CN112010961B - 一种索玛鲁肽的固液合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种索玛鲁肽的固液合成方法，该方法包括：片段或逐步偶联合成索玛鲁肽序列的第1‑14位氨基酸作为片段1；片段或逐步偶联合成索玛鲁肽序列的第15‑31位氨基酸作为片段2；片段1和片段2偶联合成索玛鲁肽全保护肽或肽树脂；索玛鲁肽全保护肽或肽树脂经裂解得到索玛鲁肽。本发明通过一种新的索玛鲁肽的合成方法，采用固液相结合的方式，多个短链片段同时进行合成，最后缩合片段获得该产品。本发明所述方法合成周期缩短，杂质少，易纯化，适合大规模生产。

Description

一种索玛鲁肽的固液合成方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种索玛鲁肽的固液合成方法。
技术背景
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由人肠道L细胞分泌的一种肽类激素，能够促进胰岛素的分泌、抑制胰高血糖素的分泌，具有降低血糖浓度的功效，被用于II型糖尿病的治疗。然而天然GLP-1在体内不稳定，易被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)快速降解。
索玛鲁肽，英文名称为Semaglutide，是由丹麦诺和诺德公司开发生产的一种新型长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，用于治疗II型糖尿病。索玛鲁肽具有降血糖、减肥和保护心血管的功效，已于2017年10月18日被FDA建议批准上市。索玛鲁肽的Lys侧链经PEG、Glu和十八碳二羧酸修饰后，亲水性大大提高、与白蛋白的结合力增强；同时N端第2位的Ala突变为Aib后，有效的避免了被DPP-IV酶解而失活，半衰期达到40h，患者每周只需注射一次，目前该药物的口服剂型也正在研制当中。索玛鲁肽的CAS号为910463-68-2，分子式为C187H291N45O59，分子量为4113.64g/mol，肽序列为：H-His1-Aib2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Val10-Ser11-Ser12-Tyr13-Leu14-Glu15-Gly16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20(Octadecanedioic-γ-Glu-AEEA-AEEA)-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Val27-Arg28-Gly29-Arg30-Gly31-OH。
目前已报道的索玛鲁肽的制备方法中，专利CN103848910保护了一种全固相制备索玛鲁肽的方法，固相逐一合成31个氨基酸的直链肽，选择性脱除Lys侧链保护基，逐步固相偶联侧链修饰基团，裂解得多肽产物。专利CN106928343公开了一种固相制备索玛鲁肽的方法，以Fmoc-Lys(Alloc)-OH为原料，同样采用逐一偶联的方法，其中侧链修饰部分逐步固相偶联或者直接偶联合成好的侧链四肽片段。专利CN108359006A公开了一种固相制备索玛鲁肽的方法，先逐步偶联至Lys，脱侧链保护基，逐一偶联侧链片段，然后脱主链Fmoc保护基，逐步偶联主链序列剩余氨基酸。专利CN104356224A公开了一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，以液相法合成的Lys五肽片段，以此为原料，逐步固相偶联。专利CN106478806A公开了一种固相制备索玛鲁肽的方法，同样采用逐一偶联的方法，其中五肽片段以Dde-Lys(Fmoc)-OH为原料，固相逐步偶联合成。CN105753964A公开了一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，以Ala-Ala、Ser-Ser二肽片段、Lys五肽片段为原料固相逐步偶联。现有的制备索玛鲁肽的方法，多采用逐步固相偶联的合成方法，合成产生的杂质多，例如+Gly杂质H-His-Aib-Glu-Gly-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Octadecanedioic-γ-Glu-PEG-PEG)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH，H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Octadecanedioic-γ-Glu-PEG-PEG)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；-Ala杂质H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Lys(Octadecanedioic-γ-Glu-PEG-PEG)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH，因性质与产物接近，纯化困难，另外，合成步骤多，周期长，成本高昂，也不利于工业大规模生产。
发明内容
为了解决现有索玛鲁肽合成过程中合成步骤多，周期长，杂质多，纯化难等问题，本发明提供了一种新的索玛鲁肽的合成方法，该方法能有效减少合成步骤，缩短周期，易于纯化，有利于索玛鲁肽的工业大规模生产。
为了实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：
一种索玛鲁肽的固液合成方法，包括以下步骤：
步骤1：合成索玛鲁肽序列的第1-14位氨基酸作为片段1；
步骤2：合成索玛鲁肽序列的第15-31位氨基酸作为片段2；
步骤3：片段1和片段2偶联合成索玛鲁肽全保护肽或肽树脂；
步骤4：索玛鲁肽全保护肽或肽树脂经裂解得到索玛鲁肽。
优选地，步骤1所述片段1为：P1-His(R1)-Aib-Glu(R2)-Gly-Thr(R3)-Phe-Thr(R3)-Ser(R3)-Asp(R2)-Val-Ser(R3)-Ser(R3)-Tyr(
R3)-Leu-OH；步骤2所述片段2为：P3-Glu(R2)-Gly-Gln(R4)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(R2)-Octadecanedioic acidmono-tert-butyl ester]-Glu(R2)-Phe-Ile-Ala-Trp(R5)-Leu-Val-Arg(R6)-Gly-Arg(R6)-Gly-P2，
其中P1选自：Boc、Fmoc；
P2选自：OH、resin；当P2为OH、P3为H时，步骤3中片段1和片段2的偶联采用液相合成方式；P2为固相树脂载体、P3为Fmoc时，步骤3中片段1和片段2的偶联采用固相合成方式。
R1为氨基酸侧链咪唑基保护基，可优选为：Boc、Bzl、Mtt、Mmt、Trt；
R2为氨基酸侧链羧基保护基，可优选为：OtBu、OBzl、OEt、OMe、OPh；
R3为氨基酸侧链羟基/酚羟基保护基，可优选为：Bzl、tBu、MOM、Trt；
R4为氨基酸侧链酰胺基保护基，可优选为：Trt；
R5为氨基酸侧链吲哚基保护基，可优选为：Boc、Bzl；
R6为氨基酸侧链胍基保护基，可优选为：Boc、Pbf。
作为进一步的优选方案，步骤1所述片段1为：Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-OH；步骤2所述片段2为：Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acidmono-tert-butylester]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-resin。
在一些实施例中，步骤1所述片段1由Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH和Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-resin偶联合成。
在一些实施例中，步骤2所述片段2由Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH和Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-resin合成。
在一些实施例中，步骤2所述片段2中索玛鲁肽的第20位氨基酸采用Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester]-OH为原料。此时Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butylester]-OH的合成可优选液相合成方法，其步骤为：1)tBuOCO(CH2)16COOH进行羧基活化生成活化酯；
2)tBuOCO(CH2)16COOH的活化酯与H-Glu-OtBu进行反应得到tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu-OtBu；
3)tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu-OtBu进行羧基活化生成活化酯；
4)tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu-OtBu的活化酯与H-AEEA-OH或其盐进行反应得到tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu；
5)tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu进行羧基活化生成活化酯；
6)tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu的活化酯与H-AEEA-OH或其盐进行反应得到tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu；
7)tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu进行羧基活化生成活化酯；
8)tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu的活化酯与Fmoc-Lys-OH进行反应得到索玛鲁肽侧链Fmoc-Lys[tBuOCO(CH2)16CO-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CO)-OtBu]-OH。
其中，对于活化酯的合成，所用的偶联体系优选为DCC/HOSu、EDCI/HOSu、EDCI/PFP-OH。
在本发明的一些实施例中，步骤2所述片段2中索玛鲁肽的第20位氨基酸采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH为原料。
优选地，步骤1和步骤2所用固相载体树脂2-CTC树脂、Wang树脂。
优选地，步骤1和步骤2所用固相缩合剂为DIC/HOBt、HBTU/HOBt/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA或其组合。
本发明通过一种新的索玛鲁肽的合成方法，采用固液相结合的方式，多个短链片段同时进行合成，最后缩合片段获得该产品。本发明所述方法合成周期缩短，杂质少，易纯化，适合大规模生产。
附图说明
图1为实施例4制备的索玛鲁肽粗品HPLC色谱图
图2为实施例15纯化的索玛鲁肽精肽HPLC色谱图
图3为实施例6合成片段1的工艺路线。
图4为实施例10合成片段2的工艺路线。
图5为实施例14合成索玛鲁肽的工艺路线。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明中所使用的缩写的含义列于下表中：
Fmoc 芴甲氧羰基
Fmoc-AA 芴甲氧羰基保护的氨基酸
TBTU 2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯
HOBT 1-羟基苯并三唑
DIEA: N,N-二异丙基乙胺
DIC: N,N-二异丙基碳二亚胺
tBu 叔丁基
Boc 叔丁氧羰基
DMF N,N-二甲基甲酰胺
TFE 三氟乙醇
DCM 二氯甲烷
HOSu N-羟基琥珀酰亚胺
PFP-OH 五氟苯酚
EDCI 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐
实施例1Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester]-OH的合成
(1)tBuOCO(CH2)16CO-OSu活化酯的合成
称取tBuOCO(CH2)16COOH(185.3g,0.50mol)和HOSu(69.1g,0.60mol)，加入750mLDMF溶解，冷却至0℃，缓慢滴加250mL DCC(123.8g，0.60mol)的DMF溶液，继续反应15min，然后升温至25℃反应3h，TLC和HPLC监控原料反应完全。停止反应，过滤除去宝白色沉淀，用100mL DMF洗涤沉淀。滤液合并，搅拌下加入到10L冷纯水中，析出白色固体，过滤，白色固体用1L饱和碳酸氢钠溶液打浆洗涤1h，抽滤，重复3次，得到白色固体tBuOCO(CH2)16CO-OSu212.8g，收率91％。
(2)tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu-OtBu的合成
称取H-Glu-OtBu(101.6g，0.50mol)溶于500mL10％的碳酸钠水溶液，加入500mL四氢呋喃，搅拌下于5℃，用恒压滴液漏斗缓慢滴加上述所得tBuOCO(CH2)16CO-OSu(210.4g，0.45mol)的1000mL四氢呋喃溶液，滴加完毕升温至25℃继续反应5h，TLC和HPLC监控原料反应完全。停止反应，用1M盐酸溶液调节pH＝7，旋干四氢呋喃，水相用1M盐酸溶液调节pH＝3-4，用乙酸乙酯萃取3次(150mL×3)，合并有机相，用500mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得油状粘稠物tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu-OtBu 240.1g，收率96％，[M+1]+＝556.16。
(3)tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(OSu)-OtBu的合成
称取上述所得tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu-OtBu(222.3g，0.40mol)和HOSu(55.2g，0.48mol)，加入800mL二氯甲烷，冷却至0℃，搅拌下分六批次加入EDCI(115.0g,0.75mol)，继续反应15min，然后升温至25℃反应1h，TLC和HPLC监控原料反应完全。停止反应，反应液分别用800mL水，800mL饱和碳酸氢钠溶液，800mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得白色固体tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(OSu)-OtBu 240.3g，收率92％。
(4)tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu的合成
称取H-AEEA-OH盐酸盐(79.9g，0.40mol)溶于400mL10％的碳酸钠水溶液，加入400mL四氢呋喃，搅拌下于5℃，用恒压滴液漏斗缓慢滴加上述tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(OSu)-OtBu(235.0g，0.36mol)的800mL四氢呋喃溶液，滴加完毕升温至25℃继续反应5h，TLC和HPLC监控原料反应完全。停止反应，用1M盐酸溶液调节pH＝7，旋干四氢呋喃，水相用1M盐酸溶液调节pH＝3-4，用乙酸乙酯萃取3次(150mL×3)，合并有机相，用500mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得油状粘稠物tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu 227.1g，收率90％，[M+1]+＝701.18。
(5)tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CO-OPFP)-OtBu的合成
称取上述所得tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu(210.3g,0.30mol)和PFP-OH(58.9g,0.32mol)，加入600mL二氯甲烷，冷却至0℃，搅拌下分六批次加入EDCI(86.3g,0.45mol)，继续反应15min，然后升温至25℃反应2h，TLC和HPLC监控原料反应完全。停止反应，反应液分别用600mL水，600mL饱和碳酸氢钠溶液，600mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得油状粘稠物tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CO-OPFP)-OtBu 236.7g，收率91％。
(6)tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu的合成
称取H-AEEA-OH盐酸盐(55.9g，0.28mol)溶于300mL10％的碳酸钠水溶液，加入300mL四氢呋喃，搅拌下于5℃，用恒压滴液漏斗缓慢滴加tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CO-OPFP)-OtBu(216.8g，0.25mol)的600mL四氢呋喃溶液，滴加完毕升温至25℃继续反应2h，TLC和HPLC监控原料反应完全。停止反应，用1M盐酸溶液调节pH＝7，旋干四氢呋喃，水相用1M盐酸溶液调节pH＝3-4，用乙酸乙酯萃取3次(150mL×3)，合并有机相，用500mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，柱层析纯化(洗脱液比例：DCM/MeOH＝20/1，v/v，每600mL洗脱液加1mL乙酸)得油状粘稠物tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu 188.3g，收率89％，[M+1]+＝846.22。
(7)tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CO-OPFP)-OtBu的合成
称取tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu(169.2g,0.20mol)和PFP-OH(38.7g,0.21mol)，加入400mL二氯甲烷，冷却至0℃，搅拌下分六批次加入EDCI(57.5g,0.3mol)，继续反应15min，然后升温至25℃反应2h，TLC和HPLC监控原料反应完全。停止反应，反应液分别用400mL水，400mL饱和碳酸氢钠溶液，400mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得油状粘稠物tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CO-OPFP)-OtBu 182.2g，收率90％。
(8)Fmoc-Lys[tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CO)-OtBu]-OH的合成称取Fmoc-Lys-OH(66.3g，0.18mol)溶于180mL10％的碳酸钠水溶液，加入180mL四氢呋喃，搅拌下于5℃，用恒压滴液漏斗缓慢滴加tBuOCO(CH2)16CO-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CO-OPFP)-OtBu(151.8g，0.15mol)的360mL四氢呋喃溶液，滴加完毕升温至25℃继续反应3h，TLC和HPLC监控原料反应完全。停止反应，用1M盐酸溶液调pH＝7，旋干四氢呋喃，水相用1M盐酸溶液调节pH＝3-4，得到大量白色沉淀，过滤，得白色固体Fmoc-Lys[tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CO)-OtBu]-OH 156.1g，收率87％，[M+1]+＝1196.61。
实施例2：片段1Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(t Bu)-Tyr(tBu)-Leu-OH的制备
(1)Fmoc-Leu-2-CTC树脂的制备
称取2-CTC树脂30.2g(替代度为1.06mmol/g)，加入到固相反应器中，用干燥DMF(180mL)洗涤三次，抽干。加入干燥DMF(300mL)溶胀30min，抽干。加入Fmoc-Leu-OH(28.27g，2.5eq)，DIEA(19.83mL，3.75eq)，180mL干燥DMF，室温下搅拌反应6h。抽干溶剂，加入甲醇(19.42mL，15eq)反应1h，DMF(180mL×3)洗涤3次，DCM(180mL×6)洗涤6次，取出氨基酸树脂，干燥。经紫外分光光度法测得Fmoc-Leu-2-CTC树脂的替代度为0.67mmol/g。
(2)片段1的合成
称取步骤(1)所得的Fmoc-Leu-2-CTC树脂14.93g，加入到固相反应器中，加入150mL DMF溶胀30min。抽干溶剂，加入90mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应5min，抽干溶剂，再次加入90mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应15min。抽干溶剂，加入DMF(90mL×6)洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(9.19g，20mmol)和HOBt(3.24g，24mmol)溶于90mL DMF，冰浴下加入DIC(3.78g，30mmol)，活化5min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干溶剂。加入DMF(90mL×3)洗涤3次。
重复上述步骤，依次加入Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应。偶联结束后，DMF(90mL×3)洗涤3次，DCM(90mL×6)洗涤6次，干燥得多肽片段1肽树脂。
将多肽片段1肽树脂加入到300mL 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得片段1 14.27g。
实施例3：片段2Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butylester]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-resin的制备
(1)Fmoc-Gly-2-CTC树脂的制备
称取2-CTC树脂30.2g(替代度为1.06mmol/g)，加入到固相反应器中，用干燥DMF(180mL)洗涤三次，抽干。加入干燥DMF(300mL)溶胀30min，抽干。加入Fmoc-Gly-OH(23.78g，2.5eq)，DIEA(19.83mL，3.75eq)，180mL干燥DMF，室温下搅拌反应6h。抽干溶剂，加入甲醇(19.42mL，15eq)反应1h。DMF(180mL×3)洗涤3次，DCM(180mL×6)洗涤6次，取出氨基酸树脂，干燥。经紫外分光光度法测得Fmoc-Gly-2-CTC树脂的替代度为0.70mmol/g。
(2)片段2Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butylester]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-resin的制备
称取Fmoc-Gly-2-CTC树脂14.29g，加入到固相反应器中，加入150mL DMF溶胀30min。抽干溶剂，加入90mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应5min，抽干溶剂，再次加入90mL20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应15min。抽干溶剂，加入DMF(90mL×6)洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(12.98g，20mmol)和HOBt(3.24g，24mmol)溶于90mL DMF，冰浴下加入DIC(3.78g，30mmol)，活化5min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干溶剂。加入DMF(90mL×3)洗涤3次。
重复上述步骤，依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、实施例1所得的Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester]、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH进行偶联反应。偶联结束后，DMF(90mL×3)洗涤3次，抽干溶剂，得片段2。
实施例4索玛鲁肽的合成
(1)索玛鲁肽全保护肽树脂的合成
向实施例3所得的片段2中加入180mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应5min，抽干溶剂，再次加入180mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应15min。抽干溶剂，加入DMF(180mL×6)洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
将实施例2所得的片段1和HOBt溶于180mL DMF，冰浴下加入DIC，活化5min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干溶剂。DMF(180mL×3)洗涤3次，DCM(180mL×6)洗涤6次，干燥得全保护肽树脂。
(2)索玛鲁肽全保护肽树脂的裂解
冰浴下，将全保护肽树脂加入到400mL冷冻裂解试剂95.0％TFA/2.5％TIS/2.5％H2O(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入1500mL异丙醚，析出白色沉淀，离心沉淀3次，每次加入异丙醚500mL。干燥所得白色固体即为索玛鲁肽粗肽35.1g，HPLC纯度为70.5％，HPLC色谱图如图1所示。
实施例5多肽片段Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH的合成
称取实施例3中步骤(1)所得的Fmoc-Gly-2-CTC树脂7.14g，加入到固相反应器中，加入70mL DMF溶胀30min。抽干溶剂，加入42mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应5min，抽干溶剂，再次加入42mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应15min。抽干溶剂，加入DMF(42mL×6)洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH(4.25g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于42mL DMF，冰浴下加入DIC(1.89g，15mmol)，活化5min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干溶剂。加入DMF(42mL×3)洗涤3次。
重复上述步骤，依次加入Fmoc-Aib-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应。偶联结束后，DMF(42mL×3)洗涤3次，DCM(42mL×6)洗涤6次，干燥得全保护Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-resin。
将全保护Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-resin加入到100mL 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH2.33g。
实施例6片段1Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(t Bu)-Tyr(tBu)-Leu-OH的制备
(1)Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-2-CTC树脂的制备
称取实施例2中步骤(1)所得的Fmoc-Leu-2-CTC树脂7.46g，加入到固相反应器中，加入70mL DMF溶胀30min。抽干溶剂，加入45mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应5min，抽干溶剂，再次加入45mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应15min。抽干溶剂，加入DMF(45mL×6)洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(4.60g，10mmol)、HBTU(5.69g，15mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于45mL DMF，冰浴下加入DIEA(2.58g，20mmol)，活化5min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干溶剂。加入DMF(45mL×3)洗涤3次。
重复上述步骤，依次加入Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH进行偶联反应，得到Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-2-CTC树脂。
(2)片段1的制备
将上述所得的Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-2-CTC树脂加入到固相反应器中，加入70mL DMF溶胀30min。抽干溶剂，加入45mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应5min，抽干溶剂，再次加入45mL20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应15min。抽干溶剂，加入DMF(45mL×6)洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
偶联实施例5中所得Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH，偶联结束后，DMF(45mL×3)洗涤3次，DCM(45mL×6)洗涤6次，干燥得全保护多肽片段1肽树脂。
将多肽片段1肽树脂加入到150mL 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得片段1 7.32g。
实施例7以Fmoc-Lys(Alloc)-OH为原料的多肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acidmono-tert-butylester]-Glu(O tBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH的合成
称取实施例2中步骤(1)所得Fmoc-Leu-2-CTC树脂7.46g，加入到固相反应器中，加入70mL DMF溶胀30min。抽干溶剂，加入45mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应5min，抽干溶剂，再次加入45mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应15min。抽干溶剂，加入DMF(45mL×6)洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
称取Fmoc-Trp(Boc)-OH(5.27g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于45mL DMF，冰浴下加入DIC(1.89g，15mmol)，活化5min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干溶剂。加入DMF(45mL×3)洗涤3次。
重复上述步骤，依次加入Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH进行偶联反应。
称取四三苯基膦钯(5.78g，5mmol)和0.5mL吗啉溶于45mL THF，将所得反应液加入到固相反应器中，反应3h，加入DMF(45mL×3)洗涤3次，茚三酮检测结果呈阳性。
称取由实施例1步骤6所得tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu(8.46g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于45mL DMF，冰浴下加入DIC(1.89g，15mmol)，活化5min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干溶剂。DMF(45mL×3)洗涤3次，DCM(45mL×6)洗涤6次，干燥得全保护肽树脂。
将全保护肽树脂加入到200mL 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acidmono-tert-butyl ester]-Glu(O tBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH。
实施例8以Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester]为原料的多肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acidmono-tert-butyl ester]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH的合成
称取实施例2中步骤1所得Fmoc-Leu-2-CTC树脂7.46g，加入到固相反应器中，加入70mL DMF溶胀30min。抽干溶剂，加入45mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应5min，抽干溶剂，再次加入45mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应15min。抽干溶剂，加入DMF(45mL×6)洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
称取Fmoc-Trp(Boc)-OH(5.27g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于45mL DMF，冰浴下加入DIC(1.89g，15mmol)，活化5min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干溶剂。加入DMF(45mL×3)洗涤3次。
重复上述步骤，依次加入Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acidmono-tert-butylester]、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH进行偶联反应。偶联结束，抽干溶剂，DMF(45mL×3)洗涤3次，DCM(45mL×6)洗涤6次，干燥得全保护肽树脂。
将全保护肽树脂加入到200mL 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH。
实施例9片段2Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butylester]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-resin的制备
(1)Fmoc-Gly-Wang树脂的制备
称取Wang树脂23.8g(替代度为0.84mmol/g)，加入到固相反应器中，用干燥DMF(150mL)洗涤三次，抽干。加入干燥DMF(240mL)溶胀30min，抽干。加入Fmoc-Gly-OH(14.87g，2.5eq)，DIEA(12.39mL，3.75eq)，150mL干燥DMF，室温下搅拌反应6h。抽干溶剂，加入甲醇(12.14mL，15eq)反应1h，DMF(150mL×3)洗涤3次，DCM(150mL×6)洗涤6次，取出氨基酸树脂，干燥。经紫外分光光度法测得Fmoc-Gly-Wang树脂的替代度为0.52mmol/g。
(2)Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-resin的制备
称取Fmoc-Gly-Wang树脂9.62g，加入到固相反应器中，加入100mL DMF溶胀30min。抽干溶剂，加入60mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应5min，抽干溶剂，再次加入60mL20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应15min。抽干溶剂，加入DMF(60mL×6)洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(8.46g，10mmol)、TBTU(4.82g，15mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于60mL DMF，冰浴下加入DIEA(2.58g，20mmol)，活化5min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干溶剂。加入DMF(60mL×3)洗涤3次。
重复上述步骤，依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH进行偶联反应，得到Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-resin。
(3)片段2的制备
将上述所得的Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-resin加入到固相反应器中，加入100mL DMF溶胀30min。抽干溶剂，加入60mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应5min，抽干溶剂，再次加入60mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应15min。抽干溶剂，加入DMF(60mL×6)洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
加入实施例7中所得的Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH进行偶联反应。偶联结束后，DMF(60mL×3)洗涤3次，抽干溶剂，得片段2。
实施例10片段2Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-resin的制备
(1)Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-resin的制备
称取实施例3中步骤(1)Fmoc-Gly-2-CTC树脂7.14g，加入到固相反应器中，加入70mL DMF溶胀30min。抽干溶剂，加入42mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应5min，抽干溶剂，再次加入42mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应15min。抽干溶剂，加入DMF(42mL×6)洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(8.46g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于42mL DMF，冰浴下加入DIC(1.89g，15mmol)，活化5min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干溶剂。加入DMF(42mL×3)洗涤3次。
重复上述步骤，依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH进行偶联反应得到Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-resin。
(2)片段2的制备
将上述所得的Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-resin加入到固相反应器中，加入70mL DMF溶胀30min。抽干溶剂，加入42mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应5min，抽干溶剂，再次加入42mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应15min。抽干溶剂，加入DMF(42mL×6)洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
加入实施例8中所得Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acidmono-tert-butyl ester]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH进行偶联反应。偶联结束后，DMF(42mL×3)洗涤3次，抽干溶剂，得片段2。
实施例11索玛鲁肽的合成
(1)索玛鲁肽全保护肽树脂的合成
向实施例9的片段2中加入60mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应5min，抽干溶剂，再次加入60mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应15min。抽干溶剂，加入DMF(60mL×6)洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
将实施例6所得的片段1和HOBt溶于60mL DMF，冰浴下加入DIC，活化5min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干溶剂。DMF(60mL×3)洗涤3次，DCM(60mL×6)洗涤6次，干燥得全保护肽树脂。
(2)索玛鲁肽全保护肽树脂的裂解
冰浴下，将全保护肽树脂加入到180mL冷冻裂解试剂95.0％TFA/2.5％TIS/2.5％H2O(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入700mL异丙醚，析出白色沉淀，离心沉淀3次，每次加入异丙醚200mL。干燥所得白色固体即为索玛鲁肽粗肽17.1g，HPLC纯度为71.3％，HPLC色谱图与图1相似。
实施例12索玛鲁肽的合成
(1)索玛鲁肽全保护肽树脂的合成
向实施例10的片段2中加入60mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应5min，抽干溶剂，再次加入60mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应15min。抽干溶剂，加入DMF(60mL×6)洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
将实施例6所得的片段1和HOBt溶于60mL DMF，冰浴下加入DIC，活化5min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干溶剂。DMF(60mL×3)洗涤3次，DCM(60mL×6)洗涤6次，干燥得全保护肽树脂。
(2)索玛鲁肽全保护肽树脂的裂解
冰浴下，将全保护肽树脂加入到180mL冷冻裂解试剂95.0％TFA/2.5％TIS/2.5％H2O(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入700mL异丙醚，析出白色沉淀，离心沉淀3次，每次加入异丙醚200mL。干燥所得白色固体即为索玛鲁肽粗肽18.1g，HPLC纯度为70.9％，HPLC色谱图与图1相似。
实施例13片段2H-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成
称取实施例9所得的片段2肽树脂29.32g，加入到固相反应器中，加入300mL DMF溶胀30min。抽干溶剂，加入180mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应5min，抽干溶剂，再次加入180mL 20％哌啶/DMF溶液(v/v)，反应15min。抽干溶剂，加入DMF(180mL×6)洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。DCM(180mL×6)洗涤6次，干燥得片段2全保护肽树脂。
将多肽片段2肽树脂加入到300mL 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得片段2H-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-OH15.31g。
实施例14索玛鲁肽的合成
称取实施例6多肽片段1(3.57g,2mmol)和HOSu(276mg,2.4mmol)，加入15mLDMF，冷却至0℃，搅拌下缓慢滴加EDCI(575mg,3.0mmol)的5mL DMF溶液，继续反应15min，然后升温至25℃反应3h，HPLC监控原料反应完全。停止反应，搅拌下将反应液加到600mL冷却水中，析出白色沉淀，抽滤得多肽片段1的HOSu活化酯3.39g，收率90％。
0℃搅拌下，将多肽片段1的HOSu活化酯的20mLDCM溶液加入到实施例13多肽片段2(5.31g,1.8mmol)的20mL DCM溶液中，然后升温至25℃反应3h，HPLC监控原料反应完全。停止反应，旋干得索玛鲁肽全保护肽。
冰浴下，将索玛鲁肽全保护肽加入到100mL冷冻裂解试剂95.0％TFA/2.5％TIS/2.5％H2O(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入300mL异丙醚，析出白色沉淀，离心沉淀3次，每次加入异丙醚300mL。干燥所得白色固体即为索玛鲁肽粗肽6.2g，HPLC纯度为70.1％，HPLC色谱图与图1相似。
实施例15索玛鲁肽精肽的制备
取实施例11所得的8.2g索玛鲁肽粗品溶于乙腈水溶液，以十八烷基键合硅胶为固定相、以NaClO4盐溶液和乙腈为流动相对索玛鲁肽粗肽溶液进行HPLC梯度洗脱，收集索玛鲁肽馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得索玛鲁肽的一次纯化溶液。索玛鲁肽的一次纯化液以十八烷基键合硅胶为固定相、用TFA水溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集索玛鲁肽馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得索玛鲁肽精肽3.3g，HPLC纯度为99.3％，HPLC色谱图如图2所示，纯化收率为60.9％。

Claims (8)

1.一种索玛鲁肽的固液合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤 1：片段或逐步偶联合成索玛鲁肽序列的第 1-14位氨基酸作为片段1；
步骤 2：片段或逐步偶联合成索玛鲁肽序列的第 15-31位氨基酸作为片段2；
步骤 3：片段1和片段2偶联合成索玛鲁肽全保护肽或肽树脂；
步骤 4：索玛鲁肽全保护肽或肽树脂经裂解得到索玛鲁肽粗肽；
步骤1所述逐步偶联合成索玛鲁肽序列的片段1为：P1-His(R1)-Aib-Glu(R2)-Gly-Thr(R3)-Phe-Thr(R3)-Ser(R3)-Asp(R2)-Val-Ser(R3)-Ser(R3)-Tyr(R3)-Leu-OH；步骤 2 所述逐步偶联合成索玛鲁肽序列的片段 2 为：P3-Glu(R2)-Gly-Gln(R4)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(R2)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester]-Glu(R2)-Phe-Ile-Ala-Trp(R5)-Leu-Val-Arg(R6)-Gly-Arg(R6)-Gly -P2，
其中 P1 选自：Boc、Fmoc；
P2 选自：OH、resin；
P3 选自：H、Fmoc；
R1 选自：Boc、Bzl、Mtt、Mmt、Trt；
R2 选自：OtBu、OBzl、OEt、OMe、OPh；
R3 选自：Bzl、tBu、MOM、Trt；
R4 选自：Trt；
R5 选自：Boc、Bzl；
R6 选自：Boc、Pbf；
步骤 1 所述片段偶联合成索玛鲁肽序列的片段 1 由Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH 和Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-resin 偶联合成；
步骤 2 所述片段偶联合成索玛鲁肽序列的片段 2 由Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butylester]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH 和Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-resin 合成。
2.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的固液合成方法，其特征在于：
步骤 1 所述片段 1 为：Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser (tBu)-Tyr(tBu)-Leu-OH；
步骤 2 所述片段 2 为：Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly -Arg(Pbf)-Gly-resin。
3.根据权利要求 1 所述的索玛鲁肽的固液合成方法，其特征在于：步骤 2 所述片段2 中索玛鲁肽采用 Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester]-OH 为原料。
4.根据权利要求 1 所述的索玛鲁肽的固液合成方法，其特征在于：步骤 2 所述片段2中索玛鲁肽采用 Fmoc-Lys(Alloc)-OH 为原料。
5.根据权利要求 3 所述的索玛鲁肽的固液合成方法，其特征在于：Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester]-OH的液相合成方法为：
1）tBuOCO(CH2)16COOH 进行羧基活化生成活化酯；
2）tBuOCO(CH2)16COOH 的活化酯与 H-Glu-OtBu 进行反应得到tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu-OtBu；
3）tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu-OtBu 进行羧基活化生成活化酯；
4）tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu-OtBu 的活化酯与 H-AEEA-OH 或其盐进行反应得到tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu；
5）tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu 进行羧基活化生成活化酯；
6）tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu 的活化酯与H-AEEA-OH或其盐进行反应得到tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu；
7）tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu 进行羧基活化生成活化酯；
8）tBuOCO(CH2)16CO-γ-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2COOH)-OtBu 的活化酯与 Fmoc-Lys-OH 进行反应得到Fmoc-Lys[tBuOCO(CH2)16CO-Glu(NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CO)-OtBu]-OH。
6.根据权利要求 1 所述的索玛鲁肽的固液合成方法，其特征在于：步骤 1 和步骤 2所用固相载体树脂选自 2-CTC 树脂、Wang 树脂。
7.根据权利要求 1 所述的索玛鲁肽的固液合成方法，其特征在于：步骤 1 和步骤 2所用固相缩合剂选自 DIC/HOBt、HBTU/HOBt/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA 或其组合。
8.根据权利要求 5所述的索玛鲁肽的固液合成方法，其特征在于：活化酯的合成，所用的偶联体系选自 DCC/HOSu、EDCI/HOSu、EDCI/PFP-OH。
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