CN102532274B - 一种比伐卢定的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及比伐卢定的制备方法。本发明比伐卢定的制备方法，包括固相多肽合成法制备比伐卢定树脂、比伐卢定树脂酸解得到比伐卢定粗品、比伐卢定粗品纯化得到比伐卢定纯品，其中固相多肽合成法制备比伐卢定树脂的方法为：在Fmoc-Leu-载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的保护氨基酸或片段，得到比伐卢定树脂：R1-D-Phe-Pro-X-Y-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂其中，R1为Fmoc或Boc或H；X为Arg(Pbf)-Pro；Y为Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R2)-Gly-Asp(OtBu)，R2为Trt或H。本发明产品纯度可达99.5％以上。

Description

一种比伐卢定的制备方法
技术领域
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及一种新的比伐卢定的制备方法。
背景技术
比伐卢定(Bivalirudin)属于直接凝血酶抑制剂(direct thrombin inhibitor，DTI)，由20个氨基酸残基组成。直接凝血酶抑制剂(DTI)是一组不需要辅助因子参与而直接抑制凝血酶活性的多肽，它不仅有抗凝血功能，还能抑制血小板的聚集。与其他抗凝药相比，其药理作用及药动学特点更优越，尤其在心血管疾病中有良好的用途。
比伐卢定为水蛭素衍生物(片段)，人工合成的包含20个氨基酸残基的多肽。它主要由两部分构成，一部分是氨基末端(N端)的短肽链，含有苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸序列，能与凝血酶的活性部位发生特异性结合，另一部分是含羧基末端(C端)的12肽链，两部分靠四甘氨酸连接，它们与凝血酶的两个结合部位都有很高的亲和力。比伐卢定与凝血酶的结合是可逆的，结合后很容易在凝血酶的活性部位断开成两部分并分解出多肽链中的脯氨酸-精氨酸序列，使凝血酶的催化活性很快恢复，所以它的半衰期只有20～25min。半衰期短使它比水蛭素更安全。比伐卢定主要经肽酶降解后清除，少部分以原型经肾排泄，所以在肾功能不全时使用安全。
比伐卢定具有以下的结构：
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-
Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH
有关比伐卢定的制备方法，国内外有大量的报道。
Okayama et al.(1996，Chem.Pharm.Bull.44：1344-1350)和Steinmetzer et al.(1999，Eur.J.Biochem.265：598-605)报道了比伐卢定的Fmoc固相合成法，采用王树脂为开始的载体树脂，依次接入保护氨基酸，所得肽树脂采用三氟醋酸(TFA)酸解。
由于本产品结构的特点，本品种含有5个Gly，在固相法依次接入Fmoc-Gly过程中，由于Gly自身的特性，使产品中产生以下杂质：[+1Gly]-比伐卢定，[+2Gly]-比伐卢定，[-1Gly]-比伐卢定，[-2Gly]-比伐卢定，而这些杂质与比伐卢定自身的极性相近，所以在纯化的时候很难完全纯化掉，产品总收率无法得到有效提高，产品纯度不高，影响用药的安全性。
为了解决比伐卢定结构中Gly增加和减少问题，以色利NOVETIDE公司WO2010117725专利，在接肽过程中使用Fmoc-Gly-Gly-OH为原料仅仅解决了[+1Gly]-比伐卢定和[-1Gly]-比伐卢定杂质的产生，而无法解决[+2Gly]-比伐卢定和[-2Gly]-比伐卢定的产生。
同时在制备过程中还发现，由于氨基酸的空间位阻大，在接入Fmoc-Arg(Pbf)-OH过程中反应不完全，易产生[-Arg]-比伐卢定杂质，严重影响了产品收率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供比伐卢定的制备方法，该制备方法使用了新的保护氨基酸片段，避免了[+1Gly]-比伐卢定、[-1Gly]-比伐卢定、[+2Gly]-比伐卢定、[-2Gly]-比伐卢定杂质的产生，提高了产品收率和纯度，反应效率高、有利于实现规模化的固相合成工艺。
本发明比伐卢定的制备方法，包括固相多肽合成法制备比伐卢定树脂、比伐卢定树脂酸解得到比伐卢定粗品、比伐卢定粗品纯化得到比伐卢定成品，其中固相多肽合成法制备比伐卢定树脂的方法为：在Fmoc-Leu-载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的保护氨基酸或片段，得到比伐卢定树脂：
R1-D-Phe-Pro-X-Y-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-
Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂
其中，
R1为Fmoc或Boc或H；
X为Arg(Pbf)-Pro；
Y为Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R2)-Gly-Asp(OtBu)，R2为Trt或H。
作为本发明优选的方案，接入X片段时，
1)用1次偶联直接接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-OH；或
2)用2次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-Pro-OH、第二次为Fmoc-Arg(Pbf)-OH。
作为本发明优选的方案，接入Y片段时，
1)分2次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-Asn(R2)-Gly-Asp(OtBu)-OH，第二次为Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；或
2)分3次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-Asp(OtBu)-OH、第二次为Fmoc-Asn(R2)-Gly-OH、第三次为Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；或
3)分3次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-OH、第二次为Fmoc-Asn(R2)-OH、第三次为Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；或
4)分3次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-Asp(OtBu)-OH、第二次为Fmoc-Gly-Asn(R2)-Gly-OH，第三次为Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH。
本发明接入X和Y以外的其它片段时保护氨基酸分别为：
Fmoc-D-Phe-OH或Boc-D-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Glu(OtBu)-OH；Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
作为本发明优选的方案，接入各个氨基酸片段时，保护氨基酸的用量为载体树脂总摩尔数的1.2～6倍，优选3倍。
本发明所述Fmoc-Leu-载体树脂是将载体树脂与Fmoc-Leu-OH偶联得到；所述Fmoc-Leu-载体树脂的Fmoc-Leu取代值为0.3～1.5mmol/g树脂，优选的Fmoc-Leu-取代值为0.5～1.2mmol/g树脂。
进一步地，所述载体树脂为Trityl-Cl类型树脂或羟基类型树脂，其中Trityl-Cl类型树脂优选为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl树脂、4-MethoYytrityl-Cl树脂或2-Cl Trity-Cl树脂；羟基类型树脂优选为Wang树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂。
当载体树脂为三苯甲基氯树脂时，Fmoc-Leu-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Leu-OH的羧基与树脂中的Cl-代烷在碱作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸；当载体树脂为羟基类型树脂时，Fmoc-Leu-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Leu-OH的羧基与树脂中的羟基在偶联剂、活化剂和碱催化剂的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。
作为本发明优选的方案是，所述固相偶联合成法：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去保护Fmoc后再与下一个保护氨基酸偶联反应，偶联反应时间为60～300分钟，优选的为100～140分钟。
作为本发明优选的方案，上述比伐卢定树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到比伐卢定粗品：
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-
Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH。
进一步地，所述比伐卢定树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1，2-乙二硫醇(EDT)和水混合溶剂，混合溶剂的配比为：TFA的比列为80-95％(V/V)，EDT的比例为1～10％(V/V)，余量为水。
优选的配比为89-91％、EDT4-6％、余量为水。最优的，配比为90％、EDT5％、余量为水。
所述酸解剂用量为每克比伐卢定树脂需要4～15ml酸解剂，优选的，每克比伐卢定树脂需要9～11ml酸解剂。
使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～5小时，优选的为2小时。
进一步的，比伐卢定粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到比伐卢定纯品。
本发明方法直接使用含Gly的保护氨基酸片段制备比伐卢定，在整个制备过程中未使用Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH作为原料，直接避免了[+1Gly]-比伐卢定、[-1Gly]-比伐卢定、[+2Gly]-比伐卢定和[-2Gly]-比伐卢定等杂质的产生，使纯化难度大幅度减低，保证了产品纯度，所得大于产品纯度99.5％，单一杂质小于0.2％，同时可使用Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-OH片段，避免了[-1Arg]-比伐卢定杂质的产生，有助于产品收率的提高。与已有技术相比，本发明工艺具有反应操作简单、反应条件温等特点，具有广泛的实用价值和应用前景。
具体实施方式
本发明比伐卢定的制备方法，包括固相多肽合成法制备比伐卢定树脂、比伐卢定树脂酸解得到比伐卢定粗品、比伐卢定粗品纯化得到比伐卢定纯品，其中固相多肽合成法制备比伐卢定树脂的方法为：在Fmoc-Leu-载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的保护氨基酸或片段，得到比伐卢定树脂：
R1-D-Phe-Pro-X-Y-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-
Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂
其中，
R1为Fmoc或Boc或H；
X为Arg(Pbf)-Pro；
Y为Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R2)-Gly-Asp(OtBu)，R2为Trt或H。
作为本发明优选的方案，接入X片段时，
1)用1次偶联直接接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-OH；或
2)用2次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-Pro-OH、第二次为Fmoc-Arg(Pbf)-OH。
作为本发明优选的方案，接入Y片段时，
1)分2次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-Asn(R2)-Gly-Asp(OtBu)-OH，第二次为Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；或
2)分3次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-Asp(OtBu)-OH、第二次为Fmoc-Asn(R2)-Gly-OH、第三次为Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；或
3)分3次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-OH、第二次为Fmoc-Asn(R2)-OH、第三次为Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；或
4)分3次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-Asp(OtBu)-OH、第二次为Fmoc-Gly-Asn(R2)-Gly-OH，第三次为Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH。
本发明接入X和Y以外的其它片段时保护氨基酸分别为：
Fmoc-D-Phe-OH或Boc-D-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Glu(OtBu)-OH；Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
其中，上述Fmoc为9-芴甲氧羰基，tBu为叔丁基、Trt为三苯基甲烷、OtBu为叔丁氧基、Boc为叔丁氧羰酰基。
本发明中，各个保护氨基酸用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍，优选3倍。
本发明中所述固相偶联合成法具体为：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去保护Fmoc后再与下一个保护氨基酸偶联反应。脱去Fmoc保护的试剂为10～30％(V/V)哌啶(PIP)/N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，优选的为20％(V/V)。使用的去保护试剂用量为每克投料树脂5～15ml，优选为每克投料树脂10ml。去保护反应时间为10～60分钟，优选为15～25分钟。
偶联时需添加缩合试剂和活化试剂，缩合试剂选自N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)。优选的为N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)。
缩合试剂的摩尔用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选为2.5～3.5倍。
活化试剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)，优选的为1-羟基苯并三唑(HOBt)。
活化试剂用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选的为2.5～3.5倍。
偶联反应时间为60～300分钟，优选的为100～140分钟。
作为本发明优选的方案，所述载体树脂为Trityl-Cl类型树脂或羟基类型树脂，其中Trityl-Cl类型树脂优选为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl树脂、4-MethoYytrityl-Cl树脂或2-ClTrity-Cl树脂；羟基类型树脂优选为Wang树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂。
所述Fmoc-Leu-载体树脂可以将上述载体树脂与Fmoc-Leu-OH偶联得到。所述Fmoc-Leu-载体树脂的取代值为0.3～1.5mmol/g，优选的取代值为0.5～1.2mmol/g树脂时产率较高。
作为本发明优选的方案，当载体树脂为三苯甲基氯树脂时，Fmoc-Leu-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Leu-OH的羧基与树脂中的Cl-代烷在碱作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。
所述的碱选自N.N-二异丙基乙基胺(DIEA)、三乙胺(TEA)、吡啶中的至少一种，优选为DIEA。碱的摩尔用量为保护氨基酸摩尔数的1.5～3倍。
酯化反应时间为1～6小时，优选为3小时。
作为本发明优选的方案，当载体树脂为羟基类型树脂时，Fmoc-Leu-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Leu-OH的羧基与树脂中的羟基在偶联剂、活化剂和碱催化剂的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。酯化反应时间为12～36小时，优选为18小时。
所述偶联剂选自N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)中的至少一种，优选为DIC。偶联剂用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍，优选为3倍。
所述碱催化剂为4-N，N-二甲基吡啶(DMAP)，用量为为所投料树脂总摩尔数的0.1倍。
所述活化剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)中的至少一种，优选为HOBt。活化剂用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍，优选的为3倍。
进一步的，上述比伐卢定树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到比伐卢定粗品：
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-
Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH
上述比伐卢定树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1，2-乙二硫醇(EDT)和水混合溶剂，混合溶剂的配比为：TFA的比列为80-95％(V/V)，EDT的比例为1～10％(V/V)，余量为水。优选的配比为89-91％、EDT4-6％、余量为水。最优的，配比为90％、EDT5％、余量为水。
所述酸解剂用量为每克比伐卢定树脂需要4～15ml酸解剂，优选的，每克比伐卢定树脂需要9～11ml酸解剂。
使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～5小时，优选的为2小时。
进一步的，比伐卢定粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到比伐卢定纯品。纯化方法具体为：
称取比伐卢定粗品粉末，加入到适量的水中，搅拌下滴加稀氨水调pH＝4.5～7.5，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，备用。
然后采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90ml/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化。取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得比伐卢定纯化浓缩液。
取比伐卢定纯化浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用。采用高效液相色谱法，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-乙腈，色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90ml/min。采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，收集脱盐主峰并用分析液相检测纯度，合并脱盐主峰溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，得到比伐卢定三氟醋酸盐水溶液，冷冻干燥得产品(比伐卢定三氟醋酸盐)。
本发明方法直接使用保护氨基酸片段制备比伐卢定，产品纯度大于99.5％，单一杂质小于0.2％。与已有技术相比，本发明工艺具有反应操作简单、反应条件温等特点，具有广泛的实用价值和应用前景。
通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容：
实施例1Fmoc-Leu-Wang树脂的制备
取wang树脂500g(取代值为1.0mmol/g)，用5L N，N-二甲基酰胺(DMF)溶涨30分钟，加入Fmoc-Leu-OH 353g(1.0mol)，搅拌30分钟后加入155ml DIC(1.0mol)、135g HOBt(1.0mol)、6.1g(0.05mol)DMAP，室温搅拌反应18小时，过滤后树脂分别用DMF、二氯甲烷(DCM)、甲醇洗涤3次，减压干燥，得Fmoc-Leu-Wang树脂651g，酯化收率95.6％。
实施例2Fmoc-Leu-Wang树脂脱Fmoc保护得到H-Leu-Wang树脂
取上述Fmoc-Leu-Wang树脂，用5L 20％哌啶(PIP)/NN-二甲基酰胺(DMF)溶液溶涨10分钟，过滤后再加入5L 20％PIP/DMF溶液，室温搅拌反应25分钟，过滤后树脂分别用DMF、DCM、甲醇洗涤3次，减压干燥即得H-Leu-Wang树脂的制备。
实施例3Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH的合成
取3.0mol Fmoc-Asn(Trt)-OH和3.0mol HOBt，用适量DMF溶解；另取3.0mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液。
取总摩尔数为1.0mmol的Fmoc-Gly-2-Cl-Trt-树脂，采用5L 20％PIP/DMF溶液去Fmoc保护25分钟，过滤后树脂分别用MDF、DCM洗涤3次，加入上述保护氨基酸溶液，室温搅拌反应3小时，反应完成后，过滤后树脂分别用MDF、DCM洗涤3次，干燥，制得Fmoc-Asn(Trt)-Gly-2-Cl-Trt-树脂。
取Fmoc-Asn(Trt)-Gly-2-Cl-Trt-树脂，加入20L 30％六氟异丙醇/DCM溶液，搅拌反应2小时，过滤收集滤液，减压蒸干溶剂，减压干燥，得Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH 613g，收率为93.7％，纯度为97.2％，MS m/z：655(M+1)
实施例4Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的合成
取3.0mol Fmoc-Gly-OH和3.0mol HOBt，用适量DMF溶解；另取3.0mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液。
取总摩尔数为1.0mmol的Fmoc-Gly-2-Cl-Trt-树脂，采用5L 20％PIP/DMF溶液去Fmoc保护25分钟，过滤后树脂分别用MDF、DCM洗涤3次，加入上述保护氨基酸溶液，室温搅拌反应3小时，反应完成后，过滤后树脂分别用MDF、DCM洗涤3次。
重复上述两步反应，接入另外2个Gly，制得Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-2-Cl-Trt-树脂。
取Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-2-Cl-Trt-树脂，加入20L 30％六氟异丙醇/DCM溶液，搅拌反应2小时，过滤收集滤液，减压蒸干溶剂，减压干燥，得Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 457g，收率为97.2％，纯度为98.3％，MS m/z：469(M+1)
实施例5Fmoc-Arg(pbf)-Pro-OH的合成
取3.0mol Fmoc-Arg(pbf)-OH和3.0mol HOBt，用适量DMF溶解；另取3.0mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液。
取总摩尔数为1.0mmol的Fmoc-Pro-2-Cl-Trt-树脂，采用5L 20％PIP/DMF溶液去Fmoc保护25分钟，过滤后树脂分别用MDF、DCM洗涤3次，加入上述保护氨基酸溶液，室温搅拌反应3小时，反应完成后，过滤后树脂分别用MDF、DCM洗涤3次，干燥，制得Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2-Cl-Trt-树脂。
取Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2-Cl-Trt-树脂，加入20L 30％六氟异丙醇/DCM溶液，搅拌反应2小时，过滤收集滤液，减压蒸干溶剂，减压干燥，得Fmoc-Arg(pbf)-Pro-OH 682g，收率为91.4％，纯度为96.9％，MS m/z：747(M+1)
实施例6比伐卢定树脂的合成
比伐卢定树脂为：
R1-D-Phe-Pro-X-Y-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-
Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂
其中：R1为Fmoc；X为1次偶联直接接入Fmoc-Arg(pbf)-Pro-OH；Y分3次偶联依次接入，第一次为Fmoc-Asp(OtBu)-OH、第二次为Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH，第三次为Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
取Fmoc-Leu-Wang树脂，依次与表1所示的保护氨基酸偶联，制得比伐卢定树脂。本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第2至第16个氨基酸相对应的保护氨基酸如下所示：
表1
  接肽顺序n＝   保护氨基酸   分子量
  2   Fmoc-Tyr(tBu)-OH   460
  3   Fmoc-Glu(OtBu)-OH   426
  4   Fmoc-Glu(OtBu)-OH   426
  5   Fmoc-Pro-OH   337
  6   Fmoc-Ile-OH   353
  7   Fmoc-Glu(OtBu)-OH   426
  8   Fmoc-Glu(OtBu)-OH   426
  9   Fmoc-Phe-OH   387
  10   Fmoc-Asp(OtBu)-OH   412
  11   Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH   654
  12   Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH   468
  13   Fmoc-Arg(pbf)-Pro-OH   746
  14   Fmoc-Pro-OH   337
  15   Fmoc-D-Phe-OH   387
其中第11个为实施例3制得的Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH，第12个为实施例4制得的Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，第13个为实施例5制得的Fmoc-Arg(pbf)-Pro-OH。
保护氨基酸的活化方法为：
取1.5mol保护氨基酸和1.5mol HOBt，用适量DMF溶解；另取1.5mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液。
取总摩尔数为0.5mmol的Fmoc-Leu-Wang树脂，用5L 20％哌啶(PIP)/NN-二甲基酰胺(DMF)溶液溶涨10分钟，过滤后再加入5L 20％PIP/DMF溶液，室温搅拌反应25分钟，过滤后树脂分别用DMF、DCM、甲醇洗涤3次，减压干燥即得H-Leu-Wang树脂的制备。
去Fmoc的树脂(H-Leu-Wang树脂)加入活化后的第2个保护氨基酸溶液，偶联反应60～300分钟，过滤洗涤得2肽树脂。2肽树脂用5L 20％PIP/DMF溶液去Fmoc保护25分钟，过滤洗涤后，与第3个活化后的保护氨基酸溶液偶联反应60～300分钟，过滤洗涤后得3肽树脂。
采用上述同样方法，依次接入第4至第17个氨基酸对应的Fmoc-保护氨基酸，即前一步得到的Fmoc-[1～(n-1)个]氨基酸-Wang树脂，脱Fmoc保护后与活化的Fmoc-保护氨基酸(第n个)偶联反应60～300分钟，n＝2～17。接完所有保护氨基酸后，再用5L 20％PIP/DMF溶液去Fmoc保护25分钟，过滤洗涤后，即得比伐卢定树脂。
实施例7比伐卢定树脂的酸解
取实施例7制得的比伐卢定树脂，加入裂解试剂[TFA/水/EDT＝95∶5∶5(V/V)(约10ml/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得白色粉末即为比伐卢定粗品。
实施例8比伐卢定粗品的纯化
称取比伐卢定粗品粉末，将粗品加入纯化水中(约20ml水/g粗品)，搅拌下滴加稀氨水调pH，将pH控制在～5.0，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，备纯化用。采用高效液相色谱法进行纯化，流动相A为0.1％TFA/水溶液，流动相B为0.1％TFA/乙腈溶液，色谱柱为77mm*250mm C18柱，流速为90ml/min，梯度洗脱条件见表2，循环进样纯化。取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得比伐卢定纯化浓缩液。
表2
  时间   流动相B
  00→05.0min：   5％
  05→20.0min：   5％→15％
  20→25.0min：   15％
  25→65.0min：   15％→35％
  65→75.0min：   35％
  75→76.0min：   35％→90％
  76→79.0min：   90％
  79→80.0min：   90％→5％
  80→90.0min：   5％
取比伐卢定纯化浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用。采用高效液相色谱法脱盐，流动相A为0.1％TFA/水溶液，流动相B为乙腈溶液，色谱柱为77mm*250mm C18柱，流速为90ml/min，梯度洗脱条件见表3，循环进样脱盐。取待脱盐浓缩液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集脱盐主峰并用分析液相检测纯度，合并脱盐主峰溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，得到比伐卢定三氟醋酸盐水溶液。
表3
  时间   流动相B
  00→05.0min：   5％
  05→40.0min：   5％→35％
  40→55.0min：   35％
  55→60.0min：   35％→5％
  60→70.0min：   5％
取比伐卢定三氟醋酸盐水溶液，冷冻干燥，得产品574g，总收率为52.7％。
分子量：2181.6(100％M+H)；比旋度：-113.3°；水分2.6％；三氟醋酸：10.2％；纯度：99.7％，单一最大杂质为0.13％。

Claims (13)

1.一种比伐卢定的制备方法，包括固相多肽合成法制备比伐卢定树脂、比伐卢定树脂酸解得到比伐卢定粗品、比伐卢定粗品纯化得到比伐卢定纯品，其中固相多肽合成法制备比伐卢定树脂的方法为：在Fmoc-Leu-载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的保护氨基酸或片段，得到比伐卢定树脂：
R1-D-Phe-Pro-X-Y-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-
Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂
其中，
R1为Fmoc或Boc或H；
X为Arg(Pbf)-Pro；
Y为Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R2)-Gly-Asp(OtBu)，R2为Trt或H；
接入X片段时，用1次偶联直接接入时，Fmoc-保护氨基酸或片段为：Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-OH；
接入Y片段时，
1）分2次偶联依次接入时，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-Asn(R2)-Gly-Asp(OtBu)-OH，第二次为Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；或
2）分3次偶联依次接入时，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-OH、第二次为Fmoc-Asn(R2)-OH、第三次为Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；或
3）分3次偶联依次接入时，Fmoc-保护氨基酸或片段为：第一次为Fmoc-Asp(OtBu)-OH、第二次为Fmoc-Gly-Asn(R2)-Gly-OH，第三次为Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH。
2.根据权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：接入X和Y以外的其它的保护氨基酸分别为：
Fmoc-D-Phe-OH或Boc-D-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Glu(OtBu)-OH；Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
3.根据权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：接入各个氨基酸片段时，保护氨基酸的用量为载体树脂总摩尔数的1.2～6倍。
4.根据权利要求3所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：接入各个氨基酸片段时，保护氨基酸的用量为载体树脂总摩尔数的3倍。
5.根据权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：所述Fmoc-Leu-载体树脂是将载体树脂与Fmoc-Leu-OH偶联得到；所述Fmoc-Leu-载体树脂的Fmoc-Leu取代值为0.3～1.5mmol/g树脂。
6.根据权利要求5所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：所述Fmoc-Leu-取代值为0.5～1.2mmol/g树脂。
7.根据权利要求5所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：所述载体树脂为Trityl-Cl类型树脂或羟基类型树脂。
8.根据权利要求7所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：所述Trityl-Cl类型树脂为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl树脂、4-Methoxytrityl-Cl树脂或2-Cl Trity-Cl树脂；所述羟基类型树脂为Wang树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂。
9.根据权利要求5所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：当载体树脂为三苯甲基氯树脂时，Fmoc-Leu-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Leu-OH的羧基与树脂中的Cl-代烷在碱作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸；当载体树脂为羟基类型树脂时，Fmoc-Leu-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Leu-OH的羧基与树脂中的羟基在偶联剂、活化剂和碱催化剂的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。
10.根据权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：所述固相偶联合成法是：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去保护Fmoc后再与下一个保护氨基酸偶联反应，偶联反应时间为60～300分钟。
11.根据权利要求10所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：偶联反应时间为100～140分钟。
12.根据权利要求1-11任一项所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：比伐卢定树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到比伐卢定粗品：
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-
Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH。
13.根据权利要求12所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：比伐卢定树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸、1,2-乙二硫醇和水混合溶剂，混合溶剂的体积百分比为：三氟醋酸的比例为80-95%，1,2-乙二硫醇的比例为1～10%，余量为水。
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