CN113880935B - 一种索马鲁肽全保护肽树脂的制备方法、一种索马鲁肽制备方法 - Google Patents

一种索马鲁肽全保护肽树脂的制备方法、一种索马鲁肽制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种索马鲁肽的制备方法，涉及多肽合成技术领域。本发明提供的制备方法，采用式I所示的氨基酸或式II所示的二肽片段，通过原料结构的空间位阻，能够改善索马鲁肽全保护肽树脂偶联过程中因beta折叠形成的缩聚，降低马鲁肽树脂偶联的难度，从而有效避免缺失杂质、插入杂质和消旋杂质的产生。由此，本发明提供的制备方法能够提高索马鲁肽粗品的质量，增加索马鲁肽的收率，且成本低，操作简单，适宜工业化生产。

Description

一种索马鲁肽全保护肽树脂的制备方法、一种索马鲁肽制备 方法
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，具体涉及一种索马鲁肽全保护肽树脂的制备方法、一种索马鲁肽制备方法。
背景技术
索马鲁肽(SemaglutideCAS：910463-68-2)是一种新的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，对2型糖尿病(T2DM)的血糖控制和体重减轻有显著的作用。
在人体中，Semaglutide在化学上类似于胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。Semaglutide的结构为GLP-1(7-37)链上8位Aib取代了Ala，34位Arg取代了Lys，26位上Lys接上了十八烷二酸脂肪链，谷氨酸和短链的PEG修饰。PEG修饰后不但可以与白蛋白紧密结合，掩盖DPP-4酶水解位点，还能降低肾排泄，可延长生物半衰期，达到长效的目的，其结构如下：
H-His1-Aib2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Val10-Ser11-Ser12-Tyr13-Leu14-Glu15-Gly16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20[AEEA32-AEEA33-γ-Glu34-N-(17-carboxy-1-oxoheptadecyl)35]-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Val27-Arg28-Gly29-Arg30-Gly31-OH。
目前，索马鲁肽固相合成方法主要有以下两种：一是逐步偶联主链，然后脱除Lys侧链保护基，再逐步偶联侧链；二是逐步偶联至Lys20后，先逐步连接侧链，再完成主链连接。然而由于序列原因，采用常规保护的氨基酸逐步连接时，由于树脂缩聚导致连接困难，从而影响产品质量。很难获得高质量的粗品，造成生产成本提高。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种索马鲁肽全保护肽树脂的制备方法、一种索马鲁肽制备方法，本发明提供的制备方法能有效改善合成过程中树脂缩聚情况，够有效避免缺失、插入和消旋杂质的产生，提高索马鲁肽粗品的质量，增加索马鲁肽的收率，且成本低。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种索马鲁肽全保护肽树脂的制备方法，包括以下步骤：按照索马鲁肽的序列，取Fmoc-Gly31-树脂，依次与式I所示的氨基酸或式II所示的二肽片段和提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料偶联，得到索马鲁肽全保护肽树脂，所述式I为Fmoc-N(R)-AA1-OH，所述式II为Fmoc-AA2-N(R)-AA1-OH，所述式I和式II中R为Dmb或Hmb，所述式I和式II中AA1为Gly29、Leu26、Ala24、Ala19、Ala18、Gly16、Leu14中的一个或多个，所述AA2为Arg(Pbf)28、Trp(Boc)25、Ile23、Ala18、Gln(Trt)17、Glu(OtBu)15、Tyr(tBu)13中的一个或多个，所述提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料包括氨基酸和/或肽片段，所述氨基酸和/或肽片段具有N端Fmoc保护且侧链保护。
优选的，所述提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料包括式III所示的五肽片段，所述式III为Fmoc-Lys(AEEA32-AEEA33-γ-Glu(OtBu)34-Octadecanedioic acidmono-tert-butyl ester35)-OH。
优选的，所述提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料包括式IV所示四肽片段或式V所示二肽片段，所述式IV为X-His(Trt)1-Aib2-Glu(OtBu)3-Gly4-OH，所述式V为X-His(Trt)1-Aib2-OH，所述式IV和式V中X为Boc、Fmoc、Trt、Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Alloc。
优选的，所述提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料包括式VI所示二肽片段，所述式VI为Fmoc-Thr(tBu)5-Phe6-OH。
优选的，所述偶联在偶联试剂中进行，所述偶联试剂包括DIC/HoBt、DIC/HoAt、PyBOP/HoBt/DIPEA、HATU/DIPEA或HBTU/DIPEA。
优选的，所述Fomc-Gly31-树脂的制备方法包括以下步骤：
取起始树脂和Fmoc-Gly31-OH偶联得到Fomc-Gly31-树脂，所述起始树脂为CTC树脂或Wang树脂，所述起始树脂的取代度为0.45～0.75mmol/g。
优选的，所述Fmoc-Gly31-OH和所述起始树脂的摩尔比为(1.5～4):1。
本发明提供了一种索马鲁肽的制备方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法得到的索马鲁肽全保护肽树脂依次酸裂解和纯化，得到所述索马鲁肽。
优选的，所述酸裂解用酸性裂解液为TFA、EDT、Tis和水，所述TFA、EDT、Tis和水的体积比为(85～95):(2.5～6):(1.25～3):(1.25～3)；
所述酸裂解的温度为20～40℃，所述酸裂解的时间为2～4h。
优选的，所述纯化得到纯化液，所述纯化后还包括取所述纯化液采用醋酸转盐，得到醋酸盐索马鲁肽。
本发明提供了一种索马鲁肽全保护肽树脂的制备方法，包括以下步骤：按照索马鲁肽的序列，取Fmoc-Gly31-树脂，依次与式I所示的氨基酸或式II所示的二肽片段和所述索马鲁肽序列中剩余的氨基酸和/或肽片段偶联，得到索马鲁肽全保护肽树脂，所述式I为Fmoc-N(R)-AA1-OH，所述式II为Fmoc-AA2-N(R)-AA1-OH，所述式I和式II中R为Dmb或Hmb，所述式I和式II中AA1为Gly29、Leu26、Ala24、Ala19、Ala18、Gly16、Leu14中的一个或多个，所述AA2为Arg(Pbf)28、Trp(Boc)25、Ile23、Ala18、Gln(Trt)17、Glu(OtBu)15、Tyr(tBu)13中的一个或多个，所述索马鲁肽序列中剩余的氨基酸和/或肽片段具有N端Fmoc保护且侧链保护。本发明提供的制备方法，采用式I所示的氨基酸或式II所示的二肽片段为原料制备索马鲁肽，通过R结构的空间位阻，能够改善索马鲁肽全保护肽树脂偶联过程中因beta折叠形成的缩聚，降低马鲁肽树脂偶联的难度，从而有效避免缺失杂质、插入杂质和消旋杂质的产生。由此，本发明提供的制备方法能够提高索马鲁肽粗品的质量，增加索马鲁肽的收率，且成本低，操作简单，适宜工业化生产。
具体实施方式
本发明提供了一种索马鲁肽全保护肽树脂的制备方法，包括以下步骤：按照索马鲁肽的序列，取Fmoc-Gly31-树脂，依次与式I所示的氨基酸或式II所示的二肽片段和提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料偶联，得到索马鲁肽全保护肽树脂，所述式I为Fmoc-N(R)-AA1-OH，所述式II为Fmoc-AA2-N(R)-AA1-OH，所述式I和式II中R为Dmb或Hmb，所述式I和式II中AA1为Gly29、Leu26、Ala24、Ala19、Ala18、Gly16、Leu14中的一个或多个，所述AA2为Arg(Pbf)28、Trp(Boc)25、Ile23、Ala18、Gln(Trt)17、Glu(OtBu)15、Tyr(tBu)13中的一个或多个，所述提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料包括氨基酸和/或肽片段，所述氨基酸和/或肽片段具有N端Fmoc保护且侧链保护。
在本发明中，缩写代表的物质如表1所示：
表1缩写对应的物质名称
Figure BDA0003319255700000041
Figure BDA0003319255700000051
在本发明中，如无特殊说明，所用原料为本领域技术人员熟知的市售产品。
在本发明中，所述索马鲁肽的结构式为：
H-His1-Aib2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Val10-Ser11-Ser12-Tyr13-Leu14-Glu15-Gly16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20[AEEA32-AEEA33-γ-Glu34-N-(17-carboxy-1-oxoheptadecyl)35]-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Val27-Arg28-Gly29-Arg30-Gly31-OH。
在本发明中，所述Fmoc-Gly31-树脂的制备方法优选包括以下步骤：
取起始树脂和Fmoc-Gly31-OH偶联(以下称为第一偶联)得到Fmoc-Gly31-树脂，所述起始树脂为CTC树脂或Wang树脂。
在本发明中，所述第一偶联优选为：将起始树脂、Fmoc-Gly31-OH、吡啶类催化剂、偶联试剂和溶剂混合，进行第一偶联，得到所述Fmoc-Gly31-树脂。
在本发明中，所述起始树脂优选为CTC树脂(二氯树脂)或Wang树脂(王树脂)。在本发明中，所述起始树脂的取代度优选为0.45～0.75mmol/g，更优选为0.5～0.7mmol/g，最优选为0.6mmol/g。
在本发明中，所述起始树脂在使用前优选还包括进行预处理，所述预处理优选包括：将起始树脂置于有机溶剂中进行溶胀后除去所述有机溶剂。在本发明中，所述有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或二氯甲烷。在本发明中，所述起始树脂和有机溶剂的体积比优选为1：(1～3)，更优选为1:2。在本发明中，所述溶胀的温度优选为室温；所述溶胀的时间优选为30～120min，更优选为50～100min。在本发明中，所述溶胀的目的是将初始树脂中多余的酸中和掉，通过溶胀可以使得树脂膨胀开，反应位点舒展，有利于初始树脂偶联氨基酸。在本发明中，除去所述有机溶剂的方式优选为抽滤。
在本发明中，所述Fmoc-Gly31-OH和所述起始树脂的摩尔比为(2～5):1，更优选为(1.8～3):1，最优选为2:1。
在本发明中，所述吡啶类催化剂优选为DMAP。在本发明中，所述起始树脂和吡啶类催化剂的摩尔比优选为1：(0.1～0.3)，更优选为1:0.2。
在本发明中，所述第一偶联用偶联试剂优选包括DIC/HoBt、DIC/HoAt、PyBOP/HoBt/DIPEA、HATU/DIPEA或HBTU/DIPEA。在本发明中，所述DIC/HoBt中DIC和HoBt的摩尔比优选为(1.5～3):(1.5～3)，更优选为(2～2.5):(2～2.5)。在本发明中，所述DIC/HoAt中DIC和HoAt的摩尔比优选为(1.5～3):(1.5～3)，更优选为(2～2.5):(2～2.5)。在本发明中，所述PyBOP/HoBt/DIPEA中PyBOP、HoBt和DIPEA的摩尔比优选为(1.5～3):(1.5～3):(1.5～6)，更优选为(2～2.5):(2～2.5):(2～5)。在本发明中，所述HATU/DIPEA中HATU和DIPEA的摩尔比优选为(1.4～2.85):(3～6)，更优选为(2～2.5):(4～5)。在本发明中，所述HBTU/DIPEA中HBTU和DIPEA的摩尔比优选为(1.4～2.85):(3～6)，更优选为(2～2.5):(4～5)。在本发明中，当所述偶联试剂中包括HoBt或HoAt时，所述起始树脂和HoBt的摩尔比优选为1:(2～5)，所述起始树脂和HoAt的摩尔比优选为1:(2～5)。当所述偶联试剂中包括HATU或HBTU时，所述起始树脂和HATU的摩尔比优选为1:(2～5)，所述起始树脂和HBTU的摩尔比优选为1:(2～5)。
在本发明中，所述溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺二氯甲烷(DCM)或四氢呋喃(THF)。本发明对于所述溶剂的用量没有特殊限定，能够将偶联试剂溶解即可。
在本发明中，所述起始树脂、Fmoc-Gly31-OH、吡啶类催化剂、偶联试剂和溶剂混合的顺优选为：将起始树脂、Fmoc-Gly31-OH、偶联剂中除DIPEA或DIC外的其他成分和溶剂第一混合，加入偶联剂中的DIPEA或DIC第二混合，加入吡啶类催化剂第三混合。在本发明中，所述第一混合优选在室温条件下进行；所述第一混合的时间优选为15～25min，更优选为20min。在本发明中，所述第二混合的温度优选为室温；所述第二混合的时间优选为8～12min，更优选为10min。在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。
在本发明中，所述第一偶联反应的温度优选为20～40℃，更优选为室温；所述第一偶联反应的时间优选为2～4h，更优选为2.5～3h。本发明在进行第一偶联反应时优选向第一偶联反应液中通入氮气，在本发明中，所述氮气的作为搅拌所述第一偶联反应液。
所述第一偶联反应后，本发明优选还包括将所述第一偶联反应进行后处理，得到未封端的Fmoc-Gly31-树脂。在本发明中，所述后处理包括：依次进行固液分离和洗涤。本发明将所述第一偶联反应的体系固液分离，本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如过滤。本发明将所得固体组分进行有机溶剂洗涤。在本发明中，所述有机溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺；所述有机溶剂洗涤的次数优选为4～6次，更优选为5次；所述有机溶剂洗涤的目的是洗去未参加反应的氨基酸和偶联试剂。
得到所述未封端的Fmoc-Gly31-树脂并封端后，得到所述Fmoc-Gly31-树脂。在本发明中，所述封端采用的封端试剂优选包括醋酸酐/N-甲基吗啉混合溶液或醋酸酐/N,N-二异丙基乙胺混合溶液。在本发明中，所述醋酸酐/N-甲基吗啉混合溶液和醋酸酐/N,N-二异丙基乙胺混合溶液中的溶剂独立地优选包括N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺。在本发明中，所述醋酸酐/N-甲基吗啉混合溶液中醋酸酐的浓度优选为5～30％，更优选为10～20％；所述N-甲基吗啉的浓度优选为3～16％，更优选为6～11％。在本发明中，所述醋酸酐/N,N-二异丙基乙胺混合溶液中醋酸酐的浓度优选为5～30％，更优选为10～20％；所述N,N-二异丙基乙胺的浓度优选为3～16％，更优选为6～11％。在本发明中，起始树脂的质量和封端试剂的体积之比优选为1g:(1～10)mL，更优选为1g:(5～6)mL。在本发明中，所述封端树脂的温度优选为室温；时间优选为2～4h，更优选为3h。
所述封端后，本发明优选还包括将所述封端得到的Fmoc-Gly31-树脂体系依次进行洗涤和干燥，得到所述Fmoc-Gly31-树脂。在本发明中，所述洗涤优选包括：依次进行酰胺类溶剂洗涤、第一醇类溶剂洗涤、二氯甲烷洗涤、第二醇类溶剂洗涤。在本发明中，所述酰胺类溶剂洗涤的次数优选为2～3次，所述酰胺类溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺。在本发明中，所述第一醇类溶剂洗涤的次数优选为2～3次，所述第一醇类溶剂优选包括甲醇或乙醇。在本发明中，所述二氯甲烷洗涤的次数优选为2～3次。在本发明中，所述第二醇类溶剂洗涤的次数优选为2～3次，所述第二醇类溶剂优选包括甲醇或乙醇。在本发明中，所述干燥优选为真空干燥，所述干燥的温度优选为20～35℃，更优选为25～30℃；时间优选为12～20h，更优选为12～15h。本发明优选将所述固体组分干燥至恒重即可。
在本发明中，所述式I为Fmoc-N(R)-AA1-OH，所述式I中R为Dmb或Hmb，更优选为Dmb。在本发明中，所述式I中AA1为Gly29、Leu26、Ala24、Ala19、Ala18、Gly16、Leu14中的一个或多个，更优选为Gly29、Leu26、Ala24、Ala19、Ala18和Gly16中的一个或多个，在本发明的具体实施例中，所述AA1为Gly16或、Gly16和Gly29。
在本发明中，所述式II为Fmoc-AA2-N(R)-AA1-OH，所述式II中R为Dmb或Hmb，更优选为Dmb。在本发明中，所述式II中AA1为Gly29、Leu26、Ala24、Ala19、Ala18、Gly16、Leu14中的一个或多个，更优选为Gly29、Leu26、Ala24、Ala19、Ala18和Gly16中的一个或多个。在本发明中，所述AA2为Arg(Pbf)28、Trp(Boc)25、Ile23、Ala18、Gln(Trt)17、Glu(OtBu)15、Tyr(tBu)13中的一个或多个，更优选为Arg(Pbf)28、Trp(Boc)25、Ile23、Ala18、Gln(Trt)17和Glu(OtBu)15中的一个或多个。
在本发明中，当提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料优选为氨基酸时，所述氨基酸为索马鲁肽序列中除Fmoc-Gly31-树脂和式I所示的氨基酸或式II所示的二肽片段所含氨基酸外其他的氨基酸。
在本发明中，所述提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料优选包括式III所示的五肽片段，所述式III优选为Fmoc-Lys(AEEA32-AEEA33-γ-Glu(OtBu)34-Octadecanedioic acidmono-tert-butyl ester35)-OH。
在本发明中，所述提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料优选包括式IV所示四肽片段或式V所示二肽片段，所述式IV为X-His(Trt)1-Aib2-Glu(OtBu)3-Gly4-OH，所述式V为X-His(Trt)1-Aib2-OH，所述式IV和式V中X为Boc、Fmoc、Trt、Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Alloc。
在本发明中，所述式IV优选为X-His(Trt)1-Aib2-Glu(OtBu)3-Gly4-OH，所述式IV中X优选为Boc、Fmoc、Trt、Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Alloc，更优选为Boc、Fmoc、Trt、Mtt、Mmt、Dde或ivDde，在本发明的具体实施例中，所述式IV具体为Boc-His(Trt)1-Aib2-Glu(OtBu)3-Gly4-OH。
在本发明中，所述式V优选为X-His(Trt)1-Aib2-OH，所述式V中X优选为Boc、Fmoc、Trt、Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Alloc，更优选为Boc、Fmoc、Trt、Mtt、Mmt、Dde或ivDde。
在本发明中，所述提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料优选包括式VI所示二肽片段，所述式VI为Fmoc-Thr(tBu)5-Phe6-OH。
在本发明中，所述偶联为按照索马鲁肽的序列，在所述Fmoc-Gly31-树脂上依次偶联上述原料，得到所述索马鲁肽全保护肽树脂。
本发明在所述Fmoc-Gly31-树脂上第二偶联Fmoc-Arg(pbf)30-OH，得到Fmoc-Arg(pbf)30-Gly31-树脂。
在本发明中，所述第二偶联优选为：将Fmoc-Gly31-树脂、Fmoc-Arg(pbf)30-OH、偶联试剂和溶剂混合，进行第二偶联，得到所述Fmoc-Arg(pbf)30-Gly31-树脂。
本发明优选对所述Fmoc-Gly31-树脂进行前处理，在本发明中，所述前处理优选包括：依次进行溶胀和脱除Fmoc保护基。在本发明中，所述溶胀用有机溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或二氯甲烷；所述Fmoc-Gly31-树脂和溶胀用有机溶剂的体积比优选为1：(1～3)，更优选为1:2；所述溶胀的温度优选为室温；所述溶胀的时间优选为30～120min，更优选为50～100min。溶胀后，本发明将溶胀后的体系进行固液分离，得到溶胀树脂后，将溶胀树脂脱除Fmoc保护基。
在本发明中，所述脱除Fmoc保护基采用的Fmoc脱保护试剂优选包括PIP、DBU或TEA；在本发明中，所述Fmoc脱保护试剂优选以Fmoc脱保护试剂溶液形式使用，所述Fmoc脱保护试剂溶液的体积百分浓度优选为15～25％，更优选为20％。在本发明中，所述Fmoc脱保护试剂溶液中的溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺。在本发明中，所述Fmoc-Gly31-树脂和Fmoc脱保护试剂的体积比优选为1：(1～3)，更优选为1:2。在本发明中，所述脱除Fmoc保护基的温度优选为室温；时间优选为15～30min，更优选为20min。
在本发明中，所述脱除Fmoc保护基优选通过茚三酮检测液检测判定反应终点，具体步骤如下：取所述脱除Fmoc保护基的反应液有机溶剂洗涤，得到去除反应液的反应物，在所述去除反应液的反应物中加入茚三酮检测液进行检测，当检测结果为阳性时，所述脱除保护基反应完毕，即Fmoc被脱除。在本发明中，所述茚三酮检测液包括独立分装的A溶液(苯酚/无水乙醇溶液)、B溶液(重蒸吡啶)和C溶液(茚三酮/无水乙醇溶液)。在本发明的实施例中，所述茚三酮检测液的加入量为A溶液、B溶液和C溶液各滴加两滴。在本发明中，所述有机溶剂洗涤优选为采用N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺进行洗涤；所述有机溶剂洗涤的次数优选为4～6次，更优选为5次。
在本发明中，所述Fmoc-Gly31-树脂和所述Fmoc-Arg(pbf)30-OH的摩尔比优选为1:(1.5～4)，更优选为1:2。
在本发明中，所述第二偶联用偶联试剂和溶剂的可选种类优选与所示第一偶联用偶联试剂和溶剂的可选种类相同，在此不再一一赘述。
在本发明中，当所述偶联试剂为DIC/HoBt时，所述Fmoc-Gly31-树脂、Fmoc-Arg(pbf)30-OH、偶联试剂和溶剂混合的顺优选为将Fmoc-Gly31-树脂、Fmoc-Arg(pbf)30-OH、HoBt和溶剂第四混合，加入DIC第五混合。在本发明中，所述第四混合优选在冰水浴条件下进行；所述第四混合的时间优选为15～25min，更优选为20min。在本发明中，所述第五混合的温度优选为室温；所述第五混合的时间优选为4～6min，更优选为5min。在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。
在本发明中，所述第二偶联反应的温度优选为20～40℃，更优选为室温；时间优选为2～4h，更优选为2.5～3h。在本发明中，所述第二偶联反应优选在保护气氛中进行，所述保护气氛优选为氮气。在本发明中，所述第二偶联反应优选通过茚三酮检测液检测判定反应终点，当检测结果为阴性时，所述第二偶联反应完毕。
所述第二偶联反应后，本发明优选还包括后处理，得到所述Fmoc-Arg(pbf)30-Gly31-树脂。在本发明中，所述后处理优选包括：依次进行固液分离、有机溶剂洗涤和干燥。本发明将所述第二偶联反应的体系固液分离，本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如过滤。本发明将固液分离所得固体组分进行有机溶剂洗涤，在本发明中，所述有机溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺；所述有机溶剂洗涤的次数优选为4～6次，更优选为5次；所述有机溶剂洗涤的目的是洗去未参加反应的氨基酸和偶联试剂或者脱保护试剂。在本发明中，所述干燥优选为真空干燥，所述干燥的温度优选为20～35℃，更优选为25～30℃；时间优选为12～20h，更优选为12～15h。本发明优选将所述固体组分干燥至恒重即可。
得到Fmoc-Arg(pbf)30-Gly31-树脂，本发明按照所述第二偶联的具体实施过程依次偶联上述所述索马鲁肽的原料，得到索马鲁肽全保护肽树脂。
在本发明中，当原料包括式I所示的氨基酸时，所述式I所示的氨基酸的脱保护的终点优选采用四氯苯醌检测反应终点。所述式I所示的氨基酸的偶联的终点优选采用四氯苯醌检测反应终点。
本发明提供了一种索马鲁肽的制备方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述制备方法制备得到索马鲁肽全保护肽树脂依次酸裂解和纯化，得到所述索马鲁肽。
在本发明中，所述酸裂解用酸性裂解液优选为TFA、EDT、Tis和水，所述TFA、EDT、Tis和水的体积比为(85～95):(2.5～6):(1.25～3):(1.25～3)，更优选为(88～93):(3～6):(1.5～2.8):(1.5～2.8)，最优选为90:5:2.5:2.5。
在本发明中，所述索马鲁肽全保护肽树脂的质量和酸性裂解液的体积之比优选为1g:(5～15)mL，更优选为1g:10mL。
在本发明中，所述酸裂解的温度优选为20～40℃，所述酸裂解的时间优选为2～4h。
所述裂解后，本发明优选还包括将所述酸裂解的体系进行后处理，得到索马鲁肽粗品。在本发明中，所述后处理优选包括：依次进行固液分离、沉降、有机溶剂洗涤和干燥。本发明对所述固液分离的具体实施过程没有特殊要求，本发明在所所述固液分离所得滤液组分中加入沉降剂进行沉降，在本发明中，所述沉降剂优选包括冰甲基叔丁基醚或冰乙醚；所述冰甲基叔丁基醚的温度优选为0～-20℃；所述冰乙醚的温度优选为0～-20℃；所述沉降剂和液体组分的体积比优选为(3～10):1，更优选为(5～7):1；所述沉降的时间优选为5～60min，更优选为10～15min。本发明优选对沉降得到的固体组分有机溶剂洗涤，在本发明中，所述洗涤用有机溶剂优选包括冰甲基叔丁基醚或冰乙醚；所述有机溶剂洗涤的次数优选为3～4次。本发明对所述有机溶剂洗涤后的固体组分干燥，在本发明中，所述干燥的方式优选为真空干燥；所述干燥的温度优选为20～35℃，更优选为25～30℃；时间优选为12～20h，更优选为12～15h。本发明优选将所述固体组分干燥至恒重即可。
得到索马鲁肽粗品后，本发明将所述索马鲁肽粗品纯化，得到索马鲁肽。
在本发明中，所述纯化优选为色谱柱纯化。在本发明中，所述色谱柱纯化优选为半制备液相色谱纯化，所述半制备液相色谱纯化的条件包括：
色谱柱优选为反相C18的DAC200；
流动相A优选为0.05～0.2v/v％TFA水溶液，更优选为0.1v/v％TFA水溶液；
流动相B优选为乙腈；
流动相A和流动相B的流速独立地优选为500～1000mL/min，更优选为700～800mL/min；
检测波长优选为220nm；
洗脱方式优选为梯度洗脱；
所述梯度系统的具体程序为：0～1h，流动相B的体积百分含量由20％匀速增加至60％，流动相A的体积百分含量由80％匀速降低至40％。
所述色谱柱纯化后，本发明优选还包括将所述色谱柱纯化得到的目标峰洗脱液(即纯化液)采用醋酸转盐后冻干，得到醋酸盐索马鲁肽。本发明对于所述醋酸的用量没有特殊限定，能够得到醋酸盐索马鲁肽即可。在本发明中，所述干燥的方式优选为冻干，本发明对于所述冻干的温度和时间没有特殊限定，采用本领域人员熟知的冻干温度和时间即可；在本发明的实施例中，所述冻干优选利用挂瓶冻干机进行。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
称取取代度为0.58mmol/g的Wang Resin 17.24g，加入到合成反应器中，加入DMF溶胀30min，，抽去DMF溶液；称取Fmoc-Gly31-OH 4.46g、HoBt 2.05g加入到合成反应器中，用DMF溶解，鼓氮气，加入DIC2.310ml，反应10min后，称取DMAP 0.366g加入到上述反应混合物中，继续反应3h，抽去反应液，用DMF洗涤树脂5次，用200ml醋酸酐/NMM/DMF封端3h，用DMF洗涤2次、MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次、MeOH洗涤2次，真空干燥至恒重，得到Fmoc-Gly31-WangResin 31.82g，测得取代度为0.31mmol/g。
称取取代度为0.31mmol/g的Fmoc-Gly31-Wang Resin 3.26g，加入到合成反应器中，用DMF溶胀60min，抽去DMF溶液，加入20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc，用DMF洗涤树脂5次，茚三酮检测液检测树脂，检测呈阳性，表示Fmoc被脱除。称取Fmoc-Arg(pbf)30-OH 1.32g、HoBt0.25g加入到合成反应器中，用DMF溶解，鼓氮气，加入DIC0.310ml，室温反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，如检测呈阴性，则表示反应完成，如检测呈阳性，则表示还需要继续反应。
重复上述脱Fmoc和各相应氨基酸的偶联步骤，按照索马鲁肽序列，依次偶联Fmoc-Gly29-OH、Fmoc-Arg(pbf)28-OH、Fmoc-Val27-OH、Fmoc-Leu26-OH、Fmoc-Trp(Boc)25-OH、Fmoc-Ala24-OH、Fmoc-Ile23-OH、Fmoc-Phe22-OH、Fmoc-Glu(OtBu)21-OH、Fmoc-Lys(AEEA32-AEEA33-γ-Glu(OtBu)34-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester35)-OH、Fmoc-Ala18-OH、Fmoc-Ala19-OH、Fmoc-Gln(Trt)17-OH、Fmoc-N(Dmb)-Gly16-OH、Fmoc-Glu(OtBu)15-OH、Fmoc-Leu14-OH、
Fmoc-Tyr(tBu)13-OH、Fmoc-Ser(tBu)12-OH、Fmoc-Ser(tBu)11-OH、Fmoc-Val10-OH、Fmoc-Asp(OtBu)9-OH、Fmoc-Ser(tBu)8-OH、Fmoc-Thr(tBu)7-OH、Fmoc-Phe6-OH、Fmoc-Thr(tBu)5-OH、Fmoc-Gly4-OH、Fmoc-Glu(OtBu)3-OH、Fmoc-Aib2-OH、Boc-His(Trt)1-OH。其中Boc-His(Trt)-OH采用HATU/DIEA体系缩合；Fmoc-N(Dmb)-Gly-OH脱保护和Fmoc-Glu(OtBu)21-OH缩合反应终点采用四氯苯醌检测反应终点，得到索马鲁肽全保护肽树脂，将索马鲁肽全保护肽树脂用DMF洗涤2次，甲醇洗涤3次，真空干燥至恒重，得到索马鲁肽全保护肽树脂6.51g，索马鲁肽全保护肽树脂收率：71.53％。
取索玛鲁肽全保护肽树脂加入100ml锥形瓶中，然后向锥形瓶加入冷冻的裂解液(TFA/EDT/Tis/H2O＝90/5/2.5/2.5)50ml，密封锥形瓶，磁力搅拌器搅拌，反应3.0h，过滤反应混合物并用少量裂解液洗涤滤饼，收集滤液，将滤液缓慢加入到400ml冷藏的甲基叔丁基醚中，有白色固体析出，离心，用冰甲基叔丁基醚洗涤白色固体3次，白色固体用真空干燥至恒重，得到索马鲁肽粗品，裂解结果见表2。
将所述索马鲁肽粗品采用半制备液相色谱仪进行纯化、转盐，收集目标峰的洗脱液，采用挂瓶冻干机冻干，得到索玛鲁肽醋酸盐。
其中，HPLC纯化的条件包括：色谱柱为反相C18的DAC200；检测波长为220nm；流动相A为0.1v/v％TFA水溶液；流动相B为乙腈；流动相A和流动相B的流速均为800mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度系统的具体程序为：0～1h，流动相B的体积百分含量由20％匀速增加至60％，流动相A的体积百分含量由80％匀速降低至40％。
实施例2
称取取代度为0.58mmol/g的Wang Resin 17.24g，加入到合成反应器中，加入DMF溶胀30min，，抽去DMF溶液；称取Fmoc-Gly31-OH 4.46g、HoBt 2.05g加入到合成反应器中，用DMF溶解，鼓氮气，加入DIC 2.310ml，反应10min后，称取DMAP 0.366g加入到上述反应混合物中，继续反应3h，抽去反应液，用DMF洗涤树脂5次，用200ml醋酸酐/NMM/DMF封端3h，用DMF洗涤2次、MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次、MeOH洗涤2次，真空干燥至恒重，得到Fmoc-Gly31-WangResin 31.82g，测得取代度为0.31mmol/g。
称取取代度为0.31mmol/g的Fmoc-Gly31-Wang Resin 3.23g，加入到合成反应器中，用DMF溶胀60min，抽去DMF溶液，加入20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc，用DMF洗涤树脂5次，茚三酮检测液检测树脂，检测呈阳性，表示Fmoc被脱除。称取Fmoc-Arg(pbf)30-OH 1.30g、HoBt0.27g加入到合成反应器中，用DMF溶解，鼓氮气，加入DIC 0.310ml，室温反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，如检测呈阴性，则表示反应完成，如检测呈阳性，则表示还需要继续反应。
重复上述脱Fmoc和各相应氨基酸的偶联步骤，按照索马鲁肽序列，依次偶联Fmoc-Gly29-OH、Fmoc-Arg(pbf)28-OH、Fmoc-Val27-OH、Fmoc-Leu26-OH、Fmoc-Trp(Boc)25-OH、Fmoc-Ala24-OH、Fmoc-Ile23-OH、Fmoc-Phe22-OH、Fmoc-Glu(OtBu)21-OH、Fmoc-Lys(AEEA32-AEEA33-γ-Glu(OtBu)34-Octadecanedioic acid mono-tert-butylester35)-OH、Fmoc-Ala18-OH、Fmoc-Ala19-OH、Fmoc-Gln(Trt)17-OH、Fmoc-N(Dmb)-Gly16-OH、Fmoc-Glu(OtBu)15-OH、Fmoc-Leu14-OH、Fmoc-Tyr(tBu)13-OH、Fmoc-Ser(tBu)12-OH、Fmoc-Ser(tBu)11-OH、Fmoc-Val10-OH、Fmoc-Asp(OtBu)9-OH、Fmoc-Ser(tBu)8-OH、Fmoc-Thr(tBu)7-OH、Fmoc-Phe6-OH、Fmoc-Thr(tBu)5-OH、Boc-His(Trt)1-Aib2-Glu(OtBu)3-Gly4-OH。
其中Boc-His(Trt)1-Aib2-Glu(OtBu)3-Gly4-OH采用HATU/DIEA体系缩合；Fmoc-N(Dmb)-Gly16-OH脱保护和Fmoc-Glu(OtBu)15-OH缩合反应终点采用四氯苯醌检测反应终点，将索马鲁肽全保护肽树脂用DMF洗涤2次，甲醇洗涤3次，真空干燥至恒重，得到索马鲁肽全保护肽树脂8.03g，收率：88.28％。
取索玛鲁肽全保护肽树脂加入100ml锥形瓶中，然后向锥形瓶加入冷冻的裂解液(TFA/EDT/Tis/H2O＝90/5/2.5/2.5)50ml，密封锥形瓶，磁力搅拌器搅拌，反应3.0h，过滤反应混合物并用少量裂解液洗涤滤饼，收集滤液，将滤液缓慢加入到400ml冷藏的甲基叔丁基醚中，有白色固体析出，离心，用冰甲基叔丁基醚洗涤白色固体3次，白色固体用真空干燥至恒重，得到索马鲁肽粗品，裂解结果见表2。
将所述索马鲁肽粗品采用半制备液相色谱仪进行纯化、转盐，收集目标峰的洗脱液，采用挂瓶冻干机冻干，得到索玛鲁肽醋酸盐。
其中，HPLC纯化的条件包括：色谱柱为反相C18的DAC200；检测波长为220nm；流动相A为0.1v/v％TFA水溶液；流动相B为乙腈；流动相A和流动相B的流速均为800mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度系统的具体程序为：0～1h，流动相B的体积百分含量由20％匀速增加至60％，流动相A的体积百分含量由80％匀速降低至40％。
实施例3
称取取代度为0.58mmol/g的Wang Resin 17.24g，加入到合成反应器中，加入DMF溶胀30min，，抽去DMF溶液；称取Fmoc-Gly31-OH 4.46g、HoBt 2.05g加入到合成反应器中，用DMF溶解，鼓氮气，加入DIC2.310ml，反应10min后，称取DMAP0.366g加入到上述反应混合物中，继续反应3h，抽去反应液，用DMF洗涤树脂5次，用200ml醋酸酐/NMM/DMF封端3h，用DMF洗涤2次、MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次、MeOH洗涤2次，真空干燥至恒重，得到Fmoc-Gly31-WangResin 31.82g，测得取代度为0.31mmol/g。
称取取代度为0.31mmol/g的Fmoc-Gly31-Wang Resin 3.21g，加入到合成反应器中，用DMF溶胀60min，抽去DMF溶液，加入20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc，用DMF洗涤树脂5次，茚三酮检测液检测树脂，检测呈阳性，表示Fmoc被脱除。称取Fmoc-Arg(pbf)30-OH 1.33g、HoBt0.30g加入到合成反应器中，用DMF溶解，鼓氮气，加入DIC 0.310ml，室温反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，如检测呈阴性，则表示反应完成，如检测呈阳性，则表示还需要继续反应。
重复上述脱Fmoc和各相应氨基酸的偶联步骤，按照索马鲁肽序列，依次偶联Fmoc-Gly29-OH、Fmoc-Arg(pbf)28-OH、Fmoc-Val27-OH、Fmoc-Leu26-OH、Fmoc-Trp(Boc)25-OH、Fmoc-Ala24-OH、Fmoc-Ile23-OH、Fmoc-Phe22-OH、Fmoc-Glu(OtBu)21-OH、Fmoc-Lys(AEEA32-AEEA33-γ-Glu(OtBu)34-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester35)-OH、Fmoc-Ala18-OH、Fmoc-Ala19-OH、Fmoc-Gln(Trt)17-OH、Fmoc-N(Dmb)-Gly16-OH、Fmoc-Glu(OtBu)15-OH、Fmoc-Leu14-OH、Fmoc-Tyr(tBu)13-OH、Fmoc-Ser(tBu)12-OH、Fmoc-Ser(tBu)11-OH、Fmoc-Val10-OH、Fmoc-Asp(OtBu)9-OH、Fmoc-Ser(tBu)8-OH、Fmoc-Thr(tBu)7-OH、Fmoc-Thr(tBu)5-Phe6-OH、Boc-His(Trt)1-Aib2-Glu(OtBu)3-Gly4-OH。
其中Fmoc-Thr(tBu)5-Phe6-OH、Boc-His(Trt)1-Aib2-Glu(OtBu)3-Gly4-OH采用HATU/DIEA体系缩合；Fmoc-N(Dmb)-Gly16-OH脱保护和Fmoc-Glu(OtBu)15-OH缩合反应终点采用四氯苯醌检测反应终点，将索马鲁肽全保护肽树脂用DMF洗涤2次，甲醇洗涤3次，真空干燥至恒重，得到索马鲁肽全保护肽树脂9.04g，收率：98.79％。
取索玛鲁肽全保护肽树脂加入100ml锥形瓶中，然后向锥形瓶加入冷冻的裂解液(TFA/EDT/Tis/H2O＝90/5/2.5/2.5)50ml，密封锥形瓶，磁力搅拌器搅拌，反应3.0h，过滤反应混合物并用少量裂解液洗涤滤饼，收集滤液，将滤液缓慢加入到400ml冷藏的甲基叔丁基醚中，有白色固体析出，离心，用冰甲基叔丁基醚洗涤白色固体3次，白色固体用真空干燥至恒重，得到索马鲁肽粗品，裂解结果见表2。
将所述索马鲁肽粗品采用半制备液相色谱仪进行纯化、转盐，收集目标峰的洗脱液，采用挂瓶冻干机冻干，得到索玛鲁肽醋酸盐。
其中，HPLC纯化的条件包括：色谱柱为反相C18的DAC200；检测波长为220nm；流动相A为0.1v/v％TFA水溶液；流动相B为乙腈；流动相A和流动相B的流速均为800mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度系统的具体程序为：0～1h，流动相B的体积百分含量由20％匀速增加至60％，流动相A的体积百分含量由80％匀速降低至40％。
实施例4
称取取代度为0.58mmol/g的Wang Resin 17.24g，加入到合成反应器中，加入DMF溶胀30min，，抽去DMF溶液；称取Fmoc-Gly31-OH 4.46g、HoBt 2.05g加入到合成反应器中，用DMF溶解，鼓氮气，加入DIC 2.310ml，反应10min后，称取DMAP 0.366g加入到上述反应混合物中，继续反应3h，抽去反应液，用DMF洗涤树脂5次，用200ml醋酸酐/NMM/DMF封端3h，用DMF洗涤2次、MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次、MeOH洗涤2次，真空干燥至恒重，得到Fmoc-Gly31-WangResin 31.82g，测得取代度为0.31mmol/g。
称取取代度为0.31mmol/g的Fmoc-Gly31-Wang Resin 3.18g，加入到合成反应器中，用DMF溶胀60min，抽去DMF溶液，加入20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc，用DMF洗涤树脂5次，茚三酮检测液检测树脂，检测呈阳性，表示Fmoc被脱除。称取Fmoc-Arg(pbf)30-OH 1.28g、HoBt0.29g加入到合成反应器中，用DMF溶解，鼓氮气，加入DIC 0.310ml，室温反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，如检测呈阴性，则表示反应完成，如检测呈阳性，则表示还需要继续反应。
重复上述脱Fmoc和各相应氨基酸的偶联步骤，按照索马鲁肽序列，依次偶联Fmoc-N(Dmb)-Gly29-OH、Fmoc-Arg(pbf)28-OH、Fmoc-Val27-OH、Fmoc-Leu26-OH、Fmoc-Trp(Boc)25-OH、Fmoc-Ala24-OH、Fmoc-Ile23-OH、Fmoc-Phe22-OH、Fmoc-Glu(OtBu)21-OH、Fmoc-Lys(AEEA32-AEEA33-γ-Glu(OtBu)34-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester35)-OH、Fmoc-Ala18-OH、Fmoc-Ala19-OH、Fmoc-Gln(Trt)17-OH、Fmoc-N(Dmb)-Gly16-OH、Fmoc-Glu(OtBu)15-OH、Fmoc-Leu14-OH、Fmoc-Tyr(tBu)13-OH、Fmoc-Ser(tBu)12-OH、Fmoc-Ser(tBu)11-OH、Fmoc-Val10-OH、Fmoc-Asp(OtBu)9-OH、Fmoc-Ser(tBu)8-OH、Fmoc-Thr(tBu)7-OH、Fmoc-Thr(tBu)5-Phe6-OH、Boc-His(Trt)1-Aib2-Glu(OtBu)3-Gly4-OH。
其中Fmoc-Thr(tBu)5-Phe6-OH、Boc-His(Trt)1-Aib2-Glu(OtBu)3-Gly4-OH采用HATU/DIEA体系缩合；Fmoc-N(Dmb)-Gly29-OH脱保护、Fmoc-N(Dmb)-Gly16-OH脱保护、Fmoc-Arg(pbf)28-OH缩合反应终点和Fmoc-Glu(OtBu)15-OH缩合反应终点采用四氯苯醌检测反应终点，将索马鲁肽全保护肽树脂用DMF洗涤2次，甲醇洗涤3次，真空干燥至恒重，得到索马鲁肽全保护肽树脂7.18g，收率：78.86％。
取索玛鲁肽全保护肽树脂加入100ml锥形瓶中，然后向锥形瓶加入冷冻的裂解液(TFA/EDT/Tis/H2O＝90/5/2.5/2.5)50ml，密封锥形瓶，磁力搅拌器搅拌，反应3.0h，过滤反应混合物并用少量裂解液洗涤滤饼，收集滤液，将滤液缓慢加入到400ml冷藏的甲基叔丁基醚中，有白色固体析出，离心，用冰甲基叔丁基醚洗涤白色固体3次，白色固体用真空干燥至恒重，得到索马鲁肽粗品，裂解结果见表2。
将所述索马鲁肽粗品采用半制备液相色谱仪进行纯化、转盐，收集目标峰的洗脱液，采用挂瓶冻干机冻干，得到索玛鲁肽醋酸盐。
其中，HPLC纯化的条件包括：色谱柱为反相C18的DAC200；检测波长为220nm；流动相A为0.1v/v％TFA水溶液；流动相B为乙腈；流动相A和流动相B的流速均为800mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度系统的具体程序为：0～1h，流动相B的体积百分含量由20％匀速增加至60％，流动相A的体积百分含量由80％匀速降低至40％。
实施例5
称取取代度为0.58mmol/g的Wang Resin 17.24g，加入到合成反应器中，加入DMF溶胀30min，，抽去DMF溶液；称取Fmoc-Gly31-OH 4.46g、HoBt 2.05g加入到合成反应器中，用DMF溶解，鼓氮气，加入DIC 2.310ml，反应10min后，称取DMAP 0.366g加入到上述反应混合物中，继续反应3h，抽去反应液，用DMF洗涤树脂5次，用200ml醋酸酐/NMM/DMF封端3h，用DMF洗涤2次、MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次、MeOH洗涤2次，真空干燥至恒重，得到Fmoc-Gly31-WangResin31.82g，测得取代度为0.31mmol/g。
称取取代度为0.31mmol/g的Fmoc-Gly31-Wang Resin 3.15g，加入到合成反应器中，用DMF溶胀60min，抽去DMF溶液，加入20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc，用DMF洗涤树脂5次，茚三酮检测液检测树脂，检测呈阳性，表示Fmoc被脱除。称取Fmoc-Arg(pbf)30-OH 1.33g、HoBt0.25g加入到合成反应器中，用DMF溶解，鼓氮气，加入DIC0.310ml，室温反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，如检测呈阴性，则表示反应完成，如检测呈阳性，则表示还需要继续反应。
重复上述脱Fmoc和各相应氨基酸的偶联步骤，按照索马鲁肽序列，依次偶联Fmoc-Gly29-OH、Fmoc-Arg(pbf)28-OH、Fmoc-Val27-OH、Fmoc-Leu26-OH、Fmoc-Trp(Boc)25-OH、Fmoc-Ala24-OH、Fmoc-Ile23-OH、Fmoc-Phe22-OH、Fmoc-Glu(OtBu)21-OH、Dde-Lys(Fmoc)-OH、
Fmoc-AEEA32-OH、Fmoc-AEEA33-OH、Fmoc-Glu-OtBu34、十八烷二酸单叔丁酯、Fmoc-Ala18-OH、Fmoc-Ala19-OH、Fmoc-Gln(Trt)17-OH、Fmoc-N(Dmb)-Gly16-OH、Fmoc-Glu(OtBu)15-OH、Fmoc-Leu14-OH、
Fmoc-Tyr(tBu)13-OH、Fmoc-Ser(tBu)12-OH、Fmoc-Ser(tBu)11-OH、Fmoc-Val10-OH、Fmoc-Asp(OtBu)9-OH、Fmoc-Ser(tBu)8-OH、Fmoc-Thr(tBu)7-OH、Fmoc-Phe6-OH、Fmoc-Thr(tBu)5-OH、Fmoc-Gly4-OH、Fmoc-Glu(OtBu)3-OH、Fmoc-Aib2-OH、Boc-His(Trt)1-OH。其中Boc-His(Trt)17-OH采用HATU/DIEA体系缩合；Fmoc-N(Dmb)-Gly16-OH脱保护反应终点采用四氯苯醌检测反应终点，得到索马鲁肽全保护肽树脂，将索马鲁肽全保护肽树脂用DMF洗涤2次，甲醇洗涤3次，真空干燥至恒重，得到索马鲁肽全保护肽树脂6.51g，索马鲁肽全保护肽树脂收率：71.53％。
取索玛鲁肽全保护肽树脂加入100ml锥形瓶中，然后向锥形瓶加入冷冻的裂解液(TFA/EDT/Tis/H2O＝90/5/2.5/2.5)50ml，密封锥形瓶，磁力搅拌器搅拌，反应3.0h，过滤反应混合物并用少量裂解液洗涤滤饼，收集滤液，将滤液缓慢加入到400ml冷藏的甲基叔丁基醚中，有白色固体析出，离心，用冰甲基叔丁基醚洗涤白色固体3次，白色固体用真空干燥至恒重，得到索马鲁肽粗品，裂解结果见表2。
将所述索马鲁肽粗品采用半制备液相色谱仪进行纯化、转盐，收集目标峰的洗脱液，采用挂瓶冻干机冻干，得到索玛鲁肽醋酸盐。
其中，HPLC纯化的条件包括：色谱柱为反相C18的DAC200；检测波长为220nm；流动相A为0.1v/v％TFA水溶液；流动相B为乙腈；流动相A和流动相B的流速均为800mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度系统的具体程序为：0～1h，流动相B的体积百分含量由20％匀速增加至60％，流动相A的体积百分含量由80％匀速降低至40％。
对比例1
称取取代度为0.58mmol/g的Wang Resin 17.24g，加入到合成反应器中，加入DMF溶胀30min，，抽去DMF溶液；称取Fmoc-Gly31-OH 4.46g、HoBt 2.05g加入到合成反应器中，用DMF溶解，鼓氮气，加入DIC2.310ml，反应10min后，称取DMAP 0.366g加入到上述反应混合物中，继续反应3h，抽去反应液，用DMF洗涤树脂5次，用200ml醋酸酐/NMM/DMF封端3h，用DMF洗涤2次、MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次、MeOH洗涤2次，真空干燥至恒重，得到Fmoc-Gly31-WangResin 31.82g，测得取代度为0.31mmol/g。
称取取代度为0.31mmol/g的Fmoc-Gly31-Wang Resin 3.20g，加入到合成反应器中，用DMF溶胀60min，抽去DMF溶液，加入20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc，用DMF洗涤树脂5次，茚三酮检测液检测树脂，检测呈阳性，表示Fmoc被脱除。称取Fmoc-Arg(pbf)30-OH 1.35g、HoBt0.30g加入到合成反应器中，用DMF溶解，鼓氮气，加入DIC 0.310ml，室温反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，如检测呈阴性，则表示反应完成，如检测呈阳性，则表示还需要继续反应。
重复上述脱Fmoc和各相应氨基酸的偶联步骤，按照索马鲁肽序列，依次偶联Fmoc-Gly29-OH、Fmoc-Arg(pbf)28-OH、Fmoc-Val27-OH、Fmoc-Leu26-OH、Fmoc-Trp(Boc)25-OH、Fmoc-Ala24-OH、Fmoc-Ile23-OH、Fmoc-Phe22-OH、Fmoc-Glu(OtBu)21-OH、Dde-Lys(Fmoc)-OH、
Fmoc-AEEA32-OH、Fmoc-AEEA33-OH、Fmoc-Glu-OtBu34、十八烷二酸单叔丁酯、Fmoc-Ala18-OH、Fmoc-Ala19-OH、Fmoc-Gln(Trt)17-OH、Fmoc-Glu(OtBu)15-OH、Fmoc-Gly16-OH、Fmoc-Leu14-OH、
Fmoc-Tyr(tBu)13-OH、Fmoc-Ser(tBu)12-OH、Fmoc-Ser(tBu)11-OH、Fmoc-Val10-OH、Fmoc-Asp(OtBu)9-OH、Fmoc-Ser(tBu)8-OH、Fmoc-Thr(tBu)7-OH、Fmoc-Phe6-OH、Fmoc-Thr(tBu)5-OH、Fmoc-Gly4-OH、Fmoc-Glu(OtBu)3-OH、Fmoc-Aib2-OH、Boc-His(Trt)1-OH。其中，其中脱除Dde采用2.0％水合肼/DMF溶液；Boc-His(Trt)17-OH采用HATU/DIEA体系缩合；得到索马鲁肽全保护肽树脂，将索马鲁肽全保护肽树脂用DMF洗涤2次，甲醇洗涤3次，真空干燥至恒重，得到索马鲁肽全保护肽树脂5.79g，索马鲁肽全保护肽树脂收率：63.60％。
取索玛鲁肽全保护肽树脂加入100ml锥形瓶中，然后向锥形瓶加入冷冻的裂解液(TFA/EDT/Tis/H2O＝90/5/2.5/2.5)50ml，密封锥形瓶，磁力搅拌器搅拌，反应3.0h，过滤反应混合物并用少量裂解液洗涤滤饼，收集滤液，将滤液缓慢加入到400ml冷藏的甲基叔丁基醚中，有白色固体析出，离心，用冰甲基叔丁基醚洗涤白色固体3次，白色固体用真空干燥至恒重，得到索马鲁肽粗品，裂解结果见表2。
将所述索马鲁肽粗品采用半制备液相色谱仪进行纯化、转盐，收集目标峰的洗脱液，采用挂瓶冻干机冻干，得到索玛鲁肽醋酸盐。
其中，HPLC纯化的条件包括：色谱柱为反相C18的DAC200；检测波长为220nm；流动相A为0.1v/v％TFA水溶液；流动相B为乙腈；流动相A和流动相B的流速均为800mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度系统的具体程序为：0～1h，流动相B的体积百分含量由20％匀速增加至60％，流动相A的体积百分含量由80％匀速降低至40％。
表2实施例1～6检测结果
Figure BDA0003319255700000221
由表2可知，本发明制备得到的索马鲁肽粗品收率和纯度高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种索马鲁肽全保护肽树脂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：按照索马鲁肽的序列，取Fmoc-Gly31-树脂，依次与式I所示的氨基酸或式II所示的二肽片段和提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料偶联，得到索马鲁肽全保护肽树脂，所述式I为Fmoc-N(R)-AA1-OH，所述式II为Fmoc-AA2-N(R)-AA1-OH，所述式I和式II中R为Dmb或Hmb，所述式I和式II中AA1为Gly29、Gly16中的一个或两个，所述AA2为Arg(Pbf)28、Glu(OtBu)15中的一个或两个，所述提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料包括氨基酸和/或肽片段，所述氨基酸和/或肽片段具有N端Fmoc保护且侧链保护；
所述提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料包括式IV所示四肽片段或式V所示二肽片段，所述式IV为X-His(Trt)1-Aib2-Glu(OtBu)3-Gly4-OH，所述式V为X-His(Trt)1-Aib2-OH，所述式IV和式V中X为Boc、Fmoc、Trt、Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Alloc。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料包括式III所示的五肽片段，所述式III为Fmoc-Lys(AEEA32-AEEA33-γ-Glu(OtBu)34-Octadecanedioic acidmono-tert-butyl ester35)-OH。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述提供所述索马鲁肽序列中剩余氨基酸的原料包括式VI所示二肽片段，所述式VI为Fmoc-Thr(tBu)5-Phe6-OH。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联在偶联试剂中进行，所述偶联试剂包括DIC/HoBt、DIC/HoAt、PyBOP/HoBt/DIPEA、HATU/DIPEA或HBTU/DIPEA。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Fomc-Gly31-树脂的制备方法包括以下步骤：
取起始树脂和Fmoc-Gly31-OH偶联得到Fomc-Gly31-树脂，所述起始树脂为CTC树脂或Wang树脂，所述起始树脂的取代度为0.45～0.75mmol/g。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Gly31-OH和所述起始树脂的摩尔比为(1.5～4):1。
7.一种索马鲁肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1～6任意一项所述制备方法得到的索马鲁肽全保护肽树脂依次酸裂解和纯化，得到所述索马鲁肽。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述酸裂解用酸性裂解液为TFA、EDT、Tis和水，所述TFA、EDT、Tis和水的体积比为(85～95):(2.5～6):(1.25～3):(1.25～3)；
所述酸裂解的温度为20～40℃，所述酸裂解的时间为2～4h。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述纯化得到纯化液，所述纯化后还包括取所述纯化液采用醋酸转盐，得到醋酸盐索马鲁肽。
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