CN104817638A - 一种合成替度鲁肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成替度鲁肽的方法。本发明所述方法按照替度鲁肽主链N端至C端的氨基酸顺序，先合成第1至第2氨基酸、第3至第4氨基酸以及第5至第33氨基酸的3个多肽片段，然后按C端至N端顺序偶联3个多肽片段合成替度鲁肽。本发明所述方法调整替度鲁肽的合成工艺，以较简便的工艺步骤实现了同时在粗肽纯度、控制杂质含量和总收率方面具有较高水平，相比现有技术更加具有实用价值和应用前景。

Description

一种合成替度鲁肽的方法
技术领域
本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成替度鲁肽的方法。
背景技术
短肠综合征(SBS)是指由于严重小肠疾病或外科手术切除大部分小肠导致机体无法正常吸收营养而引发一系列综合征。SBS降低了患者摄取液体和营养物质的能力，导致他们脱水和营养不良。而肠外营养支持治疗又将增加全身感染和其他长期并发症的风险，迄今为止尚无药物可以治疗短肠综合征。
替度鲁肽(teduglutide)是一种胰高血糖素样肽2(GLP-2)类似物，一种天然生成的激素，可减少胃排空和分泌，并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复。临床试验表明，该药能够降低短肠综合征患者对胃肠外营养的需求，其氨基酸肽序如下：
H-His1-Gly2-Asp3-Gly4-Ser5-Phe6-Ser7-Asp8-Glu9-Met10-Asn11-Thr12-Ile13-Leu14-Asp15-Asn16-Leu17-Ala18-Ala19-Arg20-Asp21-Phe22-Ile23-Asn24-Trp25-Leu26-Ile27-Gln28-Thr29-Lys30-Ile31-Thr32-Asp33-OH
在替度鲁肽的氨基酸序列中N端存在特殊序列，如His在缩合过程中产生会产生[D-His1]-替度鲁肽杂质,而Asp-Gly结构在缩合过程也会产生的杂质[Asu3]-替度鲁肽，为此需要较为合适的合成策略来最大程度上的降低这些杂质的产生。
在替度鲁肽现有合成方法中，专利CN104072603A公开了一种替度鲁肽的合成方法，其先合成替度鲁肽2-33位氨基酸片段，而后采用特殊保护基保护的His偶联获得，在该专利记载的数据中，其获得的替度鲁肽纯品中[D-His1]-替度鲁肽杂质含量在0.2％左右，而对于[Asu3]-替度鲁肽杂质含量并未有针对性的进行控制以及检测；
专利CN104418949A也公开了一种替度鲁肽的制备方法，其合成方式是先合成1-3位和4-33位氨基酸片段，而后再偶联而成，在该专利记载的数据中，其合成的替度鲁肽粗品纯度最高为63.8％，最低为59.78％，同时替度鲁肽纯品中[Asu3]-替度鲁肽杂质含量＜0.2％，但是对于[D-His1]-替度鲁肽杂质含量并未有针对性的进行控制以及检测，而且其粗肽纯度也不够理想；
专利CN104072605A公开了另一种替度鲁肽的制备方法，其同时包含了三种合成方式，一是先合成1-9位、10-18位、19-33位氨基酸片段，而后偶联各片段获得；二是先合成1-4位、5-12位、13-20位、21-33位氨基酸片段，而后偶联各片段获得；三是先合成1-4位、5-9位、10-18位、19-26位、27-33位氨基酸片段，而后偶联各片段获得。在该专利记载的数据中，其获得替度鲁肽粗肽纯度最高为63.4％，最低为60.8％，同时替度鲁肽纯品中[Asu3]-替度鲁肽杂质含量为0.15％，但是对于[D-His1]-替度鲁肽杂质含量同样未有针对性的进行控制以及检测，而且其粗肽纯度也不够理想。
无论上述三种现有技术的哪一种技术方案，其都没有同时控制替度鲁肽粗肽纯度以及[D-His1]-替度鲁肽杂质含量和[Asu3]-替度鲁肽杂质含量，并达到较好地水平，同时对于三者的替度鲁肽总收率也未记载，仅是在专利CN104072605A背景技术中公开了现有替度鲁肽合成的收率为20％左右。在多肽药物合成领域，同时实现多个质量标准是研究难题，也是研究人员不断追求的目标，这和合成方案中的各方面因素都存在很大关系，尤其是合成策略。不同的合成策略对最终产品的纯度、杂质含量和收率有很大影响，如何在保证纯度和收率的前提下，尽可能的降低合成工艺的复杂程度、杂质以及缩短合成周期，是当下技术人员的研究重点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成替度鲁肽的方法，使得本发明所述方法能够同时保证所获得的替度鲁肽粗肽纯度以及总收率具有较高水平，同时进一步降低替度鲁肽合成中常见的[D-His1]-替度鲁肽杂质含量和[Asu3]-替度鲁肽杂质含量。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种合成替度鲁肽的方法，包括以下步骤：
步骤1、合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端、His侧链上偶联有保护基的多肽片段1；
合成在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列N端、Asp侧链上偶联有保护基的多肽片段2；
合成在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列C端偶联有树脂载体、在Ser侧链上、Asp侧链上、Glu侧链上、Asn侧链上、Thr侧链上、Arg侧链上、Trp侧链上、Gln侧链上、Lys侧链上偶联有保护基的多肽片段3；
步骤2、将多肽片段3的N端和多肽片段2的C端偶联，偶联后脱除多肽片段2的N端保护基，得到多肽树脂Ⅰ；
步骤3、将多肽片段1的C端和多肽树脂Ⅰ的N端偶联，偶联后脱除多肽片段1的N端保护基，得到替度鲁肽树脂；
步骤4、替度鲁肽树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到替度鲁肽粗品，粗品纯化转醋酸盐，获得替度鲁肽成品。
替度鲁肽主链氨基酸有33个，采用片段方法进行合成存在很多种形式，但只有合适的片段方法才能保证较高的替度鲁肽的总收率以及纯度，同时又能降低杂质的产生。为此，申请人根据长期的试验研究以及氨基酸消旋情况，提出了本发明所述方法来制备替度鲁肽，在保证其总收率和纯度的前提下，进一步降低合成方法的杂质的产生。
在本发明所述方法中，首先按照替度鲁肽主链肽序分成3个部分，即分成3个片段的合成，以替度鲁肽主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式：
H-His1-Gly2-Asp3-Gly4-Ser5-Phe6-Ser7-Asp8-Glu9-Met10-Asn11-Thr12-Ile13-Leu14-Asp15-Asn16-Leu17-Ala18-Ala19-Arg20-Asp21-Phe22-Ile23-Asn24-Trp25-Leu26-Ile27-Gln28-Thr29-Lys30-Ile31-Thr32-Asp33-OH
SEQ ID NO:1所示氨基酸序列即为上式中编号1-2的多肽序列，SEQ IDNO:2所示氨基酸序列即为上式中编号3-4的多肽序列，SEQ ID NO:3所示氨基酸序列即为上式中编号5-33的多肽序列。
本发明在步骤1中合成的多肽片段1是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上，在其N端、His侧链上分别偶联有保护基；合成的多肽片段2是在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列基础上，在其N端、Asp侧链上分别偶联保护基；合成的多肽片段3是在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列基础上，在其C端偶联有树脂载体、在Ser侧链上、Asp侧链上、Glu侧链上、Asn侧链上、Thr侧链上、Arg侧链上、Trp侧链上、Gln侧链上、Lys侧链上偶联有保护基。三个片段分别合成后再逐一偶联起来获得替度鲁肽。
本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质，对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基等基团，作为优选，本发明按照表1中的保护基保护对应氨基酸的侧链
表1
Ser(tBu) His(Trt) Arg(Pbf)
Lys(Boc) Trp(Boc) Glu(OtBu)
Thr(tBu) Asn(Trt) Asp(OtBu)
Gln(Trt)
此外，在本发明所述方法涉及的氨基酸中，氨基酸N端均优选通过Fmoc保护基进行保护，而组氨酸也可通过Boc保护基进行保护。而被保护基保护的氨基酸称为保护氨基酸。
作为优选方案，步骤1所述合成多肽片段1具体为：
Fmoc-His(Trt)-OH或Boc-His(Trt)-OH与Gly-OBzl.HCl和三乙胺，在HOSu和DIC的作用下缩合形成Fmoc-His(Trt)-Gly.OBzL或Boc-His(Trt)-Gly.OBzL，然后钯碳催化氢解，得到Fmoc-His(Trt)-Gly或Boc-His(Trt)-Gly。
作为优选方案，步骤1所述合成多肽片段2具体为：
Fmoc-Asp(OtBu)-OH与Gly-OBzl.HCl和三乙胺，在HOSu和DIC的作用下缩合形成Fmoc-Asp(OtBu)-Gly.OBzL，然后钯碳催化氢解，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Gly。
在上述两个优选方案中，所述HOSu、DIC、保护氨基酸、三乙胺和Gly-OBzl.HCl的摩尔比为1：1：1：1：1。
作为优选方案，步骤1所述合成多肽片段3具体为：
在偶联试剂存在下，将Fmoc-Asp(OtBu)-OH与树脂载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Asp(OtBu)-树脂载体，然后采用活化试剂和缩合试剂，按照SEQID NO:3所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将剩余氨基酸或保护氨基酸进行延伸偶联，脱除N段带有的Fmoc保护基得到多肽片段3，即Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-树脂载体。
在上述合成多肽片段3的优选方案中，Fmoc-Asp(OtBu)-OH与树脂载体偶联所形成的多肽树脂取代值优选为0.2～1.0mmol/g多肽树脂，更优选的取代值为0.3～0.5mmol/g多肽树脂。
本发明所述延伸偶联是指在Fmoc-Asp(OtBu)-OH与树脂载体偶联后，剩余氨基酸按照各自序列的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应(主链氨基和羧基的缩合反应)进行偶联。本发明偶联时，每个保护氨基酸或多肽片段用量优选为多肽树脂摩尔数的1-6倍，更优选为2.5-3.5倍；所述偶联反应时间优选为60～300分钟，更优选为100～140分钟。
在延伸偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识。本发明优选用PIP/DMF(哌啶/N,N-二甲基甲酰胺)混合溶液脱除N端保护基，混合溶液中含哌啶为10～30％(V)，其余为DMF。去N端保护基试剂的用量为每克多肽树脂5～15mL，更优选的为每克多肽树脂8～12mL；去N端保护基时间为10～60分钟，优选的为15～25分钟。
需要说明的是，本发明所述多肽树脂指任意个数保护氨基酸或氨基酸按照替度鲁肽氨基酸顺序和树脂载体相连接形成的多肽树脂，这其中也包括独立权利要求中的多肽树脂Ⅰ、替度鲁肽树脂、多肽片段3及多肽片段3形成过程中的片段。
在上述合成多肽片段3的优选方案中，所述多肽片段合成中采用的树脂载体为Trityl-Cl(三苯甲基氯)类树脂或羟基类树脂。更优选地，所述Trityl-Cl类树脂为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl(4-甲基三苯甲基氯)树脂、4-Methoxytrityl-Cl(4-甲氧基三苯甲基氯)树脂或2-Cl Trity-Cl(2-氯三苯甲基氯)树脂；所述羧基类树脂为Wang(王)树脂或HMP(对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯)树脂。
同时，所述偶联试剂为N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑/4-N,N-二甲基吡啶(DIC/HOBt/DMAP)两种之一。其中，进一步优选地，当树脂载体为Trityl-Cl类树脂时，保护氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH与载体树脂的偶联方法为：保护氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH的羧基与树脂中的Cl-代烷基在DIPEA的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸；当载体树脂为羟基类型树脂时，Fmoc-Asp(OtBu)-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Asp(OtBu)-OH的羧基与树脂中的羟基在DIC/HOBt/DMAP的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。
作为优选，所述缩合试剂优选为N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱(PyBOP/有机碱)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱(HATU/有机碱)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱(HBTU/有机碱)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱(TBTU/有机碱)中的一种。所述缩合试剂的摩尔用量优选为肽树脂中总摩尔数的1～6倍，更优选为2.5～3.5倍，最优选为3倍。
需要说明的是，所述PyBOP/有机碱、HATU/有机碱、HBTU/有机碱、TBTU/有机碱，在本发明中属于四种双体系的缩合试剂，即PyBOP、HATU、HBTU在使用时需要分别和有机碱组合在一起成为一种缩合试剂使用，其中所述有机碱和PyBOP、HATU、HBTU、TBTU的摩尔比优选为为1.3-3.0:1，更优选为1.3-2:1。
作为优选，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺(TEA)或N-甲基吗啡啉(NMM),更优选为DIPEA。
作为优选，所述活化试剂为1-羟基苯并三唑(HOBt)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)。所述活化试剂的用量优选为肽树脂中总摩尔数的1～6倍，更优选为2.5～3.5倍，最优选为3倍。
同时，本发明合成方法的步骤2和步骤3优选采用上述缩合试剂和活化试剂进行偶联。
在本发明合成过程中，优选采用DMF溶剂来溶解。
除上述列举的合成方法，本发明也可以采用液相合成法按照本发明片段合成策略进行合成。
在本发明所述方法步骤4中，作为优选方案，步骤4所述酸解采用由体积百分比为80-95％的TFA、体积百分比为1-10％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。更优选地，用由体积百分比为90％的TFA、体积百分比为5％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。所述混合酸解液用量优选为每克替度鲁肽树脂需要4～15mL，更优选为9～11mL。所述酸解的时间优选为室温条件下1～6小时，更优选为3～4小时。
作为优选，所述纯化转醋酸盐具体为：
替度鲁肽粗品，用30％醋酸溶液溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得替度鲁肽纯化中间体浓缩液；
取替度鲁肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到替度鲁肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得替度鲁肽成品。
由本发明所述方法合成的替度鲁肽经HPLC检测，粗肽纯度在65.1-73.5％，纯化后成品纯度在99％以上，总收率在34.3-37.7％，[D-His1]-替度鲁肽杂质含量在0.07-0.11％，[Asu3]-替度鲁肽杂质含量在0.06-0.12％。与CN104072603A、CN104418949A、CN104072605A相比，本发明同时在粗肽纯度、控制杂质含量和总收率方面具有较高水平。
由以上技术方案可知，本发明所述方法调整替度鲁肽的合成工艺，以较简便的工艺步骤实现了同时在粗肽纯度、控制杂质含量和总收率方面具有较高水平，相比现有技术更加具有实用价值和应用前景。
具体实施方式
本发明公开了一种合成替度鲁肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，所有偶联由保护基的氨基酸均可通过市售获得，本发明中的保护氨基酸购自于成都晖蓉生物科技有限公司，所用树脂购自于上虞普尔树脂有限公司，其中本发明所述多肽片段1、多肽片段2也可以通过市售获得，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表2。
表2英文缩写释义
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：Fmoc-His(Trt)-Gly-OH(多肽片段1)的合成
在10L三口玻璃反应瓶中加入1220g(2mol)Fmoc-His(Trt)-OH和230g(2mol)HOSu用4000ml DMF溶解30分钟再加入412g DIC室温搅拌反应2小时，最后加入402g(2mol)Gly-OBzl.HCl和300ml(2mol)三乙胺反应10小时，反应完成缩合成Fmoc-His(Trt)-Gly.OBzL保护二肽。用10倍反应液体积水沉淀，过滤收集沉淀，并用大量的水洗涤，减压干燥。送检合格后，固体用50％乙醇水溶液溶解，加入50g 5％Pd/c，催化氢解16小时，完毕浓缩乙醇，过滤产品减压干燥得最终成品644.2g Fmoc-His(Trt)-Gly-OH，收率47.6％。
实施例2：Boc-His(Trt)-Gly-OH(多肽片段1)的合成
在10L三口玻璃反应瓶中加入1000g(2mol)Boc-His(Trt)-OH和230g(2mol)HOSu用4000mlDMF溶解30分钟再加入412g DIC室温搅拌反应2小时，最后加入402g(2mol)Gly-OBzl.HCl和300ml(2mol)三乙胺反应10小时，反应完成缩合成Boc-His(Trt)-Gly.OBzL保护二肽。用10倍反应液体积水沉淀，过滤收集沉淀，并用大量的水洗涤，减压干燥。送检合格后，固体用50％乙醇水溶液溶解，加入50g 5％Pd/c，催化氢解16小时，完毕浓缩乙醇，过滤产品减压干燥得最终成品585.9g Boc-His(Trt)-Gly-OH，收率52.8％，MW:554。
实施例3：Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH(多肽片段2)的合成
在10L三口玻璃反应瓶中加入422g(2mol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH和230g(2mol)HOSu用4000mlDMF溶解30分钟再加入412g DIC室温搅拌反应2小时，最后加入402g(2mol)Gly-OBzl.HCl和300ml(2mol)三乙胺反应10小时，完成缩合成Fmoc-Asp(OtBu)-Gly.OBzL保护二肽。用10倍反应液体积水沉淀，过滤收集沉淀，并用大量的水洗涤，减压干燥。送检合格后，固体用50％乙醇水溶液溶解，加入50g 5％Pd/c，催化氢解16小时，完毕浓缩乙醇，过滤产品减压干燥得最终成品402.1g Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH，收率42.9％。MW:468
实施例4：Fmoc-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂的合成
取500g取代值为0.6mmol/g的2-Cl Trt-Cl树脂，加入DMF溶胀树脂。取0.6mol Fmoc-Asp(OtBu)，用适量DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入1.2mol DIEA，搅拌反应3小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂，取代值为0.46mmol/g。
实施例5：Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂的合成
取500g取代值为0.5mmol/g的Wang树脂，加入DMF溶胀树脂。取0.5molFmoc-Asp(OtBu),用适量DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入1.0mol DIC、0.4molHOBt、0.04mol 4-N,N-二甲基吡啶，搅拌反应6小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂，取代值为0.41mmol/g。
实施例6：多肽片段3和替度鲁肽树脂的合成
取0.1mol实施例4的Fmoc-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂(取代值约0.46mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂。
取0.3mol Fmoc-Thr(tBu)和0.3mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.3molDIC，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应30分钟，加入到上述H-Asp(OtBu)-2-ClTrt-树脂中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-Thr(tBu)-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂。
同上法依次接入表3中的保护氨基酸或氨基酸，得到多肽片段3：
H-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂
表3
将上述多肽片段3和实施例1的多肽片段1以及实施例3的多肽片段2进行偶联，获得替度鲁肽树脂：
H-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂
实施例7：多肽片段3和替度鲁肽树脂的合成
取0.1mol实施例4的Fmoc-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂(取代值约0.46mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂。
取0.3mol Fmoc-Thr(tBu)和0.3mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.3molDIC，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应30分钟，加入到上述H-Asp(OtBu)-2-ClTrt-树脂中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-Thr(tBu)-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂。
同上法依次接入表3中的保护氨基酸或氨基酸，得到多肽片段3：
H-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂
将上述多肽片段3和实施例2的多肽片段1以及实施例3的多肽片段2进行偶联，获得替度鲁肽树脂：
Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂
实施例8：多肽片段3和替度鲁肽树脂的合成
取0.1mol实施例5的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang-树脂(取代值约0.41mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Asp(OtBu)-Wang-树脂。
取0.3mol Fmoc-Thr(tBu)和0.3mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.3molDIC，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应30分钟，加入到上述H-Asp(OtBu)-Wang-树脂中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Wang-树脂。
同上法依次接入表3中的保护氨基酸或氨基酸，得到多肽片段3：
H-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang树脂
将上述多肽片段3和实施例1的多肽片段1以及实施例3的多肽片段2进行偶联，获得替度鲁肽树脂：
H-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang树脂
实施例9：多肽片段3和替度鲁肽树脂的合成
取0.1mol实施例5的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang-树脂(取代值约0.41mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Asp(OtBu)-Wang-树脂。
取0.3mol Fmoc-Thr(tBu)和0.3mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.3molDIC，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应30分钟，加入到上述H-Asp(OtBu)-Wang-树脂中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Wang-树脂。
同上法依次接入表3中的保护氨基酸或氨基酸，得到多肽片段3：
H-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang树脂
将上述多肽片段3和实施例2的多肽片段1以及实施例3的多肽片段2进行偶联，获得替度鲁肽树脂：
Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang树脂
实施例10：替度鲁肽粗品的制备
取实施例6所得替度鲁肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝90︰5︰5的混合酸解液(用量10mL/克替度鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得替度鲁肽粗品，粗品纯度为65.1％。
实施例11：替度鲁肽粗品的制备
取实施例7所得替度鲁肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝90︰5︰5的混合酸解液(用量10mL/克替度鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得替度鲁肽粗品，粗品纯度为68.7％。
实施例12：替度鲁肽粗品的制备
取实施例8所得替度鲁肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝90︰5︰5的混合酸解液(用量10mL/克替度鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得替度鲁肽粗品，粗品纯度为70.3％。
实施例13：替度鲁肽粗品的制备
取实施例9所得替度鲁肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝90︰5︰5的混合酸解液(用量10mL/克替度鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得替度鲁肽粗品，粗品纯度为73.5％。
实施例14：替度鲁肽粗品纯化转醋酸盐
取实施例10所得替度鲁肽粗品，用30％醋酸溶液溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用。
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得替度鲁肽纯化中间体浓缩液；
取替度鲁肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到替度鲁肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得替度鲁肽纯品132.4g，总收率为35.3％，分子量：3752.4(100％M+H)，纯度：98.9％，[D-His1]-替度鲁肽含量为0.07％，[Asu3]-替度鲁肽含量为0.11％。
实施例15：替度鲁肽粗品纯化转醋酸盐
取实施例11所得替度鲁肽粗品，用30％醋酸溶液溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用。
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得替度鲁肽纯化中间体浓缩液；
取替度鲁肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到替度鲁肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得替度鲁肽纯品129.1g，总收率为34.4％，分子量：3752.2(100％M+H)，纯度：99.3％，[D-His1]-替度鲁肽含量为0.10％，[Asu3]-替度鲁肽含量为0.06％。
实施例16：替度鲁肽粗品纯化转醋酸盐
取实施例12所得替度鲁肽粗品，用30％醋酸溶液溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用。
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得替度鲁肽纯化中间体浓缩液；
取替度鲁肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到替度鲁肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得替度鲁肽纯品139.6g，总收率为37.2％，分子量：3752.4(100％M+H)，纯度：99.0％，[D-His1]-替度鲁肽含量为0.09％，[Asu3]-替度鲁肽含量为0.12％。
实施例17：替度鲁肽粗品纯化转醋酸盐
取实施例13所得替度鲁肽粗品，用30％醋酸溶液溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用。
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得替度鲁肽纯化中间体浓缩液；
取替度鲁肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到替度鲁肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得替度鲁肽纯品141.5g，总收率为37.7％，分子量：3752.4(100％M+H)，纯度：99.1％，[D-His1]-替度鲁肽含量为0.11％，[Asu3]-替度鲁肽含量为0.08％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种合成替度鲁肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端、His侧链上偶联有保护基的多肽片段1；
合成在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列N端、Asp侧链上偶联有保护基的多肽片段2；
合成在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列C端偶联有树脂载体、在Ser侧链上、Asp侧链上、Glu侧链上、Asn侧链上、Thr侧链上、Arg侧链上、Trp侧链上、Gln侧链上、Lys侧链上偶联有保护基的多肽片段3；
步骤2、将多肽片段3的N端和多肽片段2的C端偶联，偶联后脱除多肽片段2的N端保护基，得到多肽树脂Ⅰ；
步骤3、将多肽片段1的C端和多肽树脂Ⅰ的N端偶联，偶联后脱除多肽片段1的N端保护基，得到替度鲁肽树脂；
步骤4、替度鲁肽树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到替度鲁肽粗品，粗品纯化转醋酸盐，获得替度鲁肽成品。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述合成多肽片段1具体为：
Fmoc-His(Trt)-OH或Boc-His(Trt)-OH与Gly-OBzl.HCl和三乙胺，在HOSu和DIC的作用下缩合形成Fmoc-His(Trt)-Gly.OBzL或Boc-His(Trt)-Gly.OBzL，然后钯碳催化氢解，得到Fmoc-His(Trt)-Gly或Boc-His(Trt)-Gly。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述合成多肽片段2具体为：
Fmoc-Asp(OtBu)-OH与Gly-OBzl.HCl和三乙胺，在HOSu和DIC的作用下缩合形成Fmoc-Asp(OtBu)-Gly.OBzL，然后钯碳催化氢解，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Gly。
4.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述HOSu、DIC、保护氨基酸、三乙胺和Gly-OBzl.HCl的摩尔比为1：1：1：1：1。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤1所述合成多肽片段3具体为：
在偶联试剂存在下，将Fmoc-Asp(OtBu)-OA与树脂载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Asp(OtBu)-树脂载体，然后采用活化试剂和缩合试剂，按照SEQID NO:3所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将剩余氨基酸或保护氨基酸进行延伸偶联，脱除N段带有的Fmoc保护基得到多肽片段3，即Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-树脂载体。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述偶联试剂为N,N-二异丙基乙胺、N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑/4-N,N-二甲基吡啶两种之一。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述树脂载体为Trityl-Cl类树脂或羟基类树脂。
8.根据权利要求2-4任意一项所述方法，其特征在于，步骤4所述酸解所述酸解采用由体积百分比为80-95％的TFA、体积百分比为1-10％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。
9.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述缩合试剂N,N-二异丙基碳二亚胺、N,N-二环己基碳二亚胺，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱中的一种。
10.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述活化试剂为1-羟基苯并三唑或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑。
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