DE69130872T2

DE69130872T2 - Sekretionsvektor, diesen enthaltene transformierte Mikroorganismen und Herstellung von Produkten durch obigen Mikroorganismus

Info

Publication number: DE69130872T2
Application number: DE69130872T
Authority: DE
Inventors: Hideyuki Furuya; Yoshifumi Inoue; Hitoshi Matsuda; Satoru Misawa
Original assignee: Japan Energy Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1990-11-08
Filing date: 1991-11-08
Publication date: 1999-08-26
Anticipated expiration: 2011-11-09
Also published as: AU5470194A; US5573929A; NO982207L; ES2093717T3; FI107928B; CA2072375A1; CA2255396A1; DE69121192D1; NO922671L; EP0511393A4; ATE140929T1; US5516656A; EP0687731B1; WO1992008736A1; DK0511393T3; FI922963A; NO303735B1; FI922963A0; DE69121192T2; DE69130872D1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Sekretionsvektoren zur Herstellung von Fremdproteinen, transformierte Mikroorganismen, welche die Vektoren enthalten und ein Verfahren zur Herstellung von Hirudin oder Analogen davon durch die Verwendung transformierter Mikroorganismen.
Die Sekretionsvektoren zur Sekretion von Fremdproteinen, wie das in der vorliegende Erfindung beschriebene Hirudin-Analoge, vereinfachen die industriell vorteilhafte Herstellung von Fremdproteinen wie Hirudin-Analoge, da sie die extrazelluläre Herstellung von Fremdproteinen in hoher Ausbeute ermöglichen, wenn E. coli mit diesen Vektoren transformiert ist.

Stand der Technik

Hirudin ist ein Anti-Koagulationsfaktor, der von den Speicheldrüsen medizinischer Blutegel, Hirudo medicinalis, sekretiert wird, und ist eine Mischung von Peptiden, die aus 65 und 66 Aminosäuren bestehen. Die Hirudinstruktur wurde von Dodt et al. als die der Hirudin-Variante 1 (HV-1) bestimmt [FEBS Lett. 165, 180 (1984)]. Eine andere Variante, Hirudin HV2 [Harvey et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1084 (1986)], enthält im Vergleich zu Hirudin HV1 neun davon verschiedene Aminosäuren, und eine weitere Variante, Hirudin HV3 [Dodt et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 367, 803 (1986)], enthält im Vergleich mit HV2 zehn davon verschiedene Aminosäuren, besitzt dieselbe Sequenz wie HV2 bis zu Ser³² und weist eine Aminosäureinsertion (Ala&sup6;³) in der C-terminalen Region auf. Die Strukturen dieser drei Hirudin-Varianten sind in Fig. 1 gezeigt.
Diese natürlichen Typ-Varianten umfassen 65 oder 66 Aminosäuren, und zwei Domänen sind unterscheidbar. Diese sind die sphärisch strukturierte N-terminale Region mit drei Disulfidbindungen und die saure C-terminale Region, die eine Homologie mit der Thrombin-Spaltungsregion des Prothrombin-Moleküls oder mit der Fibrinogen-Spaltungsregion aufweist.
Die Erfinder haben festgestellt, daß HV1 Leu&sup6;&sup4;-Gln&sup6;&sup5; enthält, während HV3 in der C-terminalen Aminosäure-Region Asp&sup6;&sup5;-Glu&sup6;&sup6; enthält. Es wurde eine Patentanmeldung (Japanische offengelegte Patentveröffentlichung 3-164184 (1991)) über die Synthese von synthetischen Genen für HV1 und HV3 und deren Expression in E. coli eingereicht.
Die Hirudin-Varianten HV1, HV2 und HV3, die eine Anti-Thrombin-Aktivität aufweisen, sind aufgrund ihrer schwerwiegenden Nebenwirkungen wie der Verlängerung der Blutungszeit keine annehmbaren Medikamente zur klinischen Verwendung.
Es wurden Systeme zur Herstellung von Hirudin mittels Gentechnologie vorgeschlagen, jedoch wurde bis jetzt keine zufriedenstellende Methode entwickelt. Vom industriellen Standpunkt aus ist ein extrazelluläres Herstellungssystem besonders wünschenswert, da, wenn das hergestellte Protein extrazellulär sekretiert werden kann, sich nicht nur Vorteile aufgrund der Vereinfachung der Trennung und Reinigung des Produkts wegen seines Vorhandenseins in aktiver Form ergeben, sondern ebenfalls weil das Produkt vor dem Verdau durch intrazelluläre bakterielle Proteasen geschützt wird.
Es wurden Verfahren unter Verwendung von Bacillus subtilis, Hefe oder E. coli als Wirte zur Herstellung von Hirudin mittels Sekretion vorgeschlagen.
Verfahren unter Verwendung von Bacillus subtilis als Wirt sind dahingehend unvorteilhaft, daß in diesem Bakterium Plasmide im allgemeinen instabil sind, was zum regelmäßigen Verlust der Plasmide führt, wodurch eine stabile Protein- Herstellung erschwert wird, oder die Protein-Produkte im Medium werden wahrscheinlich von den eigenen Proteasen, die ebenfalls ins Medium sekretiert werden, abgebaut. Verfahren, die zur Hirudin-Produktion vorgeschlagen wurden (beispielsweise Japanische offengelegte Patentveröffentlichung 2-35084 (1990)) haben solche Probleme nicht gelöst, und die Ausbeute bei der Herstellung liegt nur etwa bei 100 mg/L.
Von Verfahren, bei denen Hefen als Wirte verwendet wurden, ist bekannt, daß die C-terminalen Aminosäuren des Produkts durch die Carboxypeptidase hydrolysiert werden.
In einem früheren Bericht (N. Riehl-Bellon et al., Biochemistry 1989, 28, 2941- 2949) sind Nebenprodukte offenbart, bei denen ein oder zwei Aminosäurereste vom C-terminalen Ende von HV2 hydrolysiert werden.
Um dieses Problem zu lösen, wurde ein Verfahren unter Verwendung Carboxypeptidase-freier Hefen (Japanische offengelegte Patentveröffentlichung 2- 104279 (1990)) als Wirte vorgeschlagen, das aber nicht zu einer ausreichenden Produktivität geführt hat.
Unter Verwendung von E. coli als Wirt wurde über ein Verfahren berichtet, bei dem die Signalsequenz der alkalischen Phosphatase verwendet wird (J. Dodt et al., FEBS Lett. 202, 373-377 (1986)). Obwohl dies ein Sekretionssystem ist, wird das Produkt hauptsächlich in den periplasmatischen Raum sekretiert, was nicht zufriedenstellend ist, da die Zerstörung von Bakterienzellen durch einen zusätzlichen Aufarbeitungsschritt wie ein osmotischer Schock erforderlich ist, und die Produktausbeute liegt nur bei 4 mg/L.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfinder haben verschiedene Hirudin-Analoge, die auf der Primärstruktur der vorstehenden Hirudine HV1, HV2 und HV3 basieren, hergestellt, um ihre Eigenschaften in Tiermodellen zu vergleichen. Sie haben festgestellt, daß ein Hirudin- Analoges (chimäres Hirudin) mit der Hirudin HV1-Aminosäuresequenz bis zur 52. Aminosäure und danach ersetzt durch die Sequenz von HV3, nicht nur eine hohe Anti-Thrombin-Aktivität aufweist, sondern ebenfalls die Verlängerung der Blutungszeit verkürzt.
Darüber hinaus haben die Erfinder hier die extrazelluläre Herstellung von Fremdproteinen in hoher Ausbeute unter Verwendung von E. coli als Wirt eingehend untersucht und haben die vorliegende Erfindung durch die Entdeckung vervollständigt, daß bei einer Verwendung eines Replikationsursprungs (ori) eines pUC- Plasmids als Replikationsursprung in einem Sekretionsvektor mit der DNA-Sequenz für ein Signalpeptid und einem Promotor Fremdprotein in großer Menge von E. coli sekretiert werden kann.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung einen Sekretionsvektor für Hirudin oder ein Hirudin-Analoges mit hoher Anti-Thrombin-Aktivität.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls einen für die Aminosäuresequenz des Hirudin-Analogen, das die hohe Anti-Thrombin-Aktivität und niedrige Blutungstendenz aufweist, kodierenden DNA-Sekretionsvektor, transformierte Mikroorganismen, die durch Transformation von E. coli mit Expressionsvektoren, welche die DNA-Sequenz beinhalten, hergestellt wurden und ein Verfahren zur Herstellung von Hirudin-Analogen durch Expression der DNA-Sequenz unter Verwendung der vorstehenden transformierten Mikroorganismen und Gewinnung des Hirudin-Analogen.
Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Sekretionsvektors kodiert für das Hirudin-Analoge HV1C3, das die in der folgenden Primärstruktur gezeigte Se quenz besitzt: (Formel-1)
Eine beispielhafte DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz dieses Analogen kodiert, kann durch die folgende Formel dargestellt werden:
GTT GTA TAC ACT GAT TGT ACT GAA TCT GGC 30
CAG AAC CTG TGT CTG TGT GAA GGA TCC AAC 60
GTT TGT GGT CAG GGT AAC AAA TGT ATC CTC 90
GGG TCT GAT GGT GAA AAG AAC CAG TGT GTT 120
ACT GGT GAA GGT ACC CCG AAA CCG CAG TCT 150
CAT AAC CAG GGT GAT TTC GAA CCG ATC CCG 180
GAA GAC GCG TAC GAT GAA
Das in der Formel-1 gezeigte erfindungsgemäße Hirudin-Analoge kann durch chemische Synthese synthetisiert werden, oder es kann durch gentechnologische Verfahren hergestellt werden.
Zur Herstellung des Hirudin-Analoge durch Gentechnologie wurden erstens, wie in einem späteren Beispiel beschrieben, die Hirudin HV1-Sekretionsplasmide pMTSHV1 und pMKSHV1 konstruiert und zur Transformation von E. coli verwendet. Hirudin HV1 wurde durch Sekretion unter Verwendung der transformierten Mikroorganismen hergestellt. Wie in Fig. 3 gezeigt, umfaßt das Plasmid pMTSHV1 einen Promotor (Ptrp), eine für ein Signalpeptid (PhoA-Signal) kodierende DNA-Sequenz, eine für die Aminosäuresequenz von Hirudin HV1 kodierende DNA-Sequenz, einen Replikationsursprung (ori) und eine DNA-Sequenz, die ein Translationsterminationssignal (rrnBT1T2) enthält. Um nach der 52. Aminosäure die Sequenz von Hirudin HV1 durch die Aminosäuresequenz von HV3 zu ersetzen, wurde in der vorliegenden Erfindung das HV1-Sekretionsplasmid pMTSHV1 mit einem Restriktionsenzym gespalten, um die nach der 52. Aminosäure für Hirudin HV1 kodierende DNA-Sequenz zu entfernen. Andererseits wurde die für die mit der 53. Aminosäure beginnende Aminosäuresequenz des HV3-Expressionsplasmids kodierende DNA-Sequenz unter Verwendung eines Restriktionsenzyms ausgeschnitten. Die DNA mit der für bis zur 52. Aminosäure von Hirudin HV1 kodierenden Sequenz, aus dem Plasmid pMTSHV1, und die für die Aminosäuresequenz, beginnend mit der 53. Aminosäure von Hirudin HV3, stammend vom Plasmid pUCHV3, kodierende DNA wurden mit DNA-Ligase zur Konstruktion des Plasmids pMTSHV1C3 ligiert.
Das Plasmid pMTSHV1C3 umfaßt eine DNA-Sequenz, enthaltend einen Promotor, ein Signalpeptid und einen Replikationsursprung (ori), stammend vom Plasmid pMTSHV1, eine für die 1. bis 52. Aminosäure von Hirudin HV1 kodierende DNA-Sequenz und ein Translationsterminationssignal und eine für die mit der 53. Aminosäure beginnenden Aminosäuren von Hirudin HV3 kodierende DNA-Sequenz, stammend vom Plasmid pUCHV3, die zwischen der vorstehenden, für die 1. bis 52. Aminosäuren von Hirudin HV1 kodierenden, DNA-Sequenz und dem Translationsterminationssignal eingefügt ist.
Wenn das Plasmid pMTSHV1C3 von einer erfindungsgemäßen Ausführungsform in E. coli eingeschleust bzw. eingeführt wird und die transformierten Mikroorganismen anschließend gezüchtet werden, wird das Hirudin-Analoge intrazellulär erzeugt und in das Medium sekretiert.
In der vorliegenden Erfindung wurde das Hirudin-Analoge durch allgemein bekannte Verfahren isoliert und durch Verfahren wie Säulenchromatographie, Reverse-Phase-HPLC etc. gereinigt.
Das erhaltene Hirudin-Analoge zeigte im Tiermodell verglichen mit Hirudin HV1 eine höhere Anti-Thrombin-Aktivität und eine niedrigere Blutungsneigung auf. Es kann durch Herstellen mittels allgemein bekannter Formulierungsverfahren zu einem ausgezeichneten Anti-Koagulanz-Medikament formuliert werden. Mit anderen Worten kann das erfindungsgemäße Hirudin-Analoge mittels üblicher Verfahren weiter aufgearbeitet werden, bei denen herkömmliche Träger für den pharmazeutischen Gebrauch oder Formulierungszusätze verwendet werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung wird intravenös, intrakutan, subkutan oder intramuskulär oder nicht-oral äußerlich verabreicht. Obwohl die richtige Dosis für jeden einzelnen Fall unter Einbeziehung von Faktoren wie Symptome, Alter und Geschlecht eines Patienten bestimmt wird, liegt sie im allgemeinen im Bereich von 0,1 mg bis 100 mg für einen Erwachsenen pro Tag, und die Gesamtmenge wird in einer bis mehreren Dosen verabreicht.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung, wie vorstehend beschrieben, ebenfalls Sekretionsvektoren zur Herstellung von Fremdproteinen, insbesondere den Sekretionsvektor zur extrazellulären Herstellung von Hirudin oder eines Analogen davon in hoher Ausbeute.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Sekretionsvektoren, die für Hirudin oder Analoge davon kodierende DNA-Sequenzen enthalten, Mikroorganismen (E. coli), die mit den Sekretionsvektoren transformiert sind und Verfahren zur Herstellung von Hirudin oder Analoge davon durch Züchtung der transformierten Mikroorganismen und Gewinnung des Produkts aus dem Medium.
Der erfindungsgemäße Sekretionsvektor für Fremdproteine umfaßt einen von einem pUC-Plasmid stammenden Replikationsursprung (ori), einen tac- oder trp- Promotor, eine Signalpeptidsequenz und eine für das Fremdprotein kodierende DNA-Sequenz.
Das DNA-Fragment, das den Replikationsursprung (ori) eines pUC-Plasmids enthält, kann in der vorliegenden Erfindung durch Spaltung im Handel erhältlicher Plasmide der pUC-Familie, beispielsweise pUC9, pUC18 oder pUC19, mit Kombinationen geeigneter Restriktionsenzyme hergestellt werden. Beispielsweise kann ein DNA-Fragment von etwa 1440 Basenpaaren, enthaltend einen durch Spaltung von pUC18 mit den Restriktionsenzymen Pvu I oder Pvu I und Pvu II hergestellten Replikationsursprung (ori), als pUC-Replikationsursprung in den erfindungsgemäßen Plasmiden verwendet werden.
Der erfindungsgemäße tac- und trp-Promotor weisen die in Fig. 7 bzw. 8 gezeigten Nukleotidsequenzen auf und können in einfacher Weise mittels eines DNA-Synthesegeräts synthetisiert werden usw. Daher können diese Promotoren synthetisiert und mit den Replikationsursprung (ori) des Plasmids pUC18 enthaltenden Fragmenten ligiert werden. In einer anderen Ausführungsform können sie in relativ einfacher Weise durch Ligation von DNA-Fragmenten, die durch Spaltung im Handel erhältlicher Plasmide mit Restriktionsenzymen erhalten wurden, hergestellt werden. Beispielsweise kann das Plasmid pMK2 durch Ligation mit T4-DNA-Ligase von DNA-Fragmenten, enthaltend die DNA-Sequenz des tac- Promotors, erhalten durch Spaltung des im Handel erhältlichen Plasmids pKK223-3 (Pharmacia) mit den Restriktionsenzymen Pvu I und Nru I und eines DNA-Fragments, enthaltend einen Replikationsursprung (ori), erhalten durch Spaltung des im Handel erhältlichen Plasmids pUC18 mit den Restriktionsenzymen Pvu I und Pvu II, hergestellt werden.
Das Plasmid pMT1 kann durch Entfernen des Fragments, enthaltend die DNA- Sequenz des tac-Promotors, durch Spaltung des vorstehenden Plasmids pMK2 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Eco47III und anschließendem Einfügen eines Fragments, enthaltend die mit einem DNA-Synthesegerät synthetisierte trp- Promotorsequenz, hergestellt werden.
Als DNA-Sequenz der erfindungsgemäßen Signalpeptide können für Signalpeptide von im Periplasma von E. coli lokalisierter Proteine, beispielsweise Enzyme, wie alkalische Phosphatase (pho A) und b-Lactamase (bla) oder Proteine in der äußeren Membran, wie OmpA, OmpB und OmpF, kodierende DNA-Sequenzen verwendet werden. Diese DNA-Fragmente können unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts in einfacher Weise hergestellt werden.
Sekretionsvektoren für Hirudin und Varianten davon sind von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Die Aminosäuresequenzen dieser Proteine sind in der Fig. 1 als Hirudine HV1, HV2, HV3 und HV1C3 gezeigt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz der Hirudine HV1, HV2, HV3 und HV1C3.
Fig. 2 zeigt die DNA-Sequenz des phoA-Signalpeptids.
Fig. 3 zeigt einen Überblick zur Konstruktion des Hirudin HV1-Sekretionsplasmids pMTSHV1.
Fig. 4 zeigt einen Überblick zur Konstruktion des Plasmids pMKSHV1.
Fig. 5 zeigt einen Überblick zur Konstruktion des Hirudin HV1C3-sekretierenden Plasmids pMTSHV1C3.
Fig. 6(A) zeigt das C4-Reverse-Phase-HPLC-Profil von Hirudin HV1, bzw. (B) zeigt das C4-Reverse-Phase-HPLC-Profil von Hirudin HV1C3.
Fig. 7 zeigt die DNA-Sequenz des in der vorliegenden Erfindung verwendeten tac-Promotors.
Fig. 8 zeigt die DNA-Sequenz des in der vorliegenden Erfindung verwendeten trp-Promotors.
Fig. 9 zeigt einen Überblick zur Konstruktion des Hirudin HV3-sekretierenden Plasmids pMTSHV3.
Fig. 10 zeigt die DNA-Sequenz des für die Hirudin-HV3-Sekretion in Beispiel 5 verwendeten Signalpeptids PhoA.
Fig. 11 zeigt das Profil des durch C4-Reverse-Phase-HPLCvon gereinigten Hirudins HV3.

Beste Art und Weise zur Durchführung der Erfindung

Die Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pUCHV1, pMT1 und pMK2 zur Verwendung bei der Konstruktion von pMTSHV1 oder pMKSHV1 als Hirudin HV1-Sekretionsplasmide, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, und des Plasmids pUCHV3 zur Verwendung bei der Konstruktion von Plasmid pMTSHV1C3 sind in den folgenden Referenzbeispielen bereitgestellt.

[Referenzbeispiel 1]

Herstellung des Plasmids pUCHV1 und des Plasmids pUCHV3

10 ug im Handel erhältliches Plasmid pUC18 wurden mit 30 Einheiten EcoRI und 30 Einheiten HindIII bei 37ºC für 2 Stunden verdaut. Der Vektoranteil wurde dann durch Agarosegel-Elektrophorese und anschließender Extraktion abgetrennt. Proteine wurden durch Phenol-Extraktion entfernt, die DNA wurde mit kaltem Ethanol präzipitiert und in 50 pL TE-Pufferlösung (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) gelöst. Zu dieser Lösungsmenge, die 50 ng DNA enthalten sollte, wurden 10 uL von 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 1 mM ATP und 300 Einheiten T4-DNA-Ligase, enthaltend doppelsträngige HV1- oder HV3-DNA, zugegeben, mit anschließender Reaktion bei 16ºC über Nacht, um das Plasmid pUCHV1 oder pUCHV3 zu erzeugen, in welchem das HV1- bzw. HV3-Gen zwischen den EcoRI- und HindIII-Spaltstellen des Plasmids pUC18 eingefügt wurde.

[Referenzbeispiel 2]

Herstellung des Plasmids pMK2 und des Plasmids pMT1

(a) Herstellung des Plasmids pMK2

Ein Fragment, das den tac-Promotor enthält, der durch Spaltung von im Handel erhältlichem Plasmid pKK223-3 (Pharmacia) mit dem Restriktionsenzym PvuI und Nrul erhalten wurde, ein Fragment, das einen Replikationsursprung (ori) enthält, der durch Spaltung von im Handel erhältlichem pUC18 mit den Restriktionsenzymen PvuI und PvuII erhalten wurde, und ein Fragment, das das Ampicillin-Resistenzgen enthält, wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert. Das so erhaltene Fragment wurde in E. coli JM109 eingeschleust, mit anschließender Züchtung, Absuche nach Ampicillinresistenz, und ein Vektor wurde erhalten, der sowohl den tac-Promotor als auch den Replikationsursprung (ori) von pUC18 aufweist, und mit pMK2 bezeichnet.

(b) Herstellung des Plasmids pMT1

10 ug Plasmid pMK2 wurden mit 30 Einheiten EcoRI und Eco47III zur Entfernung des den tac-Promotor enthaltenden Fragments verdaut, und dann wurde das den Replikationsursprung (ori) enthaltende Fragment durch Agarosegel-Elektrophorese gewonnen. Das den trp-Promotor enthaltende DNA-Fragment wurde mittels eines DNA-Synthesegeräts synthetisiert. Dieses Fragment wurde mit dem vorstehenden Fragment, das durch den Verdau von pMK2 mit EcoRI und Eco47III hergestellt wurde, unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 16ºC über Nacht ligiert. Die Ligationsprodukte wurden zur Transformation von E. coli JM109 verwendet, um einen Vektor herzustellen, der sowohl den trp-Promotor als auch den Replikationsursprung (ori) des Plasmids pMK2 aufweist. Die DNA-Sequenz dieses Plasmids wurde durch das Verfahren von Sanger et al. überprüft und mit pMT1 bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung wird hiernach ausführlich durch das folgende Beispiel erläutert.

[Beispiel 1]

(1) Konstruktion des Hirudin-HV1-Sekretionsplasmids pMTSHV1

Das Plasmid pMTSHV1 wurde gemäß dem in Fig. 3 gezeigten Verfahren konstruiert. Die vier in Fig. 2 gekennzeichneten Oligonukleotide wurden synthetisiert, um ein DNA-Fragment zu konstuieren, das dem Signalpeptid der alkalischen Phosphatase (phoA) von E. coli und dem für Val¹-Val² der N-terminalen Aminosäure von Hirudin HV1 kodierenden DNA-Fragment entspricht. Nach dem Entschützen wurde jedes Oligonukleotid durch 10% Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt.
Nachdem 500 umol von jedem der beiden Oligonukleotide S2 und S4 phosphoryliert worden waren, wurden jeweils 20 umol der vier Oligonukleotide gemischt, aneinander angelagert und dann bei 16ºC über Nacht mit 20 uL Lösung, die T4- DNA-Ligase enthielt, behandelt. Nach dem Entfernen von Protein unter Verwendung von Phenol und Chloroform und Präzipitation mit kaltem Ethanol wurde das gewünschte doppelsträngige DNA-Fragment erhalten. 1/10 der Menge des erhaltenen Fragments und 100 ng des Plasmids pUCHV1 (Japanische offengelegte Patentveröffentlichung 3-164184 (1991)), gespalten mit den Restriktionsenzymen EcoRI und AccI, wurden mit T4-DNA-Ligase bei 16ºC über Nacht umgesetzt. Das Hybridplasmid pSHV1, enthaltend das Fusionsgen, in welchem die für das Hirudin HV1 kodierende DNA-Sequenz direkt hinter der für das phoA- Signalpeptid kodierenden Sequenz ligiert ist, wurde durch Transformation von E. coli JM109 erhalten. Die DNA-Sequenz dieses Plasmids pSHV1 wurde durch das Verfahren von Sanger et al. überprüft.
10 ug pSHV1 wurden mit den Restriktionsenzymen EcoRI (30 Einheiten) und HindIII (30 Einheiten) verdaut, und das 276 Bp umfassende Fusionsgenfragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt.
100 ng des erhaltenen DNA-Fragments und 100 ng der DNA, erhalten durch Verdau des E.-coli-Expressionsvektors pMT1 (Japanische offengelegte Patentveröffentlichung 3-76579 (1991)) mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII, mit anschließender Reinigung der DNA-Fragmente durch Agarosegel- Elektrophorese, wurden mit T4-DNA-Ligase bei 1600 über Nacht ligiert. Die resultierende Reaktionsmischung wurde zur Transformation von E. coli JM 109 verwendet, um das Hirudin HV1-Sekretionsplasmid pMTSHV1 zu erhalten, in welchem das für das phoA-Signalpeptid und Hirudin HV1 kodierende Fusionsgen der trp-Promotor-Region folgt. Die DNA-Sequenz von pMTSHV1 wurde durch das Verfahren von Sanger et al. überprüft.

(2) Konstruktion des Hirudin-HV1-Sekretionsplasmids pMKSHV1

Das Plasmid pMKSHV1 wurde gemäß dem in Fig. 4 gezeigten Verfahren konstruiert.
Die vorstehende, für das phoA-Signalpeptid und Hirudin HV1 kodierende, fusionierte DNA und das DNA-Fragment, erhalten durch Verdau des E.-coli-Expressionsplasmids pMK2 (Japanische offengelegte Patentveröffentlichung 3-76579 (1991)) mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII, wurden mit T4-DNA- Ligase ligiert, die Ligationsprodukte wurden zur Transformation von E. coli JM109 verwendet, und das Hirudin HV1-Sekretionsplasmid pMKSHV1 wurde erhalten, bei welchem das Fusionsgen stromabwärts vom tac-Promotors eingefügt ist. DNA-Sequenz des Plasmids pMKSHV1 wurde durch das Verfahren von Sanger et al. überprüft.

(3) Herstellung von Hirudin HV1 durch pMTSHV1 mittels Sekretion

E. coli JM109, transformiert mit dem Plasmid pMTSHV1 oder pMKSHV1, konstruiert wie vorstehend in (1) und (2), wurde in 2 · YT-Medium (16 g/L Bactotrypton, 10 g/L Bacto-Hefeextrakt und 5 g/L NaCl), enthaltend 100 pg/mL Ampicillin, gezüchtet. Nach der Züchtung bei 37ºC für 24 Stunden wurde 1 mL des Kulturmediums entnommen.
Die präzipitierten Zellen jeder Probe wurden in 1 mL von 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 25% Saccharose und 1 mM EDTA, suspendiert und anschließend bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Nach dem Gewinnen der Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 · g für 10 Minuten wurden die Zellen in 1 mL kaltem Wasser suspendiert, um die Substanzen im periplasmatischen Raum durch osmotischen Schock freizusetzen. Die Zellen wurden von der periplasmatischen Fraktion durch Zentrifugation bei 6.000 · g für 10 Minuten entfernt. Die Menge des sekretierten und periplasmatisch angereicherten Hirudins wurde durch Bestimmung der Anti-Thrombin-Aktivität im Überstand bestimmt. Die Anti- Thrombin-Aktivität basiert auf der quantitativen Messung der Farbintensität, hervorgerufen durch die hydrolytische Thrombin-Aktivität bezüglich des synthetischen Farbsubstrats Chromozym TH (Tocylglycilprolylarginin-4-nitroanilidacetat, Boehringer-Mannheim) und der inhibitorischen Hirudin-Aktiviät gegenüber Thrombin, welche die Farbentwicklung vermindert.
Diese Umsetzung wurde folgendermaßen durchgeführt. Im Reaktionsvolumen von 1 mL wurden 0,36 NIH U humanes Thrombin (Sigma) zu einem Puffer, enthaltend 100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 150 mM NaCl und 0,1% Polyethylenglykol-6000, hinzugegeben, anschließend wurden Standard-Hirudin oder unbekannte Probe hinzugegeben, und danach wurde bei 37ºC für 3 Minuten vorinkubiert.
Sowohl das Substrat als auch Chromozym TH wurden zu einer Endkonzentration von 200 uM hinzugegeben, um die Freisetzung von p-Nitroanilid durch dem Anstieg der Absorption bei 405 nm der Lösung pro 1 Minute zu messen, und die Anti-Thrombin-Aktivität (ATU) wurde berechnet.
Als Ergebnis ergab der Stamm, enthaltend das Plasmid pMTSHV1, eine Anti- Thrombin-Aktivität von 450 ATU pro 1 mL Kulturmedium. Der Stamm, enthaltend das Plasmid pMKSHV1, ergab eine Anti-Thrombin-Aktivität von 360 ATU pro 1 mL Kulturmedium. Die Ergebnisse weiterer Untersuchungen zur Herstellung von Hirudin mit verschiedenen E. coli-Stämmen wie JM101, JM103, JM109, TG1, HB101, JA221, IFO3301, C600, RR1 und DH5, in welchen das Plasmid pMTSHV1 durch das Transformationsverfahren von Hanahan et al. eingeschleust wurde, sind in Tabelle 1 gezeigt.
Wenn RR1 als Wirt verwendet wurde, wurden etwa 2000 ATU/mL HV1 extrazellulär erzeugt. Tabelle 1

(4) Sekretion von Hirudin HV1 in das Kulturmedium von transformierten E. coli JM 109/pMTSHV1

Wenn der E. coli-Stamm JM109 mit dem Plasmid pMTSHV1 (E. coli JM 109/pMTSHV 1) (FERM BP-3266) transformiert und in 2L2 · YT-Kulturmedium, enthaltend 2% Glucose in einem 5 L-Fermenter, unter Schütteln und Belüftung bei 37ºC für 24 Stunden gezüchtet wurde, wurden 5300 ATU Hirudin HV1 pro 1 mL extrazellulär hergestellt.

(5) Reinigung von Hirudin HV1 aus Kulturmedien

Nach der Fermentation wurden 1,5 L Kulturmedium gesammelt und zur Trennung des Überstands von Zelltrümmern bei 6.000 · g für 10 Minuten zentrifugiert. Da die Salzkonzentration im Überstand 1,3% betrug, wenn sie mit einem Salz messer gemessen wurde, wurde der Überstand vierfach mit 10 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) verdünnt und durch einen 3,2 um-Filter (Pole Co. Ltd.) filtriert. Das Filtrat wurde auf eine mit 10 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) äquilibrierte QAE-Toyopearl-Säule (4,4 · 7 cm) aufgetragen. Nach dem Auftragen der Probe wurde die Säule mit Puffer äquilibriert, und anschließend wurde das Hirudin HV1 mit 0,2 M NaCl schrittweise eluiert. Die eluierte Lösung wurde unter Verwendung einer Amicon Diaflow Membran (YM5) konzentriert, und anschließend durch Gelfiltration über Sephacryl S-100HR, voräquilibriert mit 10 mM Kaliumphophat-Puffer (pH 7,0), entsalzt.
Die aktiven Fraktionen wurden auf eine DEAE-Toyopearl-Säule (4,4 · 40 cm), äquilibriert mit 10 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0), aufgetragen, gründlich gewaschen und dann mit einem linearen Gradienten, der zwischen 3 L Äquilibrierungspuffer und 3L 0,3 M NaCl in Äquilibrierungspuffer erzeugt wurde, eluiert. Die abschließende Reinigung wurde über eine C4-Reverse-Phase-HPLC-Säule mit Delta-prep 3000, einem Produkt von Waters, durchgeführt. Das gereinigte Hirudin HV1 wurde durch Elution von der Säule unter Verwendung eines linearen Gradienten von 15 bis 30% (v/v) Acetonitril, enthaltend 0,065% (v/v) Trifluoracetat, erhalten.
Der Reinigungsgrad bei jedem Schritt ist in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Die Aminosäurezusammensetzung des so erhaltenen Hirudins HV1 zeigte einen mit dem des natürlichen Hirudins HV1 konsistenten Wert, wie in Tabelle 3 gezeigt. Die N-terminale Aminosäuresequenz des gereinigten Hirudins HV1 begann mit Val-Val-Tyr, wie in Tabelle 4 gezeigt, was darauf hinweist, daß die korrekte Spaltung des phoA-Signalpeptids stattgefunden hatte. Die Anti-Thrombin-Aktivität betrug 8202 ATU/mg. Tabelle 3 Tabelle 4

(6) Herstellung des chimären Hirudin-HV1C3-Sekretionsplasmids pMTSHV1C3

Das Plasmid pMTSHV1C3 wurde entsprechend des in Fig. 5 beschriebenen Verfahrens konstruiert. Um die Sequenz nach der 52. Aminosäure des Hirudins HV1 durch die Sequenz von HV3 zu ersetzen, wurde das HV1-Sekretionsplasmid pMTSHV1 (10 ug) mit den Restriktionsenzymen Kpn I (30 Einheiten) und HindIII (30 Einheiten) verdaut und anschließend der Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, um ein 2,8 kBp umfassendes DNA-Fragment zu isolieren.
In ähnlicher Weise wurden 10 ug Plasmid pUCHV3 (Japanische offengelegte Patentveröffentlichung 3-164184 (1991)) ebenfalls mit KpnI und HindIII verdaut, und ein für die C-terminale Aminosäuresequenz von HV3 kodierendes 80 Bp- DNA-Fragment wurde isoliert.
100 ng beider DNA-Fragmente wurden mit T4-DNA-Ligase bei 16ºC über Nacht umgesetzt, und die resultierende Reaktionsmischung wurde zur Transformation von E. coli JM109 verwendet, um das chimäre Hirudin HV1C3-Sekretionsplasmid pMTSHV1C3 zu erhalten. Die DNA-Sequenz des Plasmids pMTSHV1C3 wurde durch das Verfahren von Sanger et al. überprüft.

(7) Herstellung des chimären Hirudins HV1C3 durch Sekretion unter Verwendung des Hirudin-Sekretionsnlasmids pMTSHV1C3

E. coli RR1 (FERM BP-3130), transformiert mit dem Plasmid pMTSHV1C3, das wie vorstehend in (6) konstruiert wurde, wurde in 2 · YT-Medium, enthaltend 100 ug/mL Ampicillin, gezüchtet. Nach der Züchtung bei 37ºC für 24 Stunden wurde 1 mL Kulturmedium entnommen, und es wurde ein osmotischer Schock angewendet, um die Anti-Thrombin-Aktivität der periplasmatischen Fraktion zu messen.
Als Ergebnis wurden 3060 ATU Anti-Thrombin-Aktivität pro 1 mL Kulturmedium ermittelt.

(8) Sekretion des chimären Hirudins HV1C3 in das Fermentations- oder Kulturmedium durch den transformierten Stamm E. coli JM109/pMTSH1C3

Wenn E. coli JM109 (FERM BP-3104), transformiert mit Plasmid pMTSHV1C3, in 2 L 2 · YT-Kulturmedium, enthaltend 2% Glucose, in einem 5 I-Fermenter unter Schütteln und Belüften bei 37ºC für 24 Stunden gezüchtet wurde, wurde eine Gesamt-Anti-Thrombin-Aktivität von 6050 ATU/mL, 350 ATU/mL im Periplasma und 5700 ATU/mL im Kulturmedium ermittelt.

(9) Reinigung des chimären Hirudins HV1C3

Das Hirudin HV1C3 wurde aus dem vorstehend in (8) erhaltenen Kulturmedium gemäß dem vorstehend in (5) angegebenen Verfahren gereinigt. Wenn die Aminosäuresequenz des gereinigten chimären Hirudins HV1C3 bestimmt wurde, wurde bestätigt, daß sich die C-terminale Aminosäuresequenz wie beabsichtigt von der in HV1 unterschied, wie in Fig. 1 gezeigt. Die spezifische Aktivität betrug 11.250 ATU/mg. Die HPLC-Profile von gereinigtem HV1 und HV1C3 sind in Fig. 6 gezeigt. Das Experiment wurde mit einer VYDAC C4-Säule (0,46 · 25 cm) unter Verwendung eines linearen Acetonitril-Gradienten von 15 bis 30% bei einer Flußrate von 1 mL/min für 30 Minuten durchgeführt.

[Beispiel 2]

Inhibierungswirkung von Hirudin gegen Thrombin-induzierten Tod

Thrombin (10 NIH-Einheit/10 g) wurde interavenös an männliche Mäuse (20-25 g) ohne Anästhesie verabreicht, und die Anti-Thrombin-Aktivität der getesteten Verbindung wurde durch Beobachtung des Schwundes der "roll over"-Reflexion und des Todes als Indikatoren abgeschätzt. Alle getesteten Verbindungen wurden in Kochsalzlösung gelöst und 0,05 mL/10 g wurden intravenös 5 min vor der Thrombin-Injektion verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Inhibierungswirkung von Hirudin gegen Thrombin-induzierten Tod
*Wertung Wertung 0: Kein Schwund der "roll over"-Reflexion (scheinbar normal)
Wertung 1: Schwund der "roll over"-Reflexion, aber kein Tod innerhalb von 20 Minuten
Wertung 2: Tod innerhalb von 20 Minuten
Aus der Tabelle ist es deutlich ersichtlich, daß das erfindugsgemäße chimäre Hirudin (HV1C3) bezüglich der Thrombin-induzierten Todesreaktion in vivo eine etwa 4 bis 5 mal größere inhibitorische Wirkung, verglichen mit Hirudin HV1, aufzeigte.

[Beispiel 3]

Verlängerung der Blutungszeit

Es wurden Proben in männliche Mäuse (20-25 g) unter Anästhesie mit Natriumpentobarbital (40 mg/kg i. p.) über ihre Schwanzvene injiziert. Es wurde eine punktförmige Wunde durch den Stich mit einer 21G-Nadel (äußerer Durchmesser 0,85 mm) in die andere Seite der Schwanzvene 5 Minuten nach der Verabreichung der Test-Verbindungen zugefügt, und die Blutungszeit der Wunde wurde gemessen. Es wurde ein Filterpapier auf die Wunde gelegt und alle 15 Sekunden gewechselt. Die Blutungszeit ist als die Zeit definiert, die vergeht, bis kein roter Punkt mehr auf dem Filterpapier beobachtet wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6: Verlängerung der Blutungszeit
Im allgemeinen ist die Verlängerung der Blutungszeit eine der Nebenwirkungen von Anti-Koagulanzien. Hier konnte für das durch einen erfindungsgemäßen Sekretionsvektor hergestellte chimäre Hirudin (HV1C3) deutlich bestätigt wer den, daß es zu einer geringeren Blutung führt als Hirudin HV1.

[Beispiel 4]

Zubereitung mit chimärem Hirudin HV1C3 als Bestandteil

Das gereinigte chimäre Hirudin HV1C3 des Beispiels 1-(9) wurde unter Verwendung von Sephadex G25 (Pharmacia) entsalzt und anschließend durch einen 0,22 um-Filter unter sterilen Bedingungen filtriert. Die Lösung wurde auf Fläschchen bzw. Ampullen aufgeteilt und lyophilisiert. Das so erhaltene lyophilisierte Pulver des chimären Hirudins HV1C3 kann in Kochsalzlösung aufgelöst und als injizierbares Medikament verwendet werden.

[Beispiel 5]

Herstellung des Hirudins HV3

(1) Konstruktion eines Hirudin HV3-Sekretionsplasmids

(i) Wie in Fig. 9 gezeigt, wurden der Replikationsursprung (ori), erhalten durch Verdau des Plasmids pUCHV3, hergestellt in Referenzbeispiel 1, mit den Restriktionsenzymen EcoRI und AccI, ein Vektorfragment, enthaltend das Ampicillin- Resistenzgen, und ein für die Signalsequenz der alkalischen Phosphatase (phoA) kodierendes synthetisches Gen, dessen DNA-Sequenz in Fig. 10 gezeigt ist, mit T4-DNA-Ligase ligiert. Als Ergebnis wurde das Plasmid pSHV3 erhalten, in welchem die für das Signalpeptid des alkalischen Phosphatase-Gens (phoA) kodierende DNA-Sequenz stromaufwärts von der für HV3 kodierenden DNA- Sequenz angefügt wurde. Das Plasmid wurde in E. coli JM109 eingeschleust, das anschließend gezüchtet und auf Ampicillin-Resistenz abgesucht wurde.
(ii) Als nächstes wurde das Plasmid pSHV3 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII gespalten, um ein 275 Bp-Genfragment mit einer für das Signalpeptid des alkalischen Posphatasegens (phoA) kodierenden DNA-Sequenz, die stromaufwärts von der für HV3 kodierenden DNA-Sequenz eingefügt ist, zu erhalten.
(iii) Andererseits wurde das Plasmid pMT1 durch das in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt. Dieses Plasmid umfaßt eine DNA-Sequenz, die den Replikationsursprung (ori) des Plasmids pUC18 und den trp-Promotor enthält, wie in Referenzbeispiel 2 beschrieben. Das Vektorfragment wurde durch Spaltung des Plasmids pMT1 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII erhalten.
(iv) Das vorstehende 275 Bp-Fragment und das Vektorfragment wurden mit T4- DNA-Ligase ligiert, in E. coli JM109 eingeschleust, das gezüchtet und auf Ampicillin-Resistenz abgesucht wurde, um das Plasmid pMTSHV3 zu erhalten, den 2,87 kB HV3-Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz umfaßt, enthaltend den Replikationsursprung (ori) des Plasmids pUC, die DNA-Sequenz des trp- Promotors, eine für das Signalpeptid des alkalischen Phosphatasegens (phoA) kodierende DNA-Sequenz und die für HV3 kodierende DNA-Sequenz.

(2) Herstellung von Hirudin HV3 durch das Hirudin-HV3-Sekretionsplasmid mittels Sekretion

E. coli RR1 (E. coli RR1/pMTSHV3) (FERM BP-3267), transformiert mit dem Plasmid pMTSHV3, das durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt wurde, wurden in 2 L 2 · YT-Medium, enthaltend 100 ug/mL Ampicillin und 2% Glucose, gezüchtet. Die Züchtung wurde in 2 L Medium in einem 5 L-Glasgefäß bei 37ºC für 24 Stunden durchgeführt. Als Ergebnis wurden 6073 ATU Anti- Thrombin-Aktivität pro 1 mL Kulturmedium nachgewiesen.

(3) Reinigung von Hirudin HV3 aus Kulturmedien

Hirudin HV3 wurde aus dem Kulturmedium durch der in Beispiel 1-(5) beschriebenen Methode erhalten. Insbesondere wurde, nachdem das Kulturmedium zur Abtrennung des Überstands von den Zellen zentrifugiert worden war, der Überstand vierfach mit 10 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) verdünnt und filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde auf eine QAE-Toyopearl-Säule (4,4 · 13 cm) aufge tragen, wie in Beispiel (5) beschrieben, und anschließend über eine Sephacryl S- 100-HR-Säule gelfiltriert.
Die aktive Fraktion wurde auf eine DEAE-Toyopearl-Säule (4,4 · 40 cm), äquilibriert mit Äquilibrierungspuffer, aufgetragen und dann mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl in Äquilibrierungspuffer eluiert. Schließlich wurde das Hirudin HV3 durch C4-Reverse-Phase-HPLC unter Verwendung einer Vydac- C4-Säule (4,7 · 30 cm) gereinigt, eluiert mit einem linearen Acetonitril-Gradienten (1% pro Minute, 30 Minuten oder länger) von 15 bis 30% (v/v). Das Profil ist in Fig. 11 gezeigt.
Der Reinigungsgrad bei jedem Schritt ist in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7
Wenn die Aminosäurezusammensetzung und die N-terminale Aminosäuresequenz des gereinigten Produkts analysiert wurde, so zeigte die Aminosäurezusammensetzung einen mit dem theoretischen Wert von Hirudin HV3 entsprechenden Wert auf, wie in Tabelle 8 gezeigt. Wie in Tabelle 9 gezeigt, war die Sequenz bis zur 15. Aminosäure der N-terminalen Aminosäuresequenz identisch mit der des Hirudins HV3. Diese Ergebnisse beweisen die korrekte Abspaltung des Signalpeptids, und das Produkt wurde als Hirudin HV3 identifiziert. Tabelle 8 Tabelle 9

Industrielle Anwendbarkeit

Die vorliegende Erfindung stellt Sekretionsvektoren für neue Hirudin-Analoge bereit. Das Hirudin-Analoge ist als Anti-Koagulanz mit hoher Anti-Thrombin- Aktivität und einer Neigung, Blutung hervorzurufen, verwendbar.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls transformierte Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung von Fremdproteinen unter Verwendung der transformierten Mikroorganismen bereit. Unter Verwendung des in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahrens können Fremdproteine extrazellulär in hohen Ausbeuten hergestellt werden, was industriell für das Herstellen von Fremdproteinen vorteilhaft ist.

Hinterlegung von Mikroorganismen:

(1) E. coli JM109/pMTSHV1C3

(Eintrag E. coli JM109/pMTPHOHV1C3 wurde berichtigt.)

Hinterlegungsorganisation:

Fermentation Research Institute,
Agency of Industrial Science and Technology,
Ministry of International Trade and Industry

Adresse:

1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japan
Datum der Hinterlegung:
18. September 1990

Hinterlegungs-Nr.:

FERM BP-3104

(2) E. coli RR1/pMTSHV1C3

Hinterlegungsorganisation:

Adresse:

1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japan

Datum der Hinterlegung:

11. Oktober 1990

Hinterlegungs-Nr.:

FERM BP-3130

(3) E. coli JM109/pMTSHV1

Hinterlegungsorganisation:

Adresse:

1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japan
Datum der Hinterlegung:
6. Februar 1991

Hinterlegungs-Nr.:

FERM BP-3266

(4) E. coli RR1/pMTSHV3

Hinterlegungsorganisation:

Adresse:

1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japan

Datum der Hinterlegung:

6. Februar 1991

Hinterlegungs-Nr.:

FERM BP-3267

Claims

1. Sekretionsvektor zur Herstellung von Hirudin oder eines Hirudinanalogen, umfassend eine DNA-Sequenz, welche einen Replikationsursprung (ori) eines pUC-Plasmids, einen tac- oder trp-Promoter, eine ein Signalpeptidkodierende DNA-Sequenz und eine DNA-Sequenz, welche das Hirudin oder das Hirodinanaloge, direkt verknüpft stromabwärts von der das Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenz, kodiert, umfaßt, wobei alle in funktionsfähiger Weise verknüpft sind.

2. Sekretionsvektor nach Anspruch 1, wobei die das Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz von einer alkalischen Phosphatase abgeleitet ist.

3. Sekretionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Sequenz des Replikationsursprungs (ori) des pUC-Plasmids durch Verdau des Plasmids pUC 18 mit den Restriktionsenzymen PvuI und PvuII erhalten wird.

4. Sekretionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Hirudin HV1 ist.

5. Sekretionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Hirudin HV3 ist.

6. Sekretionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Hirudinana loge HV1C3 mit einer Aminosäuresequenz der nachstehenden Formel-1 ist:

(Formel-1)

7. Transformierter Mikroorganismus, wobei E. coli mit einem Sekretionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 transformiert worden ist.

8. Verfahren zur Herstellung von Hirudin HV 1, HV 3 oder des Hirudinanalogen HV1C3 der Formel-1, umfassend das Züchten des transformierten Mikroorganismus von Anspruch 7 und das Gewinnen des Produkts aus dem Kulturmedium.

9. Verfahren zur Herstellung von Hirudin oder eines Hirudinanalogen, umfassend das Züchten von E. coli, welches mit einem Sekretionsvektor zur Herstellung von Hirudin oder eines Hirudinanalogen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 transformiert ist, und das Gewinnen des Hirudins oder des Hirudinanalogen aus dem Kulturmedium.