CN113321723A - 一种胸腺法新的制备方法 - Google Patents

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CN113321723A CN202110219597.9A CN202110219597A CN113321723A CN 113321723 A CN113321723 A CN 113321723A CN 202110219597 A CN202110219597 A CN 202110219597A CN 113321723 A CN113321723 A CN 113321723A
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张藤
王翔
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Abstract

本发明公开了一种胸腺法新的制备方法，包括以下步骤：(1)制备Fmoc‑Asp‑树脂复合物；(2)制备保护的胸腺法新‑树脂复合物；(3)采用切割试剂脱除侧链保护基并将胸腺法新从树脂上裂解下来，乙醚沉淀后得到胸腺法新粗品；和(4)采用高效液相法纯化粗品，得到胸腺法新精品。本发明提供一种简便、高效的胸腺法新制备方法，解决目前胸腺法新制备工艺繁琐、效率低或成本高的问题。

Description

一种胸腺法新的制备方法
技术领域
本发明属多肽化学领域，特别涉及一种胸腺法新的制备方法。
背景技术
胸腺法新由28个氨基酸组成，N端含有乙酰化结构，分子量为3108，一级结构为Ac-Ser1-Asp2-Ala3-Ala4-Val5-Asp6-Thr7-Ser8-Ser9-Glu10-Ile11-Thr12-Thr13-Lys14-Asp15-Leu16-Lys17-Glu18-Lys19-Lys20-Glu21-Val22-Val23-Glu24-Glu25-Ala26-Glu27-Asn28-OH。胸腺法新是一种生物反应的调节因子，是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂，它可以促进T细胞的成熟和分化，可促使成熟的T细胞、NK细胞分泌多种淋巴因子(IL-2、INF-α、INF-γ等)，同时也促进了高亲合力白介素-2受体(IL-ZR)的生成。另外，胸腺法新对一些病毒感染细胞和某些肿瘤细胞的生长有直接的抑制或杀伤作用。
胸腺法新作为免疫增强剂，主要用于治疗免疫缺陷和免疫抑制疾病。由赛生制药公司(SciClone pharmaceuticals)生产的化学合成Tαl(商品名为Zdaxain，日达仙)，作为单一治疗药或与α干扰素联合使用治疗慢性病毒性乙型肝炎,疗效好于或等同于现有处方药品。至2003年，日达仙已经在拉丁美洲、中东地区、东欧地区的三十多个国家上市。日达仙对于许多其它疾病(如丙型肝炎、非小细胞肺癌、黑色素瘤等)都有一定疗效。另外，日达仙还可作为疫苗辅助药，加强流感疫苗和乙型肝炎疫苗的免疫效果。因此胸腺法新具有很高的药用价值和广阔的市场前景。
胸腺法新序列较长，其制备主要采用化学法合成。化学方法主要分为两类，一类是固相合成法，另一类是片段缩合法。胸腺法新的固相合成法的代表性报道有文献(天津药学，2001，13(3)：39-41)、文献(化工学报，64(7)：2497-2502)、专利CN102286091B(其通过改变缩合途径、缩合试剂种类或重复投料的方式来提高缩合效率)和专利CN103936848A(其采用异二肽的方法来提高缩合效率，但异二肽的位点不在容易发生聚集的序列中)等。这些方法均无法有效解决胸腺法新合成中的一些公知困难点，例如二级结构如β折叠的产生，在合成过程中树脂容易聚集，导致缩合效率降低，副产物增多。胸腺法新的片段缩合法的代表性报道有专利CN108314725A、CN107417786A、CN104987382B和CN103665144B等。这些方法采用2～5个片段进行缩合来解决聚集问题，但是每个片段均需要一份固相载体，且片段直接缩合的效率又大大低于单个氨基酸缩合，且得到产物的消旋率又高于单个氨基酸缩合时得到产物的消旋率，因而片段缩合法问题主要在于成本高，产率低，不适合工业化生产。
因此，为了解决上述问题，仍需要开发一种简便、高效的胸腺法新制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、高效的胸腺法新制备方法，解决目前胸腺法新制备工艺繁琐、效率低或成本高的问题。本发明的目的可以通过以下技术方案实现。
根据本发明的一方面，提供一种胸腺法新的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备Fmoc-Asp-树脂复合物：在树脂中加入Fmoc脱保护试剂以脱除Fmoc保护基，过滤并用溶剂洗涤树脂。用溶剂溶解Fmoc-Asp-OtBu及缩合试剂后，加入到树脂中进行缩合反应，反应结束后，用溶剂洗涤树脂，得到Fmoc-Asp-树脂复合物；
(2)制备保护的胸腺法新-树脂复合物：向步骤(1)得到的Fmoc-Asp-树脂复合物中加入Fmoc脱保护试剂脱除Fmoc保护基，反应结束后过滤并用溶剂洗涤树脂得到Asp-树脂复合物，然后向Asp-树脂复合物中加入胸腺法新的C端第二个氨基酸和缩合试剂进行缩合反应，缩合反应结束后用溶剂洗涤树脂；重复上述的Fmoc脱保护反应和缩合反应，按照胸腺法新从C端到N端的顺序，将其余26个氨基酸依次连接到树脂上，其中在合成胸腺法新序列从N端到C端第22-23位的两个氨基酸时加入Fmoc-Val-(DMB)Val-OH以合成这两个氨基酸，得到保护的胸腺法新-树脂复合物；
(3)制备胸腺法新粗品：向保护的胸腺法新-树脂复合物中加入切割试剂，脱除多肽侧链保护基并将胸腺法新从树脂上裂解下来，乙醚沉淀后得到胸腺法新粗品；和
(4)制备纯化的胸腺法新：采用反相高效液相色谱分离纯化胸腺法新粗品，得到纯化的胸腺法新；
其中，步骤(1)和步骤(2)中的溶剂为选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基丙酰胺、N,N-二乙基甲酰胺和N,N-二乙基乙酰胺中的任一种。
在一些优选的实施方案中，步骤(1)和步骤(2)中的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
在一些优选的实施方案中，步骤(1)和步骤(2)中所述的Fmoc脱保护试剂是体积比为1：1～4的哌啶与二甲基甲酰胺的混合物，所述Fmoc脱保护反应的温度为20℃～60℃，反应时间为10min～60min。
在一些优选的实施方案中，步骤(1)中所述的树脂为氨基树脂。
在一些优选的实施方案中，步骤(1)中所述的树脂为选自Rink amide AM树脂(Rink amide AM resin)、Rink amide树脂(Rink amide resin)、Rink amide MBHA树脂(Rink amide MBHA resin)、氨基2-氯三苯甲基树脂(Amino 2-Chlorotrityl resin)和Sieber amide树脂(Sieber amide resin)中的任一种。
在一些优选的实施方案中，步骤(1)和步骤(2)中所述的缩合试剂为缩合试剂1和缩合试剂2的组合，其中，缩合试剂1为选自N,N-二环己基碳二亚胺、N,N-二异丙基碳二亚胺、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、卡特缩合剂和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷中的任一种；缩合试剂2为选自1-羟基苯并三氮唑、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑和N,N-二异丙基乙胺中的任一种。
在另一些优选的实施方案中，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述的缩合试剂为N,N-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三氮唑的组合，即，缩合试剂1为N,N-二异丙基碳二亚胺，缩合试剂2为1-羟基苯并三氮唑。
在另一些优选的实施方案中，步骤(1)和步骤(2)中所述的缩合试剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺的组合，即，缩合试剂1为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，缩合试剂2为N,N-二异丙基乙胺。
在一些优选的实施方案中，步骤(2)中所述的氨基酸的保护基分别为：所有氨基酸的α氨基保护基均为Fmoc保护基，丝氨酸和苏氨酸侧链羟基保护基为叔丁基，天冬氨酸和谷氨酸侧链羧基保护基为叔丁基，赖氨酸和色氨酸侧链保护基为叔丁氧羰基。
在一些优选的实施方案中，其特征在于，步骤(2)中所述的各试剂的摩尔比例为：氨基酸：缩合试剂1：缩合试剂2：树脂＝6～12：6～12：6～24：1；所述缩合反应的温度为20℃～60℃，反应时间为1小时～4小时。
在一些优选的实施方案中，步骤(3)中所述的切割试剂为重蒸水、三乙基硅烷、1,2二硫苏糖醇、苯酚、苯甲硫醚、碘化铵、三异丙基硅烷、苯甲醚和乙二硫醇中的至少一种与三氟乙酸的混合液，所述的混合液中三氟乙酸的体积比不小于85％；向保护的胸腺法新-树脂复合物中加入切割试剂进行反应的温度为0℃～60℃，反应时间为1小时～4小时。
在另一些优选的实施方案中，步骤(3)中所述的切割试剂为苯酚、苯甲硫醚、乙二硫醇和三氟乙酸的混合液体；优选地，按体积百分含量计，三氟乙酸：苯酚：苯甲硫醚：乙二硫醇＝87.5％：5％：2.5％：5％。
在另一些优选的实施方案中，步骤(3)中所述的切割试剂为苯酚、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和三氟乙酸的混合液体；优选地，三氟乙酸：苯酚：苯甲硫醚：乙二硫醇：水＝85％：5％：2.5％：5％：2.5％。
在另一些优选的实施方案中，步骤(3)中所述的切割试剂为苯酚、苯甲硫醚、三异丙基硅烷和三氟乙酸的混合液体；优选地，三氟乙酸：苯酚：苯甲硫醚：三异丙基硅烷＝87.5％：5％：2.5％：5％。
反相高效液相色谱的适合的填料和流动相是本领域技术人员熟知的。填料例如可以是碳载硅胶类型，如C18制备柱，其可以通过在不锈钢柱中填入C18填料制成，也可以直接通过商购获得。流动相例如可以是TFA水溶液、TFA乙腈溶液和TFA甲醇溶液中的任何一种或两种或三种。在一些优选的实施方案中，步骤(4)中所述的纯化条件为：色谱柱填料为碳载硅胶，两种流动相中的一种为质量百分比浓度为0.1％的TFA水溶液，另一种为质量百分比浓度为0.1％的TFA乙腈溶液或质量百分比浓度为0.1％的TFA甲醇溶液。
本申请在进行胸腺法新固相合成时可以采用氨基树脂，例如，Rink amide AM树脂、Rink amide树脂、Rink amide MBHA树脂、氨基2-氯三苯甲基树脂、Sieber amide树脂等。与羧基树脂如王树脂相比，氨基树脂在连接胸腺法新C端的第一个氨基酸Asn时能大大减少相应D型副产物的产生，提高总合成产率。此外，在多肽固相合成中，如果目标多肽C端的第一个氨基酸是Asn时，使用的Fmoc-Asn侧链酰胺通常采用三苯甲基(Trt)、2,4,6-三甲基苄基(Tmob)等传统保护基进行保护，但由于这些保护基的亲脂性大，体积过大且位阻过大，在合成中不利于后续氨基酸的连接，容易导致大量缺失肽的产生。本申请通过采用氨基树脂，在合成胸腺法新C端的第一个氨基酸Asn时，采用Fmoc-Asp-OtBu(此处的Asp在将胸腺法新从氨基树脂上切割下来时转变为Asn)，有效避免了缺失肽的产生，可以大大提高合成产率。
本申请在合成胸腺法新序列从N端到C端第22-23位的两个氨基酸时用Fmoc-Val-(DMB)Val-OH替代Fmoc-Val-OH。由于在Val的N上引入DMB(即，2,4-二甲氧基苄基)，破坏氢键的形成，使得合成的胸腺法新的第17-24位的氨基酸片段之间不易形成β-折叠的二级结构，大大减少多肽之间的聚集，从而有效提高缩合效率。DMB可在步骤(3)中通过切割试剂一并除去，无需加入其他试剂进行脱除，因此在合成过程中，不会额外引入其他杂质。此外，本申请采用全固相合成法，在合成时只需使用单一树脂，而且单个氨基酸之间的缩合率远远高于片段之间的缩合率，因此与片段缩合法相比，本申请的合成方法不仅降低了成本还提高了产率。
因此，本发明的有益效果是：(1)采用氨基树脂为固相载体，有效避免了采用王树脂在连接第一个氨基酸时相应的D型副产物的产生；(2)采用Fmoc-Val-(DMB)Val-OH插入序列中，解决了17-24序列容易产生二级结构导致多肽聚集的问题，大大提升了缩合效率；和(3)采用全固相合成法，避免多肽大片段的使用，一方面降低了成本，另一方面也避免了大片段难缩合的问题。综上所述，本发明提供了一条简便、副反应少、低成本的胸腺法新合成工艺。
本发明中一些常用的缩写或英文全称具有如下含义：
Fmoc：9-芴甲氧羰基
Boc：叔丁氧羰基
Trt：三苯甲基
Tmob：2,4,6-三甲基苄基
TFA：三氟乙酸
EDT：乙二硫醇
Phenol：苯酚
Thioanisole：苯甲硫醚
TES：三乙基硅烷
TIS：三异丙基硅烷
DTT：1,2二硫苏糖醇
Anisole：苯甲醚
NH4I：碘化铵
MeOH：甲醇
DCM：二氯甲烷
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
PIP：哌啶
DIEA：N,N-二异丙基乙胺
BOP：卡特缩合剂
HOBt：1-羟基苯并三氮唑
DIC：N,N-二异丙基碳化二亚胺
DCC：N,N-二环己基碳二亚胺
HOAt：N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
HBTU：苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
Fmoc-Asp-OtBu：N-(9-芴甲氧羰基)-天冬氨酸-1-叔丁酯
Fmoc-Val-(DMB)Val-OH：N-(9-芴甲氧羰基)-缬氨酰基-N-[(2,4-二甲氧基苯基)甲基]缬氨酸
Fmoc-Glu(OtBu)-OH：N-(9-芴甲氧羰基)-谷氨酸-5-叔丁酯
Adpoc：1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙氧羰基
本文所使用的术语“固相合成法”是指将目的肽的第一个氨基酸C端通过共价键与固相载体连接，再以该氨基酸N端为合成起点，经过脱去氨基保护基和过量的已活化的第二个氨基酸进行反应，接长肽链，重复操作，达到理想的合成肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，分离纯化，获得目标多肽。如本领域所公知的，用于固相合成法合成多肽的树脂包括但不限于聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺树脂、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物，这些树脂导入反应基团后可以直接连上(第一个)氨基酸。根据所导入反应基团的不同，这些树脂及树脂衍生物又可以分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。在本发明的一些实施方案中，所使用的树脂是氨基树脂，所述氨基树脂可以是导入氨基反应基团的各种适合的树脂。
本文所使用的术语“缩合试剂”包括但不限于碳二亚胺型和鎓盐型。碳二亚胺型主要包括DCC、DIC、EDC.HCl等。碳二亚胺型缩合试剂可以单独使用，也可以与其它缩合试剂组合使用。当碳二亚胺型缩合试剂与与HOBt、HOAt等组合使用时，可以将副反应控制在很低的范围。鎓盐型主要包括HBTU、HATU、PyBOP等。鎓盐型缩合试剂在使用过程中可以添加用于活化氨基酸的有机碱，如DIEA等。
本文所使用的术语“反相高效液相色谱”是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，它与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系(正相色谱)相反。可用于反相高效液相色谱的固定相和流动相是本领域技术人员熟知的，例如固定相可以是十八烷基键合硅胶，例如流动相可以是甲醇和乙腈。反相高效液相色谱是当今液相色谱的最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离。
本发明中，在进行多肽固相合成时，加入的氨基酸具有保护。氨基酸的保护包括α-氨基保护和侧链保护。α-氨基可通过Boc、Fmoc等进行保护；丝氨酸和苏氨酸侧链羟基可通过苄基、叔丁基等进行保护；天冬氨酸和谷氨酸侧链羧基可通过叔丁基等进行保护；赖氨酸侧链可通过叔丁氧羰基、1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙氧羰基(Adpoc)等进行保护；色氨酸可通过叔丁氧羰基等进行保护。对不同的氨基酸采用何种保护基团是本领域技术人员熟知的，带有保护基团的氨基酸可以通过商购获得，也可以自行合成。在本申请的优选实施方式中，多肽固相合成中采用的所有氨基酸的α氨基保护基均为Fmoc保护基，丝氨酸和苏氨酸侧链羟基保护基为叔丁基，天冬氨酸和谷氨酸侧链羧基保护基为叔丁基，赖氨酸和色氨酸侧链保护基为叔丁氧羰基。
本发明中，在接上目的多肽的全部氨基酸以后，需要脱除多肽侧链保护基并将胸腺法新从树脂上裂解下来，这一过程使用切割试剂完成。在多肽固相合成中，依据不同的树脂、不同的氨基酸序列和/或不同的保护基，可以选择不同的切割方法和/或不同的切割试剂。例如，可以选择酸性条件下切割的条件，对于PAM、MBHA树脂，可以采用HF切割，切割过程中可以添加对甲苯酚、对巯基苯酚和/或苯甲醚等试剂。对于Wang，Rink-Amide，Trt树脂，可以采用TFA切割，切割过程中还可以加入乙二硫醇、苯甲硫醚、水、三异丙基硅烷和/或苯酚等。这些添加试剂可作为碳正离子俘获试剂，用于俘获切割反应过程中生成的碳正离子，减少这些碳正离子对部分氨基酸(例如Trp、Tyr等)侧链的进攻导致的副反应。根据树脂、氨基酸序列和保护基选择合适的切割试剂属于本领域的常规技术手段。在本发明中，所使用的切割试剂优选含有TFA。所使用的切割试剂还可以含有重蒸水、三乙基硅烷、1,2二硫苏糖醇、苯酚、苯甲硫醚、碘化铵、三异丙基硅烷、苯甲醚和乙二硫醇中的任意一种或更多种。
除非另有说明，本说明书所使用的所有技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
本发明通过以下实施例作进一步举例说明，这些实施例不应解释为对本发明的限制。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
具体实施方式
实施例1：制备胸腺法新
(1)制备Fmoc-Asp-树脂复合物
向带有过滤装置的反应器中加入Rink amide AM树脂(0.5mmol/g)1g，注入10mlDMF，静置1h，过滤。
向反应器中加入10ml体积比为1：4的PIP/DMF溶液，30℃下反应20min。反应完毕后，过滤。然后加入10ml DMF洗涤树脂六遍，过滤。
取4mmol Fmoc-Asp-OtBu，4mmol HOBt及4mmol DIC，溶于10ml DMF中，加入到树脂中，30℃下反应2h。反应结束后，过滤。然后加入10ml DMF，洗涤树脂六遍，过滤。
(2)制备保护的胸腺法新-树脂复合物
向反应器中加入10ml体积比为1：4的PIP/DMF溶液，30℃下反应20min。反应完毕后，过滤。然后加入10ml DMF洗涤树脂六遍，过滤。
取4mmol Fmoc-Glu(OtBu)-OH，4mmol DIC及4mmol HOBt，溶于10ml DMF中，将所得溶液加入到反应器中，30℃下反应2h。反应结束后，过滤。然后加入10ml DMF，洗涤树脂六遍，过滤。
循环脱保护反应和缩合反应的操作，按照胸腺法新C端到N端的顺序，将其余26个氨基酸依次连接到树脂上(其中在合成胸腺法新序列从N端到C端第22-23位的两个氨基酸时用Fmoc-Val-(DMB)Val-OH替代Fmoc-Val-OH)，合成保护的胸腺法新-树脂复合物。
(3)制备胸腺法新粗品
向上述保护的胸腺法新-树脂复合物中加入10ml切割试剂(按体积百分含量计，TFA：苯酚：苯甲硫醚：EDT＝87.5％：5％：2.5％：5％)，20℃下反应2h。过滤。将滤液加入到10倍体积的乙醚中沉淀，离心后得到胸腺法新粗品。
(4)制备纯化的胸腺法新
将胸腺法新粗品溶于乙腈水溶液中，经高效液相色谱纯化得到纯化的胸腺法新，冷冻干燥后得0.652g，纯度为98.9％，产率42.1％。制备条件为：C18制备柱(在不锈钢柱中填入C18填料制成)，两种流动相分别为质量百分比浓度为为0.1％的TFA水溶液和质量百分比浓度为0.1％的TFA乙腈溶液。
实施例2：制备胸腺法新
(1)制备Fmoc-Asp-树脂复合物
向带有过滤装置的反应器中加入Rink amide MBHA树脂(0.5mmol/g)1g，注入10mlDMF，静置1h，过滤。
向反应器中加入10ml体积比为1：3的PIP/DMF溶液，20℃下反应10min。反应完毕后，过滤。然后加入10ml DMF洗涤树脂六遍，过滤。
取3mmol Fmoc-Asp-OtBu，3mmol HOBt及3mmol DIC，溶于10ml DMF中，加入到树脂中，20℃下反应4h。反应结束后，过滤。然后加入10ml DMF，洗涤树脂六遍，过滤。
(2)制备保护的胸腺法新-树脂复合物
向反应器中加入10ml体积比为1：3的PIP/DMF溶液，20℃下反应10min。反应完毕后，过滤。然后加入10ml DMF洗涤树脂六遍，过滤。
取3mmol Fmoc-Glu(OtBu)-OH，3mmol DIC及3mmol HOBt，溶于10ml DMF中，将所得溶液加入到反应器中，20℃下反应4h。反应结束后，过滤。然后加入10ml DMF，洗涤树脂六遍，过滤。
循环脱保护反应和缩合反应的操作，按照胸腺法新C端到N端的顺序，将其余26个氨基酸依次连接到树脂上(其中在合成胸腺法新序列从N端到C端第22-23位的两个氨基酸时用Fmoc-Val-(DMB)Val-OH替代Fmoc-Val-OH)，合成保护的胸腺法新-树脂复合物。
(3)制备胸腺法新粗品
向上述保护的胸腺法新-树脂复合物中加入10ml切割试剂(按体积百分含量计，TFA：苯酚：苯甲硫醚：TIS＝87.5％：5％：2.5％：5％)，0℃下反应4h。过滤。将滤液加入到10倍体积的乙醚中沉淀，离心后得到胸腺法新粗品。
(4)制备纯化的胸腺法新
将胸腺法新粗品溶于甲醇水溶液中，经高效液相色谱纯化得到纯化的胸腺法新，冷冻干燥后得0.284g，纯度为98.5％，产率30.5％。制备条件为：C18制备柱(与实施例1中相同)，两种流动相分别为质量百分比浓度为0.1％的TFA水溶液和质量百分比浓度为0.1％的TFA甲醇溶液。
实施例3：制备胸腺法新
(1)制备Fmoc-Asp-树脂复合物
向带有过滤装置的反应器中加入氨基2-氯三苯甲基树脂(0.5mmol/g)1g，注入10ml DMF，静置1h，过滤。
向反应器中加入10ml体积比为1：1的PIP/DMF溶液，60℃下反应60min。反应完毕后，过滤。然后加入10ml DMF洗涤树脂六遍，过滤。
取6mmol Fmoc-Asp-OtBu，6mmol HBTU及12mmol DIEA，溶于10ml DMF中，加入到树脂中，60℃下反应1h。反应结束后，过滤。然后加入10ml DMF，洗涤树脂六遍，过滤。
(2)制备保护的胸腺法新-树脂复合物
向反应器中加入10ml体积比为1：1的PIP/DMF溶液，60℃下反应60min。反应完毕后，过滤。然后加入10ml DMF洗涤树脂六遍，过滤。
取6mmol Fmoc-Glu(OtBu)-OH，6mmol HBTU及12mmol DIEA，溶于10ml DMF中，将所得溶液加入到反应器中，60℃下反应1h。反应结束后，过滤。然后加入10ml DMF，洗涤树脂六遍，过滤。
循环脱保护反应和缩合反应的操作，按照胸腺法新C端到N端的顺序，将其余26个氨基酸依次连接到树脂上(其中在合成胸腺法新序列从N端到C端第22-23位的两个氨基酸时用Fmoc-Val-(DMB)Val-OH替代Fmoc-Val-OH)，合成保护的胸腺法新-树脂复合物。
(3)制备胸腺法新粗品
向上述保护的胸腺法新-树脂复合物中加入10ml切割试剂(按体积百分含量计，TFA：苯酚：苯甲硫醚：EDT：水＝85％：5％：2.5％：5％：2.5％)，60℃下反应1h。过滤。将滤液加入到10倍体积的乙醚中沉淀，离心后得到胸腺法新粗品。
(4)制备纯化的胸腺法新
将胸腺法新粗品溶于甲醇水溶液中，经高效液相色谱纯化得到纯化的胸腺法新，冷冻干燥后得0.398g，纯度为98.1％，产率25.6％。制备条件为：C18制备柱(与实施例1中相同)，两种流动相分别为质量百分比浓度为0.1％的TFA水溶液和质量百分比浓度为0.1％的TFA甲醇溶液。
用本发明方法和现有技术的方法进行收率比较，结果如下：
Figure BDA0002954150760000081
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干修改和改进，这些修改和改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (16)

1.一种胸腺法新的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备Fmoc-Asp-树脂复合物：在树脂中加入Fmoc脱保护试剂以脱除Fmoc保护基，过滤并用溶剂洗涤树脂；用溶剂溶解Fmoc-Asp-OtBu及缩合试剂后，加入到树脂中进行缩合反应，反应结束后，用溶剂洗涤树脂，得到Fmoc-Asp-树脂复合物；
(2)制备保护的胸腺法新-树脂复合物：向步骤(1)得到的Fmoc-Asp-树脂复合物中加入Fmoc脱保护试剂脱除Fmoc保护基，反应结束后过滤并用溶剂洗涤树脂得到Asp-树脂复合物，然后向Asp-树脂复合物中加入胸腺法新的C端第二个氨基酸和缩合试剂进行缩合反应，缩合反应结束后用溶剂洗涤树脂；重复上述的Fmoc脱保护反应和缩合反应，按照胸腺法新从C端到N端的顺序，将其余26个氨基酸依次连接到树脂上，其中在合成胸腺法新序列从N端到C端第22-23位的两个氨基酸时加入Fmoc-Val-(DMB)Val-OH以合成这两个氨基酸，得到保护的胸腺法新-树脂复合物；
(3)制备胸腺法新粗品：向保护的胸腺法新-树脂复合物中加入切割试剂，脱除多肽侧链保护基并将胸腺法新从树脂上裂解下来，乙醚沉淀后得到胸腺法新粗品；和
(4)制备纯化的胸腺法新：采用反相高效液相色谱分离纯化胸腺法新粗品，得到纯化的胸腺法新；
其中，步骤(1)和步骤(2)中的溶剂为选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基丙酰胺、N,N-二乙基甲酰胺和N,N-二乙基乙酰胺中的任一种。
2.根据权利要求1所述的胸腺法新的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述的Fmoc脱保护试剂是体积比为1：1～4的哌啶与二甲基甲酰胺的混合物，所述Fmoc脱保护反应的温度为20℃～60℃，反应时间为10min～60min。
3.根据权利要求1或2所述的胸腺法新的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的树脂为选自Rink amide AM树脂、Rink amide树脂、Rink amide MBHA树脂、氨基2-氯三苯甲基树脂和Sieber amide树脂中的任一种。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的胸腺法新的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述的缩合试剂为缩合试剂1和缩合试剂2的组合，其中，缩合试剂1为选自N,N-二环己基碳二亚胺、N,N-二异丙基碳二亚胺、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、卡特缩合剂和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷中的任一种；缩合试剂2为选自1-羟基苯并三氮唑、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑和N,N-二异丙基乙胺中的任一种；条件是N,N-二环己基碳二亚胺或N,N-二异丙基碳二亚胺不与N,N-二异丙基乙胺组合应用。
5.根据权利要求4所述的胸腺法新的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述的缩合试剂为N,N-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三氮唑的组合，即，缩合试剂1为N,N-二异丙基碳二亚胺，缩合试剂2为1-羟基苯并三氮唑。
6.根据权利要求4所述的胸腺法新的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述的缩合试剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺的组合，即，缩合试剂1为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，缩合试剂2为N,N-二异丙基乙胺。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的胸腺法新的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的氨基酸的保护基分别为：所有氨基酸的α氨基保护基均为Fmoc保护基，丝氨酸和苏氨酸侧链羟基保护基为叔丁基，天冬氨酸和谷氨酸侧链羧基保护基为叔丁基，赖氨酸和色氨酸侧链保护基为叔丁氧羰基。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的胸腺法新的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的各试剂的摩尔比例为：氨基酸：缩合试剂1：缩合试剂2：树脂＝6～12：6～12：6～24：1；所述缩合反应的温度为20℃～60℃，反应时间为1小时～4小时。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的胸腺法新的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的切割试剂为重蒸水、三乙基硅烷、1,2二硫苏糖醇、苯酚、苯甲硫醚、碘化铵、三异丙基硅烷、苯甲醚和乙二硫醇中的至少一种与三氟乙酸的混合液，所述的混合液中三氟乙酸的体积比不小于85％；向保护的胸腺法新-树脂复合物中加入切割试剂进行反应的温度为0℃～60℃，反应时间为1小时～4小时。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的胸腺法新的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的切割试剂为苯酚、苯甲硫醚、乙二硫醇和三氟乙酸的混合液体。
11.根据权利要求10中所述的胸腺法新的制备方法，其特征在于，按体积百分含量计，三氟乙酸：苯酚：苯甲硫醚：乙二硫醇＝87.5％：5％：2.5％：5％。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的胸腺法新的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的切割试剂为苯酚、苯甲硫醚、乙二硫醇、重蒸水和三氟乙酸的混合液体。
13.根据权利要求12中所述的胸腺法新的制备方法，其特征在于，按体积百分含量计，三氟乙酸：苯酚：苯甲硫醚：乙二硫醇：重蒸水＝85％：5％：2.5％：5％：2.5％。
14.根据权利要求1-9中任一项所述的胸腺法新的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的切割试剂为苯酚、苯甲硫醚、三异丙基硅烷和三氟乙酸的混合液体。
15.根据权利要求10中所述的胸腺法新的制备方法，其特征在于，按体积百分含量计，三氟乙酸：苯酚：苯甲硫醚：三异丙基硅烷＝87.5％：5％：2.5％：5％。
16.根据权利要求1-12中任一项所述的胸腺法新的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的纯化条件为：色谱柱填料为碳载硅胶，两种流动相中的一种为质量百分比浓度为0.1％的TFA水溶液，另一种为质量百分比浓度为0.1％的TFA乙腈溶液或质量百分比浓度为0.1％的TFA甲醇溶液。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116199765A (zh) * 2022-12-29 2023-06-02 江苏诺泰澳赛诺生物制药股份有限公司 一种以修饰二肽合成胸腺法的方法

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