CN104987382A - 一种二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于多肽合成领域，涉及一种液固结合制备胸腺法新的方法，本发明采用液相方式合成连续氨基酸的二肽片段，以二肽片段投料固相合成，解决了这些位点难以偶联，容易生成缺失肽的问题，同时提高的粗肽的纯度与收率，利用此工艺制备胸腺法新，可使粗肽纯度达到75%以上。与现有技术相比，本发明合成路线简单，着重解决了困难位点不易偶联及易生成缺失肽的问题，降低了合成成本及纯化成本，利于工业大规模生产。

Description

一种二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法。     
背景技术
胸腺法新(Thymosin)，商品名日达仙，由美国SciClone公司申请，意大利Patheon 公司生产。目前已在全球五十多个国家上市，适应症有慢性乙肝，慢性丙肝，癌症辅助药物，疫苗增强剂，免疫刺激剂。此外，治疗肝癌及恶性黑色素瘤已完成二期临床。胸腺法新有着良好的安全记录，根据治疗超过30万例患者的经验看来，被证明无明显的副作用以及有很好的耐受性。胸腺法新被用于治疗老年患者(高达101岁)，儿童患者(仅13个月大)以及免疫功能低下患者，并未引发明显副作用以及毒性反应。此外，胸腺法新与其他药物，例如干扰素结合治疗时并无明显的恶化副作用的现象出现。在动物实验中，胸腺法新以高于推荐使用量800倍的剂量测试时并无证据显示不良的临床症状发生。
胸腺法新是由28个氨基酸组成的多肽，氨基酸序列如下所示：Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH 
目前，胸腺法新的合成主要有化学合成法(如 CN 10409688 A，CN 102199205)及基因工程法(如CN1431311)，其中基因工程法工艺繁琐，纯化复杂，应用不如固相合成法普遍。专利CN 102199205公开了一种逐个氨基酸偶联的固相合成方法，但该方法合成周期长，困难位点连接效率低，缺失肽严重；专利CN 10409688 A公开了一种以片段方式偶联合成胸腺法新的方法，将胸腺法新肽链分成三段，之后片段连接完成胸腺法新合成；专利201310202015.1 在合成26位Ala和27位Glu时引入片段二肽Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-OH,解决了采用CTC树脂合成胸腺法新中二肽Glu-Asn容易从树脂上断裂下来的难题；总之，这类使用肽片段的合成方法虽然解决了部分困难位点难于偶联、部分肽片段容易从树脂上断裂下来的难题，但是仍不能解决胸腺法新中多个连续氨基酸片段的合成、纯化以及偶联过程中的反应效率低、损失严重等问题。
众所周知，胸腺法新含有多个连续氨基酸片段，例如23～22位的Val～Val，20位～19位的Lys～Lys，13位～12位的Thr～Thr，9位～8位的Ser～Ser，4位～3位的Ala～Ala；在胸腺法新合成过程中经检测发现，除23位～22位的连续Val相对容易连接之外，剩余四个连续氨基酸偶联均较为困难、连接效率不高；并且在固相合成过程中，连续氨基酸往往容易产生缺失肽，且部分缺失肽在后续纯化过程中难以分离。
发明内容
为解决胸腺法新合成中所遇到的以上难点，本发明提供一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法，既能避免缺失肽的生成，又能提高总体合成效率，解决19位，12位，8位，3位偶联困难需要连续复投的问题；同时与逐个位点偶联相比，因解决了四个位点的偶联困难问题，可较大幅度的提高最终粗肽的纯度和收率。与片段偶联相比，合成过程简便，物料成本降低，有利于胸腺法新的工业化大规模生产。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)Fmoc-Lys(Boc)-OSu与H-Lys(Boc)-OH在碱A溶液中偶联生成二肽Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OSu与H-Thr(tBu)-OH在碱A溶液中偶联生成二肽Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OSu与H-Ser(tBu)-OH在碱A溶液中偶联生成二肽Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Ala-OSu与H-Ala-OH在碱A溶液中偶联生成二肽Fmoc-Ala-Ala-OH。
(b)以Wang Resin或CTC树脂为固相载体，在偶联剂存在下，依次与Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)- OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-Lys (Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Ile- OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Ala-Ala-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH发生偶联接肽反应；经N端乙酰化后，得侧链保护的胸腺法新肽树脂，其结构如下；
AC-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn (Trt)- Wang Resin；
（c）胸腺法新肽树脂经过裂解，纯化，冻干得到胸腺法新精肽。
其中步骤(a)中所述的二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)制备方法为：将H-Lys(Boc)-OH和碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20%体积的有机溶剂B助溶,待完全溶解后，搅拌下滴加入0.8～1.0倍摩尔量（以H-Lys(Boc)-OH的量计）Fmoc-Lys(Boc)-OSu有机溶剂B溶液；TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸发去掉有机溶剂后，再加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH。
    步骤(a)中所述的二肽片段Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-OH的制备方法为：将H-Thr(tBu)-OH和碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20%体积的有机溶剂B助溶,待完全溶解后，搅拌下滴加入0.8～1.0倍摩尔量（以H-Thr(tBu)-OH的量计）Fmoc-Thr(tBu)-OSu有机溶剂B溶液；TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸发去掉有机溶剂后，再加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-OH。
   步骤(a)中所述的二肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH的制备方法为：将H-Ser(tBu)-OH和碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20%体积的有机溶剂B助溶,待完全溶解后，搅拌下滴加入0.8～1.0倍摩尔量（以H-Ser(tBu)-OH的量计）Fmoc-Ser(tBu)-OSu有机溶剂B溶液；TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸发去掉有机溶剂后，再加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH。
    步骤(a)中所述的二肽片段Fmoc-Ala-Ala-OH的制备方法为：将H-Ala-OH和碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20%体积的有机溶剂B助溶,待完全溶解后，搅拌下滴加入0.8～1.0倍摩尔量（以H-Ala-OH的量计）Fmoc-Ala-OSu有机溶剂B溶液；TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸发去掉有机溶剂后，再加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Ala-Ala-OH。
    以上步骤中碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、三乙胺、二乙胺、N-乙基二异丙基胺、N,N-二异丙基乙胺等中的一种;
 有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈中的一种或几种。
步骤(a)中所述的Fmoc-Lys(Boc)-OSu的制备方法为：将Fmoc-Lys(Boc)-OH和HOSu按照摩尔比为1:1.0-1.2量溶于THF中，冰水浴下将1.0-1.2倍摩尔量的DCC/THF（以Fmoc-Lys(Boc)-OH的量计）溶液滴加到上述溶液中，1 h内滴加完毕，撤冰浴，25℃继续搅拌反应2 h；反应完成后抽滤，滤液浓缩，减压蒸去60-70%体积的有机溶剂，在剩余油状物中加入3-4倍体积的石油醚，等析出白色固体，抽滤，干燥，得Fmoc-Lys(Boc)-OSu。
步骤(a)中所述的Fmoc-Thr(tBu)-OSu的制备方法为：将Fmoc-Thr(tBu)-OH和HOSu按照摩尔比为1:1.0-1.2量溶于THF中，冰水浴下将1.0-1.2倍摩尔量的DCC/THF（以Fmoc-Thr(tBu)-OH的量计）溶液滴加到上述溶液中，1 h内滴加完毕，撤冰浴，25℃继续搅拌反应2 h；反应完成后抽滤，滤液浓缩，减压蒸去60-70%体积的有机溶剂，在剩余油状物中加入3-4倍体积的石油醚，等析出白色固体，抽滤，干燥，得Fmoc-Thr(tBu)-OSu。
步骤(a)中所述的Fmoc-Ser(tBu)-OSu的制备方法为：将Fmoc-Ser(tBu)-OH和HOSu按照摩尔比为1:1.0-1.2量溶于THF中，冰水浴下将1.0-1.2倍摩尔量的DCC/THF（以Fmoc-Ser(tBu)-OH的量计）溶液滴加到上述溶液中，1 h内滴加完毕，撤冰浴，25℃继续搅拌反应2 h；反应完成后抽滤，滤液浓缩，减压蒸去60-70%体积的有机溶剂，在剩余油状物中加入3-4倍体积的石油醚，等析出白色固体，抽滤，干燥，得Fmoc-Ser(tBu)-OSu。
步骤(a)中所述的Fmoc-Ala-OSu的制备方法为：将Fmoc-Ala-OH和HOSu按照摩尔比为1:1.0-1.2量溶于THF中，冰水浴下将1.0-1.2倍摩尔量的DCC/THF（以Fmoc-Ala-OH的量计）溶液滴加到上述溶液中，1 h内滴加完毕，撤冰浴，25℃继续搅拌反应2 h；反应完成后抽滤，滤液浓缩，减压蒸去60-70%体积的有机溶剂，在剩余油状物中加入3-4倍体积的石油醚，等析出白色固体，抽滤，干燥，得Fmoc-Ala-OSu。
其中步骤(b)中所述的Wang Resin或CTC树脂替代度为0.2～0.5 mmol/g，树脂改造后替代度为0.15～0.30 mmol/g，优选0.3mmol/g；优选的Fmoc-Asn(Trt)-OH与Wang Resin偶联反应所采用的偶联剂组合为HOBt/DIC/DMAP，HOAt/DIC/DMAP中的一种。
所述的二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法步骤(b)中，在合成至20位Lys及19位Lys时，采用二肽单体Fmoc-Lys (Boc)-Lys(Boc)-OH投料偶联反应；在合成至13位Thr及12位Thr时，采用二肽单体Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-OH投料偶联反应；在合成至9位Ser及8位Ser时，采用二肽单体Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH投料偶联反应；在合成至4位Ala及3位Ala时，采用二肽单体Fmoc-Ala-Ala-OH投料偶联反应。
步骤(b)中采用单个氨基酸或二肽片段进行投料时投料比为3-4倍量（以合成规模的摩尔量计），接肽反应时间为2～3 h，终点判断以Kaiser试剂检测现象为准；偶联反应所采用的偶联剂为DIC/HOBT，DIC/HOAT，TBTU/HOBT/DIPEA，HBTU/HOBT/DIPEA，HATU/HOAT/DIPEA中的一种。
    上述技术方案中步骤(c)中所述裂解试剂为加入体积比1-5%清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和三异丙基硅烷中的一种或几种。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
针对胸腺法新固相合成过程中连续相同的氨基酸不易偶联的特点，采用液相方法合成二肽片段，固液结合进行胸腺法新的制备。本发明解决了胸腺法新19位Lys，12位Thr，8位Ser，3位Ala偶联效率低的难题，同时完全避免了这些位点缺失肽的形成。此外，以四个二肽片段进行投料，相当于四个位点偶联效率达到百分之百，使得最终粗肽的纯度超过75%，主峰前后五分钟积分纯度超过90%，避免了难以纯化除去的缺失肽生成，大大降低了纯化成本，有利于工业大规模生产。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比，或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：
Fmoc             9-芴甲氧羰基
CTC树脂         2-氯三苯甲基氯树脂
Wang Resins       王树脂
tBu               叔丁基
Trt               三苯甲基
DCM             二氯甲烷
DMF             N,N-二甲基甲酰胺
DMAP            4-二甲氨基吡啶
DIEA             N,N-二异丙基乙胺
DIC              N,N-二异丙基碳二亚胺
HBTU            苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HATU            2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTU            O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
HOBT            1-羟基苯并三唑
HOAT            1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
TFA             三氟乙酸
HOSu            N-羟基琥珀酰亚胺
EA               乙酸乙酯
THF             四氢呋喃
PE               石油醚
实施例1：Fmoc-Lys(Boc)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 234.2 g(0.5mol)和HOSu 57.5 g (0.5 mol)溶于1000 ml 四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 103.2 g (0.5 mol)，溶于600 ml四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1 h后25度继续反应2 h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至500～600 ml，加入2000 ml 石油醚，析出大量白色固体，抽滤。滤饼以500 ml乙酸乙酯溶解，加入1500 ml石油醚，溶液澄清，置于-20 度冰箱中，2 h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Lys(Boc)-OSu 263.1g，收率93%。
实施例2：Fmoc-Lys(Boc)- Lys(Boc)-OH的制备
准确称取H-Lys(Boc)-OH 110.8 g(0.45mol)和碳酸钠57.2 g(0.54mol)溶于1000mL水中，冰浴下(2-8℃)缓慢加入Fmoc-Lys(Boc)-OSu (254.5 g, 0.45 mol)的四氢呋喃溶液800ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液冰水浴下加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，2000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相，旋蒸浓缩至1000ml，600ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，加入石油醚1000ml析晶，得Fmoc-Lys(Boc)- Lys(Boc)-OH 280.1 g，收率89.1%。
实施例3：Fmoc-Thr(tBu)-OSu的制备
准确称取Fmoc- Thr(tBu)-OH 198.74 g(0.5mol)和HOSu 63.25 g (0.55 mol)溶于1000 ml 四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 113.5 g (0.55 mol)，溶于600 ml四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1 h后25度继续反应2 h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至500～600 ml，加入2000 ml 石油醚，析出大量白色固体，抽滤。滤饼以500 ml乙酸乙酯溶解，加入1500 ml石油醚，溶液澄清，置于-20 度冰箱中，2 h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc- Thr(tBu)-OSu 234.85g，收率95%。
实施例4：Fmoc- Thr(tBu)- Thr(tBu)-OH的制备
准确称取H- Thr(tBu)-OH 78.85 g(0.45mol)和碳酸钠94.8 g(0.9mol)溶于1000mL水中，冰浴下(2-8℃)缓慢加入Fmoc- Thr(tBu)-OSu (222.56 g, 0.45 mol)的四氢呋喃溶液800ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液冰水浴下加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，2000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相，旋蒸浓缩至1000ml，600ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，加入石油醚1000ml析晶，得Fmoc- Thr(tBu)- Thr(tBu)-OH 217.1 g，收率87.3%。
实施例5：Fmoc-Ser(tBu)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Ser(tBu)-OH 191.73 g(0.5mol)和HOSu 69.0 g (0.6 mol)溶于1000 ml 四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 123.8 g (0.6 mol)，溶于600 ml四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1 h后25度继续反应2 h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至500～600 ml，加入2000 ml 石油醚，析出大量白色固体，抽滤。滤饼以500 ml乙酸乙酯溶解，加入1500 ml石油醚，溶液澄清，置于-20 度冰箱中，2 h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Ser(tBu)-OSu 221.11g，收率92%。
实施例6：Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH的制备
准确称取H-Ser(tBu)-OH 72.54 g(0.45mol)和碳酸钠47.4 g(0.45mol)溶于1000mL水中，冰浴下(2-8℃)缓慢加入Fmoc-Ser(tBu)-OSu (216.24 g, 0.45 mol)的四氢呋喃溶液800ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液冰水浴下加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，2000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相，旋蒸浓缩至1000ml，600ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，加入石油醚1000ml析晶，得Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH 209.4 g，收率88.3%。
实施例7：Fmoc-Ala-OSu的制备
准确称取Fmoc-Ala-OH 155.67 g(0.5mol)和HOSu 57.5 g (0.5 mol)溶于1000 ml 四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 103.2 g (0.5 mol)，溶于600 ml四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1 h后25度继续反应2 h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至500～600 ml，加入2000 ml 石油醚，析出大量白色固体，抽滤。滤饼以500 ml乙酸乙酯溶解，加入1500 ml石油醚，溶液澄清，置于-20 度冰箱中，2 h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Ala -OSu 194.2g，收率95%。
实施例8：Fmoc-Aa-Ala-OH的制备
准确称取H-Ala-OH 40.05g(0.45mol)和碳酸钠47.4 g(0.45 mol)溶于1000mL水中，冰浴下(2-8℃)缓慢加入Fmoc-Ala-OSu (183.80 g, 0.45 mol)的四氢呋喃溶液800ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液冰水浴下加入10% 的HCl水溶液调溶液pH值至2～3，2000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相，旋蒸浓缩至1000 ml，600 ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，加入石油醚1000 ml析晶，得Fmoc-Ala-Ala-OH 146.54 g，收率85.4%。
实施例9: Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin的合成
称取30.0 g(Sub=0.47 mmol/g)置于固相反应器，以DMF洗涤树脂两次，200 ml/次，重新加入DCM 200 ml溶胀树脂30 min。树脂活化同时，称取Fmoc-Asn(Trt)-OH 25.21 g(42.3 mmol, 3 eq),HOBt 6.28 g(46.5 mmol, 3.3eq)，以150 ml体积比为1:1的DMF和DCM的混合溶液溶解，冰浴10 min，加入DIC 7.25ml(46.5 mmol, 3 eq)活化5 min。树脂溶胀及氨基酸活化完成后，投料反应，氮气搅拌，10 min后加入DMAP 0.51g(4.23 mmol, 0.3 eq)，继续反应5 h。5 h后，抽掉反应液，DMF洗涤树脂4次，200 ml/每次；DCM洗涤树脂2次，200 ml/次。加入封端试剂180 mL(50 ml乙酸酐和42.5 ml吡啶溶解于87.5 mL DMF中)将剩余未反应羟基乙酰化，2 h。反应完成后抽滤反应液，分别以DMF，DCM，甲醇洗涤树脂2次，200 ml/次，真空干燥后得Fmoc-Asn(Trt)-Wang  Resin 44.2 g，替代度为0.31 mmol/g。
实施例10: Fmoc-Asn(Trt)-CTC Resin的合成
称取CTC树脂30.0g(sub=0.40mmol/g)置于合成柱中，用200mL DMF 洗涤两次,加入200mL DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入溶有7.15g(12mmol) Fmoc-Asn(Trt)-OH的DCM/DMF(3/1,体积比)溶液100ml，搅拌后加入DIPEA 4.0ml(24mmol)，鼓N2反应60min，抽掉反应液，加入DCM/CH3OH/DIPEA (体积比17：2：1) 混合溶液200ml封端3次，每次10min；然后用DMF、DCM、甲醇分别洗涤2次，真空干燥得Fmoc-Asn(Trt)-CTC Resins 36.5g。测替代度为0.29mmol/g.
    实施例11：胸腺法新肽树脂的制备
准确称取替代度为0.31 mmol/g 的Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin 32.26 g(合成规模10 mmol)置于固相反应器中，DMF洗涤树脂2次，150 ml/次，加入150 ml DCM溶胀30min；树脂溶胀完毕后以20 %的哌啶/DMF脱Fmoc 2次，150 ml/次，分别反应5min和10min；脱保护完成后以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，150 ml/次。取小样以Kaiser试剂检测，树脂呈深蓝色。
称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH 12.75 g(30 mmol，3 eq)，HOBt 4.05 g(30 mmol，3 eq)，以120 ml体积比为1:1的DMF，DCM溶液溶解，冰水浴10 min，加入DIC 4.68 ml(30 mmol，3 eq)活化5 min。活化完成后投料反应，氮气搅拌2 h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，检测反应完成后，抽滤除去反应液，以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，200 ml/次。以20 %的哌啶/DMF脱Fmoc 2次，150 ml/次，分别反应5min和10min；脱保护完成后以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，150 ml/次。取小样以Kaiser试剂检测，树脂呈深蓝色，27位Glu偶联完成。
按照27位Glu的偶联方法，依照胸腺法新肽序，依次连接氨基酸及二肽片段：Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Ala-Ala-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，乙酰化。完成肽树脂合成，依次以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，甲醇洗涤2次，200 ml/次，树脂25度真空干燥8 h，称重得68.21 g。
实施例12：胸腺法新肽树脂的制备
准确称取替代度为0.29 mmol/g 的Fmoc-Asn(Trt)-CTC Resin 34.48 g(合成规模10 mmol)置于合成柱中，DMF洗涤树脂2次，150 ml/次，加入150 ml DCM溶胀30min；树脂溶胀完毕后以20 %的哌啶/DMF脱Fmoc 2次，150 ml/次，分别反应5min和10min；脱保护完成后以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，150 ml/次。取小样以Kaiser试剂检测，树脂呈深蓝色。
称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH 12.75 g(30 mmol，3 eq)，HOBt 4.05 g(30 mmol，3 eq)，以120 ml体积比为1:1的DMF，DCM溶液溶解，冰水浴10 min，加入DIC 4.68 ml(30 mmol，3 eq)活化5 min。活化完成后投料反应，氮气搅拌2 h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，检测反应完成后，抽滤除去反应液，以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，200 ml/次。以20 %的哌啶/DMF脱Fmoc 2次，150 ml/次，分别反应5min和10min；脱保护完成后以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，150 ml/次。取小样以Kaiser试剂检测，树脂呈深蓝色，27位Glu偶联完成。
按照27位Glu的偶联方法，依照胸腺法新肽序，依次连接氨基酸及二肽片段：Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Ala-Ala-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，乙酰化。完成肽树脂合成，依次以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，甲醇洗涤2次，200 ml/次，树脂25度真空干燥8 h，称重得64.34 g。
实施例13：胸腺法新粗肽的制备
   将实施例11所制备的胸腺法新肽树脂68.21 g置于1000 ml圆底烧瓶中，冰浴预冷。配置裂解试剂 900 ml，其组成为TFA:TIS:水=94:1:5，体积比，并将其置于-20冰箱中预冷30 min。按照1 g树脂12 ml的比例将裂解试剂加入到肽树脂中，冰水浴搅拌2 h，25度搅拌2 h，停止反应后抽滤，树脂以剩余的裂解试剂洗涤两次，50 ml/次，合并滤液，缓慢倾倒至8 L预冷的乙醚中，搅拌，置于-20冰箱中静置1 h。将乙醚沉降液离心，并以乙醚洗涤六次，离心所得固体干燥，得35.21 g，收率115.3 %。取粗肽样品分析，纯度为75.4 %。
实施例14：胸腺法新粗肽的制备
   将实施例12所制备的胸腺法新肽树脂64.00 g置于1000 ml圆底烧瓶中，冰浴预冷。配置裂解试剂 600 ml，其组成为TFA:TIS:水=94:1:5，体积比，并将其置于-20冰箱中预冷30 min。按照1 g树脂12 ml的比例将裂解试剂加入到肽树脂中，冰水浴搅拌2 h，25度搅拌2 h，停止反应后抽滤，树脂以剩余的裂解试剂洗涤两次，50 ml/次，合并滤液，缓慢倾倒至6 L预冷的乙醚中，搅拌，置于-20冰箱中静置1 h。将乙醚沉降液离心，并以乙醚洗涤六次，离心所得固体干燥，得28.96 g，收率93.18 %。取粗肽样品分析，纯度为75.9 %。
实施例15：胸腺法新粗肽的纯化
    称取实施例13所得粗肽35 .0g，以500 ml 5 %的乙腈/水溶解，超声助溶，0.45 um滤膜过滤。
内径为100 mm 的C 18制备柱，流动相A为0.1%TFA/水，流动相B为 0.1%TFA/乙腈，上样量为10g/针，流速300ml/min，检测波长 210 nm。梯度洗脱，峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度为99.5%以上的精肽溶液，转盐后冻干得胸腺法新精肽16.1 g，纯度99.5%以上，总收率 51.9%。
实施例16：胸腺法新粗肽的纯化
    称取实施例14所得粗肽28.0 g，以500 ml 5 %的乙腈/水溶解，超声助溶，0.45 um滤膜过滤。
内径为100 mm 的C 18制备柱，流动相A为0.1%TFA/水，流动相B为 0.1%TFA/乙腈，上样量为10g/针，流速300ml/min，检测波长 210 nm。梯度洗脱，峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度为99.5%以上的精肽溶液，转盐后冻干得胸腺法新精肽12.9 g，纯度99.5%以上，总收率 41.6%。

Claims (10)

1.一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法，其特征在于，包括如下步骤：（a）Fmoc-Lys(Boc)-OSu与H-Lys(Boc)-OH在碱A溶液中偶联生成二肽Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OSu与H-Thr(tBu)-OH在碱A溶液中偶联生成二肽Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OSu与H-Ser(tBu)-OH在碱A溶液中偶联生成二肽Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH；Fmoc-SAla-OSu与H-Ala-OH在碱A溶液中偶联生成二肽Fmoc-Ala-Ala-OH ;
(b)以Wang Resin或CTC树脂为固相载体，在偶联剂存在下，依次与Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)- OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-Lys (Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-  Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Ile- OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Ala-Ala-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH发生偶联接肽反应；经N端乙酰化后，得侧链保护的胸腺法新肽树脂，其结构如下：
 (c)胸腺法新肽树脂经过裂解，纯化，冻干得到胸腺法新精肽。
2. 根据权利要求1所述的一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)- OH的制备方法为：将H-Lys(Boc)-OH和碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20%体积的有机溶剂B助溶,待完全溶解后，搅拌下滴加入0.8～1.0倍摩尔量（以H-Lys(Boc)-OH的量计）Fmoc-Lys(Boc)-OSu有机溶剂B溶液；TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸发去掉有机溶剂后，再加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH。
3.根据根据权利要求1所述的一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的二肽片段Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-OH的制备方法为：将H-Thr(tBu)-OH和碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20%体积的有机溶剂B助溶,待完全溶解后，搅拌下滴加入0.8～1.0倍摩尔量（以H-Thr(tBu)-OH的量计）Fmoc-Thr(tBu)-OSu有机溶剂B溶液；TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸发去掉有机溶剂后，再加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-OH。
4.根据根据权利要求1所述的一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的二肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH的制备方法为：将H-Ser(tBu)-OH和碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20%体积的有机溶剂B助溶,待完全溶解后，搅拌下滴加入0.8～1.0倍摩尔量（以H-Ser(tBu)-OH的量计）Fmoc-Ser(tBu)-OSu有机溶剂B溶液；TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸发去掉有机溶剂后，再加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH。
5.根据根据权利要求1所述的一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的二肽片段Fmoc-Ala-Ala-OH的制备方法为：
将H-Ala-OH和碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20%体积的有机溶剂B助溶,待完全溶解后，搅拌下滴加入0.8～1.0倍摩尔量（以H-Ala- OH的量计）Fmoc-Ala-OSu有机溶剂B溶液；TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸发去掉有机溶剂后，再加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Ala-Ala-OH。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法，其特征在于：所述的碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、三乙胺、二乙胺、N-乙基二异丙基胺、N,N-二异丙基乙胺等中的一种;所述有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈中的一种或一种以上的混合液。
7.根据权利要求1所述的一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法，其特征在于，步骤(b)中所述的Wang Resin或CTC树脂替代度为0.2～0.5 mmol/g。
8.根据权利要求1所述的一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法，其特征在于，步骤(b)中，在合成至20位Lys及19位Lys时，采用二肽单体Fmoc-Lys (Boc)-Lys(Boc)-OH投料偶联反应；在合成至13位Thr及12位Thr时，采用二肽单体Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-OH投料偶联反应；在合成至9位Ser及8位Ser时，采用二肽单体Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH投料偶联反应；在合成至4位Ala及3位Ala时，采用二肽单体Fmoc-Ala-Ala-OH投料偶联反应。
9.根据权利要求1所述的一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法，其特征在于，步骤(b)中所述的偶联剂为：DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/ HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种。
10.根据权利要求1所述的一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法，其特征在于，步骤(c)中所述的裂解试剂为加入体积比1-5%清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水、三异丙基硅烷中的一种或几种。
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