CN108383905A - 一种比伐卢定的制备方法 - Google Patents

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CN108383905A CN201611265509.4A CN201611265509A CN108383905A CN 108383905 A CN108383905 A CN 108383905A CN 201611265509 A CN201611265509 A CN 201611265509A CN 108383905 A CN108383905 A CN 108383905A
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Abstract

本发明公开了一种比伐卢定的制备方法，具体涉及药物多肽比伐卢定的高效合成。本方法采用Fmoc固相多肽合成法，在固相载体上依次偶联各个N端保护的氨基酸得到比伐卢定肽树脂，肽树脂经酸试剂裂解得到粗肽，粗肽经C18制备色谱柱纯化得到比伐卢定纯品。比伐卢定序列中有五个Gly，常规Fmoc固相多肽合成中Gly对应原料为Fmoc‑Gly‑OH，本发明采用Fmoc‑Gly(DMB)‑OH为原料，替换其中的一个或多个Fmoc‑Gly‑OH，有效提高了甘氨酸及其后续氨基酸的偶联效率，避免了Gly的缺失或多加现象。该方法操作简单，粗品纯度高，制备后产品纯度达到99.2％，单杂小于0.5％，具备良好的工业化生产前景。

Description

一种比伐卢定的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽类药物合成领域，具体涉及一种新的比伐卢定的制备方法。
背景技术
比伐卢定(Bivalirudin)是一个含20个氨基酸的水蛭素衍生片段。其氨基酸序列为D-Phe1-Pro2-Arg3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn9-Gly10-Asp11-Phe12-Glu13-Glu14-Ile15-Pro16-Glu17-Glu18-Tyr19-Leu20-OH。通过直接并特异性抑制凝血酶活性而发挥抗凝作用。由于凝血酶可水解多肽序列中Arg3和Pro4之间的肽键，使多肽失活，所以比伐卢定的抗凝作用是短暂而可逆的。早期的临床研究认为：比伐卢定抗凝治疗效果显著，出血概率较低，比传统的肝素抗凝治疗更为安全。
早期比伐卢定合成专利由Biogen和Cambridge公司于1993年得到授权，专利号为US5196404，该专利采用标准Boc化学固相多肽合成法，需要用剧毒的HF作为裂解试剂，裂解时需要特殊的反应装置及操作人员防护设备，不适合规模化生产。专利CN101094867、CN101033249和CN101555274采用标准Fmoc化学固相多肽合成法，避免了强酸切割的风险，但粗品副产物较多,纯品收率仅为14％左右(CN101033249)。
专利如CN101475631、CN103864895、CN102816208和CN105273062采用多肽片段液相拼接的方法来合成比伐卢定，将比伐卢定分成三个、四个或五个多肽片段，在液相中完成片段的拼接。该方法片段与片段间缩合效率不高，多肽片段原料及每步拼接产物都需要纯化，废液量大，生产成本较高。
专利如CN102286076、CN102532274、CN102924575、CN102731624、CN105218644、CN104031127、CN103242431和US20130196920采用固相片段合成法，以氨基酸和多肽片段为原料，在固相载体上依次拼接完成树脂肽的合成，裂解得到比伐卢定粗品。原料多肽片段生产成本较高，固相上片段缩合效率较低，多肽片段需要过量投料且难以回收套用，造成了大量的原料浪费，给成本和环境都造成了压力。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供了一种低成本，高收率的比伐卢定制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种比伐卢定的制备方法，包括以下步骤：
1)将氨基酸Fmoc-Leu-OH连接到固相树脂上,得到Fmoc-Leu-固相树脂；
2)脱除Fmoc-Leu-固相树脂的保护基，以带保护氨基酸为原料，依次偶联得到比伐卢定树脂肽；偶联比伐卢定第5、6、7、8、10位的甘氨酸时，所采用的带保护甘氨酸原料中包含至少一个Fmoc-Gly(DMB)-OH；优选为包含1～2个Fmoc-Gly(DMB)-OH；
3)用酸性裂解试剂将比伐卢定从树脂上裂解，经沉淀后分离得到比伐卢定粗品；
4)粗品经HPLC分离纯化，得到目标产物比伐卢定。
本发明比伐卢定的制备方法详细包括以下几个步骤：
1)选择聚苯乙烯树脂为固相树脂(含0.5-2.0％(w/w)的二乙烯苯)；将Fmoc-Leu-OH与固相树脂连接，得到Fmoc-Leu-固相树脂；
2)脱除Fmoc-Leu-固相树脂的保护基，以Fmoc保护的氨基酸为原料，依次连接各个氨基酸得到11-20的树脂肽
Fmoc-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-固相树脂；
再以1～2个Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH为原料，依次连接5-10位氨基酸得到树脂肽Fmoc-Gly(X)5-Gly(X)6-Gly(X)7-Gly(X)8-Asn(Trt)9-Gly(X)10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-固相树脂；X为甘氨酸上的氨基保护基DMB或H。在该树脂肽上继续依次连接Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Pro-OH,D-Boc-Phe-OH得到比伐卢定树脂肽D-Phe(Boc)1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly(X)5-Gly(X)6-Gly(X)7-Gly(X)8-Asn(Trt)9-Gly(X)10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-固相树脂；
3)在酸性裂解试剂中切割树脂，同时脱除DMB及侧链保护基，乙醚沉淀后分离得到比伐卢定粗肽。
4)粗肽经高效液相色谱分离纯化，得到比伐卢定纯品。
本发明所用的固相树脂为CTC树脂或Wang树脂，Fmoc-Leu-OH与CTC树脂在碱性条件下进行酯化反应得到Fmoc-Leu-CTC树脂，Fmoc-Leu-OH与Wang树脂在偶联试剂条件下进行酯化反应得到Fmoc-Leu-Wang树脂；所述Fmoc-Leu-CTC树脂或Fmov-Leu-Wang树脂的取代度为0.4-1.2mmol/g树脂，优选0.5-0.9mmol/g树脂。
本发明步骤2)脱除Fmoc-Leu-固相树脂保护基的过程中，所采用的脱Fmoc保护基的试剂为20％(v/v)哌啶/DMF溶液，脱保护时间为15-60min，优选20-40min。
步骤2)所述偶联的过程中所采用的偶联试剂选自DCC、EDC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/DIEA、TBTU/HOBt/NMM、HBTU/HOBt/DIEA、HCTU/HOBt/DIEA、BOP/HOAt/NMM、PyBOP/HOAt/DIEA中的任意一种。所述的偶联反应在DMF溶剂中进行，偶联反应时间为0.5-2.0h，优选0.5-1.5h，茚三酮检测树脂呈阴性则表示偶联反应完全。
本发明步骤2)中在偶联时所使用的带保护氨基酸投料量为所述Fmoc-Leu-固相树脂取代度的1.0-3.0倍量，优选1.2-2.5倍量。
比伐卢定序列中有五个Gly，常规Fmoc固相多肽合成中Gly对应原料为Fmoc-Gly-OH，本发明在偶联过程中所用的甘氨酸原料不仅限于Fmoc-Gly-OH，对于序列中的五个甘氨酸单元，本发明采用Fmoc-Gly(DMB)-OH为原料，替换其中的一个或多个Fmoc-Gly-OH原料，优选为替换其中的1～2个Fmoc-Gly-OH原料。有效提高了甘氨酸及其后续氨基酸的偶联效率，避免了Gly的缺失或多加现象。
依次偶联序列中的各个氨基酸得到含DMB的树脂肽D-Phe(Boc)1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly(X)5-Gly(X)6-Gly(X)7-Gly(X)8-Asn(Trt)9-Gly(X)10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-固相树脂。X为甘氨酸上氨基保护基DMB或H。
本发明所用的酸性裂解试剂为TFA与水的体积比为95:5的溶液、或者TFA与水与Tis的体积比为95:2.5:2.5的混合溶液、或者TFA与水与EDT与苯酚与茴香硫醚的比例为87.5(ml):5(ml):2.5(ml):5(g):5(g)的混合溶液。所述裂解反应时间为1.0-4.0h，优选1.5-3.0h。裂解液用乙醚沉淀后分离得到比伐卢定粗品。
本发明步骤4)HPLC分离纯化过程中所用的色谱柱为C18的反相色谱柱，填料粒径为10um。所用的洗脱液为乙腈/水或甲醇/水，洗脱液添加剂为三氟乙酸，三氟乙酸与乙腈/水或甲醇/水的体积比为0.01％-0.15％(即三氟乙酸在洗脱液中添加体积百分量为0.01％-0.15％)，优选0.05％-0.1％。
本发明所述的室温为本领域技术人员公知的25±5℃。
比伐卢定序列中5、6、7、8、10位为Gly，因此Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly是主要的副产物，由于该副产物序列与比伐卢定高度接近，后续纯化分离困难，提纯过程中比伐卢定损失量大，总收率偏低。本发明采用Fmoc化学固相多肽合成法，以Fmoc-Gly(DMB)-OH为原料，替换其中的一个或多个Fmoc-Gly-OH原料，避免了多加和缺失甘氨酸的现象。在比伐卢定的固相合成中也发现存在Pro缺失的副产物，本发明方案能有效提高2位Pro与3位Arg的缩合效率，避免Bivalirudin-1Pro副产物的生成。用本发明技术操作简单，生产的比伐卢定粗品纯度高，易于纯化，HPLC纯化后产品纯度达到99.2％，单杂小于0.5％，具备良好的工业化生产前景。
本发明的有益效果
本发明通过在甘氨酸片段上引入DMB保护基，有效避免了副产物Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly副产物的生成。本发明保持了Fmoc固相多肽合成法的简洁和高效，具备规模化生产前景。
附图说明
图1为实施例3中的树脂肽制备七合成的比伐卢定粗品谱图
图2为对比实施例一合成的比伐卢定粗品谱图
图3为实施例3中的树脂肽制备七合成的比伐卢定纯品谱图
具体实施方式
实施例一取代度0.5mmol/g的Fmoc-Leu-CTC树脂的制备：
在1000ml的船型反应器中加入2-chlorotrityl chloride resin(CTC树脂)(1.0mmol/g,100g)、Fmoc-Leu-OH(23g,65mmol)和DMF(400ml)，震荡均匀。室温下滴加DIEA(60ml)的DCM溶液(200ml)，十分钟加完。将反应器放置于恒温震荡器中，控温35℃，摇速100转/分,反应1.5小时。减压抽除反应液，向反应器中加入DMF(500ml)，震荡5.0min，减压抽除DMF溶液。反应器中加入DCM(400ml)，无水甲醇(200ml)，DIEA(60ml)，放置于恒温震荡器中继续反应30min，减压抽除反应液。树脂用DCM洗涤两次，每次500ml；DMF洗涤两次，每次500ml；无水甲醇洗涤两次，每次500ml。洗涤后的树脂连同反应器一起放入真空干燥器中干燥5小时，通过紫外分光光度计计算出Fmoc-Leu-CTC树脂的取代度为0.502mmol/g。
实施例二取代度0.5mmol/g的Fmoc-Leu-Wang树脂的制备：
在1000ml的船型反应器中加入wang resin(1.0mmol/g,100g)、DMAP(2.0g)、HOBt(53g,396mmol)、Fmoc-Leu-OH(70g,198mmol)和DMF(400ml)，震荡均匀。室温下滴加DIC(62ml,396mmol)的DCM溶液200ml，十分钟加完。将反应器放置于恒温震荡器中，控温35℃，摇速100转/分,反应2.0小时。减压抽除反应液，向反应器中加入DMF(500ml)，震荡5.0min减压抽除反应液。将醋酐(100ml)、DMAP(2.0g)、吡啶(100ml)、DCM(300ml)加入到反应器中，放置于恒温震荡器中继续反应20min，减压抽除反应液。树脂用DCM洗涤两次，每次500ml；DMF洗涤两次，每次500ml；无水甲醇洗涤两次，每次500ml。洗涤后的树脂连同反应器一起放入真空干燥器中干燥5小时，通过紫外分光光度计计算出Fmoc-Leu-Wang树脂取代度为0.505mmol/g。
实施例三
树脂肽的制备一
在500ml的船型反应器中加入Fmoc-Leu-CTC树脂(0.502mmol/g,30g)、20％(v/v)哌啶/DMF溶液(250ml)。将反应器放置于恒温震荡器中，控温30℃，摇速100转/分,反应30min。减压抽除反应液，树脂用DMF洗涤三次，每次150ml。将Fmoc-Tyr(tBu)-OH(13.8g,30mmol)的DMF溶液250ml加入反应器，震荡均匀，加入DIC(6.2g,40mmol)和HOBt(5.4g,40mmol)将反应器放置于恒温震荡器中，控温30℃，摇速100转/分,反应1.5h,减压抽除反应液，树脂用DMF洗涤三次，每次150ml。重复上述脱保护及偶联步骤，依次接入比伐卢定中的各个氨基酸，氨基酸投料量为(30mmol)，氨基酸顺序如下：Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、D-Boc-Phe-OH制得如下结构树脂肽：D-Phe(Boc)1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly(DMB)7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly(DMB)10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-CTC
树脂肽的制备二
在500ml的船型反应器中加入Fmoc-Leu-CTC树脂(0.502mmol/g,30g)、20％的哌啶/DMF溶液(250ml)。将反应器放置于恒温震荡器中，控温30℃，摇速100转/分,反应30min。减压抽除反应液，树脂用DMF洗涤三次，每次150ml。将Fmoc-Tyr(tBu)-OH(13.8g,30mmol)的DMF溶液250ml加入反应器，震荡均匀，加入HATU(15.2g,40mmol)、DIEA(12ml,75mmol)和HOAt(5.4g,40mmol)将反应器放置于恒温震荡器中，控温30℃，摇速100转/分,反应1.5h,减压抽除反应液，树脂用DMF洗涤三次，每次150ml。重复上述脱保护及偶联步骤，依次接入比伐卢定中的各个氨基酸，氨基酸投料量为(30mmol)，氨基酸顺序如下：Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、D-Boc-Phe-OH制得如下结构树脂肽：D-Phe(Boc)1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly(DMB)7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly(DMB)10-Asp(OtBu)11-Phe12- Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-CTC
树脂肽的制备三
在500ml的船型反应器中加入Fmoc-Leu-CTC树脂(0.502mmol/g,30g)、20％的哌啶/DMF溶液(250ml)。将反应器放置于恒温震荡器中，控温30℃，摇速100转/分,反应30min。减压抽除反应液，树脂用DMF洗涤三次，每次150ml。将Fmoc-Tyr(tBu)-OH(13.8g,30mmol)的DMF溶液250ml加入反应器，震荡均匀，加入HATU(15.2g,40mmol)、DIEA(12ml,75mmol)和HOAt(5.4g,40mmol)将反应器放置于恒温震荡器中，控温30℃，摇速100转/分,反应1.5h,减压抽除反应液，树脂用DMF洗涤三次，每次150ml。重复上述脱保护及偶联步骤，依次接入比伐卢定中的各个氨基酸，氨基酸投料量为(30mmol)，氨基酸顺序如下：Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、D-Boc-Phe-OH制得如下结构树脂肽：D-Phe(Boc)1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly(DMB)7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-CTC
树脂肽的制备四
在500ml的船型反应器中加入Fmoc-Leu-Wang树脂(0.505mmol/g,30g)、20％的哌啶DMF溶液(250ml)。将反应器放置于恒温震荡器中，控温30℃，摇速100转/分,反应30min。减压抽除反应液，树脂用DMF洗涤三次，每次150ml。将Fmoc-Tyr(tBu)-OH(13.8g,30mmol)的DMF溶液250ml加入反应器，震荡均匀，加入HATU(15.2g,40mmol)、DIEA(12ml,75mmol)和HOAt(5.4g,40mmol)将反应器放置于恒温震荡器中，控温30℃，摇速100转/分,反应1.5h,减压抽除反应液，树脂用DMF洗涤三次，每次150ml。重复上述脱保护及偶联步骤，依次接入比伐卢定中的各个氨基酸，氨基酸投料量为(30mmol)，氨基酸顺序如下：Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、D-Boc-Phe-OH制得如下结构树脂肽：D-Phe(Boc)1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly(DMB)7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Wang
树脂肽的制备五
在500ml的船型反应器中加入Fmoc-Leu-CTC树脂(0.502mmol/g,30g)、20％的哌啶DMF溶液(250ml)。将反应器放置于恒温震荡器中，控温30℃，摇速100转/分,反应30min。减压抽除反应液，树脂用DMF洗涤三次，每次150ml。将Fmoc-Tyr(tBu)-OH(13.8g,30mmol)的DMF溶液250ml加入反应器，震荡均匀，加入HATU(15.2g,40mmol)、DIEA(12ml,75mmol)和HOAt(5.4g,40mmol)将反应器放置于恒温震荡器中，控温30℃，摇速100转/分,反应1.5h,减压抽除反应液，树脂用DMF洗涤三次，每次150ml。重复上述脱保护及偶联步骤，依次接入比伐卢定中的各个氨基酸，氨基酸投料量为(30mmol)，氨基酸顺序如下：Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、D-Boc-Phe-OH制得如下结构树脂肽：D-Phe(Boc)1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly(DMB)5-Gly6-Gly(DMB)7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly(DMB)10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-CTC
树脂肽的制备六
在500ml的船型反应器中加入Fmoc-Leu-Wang树脂(0.505mmol/g,30g)、20％的哌啶DMF溶液(250ml)。将反应器放置于恒温震荡器中，控温30℃，摇速100转/分,反应30min。减压抽除反应液，树脂用DMF洗涤三次，每次150ml。将Fmoc-Tyr(tBu)-OH(13.8g,30mmol)的DMF溶液250ml加入反应器，震荡均匀，加入HATU(15.2g,40mmol)、DIEA(12ml,75mmol)和HOAt(5.4g,40mmol)将反应器放置于恒温震荡器中，控温30℃，摇速100转/分,反应1.5h,减压抽除反应液，树脂用DMF洗涤三次，每次150ml。重复上述脱保护及偶联步骤，依次接入比伐卢定中的各个氨基酸，氨基酸投料量为(30mmol)，氨基酸顺序如下：Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、D-Boc-Phe-OH制得如下结构树脂肽：
D-Phe(Boc)1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly(DMB)5-Gly6-Gly(DMB)7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly(DMB)10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Wang
树脂肽的制备七
在500ml的船型反应器中加入Fmoc-Leu-CTC树脂(0.502mmol/g,30g)、20％的哌啶/DMF溶液(250ml)。将反应器放置于恒温震荡器中，控温30℃，摇速100转/分,反应30min。减压抽除反应液，树脂用DMF洗涤三次，每次150ml。将Fmoc-Tyr(tBu)-OH(13.8g,30mmol)的DMF溶液250ml加入反应器，震荡均匀，加入HATU(15.2g,40mmol)、DIEA(12ml,75mmol)和HOAt(5.4g,40mmol)将反应器放置于恒温震荡器中，控温30℃，摇速100转/分,反应1.5h,减压抽除反应液，树脂用DMF洗涤三次，每次150ml。重复上述脱保护及偶联步骤，依次接入比伐卢定中的各个氨基酸，氨基酸投料量为(30mmol)，氨基酸顺序如下：Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、D-Boc-Phe-OH制得如下结构树脂肽：
D-Phe(Boc)1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly(DMB)8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-CTC
树脂肽的制备八
偶联比伐卢定第8位的甘氨酸时，采用的带DMB保护氨基酸Fmoc-Gly(DMB)-OH为原料，其他条件与对比实施例一相同，所得的树脂肽按照实施例四进行裂解，粗肽按实施例五进行纯化，得到比伐卢定纯品。
氨基酸顺序如下：Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly(DMB)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、D-Boc-Phe-OH制得如下结构树脂肽：
D-Phe(Boc)1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly(DMB)8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-CTC
实施例四比伐卢定粗品的制备
在上述树脂肽中加入裂解试剂150ml(TFA:H2O:Tis的体积比为95:2.5:2.5)将反应器放置于恒温震荡器中，控温30℃，摇速100转/分,反应2.5h。反应液用氮气压滤，树脂用裂解试剂洗涤两次，每次60ml。将合并的裂解液在磁子搅拌下滴入预冷却的冰乙醚中，乙醚中析出白色粗肽固体，过滤，用乙醚洗涤固体，真空干燥后得到比伐卢定粗品。
实施例五比伐卢定粗品的纯化
将上述制得的比伐卢定粗肽用50％(v/v)乙腈/水溶解，溶液用0.45um滤膜过滤后备用。高效液相色谱系统为Shimadzu LC-8A，色谱柱填料为10um C18，流动相为0.06％(v/v)TFA/H2O和0.06％(v/v)TFA/CH3CN。
梯度洗脱，洗脱梯度为5％(v/v)乙腈/水至95％(v/v)乙腈/水，洗脱时间为1.0h。收集目标产品馏分。目标馏分在40℃下用旋转蒸发仪浓缩。浓缩液经冷冻干燥器干燥后得到比伐卢定纯品，外观为白色粉末。
对比实施例一
现有技术如专利CN101033249A中采用Fmoc化学固相多肽合成法制备比伐卢定树脂肽及粗肽，该方法利用Fmoc-Gly-OH为原料来构建序列中的所有甘氨酸单元。
(1)制备Fmoc-Leu-树脂：
称取2-chlorotrityl chloride resin(1.0mmol/g,50g)，用500ml DMF浸泡30min，加入DIEA 44ml，Fmoc-Leu-OH 17.7g，25℃反应1小时，再加入甲醇20ml，25℃反应1小时，抽干，树脂用DMF洗涤六次，抽干。
(2)比伐卢定树脂肽的制备：
在步骤(1)的Fmoc-Leu-树脂中，加入脱帽试剂500ml(Pip：DMF＝1：3.5体积比)，25℃反应0.5小时，抽干，用DMF洗涤，抽干，加入用400ml接肽试剂(NMM:DMF＝1:10体积比)溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH(150mmol)、TBTU(150mmol)和HOBt(150mmol)的混合物，25℃反应2小时，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干。重复上述脱保护及偶联步骤，依次接入比伐卢定中的各个氨基酸，氨基酸投料量为(150mmol)，氨基酸顺序如下：Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、D-Boc-Phe-OH制得如下结构树脂肽：D-Phe(Boc)1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-CTC
所得的树脂肽按照实施例四进行裂解，粗肽按实施例五进行纯化，得到比伐卢定纯品。
对比实施例二
偶联比伐卢定第8位的甘氨酸时，采用的常规Fmoc保护氨基酸Fmoc-Gly-OH，其他条件与树脂肽的制备七相同，所得的树脂肽按照实施例四进行裂解，粗肽按实施例五进行纯化，得到比伐卢定纯品。
比伐卢定树脂肽经裂解和纯化后HPLC检测结果如表1：
表1比伐卢定树脂肽经裂解和纯化后HPLC检测结果
实施例 HPLC检测结果 纯品总收率
树脂肽的制备一 97.3％ 21％
树脂肽的制备二 97.1％ 23％
树脂肽的制备三 98.3％ 27％
树脂肽的制备四 97.7％ 25％
树脂肽的制备五 96.2％ 13％
树脂肽的制备六 97.5％ 17％
树脂肽的制备七 99.2％ 31％
树脂肽的制备八 99.0％ 28％
对比实施例一 97.5％ 15％
对比实施例二 97.2％ 18％
表2试剂名称对照表
Fmoc-Gly-OH的结构式如下：
Fmoc-Gly(DMB)-OH的结构式如下：
Fmoc-Tyr(tBu)-OH的结构式如下：
Fmoc-Glu(OtBu)-OH的结构式如下：
Fmoc-Gln(Trt)-OH的结构式如下：
Fmoc-Arg(Pbf)-OH的结构式如下：
D-Boc-Phe-OH的结构式如下：
D-Phe(Boc)1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly(X)5-Gly(X)6-Gly(X)7-Gly(X)8-Asn(Trt)9-Gly(X)10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-固相树脂，结构式如下：

Claims (9)

1.一种比伐卢定的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将氨基酸Fmoc-Leu-OH连接到固相树脂上,得到Fmoc-Leu-固相树脂；
2)脱除Fmoc-Leu-固相树脂的保护基，以带保护氨基酸为原料，依次偶联得到比伐卢定树脂肽；偶联比伐卢定第5、6、7、8、10位的甘氨酸时，所采用的带保护甘氨酸原料中包含至少一个Fmoc-Gly(DMB)-OH；
3)用酸性裂解试剂将比伐卢定从树脂上裂解，经沉淀后分离得到比伐卢定粗品；
4)粗品经HPLC分离纯化，得到目标产物比伐卢定。
2.根据权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述的固相树脂为CTC树脂或Wang树脂。
3.根据权利要求1或2所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述Fmoc-Leu-固相树脂的取代度为0.4-1.2mmol/g，优选为0.5-0.9mmol/g。
4.根据权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：步骤2)所述偶联的过程中所采用的偶联试剂选自DCC、EDC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/DIEA、TBTU/HOBt/NMM、HBTU/HOBt/DIEA、HCTU/HOBt/DIEA、BOP/HOAt/NMM、PyBOP/HOAt/DIEA中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：步骤2)所述偶联的反应时间为0.5-2.0h，优选0.5-1.5h。
6.根据权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：步骤2)脱除Fmoc-Leu-固相树脂保护基的过程中，所采用的脱Fmoc保护基的试剂为20％哌啶/DMF溶液，脱保护时间为15-60min，优选20-40min。
7.根据权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：步骤2)所述偶联的过程中所使用的带保护氨基酸投料量为所述Fmoc-Leu-固相树脂取代度的1.0-3.0倍量，优选1.0-2.5倍量。
8.根据权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述的酸性裂解试剂为TFA与水的体积比为95:5的溶液、或者TFA与水与Tis的体积比为95:2.5:2.5的混合溶液、或者TFA与水与EDT与苯酚与茴香硫醚的比例为87.5:5:2.5:5:5的混合溶液；所述裂解的反应时间为1.0-4.0h，优选1.5-3.0h。
9.根据权利要求1所述的比伐卢定的制备方法，其特征在于：步骤4)HPLC分离纯化过程中所用的色谱柱为C18的反相色谱柱，填料粒径为10um；所用的洗脱液为乙腈/水或甲醇/水，洗脱液添加剂为三氟乙酸，三氟乙酸与乙腈/水或甲醇/水的体积比为0.01-0.15％，优选0.05-0.1％。
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