CN115651075A

CN115651075A - 一种Tirzepatide的合成方法

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Publication number: CN115651075A
Application number: CN202211588132.1A
Authority: CN
Inventors: 纪东亮; 罗瑞昌; 李雪豪; 龚裕录
Original assignee: Hangzhou Xinhai Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Xinhai Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-12
Filing date: 2022-12-12
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2042-12-12
Also published as: CN115651075B

Abstract

本发明公开了一种Tirzepatide的合成方法，涉及多肽合成技术领域。该合成方法以氨基树脂作为起始物料，使用多肽固相合成法，得到肽树脂，裂解后得到粗肽，再经纯化冻干后得到Tirzepatide纯品。本发明降低了合成难度，缩短了生产周期，提高了粗肽的纯度，极大的降低了生产成本及废液的产出量。本发明还采用N‑(β‑氨乙基)‑γ‑氨丙基三甲氧基硅烷、苧烯改性多孔硅胶，将其用于Tirzepatide的纯化，使得Tirzepatide的纯度进一步提升；本发明还公开了一种多肽缩合剂，将其用于Tirzepatide合成反应中的缩合活化，提升Tirzepatide的纯度。

Description

一种Tirzepatide的合成方法

技术领域

本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种Tirzepatide的合成方法。

背景技术

Tirzepatide为GLP-1和GIP两种激素的合成模拟物，能改善成人2型糖尿病患者的血糖水平和体重。Tirzepatide序列结构如下：

Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp-Lys-Ile-Ala-Gln-Lys(AEEA-AEEA-γGlu-Eicosanedioic acid)-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂。

Tirzepatide又名替西帕肽，已经被FDA美国食品和药物管理局批准，用于治疗2型糖尿病血糖控制不佳的患者使用。它是第一个也是唯一一个获得FDA批准的GIP和GLP-1受体激动剂，作用原理和GLP-1受体激动剂相似，但增加了GIP，被称为双重激动剂。此外口服用药后肠道会自然释放这两种激素，让人感到饱腹，具有减肥的效果。但是由于Tirzepatide肽链过长，中间部分会出现偶联困难，缺失肽过多，因此需要一种Tirzepatide制备方法来解决现有合成Tirzepatide纯度偏低的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Tirzepatide的合成方法，该合成方法缩短了生产周期，减少了废液排放，提升了粗品纯度，且成品纯化回收率高，极大的提高了总体收率，成本优势明显，利于大规模生产。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种Tirzepatide的合成方法，包括：

1）将带氨基官能团的树脂作为起始树脂，采用Fmoc固相合成法，与特殊保护的氨基酸及多肽片段进行偶联，得到Tirzepatide的肽树脂；

2）经裂解液裂解得到Tirzepatide粗肽；

3）采用C18填料进行纯化得到Tirzepatide纯品；

上述特殊保护的氨基酸及多肽片段包含：Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH、Fmoc-Ile-Aib-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH、Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH。

本发明还公开了一种Tirzepatide的合成方法，采用带氨基官能团的树脂作为起始树脂，使用Fmoc固相合成法进行偶联，得到Tirzepatide的肽树脂，经裂解得到Tirzepatide粗肽，经纯化得到Tirzepatide纯品；该合成方法一方面减少了反应步骤，且缩短生产周期约30%，从而大大减少合成废液的产生；另一方面也极大的提高了粗品的纯度，降低了纯化的难度，提升了纯化的收率；且降低了人工物料成本，利于规模化生产。

具体地，上述Tirzepatide的合成方法，包括以下步骤：

1）在固相合成反应釜内加入起始树脂，然后加入DMF（起始树脂与DMF的质量体积比为1g:10-20mL）溶胀树脂25-35min，抽滤掉DMF；在Rink Amide Linker和HOBT中加入DMF（其中，起始树脂与HOBT的质量比为1:0.1-0.2；Rink Amide Linker与HOBT的质量比为1:0.23-0.28；HOBT与DMF的质量体积比为1g:25-30mL）溶解，然后冷却至0-3℃，加入DIC（RinkAmide Linker与DIC的质量体积比为1g:0.25-0.35mL）活化5-15min，将活化完的溶液倒入固相合成反应釜内，缩合1-2h，抽滤掉反应液，DMF洗涤3-5次；甲醇洗涤3-5次，干燥后，加入DMF（起始树脂与DMF的质量体积比为1g:6-8mL）溶胀树脂55-65min；抽滤掉DMF，加入DBLK（18-23wt%六氢吡啶/DMF溶液）进行去保护30-35min，抽滤掉反应液，DMF洗涤5-7次；在Fmoc-Ser(tBu)-OH和HOBT中加入DMF（其中，起始树脂与HOBT的质量比为1:0.43-0.48；Fmoc-Ser(tBu)-OH与HOBT的质量比为1:3.8-4；HOBT与DMF的质量体积比为1g:3.5-4.5mL）进行溶解，然后冷却至0-3℃，加入DIC（Fmoc-Ser(tBu)-OH与DIC的质量体积比为1g:0.35-0.45mL）活化5-15min，将活化完的溶液倒入上述固相合成反应釜内，缩合1-2h，抽滤掉反应液，DMF洗涤3-5次；使用同样的操作流程，继续偶联剩余氨基酸（包含特殊保护的氨基酸及多肽片段）；偶联完成后，得到Tirzepatide的肽树脂；

2）按比例配制裂解液，冷却至（-15）-（-20）℃；然后将肽树脂加入到裂解液中，升温至裂解温度，搅拌反应3-4h，过滤掉废树脂，取滤液，并将滤液倒入到冰乙醚中沉淀，离心取沉淀，并用乙醚洗涤沉淀3-5次，真空干燥20-24h，得到Tirzepatide粗肽；

3）取粗肽，采用由乙腈、浓度为2-2.5g/L的碳酸氢铵水溶液按照质量比为1-3:97-99组成的溶剂（粗肽与溶剂的质量体积比为1g:90-100mL）进行溶解，然后利用C18填料进行两次纯化，得到Tirzepatide纯品。

对本发明而言，上述起始树脂与DBLK的质量体积比为1g:6-8mL。

对本发明而言，上述肽树脂与裂解液的质量体积比为1g:10-13mL。

对本发明而言，上述裂解温度为15-30℃，更优选地，上述裂解温度为20-25℃。

对本发明而言，上述起始树脂包含AM Resin、MBHA Resin中的一种；上述起始树脂取代度范围为0.25mmol/g-0.85mmol/g；更优选地，上述起始树脂取代度范围为0.3mmol/g-0.65mmol/g。

对本发明而言，上述肽树脂结构为：

Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ile-Ala-Gln(Trt)-Lys(AEEA-AEEA-γGlu-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-LinkerAmide-氨基树脂。

对本发明而言，上述合成方法中使用的各物料的总投料量为起始树脂总摩尔数的2-4倍。

对本发明而言，上述裂解步骤中用到的裂解液包含：TFA、EDT、茴香硫醚、水；上述TFA、EDT、茴香硫醚、水的质量比为85-95:4.5-5.5:2-3:2-3:2.5。

对本发明而言，上述纯化步骤中采用C18填料进行提纯。

对本发明而言，上述C18填料包含改性多孔硅胶。

本发明还公开了一种改性多孔硅胶的制备方法，包括：采用N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷与多孔硅胶发生缩合反应，再与苧烯发生迈克尔加成反应制得。

本发明提供了一种改性多孔硅胶的制备方法，采用N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷中的甲氧基与多孔硅胶表面的硅羟基发生缩合反应，再与苧烯发生迈克尔加成反应，从而对多孔硅胶的表面进行修饰，将制得的改性多孔硅胶用于Tirzepatide粗肽的纯化，进一步提升了Tirzepatide纯品的纯度；原因可能是由于N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷增强了多孔硅胶表面的疏水性能，提高了改性多孔硅胶对有机物的选择性，使得制备的Tirzepatide纯度较高。

具体地，上述改性多孔硅胶的制备方法，包括以下步骤：采用浓度为1-1.5wt%的NaOH溶液浸泡多孔硅胶5-8min，然后超声5-8min，再浸泡5-8min后，采用去离子水冲洗至中性，抽滤干燥，制得预处理的多孔硅胶；然后真空状态下，在预处理的多孔硅胶中加入浓度为5-8wt%的N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷的乙酸乙酯溶液（预处理的多孔硅胶与N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷乙酸乙酯溶液的质量体积比为1g:1.5-2mL），搅拌反应2-2.5h后，抽滤，然后在140-160℃下真空干燥2-2.5h；然后加入到甲醇（预处理的多孔硅胶与甲醇的质量体积比为1g:15-20mL）中，并加入苧烯，搅拌回流反应40-50h，离心，乙醇洗涤，制得改性多孔硅胶。

对本发明而言，上述预处理的多孔硅胶与苧烯的质量体积比为1g:2-2.5mL。

本发明还公开了上述制备方法制得的改性多孔硅胶在纯化Tirzepatide中的用途。

本发明合成使用的缩合试剂为DIC/HOBT，为进一步提升Tirzepatide的合成效率，本发明还采用多肽缩合剂替代DIC。

本发明还公开了一种多肽缩合剂的制备方法，包括：采用3,5-二甲氧基-4-(烯丙氧基)苯乙胺与氰乙酸乙酯进行交换反应，制得化合物a，然后将化合物a与亚硝酸钾、磷酸进行肟化反应，制得化合物b，再将化合物b与N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐进行酯化反应，得到多肽缩合试剂。

本发明提供了一种多肽缩合剂的制备方法，采用3,5-二甲氧基-4-(烯丙氧基)苯乙胺与氰乙酸乙酯进行交换反应，然后与亚硝酸钾、磷酸进行肟化反应，再与N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐进行酯化反应，制得的多肽缩合试剂用于Tirzepatide的合成中，使得制备的Tirzepatide具有更高的纯度；原因可能是由于碳二亚胺类缩合试剂活性较低，其缩合后的副产物脲在一般溶剂中都有一定溶解度，容易残留溶液中对多肽的纯度造成影响，而本发明制备的多肽缩合剂不仅具有显著的缩合活性，还具有聚合物树脂的性质，方便缩合后的试剂与溶液的分离，提升Tirzepatide的纯度，且发挥缩合活性后的副产物可以重新回收，符合绿色化学合成的要求。

具体地，上述多肽缩合剂的制备方法，包括以下步骤：将3,5-二甲氧基-4-(烯丙氧基)苯乙胺、氰乙酸乙酯加入到二甲基甲酰胺（氰乙酸乙酯与二甲基甲酰胺的质量体积比为1g:5.5-6.5mL）中，在20-35℃反应5-8h，然后将反应液浓缩干，加入二氯甲烷（二甲基甲酰胺与二氯甲烷的体积比为1:0.6-0.8），搅拌后采用浓度为1-1.3mol/L的盐酸对二氯甲烷相进行洗涤，分出二氯甲烷相，然后用饱和食盐水洗涤，分液后干燥浓缩，制得化合物a；在18-23℃条件下，将化合物a与亚硝酸钠加入到去离子水（亚硝酸钠与去离子水的质量体积比为1g:7.5-8.5mL）中，然后缓慢加入磷酸，在35-40℃反应1-1.5h，然后升温至45-48℃，采用TLC检测至反应结束，加入浓度为35-37wt％的浓盐酸（亚硝酸钠与浓盐酸的质量体积比为1g:1-1.3mL），搅拌冷却至0-5℃，保温1.5-2h，抽滤，采用冰水洗涤后烘干，制得化合物b；在过氧化苯甲酰中加入乙酸乙酯（过氧化苯甲酰与乙酸乙酯的质量体积比为1g:90-100mL），并缓慢加入化合物b的乙腈溶液（浓度为0.4-0.6wt%），在回流状态下，反应1.5-2h，过滤，采用乙酸乙酯洗涤，烘干，然后与N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐（化合物b与N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐的质量比为1:1.5-1.8）混合后，加入到DMF（N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐与DMF的质量体积比为1g:2-2.3mL）中，然后缓慢加入三乙胺（N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐与三乙胺的质量比为1:0.35-0.4），室温反应3.5-4.5h，过滤，采用甲醇洗涤，干燥，制得多肽缩合剂。

对本发明而言，上述氰乙酸乙酯与3,5-二甲氧基-4-(烯丙氧基)苯乙胺的摩尔比为1:1.5-2；化合物a与亚硝酸钠的摩尔比为1:1.2-1.5；亚硝酸钠与磷酸的摩尔比为1:1.6-1.9；化合物b与过氧化苯甲酰的质量比为1:0.01-0.015。

本发明还公开了上述制备方法得到的多肽缩合剂在Tirzepatide合成中的用途。

本发明的有益效果包括：

本发明公开了一种Tirzepatide的合成方法，以氨基树脂作为起始树脂，使用Fmoc固相合成法进行偶联，得到Tirzepatide的肽树脂，经裂解得到Tirzepatide粗肽，经纯化得到Tirzepatide纯品；该合成方法减少了反应步骤，且缩短了生产周期，大大减少了合成废液的产生；另外，该合成方法也极大的提高了粗品的纯度，降低了纯化的难度，提升了纯化的收率；且降低了人工物料成本，利于规模化生产；本发明还将N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷、苧烯改性的多孔硅胶用于Tirzepatide的纯化步骤，使得Tirzepatide的纯度进一步提升；本发明还公开了一种多肽缩合剂，将其用于Tirzepatide合成反应中的缩合活化，且方便缩合后试剂与溶液的分离，提升Tirzepatide的纯度。

因此，本发明提供了一种Tirzepatide的合成方法，该合成方法缩短了生产周期，减少了废液排放，提升了粗品纯度，且成品纯化回收率高，极大的提高了总体收率，成本优势明显，利于大规模生产。

附图说明

图1为实施例3制备的改性多孔硅胶及多孔硅胶的红外光谱图测试结果；

图2为实施例4制备的多肽缩合剂的红外光谱图测试结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明确，以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细描述：

本发明中所使用的缩写的结构和名称如表1所示。

表1 英文缩写对应结构和名称

英文缩写	结构或者名称
		Fmoc	9-芴甲氧羰基
Boc	叔丁氧羰基
		tBu	叔丁基
Trt	三苯甲基
		Dde
DMF	N,N-二甲基甲酰胺
		DCM	二氯甲烷
DBLK	20%六氢吡啶/DMF溶液
		DIC	N,N-二异丙基碳二亚胺
DIPEA	N,N-二异丙基乙胺
		TFA	三氟乙酸
HOBT	1-羟基苯并三唑
		DMSO	二甲基亚砜

实施例1：

一种Tirzepatide的合成方法，包括以下步骤：

1）在固相合成反应釜内加入307.69g取代度为0.65mmol/g的起始树脂MBHAResin，然后加入5000mL DMF溶胀树脂30min，抽滤掉DMF；在215.6g Rink Amide Linker和54.04g HOBT中加入1500mL DMF溶解，然后冷却至0℃，加入63mL DIC活化10min，将活化完的溶液倒入固相合成反应釜内，缩合1.5h，抽滤掉反应液，DMF洗涤3次；甲醇洗涤5次，干燥后得到Rink Amide MBHA Resin，取102.67g Rink Amide MBHA Resin，加入2000mL DMF溶胀树脂60min；抽滤掉DMF，加入2000mL DBLK（20wt%六氢吡啶/DMF溶液）进行去保护30min，抽滤掉反应液，DMF洗涤5次；在38.34g Fmoc-Ser(tBu)-OH和135.11g HOBT中加入500mLDMF进行溶解，然后冷却至0℃，加入15.75mL DIC活化10min，将活化完的溶液倒入固相合成反应釜内，缩合1.5h，抽滤掉反应液，DMF洗涤3次；使用同样的操作流程，继续偶联剩余氨基酸（按表2的顺序及投料量进行投料），偶联完成后，得到Tirzepatide的肽树脂；

表2 氨基酸投料顺序及投料量

序号	原料名称	投料量	序号	原料名称	投料量
						1	Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH	53.1g	2	Fmoc-Ala-OH	31.1g
3	Fmoc-Gly-OH	29.7g	4	Fmoc-Ser(tBu)-OH	38.3g
						5	Fmoc-Ser(tBu)-OH	38.3g	6	Fmoc-Pro-OH	33.7g
7	Fmoc-Gly-Gly-OH	35.4g	8	Fmoc-Ala-OH	31.1g
						9	Fmoc-Ile-OH	35.3g	10	Fmoc-Leu-OH	35.3g
11	Fmoc-Trp(Boc)-OH	52.6g	12	Fmoc-Gln(Trt)-OH	61.0g
						13	Fmoc-Val-OH	33.9g	14	Fmoc-Phe-OH	38.7g
15	Fmoc-Ala-OH	31.1g	16	Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH	143.6g
						17	Fmoc-Gln(Trt)-OH	122.0g	18	Fmoc-Ala-OH	46.6g
19	Fmoc-Ile-OH	52.9g	20	Fmoc-Lys(Boc)-OH	70.2g
						21	Fmoc-Asp(OtBu)-OH	61.6g	22	Fmoc-Leu-OH	52.9g
23	Fmoc-Ile-Aib-OH	65.7g	24	Fmoc-Ser(tBu)-OH	57.5g
						25	Fmoc-Tyr(tBu)-OH	68.8g	26	Fmoc-Asp(OtBu)-OH	61.6g
27	Fmoc-Ser(tBu)-OH	57.5g	28	Fmoc-Thr(tBu)-OH	59.5g
						29	Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH	54.4g	30	Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH	88.6g

2）按TFA:EDT:茴香硫醚:水=90:5:2.5:2.5:2.5的比例配制1000mL裂解液，冷却至-20℃；然后取100g上述肽树脂加入到裂解液中，升温至裂解温度20℃，搅拌反应3h，过滤掉废树脂，取滤液，并将滤液倒入到冰乙醚中沉淀，离心取沉淀，用乙醚洗涤沉淀3次，真空干燥24h，得到Tirzepatide粗肽；

3）取3g粗肽，采用300mL由乙腈、浓度为2g/L的碳酸氢铵水溶液按照质量比为2:98组成的溶剂进行溶解，然后利用C18多孔硅胶填料进行两次纯化，一纯A相：0.05mol/L的硫酸铵/水溶液，用硫酸调pH到3；B相：20%水/80%乙腈（含0.05mmol/L的磷酸三乙胺）用三乙胺调pH到6.5，洗脱梯度50%B相-70%B相，洗脱时长60min，对收集液进行检测并合并收集纯度大于98%的部分进行二纯；二纯采用的流动相及洗脱梯度为：A相：1%醋酸水溶液；B相1%醋酸乙腈溶液，洗脱梯度为38%B相-58%B相，洗脱时长60min，对收集液进行检测并合并收集液大于99.5%部分进行冻干，将二纯收集液进行冻干，时长48h，得到Tirzepatide纯品。

实施例2：

一种Tirzepatide的合成方法与实施例1的区别：采用AM Resin替代MBHA Resin。

实施例3：

一种Tirzepatide的合成方法与实施例1的区别：采用改性多孔硅胶替代多孔硅胶。

改性多孔硅胶的制备方法，包括以下步骤：

采用浓度为1wt%的NaOH溶液浸泡多孔硅胶5min，然后超声5min，再浸泡8min后，采用去离子水冲洗至中性，抽滤干燥，制得预处理的多孔硅胶；然后真空状态下，在预处理的多孔硅胶中加入浓度为5wt%的N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷的乙酸乙酯溶液（预处理的多孔硅胶与N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷乙酸乙酯溶液的质量体积比为1g:1.5mL），搅拌反应2h后，抽滤，然后在140℃下真空干燥2.5h；然后加入到甲醇（预处理的多孔硅胶与甲醇的质量体积比为1g:20mL）中，并加入苧烯（预处理的多孔硅胶与苧烯的质量体积比为1g:2mL），搅拌回流反应48h，离心，乙醇洗涤，制得改性多孔硅胶。

实施例4：

一种Tirzepatide的合成方法与实施例1的区别：采用多肽缩合剂替代DIC。

多肽缩合剂的制备方法，包括以下步骤：将3,5-二甲氧基-4-(烯丙氧基)苯乙胺、氰乙酸乙酯加入到二甲基甲酰胺（氰乙酸乙酯与二甲基甲酰胺的质量体积比为1g:5.5mL）中，在20℃反应5h，然后将反应液浓缩干，加入二氯甲烷（二甲基甲酰胺与二氯甲烷的体积比为1:0.6），搅拌后采用浓度为1mol/L的盐酸对二氯甲烷相进行洗涤，分出二氯甲烷相，然后用饱和食盐水洗涤，分液后干燥浓缩，制得化合物a；18℃条件下，将化合物a与亚硝酸钠加入到去离子水（亚硝酸钠与去离子水的质量体积比为1g:7.5mL）中，然后缓慢加入磷酸，在35℃反应1h，然后升温至45℃，采用TLC检测至反应结束，加入浓度为35wt％的浓盐酸（亚硝酸钠与浓盐酸的质量体积比为1g:1mL），搅拌冷却至0℃，保温1.5h，抽滤，采用冰水洗涤后烘干，制得化合物b；在过氧化苯甲酰中加入乙酸乙酯（过氧化苯甲酰与乙酸乙酯的质量体积比为1g:90mL），并缓慢加入化合物b的乙腈溶液（浓度为0.4wt%），在回流状态下，反应1.5h，过滤，采用乙酸乙酯洗涤，烘干，然后与N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐（化合物b与N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐的质量比为1:1.5）混合后，加入到DMF（N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐与DMF的质量体积比为1g:2mL）中，然后缓慢加入三乙胺（N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐与三乙胺的质量比为1:0.35），室温反应3.5h，过滤，采用甲醇洗涤，干燥，制得多肽缩合试剂（如式Ⅰ所示）；其中，氰乙酸乙酯与3,5-二甲氧基-4-(烯丙氧基)苯乙胺的摩尔比为1:1.5；化合物a与亚硝酸钠的摩尔比为1:1.2；亚硝酸钠与磷酸的摩尔比为1:1.6；化合物b与过氧化苯甲酰的质量比为1:0.01。

实施例5：

一种Tirzepatide的合成方法与实施例4的区别：采用改性多孔硅胶替代多孔硅胶。

实施例6：

一种Tirzepatide的合成方法与实施例1的区别：表2中的氨基酸投料顺序及投料量采用现有技术中的氨基酸（如表3所示）进行替代。

表3 现有技术中的氨基酸投料顺序及投料量

序号	原料名称	投料量	序号	原料名称	投料量
						1	Fmoc-Pro-OH	33.7g	2	Fmoc-Pro-OH	33.7g
3	Fmoc-Pro-OH	33.7g	4	Fmoc-Ala-OH	31.1g
						5	Fmoc-Gly-OH	29.7g	6	Fmoc-Ser（tBu）-OH	38.3g
7	Fmoc-Ser（tBu）-OH	38.3g	8	Fmoc-Pro-OH	33.7g
						9	Fmoc-Gly-OH	29.7g	10	Fmoc-Gly-OH	29.7g
11	Fmoc-Ala-OH	31.1g	12	Fmoc-Ile-OH	35.3g
						13	Fmoc-Leu-OH	35.3g	14	Fmoc-Trp(Boc)-OH	52.6g
15	Fmoc-Gln(Trt)-OH	61.0g	16	Fmoc-Val-OH	33.9g
						17	Fmoc-Phe-OH	38.7g	18	Fmoc-Ala-OH	31.1g
19	Dde-Lys(Fmoc)-OH	53.2g	20	Fmoc-AEEA	38.5g
						21	Fmoc-AEEA	38.5g	22	Fmoc-Glu-OtBu	42.5g
23	二十烷二酸单叔丁脂	39.8g	24	Fmoc-Gln(Trt)-OH	122.0g
						25	Fmoc-Ala-OH	46.6g	26	Fmoc-Ile-OH	52.9g
27	Fmoc-Lys(Boc)-OH	70.2g	28	Fmoc-Asp(OtBu)-OH	61.5g
						29	Fmoc-Leu-OH	52.9g	30	Fmoc-Aib-OH	49.3g
31	Fmoc-Ile-OH	141.2g	32	Fmoc-Ser(tBu)-OH	57.5g
						33	Fmoc-Tyr(tBu)-OH	68.8g	34	Fmoc-Asp(OtBu)-OH	61.5g
35	Fmoc-Ser(tBu)-OH	57.5g	36	Fmoc-Thr(tBu)-OH	59.5g
						37	Fmoc-Phe-OH	58.1g	38	Fmoc-Thr(tBu)-OH	59.5g
39	Fmoc-Gly-OH	44.5g	40	Fmoc-Glu(OtBu)-OH	63.7g
						41	Fmoc-Aib-OH	49.3g	42	Boc-Tyr(tBu)-OH	67.4g

试验例1：

红外光谱测试

采用傅里叶红外光谱仪对样品进行测试。

对实施例3制备的改性多孔硅胶及多孔硅胶进行红外光谱测试，结果如图1所示。由图1可知，与多孔硅胶的红外谱图相比，改性多孔硅胶的红外谱图在1674cm^-1处存在C=C键的红外特征吸收峰，在1250cm^-1处存在C-N键的红外特征吸收峰；说明N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷、苧烯均参与了改性多孔硅胶的生成反应。

对实施例4制备的多肽缩合剂进行上述测试，结果如图2所示。由图2可知，多肽缩合剂在1400-1600cm^-1处存在苯环的红外特征吸收峰；在2257cm^-1处存在C≡N的红外特征吸收峰；1647cm^-1处存在C=N的红外特征吸收峰；说明制得了目标多肽缩合剂。

试验例2：

产品纯度及纯化收率测试

对样品的产品纯度及纯化收率进行测试，测试结果如表4所示。

表4 产品纯度及纯化收率测试结果

实验分组	纯度/%	纯化收率/%
			实施例1	99.85	55.67
实施例2	99.77	56.25
			实施例3	99.93	54.19
实施例4	99.90	61.82
			实施例5	99.97	60.14
实施例6	99.74	48.81

对实施例1-实施例6制备的Tirzepatide纯度及纯化收率进行测试，结果如表4所示。由表4可知，实施例3与实施例1、实施例5与实施例4相比，纯度有所提升，纯化收率变化稍有减少，说明N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷、苧烯对多孔硅胶的改性作用，进一步提升了多孔硅胶的纯化效果，使得Tirzepatide纯品具有良好的纯度；实施例4与实施例1、实施例5与实施例3相比，纯度均有所提升，纯化收率也明显增加，说明采用本发明制备的多肽缩合剂替代DIC，缩合效率得到一定改善，可以进一步提升Tirzepatide的纯度及纯化收率；实施例1与实施例6相比，Tirzepatide的纯度及纯化收率均明显提升，原因可能是由于本发明提供的合成方法缩短了生产周期，减少了废液排放，提升了合成效率，并极大的提高了总体收率，成本优势明显，且利于大规模生产。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种Tirzepatide的合成方法，包括：

2）经裂解液裂解得到Tirzepatide粗肽；

3）采用C18填料进行纯化得到Tirzepatide纯品；

其特征在于：所述特殊保护的氨基酸及多肽片段包含：Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γGlu(α-OtBu)-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-OH、Fmoc-Ile-Aib-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH、Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH。

2.根据权利要求1所述的一种Tirzepatide的合成方法，其特征在于：所述起始树脂包含AM Resin、MBHA Resin中的一种；所述起始树脂取代度范围为0.25mmol/g-0.85mmol/g。

3.根据权利要求1所述的一种Tirzepatide的合成方法，其特征在于：所述肽树脂结构为：Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ile-Ala-Gln(Trt)-Lys(AEEA-AEEA-γGlu-Eicosanedioic acid(mon-tBu))-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-LinkerAmide-氨基树脂。

4.根据权利要求1所述的一种Tirzepatide的合成方法，其特征在于：所述裂解液包含：TFA、EDT、茴香硫醚、水。

5.根据权利要求4所述的一种Tirzepatide的合成方法，其特征在于：所述TFA、EDT、茴香硫醚、水的质量比为85-95:4.5-5.5:2-3:2-3:2.5。

6.根据权利要求1所述的一种Tirzepatide的合成方法，其特征在于：所述肽树脂与裂解液的质量体积比为1g:10-13mL。

7.根据权利要求1所述的一种Tirzepatide的合成方法，其特征在于：所述C18填料包含改性多孔硅胶。

8.根据权利要求7所述的一种Tirzepatide的合成方法，其特征在于：所述改性多孔硅胶的制备方法，包括：采用N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷与多孔硅胶发生缩合反应，再与苧烯发生迈克尔加成反应制得。