CN115181174A - 一种Tirzepatide的制备方法 - Google Patents

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CN115181174A CN202110359422.8A CN202110359422A CN115181174A CN 115181174 A CN115181174 A CN 115181174A CN 202110359422 A CN202110359422 A CN 202110359422A CN 115181174 A CN115181174 A CN 115181174A
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Abstract

本发明涉及多肽药物制备领域，公开了一种Tirzepatide的制备方法，主要包括以下步骤，用固相多肽合成法制备Tirzepatide肽树脂，Tirzepatide肽树脂经裂解得到Tirzepatide；其中接入Phe‑Val‑Gln‑Trp‑Leu的方法为：采用含Phe‑Val‑Gln‑Trp‑Leu的5～7肽片段。本发明选择含Phe‑Val‑Gln‑Trp‑Leu的5～7肽片段进行固相偶联，可以减少缺失肽以及相关消旋杂质的产生，减小纯化难度，提高收率。

Description

一种Tirzepatide的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽药物制备领域，具体涉及一种Tirzepatide的制备方法。
背景技术
Tirzepatide(替尔泊肽)具有葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽(GIP)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)双受体激动的作用，是礼来制药的重磅在研产品，目前正在进行临床三期研究，预计2022年将获批上市。被认为是最有可能给索玛鲁肽带来市场挑战的GLP-1类似物降糖药物。其肽序如下：H-Tyr1-Aib2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Ile12-Aib13-Leu14-Asp15-Lys16-Ile17-Ala18-Gln19-Lys20(AEEA-AEEA-γ-Glu-Eicosanedioic acid)-Ala21-Phe22-Val23-Gln24-Trp25-Leu26-Ile27-Ala28-Gly29-Gly30-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38-Ser39-NH2。
Tirzepatide的制备方法已有报道，CN107207576A公开了一种固相制备Tirzepatide的方法，固相逐步合成39个氨基酸的直链肽，选择性脱除Lys20侧链保护基Alloc，固相偶联侧链修饰基团，裂解得多肽产物，该方法步骤多，周期长，杂质多，纯化难。CN110903355A公开了一种固相制备Tirzepatide的方法，同样采用逐步偶联的方法，其中Lys20侧链的接入选择Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mono-tBu))-OH，1-4位氨基酸的接入选择4肽片段Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(tBu)-Gly-OH，裂解得多肽产物，该法虽然选择了部分片段偶联的方式，但仍不可避免相关缺失肽和消旋肽杂质的生成。WO2020159949公开了一种固液相结合制备Tirzepatide的方法，先固相合成不同长度的片段，再通过液相缩合片段得到全保护肽，最后裂解得到多肽产物，该方法可以解决相关缺失肽杂质带来的纯化困难等部分问题，但液相反应不易控制，中间体不易纯化，不利于工业大规模生产。因此，提供一种Tirzepatide的制备方法具有重要的现实意义。
发明内容
针对现有技术存在的杂质多、纯化难、收率低的问题，本发明提供了一种Tirzepatide的制备方法，包括以下内容：用固相多肽合成法制备Tirzepatide肽树脂，Tirzepatide肽树脂经裂解得到Tirzepatide；其中接入Phe-Val-Gln-Trp-Leu的方法为：采用含Phe-Val-Gln-Trp-Leu的5～7肽片段。
作为优选，含Phe-Val-Gln-Trp-Leu的5～7肽片段选自：
Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala；
Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile；
Lys-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu。
作为优选，Phe-Val-Gln-Trp-Leu的5～7肽片段选自：
Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile；
Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu。
作为优选，Phe-Val-Gln-Trp-Leu的5～7肽片段为：Phe-Val-Gln-Trp-Leu。
上述制备方法中，接入20位赖氨酸采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH或Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosaned(mon-tBu)]-OH。赖氨酸采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH时，Tirzepatide主链肽树脂选择性脱除Alloc保护基后，经侧链修饰得到Tirzepatide肽树脂，裂解后得到Tirzepatide；赖氨酸采用Lys[AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosaned(mon-tBu)]-OH时，可直接合成得到Tirzepatide肽树脂，裂解后得到Tirzepatide。
作为优选，在制备Tirzepatide过程中，采用二肽片段或其组合；其中，二肽片段选自Thr-Phe、Leu-Asp、Gly-Gly、Ser-Ser。若采用逐步偶联的方式偶联肽序主链中各个氨基酸或氨基酸衍生物时，肽序中的Thr-Phe、Leu-Asp、Gly-Gly、Ser-Ser以单个氨基酸的形式逐步偶联难度较大，容易形成缺失肽或插入肽，进而影响Tirzepatide的收率。若以Thr-Phe、Leu-Asp、Gly-Gly、Ser-Ser二肽片段或其组合的形式偶联，可以有效减少缺失肽或插入肽的形成，进一步提高Tirzepatide的收率。
更为优选，在制备Tirzepatide过程中，采用含Phe-Val-Gln-Trp-Leu的5～7肽片段和二肽片段的组合，所述组合为：
Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala和Gly-Gly；
Lys-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu和Thr-Phe、Ser-Ser；
Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile和Leu-Asp；
Phe-Val-Gln-Trp-Leu和Leu-Asp、Gly-Gly；
采用片段偶联的固相合成法合成Tirzepatide时，只有合适的片段才可以抑制或减少缺失肽、错配肽、消旋肽等杂质的产生。本申请人在实验过程中发现，逐步偶联制备Tirzepatide时，由于Tirzepatide序列中有较多的疏水氨基酸，这些氨基酸在逐步偶联时产生较大的位阻，从而导致后续氨基酸偶联困难，尤其是Phe22、Val23、Trp25和Leu26这四个氨基酸，偶联更加困难，易产生相关缺失肽杂质，其中，苯丙氨酸残基由于自身结构的原因，还容易发生消旋，形成D-Phe22消旋副产物。这些杂质与产品性质相近，其含量的增加会影响纯化难度和收率。采取Phe-Val-Gln-Trp-Leu的5～7肽片段不仅可以减少单个或多个氨基酸残基缺失肽的产生，也可以减少D-Phe22消旋副产物的产生，从而减小纯化难度，提高收率。此外，采用Thr-Phe、Leu-Asp、Gly-Gly、Ser-Ser二肽片段或其组合也可以减少相关缺失肽或插入肽杂质的产生，利于纯化。
本发明提供了一种Tirzepatide的制备方法，选择含Phe-Val-Gln-Trp-Leu的5～7肽片段进行固相偶联，可以减少缺失肽以及相关消旋杂质的产生，减小纯化难度，提高收率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明。实施例不应限定为对保护范围的限制。
本发明涉及的英文缩写对应的中文名称如表1所示：
表1本发明涉及的英文缩写对应的中文名称
Figure BDA0003004885430000031
根据下述实施例，对本发明技术方案进行进一步详细描述。
实施例1 Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-OH的制备
(1)Fmoc-Ala-2-CTC树脂的制备
称取2-CTC树脂90.91g(替代度为1.1mmol/g，规模100mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。加入Fmoc-Ala-OH(62.23g，200mmol)，DIEA(51.70g，400mmol)，1.5L的DMF，反应6h。抽干，加入甲醇(9.61g，300mmol)，DIEA(12.93g，100mmol)和1.5LDMF反应1h，抽干，DMF和DCM分别洗涤3次，取出Fmoc-Ala-2-CTC树脂，干燥，测得Fmoc-Ala-2-CTC树脂的替代度为0.66mmol/g，重量为75.77g。
(2)Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-OH的制备
称取步骤(1)所得的Fmoc-Ala-2-CTC树脂60.61g(0.66mmol/g,40mmol)，加入到固相反应器中，DMF溶胀洗涤，20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次，K检树脂阳性。称取Fmoc-Ile-OH(28.27g，80mmol)和HOBt(12.97g，96mmol)溶于150mL DMF，冰浴下加入DIC(15.15g，120mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，K检树脂阴性，抽干，DMF洗涤4次。采取同样步骤继续偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH，反应完后，DMF和DCM分别洗涤3次，干燥得Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-2-CTC树脂。将树脂加入到1L 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-OH 51.34g。
实施例2 Fmoc-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH的制备
(1)Fmoc-Ile-2-CTC树脂的制备
称取2-CTC树脂181.82g(替代度为1.1mmol/g，规模200mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。加入Fmoc-Ile-OH(141.36g，400mmol)，DIEA(103.39g，800mmol)，3.0L的DMF，反应6h。抽干，加入甲醇(19.2g，600mmol)，DIEA(25.85g，200mmol)和3.0LDMF反应1h，抽干，DMF和DCM分别洗涤3次，取出Fmoc-Ile-2-CTC树脂，干燥，测得Fmoc-Ile-2-CTC树脂的替代度为0.67mmol/g，重量为151.33g。
(2)Fmoc-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH的制备
称取步骤(1)所得的Fmoc-Ile-2-CTC树脂59.70g(0.67mmol/g,40mmol)，加入到固相反应器中，DMF溶胀洗涤，20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次，K检树脂阳性。称取Fmoc-Leu-OH(28.27g，80mmol)和HOBt(12.97g，96mmol)溶于150mL DMF，冰浴下加入DIC(15.15g，120mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，K检树脂阴性，抽干，DMF洗涤4次。采取同样步骤继续偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH，反应完后，DMF和DCM分别洗涤3次，干燥得Fmoc-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-2-CTC树脂。将树脂加入到1L 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得Fmoc-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH 51.29g。
实施例3 Fmoc-Lys(Alloc)-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-OH的制备
(1)Fmoc-Leu-2-CTC树脂的制备
称取2-CTC树脂272.73g(替代度为1.1mmol/g，规模300mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。加入Fmoc-Leu-OH(141.36g，400mmol)，DIEA(103.39g，800mmol)，3.0L的DMF，反应6h。抽干，加入甲醇(19.2g，600mmol)，DIEA(38.8g，300mmol)和3.0L的DMF反应1h，抽干，DMF和DCM分别洗涤3次，取出Fmoc-Leu-2-CTC树脂，干燥，测得Fmoc-Leu-2-CTC树脂的替代度为0.67mmol/g，重量为151.33g。
(2)Fmoc-Lys(Alloc)-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-OH的制备
称取步骤(1)所得的Fmoc-Leu-2-CTC树脂59.70g(0.67mmol/g,40mmol)，加入到固相反应器中，DMF溶胀洗涤，20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次，K检树脂阳性。称取Fmoc-Trp(Boc)-OH(42.13g，80mmol)和HOBt(12.97g，96mmol)溶于150mL DMF，冰浴下加入DIC(15.15g，120mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，K检树脂阴性，抽干，DMF洗涤4次。采取同样步骤继续偶联Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH，反应完后，DMF和DCM分别洗涤3次，干燥得Fmoc-Lys(Alloc)-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-2-CTC树脂。将树脂加入到1L 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得Fmoc-Lys(Alloc)-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-OH 56.52g。
实施例4 Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH的制备
(1)Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH的制备
称取实施例2步骤(1)所得的Fmoc-Ile-2-CTC树脂59.70g(0.67mmol/g,40mmol)，加入到固相反应器中，DMF溶胀洗涤，20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次，K检树脂阳性。称取Fmoc-Leu-OH(28.27g，80mmol)和HOBt(12.97g，96mmol)溶于150mL DMF，冰浴下加入DIC(15.15g，120mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，K检树脂阴性，抽干，DMF洗涤4次。采取同样步骤继续偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH，反应完后，DMF和DCM分别洗涤3次，干燥得Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-2-CTC树脂。将树脂加入到1L20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH 49.89g。
实施例5 Fmoc-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-OH的制备
称取实施例3步骤(1)Fmoc-Leu-2-CTC树脂59.70g(0.67mmol/g,40mmol)，加入到固相反应器中，DMF溶胀洗涤，20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次，K检树脂阳性。称取Fmoc-Trp(Boc)-OH(42.13g，80mmol)和HOBt(12.97g，96mmol)溶于150mL DMF，冰浴下加入DIC(15.15g，120mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，K检树脂阴性，抽干，DMF洗涤4次。采取同样步骤继续偶联Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH，反应完后，DMF和DCM分别洗涤3次，干燥得Fmoc-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-2-CTC树脂。将树脂加入到1L 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得Fmoc-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-OH 49.33g。
实施例6 Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-OH的制备
称取实施例3步骤(1)Fmoc-Leu-2-CTC树脂59.70g(0.67mmol/g,40mmol)，加入到固相反应器中，DMF溶胀洗涤，20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次，K检树脂阳性。称取Fmoc-Trp(Boc)-OH(42.13g，80mmol)和HOBt(12.97g，96mmol)溶于150mL DMF，冰浴下加入DIC(15.15g，120mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，K检树脂阴性，抽干，DMF洗涤4次。采取同样步骤继续偶联Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH，反应完后，DMF和DCM分别洗涤3次，干燥得Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-2-CTC树脂。将树脂加入到1L 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-OH46.73g。
实施例7 Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH的制备
(1)Fmoc-Phe-2-CTC树脂的制备
称取2-CTC树脂90.91g(替代度为1.1mmol/g，规模100mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。加入Fmoc-Phe-OH(77.49g，200mmol)，DIEA(51.70g，400mmol)，1.5L的DMF，反应6h。抽干，加入甲醇(9.61g，300mmol)，DIEA(12.93g，100mmol)和1.5L的DMF反应1h，抽干，DMF和DCM分别洗涤3次，取出Fmoc-Phe-2-CTC树脂，干燥，测得Fmoc-Phe-2-CTC树脂的替代度为0.67mmol/g，重量为77.63g。
(2)Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH的制备
称取步骤(1)所得Fmoc-Phe-2-CTC树脂59.70g(0.67mmol/g,40mmol)，加入到固相反应器中，DMF溶胀洗涤，20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次，K检树脂阳性。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH(31.80g，80mmol)和HOBt(12.97g，96mmol)溶于150mL DMF，冰浴下加入DIC(15.15g，120mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，K检树脂阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤3次，干燥得Fmoc-Thr(tBu)-Phe-2-CTC树脂。将树脂加入到1L 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH 19.84g。
实施例8 Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-OH的制备
(1)Fmoc-Asp(OtBu)-2-CTC树脂的制备
称取2-CTC树脂90.91g(替代度为1.1mmol/g，规模100mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH(82.29g，200mmol)，DIEA(51.70g，400mmol)，1.5L的DMF，反应6h。抽干，加入甲醇(9.61g，300mmol)，DIEA(12.93g，100mmol)和1.5L的DMF反应1h，抽干，DMF和DCM分别洗涤3次，取出Fmoc-Asp(OtBu)-2-CTC树脂，干燥，测得Fmoc-Asp(OtBu)-2-CTC树脂的替代度为0.65mmol/g，重量为79.41g。
(2)Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-OH的制备
称取步骤(1)所得Fmoc-Asp(OtBu)-2-CTC树脂61.54g(0.65mmol/g,40mmol)，加入到固相反应器中，DMF溶胀洗涤，20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次，K检树脂阳性。称取Fmoc-Leu-OH(28.27g，80mmol)和HOBt(12.97g，96mmol)溶于150mL DMF，冰浴下加入DIC(15.15g，120mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，K检树脂阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤3次，干燥得Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-2-CTC树脂。将树脂加入到1L 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-OH 19.84g。
实施例9 Fmoc-Gly-Gly-OH的制备
(1)Fmoc-Gly-2-CTC树脂的制备
称取2-CTC树脂90.91g(替代度为1.1mmol/g，规模100mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。加入Fmoc-Gly-OH(59.46g，200mmol)，DIEA(51.70g，400mmol)，1.5L的DMF，反应6h。抽干，加入甲醇(9.61g，300mmol)，DIEA(12.93g，100mmol)和1.5L的DMF反应1h，抽干，DMF和DCM分别洗涤3次，取出Fmoc-Gly-2-CTC树脂，干燥，测得Fmoc-Gly-2-CTC树脂的替代度为0.66mmol/g，重量为77.45g。
(2)Fmoc-Gly-Gly-OH的制备
称取步骤(1)所得Fmoc-Gly-2-CTC树脂60.61g(0.66mmol/g,40mmol)，加入到固相反应器中，DMF溶胀洗涤，20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次，K检树脂阳性。称取Fmoc-Gly-OH(23.78g，80mmol)和HOBt(12.97g，96mmol)溶于150mL DMF，冰浴下加入DIC(15.15g，120mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，K检树脂阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤3次，干燥得Fmoc-Gly-Gly-2-CTC树脂。将树脂加入到1L 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得Fmoc-Gly-Gly-OH 12.97g。
实施例10 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH的制备
(1)Fmoc-Ser(tBu)-2-CTC树脂的制备
称取2-CTC树脂90.91g(替代度为1.1mmol/g，规模100mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。加入Fmoc-Ser(tBu)-OH(76.69g，200mmol)，DIEA(51.70g，400mmol)，1.5L的DMF，反应6h。抽干，加入甲醇(9.61g，300mmol)，DIEA(12.93g，100mmol)和1.5L的DMF反应1h，抽干，DMF和DCM分别洗涤3次，取出Fmoc-Ser(tBu)-2-CTC树脂，干燥，测得Fmoc-Ser(tBu)-2-CTC树脂的替代度为0.66mmol/g，重量为76.45g。
(2)Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH的制备
称取步骤(1)所得Fmoc-Ser(tBu)-2-CTC树脂60.61g(0.66mmol/g,40mmol)，加入到固相反应器中，DMF溶胀洗涤，20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次，K检树脂阳性。称取Fmoc-Ser(tBu)-OH(30.68g，80mmol)和HOBt(12.97g，96mmol)溶于150mL DMF，冰浴下加入DIC(15.15g，120mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，K检树脂阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤3次，干燥得Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-2-CTC树脂。将树脂加入到1L 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH 19.01g。
实施例11 Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosaned(mon-tBu)]-OH的制备
(1)Fmoc-AEEA-2-CTC树脂的制备
称取2-CTC树脂90.91g(替代度为1.1mmol/g，规模100mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。加入Fmoc-AEEA-OH(77.08g，200mmol)，DIEA(51.70g，400mmol)，540mL的DMF，反应6h。抽干，加入甲醇(48.06g，1500mmol)，DIEA(12.92g，100mmol)和540ml的DMF，反应1h，抽干，DMF和DCM分别洗涤3次，取出Fmoc-AEEA-2-CTC树脂，干燥，测得其替代度为0.69mmol/g，质量为78.98g。
(2)AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosaned(mon-tBu)的制备
称取步骤(1)的Fmoc-AEEA-2-CTC树脂59.70g(0.67mmol/g,40mmol)，加入到固相反应器中，DMF溶胀洗涤，20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-AEEA-OH(30.83g，80mmol)和HOBt(12.97g，96mmol)溶于360mL DMF，冰浴下加入DIC(15.15g，120mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，抽干，DMF洗涤6次。采取同样步骤继续偶联Fmoc-γGlu(α-OtBu)-OH和二十烷二酸单叔丁基酯，反应完后，DMF和DCM分别洗涤3次，干燥得Eicosaned(mon-tBu)-γGlu(α-OtBu)-AEEA-AEEA-2-CTC树脂。将树脂加入到1500mL 20％TFE/DCM(v/v)中，反应2h。过滤，滤液旋干，真空干燥得AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosaned(mon-tBu)32.48g。
(3)Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosaned(mon-tBu)]-OH的制备
称取步骤(2)所得AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosaned(mon-tBu)(32.48g，40mmol)和PFP-OH(7.74g，42mmol)，加入100mL二氯甲烷，冷却至0℃，搅拌下分六批次加入EDCI(11.5g,60mmol)，继续反应15min，然后升温至25℃反应2h，TLC和HPLC监控原料反应完全。停止反应，反应液分别用100mL水，100mL饱和碳酸氢钠溶液，100mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得油状粘稠物。称取Fmoc-Lys-OH(14.73g，40mmol)溶于100mL10％的碳酸钠水溶液，加入100mL四氢呋喃，搅拌下于5℃，用恒压滴液漏斗缓慢滴加上述油状粘稠物的200mL四氢呋喃溶液，滴加完毕升温至25℃继续反应3h，TLC和HPLC监控原料反应完全。停止反应，用1M盐酸溶液调pH＝3-4，旋干四氢呋喃，水相DCM萃取，有机相干燥浓缩得Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosaned(mon-tBu)]-OH粗品，纯化得纯品28g，收率59％，纯度99.2％。
实施例12 Tirzepatide粗肽的制备1
称取Rink Amide AM树脂12.5g(替代度为0.40mmol/g，5mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。称取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.83g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于60mL DMF，冰浴下加入DIC(1.89g，15mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干，DMF洗涤3次。20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
重复上述步骤，按Tirzepatide肽序依次偶联剩余氨基酸或氨基酸片段，其中氨基酸片段为实施例1制得的Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-OH、实施例11制得的Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu)]-OH，得到Tirzepatide肽树脂39.42g。
将所得Tirzepatide肽树脂加入到390mL冷冻裂解试剂92.5％TFA/2.5％TIS/2.5％H2O/2.5％Mpa(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2L异丙醚，析出白色沉淀，沉淀用异丙醚洗涤3次，干燥所得白色固体即为Tirzepatide粗肽12.02g，纯度为73.4％。
实施例13 Tirzepatide粗肽的制备2
称取Rink Amide AM树脂12.5g(替代度为0.40mmol/g，5mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。称取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.83g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于60mL DMF，冰浴下加入DIC(1.89g，15mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干，DMF洗涤3次。20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
重复上述步骤，按Tirzepatide肽序依次偶联剩余氨基酸或氨基酸片段，其中氨基酸片段为实施例2制得的Fmoc-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH、实施例11制得的Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu)]-OH，得到Tirzepatide肽树脂38.85g。
将所得Tirzepatide肽树脂加入到390mL冷冻裂解试剂92.5％TFA/2.5％TIS/2.5％H2O/2.5％Mpa(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2L异丙醚，析出白色沉淀，沉淀用异丙醚洗涤3次，干燥所得白色固体即为Tirzepatide粗肽12.03g，纯度为74.3％。
实施例14 Tirzepatide粗肽的制备3
称取Rink Amide MBHA树脂12.5g(替代度为0.40mmol/g，5mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。称取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.83g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于60mL DMF，冰浴下加入DIC(1.89g，15mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干，DMF洗涤3次。20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
重复上述步骤，按Tirzepatide主链肽序依次偶联剩余氨基酸或氨基酸片段，其中氨基酸片段为实施例3制得的Fmoc-Lys(Alloc)-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-OH，Pd(PPh3)4/DMF脱Alloc后偶联实施例11步骤(2)制得的AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu)，得到Tirzepatide肽树脂38.41g。
将所得Tirzepatide肽树脂加入到390mL冷冻裂解试剂92.5％TFA/2.5％TIS/2.5％H2O/2.5％Mpa(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2L异丙醚，析出白色沉淀，沉淀用异丙醚洗涤3次，干燥所得白色固体即为Tirzepatide粗肽11.92g，纯度为73.8％。
实施例15 Tirzepatide粗肽的制备4
称取Sieber树脂12.5g(替代度为0.40mmol/g，5mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。称取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.83g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于60mL DMF，冰浴下加入DIC(1.89g，15mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干，DMF洗涤3次。20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
重复上述步骤，按Tirzepatide肽序依次偶联剩余氨基酸或氨基酸片段，其中氨基酸片段为实施例4制得的Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH、实施例11制得的Lys[AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu)]-OH，得到Tirzepatide肽树脂38.89g。
将所得Tirzepatide肽树脂加入到390mL冷冻裂解试剂92.5％TFA/2.5％TIS/2.5％H2O/2.5％Mpa(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2L异丙醚，析出白色沉淀，沉淀用异丙醚洗涤3次，干燥所得白色固体即为Tirzepatide粗肽11.97g，纯度为73.6％。
实施例16 Tirzepatide粗肽的制备5
称取Rink Amide AM树脂12.5g(替代度为0.40mmol/g，5mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。称取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.83g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于60mL DMF，冰浴下加入DIC(1.89g，15mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干，DMF洗涤3次。20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
重复上述步骤，按Tirzepatide肽序依次偶联剩余氨基酸或氨基酸片段，其中氨基酸片段为实施例5制得的Fmoc-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-OH、实施例11制得的Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu)]-OH，得到Tirzepatide肽树脂38.93g。
将所得Tirzepatide肽树脂加入到390mL冷冻裂解试剂92.5％TFA/2.5％TIS/2.5％H2O/2.5％Mpa(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2L异丙醚，析出白色沉淀，沉淀用异丙醚洗涤3次，干燥所得白色固体即为Tirzepatide粗肽11.86g，纯度为73.2％。
实施例17 Tirzepatide粗肽的制备6
称取Rink Amide AM树脂12.5g(替代度为0.40mmol/g，5mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。称取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.83g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于60mL DMF，冰浴下加入DIC(1.89g，15mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干，DMF洗涤3次。20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
重复上述步骤，按Tirzepatide肽序依次偶联剩余氨基酸或氨基酸片段，其中氨基酸片段为实施例6制得的Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-OH、实施例11制得的Lys[AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu)]-OH，得到Tirzepatide肽树脂38.46g。
将所得Tirzepatide肽树脂加入到390mL冷冻裂解试剂92.5％TFA/2.5％TIS/2.5％H2O/2.5％Mpa(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2L异丙醚，析出白色沉淀，沉淀用异丙醚洗涤3次，干燥所得白色固体即为Tirzepatide粗肽11.99g，纯度为73.7％。
实施例18 Tirzepatide粗肽的制备7
称取Rink Amide AM树脂12.5g(替代度为0.40mmol/g，5mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。称取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.83g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于60mL DMF，冰浴下加入DIC(1.89g，15mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干，DMF洗涤3次。20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
重复上述步骤，按Tirzepatide肽序依次偶联剩余氨基酸或氨基酸片段，其中氨基酸片段为实施例9制得的Fmoc-Gly-Gly-OH、实施例1制得的Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-OH、实施例11制得的Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu)]-OH，得到Tirzepatide肽树脂38.76g。
将所得Tirzepatide肽树脂加入到390mL冷冻裂解试剂92.5％TFA/2.5％TIS/2.5％H2O/2.5％Mpa(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2L异丙醚，析出白色沉淀，沉淀用异丙醚洗涤3次，干燥所得白色固体即为Tirzepatide粗肽12.03g，纯度为74.5％。
实施例19 Tirzepatide粗肽的制备8
称取Rink Amide AM树脂12.5g(替代度为0.40mmol/g，5mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。称取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.83g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于60mL DMF，冰浴下加入DIC(1.89g，15mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干，DMF洗涤3次。20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
重复上述步骤，按Tirzepatide肽序依次偶联剩余氨基酸或氨基酸片段，其中氨基酸片段为实施例9制得的Fmoc-Gly-Gly-OH、实施例6制得的Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-OH、实施例11制得的Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioicacid(mon-tBu)]-OH、实施例8制得的Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-OH，得到Tirzepatide肽树脂38.99g。
将所得Tirzepatide肽树脂加入到390mL冷冻裂解试剂92.5％TFA/2.5％TIS/2.5％H2O/2.5％Mpa(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2L异丙醚，析出白色沉淀，沉淀用异丙醚洗涤3次，干燥所得白色固体即为Tirzepatide粗肽12.09g，纯度为74.8％。
实施例20 Tirzepatide粗肽的制备9
称取Rink Amide AM树脂12.5g(替代度为0.40mmol/g，5mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。称取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.83g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于60mL DMF，冰浴下加入DIC(1.89g，15mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干，DMF洗涤3次。20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
重复上述步骤，按Tirzepatide主链肽序依次偶联剩余氨基酸或氨基酸片段，其中氨基酸片段为实施例10制得的Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH、实施例3制得的Fmoc-Lys(Alloc)-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-OH、实施例7制得的Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH，Pd(PPh3)4/DMF脱Alloc后偶联实施例11步骤(2)制得的AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu)片段，得到Tirzepatide肽树脂38.41g。
将所得Tirzepatide肽树脂加入到390mL冷冻裂解试剂92.5％TFA/2.5％TIS/2.5％H2O/2.5％Mpa(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2L异丙醚，析出白色沉淀，沉淀用异丙醚洗涤3次，干燥所得白色固体即为Tirzepatide粗肽11.94g，纯度为74.0％。
实施例21 Tirzepatide粗肽的制备10
称取Rink Amide AM树脂12.5g(替代度为0.40mmol/g，5mmol)，加入到固相反应器中，用DMF溶胀并洗涤三次。称取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.83g，10mmol)和HOBt(1.62g，12mmol)溶于60mL DMF，冰浴下加入DIC(1.89g，15mmol)，活化3min。将活化后的溶液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干，DMF洗涤3次。20％哌啶/DMF溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，DMF洗涤6次。茚三酮检测结果呈阳性。
重复上述步骤，按Tirzepatide肽序依次偶联剩余氨基酸或氨基酸片段，其中氨基酸片段为实施例4制得的Fmoc-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH、实施例11制得的Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu)]-OH、实施例8制得的Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-OH，得到Tirzepatide肽树脂38.71g。
将所得Tirzepatide肽树脂加入到390mL冷冻裂解试剂92.5％TFA/2.5％TIS/2.5％H2O/2.5％Mpa(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2L异丙醚，析出白色沉淀，沉淀用异丙醚洗涤3次，干燥所得白色固体即为Tirzepatide粗肽12.01g，纯度为73.9％。
实施例22 Tirzepatide精肽的制备1
取实施例12所得的Tirzepatide粗肽溶于乙腈水溶液，以十八烷基键合硅胶为固定相、以TFA水溶液和乙腈为流动相对Tirzepatide粗肽溶液进行HPLC梯度洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得Tirzepatide的一次纯化溶液。Tirzepatide的一次纯化液以十八烷基键合硅胶为固定相、用NaClO4盐溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得Tirzepatide精肽6.98g，HPLC纯度为99.1％，收率为29.0％。
实施例23 Tirzepatide精肽的制备2
取实施例13所得的Tirzepatide粗肽溶于乙腈水溶液，以十八烷基键合硅胶为固定相、以TFA水溶液和乙腈为流动相对Tirzepatide粗肽溶液进行HPLC梯度洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得Tirzepatide的一次纯化溶液。Tirzepatide的一次纯化液以十八烷基键合硅胶为固定相、用NaClO4盐溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得Tirzepatide精肽7.51g，HPLC纯度为99.5％，收率为31.2％。
实施例24 Tirzepatide精肽的制备3
取实施例14所得的Tirzepatide粗肽溶于乙腈水溶液，以十八烷基键合硅胶为固定相、以TFA水溶液和乙腈为流动相对Tirzepatide粗肽溶液进行HPLC梯度洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得Tirzepatide的一次纯化溶液。Tirzepatide的一次纯化液以十八烷基键合硅胶为固定相、用NaClO4盐溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得Tirzepatide精肽7.39g，HPLC纯度为99.3％，收率为30.5％。
实施例25 Tirzepatide精肽的制备4
取实施例15所得的Tirzepatide粗肽溶于乙腈水溶液，以十八烷基键合硅胶为固定相、以TFA水溶液和乙腈为流动相对Tirzepatide粗肽溶液进行HPLC梯度洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得Tirzepatide的一次纯化溶液。Tirzepatide的一次纯化液以十八烷基键合硅胶为固定相、用NaClO4盐溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得Tirzepatide精肽7.59g，HPLC纯度为99.2％，收率为31.3％。
实施例26 Tirzepatide精肽的制备5
取实施例16所得的Tirzepatide粗肽溶于乙腈水溶液，以十八烷基键合硅胶为固定相、以TFA水溶液和乙腈为流动相对Tirzepatide粗肽溶液进行HPLC梯度洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得Tirzepatide的一次纯化溶液。Tirzepatide的一次纯化液以十八烷基键合硅胶为固定相、用NaClO4盐溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得Tirzepatide精肽7.12g，HPLC纯度为99.1％，收率为29.3％。
实施例27 Tirzepatide精肽的制备6
取实施例17所得的Tirzepatide粗肽溶于乙腈水溶液，以十八烷基键合硅胶为固定相、以TFA水溶液和乙腈为流动相对Tirzepatide粗肽溶液进行HPLC梯度洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得Tirzepatide的一次纯化溶液。Tirzepatide的一次纯化液以十八烷基键合硅胶为固定相、用NaClO4盐溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得Tirzepatide精肽7.82g，HPLC纯度为99.4％，收率为32.3％。
实施例28 Tirzepatide精肽的制备7
取实施例18所得的Tirzepatide粗肽溶于乙腈水溶液，以十八烷基键合硅胶为固定相、以TFA水溶液和乙腈为流动相对Tirzepatide粗肽溶液进行HPLC梯度洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得Tirzepatide的一次纯化溶液。Tirzepatide的一次纯化液以十八烷基键合硅胶为固定相、用NaClO4盐溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得Tirzepatide精肽8.13g，HPLC纯度为99.5％，收率为33.6％。
实施例29 Tirzepatide精肽的制备8
取实施例19所得的Tirzepatide粗肽溶于乙腈水溶液，以十八烷基键合硅胶为固定相、以TFA水溶液和乙腈为流动相对Tirzepatide粗肽溶液进行HPLC梯度洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得Tirzepatide的一次纯化溶液。Tirzepatide的一次纯化液以十八烷基键合硅胶为固定相、用NaClO4盐溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得Tirzepatide精肽8.18g，HPLC纯度为99.4％，收率为33.8％。
实施例30 Tirzepatide精肽的制备9
取实施例20所得的Tirzepatide粗肽溶于乙腈水溶液，以十八烷基键合硅胶为固定相、以TFA水溶液和乙腈为流动相对Tirzepatide粗肽溶液进行HPLC梯度洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得Tirzepatide的一次纯化溶液。Tirzepatide的一次纯化液以十八烷基键合硅胶为固定相、用NaClO4盐溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得Tirzepatide精肽7.87g，HPLC纯度为99.2％，收率为32.5％。
实施例31 Tirzepatide精肽的制备10
取实施例21所得的Tirzepatide粗肽溶于乙腈水溶液，以十八烷基键合硅胶为固定相、以TFA水溶液和乙腈为流动相对Tirzepatide粗肽溶液进行HPLC梯度洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得Tirzepatide的一次纯化溶液。Tirzepatide的一次纯化液以十八烷基键合硅胶为固定相、用NaClO4盐溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集Tirzepatide馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得Tirzepatide精肽7.94g，HPLC纯度为99.1％，收率为32.8％。

Claims (7)

1.一种Tirzepatide的制备方法，其特征在于，主要包括：用固相多肽合成法制备Tirzepatide肽树脂，Tirzepatide肽树脂经裂解得到Tirzepatide；其中接入Phe-Val-Gln-Trp-Leu的方法为：采用含Phe-Val-Gln-Trp-Leu的5～7肽片段。
2.根据权利要求1所述Tirzepatide的制备方法，其特征在于，含Phe-Val-Gln-Trp-Leu的5～7肽片段选自：
Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala；
Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile；
Lys-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu。
3.根据权利要求1所述Tirzepatide的制备方法，其特征在于，含Phe-Val-Gln-Trp-Leu的5～7肽片段选自：
Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile；
Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu。
4.根据权利要求1所述Tirzepatide的制备方法，其特征在于，含Phe-Val-Gln-Trp-Leu的5～7肽片段为：Phe-Val-Gln-Trp-Leu。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在制备Tirzepatide过程中，采用二肽片段或其组合；
其中二肽片段选自Thr-Phe、Leu-Asp、Gly-Gly、Ser-Ser。
6.根据权利要求1-5任一项所述制备方法，其特征在于，在制备Tirzepatide过程中，采用含Phe-Val-Gln-Trp-Leu的5～7肽片段和二肽片段的组合，所述组合为：
Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala和Gly-Gly；
Lys-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu和Thr-Phe、Ser-Ser；
Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile和Leu-Asp；
Phe-Val-Gln-Trp-Leu和Leu-Asp、Gly-Gly。
7.权利要求1-5任一项制备得到的Tirzepatide经进一步纯化和冻干，得到Tirzepatide纯品。
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