CN110724188B - 一种pt141合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种PT141合成方法，属于多肽合成技术领域。本发明的合成方法包括如下步骤(1)以Rink HMBA‑AM Resin和Fmoc‑Lys(Boc)‑OH为原料，制备Fmoc‑Lys(Boc)‑HMBA‑Am Resin；(2)在步骤(1)制得的Fmoc‑Lys(Boc)‑HMBA‑Am Resin上通过Fmoc固相合成法依次偶联保护基氨基酸，得到线性PT141全保护肽树脂；(3)将步骤(2)制得的线性PT141全保护肽树脂用裂解液裂解脱除氨基酸保护基，对所得产物进行环化处理，使得肽链在2位的Asp处与7位Lys处成环；(4)对步骤(3)所得环化产物进行甲酯化脱除HMBA‑Am Resin残基，而后将产物水解，经过纯化，冷冻干燥得PT141。本发明的方法相对其他固相方法收率更高，相对酶制剂方法成本较低，且易于操作，工艺较为简单。

Description

一种PT141合成方法
技术领域
本发明涉及一种PT141合成方法，属于多肽合成技术领域。
背景技术
PT141，即布雷默浪丹(Bremelanotide)，是一种alpha-黑素细胞刺激激素类似物。由美国Palatin公司开发作为一种治疗性功能障碍的环肽类药物。PT141为人工合成的氮端乙酰化环七肽化合物，肽序为
Ac-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]-OH
其化学结构存在两处羧基，天冬氨酸侧链羧基和赖氨酸侧链氨基通过形成酰胺键成环，由于C端羧基的存在，直接液相环化产物不唯一，对合成工艺来说存在挑战。目前，合成PT141方法主要为固相合成法，以Fmoc-Asp(OAllyl)-OH和Fmoc-Lys(Alloc)-OH为原料进行合成，但是在合成过程中存在保护氨基酸和脱保护试剂昂贵以及采用HF裂解方式对设备要求较高，并且对环境污染也较严重的问题，同时产品收率也比较低。中国专利200710048824.6公开了一种采用Fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相合成方法，收率为17％。中国专利200610086841.4公开的PT-141的固相合成方法，收率为40％以下。
中国专利201510667256.2公开了一种分别合成Ac-Nle-Asp(COOH)-otBu和Boc-His(Trt)-D-Phe-Arg(pbf)-TrP(Boc)-Lys(IVDde)-HMBA-P的方法，该方法需要合成大量片断Ac-Nle-Asp(COOH)-otBu，同时脱除Lys保护基时需要使用水合肼等危险化合物。
中国专利201710619602.9使用酶制剂进行环化，对于反应环境条件控制要求比较严格，且酶制剂较昂贵。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种PT141合成方法，本发明的方法相对其他固相方法收率更高，相对酶制剂方法成本较低，且易于操作，工艺较为简单。
本发明的第一个目的是提供一种PT141合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以Rink HMBA-Am Resin和Fmoc-Lys(Boc)-OH为原料，制备Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin；
(2)在步骤(1)制得的Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin上通过Fmoc固相合成法依次偶联保护基氨基酸，得到线性PT141全保护肽树脂；
(3)将步骤(2)制得的线性PT141全保护肽树脂用裂解液裂解脱除氨基酸保护基，对所得产物进行环化处理，使得肽链在2位的Asp处与7位Lys处成环；
(4)对步骤(3)所得环化产物进行甲酯化脱除HMBA-Am Resin残基，而后将产物水解，经过纯化，冷冻干燥得PT141。
进一步地，在步骤(2)中，脱Fmoc使用的试剂为15-25％的哌啶/DMF。
进一步地，在步骤(3)中，所述的裂解液包括85-95％三氟乙酸、4-6％苯甲硫醚、1-3％苯甲醚和2-4％1,2-乙二硫醇。
进一步地，所述的裂解液的添加量为6-10ml/g线性PT141全保护肽树脂，裂解时间为1-3h。
进一步地，在步骤(3)中，裂解后还包括采用DCM洗涤2-4遍，DMF洗涤5-7遍的步骤。
进一步地，在步骤(3)中，环化过程是在载体树脂上进行的，采用的缩合剂为HOBt、PyBoP或DIEA。
进一步地，在步骤(4)中，甲酯化所用的试剂为DIEA、MeOH和DMF按照1：1-3：4-6体积比配制而成。
进一步地，在步骤(4)中，水解是采用30-200mg/L的NaOH将溶液调节至碱性进行水解反应去除甲酯。
进一步地，在步骤(4)中，所述的纯化是采用高效液相色谱进行纯化，条件为：纯化：流动相：A相：0.5-1.5‰TFA；B相：乙腈；转盐：流动相：A相：1)40-60mmol/L的NH4Ac水溶液，2)0.3-0.5‰醋酸；B相：乙腈。
本发明的有益效果是：肽序直接偶联完成避免了片段合成，采用常规氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH为原料替代Fmoc-Asp(OAllyl)-OH和Fmoc-Lys(Alloc)-OH或Fmoc-Lys(IVDde)-OH等昂贵的原料，避免了氢化工艺或水合肼等危险化合物的使用。固相环化，酰胺键成环结构唯一。本发明的方法易于操作，工艺简单，产品纯度可达到99.3％，总收率55.0％，偏于工业化生产。
附图说明
图1为PT141产品的HPLC图；
图2为PT141产品的MS图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本工艺中，“替代度”指的是单位量的树脂负载的物质的数量，单位为“mmol/g”。在文中出现的缩写代表的意义如下所示：
表1本发明相关名词解释
缩写 含义
Fmoc 9-芴甲氧羰基
Boc 叔丁氧羰基
Trt 三苯甲基
HOBt 1-羟基苯并三唑
Pbf 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
OtBu 叔丁氧基
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DIC N,N'-二异丙基碳二亚胺
TFA 三氟乙酸
DBLK 20％六氢吡啶/DMF溶液
HPLC 高效液相色谱
Ac 醋酸盐
DIEA N,N-二异丙基乙胺
EDT 1,2-乙二硫醇
实施例1：合成Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin
称取5mmol Rink HMBA-AM Resin倒入500mL反应柱中，(所需树脂重量(g)＝合成规模(mmol)/Sub(mmol/g))，加入200mL DMF溶胀30min，抽干。加入DMF 100mL洗涤1min。
加入DBLK试剂(哌啶：DMF＝1：4)进行脱帽处理2次，每次100mL，时间分别为5min和15min，两次脱帽之间用DMF洗涤一次，用量100mL洗涤1min。脱帽完毕后加入DMF洗涤5次，每次100mL洗涤1min。取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性。
茚三酮检测：取少许树脂置于小玻璃试管中，依次加入试剂a：5％茚三酮的无水乙醇溶液(w/v)、b：苯酚：无水乙醇溶液(4:1，w/v)、c：吡啶各2滴，105℃加热5分钟即成。若溶液及树脂呈蓝色或深蓝色则茚三酮检测为阳性；若溶液澄清，树脂透明无色则茚三酮检测为阴性。
称取7.026g Fmoc-Lys(Boc)-OH、2.432g HOBt至反应柱中，再加入100mL DMF和2.786mL DIC，氮气吹拂搅拌反应2h，取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性，抽干反应液。加入DMF洗涤3次，每次100mL洗涤1min。
加入无水甲醇收缩3次，每次100mL 10min，抽干，真空减压干燥8h，得到Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin。
实施例2：固相合成序列Ac-Nle-Asp(OtBu)-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin
称取5mmol Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin加入500mL反应柱中，加入200mL DMF溶涨30min，抽干。加入100mL DMF洗涤1min并抽干。
加入DBLK试剂(哌啶：DMF＝1：4)进行脱帽处理2次，每次100mL，时间分别为5min和15min，两次脱帽之间用DMF洗涤一次，用量100mL洗涤1min。脱帽完毕后加入DMF洗涤5次，每次100mL洗涤1min。取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性。
称取7.899g Fmoc-Trp(Boc)-OH、2.432g HOBt至反应柱中，再加入100m L DMF和2.786mL DIC，氮气吹拂搅拌反应2h，取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性，抽干反应液。加入DMF洗涤3次，每次100mL洗涤1min。
重复上述偶联操作依次加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH进行偶联。
氨基酸偶联结束后，加入DBLK试剂(哌啶：DMF＝1：4)进行脱帽处理2次，每次100mL，时间分别为5min和15min，两次脱帽之间用DMF洗涤一次，用量100mL洗涤1min。脱帽完毕后加入DMF洗涤5次，每次100mL洗涤1min。取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性。
加入乙酰化试剂(将11.2ml NMM与9.5ml醋酸酐加入500mL烧杯中，再加入100mlDMF搅匀)进行封闭实验，氮气吹拂搅拌反应30min，取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性，抽干反应液。加入DMF洗涤3次，每次100mL洗涤1min。
加入无水甲醇收缩3次，每次100mL 10min，抽干，真空减压干燥8h。
实施例3：裂解脱除氨基酸保护基，并对产物进行环化
将配制好且冰水浴降温处理过的150ml裂解液(三氟乙酸TFA：苯甲硫醚：乙二硫醇：苯甲醚＝90：5：3：2)加入到抽干的肽树脂中，机械搅拌反应2h，过滤.使用DCM洗涤3遍，DMF洗涤6遍。取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性。称取2.432g HOBt至反应柱中，再加入100mL DMF和2.786mL DIC，氮气吹拂搅拌反应2h，取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性，抽干反应液。加入DMF洗涤3次，每次100mL洗涤1min。
实施例4：甲酯化、水解、纯化、冻干得到PT141
甲酯化(将产物从载体上去除)：加入100ml甲酯化试剂(DIEA：MeOH：DMF＝1：2：5)，氮气吹拂搅拌反应2-4h，过滤反应液，保留滤液，用2倍体积的纯水稀释。过程中会有白色固体析出，加入适量的乙腈将析出物溶解。
水解(将上步甲酯化形成的C端甲酯去除，形成最终产物)：将30-200mg/LNaOH水溶液缓慢滴入上述溶液中至碱性(pH＝7.5-8.5)反应1-2h，高效液相色谱分析跟踪至水解完全。加入冰醋酸调pH至2-3，得到PT141粗品溶液。
纯化和冻干：粗肽溶液采用高效液相色谱进行纯化，纯化的条件为：第一步纯化：流动相：A相：1‰TFA(量取TFA约20mL，加水至约20L)；B相：乙腈；第二步转盐：流动相：A相：1)50mmol/L的NH4Ac水溶液，2)0.4‰醋酸；B相：乙腈。收集纯度99.0％以上样品冻干。冷冻干燥得2.82gPT141，纯度99.3％，总收率55.0％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (9)

1.一种PT141合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以Rink HMBA-Am Resin和Fmoc-Lys(Boc)-OH为原料，制备Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-AmResin；
(2)在步骤(1)制得的Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin上通过Fmoc固相合成法依次偶联保护基氨基酸，得到线性PT141全保护肽树脂；
(3)将步骤(2)制得的线性PT141全保护肽树脂用裂解液裂解脱除氨基酸保护基，对所得产物进行环化处理，使得肽链在2位的Asp处与7位Lys处成环；
(4)对步骤(3)所得环化产物进行甲酯化脱除HMBA-Am Resin残基，而后将产物水解，经过纯化，冷冻干燥得PT141。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，脱Fmoc使用的试剂为15-25％的哌啶/DMF。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述的裂解液包括85-95％三氟乙酸、4-6％苯甲硫醚、1-3％苯甲醚和2-4％1,2-乙二硫醇。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的裂解液的添加量为6-10ml/g线性PT141全保护肽树脂，裂解时间为1-3h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，裂解后还包括采用DCM洗涤2-4遍，DMF洗涤5-7遍的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，环化过程是在载体树脂上进行的，采用的缩合剂为HOBt、PyBoP或DIEA。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，甲酯化所用的试剂为DIEA、MeOH和DMF按照1：1-3：4-6体积比配制而成。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，水解是采用30-200mg/L的NaOH将溶液调节至碱性进行水解反应去除甲酯。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述的纯化是采用高效液相色谱进行纯化，条件为：纯化：流动相：A相：0.5-1.5‰TFA；B相：乙腈；转盐：流动相：A相：1)40-60mmol/L的NH4Ac水溶液，2)0.3-0.5‰醋酸；B相：乙腈。
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