CN111087462A

CN111087462A - 一种阿巴帕肽的固相合成方法

Info

Publication number: CN111087462A
Application number: CN201811247435.0A
Authority: CN
Inventors: 邹正才; 张孝清; 杨凯; 宋志春; 包金远
Original assignee: Nanjing Huawe Medicine Technology Group Co Ltd
Current assignee: Nanjing Huawe Medicine Technology Group Co Ltd
Priority date: 2018-10-24
Filing date: 2018-10-24
Publication date: 2020-05-01
Anticipated expiration: 2038-10-24
Also published as: CN111087462B

Abstract

本发明提供一种阿巴帕肽合成方法。本发明的所述的方法中，按照阿巴帕肽主链肽序分为说明书所述的一个片段的肽树脂及两个片段，分别先合成片段肽树脂、及另外两个片段，然后再将片段肽树脂与两个片段偶联，切割树脂得到最终产品的粗品。最后纯化，成盐最终获得目标产品。各片段及片段树脂的结构如说明书所述。本发明方法操作简单，所得产品纯度较高，方法工艺稳定、制备得到的阿巴帕肽纯度可达99.5％以上，总收率较高，有利于工业化生产。

Description

一种阿巴帕肽的固相合成方法

技术领域

本发明涉及多肽的合成技术，特别是利用固相合成技术实现阿巴帕肽的合成工艺。

背景技术

甲状旁腺激素(PTH)是一种由甲状旁腺主细胞分泌的，调节体内钙和磷代谢的多肽类激素，其C端肽链与PTH-II受体结合可促进骨细胞凋亡、N端肽链与PTH-I受体结合可促进骨骼重建。Lilly公司以人甲状旁腺素(hPTH)N-末端34个氨基酸残基研制的用于治疗骨质疏松症的药物阿巴帕肽(Abaloparatide)于2002年12月被FDA批准上市

阿巴帕肽的结构式为以下：

Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Aib-Lys-Leu-His-Thr-Ala-NH2

阿巴帕肽，英文名称为Abaloparatide，是由Radius Health公司研制的一种新型甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)，它是PTH-I受体强有力的选择性激活剂，可以增加骨矿物质含量、骨密度以及骨强度，促进骨骼形成，已于2017年4月28日被FDA批准上市，其商品名称为Tymlos。阿巴帕肽经皮下注射，用于治疗处于骨折风险或对其它治疗药物无效的绝经后妇女的骨质疏松症，可有效降低新发椎体和非椎体骨折率。与阿巴帕肽相比，阿巴帕肽能够更好的降低骨折率和高钙血症发生率

采用液相法合成阿巴帕肽由于操作繁杂、合成周期长而暂时未见报道。目前阿巴帕肽合成的有关专利如下：

1)固相逐级合成法。专利US6921750B2公开了Boc策略保护氨基酸及采用TFA切除Boc保护基，通过固相法逐个连接氨基酸。最后采用危险性较高氢氟酸对肽树脂进行裂解，反应收率较低。

2)固相片段合成法。专利CN106146648A将阿巴帕肽分割成三个肽树脂片段独立合成，随后将肽片段2、肽片段3与片段1肽树脂进行连接。该方法在氨基酸缩合时氨基酸与树脂投料量的摩尔比值为3:1，在肽片段进行缩合时肽片段2和3与肽树脂片段1投料量的摩尔比值为5:1，造成消耗大量原料，导致生产成本增加，三废增加。专利CN106146648A将主链分成三个片段，按照阿巴帕肽的氨基酸序列从C端至N端的顺序编号，分别独立合成片段[20-34](即专利中的片段[1-15])、片段[12-19](即专利中的片段[16-23])和片段[2-11]肽树脂(即专利中的片段[24-33])，然后再将这多肽片段连接最终得到缺失Ala氨基酸的产品。该发明的缩合工艺采用有机强碱DIEA，容易造成消旋，杂质多，粗品纯度不高。专利CN108047329A采用液相合成方法，同时合成二肽片段三个Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH、Fmoc-Ala-Val-OH和四肽片段一个Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH，再以氨基树脂作为固相合成的载体，按照阿巴帕肽的氨基酸序列从C端至N端依次缩合α依次缩合带有Fmoc保护基的全保护氨基酸和所合成的二肽片段、四肽片段，较固相逐级合成法减少了6步固相缩合反应。缺点是片段多，操作麻烦，反应步骤较多。

综上所述，现有阿巴帕肽的合成方法，总收率基本在15-45％，存在杂质多、氨基酸消旋、纯化困难、收率低等问题，尚未见比较适合工业化生产的技术方案。为此，本发明对阿巴帕肽的合成方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有合成过程中所存在的杂质多，纯度和收率低，成本昂贵，操作步骤繁琐，废液过量，不利于工业化生产的问题，提供一种阿巴帕肽合成方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的，一种阿巴帕肽的合成方法，包括如下步骤：

步骤一、按照主链C端至N端的氨基酸顺序，固相合成第1-9氨基酸的片段[1-9]肽树脂；

步骤二、按照主链C端至N端的氨基酸顺序，固相合成第10-20氨基酸的肽树脂，切割树脂得片段一；

步骤三、按照主链C端至N端的氨基酸顺序，固相合成第21-34氨基酸的肽树脂，切割树脂得片段二；

步骤四、固相法将片段[1-9]肽树脂脱末端Fmoc后，与片段一缩合连接，得到片段[1-20]肽树脂；

步骤五、固相法将片段[1-20]肽树脂脱末端Fmoc后，与片段二缩合连接，得到阿巴帕肽树脂；

步骤六：将阿巴帕肽树脂进行裂解反应得到阿巴帕肽粗品；

其中所述的片段[1-9]肽树脂、片段[1-20]肽树脂、阿巴帕肽树脂的Arg、Asp、Gln、Glu、His、Lys、Ser、Thr上有保护基；片段一与片段二的Arg、Asp、Glu、Gln、His、Lys、Ser上有保护基。

阿巴帕肽固相合成方法中，固相合成的固相载体为取代度为0.1-0.7mmol/g的MBHA树脂或取代度为0.1-1.5mmol/g的2-CTC树脂，优选为取代度0.3-0.5mmol/g的MBHA树脂或0.6-0.8mmol/g的2-CTC树脂。

可以将上述阿巴帕肽粗品经过纯化、成盐、冻干得到醋酸阿巴帕肽精肽。

在本发明的所述的方法中，按照阿巴帕肽主链肽序分为上文所述的一个片段的肽树脂及两个片段，分别先合成片段肽树脂、及另外两个片段，然后再将这三个偶联，切割树脂得到最终产品的粗品。以阿巴帕肽主链C端到N端的氨基酸顺序编号，其肽序如下式所示：

Ala³⁴-Val³³-Ser³²-Glu³¹-His³⁰-Gln²⁹-Leu²⁸-Leu²⁷-His²⁶-Asp²⁵-Lys²⁴-Gly²³-Lys²²-Ser²¹-Ile²⁰-Gln¹⁹-Asp¹⁸-Leu¹⁷-Arg¹⁶-Arg¹⁵-Arg¹⁴-Glu¹³-Leu¹²-Leu¹¹-Glu¹⁰-Lys⁹-Leu⁸-Leu⁷-Aib⁶-Lys⁵-Leu⁴-His³-Thr²-Ala¹-NH₂

本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链上氨基、侧链功能团包括含活泼氢的氮基或羟基或羧基等干扰合成的基团的保护基团,防止主链氨基或侧链功能团等在制备目标产物过程中产生杂质。优选地，Ser、Thr的保护基为TES、TMS、TBS、DHP、THP或tBu，进一步地，优选为tBu，His、Gln的保护基为Adoc、Boc、Mmt、Mtt或Trt，进一步地，优选Trt；Lys的保护基为Boc或Trt，进一步地，优选Boc；Arg的侧链保护基为Boc或Pbf，进一步地，优选Pbf；Glu的保护基优选OtBu。

优选地，

所述的片段[1-9]肽树脂结构式为：

Fmoc-Lys⁹(Boc)-Leu⁸-Leu⁷-Aib⁶-Lys⁵(Boc)-Leu⁴-His³(Trt)-Thr²(tBu)-Ala¹-MBHAResin；

所述的片段一结构式为：

Fmoc-Ile²⁰-Gln¹⁹(Trt)-Asp¹⁸(OtBu)-Leu¹⁷-Arg¹⁶(pbf)-Arg¹⁵(pbf)-Arg¹⁴(pbf)-Glu¹³(OtBu)-Leu¹²-Leu¹¹-Glu¹⁰(OtBu)-OH；

所述的片段二结构式为：

Fmoc-Ala³⁴-Val³³-Ser³²(tBu)-Glu³¹(OtBu)-His³⁰(Trt)-Gln²⁹(Trt)-Leu²⁸-Leu²⁷-His²⁶(Trt)-Asp²⁵(OtBu)-Lys²⁴(Boc)-Gly²³-Lys²²(Boc)-Ser ²¹(tBu)-OH；

所述的片段[1-20]肽树脂其结构式为：

Fmoc-Ile²⁰-Gln¹⁹(Trt)-Asp¹⁸(OtBu)-Leu¹⁷-Arg¹⁶(pbf)-Arg¹⁵(pbf)-Arg¹⁴(pbf)-Glu¹³(OtBu)-Leu¹²-Leu¹¹-Glu¹⁰(OtBu)-Lys⁹(Boc)-Leu⁸-Leu⁷-Aib⁶-Lys⁵(Boc)-Leu⁴-His³(Trt)-Thr²(tBu)-Ala¹-MBHA Resin；

所述的阿巴帕肽树脂其结构式为：

Ala³⁴-Val³³-Ser³²(tBu)-Glu³¹(OtBu)-His³⁰(Trt)-Gln²⁹(Trt)-Leu²⁸-Leu²⁷-His²⁶(Trt)-Asp²⁵(OtBu)-Lys²⁴(Boc)-Gly²³-Lys²²(Boc)-Ser²¹(tBu)-Ile²⁰-Gln¹⁹(Trt)-Asp¹⁸(OtBu)-Leu¹⁷-Arg¹⁶(pbf)-Arg¹⁵(pbf)-Arg¹⁴(pbf)-Glu¹³(OtBu)-Leu¹²-Leu¹¹-Glu¹⁰(OtBu)-Lys⁹(Boc)-Leu⁸-Leu⁷-Aib⁶-Lys⁵(Boc)-Leu⁴-His³(Trt)-Thr²(tBu)-Ala¹-MBHA Resin；

一种阿巴帕肽的合成方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤一、将Rink-Amide-MBHA Resin，加入固相反应器中，在脱保护剂的作用下脱Fmoc反应后与Fmoc-Ala-OH在缩合剂的作用下进行偶联反应，然后重复所述的脱保护基反应和偶联反应，按照阿巴帕肽多肽序列依次连接如下氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH，得到片段[1-9]肽树脂；

步骤二、将2-CTC Resin与Fmoc-Glu(OtBu)-OH在缩合剂的作用下偶联反应，然后进行Fomc脱保护基反应，与Fmoc-Leu-OH进行偶联反应，然后采用逐一固相偶联反应的方式按照多肽序列依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH，重复偶联反应和脱保护基反应操作，直至合成得到片段一肽树脂，最后在裂解剂的作用下裂解树脂后得到片段一；

步骤三、将2-CTC Resin加入固相反应器中与氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH在缩合剂的作用下偶联反应，然后进行Fomc脱保护基反应，与Fmoc-Lys(Boc)-OH进行偶联反应，然后采用逐一固相偶联反应的方式按照多肽序列依次连接氨基酸Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH及Fmoc-Ala-OH，重复偶联反应和脱保护基反应操作直至合成得到片段二肽树脂，最后在裂解剂的作用下裂解树脂后得到片段二；

步骤四、固相法将片段[1-9]肽树脂末端Fmoc进行脱保护基反应，与片段一在缩合剂的作用下偶联，得到片段[1-20]肽树脂；

步骤五、固相法将片段[1-20]肽树脂末端Fmoc进行脱保护基反应，与片段二在缩合剂的作用下偶联，得到阿巴帕肽树脂；

步骤六：将阿巴帕肽树脂在裂解剂的作用下进行裂解反应得到阿巴帕肽。

进一步地，

步骤一到步骤五中，缩合剂选自DIC/HOBt、HBTU/HOBt/DIEA、PyBop/HOBt/DIEA中的一种或多种，优选DIC/HOBt；

所用的反应溶剂优选为二氯甲烷、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合，优选DMF；

脱保护基反应是在脱保护剂的作用下进行的，所述的脱保护剂选自Pip/DMF、NaOH/MeOH、TEA/DMF中的任意一种，优选为体积比20％的Pip/DMF溶液。作为优选的方案，

步骤二或步骤三中，采用的裂解剂为TFA与二氯甲烷混合溶液，体积比为TFA：DCM＝0.5～5：95.0～99.5；或者为TFE与二氯甲烷混合溶液，体积比为TFE：DCM＝10～30：7～90,进一步优选为TFE：DCM＝20：80(体积比)；裂解溶剂体积为肽树脂质量的5～20倍，优选为肽树脂质量的8～12倍；

步骤六中，采用的裂解剂采用三氟乙酸混合溶液。混合溶液体积比为TFA：PhSMe：TIS：水＝70～97：10～1：10～1：10～1；或者混合溶液体积比为TFA：EDT：水＝90～95：1～5：1～5，比例优选为90：5：5；裂解溶剂体积为肽树脂质量的5～25倍，优选为肽树脂质量的8～12倍；

在一种方案中，本发明所用的反应溶剂任意选自二氯甲烷、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合。

本发明中，所述的逐一固相偶联反应的方式通常是将反应底物依次连接Fmoc保护的氨基酸，每次偶联反应完毕，用脱保护剂进行脱Fmoc保护基反应，然后再与下一个Fmoc保护的氨基酸进行固相偶联反应，依次重复偶联反应和脱保护基反应操作，直至合成得到目标肽序结构的产物。

本发明所述侧链保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上含氢的氮基、羟基或羧基等功能团的保护基团,其有助于防止侧链的一部分与肽合成、加工等步骤中使用的化学物质发生反应。

所述的缩合剂是能引起缩合反应的试剂，在多肽合成中，尤指能促进氨基与羧基偶联形成肽键的试剂。

附图说明说明书附图图1为阿巴帕肽制备流程图

本发明的有益效果如下：

本发明采用三个片段偶联法进行固相合成阿巴帕肽，其中所述的片段一、片段二容易合成与纯化，纯度高；三个片段可以同时进行合成，有效地缩短了阿巴帕肽合成时间，从而提高了制备效率；

针对现有技术中小片段过多，合成周期长且浪费物料，三废多，容易产生缺失肽、杂质、纯化困难等问题，本发明所采用的片段合成法，可有效地减少缺失肽、杂质与主成份的氨基酸序列相差较多的问题；由于反应时间缩短，有助于减少异构化及氨基酸消旋问题。本发明使得产品更容易纯化，后处理操作简单，三废减少，各中间体纯度较高；

本发明所述的方法工艺稳定、制备得到的阿巴帕肽纯度可达99.5％以上，总收率较高。

具体实施方式

为便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出修正。

本发明说明书和权利要求书中所使用的缩写或英文全称的含义如下表：

实施例一：片段[1-9]肽树脂的合成

固相反应瓶中依次加入Rink-Amide-MBHA Resin(15.00g,4.25mmol)、200mLDCM，溶胀后抽滤。滤饼用300mL20％Pip/DMF溶液混合，搅拌5分钟，抽滤得滤饼；再加入300mL20％Pip/DMF溶液，搅拌15分钟，抽滤得滤饼。用适量DMF洗涤，抽滤得滤饼。Pip/DMF加入300mLDMF搅拌，冰浴下30min内依次加入Fmoc-Ala-OH(4.20g)、HOBT(1.82g)、DIC(1.70g)。氮气保护下搅拌约2h至用茚三酮检测反应完全。用适量DMF洗涤，抽干。重复上述脱保护与偶联反应步骤，依次连接氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH。反应结束，抽滤，滤饼依次经适量DMF洗涤、DCM洗涤三遍，室温下真空干燥得到片段[1-9]肽树脂。

取0.10g肽树脂，投入1mL裂解液(TFA：EDT：水，90：5：5，体积比)中，室温搅拌3h。过滤，树脂用少量TFA洗涤，合并有机相，与冰乙醚混合，析晶，离心，白色沉淀用乙醚洗涤。真空干燥得到固体，经检测，纯度95％。

实施例二:片段一的合成

固相反应瓶中依次加入2-CTC Resin(25.00g)、400mLDCM，溶胀后抽滤。加入Fmoc-Glu(OtBu)-OH(8.51g)、100mLDCM，逐滴加入DIEA(约9.53g)，氮气鼓泡搅拌反应2h后加入MeOH(25mL)，搅拌30min后抽滤，滤饼经DMF、DCM交替洗涤后真空干燥。

固相反应瓶中依次加入上述物料、200mLDCM，溶胀后抽滤。滤饼用100mL20％Pip/DMF溶液混合，搅拌5分钟，抽滤得滤饼；再加入100mL20％Pip/DMF溶液，搅拌15分钟，抽滤。滤饼用适量DMF洗涤，抽滤得滤饼。Pip/DMF。加入400mLDMF，搅拌，冰浴下30min内依次加入Fmoc-Leu-OH(18.53g)、HOBT(8.75g)、DIC(8.18g)。氮气保护下搅拌至茚三酮检测反应完全。抽滤，滤饼经适量DMF洗涤。重复脱保护与偶联反应步骤，依次链接氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH。过滤，滤饼经适量DMF、DCM交替洗涤，抽滤，室温下真空干燥得到片段一肽树脂。

固相反应瓶中依次加入上述物料、500mL20％TFE/DCM，氮气鼓泡搅拌反应2h后抽滤，滤饼用适量DCM洗涤，合并滤液，减压浓缩，残留物与200mLDCM混合，溶解，加入冰乙醚，析晶，离心，乙醚洗涤，得片段一46.01g,收率93％，纯度94％。

实施例三：片段二的合成

在固相反应瓶中加入2-CTC Resin(25.00g)、400mLDCM，溶胀后抽滤。加入Fmoc-Ser(tBu)-OH(6.88g)、100mLDCM，氮气鼓泡下逐滴加入DIEA(约9.53g)，搅拌反应2h后加入MeOH(25mL)，搅拌反应30min。过滤，滤饼经MeOH、DCM交替洗涤三遍，室温下真空干燥。经检测，取代度0.74mmol/g；

在固相反应瓶中加入干燥的上述树脂、200mLDCM，溶胀，抽滤。滤饼用100mL20％Pip/DMF溶液混合，搅拌5分钟，抽滤得滤饼；再加入100mL20％Pip/DMF溶液，搅拌15分钟，抽滤。滤饼用适量DMF洗涤，抽干。加入400mLDMF搅拌，冰浴下30min内依次加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(26.03g)、HOBT(8.75g)、DIC(8.18g)。氮气保护下搅拌反应至茚三酮检测反应完全。抽干，滤饼经适量DMF洗涤，抽干。重复脱保护与偶联反应步骤，依次连接氨基酸Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH及Fmoc-Ala-OH。反应结束，抽滤，滤饼经适量DMF、DCM交替洗涤后室温下真空干燥，得到片段二肽树脂。

肽树脂与500mL20％TFE/DCM混合，氮气下搅拌反应2h，抽滤，滤饼用适量DCM洗涤，合并滤液，室温下减压浓缩，残留物经200mLDCM溶解，加入冰乙醚析晶，离心，乙醚洗涤，得片段二46.13g，收率87％，纯度92％。

实施例四：片段[1-20]肽树脂的合成

在固相反应瓶中加入实施例一中所得到的肽树脂(17.86g)与200mLDCM，混合，溶胀，抽滤。滤饼用100mL20％Pip/DMF溶液混合，搅拌5分钟，抽滤得滤饼；再加入100mL20％Pip/DMF溶液，搅拌15分钟，抽滤。滤饼用适量DMF洗涤，抽干待用。在干燥的反应瓶中，依次加入片段一(36.38g)、HOBT(2.07g)、DMF(100mL)及DIC(1.93g)，活化后加入到上述固相反应瓶中，反应至茚三酮检测反应完全。抽滤，经适量DMF、DCM依次洗涤，抽干。滤饼与100mL适量30％乙酸酐/吡啶/DCM溶液混合，搅拌1h，抽滤。滤饼经经适量DMF洗涤、抽干，直接用于下一步。

实施例五：阿巴帕肽树脂的合成

固相反应瓶中依次加入实施例四中所得到的肽树脂、200mLDCM，混合，溶胀，抽滤。滤饼用100mL20％Pip/DMF溶液混合，搅拌5分钟，抽滤得滤饼；再加入100mL20％Pip/DMF溶液，搅拌15分钟，抽滤得滤饼。用适量DMF洗涤，抽干待用。在干燥的反应瓶中，依次加入片段二(37.30g)、HOBT(2.07g)、DMF(100mL)及DIC(1.93g)，活化后加入上述固相反应瓶中，搅拌至茚三酮检测反应完全。抽滤，经适量DMF、DCM依次洗涤，抽干。滤饼与100mL适量30％乙酸酐/吡啶/DCM溶液混合，搅拌1h，抽干。滤饼经适量DMF洗涤，抽滤。滤饼用100mL20％Pip/DMF溶液混合，搅拌5分钟，抽干；再加入100mL20％Pip/DMF溶液，搅拌15分钟，抽干。滤饼经适量DMF、DCM洗涤后室温下真空干燥，得肽树脂25.00g，直接用于下一步。

实施例六：阿巴帕肽粗品的合成

将实施例五所得的树脂与100mL裂解剂(TFA：水：EDT，90：5：5，体积比)混合，在室温下裂解时间3小时至反应结束。过滤，滤液中加入适量异丙醚，离心、沉降。洗涤，分离，室温下真空干燥得到阿巴帕肽粗品14.72g，HPLC纯度75％，总收率85％。

实施例七：醋酸阿巴帕肽的制备

称取1.00g阿巴帕肽粗品，与含少量氨水的10ml水混合，溶解。采用汉邦制备HPLC系统(波长为210nm，色谱柱为C8反相柱，20M乙酸铵溶液，pH3.0/乙腈为流动相)在室温下纯化，得到纯度大于99.5％的阿巴帕肽精肽溶液。将精肽溶液经制备HPLC系统(色谱柱为C18反相柱，0.2％醋酸/乙腈为流动相)转盐，收集目标组分，减压浓缩，冻干得到醋酸阿巴帕肽0.52g，纯度为99.7％，纯化收率52％，总收率44％；质谱(M+H)⁺＝1321.2,1981.4；Calculated：3960.6。

Claims

1.一种阿巴帕肽的合成方法，包括如下步骤：

步骤六：将阿巴帕肽肽树脂进行裂解反应得到阿巴帕肽粗品；

所述的片段[1-9]肽树脂、片段[1-20]肽树脂、阿巴帕肽树脂的Thr、His、Lys、Glu、Arg、Asp、Gln、Ser上有保护基；片段一与片段二的His、Lys、Glu、Arg、Asp、Gln、Ser上有保护基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的Ser、Thr的保护基任意选自TES、TMS、TBS、DHP、THP或tBu中的一种；

His、Gln的保护基任意选自Adoc、Boc、Mmt、Mtt或Trt中的一种；

Lys的保护基为Boc或Trt；

Arg的侧链保护基为Boc或Pbf；Glu的保护基为OtBu。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的片段[1-9]肽树脂结构式为：

所述的片段二结构式为：

所述的片段三结构式为：

Fmoc-Ala³⁴-Val³³-Ser³²(tBu)-Glu³¹(OtBu)-His³⁰(Trt)-Gln²⁹(Trt)-Leu²⁸-Leu²⁷-His²⁶(Trt)-Asp²⁵(OtBu)-Lys²⁴(Boc)-Gly²³-Lys²²(Boc)-Ser²¹(tBu)-OH；

所述的片段[1-20]肽树脂其结构式为：

Fmoc-Ile²⁰-Gln¹⁹(Trt)-Asp¹⁸(OtBu)-Leu¹⁷-Arg¹⁶(pbf)-Arg¹⁵(pbf)-Arg¹⁴(pbf)-Glu¹³(OtBu)-Leu¹²-Leu¹¹-Glu¹⁰(OtBu)-Lys⁹(Boc)-Leu⁸-Leu⁷-Aib⁶-Lys⁵(Boc)-Leu⁴-His³(Trt)-Thr²(tBu)-Ala¹-MBHA Resin。

所述的阿巴帕肽树脂其结构式为：

Ala³⁴-Val³³-Ser³²(tBu)-Glu³¹(OtBu)-His³⁰(Trt)-Gln²⁹(Trt)-Leu²⁸-Leu²⁷-His²⁶(Trt)-Asp²⁵(OtBu)-Lys²⁴(Boc)-Gly²³-Lys²²(Boc)-Ser²¹(tBu)-Ile²⁰-Gln¹⁹(Trt)-Asp¹⁸(OtBu)-Leu¹⁷-Arg¹⁶(pbf)-Arg¹⁵(pbf)-Arg¹⁴(pbf)-Glu¹³(OtBu)-Leu¹²-Leu¹¹-Glu¹⁰(OtBu)-Lys⁹(Boc)-Leu⁸-Leu⁷-Aib⁶-Lys⁵(Boc)-Leu⁴-His³(Trt)-Thr²(tBu)-Ala¹-MBHA Resin。

4.一种阿巴帕肽的合成方法，其特征在于包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤一到步骤五任意步骤中，所述的缩合剂选自DIC/HOBt、HBTU/HOBt/DIEA、PyBop/HOBt/DIEA中的一种或多种。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的脱保护基反应是在脱保护剂的作用下进行的，所述的脱保护剂选自Pip/DMF、NaOH/MeOH、TEA/DMF中的任意一种。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的步骤二或步骤三中采用的裂解剂为TFA与二氯甲烷混合溶液，体积比为TFA：DCM＝0.5～5：95.0～99.5。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的步骤二或步骤三中采用的裂解剂为TFE与二氯甲烷混合溶液，体积比为TFE：DCM＝10～30：7～90。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的步骤六中，采用的裂解剂采用三氟乙酸混合溶液，所述的三氟乙酸混合溶液的体积比为TFA：PhSMe：TIS：水＝70～97：10～1：10～1：10～1；或者体积比为TFA：EDT：水＝90～95：1～5：1～5；裂解溶剂体积为肽树脂质量的5～25倍。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于合成的固相载体为取代度为0.1-0.7mmol/g的MBHA树脂或取代度为0.1-1.5mmol/g的2-CTC树脂。