CN112592387A - 一种Tirzepatide的制备方法 - Google Patents

一种Tirzepatide的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种Tirzepatide的制备方法，属肽合成技术领域。该方法采用氨基树脂为起始树脂，用固相多肽合成法制备，经过多肽固相合成法得到Tirzepatide肽树脂，Tirzepatide树脂再经酸解得到Tirzepatide粗品，最后Tirzepatide粗品纯化得到Tirzepatide纯品。本发明通过方法中采用了特殊的保护氨基酸：Boc‑Tyr(tBu)‑Aib‑OH和Fmoc‑Lys(AEEA‑AEEA‑γGlu(α‑OtBu)‑Eicosanedioicacid(mon‑tBu))‑OH，Fmoc‑Tyr‑Ser(pro‑me‑me)‑OH，Fmoc‑(Dmb)Gly‑OH。本发明方法提高了粗肽纯度，极大降低了物料成本和纯化成本，利于进行工业化放大生产。

Description

一种Tirzepatide的制备方法
技术领域
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及Tirzepatide的制备方法。
背景技术
Tirzepatide是一种GIP和GLP-1双激动剂，Tirzepatide结构如下：Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr10-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp15-Lys-Ile-Ala-Gln-Lys20(二十烷二酸-γ-Glu-AEEA-AEEA)-Ala-Phe-Val-Gln-Trp25-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly30-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala35-Pro-Pro-Pro-Ser39-NH2。
Tirzepatide可改善β细胞功能、提高胰岛素的敏感性，从而证明了其疗效；Tirzepatide对初始使用剂量较低且后续剂量递增幅度较小的患者显示出疗效和耐受性的双重改善；使用Tirzepatide治疗8周后，日本2型糖尿病患者的A1C和体重出现明显降低；Tirzepatide可对2型糖尿病患者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH，肝脏炎症和肝脏脂肪引起的细胞损伤)的标志物带来改善。“这些新的Tirzepatide数据是建立在迄今为止对2型糖尿病患者开展的研究的阳性结果之上的，这些结果提供了额外的证据，证明了Tirzepatide对2型糖尿病患者的A1C和体重水平可带来有意义的降低，同时该药也可治疗其他代谢类疾病。公开专利文献CN 110903355 A公开了一种Tirzepatide的制备方法，方法中采用了特殊的保护氨基酸：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH和Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH。但是由于肽链过长，中间部分会出现偶联困难，缺失肽过多，本领域需要一种Tirzepatide制备方法，来解决现有合成Tirzepatide纯度偏低的问题。
发明内容
本发明的目的是解决现有合成过程中所存在的杂质多，纯度和收率低，成本昂贵，操作步骤繁琐，废液过量，不利于工业化生产的问题，提供了新的一种Tirzepatide的制备方法，该方法提高了粗肽纯度，极大降低了物料成本和纯化成本，利于进行工业化放大生产。
本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种Tirzepatide的制备方法包括：采用氨基树脂为起始树脂，用固相多肽合成法制备，经过多肽固相合成法得到Tirzepatide树脂，Tirzepatide树脂再经酸解得到Tirzepatide粗品，最后Tirzepatide粗品纯化得到Tirzepatide纯品。
其中Tirzepatide多树脂的合成过程中除了使用其他常规的保护氨基酸，同时使用了以下特殊保护氨基酸和片段：
(1)Boc-Tyr(tBu)-Aib-OH
(2)(2)Fmoc-Tyr-Ser(pro-me-me)-OH
(3)Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH
(4)Fmoc-(Dmb)Gly-OH。
采用了3种组合方式：
1.Boc-Tyr(tBu)-Aib-OH，Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioicacid(mon-tBu))-OH，Fmoc-(Dmb)Gly-OH；
2.Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH，Fmoc-Tyr-Ser(pro-me-me)-OH，Fmoc-(Dmb)Gly-OH；
3.Boc-Tyr(tBu)-Aib-OH，Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioicacid(mon-tBu))-OH，Fmoc-Tyr-Ser(pro-me-me)-OH，Fmoc-(Dmb)Gly-OH
Tirzepatide肽树脂：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ile-Ala-Gln(Trt)-Lys(AEEA-AEEA-γGlu-Eicosanedioicacid(mon-tBu))-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tB u)-氨基树脂。
本发明Tirzepatide的制备方法中，所述氨基树脂为Rink MBHA树脂、Rink Amide树脂或Rink Amide AM树脂中的一种，优选为Rink Amide MBHA树脂；所选树脂替代度为0.3～0.5mmol/g；所述的Fmoc-保护氨基酸或保护氨基酸片段的用量为所投料树脂总摩尔数的2.5～3.5倍；所述合成各个氨基酸所用的缩合剂为DIC/HOBt，HBTU/HOBT/DIEA，PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种；所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合；所使用的Fmoc脱除试剂为v/v20％哌啶/DMF溶液；所述Tirzepatide树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1，2-乙二硫醇(EDT)、三异丙基硅烷(Tis)和水混合溶剂，配比为92.5％TFA,2.5％EDT，2.5％Tis和2.5％水。
与现有技术相比，本发明方法具有以下有益效果：本发明方法提高了粗肽纯度，极大降低了物料成本和纯化成本，利于进行工业化放大生产。
具体实施方式
本发明公开了一种Tirzepatide的制备方法。本领域技术人员可以参考本文内容，实施该方法，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的Tirzepatide的制备方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的Tirzepatide的制备方法中所用到的试剂和原料均可由市场购得。为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：Tirzepatide的制备方法
Tirzepatide肽树脂的合成
Tirzepatide肽树脂：
Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ile-Ala-Gln(Trt)-Lys(AEEA-AEEA-γGlu-Eicosanedioicacid(mon-tBu))-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tB u)-氨基树脂。
分别使用Rink Amide MBHA树脂为起始树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与表1、表2、表3的保护氨基酸偶联，制得Tirzepatide肽树脂。本实施例使用的保护氨基酸相对应的保护氨基酸或片段如下所示：
表1
Figure BDA0002880610120000051
Figure BDA0002880610120000061
Figure BDA0002880610120000071
表2
Figure BDA0002880610120000072
Figure BDA0002880610120000081
Figure BDA0002880610120000091
表3
Figure BDA0002880610120000092
Figure BDA0002880610120000101
Figure BDA0002880610120000111
1、接入第1个保护氨基酸取0.09mol第1个保护氨基酸和0.09mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.09mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。取0.03mol的Fmoc-Gly-树脂(取代值约0.5mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。将活化后的第1个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得含1个保护氨基酸的树脂。
2、接入第2～37(38)个保护氨基酸或片段采用上述同样方法，依次按照表1表2、表3接入上述对应的第2～37(38)个保护氨基酸或片段，得Tirzepatide肽树脂。
二、Tirzepatide粗品的制备
取制得的Tirzepatide肽树脂，加入体积比为TFA∶Tis∶EDT∶水＝92.5∶2.5∶2.5∶2.5的裂解试剂(裂解试剂8mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应2.5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀4次，抽干得类白色粉末即为Tirzepatide粗品，粗品纯度分别为：69％，72％，78％。
通过图谱分析，最佳合成方案是：Boc-Tyr(tBu)-Aib-OH，Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH，Fmoc-Tyr-Ser(pro-me-me)-OH，Fmoc-(Dmb)Gly-OH作为原料合成Tirzepatide肽树脂。

Claims (9)

1.一种Tirzepatide的制备方法，其特征在于：该方法采用氨基树脂为起始树脂，用固相多肽合成法制备，经过多肽固相合成法得到Tirzepatide肽树脂，Tirzepatide树脂再经酸解得到Tirzepatide粗品，最后Tirzepatide粗品纯化得到Tirzepatide纯品。
2.根据权利要求1所述的Tirzepatide的制备方法，其特征在于：所述的Tirzepatide肽树脂为：
Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ile-Ala-Gln(Trt)-Lys(AEEA-AEEA-γGlu-Eicosanedioic
acid(mon-tBu))-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-
Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂。
3.根据权利要求2所述的Tirzepatide的制备方法，其特征在于：所述氨基树脂为RinkMBHA树脂、Rink Amide树脂或Rink Amide AM树脂中的一种。
4.根据权利要求2所述的Tirzepatide的制备方法，其特征在于：
Tirzepatide肽树脂的合成过程中除了使用其他常规的保护氨基酸，还使用了以下保护氨基酸和片段：
(1)Boc-Tyr(tBu)-Aib-OH
(2)Fmoc-Tyr-Ser(pro-me-me)-OH
(3)Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic
acid(mon-tBu))-OH
(4)Fmoc-(Dmb)Gly-OH；
保护氨基酸采用以下3种组合方式中的一种：
一、Boc-Tyr(tBu)-Aib-OH，Fmoc-Lys
(AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH，Fmoc-(Dmb)Gly-OH；
二、Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH，Fmoc-Tyr-Ser(pro-me-me)-OH，Fmoc-(Dmb)Gly-OH；
三、Boc-Tyr(tBu)-Aib-OH，Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioicacid(mon-tBu))-OH，Fmoc-Tyr-Ser(pro-me-me)-OH，Fmoc-(Dmb)Gly-OH。
5.根据权利要求4所述的Tirzepatide的制备方法，其特征在于：所选树脂替代度为0.3～0.5mmol/g。
6.根据权利要求4所述的Tirzepatide的制备方法，其特征在于：所述的Fmoc-保护氨基酸或保护氨基酸片段的用量为所投料树脂总摩尔数的2.5～3.5倍。
7.根据权利要求4所述的Tirzepatide的制备方法，其特征在于：所述合成各个氨基酸所用的缩合剂为DIC/HOBt，HBTU/HOBT/DIEA，PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种。
8.根据权利要求4所述的Tirzepatide的制备方法，其特征在于：所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合；所使用的Fmoc脱除试剂为v/v20％哌啶/DMF溶液。
9.根据权利要求4所述的Tirzepatide的制备方法，其特征在于：所述Tirzepatide树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1，2-乙二硫醇、三异丙基硅烷和水混合溶剂，配比为：92.5％TFA，2.5％EDT，2.5％Tis和2.5％水。
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