WO2014032257A1 - 一种比伐卢定的制备方法 - Google Patents

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WO2014032257A1
WO2014032257A1 PCT/CN2012/080792 CN2012080792W WO2014032257A1 WO 2014032257 A1 WO2014032257 A1 WO 2014032257A1 CN 2012080792 W CN2012080792 W CN 2012080792W WO 2014032257 A1 WO2014032257 A1 WO 2014032257A1
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glu
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fmoc
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宓鹏程
覃亮政
马亚平
袁建成
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深圳翰宇药业股份有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin

Definitions

  • the invention relates to the field of preparation methods of polypeptide medicines, in particular to a preparation method of bivalirudin. Background technique
  • Bivalimdin (Angiomax) is a synthetic anticoagulant that is a clinically used thrombin inhibitor that directly inhibits coagulation by binding to the catalyst site and the anion output site of the circulating and thrombin clots. The role of the enzyme. Clinical studies have shown that bivalirudin has superior pharmacological and pharmacokinetic properties compared to other anticoagulant drugs, and has been widely used in clinical treatment in recent years.
  • Bivalirudin is a carboxy terminal (C-terminal) polypeptide of a hirudin derivative, and the polypeptide comprises 20 amino acid residues, and the structural sequence is as shown in SEQ ID NO: 6.
  • Chinese Patent No. 200910051311 discloses a Fmoc solid phase sequential synthesis method of bivalirudin, which uses Wang resin as a starting resin, and sequentially inserts a protected amino acid, and the obtained polypeptide resin is subjected to trifluoroacetic acid hydrolysis to obtain crude bivalirudin.
  • the preparation process is more straightforward.
  • the world patent ⁇ 91/02750 ⁇ 3 ⁇ 4 has a method of preparing bivalirudin by Boc method, using Merrifiled resin as solid phase carrier for synthesis, sequentially adding protected amino acids, and finally using hydrofluoric acid (HF) acid hydrolysis. .
  • the bivalirudin structure contains a Gly-Gly-Gly-Gly fragment, it is easy to generate impurities or 1 or 2 Gly impurities according to the characteristics of Gly in the process of sequentially coupling -Gly. These impurities are similar to the polarity of Bivalimdin itself, and are difficult to remove during the subsequent separation and purification process, resulting in a decrease in total yield and product purity, and even affecting the quality of the drug and increasing the risk of drug use.
  • the patent WO20117725 uses Fmoc-Gly-Gly-OH as a raw material to synthesize the -Gly-Gly-Gly-Gly fragment, but this only solves [-Gly]-Bivalimdin and
  • the technical problem to be solved by the present invention is to provide a preparation method of bivalirudin to avoid introduction of [-Gly]-Bivalimdin, [-2Gly]-Bivalirudin, [+Gly]-Bivalimdin in the preparation of raw materials. Or [+2Gly]-Bivalimdin impurities.
  • the preparation method of bivalirudin provided by the invention comprises the following steps:
  • Step 1 preparing a polypeptide fragment
  • Step 2 coupling the polypeptide fragment with an amino acid and a solid phase carrier to prepare a bivalirudin peptide resin
  • Step 3 taking the bivalirudin peptide resin to be lysed and purified to obtain bivalirudin;
  • amino acid sequence of the polypeptide fragment is set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.
  • the coupling is specifically a step of coupling Leu, Tyr, Glu, Glu, Pro, Ile, Glu, Glu, Phe, Asp, and the polypeptide having the structure shown in SEQ ID NO: 2 on the solid phase carrier.
  • the coupling is specifically coupling Leu, Tyr, Glu, Glu, Pro, Ile, Glu, Glu, Phe, Asp, Gly, Asn, and having SEQ ID NO: 3 on the solid phase carrier. a polypeptide fragment of the structure, Arg, Pro, Phe, having
  • the coupling is specifically a step of coupling a Leu, Tyr, Glu, Glu, Pro, Ile, Glu, Glu, Phe, Asp polypeptide having the structure shown in SEQ ID NO: 5 on the solid phase carrier.
  • amino protecting group and the protected amino group employed in the amino acid side chain of the present invention are as shown in Table 1:
  • the step 1 is specifically:
  • the amino acid resin having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 1-5 is cleaved to obtain a polypeptide fragment having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 1 to 5.
  • the degree of substitution of the Fmoc-Gly-CTC resin or the Fmoc-Gly-Gly-CTC resin is from 0.8 mmol/g to 1.2 mmol/g, more preferably from 0.9 mmol/g to 1.1 mmol/g, most Preferably 1.0 mmol/go
  • Fmoc-Pro-OH one or both of Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-Gly-OH, and Fmoc-Gly-OH.
  • the solid phase carrier described in step 2 is a Wang resin.
  • the cleavage in the step 3 is carried out by the composition of the reagent by volume: trifluoroacetic acid 90% to 95%, triisopropyl silane 2% to 4%, and the balance being water.
  • the mass to volume ratio of the reagent to the bivalirudin peptide resin is 10:1 in ml/g.
  • the purification described in step 3 employs high performance liquid chromatography.
  • the present invention provides a preparation method of bivalirudin which can separate and remove the impurities in the crude peptide by using the amino acid, thereby utilizing the difference in hydrophobicity and chargeability.
  • the production of bivalirudin impurities that are missing or increased by 1 or 2 Gly are avoided.
  • the method provided by the invention is low in cost and the process is simple.
  • Figure 1 is a chromatogram of the bivalirudin peptoid prepared in Example 25. detailed description
  • the invention provides a preparation method of bivalirudin, which can be used by those skilled in the art. Text content, appropriate improvement of process parameters. It is to be understood that all such alternatives and modifications are obvious to those skilled in the art and are considered to be included in the present invention.
  • the method and the application of the present invention have been described by the preferred embodiments, and it is obvious that the method and application described herein may be modified or appropriately modified and combined without departing from the scope of the present invention. The technique of the present invention is applied.
  • the preparation method of bivalirudin provided by the invention comprises the following steps:
  • Step 1 preparing a polypeptide fragment
  • Step 2 coupling the polypeptide fragment with an amino acid and a solid phase carrier to prepare a bivalirudin peptide resin
  • Step 3 taking the bivalirudin peptide resin to be lysed and purified to obtain bivalirudin;
  • amino acid sequence of the polypeptide fragment is shown as SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid is coupled to the solid phase carrier.
  • the sequence is: Leu, Tyr, Glu, Glu, Pro, Ile, Glu, Glu, Phe, Asp, a polypeptide fragment having the structure shown in SEQ ID NO: 2, a polypeptide fragment having the structure shown in SEQ ID NO: 1, Arg, Pro, Phe, have
  • polypeptide fragment employed is SEQ ID NO:
  • the sequence of coupling the amino acid in the solid phase carrier is: Leu, Tyr, Glu, Glu, Pro, Ile, Glu, Glu, Phe, Asp, a polypeptide fragment having the structure shown in SEQ ID NO: 5, having the SEQ ID
  • the polypeptide fragment of NO: 4, Arg, Pro, Phe has D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly
  • amino protecting group and the protected amino group used in the present invention are shown in Table 1:
  • Fmoc-Gly-Gly-CTC resin added to the solid phase reaction column, washed with hydrazine, hydrazine dimethylformamide (DMF), swollen with DMF, and then removed with 20% hexahydropyridine / DMF solution (DBLK)
  • the Fmoc protecting group is then washed with DMF and then with dichloromethane (DCM); then, the amino acid with Fmoc protecting group and the corresponding side chain protecting group are dissolved in DCM and DMF in a volume ratio of 1:1.
  • DCM dichloromethane
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • SEQ ID NO amino acid resin of amino acid sequence of 1-5; finally, an amino acid resin having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1-5 is added to a cleavage reactor, and trifluoroethanol (TFE) and dichloromethane are added.
  • TFE trifluoroethanol
  • the degree of substitution of the Fmoc-Gly-CTC resin or the Fmoc-Gly-Gly-CTC resin used in the preparation of the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 1 to 5 of the present invention is 0.8 mmol/g. - 1.2mmol/g, the best effect is 1.0mmol/g.
  • the amino acid with Fomc protecting group used in the present invention is Fmoc-Pro-OH
  • An amino acid fragment having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NOS: 1 to 5 is synthesized by one or both of Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-Gly-OH, and Fmoc-Gly-OH. Since Pro and Asn are introduced into the synthesized polypeptide fragment, the difference in hydrophobicity and chargeability can be used to separate and remove the bivalirudin impurity which is missing or increased by 1 or 2 Gly.
  • the solid phase carrier used in the synthesis of the bivalirudin polypeptide resin of the present invention is Wang resin.
  • the mass-to-volume ratio of the lysate to the bivalirudin peptide resin is 10:1 in ml/g.
  • the composition of the lysate is expressed by volume percent: trifluoroacetic acid 90% ⁇ 95%, triisopropylsilane 2% ⁇ 4%, and the balance is water.
  • the purification of the crude valacidine of the present invention is carried out by high performance liquid chromatography, and the purified column is subjected to a reverse phase/weak cation exchange mixed mode stationary phase packing, and the salt transfer column is subjected to a reverse phase C18 chromatography packing.
  • the preparation method of bivalirudin provided by the invention introduces other amino acids contained in the bivalirudin polypeptide chain into the synthesized Gly-Gly-Gly-Gly raw material fragment, avoiding deletion or increasing 1 or 2 Gly
  • the production of bivalirudin impurity impurities is low in cost and the process is simple.
  • the Wang resin and 2-CTC resin used in the present invention were purchased from Tianjin Nankai Hecheng Co., Ltd., and the reverse phase/weak cation exchange mixed mode stationary phase was purchased from Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, and various protected amino acids were purchased from Jill Biochemical Co., Ltd. Other solvents and reagents are common commercial products.
  • Example 1 Preparation of Fmoc-Gly-Gly-CTC Resin with a degree of substitution of 0.8 mmol/g
  • the mixture was washed three times with DMF, three times with DCM, and the methanol was subjected to a thousand cycles to obtain Fmoc-Gly-Gly-CTC resin, and the detection degree of substitution was 1.113 mmol/g.
  • the Fmoc-Gly-Gly-CTC tree having a degree of substitution of 0.976 mmol/g prepared in Example 2 was weighed 92.2 g (90 mmol), added to a solid phase reaction column, washed twice with DMF, and swollen with DMF-Fmoc- After 30 minutes of Gly-Gly-CTC resin, Fmoc protection was removed with DBLK, then washed 4 times with DMF and 2 times with DCM.
  • the Fmoc-Gly-Gly-CTC tree having a degree of substitution of 0.976 mmol/g prepared in Example 2 was weighed 92.2 g (90 mmol), added to a solid phase reaction column, washed twice with DMF, and swollen with DMF-Fmoc- After 30 minutes of Gly-Gly-CTC resin, Fmoc protection was removed with DBLK, then washed 4 times with DMF and 2 times with DCM. Will 95.7g Fmoc-Gly
  • the Fmoc-Gly-Gly-CTC tree having a degree of substitution of 0.976 mmol/g prepared in Example 2 was weighed 92.2 g (90 mmol), added to a solid phase reaction column, washed twice with DMF, and swollen with DMF-Fmoc- After 30 minutes of Gly-Gly-CTC resin, Fmoc protection was removed with DBLK, then washed 4 times with DMF and 2 times with DCM.
  • Example 13 The 25.5 g amino acid sequence obtained in Example 13 is shown in SEQ ID N0.6.
  • the reactant was filtered through a sand funnel, and the filtrate was collected.
  • the resin was washed three times with a small amount of TFA, and the filtrate was combined and concentrated under reduced pressure. It was precipitated by the addition of iced diethyl ether and washed three times with anhydrous diethyl ether and dried in vacuo to give white powdery solid, ⁇ /RTI>
  • the weight yield was 95.4% and the HPLC purity was 80.6%.
  • Example 13 The 25.5 g amino acid sequence obtained in Example 13 is as shown in SEQ ID NO.
  • ⁇ 6 : SLL : Vd ⁇ ) W ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ f ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ k ⁇ f ⁇ /I m OI ⁇ ' ⁇ , ⁇ ⁇
  • Example 15 The 24.6 g amino acid sequence obtained in Example 15 is Boc-D-Phe as shown in SEQ ID N0.6.
  • Example 15 The 24.6 g amino acid sequence obtained in Example 15 is as shown in SEQ ID N0.6.
  • the amino acid sequence obtained by the production method of any one of the present inventions 16 to 24 was dissolved in 600 ml of purified bivalirudin as shown in SEQ ID N0.6, filtered, and the filtrate was collected for use.
  • Mobile phase Phase A 20 mmol/L sodium dihydrogen phosphate buffer solution with 5% acetonitrile (V/V) and pH adjusted to 2.5 with phosphoric acid.
  • Mobile phase Phase B 20 mmol/L sodium dihydrogen phosphate + 300 mmol/L sodium chloride buffer solution supplemented with 50% acetonitrile (V/V), adjusted to pH 7.0 with sodium hydroxide.
  • Loading amount 2.0 g (100 ml).
  • Salt transfer chromatography conditions Column: 50 250mm, built-in reversed phase C18 chromatography packing.
  • the content of [-Gly]-Bivalimdin and [+Gly]-Bivalimdin impurities in the bivalirudin peptide prepared by the present invention is less than 0.05% by mass percentage, [-2Gly]-Bivalirudin and [+ 2Gly]-Bivalimdin was not detected, and the content of other impurities was less than 0.10%.
  • the total yield was 49.3%.

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Abstract

提供了一种比伐卢定的制备方法。该方法包括制备多肽片段，并将多肽片段与氨基酸、固相载体偶联制得比伐卢定肽树脂，然后裂解并纯化得到比伐卢定。该方法利用比伐卢定中Gly-Gly-Gly-Gly两侧是疏水性和带电性的氨基酸残基的特点制备作为原料的多肽片段，通过极性和电荷的差异有效分离杂质，避免了缺失或增加1个或2个Gly的比伐卢定杂质的产生。

Description

一种比伐卢定的制备方法 技术领域
本发明涉及多肽药物制备方法领域，尤其涉及一种比伐卢定的制备方 法。 背景技术
比伐卢定（Bivalimdin, Angiomax )是人工合成抗凝药物， 是一种应 用于临床的凝血酶抑制剂，可通过结合于催化剂位点和循环及凝血酶血块 的阴离子输出位点而直接抑制凝血酶的作用。临床研究显示： 与其他抗凝 药物相比， 比伐卢定的药理作用和药动力学特点更为优越，故而近年来较 广的应用于临床治疗。
比伐卢定是水蛭素衍生物羧基末端（C端）的多肽， 该多肽包含 20个 氨基酸残基， 结构序列为如 SEQ ID NO: 6所示。
关于比伐卢定的制备方法， 国内外已有大量报道： 合成三条分别含有 6, 6, 8个氨基酸全保护片段， 然后在液相中将三个片 段依次偶联。 中国专利 200980152943.3中报道了与上述专利相似的全液相 合成方法， 只是将片段分为了 5条， 并提高了比伐卢定的产率。
中国专利 200910051311公开了一种比伐卢定的 Fmoc固相顺序合成方 法， 采用 Wang树脂为起始树脂， 依次接入保护氨基酸， 所得多肽树脂采 用三氟乙酸酸解得到比伐卢定粗品， 使制备过程更筒单。 世界专利 λ¥Ο91/02750·¾道了一种采用 Boc方法制备比伐卢定的方法， 采用 Merrifiled树脂为固相载体进行合成， 依次接入保护氨基酸， 最终采用氢 氟酸（HF ) 酸解。
但是， 由于比伐卢定结构中含有一个 Gly-Gly-Gly-Gly片段，在依次偶 联 -Gly过程中，根据 Gly自身特性，极易生成缺失或增加 1或 2个 Gly的杂质， 即 这些杂质与 Bivalimdin自身的极性相近， 在后续分离纯化的过程中时 ^艮难 去除， 导致总收率及产品纯度降低， 甚至影响药物质量， 增加用药风险。
为解决这个问题， 专利 WO20117725采用 Fmoc-Gly-Gly-OH为原料进 行 -Gly-Gly-Gly-Gly片段的合成， 但这仅仅解决 [-Gly] -Bivalimdin和
[+Gly]-Bivalimdin的杂质的问题， 无法解决由于原料所产生的
[-2Gly]-Bivalimdin和 [+2Gly]-Bivalimdin的杂质。
中国专利 201110144317则采用了 Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH作为反 应原料来解决上述 Gly杂质的问题。 但是， 无论是采用 Gly或者 Gly-Gly 作为原料对 Gly-Gly-Gly-Gly-进行合成， 都会在原料的制备过程中引入上 述杂质， 从而导致制备的比伐卢定中上述杂质的含量增加。 发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种比伐卢定的制备 方法， 避免在原料制备过程中引入 [-Gly]-Bivalimdin、 [-2Gly]-Bivalirudin, [+Gly]-Bivalimdin或 [+2Gly]-Bivalimdin杂质。
本发明提供的比伐卢定的制备方法， 包括以下步骤：
步骤 1: 制备多肽片段；
步骤 2: 取所述多肽片段与氨基酸、 固相载体偶联制得比伐卢定肽树 脂；
步骤 3: 取所述比伐卢定肽树脂裂解并纯化即得比伐卢定；
所述多肽片段的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 3或 SEQ ID NO: 4或 SEQ ID NO: 5所示。
优选地，所述偶联具体为在所述固相载体上依次偶联 Leu、 Tyr、 Glu、 Glu、 Pro, Ile、 Glu、 Glu、 Phe、 Asp, 具有 SEQ ID NO: 2所示结构的多 肽片段、 具有 SEQ ID NO: 1所示结构的多肽片段、 Arg、 Pro, Phe, 制 得具有 D-Phe-Pro
-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Gl u(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang结构的多肽树 脂。 优选地，所述偶联具体为在所述固相载体上依次偶联 Leu、 Tyr、 Glu、 Glu、 Pro, Ile、 Glu、 Glu、 Phe、 Asp, Gly、 Asn、 具有 SEQ ID NO: 3 所示结构的多肽片段、 Arg、 Pro, Phe, 制得具有
D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly
-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang结构的多肽树脂。
优选地，所述偶联具体为在所述固相载体上依次偶联 Leu、 Tyr、 Glu、 Glu、 Pro, Ile、 Glu、 Glu、 Phe、 Asp, 具有 SEQ ID NO: 5所示结构的多 肽片段、 具有 SEQ ID NO: 4所示结构的多肽片段、 Arg、 Pro, Phe, 制 得具有 D-Phe-Pro
-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Gl u(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang结构的多肽树 脂。
作为优选，作为优选，本发明对氨基酸侧链采用的氨基保护基及所保 护的氨基如表 1所示：
表 1 本发明对氨基酸侧链采用的氨基保护基及所保护的氨基
Figure imgf000004_0001
优选地， 所述步骤 1具体为：
11 )制备 Fmoc-Gly-CTC树脂或 Fmoc-Gly-Gly-CTC树脂；
12 )脱除所述 Fmoc-Gly-CTC树脂或 Fmoc-Gly-Gly-CTC树脂上的 Fmoc保护基， 获得脱除 Fmoc保护基的 CTC树脂；
13 )取所述脱去 Fmoc保护基的 CTC树脂， 依次偶联带有 Fomc保 护基的氨基酸，分别制得具有如 SEQ ID NO: 1~5所示氨基酸序列的氨基 酸树脂；
14 )取所述具有如 SEQ ID NO: 1-5所示氨基酸序列的氨基酸树脂裂 解， 制得具有如 SEQ ID NO: 1~5所示氨基酸序列的多肽片段。 优选地， 所述 Fmoc-Gly-CTC树脂或 Fmoc-Gly-Gly-CTC树脂的替代 度为 0.8mmol/g~1.2mmol/g, 更优选的为 0.9 mmol/g ~l.lmmol/g, 最优选的 为 1.0 mmol/g o
作为优选， 步骤 13 ) 中所述的带有 Fomc保护基的氨基酸为
Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH、 Fmoc-Gly-Gly-OH、 Fmoc-Gly-OH中 的一种或两种。
由于在合成的多肽片段中引入了 -Pro和 -Asn这两种比伐卢定肽链中 包含的氨基酸，从而在纯化过程中，可以利用疏水性和带电性的差异将缺 失或增加 1或 2个 Gly的比伐卢定杂质分离去除。
优选地， 步骤 2中所述的固相载体为 Wang树脂。
优选地，步骤 3中所述裂解采用试剂的组成按体积百分比计为： 三氟 乙酸 90%~95%、 三异丙基硅烷 2%~4%, 余量为水。
优选地， 以 ml/g计所述试剂与所述比伐卢定肽树脂的质量体积比为 10:1。
优选地， 步骤 3中所述的纯化采用高效液相色谱法。
与现有技术相比，本发明提供了一种比伐卢定的制备方法，该方法在 他氨基酸,从而可以利用疏水性和带电性的差异将粗肽中的杂质 4艮好的分 离去除，避免了缺失或增加 1或 2个 Gly的比伐卢定杂质的产生。 同时本 发明提供的方法成本低廉、 工艺过程筒单。 实验表明： 按照本方法制备的 比伐卢定粗品纯度为 77.1% ~ 87.1% , 纯化后比伐卢定中未检出 [-2Gly]-Bivalirudin 和 [+2Gly]-Bivalimdin 杂质， [-Gly]-Bivalimdin 或 [+Gly]-Bivalirudin单一杂质含量小于 0.05。 附图说明
图 1为实施例 25制得的比伐卢定精肽色谱图。 具体实施方式
本发明提供了一种比伐卢定的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本 文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有类似的替换和 改动对本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。 本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在 不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适 当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。
本发明提供的比伐卢定的制备方法， 包括以下步骤：
步骤 1: 制备多肽片段；
步骤 2: 取所述多肽片段与氨基酸、 固相载体偶联制得比伐卢定肽树 脂；
步骤 3: 取所述比伐卢定肽树脂裂解并纯化即得比伐卢定；
其中多肽片段的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 3或 SEQ ID NO: 4或 SEQ ID NO: 5所示。
在本发明的一些实施例中， 当采用的多肽片段为具有 SEQ ID NO: 1 所示结构的多肽片段和具有 SEQ ID NO: 2所示结构的多肽片段时，在固 相载体进行偶联氨基酸的顺序为： Leu、 Tyr、 Glu、 Glu、 Pro, Ile、 Glu、 Glu、 Phe、 Asp, 具有 SEQ ID NO: 2所示结构的多肽片段、 具有 SEQ ID NO: 1所示结构的多肽片段、 Arg、 Pro, Phe, 制得具有
D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly
-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(Ot Bu) -Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang结构的多肽树脂。
在本发明的另一些实施例中， 当采用的多肽片段为具有 SEQ ID NO:
3所示结构的多肽片段时， 在固相载体进行偶联氨基酸的顺序为： Leu、
Tyr、 Glu、 Glu、 Pro, Ile、 Glu、 Glu、 Phe、 Asp, Gly、 Asn、 具有 SEQ ID
NO: 3所示结构的多肽片段、 Arg、 Pro, Phe, 制得具有
D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly
-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(0 tBu) -Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu- Wang结构的多肽树脂。
或在本发明的另一些实施例中， 当采用的多肽片段为具有 SEQ ID
NO: 4所示结构的多肽片段和具有 SEQ ID NO: 5所示结构的多肽片段 时， 在固相载体进行偶联氨基酸的顺序为： Leu、 Tyr、 Glu、 Glu、 Pro, Ile、 Glu、 Glu、 Phe、 Asp, 具有 SEQ ID NO: 5所示结构的多肽片段、 具有 SEQ ID NO: 4所示结构的多肽片段、 Arg、 Pro, Phe, 制得具有 D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly
-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu) -Glu (OtBu)-Tyr(tBu)-Leu- Wang结构的多肽树脂。
本发明采用的氨基保护基及所保护的氨基如表 1所示：
表 1 本发明采用的氨基保护基及所保护的氨基
Figure imgf000007_0001
为了制备多肽片段， 首先制备 Fmoc-Gly-CTC树脂或
Fmoc-Gly-Gly-CTC树脂； 然后， 称取 Fmoc-Gly-CTC树脂或
Fmoc-Gly-Gly-CTC树脂，加入固相反应柱中，用 Ν,Ν二甲基甲酰胺（ DMF ) 洗涤， 用 DMF溶胀树脂， 然后用 20%六氢吡啶/ DMF溶液（DBLK )脱 除 Fmoc保护基， 之后先用 DMF洗涤， 再用二氯甲烷（ DCM )洗涤； 然 后， 取带有 Fmoc保护基的氨基酸和相应的侧链保护基溶于体积比为 1:1 的 DCM和 DMF混合溶液中， 冰水浴下加入二异丙基碳二亚胺（ DIC ), 活化后加入固相反应柱中， 室温反应 2 h, 依同样方法偶联下一氨基酸， 分别制得具有如 SEQ ID NO: 1-5所示氨基酸序列的氨基酸树脂； 最后， 取具有如 SEQ ID NO: 1-5所示氨基酸序列的氨基酸树脂加入裂解反应器 中， 加入含有三氟乙醇（TFE )和二氯甲烷（DCM ) 的裂解液（体积比， TFE: DCM=1:4 ), 室温反应 2h。 反应结束， 过滤树脂， 收集滤液。 将滤 液体积旋蒸至 < 25vol%后， 滴加至沉淀试剂中 （体积比， 正己烷： 乙醚 =1:4 ), 离心后用无水乙醚洗涤， 并且真空干燥， 得到具有如 SEQ ID NO: 1-5所示氨基酸序列的多肽片段。
其中，本发明在制备具有如 SEQ ID NO: 1~5所示氨基酸序列时采用 的 Fmoc -Gly-CTC树脂或 Fmoc-Gly-Gly-CTC树脂的替代度为 0.8mmol/g - 1.2mmol/g , 效果最佳的为 1.0mmol/g。
为了更好的分离去除缺失或增加 1或 2个 Gly的比伐卢定中的杂质， 本发明采用的带有 Fomc保护基的氨基酸为 Fmoc-Pro-OH,
Fmoc-Asn(Trt)-OH、 Fmoc-Gly-Gly-OH、 Fmoc- Gly- OH中的一种或两种， 合成具有如 SEQ ID NO: 1~5所示氨基酸序列的氨基酸片段。 由于在合成 的多肽片段中引入了 Pro和 Asn, 从而在纯化过程中， 可以利用疏水性和 带电性的差异将缺失或增加 1或 2个 Gly的比伐卢定杂质分离去除。
此外， 本发明合成比伐卢定多肽树脂时采用的固相载体为 Wang树 脂。
而进行比伐卢定树脂裂解时， 以 ml/g计裂解液与比伐卢定肽树脂的 质量体积比为 10:1。 其中裂解液的组成按体积百分比计为： 三氟乙酸 90%~95%、 三异丙基硅烷 2%~4%, 余量为水。
在此基础上，本发明对比伐卢定粗品的纯化采用高效液相色谱法，纯 化色谱柱采用反相 /弱阳离子交换混合模式固定相填料， 转盐色谱柱采用 反相 C18色谱填料。
本发明提供的比伐卢定的制备方法， 在合成的 Gly-Gly-Gly-Gly原料 片段中引入了比伐卢定多肽链中所包含的其他氨基酸,避免了缺失或增加 1或 2个 Gly的比伐卢定杂质杂质的产生。且本发明提供的方法成本低廉、 工艺过程筒单。
本发明中采用的 Wang树脂和 2-CTC树脂购自天津南开和成有限公 司， 反相 /弱阳离子交换混合模式固定相购自中国科学院大连化物所， 各 种保护氨基酸购自吉尔生化有限公司， 其它溶剂和试剂为普通市售品。
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明： 实施例 1: 替代度为 0.8mmol/g的 Fmoc-Gly-Gly-CTC Resin的制备
称取替代度为 0.85mmol/g的 2-CTC树脂 300g ( 255mmol ),加入到固相 反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30分钟后， 取 180.7g Fmoc-Gly-Gly-OH ( 510mmol )用 DMF溶解， 冰水浴下加入 177.3mL Ν,Ν 二异丙基乙胺（DIPEA ) ( 1020mmol )活化后， 加入上述装有树脂的反应 柱中， 反应 2小时后， 加入 243mL无水曱醇封闭 30min。 用 DCM洗 3次， 曱 醇收缩抽干， 得到 Fmoc-Gly-Gly-CTC树脂， 检测替代度为 0.812mmol/g。 实施例 2: 替代度为 1.0mmol/g的 Fmoc-Gly-Gly-CTC Resin的制备
称取替代度为 1.0 mmol/g的 2-CTC树脂 300g ( 300mmol ), 加入到固相 反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30分钟后， 取 212.6g Fmoc-Gly-Gly-OH(600mmol)用 DMF溶解， 冰水浴下加入 208.6mL DIPEA(1200mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应 2小时后， 加入 243mL无水曱醇封闭 30min。 用 DMF洗涤 3次， DCM洗 3次， 甲醇收缩 抽干， 得到 Fmoc-Gly- Gly- CTC树脂， 检测替代度为 0.976mmol/g。
实施例 3: 替代度为 1.2mmol/g的 Fmoc-Gly-Gly-CTC Resin的制备
称取替代度为 1.25 mmol/g的 2-CTC树脂 300g(375mmol), 加入到固相 反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30分钟后， 取 265.8 g Fmoc-Gly-Gly-OH( 750mmol )用 DMF溶解，冰水浴下加入 260.8 mL DIPEA ( 1500mmol )活化后， 加入上述装有树脂的反应柱中， 反应 2小时后， 加 入 243mL无水甲醇封闭 30min。 用 DMF洗涤 3次， DCM洗 3次， 甲醇收缩抽 千， 得到 Fmoc-Gly-Gly-CTC树脂， 检测替代度为 1.113mmol/g。
实施例 4: 替代度为 0.8mmol/g的 Fmoc-Gly-CTC Resin的制备
称取替代度为 0.85mmol/g的 2-CTC树脂 300g ( 255mmol ),加入到固相 反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30分钟后， 取 151.6g Fmoc-Gly-OH ( 510mmol ) 用 DMF溶解， 冰水浴下加入 177.3mL DIPEA U020mmol )活化后， 加入上述装有树脂的反应柱中， 反应 2小时后， 加 入 243mL无水曱醇封闭 30min。 用 DMF洗涤 3次， DCM洗 3次， 曱醇收缩抽 千， 得到 Fmoc-Gly-CTC树脂， 检测替代度为 0.798mmol/g。
实施例 5: 替代度为 1.0mmol/g的 Fmoc-Gly-CTC Resin的制备
称取替代度为 1.0mmol/g的 2-CTC树脂 300g OOOmmol ), 加入到固相 反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30分钟后， 取 178.4g Fmoc-Gly-OH ( 600mmol ) 用 DMF溶解， 冰水浴下加入 208.6mL DIPEA ( 1200mmol )活化后， 加入上述装有树脂的反应柱中， 反应 2小时后， 加 入 243mL无水甲醇封闭 30min。 用 DMF洗涤 3次， DCM洗 3次， 甲醇收缩抽 干， 得到 Fmoc-Gly-CTC树脂， 检测替代度为 0.956mmol/g。 实施例 6: 替代度为 1.2mmol/g的 Fmoc-Gly-CTC Resin的制备
称取替代度为 1.25mmol/g的 2-CTC树脂 300g ( 375mmol ),加入到固相 反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30分钟后， 取 223.0g Fmoc-Gly-OH ( 750mmol ) 用 DMF溶解， 冰水浴下加入 260.8mL DIPEA ( 1500mmol )活化后， 加入上述装有树脂的反应柱中， 反应 2小时后， 加 入 243mL无水甲醇封闭 30min。 用 DMF洗涤 3次， DCM洗 3次， 甲醇收缩抽 干， 得到 Fmoc-Gly-CTC树脂， 检测替代度为 1.082mmol/g。 实施例 7: 如 SEQ ID NO 1所示的多肽片段 Fmoc-Pro-Gly-Gly-OH的制 备
称取实施例 2中制备的替代度为 0.976mmol/g的 Fmoc-Gly-Gly-CTC树 月旨 92.2 g ( 90mmol ), 加入固相反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀 Fmoc-Gly-Gly-CTC树脂 30分钟后， 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF 洗涤 4次， DCM洗 2次。 将 91.1g Fmoc-Pro-OH ( 270mmol ), 43.8 g HOBt ( 324 mmol )溶于体积比为 1 : 1的 DCM和 DMF混合溶液， 冰水浴下加入 40.8g DIC ( 324 mmol ), 活化 5min后加入固相反应柱中， 室温反应 2 h (反 应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色， 表示反应不完全， 需再偶联反应 lh )。 得到 120.7g如 SEQ ID NO 1所示的 多肽片段的 CTC树脂。
将 120.7g如 SEQ ID NO 1所示的多肽片段的 CTC树脂加入裂解反应器 中， 加入 1207ml裂解液（体积比， TFE: DCM=1:4 ), 室温反应 2h。 反应 结束， 过滤树脂， 收集滤液。 将滤液体积旋蒸至 < 25vol%后， 滴加至 5L 沉淀试剂中 （体积比， 正己烷： 乙醚 =1:4 ), 离心， 无水乙醚洗涤， 并且 真空干燥， 得到如 SEQ ID NO 1所示的多肽片段 39.8 g。 收率为 98.1%, 纯 度为 96.9%。 实施例 8: 如 SEQ ID NO 2所示的多肽片段
Fmoc-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-OH的制备
称取实施例 5中制备的替代度为 0.956mmol/g的 Fmoc-Gly-CTC树脂 103.6 g ( lOOmmol ), 加入固相反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀 Fmoc-Gly-CTC树脂 30分钟后， 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗涤 4次， DCM洗 2次。 将179.0g Fmoc-Asn(Trt)-OH ( 300mmol ), 48.6 g HOBt ( 360 mmol )溶于体积比为 1:1的 DCM和 DMF混合溶液， 冰水浴下加入 45.4g DIC ( 360 mmol ), 活化 5min后加入固相反应柱中， 室温反应 2 h (反 应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色， 表示反应不完全， 需再偶联反应 lh )。 依次同样方法偶联下一个氨基酸 Fmoc-Gly-Gly-OH。 得到 163.3g如 SEQ ID NO 2所示的多肽片段的 CTC树 脂。
将 163.3g如 SEQ ID NO 2所示的多肽片段的 CTC树脂加入裂解反应器 中， 加入 1663ml 裂解液（体积比， TFE: DCM=1:4 ), 室温反应 2h。 反应 结束， 过滤树脂， 收集滤液。 将滤液体积旋蒸至 < 25vol%后， 滴加至 5L 沉淀试剂中 （体积比， 正己烷： 乙醚 =1:4 ), 离心， 无水乙醚洗涤， 并且 真空干燥， 得到如 SEQ ID NO 2所示的多肽片段 74.32 g。 收率为 96.7%, 纯度为 95.8%。 实 施 例 9 ： 如 SEQ ID NO 3 所 示 的 多 肽 片 段 Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的制备
称取实施例 2中制备的替代度为 0.976mmol/g的 Fmoc-Gly-Gly-CTC树 月旨 92.2 g ( 90mmol ), 加入固相反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀 Fmoc-Gly-Gly-CTC树脂 30分钟后， 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF 洗涤 4次， DCM洗 2次。 将 95.7g Fmoc-Gly
-Gly-OH ( 270mmol ), 43.8 g HOBt ( 324 mmol )溶于体积比为 1:1的 DCM 和 DMF混合溶液， 冰水浴下加入 40.8g DIC ( 324 mmol ), 活化 5min后加 入固相反应柱中， 室温反应 2 h (反应终点以茚三酮法检测为准， 如果树 脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应 lh )。 依次同样方法偶联下一个氨基酸 Fmoc-Pro-OH。 得到 130.9g如 SEQ ID NO 3所示的多肽片段的 CTC树月旨。
将 130.9g如 SEQ ID NO 3所示的多肽片段的 CTC树脂加入裂解反应器 中， 加入 1309ml 裂解液（体积比， TFE: DCM=1:4 ), 室温反应 2h。 反应 结束， 过滤树脂， 收集滤液。 将滤液体积旋蒸至 < 25vol%后， 滴加至 5L 沉淀试剂中 （体积比， 正己烷： 乙醚 =1:4 ), 离心， 无水乙醚洗涤， 并且 真空干燥， 得到如 SEQ ID NO 1所示的多肽片段 46.3 g。 收率为 91.0%%, 纯度为 97.1%。 实施例 10: 如 SEQ ID NO 4所示的多肽片段 Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-OH 的制备
称取实施例 2中制备的替代度为 0.976mmol/g的 Fmoc-Gly-Gly-CTC树 月旨 92.2 g ( 90mmol ), 加入固相反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀 Fmoc-Gly-Gly-CTC树脂 30分钟后， 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF 洗涤 4次， DCM洗 2次。 将 80.3g Fmoc-Gly-OH ( 270mmol ), 43.8 g HOBt ( 324 mmol )溶于体积比为 1 : 1的 DCM和 DMF混合溶液， 冰水浴下加入 40.8g DIC ( 324 mmol ), 活化 5min后加入固相反应柱中， 室温反应 2 h (反 应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色， 表示反应不完全， 需再偶联反应 lh )。 依次同样方法偶联下一个氨基酸 Fmoc-Pro-OH。 得到 125.9g如 SEQ ID NO 4所示的多肽片段的 CTC树月旨。
将 125.9g如 SEQ ID NO 4所示的多肽片段的 CTC树脂加入裂解反应器 中， 加入 1259ml 裂解液（体积比， TFE: DCM=1:4 ), 室温反应 2h。 反应 结束， 过滤树脂， 收集滤液。 将滤液体积旋蒸至 < 25vol%后， 滴加至 5L 沉淀试剂中 （体积比， 正己烷： 乙醚 =1:4 ), 离心， 无水乙醚洗涤， 并且 真空干燥， 得到如 SEQ ID NO 1所示的多肽片段 42.9 g。 收率为 93.8%, 纯 度为 96.8%。 实施例 11:如 SEQ ID NO 5所示的多肽片段 Fmoc-Gly-Asn(Trt)-Gly-OH 的制备
称取实施例 5中制备的替代度为 0.956mmol/g的 Fmoc-Gly-CTC树脂 103.6 g ( lOOmmol ), 加入固相反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀 Fmoc-Gly-CTC树脂 30分钟后， 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗涤 4次， DCM洗 2次。 将179.0g Fmoc-Asn(Trt)-OH ( 300mmol ), 48.6 g HOBt ( 360 mmol ) 溶于体积比为 1 :1的 DCM和 DMF混合溶液， 冰水浴下加入 45.4g DIC ( 360 mmol ), 活化 5min后加入固相反应柱中， 室温反应 2 h (反 应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色， 表示反应不完全， 需再偶联反应 lh )。 依次同样方法偶联下一个氨基酸 Fmoc-Gly-OH。 得到 152.8g如 SEQ ID NO 5所示的多肽片段的 CTC树脂。
将 152.8g如 SEQ ID NO 5所示的多肽片段的 CTC树脂加入裂解反应器 中， 加入 1528ml 裂解液（体积比， TFE: DCM=1:4 ), 室温反应 2h。 反应 结束， 过滤树脂， 收集滤液。 将滤液体积旋蒸至 < 25vol%后， 滴加至 5L 沉淀试剂中 （体积比， 正己烷： 乙醚 =1 :4 ), 离心， 无水乙醚洗涤， 并且 真空干燥， 得到如 SEQ ID NO 1所示的多肽片段 64.2 g。 收率为 90.3%, 纯 度为 95.3%。 实施例 12: Fmoc-Leu-Wang Resin的制备
称取替代度为 1.0mmol/g的 Wang树脂 150g ( 150mmol ), 加入固相 反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30分钟后， 取 106.1g Fmoc-Leu-OH ( 300mmol )、 48.6g HOBt ( 360mmol )、 3.7g 4-二甲氨基吡 啶 (DMAP) ( 30mmol )溶于体积比为 1:1的 DCM和 DMF混合溶液， 冰 水浴下加入 45.4g DIC ( 360 mmol ), 活化 5min后加入固相反应柱中， 室 温反应 2 h。反应结束后用 DMF洗涤 4次， DCM洗 2次。然后加入 237.3g 吡啶和 306.3g 乙酸酐混合液封闭树脂 6h。用 DMF洗涤 4次， DCM洗涤 2 次后， 甲醇收缩抽干， 得到 Fmoc-Leu-Wang 树脂， 检测替代度为 0.582mmol/g。 实施例 13: 氨基酸序列如 SEQ ID NO.6所示的
D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly
-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pr 0-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wan 树脂的制备
将 34.4g 实施例 12中制备的 Fmoc-Leu-Wang Resin( 20mmol )用 DMF 洗涤 4次， DCM洗 2次， 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗涤 4 次， DCM洗 2次。 称取 27.6g Fmoc-Tyr(tBu)-OH ( 60mmol ), 9.7 g HOBt ( 72 mmol ), 136.1g DIC ( 1080 mmol )溶于体积比为 1:1的 DCM和 DMF 混合溶液， 加入固相反应柱中， 室温反应 2 h (反应终点以茚三酮法检测 为准， 如果树脂无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表示反应不完全， 需 再偶联反应 lh。 重复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤， 按照比伐卢定的顺序， 依次完成 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、
Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)
-OH、 实施例 8中制备的具有 SEQ ID NO 2所示结构的多肽片段、 实施例 7中制备的具有 SEQ ID NO 1所示结构的多肽片段、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Pro-OH, Fmoc-D-Phe-OH反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过 夜， 称重得到氨基酸序列如 SEQ ID NO.6所示的
D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly
-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(0 tBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂 76.7g。 实施例 14: 氨基酸序列如 SEQ ID NO.6所示的
D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly
-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pr 0-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wan 树脂的制备
将 34.4g实施例 12中制备的 Fmoc-Leu-Wang Resin( 20mmol )用 DMF 洗涤 4次， DCM洗 2次， 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗涤 4 Ο-(η910)ηΙΟ-。蘭 Ο-3ΙΙ-。蘭 Ή0-0 -。蘭 Ο-(ηΦΟ)ηΙΟ-。蘭
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Z6L080/Zl0Z l3/13d ■SZ而 OZ OAV Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)
-OH、 实施例 11中制备的具有 SEQ ID NO 5所示结构的多肽片段、 实施 例 10中制备的具有 SEQ ID NO 4所示结构的多肽片段、
Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Pro-OH, Fmoc-D-Phe-OH反应结束后用甲醇收 缩， 树脂真空干燥过夜， 称重得到氨基酸序列如 SEQ ID N0.6所示的 D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly
-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(0 tBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂 73.9g。 实施例 16: 比伐卢定粗品的制备
将实施例 13得到的 25.5g氨基酸序列如 SEQ ID N0.6所示的
Boc-D-Phe
-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu )-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂置于裂 解反应器中， 以 10ml/g树脂的比例加入裂解试剂 [三氟乙酸（TFA ): 三异 丙基硅烷（TIS ): 水 =90: 2: 8 ( V/V ) ] , 室温搅拌 2.5h。 反应物用砂芯 漏斗过滤， 收集滤液， 树脂再用少量 TFA洗涤 3次， 合并滤液后减压浓 缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀， 用无水乙醚洗涤 3次， 真空干燥得到白色 粉末固体， 即比伐卢定粗肽 13.86g。 重量收率为 95.4%, HPLC纯度为 80.6%。其中杂质 [-Gly]-Bivalimdin为 0.21%, [+Gly]-Bivalirudin为 0.15%, [-2Gly]-Bivalirudin为 0.09%, [+2Gly]-Bivalirudin为 0.12%。 实施例 17: 比伐卢定粗品的制备
将实施例 13得到的 25.5g氨基酸序列如 SEQ ID NO.6所示的
Boc-D-Phe
-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu )-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树脂置于裂 解反应器中， 以 10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA: TIS: 水 =95: 4: 1 ( V/V ) ), 室温搅拌 2.5h。 反应物用砂芯漏斗过滤， 收集滤液， 树脂再 ^^l^ °%Γε8 CTHH '%Γ96 ^古 善罩 ° 6·ει
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一乙 ΐ一
Z6.080/ZT0ZN3/X3d ■SZ而 OZ OAV 实施例 22: 比伐卢定粗品的制备
将实施例 15 得到的 24.6 g 氨基酸序列如 SEQ ID N0.6 所示的 Boc-D-Phe
-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu )-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang 树脂置于裂 解反应器中， 以 10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA: TIS: 水 =90: 2: 8 ( V/V ) ), 室温搅拌 2.5h。 反应物用砂芯漏斗过滤， 收集滤液， 树脂再 用少量 TFA洗涤 3次， 合并滤液后减压浓缩。 加入冰冻的无水乙醚沉淀， 用无水乙醚洗涤 3 次， 真空干燥得到白色粉末固体， 即比伐卢定粗肽 12.74g。 重量收率为 87.7% , HPLC 纯度为 75.9%。 其中杂质 [-Gly]-Bivalirudin 为 0.14% , [+Gly]-Bivalirudin 为 0.06% , [-2Gly]-Bivalirudin为 0.04%, [+2Gly]-Bivalirudin为 0.05%。 实施例 23: 比伐卢定粗品的制备
将实施例 15 得到的 24.6 g 氨基酸序列如 SEQ ID N0.6 所示的
Boc-D-Phe
-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu )-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang 树脂置于裂 解反应器中， 以 10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA: TIS: 水 =95: 4: 1 ( V/V ) ), 室温搅拌 2.5h。 反应物用砂芯漏斗过滤， 收集滤液， 树脂再 用少量 TFA洗涤 3次， 合并滤液后减压浓缩。 加入冰冻的无水乙醚沉淀， 用无水乙醚洗涤 3 次， 真空干燥得到白色粉末固体， 即比伐卢定粗肽 13.15g。 重量收率为 90.5% , HPLC 纯度为 77.1%。 其中杂质 [-Gly]-Bivalirudin 为 0.13% , [+Gly]-Bivalirudin 为 0.08% , [-2Gly]-Bivalimdin为 0.05%, [+2Gly]-Bivalimdin为 0.05%。 实施例 24: 比伐卢定粗品的制备
将实施例 15 得到的 24.6 g 氨基酸序列如 SEQ ID NO.6 所示的 Boc-D-Phe -Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu )-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang 树脂置于裂 解反应器中， 以 10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA: TIS: 水 =94: 3: 3 ( V/V ) ), 室温搅拌 2.5h。 反应物用砂芯漏斗过滤， 收集滤液， 树脂再 用少量 TFA洗涤 3次， 合并滤液后减压浓缩。 加入冰冻的无水乙醚沉淀， 用无水乙醚洗涤 3 次， 真空干燥得到白色粉末固体， 即比伐卢定粗肽 13.94g。 重量收率为 95.9% , HPLC 纯度为 80.6%。 其中杂质 [-Gly]-Bivalirudin 为 0.11% , [+Gly]-Bivalirudin 为 0.05% , [-2Gly]-Bivalirudin为 0.02%, [+2Gly]-Bivalirudin为 0.02%。 实施例 25: 比伐卢定粗肽纯化
取本发明实施例 16至 24任意一项的制备方法制得的氨基酸序列如 SEQ ID N0.6所示的比伐卢定粗肽 12.0g用纯化水 600ml溶解， 过滤， 收 集滤液备用。
纯化色谱条件：
色谱柱： 50 250mm, 内装反相 /弱阳离子交换混合模式固定相填料。 流速： 80ml/min。
监测波长： 280nm。
流动相 A相：加有 5%乙腈（ V/V )的 20mmol/L磷酸二氢钠緩沖溶液， 用磷酸调 pH为 2.5。
流动相 B 相： 加有 50%乙腈 （V/V ) 的 20mmol/L 磷酸二氢钠 +300mmol/L氯化钠緩沖溶液， 用氢氧化钠调 pH为 7.0。
， „ 、 35min 、
梯度： 80%Α+20%Β 、 50%Α+50%Β
上样量： 2.0g(100ml)。
纯化过程： 将色谱柱平衡 5min后上样， 运行梯度纯化， 监测并分峰 前、 峰顶、 峰后三段收集目的峰愤分。 峰前、 峰后馏分除去大部分乙腈后 回收纯化； 峰顶馏分除去大部分乙腈后回转盐。
分六次进样， 重复以上纯化过程。
转盐色谱条件： 色谱柱： 50 250mm, 内装反相 C18色谱填料。
流速： 80ml/min。
监测波长： 280nm。
流动相 A相： 0.05 %TFA ( V/V )溶液。
流动相 B相： 色谱纯乙腈。
梯度：
95 % A+5 %B -^^95 % A+5 %B ^^60% A+40%B ^^60% A+40%B
上样体积： 300ml。
纯化过程： 将色语柱平衡 5min后上样， 运行梯度纯化， 监测并收集 目的峰愤分。 将目的峰愤分减压旋蒸浓缩至 30ml后冻干。
冻干后得白色粉末状固体精肽 6.16g, 对制得的比伐卢定精肽进行高 效液相色语检测，检测的色谱图如图 1所示，其中比伐卢定峰的出峰时间 为： 27.562min, 与比伐卢定标准品的出峰时间一致， 紫外吸收光谱分析 表明， 比伐卢定与比伐卢定标品的吸收光谱一致。表明以本发明的方法制 备出了比伐卢定。 经分析， 以质量百分比计， 本发明制备的比伐卢定精肽 中， [-Gly]-Bivalimdin 及 [+Gly]-Bivalimdin 杂质的含量均小于 0.05% , [-2Gly]-Bivalirudin及 [+2Gly]-Bivalimdin均未检出， 其它杂质的含量均小 于 0.10%。 总收率为 49.3%。 以上对本发明所提供的一种比伐卢定的制备方法进行了详细介绍。本 说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技 术领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进 行若干改进和修饰， 这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围 内。

Claims

权 利 要 求
1、 一种比伐卢定的制备方法， 包括以下步骤：
步骤 1: 制备多肽片段；
步骤 2: 取所述多肽片段与氨基酸、 固相载体偶联制得比伐卢定肽树 脂；
步骤 3: 取所述比伐卢定肽树脂裂解并纯化即得比伐卢定；
所述多肽片段的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 3或 SEQ ID NO: 4或 SEQ ID NO: 5所示。
2、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述偶联具体为在所 述固相载体上依次偶联 Leu、 Tyr、 Glu、 Glu、 Pro, Ile、 Glu、 Glu、 Phe、 Asp, 具有 SEQ ID NO: 2所示结构的多肽片段、 具有 SEQ ID NO: 1所 示结构的多肽片段、 Arg、 Pro, Phe。
3、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述偶联具体为在所 述固相载体上依次偶联 Leu、 Tyr、 Glu、 Glu、 Pro, Ile、 Glu、 Glu、 Phe、
Asp, Gly、 Asn、 具有 SEQ ID NO: 3所示结构的多肽片段、 Arg、 Pro, Phe。
4、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述偶联具体为在所 述固相载体上依次偶联 Leu、 Tyr、 Glu、 Glu、 Pro, Ile、 Glu、 Glu、 Phe、 Asp, 具有 SEQ ID NO: 5所示结构的多肽片段、 具有 SEQ ID NO: 4所 示结构的多肽片段、 Arg、 Pro, Phe。
5、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 1具体为：
11 )制备 Fmoc-Gly-CTC树脂或 Fmoc-Gly-Gly-CTC树脂；
12 )脱除所述 Fmoc-Gly-CTC树脂或 Fmoc-Gly-Gly-CTC树脂上的 Fmoc保护基， 获得脱除 Fmoc保护基的 CTC树脂；
13 )取所述脱去 Fmoc保护基的 CTC树脂， 依次偶联带有 Fomc保 护基的氨基酸，分别制得具有如 SEQ ID NO: 1~5所示氨基酸序列的氨基 酸树脂；
14 )取所述具有如 SEQ ID NO: 1-5所示氨基酸序列的氨基酸树脂裂 解， 制得具有如 SEQ ID NO: 1~5所示氨基酸序列的多肽片段。
6、 根据权利要求 5所述的方法， 其特征在于， 所述 Fmoc-Gly-CTC树 脂或 Fmoc-Gly-Gly-CTC树脂的替代度为 0.8mmol/g~1.2mmol/g。
7、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 步骤 2中所述的固相 载体为 Wang树脂。
8、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 步骤 3中所述裂解采 用试剂的组成按体积百分比计为： 三氟乙酸 90%~95%、 三异丙基硅烷 2%~4%, 余量为水。
9、 根据权利要求 8所述的方法， 其特征在于， 以 ml/g计所述试剂与 所述比伐卢定肽树脂的质量体积比为 10:1。
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