MX2011006950A

MX2011006950A - Proceso para la produccion de bivalirudina.

Info

Publication number: MX2011006950A
Application number: MX2011006950A
Authority: MX
Inventors: Geoffroy Sommen; Luciano Forni
Original assignee: Lonza Braine S A
Priority date: 2008-12-29
Filing date: 2009-12-17
Publication date: 2011-07-28
Also published as: CA2744627C; TWI453216B; EA201101015A1; CN103864894B; HK1162527A1; TWI538919B; IL213457A; DK2382232T3; TW201500378A; WO2010075983A8; US8921517B2; US20110251372A1; CO6400148A2; TW201024317A; JP5996618B2; CA2916716A1; EP2382232A1; WO2010075983A1; CN103864895A; TW201630927A

Abstract

La presente invención se relaciona con un proceso para la producción de bivalirudina, un péptido de 20-mer de la fórmula H-D- Phe1- Pro-Arg- Pro-Gly5 -Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10 -Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH (I) a través de una síntesis convergente de cinco fragmentos, y con varios intermedios de péptido de los mismos.

Description

PROCESO PARA LA PRODUCCIÓN DE BIVALIRUDINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una síntesis de bivalirudina convergente novedosa, que es un péptido de 20-mer de la fórmula H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15- -Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH (I) La invención se relaciona adicionalmente con varios péptidos protegidos como intermedios en la síntesis de bivalirudina .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El procesamiento proteolítico mediante trombina es fundamental en el control de coagulación de sangre. La hirudina, un inhibidor de péptido de trombina clínica potencial, consiste de 65 aminoácidos. Pero también segmentos de péptido más cortos han probado ser efectivos para el tratamiento de trombosis, una afección potencialmente mortal.

La US 5,196,404 describe, entre otros, bivalirudina, uno de estos péptidos más cortos, que son inhibidores de trombina potentes. La bivalirudina también se conoce como hirulog-8, BG-8967, Efludan, Angiomax1" o Hirulog11 y posee la secuencia de aminoácido dada en la fórmula I .

La WO 98/50563 describe un método para la preparación de varios péptidos, que incluyen bivalirudina, mediante tecnología recombinante . El método comprende expresar el péptido como parte de una proteína de fusión, seguido por la liberación del péptido de la proteína de fusión mediante un aceptor de acilo.

Okayama et al. Chem. Pharm. Bull. 1996, 44, 1344-1350, y Steinmetzer et al. Eur. J. Biochem. 1999, 265, 598-605, inventan una síntesis de fase sólida de hirulogos diferentes en resina Wang. La resina Wang requiere la división del péptido de la resina con ácido trifluoroacético concentrado. En un método de síntesis de fase sólida similar para la preparación de bivalirudina, la WO 91/02750 describe un método secuencial para unir aminoácidos protegidos Boc únicos con resina de BOC-L- leucina-o-divinilbenceno, seguido por desprotección simultánea y desprendimiento utilizando sulfato de HF/p-cresol/etil metilo y posterior liofilización y purificación. En ambos casos, la división del péptido de la resina requiere condiciones acídicas agresivas, que son probablemente la causa de la desprotección global concomitante y podría resultar en reacciones secundarias no deseadas con residuos de aminoácido, afectando así negativamente la pureza del producto. Más aún, las reacciones secundarias a menudo surgen en la síntesis de fase sólida mediante incorporación errónea, doble golpe de aminoácidos monocatenarios y/o racemización y llevan a productos secundarios que tienen una estructura muy similar a aquella del péptido objetivo. La purificación es por lo tanto difícil y resulta en pérdida de rendimiento. Especialmente los péptidos mayores son propensos a adoptar una conformación irregular mientras que aún se adhieren al soporte sólido, lo cual hace esto aún más difícil para adherir los aminoácidos adicionales a la cadena que crece. Por lo tanto, este problema aumenta en la medida en que aumenta la longitud del péptido .

La WO 2007/033383 describe un método para la producción de bivalirudina con base en una síntesis de fase sólida o una combinación de fase sólida y síntesis de solución (método mixto) . En una realización, la secuencia de péptido de bivalirudina se prepara cobre una resina de ácido hiper lábil. En otra realización, la bivalirudina se prepara al acoplar un fragmento de péptido de terminal N protegido de cadena lateral con un fragmento de péptido de terminal C protegido de cadena lateral y posterior desprotección utilizando condiciones fuertemente acídicas . En este caso, dichos fragmentos de terminal N y el precursor de dicho fragmento de terminal C (es decir secuencia de péptido menos Leu) se preparan ambos mediante síntesis de fase sólida. Una de las desventajas de esta estrategia es la formación sustancial de D-Tyr19-bivalirudina. Esta impureza es difícil de remover, requiriendo así esfuerzos extra, costos y pérdida de rendimiento para obtener el producto purificado. Adicionalmente, la cantidad de bivalirudina purificada obtenida en los ejemplos de la WO 2007/033383 está solo en el rango de gramos, lo que indica que este método no es adecuado para la producción de bivalirudina a gran escala con buena pureza.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención proporcionar una síntesis más eficiente de la bivalirudina que supere los inconvenientes conocidos de la síntesis de fase sólida, lineal y sea adecuada para la producción en una escala industrial. Este objeto se ha logrado por el proceso de acuerdo con la reivindicación 1, los fragmentos de péptido de la reivindicación 19 y el uso de estos fragmentos de péptido de acuerdo con la reivindicación 29. Las realizaciones preferidas constituyen la materia objeto de las reivindicaciones dependientes 2-18 y 20-28.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un proceso que sigue a un método convergente, es decir se sintetizan fragmentos individuales de forma separada y luego se acopla en la fase de solución para construir el péptido deseado. El reto de la síntesis convergente es encontrar los fragmentos adecuados y su acoplamiento con el fin de superar . los inconvenientes conocidos de la síntesis convergente. Estos inconvenientes son problemas de solubilidad durante el acoplamiento y el aislamiento, bajos índices de reacción comparados con la síntesis de fase sólida y un mucho mayor riesgo de racemización del fragmento de terminal C durante acoplamiento. La Bivalirudina consiste de veinte residuos de aminoácido de tal manera que existe un enorme número de posibles fragmentos y órdenes de acoplamiento. Adicionalmente, la bivalirudina contiene siete residuos de aminoácido, a saber -Arg3-, -Asn9-, -Asp11-, -Glu13-, -Glu14-, -Glu17- y -Glu18-, todos los cuales tienen funciones de cadena lateral reactivas que requieren protección y desprotección adecuados. Lo mismo aplica para la protección y desprotección adecuada del terminal N- y C de los fragmentos sencillos, incrementando así el reto de encontrar una ruta que logra el objeto de la presente invención.

El solicitante ha encontrado de forma sorprendente que la bivalirudina de la fórmula I se puede construir de forma ventajosa por la estrategia [(1 + 2) + (3 + {4 + 5})] como se define adelante. Los números 1, 2 y 5 representan los tres fragmentos de péptido de la fórmula V, VI y X, el número 3 representa el derivado de ácido aspártico de la fórmula XIII, y el número 4 representa el derivado de fenilalanina de la fórmula XI. La presente invención se relaciona con un proceso para la producción de bivalirudina de la fórmula I en la fase de solución que comprende las etapas de (a) hacer reaccionar un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) (V) , en donde Pl es un grupo protector, con un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 5) (VI) , en donde P2 es un grupo protector, para producir un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly1°-OP2 (SEQ ID NO 2) (VII) , en donde Pl y P2 son como se definieron anteriormente, (b) eliminar P2 del péptido producido en la etapa (a) para producir el péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-P e1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) (II) , en donde Pl es como se definió anteriormente, (c) ha cer reaccionar un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8) (X) , en donde P3 es un grupo protector, con una fenilalanina de la fórmula P4-Phe12-OH (XI) , en donde P4 es un grupo protector, para producir un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 9) (XII), en donde P3 y P4 son como se definieron anteriormente, (d) el iminar P4 del péptido producido en la etapa (c) para producir el péptido protegido de cadena lateral, desprotegido de terminal N correspondiente de la fórmula XII, (e) ha cer reaccionar el péptido de la fórmula XII producido en la etapa (d) con un ácido aspártico protegido de cadena lateral de la fórmula PS-Asp^-OH (XIII) , en donde P5 es un grupo protector, para producir un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (XIV) , en donde P3 y P5 son como se definieron anteriormente, (f ) eliminar P5 del péptido producido en la etapa (e) para producir el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (III) , en donde P3 es como se definió anteriormente, (g) hacer reaccionar el péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula II producido en la etapa (b) con el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula III producido en la etapa (f) para producir un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro--Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 1) (IV), en donde Pl y P3 son como se definieron anteriormente, (h) eliminar Pl, P3 y los grupos de protección de cadena lateral del péptido producido en la etapa (g) para producir la bivalirudina de la fórmula I.

El proceso de la presente invención permite una síntesis muy eficiente de bivalirudina a través de una síntesis de fragmento convergente, que se puede adaptar fácilmente a la producción en una escala industrial.

Los grupos de protección de terminal C P2 (para el péptido VI) y P3 (para el péptido X) pueden ser cualquier grupo protector que está en línea con la ortogonalidad de los otros grupos de protección. Ejemplos adecuados son grupos de protección de terminal C que se pueden eliminar mediante saponificación como metilo (Me) o etilo (Et) o grupos de protección de terminal C que se pueden eliminar mediante hidrogenación catalítica.

En una realización del proceso de la presente invención, en la etapa (a) , el grupo de protección Pl es un grupo protector que es estable a hidrogenación catalítica y el grupo de protección P2 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica y que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral opcionales; en la etapa (c) , el grupo de protección P3 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica y el grupo de protección P4 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral del péptido de la fórmula X y a P3 ; y en la etapa (e) , el grupo de protección P5 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral del péptido/aminoácido de la fórmula XII y XIII y un P3 , proporciona un proceso de fase en solución que comprende las etapas de (a) hacer reaccionar un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) (V) , en donde Pl es un grupo protector que es estable a hidrogenación catalítica, con un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 5) (VI) , en donde P2 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica y que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral opcionales, para producir un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 2) (VII) , en donde Pl y P2 son como se definieron anteriormente, (b) eliminar P2 del péptido producido en la etapa (a) para producir el péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) (II) , en donde Pl es como se definió anteriormente, (c) hacer reaccionar un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8) (X) , en donde P3 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica, con una fenilalanina de la fórmula P4-Phe12-OH (XI) , en donde P4 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral del péptido de la fórmula X y un P3 , para producir un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 9) (XII) , en donde P3 y P4 son como se definieron anteriormente, (d) eliminar P4 del péptido producido en la etapa (c) para producir el péptido protegido de cadena lateral, desprotegido de terminal N correspondiente de la fórmula XII, (e) hacer reaccionar el péptido de la fórmula XII producido en la etapa (d) con un ácido aspártico protegido de cadena lateral de la fórmula P5-Asp11-0H (XIII), en donde P5 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral del péptido/aminoácido de la fórmula XII y XIII y un P3 , para producir un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (XIV) , en donde P3 y P5 son como se definieron anteriormente, (f) eliminar P5 del péptido producido en la etapa (e) para producir el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (III) , en donde P3 es como se definió anteriormente, (g) hacer reaccionar el péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula II producido en la etapa (b) con el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula III producido en la etapa (f) para producir un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro--Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 1) (IV), en donde Pl y P3 son como se definieron anteriormente, (h) eliminar Pl, P3 y los grupos de protección de cadena lateral del péptido producido en la etapa (g) para producir la bivalirudina de la fórmula H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu- -Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH (SEQ ID NO 1) (I) .

Aquí y en lo siguiente, el término "ortogonal" como atributo que caracteriza el comportamiento de dos diferentes grupos de protección, se debe entender que un grupo de protección se puede dividir por un cierto método que no afecta el otro grupo de protección. Por ejemplo, "un grupo de protección que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral" significa un grupo de protección que puede ser divisible por un cierto método que no afecta los grupos de protección de cadena lateral.

La ventaja de esta estrategia es que se puede aplicar a una escala comercial, permitiendo así la producción de bivalirudina con excelente pureza y en una cantidad de kilogramos por tanda sin formación de impurezas desagradables como D-Phe12-bivalirudina, D-Tyr19-bivalirudina o Asp9-bivalirudina . Por ejemplo, al acoplar el fragmento protegido Asp-Phe12 al fragmento de péptido protegido de la fórmula X, se forma 5% de D-Phe1 -bivalirudina, la formación que se puede suprimir inesperadamente por el proceso de acuerdo con la invención. La hidrogenación catalítica cuando se aplica en el proceso de acuerdo con la invención tiene la ventaja que es un método de reacción muy limpio que, a diferencia de otros métodos de desprotección, no induce la formación de carbocatión, de tal manera que no se forman las subproductos indeseados que resultan de las reacciones entre tales carbocationes y el péptido objetivo. Para comparación, en la ruta descrita en la WO 2007/033383 la protección se logra al utilizar tere- butilo (tBu; como éter de tere- butilo o como éster de tere- butilo) , que es un grupo de protección que solo es divisible mediante acidólisis (por ejemplo con ácido clorhídrico o ácido trifluoroacético) . Esta acidólisis induce la formación de subproductos, tales como tirosina terc-butilada, que son difíciles de eliminar en el producto final debido a sus propiedades fisioquímicas similares. Otras desventajas de acidólisis es que el manejo de grandes cantidades de ácidos fuertes, tales como ácido trifluoroacético, plantea problemas de seguridad para la producción y medio ambiente, especialmente a una escala comercial.

Para comparación adicional, si un grupo de terminal C de protección que se puede eliminar mediante saponificación, tal como Et, se utiliza como P2 para los péptidos de la fórmula VI y VII, esta eliminación bajo condición básica induce la degradación sustancial del residuo asparagina (-Asn9-) y del residuo arginina (-Arg3-). Aún si la saponificación no se logra con ácido ni con base sino con el método más gentil de la reacción enzim tica, como la saponificación con la enzima subtilisina, se observa la formación sustancial de Asp9-bivalirudina originada por la degradación del residuo asparagina .

Antes, durante y después de las etapas de reacción sencillas de la presente invención, todos los fragmentos de péptido así como también todos los productos de acoplamiento pueden estar presentes tal como en una forma de sal adecuada, que depende de las propiedades fisicoquímicas de la molécula y/o las condiciones de reacción. Las sales adecuadas son por ejemplo las sales formadas con trietilamina (TEA), diciclohexilamina (DCHA) , ácido clorhídrico (HC1) y ácido trifluoroacético (TFA) .

En la etapa (h) , Pl, P3 y los grupos de protección de cadena lateral se pueden eliminar después o simultáneamente.

Preferiblemente, en la etapa (h) , primero el P3 y los grupos de protección de cadena lateral se eliminan simultáneamente, y el Pl se elimina después.

Típicamente, el fragmento de péptido obtenido después de cada una de las etapas (a) a (g) se aisla antes de someter a la siguiente etapa. El solicitante ha encontrado de manera sorprendente que en la etapa (h) el aislamiento del péptido, obtenido después de eliminación simultánea de P3 y los grupos de protección de cadena lateral, se pueden dispensar con eliminación anterior del Pl, mientras que se obtienen rendimientos similares y sin efecto negativo sobre la pureza. Esto es sorprendente, ya que normalmente una etapa de aislamiento es esencial para eliminar los productos laterales que también pueden reaccionar en la siguiente etapa de desprotección y así reducir a pureza del péptido objetivo. Este hallazgo tiene un efecto positivo sobre los costos y el tiempo para el proceso completo y típicamente resulta en un mayor rendimiento del péptido protegido Pl- ya que el asilamiento usualmente implica la pérdida del producto. Por lo tanto, en una realización más preferida del proceso de acuerdo con la invención, en la etapa (h) , el péptido obtenido después de eliminar simultáneamente el P3 y los grupos de protección de cadena lateral no se aisla antes de eliminar el Pl .

Cualquier grupo de protección comúnmente conocido que es estable a hidrogenación catalítica se puede utilizar como Pl . Ejemplos adecuados son tere- butoxicarbonilo (Boc) , 2- (bifenil-4-il) - prop-2-il -oxicarbonilo (Bpoc) , 2-(3,5-di-metoxi-fenil) prop-2-iloxicarbonilo (Ddz) , fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc) , adamantil-1- oxicarbonilo (Adc) , tere- amiloxi- carbonilo (Aoc) , difenilfosfinilo (Dpp) , 2- (metilsulfonil) etoxicarbonilo (Msc) y ftaloilo (Pht) . Preferiblemente, el Pl es Boc, Bpoc, Ddz, Fmoc o Msc, más preferiblemente el Pl es Boc.

Como grupos de protección se pueden utilizar el P4 y P5, cualquier grupo de protección comúnmente conocido y adecuado que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral (s) y un P3 del fragmento de la fórmula II (para P4) , respectivamente del aminoácido de la fórmula XIII y del fragmento de la fórmula XIV (para P5) . Preferiblemente, el P4 y P5 son estables a hidrogenación catalítica y ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral (s) y un P3. Por ejemplo, grupos de protección adecuados son Boc, Bpoc, Ddz, Fmoc, Adc, Aoc, Dpp, Msc y Pht. Preferiblemente, el P4 y/o P5 es Boc, Bpoc, Ddz, Fmoc o Msc; más preferiblemente P4 y/o P5 es Boc .

En una realización preferida del proceso de la presente invención, por lo menos uno de Pl, P4 y P5 es Boc, Bpoc, Ddz, Fmoc o Msc; preferiblemente por lo menos uno de Pl, P4 y P5 es Boc.

Como grupo de protección el P3 , se puede utiliza cualquier grupo de protección comúnmente conocido que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica. Ejemplos adecuados son bencilo (Bzl) , benciloximetilo (Bom) , fenacilo (Pac) , 4 -nitrobencilo (ONbz) , 4 -piridil-metilo (Pie) , y 4-sulfobencilo . Preferiblemente, P3 es Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie o 4 -sulfobencilo con la condición que, si P4 o P5 es Boc, Bpoc o Ddz, P3 no es Bom. Más preferiblemente P3 es Bzl.

El grupo de protección Bom es sensible a ácido y los grupos de protección Boc, Bpoc y Ddz son dividibles mediante ácido, es decir Bom no es ortogonal a Boc, Bpoc o Dzd. Este comportamiento excluye, aquí y en lo siguiente, el uso simultáneo de Bom y uno de los grupos de protección Boc, Bpoc o Dzd.

Como grupo de protección P2 , se puede utilizar cualquier grupo de protección comúnmente conocido que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica - y en caso de protección de cadena lateral, al mismo tiempo que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral. Ejemplos adecuados son Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie y 4 -sulfobencilo. Preferiblemente, P2 es Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie o 4-sulfobencilo; más preferiblemente P2 es Bzl.

En una realización preferida, por lo menos uno de P2 y P3 es Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie o 4 -sulfobencilo, con la condición que, si P4 o P5 es Boc, Bpoc o Ddz, P3 no es Bom. Preferiblemente por lo menos uno de P2 y P3 es Bzl.

En una realización más preferida, por lo menos uno de Pl, P4 y P5 es Boc, Bpoc, Ddz, Fmoc o Msc; y por o menos uno de P2 y P3 es Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie, o 4 -sulfobencilo, con la condición que, si P4 o P5 es Boc, Bpoc o Ddz, entonces P3 no es Bom.

Preferiblemente, por lo menos uno de Pl, P4 y P5 es Boc y por lo menos uno de P2 y P3 es Bzl.

Preferiblemente, en el proceso de acuerdo con la invención los péptidos protegidos de cadena lateral/aminoácidos de la fórmula III, IV, X, y XII-XIV se protegen con por lo menos un grupo de protección de cadena lateral seleccionado del grupo que consiste de Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie y 4 -sulfobencilo; con la condición que, si P4 o P5 es Boc, Bpoc o Ddz, ninguno del grupo de protección es Bom.

En particular, en el proceso de acuerdo con la invención los péptidos protegidos de cadena lateral/aminoácidos de la fórmula III, IV, X, y XII-XIV se protegen con por lo menos un Bzl como grupos de protección de cadena lateral.

Típicamente, el péptido de la fórmula V se protege de cadena lateral en el residuo arginina con un grupo de protección de cadena lateral adecuado, tal como nitro, con el fin de evitar reacciones secundarias no deseadas. Típicamente, el péptido de la fórmula VI se protege de cadena lateral en el residuo asparagina con un grupo de protección de cadena lateral adecuado, especialmentepara la protección del terminal N con Fmoc , con el fin de evitar reacciones secundarias no deseadas. Un ejemplo adecuado es tritilo (Trt) , especialmente en caso de protección de terminal N con Fmoc .

De forma sorprendente, el solicitante encuentra que la protección de cadena lateral se puede dispensar con los péptidos de la fórmula V y VI, lo cual facilita su ensamble y la desprotección del terminal C de su producto de acoplamiento, es decir del péptido de la fórmula VII. Este hallazgo permite ignorar la ortogonalidad entre el terminal C y la protección de cadena lateral, haciendo así la ruta más sencilla. Otra ventaja es que el material de partida no protegido correspondiente es más barato en la compra que el protegido, esto es importante especialmente para la producción a gran escala.

Preferiblemente, en el proceso de acuerdo con la invención, en la etapa (a) por lo menos uno de los péptidos opcionalmente protegidos de cadena laterales de la fórmula V y VI es no protegido de cadena lateral. En este caso ambos péptidos son no protegidos de cadena lateral, los péptidos resultantes de la fórmula VII y II en las etapas (a) y (b) también son cadenas laterales no protegidas .

Más preferiblemente, en el proceso de acuerdo con la invención, en la etapa (a) , ambos péptidos de la fórmula V y VI son no protegidos de cadena lateral; en la etapa (c) , el péptido de la fórmula X se protege con por lo menos un grupo de protección de cadena lateral seleccionado del grupo que consiste de Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie y 4 -sulfobencilo, preferiblemente Bzl, con la condición que, si P4 o P5 es Boc, Bpoc o Ddz , ninguno de los grupos de protección de cadena lateral es Bom; y en la etapa (e) , el derivado de ácido aspártico de la fórmula XIII se protege con un grupo de protección de cadena lateral seleccionado del grupo que consiste de Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie y 4-sulfobencilo, preferiblemente Bzl, con la condición que, si P4 o P5 es Boc, Bpoc o Ddz, ninguno de los grupos de protección de cadena lateral es Bom.

Aún más preferiblemente, en el proceso de acuerdo con la invención, en la etapa (a) , ambos péptidos de la fórmula V y VI son no protegidos de cadena lateral; y en ambas etapas (c) y (e) , el por lo menos un grupo de protección de cadena lateral es Bzl.

En una realización más preferida del proceso de acuerdo con la invención, en la etapa (c) el péptido de la fórmula X se protege de cadena lateral con cinco grupos de protección de cadena lateral que protegen las cadenas laterales de los cuatro ácidos glutámicos y de tirosina, proporcionando así el péptido de la fórmula H-Glu(0P6) -Glu(0P7) - Ile15-Pro-Glu (0P8 ) -Glu(OP9) -Tyr (PIO) - -Leu20-OP3 (SEQ ID 8) (Xb) , en donde P3 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica, preferiblemente P3 es Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie o 4 -sulfobencilo; más preferiblemente P3 es Bzl; y cada uno de P6 a PIO se selecciona independientemente del grupo que consiste de Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie y 4-sulfobencilo; preferiblemente cada uno de P6 a PIO es Bzl; y en la etapa (e) el ácido aspártico protegido de cadena lateral de la fórmula XIII es P5-Asp (OP11) xl-OH, en donde P5 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral del péptido/aminoácido de la fórmula XII y XIII y un P3 ; preferiblemente P5 es estable a hidrogenación catalítica y ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral y un P3 ; más preferiblemente P5 es Boc, Bpoc, Ddz , Fmoc o Msc; más preferiblemente P5 es Boc ; y Pll se selecciona del grupo que consiste de Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie y 4 -sulfobencilo ; preferiblemente Pll es Bzl.

Aquí y como sigue, para el terminal C y las cadenas laterales, la abreviatura "OP [número] " indica un éster (después de la reacción con un ácido carboxílico de la cadena lateral y el terminal C) , mientras ' que la abreviatura "P [número] " indica un éter. Por ejemplo, "OBzl" indica un éster de bencilo (después de la reacción con un grupo carboxi de la cadena lateral o el terminal C) , mientras que la abreviatura "Bzl" indica un éter de bencilo (después de la reacción con por ejemplo el grupo hidroxi fenólico de tirosina) .

Preferiblemente, en el proceso de acuerdo con la invención Pl, P4 y P5 son Boc; P2 , P3 , P6, P7 , P8 , P9, PIO y Pll son Bzl; Más preferiblemente, Pl, P4 y P5 son Boc, P2, P3 , P6 , P7, P8, P9, PIO y Pll son Bzl y los péptidos de la fórmula V y VI son no protegidos de cadena lateral, proporcionan un proceso de fase en solución que comprende las etapas de (a) hacer reaccionar Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) con H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID NO 5) para producir Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID NO 2) . (b) eliminar Bzl del péptido producido en la etapa (a) para producir Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-Gly^-OH (SEQ ID NO 2) , (c) hacer reaccionar H-Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Ile1 -Pro-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID 8) Con Boc-Phe12-OH para producir Boc-Phe-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) - lie15-Pro-Glu (OBzl ) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) - -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 9) , (d) eliminar Boc del péptido producido en la etapa (c) para producir el péptido desprotegido de terminal N correspondiente , (e) hacer reaccionar el péptido producido en la etapa (d) con Boc-Asp (OBzl) "-OH para producir Boc-Asp (OBzl) "-Phe-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) --Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3) (f) eliminar Boc del péptido producido en la etapa (e) para producir H-Asp (OBzl) "-Phe-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) -Ile15-Pro- Glu(OBzl) -Glu(OBzl) --Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3) (g) hacer reaccionar el péptido producido en la etapa (b) con el péptido producido en la etapa (f) (h) para producir Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OBzl) -Phe--Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 1) , y (i) eliminar Boc, el Bzl de protección de terminal C y todos los Bzl de protección de cadena lateral del péptido producido en la etapa (g) para producir la bivalirudina de la fórmula I .

Esta realización preferida es muy sencilla y no requiere una estrategia de grupo de protección complicada.

Preferiblemente, en la etapa (h) , primero el Bzl de protección de terminal C y todos los Bzl de protección de cadena lateral se eliminan simultáneamente, proporcionan bivalirudina N-terminal protegida con Boc.

Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu--Glu-Tyr-Leu20-OH (SEQ ID NO 1) , y El Boc se elimina después.

Preferiblemente, la bivalirudina protegida con Boc de terminal N obtenida después de eliminar simultáneamente el Bzl de protección de terminal C y todos los Bzl de protección de cadena lateral no se aisla antes de eliminar Boc.

Los grupos de protección de terminal C P2, P3 , así como también los grupos de protección de cadena lateral P6 a Pll, en el caso en el que ellos sean eliminables mediante hidrogenación catalítica, se pueden eliminar mediante cualquier método de hidrogenación catalítica conocido por la persona experta. La hidrogenación se puede lograr mediante hidrógeno elemental o mediante uso de un donante de hidrógeno adecuado como ácido fórmico, formato de amonio, 1,3-ciclohexadieno, 1, 4-ciclo-hexadieno o aductos de borano tales como tere- BuNH2 · BH3. Los catalizadores de hidrogenación adecuados son por ejemplo catalizadores de hidrogenación basados en metal noble, en particular los metales conocidos como metales de platino, es decir rodio, rutenio, paladio, osmio, iridio y platino. Convenientemente, el catalizador de hidrogenación está sobre un soporte tal como carbón. Dependiendo de la actividad requerida, el catalizador de hidrogenación puede ser "envenenado" para reducir su actividad, en particular sulfurado.

Opcionalmente , los co-catalizadores adecuados se pueden agregar para soportar la hidrogenación. Tales co-catalizadores pueden ser compuestos de vanadio o molibdeno como óxido de vanadio (V) (V205) , metavanadato de amonio (NH4VO3) o molibdato de sodio (Na2Mo04) .

En una realización preferida, el catalizador se recicla por tener un efecto positivo en los costos de producción y medio ambiente. Para el reciclaje del catalizador, se puede aplicar cualquier tratamiento adecuado para reciclar el catalizador .

Preferiblemente, por lo menos una de las etapas de eliminación (b) y (h) se lleva a cabo en un disolvente con gas de hidrógeno y paladio sobre carbón. Como disolvente, se puede utilizar cualquier disolvente líquido inerte que puede disolver los reactivos.

Los disolventes aplicables incluyen hidrocarburos aromáticos halogenados tales como clorobenceno y trifluorotolueno; hidrocarburos halogenados tales como diclorometano y dicloroeteno; alcoholes tales como metanol, etanol, 2 -propanol, butanol y bencil alcohol; los alcoholes halogenados tales como 2, 2, 2 -trifluoroetanol; ácidos carboxílicos tales como ácido acético; ésteres carboxílicos y lactonas tales como acetato de etilo, acetato de metilo y valerolactona; y disolventes orgánicos que contienen heteroátomos tales como N-metilpirrolidona (NMP) o N,N-dimetilformamida (DMF) . Los disolventes se pueden utilizar solos, como mezcla de disolvente o como mezcla con agua. Dependiendo de la solubilidad del fragmento de péptido, aún se puede utilizar agua pura. Por lo tanto, en la etapa (b) la eliminación se puede lograr en agua pura como disolvente.

Un disolvente preferido se selecciona del grupo que consiste de DMF, acetona, ácido acético, una mezcla de acetona y agua, y una mezcla de ácido acético y agua.

En una realización preferida, la etapa de eliminación (b) se lleva a cabo en un disolvente seleccionado del grupo que consiste de DMF, acetona, agua, y una mezcla de acetona y agua; particularmente en DMF.

Más preferiblemente, la etapa de eliminación (b) se lleva a cabo en DMF. De forma sorprendente, se encuentra que el disolvente utilizado en la etapa de eliminación (b) tiene una influencia en el perfil de impureza de la bivalirudina final. Se observa que el DMF se compara ventajosamente con por ejemplo una mezcla de acetona y agua de tal manera que se puede suprimir la impureza formada después de la doble incorporación de -D-Phe1- -Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10- (SEQ ID NO 2) .

En otra realización preferida, la etapa de eliminación (h) se lleva a cabo en ácido acético o una mezcla de ácido acético y agua; particularmente en una mezcla de ácido acético y agua.

Los procesos de hidrogenación de las etapas de eliminación (b) y (h) se pueden llevar a cabo a presión atmosférica o presión superatmosférica . Las presiones típicas son de 1 a 100 bar (1.02 kg/cm2 a 102 kg/cm2) . De forma ventajosa, se utilizan 1 a 70 bar (1.02 kg/cm2 a 71.4 kg/cm2); en particular 2 a 10 bar (2.04 kg/cm2 a 10.2 kg/cm2).

Las reacciones de hidrogenación de las etapas de eliminación (b) y (h) se pueden llevar a cabo a temperaturas bajas y elevadas. Un rango de temperatura de ejemplo es de -20° C a 70° C. Se prefiere una temperatura entre 0o C y 60° C, y se prefiere más un rango de 10° C a 40° C.

Las etapas de acoplamiento (a) , (c) , (e) y (g) del proceso de acuerdo con la invención se realizan en la fase de solución y se pueden llevar a cabo utilizando condiciones de reacciones conocidas en la técnica de síntesis de péptido. El acoplamiento de los fragmentos de péptido/derivados de aminoácido protegidos o no protegidos de cadena lateral respectivos se puede alcanzar utilizando reactivos de acoplamiento in situ, por ejemplo reactivos de acoplamiento de fosfonio o uronio, como hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris (dimetil-amino) -fosfonio (BOP) , hexafluorofosfato de benzotriazol -1-iloxi-tris (pirrolidino) -fosfonio (PyBOP) , hexafluorofosfato de 0- (benzotriazol-l-il) -1,1,3,3- tetra-metil-uronio (HBTU) , hexafluorofosfato de O- (6- clorobenzotriazol-l-il) -1, 1, 3, 3 -tetrametiluronio (HCTU) , O- (6-clorobenzotriazol-l-il) - 1 , 1 , 3 , 3 -tetrametiluronio tetrafluoroborato (TCTU) , hexafluorofosf to de O- (7-azabenzo--triazol-l-il) -1,1,3,3-tetra- metil-uronio (HATU) , tetrafluoroborato de O- (7-azabenzotriazol -1-il) -1, 1, 3, 3- tetrametiluronio (TATU), tetrafluoroborato de O- (benzotriazol-l-il) -1,1,3,3- tetrametiluronio (TBTU) , y tetra-fluoro-borato de O- [ciano- 3 O (etoxi-carbonil) -metilen- amino] -1 , 1 , 3 , 3 - tetrametiluronio (TOTU) , o reactivos de acoplamiento de carbodiimida, comp diisopropilcarbodiimida (DIC) , diciclohexilcarbodiimida (DCC) y carbodiimidas solubles en agua (WSCDI) como l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) -carbo-diimida (EDC) opcionalmente similar a sal de clorhidrato. Otras técnicas de acoplamiento utilizan ásteres activos pre- formados , tales como ésteres de N-hidroxisuccinimida (HOSu) y p-nitrofenol (HONp) , anhídridos simétricos pe-formados, anhídridos no simétricos tales como N-carboxianhídridos (NCAs) y haluros de ácido, tales como fluoruros de acilo o cloruros de acilo. Los reactivos de acoplamiento preferidos son reactivos de acoplamiento de, se prefieren más DIC o EDC, de forma adecuada como sal de EDC tal como EDC, HC1.

La mezcla de reacción de las etapas de acoplamiento (a) , (c) , (e) y (g) pueden de forma ventajosa contener una base, preferiblemente una base de amina terciaria, que desprotona al componente carboxi y neutraliza el contraión del componente amino, y así facilita la reacción in situ. Las bases adecuadas son por ejemplo trialquilaminas , como N,N -diisopropiletilamina (DIPEA) o trietilamina (TEA); N,N-di-alquil -anilinas, como N, N-dietilanilina; 2,4,6-trialquilpiridinas , como 2,4,6- trimetilpiridina; y N-alquilmorfolinas , como N-metil- morfolina. En particular, la mezcla de reacción de forma ventajosa contiene TEA o DIPEA como una base .

La mezcla de reacción de las etapas de acoplamiento (a) , (c) , (e) y (g) pueden contener adicionalmente nucleófilos auxiliares como aditivos debido a su efecto positivo en la supresión de reacciones secundarias no deseadas. Se puede aplicar cualquier nucleófilo auxiliar conocido. Ejemplos de nucleófilos auxiliares adecuados son 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), N-hidroxisuccinimida (HOSu) , N-hidroxi- 3,4-dihidro-4-oxo- 1 , 2 , 3-benzotriazina (HOOBt) y l-hidroxi-7- azabenzo-triazol (HOAt) . Preferiblemente, las mezclas de reacción de las etapas de acoplamiento adicionalmente contienen HOBt.

En una realización preferida, las mezcla de acoplamiento de las etapas de acoplamiento (a) , (c) , (e) y (g) se selecciona del grupo que consiste de DIC/HOBt/TEA, EDC/HOBt/DIPEA y EDC/HOBt/TEA.

Como disolvente de las etapas de acoplamiento (a) , (c) , (e) y (g) , se pueden utilizar cualquier disolvente líquido inerte que pueda disolver los reactivos. Los disolventes de acoplamiento aplicables son disolventes miscibles en agua como sulfóxido de dimetilo (DMSO) , dioxano, tetrahidrofurano (THF) , l-metil-2- pirrolidona ( MP) , N,N- dimetilformamida (DMF) , N,N- dimetilacetamida (DMA), o cualquier mezcla de los mismos; disolventes no miscibles en agua como diclorometano (DCM) , acetato de etilo o cualquier mezcla de los mismos; y cualquier mezcla adecuada entre disolventes miscibles en agua y no miscibles en agua, que incluyen mezclas con agua. Un disolvente preferido es DMF o una mezcla de DMF y agua.

La desprotección de terminal N de las etapas (d) , (f ) y (h) se pueden llevar a cabo utilizando condiciones de reacciones conocidas en la técnica de síntesis de péptido y depende de la naturaleza de los grupos de protección Pl, P4 y P5. En caso que el grupo de protección sea Boc, la desprotección se logra de forma adecuada mediante ácido, preferiblemente mediante ácido trifluoroacético, que se puede aplicar puro o como una mezcla con un disolvente inerte, como tolueno, THF o una mezcla de tolueno y THF. En caso que el grupo de protección sea Fmoc, la desprotección de terminal N se puede alcanzar mediante reacción con una base, favorablemente con una amina secundaria tal como piperidina o dietilamina. Típicamente, la desprotección de terminal N se lleva a cabo en un disolvente que puede ser cualquier disolvente que no interfiere con los reactivos similares a hidrocarburos clorinados tales como dicloro-metano ,· amidas alquilatadas y lactamas tales como dimetilformamida o 1-metil-2 -pirrolidona; hidrocarburos aromáticos tales como tolueno; éteres tales como THF o cualquier mezcla de los mismos. Preferiblemente, la desprotección del grupo Boc de terminal N se lleva a cabo en tolueno o en una mezcla de fenol, tolueno y THF .

La bivalirudina cruda obtenida después de la etapa (h) se puede purificar mediante métodos convencionales, como HPLC preparativo o distribución contracorriente. Se pueden repetir las etapas de purificaciones.

La muestra aplica a los fragmentos de péptido obtenidos después de las etapas (a) a (g) .

La bivalirudina final de la fórmula I se puede aislar de acuerdo con métodos de aislamiento conocidos en la química de péptido, tal como precipitación o secado por congelamiento que también se conoce como liofilización .

Los péptidos opcionalmente protegidos de cadena lateral de la fórmula V y VI y el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula X se pueden preparar utilizando métodos de síntesis de péptido convencionales, por ejemplo síntesis de fase en solución (sinónimo: síntesis de péptido de fase homogénea, abreviado como HPPS) , síntesis de péptido de fase sólida (SPPS) o una combinación de SPPS y síntesis mezclada denominada HPPS (sinónimo: síntesis de péptido de fase mezclado, abreviado como MPPS) .

En una realización del proceso de acuerdo con la presente invención, por lo menos uno de los péptidos seleccionados del grupo que consiste del péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula V, el péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula VI y el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula X se prepara mediante síntesis de fase en solución en un proceso precedente. Preferiblemente, estos péptidos se ensamblan partiendo los dipéptidos correspondientes, es decir los patrones de secuencia -D-Phe^Pro- , -Arg3-Pro-, -Gly5-Gly-, -Gly7-Gly-, -Asn9-Gly-, -Glu13-Glu-, -Ile15-Pro-, -Glu1 -Glu- o -Tyr19-Leu- . El terminal N, terminal C y grupos de protección de cadena lateral así como también las condiciones de reacción pueden ser cualesquiera conocidas por la persona experta, preferiblemente ser las mismas o similares como se describió anteriormente.

En particular, el proceso para la producción del péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) (V), preferiblemente del péptido Va no protegido de cadena lateral , en donde Pl es un grupo protector, preferiblemente Pl es un grupo protector que es estable a hidrogenación catalítica, más preferiblemente Pl es Boc, Bpoc, Ddz , Fmoc o Msc, más preferiblemente Pl es Boc; en fase en solución, comprende las etapas de (a) eliminar P12 de un dipéptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula P12-Arg-Pro4-OP13 (XVI), preferiblemente del dipéptido no protegido de cadena lateral XVIa, en donde P12 es un grupo protector, preferiblemente P12 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral y un P13, más preferiblemente P12 es un grupo protector que es estable a hidrogenación catalítica y ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral y un P13 , aún más preferiblemente P12 es Boc, Bpoc, Ddz, Fmoc o Msc, más preferiblemente P12 es Boc; y P13 es un grupo protector tal como Bzl, metilo (Me) o etilo (Et) ; preferiblemente P13 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica y ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral, más preferiblemente P13 es Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie, o 4-sulfobencilo, más preferiblemente P13 es Bzl; con la condición que, si P12 es Boc, Bpoc o Ddz, entonces P13 no es Bom; (b) hacer reaccionar el dipéptido opcionalmente protegido de cadena lateral, desprotegido de cadena terminal N, preferiblemente el dipéptido no protegido de cadena lateral, producido en la etapa (a) con un dipéptido opcionalraente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-OW (XVII) , preferiblemente con el dipéptido no protegido de cadena lateral XVIIa, en donde Pl es como se definió anteriormente, y W es hidrógeno o un grupo de pre- activación tal como penta-fluorofenilo (Pfp) , para producir un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-0P13 (SEQ ID NO 4) (XV) , preferiblemente el péptido no protegido de cadena lateral XVa, en donde Pl y P13 son como se definieron anteriormente, y (c) eliminar P13 del péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula XV, preferiblemente del péptido no protegido de cadena lateral XVa, producido en la etapa (b) para producir el péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula V; preferiblemente el péptido Va no protegido de cadena lateral .

También en particular, el proceso para la producción del péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 5) (VI) , preferiblemente del péptido no protegido de cadena lateral Vía, en donde P2 es un grupo protector, preferiblemente P2 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica y que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral opcionales, más preferiblemente P2 es Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie, o 4-sulfobencilo, más preferiblemente P2 es Bzl, en fase en solución, comprende las etapas de (a) eliminar P14 de un dipéptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula P14-Asn-Gly10-OP2 (XVIII), preferiblemente del dipéptido no protegido de cadena lateral XVIIIa, en donde P14 es un grupo protector, preferiblemente P14 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral y un P2 , más preferiblemente P14 es un grupo protector que es estable a hidrogenación catalítica y ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral y un P2 , aún más preferiblemente P14 es Boc, Bpoc, Ddz, Fmoc o Msc, más preferiblemente P14 es Boc; y P2 es como se definió anteriormente; con la condición que, si P14 es Boc, Bpoc o Ddz , entonces P2 no es Bom; (b) hacer reaccionar el dipéptido opcionalmente protegido de cadena lateral, desprotegido de cadena terminal N, preferiblemente el dipéptido no protegido de cadena lateral, producido en la etapa (a) con tetraglicina de la fórmula P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH (SEQ ID NO 10) (IXX) , en donde P15 es un grupo protector, preferiblemente P15 es un grupo protector que es ortogonal a la cadena lateral grupo de protección del péptido de la fórmula XX, más preferiblemente P15 es un grupo protector que es estable a hidrogenación catalítica y ortogonal a la cadena lateral grupo de protección del péptido de la fórmula XX, aún más preferiblemente P15 es Boc, Bpoc, Ddz, Fmoc o Msc, más preferiblemente P15 es Boc; para producir un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 5) (XX) , preferiblemente el péptido no protegido de cadena lateral XXa, en donde P2 y P15 son como se definieron anteriormente, con la condición que, si P15 es Boc, Bpoc o Ddz, entonces P2 no es Bom y (c) eliminar P15 del péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula XX, preferiblemente del péptido no protegido de cadena lateral XXa, producido en la etapa (b) para producir el péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula VI; preferiblemente el péptido no protegido de cadena lateral Vía.

Adicionalmente, en particular, el proceso para la producción del péptido protegido de cadena lateral de la fórmula H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8) (X) , preferiblemente del péptido de la fórmula H-Glu(0P6) -Glu(0P7) -Ile15-Pro-Gl (0P8 ) -Glu(0P9) -Tyr (PIO) -Leu20-OP3 (SEQ ID 8) (Xb) , en donde P3 es un grupo protector, preferiblemente P3 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica, más preferiblemente P3 es Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie o 4 -sulfobencilo, más preferiblemente P3 es Bzl, y cada uno de P6 a PIO se selecciona independientemente 4 O del grupo que consiste de Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie y 4-sulfobencilo, preferiblemente cada uno de P6 a PIO es Bzl, en fase en solución, comprende las etapas de (a) eli minar P16 de un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula P16-Glu-Glu-Ty-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 6) (VIII), preferiblemente del péptido de la fórmula P16 -Glu (0P8 ) -Glu (0P9) -Tyr (PIO ) -Leu20-OP3 (SEQ ID NO 6) (VlIIb) , en donde P3 y P8 a PIO son como se definieron anteriormente, y P16 es un grupo protector, preferiblemente P16 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral y un P3 , más preferiblemente P16 es un grupo protector que es estable a hidrogenación catalítica y ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral y un P3 , aún más preferiblemente P16 es Boc, Bpoc, Ddz, Fmoc o Msc, más preferiblemente P16 es Boc,- con la condición que, si P16 es Boc, Bpoc o Ddz, entonces P3 no es Bom; (b) hacer reaccionar el péptido protegido de cadena lateral , desprotegido de terminal N de la fórmula VIII, preferiblemente el péptido correspondiente VlIIb, producido en la etapa (a) con un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula P17-Glu-Glu-Ile15-Pro-OH (SEQ ID NO 7) (IX) , preferiblemente de P17-Glu(OP6) -Glu(0P7) -Ile15-Pro-OH (SEQ ID NO 7) (IXb) , en donde P6 y P7 son como se definieron anteriormente, y P17 es un grupo protector, preferiblemente P17 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral, más preferiblemente P17 es un grupo protector que es estable a hidrogenación catalítica y ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral, aún más preferiblemente P17 es Boc, Bpoc, Ddz , Fmoc o Msc, más preferiblemente P17 es Boc, para producir un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula P17-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8) (XXI) , preferiblemente del péptido de la fórmula P17-Glu(OP6) -Glu(OP7) -Ile15-Pro-Glu (OP8 ) -Glu(OP9) - Tyr (PIO) -Leu20-OP3 (SEQ ID 8) (XXIb) , en donde P3 , P6 a PIO y P17 son como se definieron anteriormente con la condición que, si P17 es Boc, Bpoc o Ddz, entonces P3 o uno cualquiera de P6 a PIO no es Bom, y (c) eliminar P17 del péptido protegido de cadena lateral de la fórmula XXI, preferiblemente del péptido correspondiente XXIb, producido en la etapa (b) para producir el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula X; preferiblemente el péptido Xb.

En una realización adicional del proceso de acuerdo con la presente invención, por lo menos uno de los péptidos seleccionados del grupo que consiste del péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula V, el péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula VI y el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula X se prepara mediante síntesis de fase sólida en un proceso precedente. Por lo cual, se puede emplear cualquier método SPPS comúnmente conocido, que incluye elementos fundamentales SPPS y condiciones SPPS. Se pueden aplicar todas las resinas que son conocidas por el experto en la técnica y que permiten la preparación de péptidos protegidos. Aquí, las resinas se han de interpretar de manera amplia. Por lo tanto, el término "resina" se debe entender que significa por ejemplo un soporte sólido solo o un soporte sólido directamente ligado a un ligador, opcionalmente con una manija en el medio. La resina puede ser insoluble o soluble. El polímero de polietilenglicol soluble (polímero PEG soluble) es un ejemplo para el soporte sólido de una resina soluble formando así una resina de péptido soluble después de ensamble de los únicos elementos fundamentales. Las resinas preferidas son resinas basadas en poliestireno con tritilo o bromobenzhidrilo . Ejemplos para resinas de tritilo son resina de cloruro de 2-clorotritilo (resina CTC) , resina de cloruro de tritilo, resina de cloruro de 4 -metiltritilo y resina de cloruro de 4 -metoxitritilo . Preferiblemente, la resina CTC se aplica para la síntesis de dichos fragmentos de péptido.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar péptidos que son útiles como intermedios en el proceso de la invención. En particular, uno de estos péptidos es un péptido seleccionado del grupo que consiste de (i) un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) (V), en donde Pl es un grupo protector, preferiblemente Pl es un grupo protector que es estable a hidrogenación catalítica, más preferiblemente Pl es Boc, Bpoc, Ddz , Fmoc o Msc, más preferiblemente Pl es Boc; y dicho péptido es opcionalmente protegido de cadena lateral en el residuo arginina con un grupo de protección de cadena lateral adecuado tal como nitro; (ii) un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 5) (VI) , en donde P2 es un grupo protector, preferiblemente P2 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenacion catalítica y que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral opcionales, más preferiblemente P2 es Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie, o 4-sulfobencilo, más preferiblemente P2 es Bzl; y dicho péptido es opcionalmente protegido de cadena lateral en el residuo asparagina con un grupo de protección de cadena lateral adecuado tal como tritilo (Trt) ; (iii) un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 2) (VII) , en donde Pl, P2 y los grupos de protección de cadena lateral opcionales, así como también los significados preferidos de Pl, de P2 y de los grupos de protección de cadena lateral opcionales, son como se definieron anteriormente; (iv) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) (lia) , en donde Pl y los grupos de protección de cadena lateral, así como también los significados preferidos de Pl y de los grupos de protección de cadena lateral opcionales, son como se definieron anteriormente, excepto para Boc-D-Phe1-Pro-Arg (Pbf ) -Pro-Gly5-Gly-Gly- Gly-Asn (Trt) -Gly10-OH con Pbf que es pentametildihidro-benzo-furan- sulfonilo y Trt que es tritilo. Este péptido se describe en la WO 2007/033383 como el producto de una síntesis de fase sólida sobre resina CTC. En contraste, el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula lia de acuerdo con la presente invención se forma mediante una forma diferente, a saber mediante síntesis de fase en solución; (v) un péptido no protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) (Ilb) , en donde Pl, así como también los significados preferidos de Pl, son como se definieron anteriormente; (vi) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8) (X) , en donde P3 es un grupo protector, preferiblemente P3 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica, más preferiblemente P3 es Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie, o 4-sulfobencilo, más preferiblemente P3 es Bzl; y los grupos de protección de cadena lateral es/son por lo menos un grupo (s) de protección de cadena lateral adecuado (s), preferiblemente seleccionados del grupo que consiste de Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie, y 4-sulfobencilo, más preferiblemente Bzl; (vii) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 9) (XII), en donde P3 y los grupos de protección de cadena lateral, así como también los significados preferidos de P3 y de los grupos de protección de cadena lateral opcionales, son como se definieron anteriormente; y P4 es un grupo protector, preferiblemente P4 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral del péptido de la fórmula X y un P3 , más preferiblemente P4 es Boc, Bpoc, Ddz, Fmoc o Msc, más preferiblemente P4 es Boc, con la condición que, si P4 es Boc, Bpoc o Ddz, luego P3 no es Bom; o P4 es hidrógeno; (viii) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (XIV) , en donde P3 y los grupos de protección de cadena lateral, así como también los significados preferidos de P3 y de los grupos de protección de cadena lateral, son como se definieron anteriormente; y P5 es un grupo protector, preferiblemente P5 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral del péptido/aminoácido de la fórmula XII y XIII y un P3 , más preferiblemente P5 es Boc, Bpoc, Ddz , Fmoc o Msc, más preferiblemente P5 es Boc, con la condición que, si P5 es Boc, Bpoc o Ddz, entonces P3 no es Bom, excepto para Fmoc-As (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile15-Pro-Glu (OtBu) --Glu(OtBu) -Tyr (tBu) -Leu20-OtBu con tBu que es tere- butilo. Este péptido se describe en la WO 2007/033383 como el producto de la reacción entre un péptido precursor (es decir secuencia de péptido menos Leu) y H-Leu-OtBu. El péptido precursor como se describe en la WO 2007/033383 se ha formado en una etapa precedente mediante síntesis de fase sólida sobre la resina CTC. Después de la reacción con H-Leu-OtBu, el péptido descrito no se aisla antes de continuar con la siguiente etapa. En contraste, el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula XIV de acuerdo con la presente invención se forma mediante un modo diferente, a saber mediante síntesis de fase en solución, yse aisla después de su formación; (ix) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (III) , en donde P3 y los grupos de protección de cadena lateral, así como también los significados preferidos de P3 y de los grupos de protección de cadena lateral, son como se definieron anteriormente, excepto para H-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) - Ile15-Pro-Glu (OtBu) --Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu20-OtBu. Este péptido se describe en la WO 2007/033383. es es e péptido desprotegido de terminal N descrito anteriormente. De acuerdo con lo anterior, como se explicó anteriormente, su modo de formación es diferente al del péptido protegido de cadena lateral de la fórmula III de acuerdo con la presente invención; y (x) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe- Glu-Glu-Ile15-Pro--Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 1) (IV), en donde Pl, P3 y los grupos de protección de cadena lateral, así como también los significados preferidos de Pl, de P3 y de los grupos de protección de cadena lateral opcionales, son como se definieron anteriormente, excepto para Boc-D-Phe1-Pro-Arg (Pbf ) -Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt) -Gly10- -Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu(OtBu) -Ile15-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr ( tBu) - -Leu20-OtBu. Este péptido se describe en la WO 2007/033383 como producto después de acoplamiento de Boc-D-Phe1-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt) -Gly10-OH y H-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) - Ile15-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) - -Leu20-OtBu, ambos de los cuales se explicaron anteriormente. De acuerdo con lo anterior, la forma hacia su producto de acoplamiento es diferente de la forma hacia el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula IV de acuerdo con la presente invención.

En una realización preferida, el péptido de la fórmula V es no protegido de cadena lateral y es de la fórmula Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) , que comprende la secuencia de posición 1-4 de aminoácido de la bivalirudina .

En otra realización preferida, el péptido de la fórmula VI es no protegido de cadena lateral y es de la fórmula H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID NO 5) , que comprende la secuencia de posición 5-10 de aminoácido de bivalirudina .

En otra realización preferida, el péptido de la fórmula VII es no protegido de cadena lateral y es de la fórmula Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID NO 2) , que comprende la secuencia de posición 1-10 de aminoácido de bivalirudina.

En otra realización preferida, el péptido no protegido de cadena lateral de la fórmula Ilb is Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) , que comprende la secuencia de posición 1-10 de aminoácido de bivalirudina.

En otra realización preferida, el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula X es H-Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 8), que comprende la secuencia de posición 13-20 de aminoácido de bivalirudina.

En otra realización preferida, el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula XII es Boc-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) - Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 9) , o H-Phe-Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 9), los cuales comprenden la secuencia de posición 12-20 de aminoácido de bivalirudina .

En otra realización preferida, el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula XIV es Boc-As (OBzl) -Phe-Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Ilels-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) --Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3), que comprende la secuencia de posición 11-20 de aminoácido de bivalirudina.

En otra realización preferida, el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula III es H-Asp(OBzl) -Phe-Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) --Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3), que comprende la secuencia de posición 11-20 de aminoácido de bivalirudina.

En otra realización preferida, el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula IV es Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OBzl) -Phe-Glu(OBzl) --Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 1), que comprende la secuencia de posición 1-20 de aminoácido de bivalirudina.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de un péptido seleccionado del grupo que consiste de (i) un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) (V), en donde Pl es un grupo protector, preferiblemente Pl es un grupo protector que es estable a hidrogenación catalítica, más preferiblemente Pl es Boc, Bpoc, Ddz, Fmoc o Msc, más preferiblemente Pl es Boc; y dicho péptido es opcionalmente protegido de cadena lateral en el residuo arginina con un grupo de protección de cadena lateral adecuado tal como nitro; preferiblemente, el péptido V es no protegido de cadena lateral y es de la fórmula Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) ; (ii) un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 5) (VI) , en donde P2 es un grupo protector, preferiblemente P2 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica y que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral opcionales, más preferiblemente P2 es Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie, o 4-sulfobencilo, más preferiblemente P2 es Bzl; y dicho péptido es opcionalmente protegido de cadena lateral en el residuo asparagina con un grupo de protección de cadena lateral adecuado tal como tritilo (Trt) ; preferiblemente, el péptido VI es no protegido de cadena lateral y es de la fórmula H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID NO 5) ; (iii) un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 2) (VII) , en donde Pl, P2 y los grupos de protección de cadena lateral opcionales, así como también los significados preferidos de Pl, de P2 y de los grupos de protección de cadena lateral opcionales, son como se definieron anteriormente; preferiblemente, el péptido VII es no protegido de cadena lateral y es de la fórmula Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID NO 2) ; (iv) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) (Ha) , en donde Pl y los grupos de protección de cadena lateral, así como también los significados preferidos de Pl y de los grupos de protección de cadena lateral opcionales, son como se definieron anteriormente, excepto para Boc-D-Phe1-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly10-OH con Pbf que es pentametildihidro-benzo-furan-sulfonilo y Trt que es tritilo. Este péptido se describe en la O 2007/033383 como el producto de una síntesis de fase sólida sobre la resina CTC. En contraste, el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula lia de acuerdo con la presente invención se forma mediante un modo diferente, a saber mediante síntesis de fase en solución; (v) un péptido no protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-Gly^-OH (SEQ ID NO 2) (Ilb) , en donde Pl, así como también los significados preferidos de Pl, son como se definieron anteriormente; preferiblemente, el péptido no protegido de cadena lateral de la fórmula Ilb es Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) ; (vi) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8) (X) , en donde P3 es un grupo protector, preferiblemente P3 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica, más preferiblemente P3 es Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie, o 4 -sulfobencilo, más preferiblemente P3 es Bzl; y los grupos de protección de cadena lateral es/son preferiblemente seleccionados del grupo que consiste de Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie, y 4 -sulfobencilo, más preferiblemente Bzl; preferiblemente, el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula X es H-Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 8) ; (vii) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 9) (XII), en donde P3 y los grupos de protección de cadena lateral, así como también los significados preferidos de P3 y de los grupos de protección de cadena lateral opcionales, son como se definieron anteriormente; y P4 es un grupo protector, preferiblemente P4 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral del péptido de la fórmula X y un P3 , más preferiblemente P4 es Boc, Bpoc, Ddz, Fmoc o sc, más preferiblemente P4 es Boc, con la condición que, si P4 es Boc, Bpoc o Ddz, luego P3 no es Bom; o P4 es hidrógeno; preferiblemente, el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula XII es Boc-Phe-Glu(OBzl) -Glu(OBzl) - Ile15-Pro-Glu (OBzl) - Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 9) , o H-Phe-Gl (OBzl) -Glu(OBzl) - lie15-Pro-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 9); (viii) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (XIV) , en donde P3 y los grupos de protección de cadena lateral, así como también los significados preferidos de P3 y de los grupos de protección de cadena lateral, son como se definieron anteriormente; y P5 es un grupo protector, preferiblemente P5 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral del péptido/aminoácido de la fórmula XII y XIII y un P3 , más preferiblemente P5 es Boc, Bpoc, Ddz, Fmoc o Msc, más preferiblemente P5 es Boc, con la condición que, si P5 es Boc, Bpoc o Ddz, entonces P3 no es Bom, Excepto para Fmoc-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile15-Pro-Glu(OtBu) --Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu20-OtBu con tBu que es tere- butilo. Este péptido se describe en la WO 2007/033383 como el producto de la reacción entre un péptido precursor (es decir secuencia de péptido menos Leu) y H-Leu-OtBu. El péptido precursor como se describe en la WO 2007/033383 se ha formado en una etapa precedente mediante síntesis de fase sólida sobre la resina CTC. Después de la reacción con H-Leu-OtBu, el péptido descrito no se aisla antes de continuar con la siguiente etapa. En contraste, el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula XIV de acuerdo con la presente invención se forma mediante un modo diferente, a saber mediante síntesis de fase en solución, y se aisla después de su formación; preferiblemente, el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula XIV es Boc-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro- Glu(OBzl) -Glu(OBzl) --Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3); (ix) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (III) , en donde P3 y los grupos de protección de cadena lateral, así como también los significados preferidos de P3 y de los grupos de protección de cadena lateral, son como se definieron anteriormente, excepto para H-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile15-Pro-Glu (OtBu) - -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu20-OtBu . Este péptido se describe en la WO 2007/033383. Este es el péptido desprotegido de terminal N descrito anteriormente. De acuerdo con lo anterior, como se explicó anteriormente, su modo de formación es diferente al del péptido protegido de cadena lateral de la fórmula III de acuerdo con la presente invención; preferiblemente, el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula III es H-Asp(OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) - lie15-Pro-Glu (OBzl ) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) --Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3); y (x) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro--Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 1) (IV), en donde Pl , P3 y los grupos de protección de cadena lateral, así como también los significados preferidos de Pl, de P3 y de los grupos de protección de cadena lateral opcionales, son como se definieron anteriormente, excepto para Boc-D-Phe1-Pro-Arg (Pbf ) -Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt) -Gly10- -Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu(OtBu) -Ile15-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) - -Leu20-OtBu . Este péptido se describe en la WO 2007/033383 como producto después de acoplamiento de Boc-D-Phe1-Pro- -Arg (Pbf ) -Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly10-OH y H-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile15-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) - -Leu20-OtBu, ambos de los cuales se explicaron anteriormente. De acuerdo con lo anterior, la forma hacia su producto de acoplamiento es diferente de la forma hacia el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula IV de acuerdo con la presente invención; preferiblemente, el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula IV es Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10- Asp(OBzl) -Phe--Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) - Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 1) ; como intermedio en una síntesis de bivalirudina de la fórmula H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu--Glu-Tyr-Leu20-OH (SEQ ID NO 1) (I) .

La presente invención también se relaciona con un proceso para la producción de bivalirudina de la fórmula I que comprende las etapas de (a) hacer reaccionar un péptido de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) (lie) , en donde Pl es un grupo protector, con un péptido de la fórmula H-Asp(OPll) -Phe-Glu(0P6) -Glu(0P7) - Ile15-Pro-Glu (0P8 ) -Glu(0P9) - -Tyr (PIO) -Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (lile), en donde P3 y cada uno de P6 a Pll son Bzl, para producir un péptido de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10- Asp(OPll) -Phe-Glu(0P6) --Glu(0P7) - lie15-Pro-Glu (0P8 ) -Glu(0P9) - Tyr (PIO) -Leu20-OP3 (SEQ ID NO 1) (IVc), en donde Pl, P3 y P6 a Pll son como se definieron anteriormente ; (b) eliminar la cadena lateral y grupos de protección de terminal C P3 y P6 a Pll del péptido producido en la etapa (a); y (c) eliminar el grupo de protección de terminal N Pl del péptido producido en la etapa (b) para producir la bivalirudina de la fórmula I.

El proceso de la presente invención permite una síntesis muy eficiente de bivalirudina a través de una síntesis de fragmento convergente, que se puede adaptar fácilmente a la producción en una escala industrial. Adicionalmente, esta ruta para la preparación de bivalirudina es muy sencilla y no requiere el uso de una estrategia de grupo de protección complicada. Adicionalmente, los varios elementos f ndamentales (fragmentos) se escogen para evitar o minimizar la racemización durante el ensamble.

Antes, durante y después de las reacciones de la presente invención, todos los fragmentos así como también todos los productos de acoplamiento pueden estar presentes como tales o pueden estar presentes en una forma de sal adecuada dependiendo de las propiedades físico- química de la molécula y/o las condiciones de reacción. Los contraiones adecuados son por ejemplo las formas de sal de la trietilamina (TEA) , diciclohexilamina (DCHA) , ácido clorhídrico (HC1) y ácido trifluoroacético (TFA) .

Como grupo de protección Pl, se puede utilizar cualquier grupo protector que es estable a hidrogenación catalítica tal como tere- butoxicarbonilo (Boc) , fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc) , 2 - (3 , 5-di-metoxi-fenil) prop-2-iloxicarbonilo (Ddz) , adamantil- 1-oxicarbonilo (Adc) , tere- amiloxicarbonilo (Aoc) , difenilfosfinilo (Dpp) , 2-(metil- sulfonil) -etoxi-carbonilo (Msc) y ftaloilo (Pht) . Preferiblemente, el grupo de protección Pl es Boc, Fmoc o Ddz .

Preferiblemente, los grupos de protección P3 y P6 a Pll son bencilo (Bzl) . Aquí y como sigue, la abreviatura "OBzl" indica un éster de bencilo (después de la reacción con un ácido carboxílico ambos de la cadena lateral y el terminal C) , mientras que la abreviatura "Bzl" indica un éter de bencilo (después de la reacción con por ejemplo el grupo hidroxi fenólico de tirosina) .

Las etapas (a) a (c) se pueden llevar a cabo utilizando condiciones estándar de reacciones conocidas en la técnica de síntesis de péptido.

Las etapas de acoplamiento y la desprotección (a) , (b) , y (c) se realizan preferiblemente en solución.

Para la etapa de acoplamiento (a) , DMF se utiliza preferiblemente como disolvente. La primera etapa de desprotección (b) se realiza preferiblemente en ácido acético y/o agua, mientras que la segunda etapa de desprotección (c) se lleva a cabo preferiblemente en tolueno.

En una realización preferida, la etapa de acoplamiento (a) se logra con una combinación de HOBt, EDC · HC1, y TEA.

En una realización preferida, la primera etapa de desprotección (b) se lleva a cabo con gas de hidrógeno y paladio sobre carbón.

En una realización preferida, la segunda etapa de desprotección (c) se lleva a cabo con TFA.

El producto crudo obtenido después de la etapa (c) se pueden purificar mediante métodos convencionales, por ejemplo con HPLC preparativo, distribución contracorriente o equivalente. La muestra aplica a los intermedios obtenidos después de las ' etapas (a) y (b) , si se requiere la purificación .

Se pueden preparar los fragmentos de péptido protegidos lie y lile utilizando métodos de síntesis de péptido convencionales, por ejemplo síntesis de fase en solución (HPPS) o síntesis de fase sólida (SPPS) . En caso del SPPS, se pueden aplicar todas las resinas que se conocen por la persona experta en la técnica y que permiten la preparación de péptidos protegidos. Aquí, las resinas se han de interpretar de manera amplia. Por lo tanto, el término "resina" se debe entender que significa por ejemplo un soporte sólido solo o un soporte sólido directamente ligado a un ligador, opcionalmente con una manija en el medio. La resina puede ser insoluble o soluble. El polímero de polietilenglicol soluble es un ejemplo para el soporte sólido de una resina soluble. Las resinas preferidas son resinas basadas en poliestireno con tritilo o bromobenzhidrilo . Ejemplos para resinas de tritilo son resina de cloruro de 2-clorotritilo (resina CTC) , resina de cloruro de tritilo, resina de cloruro de 4 -metiltritilo y resina de cloruro de 4-metoxitritilo . Preferiblemente, la resina CTC se aplica para la síntesis de fragmentos que contienen una función carboxílica libre.

En una realización preferida, los fragmentos protegidos de péptido IIc y lile se preparan utilizando síntesis de fase en solución.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar péptidos protegidos que son útiles como intermedios en el proceso de la invención. En particular, uno de estos péptidos es un péptido protegido de la fórmula IVc, en donde Pl es un grupo protector; preferiblemente Pl es Boc ; o H; y P3 y P6 a Pll son Bzl.

Otro péptido, que es particularmente útil como un intermedio en el proceso de la invención, es un péptido protegido de terminal N de la fórmula lie, en donde Pl es un grupo protector, preferiblemente Pl es Boc.

En un aspecto adicional, la presente invención también se relaciona con un proceso para la producción de un péptido protegido de terminal N de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) (IIc) , en donde Pl es Boc, que comprende : (a) eliminar el terminal C grupo de protección de un péptido de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-0P13 (SEQ ID NO 4) (Ve) , en donde Pl es Boc y P13 es un grupo protector tal como Bzl, metilo (Me) y etilo (Et) ; preferiblemente P13 es Bzl; para producir un péptido no protegido de terminal C, protegido de terminal N de la fórmula Ve con P13 que es H; (b) eliminar el grupo de protección de terminal N de un péptido de la fórmula P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID NO 5) (VIc) , en donde P15 es Boc, para producir un péptido no protegido de terminal N, protegido de terminal C de la fórmula VIc con P15 que es H; (c) hacer reaccionar el péptido de la fórmula Ve producido en la etapa (a) , en donde P13 es H, con el péptido de la fórmula VIc producido en la etapa (b) , en donde P15 es H, para producir un péptido de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID NO 2) (VIIc) , en donde Pl es Boc; y (d) eliminar el terminal C grupo de protección del péptido producido en la etapa (c) para producir el péptido protegido de terminal N de la fórmula IIc.

Las etapas (a) a (d) se pueden llevar a cabo utilizando condiciones estándar de reacciones conocidas en la técnica de síntesis de péptido.

Las etapas de acoplamiento y la desprotección (a) , (b) , (c) , y (d) se realizan preferiblemente en solución.

Para la etapa de acoplamiento (c) , DMF se utiliza preferiblemente como disolvente. La primera etapa de desprotección (a) se realiza preferiblemente en acetona, mientras que la segunda etapa de desprotección (b) se lleva a cabo preferiblemente en tolueno y/o THF. La tercera etapa de desprotección (d) se realiza preferiblemente en un disolvente seleccionado del grupo que consiste de DMF, acetona, agua y una mezcla de acetona y agua.

En una realización preferida, la primera etapa de desprotección (a) se lleva a cabo con gas de hidrógeno y paladio sobre carbón.

En una realización preferida, la segunda etapa de desprotección (b) se lleva a cabo con TFA.

En una realización preferida, la etapa de acoplamiento (c) se logra con una combinación de HOBt, DIC y TEA.

En una realización preferida, la tercera etapa de desprotección (d) se lleva a cabo con gas de hidrógeno y paladio sobre carbón.

El producto crudo obtenido después de la etapa (d) se puede purificar mediante métodos convencionales, por ejemplo con HPLC preparativo, distribución contracorriente o equivalente. La muestra aplica a los intermedios obtenidos después de las etapas (a) , (b) y (c) , si se requiere purificación.

Los fragmentos protegidos de péptido Ve y VIc se pueden preparar utilizando métodos de síntesis de péptido convencionales, por ejemplo síntesis de fase en solución (HPPS) o síntesis de fase sólida (SPPS) . En caso del SPPS, se pueden aplicar todas las resinas que son conocidas por la persona experta en la técnica y que permiten la preparación de péptidos protegidos. Aquí, las resinas se han de interpretar de manera amplia. Por lo tanto, el término "resina" se debe entender que significa por ejemplo un soporte sólido solo o un soporte sólido directamente ligado a un ligador, opcionalmente con una manija en el medio. La resina puede ser insoluble o soluble. El polímero de polietilenglicol soluble es un ejemplo para el soporte sólido de una resina soluble, llevando así a una resina de péptido soluble conjugada. Las resinas preferidas son resinas basadas en poliestireno con tritilo o bromobenzhidrilo . Ejemplos para resinas de tritilo son resina de cloruro de 2 -clorotritilo (resina CTC) , resina de cloruro de tritilo, resina de cloruro de 4 -metiltritilo y resina de cloruro de -metoxitritilo .

Preferiblemente, la resina CTC se aplica para la síntesis de fragmentos que contienen una función carboxílica libre.

En una realización preferida, los fragmentos protegidos de péptido Ve y VIc se preparan utilizando síntesis de fase en solución.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar péptidos protegidos que son útiles como intermedios en el proceso de la invención para la producción de un péptido protegido de terminal N de la fórmula IIc. En particular, uno de estos péptidos es el péptido protegido de terminal C y N de la fórmula Ve, en donde P13 es un grupo protector, preferiblemente Bzl. Otro de estos péptidos es un péptido protegido de terminal N de la fórmula Ve con el teminal C libre .

Otro péptido, que es particularmente útil como un intermedio en el proceso de la invención, es un péptido protegido de terminal C de la fórmula VIc, en donde P15 es Boc; o P15 es H.

Otro péptido, que es particularmente útil como un intermedio en el proceso de la invención, es un péptido protegido de terminal C y N de la fórmula VIIc, en donde Pl es un grupo protector, preferiblemente Pl es Boc.

Otro péptido, que es particularmente útil como un intermedio en el proceso para la producción de bivalirudina, es un péptido protegido de la fórmula lile, en donde P3 y P6 a Pll son Bzl .

En un aspecto adicional, la presente invención también se relaciona con un proceso para la producción de un péptido protegido de la fórmula H-Asp(OPll) -Phe-Glu(0P6) -Glu(0P7) - lie15- Pro-Glu (0P8 ) -Glu (0P9) -Tyr (PIO) - -Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (Ule) , en donde P3 y P6 a Pll son Bzl, que comprende : (a) eliminar el grupo de protección de terminal N de un péptido de la fórmula P16-Glu(OP8) -Glu(0P9) -Tyr (PIO) -Leu20-OP3 (SEQ ID NO 6) (V IIc) , en donde P3 y P8 a PIO son Bzl y P16 es Boc, para producir un péptido no protegido de terminal N, protegido de terminal C de la fórmula VIIIc con P16 que es H; (b) hacer reaccionar el péptido de la fórmula VIIIc producido en la etapa (a) , en donde P16 es H y P3 y P8 a PIO son Bzl, con un péptido de la fórmula P17-Glu(OP6) -Glu(0P7) -Ile15-Pro-OH (SEQ ID NO 7) (IXc) , en donde P17 es Boc; y P6 y P7 son Bzl, para producir un péptido de la fórmula P17-Glu(OP6) -Glu(0P7) - lie15- Pro-Glu (OP8 ) -Glu(0P9) -Tyr (PIO) -Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8) (Xc) , en donde P17 es Boc; y P3 y P6 a PIO son Bzl; (c) eliminar el grupo de protección de terminal N del péptido de la fórmula Xc producido en la etapa (b) , en donde P3 y P6 a PIO son Bzl; y P17 es Boc, para producir un péptido no protegido de terminal N, protegido de terminal C de la fórmula Xc con P3 y P6 a PIO siendo Bzl y P17 siendo H; (d) hacer reaccionar el péptido de la fórmula Xc producido en la etapa (c) , en donde P17 es H; y P3 y P6 a PIO son Bzl, con un aminoácido protegido de la fórmula Boc-Phe12-OH (XI) para producir un péptido de la fórmula P4-Phe-Glu (OP6) -Glu(OP7) - lie15-Pro-Glu (OP8 ) -Glu(OP9) -Tyr (PIO) -Leu20-OP3 (SEQ ID NO 9) (XIIc), en donde P3 y P6 a PIO son Bzl; y P4 es Boc; (e) eliminar el grupo de protección de terminal N del péptido de la fórmula XIIc producido en la etapa (d) con P3 y P6 a PIO siendo Bzl y P4 siendo Boc, para producir un péptido no protegido de terminal N, protegido de terminal C de la fórmula XIIc con P3 y P6 a PIO siendo Bzl; y P4 siendo H; (f) hacer reaccionar el péptido de la fórmula XIIc producido en la etapa (e) , en donde P4 es H; y P3 y P6 a PIO son Bzl, con un aminoácido protegido de la fórmula Boc-Asp (0P11) "-0H (XIIIc) , en donde Pll es Bzl, para producir un péptido de la fórmula Boc-Asp (0P11) -Phe-Glu(0P6) -Glu(0P7) -Ile15-Pro-Glu (0P8 ) -Glu(0P9) --Tyr(PlO) -Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (XIVc) , en donde P3 y P6 a Pll son Bzl; y (g) eliminar el grupo de protección de terminal N del péptido producido en la etapa (f) para producir el péptido protegido de de terminal C de la fórmula lile.

Las etapas (a) a (g) se pueden llevar a cabo utilizando condiciones estándar de reacciones conocidas en la técnica de síntesis de péptido.

Las etapas de acoplamiento y la desprotección (a) a (g) se realizan preferiblemente en solución.

Para las etapas de acoplamiento (b) , (d) y (f ) DMF se utiliza preferiblemente como disolvente. Las etapas de desprotección (a) , (c) , (e) y (g) se realizan preferiblemente en una mezcla de tolueno y THF como disolvente.

En una realización preferida, las etapas de acoplamiento (b) , (d) y (f ) se realizan con una combinación de HOBt, EDC · HC1, y la base TEA para la etapa (b) , respectivamente DIPEA para las etapas (d) y (f) . En otra realización preferida, las etapas de desprotección (a) , (c) , (e) y (g) se llevan a cabo mediante uso de TFA y fenol .

El producto crudo obtenido después en la etapa (g) se puede purificar mediante métodos convencionales, por ejemplo con HPLC preparativo, distribución contracorriente o equivalente. La muestra aplica a los intermedios obtenidos después de las etapas (a) a (f) , si se requiere purificación.

Los fragmentos protegidos de péptido VIIIc, IXc, XI, y XIIIc se pueden preparar utilizando métodos de síntesis de péptido convencionales, por ejemplo síntesis de fase en solución (HPPS) o síntesis de fase sólida (SPPS) . En caso del SPPS, se pueden aplicar todas las resinas que son conocidas para la persona experta en la técnica y que permiten preparación de péptidos protegidos. Aquí, las resinas se han de interpretar de manera amplia. Por lo tanto, el término "resina" se debe entender que significa por ejemplo un soporte sólido solo o un soporte sólido directamente ligado a un ligador, opcionalmente con una manija en el medio. La resina puede ser insoluble o soluble. El polímero de polietilenglicol soluble es un ejemplo para el soporte sólido de una resina soluble. Las resinas preferidas son resinas basadas en poliestireno con tritilo o bromobenzhidrilo . Ejemplos para resinas de tritilo son resina de cloruro de 2-clorotritilo (resina CTC) , resina de cloruro de tritilo, resina de cloruro de 4 -metiltritilo y resina de cloruro de 4- metoxitritilo. Preferiblemente, la resina CTC se aplica para la síntesis de fragmentos que contienen una función carboxí1ica 1ibre .

En una realización preferida, los fragmentos protegidos de péptido VIIIc, IXc, XI, y XIIIc se preparan utilizando síntesis de fase en solución.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar péptidos protegidos que son útiles como intermedios en el proceso de la invención para la producción de un péptido protegido de terminal C de la fórmula lile. En particular, uno de estos péptidos es un péptido protegido de la fórmula XIVc, en donde P3 y P6 a Pll son Bzl.

Otro péptido, que es particularmente útil como un intermedio en el proceso de la invención, es un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula XIIc, en donde P3 y P6 a PIO son Bzl; y P4 es el grupo de protección Boc, o P4 es H.

Otro péptido, que es particularmente útil como un intermedio en el proceso de la invención, es un péptido protegido de la fórmula Xc, en donde P3 y P6 a PIO son Bzl; y P17 es el grupo de protección Boc, o P17 es H.

Otro péptido, que es particularmente útil como un intermedio en el proceso de la invención, es un péptido protegido de la fórmula IXc, en donde P6 y P7 son Bzl; y preferiblemente P17 es Boc.

Otro péptido, que es particularmente útil como un intermedio en el proceso de la invención, es un péptido protegido de la fórmula VIIIc, en donde P3 y P8 a PIO son Bzl; y P16 es el grupo de protección Boc, o P16 es H.

En un aspecto adicional, la presente invención también se relaciona con el uso de cualesquiera de los péptidos anteriores como intermedios en una síntesis de bivalirudina .

Ej emplos Los siguientes ejemplos no limitantes ilustrarán las realizaciones representativas de la invención en detalle.

Abreviaturas : Boc tere- butoxicarbonilo Bzl bencio DCC 1,3- diciclohexilcarbodiimida DCHA diciclohexilamina DCU diciclohexilurea DIC diisopropilcarbodiimida DIPEA N,N- diisopropiletilamina DMF N,N- dimetilformamida EDC · HC1 clorhidrato de l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida equiv. equivalentes HOBt 1-hidroxibenzotriazol MTBE éter de metil tere- butil NMM N-metilmorfolina HOPfp pentafluorofenol OPfp éster de pentafluorofenilo HOSu N-hidroxisuccinimida Su N-succinimidilo TEA trietilamina TFA ácido trifluoroacético THF tetrahidrofurano Ejemplo 1: Preparación de H-Asn-Gly10-OBzl · TFA Se agrega Boc-Asn-Gly-OBzl (90.20 kg; Hexagon Labs Inc., USA) a 20° C a una mezcla de TFA (90 L) , tolueno (388 L) y THF (45 L) . Se agrega TFA (198 L) lentamente a la mezcla a =22° C. Se deja que la reacción llegue a terminación a 20° C. Se monitorea la terminación de la división mediante HPLC.

Luego, se agrega lentamente THF, y la mezcla de reacción se evapora al vacío. Tres destilaciones azeotrópicas se realizan con una mezcla de tolueno y THF.

H-Asn-Gly10-OBzl · TFA se obtiene como un residuo aceitoso, que se diluye con acetato de etilo. Esta solución se utiliza directamente en la siguiente etapa química (ver Ejemplo 3). Rendimiento: 100%. Pureza (por HPLC): 99.3%.

Ejemplo 2: Preparación de Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH · TEA (SEQ ID NO 10) Se agrega TEA (73.1 L) lentamente a 20° C a una suspensión de Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-OEt (SEQ ID NO 10) [98.11 kg; Bonora et al, Gazzetta Chimica Italiana 1980, 110, 503-510, se prepara de forma análoga a partir de Boc-Gly-Gly-OH (Senn Chemicals, Suiza) , y H-Gly-Gly-OEt · HC1 (Senn Chemicals, Suiza)] en una mezcla de acetona (78.44 L) y agua procesada (491 L) . Se deja que la reacción llegue a terminación a 20° C. Se monitorea la terminación de la saponificación mediante HPLC.

La solución se evapora al vacío, y el volumen del residuo se ajusta a 456 L con agua procesada. Esta solución de Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH · TEA (SEQ ID NO 10) se utiliza directamente en la siguiente etapa química (ver Ejemplo 3) . Rendimiento: 100%. Pureza (por HPLC): 99.6%.

Ejemplo 3: Preparación de Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn- Gly10-OBzl (SEQ ID NO 5) El pH de una solución de H-Asn-Gly10-OBzl · TFA (573 L, ver Ejemplo 1) en acetato de etilo se ajusta a 6-6.5 con TEA a 0o C. La solución de Boc-Gly5-Gly-Gly- -Gly-OH (SEQ ID NO 10) como se obtiene a partir del Ejemplo 2 se enfría a 0o C y se agrega, seguido por la adición de HOBt (28.52 kg) y EDC ¦ HC1 (69.81 kg) . El pH se ajusta a 6-6.5 con TEA (121 L) a 0o C. La mezcla de reacción se deja calentar hasta que alcanza temperatura ambiente (después aproximadamente 10 h; como se indica por HPLC) , NaCl se agrega a la mezcla de reacción. La suspensión se enfria y se filtra para dar un residuo sólido, que se lava varias veces con solución de NaCl acuosa y luego se enfría. El sólido resultante se seca al vacío para dar 130.15 kg (100%) de Boc-Gly5-Gly-Gly- -Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID NO 5) con 97.9% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 4: Preparación de H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn- Gly10-OBzl · TFA (SEQ ID NO 5) Se agrega Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID NO 5) (131.20 kg, ver Ejemplo 3) lentamente a una mezcla de TFA (131 L) , tolueno (525 L) y THF (105 L) a una temperatura de <22° C. Se agrega TFA (289 L) lentamente a la mezcla de reacción a una temperatura de =22° C. La reacción se deja terminar a 20° C dentro de aproximadamente 1.5 h (se monitorea por HPLC) . La mezcla de reacción se concentra en el vacío, y el residuo se vierte en éter de diisopropilo. La suspensión resultante se filtra para dar un sólido, que se lava varias veces con éter de diisopropilo y luego se seca al vacío para dar 130.99 kg H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl · TFA (SEQ ID NO 5) con 97.5% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 5: Preparación de H-Arg-Pro-OBzl · 2 HCl Se agrega ácido clorhídrico (1 M) en ácido acético (380 L) lentamente a =22° C a una suspensión de Boc-Arg-Pro-OBzl · HCl (95.00 kg; Hexagon Labs Inc., USA) en ácido acético (190 L) y THF (19 L) . La terminación de la división (después de aproximadamente 1 hora) se monitorea por HPLC.

La mezcla de reacción se evapora al vacío. Las destilaciones azeotrópicas se realizan primero con ácido acético y luego con DMF. The H-Arg-Pro-OBzl · 2 HC1 se proporciona como residuo aceitoso, que se diluye con DMF para obtener un volumen de aproximadamente 380 L. La solución resultante se utiliza directamente en la siguiente etapa química (ver Ejemplo 7). Rendimiento: 100%. Pureza (por HPLC) : 96%.

Ejemplo 6: Preparación de Boc-D-Phe-Pro-OPfp Una solución de HOPfp (17.78 kg) en acetato de etilo (10 L) se agrega a =24° C a una suspensión de Boc-D-Phe-Pro-OH (33.33 kg; Bachem AG, Suiza) en acetato de etilo (183 L) . Una solución de DCC (21.44 kg) en acetato de etilo (83.3 L) se agrega lentamente a la mezcla de reacción a -6o C. La mezcla luego se le permite calentar hasta temperatura ambiente. La terminación de acoplamiento (aproximadamente 2 h) se monitorea por HPLC.

La sal DCU se elimina mediante filtración y se lava con acetato de etilo. El filtrado se evapora al vacío hasta que se alcanza un volumen residual de aproximadamente 80 L. Varias destilaciones azeotrópicas se realizan con tolueno. El residuo aceitoso se precipita en éter de petróleo. El sólido se filtra, se lava con éter de petróleo y se seca al vacío para obtener 26.3 kg (54%) Boc-D-Phe-Pro-OPfp con 99.3% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 7: Preparación de Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OBzl · HC1 (SEQ ID NO 4) Se diluye una solución de H-Arg3-Pro-OBzl · 2 HC1 (103.00 kg; 561 L de solución; ver Ejemplo 5) con DMF (360 L) a 20° C. DMF (82 L) se evapora al vacío por debajo de 55° C.

Luego se agrega Boc-D-Phe1-Pro-OPfp (121.54 kg; ver Ejemplo 6) a la solución de H-Arg3-Pro-OBzl · 2 HC1 a 20° C. El pH de la mezcla resultante se ajusta a 6.5 con TEA (58 L) a 0o C. La reacción se deja terminar a 0o C durante aproximadamente 20 h, como se indica al monitorear con HPLC.

Las fracciones sólidas de la suspensión resultante se filtran y se lavan con DMF. El filtrado se concentra al vacío hasta un volumen residual de aproximadamente 385 L. Se agrega una mezcla de agua desionizada, NaCl y acetato de etilo. Las fases se separan y la fase orgánica se lava sucesivamente con NaHC03 acuoso, con -Na2C03 acuoso, con una solución de HC1 en solución salina, y finalmente con solución salina. La fase orgánica se concentra al vacío para dar un residuo aceitoso, que se seca mediante destilación azeotrópica con tolueno y se precipita en éter de diisopropilo a 20° C. La suspensión resultante se filtra para proporcionar un sólido, que se lava varias veces con éter de diisopropilo y se seca al vacío para dar 106 kg de Boc-D-Phe^Pro-Arg- -Pro-OBzl · HC1 (SEQ ID NO 4) con 96% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 8: Preparación de Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) El pH de una solución de Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OBzl · HC1 (SEQ ID NO 4) (33.58 kg, ver Ejemplo 7) en acetona (67 L) se ajusta a 4 con una mezcla de TFA/THF (50/50, v/v, 0.03 L) a 20° C. La mezcla resultante se agrega a una suspensión de paladio sobre carbón (3.36 kg) en acetona (17 L) . La hidrogenacion se realiza a 20° C durante por lo menos 2 h a aproximadamente 3 bar (3.06 kg/cm2) de presión de hidrógeno. La terminación de la hidrogenacion se monitorea por HPLC.

La mezcla de reacción se filtra sobre cartucho de celulosa. La torta de filtro se lava varias veces con acetona. Los filtrados combinados se concentran al vacío. El residuo aceitoso resultante se seca mediante destilación azeotrópica utilizando una mezcla de acetona y tolueno. El residuo aceitoso se diluye con acetato de etilo y se vierte en éter de diisopropilo. La suspensión resultante se filtra y el precipitado se lava varias veces con éter de diisopropilo y se seca al vacío para dar 31.4 kg de Boc-D-Phe1-Pro-Arg- -Pro-OH (SEQ ID NO 4) con una pureza de 99.4% (mediante HPLC) .

Ejemplo 9: Preparación de Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro- Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn- -Gly10-OBzl (SEQ ID NO 2) El pH de una solución de H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl · TFA (SEQ ID NO 5) (25.20 kg, ver Ejemplo 4) en DMF (504 L) y agua desionizada (25 L) se ajusta a 6.5-7 utilizando TEA (9 L) a =22° C. Se agregan lentamente BOC-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) (25.46 kg, ver Ejemplo 8) y HOBt (1.02 kg) a <22° C. Se agrega lentamente DIC (9.5 L) a la mezcla de reacción a =12° C. El pH de la mezcla resultante se ajusta a 7-7.5 utilizando TEA (0.3 L) a =12° C. La reacción se deja terminar durante 10 días a 10° C, como se monitorea por HPLC y TLC.

La mezcla de reacción se concentra al vacío para dar un residuo aceitoso, que se precipita en una mezcla de acetato de etilo y éter de diisopropilo . El líquido sobrenadante se elimina varias veces y se reemplaza mediante el mismo volumen de éter de diisopropilo. La mezcla se filtra para dar un sólido, que se lava tres veces con éter de diisopropilo y se seca al vacío para dar 30.50 kg (76%) de Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly--Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID NO 2) con 83.4% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 10: Preparación de Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) Una solución de Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID NO 2) (23.43 kg peso de péptido neto, ver Ejemplo 9) en una mezcla de acetona (43 L) y agua desionizada (9 L) se agrega a una suspensión de paladio sobre carbón (0.75 kg) en acetona (3 L) . La hidrogenación se realiza a 20° C durante 11 h a aproximadamente 3 bar (3.06 kg/cm2). presión de hidrógeno. La terminación de la hidrogenación se monitorea por HPLC.

Se agrega agua desionizada (36 L) a la mezcla de reacción y la mezcla resultante se filtra sobre cartucho de celulosa. La torta de filtro se lava varias veces con una mezcla 2:8 de agua desionizada y acetona. Los filtrados combinados se concentran al vacío. El residuo resultante se seca mediante destilación azeotrópica utilizando una mezcla de DMF y tolueno para dar 21.5 kg de Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn- -Gly10-OH (SEQ ID NO 2) con 80% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 11: Preparación de Boc-Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl Se suspende · p-tosilato H-Leu-OBzl (22.2 kg; Bachem AG, Suiza) en acetato de etilo (108 L) , luego se agrega TEA (aproximadamente 7.1 L) a temperatura ambiente.

Se agregan Boc-Tyr (Bzl) -OH (20 kg; Senn Chemicals, Suiza) y HOBt (7.3 kg) como sólidos. Una solución de DCC (12.2 kg) en DMF (40 L) se agrega a la mezcla a -6o C. La terminación de la reacción se monitorea por TLC y HPLC.

El DCU formado se elimina mediante filtración. El filtrado se lava sucesivamente con una mezcla de solución de KHSO4 acuosa y solución salina; solución de KHS04 acuosa; solución de NaHC03 acuosa y con solución salina. La fase orgánica se evapora al vacío. El residuo se disuelve en acetato de etilo, y luego se precipita en éter de petróleo. El sólido se filtra, se lava con éter de petróleo y se seca al vacío. Un segundo cultivo se obtiene después de la concentración del licor madre al vacío y precipitación en éter de petróleo. El sólido se filtra, se lava con éter de petróleo y se seca al vacío. Los dos cultivos luego se mezclan, produciendo 25.9 kg (84%) de Boc-Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl con 97% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 12: Preparación de H-Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl · TFA Se agrega TFA (83 L) lentamente a 20° C a una mezcla de Boc-Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (25.9 kg, ver Ejemplo 11), fenol (1.3 kg) , tolueno (104 L) y THF (21 L) . Se deja que la reacción llegue a terminación a 20° C. Se monitorea la terminación de la división mediante HPLC.

La mezcla de reacción se evapora al vacío. Una destilación azeotrópica se realiza con una mezcla de tolueno y THF. Luego, acetato de etilo y éter de petróleo se agregan al residuo. El sólido se filtra, se lava con una mezcla de acetato de etilo y éter de petróleo, luego con éter de petróleo, y finalmente se seca al vacío, produciendo 23.7 kg (89%) de H-Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl · TFA con 98% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 13: Preparación de Boc-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr(Bzl)- Leu20-OBzl (SEQ ID NO 6) Se agrega Boc-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -OSu (42.90 kg, Senn Chemicals, Suiza) a una solución de H-Tyr (Bzl) -Leu-OBzl -TFA (23.7 kg, ver Ejemplo 12) en DMF (80 L) . El pH de la mezcla de reacción se ajusta lentamente a 7-7.5 con DIPEA a 0o C. Se deja que la mezcla de reacción se someta a terminación a 20° C. La terminación del acoplamiento se monitorea por HPLC.

La mezcla de reacción se evapora al vacío, y el residuo aceitoso se vierte en agua procesada. El sólido se filtra, se lava con agua procesada, se re-suspende en una mezcla de acetonitrilo y agua procesada y finalmente se seca al vacío, produciendo 40.3 kg de Boc-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 6) con 92% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 14: Preparación de H-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl · TFA (SEQ ID NO 6) Se agrega Boc-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 6) (117.45 kg, ver Ejemplo 13) lentamente a 15° C a una mezcla de TFA (117 L) , fenol (5.87 kg) , tolueno (470 L) y THF (94 L) . Se agrega TFA adicional (282 L) lentamente a la mezcla a =17° C. Se deja que la reacción llegue a terminación a 15° C. La terminación de la división (3 h) se monitorea por HPLC.

La mezcla de reacción se evapora al vacío por debajo de 35° C. El TFA residual se elimina mediante destilaciones azeotrópicas con una mezcla de tolueno/THF y luego con tolueno. MTBE (825 L) se agrega al residuo aceitoso. Luego, éter de petróleo se agrega a la suspensión obtenida. Después de enfriamiento, el sólido se filtra y se lava varias veces con éter de petróleo. Después de re-suspensión en éter de petróleo y filtración, el sólido se lava con éter de petróleo. Este procedimiento se repite una vez. El sólido luego se seca al vacío produciendo 114.86 kg (96%) de H-Glu(OBzl) --Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl · TFA (SEQ ID NO 6) con 96% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 15: Preparación de Boc-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) - Ile15-Pro-OH · DCHA (SEQ ID NO 7) Se agrega Boc-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -OSu (62 kg, Senn Chemicals, Suiza) lentamente a una solución de H-Ile-Pro-OH · TFA (36 kg, Bachem AG, Suiza) en DMF (433 L) . El pH se ajusta a 7-7.5 con DIPEA a 0o C. La terminación de la reacción se monitorea por HPLC.

La mezcla de reacción se evapora al vacío y el residuo aceitoso se diluye con acetato de etilo. La mezcla se lava con solución de KHS04 acuosa y con solución salina. La capa orgánica se evapora al vacío y el residuo aceitoso se seca mediante destilaciones azeotrópicas con tolueno. El residuo aceitoso se diluye con tolueno, y el pH se ajusta a 7-7.5 con DCHA. Se agrega éter de petróleo luego a la mezcla. El sólido así obtenido se filtra, se lava con éter de petróleo y se seca al vacío, produciendo 102 kg de Boc-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-OH · DCHA (SEQ ID NO 7) con 89% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 16: Preparación de Boc-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) --Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 8) Se agregan Boc-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-0H · DCHA (SEQ ID NO 7) (98.88 kg, ver Ejemplo 15) y HOBt (13.82 kg) lentamente a <24° C a una solución de H-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl ¦ TFA (SEQ ID NO 6) (110.39 kg, peso de péptido neto, ver Ejemplo 14) en DMF (451 L) . EDC · HCl (22.99 kg) se agrega mediante pequeñas porciones a la mezcla a -6o C. El pH de la mezcla de reacción se ajusta a 6.5-7 con TEA (12 L) a -6o C. se deja que el acoplamiento se someta a terminación a 10° C durante 16 h como se monitorea por HPLC.

Las sales se eliminan mediante filtración. El filtrado se evapora al vacío. El residuo aceitoso (470 L) se precipita en a NaHC03 solución. El sólido se filtra y se lava varias veces con agua procesada. Después de re-suspensión en agua procesada, se agrega acetonitrilo . Luego, la suspensión se enfría. El sólido se filtra, se lava con agua y se seca al vacío produciendo 160.34 kg (88%) de Boc-Glu (OBzl) - -Glu(OBzl) -Ile15-Pro-Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 8) con 90% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 17: Preparación de H-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) - Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) --Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl · TFA (SEQ ID NO 8) Se agrega Boc-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 8) (72.24 kg, ver Ejemplo 16) a =15° C a una mezcla de TFA (72 L) , tolueno (289 L) y THF (6 L) . Se agrega TFA adicional (159 L) lentamente a la mezcla a =22° C. Se deja que la reacción llegue a terminación a 20° C durante 2.5 h (se monitorea por HPLC) . La mezcla de reacción se evapora al vacío. El TFA residual se elimina por varias destilaciones azeotrópicas con una mezcla de tolueno y THF. El residuo aceitoso se diluye con tolueno y se vierte en éter de diisopropilo . El sólido se filtra y se lava varias veces con éter de diisopropilo. Después de resuspensión en una mezcla de acetonitrilo y éter de diisopropilo, el sólido luego se filtra, se lava varias veces con éter de diisopropilo y finalmente se seca al vacío produciendo 61.7 kg (87%) de H-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) - lie15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl · TFA (SEQ ID NO 8) con 88.9% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 18: Preparación de Boc-Phe-Glu (OBzl) - Glu(OBzl) - lie15-Pro-Glu (OBzl) - -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 9) Se agregan Boc-Phe-OH (10.03 kg; Senn Chemicals AG, Suiza) y HOBt (4.95 kg) lentamente a =24° C a una solución de H-Glu(OBzl) -Glu (OBzl) -lie15-Pro-Glu (OBzl) --Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl - TFA (SEQ ID NO 8) (61.63 kg, ver Ejemplo 17) en D F (264 L) . EDC · HC1 (8.53 kg) se agrega lentamente a -5o C. El pH de la mezcla de reacción se ajusta progresivamente a 6.5-7 con DIPEA (47.5 L) a -5o C. Se deja que el acoplamiento se someta a terminación a 10° C durante 23 h (se monitorea por HPLC) .

La mezcla de reacción se evapora al vacío. El residuo aceitoso se suspende en una solución de NaHC03. El sólido se filtra, se lava varias veces con agua procesada y se seca al vacío produciendo 67.64 kg (95%) de Boc-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) - lie15-Pro- -Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 9) con 87.9% pureza (por HPLC).

Ejemplo 19: Preparación de H-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) - Ile15-Pro-Glu(OBzl) - -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl · TFA (SEQ ID NO 9) Se agrega Boc-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro- Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 9) (67.66 kg, ver Ejemplo 18) mediante porciones pequeñas a 15° C a una mezcla de TFA (68 L) , fenol (3.38 kg) , tolueno (271 L) y THF (54 L) . TFA adicional (149 L) se agrega lentamente a la mezcla a 15° C. La terminación de la división (4.3 h) se monitorea por HPLC.

La mezcla de reacción se evapora al vacío. El TFA residual se elimina mediante varias destilaciones azeotrópicas con una mezcla de tolueno y THF. El residuo aceitoso se diluye con tolueno y se vierte en éter de diisopropilo . El sólido se filtra, se lava varias veces con éter de diisopropilo y se seca al vacío produciendo 67.25 kg (99%) de H-Phe-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl ¦ TFA (SEQ ID NO 9) con 86.6% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 20: Preparación de Boc-Asp (OBzl) -Phe- Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Ile15-Pro- -Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3) Se agregan Boc-Asp (OBzl) 13--OH (20.22 kg) (Senn Chemicals AG, Suiza) y HOBt (8.42 kg) en pequeñas porciones a una solución de H-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) - -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl · TFA (SEQ ID NO 9) (60.46 kg peso de péptido neto, ver Ejemplo 19) en DMF (370 L) a =20° C. Se agrega EDC · HC1 (13.38 kg) lentamente a la mezcla de reacción a -5o C. El pH de la mezcla resultante se ajusta progresivamente a 6.5-7 con DIPEA (27 L) a -5o C. El acoplamiento reacción luego se deja terminar durante 35 h a 10° C (se monitorea por HPLC) .

La mezcla de reacción luego se concentra al vacío. El residuo aceitoso resultante se agrega lentamente a una solución de NaHC03 acuosa. La suspensión resultante se filtra y se re-suspende en agua desionizada. Después de filtración y varios lavados con agua desionizada y una vez con una mezcla de acetonitrilo y agua desionizada, el sólido resultante se seca al vacío produciendo 64 kg (96%) de Boc-Asp (OBzl) -Phe- -Glu(OBzl) -Glu(OBzl) - Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu0-OBzl (SEQ ID NO 3) con 81.4% pureza (por HPLC).

Ejemplo 21: Preparación de H-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) -Ile15-Pro- -Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl · TFA (SEQ ID NO 3) Se agrega Boc-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) - -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3) (64.00 kg, ver Ejemplo 20) en pequeñas porciones a una mezcla de TFA (64 L) , fenol (3.2 kg) , tolueno (265 L) , y THF (51 L) a una temperatura por debajo de 15° C. Se agrega TFA adicional (141 L) lentamente a la mezcla de reacción a =15° C. La división se realiza a 15° C durante 4.8 h (se monitorea por HPLC) .

La mezcla de reacción se concentra al vacío. El residuo aceitoso resultante se agrega a éter de diisopropilo durante precipitación a 20° C. La suspensión resultante se filtra, se re-suspende en éter de diisopropilo y se filtra de nuevo. El sólido se lava con éter de diisopropilo y se seca al vacío produciendo 61.4 kg (peso péptido neto) (95%) de H-Asp(OBzl)-Phe-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) - -Leu20-OBzl · TFA (SEQ ID NO 3) con 77.6% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 22: Preparación de Boc-D-Phex-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10- -Asp(OBzl) -Phe-Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) - -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 1) Se agregan H-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) --Leu20-OBzl · TFA (SEQ ID NO 3) (104.40 kg, ver Ejemplo 21) y HOBt (8.42 kg) en pequeñas porciones a una solución de Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly--Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2 ) (65.47 kg, ver Ejemplo 10) en DMF (345 L) a <24° C. Se agrega EDC · HC1 (12.46 kg) lentamente a -5o C. El pH de la mezcla de reacción se ajusta progresivamente a 6.5-7 con TEA (16.5 L) a -5o C. El acoplamiento se deja terminar durante 22 h a -5 o C (se monitorea por HPLC) .

La mezcla de reacción se diluye lentamente con agua desionizada. La suspensión resultante se filtra, se lava con agua desionizada y se seca al vacío produciendo 72 kg (50%) de Boc-D^Phe-Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-As (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) --Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 1) con 81.4% pureza (por HPLC) .

Ejemplo 23: Preparación de H-D-P e1-Pro-Arg-Pro-Gly5- Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp- -Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH · 2 TFA (bivalirudina) (SEQ ID NO 1) Una suspensión de Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly- Gly-Asn-Gly10-Asp (OBzl) -Phe- -Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 1) (15.00 kg, ver Ejemplo 22) en ácido acético (53 L) se agrega a una mezcla de paladio sobre carbón (1.13 kg) , agua desionizada (6 L) y ácido acético (5 L) . La hidrogenación se realiza a =37° C bajo aproximadamente 3 bar (3.06 kg/cm2) de presión de hidrógeno (se monitorea por HPLC) .

Después de la terminación (5 h) , la mezcla de reacción se enfría y se diluye con agua desionizada y ácido acético.

La mezcla resultante se filtra sobre cartucho de celulosa, que se eluye varias veces con una mezcla de ácido acético y agua procesada. El filtrado se concentra al vacío. El residuo resultante se prueba para su contenido de agua mediante titulación de Karl Fischer (contenido de agua <5.0 ).

Luego, se agrega tolueno al residuo aceitoso seguido por adición de TFA. La terminación de la división (después de 1 h) se monitorea por HPLC.

La mezcla de reacción se concentra al vacío. El residuo aceitoso resultante se agrega a éter de diisopropilo durante precipitación. La suspensión resultante se filtra para dar un sólido, que se lava varias veces con éter de diisopropilo y se seca al vacío produciendo 8.41 kg (peso péptido neto) (78%) de H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly--Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-H · 2 TFA crudo (bivalirudina) (SEQ ID NO 1) con una pureza de bivalirudina crudo de 65% (mediante HPLC) . No se detecta impureza D-Phe12-bivalirudina mediante HPLC, es decir no ocurre racemización en la posición 12.

El péptido crudo se purifica mediante HPLC preparativo en una fase estacionaria de fase inversa C18. En una primera etapa, la bivalirudina cruda se purifica mediante elusión con gradiente con acetato de amonio/agua/acetonitrilo y en una segunda etapa mediante con elución de gradiente con ácido trifluoroacético/agua/acetonitrilo. Las fracciones eluidas que contienen producto puro se concentran y liofilizan, produciendo 5.89 kg (70%, con base en el contenido de bivalirudina en el péptido crudo) de H-D-Phex-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu--Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu0-H · 2 TFA (bivalirudina) (SEQ ID NO 1) como un polvo blanco con una pureza de 99% (mediante HPLC) . No se detecta D-Phe12-bivalirudina y ni D-Tyr19-bivalirudina, y cada otra impureza detectada no es mayor de 0.2% (mediante HPLC) .

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la invención como antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un proceso para la producción de bivalirudina de la fórmula H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp¬ Phe-Glu-Glu- -Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH (SEQ ID NO 1) (I) en fase en solución, caracterizado porque comprende las etapas de : (a) hacer reaccionar un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula -Phe^Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) (V) , en donde Pl es un grupo protector que es estable a hidrogenación catalítica, con un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 5) (VI) , en donde P2 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica y que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral opcionales, para producir un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 2) (VII) , en donde Pl y P2 son como se definieron anteriormente , (b) eliminar P2 del péptido producido en la etapa (a) para producir el péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Glys-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) (II) , en donde Pl es como se definió anteriormente, (c) hacer reaccionar un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8) (X), en donde P3 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenacion catalítica, con una fenilalanina de la fórmula P4-Phe12-OH (XI) , en donde P4 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral del péptido de la fórmula X y un P3 , para producir un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 9) (XII) , en donde P3 y P4 son como se definieron anteriormente , (d) eliminar P4 del péptido producido en la etapa (c) para producir el péptido protegido de cadena lateral, desprotegido de terminal N correspondiente de la fórmula XII, (e) hacer reaccionar el péptido de la fórmula XII producido en la etapa (d) con un ácido aspártico protegido de cadena lateral de la fórmula P5-Asp11-0H (XIII), en donde P5 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral del péptido/aminoácido de la fórmula XII y XIII y un P3, para producir un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (XIV) , en donde P3 y P5 son como se definieron anteriormente , (f) eliminar P5 del péptido producido en la etapa (e) para producir el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (III) , en donde P3 es como se definió anteriormente, (g) hacer reaccionar el péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula II producido en la etapa (b) con el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula III producido en la etapa (f) para producir un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula Pl -D-Phe1- Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp- Phe-Glu-Glu--Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 1) (IV) , en donde Pl y P3 son como se definieron anteriormente , (h) eliminar Pl, P3 y los grupos de protección de cadena lateral del péptido producido en la etapa (g) para producir la bivalirudina de la fórmula I .

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos uno de Pl, P4 y P5 es tere- butoxicarbonilo (Boc) , 2- (bifenil-4-il) prop-2-iloxicarbonilo (Bpoc) , 2- (3 , 5-di-metoxi-fenil) prop-2-iloxicarbonilo (Ddz) , fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-(metilsulfonil) etoxicarbonilo (Msc) .

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque por lo menos uno de Pl, P4 y P5 es Boc.

4. El proceso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque por lo menos uno de P2 y P3 es bencilo (Bzl) , benciloximetilo (Bom) , fenacilo (Pac) , 4 -nitrobencilo (ONbz) , 4 -piridil-metilo (Pie) , o 4 sulfobencilo, con la condición que, si P4 o P5 es Boc, Bpoc o Ddz, P3 no es Bom.

5. El proceso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque por lo menos uno de P2 y P3 es Bzl.

6. El proceso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los péptidos protegidos de cadena lateral/aminoácido de la fórmula III, IV, X, y XII-XIV se protegen con por lo menos un grupo de protección de cadena lateral seleccionado del grupo que consiste de bencilo (Bzl) , benciloximetilo (Bom) , fenacilo (Pac) , 4 -nitrobencilo (ONbz) , 4 -piridil-metilo (Pie) , y 4-sulfobencilo; con la condición que, si P4 o P5 es Boc, Bpoc o Ddz, ninguno de los grupos de protección de cadena lateral es Bom .

7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque los péptidos protegidos de cadena lateral/aminoácido de la fórmula III, IV, X, y XII-XIV se protegen con por lo menos un Bzl.

8. El proceso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque en la etapa (a) por lo menos uno de los péptidos opcionalmente protegidos de cadena laterales de la fórmula V y VI son no protegidos de cadena lateral.

9. El proceso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque en la etapa (c) el péptido de la fórmula X es de la fórmula H-Glu(0P6) -Glu(0P7) -Ile15-Pro-Glu (0P8) -Glu(0P9) - Tyr (PIO) - -Leu20-OP3 (SEQ ID 8) (Xb) , en donde P3 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica; y cada uno de P6 a PIO se selecciona independientemente del grupo que consiste de Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie y 4-sulfobencilo; y en la etapa (e) el ácido aspártico protegido de cadena lateral de la fórmula XIII es P5-Asp (OP11) 11-OH, en donde P5 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral del péptido/aminoácido de la fórmula XII y XIII y un P3; y Pll se selecciona del grupo que consiste de Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie y 4 - sulfobencilo .

10. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque P3 es Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie o 4-sulfobencilo; cada uno de P6 a PIO es independientemente Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie o 4 -sulfobencilo ; P5 es Boc, Bpoc, Ddz , Fmoc o sc; y Pll es Bzl, Bom, Pac, ONbz, Pie o 4-sulfobencilo .

11. El proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque P3 es Bzl, cada uno de P6 a PIO es Bzl, P5 es Boc, y Pll es Bzl

12. El proceso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque Pl, P4 y P5 son Boc; y P2, P3, P6, P7, P8 , P9, PIO y Pll son Bzl.

13. El proceso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque en la etapa (h) , primero se eliminan P3 y los grupos de protección de cadena lateral simultáneamente, y después se elimina Pl .

14. El proceso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el péptido obtenido después de eliminación simultánea P3 y los grupos de protección de cadena lateral, no se aisla antes de eliminación Pl .

15. El proceso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque por lo menos una de las etapas de eliminación (b) y (h) se lleva a cabo en un disolvente con gas de hidrógeno y paladio sobre carbón.

16. El proceso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el disolvente se selecciona del grupo que consiste de N, ¿V-dimetilformamida, acetona, una mezcla de acetona y agua, ácido acético, y una mezcla de ácido acético y agua.

17. El proceso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque por lo menos uno de los péptidos seleccionados del grupo que consiste del péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula V, el péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula VI y el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula X se prepara mediante síntesis de fase en solución en un proceso precedente.

18. El proceso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque por lo menos uno de los péptidos seleccionados del grupo que consiste del péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula V, el péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula VI y el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula X se prepara mediante síntesis de fase sólida en un proceso precedente.

19. Un péptido seleccionado del grupo que consiste de (i) un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe^Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) (V), en donde Pl es Bpoc, Ddz, Fmoc, Adc, Aoc, Dpp, Msc o Pht; ( ii) un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 5) (VI) , en donde P2 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica y que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral opcionales; ( iii ) un péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 2) (VII) , en donde Pl y P2 son como se definieron anteriormente ; (iv) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) (Ha) , en donde Pl es como se definió anteriormente, excepto para Boc-D-Phe1-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly5- -Gly-Gly- Gly-Asn(Trt) -Gly10-OH; (v) un péptido no protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) (Hb) , en donde Pl es como se definió anteriormente; (vi) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8) (X), en donde P3 es un grupo protector que se puede eliminar mediante hidrogenación catalítica; (vii) a péptido protegido de cadena lateral de la fórmula P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 9) (XII) , en donde P3 es como se definió anteriormente; y P4 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral del péptido de la fórmula X y un P3 ; o P4 es hidrógeno; (viii) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (XIV) , en donde P5 es un grupo protector que es ortogonal a los grupos de protección de cadena lateral del péptido/aminoácido de la fórmula XII y XIII y un P3 ; y P3 es como se definió anteriormente; excepto para Fmoc-Asp (OtBu) -Phe- -Glu (OtBu) - Glu(OtBu) -Ile15-Pro-Glu(OtBu) -Glu(OtBu) -Tyr(tBu) - Leu20-OtBu; (ix) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (III) , en donde P3 es como se definió anteriormente; excepto para H-As (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) - -Glu (OtBu) - Ile15- Pro-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr(tBu) -Leu20-OtBu; y (x) un péptido protegido de cadena lateral de la fórmula Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp- Phe-Glu-Glu--Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 1) (IV) , en donde Pl y P3 son como se definieron anteriormente; excepto para Boc-D-Phe^Pro- - Arg(Pbf) -Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly10- Asp(OtBu) -Phe-Glu(OtBu) --Glu(OtBu) -Ile15-Pro- Glu(OtBu) -Glu(OtBu) -Tyr(tBu) -Leu20-OtBu.

20. El péptido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula VI es H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID NO 5) .

21. El péptido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el péptido opcionalmente protegido de cadena lateral de la fórmula VII es Boc-D-Phe^Pro-Arg- Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID NO 2) .

22. El péptido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el péptido no protegido de cadena lateral de fórmula Ilb es Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) .

23. El péptido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula X es H-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) - Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 8).

24. El péptido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula XII es Boc-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 9), or H-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 9).

25. El péptido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula XIV es Boc-As (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu(OBzl) -Glu(OBzl) --Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3) .

26. El péptido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula III es H-As (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu(OBzl) -Glu(OBzl) -Tyr (Bzl) --Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3) .

27. El péptido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el péptido protegido de cadena lateral de la fórmula IV es Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) --Glu(OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 1).

28. Uso de cualquiera de los péptidos de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27 como un intermedio en una síntesis de bivalirudina .