CN103665144A - 液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法 - Google Patents

液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法，属于生化技术领域。该方法利用高荷载量（≥0.8mmol/g树脂）的树脂为起始原料，先采用标准的固相多肽合成(SPPS)技术合成选定结构的高纯度肽片段，再采用液相缩合技术连接肽片段，从而获得高纯度(＞99%)的目标肽。相比较固相合成胸腺肽α1的工艺，本发明避免了12位以后氨基酸偶联率低的问题，大大提高了胸腺肽α1的收率（达25～30%）；同时固相合成的肽片段不必纯化，简化了后处理工艺，最终采用高效液相色谱纯化胸腺肽α1，制备难度降低，制备次数减少，胸腺肽α1的合成成本降低，有利于实现规模化、产业化生产。

Description

液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法
技术领域
本发明属于生化技术领域，涉及一种胸腺肽α1的合成方法，尤其涉及一种液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法。 
背景技术
胸腺肽α1(又称胸腺素α1、胸腺法新)是一种具有下式结构的胸腺肽：Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH。胸腺肽α1是哺乳动物胸腺中存在的单一组分的多肽化合物，是由28个氨基酸残基和N端氨基酸乙酰化构成的多肽，是与免疫细胞发育分化相关的分子，具有使T淋巴细胞分化、增殖、提高细胞免疫功能的作用，能破坏被感染的靶细胞，还可激活NK细胞活性，促进与免疫相关的细胞因子的产生。胸腺肽α1的活性较胸腺五肽高10到1000倍，是复合治疗慢性乙肝、丙肝、免疫缺陷综合症药物，在非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤治疗中也发挥了较大的作用。胸腺肽α1于1997年由意大利赛生(Sciclone)公司开发上市，现己被24个国家批准用于慢性乙型肝炎(HBV)的治疗，在欧美日等国也用于治疗丙型肝炎(HCV)、肝细胞癌及增强免疫疾病的治疗。 
   1983年公开的美国专利US4504415使用全液相合成胸腺肽α1。最近的胸腺肽α1及其类似物的制备方法主要有两种，其中一种是采用生物合成技术，在2003年1月1日公开的中国发明专利(CN1388133A)中，利用人工基因合成技术获得胸腺肽α1的全序列。另一种为固相合成方法，“化学学报”2004年第55卷第2期《胸腺素α1的DIC固相化学合成与鉴定》中提到，以Wang Resin为起始原料，通过激活试剂DIC+HOBt将Fmoc-Asn(Trt)-OH与树脂相连接；“天津药学”2001年6月第13卷第3期《Fmoc新型固相法合成胸腺素α1及其反应途径》中提到，以HMP树脂为起始原料，通过激活试剂DCC+ HOBt将Fmoc-Asn(Trt)-OH与树脂相连接。中国专利CN200610024610.0、CN200680014615.3、CN200710024406.3、CN200780024724.8、CN201110069876.8均为固相合成胸腺肽α1。 
综合参考国内外关于胸腺肽α1制备方法以及相关的合成报道文献，发现这些技术都存在一些不足，主要表现在：①全液相合成费时，需要良好的后处理技术；②生物合成技术难以规模化生产；③常规固相合成方法难以获得高纯度的胸腺肽α1，而且收率低（5~10%），导致生产成本高。 
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法。 
本发明液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法，包括在固相支持体上合成胸腺肽α1的侧链保护肽片段，在液相中缩合侧链保护肽片段，形成保护的胸腺肽α1，然后将侧链和羧基端去保护，获得目的肽。其具体制备工艺如下： 
（1）将结构为Fmoc-EVVEEAEN-COOH的侧链保护肽羧基端进行保护，得到结构为Fmoc-EVVEEAEN-Y的侧链保护肽片段，并使该肽片段的氨基端去保护，得到结构为NH2-EVVEEAEN-Y的侧链保护肽；
（2）采用液相片段缩合方法，将侧链保护肽NH2-EVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-KEKK-COOH的侧链保护肽反应，得结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽；并使该肽片段的氨基端去保护，得NH2-KEKKEVVEEAEN-Y；
（3）将Fmoc-EITTKD-COOH侧链保护肽与Leu-OBzl反应得到侧链保护肽Fmoc-EITTKDL-OBzl，并将氨基Fmoc脱去，得到侧链保护肽NH2-EITTKDL-OBzl，再采用液相片段缩合法将NH2-EITTKDL-OBzl侧链保护肽与结构为Fmoc-SDAAVDTSS-COOH的侧链保护肽缩合，产生结构为侧链保护肽Fmoc-SDAAVDTSSEITTKDL-OBzl；再将肽氨基末端乙酰化，得侧链保护肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-OBzl，并脱去羧基端Bzl保护，得到Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-COOH；
或将侧链保护肽NH2-EITTKDL-OBzl与侧链保护肽Ac-SDAAVDTSS-COOH缩合得到侧链保护肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-OBzl，并脱去羧基端Bzl保护，得到侧链保护肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-COOH；
（4）采用液相片段缩合方法将羧基保护的侧链保护肽NH2-KEKKEVVEEAEN-Y与结构为 Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-COOH的侧链保护肽反应，产生结构为Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽；
（5）将肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y侧链保护肽的侧链和羧基去保护，得目标肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH；
本发明液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法也可以由以下工艺步骤完成：
（1）将结构为Fmoc-EVVEEAEN-COOH的侧链保护肽羧基端进行保护，得到Fmoc-EVVEEAEN-Y；将肽氨基端去保护，得侧链保护肽NH2-EVVEEAEN-Y；
（2）采用液相片段缩合方法，使侧链保护肽NH2-EVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-EITTKDLKEKK-COOH的侧链保护肽反应，产生结构为Fmoc-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽，并将肽氨基端去保护，得肽NH2-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y；
（3）采用液相片段缩合方法，使侧链保护肽NH2-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-SDAAVDTSS-COOH的侧链保护肽反应，产生结构为Fmoc-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽；再将肽氨基末端乙酰化，得肽Ac- SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y；
或将肽NH2-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y与结构为 Ac-SDAAVDTSS-COOH的肽反应，产生结构为Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽；
（4）将肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y侧链保护肽的侧链和羧基去保护，得目标肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH。
上述两种合成工艺中，各步骤所涉及的片段肽中，Y为叔丁酯基、苄酯基、对硝基苄酯基、三苯甲基。各步骤所涉及的肽片段均是以2-氯代三苯甲基氯树脂为起始原料，采用经典的固相合成方法而得。 
上述方法合成的产物经高效液相色谱分析、质谱分析检测，表明目标肽成功合成。 
本发明相对现有技术具有以下优点： 
1、本发明利用高荷载量（≥0.8mmol/g树脂）的树脂为起始原料，先采用标准的固相肽合成(SPPS)技术合成选定结构的高纯度肽片段，再采用液相缩合技术使肽片段缩合，从而获得高纯度(＞99%)的目标肽；
2、相比较固相合成胸腺肽α1的工艺，本发明避免了12位以后氨基酸偶联率低的问题，大大提高了胸腺肽α1的收率（达25～30%）；
3、对生产的肽片段不必用色谱技术来纯化，只需要使用前进行沉淀、研磨，大大简化了后处理工艺；在最终高效液相色谱纯化中减少制备次数，降低了胸腺肽α1的合成成本，有利于实现规模化、产业化生产。
附图说明
图1为本发明制备的胸腺肽α1粗肽分析色谱图； 
图2为本发明制备的胸腺肽α1纯肽分析色谱图；
图3为本发明制备的胸腺肽α1纯肽质谱图；
图4为实施例一的2+2片段合成胸腺肽α1的工艺路线图；
图5为实施例二的三片段合成胸腺肽α1的工艺路线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明液相片段缩合制备胸腺肽α1的合成工艺作进一步说明。 
下列各实施例中，合成胸腺肽α1所涉及的目的肽及中间体的各个肽片段的氨基酸序列见表l。各实施例中肽片段组合方式见表2。中间片段肽的氨基酸序列见表3。本发明所涉及氨基酸的缩写见的表4。 
Figure DEST_PATH_DEST_PATH_IMAGE001
Figure DEST_PATH_DEST_PATH_IMAGE003
实施例一、2+2片段法制备胸腺肽α1
    1、树脂制备
1.1制备Fmoc-Asn(Trt)-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.8mmol/g树脂，1 eq.)加入150 mL多肽合成器，用60mL DCM洗涤溶胀树脂30分钟。抽干溶剂，加入Fmoc-Asn(Trt)-OH (1.2 eq.)和DIEA (2.5eq.)的30 mL DCM溶液。氩气保护下机械搅拌该混合物1小时。加入色谱级甲醇10 mL（2ml/g树脂）对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。抽干溶剂，用3×60 mL DMF、3×60 mL DCM、3×60 mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得6.39g Fmoc-Asn(Trt)-2-氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷栽量为0.39 mmol/g。
1.2制备Fmoc-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.8mmol/g树脂，1 eq.)加入150 mL多肽合成器，用60mL DCM洗涤溶胀树脂。排干树脂床，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH (1.5 eq.)和DIEA (2.5eq.)的30 mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10 mL（2ml/g树脂）对树脂上的活性部分进行30分钟封端。排干树脂床，用3×60 mLDMF、3×60 mLDCM、3×60 mLMeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得6.69g Fmoc-Lys(Boc)-2氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷栽量为0.58 mmol/g。 
1.3制备Fmoc-Asp(OtBu)-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.8mmol/g树脂，1 eq.)加入150 mL多肽合成器，用6mL DCM洗涤溶胀树脂。排干树脂床，加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH (1.5 eq.)和DIEA (2.5eq.)的30 mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10 mL（2ml/g树脂）对树脂上的活性部分进行30分钟封端。排干树脂床，用3×60 mL DMF、3×60 mL DCM、3×60 mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得6.32g Fmoc-Asp(OtBu)-2氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷栽量为0.583 mmol/g。 
1.4制备Fmoc-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.8mmol/g树脂，1 eq.)加入150 mL多肽合成器（自制），用100mL DCM洗涤溶胀树脂。排干树脂床，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH (1.5 eq.)和DIEA (2.5eq.)的25 mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10 mL（2ml/g树脂）对树脂上的活性部分进行30分钟封端。排干树脂床，用3×60 mLDMF、3×60 mLDCM、3×60 mLMeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得6.23g Fmoc-Ser(tBu)-2氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷栽量为0.57 mmol/g。 
2.片段制备 
2.1 肽片段Ac-AA(1-9)-OH的制备:
向150 mL肽反应室中加入5g Fmoc-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂。加入60 mL DCM中搅拌约30分钟溶胀树脂，然后抽干。用2×50 mL 20%哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50 mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物（二苯并富烯和其哌啶加合物）和残余哌啶，然后按茚三酮试验测定。    
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(1.5 eq.)、HOBT (1.5 eq.)和DIEA (1.5eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU (1.5 eq.)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5 mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50 mL DMF洗涤树脂。
依次用Fmoc-保护的氨基酸Thr (tBu)、Asp(OtBu)、Val、Ala、Ala、Asp(OtBu)、Ser (tBu)各1.5当量，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，脱去N末端Fmoc保护，用乙酸酐和吡啶(各8 eq.)的25mL NMP: DMF(3：1)乙酰化所述树脂结合肽30分钟，抽干树脂床，用3×60 mL DMF、3×60 mL DCM、3×60 mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得8.05g树脂结合肽。 
用100 mL l% TFA的DCM处理约1小时，然后用2 × 50 mL 0.5%TFA的DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶（与TFA体积比1：1）上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10 mL体积，然后用10 mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约 10mL。加入100 mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100 mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得3.31g纯度92% Ac-AA (1-9)-OH，产率93%。 
上述制备的片段Ac-AA(1-9)-OH的结构如下（见表3序列2a）： 
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-COOH。
分子式：C58H103N9O19，分子量：MW：1229.74。 
2.2肽片段Fmoc-AA(10-15)-OH的制备 
向150 mL肽反应室中加入5g Fmoc-Asp(OtBu)-2氯-三苯甲基树脂。在60 mL DCM中搅拌约30分钟溶胀树脂，然后抽干。用2×50 mL 20%哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50 mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物和残余哌啶，然后按茚三酮试验测定。    
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(1.5 eq.)、HOBT (1.5 eq.)和DIEA (1.5eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。在氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU (1.5 eq.)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5 mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50 mL DMF洗涤树脂。
用Fmoc-保护的氨基酸Thr (tBu)、Thr (tBu)、Ile、Glu (OtBu)各1.5当量，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，不脱除最后一个氨基酸的Fmoc保护，3×60 mL DCM、3×60 mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得8.35g树脂结合肽。 
用100 mL l% TFA的DCM处理约1小时，然后用2 x 50 mL 0.5%TFA的DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶（与TFA体积比1:1）上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10 mL体积，然后用10 mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约 10mL。加入100 mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100 mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得3.51g 纯度95%的Fmoc-AA(10-15)-OH，产率96%。 
上述制备的肽片段Fmoc-AA(10-15)-OH的结构如下（见表3序列4a）： 
Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-COOH。
分子式：C65H101N7O17，分子量：MW：1251.72。 
2.3 肽片段Fmoc-AA(17-20)-OH的制备: 
向150 mL肽反应室中加入5g Fmoc-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂。在60 mL DCM中搅拌约30分钟溶胀树脂，然后抽干。用2×50 mL 20%哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂。用50 mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物（二苯并富烯和其哌啶加合物）和残余哌啶，然后按茚三酮试验测定。    
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(1.5 eq.)、HOBt (1.5 eq.)和DIEA (1.5eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU (1.5 eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5 mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50 mL DMF洗涤树脂。
用Fmoc-保护的氨基酸Glu (OtBu)、Lys(Boc)各1.5当量，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，不脱去脱去N末端Fmoc保护， 3×60 mL DCM、3×60 mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得7.46g树脂结合肽。 
用100 mL l% TFA的DCM处理约1小时，然后用2 x 50 mL 0.5%TFA的DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶（与TFA体积比1：1）上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10 mL体积，然后用10 mL 乙醇重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约 10mL。加入100 mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100 mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得3.08g纯度95%的Fmoc-AA(17-20)-OH，产率97%。 
上述制备的肽片段Fmoc-AA(17-20)-OH的结构如下（见表3序列8a）： 
Fmoc-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-COOH。
分子式：C57H87N7O15，分子量：MW：1109.63。 
2.4 肽片段Fmoc-AA(21-28)-OH的制备: 
固相制备片段Fmoc-AA(21-28)-OH
向150 mL肽反应室中加入6g Fmoc-Asn(Trt)-2-氯-三苯甲基树脂（取代值0.39mmol/g）。在60 mL DCM中搅拌约30分钟溶胀树脂，然后抽干。用2×60 mL 20%哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用60 mLDMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物和残余哌啶，然后按茚三酮试验测定。    
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(1.5 eq.)、HOBt (1.5 eq.)和DIEA (1.5eq.)在室温下溶解于28mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU (1.5 eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5 mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×60 mL DMF洗涤树脂。
用Fmoc-保护的氨基酸Ala、Glu (OtBu)、Glu(OtBu)、Val、Val、Glu(OtBu)各1.5当量，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，不脱去N末端Fmoc保护，用3×60 mL DCM、3×60 mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得9.01g树脂结合肽。 
用100 mL l% TFA的DCM处理约1小时，然后用2 × 50 mL 0.5%TFA的DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶（与TFA体积比1：1）上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10 mL体积，然后用10 mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约 10mL。加入100 mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100 mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得3.45g 纯度92% Fmoc-AA(21-28)-OH，产率92%。 
上述制备的片段Fmoc-AA(21-28)-OH的结构如下（表3序列10a）： 
Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-COOH (序列13a)。分子式：C87H112N9O20，分子量：MW：1602.80。
3片段缩合过程 
3.1 Fmoc-AA(21-28)-OtBu制备
通过Fmoc-AA(21-28)-OH与叔丁基三氯乙酰亚胺酯（TBTA）制备片段Fmoc-AA(21-28)-OtBu。
在100 mL圆底烧瓶中加入1mmol Fmoc-AA(21-28)-OH（3.2g），加入DCM:DMF:TBTA=7:1:2溶液20 mL，加温至35℃磁力搅拌反应1小时，TLC监测，反应完全后，加入冷MTBE  80 mL沉淀产物，搅拌1小时去除TBTA，过滤沉淀，干燥，得到Fmoc-AA(21-28)-OtBu 3.21g，收率96%，92%HPLC纯。 
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=9:0.5:0.5；UV，碘检测；Rf: Fmoc-AA(21-28)-OH, 0.16；Rf: Fmoc-AA(21-28)-OtBu, 0.71。 
片段Fmoc-AA(21-28)-OtBu的结构（序列10b）： 
Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。
分子式：C91H120N9O20，分子量：MW 1658.86。 
3.2制备NH2-AA(21-28)-OtBu 
在100 mL圆底烧瓶中加入3.1合成的Fmoc-AA(21-28)-OtBu 3.0g，加入DMF 25.2 mL溶解，滴加哌啶至30mL（最终浓度16%），反应2小时，TLC监测，HPLC检定，反应完全后加入70mL冰水沉淀产物，冰水20 mL洗涤过滤沉淀2遍，真空干燥。干燥产物加入冷冻MTBE 60 mL搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到NH2- AA(21-28)-OtBu 2.55g，收率98%。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf： NH2- AA(21-28)-OtBu, 0.20；Rf: Fmoc-AA(21-28)-OtBu，0.71。 
制备的NH2-AA(21-28)-OtBu的结构如下（见表3序列10c）： 
NH2-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。
分子式：C76H110N9O18，分子量：MW 1436.79。 
3.3通过液相缩合片段制备Fmoc-AA(17-28)-OtBu 
在100 mL圆底烧瓶中加入NH2-AA(21-28)-OtBu 1.00g、Fmoc-AA(17-20)-OH 0.816g和HOBt 0.104g。将所述固体溶解于含有DIEA（0.199g）的DMF (20 mL)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入HBTU 0.292g。在0℃搅袢反应混合物1小时，然后升温至室温，再搅拌1小时。加入水(60mL)从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用水(20 mL×2)洗涤，并干燥获得1.853g粗品Fmoc-AA(17-28)-OtBu。在室温下用MTBE (100 mL)研磨所述固体3小时，真空过滤收集，并干燥获得1.608g Fmoc-AA(17-28)-OtBu，收率91%。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf： NH2-AA(21-28)-OtBu, 0.20；Rf: Fmoc-AA(17-20)-OH, 0.10；Rf: Fmoc-AA(17-28)-OtBu, 0.36。 
制备的 Fmoc-AA(17-28)-OtBu的结构如下（见表 3序列9b）： 
Fmoc-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。分子式：C133H195N16O32，分子量：MW 2528.41。
3.4制备NH2-AA(17-28)-OtBu 
在100 mL圆底烧瓶中加入合成的Fmoc-AA(17-28)-OtBu 1.568g，加入DMF 16.8 mL溶解，滴加哌啶至最终浓度16%，反应2小时，TLC监测，HPLC检定，反应完全后加入冰水沉淀产物，冰水洗涤过滤沉淀2遍，真空干燥。加入冷MTBE 60 mL搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到NH2-AA(17-28)-OtBu 1.39g，收率97%。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf： NH2-AA(17-28)-OtBu, 0.11；Rf: Fmoc-AA(17-28)-OtBu, 0.36。 
制备的NH2-AA(17-28)-OtBu的 结构如下（见表3序列9c）： 
NH2-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。
分子式：C118H185N16O30，分子量：MW 2306.34。 
3.5 Fmoc-AA(10-15)-OH与H-L-Leu-OBzl﹒Tos反应得到Fmoc-AA(10-16)-OBzl 
将1.253g Fmoc-AA(10-15)-OH (1mmol)、H-L-Leu-OBzl﹒Tos（1.5 eq.）、HOBt（1.5 eq.）和DIEA（3 eq.）加入50 mL圆底烧瓶中，并加入DMF (20 mL)。将生成的溶液冰浴冷却至0-5℃。向该冷却溶液中加入HBTU（1.5 eq.）。在冰浴下搅拌该溶液15分钟，去除冰浴，继续搅拌2.5小时。将反应化合物冰浴冷却，并加入0.5 N盐酸水溶液(25 mL)，沉淀所保护的肽。真空过滤收集固体，并在过滤瓶中干燥获得1.55g粗品Fmoc-AA(10-16)-OBzl。将该固体溶解于乙酸乙酯(25 mL)中，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩至10 mL体积。将该溶液冷却至0～5℃，加入己烷(25 mL)沉淀所述肽。真空过滤收集固体，并干燥获得1.43g Fmoc-AA(10-16)-OBzl，收率98%。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf： Fmoc-AA(10-15)-OH, 0.29；Rf: Fmoc-AA(10-16)-OBzl, 0.57。 
上述制备的肽片段Fmoc-AA(10-16)-OBzl的结构如下（见表3序列5a）： 
Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-COOBzl。分子式：C78H118N8O18，分子量：MW：1454.86。
3.6 Fmoc-AA(10-16)-OBzl脱去Fmoc得到NH2-AA(10-16)-OBzl 
100mL圆底烧瓶中加入1.4g Fmoc-AA(10-16)-OBzl和16%的哌啶／DMF 15mL，室温搅拌60分钟，加入己烷(40 mL)沉淀所述肽。从粘性固体倾析所述溶剂。用MTBE (50 mL)在室温下研制固体3小时。真空过滤收集固体，干燥获得1.35g NH2-AA(10-16)-OBzl。将所述固体溶解于甲醇(15 mL)中，搅拌冷却至0-5℃。加入0.5N盐酸水溶液(15 mL)沉淀所述肽。真空过滤收集固体，用水(50 mL)然后用2-丙醇(50 mL)洗涤，干燥获得1.12g NH2-AA(10-16)-OBzl，收率95%。
反应过程TLC控制，TLC条件： 氯仿/甲醇/TFE=80:6:6（5滴醋酸）； UV，碘检测；    Rf: NH2-AA(10-16)-OBzl, 0.41；Rf: Fmoc-AA(10-16)-OBzl, 0.57。 
上述制备的肽片段NH2-AA(10-16)-OBzl的结构如下（见表3序列5b）： 
NH2-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-COOBzl。
分子式：C63H109N8O16，分子量：MW：1233.80。 
3.7 Ac-AA(1-9)-OH与NH2-AA(10-16)-OBzl反应得到Ac-AA(1-16)-OBzl 
将1.047g Ac-AA(1-9)-OH（1.05 eq.）与1g NH2-AA(10-16)-OBzl（1 eq.）、HOBt（1.05 eq.）和DIEA（2.1 eq.）加入50 mL圆底烧瓶中，并加入DMF (20 mL)。将生成的溶液搅拌冰浴冷却至0-5℃。向该冷却溶液中加入HBTU（1.05 eq.）。在冰浴下搅拌15分钟，去除冰浴，继续搅拌3小时。将反应化合物冰浴冷却，并加入冰水(20 mL)沉淀肽。真空过滤收集固体，并在过滤瓶中干燥获得1.824g Ac-AA(1-16)-OBzl，收率92%。
反应过程TLC控制，TLC条件： 氯仿/甲醇/TFE=80:6:6（5滴醋酸）； UV，碘检测；    Rf: NH2-AA(10-16)-OBzl, 0.41；Rf: Ac-AA(1-9)-OH, 0.13（无紫外显色，只有碘显色）；Rf：Ac-AA(1-16)-OBzl, 0.64。 
上述制备的肽片段Ac-AA(1-16)-OBzl的结构如下（见表3序列3c）： 
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-COOBzl。
分子式：C121H210N17O34，分子量：MW：2445.52。 
3.8 Ac-AA(1-16)-OBzl催化氢化得到Ac-AA(1-16)-OH 
在50 mL圆底烧瓶中加入1.8g Ac-AA(1-16)-OBzl和DMF(20 mL)。向该溶液中加入甲酸铵水溶液(1 mL)，然后加入湿的10%钯碳(60%含水量)，室温下搅拌120分钟。将该淤浆过滤到90 mL水中。用DMF(5 mL)洗涤滤饼。用乙酸乙酯(15 mL)洗涤水悬浮液。然后浓缩乙酸乙酯至5 mL体积。加入己烷(20 mL)沉淀，从固体倾析溶剂。将固体溶解于甲醇(10 mL)中，加入4：1水／饱和氯化钠水溶液(25 mL)沉淀所述肽。真空过滤收集固体，用水(10 mL)洗涤，干燥获得1.47g Ac-AA(1-16)-OH，收率85%。
上述制备的肽片段Ac-AA(1-16)-OH的结构如下（见表3序列3a）： 
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-COOH。
分子式：C114H204N17O34，分子量：MW：2355.48。 
3.9 Ac-AA(1-16)-OH与NH2-AA(17-28)-OtBu得到Ac-AA(1-28)-OtBu 
将1.4g Ac-AA(1-16)-OH（1.05 eq.）与1.31g NH2-AA(17-28)-OtBu（1 eq.）、HOBt（1.05 eq.）和DIEA（2.1 eq.）加入50 mL圆底烧瓶中，并加入DMF (20 mL)。将生成的溶液搅拌冷却至0-5℃。向该冷却溶液中加入HBTU（1.05 eq.）。在冰浴下搅拌15分钟，去除冰浴，继续搅拌3小时。将反应化合物冰浴冷却，并加入冰水(20 mL)沉淀肽。真空过滤收集固体，干燥获得2.38g Ac-AA(1-28)-OtBu，收率90%。
反应过程TLC控制。TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf：NH2-AA(17-28)-OtBu, 0.11；Rf: Ac-AA(1-16)-OH, 0.19；Rf: Ac-AA(1-28)-OtBu, 0.45。 
制备的Ac-AA(1-28)-OtBu的结构为（见表3序列1a）： 
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-COOtBu。
分子式：C232H386N33O63，分子量：MW 4642.80。 
4、胸腺肽α1的制备及纯化 
4.1 通过去除侧链保护Ac-AA(1-28)-OtBu制备胸腺肽α1粗肽
在250 mL圆底烧瓶中加入三氟乙酸/水/三异丙基硅烷/1,2-乙二硫醇(92.5: 2.5: 2.5: 2.5(v/v/v/v%,)溶液50 mL，并冷却至0℃。向该冷却溶液中加入加入Ac-AA(1-28)-OtBu 2g。在0℃搅拌所述淤浆直到所述固体溶解（约5分钟），然后升温至室温，搅拌3小时。将该溶液加入0℃乙醚70 mL中沉淀所述肽。以3000 rpm离心旋转淤浆5分钟，从所述固体倾析乙醚。将所述固体再悬浮于乙醚(50 mL)中，以3000rpm离心旋转5分钟，倾析乙醚。重复该过程一次，然后将固体溶解于含有1%(体积)乙酸的1：l水／乙腈(30 mL)中，在室温下保存24小时。将该溶液冷冻，然后用冷冻干燥器冷冻干燥获得1.26mg胸腺肽α1粗肽，产率95%。胸腺肽α1粗肽的色谱图见图1。
4.2 HPLC纯化胸腺肽α1粗肽 
30 mg胸腺肽α1粗肽经制备型HPLC纯化产生全长胸腺肽α1纯品14.6mg，产率48%。
HPLC纯化条件：色谱柱：Waters C18 250×19, 5u, 130A；流速：8mL/min；检测：UV，210 nm；流动相：A．5%乙腈/H2O/0.05% TFA；B．80%乙腈/H2O/0.05% TFA；5%B，10分钟；5-15%B，10分钟；15-50%B，22分钟。胸腺肽α1纯肽色谱图见图2（色谱方法为2010版中国药典方法），纯肽质谱图见图3。 
胸腺肽α1的结构如下： 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu -Asn-COOH。分子式：C129H215N33O55，分子量：MW：3107.5041。
本实施例2+2片段合成胸腺肽α1的工艺路线如图4所示。 
实施例二、三片段法合成胸腺肽α1
1树脂制备
1.1 Fmoc-Asn(Trt)-2-氯-三苯甲基树脂的合成同实施例一。
1.2 Fmoc-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂的合成同实施例一。 
1.3 Fmoc-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂的制备：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.8mmol/g树脂，1 eq.)加入150 mL多肽合成器，用60mL DCM洗涤溶胀树脂。排干树脂床，由于要合成Fmoc-AA(10-20)-OH必须降低树脂取代值，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH (1.2 eq.)和DIEA (2.5eq.)的30 mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10 mL（2ml/g树脂）对树脂上的活性部分进行30分钟封端。排干树脂床，用3×60 mLDMF、3×60 mLDCM、3×60 mLMeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得6.13g Fmoc-Lys(Boc)-2氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷栽量为0.43 mmol/g。 
2 片段合成 
2.1片段Ac-AA(1-9)-OH的制备同实施例一；
2.2片段Fmoc-AA(21-28)-OH的制备同实施例一 。
2.3片段Fmoc-AA(10-20)-OH的制备 
向150 mL肽反应室中加入5g Fmoc-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂。在60 mL DCM中搅拌约30分钟溶胀树脂，然后抽干。用2x50 mL 20%哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50 mLDMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物（二苯并富烯和其哌啶加合物）和残余哌啶，然后按茚三酮试验测定。    
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(1.5 eq.)、HOBt (1.5 eq.)和DIEA (1.5eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU (1.5 eq.)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5 mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3x50 mL DMF洗涤树脂。
用Fmoc-保护的氨基酸Glu (OtBu)、Lys(Boc)、Leu、Asp(OtBu)、Lys(Boc)、Thr(Trt)、Thr(Trt)、Ile、Glu(OtBu)各1.5当量，注意在合成中使用Trt保护Thr的侧链羟基，这样可以降低肽链聚集。对所述肽片段后续单体重复该操作过程。与其他以上片段合成不同是Thr的侧链保护采用Trt保护，这样可以减轻肽链的聚集。在最后一个偶合反应后，不脱去N末端Fmoc保护，用3x60 mL DCM、3x60 mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得9.55g树脂结合肽。 
用100 mL l% TFA的DCM处理约1小时，然后用2 x 50 mL 0.5%TFA的DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶（与TFA体积比1：1）上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10 mL体积，然后用10 mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约 10mL。加入100 mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100 mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得4.55g纯度90% Fmoc-AA(10-20)-OH，产率85%。 
片段Fmoc-AA(10-20)-OH的结构如下（表3序列6a）： 
Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Thr(Trt)-Thr(Trt)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-COOH。
分子式：C143H193N15O30；分子量：2602.19。 
3片段缩合 
3.1片段Fmoc-AA(21-28)-OtBu的制备同实施例一。
3.2片段NH2-AA(21-28)-OtBu的制备同实施例一。 
3.3 片段Fmoc-AA(10-28)-OtBu的合成 
在100 mL圆底烧瓶中加入NH2-AA(21-28)-OtBu 1.437g、Fmoc-AA(10-20)-OH 2.732 g和HOBt 0.527g。将所述固体溶解于含有DIEA（1.008g）的DMF (15 mL)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入HBTU 1.479g。在0℃搅袢反应混合物1小时，然后升温至室温，再搅拌1小时。加入水(50mL)从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用水(20 mL)洗涤，并干燥获得0.369 g粗品Fmoc-AA(10-28)-OtBu。在室温下用MTBE (10 mL)研磨所述固体1.5小时，真空过滤收集，并干燥获得2.933g Fmoc-AA(10-28)-OtBu，收率90%。
生产过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf： NH2-AA(21-28)-OtBu, 0.20；Rf: Fmoc-AA(10-20)-OH, 0.15；Rf: Fmoc-AA(10-28)-OtBu, 0.56。 
Fmoc-AA(10-28)-OtBu结构如下（表3序列7a）： 
Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。
分子式：C169H263N24O39；分子量：MW 3259.93。 
3.4  NH2-AA(10-28)-OtBu的制备 
在100 mL圆底烧瓶中加入Fmoc-AA(10-28)-OtBu 2.9g，加入DMF 21 mL溶解，滴加哌啶至最终浓度16%，反应2小时，TLC监测，HPLC检定，反应完全后将反应物加入70mL冰水沉淀产物，冰水洗涤过滤沉淀2遍，真空干燥。加入冷MTBE 80 mL搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到NH2-AA(10-28)-OtBu 2.48g，收率92%。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf: Fmoc-AA(10-28)-OtBu, 0.56；Rf: NH2-AA(10-28)-OtBu, 0.18。 
制备的NH2-AA(10-28)-OtBu的结构为（见表3序列4c）： 
NH2-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。
分子式：C154H253N24O37，分子量：MW 3030.87。 
3.5  Ac-AA(1-28)-OtBu的制备。 
在100 mL圆底烧瓶中加入NH2-AA(10-28)-OtBu 2.4g、Ac-AA(1-9)-OH 1.02g和0.113g HOAt。将所述固体溶解于含有DIEA（275uL）的DMF (25 mL)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入HBTU 0.315g。在0℃搅袢反应混合物2小时，然后升温至室温，再搅拌2小时。反应物加入水(80mL)中沉淀肽。真空过滤收集固体，用水(20 mL)洗涤，并干燥获得3.53g粗品Ac-AA(1-28)-OtBu。在室温下用MTBE (50 mL)搅拌沉淀3小时，真空过滤收集，并干燥获得3.38g Ac-AA(1-28)-OtBu，收率92%。 
生产过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf: NH2-AA(10-28)-OtBu, 0.18；Rf：Ac-AA(1-9)-OH, 0.13（无紫外显色，只有碘显色）；Rf: Ac-AA(1-28)-OtBu, 0.45。 
制备的Ac-AA(1-28)-OtBu的结构为（见表3序列1a）： 
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。
分子式：C232H386N33O63，分子量：MW 4642.80。 
4、胸腺肽α1的制备及纯化 
通过去除侧链保护Ac-AA(1-28)-OtBu制备胸腺肽α1粗肽及胸腺肽α1粗肽的纯化与实施例一相同。
本实施例三片段合成胸腺肽α1的工艺路线如图5所示。  

Claims (4)

1.一种液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法，包括以下工艺步骤：
（1）将结构为Fmoc-EVVEEAEN-COOH的侧链保护肽羧基端进行保护，得到结构为Fmoc-EVVEEAEN-Y的侧链保护肽片段，并使该肽片段的氨基端去保护，得到结构为NH2-EVVEEAEN-Y的侧链保护肽；
（2）采用液相片段缩合方法，将侧链保护肽NH2-EVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-KEKK-COOH的侧链保护肽反应，得结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽；并使该肽片段的氨基端去保护，得NH2-KEKKEVVEEAEN-Y；
（3）将Fmoc-EITTKD-COOH侧链保护肽与Leu-OBzl反应得到侧链保护肽Fmoc-EITTKDL-OBzl，并将氨基Fmoc脱去，得到侧链保护肽NH2-EITTKDL-OBzl，再采用液相片段缩合法将NH2-EITTKDL-OBzl侧链保护肽与结构为Fmoc-SDAAVDTSS-COOH的侧链保护肽缩合，产生侧链保护肽Fmoc-SDAAVDTSSEITTKDL-OBzl；再将肽氨基末端乙酰化，得侧链保护肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-OBzl，并脱去羧基端Bzl保护，得到Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-COOH；
或将侧链保护肽NH2-EITTKDL-OBzl与侧链保护肽Ac-SDAAVDTSS-COOH缩合得到侧链保护肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-OBzl，并脱去羧基端Bzl保护，得到侧链保护肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-COOH；
（4）采用液相片段缩合方法将羧基保护的侧链保护肽NH2-KEKKEVVEEAEN-Y与结构为 Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-COOH的侧链保护肽反应，产生结构为Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽；
（5）将肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y侧链保护肽的侧链和羧基去保护，得目标肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH；
上述Y为叔丁酯基、苄酯基、对硝基苄酯基或三苯甲基。
2.如权利要求1所述液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法，其特征在于：各肽片段是以2-氯代三苯甲基氯树脂为起始原料，采用经典的固相合成方法而得。
3.一种液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法，包括以下工艺步骤：
（1）将结构为Fmoc-EVVEEAEN-COOH的侧链保护肽羧基端进行保护，得到Fmoc-EVVEEAEN-Y；将肽氨基端去保护，得肽NH2-EVVEEAEN-Y；
（2）采用液相片段缩合方法，使肽NH2-EVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-EITTKDLKEKK-COOH的侧链保护肽反应，产生结构为Fmoc-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽，并将肽氨基端去保护，得肽NH2-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y；
（3）采用液相片段缩合方法，使肽NH2-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-SDAAVDTSS-COOH的侧链保护肽反应，产生结构为Fmoc-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽；再将肽氨基末端乙酰化，得肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y；
或将肽NH2-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y与结构为 Ac-SDAAVDTSS-COOH的侧链保护肽反应，产生结构为Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽；
（4）将肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y侧链保护肽的侧链和羧基去保护，得目标肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH；
上述Y为叔丁酯基、苄酯基、对硝基苄酯基或三苯甲基。
4.如权利要求3所述液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法，其特征在于：各肽片段是以2-氯代三苯甲基氯树脂为起始原料，采用经典的固相合成方法而得。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107417786A (zh) * 2017-05-04 2017-12-01 苏州强耀生物科技有限公司 一种胸腺肽α1的制备方法
CN107629111A (zh) * 2017-10-26 2018-01-26 陕西慧康生物科技有限责任公司 一种乙酰基四肽‑2的液相合成方法
CN108218980A (zh) * 2016-12-21 2018-06-29 鲁南制药集团股份有限公司 一种胸腺法新的合成方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101412755A (zh) * 2007-12-26 2009-04-22 杭州诺泰制药技术有限公司 一种胸腺素β4的固相合成方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101412755A (zh) * 2007-12-26 2009-04-22 杭州诺泰制药技术有限公司 一种胸腺素β4的固相合成方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴蕾等: "胸腺素α1的Fmoc固相合成法", 《化学工业与工程》, vol. 18, no. 6, 30 December 2001 (2001-12-30), pages 323 - 330 *
张鸿鹏: "胸腺素α1的固相片段合成及鉴定分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》, 15 July 2007 (2007-07-15) *
黄鹤等: "液相色谱法分离纯化固相合成的胸腺素α1", 《化学工业与工程》, vol. 18, no. 6, 30 December 2001 (2001-12-30), pages 331 - 335 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108218980A (zh) * 2016-12-21 2018-06-29 鲁南制药集团股份有限公司 一种胸腺法新的合成方法
CN108218980B (zh) * 2016-12-21 2020-12-08 鲁南制药集团股份有限公司 一种胸腺法新的合成方法
CN107417786A (zh) * 2017-05-04 2017-12-01 苏州强耀生物科技有限公司 一种胸腺肽α1的制备方法
CN107417786B (zh) * 2017-05-04 2021-03-09 苏州强耀生物科技有限公司 一种胸腺肽α1的制备方法
CN107629111A (zh) * 2017-10-26 2018-01-26 陕西慧康生物科技有限责任公司 一种乙酰基四肽‑2的液相合成方法

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