CN108218980B - 一种胸腺法新的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种胸腺法新的合成方法，采用先三段(片段1～8、片段9～18和片段19～28)分别合成，再片段间进行缩合的方法。本发明的合成方法可以有效的提高粗品的纯度，降低杂质含量，使之易于纯化，从而降低成本，更加适合于工业化生产。

Description

一种胸腺法新的合成方法
技术领域
本发明属医药技术领域，涉及一种胸腺法新的合成方法。
背景技术
胸腺法新，曾用名胸腺素α1、胸腺肽α1，是一种新型免疫调节因子，1997年由意大利赛生(Sciclone)公司开发上市，商品名称“日达仙”(Zadaxin)，临床上应用胸腺法新提高T细胞的免疫功能，治疗病毒性肝炎和延缓某些老年病的发生与发展。另外，胸腺法新还有抗感染、抗病毒和抗肿瘤的功效，尤其对癌症的免疫性治疗也具有一定的作用。
目前胸腺法新的合成方式主要有两种，一种为Boc策略，一种为Fmoc策略，Boc策略由于用到剧毒的HF，现在已经较少使用。关于Fmoc策略有较多的报道，如《天津药学》2001年第13卷第3期《Fmoc新型固相法合成胸腺素α1及其反应途径》描述了以HMP树脂为载体，以DCC-HOBT为耦合剂合成胸腺法新的方法；《化工学报》2004年第55卷第2期《胸腺素α1的DIC固相化学合成与鉴定》描述了以王树脂为载体，以DIC-HOBT为耦合剂合成胸腺法新的方法；专利CN101104638A描述了以Fmoc-RinkAmideMBHA树脂和Fmoc-Asp-X合成胸腺法新的方法；专利CN102199205A描述了以羟基官能团树脂为载体，以DIC-HOBT为耦合剂合成胸腺法新的方法。
目前合成工艺中存在以下问题：首先，在多肽序列的某些氨基酸残基处，经多次的缩合反应会引起侧链反应；其次，随着肽段的延伸，其溶解性降低，可能形成分子内的折叠结构，即存在所谓“困难序列”，使氨基酸缩合反应很难进行彻底，而且脱除氨基保护基团Fmoc也很困难。这些问题都将导致副产物不断累积，使得在最终的粗品中存在大量的缺失肽及空心肽，目标产物肽收率低，并且这些杂质与目标肽在结构上很相似，难以纯化。
本发明采用分段合成的策略，可以有效改善或解决上述问题，缩短了合成周期、提高了粗品的纯度，更有利于工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胸腺法新的合成方法，采用先三段(片段1～8、片段9～18和片段19～28)分别合成，再片段间进行缩合的方法。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究，最终获得了如下技术方案：
一种胸腺法新的合成方法，采用先三段(片段1～8、片段9～18和片段19～28)分别合成，再片段间进行缩合的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)将Fmoc-Asn(Trt)-OH和替代值为0.3mmol/g～0.8mmol/g的2-氯三苯甲基(CTC)树脂在DMF溶液中混合，加入DIEA溶液，经酯化反应得到Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂；
(2)将Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂和体积比10％-50％的哌啶DMF溶液组成的脱保护液混合，得到H2N-Asn(Trt)-CTC树脂，将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和H2N-Asn(Trt)-CTC树脂耦合，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-CTC树脂，重复以上步骤，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-CTC(片段1-8)树脂；将Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-CTC(片段1-8)树脂加入10％-50％哌啶/DMF溶液分别脱Fmoc保护基10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂。
(3)将Fmoc-Lys(Boc)-OH和替代值为0.3mmol/g～0.8mmol/g的2-氯三苯甲基(CTC)树脂混合，经酯化反应得到Fmoc-Lys(Boc)-CTC树脂；
(4)将Fmoc-Lys(Boc)-CTC树脂和体积比10％-50％的哌啶DMF溶液组成的脱保护液混合，得到H2N-Lys(Boc)-CTC树脂，将Fmoc-Lys(Boc)-OH和H2N-Lys(Boc)-CTC树脂耦合，得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-CTC树脂，重复以上步骤，得到Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-CTC(片段9-18)树脂；将Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-CTC(片段9-18)树脂加入10％-50％哌啶/DMF溶液分别脱Fmoc保护基10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂。
(5)将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和替代值为0.3mmol/g～0.8mmol/g的2-氯三苯甲基(CTC)树脂混合，经酯化反应得到Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂；
(6)将Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂和体积比10％-50％的哌啶DMF溶液组成的脱保护液混合，得到H2N-Glu(OtBu)-CTC树脂，将Fmoc-Ser(tBu)-OH和H2N-Glu(OtBu)-CTC树脂耦合，得到Fmoc-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-CTC树脂，重复以上步骤，得到Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-CTC(片段19-28)树脂；
(7)将片段19-28树脂，加入10％-50％哌啶DMF溶液分别脱保护10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂，使用乙酸酐和有机碱对片段19-28N末端氨基乙酰化得到Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu-CTC(片段Ac-19-28)树脂；
(8)用含5％TFA的DCM溶液将步骤(2)、步骤(4)和步骤(7)中合成的带侧链保护基的肽片段从树脂上切落，得到H2N-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OH(片段1-8)，H2N-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH(片段9-18)，Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-OH(片段19-28)；
(9)片段合成选用HBTU、HATU或TBTU中的一种，HOBT、HOAT或6-Cl-HOBT中的一种，DIEA或NMM中的一种，即3种试剂的组合作为缩合试剂，带保护基的氨基酸的用量是1.5～2.5倍量，先将片段9-18用V(DMF)/V(DCM)等于3.0的溶剂溶解，后加入等摩尔量的HBTU、HATU或TBTU中的一种和HOBT、HOAT或6-Cl-HOBT中的一种，待溶解后滴加2倍摩尔量的DIEA或NMM中的一种，30分钟后将反应溶液倒入到用NMP溶解的片段1-8溶液中，反应完全后得到片段1-18，以同样的方法得到多肽1-28；
(10)向多肽1-28中加入切割试剂A、B或C中的一种，脱去保护基后加入冰乙醚沉淀，过滤，冰乙醚洗涤，减压干燥得胸腺法新粗品，其中A为TFA、茴香硫醚、水、苯酚和EDT组成的混合溶液，其体积比为82.5：5：5：5：2.5；B为TFA、茴香硫醚、茴香醚和EDT组成的混合溶液，其体积比为90:5:3:2；C为TFA、Tis和水组成的混合溶液，其体积比为95：2.5：2.5。
所述的脱保护液优选为体积比20％的哌啶DMF溶液。
所述的步骤(7)中有机碱优选为吡啶、NMM或DIEA中的一种，乙酸酐摩尔量为树脂摩尔量的5～10倍，有机碱摩尔量为树脂摩尔量的1～5倍。
所述的步骤(9)中的缩合试剂组合优选为HBTU、HOBt和DIEA。
所述的步骤(10)中的切割试剂优选为C。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
常规方法很难克服困难序列，所得粗肽纯度较差，且主峰前后的杂质较多，不易纯化；而采用本发明的工艺提高了粗肽的纯度，而且杂峰减少，特别是影响分离纯化的主峰前后杂峰明显降低，使之易于纯化，从而降低了生产成本，更有利于工业化生产。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
本发明所使用的缩写的含义见于下表：
Fmoc 9-芴甲氧羰基
DMAP 二甲氨基吡啶
DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
HATU 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HBTU O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTU O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
HOBT 1-羟基苯并三氮唑
HOAT 1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑
6-Cl-HOBT 6-氯羟基苯并三氮唑
DIEA N,N-二异丙基乙胺
NMM N-甲基吗啡啉
Ac<sub>2</sub>O 乙酸酐
TFA 三氟乙酸
Tis 三异丙基硅烷
EDT 1,2-乙二硫醇
Boc 叔丁氧羰基
tBu 叔丁基
OtBu 氧叔丁基
Trt 三苯甲基
HMP 对苄氧苯甲醇
DCM 二氯甲烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
NMP N-甲基吡咯烷酮
实施例1
1)Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂的合成
称取替代值为0.3mmol/g～0.8mmol/g的CTC树脂10g用100ml DCM溶胀2～4小时后抽干，加入3.0当量的Fmoc-Asn(Trt)-OH 9.0g、3.6当量的DIEA 3.0ml、100ml DMF溶液，室温反应2～4小时，抽干反应液，用DMF和甲醇洗涤树脂，取约0.2g树脂测替代值，替代值为：0.41mmol/g。剩余树脂加入21ml甲醇和100ml DMF溶液封闭1小时，抽干反应溶液，用DMF洗涤树脂。
2)耦合片段1-8树脂
将Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂加入20％哌啶/DMF溶液分别脱Fmoc保护基10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂，称取3.0当量的Fmoc-Glu(OtBu)-OH 5.2g，3.0当量的HBTU 4.7g，3.0当量的HOBT 1.7g，用100ml DMF溶解，冰浴下加入6.0当量的DIEA 4.1ml活化，活化后加入多肽固相合成管中，20℃～30℃反应1.5h～4.5h，以茚三酮显色反应作为反应终点的判断依据，抽干反应液，DMF洗涤树脂，重复以上操作，分别依次耦合Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-CTC(片段1-8)树脂。将Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-CTC(片段1-8)树脂加入20％哌啶/DMF溶液分别脱Fmoc保护基10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂。
3)Fmoc-Lys(Boc)-CTC树脂的合成
称取替代值为0.3mmol/g～0.8mmol/g的CTC树脂10g用100ml DCM溶胀2～4小时后抽干，加入3.0当量的Fmoc-Lys(Boc)-OH 7.0g、3.6当量的DIEA 3.0ml、100ml DMF溶液，室温反应2～4小时，抽干反应液，用DMF和甲醇分别洗涤树脂，取约0.2g树脂测替代值，替代值为：0.39mmol/g，剩余树脂加入21ml甲醇和100mlDMF溶液封闭1小时，抽干反应溶液，用DMF洗涤树脂。
4)耦合片段9-18树脂
将Fmoc-Lys(Boc)-CTC树脂加入20％哌啶/DMF溶液分别脱保护10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂，得到H2N-Lys(Boc)-CTC树脂。称取3.0当量的Fmoc-Lys(Boc)-OH 5.5g，3.0当量的HBTU 4.4g、3.0当量的HOBT 1.6g，用100mlDMF溶解，冰浴下加入6.0当量DIEA 3.9ml活化，活化后加入反应器，20℃～30℃反应1.5h～4.5h，以茚三酮显色反应作为反应终点的判断依据，抽干反应液，DMF洗涤树脂，重复以上操作，依次耦合Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH，得到Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-CTC(片段9-18)树脂。将Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-CTC(片段9-18)树脂加入20％哌啶/DMF溶液分别脱Fmoc保护基10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂。
5)Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂的合成
称取替代值为0.3mmol/g～0.8mmol/g的CTC树脂10g用100ml DCM溶胀2～4小时后抽干，加入3.0当量的Fmoc-Glu(OtBu)-OH 6.4g、3.6当量的DIEA 3.0ml、100ml DMF溶液，室温反应2～4小时，抽干反应液，用DMF和甲醇分别洗涤树脂，取约0.2g树脂测替代值，替代值为：0.40mmol/g。剩余树脂加入21ml甲醇和100ml DMF溶液封闭1小时，抽干反应溶液，用DMF洗涤树脂。
6)耦合片段19-28树脂
将Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂加入20％哌啶/DMF溶液分别脱保护10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂，得到H2N-Glu(OtBu)-CTC树脂。称取3.0当量的Fmoc-Ser(tBu)-OH 4.6g，3.0当量的HBTU 4.5g、3.0当量的HOBT 1.6g用100ml DMF溶解，冰浴下加入6.0当量DIEA 4.0ml活化，活化后加入反应器，20℃～30℃反应1.5h～4.5h，以茚三酮显色反应作为反应终点的判断依据，抽干反应液，DMF洗涤树脂，重复以上操作，依次耦合Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，得到Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-CTC(片段19-28)树脂。
7)合成片段Ac-19-28树脂
将片段19-28树脂，加入20％哌啶/DMF溶液分别脱保护10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂，用7.07ml乙酸酐和5.36ml DIEA、100ml DMF封闭2～4h，用DMF洗涤树脂，甲醇收缩树脂，干燥至恒重。
8)合成片段1-8、9-18、Ac-19-28
冰浴条件下，将树脂倒入含5％TFA的DCM溶液120ml中，磁力搅拌10分钟，用漏斗抽滤，收集滤液，减压蒸馏，将烧瓶内剩余溶液倒入200ml冰水中析出白色沉淀物，静置30min，过滤，滤饼用冰水洗涤，再用正己烷洗涤，收集滤饼减压干燥至衡重，得到H2N-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OH(片段1-8)5.5g，同样步骤操作得到H2N-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH(片段9-18)6.5g和Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-OH(片段19-28)5.2g。
9)多肽1-28合成
片段合成选用HBTU/HOBt/DIEA的组合作为缩合试剂，带保护基的氨基酸的用量是1.5～2.5倍量。先将片段9-18用V(DMF)/V(DCM)等于3.0的溶剂溶解，后加入等摩尔量的HOBt和HBTU，待溶解后滴加两倍摩尔量的DIEA，30分钟后将反应溶液倒入到用NMP溶解的片段1-8溶液中。用HPLC或TLC来判断缩合的程度，反应完全后得到片段1-18，以同样的方法得到多肽1-28，用DMF洗涤树脂，甲醇收缩树脂，干燥至恒重，得多肽1-28。
10)粗品合成
将12g多肽1-28加入圆底烧瓶，冰浴下加入预冻的切割液120ml(TFA:H2O:Tis＝95:2.5:2.5)，搅拌反应2～3h，然后加入到1.2L的冰乙醚中沉淀，过滤，冰乙醚洗涤，减压干燥得胸腺法新粗品8.4g，粗品主峰纯度71.3％。
实施例2
1)Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂的合成
同实施例1。
2)耦合片段1-8树脂
将Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂加入10％哌啶/DMF溶液分别脱Fmoc保护基10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂，称取3.0当量的Fmoc-Glu(OtBu)-OH 5.2g，3.0当量的HBTU 4.7g，3.0当量的HOBT 1.7g，用100ml DMF溶解，冰浴下加入6.0当量的DIEA 4.1ml活化，活化后加入多肽固相合成管中，20℃～30℃反应1.5h～4.5h，以茚三酮显色反应作为反应终点的判断依据，抽干反应液，DMF洗涤树脂，重复以上操作，分别依次耦合Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-CTC(片段1-8)树脂。将Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-CTC(片段1-8)树脂加入10％哌啶/DMF溶液分别脱Fmoc保护基10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂。
3)Fmoc-Lys(Boc)-CTC树脂的合成
同实施例1。
4)耦合片段9-18树脂
将Fmoc-Lys(Boc)-CTC树脂加入10％哌啶/DMF溶液分别脱保护10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂，得到H2N-Lys(Boc)-CTC树脂。称取3.0当量的Fmoc-Lys(Boc)-OH 5.5g，3.0当量的HBTU 4.4g、3.0当量的HOBT 1.6g，用100mlDMF溶解，冰浴下加入6.0当量DIEA 3.9ml活化，活化后加入反应器，20℃～30℃反应1.5h～4.5h，以茚三酮显色反应作为反应终点的判断依据，抽干反应液，DMF洗涤树脂，重复以上操作，依次耦合Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH，得到Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-CTC(片段9-18)树脂。将Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-CTC(片段9-18)树脂加入10％哌啶/DMF溶液分别脱Fmoc保护基10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂。
5)Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂的合成
同实施例1。
6)耦合片段19-28树脂
将Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂加入10％哌啶/DMF溶液分别脱保护10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂，得到H2N-Glu(OtBu)-CTC树脂。称取3.0当量的Fmoc-Ser(tBu)-OH 4.6g，3.0当量的HBTU 4.5g、3.0当量的HOBT 1.6g用100ml DMF溶解，冰浴下加入6.0当量DIEA 4.0ml活化，活化后加入反应器，20℃～30℃反应1.5h～4.5h，以茚三酮显色反应作为反应终点的判断依据，抽干反应液，DMF洗涤树脂，重复以上操作，依次耦合Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，得到Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-CTC(片段19-28)树脂。
7)合成片段Ac-19-28树脂
将片段19-28树脂，加入10％哌啶/DMF溶液分别脱保护10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂，用10.68ml乙酸酐和5.32ml DIEA、100ml DMF封闭2～4h，用DMF洗涤树脂，甲醇收缩树脂，干燥至恒重。
8)合成片段1-8、9-18、Ac-19-28
同实施例1。
9)多肽1-28合成
同实施例1。
10)粗品合成
将12g多肽1-28加入圆底烧瓶，冰浴下加入预冻的切割液120ml(TFA、茴香硫醚、水、苯酚和EDT组成的混合溶液，其体积比为82.5：5：5：5：2.5)，搅拌反应2～3h，然后加入到1.2L的冰乙醚中沉淀，过滤，冰乙醚洗涤，减压干燥得胸腺法新粗品7.9g，粗品主峰纯度67.1％。
实施例3
1)Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂的合成
同实施例1。
2)耦合片段1-8树脂
将Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂加入50％哌啶/DMF溶液分别脱Fmoc保护基10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂，称取3.0当量的Fmoc-Glu(OtBu)-OH 5.2g，3.0当量的HBTU 4.7g，3.0当量的HOBT 1.7g，用100ml DMF溶解，冰浴下加入6.0当量的DIEA 4.1ml活化，活化后加入多肽固相合成管中，20℃～30℃反应1.5h～4.5h，以茚三酮显色反应作为反应终点的判断依据，抽干反应液，DMF洗涤树脂，重复以上操作，分别依次耦合Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-CTC(片段1-8)树脂。将Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-CTC(片段1-8)树脂加入50％哌啶/DMF溶液分别脱Fmoc保护基10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂。
3)Fmoc-Lys(Boc)-CTC树脂的合成
同实施例1。
4)耦合片段9-18树脂
将Fmoc-Lys(Boc)-CTC树脂加入50％哌啶/DMF溶液分别脱保护10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂，得到H2N-Lys(Boc)-CTC树脂。称取3.0当量的Fmoc-Lys(Boc)-OH 5.5g，3.0当量的HBTU 4.4g、3.0当量的HOBT 1.6g，用100mlDMF溶解，冰浴下加入6.0当量DIEA 3.9ml活化，活化后加入反应器，20℃～30℃反应1.5h～4.5h，以茚三酮显色反应作为反应终点的判断依据，抽干反应液，DMF洗涤树脂，重复以上操作，依次耦合Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH，得到Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-CTC(片段9-18)树脂。将Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-CTC(片段9-18)树脂加入50％哌啶/DMF溶液分别脱Fmoc保护基10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂。
5)Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂的合成
同实施例1。
6)耦合片段19-28树脂
将Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂加入50％哌啶/DMF溶液分别脱保护10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂，得到H2N-Glu(OtBu)-CTC树脂。称取3.0当量的Fmoc-Ser(tBu)-OH 4.6g，3.0当量的HBTU 4.5g、3.0当量的HOBT 1.6g用100ml DMF溶解，冰浴下加入6.0当量DIEA 4.0ml活化，活化后加入反应器，20℃～30℃反应1.5h～4.5h，以茚三酮显色反应作为反应终点的判断依据，抽干反应液，DMF洗涤树脂，重复以上操作，依次耦合Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，得到Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-CTC(片段19-28)树脂。
7)合成片段Ac-19-28树脂
将片段19-28树脂，加入50％哌啶/DMF溶液分别脱保护10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂，用7.13ml乙酸酐和1.42ml DIEA、100ml DMF封闭2～4h，用DMF洗涤树脂，甲醇收缩树脂，干燥至恒重。
8)合成片段1-8、9-18、Ac-19-28
同实施例1。
9)多肽1-28合成
同实施例1。
10)粗品合成
将12g多肽1-28加入圆底烧瓶，冰浴下加入预冻的切割液120ml(TFA、茴香硫醚、茴香醚和EDT组成的混合溶液，其体积比为90:5:3:2)，搅拌反应2～3h，然后加入到1.2L的冰乙醚中沉淀，过滤，冰乙醚洗涤，减压干燥得胸腺法新粗品8.1g，粗品主峰纯度68.8％。

Claims (4)

1.一种胸腺法新的合成方法，采用先三段分别合成，所述三段分别是片段1～8、片段9～18和片段19～28，再片段间进行缩合的方法，其特征在于该方法包括以下步骤： (1)将Fmoc-Asn(Trt)-OH和替代值为0.3mmol/g～0.8mmol/g的2-氯三苯甲基(CTC)树脂在DMF溶液中混合，加入DIEA溶液，经酯化反应得到Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂；
(2)将Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂和体积比10％-50％的哌啶DMF溶液组成的脱保护液混合，得到H2N-Asn(Trt)-CTC树脂，将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和H2N-Asn(Trt)-CTC树脂耦合，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-CTC树脂，重复以上步骤，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)- Asn (Trt)-CTC树脂，即片段1-8树脂；将所述片段1-8树脂加入10％-50％哌啶/DMF溶液分别脱Fmoc保护基10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂；
(3)将Fmoc-Lys(Boc)-OH和替代值为0 .3mmol/g～0 .8mmol/g的2-氯三苯甲基(CTC)树脂混合，经酯化反应得到Fmoc-Lys(Boc)-CTC树脂；
(4)将Fmoc-Lys(Boc)-CTC树脂和体积比10％-50％的哌啶DMF溶液组成的脱保护液混合，得到H2N-Lys(Boc)-CTC树脂，将Fmoc-Lys(Boc)-OH和H2N-Lys(Boc)-CTC树脂耦合，得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-CTC树脂，重复以上步骤，得到Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu (OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-CTC树脂，即片段9-18树脂；将所述片段9-18树脂加入10％-50％哌啶/DMF溶液分别脱Fmoc保护基10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂；
(5)将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和替代值为0.3mmol/g～0.8mmol/g的2-氯三苯甲基(CTC)树脂混合，经酯化反应得到Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂；
(6)将Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂和体积比10％-50％的哌啶DMF溶液组成的脱保护液混合，得到H2N-Glu(OtBu)-CTC树脂，将Fmoc-Ser(tBu)-OH和H2N-Glu(OtBu)-CTC树脂耦合，得到Fmoc-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-CTC树脂，重复以上步骤，得到Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser (tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-CTC树脂，即片段19-28树脂；
(7)将片段19-28树脂，加入10％-50％哌啶DMF溶液分别脱保护10min和20min，抽干脱保护液，用DMF洗涤树脂，使用乙酸酐和有机碱对片段19-28N末端氨基乙酰化得到Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)- Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu-CTC树脂，即片段Ac-19-28树脂；所述有机碱为吡啶、NMM或DIEA中的一种，乙酸酐摩尔量为树脂摩尔量的5～10倍，有机碱摩尔量为树脂摩尔量的1～5倍；
(8)用含5％TFA的DCM溶液将步骤(2)、步骤(4)和步骤(7)中合成的带侧链保护基的肽片段从树脂上切落，得到H2N-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OH，即片段1-8，H2N-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH，即片段9-18，Ac-Ser(tBu)- Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-OH ，即片段19-28；
(9)片段合成选用HBTU、HATU或TBTU中的一种，HOBT、HOAT或6-Cl-HOBT中的一种，DIEA或NMM中的一种，即3种试剂的组合作为缩合试剂，带保护基的氨基酸的用量是1 .5～2 .5倍量，先将片段9-18用V(DMF)/V(DCM)等于3 .0的溶剂溶解，后加入等摩尔量的HBTU、HATU或TBTU中的一种和HOBT、HOAT或6-Cl-HOBT中的一种，待溶解后滴加2倍摩尔量的DIEA或NMM中的一种，30分钟后将反应溶液倒入到用NMP溶解的片段1-8溶液中，反应完全后得到片段1-18，以同样的方法将片段19-28与片段1-18反应得到多肽1-28；
(10)向多肽1-28中加入切割试剂A、B或C中的一种，脱去保护基后加入冰乙醚沉淀，过滤，冰乙醚洗涤，减压干燥得胸腺法新粗品，其中A为TFA、茴香硫醚、水、苯酚和EDT组成的混合溶液，其体积比为82 .5：5：5：5：2 .5；B为TFA、茴香硫醚、茴香醚和EDT组成的混合溶液，其体积比为90:5:3:2；C为TFA、Tis和水组成的混合溶液，其体积比为95：2.5：2.5。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于所述的脱保护液为体积比20％的哌啶DMF溶液。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于步骤(9)中的缩合试剂组合为HBTU、HOBt和DIEA。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于步骤(10)中的切割试剂为C。
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