CN108864275B - 一种乌拉立肽的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种乌拉立肽的制备方法，其包括以下步骤：1)在固相合成树脂上，依次偶联Fmoc‑AA‑OH；2)裂解液脱除树脂；3)将步骤2)所得中间体与五水合硫代硫酸钠在溶剂中进行反应，反应温度为25‑100℃，至反应完全得乌拉立肽。本发明的方法适合工业上制备，产率相比于固相合成方法效率和产率均有较高的提高。

Description

一种乌拉立肽的合成方法
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种乌拉立肽的合成方法。
背景技术
乌拉立肽(Ularitide)最初是从人体尿液中分离出来的一种利钠肽，其结构与心房利钠肽类似，区别仅仅是在于其序列N-端多出四个氨基酸残基。
乌拉立肽由CardioPep Pharma公司开发并生产，由Protein Desin Labs公司进行临床开发及市场推广。乌拉立肽不仅具有尿钠排泄及利尿作用，而且有明显的扩血管效应，适用于失代偿性心力衰竭、急性心力衰竭、急性肾衰竭及支气管哮喘等病症。2014年底，国外对于乌拉立肽的研究已进入三期临床。
乌拉立肽，也称乌拉力肽，英文名称Ularitide、Urodilatin，是一种含有32 个氨基酸残基的二硫桥环肽，分子式为C145H234N52O44S3，分子量：3506.00， CAS登记号：118812-69-4。多肽序列为 H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg–Met -Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH(S-S，11-27)。
到目前为止，有几种方法合成乌拉立肽。
1995年的一份专利(US5449751)，公开了一种制备乌拉立肽的方法：从人的尿中提取和分离乌拉立肽。
专利US5449751中，公开了一种固相合成乌拉立肽的方法：使用BOC保护的氨基酸固相合成。
专利CN 103145827A中，公开了一种固相合成乌拉立肽的方法：使用Fmoc 保护的氨基酸固相合成，液相空气氧化二硫键。
发明内容
本发明的目的是提供另外一种制备乌拉立肽的合成方法。该方法新颖、合成条件温和、工艺简单且工艺稳定。
本发明一个方面提供了一种乌拉立肽的制备方法，其包括以下步骤：
1)在固相合成树脂上，依次偶联Fmoc-AA-OH，按顺序Fmoc-AA-OH为 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-3-Cl-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-3-Cl-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH；
2)裂解液脱除树脂；
3)将步骤2)所得中间体与硫化剂在溶剂中进行反应，至反应完全得乌拉立肽。
在本发明的技术方案中，步骤1)中，固相合成树脂为wang树脂或2-氯树脂，树脂替代度为0.5-1.5mmol/g，优选0.8-1.2mmol/g，更优选1mmol/g。
在本发明的技术方案中，步骤1)中，
偶联Fmoc-Tyr(tBu)-OH的方法为，
将Fmoc-Tyr(tBu)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后加入到固相合成树脂中，反应完全后封闭树脂，得到Fmoc-Tyr(tBu)-固相合成树脂；
偶联除Fmoc-Tyr(tBu)-OH以外的Fmoc-AA-OH的方法为，
i)脱除Fmoc-AA-固相合成树脂的Fmoc保护基至完全；
ii)将Fmoc-AA-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，加入到固相反应柱中，至反应完全；
优选地，步骤i)中脱除Fmoc保护基的试剂为20％的哌啶/DMF溶液。
优选地，步骤1)中的偶联剂为DIC和化合物A的组合物、DIC和化合物B 的组合物、DIPCDI和化合物A的组合物或DIPEA和化合物A以及化合物B的组合物，其中化合物A为HOBt或HOAt中的一种或多种，化合物B为PyBOP、 PyAOP、HATU、HBTU或TBTU中的一种或多种，
更优选地，偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIPCDI:A＝1.2:1.1或 DIPEA:A:B＝2.0:1.1:1.0。
在本发明的技术方案中，步骤2)中，所述的裂解液为TFA、H2O、PhOMe、苯甲硫醚的组合物；优选地，TFA：H2O：PhOMe：苯甲硫醚＝50-120：1-10： 1-10：0.1-5；更优选为80-110：4-6：3-5：0.5-1.5。
在本发明的技术方案中，步骤3)中，在液相条件下，以硫化剂处理步骤2) 所得多肽；
优选地，所述硫化剂选自硫代硫酸钠、硫化钾、硫氰化钾。
在本发明的技术方案中，步骤3)中，硫化剂与步骤2)所得多肽的比例为 1:1-1:10；优选地，两者用量比例为1:2。
在本发明的技术方案中，步骤3)中，液相反应温度为25-100℃，优选温度60℃。
在本发明的技术方案中，在步骤3)后还包含步骤4)，
4)纯化步骤；
优选地，以反相高压液相色谱法进行纯化，更优选地，所述反相高压液相色谱法包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。
本发明另一个方面提供了一种乌拉立肽的制备方法，其包括以下步骤：
1)在替代度为1.0mmol/g的Wang树脂上，加入DMF；称取 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HOBt、DMAP，以DMF溶解，0℃下加入DIC活化后加入 Wang树脂反应柱中；反应至完全，加入醋酸酐和吡啶，混合封闭，以DCM洗涤，得到Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂；
依次偶联Fmoc-AA-OH，按顺序Fmoc-AA-OH为Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-3-Cl-Ala-OH、 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-3-Cl-Ala-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH；
偶联Fmoc-AA-OH的方法为，以20％的哌啶/DMF溶液脱除Fmoc保护基，称取Fmoc-AA-OH和HOBT用DMF溶解，加入DIPCDI活化后加入固相合成树脂反应柱中，反应至完全；
2)以TFA：H2O：PhOMe：苯甲硫醚＝90：5：4：1(V:V)与步骤1) 所得中间体室温反应至完全，除去树脂，以冰乙醚进行沉淀并收集沉淀；
3)将步骤2)所得与五水合硫代硫酸钠在加入乙腈与水体积比为5:1混合溶液中进行反应，反应温度为60℃，至反应完全；
4)以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干，得乌拉立肽。
在本发明的技术方案中，所述固相多肽合成方法包括：1)脱除Fmoc，接着用溶剂洗涤树脂，直至用检测方法检测到完全脱除Fmoc为止；2)将合适量的待偶联氨基酸和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；3)重复1)和2)。其中脱除Fmoc的试剂为20％的哌啶/DMF溶液(DBLK)，即哌啶：DMF(体积比)为1:4的混合溶液。
在本发明的技术方案中，反应在固相反应柱中进行。对固相反应柱无特别限制，可为可实现此目的的任意固相反应柱。此外，每种氨基酸进行偶联反应的时间通常为1.5-4小时，优选2-3小时；压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力下进行；温度优选为室温(即20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下进行。
在本发明的技术方案中，步骤2)的反应优选将树脂在偶联之前进行溶胀，所述洗涤和溶胀的步骤本领域可采用实现该目的的任何试剂进行，包括DMF、 NMP、二氯甲烷等，优选DMF。所述反应中应用的检测方法是本领域已知的可实现此目的的任意方法，例如色谱法或化学标定法，优选使用可判定反应终点的试剂，优选茚三酮，当使用茚三酮时，若树脂显色则说明多肽中有游离的胺，即胺上无保护基。选用的偶联剂为DIPCDI+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt 或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一。
有益效果
本发明的方法适合工业上制备，产率相比于固相合成方法效率和产率均有较高的提高。
附图说明
图1为本发明的合成线路图。
具体实施方式
实施例1：替代度为0.50mmol Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂的制备
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂100g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH 45.9克(100mmol)、HOBt16.2 克(120mmol)、DMAP 1.2克(10mmol)，用DMF溶解，0℃下加入20.3mLDIC, 活化5分钟，加入反应柱。反应两小时后，加入70mL醋酸酐和60mL吡啶，混合封闭24小时，DCM洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到 Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂，检测替代度为0.50mmol/g。
实施例2：肽树脂的制备
称取实施例1制备的替代度为0.50mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂 50g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；然后用DBLK脱保护 6min+8min，DMF洗涤6次。称取48.7g(75mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH和 11.7g(75mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入13mL(75mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。重复上述偶联操作，按照肽序依次偶联Fmoc-Phe-OH， Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-3-Cl-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH， Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-3-Cl-Ala-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Leu-OH， Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH。偶联结束，用甲醇收缩树脂，抽干，得到肽树脂215.5 克。
实施例3：中间体粗肽的制备
将实施例2得到的肽树脂215.5克加入到3L三口瓶中，加入预先配置好的 TFA：H2O：PhOMe：苯甲硫醚＝90：5：4：1(V:V)2L，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入20L冰乙醚中沉淀，离心，冰乙醚洗涤5次，减压干燥得到粗肽70.2克，HPLC纯度 61.6％。
实施例4：乌拉立肽粗肽的制备
将实施例3得到的中间体粗肽70.2克加入到1000ml反应瓶中，加入乙腈与水体积比为5:1混合溶液700ml溶解，然后加入五水合硫代硫酸钠10.0g。混合液加热至60℃反应。反应结束后，减压蒸除溶剂，得到固体80g。
实施例5：乌拉立肽精肽的制备
将实施例4得到80g固体直接用高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品17.5g，纯度大于95％，收率25％。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳翰宇药业股份有限公司
<120> 一种乌拉立肽的合成方法
<130> CP11701043C
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met
1 5 10 15
Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
20 25 30

Claims (20)

1.一种乌拉立肽的制备方法，其包括以下步骤：
1)在固相合成树脂上，依次偶联Fmoc-AA-OH，按顺序Fmoc-AA-OH为Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-3-Cl-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-3-Cl-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH；
2)裂解液脱除树脂；
3)将步骤2)所得中间体与硫化剂在溶剂中进行反应，至反应完全得乌拉立肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤1)中，固相合成树脂为wang树脂或2-氯树脂，树脂替代度为0.5-1.5mmol/g。
3.根据权利要求2所述的制备方法，所述树脂替代度为0.8-1.2mmol/g。
4.根据权利要求3所述的制备方法，所述树脂替代度为1mmol/g。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤1)中，
偶联Fmoc-Tyr(tBu)-OH的方法为，
将Fmoc-Tyr(tBu)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后加入到固相合成树脂中，反应完全后封闭树脂，得到Fmoc-Tyr(tBu)-固相合成树脂；
偶联除Fmoc-Tyr(tBu)-OH以外的Fmoc-AA-OH的方法为，
i)脱除Fmoc-AA-固相合成树脂的Fmoc保护基至完全；
ii)将Fmoc-AA-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，加入到固相反应柱中，至反应完全。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，步骤i)中脱除Fmoc保护基的试剂为20％的哌啶/DMF溶液。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其中，步骤1)中的偶联剂为DIC和化合物A的组合物、DIC和化合物B的组合物、DIPCDI和化合物A的组合物或DIPEA和化合物A以及化合物B的组合物，其中化合物A为HOBt或HOAt中的一种或多种，化合物B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIPCDI:A＝1.2:1-1.2或DIPEA:A:B＝2.0:1.1:1.0。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤2)中，所述的裂解液为TFA、H2O、PhOMe、苯甲硫醚的组合物。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其中TFA：H2O：PhOMe：苯甲硫醚＝50-120：1-10：1-10：0.1-5。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其中TFA：H2O：PhOMe：苯甲硫醚＝80-110：4-6：3-5：0.5-1.5。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤3)中，在液相条件下，以硫化剂处理步骤2)所得多肽。
13.根据权利要求12所述的制备方法，所述硫化剂选自硫代硫酸钠、硫化钾、硫氰化钾。
14.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤3)中，硫化剂与步骤2)所得多肽的比例为1:1-1:10。
15.根据权利要求14所述的制备方法，所述硫化剂与步骤2)所得多肽的比例为1:2。
16.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤3)中，液相反应温度为25-100℃。
17.根据权利要求16所述的制备方法，所述液相反应温度为60℃。
18.根据权利要求1所述的制备方法，在步骤3)后还包含步骤4)纯化步骤。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其中以反相高压液相色谱法进行纯化，所述反相高压液相色谱法包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。
20.一种乌拉立肽的制备方法，其包括以下步骤：
1)在替代度为1.0mmol/g的Wang树脂上，加入DMF；称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HOBt、DMAP，以DMF溶解，0℃下加入DIC活化后加入Wang树脂反应柱中；反应至完全，加入醋酸酐和吡啶，混合封闭，以DCM洗涤，得到Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂；
依次偶联Fmoc-AA-OH，按顺序Fmoc-AA-OH为Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-3-Cl-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-3-Cl-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH；
偶联Fmoc-AA-OH的方法为，以20％的哌啶/DMF溶液脱除Fmoc保护基，称取Fmoc-AA-OH和HOBT用DMF溶解，加入DIPCDI或DIC活化后加入固相合成树脂反应柱中，反应至完全；
2)以TFA：H2O：PhOMe：苯甲硫醚＝90：5：4：1(V:V)与步骤1)所得中间体室温反应至完全，除去树脂，以冰乙醚进行沉淀并收集沉淀；
3)将步骤2)所得与五水合硫代硫酸钠在加入乙腈与水体积比为5:1混合溶液中进行反应，反应温度为60℃，至反应完全；
4)以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干，得乌拉立肽。
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