CN111732649B - 连续流固相反应制备利拉鲁肽 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结合连续流固相合成系统制备利拉鲁肽的方法，主链构造采用Boc‑His(x)‑Ala‑Glu(OtBu)‑Gly，Fmoc‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Asp(OtBu)‑Val‑Ser(Psi(me.me)Pro)‑OH,H‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑Leu‑Glu(OtBu)‑Gly‑Gln(Trt)‑Ala‑Ala‑Lys(Palm‑Glu‑OtBu)‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(y)‑Gly‑Arg(y)‑Gly‑树脂片段，同时采用连续流固相合成增长肽链。
Description
技术领域
本发明属于多肽药物合成领域，具体涉及一种结合连续流固相合成系统制备利拉鲁肽的方法。
背景技术
利拉鲁肽是一种GLP-1受体激动剂，适用于成人2型糖尿病患者控制血糖；适用于单用二甲双胍或磺脲类药物可耐受剂量治疗后血糖仍控制不佳的患者，与二甲双胍或磺脲类药物联合应用。利拉鲁肽是艾塞那肽、阿必鲁肽、利司那肽、贝那鲁肽等GLP-1受体激动剂中降糖效果最好的药物。利拉鲁肽与度拉糖肽的疗效相当。利拉鲁肽降低体重效果明显。同传统降糖药对比，GLP-1还能延缓胃排空，并作用于中枢的饱胀中心而降低食物的摄入，通过抑制食欲从而产生减肥的功效。
利拉鲁肽的多肽序列如下：
H-His7-Ala8-Glu9-Gly10-Thr11-Phe12-Thr13-Ser14-Asp15-Val16-Ser17-Ser18-Tyr19-Leu20-Glu21-Gly22-Gln23-Ala24-Ala25-Lys26(Pal-γ-Glu)-Glu27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp31-Leu32-Val33-Arg34-Gly35-Arg36-Gly37-OH。
目前主要通过间歇性固相合成法制备长链多肽药物。早在20世纪80年代已经提出连续方法固相合成法（J.Chem.Soc.Perkin Trans.I125-147，1986；Tetrahedron Letters,Vol.28,38,4469- 4472,1987）。但是由于当时使用传统的多肽合成树脂，树脂溶胀性不高，连续流合成条件下树脂表面的活性基团不易参与反应，同时柱内压力太高容易出现氨基酸消旋，导致合成效果远远不如间歇性固相合成法。溶胀性好的树脂出现后，连续流固相合成技术也没有引起业界重视。最近文献(Continuous-Flow Solid-Phase PeptideSynthesis:A Revolutionary Reduction of the Amino Acid Excess，ChemSusChem2014,7,3172–3176)报道利用连续流工艺结合优良溶胀性的树脂合成多肽，相对于间歇性方法该工艺在节省时间、产品质量、节约氨基酸和溶剂方面表现出非常突出的效果。
连续流固相多肽合成工艺用于多肽药物合成目前报道还很少。微反应器将连续通过的保护氨基酸快速加热并完全活化的技术与连续流固相多肽合成相结合的工艺用来制备利拉鲁肽也未见公布。已经公布的合成工艺全部集中在间歇性固相合成法和固液结合法方面。
现有公布的合成利拉鲁肽的方法分为几种途径。
1）通过多肽固相合成，按照多肽序列中氨基酸顺序逐一完成利拉鲁肽的肽链连接，相关文献比如CN110291099A、CN109456402A、US20180057558A1等。此类方法以Lys26为支点，从Lys26的主链胺基往下连先完成多肽主链，然后在Lys26的侧链引入Pal-γ-Glu，另外的方法是先从Lys26的侧链胺基引入Pal-γ-Glu完成多肽主链，然后再从Lys26的主链胺基往下完成H-His7-Ala8-Glu9-Gly10-Thr11-Phe12-Thr13-Ser14-Asp15-Val16-Ser17-Ser18-Tyr19-Leu20-Glu21-Gly22-Gln23-Ala24-Ala25部分的连接。此类方法通过传统的Wang PS树脂或者CTC PS树脂来合成利拉鲁肽，会出现肽链偶联时间长、肽链偶联不完全，粗品纯度低等问题。多肽合成当中微波辅助，在实际放大生产当中具有局限性。
2）固相片段合成法，在连接多肽的时候，把短肽通过固相合成方法引入利拉鲁肽主肽链上，相关文献有CN103275208B、CN110028573A、CN105111303B等。此类方法巧妙地解决了缺失肽、肽链折叠等问题，但是同样面临肽链偶联时间偏长、多肽差向异构化严重、溶剂和氨基酸消耗过大的问题。
3）固液结合法，通过固相方法合成出特定的片段，再将片段用液相合成连接成整条肽链（见CN104650219B）。本方法同样需要通过固相合成或液相合成制备短肽，不能从根本上提高利拉鲁肽的产能，其次液相合成时将小片段、缩合试剂和杂质与主片段分离会是一个非常繁琐的工作，尤其是多肽片段溶解性好，不能像保护氨基酸那样通过调溶液的酸碱被大部分除去，纯化工，作难度大，实际效率很低。
通常氨基酸数量大于10个时，平均每步多肽偶联未完成率达到1%，当氨基酸数量大于20个时，平均每步多肽偶联未完成率达到2%（《固相有机合成.原理及应用指南》王德心），逐步偶联法合成利拉鲁肽势必造成粗产品总收率低于50%，这对于工业化生产是不可取的。但是过分追求片段法，片段的物料成本相比单个氨基酸偶联高，效率低很多。同时片段偶联存在时间长，偶联不易完全的情况。多肽粗品纯化的成本较高，如果能够做到主峰前后一分钟无杂峰，纯化上样量可以做得较大，重复纯化次数少，这将大幅降低纯化成本。如下2种方法可以提高粗品产量和降低纯化成本：1）即使氨基酸个数大于20个时，平均每步多肽偶联未完成率小于0.5%。2）偶联最后几步采用长的并且高纯度多肽片段与主链缩合，以此在HPLC上拉开主产品与杂质的距离。本发明通过这2个方法，可以高效地制备低成本的利拉鲁肽及其它多肽药物。
发明内容
本方法合成利拉鲁肽采用先将Palm-Glu-OtBu引入到Lys26的侧链再完成主链的策略。主链构造采用Boc-His(x)-Ala-Glu(OtBu)-Gly，Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)- Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-OH，H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys (Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂片段，同时利用Fmoc-Arg(y)-Gly-OH参与片段或主链的制备。
多肽固相合成树脂表面引入连接子(Linker)得到Linker-PEG-PS树脂、Linker-PEGA、Linker-ChemMatrix等。Linker-PEG-PS树脂结合连续流固相合成利拉鲁肽表现出超高效、低成本等优点。
本发明中所用的连续流固相合成系统参照 Spare, L. K，et al., An optimisedapproach for continuous-flow solid-phase peptide synthesis utilising arudimentary flow reactor，Reaction Chemistry And Engineering, 3(6), 875-882.中公开的设备进行生产。
制备利拉鲁肽的方法，按照如下步骤进行：
1、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-OH片段1
Fmoc-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-OH、有机碱和2-Cl-树脂混合于二氯甲烷中，室温搅拌反应3小时。过滤洗涤后用Fmoc脱除溶液脱掉Fmoc，然后把Fmoc保护氨基酸按照片段结构依次偶联到H-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-树脂上。
用质量浓度为10%~20%的六氟异丙醇/二氯甲烷的混合物，或质量浓度为10%~25%的醋酸/二氯甲烷的混合物切割多肽树脂，得到保护多肽片段。
脱除Fmoc溶液为质量浓度20%的哌啶溶液、质量浓度为1%~5%的DBU与质量浓度为1%~5%的1-辛硫醇的混合溶液、质量浓度为1~5%的DBU或质量浓度为5~15%的哌啶的混合溶液中任意一种或几种。
脱除Fmoc溶液中所采用的溶剂为DMF、NMP、四氢呋喃、二甲基四氢呋喃、1，4二氧六环、乙腈中任意一种或几种。
保护氨基酸为：Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH。
2、Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OH片段2制备
1）Fmoc-Lys-OBzl.HCl合成
Fmoc-Lys(Boc)-OH、溴化苄、碳酸钾混合于DMF中，室温搅拌至Fmoc-Lys(Boc)-OH消耗完全，向反应液中加入水，析出大量淡黄色膏状物，滗去水层，膏状物用二氯甲烷或乙酸乙酯溶剂溶解，再用水洗涤，减压蒸干溶剂，得到中间体。
Fmoc-Lys(Boc)-OBzl用3M~6M氯化氢乙醚或1，4二氧六环溶液处理，产生淡黄色膏状物，补加石油醚，更多膏状物产生。滗去有机层，膏状物用乙醚洗涤数次，再用溶剂溶解，减压蒸干溶剂得到Fmoc-Lys-OBzl.HCl。
2)Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OH合成
Fmoc-Lys-OBzl.HCl，Palm-Glu-OtBu混合于DMF中，冷却到-5~5℃，再依次加入EDC.HCl、DIEA，5℃以下反应，然后自然升到室温反应。反应液用盐酸调pH到3.0附近，再向反应液中加入水，析出油状物。油状物用二氯甲烷溶解，水洗涤，用无水硫酸钠等干燥剂干燥，减压蒸除溶剂得到Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Obzl；Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OBzl用H2/Pd脱保护得到Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OH。
3、将Fmoc-Gly-OH与Wang树脂或比如PAL、HMPA、HMPB等带有苄羟基作为连接子的易溶胀树脂制得Fmoc-Gly-树脂1
将Fmoc-Gly-OH、缩合试剂、有机碱与多肽合成树脂（经过聚乙二醇修饰后的树脂、聚乙二醇基质树脂或Wang树脂）按照摩尔比为1.5~3：2~6：3~8：1混合，在20~40℃反应1~5小时，制得Fmoc-Gly-树脂；
溶剂选用二氯甲烷、DMF、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、NMP中任意一种。
缩合试剂为EDC、DIC、2，6-二氯苯甲酰氯、HBTU中任意一种。
有机碱为TEA、DIEA、NMM、TMP、吡啶中任意一种。
经过聚乙二醇修饰树脂包括树脂表面通过共价键引入易溶于有机溶剂的聚合物的多肽合成树脂；具有如化学式1~13所示的结构：
其中，Re为聚苯乙烯树脂（简称PS树脂）、聚丙烯酰胺树脂或聚甲基丙烯酸酯树脂，R为氢、甲基、乙基、异丙基或苄基；n为1~3的整数；m为4~80的整数；q为1~3的整数。
化学式1~13中，M具有如化学式14~22所示的结构：
其中，n1为1-8的整数，s为1-2的整数，m1为0-10的整数，r为1-3的整数，t为1-7的整数，g为0-2的整数。
聚乙二醇基质树脂包括通过聚乙二醇交联的ChemMatrix、NovaPEG、AM PEGMatix，聚乙二醇-聚丙烯酰胺树脂PEGA1、PEGA2，具有如化学式23-26所示的结构：
其中，n为200~700的整数。
上述化学式1~13中，化学式23-26中，Linker具有如化学式27~31所示的结构：
其中，c为1-12的整数。
4、按照氨基酸排列顺序，合成H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-树脂3
连续流固相合成具体步骤为：
将Fmoc-Gly-树脂中的Fmoc脱除得到H-Gly-树脂，再对Fmoc-Arg(pbf)-OH或Fmoc-Arg(Boc)2-OH进行活化，将活化得到的Fmoc-Arg(pbf)-OH或Fmoc-Arg(Boc)2-OH的活泼脂和H-Gly-树脂进行偶联得到Fmoc-Arg(pbf)-或Fmoc-Arg(Boc)2-Gly-树脂；
对余下Fmoc保护氨基酸及Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OH依次按照以下步骤：上一步制备的多肽树脂中的Fmoc脱除，再将保护氨基酸活化，将活化的到的保护氨基酸或多肽片段的活波脂与脱除Fmoc的多肽树脂偶联，最后再脱除Fmoc，得到H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-树脂3。
Fmoc脱除具体步骤为：将Fmoc-Gly-树脂（或上一步制备的多肽树脂）装进多肽合成柱，将多肽合成溶剂以经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，再经循环液导管流回到溶剂瓶，循环泵入溶剂使Fmoc-Gly-树脂（多肽树脂）溶胀，切换试剂瓶，把脱除溶液按照经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，脱保护温度控制在10~30℃，脱保护时间为5~20分钟，Fmoc被脱除完全。
保护氨基酸进行活化的步骤为：将保护氨基酸溶于多肽合成溶剂，缩合试剂和有机碱溶解于与保护氨基酸同样的多肽缩合溶剂，将2种溶液分别以适当的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经连续流反应器活化，保护氨基酸、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂的摩尔比为1.5~3：1.5~3：3~8：1；多肽片段、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂的摩尔比为1.5~3：1.5~3：3~8：1；多肽合成溶剂与多肽合成树脂的质量比为5~20：1；Fmoc脱除溶液与多肽合成树脂的质量比为5~20：1。护氨基酸与缩合试剂在连续流反应器中活化2~5分钟，活化温度30℃~70℃。
偶联步骤为：将活化后的保护氨基酸的活泼脂进入多肽合成柱与脱除Fmoc的多肽树脂依次偶联，偶联反应温度控制在5~40℃，反应时间为10min~2h；反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应，多肽合成柱内的反应温度由夹套媒介控制在10~50℃。
偶联结束，切换试剂瓶把多肽合成溶剂以适当的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，从废液导液管进入废液收集瓶，直到在线监测器显示保护氨基酸被冲洗干净。
保护氨基酸和多肽片段为：
Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-H、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Arg(y)-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OH，得到第三肽树脂。
其中，y保护基为Pbf或双Boc。
Fmoc脱除溶液为质量浓度5%~20%的哌啶溶液、质量浓度1%~5%的1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯与质量浓度1%~5%的1-辛硫醇的混合溶液、质量浓度1~5%的1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯与质量浓度2~15%的哌啶的混合溶液中任意一种；
Fmoc脱除溶液中溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、二甲基四氢呋喃、1，4二氧六环、乙腈中任意一种或几种；
偶联过程中保护氨基酸的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、二甲基四氢呋喃、1，4-二氧六环、乙腈中任意一种或几种；
多肽合成溶剂为二氯甲烷、DMF、2-甲基四氢呋喃、1，4二氧六环、乙腈、NMP中任意一种或几种；
缩合剂为DIC/HOBt、DIC/Oxyma、HATU/HOAt、HBTU/HOBt、TBTU、COMU、HATU/HOBt中任意一种；
有机碱选用TEA、NMM、DIEA、TMP中任意一种或几种；
连续流固相合成系统中多肽合成柱的反应温度为5℃~40℃。
5、合成Boc-His(x)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂4，（简称：Boc-利拉鲁肽-树脂4）
参照合成H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-树脂3的数据及操作方法。
将缩合剂溶于溶剂当中，有机碱和Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val- Ser(Psi(me.me)Pro)-OH片段1溶于另一份溶剂中，将2种溶液分别以适当的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化，进入多肽合成柱进行偶联反应，反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应，偶联结束，洗涤及脱Fmoc。
再把Boc-His(x)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联到多肽树脂上的步骤为：缩合剂溶于溶剂中，Boc-His(x)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH和有机碱溶于溶剂中，将2种溶液分别以适当的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化，进入多肽合成柱进行偶联反应，反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应，偶联结束，经洗涤和真空干燥后得到多肽树脂。
保护氨基酸和多肽片段为：
Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-OH、Boc-His(x)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH，其中x为Boc或Trt。
多肽片段、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂的摩尔比为1.5~3：1.5~3：3~8：1；多肽合成溶剂与多肽合成树脂的质量比为5~20：1；Fmoc脱除溶液与多肽合成树脂的质量比为5~20：1。
Fmoc脱除溶液为质量浓度5%~20%的哌啶溶液、质量浓度1%~5%的DBU与质量浓度1%~5%的1-辛硫醇的混合溶液、质量浓度1~5%的DBU与质量浓度2~15%的哌啶的混合溶液。
Fmoc脱除溶液中溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、二甲基四氢呋喃、1，4二氧六环、乙腈中任意一种或几种；
偶联过程中保护氨基酸的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、二甲基四氢呋喃、1，4-二氧六环、乙腈中任意一种或几种；
多肽合成溶剂为二氯甲烷、DMF、2-甲基四氢呋喃、1，4二氧六环、乙腈、NMP中任意一种或几种；
缩合剂为DIC/HOBt、DIC/Oxyma、HATU/HOAt、HBTU/HOBt、TBTU、COMU、HATU/HOBt中任意一种；
有机碱选用TEA、NMM、DIEA、TMP中任意一种或几种；
连续流固相合成系统中多肽合成柱的反应温度为5℃~40℃。
6、将多肽树脂片段4用多肽常规制备方法切割，粗品经过纯化、脱盐、冻干后得到利拉鲁肽成品。
本发明与现有技术相比具有下列创新点及优点：
本专利利用连续流固相合成工艺制备利拉鲁肽。连续流固相合成利拉鲁肽工艺相比间歇性固相合成，每步氨基酸偶联时间从原来的1~3小时缩短到30分钟以内，大幅提高了生产效率，氨基酸、缩合剂和溶剂的消耗量大幅下降，多肽偶联，脱Fmoc保护、洗涤树脂不需要用多种溶剂处理，仅使用单一和不易燃易爆的溶剂即可，溶剂重复回收利用方便，环保压力小。连续流生产过程排除了反应釜一次性投料方式的放大效应，生产过程安全。
合成Boc-His(x)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val- Ser (Psi(me.me)Pro)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂片段通过伪脯氨酸结构把Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)引进多肽主链，用伪脯氨酸结构引入多肽片段偶联，降低了多肽粗品的杂质，同时解决了Ser11与相邻的Ser12偶联时间长，导致Ser11容易消旋的难题。当未切割的含保护基的肽链中含有Arg(Pbf)或Arg(Pmc)时，须用高浓度TFA长时间才能把Pbf或Pmc切除干净，这将导致肽链中Trp等氨基酸产生一些副反应。连续流固相合成短时间可以完成偶联，使得在传统多肽合成中长时间反应容易变质的双Boc保护的Arg可以用于利拉鲁肽的合成。
合成肽链时序列中2个Arg采用双Boc保护侧链胍基，多肽切割时可以把三氟乙酸的浓度从90%降低到40%，或者在高浓度TFA下大幅缩短多肽切除干净的时间，从而减少了很多未知的切割副反应，提高了粗肽产品的纯度。主链合成最后一步采取高纯度Boc-His(x)-Ala- Glu(OtBu)-Gly片段使得主产品与小杂质得到区分，大幅降低了产品纯化压力。合成主链Fmoc-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂时采用Fmoc-Arg(y)-Gly-OH二肽取代单个氨基酸偶联，解决了合成Fmoc- Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂脱容易出现缺Gly或增加Gly的问题。如果用传统Wang树脂间歇性合成Fmoc-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-Wang树脂，把Fmoc-Arg(y)-Gly-OH偶联到树脂上非常困难，但是采用易溶胀树脂配合连续流合成，使得偶联反应则变得非常容易。
本发明使用的缩写及英文所对应的含义
| TFA | 三氟乙酸 |
| DMF | N，N-二甲基甲酰胺 |
| NMP | N-甲基吡咯烷酮 |
| Fmoc | 9-芴甲氧羰基 |
| DBU | 1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯 |
| DIC | N，N'-二异丙基碳二亚胺 |
| HOBt | 1-羟基苯并三唑 |
| TMP | 2，4，6-三甲基吡啶 |
| HATU | 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯 |
| HBTU | 苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐 |
| TBTU | O-(IH-苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基异脲四氟化硼 |
| COMU | (2-肟基-氰基乙酸乙酯)-N，N-二甲基-吗啉基脲六氟磷酸酯 |
| Oxyma | 2-肟氰乙酸乙酯 |
| TEA | 三乙胺 |
| DIEA | N，N-二异丙基乙胺 |
| NMM | N-甲基吗啡啉 |
| Trt | 三苯甲基 |
| 2-CTC-树脂 | 2-氯三苯基氯树脂 |
| DODT | 2，2’-(1，2-乙二基双氧代)双乙硫醇 |
| AEEA | 2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸 |
| Boc | 叔丁氧羰基 |
| PS树脂 | 聚苯乙烯树脂 |
| Pbf | 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基 |
附图说明
图1为实施例1制备的利拉鲁肽粗品的高效液相色谱图；
图2为实施例1制备的利拉鲁肽纯品的高效液相色谱图；
图3为实施例1制备的利拉鲁肽粗品的质谱图。
具体实施方式
本发明公布了一种利拉鲁肽的制备方法，实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
下面结合实施例进一步阐明本发明。
实施例1
步骤1：Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-OH片段1制备
1）Fmoc-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-2-CTC-树脂
2-CTC-树脂10g（取代度=0.72mmol/g）加入到固相反应器中，树脂用120mL二氯甲烷溶胀5分钟，再依次加入Fmoc-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-OH1g(2.16mmol)，10.2mLDIEA，搅拌2小时。抽干溶剂，加入100mL10:90甲醇/二氯甲烷溶液，搅拌半小时封闭未反应完全氯甲基。每次用100mL二氯甲烷洗涤3次。真空干燥后测得Fmoc-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-2-CTC-树脂取代度为0.61mmol/g。
室温下Fmoc-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-2-CTC-树脂用100mL2%DBU/2%1-辛硫醇、DMF溶液脱除Fmoc12分钟，抽滤和洗涤后得到H-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-2-CTC-树脂。
2）Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-OH片段1
把Fmoc保护氨基酸与10gH-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-2-CTC-树脂按照经典多肽固相合成方法制备，缩合试剂采用HBTU/HOBt/DIEA，Fmoc用2%DBU/2%1-辛硫醇、DMF溶液脱除。得到16.4g多肽树脂。
Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-2-CTC-树脂16.4g与90mL15%六氟异丙醇/二氯甲烷溶液室温下搅拌30分钟，滤除树脂球，滤液减压旋干得Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-OH片段16.1gHPLC纯度97%，最大单杂小于0.5%，ESI-MS:1258.41[M+1]。
步骤2：Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OH片段2制备
1）Fmoc-Lys-OBzl.HCl合成
Fmoc-Lys(Boc)-OH46.8g(0.1mol)/溴化苄18.8g(0.11mol)、碳酸钾26.2g(0.2mol)混合250mLDMF中，室温搅拌2小时500mL水加入反应液，析出大量淡黄色膏状物，滗去水层，膏状物用200mL二氯甲烷溶解，再用水洗涤（100mL×2），减压蒸干溶剂，得到56.2gFmoc-Lys(Boc)-Obzl。
50gFmoc-Lys(Boc)-OBzl用250mL约3M氯化氢乙醚溶液处理3小时，产生淡黄色膏状物，补加100mL石油醚，更多膏状物产生。滗去有机层，膏状物用乙醚洗涤3次，再用200mL二氯甲烷溶解，减压蒸干得到42gFmoc-Lys-OBzl.HCl。
2)Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OH
44.2g(0.1mol)Fmoc-Lys-OBzl.HCl、Palm-Glu-OtBu44.2g(0.1mol)混合于200mLDMF中，冷却到5℃，再依次加入EDC.HCl14g(0.1mol)，DIEA50mL(0.3mol)，5℃以下反应1小时，然后自然升到室温反应2小时。反应液用6N盐酸调pH到3.0附近，再向反应液中加入600mL水，析出油状物。油状物用200mL二氯甲烷溶解，水洗涤(50mL×2)，用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂得到71gFmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OBzl。
71gFmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OBzl溶解于300mL甲醇，加入7g10%钯碳，通入氢气在0.005Mpa下反应4小时，滤除钯碳，滤液减压蒸干，得到Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)59g。
HPLC纯度:97.3%，ESI-MS:793.3[M+1]。
步骤3：Fmoc-Gly-HMPA-PEG-Carboxyl-PS树脂合成
称取HMPA-PEG-Carboxyl-PS树脂15g（取代度=0.57mmol/g）加入到固相反应器中，树脂用100mL二氯甲烷溶胀5分钟，再依次加入77g Fmoc-Gly-OH，8.8mLDIEA，搅拌2小时。抽干溶剂，加入100mL10:90甲醇/二氯甲烷溶液，搅拌半小时封闭未反应完全氯甲基。每次用100mL二氯甲烷洗涤3次。真空干燥后测得Fmoc-Gly-HMPA-PEG-Carboxyl-PS树脂取代度为0.50mmol/g。
步骤4：H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-2-CTC-ChemMatrix树脂3合成
将合成的Fmoc-Gly-HMPA-PEG-Carboxyl-PS树脂用于利拉鲁肽树脂合成。称取80g取代度为0.50mmol/g的Fmoc-Gly-HMPA-PEG-Carboxyl-PS树脂装进多肽合成柱，将树脂恰好填满柱子，然后拧紧盖子。
将200mLDMF以90mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，再经循环液导管流回到溶剂瓶，循环泵入溶剂使树脂溶胀10分钟，切换试剂瓶，把100mL20%哌啶/DMF以60mL/min经由循环液导管2和进料管路泵入多肽合成柱，循环8分钟，在线监测器显示Fmoc被脱除完全。切换试剂瓶把DMF以100mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，从废液导液管进入废液收集瓶，直到在线监测器显示哌啶被冲洗干净。
52.2g(80.5mmol)Fmoc-Arg(pbf)-OH溶于120mLDMF、13.7mL(88.5mmol)DIC和13.1g (88.5mmol) Oxyma溶解于120mLDMF，将2种溶液分别以60mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为60℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应。偶联结束，切换试剂瓶把DMF以100mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，从废液导液管进入废液收集瓶，直到在线监测器显示Fmoc-Arg(pbf)-OH被冲洗干净。
余下保护氨基酸及多肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH和Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OH按照氨基酸序列依次偶联，保护氨基酸、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂（HMPA-PEG-Carboxyl-PS树脂）的摩尔比为2.5：2.5：6：1；多肽片段、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂（HMPA-PEG-Carboxyl-PS树脂）的摩尔比为2.5：2.5：6：1；根据不同保护氨基酸和片段，多肽合成溶剂与多肽合成树脂（HMPA-PEG-Carboxyl-PS树脂）的质量比为15~20：1。有机碱为NMM，多肽合成溶剂为DMF，缩合剂为DIC/Oxyma。单管管式反应器循环液温度设置为30~40℃，保护氨基酸活化的液体流速控制在50mL/min~80mL/min。
Fmoc被脱除条件：每次200mL5%哌啶/DMF溶液，流速控制在80mL/min，脱Fmoc后洗涤树脂的流速控制在80mmL/min。
步骤5：Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-HMPA-PEG-Carboxyl-PS树脂4，（简称：Boc-利拉鲁肽-HMPA-PEG-Carboxyl-PS树脂4）
参照步骤4的数据及操作方法。将30.5g(80.5mmol)HBTU、10.9g(80.5mmol)HOBt溶于100mLDMF；DIEA39.6mL（225.6mmol）和101g(80.5mmol)Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-OH片段1溶于200mLDMF，将2种溶液分别以30mL/min和60mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为60℃），反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应。进入多肽合成柱进行偶联反应，偶联结束。Fmoc用200mL 6%哌啶DMF溶液脱除，流速控制在80mL/min，脱Fmoc后洗涤树脂的流速控制在100mL/min。
再把Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联到多肽树脂上，操作步骤为：将13.7mL(88.5mmol)DIC，10.9g(80.5mmol)HOBt溶于100mLDMF，Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH67.9g(80.5mmol)溶于200mLDMF，将2种溶液分别以30mL/min和60mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为60℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应。偶联结束，经洗涤和真空干燥后得到多肽树脂271g。
步骤6：Boc-利拉鲁肽-HMPA-PEG-Carboxyl-PS树脂4用多肽常规制备方法切割，粗品经过纯化、脱盐、冻干后得到利拉鲁肽成品。
具体为：
1）切割液的配置
A切割液：870mLTFA+50mL茴香硫醚+50mL水+30mLDODT+50g苯酚，置于棕色瓶中备用，切割液的用量为1g树脂6mL切割液。B液：370mL二氯甲烷+500mLTFA+50mL茴香硫醚+50mL水+30mLDODT+50g苯酚，置于棕色瓶中备用，切割液的用量为1g树脂6mL切割液。
2）Boc-利拉鲁肽-HMPA-PEG-Carboxyl-PS树脂4切割
试剂储液瓶中1500mLA切割溶液经由循环液导管和进料管路泵入抽干的多肽反应柱，循环70分钟，从废液导液管进入收集瓶，40℃温度下减压蒸馏除去约1200mL切割液，往浓缩液中加入3000mL甲基叔丁基醚，析出多肽沉淀。多肽通过离心与切割液和甲基叔丁基醚分离。得到的多肽粗品再用3000mL甲基叔丁基醚打浆一次，通过离心将利拉鲁肽粗品与残留切割液分离，重复打浆和离心2次，残留切割液基本上被除干净。利拉鲁肽粗品室温真空干燥后得到类白色固体82.7g，HPLC纯度80.9%，粗品收率：71%。
3）利拉鲁肽的纯化
称取55g利拉鲁肽粗品用乙腈和水的混合液溶解，采用C18或者C8制备柱进行1次纯化除去产品前后主要杂质，再进行1次精致纯化除去微小杂质，经过转盐和冻干得到纯度达到99.60%的产品。
实施例2
步骤1：Fmoc-Gly-HMPA-PEGA树脂合成
称取HMPA-PEGA树脂10g（取代度=0.44mmol/g）加入到固相反应器中，树脂用100mL二氯甲烷溶胀20分钟，抽滤。再依次加入5.0g（17mmol）Fmoc-Gly-OH、2.6mL(34mmol)吡啶、2.3mL（17mmol）2，6-二氯苯甲酰氯，搅拌2小时。抽干溶剂，加入100mL醋酸酐：吡啶=1:1进行树脂封闭反应溶液，搅拌半小时封闭未反应完全羟甲基。每次用100mL二氯甲烷洗涤3次。真空干燥后测得Fmoc-Gly-HMPA-PEGA树脂取代度为0.36mmol/g。
步骤2：H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Boc)2-Gly-Arg(Boc)2-Gly-HMPA-PEGA树脂片段3合成
将步骤1中合成的Fmoc-Gly-HMPA-PEGA树脂用于利拉鲁肽树脂合成。称取12g取代度为0.36mmol/g的Fmoc-Gly-HMPA-PEGA树脂装进多肽合成柱，将树脂恰好填满柱子，然后拧紧盖子。
将60mL二甲基四氢呋喃以30mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，再经循环液导管流回到试剂瓶，循环泵入使树脂溶胀10分钟，切换试剂瓶，把30mL20%哌啶/二甲基四氢呋喃以30mL/min经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，循环8分钟，在线监测器显示Fmoc被脱除完全。切换试剂瓶把DMF以30mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，从废液导液管进入废液收集瓶，直到在线监测器显示哌啶被冲洗干净。
5.2g(8.7mmol)Fmoc-Arg(Boc)2-OH和2.9mL(17.4mmol)DIEA溶于10mL二甲基四氢呋喃，3.3g(8.7mmol)HBTU和1.1g(8.7mmol)HOBt溶解于20mL二甲基四氢呋喃，将2种溶液分别以30mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为60℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应。偶联结束，切换试剂瓶把二甲基四氢呋喃以30mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，从废液导液管进入废液收集瓶，直到在线监测器显示Fmoc-Arg(Boc)2-OH被冲洗干净。
余下保护氨基酸及多肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH和Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OH按照氨基酸序列依次偶联，保护氨基酸、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂（HMPA-PEGA树脂）的摩尔比为2：2：6：1，多肽片段、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂（HMPA-PEGA树脂）的摩尔比为2：2：6：1，因保护氨基酸不同，多肽合成溶剂与多肽合成树脂（HMPA-PEGA树脂）的质量比为10~20：1，多肽合成溶剂为2-甲基四氢呋喃，有机碱为DIEA，缩合剂为HBTU/HOBt。单管管式反应器循环液温度设置为30~40℃，保护氨基酸活化的液体流速控制在10mL/min~40mL/min。
Fmoc被脱除条件：每次30mL5%哌啶/2-甲基四氢呋喃溶液，流速控制在30mL/min，脱Fmoc后用2-甲基四氢呋喃洗涤树脂，流速控制在30mmL/min。
步骤3：Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Boc)2-Gly-Arg(Boc)2-Gly-HMPA-PEGA树脂4，（简称：Boc-利拉鲁肽-HMPA-PEGA树脂片段4）
参照步骤2的数据及操作方法。将2.9g(8.7mmol)TOTU溶于20mLDMF，DIEA1.5mL（8.7mmol）和10.9g(8.7mmol) Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi (me.me)Pro)-OH片段1溶于40mL2-甲基四氢呋喃，将2种溶液分别以20mL/min和40mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为70℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应。偶联结束。Fmoc脱除条件同步骤2。
将Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联到多肽树脂上，操作步骤为：将3.3g(8.7mmol)HBTU，1.1g(8.7mmol)HOBt溶于20mLDMF，Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly -OH6.1g(8.7mmol)和NMM 0.95mL（8.7mmol）溶于40mLDMF，将2种溶液分别以20mL/min和40mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为70℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应。偶联结束，经洗涤和真空干燥后得到多肽树脂36g。
步骤4：Boc-利拉鲁肽-HMPA-PEGA树脂4用多肽常规制备方法切割，粗品经过纯化、脱盐、冻干后得到利拉鲁肽成品。
（1）切割液的配置实施例1中的步骤进行。
（2）Boc-利拉鲁肽-HMPA-PEGA树脂切割
试剂储液瓶中200mL切割液A以60mL/min的速度经溶液经由循环液导管和进料管路泵入抽干的多肽反应柱，循环70分钟，然后从废液导液管进入收集瓶，40℃温度下减压蒸馏除去约180mL切割液，往浓缩液中加入400mL甲基叔丁基醚，析出多肽沉淀。多肽通过离心与切割液和甲基叔丁基醚分离。得到的多肽粗品再用400mL甲基叔丁基醚打浆一次，通过离心将利拉鲁肽粗品与残留切割液分离，重复打浆和离心2次，残留切割液基本上被除干净。利拉鲁肽粗品室温真空干燥后得到类白色固体13.6g，HPLC纯度90.1%，收率：86.3%。
（3）粗品的纯化按照实施例1的步骤6进行。
制备出来的利拉鲁肽粗品HPLC谱图，质谱谱图，纯品HPLC谱图与实施例1类似。
实施例3
步骤1:Fmoc-Gly-HMPA-Thio PEG-UREA-PS树脂合成
称取HMPA-Thio PEG-UREA-PS树脂15g（取代度=0.41mmol/g）加入到固相反应器中，树脂用100mL二氯甲烷溶胀5分钟，再依次加入5.4gFmoc-Gly-OH，7.7mLDIEA，搅拌3小时。抽干溶剂，加入100mL10:90甲醇/二氯甲烷溶液，搅拌半小时封闭未反应完全三苯基氯甲基。每次用100mL二氯甲烷洗涤3次。真空干燥后测得Fmoc-Gly-Trt-Thio PEG-AM-PS树脂取代度为0.33mmol/g。
步骤2：H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-HMPA-Thio PEG-UREA-PS树脂3合成
将步骤1中合成的Fmoc-Gly-HMPA-Thio PEG-UREA-PS树脂用于利拉鲁肽树脂合成。称取10g取代度为0.33mmol/g的Fmoc-Gly-HMPA-Thio PEG-UREA-PS树脂装进多肽合成柱，将树脂恰好填满柱子，然后拧紧盖子。将60mLDMF以30mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，再经循环液导管流回到试剂瓶，循环泵入使树脂溶胀10分钟，切换试剂瓶，把30mL10%哌啶/DMF以30mL/min经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，循环8分钟，在线监测器显示Fmoc被脱除完全。切换试剂瓶把DMF以30mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，从废液导液管进入废液收集瓶，直到在线监测器显示哌啶被冲洗干净。
4.7g(7.6mmol)Fmoc-Arg(Boc)2-OH溶于20mLDMF，3.24g(7.6mmol) COMU和0.83mL(7.6mmol)NMM溶解于20mLDMF，将种溶液分别以30mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为60℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导和进料管路进入多肽反应柱循环反应。偶联结束，切换试剂瓶把DMF以30mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，从废液导液管进入废液收集瓶，直到在线监测器显示Fmoc-Arg(Boc)2-OH被冲洗干净。
余下保护氨基酸及多肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH和Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OH按照氨基酸序列依次偶联，保护氨基酸、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂（HMPA-Thio PEG-UREA-PS树脂）的摩尔比为1.9：1.9：6：1，多肽片段、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂（HMPA-Thio PEG-UREA-PS树脂）的摩尔比为1.9：1.9：6：1，因保护氨基酸不同，多肽合成溶剂与多肽合成树脂（HMPA-Thio PEG-UREA-PS树脂）的质量比为10~20：1；多肽合成溶剂为DMF，有机碱为DIEA，缩合剂为COMU。单管管式反应器循环液温度设置为30~40℃，根据不同保护氨基酸活化的液体流速控制在10mL/min~40mL/min。
Fmoc脱除条件：每次30mL5%哌啶/DMF溶液，流速控制在30ml/min，脱Fmoc后用DMF洗涤树脂，流速控制在30mml/min。
步骤3：Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Boc)2-Gly-Arg(Boc)2-Gly-HMPA-Thio PEG-UREA-PS树脂4，（简称：Boc-利拉鲁肽-HMPA-Thio PEG-UREA-PS树脂4）
参照步骤2的数据及操作方法。将2.9g(7.6mmol)HATU、1.03g(7.6mmol)HOBt溶于20mLDMF，DIEA2.5mL（15.2mmol）和9.6g(7.6mmol)Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-OH片段1溶于40mLDMF，将2种溶液分别以20mL/min和40mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为70℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应，循环10分钟偶联反应完全。
Fmoc被脱除条件：Fmoc用30mL5%哌啶/DMF溶液，流速控制在30mL/min，脱Fmoc后用DMF洗涤树脂，流速控制在30mmL/min。。
将Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH(MW=843.86mmol)偶联到多肽树脂上，操作步骤为：将2.9g(7.6mmol)HBTU，1.04g(7.6mmol)HOBt溶于20mLDMF，Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH6.3g(7.6mmol)和2.4mL（15.2mmol）溶于40mLDMF，将2种溶液分别以20mL/min和40mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为70℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应。偶联结束，经洗涤和真空干燥后得到多肽树脂34g。
步骤4：Boc-利拉鲁肽-HMPA-Thio PEG-UREA-PS树脂用多肽常规制备方法切割，粗品经过纯化、脱盐、冻干后得到利拉鲁肽成品。
（1）切割液的配置实施例1中的步骤进行。
（2）Boc-利拉鲁肽-HMPA-Thio PEG-UREA-PS树脂4切割：
当多肽片段里的Arg的胍基全部采用Boc保护时采用B切割液，具体操作为：试剂储液瓶中200mLB切割溶液经由循环液导管和进料管路泵入抽干的多肽反应柱，循环20分钟，切割液从废液导液管进入收集瓶，切割液继续搅拌2小时40℃温度下减压蒸馏除去约170mL切割液，往浓缩液中加入300mL甲基叔丁基醚，析出多肽沉淀。多肽通过离心与切割液和甲基叔丁基醚分离。得到的多肽粗品再用300mL甲基叔丁基醚打浆一次，通过离心将利拉鲁肽粗品与残留切割液分离，重复打浆和离心2次，残留切割液基本上被除干净。利拉鲁肽粗品室温真空干燥后得到类白色固体11.8g，纯度87.53%，粗品收率：86.1%。
（3）粗品的纯化按照实施例1的步骤6进行。
制备出来的利拉鲁肽粗品HPLC谱图，质谱谱图，纯品HPLC谱图与实施例1类似。
实施例4
步骤1:Fmoc-Gly-HMPA-PEG-AM-PS树脂合成Ⅰ
称取HMPA-PEG-AM-PS树脂10g（取代度=0.43mmol/g）加入到固相反应器中，树脂用100mL二氯甲烷溶胀20分钟，抽滤。再依次加入4.45g（17mmol）Fmoc-Gly-OH，2.7mL(34mmol)吡啶，3.58g（17mmol）2，6-二氯苯甲酰氯，搅拌2小时。抽干溶剂，加入80mL醋酸酐：吡啶=1:1进行树脂封闭反应溶液，搅拌半小时封闭未反应完全羟甲基。每次用100mL二氯甲烷洗涤3次。真空干燥后测得Fmoc-Gly-HMPA-PEG-AM-PS树脂取代度为0.39mmol/g。
步骤2：H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Boc)2-Gly-Arg(Boc)2-Gly-Trt-Thio PEG-AM-PS树脂3合成
将步骤1中合成的Fmoc-Gly-HMPA-PEG-AM-PS树脂用于利拉鲁肽树脂合成。称取80g取代度为0.39mmol/g的Fmoc-Gly-Trt-Thio PEG-AM-PS树脂装进多肽合成柱，将树脂恰好填满柱子，然后拧紧盖子。
将400mLDMF以90mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，再经循环液导管流回到试剂瓶，循环泵入使树脂溶胀10分钟，切换试剂瓶，把200mL1%DBU/2%1-辛硫醇的DMF溶液以90mL/min经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，循环8分钟，在线监测器显示Fmoc被脱除完全。切换试剂瓶把DMF以90mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，从废液导液管进入废液收集瓶，直到在线监测器显示哌啶被冲洗干净。
41.8g(70.2mmol)Fmoc-Arg(Boc)2-OH溶于120mLDMF，26.6(70.2mmol)HBTU和9.5g(70.2mmol)HOBt溶解于120mLDMF，将2种溶液分别以30mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为60℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应。偶联结束，切换试剂瓶把DMF以90mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，从废液导液管进入废液收集瓶，直到在线监测器显示Fmoc-Arg(Boc)2-OH被冲洗干净。
余下保护氨基酸及多肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH和Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OH按照氨基酸序列依次偶联，保护氨基酸、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂（HMPA-PEG-AM-PS树脂）的摩尔比为2.2：2.2：6：1；多肽片段、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂（HMPA-PEG-AM-PS树脂）的摩尔比为2.2：2.2：6：1；因保护氨基酸不同，多肽合成溶剂与多肽合成树脂（HMPA-PEG-AM-PS树脂）的质量比为10~20：1；有机碱为NMM，多肽合成溶剂为DMF，缩合剂为HBTU/HOBt。单管管式反应器循环液温度设置为25~40℃，根据不同保护氨基酸活化的液体流速控制在10mL/min~40mL/min。
Fmoc脱除条件：每次30mL1%DBU/2%1-辛硫醇的DMF溶液，流速控制在30mL/min，脱Fmoc后用DMF洗涤树脂，流速控制在30mmL/min。
步骤3：Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Boc)2-Gly-Arg(Boc)2-Gly-HMPA-PEG-AM-PS树脂4，（简称：Boc-利拉鲁肽-HMPA-PEG-AM-PS树脂4）
参照步骤2的数据及操作方法。将25.7g(70.2mmol)HBTU、9.5g(70.2mmol)HOBt溶于120mLDMF，DIEA23.1mL（140.1mmol）和88.2g(70.2mmol)Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-OH片段1溶于240mLDMF，将2种溶液分别以50mL/min和100mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为70℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应，至偶联结束。Fmoc脱除条件参照步骤2。
将Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH(MW=701.66mmol)偶联到多肽树脂上，操作步骤为：将27.5g(70.2mmol)HBTU、9.5g(70.2mmol)HOBt溶于120mLDMF，Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH46g(70.2mmol)和DIEA23.1mL（140.1mmol）溶于240mLDMF，将2种溶液分别以50mL/min和100mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线5米，循环液温度设置为50℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应偶联结束，经洗涤和真空干燥后得到多肽树脂264g。
步骤4：Boc-利拉鲁肽-HMPA-PEG-AM-PS树脂4用多肽常规制备方法切割，粗品经过纯化、脱盐、冻干后得到利拉鲁肽成品。
（1）切割液的配置按照实施例1中的步骤进行。
（2）Boc-利拉鲁肽-HMPA-PEG-AM-PS树脂4切割
当多肽片段里的Arg的胍基全部采用Boc保护时采用B切割液，具体操作为：试剂储液瓶中1500mLB切割溶液经由循环液导管和进料管路泵入抽干的多肽反应柱，循环1小时，从废液导液管进入收集瓶，40℃温度下减压蒸馏除去约1200mL切割液，往浓缩液中加入3000mL甲基叔丁基醚，析出多肽沉淀。多肽通过离心与切割液和甲基叔丁基醚分离。得到的多肽粗品再用3000mL甲基叔丁基醚打浆一次，通过离心将利拉鲁肽粗品与残留切割液分离，重复打浆和离心2次，残留切割液基本上被除干净。利拉鲁肽粗品室温真空干燥后得到类白色固体86.5g，纯度86.36%，粗品总收率：70.2%。
粗品的纯化按照实施例1的步骤6进行。
制备出来的利拉鲁肽粗品HPLC谱图，质谱谱图，纯品HPLC谱图与实施例1类似。
实施例5
步骤1：Fmoc-Gly-HMPB-AM-PS树脂合成
称取HMPB-AM-PS树脂10g（取代度=0.56mmol/g）加入到固相反应柱器中，树脂用100mL二氯甲烷溶胀5分钟，再依次加入1.7gFmoc-Gly-OH，1.8mLDIEA，搅拌3小时。抽干溶剂，60mL1:1的醋酸酐：吡啶进行树脂封闭反应溶液，搅拌半小时封闭未反应完全羟甲基。抽干溶剂，每次用80mL二氯甲烷洗涤3次。真空干燥后测得Fmoc-Gly-HMPB-AM-PS树脂取代度为0.35mmol/g。
步骤2：H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Boc)2-Gly-Arg(Boc)2-Gly-HMPB-AM-PS树脂3合成
将步骤1中合成的Fmoc-Gly-HMPB-AM-PS树脂用于利拉鲁肽树脂合成。称取10g取代度为0.35mmol/g的Fmoc-Gly-HMPB-AM-PS树脂装进多肽合成柱，将树脂恰好填满柱子，然后拧紧盖子。
将60mLDMF以30mL/min的速度经由循环液导管2和进料管路4泵入多肽合成柱，循环10分钟使树脂溶胀，切换试剂瓶，把30mL10%哌啶/DMF以30mL/min经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，循环8分钟，在线监测器显示Fmoc被脱除完全。切换试剂瓶把DMF以30mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，从废液导液管进入废液收集瓶，直到在线监测器显示哌啶被冲洗干净。
4.84g(8mmol)Fmoc-Arg(Boc)2-OH溶于20mLDMF，3.4g(8mmol)COMU和0.88mL(8mmol)NMM溶解于20mLDMF，将2种溶液分别以30mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为60℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应。偶联结束，切换试剂瓶把DMF以30mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，从废液导液管进入废液收集瓶，直到在线监测器显示Fmoc-Arg(Boc)2-OH被冲洗干净。
余下保护氨基酸及多肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH和Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OH按照氨基酸序列依次偶联，保护氨基酸、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂（HMPB-AM-PS树脂）的摩尔比为2：2：6：1，多肽片段、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂（HMPB-AM-PS树脂）的摩尔比为2：2：6：1，因保护氨基酸不同，多肽合成溶剂与多肽合成树脂（HMPB-AM-PS树脂）的质量比为10~20：1；有机碱为NMM，多肽合成溶剂为DMF，缩合剂为HBTU/HOBt。单管管式反应器循环液温度设置为25~40℃，根据不同保护氨基酸活化的液体流速控制在10mL/min~40mL/min。
Fmoc脱除条件：每次30mL7%哌啶/DMF溶液，流速控制在30mL/min，脱Fmoc后用DMF洗涤树脂，流速控制在40mmL/min。
步骤3：Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Boc)2-Gly-Arg(Boc)2-Gly-HMPB-AM-PS树脂4，（简称：Boc-利拉鲁肽-HMPB-AM-PS树脂4）
参照步骤2的数据及操作方法。将3.1g(8mmol)HATU，1.1g(8mmol)HOBt溶于20mLDMF，DIEA2.64mL（16.1mmol）和10.1g(8mmol)Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-OH片段1溶于40mLDMF，将2种溶液分别以20mL/min和40mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为70℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，循环泵入至偶联结束。Fmoc用30mL5%哌啶/DMF溶液脱除，流速控制在40mL/min，脱Fmoc后用DMF洗涤树脂的流速控制在40mmL/min。
将Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH(MW=843.86mmol)偶联到多肽树脂上，操作步骤为：将3.08g(8mmol)HBTU，1.1g(8mmol)HOBt溶于20mLDMF，Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH6.7g(8mmol)和2.64mL（16.1mmol）溶于40mLDMF，将2种溶液分别以20mL/min和40mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为70℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，循环泵入至偶联结束，经洗涤和真空干燥后得到多肽树脂37.4g。
步骤4：Boc-利拉鲁肽-HMPB-AM-PS树脂用多肽常规制备方法切割，粗品经过纯化、脱盐、冻干后得到利拉鲁肽成品。
（1）切割液的配置实施例1中的步骤进行。
（2）Boc-利拉鲁肽-HMPB-AM-PS树脂4切割：
当多肽片段里的Arg的胍基全部采用Boc保护时采用B切割液，具体操作为：试剂储液瓶中200mLB切割溶液经由循环液导管和进料管路泵入抽干含37g多肽树脂的多肽反应柱，循环20分钟，切割液从废液导液管进入收集瓶，切割液继续搅拌2小时40℃温度下减压蒸馏除去约170mL切割液，往浓缩液中加入300mL甲基叔丁基醚，析出多肽沉淀。多肽通过离心与切割液和甲基叔丁基醚分离。得到的多肽粗品再用300mL甲基叔丁基醚打浆一次，通过离心将利拉鲁肽粗品与残留切割液分离，重复打浆和离心2次，残留切割液基本上被除干净。利拉鲁肽粗品室温真空干燥后得到类白色固体12.2g，纯度41.26%，粗品收率：87.2%。
（3）粗品的纯化按照实施例1的步骤6进行。得到纯品3.4g，HPLC99.2%.
实施例6
步骤1：H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Boc)2-Gly-Arg(Boc)2-Gly-Wang树脂3合成
称取10g取代度为0.39mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂装进多肽合成柱，将树脂恰好填满柱子，然后拧紧盖子。将60mLDMF以30mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，循环10分钟使树脂溶胀，切换试剂瓶，把30mL10%哌啶/DMF以30mL/min经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，循环8分钟，在线监测器显示Fmoc被脱除完全。切换试剂瓶把DMF以30mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，从废液导液管进入废液收集瓶，直到在线监测器显示哌啶被冲洗干净。
5.7g(8.8mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH和1.3g(8.8mmol)HOBt溶于20mLDMF，3.3g(8.8mmol)HATU和1.5mL(8.8mmol)DIEA溶解于20mLDMF，将2种溶液分别以30mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为60℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，反应液流回试剂储液瓶，再被泵入循环液导管和进料管路进入多肽反应柱循环反应。偶联结束，切换试剂瓶把DMF以30mL/min的速度经由循环液导管和进料管路泵入多肽合成柱，从废液导液管进入废液收集瓶，直到在线监测器显示Fmoc-Arg(Pbf)-OH被冲洗干净。
余下保护氨基酸及多肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH和Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OH按照氨基酸序列依次偶联，保护氨基酸、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂（Fmoc-Gly-Wang树脂）的摩尔比为2.2：2.2：6：1，多肽片段、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂（Fmoc-Gly-Wang树脂）的摩尔比为2.2：2.2：6：1，因保护氨基酸不同多肽合成溶剂与多肽合成树脂（Fmoc-Gly-Wang树脂）的质量比为10~20：1，多肽合成溶剂为DMF，有机碱为DIEA，缩合剂为COMU。单管管式反应器循环液温度设置为30~40℃，根据不同保护氨基酸活化的液体流速控制在20mL/min~60mL/min。
Fmoc脱除条件：每次40mL7%哌啶/DMF溶液，流速控制在50mL/min，脱Fmoc后用DMF洗涤树脂，流速控制在50mmL/min。
步骤2：Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Boc)2-Gly-Arg(Boc)2-Gly-Wang树脂4，（简称：Boc-利拉鲁肽-Wang树脂4）
参照步骤1的数据及操作方法。将3.4g(8.8mmol)HATU，1.2g(8.8mmol)HOBt溶于20mLDMF，DIEA2.9mL（17.6mmol）和11.1g(8.8mmol)Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-OH片段1溶于40mLDMF，将2种溶液分别以20mL/min和40mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线6米，循环液温度设置为70℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，循环泵入至偶联结束。
Fmoc用7%哌啶/DMF溶液脱除，流速控制在40mL/min，脱Fmoc后用DMF洗涤树脂的流速控制在60mmL/min。
将Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH(MW=843.86mmol)偶联到多肽树脂上，操作步骤为：将3.4g(8.8mmol)HBTU，1.2g(8.8mmol)HOBt溶于20mLDMF，Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH7.4g(8.8mmol)和2.9mL（17.6mmol）溶于40mLDMF，将2种溶液分别以20mL/min和40mL/min的速度经过进料管路和进料管路泵入混合器，流经单管管式反应器活化（反应器不锈钢管线10米，循环液温度设置为70℃），进入多肽合成柱进行偶联反应，循环泵入至偶联结束，经洗涤和真空干燥后得到多肽树脂41.4g。
步骤3：Boc-利拉鲁肽-Wang树脂用多肽常规制备方法切割，粗品经过纯化、脱盐、冻干后得到利拉鲁肽成品。
（1）切割液的配置实施例1中的步骤进行。
（2）Boc-利拉鲁肽-Wang树脂4切割：
采用A切割液，具体操作为：试剂储液瓶中200mLA切割溶液经由循环液导管2和进料管路泵入抽干含41g多肽树脂的多肽反应柱，循环20分钟，切割液从废液导液管进入收集瓶，切割液继续搅拌2小时40℃温度下减压蒸馏除去约170mL切割液，往浓缩液中加入300mL甲基叔丁基醚，析出多肽沉淀。多肽通过离心与切割液和甲基叔丁基醚分离。得到的多肽粗品再用300mL甲基叔丁基醚打浆一次，通过离心将利拉鲁肽粗品与残留切割液分离，重复打浆和离心2次，残留切割液基本上被除干净。利拉鲁肽粗品室温真空干燥后得到类白色固体13.4g，纯度38.6%，粗品收率：86.4%。
（3）粗品的纯化按照实施例1的步骤6进行。得到纯品3.56g，HPLC99.13%。
制备出来的利拉鲁肽粗品HPLC谱图，质谱，利拉鲁肽纯品HPLC谱图和实施例1类似。
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种结合连续流固相合成系统制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，制备步骤如下：
步骤1：将带有多肽合成连接子的多肽合成树脂与Fmoc-Gly-OH进行反应，制得Fmoc-Gly-树脂；
步骤2：将Fmoc-Gly-树脂通过连续流固相多肽合成工艺缩合反应连接保护氨基酸和多肽片段Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-H、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Arg(y)-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OH；其中，y为Pbf或双Boc；得到H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-树脂；
步骤3：将步骤2制备得到的多肽树脂通过连续流固相多肽合成工艺缩合反应连接多肽片段Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-OH、Boc-His(x)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH；其中，x为Boc或Trt；得到Boc-His(x)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palm-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂；
步骤4：将步骤3制备得到的多肽树脂经过切割得到利拉鲁肽粗品，利拉鲁肽粗品经过纯化、脱盐、冻干后得到利拉鲁肽成品。
2.根据权利要求1所述的一种结合连续流固相合成系统制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤1中多肽合成树脂为经过聚乙二醇修饰后的树脂、聚乙二醇基质树脂或Wang树脂；经过聚乙二醇修饰后的树脂具有如化学式1~13所示的结构：
其中，Re为聚苯乙烯树脂、聚丙烯酰胺树脂或聚甲基丙烯酸酯树脂，R为氢、甲基、乙基、异丙基或苄基；n为1~3的整数；m为 4~80的整数；q为1~3的整数；
M具有如化学式14~22所示的结构：
其中，n1为1-8的整数，s为1-2的整数，m1为0-10的整数，r为1-3的整数，t为1-7的整数，g为0-2的整数。
3.根据权利要求2所述的一种结合连续流固相合成系统制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，聚乙二醇基质树脂具有如化学式23-26所示的结构：
其中，n为200~700的整数。
4.根据权利要求2或3所述的一种结合连续流固相合成系统制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，Linker具有如化学式27~31所示的结构：
其中c为1-12的整数。
5.根据权利要求1所述的一种结合连续流固相合成系统制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，
Fmoc脱除溶液为质量浓度5%~20%的哌啶溶液、质量浓度1%~5%的1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯与质量浓度1%~5%的1-辛硫醇的混合溶液、质量浓度1~5%的1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯与质量浓度2~15%的哌啶的混合溶液中任意一种；
Fmoc脱除溶液中溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、二甲基四氢呋喃、1，4二氧六环、乙腈中任意一种或几种；
多肽合成溶剂为二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、2-甲基四氢呋喃、1，4二氧六环、乙腈、N-甲基吡咯烷酮中任意一种或几种；
缩合剂为DIC/HOBt、DIC/Oxyma、HATU/HOAt、HBTU/HOBt、TBTU、COMU、HATU/HOBt中任意一种；
有机碱选用三乙胺、N-甲基吗啡啉、N，N-二异丙基乙胺、2，4，6-三甲基吡啶中任意一种或几种。
6.根据权利要求1所述的一种结合连续流固相合成系统制备利拉鲁肽的方法，其特征在于：保护氨基酸、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂的摩尔比为1.5~3：1.5~3：3~8：1，多肽片段、缩合试剂、有机碱、多肽合成树脂的摩尔比为1.5~3：1.5~3：3~8：1，多肽合成溶剂与多肽合成树脂的质量比为5~20：1；Fmoc脱除溶液与多肽合成树脂的质量比为5~20：1。
7.根据权利要求1所述的一种结合连续流固相合成系统制备利拉鲁肽的方法，其特征在于：步骤2中连续流固相多肽合成工艺的反应温度为5~40℃；步骤3中连续流固相多肽合成工艺的反应温度为5~40℃。
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