CN111518192A - 一种Apraglutide的制备方法 - Google Patents
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- C07K14/605—Glucagons
Abstract
本发明提供了一种Apraglutide的制备方法，方法中采用了特殊的保护氨基酸片段:X‑His(Trt)‑Gly‑Glu(OtBu)‑Gly‑Ser(tBu)‑Phe‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Glu(OtBu)‑Leu‑Ser(tBu)‑Thr(tBu)‑Ile‑OH，提高了粗品纯度和产品总收率。
Description
技术领域
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及Apraglutide的制备方法。
背景技术
短肠综合征(SBS)是由慢性炎症性肠病(IBD)、急性事件(如肠系膜梗塞)或先天性异常导致的广泛性肠切除所致。SBS是一种严重的慢性疾病，与肠道功能下降或完全丧失有关，称为“肠道衰竭”。SBS引起的肠道衰竭可能危及生命，其特点是吸收不良和营养不良。受影响的患者依赖于每日的肠外支持，通常每天需要10-15小时的肠胃外给养。肠外支持与感染、血凝块和不良生活质量有关。据估计，在美国和欧洲约有20000-40000名患者患有SBS。
GLP-2是一种内源性多肽，是由小肠L细胞分泌的前胰高血糖素原在翻译后进行剪切所得，序列为第126-158位。正常情况下，GLP-2在营养摄入后分泌，人摄入营养后约15min时血液出现第一个峰值。GLP-2受体(GLP-2R)定位胃肠道，胃肠道中的GLP-2通过促进肠黏膜生长发育、肠上皮隐窝细胞增殖、抑制肠黏膜上皮细胞和隐窝细胞的凋亡从而使小肠绒毛增高、肠重量增加。GLP-2在人体的半衰期为7min，且会被DPP-IV降解而代谢失活，降解产物通过肾脏代谢，机体DPP-IV的活性和肾功能状况是影响GLP-2代谢水平的重要因素，通常给予一定剂量的GLP-2类似物可以避免血液中DPP-IV降解。
Apraglutide是一种新一代合成GLP-2类似物，经过了广泛的临床前表征和优化。该药已成功完成了健康志愿者的I期单剂递增剂量/多次递增剂量临床研究，证明其具有良好的药代动力学特征，半衰期为30个小时，能够实现一种易于使用的每周一次给药方案。
Apraglutide具有以下的结构：
His-Gly-Asp-Gly-Ser5-Phe-Ser-Asp-Glu-Nle10-D-Phe-Thr-Ile-Leu-Asp15-
Leu-Leu-Ala-Ala-Arg20-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp25-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys30-Ile-
Thr-Asp-NH2
本发明提供一种Apraglutide的制备方法，提高了粗品纯度和产品总收率，以满足医药用途。
发明内容
本发明提供了一种新的高效制备方法，采用了特殊的保护氨基酸，缩短了制备工艺周期，提高了了规模化制备方法中产品纯度和收率。
本发明提供了一种Apraglutide的制备方法，包括：采用氨基树脂为起始树脂，用固相多肽合成法制备，经过多肽固相合成法得到Apraglutide树脂，Apraglutide树脂再经酸解得到Apraglutide粗品，最后Apraglutide粗品纯化得到Apraglutide纯品。
其中Apraglutide多树脂的合成过程中除了使用其他常规的保护氨基酸，同时使用了以下特殊保护氨基酸片段：
X-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Nle-OH其中：
当X为Boc时，Apraglutide肽树脂为：
Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)5-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-
Glu(OtBu)-Nle10-D-Phe-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)15-Leu-Leu-Ala-
Ala-Arg(Pbf)20-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)25-Leu-Ile-Gln(Trt)-
Thr(tBu)-Lys(Boc)30-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-氨基树脂
当X为Fmoc时，Apraglutide肽树脂为：
H-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)5-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-
Glu(OtBu)-Nle10-D-Phe-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)15-Leu-Leu-Ala-
Ala-Arg(Pbf)20-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)25-Leu-Ile-Gln(Trt)-
Thr(tBu)-Lys(Boc)30-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-氨基树脂
上述Apraglutide的制备方法中，所述的氨基树脂，其氨基取代值为0.2～0.8mmol/g树脂，优选的取代值为0.3～0.5mmol/g树脂。
上述Apraglutide的制备方法中，所述氨基树脂为Rink MBHA树脂、Rink Amide树脂或Rink Amide AM树脂中的一种，优选为Rink Amide MBHA树脂。
上述Apraglutide的制备方法中，所述的Fmoc-保护氨基酸或保护氨基酸片段的用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍；优选为2.5～3.5倍。
作为本发明优选的方案，上述Apraglutide树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基，得到Apraglutide素线性肽粗品。
进一步地，所述Apraglutide树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)和水混合溶剂，混合溶剂的配比为：TFA的比列为80-95％(V/V)，EDT的比例为1～10％(V/V)，余量为水。优选的配比TFA为89-91％、EDT 4-6％、余量为水。最优的，配比为90％、EDT 5％、余量为水。
所述酸解剂用量为每克Apraglutide树脂需要4～15ml酸解剂，优选的，每克Apraglutide树脂需要9～11ml酸解剂。使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～5小时，优选的为2小时。
进一步的，Apraglutide粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到Apraglutide纯品，具体方法为：
Apraglutide粗品，用10％醋酸水溶液溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得Apraglutide纯化中间体浓缩液。
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到Apraglutide醋酸水溶液，冷冻干燥，得Apraglutide纯品。
本发明方法直接使用了以下特殊保护氨基酸：
X-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Nle-OH
缩短了生产周期，大幅度提高了粗品纯度，提高了产品收率，具有广泛的实用价值和应用前景。
具体实施方式
本发明公开了一种合成Apraglutide的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。
表1
| 英文缩写 | 中文名称 | 英文缩写 | 中文名称 |
| Fmoc | 9-芴甲氧羰基 | OtBu | 叔丁氧基 |
| tBu | 叔丁基 | Boc | 叔丁氧羰酰基 |
| Trt | 三苯甲基 | Leu | 亮氨酸 |
| Ser | 丝氨酸 | Phe | 苯丙氨酸 |
| Glu | 谷氨酸 | Thr | 苏氨酸 |
| Trp | 色氨酸 | Arg | 精氨酸 |
| Asp | 天冬氨酸 | Gln | 谷氨酰胺 |
| Ala | 丙氨酸 | Ile | 异亮氨酸 |
| Tyr | 酪氨酸 | His | 组氨酸 |
| Gly | 甘氨酸 | Lys | 赖氨酸 |
| Val | 缬氨酸 | Arg | 精氨酸 |
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1 采用片段接入法合成Apraglutide肽树脂
Apraglutide肽树脂为：
Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)5-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-
Glu(OtBu)-Nle10-D-Phe-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)15-Leu-Leu-Ala-
Ala-Arg(Pbf)20-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)25-Leu-Ile-Gln(Trt)-
Thr(tBu)-Lys(Boc)30-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-氨基树脂
使用Rink Amide MBHA树脂为起始树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与表2所示的保护氨基酸偶联，制得Apraglutide肽树脂。本实施例使用的保护片段为：
Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-
Glu(OtBu)-Nle-OH
表2
1、接入第1个保护氨基酸
取0.03mol第1个保护氨基酸和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。
取0.01mol的Fmoc-Gly-树脂(取代值约0.5mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。
将活化后的第1个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得含1个保护氨基酸的树脂。
2、接入第2～24个保护氨基酸或片段
采用上述同样方法，依次接入上述对应的第2～24个保护氨基酸或片段，得Apraglutide肽树脂。
实施例2 采用常规逐个接入法合成Apraglutide肽树脂
Apraglutide肽树脂为：
Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)5-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-
Glu(OtBu)-Nle10-D-Phe-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)15-Leu-Leu-Ala-
Ala-Arg(Pbf)20-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)25-Leu-Ile-Gln(Trt)-
Thr(tBu)-Lys(Boc)30-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-氨基树脂
使用Rink Amide MBHA树脂为起始树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与表2所示的保护氨基酸偶联，制得Apraglutide肽树脂。
表3
1、接入第1个保护氨基酸
取0.03mol第1个保护氨基酸和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。
取0.01mol的Fmoc-Gly-树脂(取代值约0.5mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。
将活化后的第1个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得含1个保护氨基酸的树脂。
2、接入第2～33个保护氨基酸
采用上述同样方法，依次接入上述对应的第2～33个保护氨基酸，得Apraglutide肽树脂。
实施例3 Apraglutide粗品的制备
取实施例1制得的Apraglutide肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝95︰5︰5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，35～45℃减压干燥，得Apraglutide粗品，粗品纯度为76.4％。
实施例4 Apraglutide粗品的制备
取实施例2制得的Apraglutide肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝95︰5︰5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，35～45℃减压干燥，得Apraglutide粗品，粗品纯度为52.9％。
实施例5 Apraglutide粗品的纯化
取实施例3制得的Apraglutide粗品，用10％醋酸水溶液溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈。77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得Apraglutide纯化中间体浓缩液。
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到Apraglutide醋酸水溶液，冷冻干燥，得Apraglutide纯品13.7g，纯度为99.3％，最大单一杂质0.07％，总收率为36.4％，分子量3765.2(100％M+H)。
实施例6 Apraglutide粗品的纯化
取实施例4制得的Apraglutide粗品，用10％醋酸水溶液溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈。77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得Apraglutide纯化中间体浓缩液。
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到Apraglutide醋酸水溶液，冷冻干燥，得Apraglutide纯品7.1g，纯度为99.0％，最大单一杂质0.15％，总收率为18.9％，分子量为3765.2(100％M+H)。
上述实施例表明，本发明提供的方法所得产品纯度大于99.0％，产品总收率为36.4％，而常规的逐个接入法总收率仅为18.9％。本发明显著提高了粗品纯度和产品总收率，具有广泛的实用价值和应用前景。
Claims (6)
1.一种Apraglutide的制备方法，包括：采用氨基树脂为起始树脂，用固相多肽合成法制备Apraglutide肽树脂，Apraglutide肽树脂再经酸解得到Apraglutide粗品，最后经过纯化和冻干，得到Apraglutide纯品:
His-Gly-Asp-Gly-Ser5-Phe-Ser-Asp-Glu-Nle10-
D-Phe-Thr-Ile-Leu-Asp15-Leu-Leu-Ala-Ala-Arg20-
Asp-Phe-Ile-Asn-Trp25-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys30-Ile-
Thr-Asp-NH2
2.根据权利要求1所述的Apraglutide的制备方法，其特征在于：在接入第1位His至第13位Ile时一并接入，对应的保护氨基酸片段为:
X-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Nle-OH
其中X为Boc，或为Fmoc。
3.根据权利要求1所述Apraglutide的制备方法，其特征在于，所述的氨基树脂，其氨基取代值为0.2～0.8mmol/g树脂，优选的取代值为0.3～0.5mmol/g树脂。
4.根据权利要求1所述Apraglutide的制备方法，其特征在于，所述氨基树脂为RinkMBHA树脂、Rink Amide树脂或Rink Amide AM树脂中的一种，优选为Rink Amide MBHA树脂。
5.根据权利要求1～4任一项所述的Apraglutide的制备方法，其特征在于：Apraglutide肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到Apraglutide粗品。
6.根据权利要求1所述的Apraglutide的制备方法，其特征在于：Apraglutide粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到Apraglutide纯品。
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