CN101094867A - 用于固相肽合成的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种合成二价水蛭肽的新方法。

Description

用于固相肽合成的方法
本发明涉及和改进了抗凝血肽比伐卢定(bivalirudin)，即所谓的“二价水蛭素(hirulog)”的固相肽合成方法。本发明还涉及相应的肽-固相接合产物，该产物含有结合于树脂的仍受保护的肽。
凝血酶抑制剂被认为是很有前途的抗血栓药：通过凝血酶进行的蛋白水解过程是血液凝结控制的关键所在。水蛭素是一种获自吸血水蛭——医用水蛭Hirudo medicinalis的有效治疗性凝血酶肽抑制剂，其包含65个氨基酸。
业已证明了水蛭素第45-65位氨基酸的肽片段短肽类似物(即所谓的二价水蛭素)在治疗血栓症(一种危及生命的病症)中的有效性。
Okayama等(1996，Chem.Pharm.Bull.44：1344-1350)和Steinmetzer等(1999，Eur.J.Biochem.265：598-605)发明了在Wang树脂上固相合成不同二价水蛭素的方法，即将Fmoc氨基酸的C末端通过形成酯结合到被酯化为对-苄氧-苄醇基团的树脂上。使用Wang树脂需要用浓三氟乙酸将肽从树脂上切割下，其中树脂切割等于相伴进行的肽的完全脱保护(global deprotection)。
从Wang树脂上通过酸解切割(Acidolytic cleavage)是在强酸性条件下进行了，且已知如果在酸水解过程中不使用清除剂，则该方法会不可避免地引起作为副反应的Trp残基不良烷基化(Giraud等，1999，J.Peptide Science 5：457-461)。C末端Trp尤其容易发生该副反应(Atherton等，1988，Tetrahedron 44：843-857)。烷基化是由Wang树脂接头苯氧基部分产生的芳香性碳鎓离子所造成的。-当二价水蛭素不含Trp残基时，它们在邻近C末端的位置含有Tyr残基。我们发现并在此首次报告在从Wang树脂切割下时，该Tyr残基同样倾向于对烷基化不稳定，并对产物纯度产生不良的影响。
本发明的目的是消除现有技术中的缺点，提供不同的或改进的二价水蛭肽(Hirulog peptide)合成方法。
通过肽-树脂偶联物和本发明的相应合成方法来实现该目的。
在本发明中提供了一种用于对肽-固相偶联物进行分离和脱保护，最终获得肽的方法，所述肽优选具有式D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Tyr-Leu。所述肽-固相偶联物包括式I中的2-氯-三苯甲基手臂(handle)：
其中：A＝Boc-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-，或A＝Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-，或A＝NH2-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-，且其中R2、R3、R4、R5、R7、R8、R9是氨基侧链保护基团，R1是不溶性固相。
上述肽序列是二价水蛭素-8(Hirulog-8)的肽序列(描述于EP-489 070)。它是水蛭素(65聚体，天然存在的强效凝血酶抑制剂)的20聚体二价衍生物。它是由水蛭素上功能上重要的、相连的结构基序组成的：水蛭素上的活性位点结合基序D-Phe-Pro-Arg-Pro和羧基末端序列Asn9到Leu20，通过四甘氨酸间隔物桥接。在此，‘-D-Phe-’是指D-苯丙氨酸，不同于给定氨基酸(在此为Phe)的天然L-对映体。
任选地，在本发明的另一目的中，式I中的基团A可为以下基团中的任意基团：
1.A＝P-X1-Tyr(R9)-X2-，其中X1是肽基部分，任选地包括位于各单独氨基酸侧链上的保护基，其具有0-200个，优选1-100个，最优选2-50个氨基酸，其中X2是与固相通过-O-或-NH-连接的任选地在侧链或末端被保护的单个氨基酸残基，X2最好不是Trp、Cys或Arg，且其中P是H(即得到NH2)或保护基，该保护基优选正交保护基(orthogonal protection group)或如下所定义的在强酸性条件下可去除的保护基，更优选该保护基选自：Boc、Fmoc、Dde、Nps、Alloc、Z。
应理解的是，根据上文所述，当其X2残基的侧链中包含氨基官能团(例如赖氨酸、高赖氨酸或诸如3-赖氨酸的结构性异构体)时，X2残基可以与树脂仅通过氨基醚官能团结合。反之，-O-连接可以是通过侧链或Cα羧基或侧链羟基官能团与手臂或接头相连的酯键或醚键。
2.A＝P-X1-Tyr(R9)-Leu-O或P-X1-Tyr(R9)-X2
3.A＝P-X1-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O或P-X1-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-X2
4.A＝P-X1-[Gly]0-3-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O或P-X1--[Gly]0-3-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-X2
5.A＝P-X1-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-或P-X1-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-X2
P、X1、X2的定义通用于各种A和所得的肽-固相偶联物的可能实施方式中。
我们发现并在此首次报道：从Wang树脂上切下时，所述Tyr残基也同样倾向于发生不规则的烷基化，这会对产品的纯度产生不良影响。对于二价水蛭素而言，这种修饰似乎受到邻位效应的促进，这与Atherton等对Trp的研究结果类似；然而，Tyr的烷基化(例如在精氨酸脱保护中)从未作为普遍现象被报道过，这与Trp的情形明显不同(Atherton等，1989，Solid phase synthesis：A practicalapproach，《固相合成：实践进展》IRLpress，Oxford)。此外，Atherton的研究是仅限于C末端Trp，而以C末端到N末端的方向合成的二价水蛭肽中的Tyr残基，仅是邻末端的(juxtaproximal)，即生长中肽链C末端的倒数第二个残基。事后发现，不限于任何理论，这可能是因为苯氧基部分在亲电子取代中比一般芳基化合物反应性更强。事实上，酚类是从树脂上进行酸解剪切时的清除剂(scavenging agent)(D.S.King等，1990，Int.J.Peptid Protein Res.，36，255)。至此，技术人员仍不曾描述过或提及所述副反应(side-reaction)，至今仍相信仅末端Trp容易被无规烷基化。因此，直至今日，Wang树脂仍被广泛用于二价水蛭素的合成。
可通过本领域熟知的常规固相方法合成本发明的肽-固相偶联物，Bodanszky等的Principles of Peptide Synthesis，(《肽合成原理》第二版，SpringerVerlag Berlin Heidelberg 1989)对此类方法有详细描述，可作为参考。由于固相连接的酸不稳定性，这样的合成策略中必须利用Fmoc化学方法进行固相合成期间的偶联反应。只有最后的封端D-Phe残基可以是Boc-或Fmoc保护的。可在肽仍连于树脂上时消除该Fmoc保护，可采用例如20％哌啶或其它Fmoc脱保护碱试剂的标准处理进行，并由此获得了本发明的肽-树脂偶联物(conjugate)，但其带有游离的N-末端氨基。然而，这样的早期Fmoc脱保护，早早地暴露出N-末端，会在通过酸解从树脂上分离，尤其是在强酸性条件下分离的同时进行全面脱保护时，使得或可能使得所述游离N-末端D-Phe残基更容易发生外消旋。因此，更为优选的是，对封端D-Phe残基进行Boc-保护，或用在强酸条件下易于去除的其它保护基保护，从而无需单独的Fmoc脱保护步骤。为了清楚起见，这包括例如Z-(苯甲氧基-羰基-)保护基，该保护基可在本发明所述的(特别是)强酸性条件被切除，尽管已知氢解或HF促进的切割更为有效。再次指出，封端D-Phe上的单独的Fmoc脱保护步骤早早地暴露出的N-末端(以游离α-氨基封端，在式I中表示为H-D-Phe-或NH2-D-Phe，两者同义)，会在通过酸解从树脂上分离同时进行全面脱保护时使得脱保护后的游离N-末端D-Phe容易发生外消旋化，虽然这不是一种优选，但仍是本发明可行的实施方式之一。所述的一步分离或剪切的同时全面脱保护可在溶剂混合物(例如TFA和DCM水性混合物)中进行。
总体而言，根据本发明，既可以在氨基酸侧链(优选的N-末端的保护基)脱保护或完全脱保护的同时也可以在此前的起始步骤中将式I中的受保护的肽从树脂上切下。在后一种实施方式中，依次是先在弱酸条件下从树脂上进行切割，然后是在强酸条件下切除所有残留的保护基(全面脱保护)。
无论是在两种条件中的任何一种之下，尤其是2-氯-三苯甲基-树脂(简称CTC树脂)以及例如市售的十分相似的4-甲氧基-或4-甲基-三苯甲基-树脂，或者，在本发明包括的它树脂也一样或在相当程度上十分适用于在剪切和/或脱保护时避免近端酪氨酸被不当修饰。当近端酪氨酸(即位于C末端的倒数第二个酪氨酸)在肽从树脂上切下时的同时脱保护时，这防止了该酪氨酸不为所需的烷基化。由于卤代，CTC树脂可以使得受保护的肽和酪氨酸在非常温和的酸解反应条件(例如在0.5％三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DMC)溶液中)下从树脂上被有效地切下，在该条件下大部分侧链和N-末端保护基通常不会受到影响，由此通过及时分离不同的脱保护事件而防止了烷基化。下文中，以CTC树脂(作为固相或树脂的最优选实施方式)进行的具体实施例默认(tacidly)也可用本发明说明书和权利要求中所描述的其它树脂进行。
根据本发明中的定义，相对于弱酸性条件的强酸性条件是指采用浓度至少50％(v/v)的三氟乙酸(TFA)溶液。并且，反过来，需要用强酸条件来去除的保护基是至少可以80％TFA去除的保护基。因此，在本发明全文中上述的定义不包括需要更强酸(例如HF)的保护基。将弱酸性条件定义为具有0.01％(v/v)到＜50％的TFA，优选0.1％到30％的TFA。
在任一种模式中，值得注意的是，本发明的肽基部分表现为出乎意料地没有不期望的近端酪氨酸的烷基化，且完全没有二酮哌嗪副反应(在肽从树脂上切下时可能会发生的另一副反应，且已知其对于C末端最后两个氨基酸的性质尤为敏感)。不希望受限于理论，据推测，肽链上近CTC树脂手臂第2位上的酪氨酸恰处于最佳距离和间隔，从而显现出一定程度的芳性苯基部分的稳定化作用和疏水性堆积作用，避免了例如环化现象，这一环化现象正是二酮哌嗪形成的前奏。
CTC树脂的加载(load)通常是通过联苯-2’-氯苯基-氯甲烷衍生物(因此将其称为CTC，即氯化氯-三苯甲基的简称)的亲核取代进行的，已知其是有效的。作为一种选择，也有市售的经预载的Fmoc-氨基-酸-CTC树脂。
保护基和它们的化学性质是本领域熟知的，且有广泛的记载(参见Bodanszky，同上)。毋庸置疑，不同的保护基R2-R9分别适于保护独特的各氨基酸侧链，因为不同的化学部分需要使用不同保护基。例如，通常可用三苯甲基或Boc来保护组氨酸，用Boc或烯丙氧羰基来保护赖氨酸，用叔丁醚或烯丙酯来保护天冬氨酸。通常将苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸也保护为叔丁醚。在下文中还将讨论对精氨酸的保护。可施用不同的脱保护模式，例如通过Pd催化的还原酰基转移反应费力地(laborously)去除烯丙基化的保护基。Z(苯甲氧基羰基)基团使用起来较不方便，这是因为其需要氢解才能有效去除。优选地，保护基R2-R9是酸不稳定性的，‘不稳定’是指在弱酸性或强酸性条件下，在DCM溶液中孵育5小时，所述各保护基的切除率至少为20％。根据本发明所述，更优选的是，在上文所述的强酸性条件下并仅在该条件下(即通过强酸性条件下的酸解方式)去除所述保护基R2-R9。
R1是不溶性的固相，通常为聚合物固相，例如交联的聚苯乙烯/1％二乙烯基苯酚共聚物。通常(但不是严格要求)，本发明操作中该固相R1当然还可以呈现出多个以肽基A官能化的2-氯-三苯甲基-手臂部分，而非仅限于式I中明示的那一个。更重要的是，为了用于由Merrifiled首次提出的固相合成中，聚合物固相的最小粒径需能够形成具有足够大小的易过滤或易沉淀颗粒的的真悬浮液而不是胶体特性。除了直接用CTC手臂或接头(例如Bayer的4-羧基三苯甲基衬里(liner)，Bayer等，13th American Peptide Symposium，Hodges等编，ESCOM，Leiden，1994，第156页)衍生的聚苯乙烯主体聚合物(base polymer)所述主体聚合物中的个别苯部分已经被衍生化从而参与形成2-氯-三苯甲基官能)以外，还有其它主体聚合物，例如纯PEG或混合PEG树脂(例如Tentagel)或任选的混合或接枝树脂(hybrid or grafted resins)，例如通过PEG间隔基将2-CTC接头(如Bayer接头)接枝到聚苯乙烯基聚合物上而不是直接使该接头与聚苯乙烯基聚合物反应。将PEG加入树脂提供了更具两亲性的树脂，并由此获得更佳的操作性，例如在DCM/TFA混合物中进行一步分离和脱保护时的操作性，虽然负载容量可能会成问题。应注意的是，当然存在严格意义上的不溶性PEG树脂。但在Bayer等的一种技术(Nature 1972，第237卷，第512f页)记载了一种模仿固相分离原理但严格在溶液中工作的基于PEG聚合物的技术，其中的肽-树脂偶联物仍然是可溶的，并提供了均一的单相系统。根据本发明上下文的优选含义中，这样的树脂特性包括在本发明的“不溶性”定义中，因为这样的树脂特性基本上允许通过微滤或超滤技术在微观水平上快速简便地基于大小来进行分离。在更优选的含义中，“不溶性”是指在用于肽合成的给定溶剂系统中，两相系统中的一相为真正的固体悬浮相。
优选地，所述固相的粒度小于700目(粒度如US标准局所定义，可在例如Rmpps Chemie-Lexikon，7.Auflage，1973，Franck’sche Verlagshandlung，W.Keller & Co.Stuttgart/Germany检索到)。
优选地，本发明的2-氯-三苯甲基-官能化固相的粒度为50-600目(如US标准局所定义)，更优选60-400目，最优选100-300目。
可用不同的保护基来保护本发明的酪氨酸，例如叔丁醚，或者Z-，或更优选2-溴-Z酯。同样，也可采用三苯甲基醇保护基，例如2-氯-三苯甲基或4-甲氧基或4，4’甲氧基-三苯甲基。优选地，R9是三苯甲基或叔丁基保护基。更优选地，R9是叔丁基(tBu)保护基，这是指酪氨酰侧链被修饰为叔丁醚。tBu基团仅可在强酸性条件下被有效去除。
优选地，单独和尤其是结合其它优选的实施方式，精氨酸保护基R2选自：五甲基二氢苯并呋喃基(Pbf)、金刚烷氧基-羰基和异冰片基-氧-羰基、五甲基色原磺酰基(pentamethylenchromanesulfonyl，Pmc)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基(Mtr)及其4-叔丁基-2，3，5，6-四甲基同系物(Tart)或Boc，它们仅在上文所述的强酸性条件下被切除。R2更优选为Pbf、Pmc、Mtr，最优选为Pbf；在强酸性条件下且通常在水性介质中进行的侧链完全脱保护后，采用Pmc、Mtr和尤其是Pbf保护未观察到脱保护酪氨酸的旁观烷基化(bystander-alkylation)。Pbf的切除率最高。
众所周知羧基-保护基可用于Glu、Asp，例如可使用Mpe、O-1-金刚烷基、O-苄基，甚至于更简单的烷基酯，虽然不是很常用。为了简便起见，通常并优选独立地将叔丁基用作保护基R4、R5、R6、R7、R8。
保护基R3至关重要，因为其存在于二价水蛭素-8中的上述序列Gly-Asp中，该二肽序列尤其倾向于发生副反应而形成天冬酰亚胺。天冬酰亚胺的形成会在线性合成过程中接着的每一轮偶联反应中于受保护的肽中发生，反应程度轻微(0.1-0.5％)，但在最后可表现出聚积效应。同样，虽然优选用三苯甲基保护基或其2-氯和4-甲基或4-甲氧基衍生物，但也可使用金刚烷基保护基。最优选使用三苯甲基保护基。
还应注意到的是，在线性合成中可使用Nα-烷基保护二肽模块来代替侧链和Nα保护氨基酸偶联；该二肽具有干扰二级结构的作用，使得合成产率和纯度更佳。例如Fmoc-Gly-(N-Hmb)Gly-OH和Fmoc-Gly-(N-Dmb)Gly-OH可从EMD Biosciences(Novabiochem)市售购得。应理解的是，该N-烷基基团在本发明中不被认为是保护基，因此，它们的使用或存在是任选的且并不排除在式I结构之外。
在基本上如各权利要求中所述的式I所示肽-偶联物的分离和脱保护的优选方法中，使用了二步骤连续方案，首先在弱酸性条件下进行酸解以从CTC树脂上切下受保护的肽，然后在强酸性条件下去除残留的保护基。
采用这一方案的原因在于式I肽-固相偶联物的一步全面脱保护中完全脱保护产物和疏水性接合离析物对溶剂要求相互抵触，为此进行折中处理对产物的纯度和产率都有负面影响。该连续多步骤方法消除了上述内在缺陷，从而能够更好地控制不同的反应，并由此优化产率。根据本发明，其令人惊讶的效果还包括完全抑制了作为副反应的二酮哌嗪形成。
因此，设计了一种对如前所述式I所示肽-固相偶联物进行分离和脱保护以获得式D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu所示的肽的方法，该方法的特征在于：在第一步中，通过弱酸性条件下的处理，从2-氯三苯甲基手臂上切下受保护的肽，优选使用0.1-10％的TFA在极性疏质子溶剂中的溶液，在第二步中，如上所述地在强酸性条件下去除保护基。
优选地，所述第一步在极性疏质子溶剂中进行，所述溶剂为二氯甲烷。与其它溶剂(例如NMP，N-甲基吡咯烷酮)相比，这是进行该反应的最佳溶剂。还可以(而非必须)在溶剂中包含清除剂，尤其是用于第二脱保护步骤中的溶剂系统，清除剂其存在的量为反应液(reaction broth)的0.1-10％(w/w)，用于防止酪氨酸的芳核再次发生不为所需的烷基化。清除剂阻断了去除保护基时产生的反应性烷基-碳鎓离子中间体(可能在第一步中的剪切反应期间已轻微发生)。
清除剂的例子为苯甲硫醚(其还具有第二性的酸解促进效果-该第二作用和苯甲硫的替代物在Bodanszky M等，Int.J.Peptide Protein Res.23：287中有所讨论)。不具有该酸解效果的其它清除剂的例子是苯酚和/或三烷基硅烷(Stierandova等，Int.J.Peptide Protein Res.43，1994，31-38)。
优选在第一步从树脂上切下或分离后，通过与吡啶混合直接淬灭反应，然后通过与水混合来回收步骤1的产物。通过该方法可最简单有效地回收产物。
在本发明的另一实施方式中，涉及的肽与式I的肽-固相偶联物基本上被要求，唯一的不同是凝血酶切割位点-Arg(R2)-Pro-不是标准的肽键而是化学修饰的拟易裂键(pseudoscissile)或‘psi’键(酰胺键的置换用增加的括号中带‘psi’前缀的原子表示，参见Rudinger等，Drug Desgin Vol.II，编辑Ariens，E.，AcademicPress，New York，p.319(1971)。更优选，该psi置换是-Arg[psiCH2NH]Pro-(Kline，T等，1991，Hirolog peptides with scissile bond replacements resistant to thrombincleavage，带有易裂键置换的抗凝血酶切割的二价水蛭肽，Biochem.Biophys.Res.Commun.177，1049-1055)。最简单的是，例如，该psi键在固相合成中立即用预制的Fmoc保护的psi二肽与生长中的接合状态的肽正常偶联来导入。
本发明的另一目的是将上述实施方式和方法扩展到包含上述CTC树脂以外的树脂部分的肽-固相偶联物，这样扩展后，所述方法仍可在如前所述的弱酸性或温和酸性条件下从树脂上切下肽部分。
作为另一目的，设计了式A-W所示的肽-树脂偶联物，其中A可为任何前文所述A的实施方式，任选地包含各氨基酸侧链保护基团，其中所存在的R2-R9如上所述，其中W是一优选为不溶性的固相或固相复合物，其在肽部分可在弱酸性条件下得以切除并具有下所示的树脂手臂或接头
a.式II
前提是包含残基X2的A总是通过-O-与所示手臂或接头连接，
其中R是固相，R″1、R″2、R″3相同或不同，各自独立地为氢、4-或4′-(C1-C4烷基)或4-或4′-(C1-C4烷氧基)，但是R″1和R″2不可同时是氢，当R″ 1是H时，R″任选地为2-Cl，且其中更优选或最优选的是，式II的手臂或接头选自2-氯-三苯甲基、4-甲氧基-三苯甲基、4-甲基三苯甲基，
b.或式III
Figure A20058004357300112
(其可通过用Bayer的4-羧基三苯甲基接头的酰化氨基-或羟基官能化树脂衍生而来)前提是同样包含残基X2的A通过-O-连接到所述手臂或接头，R如上所定义，
c.或式IV
Figure A20058004357300113
其中R是固相或聚合物树脂，而R″ 1、R″2、R″3相同或不同，独立地为氢、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基，但R″ 1和R″2不可同时为氢，其中L是A(L＝A)或其中L是式V
Figure A20058004357300121
在另一优选的实施方式中，所述树脂手臂具有式VI，R、R″1和R″2的定义同上，
Figure A20058004357300122
如前所述，更为优选的是树脂和树脂手臂具有式VII，R、R″1和R″2的定义同上，
在另一更为优选的实施方式中，任选包括残基X2的A通过-O-与式VII的手臂或接头连接，R″1和R″2不同时为氢时，R″1和R″2独立地为氢、甲基或甲氧基；当包含残基X2的A通过-N-与式VII的手臂或接头连接时，R″1和R″2独立地为甲基或甲氧基，优选甲氧基。更为优选的是，同样包含X2的A通过-O-官能团结合于手臂，R″1是氢，R″2是甲基或甲氧基，优选A是树脂或树脂手臂。最优选R″2为甲基。
树脂或树脂手臂组合部分原则上可为用于合成的任何树脂，例如Merrifield用来与羟苄基-苯基接头部分(作为树脂的一部分)一起使用或Wang用来与羟基-苄基-对苄氧基部分一起使用的聚苯乙烯-二苯乙烯树脂，所述一起使用的部分包括例如可进一步接枝更为酸不稳定性的接头，或者可使得后一种接头整合或直接连接到树脂上的那些。原则上，用于合成的固相树脂必须包含至少一个作为其一部分的接头或手臂，所述接头或手臂是固相核心材料的一部分；可将该接头或手臂认为是固定化的保护基(Guillier等，Chem.Rev.100，2091-2157，2000)。例子为例如：Sieber树脂、相关的呫吨基(related xanthenyl)型PAL-手臂树脂、Rink酰胺树脂、Rink酸性树脂、更复杂的PEG接枝的聚苯乙烯树脂(例如基于tentagel的Novasyn TG(Novabiochem，Merck Biosciences，德国)，现成的此类树脂具有不同接枝手臂(例如2′-氯-三苯甲基))，或通过将功能性手臂接枝到基质材料(例如硅胶)上构建而成的树脂。优选的是，如果所述树脂是三苯甲基树脂或树脂手臂，那么它是选用4-甲氧基或4，4′-二甲氧基-三苯甲基树脂。用于本发明中的树脂具有标准的粒径，约为50-500目，更优选100-400目。如式IV中所示的树脂或固相R应理解为含有交联的聚合物基质材料，该材料可通过任何种类的化学惰性烷基、烷氧基、芳氧基或烷基酯间隔基或接头(其被认为是R的构成部分)结合于式IV-VII所示的手臂部分。然而，应注意的是，除了对从树脂上剪切的条件有影响以外，树脂材料的性质，尤其是手臂基团的化学性质，将极大地影响偶联和内酰胺化反应(lactamisation)的效力，但影响的机制尚不甚明了。树脂上阶段(on-resin stage)中成熟肽的产率根据所用树脂或树脂手臂的类型不同而不同。出于这一原因，在本发明的优选实施方式中，树脂或树脂手臂如式IV所示(如权利要求所述)，更优选具有式VI(如权利要求所述)，最优选的是式VII(如权利要求所述)。此类树脂或树脂手臂的例子是(4-甲氧基苯基)-甲基-和(4-甲基苯基)-甲基-聚苯乙烯(Atkinson等，2000，J.Org.Chem.65，5048)，以O-或N-连接键连接到肽部分的树脂，和它们的PEG-树脂衍生物。其它的例子为例如：酸不稳定性HMPB-MBHA或HMPB-BHA树脂(Sieber等，1987，Tetrahedron Lett.28，6147)、酸不稳定性Rink酰胺树脂或Rink酸性树脂(Rink等，1987，Tetrahedron Lett.28，3787)。术语“酸不稳定性”是指在环境温度下在2-10％TFA的二氯甲烷溶液中至少1小时，发生实质上可定量的切割。令人惊讶的是，采用具有联苯-甲基结构核心基序的此类优选树脂提高了线性合成过程中偶联反应和内酰胺化反应的效率；值得注意的是该树脂可在更低的反应温度例如15-25℃，而在例如三苯甲烷树脂上实现有效偶联所需的标准温度则是40℃。
实验
1.Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(tBu)-Phe-Glu(tBu)Glu(tBu)-Ile-Pro-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-O-2-CTC(受保护的二价水蛭素-8，详见EP-489 070，通过羧基末端以酯键连接到2-CTC树脂)的合成
所有试剂均获自EMD Biosciences(Madison，WI/U.S.A.；Novabiochem-brand)。以Fmoc-Leu-OH预载的基于聚苯乙烯的2-ClTrt(CTC)树脂(Cbl Patras，Greece)以其基体聚合物计为100-200目，以预装载后的最终CTC树脂产物计为60-200目。加载密度约为0.60mmol/g。各氨基酸以Fmoc氨基酸形式提供，或当其为D-Phe时，作为已受Boc-保护的Boc-D-Phe形式提供。在二氯甲烷/N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，在Hünig-Base(二异丙基-乙基-胺，DIEA)的存在下，用TCTU进行偶联。通常，采用1.5当量Fmoc氨基酸或Boc保护的氨基酸，但Fmoc-Arg(Pbf)的偶联反应使用2.5当量。类似地，Fmoc-Arg(Pbf)的偶联反应时间由标准的60分钟(30℃)延长到90分钟。过程中，采用Kaiser测试或Chloranil测试方法进行偶联效力的控制。
在30℃用3-4个循环的20％哌啶的NMP溶液(期间采用NMP适当清洗)来进行Fmoc的脱保护。
2.Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(tBu)-Phe-Glu(tBu)Glu(tBu)-Ile-Pro-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-OH的合成
经3轮15分钟、15℃、2％(w/w)TFA、1％(w/w)三乙基硅烷(TES)、在二氯甲烷溶液中的反应完成从48.3g树脂(如实施例1所述制得)上的剪切。通过氮气鼓泡对反应物进行搅拌；反应物的颜色随反应轮数从黄色/橙色变为褐色。每轮反应后，通过将反应液全部注入稀嘧啶(嘧啶/乙醇1∶9(v/v))直接淬灭剪切反应。然后用玻璃料(frit)过滤分离出树脂用于下一轮反应。汇集所有的滤液，真空(RotaVap)下浓缩至橙色半流体状，用DCM洗涤，重悬于400mk双蒸水中，在室温下搅拌，过滤，以水洗涤，干燥。所得为分析级(～90％纯度)的28,8g的浅黄色粉末。用HPLC和LC-MS分析产物。
3.全面脱保护，NH2-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH的合成
在剪切混合物(cleavage cocktail，‘CC’)的DCM稀释液(DCM∶‘CC’＝1∶10(v/v))中进行全面脱保护。‘CC’由混合比为(％w/w)89∶2.5∶2.5∶5.0∶1的TFA/苯甲硫醚/苯酚/水/TES组成。将0.1g的实验2干燥产物溶于10ml如上所述以‘CC’稀释的DCM，在室温下搅拌5小时。然后通过加入50ml甲基-叔丁醚(MTBE，Fluka Chemie，Buchs/Switzerland)回收产物，搅拌下水浴30分钟将反应物冷却到0℃，滤除期间形成的盐沉淀物。滤饼用MTBE洗涤数次，并在室温下进行干燥，得到0.8g的粗产物，以HPLC测定的纯度约为55％。步骤2和3的联合总产率约为55％。
4.Wang树脂或CTC树脂上二价水蛭素-8或其C末端四肽片段合成的比较剪切实验和LC-MS分析
采用HPLC LC-MS分析方法，结果显示，从树脂上剪切下来并在强酸性条件下全面脱保护后，使用Wang树脂的肽产品有1-10％的被烷基化，从CTC树脂上切下后则没有观察到这样的修饰。经MS分析定位发生在酪氨酰残基上的修饰。合成步骤如上所述。

Claims (7)

1.如式I所示的肽-树脂偶联物，其包含2-氯-三苯甲基手臂，
Figure A2005800435730002C1
其中  A＝Boc-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-或A＝Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-或A＝NH2-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-，且其中R2、R3、R4、R5、R7、R8、R9是氨基侧链保护基，R1是不溶性固相。
2.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述固相是聚合的且粒度小于700目(US标准局)，优选粒度为50-600目。
3.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，R2是五甲基二氢苯并呋喃基，金刚烷氧基-羰基或异冰片氧基羰基，R9是叔丁基或其衍生物，R3-R8是酸不稳定性保护基。
4.如权利要求3所述的偶联物，其特征在于，R2是Pbf，R4-R9是酸不稳定性保护基，该保护基要求至少50％或更浓的三氟乙酸。
5.如权利要求4所述的偶联物，其特征在于，R3是三苯甲基，R4、R5、R6、R7和R8是叔丁基。
6.如权利要求5所述的偶联物，其特征在于，R9是叔丁基。
7.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，N-末端的Boc基团被另一在强酸性条件下可被切除的保护基所取代。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101475631B (zh) * 2009-01-08 2011-08-17 苏州中科天马肽工程中心有限公司 比伐卢定的液相合成方法
CN102264757A (zh) * 2008-12-29 2011-11-30 隆萨布莱纳公司 制备比伐卢定的方法
CN101555274B (zh) * 2009-05-15 2013-08-21 海南双成药业股份有限公司 一种多肽固相合成比法卢定粗品的制备方法
CN107001409A (zh) * 2014-09-26 2017-08-01 株式会社钟化 疏水性肽的制造方法
CN108383905A (zh) * 2016-12-30 2018-08-10 江苏金斯瑞生物科技有限公司 一种比伐卢定的制备方法

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007033383A2 (en) * 2005-09-14 2007-03-22 Novetide, Ltd. Process for production of bivalirudin
WO2008109079A2 (en) * 2007-03-01 2008-09-12 Novetide, Ltd. High purity peptides
US7598343B1 (en) 2008-07-27 2009-10-06 The Medicines Company Pharmaceutical formulations of bivalirudin and processes of making the same
US7582727B1 (en) 2008-07-27 2009-09-01 The Medicinces Company Pharmaceutical formulations of bivalirudin and processes of making the same
JP5788321B2 (ja) * 2008-09-03 2015-09-30 サイノファーム タイワン リミテッド ビバリルジンの製造方法
WO2010117725A2 (en) 2009-04-06 2010-10-14 Novetide, Ltd. Production of peptides containing poly-gly sequences using fmoc chemistry
WO2013042129A1 (en) 2011-09-23 2013-03-28 Natco Pharma Limited Improved process for preparation of bivalirudin
US9388212B2 (en) 2013-02-21 2016-07-12 Chemical & Biopharmaceutical Laboratories Of Patras S.A. Solid phase peptide synthesis via side chain attachment
JP6382488B2 (ja) * 2013-02-21 2018-08-29 ケミカル アンド バイオファーマシューティカル ラボラトリーズ オブ パトラ エス．エー． 側鎖結合を介する固相ペプチド合成
GB201310921D0 (en) 2013-06-19 2013-07-31 Chemical & Biopharmaceutical Lab Of Patras S A Peptide-resin conjugate and use thereof
CN112111001B (zh) * 2019-06-19 2021-10-29 翰宇药业（武汉）有限公司 胸腺肽Tα-1的合成方法
JP2020138975A (ja) * 2020-05-18 2020-09-03 ケミカル アンド バイオファーマシューティカル ラボラトリーズ オブ パトラ エス．エー． 側鎖結合を介する固相ペプチド合成

Family Cites Families (154)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4093610A (en) 1977-01-31 1978-06-06 American Home Products Corporation Process for producing triglycyl-lysine vasopressin and intermediates therefor
US4108846A (en) 1977-02-01 1978-08-22 Hoffmann-La Roche Inc. Solid phase synthesis with base N alpha-protecting group cleavage
US4169141A (en) 1978-01-30 1979-09-25 Shering Corporation 1-Peptidyl derivatives of di-O-aminoglycosyl-1,3-diaminocyclitol antibacterial agents
US5789540A (en) 1987-01-23 1998-08-04 Merrell Pharmaceuticals Inc. Anticoagulant peptides
US6005071A (en) 1987-01-23 1999-12-21 Merrell Pharmaceuticals Inc. Anticoagulant peptides
US6239101B1 (en) 1989-07-05 2001-05-29 Oklahoma Medical Research Foundation Thrombin binding polypeptides
US5196404B1 (en) 1989-08-18 1996-09-10 Biogen Inc Inhibitors of thrombin
US5240913A (en) 1989-08-18 1993-08-31 Biogen, Inc. Inhibitors of thrombin
JP3187044B2 (ja) 1989-12-01 2001-07-11 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト ヒルジン突然変異蛋白質及びヒルジンポリアルキレングリコール複合体
US5624822A (en) 1989-12-22 1997-04-29 Basf Aktiengesellschaft Hirudin fusion proteins and preparation of hirudin
CA2035917C (en) 1990-02-13 2001-10-02 John L. Krstenansky Stabilized sulfonate, sulfate, phosphonate and phosphate derivatives of hirudin
DE4016596A1 (de) 1990-05-23 1991-11-28 Hoechst Ag Ein neues kupplungsreagenz fuer die peptidsynthese
US6060451A (en) 1990-06-15 2000-05-09 The National Research Council Of Canada Thrombin inhibitors based on the amino acid sequence of hirudin
US5574012A (en) 1990-07-24 1996-11-12 Merrell Pharmaceuticals Inc. Analogs of hirudin having anti-platelet activity
DK0511393T3 (da) 1990-11-08 1996-12-09 Japan Energy Corp Hirudin-mutant, fremstilling af denne, antikoagulant, sekretorisk vektor, mikroorganisme transformeret af vektoren og fremstilling af produkt ud fra mikroorganismen
US5242810A (en) 1990-12-07 1993-09-07 Biogen, Inc. Bifunctional inhibitors of thrombin and platelet activation
EP0498508A1 (en) 1991-02-04 1992-08-12 Akzo Nobel N.V. Factor IIa inhibitors
DE4103649A1 (de) 1991-02-07 1992-08-13 Basf Ag Neue antikoagulatorisch wirksame peptide
KR930703024A (ko) * 1991-02-08 1993-11-29 리챠드 티. 딘 영상용 테크네튬-99m표지폴리펩티드
US5767235A (en) 1991-03-05 1998-06-16 Nippon Mining Company Limited Anticoagulant hirudin variants and methods for their production
US6514730B1 (en) 1991-03-21 2003-02-04 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Secretion of hirudin derivatives
GB9112825D0 (en) 1991-06-14 1991-07-31 Ici Plc Process for making peptides
US5837808A (en) 1991-08-20 1998-11-17 Baxter International Inc. Analogs of hirudin
GB9118669D0 (en) 1991-08-30 1991-10-16 Univ Southampton Preparation of peptides by a soliphase synthesis and intermediates therefor
DE4209110A1 (de) 1991-11-26 1993-05-27 Basf Ag Neue thrombininhibitorische proteine aus landblutegeln
DE4140381A1 (de) * 1991-12-07 1993-06-09 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet
US5371184A (en) 1992-02-05 1994-12-06 Mallinckrodt Medical, Inc. Radiolabelled peptide compounds
FR2687681B1 (fr) 1992-02-20 1995-10-13 Transgene Sa Conjugues polyethyleneglycol-hirudine, leur procede de preparation et leur emploi pour le traitement des thromboses.
GB9209032D0 (en) 1992-04-25 1992-06-10 Ciba Geigy Ag New peptide derivatives
US5968476A (en) 1992-05-21 1999-10-19 Diatide, Inc. Technetium-99m labeled peptides for thrombus imaging
CN1088836A (zh) * 1992-12-30 1994-07-06 中国科学院生物物理研究所 重组水蛭素及其复合物用于制备预防和治疗血栓病药物
JP3466614B2 (ja) 1993-02-12 2003-11-17 コルバス・インターナショナル、インコーポレイテッド 血栓症のインヒビター
US5656600A (en) 1993-03-25 1997-08-12 Corvas International, Inc. α-ketoamide derivatives as inhibitors of thrombosis
DE4310632A1 (de) 1993-04-01 1994-10-06 Merck Patent Gmbh Lineare Adhäsionsinhibitoren
IT1265023B1 (it) 1993-04-16 1996-10-28 Dev Biotechnological Processes Inibitori della trombina, loro preparazione ed uso per applicazioni terapeutiche, profilattiche e diagnostiche
US5443827A (en) 1993-05-03 1995-08-22 President And Fellows Of Harvard College Fibrin-targeted inhibitors of thrombin
DK0702696T3 (da) 1993-06-11 2003-11-17 Merrell Pharma Inc Trifunktionelle antithrombin- og antiblodpladepeptider
US5457177A (en) 1993-06-16 1995-10-10 Merck & Co., Inc. Thrombin receptor radioligands
DE4323754C1 (de) 1993-07-15 1994-12-01 Gruenenthal Gmbh Bifunktionelle Urokinasevarianten mit verbesserten fibrinolytischen Eigenschaften und thrombinhemmender Wirkung
EP0710228B1 (en) 1993-07-19 1998-01-21 Resolution Pharmaceuticals Inc. Hydrazino-type radionuclide chelators having an n 3?s configuration
US5972648A (en) 1993-09-28 1999-10-26 Japan Energy Corporation Hirudin analogs, methods of manufacture thereof and anticoagulant compositions having these as active ingredients
US5449761A (en) 1993-09-28 1995-09-12 Cytogen Corporation Metal-binding targeted polypeptide constructs
FR2710917B1 (fr) 1993-10-07 1995-11-24 Adir Nouveaux dérivés de peptides thérapeutiquement actifs dans la cascade de coagulation sanguine, leur procédé de préparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
US6127337A (en) 1993-10-25 2000-10-03 National Research Council Of Canada Bivalent thrombin inhibitors
US7060484B1 (en) 1993-11-12 2006-06-13 Gilead Sciences, Inc. Polypeptides and coagulation therapy
US6156540A (en) 1993-12-22 2000-12-05 Human Genome Sciences, Inc. Thrombin inhibitor
DE4404168A1 (de) 1994-02-10 1995-08-17 Hoechst Ag Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5662885A (en) 1994-07-22 1997-09-02 Resolution Pharmaceuticals Inc. Peptide derived radionuclide chelators
US5759542A (en) 1994-08-05 1998-06-02 New England Deaconess Hospital Corporation Compositions and methods for the delivery of drugs by platelets for the treatment of cardiovascular and other diseases
KR0141651B1 (ko) 1994-09-07 1998-06-15 강재헌 금속이온 친화성 크로마토그라피를 이용한 히루딘의 정제방법
DE4440892A1 (de) 1994-11-17 1996-05-23 Gruenenthal Gmbh Proteine mit fibrinolytischen und gerinnungshemmenden Eigenschaften
DE4442665A1 (de) 1994-11-30 1996-06-05 Gruenenthal Gmbh Chimäre Proteine mit fibrinolytischen und thrombinhemmenden Eigenschaften
US5747453A (en) 1995-06-06 1998-05-05 Alza Corporation Method for increasing the electrotransport flux of polypeptides
US5767078A (en) 1995-06-07 1998-06-16 Johnson; Dana L. Agonist peptide dimers
US5817758A (en) 1995-06-07 1998-10-06 Terrapin Technologies, Inc. P-nitrobenzyl side-chain protection for solid-phase synthesis
AU703256B2 (en) 1995-06-09 1999-03-25 Regents Of The University Of Michigan, The Bradykinin analogs as selective thrombin inhibitors
IL119466A (en) 1995-11-03 2001-08-26 Akzo Nobel Nv Thrombin inhibitors, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5910481A (en) 1995-11-13 1999-06-08 Immuno Ag Hybrid proteins with modified activity
US6333189B1 (en) 1996-06-06 2001-12-25 Alza Corporation Method of making an electrotransport device
US7176282B1 (en) 1996-09-09 2007-02-13 Zealand Pharma A/S Solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis
CZ295838B6 (cs) 1996-09-09 2005-11-16 Zealand Pharma A/S Způsob výroby peptidů
US6265204B1 (en) 1997-01-17 2001-07-24 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors, and fusion polypeptides for secretion of polypeptides in filamentous fungi
US5986065A (en) 1997-03-10 1999-11-16 Sunol Molecular Corporation Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
US6077825A (en) 1997-03-13 2000-06-20 Auburn University Antithrombin protein and DNA sequences from black fly
GB9708918D0 (en) 1997-05-01 1997-06-25 Ppl Therapeutics Scotland Ltd Methods
CA2321026A1 (en) 1998-03-09 1999-09-16 Zealand Pharmaceuticals A/S Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis
US6281331B1 (en) 1998-03-23 2001-08-28 Trimeris, Inc. Methods and compositions for peptide synthesis
US6451992B1 (en) 1998-08-20 2002-09-17 Auburn University Antithrobin nucleotides and proteins from horn fly
BR0009674A (pt) 1999-04-09 2002-01-15 Basf Ag Composto, droga, e, uso de composto
ES2154590B1 (es) 1999-05-20 2001-11-01 Lipotec Sa Procedimiento de sintesis de peptidos en fase solida
US6544750B1 (en) 1999-08-17 2003-04-08 Thromgen, Inc. Peptide analogs as selective inhibitors of thrombin activation of protease activated receptor 1
EP1138694A1 (en) 2000-03-30 2001-10-04 University Of Manitoba Hirulog-like peptide
US6506761B1 (en) 2000-04-14 2003-01-14 Corvas International, Inc. Substituted hydrazinyl heteroaromatic inhibitors of thrombin
JP2002112782A (ja) 2000-10-04 2002-04-16 Ajinomoto Co Inc 抗血栓活性を有する蛋白質及びその製造法
DE10102878A1 (de) 2001-01-23 2002-08-01 Haemosys Gmbh Oligo- oder Polyalkylengekoppelte Thrombininhibitoren
WO2002079278A1 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Mayo Foundation For Medical Education And Research Efficient methods for solid phase synthesis using trityl chloride resins
WO2002100337A2 (en) 2001-06-08 2002-12-19 Emory University Antithrombotic thrombin variants
US6703364B2 (en) 2001-07-23 2004-03-09 Cleveland State University Thrombin generation inhibitors
ATE505479T1 (de) 2001-09-10 2011-04-15 Novel Science Internat Gmbh Organische verbindungen mit biologischer wirkung als thrombinhemmer und ihre verwendung
GB0123262D0 (en) 2001-09-27 2001-11-21 Adprotech Ltd Polymeric compounds
KR100718431B1 (ko) 2001-11-27 2007-05-14 주식회사 유앤비케미칼 트리틸기가 도입된 폴리스티렌 수지의 제조 방법
US7794693B2 (en) 2002-03-01 2010-09-14 Bracco International B.V. Targeting vector-phospholipid conjugates
IL162780A0 (en) 2002-04-11 2005-11-20 Kenji Kangawa Method for producing modified peptide
MXPA04010910A (es) 2002-05-03 2005-01-25 Avecia Ltd Procedimiento para la sintesis de peptidos.
US6875893B2 (en) 2002-05-23 2005-04-05 Cephalon, Inc. Preparations of a sulfinyl acetamide
EP1546186A4 (en) 2002-08-26 2006-02-08 A & Pep Inc PROCESS FOR SYNTHESIS OF PEPTIDES
KR100613945B1 (ko) 2002-12-20 2006-08-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 고상 결합된 클로로트라이틸 클로라이드 수지의 재활용방법
DE10301255A1 (de) 2003-01-15 2004-07-29 Cpi Creative Pharma International Gmbh Organische Verbindungen mit biologischer Wirkung als Thrombinhemmer und ihre Verwendung
WO2004076484A1 (en) 2003-02-27 2004-09-10 National Research Council Of Canada Peptide inhibitors of thrombin as potent anticoagulants
US7074765B2 (en) 2003-05-01 2006-07-11 The Regents Of The University Of Michigan Synthetic peptide analogs of Arg-Pro-Pro-Gly-Phe as selective inhibitors of thrombin and thrombin activation of protease activated receptors 1 and 4
US7393920B2 (en) 2003-06-23 2008-07-01 Cem Corporation Microwave-assisted peptide synthesis
WO2004113386A2 (en) 2003-06-26 2004-12-29 Merck Patent Gmbh Modified hirudin proteins and t-cell epitopes in hirudin
JP4579240B2 (ja) 2003-07-04 2010-11-10 ロンザ アーゲー 担持相合成法の改善
US7135534B2 (en) 2003-07-24 2006-11-14 Rajiv Gandhi Centre For Biotechnology Polymer support for solid phase peptide synthesis and process for preparation thereof
GB0318205D0 (en) 2003-08-02 2003-09-03 Albachem Ltd Synthetic method
WO2005063791A2 (en) 2003-12-31 2005-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for peptide synthesis using a reduced amount of deprotection agent
WO2005074575A2 (en) 2004-01-30 2005-08-18 Microbia, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
US7795205B2 (en) 2004-04-12 2010-09-14 Canyon Pharmaceuticals, Inc. Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor
EP1600455A1 (en) 2004-05-28 2005-11-30 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Preparation of solid phase bound peptides or PNAs
WO2006000081A1 (en) 2004-06-23 2006-01-05 National Research Council Of Canada Polypeptide ligands containing linkers
WO2006017208A1 (en) 2004-07-12 2006-02-16 Applera Corporation Mass tags for quantitative analyses
US20090054319A1 (en) 2005-03-17 2009-02-26 Microbia, Inc. Methods and Compositions for the Treatment of Hypertension and Gastrointestinal Disorders
DE602006011099D1 (de) 2005-05-03 2010-01-28 Novetide Ltd Verfahren zur herstellung von peptidderivaten
US7879792B2 (en) 2005-06-02 2011-02-01 The Regents Of The University Of Michigan Synthetic peptide inhibitors of thrombin and thrombin activation of protease activated receptors 1 and 4
WO2007033383A2 (en) 2005-09-14 2007-03-22 Novetide, Ltd. Process for production of bivalirudin
MX2008007321A (es) 2005-12-09 2008-09-30 Bracco Int Bv Conjugados fosfolipido de vector dirigido.
US8314208B2 (en) 2006-02-10 2012-11-20 Cem Corporation Microwave enhanced N-fmoc deprotection in peptide synthesis
CN101033249B (zh) 2006-03-10 2011-05-11 周逸明 固相多肽合成比筏芦定的制备方法
US20080096819A1 (en) 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
EP2013223A2 (en) 2006-05-03 2009-01-14 Mallinckrodt Inc. Composition and method for the release of protected peptides from a resin
WO2008009672A1 (en) 2006-07-21 2008-01-24 Solvay (Societe Anonyme) Process for the manufacture of peptides
WO2008057683A2 (en) 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
WO2008058016A2 (en) 2006-11-02 2008-05-15 University Of Virginia Patent Foundation Ethoid-containing compounds, methods for preparing ethoid-containing compounds, and methods for use
IE20060841A1 (en) 2006-11-21 2008-05-28 Ipsen Mfg Ireland Ltd Boc and fmoc solid phase peptide synthesis
KR101472765B1 (ko) 2006-12-08 2014-12-15 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 경구용 Ｘａ 인자 억제제를 포함하는 단위 용량 제형 및 경구용 Ｘａ 인자 억제제를 사용하는 혈전증의 치료 방법
ATE533789T1 (de) 2006-12-15 2011-12-15 Inst Radiation Med Amms Pla Herstellung von mit geringen blutungen assoziiertem gerinnungshemmendem fusionsprotein und dessen verwendung
CN101245110B (zh) 2007-02-16 2010-09-15 鲁南制药集团股份有限公司 重组中性粒细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白及其药物组合物
WO2008109079A2 (en) 2007-03-01 2008-09-12 Novetide, Ltd. High purity peptides
GB0711779D0 (en) 2007-06-18 2007-07-25 Univ Singapore Thrombin inhibitor
US8206967B2 (en) 2007-07-06 2012-06-26 Medimmune Limited Method for production of recombinant human thrombin
JP5515738B2 (ja) 2007-07-25 2014-06-11 味の素株式会社 ジベンゾフルベン誘導体の淘汰方法
CN101372512B (zh) 2007-08-23 2011-03-23 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一类抗凝血多肽及其用途
US20090062511A1 (en) 2007-09-05 2009-03-05 Raghavendracharyulu Venkata Palle Process for the preparation of bivalirudin and its pharmaceutical compositions
CN102027005A (zh) 2008-05-15 2011-04-20 诺沃-诺迪斯克有限公司 通过固相合成制备的肽的纯化
US7598343B1 (en) 2008-07-27 2009-10-06 The Medicines Company Pharmaceutical formulations of bivalirudin and processes of making the same
US7582727B1 (en) 2008-07-27 2009-09-01 The Medicinces Company Pharmaceutical formulations of bivalirudin and processes of making the same
WO2010016551A1 (ja) 2008-08-06 2010-02-11 味の素株式会社 ジベンゾフルベンの除去方法
US20110288235A1 (en) 2008-09-03 2011-11-24 Scinopharm Taiwan Ltd. Process for the Preparation of Pramlintide
JP5788321B2 (ja) 2008-09-03 2015-09-30 サイノファーム タイワン リミテッド ビバリルジンの製造方法
WO2010054503A1 (zh) 2008-11-17 2010-05-20 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 抗凝血多肽及其应用
MX2011006950A (es) 2008-12-29 2011-07-28 Lonza Braine S A Proceso para la produccion de bivalirudina.
CN101475631B (zh) 2009-01-08 2011-08-17 苏州中科天马肽工程中心有限公司 比伐卢定的液相合成方法
WO2010117725A2 (en) 2009-04-06 2010-10-14 Novetide, Ltd. Production of peptides containing poly-gly sequences using fmoc chemistry
GB0907698D0 (en) 2009-05-05 2009-06-10 Univ Singapore Method of modifying serine protease inhibitors
CN101555274B (zh) 2009-05-15 2013-08-21 海南双成药业股份有限公司 一种多肽固相合成比法卢定粗品的制备方法
US7803762B1 (en) 2009-08-20 2010-09-28 The Medicines Company Ready-to-use bivalirudin compositions
GB0915519D0 (en) 2009-09-04 2009-10-07 King S College London Ntithrombotic compounds
WO2011071799A2 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Dr. Reddy's Laboratories Ltd. Purification of bivalirudin
US7985733B1 (en) 2010-01-06 2011-07-26 The Medicines Company Buffer-based method for preparing bivalirudin drug product
CN101906150B (zh) 2010-06-28 2013-01-09 上海昂博生物技术有限公司 一种比法卢定的制备方法
EP2606060A1 (en) 2010-08-16 2013-06-26 CEM Corporation Water soluble solid phase peptide synthesis
KR20120069288A (ko) 2010-12-20 2012-06-28 주식회사 씨트리 수용성 당 알코올을 이용한 비바리루딘의 정제방법
CN102260323A (zh) 2011-05-30 2011-11-30 杭州诺泰制药技术有限公司 固相液相结合制备比伐卢定的方法和检测方法
WO2012165546A1 (ja) 2011-05-31 2012-12-06 味の素株式会社 ペプチドの製造方法
CN102286076B (zh) 2011-06-23 2014-03-12 成都圣诺科技发展有限公司 比伐卢定的制备方法
CN102336813B (zh) 2011-07-01 2016-01-06 上海苏豪逸明制药有限公司 一种固相多肽合成蛋白溶菌素的制备方法
US8906681B2 (en) 2011-08-02 2014-12-09 The Scripps Research Institute Reliable stabilization of N-linked polypeptide native states with enhanced aromatic sequons located in polypeptide tight turns
WO2013042129A1 (en) 2011-09-23 2013-03-28 Natco Pharma Limited Improved process for preparation of bivalirudin
CN102532274B (zh) 2012-02-13 2014-04-23 成都圣诺生物制药有限公司 一种比伐卢定的制备方法
CN102641506B (zh) 2012-04-11 2013-10-23 承德医学院中药研究所 比伐卢定-聚乙二醇化复合物
CN102731624B (zh) 2012-06-14 2015-09-23 无锡市凯利药业有限公司 一种固相片段法合成比伐卢定的方法
CN102702325B (zh) 2012-06-19 2015-09-23 深圳翰宇药业股份有限公司 一种抗凝血多肽的制备方法
CN102924575B (zh) 2012-10-31 2014-12-31 深圳翰宇药业股份有限公司 一种比伐卢定的制备方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102264757A (zh) * 2008-12-29 2011-11-30 隆萨布莱纳公司 制备比伐卢定的方法
CN101475631B (zh) * 2009-01-08 2011-08-17 苏州中科天马肽工程中心有限公司 比伐卢定的液相合成方法
CN101555274B (zh) * 2009-05-15 2013-08-21 海南双成药业股份有限公司 一种多肽固相合成比法卢定粗品的制备方法
CN107001409A (zh) * 2014-09-26 2017-08-01 株式会社钟化 疏水性肽的制造方法
CN108383905A (zh) * 2016-12-30 2018-08-10 江苏金斯瑞生物科技有限公司 一种比伐卢定的制备方法

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EP1737889B1 (en) 2010-09-08
US7939629B2 (en) 2011-05-10
IL182698A (en) 2013-11-28

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