktatásának igazolására is. Ezt a szintetikus oligonukleotidot radioaktív jelzéssel látjuk el és a génkönyvtár átvizsgálásához alkalmazzuk.

Mintegy 10 000 kiónt [5x2000 klón/lemez (0=140 mm)] vizsgálunk át telephibridizálással [Woods D. E. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5661; és Whitehead A. S. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5387 (1983)]. A két ismételt átvizsgálás! munkamenetből 5 független pozitív kiónt izolálunk. Ezek egyikét pKEX 1-nek nevezzük el. Abból a célból, hogy egy KEX1-fajlagos HindlII-BamHI fragmentumot (1380 bp) hasítsunk ki, a pKEXl plazmid DNS-t a megfelelő két endonukleázzal emésztjük. A megfelelő fragmentumot az M13+ ,31uescript” vektorba (Stratagene, USA) visszük át SK sokszoros kapcsolóval (polilinkerrel), (Stratagene, USA) és ezt a kiónt szekvenciaelemzésnek vetjük alá az Ml3-hoz szolgáló univerzális prímért alkalmazva, hogy a KEX1 fragmentumot igazoljuk; ezt a kiónt pKEXlM13-nak nevezzük.

A pUC12/URA3 plazmidot (lásd a 12a. példát), amely az URA3 gént HindlII fragmentumként klónozva tartalmazza, HindlII-mal emésztjük, hogy az 1170 bp-s HindlII fragmentumot izoláljuk [Rose M. és munkatársai: Gene 29, 115 (1984)]. A fragmentum tapadós végeit Klenow-polimerázzal betöltjük, hogy tompa végeket alakítsunk ki. Másrészt pKEXlM13 plazmidot linearizálunk EcoRV endonukleázos emésztéssel, amely által a KEX1 HindlII-BamHI fragmentumát elhasítjuk, és defoszforilezzük alkalikus foszfatázzal, hogy elkerüljük az önligálódást. Ezután ezt a két DNSfragmentumot összekeverjük, ligáljuk és átfertőzzük E. coli JM103 törzsbe. A transzformánsokat HindlII-mal és BamHI-gyel végzett kettős emésztéssel elemezzük, ahol a meghatározott HindlII-BamHI fragmentum mérete 1380 bp-ről 2550 bp-re növekszik. Egy korrekt klón DNS-ét szekvenciaelemzésnek vetjük alá, szekvenciaelemző primerként a fentebb leírt oligonukleotidot alkalmazva, hogy igazoljuk az URA3 fragmentum beiktatását a KEX1 génbe az EcoRV hasítási hely helyénél. A plazmidot pKEXlM13-URA3-nak nevezzük.

A pKEXlM13-URA3 DNS-t HindlII-mal és BamHI-gyel emésztjük, hogy kihasítsuk a K.EX1URA3 hibrid fragmentumot, és a vektortól való elkülönítés nélkül bevezetjük S. cerevisiae H449 törzsbe a fentebb említett eljárással (lásd a 3. példát). Az URA3 + transzformánsokból a membránfrakció izolálása után az ysca-aktivitást mérjük, kromogén szubsztrátumot alkalmazva (lásd az 1. példát). Egy egyedi transzformánst, amely nem mutat ysca proteázaktivitást, S. cerevisiae H449kexl-nek nevezzük.

75. példa

S. cerevisiae H449kexl törzs transzformálása

A Saccharomyces cerevisiae H449kexl törzset transzformáljuk az alábbi plazmidokkal:

pDP34/PH05(-173)-HIR pDP34/GAPEL-HIR pDP34/GAPEL-HIR pDP34/PH05(-173)-YHIR pDP34/GAPEL-YHIR pDP34/GAPEL-YHIR pDP92/PH05(- 173)-YH1R pDP92/GAPEL-YHIR pDP92/GAPEL-YHIR, a Hinnen és munkatársai által leírt (fentebb idézett munka) transzformációs munkamenet szerint. A transzformáit élesztősejteket élesztő minimáltápközeg amely leucinnal ki van egészítve, de uracilt nem tartalmaz - lemezeken szelektáljuk. Egyedi transzformált élesztősejteket izolálunk, amelyeknek az alábbi neveket adjuk.

Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP34/PH05(-173)-HIR

Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPEL-HIR

Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPEL-HIR

Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP34/PH05(-173)-YHIR

Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPEL-YHIR

Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPEL-YHIR

Saccharomyces cerevisiae H449kexl /pDP92/PH05(-173)-YHIR

Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP92/GAPEL-YHIR

Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP92/GAPEL-YHIR

16. példa

Transzformált élesztőtörzsek fermentálása laboratóriumi léptékben Saccharomyces cerevisiae

H449kexl/pDP34/PH05(-173)-YHIR és Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPEL-YHIR sejtjeit külön-külön növesztjük két egymás utáni előtenyésztésben 10 ml minimáltápközegben, amelynek összetétele g/l-ben az alábbi:

Difco Yeast Nitrogén Base (élesztő nitrogénbázis) 6,7 aszparagin 10 leucin 1 glükóz 20

Az első előtenyészetet 60 órán át 28 °C hőmérsékleten 180 fordulat/percnél növesztjük. A második előtenyészetet az első előtenyészet 2%-ával oltjuk be, és 24 órán át inkubáljuk 28 °C hőmérsékleten és 180 fordulat/percnél.

A fő tenyésztő tápközeg összetétele	az alábbi (g/1)
élesztőkivonat	49
glükóz	5
ffuktóz	57
NH4NO3	0,5
MgSO4.7H2O	1,0
CaCO3	5,0
Ca3(PO4)2	2,0

HU 218 731 Β

A fő tenyészetet mintegy 2xl0⁶ sejt/ml-rel inokuláljuk és 72 órán át inkubáljuk 28 °C hőmérsékleten 180 fordulat/percnél. Mintegy 1 χ 10⁹ sejt/ml-t kapunk a fermentáció végén. A fermentáció számos időpontjánál veszünk alikvotokat a tenyészetből, a sejteket ezekből centrifugálással eltávolítjuk, és a tenyészet-felülúszót deszulfatohirudinra elemezzük HPLC-vel (lásd korábban).

17. példa

HV1 deszulfatohirudinvariáns előállítása 50 l-es léptékben

A kétmikronos DNB-től mentes Saccharomyces cerevisiae H449 kexl/pDP34/GAPEL-YHIR működő sejtbankját alkalmazzuk hirudinforrásként deszulfatohirudin előállításához 50 1-es léptékben.

A működő sejtbank ampulláit kondenzált formában őrizzük folyékonynitrogén-tartályban. Egy ampulla tartalmát használjuk egy rázótenyészet inokulálására, amely az alábbi összetételű szelektív tápközeget tartalmazza (g/1):

Yeast Nitrogén Base
(élesztő nitrogénbázis)	8,4
L-aszparagin-monohidrát	11,4
L-hisztidin	1,0
L-leucin	0,1
D-glükóz-monohidrát	20,0
Az 500 ml-es lombik 100 ml tápközeget tartalmaz,

és ezt 48 órán át 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk orbitális rázógépen, 180 fordulat/perc rázási sebességgel.

A második rázólombik-előtenyészet azonos tápközegből 600 ml-t tartalmaz 2 1-es lombikban, amelynek négy terelőlemeze van. Az inokulum mennyisége az első előtenyészettől 5% (30 ml), és a lombikokat 48 órán át rázatjuk 28 °C hőmérsékleten, orbitális rázógépen, 120 fordulat/perc sebességnél.

Egy harmadik előtenyészetet fermentálunk 50 literes rozsdamentes acél bioreaktorban, amely 4 terelőlapáttal van felszerelve és egy egyedi tárcsás turbinakeverővei, amelynek átmérője 115 mm. Ehhez a tenyészethez is a fenti tápközeget alkalmazzuk, a kiindulási térfogat 30 1. Egy egyedi 2 1-es lombikot, amely 600 ml tenyészetet tartalmaz, alkalmazunk az 501-es reaktor inokulálására (2%). A fermentáció mintegy 42 órán át tart 28 °C hőmérsékleten. A keverő sebessége 600 fordulat/perc, a levegőztetési arány 1 térfogat/térfogat, és a reaktorban 0,3 bar túlnyomás uralkodik.

Hasonló 50 1-es bioreaktort, amely fel van szerelve betáplálási folyamatokhoz, alkalmazunk a deszulfatohirudintermelési stádiumhoz. A tápközeg az alábbiakat tartalmazza (g/1):

húspepton (Merck)	5,0
élesztőkivonat	30,0
ammónium-szulfát	6,0
magnézium-szulfát-heptahidrát	1,0
nátrium-klorid	0,1
kálium-dihidrogén-foszfát	1,0
D-glükóz-monohi drát	10,0,

ezt alkalmazzuk ebben a stádiumban (30 1). Az inokulumszint a harmadik előtenyészet-stádiumból előnyösen 2%. A fermentáció 48 órán át tart 28 °C hőmérsékleten, és a keverési sebesség 750 fordulat/percre van beállítva. A túlnyomást kezdetben 0,3 bar-ra állítjuk be, de ezt fel kell emelnünk a fermentáció folyamán 1,0 bar-ra, hogy az oldottoxigén-tenziót 20% telítés fölött tartsuk. A kezdeti levegőmennyiség 0,25 térfogat/térfogat, de ez 1 térfogat/térfogatra emelkedik kilenc óra után abból a célból, hogy biztosítsuk a megfelelő oxigénellátást.

A pH-érték a fermentáció korai szakasza során 5,0 értékre esik, ezt fenn is tartjuk ammónium-hidroxid automatikus betáplálásával.

Egy egyszerű szakaszos tenyésztésben az elért biomasszaszint, és ennek megfelelően a deszulfatohirudin titer, függ annak a szénforrásnak a mennyiségétől, amelyet kezdetben betápláltunk a fermentorba. Ezt viszont a bioreaktor oxigénátvivő kapacitása szabja meg, valamint az az igény, hogy elkerüljük az etanol fölösleges termelését a növekvő élesztő révén. Ezeket a korlátozásokat fel lehet oldani betáplálásos (fed-batch) technológiával. így inkább kevesebb glükózt alkalmazunk a kiindulási tápközegben, de glükózbetáplálást végzünk, hogy elősegítsünk egy jelentősebb nagyobb végső biomassza-koncentrációt és mintegy háromszoros deszulfatohirudin titert a szakaszos tenyésztéshez viszonyítva. Gyakorlatban a betáplálás az idő előrehaladtával fokozatosan növekszik 175 g/óra végső betáplálási sebességig glükóz-monohidrátra vonatkoztatva.

Szilikonalapú habgátló kis tételeit alkalmazzuk a habzás visszaszorítására, amikor szükséges. A fermentorból kimenő gáz egy részét elemezzük, hogy információnk legyen az oxigénfelhasználási és szén-dioxid-keletkezési sebességről. Az oldottoxigén-tenziót on-line mérjük, sterilezhető elektródot alkalmazva.

órás időközönként mintákat veszünk ki a folyamat során, hogy lehetővé tegyük a glükóz- és etanolkoncentrációk megfigyelését, a deszulfatohirudin titer mérését biológiai vizsgálattal és HPLC-vel, valamint ellenőrizhessük a sterilitást. Amint a HPLC-ből bebizonyosodik, a termelt deszulfatohirudin lényegében mentes a C-terminálison megrövidített analógoktól. A fermentációs folyamat végén a deszulfatohirudint kinyerhetjük a tenyészet felülúszójából.

18. példa

A deszulfatohirudin kinyerése 50 l-es-léptékben tenyésztett S. cerevisiae tenyészetből A tenyészetet (lásd 17. példa) összekeverjük Amberlite XAD-7-tel, és adszorpciónak vetjük alá 4 órán át 25 °C hőmérsékleten. A sejteket a gyantától oszlopban különítjük el. Az 1 mol/1 NaCl-dal végzett mosás után a gyantát trisz-pufferral (50 mmol/1, pH 7,0-8,5) eluáljuk. A fő frakciót (30 1) pH 2,9-re, állítjuk be, és S-Sepharose oszlopra visszük fel [AmiconPA, 25 mmol/l-es ammónium-formiát-pufferral (pH 2,9) kiegyensúlyozva, amelynek ágytérfogata 2 liter. Ammónium-formiát-pufferral [40 mmol/1 (pH 3,6)] végzett mosás után eluálást végzünk ammónium-formiát-pufferral [50 mmol/1 (pH 3,8)]. A fő eluátumfrakciót (10 1) koncentráljuk Filtron Minisette ultraszűrőrendszerrel

HU 218 731 Β (Filtron Technology Corporation, USA), amely Ω 3k membránnal van felszerelve. Az így létrejött tiszta fehérjeoldat 0,5 literes alikvotját Bio-Gel P-6 finom oszlopra visszük fel (AmiconGF, 0,5%-os ecetsavoldattal kiegyensúlyozva), amelynek ágytérfogata 1,5 liter. Eluálást végzünk 0,5%-os ecetsavval. A fő eluátumfrakciót (1 1) koncentráljuk ultraszűrés segítségével, majd ezt követően Q-Sepharose gyorsáramlású oszlopra [AmiconPA, 25 mmol/l-es (pH 2,9) ammóniumformiát-pufferral kiegyensúlyozva] visszük fel, amelynek ágytérfogata 2 1. Eluálást végzünk ammóniumformiát-pufferral [50 mmol/1 (pH 4,2)]. A fő eluátumffakciót koncentráljuk ultraszűrés segítségével, majd ezt követően diafiltráljuk vízzel szemben. Az így létrejövő tiszta, vizes oldatot liofilezzük. A szilárd anyag tiszta deszulfatohirudinból áll, amely mentes kimutatható mennyiségű rövidített C-terminális analógoktól.

19. példa

A pRAl gén elroncsolása S. cerevisiae H449-ben

A S. cerevisiae H449(DSM4413, prb, leu2, ura3, cir°) törzset többszörösen proteázhiányossá tesszük génroncsolás segítségével. A génroncsolásnak a meiotikus keresztezésekkel összehasonlítva az az előnye, hogy stabilan bevezetődik egy mutáció, miközben egy adott törzs genetikai háttere azonos marad.

Az első lépésben az yscA proteinázaktivitást tüntetjük el a PRAl gén elroncsolásával [Ammerer G. és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 6, 2490 (1986)]. A PRAl-et teljes élesztőgenom DNS-ből izoláljuk, Sacl-gyel és Pstlgyel emésztve. 0,6%-os preparatív agarózgélről 2 kb-s fragmentumokat izolálunk, elektroeluáljuk és ligáljuk a pUC19 polilinkerterületének Pstl-SacI helyeibe. A vektort E. coli JM109-be transzformáljuk és 280 egyedi telepet emelünk ki. A telepeket egyenként növesztjük mikrotitrálólemezek üregeiben, amelyek LB+amp tápközeget tartalmaznak. Telephibridizálást hajtunk végre lényegében úgy, amint ezt Woods D. E. és munkatársai leírták [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5651 (1982)], az alábbi ³²P-jelzett oligonukleotidvizsgáló mintát alkalmazva ’-AAGCCTAGTGACCTAGT-3 amely a publikált PRAl szekvenciából (Ammerer és munkatársai: fentebb idézett munka) származik. 3 pozitív kiónt emelünk ki, az egyiknek, a pUC19/PRAlnek, DNS-ét Sacl-gyel és Xhol-gyel hasítjuk, és a teljes PRAl gént tartalmazó 1,9 kb-s fragmentumot szubklónozzuk az M13+ „Bluescript” vektor (Stratagene Cloning Systems, San Diego, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) KS polilinker területébe. Egy 1,2 kb-s HindlII fragmentumot, amely tartalmazta a teljes URA3 gént [Rose M. és munkatársai: Gene 29, 113 (1984)] beiktatunk az egyedi HindlII helybe a PRAl-beiktatás kódolóterületén belül. Az így létrejövő plazmidot M13+/pral: :URA3-nak nevezzük. Az M13+/pral: :URA3-at SacI/XhoI-gyel emésztjük, és ellenőrizzük a megfelelő PRAl gén elroncsolására Southem-foltképzéssel. Egy transzformánst, amely a PRAl-gyei hibridizáló Sacl/Xhol fragmentum megfelelő elcsúszását mutatja 1,9 kb-ről 3,1 kb-re, Tr 1186nak nevezünk.

A következő lépésben a Tr 1186-ot - amely PRAl génjében pral: :URA3-mal el van roncsolva ismét uracilfuggővé tesszük egy kiiktatást végrehajtva a pral: :URA3 gén beiktatásban. A Tr 1186-ot 1 pg YEpl3 plazmiddal [Broach J. R. és munkatársai: Gene 8, 121 (1979)] transzformáljuk 10 pg pUC12ura3 delta-plazmiddal együtt, amely egy 200 bp-s kiiktatást tartalmaz az URA3 génben [Sengstag C. és munkatársai: Nucleic Acids Research 15, 233 (1978)]. 3000 leucin prototróf élesztőtranszformánst újraszuszpendálunk 5 ml minimáltápközegben (Difco élesztő nitrogénbázis aminosavak nélkül, amelyhez 2% glükózt, 0,1% leucint, 0,1% uracilt és 0,25% fluor-orotsavat adunk) kis rázólombikban, és 60 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten 180 fordulat/percnél. Azok a transzformánsok, amelyek növekednek, rezisztensek a toxikus fluororotsavra és ennek megfelelően a pral: :URA3 területben helyettesítés van ura3deltával. A növekedő sejteket teljes tápközegre szélesztjük (20 g/1 pepton, 10 g/1 élesztőkivonat, 20 g/1 glükóz), és 48 órán át 30 °C hőmérsékleten végzett növesztés után minimáltápközeget tartalmazó replikalemezre visszük át (Difco élesztő nitrogénbázis aminosavak nélkül, 2% glükózzal és 0,1% leucinnal kiegészítve), hogy az uracilauxotrófokat kimutassuk. Számos auxotrófot emelünk ki és vizsgálunk át a leucinauxotrófiát átadó YEpl3 plazmid elvesztésre. Egy egyedi telepet, amelyet Tr 1195-nek nevezünk, és amely leucint is, uracilt is igényel, kiemelünk, és ezt használjuk további kísérletekhez.

20. példa

A PRC1 gén elroncsolása a Tr 1195-ben

Ezután a Tr 1195-ben az yscY karboxipeptidáz-aktivitást roncsoljuk el. Az yscY-t kódoló PRC 1-et [Rothman J. H. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3248 (1986)] a pCS19 centroméravektorban [Sengstag C. és munkatársai: Nucleic Acids Research 15, 233 (1978)] levő élesztőgenom könyvtárból izoláljuk előhibridizációval 2 szintetikus oligonukleotid segítségével.

’ -GAAAGCATTC ACC AGTTT ACTATGTGG-3 ’ és ’-CG A ATGG ATCCC AACGGGTTTCTCC-3 ’, amelyek a PRC1 kódolószekvencia 5’- és 3’-végeinek felelnek meg. Egy pozitív kiónt pCS19/cpy8-nak nevezünk. A pCS19/cpy8 DNS-t Clal/PvuII-vel emésztjük, 0,6%-os preparatív agarózgélre terheljük, és egy 2,6 kb-s fragmentumot izolálunk és elektroeluálunk. Ezt a Clal/PvuII fragmentumot, amely tartalmazza a teljes PRC1 gént, tovább szubklónozzuk a pUC19 Narl/Smal helyeibe. Az így létrejövő pUC19/PRCl plazmidot egyedi Stul helyénél hasítjuk, amelybe az 1,2 kb-s URA3 fragmentumot (lásd a 19. példát) ligáljuk. Ebből a célból az URA3 tartalmú fragmentum tapadós HindlII végeit betöltjük Klenow-DNS-polimerázzal végzett reakcióval, hogy illeszkedjék a pUC/PRAl tompa végű Stul helyéhez.

Az így létrejövő pUC19/prc: :URA3 plazmidot AatlI-vel emésztjük, és az AatlI fragmentumot a vektortól való elkülönítés nélkül alkalmazzuk a S. cerevisiae

HU 218 731 Β

Tr 1195 transzformálására, amint ezt leírtuk. Egy maciitól független transzformánsra Tr 1206-ot, megvizsgálunk megfelelő PRC1 gén szétroncsolásra Southemfoltképzéssel, majd ezután uracilfüggővé tesszük, amint ezt korábban leírtuk (lásd a 19. példát). Az így létrejövő S. cerevisiae törzset Tr 1210 (pral, prbl, prcl, ura3, leu2, cir°)-nek nevezzük.

21. példa

S. cerevisiae Tr 1210 kexl variánsának előállítása

Az ysca karboxipeptidáz-aktivitást eltüntetjük a Tr 1210 S. cerevisiae törzsből a genom KEX1 gén szétzúzásával, ahogyan ezt korábban leírtuk (lásd a 14. példát). Az így létrejövő S. cerevisiae törzset, amely nem mutatja az ysca proteázaktivitását, Tr 1302 (pral, prbl, prcl, ura3, leu2, cir°, kexl)-nek nevezzük.

22. példa

A HV1-KR, HV1-SFRYés HV1-WQLR hirudinmutánsok megalkotása

Abból a célból, hogy tovább értékeljük a különböző L-terminális aminosavakkal bíró heterológ fehérjék Cterminális lebomlását, C-terminális aminosav-összetételükben különböző hirudinmutánsokat alkotunk meg. Általános eljárásként helyre irányuló in vitro mutagenezist alkalmazunk, általában az alábbi készletben szereplő leírás szerint: Bio-Rad Muta-Gene M13 kit, BioRad, Richmond, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok.

Az alábbi mutánsokat alkotjuk meg:

1. HV1-KR, amely megfelel a Lys⁶⁴-Arg⁶⁵ 1. hirudinvariánsnak,

2. HV1-SFRY, amely megfelel a Ser⁶²-Phe⁶³-Arg⁶⁴Tyr⁶⁵ HVl-nek;

3. HV1-WQLR, amely megfelel a Trp⁶²-Glu⁶³-Leu⁶⁴Arg⁶⁵ HVl-nek.

Az összes hirudinmutáns aminosavszekvenciája a 61., illetve 63. aminosavig az 1. hirudinvariáns aminosavszekvenciájának felel meg.

A HVl-SFRY-ban a C-terminális a szívpitvari natriuretikus peptidével [Vlasuk és munkatársai: J. Bioi. Chem. 261, 4789-4796 (1986) azonos, és a HV1WQLR-ben a C-terminális az epidermális növekedési faktornak [George-Nascimento C. és munkatársai: Biochemistry 27, 797-802 (1988)] felel meg; ezek közül mindkettőről ismeretes, hogy C-terminálison bomlanak a proteázt tartalmazó vad típusú élesztőtörzsek révén.

Az első lépésben a pJDB207/GAPEL-HIR plazmidot (amelyet a 225 633 számú közzétett európai szabadalmi leírás ismertet) emésztjük Sall-gyel és HindlIImal, egy 1,2 kb-s fragmentumot nyerve, amely tartalmazza a teljes hosszúságú hirudinkifejező kazettát. Az 1,2 kb-s Sall-HindlII fragmentumot Sall-gyel és HindlII-mal hasított „Bluescript” M13 + -ba klónozzuk az SK polilinkerrel. Az így létrejövő M13+/HV1 plazmidot E. coli CJ 236-ba (Biolabs, USA) fertőzzük át abból a célból, hogy uracilfuggőséget építsünk be, amint ezt korábban leírtuk (Bio-Rad Muta-Gene Ml3 kit). Az átfertőzött E. coli CJ 236-ból egyszálú DNS-t izolálunk M13 segítő („helper”) fágot (Stratagene) alkalmazva.

Abból a célból, hogy a HVl-KR-t megalkossuk, az

5’-CCGGAAGAATACAAGAGGTAGGATCCT-3 ’ mutagén prímért alkalmazzuk.

AHVl-SFRY-hozaz ’-GAAGAAATCCCGGAATCTTTCAGATACTAGGATCCTGGTACG-3 ’ mutagén prímért alkalmazzuk.

A HVl-WQLR-hez az ’-GAAGAAATCCCGGAATGGGAACTGAGATAGGATCCTGGTACG-3 ’ mutagén prímért alkalmazzuk.

Az egyes primerekből 200 pmolt először foszforilezünk 30 μΐ teljes térfogatban, amely 3 μΐ 1 mol/l-es trisz-HCl-ot (pH 8,0), 0,3 μΐ 1 mol/l-es MgCl₂-ot, 0,75 μΐ 0,2 mol/l-es DTT-t, 0,6 μΐ 20 mmol/l-es ATP-t tartalmaz. 4,5 egység T4 polinukleotidkinázt adunk hozzá, és a keveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 45 percig, majd 65 °C hőmérsékleten 10 percig.

A foszforilezett oligonukleotidokat azután hozzáforrasztjuk a templát DNS-hez az alábbi körülmények között: 0,1 pmol uratilt tartalmazó M13+/HVl-ből származó DNS-t inkubálunk 2 pmol foszforilezett primerrel, ahol mindkettő 10 μΐ teljes térfogat összeforrasztó pufferban van (20 mmol/1 trisz-HCl, 2 mmol/1 MgCl₂, 50 mmol/1 NaCl). A keverékeket azután vízfürdőben melegítjük 80 °C hőmérsékleten, majd lassan hagyjuk lehűlni, amíg a szobahőmérsékletet eléri.

Ezután komplementer szálakat alakítunk ki az alábbi körülmények között: 10-10 μΐ összeforrasztási keveréket inkubálunk 4 μΐ 2-2 mmol/1 különböző dNTP-vel, 0,75 μΐ 0,5 mol/literes trisz-HCl-dal (pH 7,4), 0,75 μΐ 0,1 mol/literes MgCl₂-vel, 2,15 μΐ 0,2 mol/literes DTTvel, 1 egység T4 DNS-polimerázzal és 2 egység T4-DNS-ligázzal. A reakciókeveréket először jégen inkubáljuk 5 percig, majd 25 °C hőmérsékleten 5 percig, végül 37 °C hőmérsékleten 90 percig. Az így létrejövő kettős szálú DNS-t E. coli JMlOl-be transzformáljuk; ez olyan törzs, amely hatékonyan távolítja el az uraciltartalmú templátot, a mutagenizált komplementer szálat replikálódni engedve (Bio-Rad, fentebb említett készlet). Plazmidokat állítunk elő, és ellenőrizzük ezeket a PstI hely távollétére, amely csak a nem mutagenizált vad típusú HV1 DNS utolsó 2 kodonjában lehet jelen.

A megfelelő mutagenezist igazoljuk továbbá az új hirudinmutánsok szekvenciaelemzésével az alábbi prímért alkalmazva:

’-GAAGGTACCCCAACCGCA-3 ’, amely a hirudin kódolószekvenciájának felel meg mintegy 20 bp-vel a mutagén primerektől felfelé.

Végül a három mutagenizált Sall-HindlII fragmentumot kimetsszük a „Bluescript” M13+-ból és újraligáljuk a pJDB207 Sall-HindlII helyeibe.

A három új plazmidot az alábbiak szerint nevezzük el:

1. pJDB207/GAPEL-HVl-KR pJDB207/GAPEL-HVl-SFRY pJDB207/GAPEL-H VI -WQLR

Egy másik eljárás szerint, és abból a célból, hogy képesek legyünk cir° törzsek, például Tr 1302 (lásd korábban a 21. példát) transzformálására, a hirudinmután19

HU 218 731 Β sokat a teljes két mikronos pDP34 vektorba szubklónozzuk (lásd a 9. példát). A pDP34-et elhasítjuk az egyedi BamHl helynél, és a tapadós végeket betöltjük KlenowDNS-polimerázzal, hogy tompa végeket alakítsunk ki. A „Bluescript” M13+-ból való Sall-HindlII fragmentumokat, amelyek a mutált hirudinszekvenciákat tartalmazzák (lásd fentebb), szintén tompa végűvé tesszük és a pDP34 tompa végű (BamHl) helyébe ligáljuk. Az így létrejövő plazmidokat az alábbiak szerint nevezzük el:

1. pDP34/GAPEL-HVl-KR

2. pDP34/GAPEL-HVl-SFRY

3. pDP34/GAPEL-HVl-WQLR

23. példa

S. cerevisiae BYSKEX1 és BYSkexl törzsek transzformálása pJDB207/GAPEL-HIR, pJDB207/GAPEL-HVl-KR, pJDB207/GAPELHV1-SFRY és pJDB207/GAPEL-HVl-WQLR plazidokkal, valamint S. cerevisiae Tr 1210 és Tr 1302 törzsek transzformálása pDP34/GAPEL-HVl-KR,pDP34/GAPEL-HVlSFRY és DP34/GAPEL-HV1-WQLR plazmidokkal pJDB207/GAPEL-HV 1 -KR-t, pJDB207/GAPELHVl-SFRY-t, pJDB207/GAPEL-HVl-WQLR-t és pJDB207/GAPEL-HIR-t transzformálunk S. cerevisiae BYSKEXl-be (DSM 4583) és S. cerevisiae BYSkexlbe, a standard munkamenetet és leucinszelekciót alkalmazva (lásd a 3. példát). Ugyanilyen módon, pDP34/GAPEL-HV1 -KR-t, pDP34/GAPEL-HV1 SFRY-t és pDP34/GAPEL-HVl-WQLR-t transzformálunk S. cerevisiae Tr 1210 és Tr 1302 törzsekbe.

Az így létrejövő törzseket az alábbiak szerint nevezzük el:

S. cerevisiae BYSKEXl/pJDB207/GAPEL-HIR S. cerevisiae BYSKEXl/pJDB207/GAPEL-HVl-KR S. cerevisiae BYSKEXl/pJDB207/GAPEL-HVlSFRY

S. cerevisiae BYSKEXl/pJDB207/GAPEL-HVlWQLR

S. cerevisiae BYSkexl/pJDB207/GAPEL-HIR S. cerevisiae BYSkexl/pJDB207/GAPEL-HVl-KR S. cerevisiae BYSkexl/pJDB207/GAPEL-HVlSFRY

S. cerevisiae BYSkexl/pJDB207/GAPEL-HVlWQLR

S. cerevisiae Tr 1210/pDP34/GAPEL-HVl-KR S. cerevisiae Tr 1210/pDP34/GAPEL-HVl-SFRY S. cerevisiae Tr 1210/pDP34/GAPEL-HVI-WQLR S. cerevisiae Tr 1302/pDP34/GAP$L-HVl-KR S. cerevisiae Tr 1302/pDP34/GAPEL-HVl-SFRY S. cerevisiae Tr 1302/pDP34/GAPEL-HVl-WQLR A S. cerevisiae törzsek fermentálását minimáltápközegen (elő- és főtenyészet) hajtjuk végre, amint ezt korábban leírtuk (lásd a 17. példát).

24. példa

Saccharomyces cerevisiae BYSkexl és BYSK.EX1 transzformánsok fermentációs tenyészeteiből kapott HV1 hirudinvariánsnak és mutánsainak analízise, fordított fázisú HPLC-t alkalmazva órás fermentálás után folyékony élesztőtenyészetből vett mintákat készítünk elő centrifügálással, hogy tiszta oldatot kapjunk, amelyet azután 1:10 (térfogat/térfogat) arányban 1 mol/literes ecetsavoldattal hígítunk, majd HPLC-elemzésnek vetünk alá az alábbi körülmények között.

HIBAR (MERCK) oszlopot (4x125 mm) töltünk meg fordított fázisú, gömb alakú kovasavanyaggal (MACHEREY-NAGEL), ebben a stacionárius fázisban a gömb alakú részecskék átmérője 5 pm és porozitása 100A. Az oszlopvégek rozsdamentes acél zárófejekkel vannak ellátva. Az „A” mobil fázis 0,1% (térfogat/térfogat) trifluor-ecetsavat tartalmazó vízből (Nanopure, BARNSTEAD) áll. A „B” mobil fázis 20% „A” mobil fázisból és 80% (térfogat/térfogat) acetonitrilből (HPLC-minőség, FLUKA) áll, amely még 0,075% (térfogat/térfogat) trifluor-ecetsavat is tartalmaz.

A kromatográfiás elkülönítést 1,5 ml/perc áramlási sebességnél hajtjuk végre az alábbi gradienst futtatva, és az eluátumokat 216 nm-nél mért abszorbanciánál követjük.

(perc)	%A	%B
0	90	10
1	79	21
9	79	21
17	64	36
20	0	100
22	0	100
24	90	10
32/0	90	10

A rendszer kalibrálásához standard oldatot készítünk, 1 mg tiszta deszulfatohirudint feloldva 1 ml vízben. Ebből a standard oldatból 50 pl-t injektálunk az oszlopra, és kromatografáljuk a leírtak szerint, hogy kalibráljuk a rendszert.

A 8. ábra mutatja be azokat az eredményeket, amelyek jelzik, hogy az S. cerevisiae BYSkexl teljes hosszúságú hirudinokat termel (vagy vad típusú HV1 hirudint, vagy HV1-KR, HV1-SFRY, vagy HV1WQLR) eltérő retenciós időkkel a S. cerevisiae BYSKEX1 által termelt hirudinlebontási termékekhez viszonyítva. A vad típusú HV1 hirudin a teljes hosszúságú HV-1 (retenciós idő 17,8 perc) és a két retenciós termék, a „HÍR—64” (retenciós idő 17,8 perc) és a „HÍR-63” (retenciós idő 15,33 perc) tipikus keverékét mutatja BYSKEXl-ben. A BYSkexl csak „HIR-65”öt termel (retenciós idő 17,05 perc).

A HV1-KR mutáns esetében a BYSKEX1 kizárólag azt a lebomlási terméket termeli, amelyből két Cterminális aminosav hiányzik („HÍR-63”, retenciós idő 15,9 perc), míg a BYSkexl a teljes hosszúságú HVl-KR-t termeli (retenciós idő 14,4 perc).

A HV1-WQLR mutáns esetében a BYSKEX1 a 18,6 perces retenciós idővel rendelkező lebomlási terméket mutatja, míg a SYSkexl zömmel teljes hosszúságú HVl-WQLR-t termel (retenciós idő 17,3 perc), és a lebomlási terméknek csak nyomait mutatja. A HV1SFRY teljes hosszúságban csak nyomokban található BYSKEXl-ben (retenciós idő 17,1 perc), a BYBkexl viszont csak ép HVl-SFRY-t mutat (retenciós idő

HU 218 731 Β

17,1 perc). A nagy csúcs (retenciós idő 15,7 perc) nem a HVl-SFRY-hoz tartozik.

Analóg eredményeket kapunk, amikor az alábbi S. cerevisiae KEX1 törzseket: Tr 1210/pDP34/GAPELHV1-KR; Tr 1210/pDP34/GAPEL-HVl-SFRY és Tr 1210/pDP34/GAPEL-HVl-WQLR összehasonlítjuk az alábbi megfelelő kexl törzsekkel:

Tr 1302/pDP34/GAPEL-HVl-KR;

Tr 1302/pDP34/GAPEL-HVl-SFRY; és

Tr 1302/pDP34/GAPEL-HVl-WQLR.

Mikroorganizmusok deponálása

Az alábbi mikroorganizmustörzseket deponáljuk a Deutsche Sammlung von Mikroorganismennél (DSM; Mascherader Weg lb, D-3300 Brauschweig) a jelzett deponálási dátumokkal és letéti számokkal:

Saccharomyces cerevisiae H449: 1988. február 24. DSM 4413

Escherichia coli JM109/pDP38: 1988. február 19. DSM 4414

Escherichia coli JM109/pDP34: 1988. március 14; DSM 4473

Saccharomyces cerevisiae BYS232-31-42: 1988. május 6.

DSM 4583

Saccharomyces cerevisiae HT 246: 1987. április 15.

DSM 4084.

A S. cerevisiae S288C törzs beszerezhető a Yeast Genetic Stock Centertől (University of Califomia, USA); az E. coli HB101Ca²⁺ törzset T. Maniatis et al. könyve - Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982 - írja le.

Claims (25)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás élesztőre heterológ fehérje előállítására, amelyben a heterológ fehérje két C-terminális aminosavmaradékaként Lys, Arg, Tyr, Alá, Leu, Gin, Glu, Asp, Asn vagy Ser van jelen, azzal jellemezve, hogy egy élesztőtörzset, amelyből hiányzik az ysca karboxipeptidáz-aktivitás, és amelyet egy hibrid vektorral transzformáltunk, amely a heterológ fehérjét kódoló DNS-szekvenciához működőképesen kapcsolt élesztőpromotert tartalmaz, tenyésztünk, és a heterológ fehérjét izoláljuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan hibrid vektorral transzformált élesztőtörzset tenyésztünk, amely vektor egy élesztőpromoterből, működőképesen összekapcsolva egy első DNS-szekvenciával, amely egy szignálpeptidet kódol, és ez utóbbi az említett heterológ fehérjét kódoló második DNS-szekvenciához megfelelő leolvasókeretben kapcsolódik, egy második DNS-szekvenciából, amely a heterológ fehérjét kódolja, valamint egy élesztő transzkripciós terminációs szignált hordozó DNS-szekvenciából áll.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás heterológ fehérjeként valamely deszulfatohirudinszármazék előállítására, azzal jellemezve, hogy az élesztőtörzset az ilyen fehérjét kódoló DNS-szakaszt tartalmazó vektorral transzformáljuk.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás deszulfatohirudinszármazékként HV1, HV1 (módosított a, b variáns), HV2, HV2 (módosított a, b, c variáns), PA, valamely PA variáns vagy de(Val₂)-deszulfatohirudin előállítására, azzal jellemezve, hogy az élesztőtörzset az ilyen fehérjét kódoló DNS-szakaszt tartalmazó vektorral transzformáljuk.
5. 5. A 3. igénypont szerinti eljárás deszulfatohirudinszármazékként deszulfatohirudin HV1, HV2, HV2 (módosított a, b, c variáns), PA, PA-variáns vagy de(Val₂)deszulfatohirudin előállítására, azzal jellemezve, hogy az élesztőtörzset az ilyen fehérjét kódoló DNS-szakaszt tartalmazó vektorral transzformáljuk.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás heterológ fehérjeként deszulfatohirudin HV1-variáns előállítására, azzal jellemezve, hogy az élesztőtörzset az ilyen fehérjét kódoló DNS-szakaszt tartalmazó vektorral transzformáljuk.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan élesztőtörzset alkalmazunk, amelyből további karboxipeptidáz-aktivitás, mégpedig az yscA-, yscB-, yscY- vagy yscS-aktivitás is hiányzik.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan élesztőtörzset alkalmazunk, amely endogén kétmikronos DNS-től mentes, és amelyet olyan hibrid vektorral transzformáltunk, amely tartalmazza a teljes kétmikronos DNS-t, beleértve az ép REP1, REP2 és FLP géneket, valamint az ép ŐRI, STB, IR1 és IR2 helyeket.
9. 9. Élesztőtörzs, amelyből hiányzik az ysca karboxipeptidáz-aktivitás, és amelyet olyan hibrid vektorral transzformáltunk, amely egy heterológ fehérjét kódoló DNS-szekvenciához működőképesen kapcsolt élesztőpromotert tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a heterológ fehérjében a két C-terminális aminosav Lys, Arg, Tyr, Alá, Leu, Gin, Glu, Asp, Asn vagy Ser.
10. 10. A 9. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy a hibrid vektor egy élesztőpromotert - amely működőképesen kapcsolódik egy első DNSszekvenciához és ez a szekvecia egy szignálpeptidet kódol, amely a megfelelő leolvasókeretben egy második DNS-szekvenciához kapcsolódik, és ez utóbbi egy heterológ fehérjét kódol - és egy élesztő transzkripciós terminációs szignált tartalmazó DNS-szekvenciát foglal magában.
11. 11. A 10. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy olyan vektorral transzformáltuk, amely heterológ fehérjeként deszulfatohirudint kódoló DNSszekvenciához kapcsolt élesztőpromotert tartalmaz.
12. 12. A 9. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy hiányzik belőle továbbá az yscA, yscB, yscY és yscS karboxipeptidáz közül valamelyiknek az aktivitása is.
13. 13. A 12. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy hiányzik belőle az yscY-aktivitás.
14. 14. A 12. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy hiányzik belőle az yscB, yscY és yscS karboxipeptidáz-aktivitás.

    HU 218 731 Β
15. 15. A 12. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy hiányzik belőle az yscA-, yscB- és yscYaktivitás.
16. 16. A 9. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy mentes az endogén kétmikronos DNS-től, és olyan hibrid vektorral transzformáltuk, amely a teljes kétmikronos DNS-t tartalmazza, ideértve a sértetlen REP1, REP2 és FLP gént, valamint a sértetlen OR1, STB, IR1 és IR2 helyet.
17. 17. A 16. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy hiányzik belőle az yscY-aktivitás.
18. 18. A 16. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy hiányzik belőle az yscB-, yscY- és yscSaktivitás.
19. 19. A 16. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy hiányzik belőle az yscA-, yscB- és yscYaktivitás.
20. 20. A 9. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy olyan hibrid vektorral transzformáltuk, amely a következő élesztőpromoterek valamelyikét tartalmazza: MFal, GÁLI, egy glikolitikus enzimet kódoló gén, ADHI, TRPI és olyan PH05 promoter, amely adott esetben mentes az upstream aktivációs helyektől.
21. 21. A 10. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy olyan hibrid vektorral transzformáltuk, amely tartalmaz egy első DNS-szekvenciát, a következők közül: hirudin szignálszekvencia, az élesztőinvertáz, α-faktor, feromonpeptidáz (K.EX1), „killer toxin” és represszálható savas foszfatáz (PH05) gén szignálás preproszekvenciája, valamint az Aspergillus awamori glükamiláz szignálszekvenciája; és a következő élesztőpromoterek valamelyikét tartalmazza: MFal, GÁLI, egy glikolitikus enzimet kódoló gén, ADHI, TRPI és olyan PH05 promoter, amely adott esetben mentes az upstream aktivációs helyektől.
22. 22. A 10. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy olyan hibrid vektorral transzformáltuk, amelyben a második DNS-szekvencia deszulfatohirudinszármazékként a következők valamelyikét tartalmazza: deszulfatohirudin HV1, HV1 (módosított a, b), HV2, HV2 (módosított a, b, c), PA, egy PA-variáns és de( V al)₂-deszulfatohirudin.
23. 23. A 9. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy olyan hibrid vektorral transzformáltuk, amely egy vagy több, élesztőre szelektív genetikai markért tartalmaz.
24. 24. A 9. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy olyan hibrid vektorral transzformáltuk, amely egy szelektív genetikai markert és egy baktérium gazdaszervezetnek megfelelő replikációs origót tartalmaz.
25. 25. A 9. igénypont szerinti élesztőtörzs, azzal jellemezve, hogy Saccharomyces cerevisiae törzs.

    HU 218 731 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/81

    1 . A B R A a BYSkexl/pJDB 207/PH05-HIR és BYSKEXl/pJDB207/ PH05-HIR tenyészeteiből kinyert hirudin analitikai forditott fázisú folyadékkromatográfiása