CN110724188B - 一种pt141合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PT141合成方法,属于多肽合成技术领域。本发明的合成方法包括如下步骤(1)以Rink HMBA‑AM Resin和Fmoc‑Lys(Boc)‑OH为原料,制备Fmoc‑Lys(Boc)‑HMBA‑Am Resin;(2)在步骤(1)制得的Fmoc‑Lys(Boc)‑HMBA‑Am Resin上通过Fmoc固相合成法依次偶联保护基氨基酸,得到线性PT141全保护肽树脂;(3)将步骤(2)制得的线性PT141全保护肽树脂用裂解液裂解脱除氨基酸保护基,对所得产物进行环化处理,使得肽链在2位的Asp处与7位Lys处成环;(4)对步骤(3)所得环化产物进行甲酯化脱除HMBA‑Am Resin残基,而后将产物水解,经过纯化,冷冻干燥得PT141。本发明的方法相对其他固相方法收率更高,相对酶制剂方法成本较低,且易于操作,工艺较为简单。
Description
技术领域
本发明涉及一种PT141合成方法,属于多肽合成技术领域。
背景技术
PT141,即布雷默浪丹(Bremelanotide),是一种alpha-黑素细胞刺激激素类似物。由美国Palatin公司开发作为一种治疗性功能障碍的环肽类药物。PT141为人工合成的氮端乙酰化环七肽化合物,肽序为
Ac-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]-OH
其化学结构存在两处羧基,天冬氨酸侧链羧基和赖氨酸侧链氨基通过形成酰胺键成环,由于C端羧基的存在,直接液相环化产物不唯一,对合成工艺来说存在挑战。目前,合成PT141方法主要为固相合成法,以Fmoc-Asp(OAllyl)-OH和Fmoc-Lys(Alloc)-OH为原料进行合成,但是在合成过程中存在保护氨基酸和脱保护试剂昂贵以及采用HF裂解方式对设备要求较高,并且对环境污染也较严重的问题,同时产品收率也比较低。中国专利200710048824.6公开了一种采用Fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相合成方法,收率为17%。中国专利200610086841.4公开的PT-141的固相合成方法,收率为40%以下。
中国专利201510667256.2公开了一种分别合成Ac-Nle-Asp(COOH)-otBu和Boc-His(Trt)-D-Phe-Arg(pbf)-TrP(Boc)-Lys(IVDde)-HMBA-P的方法,该方法需要合成大量片断Ac-Nle-Asp(COOH)-otBu,同时脱除Lys保护基时需要使用水合肼等危险化合物。
中国专利201710619602.9使用酶制剂进行环化,对于反应环境条件控制要求比较严格,且酶制剂较昂贵。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供一种PT141合成方法,本发明的方法相对其他固相方法收率更高,相对酶制剂方法成本较低,且易于操作,工艺较为简单。
本发明的第一个目的是提供一种PT141合成方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)以Rink HMBA-Am Resin和Fmoc-Lys(Boc)-OH为原料,制备Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin;
(2)在步骤(1)制得的Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin上通过Fmoc固相合成法依次偶联保护基氨基酸,得到线性PT141全保护肽树脂;
(3)将步骤(2)制得的线性PT141全保护肽树脂用裂解液裂解脱除氨基酸保护基,对所得产物进行环化处理,使得肽链在2位的Asp处与7位Lys处成环;
(4)对步骤(3)所得环化产物进行甲酯化脱除HMBA-Am Resin残基,而后将产物水解,经过纯化,冷冻干燥得PT141。
进一步地,在步骤(2)中,脱Fmoc使用的试剂为15-25%的哌啶/DMF。
进一步地,在步骤(3)中,所述的裂解液包括85-95%三氟乙酸、4-6%苯甲硫醚、1-3%苯甲醚和2-4%1,2-乙二硫醇。
进一步地,所述的裂解液的添加量为6-10ml/g线性PT141全保护肽树脂,裂解时间为1-3h。
进一步地,在步骤(3)中,裂解后还包括采用DCM洗涤2-4遍,DMF洗涤5-7遍的步骤。
进一步地,在步骤(3)中,环化过程是在载体树脂上进行的,采用的缩合剂为HOBt、PyBoP或DIEA。
进一步地,在步骤(4)中,甲酯化所用的试剂为DIEA、MeOH和DMF按照1:1-3:4-6体积比配制而成。
进一步地,在步骤(4)中,水解是采用30-200mg/L的NaOH将溶液调节至碱性进行水解反应去除甲酯。
进一步地,在步骤(4)中,所述的纯化是采用高效液相色谱进行纯化,条件为:纯化:流动相:A相:0.5-1.5‰TFA;B相:乙腈;转盐:流动相:A相:1)40-60mmol/L的NH4Ac水溶液,2)0.3-0.5‰醋酸;B相:乙腈。
本发明的有益效果是:肽序直接偶联完成避免了片段合成,采用常规氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH为原料替代Fmoc-Asp(OAllyl)-OH和Fmoc-Lys(Alloc)-OH或Fmoc-Lys(IVDde)-OH等昂贵的原料,避免了氢化工艺或水合肼等危险化合物的使用。固相环化,酰胺键成环结构唯一。本发明的方法易于操作,工艺简单,产品纯度可达到99.3%,总收率55.0%,偏于工业化生产。
附图说明
图1为PT141产品的HPLC图;
图2为PT141产品的MS图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
本工艺中,“替代度”指的是单位量的树脂负载的物质的数量,单位为“mmol/g”。在文中出现的缩写代表的意义如下所示:
表1本发明相关名词解释
缩写 | 含义 |
Fmoc | 9-芴甲氧羰基 |
Boc | 叔丁氧羰基 |
Trt | 三苯甲基 |
HOBt | 1-羟基苯并三唑 |
Pbf | 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基 |
OtBu | 叔丁氧基 |
DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
DIC | N,N'-二异丙基碳二亚胺 |
TFA | 三氟乙酸 |
DBLK | 20%六氢吡啶/DMF溶液 |
HPLC | 高效液相色谱 |
Ac | 醋酸盐 |
DIEA | N,N-二异丙基乙胺 |
EDT | 1,2-乙二硫醇 |
实施例1:合成Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin
称取5mmol Rink HMBA-AM Resin倒入500mL反应柱中,(所需树脂重量(g)=合成规模(mmol)/Sub(mmol/g)),加入200mL DMF溶胀30min,抽干。加入DMF 100mL洗涤1min。
加入DBLK试剂(哌啶:DMF=1:4)进行脱帽处理2次,每次100mL,时间分别为5min和15min,两次脱帽之间用DMF洗涤一次,用量100mL洗涤1min。脱帽完毕后加入DMF洗涤5次,每次100mL洗涤1min。取少量树脂做茚三酮检测,树脂呈阳性。
茚三酮检测:取少许树脂置于小玻璃试管中,依次加入试剂a:5%茚三酮的无水乙醇溶液(w/v)、b:苯酚:无水乙醇溶液(4:1,w/v)、c:吡啶各2滴,105℃加热5分钟即成。若溶液及树脂呈蓝色或深蓝色则茚三酮检测为阳性;若溶液澄清,树脂透明无色则茚三酮检测为阴性。
称取7.026g Fmoc-Lys(Boc)-OH、2.432g HOBt至反应柱中,再加入100mL DMF和2.786mL DIC,氮气吹拂搅拌反应2h,取少量树脂做茚三酮检测,树脂呈阴性,抽干反应液。加入DMF洗涤3次,每次100mL洗涤1min。
加入无水甲醇收缩3次,每次100mL 10min,抽干,真空减压干燥8h,得到Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin。
实施例2:固相合成序列Ac-Nle-Asp(OtBu)-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin
称取5mmol Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin加入500mL反应柱中,加入200mL DMF溶涨30min,抽干。加入100mL DMF洗涤1min并抽干。
加入DBLK试剂(哌啶:DMF=1:4)进行脱帽处理2次,每次100mL,时间分别为5min和15min,两次脱帽之间用DMF洗涤一次,用量100mL洗涤1min。脱帽完毕后加入DMF洗涤5次,每次100mL洗涤1min。取少量树脂做茚三酮检测,树脂呈阳性。
称取7.899g Fmoc-Trp(Boc)-OH、2.432g HOBt至反应柱中,再加入100m L DMF和2.786mL DIC,氮气吹拂搅拌反应2h,取少量树脂做茚三酮检测,树脂呈阴性,抽干反应液。加入DMF洗涤3次,每次100mL洗涤1min。
重复上述偶联操作依次加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH进行偶联。
氨基酸偶联结束后,加入DBLK试剂(哌啶:DMF=1:4)进行脱帽处理2次,每次100mL,时间分别为5min和15min,两次脱帽之间用DMF洗涤一次,用量100mL洗涤1min。脱帽完毕后加入DMF洗涤5次,每次100mL洗涤1min。取少量树脂做茚三酮检测,树脂呈阳性。
加入乙酰化试剂(将11.2ml NMM与9.5ml醋酸酐加入500mL烧杯中,再加入100mlDMF搅匀)进行封闭实验,氮气吹拂搅拌反应30min,取少量树脂做茚三酮检测,树脂呈阴性,抽干反应液。加入DMF洗涤3次,每次100mL洗涤1min。
加入无水甲醇收缩3次,每次100mL 10min,抽干,真空减压干燥8h。
实施例3:裂解脱除氨基酸保护基,并对产物进行环化
将配制好且冰水浴降温处理过的150ml裂解液(三氟乙酸TFA:苯甲硫醚:乙二硫醇:苯甲醚=90:5:3:2)加入到抽干的肽树脂中,机械搅拌反应2h,过滤.使用DCM洗涤3遍,DMF洗涤6遍。取少量树脂做茚三酮检测,树脂呈阳性。称取2.432g HOBt至反应柱中,再加入100mL DMF和2.786mL DIC,氮气吹拂搅拌反应2h,取少量树脂做茚三酮检测,树脂呈阴性,抽干反应液。加入DMF洗涤3次,每次100mL洗涤1min。
实施例4:甲酯化、水解、纯化、冻干得到PT141
甲酯化(将产物从载体上去除):加入100ml甲酯化试剂(DIEA:MeOH:DMF=1:2:5),氮气吹拂搅拌反应2-4h,过滤反应液,保留滤液,用2倍体积的纯水稀释。过程中会有白色固体析出,加入适量的乙腈将析出物溶解。
水解(将上步甲酯化形成的C端甲酯去除,形成最终产物):将30-200mg/LNaOH水溶液缓慢滴入上述溶液中至碱性(pH=7.5-8.5)反应1-2h,高效液相色谱分析跟踪至水解完全。加入冰醋酸调pH至2-3,得到PT141粗品溶液。
纯化和冻干:粗肽溶液采用高效液相色谱进行纯化,纯化的条件为:第一步纯化:流动相:A相:1‰TFA(量取TFA约20mL,加水至约20L);B相:乙腈;第二步转盐:流动相:A相:1)50mmol/L的NH4Ac水溶液,2)0.4‰醋酸;B相:乙腈。收集纯度99.0%以上样品冻干。冷冻干燥得2.82gPT141,纯度99.3%,总收率55.0%。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (9)
1.一种PT141合成方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)以Rink HMBA-Am Resin和Fmoc-Lys(Boc)-OH为原料,制备Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-AmResin;
(2)在步骤(1)制得的Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin上通过Fmoc固相合成法依次偶联保护基氨基酸,得到线性PT141全保护肽树脂;
(3)将步骤(2)制得的线性PT141全保护肽树脂用裂解液裂解脱除氨基酸保护基,对所得产物进行环化处理,使得肽链在2位的Asp处与7位Lys处成环;
(4)对步骤(3)所得环化产物进行甲酯化脱除HMBA-Am Resin残基,而后将产物水解,经过纯化,冷冻干燥得PT141。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中,脱Fmoc使用的试剂为15-25%的哌啶/DMF。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(3)中,所述的裂解液包括85-95%三氟乙酸、4-6%苯甲硫醚、1-3%苯甲醚和2-4%1,2-乙二硫醇。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的裂解液的添加量为6-10ml/g线性PT141全保护肽树脂,裂解时间为1-3h。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(3)中,裂解后还包括采用DCM洗涤2-4遍,DMF洗涤5-7遍的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(3)中,环化过程是在载体树脂上进行的,采用的缩合剂为HOBt、PyBoP或DIEA。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(4)中,甲酯化所用的试剂为DIEA、MeOH和DMF按照1:1-3:4-6体积比配制而成。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(4)中,水解是采用30-200mg/L的NaOH将溶液调节至碱性进行水解反应去除甲酯。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(4)中,所述的纯化是采用高效液相色谱进行纯化,条件为:纯化:流动相:A相:0.5-1.5‰TFA;B相:乙腈;转盐:流动相:A相:1)40-60mmol/L的NH4Ac水溶液,2)0.3-0.5‰醋酸;B相:乙腈。
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