PT1737889E

PT1737889E - Método para síntese de péptidos em fase sólida

Info

Publication number: PT1737889E
Application number: PT05796944T
Authority: PT
Inventors: Oleg Werbitzky; Stephane Varray; Anne-Sophie Droz; Jasmine Schnidrig; Nicole Studer; Corinne Wenger
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 2004-10-19
Filing date: 2005-10-19
Publication date: 2010-12-13
Also published as: ES2352204T3; DE602005023429D1; CN101094867A; IL182698A; ATE480561T1; EP1737889B1; EP1737889A1; US20080287648A1; DK1737889T3; IL182698A0; JP4903709B2; JP2008517018A; WO2006045503A1; CN102225966B; CN102225966A; US7939629B2; USRE46830E1; CN101094867B

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA SÍNTESE DE PÉPTIDOS EM FASE SÓLIDA" A presente invenção relaciona-se com um método melhorado de síntese de péptidos em fase sólida do péptido anticoagulante bivalirudina, um chamado "hirulog". Relaciona-se adicionalmente com os respectivos produtos conjugado péptido - sólida fase compreendendo o péptido ainda protegido ligado à resina.

Os inibidores de trombina são considerados como anti-trombóticos promissores: o processamento proteolítico por trombina é essencial no controlo da coagulação de sangue. A hirudina, um inibidor de trombina clínico potente da sanguessuga sugadora de sangue Hirudo medicinalis, consiste em 65 aminoácidos.

Os análogos de péptido mais pequenos do segmento de péptido 45 - 65 de hirudina, os chamados hirulogs, provaram ser efectivos no tratamento de trombose, um estado de risco de vida.

Okayama et al. (1996, Chem. Pharm. Buli. 44:1344-1350) e Steinmetzer et al. (1999, Eur. J. Biochem. 265: 598-605) planearam a síntese em fase sólida de diferentes hirulogs na resina de Wang, isto é utilizando a ligação éster do aminoácido Fmoc C-terminal a uma resina que é esterificada a um radical álcool p-benziloxibenzilo. A resina de Wang requer a quebra do péptido a partir da resina com ácido trifluoroacético concentrado, para o qual a quebra de resina eleva-se à concomitante desprotecção global de péptido. 2 A quebra acidolítica a partir da resina de Wang é aplicada sob condições fortemente acidicas e é conhecido incorrer inevitavelmente alquilação indesejável de resíduos de Trp como uma reacção lateral, apesar da utilização de reagentes sequestrantes durante a acidólise (Giraud et al., 1999, J. Peptide Science 5:457-461). Em particular o Trp C-terminal é propenso a tal reacção lateral (Atherton et al., 1988, Tetrahedron 44:843-857). A alquilação é provocada por iões carbénio aromáticos gerados a partir da unidade fenoxi de ligação à resina de Wang. Embora os hirulogs não contenham resíduos Trp, não compreendem um resíduo de Tyr na posição C-proximal. Nós descobrimos e relatamos aqui pela primeira vez que este resíduo Tyr é igualmente propenso a alquilação errática por quebra a partir da resina de Wang, afectando negativamente a pureza do produto.

Freund e Robinson revelam a utilização da resina 2-clorotritilo para elongação de cadeia após o protocolo Alloc quando se sintetiza o heptapéptido H-D-Leu-D-Try-L-Asn-Hpg-L-Tyr-Dhpg-OH (1999, Chem. Commun., 2509-2510). A revelação é silenciosa no que diz respeito à alquilação errática de qualquer um dos resíduos de aminoácido, e não existe qualquer alusão a que a utilização da resina 2-clorotritilo possua um efeito positivo na supressão desta reacção lateral. É um objectivo da presente invenção planear um método melhorado de sintetizar os respectivos péptidos hirulog que não possuam as desvantagens da técnica antecedente.

Este objectivo é resolvido pelos conjugados péptido-resina e respectivo método de síntese planeado pela presente invenção. 3

De acordo com a presente invenção, é planeado um método para destacar e desproteger um conjugado péptido - fase 3 sólida para originar finalmente um péptido, preferencialmente um péptido da fórmula -D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. 0 referido conjugado péptido - fase sólida compreendendo um 2-clorotritilo suporta a fórmula

em que A = Boc-D-Phe-Pro-Arg (R2) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (R3) -Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R5) -Glu (R6) -Ile-Pro-Glu- (R7)-Glu (R8)-Tyr (R9)-Leu-O- ou A = Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (R3) -Gly-Asp (R4) -Phe-Glu- (R5) -Glu (R6) -Ile-Pro-Olu (R7)-Glu (R8)-Tyr (R9)-Leu-O- ou A = NH2-D-Phe-Pro-Arg (R2) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn- (R3) -Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R5)-Glu (R6)-Ile-Pro-Glu (R7)-Glu (R8)-Tyr (R9)-Leu-O- e em que R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 são grupos protectores de cadeia lateral de aminoácido e em que RI é uma fase sólida insolúvel. A sequência de péptido acima é aquela de hirulog-8 (descrita em ep-489 070). É um derivado bivalente 20mero de hirudina (um 65mero), um inibidor de trombina potente que ocorre naturalmente. É formado a partir de motivos estruturais funcionalmente importantes ligados, a partir da hirudina: O sitio activo que liga o motivo D-Phe-Pro-Arg-Pro e a sequência carboxi-terminal Asn9 a Leu20 a partir de hirudina, formando uma ponte através de um espaçador de tetraglicina. Aqui "-D-Phe-" significa D-fenilalanina, como oposto ao enantiómero L que ocorre naturalmente. 4

Opcionalmente, num objectivo adicional da presente invenção, o radical A na fórmula I poderá ser qualquer um dos sequintes: 1. A é P-X1-Asp (R4) -Phe-Glu (R5) -Glu (R6) -Ile-Pro-Glu (R7) -

Glu (R8)-Tyr (R9)-X2, em que X1 é uma unidade peptidilo, opcionalmente compreendendo grupos protectores em cadeias laterais de aminoácido individual, de 0 até 200, preferencialmente de 1 a 100, principalmente preferencialmente de 2 até 50 aminoácidos, e em que X2 é um resíduo de aminoácido simples, opcionalmente com a cadeia lateral ou C-terminalmente protegido, ligado à fase sólida através de -O-, em que preferencialmente X2 não é Trp, Cys ou Arg, e em que P é H (i.e. origina -NH2) ou um grupo protector, preferencialmente o grupo protector é um grupo protector ortogonal ou é um removível sob condição fortemente acídica como definido adiante, mais preferencialmente o grupo protector é seleccionado a partir do grupo constituído por Boc, Fmoc, Dde, Nps, Alloc e Z. A ligação -O- poderá ser quer um éster ou um éter ligado ao suporte ou ligante através de uma cadeia lateral ou grupo Ca carboxi ou função hidroxi da cadeia lateral. 2. A é P-X^Asp (R4) -Phe-Glu (R5) -Glu (R6) -Ile-Pro-Glu (R7) -Glu (R8) -Tyr (R9) -Leu-0

As definições para P, X1, X2 aplicam-se consistentemente a todas estas possíveis concretizações para A e aos conjugados péptido - fase sólida resultantes. Nós descobrimos e relatamos aqui pela primeira vez que o referido resíduo Tyr é igualmente propenso a alquilação errática por quebra a partir da resina de Wang, afectando 5 negativamente a pureza do produto. No caso de hirulog, tal modificação parece ser promovida por um efeito de proximidade semelhante àquele observado para Trp por Atherton et al. No entanto, a alquilação de Tyr e.g. no caso de desprotecção de Arginina nunca foi relatada como um assunto geral, bastante em contraste com Trp (Atherton et al., 1989, Solid phase synthesis: A practical approach, IRL press, Oxford). Adicionalmente, as observações de Atherton pertenciam apenas a Trp C-terminal, enquanto o resíduo Tyr no péptido hirulog, sintetizado na direcção C para N-terminal, é apenas a justa-proximal, isto é o segundo resíduo próximo da terminação C da cadeia de péptido em crescimento. Em retrospectiva, sem querer estar ligado por uma teoria, isto poderá ser explicado pelas unidades fenoxi serem mais reactivas do que a média dos compostos arílicos na substituição electrofílica. De facto, os fenóis são utilizados como agentes sequestrantes na quebra acidolítica a partir da resina (D. S. King et al., 1990, Int. J. Peptid Protein Res., 36, 255). A referida reacção lateral não foi ainda descrita ou sugerida apenas se acreditou até agora que o Trp terminal seja vulnerável a este respeito. Consequentemente, a resina de Wang foi vastamente empregue na técnica antecedente, até recentemente, para síntese de hirulog. O conjugado péptido - fase sólida da presente invenção pode ser sintetizado por métodos de fase sólida de rotina bem conhecidos na técnica, e bem descritos e referenciados em Bodanszky et al., Principies of Peptide Synthesis, 2nd ed., Springer Verlag Berlin Heidelberg 1989. Necessariamente, devido à labilidade por ácido da ligação da fase sólida t, tal estratégia sintética emprega química de Fmoc para realizar as reacções de acoplamento durante a síntese de fase sólida. Apenas o último resíduo D-Phe de terminação 6 poderá ser quer protegido por Boc ou Fmoc. Tal protecção por Fmoc poderá ser eliminada ainda na resina, por tratamento comum com e.g. piperidina a 20 % ou outro reagente básico desprotector de Fmoc para originar o conjugado péptido - resina da presente invenção mas com um grupo amino N-terminal livre. No entanto, tal desprotecção de Fmoc prematura, expondo prematuramente uma terminação N, torna o referido residuo D-Phe N-terminal livre muito mais propenso a sofrer racemização quando sujeito a destacamento da resina por acidólise ou em particular desprotecção global juntamente com destacamento sob condição fortemente acidica. Portanto mais preferencialmente, o residuo D-Phe de terminação é protegido por Boc ou é protegido com outro grupo protector que possa ser facilmente removido em condição fortemente ácida, evitando assim a necessidade de um passo de desprotecção de Fmoc separado. Isto inclui e.g. o grupo protector Z (benziloxicarbonilo), que poderá ser quebrado, inter alia, por condições fortemente acidicas como definido no presente contexto, através de quebra hidrogenolitica ou promovida por HF é conhecido ser mais eficiente. Novamente, um passo separado de desprotecção de Fmoc na terminação do residuo D-Phe não é uma opção tão boa embora seja uma outra concretização viável da presente invenção. O referido destacamento num passo ou quebra juntamente com desprotecção global poderá ser levado a cabo numa mistura de solventes tais como TFA aquoso e DCM, por exemplo.

Em geral, de acordo com a presente invenção, é possível quer quebrar o péptido protegido de fórmula I a partir da resina concomitantemente com, ou, num passo inicial, precedendo a desprotecção ou desprotecção global de cadeias laterais de aminoácido e, preferencialmente, o grupo protector N-terminal. Na última concretização, é sequencialmente sujeito primeiro a condição fracamente 7 acídica para quebra a partir da resina e segundo a condição fortemente acidica para quebra de todos os grupos protectores restantes (desprotecção global).

De qualquer modo em ambas as condições, especialmente a resina de 2-clorotritilo (resina CTC para abreviar), e e.g. a resina intimamente semelhante 4-metoxi- ou 4-metiltritilo, comercialmente disponível ou, numa extensão igual ou inferior, as outras resinas reivindicadas pela presente invenção, são bem adequadas para evitar a modificação indesejada do residuo justa-proximal tirosina por quebra e/ou desprotecção. Previne a alquilação indesejável de uma tirosina justa-proximal, quando a tirosina é concomitantemente desprotegida por quebra a partir da resina. Em virtude do substituinte halogeno, opcionalmente a resina CTC permite efectuar a quebra da resina do péptido ainda protegido sob condições reaccionais acidoliticas muito moderadas, e.g. em ácido trifluoroacético (TFA) a 0,5 % em diclorometano (DCM). Esta é uma condição a que a maioria das cadeias laterais e grupos protectores N-terminais não serão normalmente afectados, e portanto a alquilação é prevenida por segregação dos diferentes eventos de desprotecção no tempo. No que se segue, as concretizações referidas com respeito à resina CTC em particular como a concretização mais preferida para a fase sólida, refere-se tacitamente às outras resinas descritas e reivindicadas na presente invenção.

Por definição, de acordo com a presente invenção, uma condição fortemente acídica, como sendo oposta a uma condição fracamente acídica, significa aplicar pelo menos 50 % (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) no solvente. Um grupo protector requerendo uma condição fortemente ácida para remoção é um grupo protector que pode ser removido, pelo menos, por TFA a 80 %. Os grupos protectores que requerem ainda ácidos mais fortes tais como HF do não estão incluídos na definição mencionada anteriormente no contexto da presente invenção.

Uma condição fracamente acidica é definida por possuir 0,01 % (v/v) até < 50 % de tfa, preferencialmente possuindo 0,1 % até 30 % de TFA. A unidade peptidilo da presente invenção revela notavelmente uma ausência inesperada da indesejável alquilação da tirosina justa-proximal. É inteiramente desprovida de reacção lateral com dicetopiperazina, outra reacção lateral possível que ocorre por quebra a partir da resina e é conhecida ser particularmente sensível à natureza dos dois últimos aminoácidos C-terminais. Sem pretender estar limitado por teoria, é especulado que uma tirosina na posição 2 da cadeia de péptido próxima da resina CTC está justamente à distância óptima para exibir algum efeito de aglomeração hidrofóbica, estabilizante das unidades fenilo aromáticas, evitando e.g. o arranjo cíclico que é o prelúdio da formação de dicetopiperazina. O carregamento da resina CTC ocorre comummente por substituição nucleofílica do difenil-(2-clorofenil)-clorometano (cloreto de clorotritilo) e é conhecido ser efectivo. Como uma opção, as resinas Fmoc-aminoácido-CTC pré-carregadas estão disponíveis comercialmente.

Os grupos protectores e a sua química são adicionalmente bem conhecidos e bem referenciados na técnica (ver Bodanszky, supra). Os diferentes grupos protectores R2 a R9 são adequados para protecção de cadeias laterais de aminoácido individual. As diferentes unidades químicas requerem diferentes grupos protectores, Exemplos são 9 histidina sendo convencionalmente sujeitos a protecção com tritilo ou Boc, lisina sendo sujeita a protecção com Boc ou aliloxicarbonilo e aspartato sendo sujeito a protecção como éster terc-butilico ou éster alilico. A treonina, a serina e a tirosina são usualmente protegidas como éter terc-butilico. A protecção de arginina irá ser discutida adiante. Poderão ser aplicados diferentes modos de desprotecção, e.g. os grupos protectores alilicos são laboriosamente removidos por reacção de transferência de acilo redutiva catalisada por Pd. Os grupos z (benziloxicarbonilo) são menos expeditamente empregues uma vez que requerem hidrogenólise para uma remoção eficiente. Preferencialmente, os grupos protectores R2 a R9 são lábeis a ácido, "lábil" significando uma taxa de quebra de pelo menos 20 % do referido grupo protector respectivo quando incubado em solução de DCM durante até 5 horas sob quer condições fracamente ou fortemente acidicas. Mais preferencialmente de acordo com a presente invenção, os grupos protectores R2 a R9 são removidos e são apenas removíveis sob condição fortemente acídica como definido acima, Rl é uma fase sólida insolúvel, normalmente polimérica, e. g. um poliestireno reticulado / 1% de co-polímero divinilbenzeno. Tipicamente, mas não estritamente requerido para trabalhar na presente invenção, tal fase sólida Rl irá certamente exibir adicionalmente, unidades 2-clorotritilo múltiplas funcionalizadas com péptido radical A para além daquela explicitamente apresentada na fórmula I. Mais importantemente, para ser útil em síntese de sólida-fase como planeado primeiro por Merrifield, a fase sólida polimérica possuirá um tamanho de partícula mínimo de modo a originar uma verdadeira suspensão de partículas facilmente filtráveis ou compressíveis de tamanho 10 suficiente, em vez de comportamento coloidal. Para além do polímero à base de poliestireno que directamente derivatizado com uma CTC ligante ou um ligante 4-carboxitritilo de Bayer (Bayer et al., 13th American Peptide Symposium, Hodges et al., Ed. ESCOM, Leiden, 1994, page 156) ou em que as unidades de benzeno individuais do polímero base foram derivatizadas para formar parte da função 2-clorotritilo, adicionalmente outros polímeros de base tais como resinas PEG puras ou misturadas ou opcionalmente resinas híbridas ou enxertadas (e.g. Tentagel®), em que e.g. um ligante 2-CTC (tal como o ligante de Bayer) foi enxertado num polímero base de poliestireno através de uma unidade de espaçamento de PEG em vez de fazer reagir directamente o ligante com o polímero de base de poliestireno. A inclusão de PEG numa resina providencia uma resina mais amplifílica e consequentemente melhor manuseamento e.g. em misturas DCM / tfa para destacamento e desprotecção de um só passo, embora a capacidade de carga possa então tornar-se uma questão a considerar. Deverá ser notado, claro, que existem resinas PEG que são estritamente insolúveis. No entanto, Bayer et al. (Nature 1972, vol. 237, page 512f), descreveram uma técnica de gerar o polímero PEG mimando o princípio de separação em fase sólida enquanto se trabalha estritamente em solução, o conjugado péptido-resina sendo ainda solúvel e providenciando um sistema de uma fase homogéneo. No seu significado preferido tal comportamento de resina é incluído pela presente definição de "insolúvel", ema vez que permite essencialmente a separação rápida e simples, baseada no tamanho por técnicas de micro- ou ultrafiltração ao nível microscópico. Num significado mais preferido, "insolúvel", num determinado sistema de solventes para síntese de péptido, refere-se a um sistema de duas fases, uma fase sendo uma fase suspensa, verdadeiramente sólida. 11

Preferencialmente, a fase sólida tem menos de 700 mesh (mesh como definido pelo US Bureau of Standards, recuperável e.g. em Rõmpps Chemie-Lexikon, 7. Auflage, 1973, Franck'sche Verlagshandlung, W. Keller & Co. Stuttgart/Germany).

Preferencialmente, a fase sólida funcionalizada com 2-clorotritilo da presente invenção possui desde 50 até 600 mesh, mais preferencialmente desde 60 até 400 mesh, principalmente preferencialmente desde 100 até 300 mesh. A tirosina da presente invenção poderá ser protegida por grupos protectores diferentes, e.g. éter terc-butilico ou Z- ou mais preferencialmente ésteres 2-bromo-Z. É igualmente possivel utilizar grupos protectores tritilo tais como grupos 2-clorotritilo, 4-metoxi- ou 4,4'-dimetoxitritilo. Preferencialmente, R9 é um grupo protector tritilo ou um terc-butilo. Mais preferencialmente, R9 é um grupo protector terc-butilo (fcBu), significando gue a cadeia lateral tirosilo é modificada para um éter terc-butilico. O grupo fcBu é apenas eficientemente removido sob condição fortemente acidica.

Preferencialmente, sozinha e em particular em combinação com as concretizações adicionais preferidas, o grupo R2 protector de arginina é seleccionado a partir do grupo constituído por pentametildihidrobenzofurano (Pbf), adamantiloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc), 4-metoxi-2,3, 6-trimetilbenzenossulfonilo (Mtr) e seu homólogo 4-terc-butil-2,3,5,β-tetrametilo (Tart) e Boc, que são apenas quebrados sob condições fortemente acidicas como definido acima. Mais preferencialmente, R2 é Pbf, Pmc, Mtr, principalmente preferencialmente, é Pbf. Por desprotecção 12 global das cadeias laterais sob condições fortemente acidicas a alquilação usualmente em meio aquoso de tirosina desprotegida não é observada com Pmc, Mtr e Pbf. A taxa de quebra de Pbf é a maior de sempre.

Os grupos protectores de carboxi para Glu, Asp são bem conhecidos, e.g. Mpe, 0-1-adamantilo, O-benzilo e poderão mesmo ser utilizados simplesmente ésteres alquilicos, embora utilizados menos comummente. Tipicamente e preferencialmente são usados grupos terc-butilo, independentemente, como grupos protectores R4, R5, R6, R7, R8. 0 grupo protector R3 poderá ser de suprema importância porque ocorre na sequência Gly-Asn acima em hirulog-8, cuja sequência de dipéptido é particularmente propensa à formação de aspartimida como uma reacção lateral. A formação de aspartimida poderá ocorrer no péptido protegido durante cada ciclo de acoplamento subsequente durante a síntese linear numa extensão menor (0,1 - 0,5 %), possuindo efeito cumulativo no final. Embora seja preferida novamente a protecção com um grupo protector tritilo ou os seus derivados 2-cloro, 4-metilo ou 4-metoxi, poderá igualmente ser utilizado o grupo protector adamantilo. Principalmente preferencialmente é empregue um grupo protector tritilo.

Deverá também ser notado que em vez de acoplamento de ambos os aminoácidos de cadeia lateral e protegidos por Na, poderão ser utilizados módulos de dipéptido protegidos por Να-alquilo para acoplamento durante a sintese linear. Tais dipéptidos possuem um efeito disruptor da estrutura secundária, facilitando o rendimento e a pureza de sintese. e.g. Fmoc-Gly-(N-Hmb)Gly-OH e Fmoc-Gly-(N-Dmb)Gly-OH estão disponíveis comercialmente a partir de EMD Biosciences (Novabiochem). Entender-se-á que tais grupos N-alquilo não 13 são considerados grupos protectores no sentido da presente invenção. A sua utilização ou presença é opcional e não excluída pela estrutura de fórmula I.

Num método preferido de destacamento e desprotecção do conjugado de péptido de fórmula I, é aplicado o esquema de dois passos de primeiro conduzir uma acidólise sob condições fracamente acídicas para quebrar o péptido protegido da resina CTC e secundariamente remover os grupos protectores restantes sob condições fortemente acídicas. A razão é que uma desprotecção global de um só passo do conjugado péptido - fase sólida de fórmula I sofre de requisitos de solvente opostos ao do produto completamente desprotegido e do material-de-partida hidrofóbico. A necessidade de um compromisso afecta negativamente ambos a pureza e o rendimento do produto. A abordagem sequencial, passo a passo, elimina tais desvantagens intrínsecas, permite um melhor controlo das diferentes reacções e consequentemente permite um rendimento óptimo. De acordo com a presente invenção, goza adicionalmente do efeito surpreendente completamente supressor de formação de dicetopiperazina como uma reacção lateral.

Concordantemente, é planeado um método de destacamento e desprotecção de um conjugado péptido - fase sólida de fórmula I como definido acima para originar um péptido de fórmula H-D-Phe-Pro-Arg-Pro—Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH, caracterizado por, num primeiro passo, o péptido protegido ser quebrado a partir do suporte 2-clorotritilo sob condição fracamente acídica, preferencialmente com TFA 0,1 até 10% num solvente polar, aprótico, e que, num segundo passo, os grupos protectores são removidos sob condição fortemente acídica como definido acima. 14

Preferencialmente, o primeiro passo é conduzido num solvente polar, aprótico que é o diclorometano. Este é o melhor solvente para levar a cabo tal reacção, em contraste com outros solventes tais como NMP (N-metilpirrolidona). É possível, mas não mandatório, incluir um reagente sequestrante adicional no solvente, especialmente no sistema de solvente para o segundo passo de desprotecção, que está presente numa quantidade de 0,1 até 10 % (p/p) relativamente ao meio reaccional para prevenir a alquilação indesejada do núcleo aromático da tirosina. Tal sequestrante intercepta iões intermediários alquil-carbénio reactivos que são gerados por remoção dos grupos protectores (que poderão já existir numa extensão pequena durante a reacção de quebra no primeiro passo).

Um sequestrante é e.g. tioanisole que também possui um segundo efeito promotor de acidólise. Tal papel secundário e os substitutos para o tioanisole são discutidos em Bodanszky M. et al. (Int. J. Peptide Protein Res. 23:287). Outros exemplos de sequestrantes não possuindo o tal efeito de acidólise são fenol e/ou trialquilsilanos (Stierandova et al., Int. J. Peptide Protein Res. 43, 1994, 31-38).

Preferencialmente, após o primeiro passo de quebra ou destacamento a partir da resina, a reacção é directamente extinta por mistura com piridina e subsequentemente recuperação do produto do passo 1 por mistura com água. Deste modo, o produto é recuperado o mais simplesmente e eficientemente.

Numa concretização adicional da presente invenção, é reivindicado essencialmente o conjugado péptido - fase sólida de fórmula I, com a única diferença que a -Arg(R2)-Pro-, que é o sítio de quebra da trombina, não é uma 15 ligação péptido comum mas uma ligação pseudo-clndivel quimicamente modificada, ou ligação "psi". A substituição de uma ligação amida é indicada pelos átomos designados num parêntesis extra precedidos pelo acrónimo "psi" (ver, Rudinger et al., Drug Design, Vol. II, Ed. Ariens, E., Academic Press, New York, p. 319, 1971). Mais preferencialmente, tal substituição psi é -Arg [psiCH2NH] Pro- (Kline, T. et al., 1991, Hirulog peptides with scissile bond replacements resistant to trombin cleavage, Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 1049 1055). Mais facilmente, tal ligação psi é e.g. introduzida durante a síntese de fase sólida por acoplamento normal do péptido conjugado em crescimento, com o psi-dipéptido protegido por Fmoc. É um objectivo adicional da presente invenção, estender as concretizações e os métodos descritos acima aos conjugados péptido - fase sólida compreendendo uma unidade resina para além da referida resina CTC acima que, ainda assim, semelhantemente permite a clivagem da unidade de péptido a partir da resina sob condições fracamente ou moderadamente acídicas como definido acima. As resinas 2-CTC e as relacionadas tritilo, 4-metoxi- e 4-metiltritilo como definido adiante são ainda assim consideradas a melhor concretização da presente invenção, de acordo com o referido acima.

Como um objectivo adicional, é planeado um conjugado péptido - resina da fórmula A-W, em que A poderá ser qualquer uma das concretizações acima definidas para A, opcionalmente compreendendo grupos protectores de cadeia lateral de aminoácido individual, e em que R2 até R9 quando presentes são como definido acima, e em que W é um compósito de fase sólida, preferencialmente insolúvel, que 16 permite a clivagem da unidade peptidica sob condições fracamente acídicas, e que compreende uma resina ligante de fórmula

referido ligante, e em que R"' é a fase sólida, e em que R1", R2", são, independentemente, hidrogénio, 4-(Ci-C4 alquilo) ou 4-(Ci-C4 alcoxi), e poderão ser o mesmo ou diferentes com a condição de que apenas um de R1", R2" possa ser hidrogénio, e em que R2" poderá opcionalmente ser 2-C1 com a condição de que então R1" seja H, e em que principalmente preferencialmente, o ligante de fórmula II seja seleccionado a partir do grupo constituído por 2-clorotritilo, 4-metoxitritilo, 4,4'-dimetoxitritilo e 4-metiltritilo. A resina ou a entidade compósito de suporte da resina poderá em princípio ser qualquer resina empregue para síntese, tal como por exemplo uma resina de poliestireno-divinilbenzeno juntamente com unidades ligantes integrais ou tais como por exemplo unidades às quais e.g. ligantes mais lábeis a ácido possam ser enxertados adicionalmente, ou alternativamente os últimos ligantes poderão estar integralmente ou directamente ligados à resina. Em princípio, a resina de fase sólida para utilizar em síntese compreende necessariamente pelo menos um ligante integral ou suporte que seja parte do material do cerne da fase sólida; tal ligante ou suporte poderá ser considerado como um grupo protector imobilizado (Guillier et al., Chem. Rev. 17 100, 2091-2157, 2000). Exemplos são e.g. resinas de poliestireno enxertadas com peg tais como Novasyn TG à base de tentagel (Novabiochem, Merck Biosciences, Germany) que estão disponíveis com diferentes suportes enxertados tais como 2-clorotritilo, ou resinas que são constituídas por suportes funcionais de enxerto num material de matriz tais como sílica géis. Preferencialmente, uma tal resina é uma resina 4-metoxi- ou 4,4'-dimetoxitritilo. As resinas como utilizado na presente invenção possuem um tamanho mesh padrão, que é cerca de 50 - 500 mesh, mais preferencialmente de 100 até 400 mesh.

Experiências 1. Síntese de Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp (fcBu)-Phe-Glu (fcBu)-Glu(fcBu)-Ile-Pro-Glu (fcBu)-Glu (fcBu)-Tyr (fcBu)-Leu-O-2-CTC (hirulog-8, protegido descrito na EP-489 070, conjugado terminalmente com carboxi em ligação éster à resina 2-CTC)

Todos os reagentes tiveram origem na EMD Biosciences (Madison, WI/U.S.A.; marca Novabiochem) . A resina 2-Cl-Trt (CTC) à base de poliestireno (Cbl Patras, Greece), pré-carregada com Fmoc-Leu-OH, possuía de 100 - 200 mesh com respeito ao polímero de base e de 60 - 200 mesh com respeito ao produto resina CTC final, pré-carregado. A densidade de carregamento foi de cerca de 0,60 mmol/g. Os aminoácidos individuais tiverem origem quer como ácidos Fmoc-amino ou, no caso de D-Phe, como Boc-D-Phe prontamente protegido por Boc. Os acoplamentos foram levados a cabo com TCTU em diclorometano/N-metilpirrolidona (NMP), na presença de Base de Hiinig {N, N-diisopropiletilamina, DIEA) . Usualmente, foram utilizados 1,5 eq. de aminoácido protegido com Fmoc ou Boc, excepto para o acoplamento de Fmoc-Arg(Pbf), em que 18 foram utilizados 2,5 eq.. Semelhantemente, o tempo de reacção de acoplamento padrão de 60 min. (a 30 °C) foi estendido até 90 min. no caso de Fmo-cArg(Pbf). O controlo da eficiência do acoplamento no processo foi efectuado através do teste de Kaiser ou do teste de cloranilo. A desprotecção de Fmoc foi levada a cabo com 3-4 ciclos de 20% de piperidina em NMP a 30°C, com enxaguagem adequada com NMP pelo meio.

2. Síntese de Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (fcBu) -Phe-Glu (tBu) -Glu (fcBu) -HePro-Glu ^Bu) -Glu (fcBu)-Tyr(fcBu)-Leu-OH A quebra a partir de 48,3 g de resina (cerca de 100 ml de resina inchada) como gerada na experiência 1 foi conseguida com 3 ciclos de 15 min. cada a 15 °C, 2 % (p/p) de TFA, 1 % (p/p) de trietilsilano (TES) em diclorometano. A reacção foi agitada pelo borbulhar de azoto. A cor da reacção mudou de ciclo para ciclo desde amarelo/laranja até acastanhado. Após cada ciclo, a reacção de quebra foi extinta directamente através da colocação de todo o meio reaccional em piridina diluída (piridina/etanol 1:9 (v/v)). A resina foi em seguida removida por filtração através de um cadinho filtrante e sujeita ao próximo ciclo. Todos os filtrados foram recolhidos, concentrados até um semi-líquido laranja sob vácuo (RotaVap), lavados com DCM, re-suspensos em 400 ml de água duplamente desionizada, agitados à temperatura ambiente, filtrados, lavados com água e secos. O rendimento foi de 28,8 g de um pó ligeiramente amarelo de qualidade analítica (~90 % puro). O produto foi analisado por HPLC e LC-MS. 19

3. Desprotecção global, síntese de H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH A desprotecção global foi levada a cabo em DCM diluído com um cocktail (mistura) de quebra ("CC"), DCM: "CC" é 1:10 (v/v). O "CC" foi formado a partir de TFA/tioanisole/fenol/água/TES na razão de mistura de (% p/p) 89:2.5:2.5:5.0:1.0. 1 g de produto seco proveniente da experiência 2 foi dissolvido em 10 ml de DCM diluído como referido acima com "CC" e agitado durante 5 horas à temperatura ambiente. O produto foi em seguida recuperado por adição de 50 ml de éter metil-terc-butílico (MTBE, Fluka Chemie, Buchs/Switzerland), arrefecimento da reacção até 0 °C num banho de água durante 30 min. sob agitação e remoção por filtração do sal precipitado que foi formado entretanto. O bolo de filtração foi enxaguado com MTBE várias vezes, o qual é em seguida seco à temperatura ambiente, originando 0,8 g de um produto bruto de cerca de 55% de pureza como determinado por HPLC. O rendimento total conjunto dos passos 2 e 3, foi de cerca de 55 %. 4. Experiências comparativas de quebra e análise de LC-MS para a síntese de hirulog-8 ou do seu fragmento tetrapéptido C-terminal quer na resina de Wang ou na resina CTC.

Utilizando a análise de HPLC LC-MS, poderia ser demonstrado que por quebra a partir da resina e desprotecção global em condições fortemente acídicas, 1-10% do produto péptido foi alquilado no caso da resina de Wang, enquanto não pode ser observada tal modificação através da quebra a partir da resina CTC. A análise de espectrometria de massa MS 20 20 permitiu tirosilo.

Lisboa, 3 mapear essa modificação para o residuo de O procedimento sintético é como descrito acima. de Dezembro de 2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Conjugado péptido - resina A-W, em que A é P-X1-Asp (R4) -Phe-Glu (R5) -Glu (R6) -Ile-Pro-Glu (R7) -Glu (R8) -Tyr(R9)-X2- em que P é hidrogénio ou um grupo protector seleccionado a partir do grupo constituído por Boc, Fmoc, Dde, Nps, Alloc e X1 é uma unidade peptidilo de 0 até 200 aminoácidos, opcionalmente compreendendo grupos protectores em cadeias laterais de aminoácido individual; R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são grupos protectores de cadeia lateral de aminoácido; X2 é um resíduo de aminoácido único estando ligado ao compósito da fase sólida de fórmula (II) através de -0-e opcionalmente sendo protegido na cadeia lateral; e W é um compósito de fase sólida de fórmula

em que R1" é hidrogénio, 4^(C4-C4 alquilo) ou 4-(C4-C4 alcoxi), R2" é cloro, hidrogénio, 4^(Ci-C4 alquilo) ou 4- (Cj-C4 alcoxi), R1" e R2" sendo o mesmo ou diferentes, com a condição de que apenas um de R1", R2" possa ser hidrogénio, e com a condição de que R1" seja hidrogénio, se R2" for 2-cloro; e R"' é uma fase sólida. 2

2. Conjugado péptido - resina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R1" ser hidrogénio e R2" ser 2-cloro, 4-metoxi ou 4-metil.

3. Conjugado péptido - resina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ambos R1" e R2" serem 4-metoxi.

4. Conjugado péptido - resina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fase sólida R"' ser uma resina polimérica.

5. Conjugado péptido - resina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X2 ser Leu.

6. Conjugado péptido - resina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X2 não ser Tip, Cys ou Arg.

7. Conjugado péptido - resina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X1 compreender de 0 a 50 resíduos de aminoácido.

8. Conjugado péptido - resina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R1 ser terc-butilo. 1 Conjugado péptido - resina de acordo com uma das reivindicações precedentes, em que A é seleccionado a partir de Boc-D-Phe-Pro-Arg (R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (R3)-Gly-Asp (R4)-Phe-Glu (R5)-G1u (R6)-Ile-Pro-Glu (R7)-G1u (R8)-Tyr (R1)-Leu-O-, Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (R2)- Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (R3)-Gly-Asp (R4)-Phe-Glu (R5)-Glu (R6) -Ile-Pro-Glu (R7)-G1u (R8)-Tyr (R1)-Leu-O- e H- D- Phe- Pro-Arg (R2)-Pro- Gly- Gly- Gly- Gly-Asn (R3)-Gly-Asp (R4) -Phe- Glu (R5)-G1u (R6)-Ile- Pro- Glu (R7)-Glu (R8)-Tyr (R1)-Leu-O-, 3 e em que R2 e R3 são grupos protectores de cadeia lateral de aminoácido e a fase sólida é insolúvel.

10. Conjugado péptido - resina de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a fase sólida ser polimérica e possuir um tamanho mesh de 100 até 400 mesh (US Bureau of Standards).

11. Conjugado péptido - resina de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por R2 é pentametildihidrobenzofurano, adamantiloxicarbonilo ou isoborniloxicarbonilo; R9 é terc-butilo; e R3 até R8 são grupos protectores lábeis a ácido.

12. Conjugado péptido - resina de acordo com as reivindicações 9 ou 11, caracterizado por R2 ser Pbf e R4 até R9 serem grupos protectores lábeis a ácido que requerem pelo menos 50 % de ácido trifluoroacético para remoção.

13. Conjugado péptido - resina de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por R3 ser tritilo; e R4, R5, R6, R7 e R8 serem terc-butilo.

14. Conjugado péptido - resina de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por R9 ser terc-butilo.

15. Conjugado péptido - resina de acordo com uma das reivindicações 9 ou 11 até 14, caracterizado por a unidade -Arg(R2)-Pro- ser -Arg[psiCH2NH] Pro-. Lisboa, 3 de Dezembro de 2010