CN103694336A - 一种固液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种片段缩合制备胸腺肽α1的方法，属于生化技术领域。该方法利用高荷载量（≥0.8mmol/g树脂）的树脂为起始原料，先采用标准的固相多肽合成(SPPS)技术合成选定结构的高纯度肽片段，再采用固相和/或液相片段缩合技术连接肽片段，从而获得高纯度(＞99%)的目标肽。相比较固相合成胸腺肽α1的工艺，本发明避免了12位以后氨基酸偶联率低的问题，大大提高了胸腺肽α1的收率（达25～30%）；同时固相合成的肽片段不必纯化；最终用高效液相色谱纯化胸腺肽α1，降低制备难度，减少制备次数，大大简化了后处理工艺，降低了胸腺肽α1的合成成本，有利于实现规模化、产业化生产。

Description

一种固液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法
技术领域
本发明属于生化技术领域，涉及一种胸腺肽α1的合成方法，尤其涉及一种固液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法。 
背景技术
胸腺肽α1(又称胸腺素α1、胸腺法新)是一种具有下式结构的胸腺肽：Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH。胸腺肽α1是哺乳动物胸腺中存在的单一组分的多肽化合物，是由28个氨基酸残基和N端氨基酸乙酰化构成的多肽，是与免疫细胞发育分化相关的分子，具有使T淋巴细胞分化、增殖、提高细胞免疫功能的作用，能破坏被感染的靶细胞，还可激活NK细胞活性，促进与免疫相关的细胞因子的产生。胸腺肽α1的活性较胸腺五肽高10到1000倍，是复合治疗慢性乙肝、丙肝、免疫缺陷综合症药物，在非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤治疗中也发挥了较大的作用。胸腺肽α1于1997年由意大利赛生(Sciclone)公司开发上市，现己被24个国家批准用于慢性乙型肝炎(HBV)的治疗，在欧美日等国也用于治疗丙型肝炎(HCV)、肝细胞癌及增强免疫疾病的治疗。 
   1983年公开的美国专利US4504415使用全液相合成胸腺肽α1。最近的胸腺肽α1及其类似物的制备方法主要有两种，其中一种是采用生物合成技术，在2003年1月1日公开的中国发明专利(CN1388133A)中，利用人工基因合成技术获得胸腺肽α1的全序列。另一种为固相合成方法，“化学学报”2004年第55卷第2期《胸腺素α1的DIC固相化学合成与鉴定》中提到，以Wang Resin为起始原料，通过激活试剂DIC+HOBt将Fmoc-Asn(Trt)-OH与树脂相连接；“天津药学”2001年6月第13卷第3期《Fmoc新型固相法合成胸腺素α1及其反应途径》中提到，以HMP树脂为起始原料，通过激活试剂DCC+ HOBt将Fmoc-Asn(Trt)-OH与树脂相连接。中国专利CN200610024610.0、CN200680014615.3、CN200710024406.3、CN200780024724.8、CN201110069876.8均为固相合成胸腺肽α1。 
综合参考国内外关于胸腺肽α1制备方法以及相关的合成报道文献，发现这些技术都存在一些不足，主要表现在：①全液相合成费时，需要良好的后处理技术；②生物合成技术难以规模化生产；③常规固相合成方法难以获得高纯度的胸腺肽α1，而且收率低（5~10%），导致生产成本高。 
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种固液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法。 
本发明一种固液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法，包括在固相支持体上合成胸腺肽α1的侧链保护肽片段，在固/液相中缩合侧链保护肽片段，形成保护的胸腺肽α1，然后将侧链和羧基端去保护，获得目的肽。其具体制备工艺如下： 
（1）将结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽的氨基端去保护，得NH2-KEKKEVVEEAEN-Y；
其中，结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽用以下方法合成：
a、将结构为Fmoc-EAEN-COOH的侧链保护肽羧基端保护，得到结构为Fmoc-EAEN-Y的侧链保护肽；并将肽氨基端去保护，得结构为NH2-EAEN-Y的侧链保护肽；
b、采用液相片段缩合方法，使肽NH2-EAEN-Y与结构为Fmoc-EVVE-COOH的侧链保护肽反应，产生结构Fmoc-EVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽；并对该肽氨基脱保护，得结构为NH2-EVVEEAEN-Y的侧链保护肽片段；
c、采用液相片段缩合方法，使肽NH2-EVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-KEKK-COOH的侧链保护肽反应，获得结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽。
上述结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽也可以用以下方法合成： 
a、将结构为Fmoc-EVVEEAEN-COOH的侧链保护肽羧基端进行保护，得到结构为Fmoc-EVVEEAEN-Y的侧链保护肽片段，并使该肽片段的氨基端去保护，得到结构为NH2-EVVEEAEN-Y的侧链保护肽；
其中Fmoc-EVVEEAEN-COOH侧链保护肽可采用经典的固相合成方法合成，也可以采用固相片段缩合工艺合成，即将Fmoc-EVVE-COOH侧链保护肽在固相体系中以1.5eq缩合于肽树脂NH2-EAEN-resin上，进而裂解肽树脂得到Fmoc- EVVEEAEN-COOH侧链保护肽。
b、采用液相片段缩合方法，将侧链保护肽NH2-EVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-KEKK-COOH的侧链保护肽反应，产生结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽。 
上述结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽还可用以下方法合成： 
a、将结构为Fmoc-EAEN-COOH的侧链保护肽羧基端保护，得到结构为Fmoc-EAEN-Y的侧链保护肽，并使肽氨基端去保护，得侧链保护肽NH2-EAEN-Y；
b、采用液相片段缩合方法，使侧链保护肽NH2-EAEN-Y与结构为Fmoc-KEKKEVVE-COOH的侧链保护肽反应，产生Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽。
（2）采用液相片段缩合方法使结构为NH2-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽与结构为Fmoc-EITTKDL-COOH的侧链保护肽缩合，得到结构为Fmoc-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽；再脱去氨基Fmoc保护，得侧链保护肽NH2-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y； 
（3）采用液相片段缩合方法将侧链保护肽NH2-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-SDAAVDTSS-COOH的侧链保护肽缩合，产生结构为Fmoc-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽，然后脱去氨基端Fmoc保护，并将氨基末端乙酰化，产生结构为Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽。
或采用液相片段缩合方法将侧链保护肽NH2-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y与结构为Ac-SDAAVDTSS-COOH的侧链保护肽反应，产生结构为Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽。 
（4）将肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y侧链保护肽的侧链和羧基去保护，得目标肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH。 
上述各步骤中涉及的片段中，Y为叔丁基、苄酯基、对硝基苄酯基、三苯甲基。各步骤所涉及的肽片段均以2-氯代三苯甲基氯树脂为起始原料，采用经典的固相合成方法制得。 
上述合成产物经高效液相色谱分析、质谱分析，表明目标肽成功合成。 
本发明相对现有技术具有以下优点： 
1、本发明利用高荷载量（≥0.8mmol/g树脂）的树脂为起始原料，先采用标准的固相肽合成(SPPS)技术，合成选定结构的高纯度肽片段，再采用固相和/或液相片段缩合技术使肽片段缩合，从而获得高纯度(＞99%)的目标肽；
2、相比较固相合成胸腺肽α1的工艺，本发明避免了12位以后氨基酸偶联率低的问题，大大提高了胸腺肽α1的收率（达25～30%）；
3、对生产的肽片段不必用色谱技术来纯化，只需要使用前进行沉淀、研磨，大大简化了后处理工艺；在最终高效液相色谱纯化中减少制备次数，降低了胸腺肽α1的合成成本，有利于实现规模化、产业化生产。
附图说明
图1为本发明制备的胸腺肽α1粗肽分析高效液相色谱图； 
图2为本发明制备的胸腺肽α1纯肽分析高效液相色谱图；
图3为本发明制备的胸腺肽α1纯肽质谱图；
图4为实施例一中五片段合成胸腺肽α1的工艺路线图；
图5为实施例二中四片段合成胸腺肽α1的工艺路线图；
图6为实施例四中四片段合成胸腺肽α1的工艺路线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明片段组合制备胸腺肽α1的方法作进一步说明。下列各实施例中，合成胸腺肽α1所涉及的目的肽及中间体的各个肽片段的氨基酸序列见表l。各实施例中肽片段组合方式见表2。中间片段肽的氨基酸序列见表3。本发明所涉及氨基酸的缩写见的表4。 
Figure DEST_PATH_314907DEST_PATH_IMAGE001
Figure DEST_PATH_169731DEST_PATH_IMAGE002
实施例一、五片段法合成胸腺肽α1
1.树脂的合成
1.1制备Fmoc-Asn(Trt)-2-氯-三苯甲基氯树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.8mmol/g树脂，1 eq.)加入150 mL多肽合成器（自制），用60mL DCM洗涤溶胀树脂30分钟。抽干溶剂，加入Fmoc-Asn(Trt)-OH (1.6 eq.)和DIEA (2.5eq.)的30 mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10 mL（2ml/g树脂）对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。抽干溶剂，用3×60 mL DMF、3×60 mL DCM、3×60 mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得7.06gFmoc-Asn(Trt)-2-氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷栽量为0.52 mmol/g。
1.2制备Fmoc-Glu(OtBu)-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.8mmol/g树脂，1 eq.)加入150 mL多肽合成器，用6mL DCM洗涤溶胀树脂。排干树脂床，加入Fmoc-Glu(OtBu)-OH (1.5 eq.)和DIEA (2.5eq.)的30 mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10 mL（2ml/g树脂）对树脂上的活性部分进行30分钟封端。排干树脂床，用3×60 mLDMF、3×60 mLDCM、3×60 mLMeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得6.41gFmoc-Asn(Trt)-2氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷栽量为0.565 mmol/g。 
1.3 制备Fmoc-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.8mmol/g树脂，1 eq.)加入150 mL多肽合成器，用60mL DCM洗涤溶胀树脂。排干树脂床，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH (1.5 eq.)和DIEA (2.5eq.)的30 mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10 mL（2ml/g树脂）对树脂上的活性部分进行30分钟封端。排干树脂床，用3×60 mLDMF、3×60 mLDCM、3×60 mLMeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得6.69g Fmoc-Lys(Boc)-2氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷栽量为0.58 mmol/g。 
1.4 制备Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.8mmol/g树脂，1 eq.)加入150 mL多肽合成器，用60mL DCM洗涤溶胀树脂。排干树脂床，加入Fmoc-Leu-OH (1.5 eq.)和DIEA (2.5eq.)的30 mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10 mL（2ml/g树脂）对树脂上的活性部分进行30分钟封端。排干树脂床，用3×60 mL DMF、3×60 mLDCM、3×60 mLMeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得6.21gFmoc-Leu-2氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷栽量为0.62 mmol/g。 
1.5制备Fmoc-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.8mmol/g树脂，1 eq.)加入150 mL多肽合成器（自制），用100mL DCM洗涤溶胀树脂。排干树脂床，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH (1.5 eq.)和DIEA (2.5eq.)的25 mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10 mL（2ml/g树脂）对树脂上的活性部分进行30分钟封端。排干树脂床，用3×60 mLDMF、3×60 mLDCM、3×60 mLMeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得6.23g Fmoc-Asn(Trt)-2氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷栽量为0.57 mmol/g。 
2 肽片段制备 
2.1制备片段Ac-AA(1-9)-OH
向150 mL肽反应室中加入5g Fmoc-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂。加入60 mL DCM中搅拌约30分钟溶胀树脂，然后抽干。用2×50 mL 20%哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50 mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物（二苯并富烯和其哌啶加合物）和残余哌啶，然后按茚三酮试验测定。    
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(1.5 eq.)、HOBT (1.5 eq.)和DIEA (1.5eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU (1.5 eq.)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5 mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50 mL DMF洗涤树脂。
依次用Fmoc-保护的氨基酸Thr (tBu)、Asp(OtBu)、Val、Ala、Ala、Asp(OtBu)、Ser (tBu)各1.5当量，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，脱去N末端Fmoc保护，用乙酸酐和吡啶(各8 eq.)的25mL NMP: DMF(3：1)乙酰化所述树脂结合肽30分钟，抽干树脂床，用3×60 mL DMF、3×60 mL DCM、3×60 mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得8.05g树脂结合肽。 
用100 mL l% TFA的DCM处理约1小时，然后用2 × 50 mL 0.5%TFA的DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶（与TFA体积比1：1）上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10 mL体积，然后用10 mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约 10mL。加入100 mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100 mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得3.31g纯度92% Ac-AA (1-9)-OH，产率93%。 
上述制备的片段Ac-AA(1-9)-OH的结构如下（见表3序列2a）： 
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-COOH。
分子式：C58H103N9O19，分子量：MW：1229.74。 
2.2制备肽片段Fmoc-AA(10-16)-OH 
向150 mL肽反应室中加入5g Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂。在60 mL DCM中搅拌约30分钟溶胀树脂，然后抽干。用2×50 mL 20%哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50 mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物（二苯并富烯和其哌啶加合物）和残余哌啶，然后按茚三酮试验测定。    
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(1.5 eq.)、HOBT (1.5 eq.)和DIEA (1.5eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。在氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU (1.5 eq.)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5 mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50 mL DMF洗涤树脂。
用Fmoc-保护的氨基酸Lys(Boc)、Thr (tBu)、Thr (tBu)、Ile、Glu (OtBu)各1.5当量，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，不脱除最后一个氨基酸的Fmoc保护，3×60 mL DCM、3×60 mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得8.65g树脂结合肽。 
用100 mL l% TFA的DCM处理约1小时，然后用2 x 50 mL 0.5%TFA的DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶（与TFA体积比1：1）上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10 mL体积，然后用10 mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约 10mL。加入100 mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100 mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得4.02g 纯度95%的Fmoc-AA(10-16)-OH，产率95%。 
上述制备的肽片段Fmoc-AA(10-16)-OH的结构如下 （见表3序列3a）： 
Fmoc-Glu (OtBu)-Ile-Thr (tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-COOH。
分子式：C71H112N8O18，分子量：MW：1364.81。 
2.3制备肽片段Fmoc-AA(17-20)-OH 
向150 mL肽反应室中加入5g Fmoc-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂。在60 mL DCM中搅拌约30分钟溶胀树脂，然后抽干。用2×50 mL 20%哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂。用50 mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物（二苯并富烯和其哌啶加合物）和残余哌啶，然后按茚三酮试验测定。    
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(1.5 eq.)、HOBt (1.5 eq.)和DIEA (1.5eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU (1.5 eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5 mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50 mL DMF洗涤树脂。
用Fmoc-保护的氨基酸Glu (OtBu)、Lys(Boc)各1.5当量，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，不脱去脱去N末端Fmoc保护， 3×60 mL DCM、3×60 mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得7.46g树脂结合肽。 
用100 mL l% TFA的DCM处理约1小时，然后用2 x 50 mL 0.5%TFA的DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶（与TFA体积比1：1）上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10 mL体积，然后用10 mL 乙醇重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约 10mL。加入100 mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100 mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得3.08g纯度95%的Fmoc-AA(17-20)-OH，产率97%。 
上述制备的肽片段Fmoc-AA(17-20)-OH的结构如下（见表3序列5a）： 
Fmoc-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-COOH。
分子式：C57H87N7O15，分子量：MW：1109.63。 
2.4制备肽片段Fmoc-AA(21-24)-OH 
向150 mL肽反应室中加入5g Fmoc-Glu(OtBu)-2-氯-三苯甲基树脂。在60 mL DCM中搅拌约30分钟溶胀树脂，然后抽干。用2×50 mL 20%哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50 mLDMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物（二苯并富烯和其哌啶加合物）和残余哌啶，然后按茚三酮试验测定。    
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Val-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(1.5 eq.)、HOBt (1.5 eq.)和DIEA (1.5eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU (1.5 eq.)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5 mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50 mL DMF洗涤树脂。
用Fmoc-保护的氨基酸Val、Glu (OtBu)各1.5当量，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，不脱去N末端Fmoc保护，用3×60 mL DCM、3×60 mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得5.57g树脂结合肽。 
用100 mL l% TFA的DCM处理约1小时，然后用2 × 50 mL 0.5%TFA的DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶（与TFA体积比1：1）上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10 mL体积，然后用10 mL 乙醇重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约 10mL。加入100 mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100 mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得2.19g纯度96%的Fmoc-AA(21-24)-OH，产率97%。 
制备肽片段Fmoc-AA(21-24)-OH的结构如下（见表3序列8a）： 
Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-COOH。
分子式：C43H60N4O11，分子量：MW 808.43。 
2.5制备片段Fmoc-AA(25-28)-OH 
向150 mL肽反应室中加入5g Fmoc-Asn(Trt)-2-氯-三苯甲基树脂。在60 mL DCM中搅拌约30分钟溶胀树脂，然后抽干。用2×50 mL 20%哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂。用50 mLDMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物（二苯并富烯和其哌啶加合物）和残余哌啶，然后按茚三酮试验测定。    
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(1.5 eq.)、HOBt (1.5 eq.)和DIEA (1.5eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU (1.5 eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5 mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50 mL DMF洗涤树脂。
用Fmoc-保护的氨基酸Ala、Glu(OtBu)各1.5当量，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，不脱去N末端Fmoc保护，用3x60 mL DCM、3x60 mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得8.15g树脂结合肽。 
用100 mL l% TFA的DCM处理约1小时，然后用2 × 50 mL 0.5%TFA的DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶（与TFA体积比1：1）上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10 mL体积，然后用10 mL 乙醇重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约 10mL。加入100 mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100 mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得2.51g纯度94% Fmoc-AA(25-28)-OH，产率93%。 
上述制备的片段Fmoc-AA(25-28)-OH的结构如下（见表3序列9a）： 
Fmoc-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-COOH；
分子式：C59H64N5O12，分子量：MW 1034.46。
3片段缩合 
3.1 Fmoc-AA(25-28)-OH与叔丁基三氯乙酰亚胺酯制备片段Fmoc-AA(25-28)-OtBu
在100 mL圆底烧瓶中加入上述合成的Fmoc-AA(25-28)-OH 1.04g，加入DCM:DMF:TBTA=7:1:2溶液20 mL，加温至35℃磁力搅拌反应1小时，TLC监测，反应完全后，加入冷冻甲基叔丁基醚（MTBE）60 mL沉淀产物，搅拌1小时去除TBTA，过滤沉淀，干燥，得到Fmoc-AA(25-28)-OtBu 1.08 g，收率99%。
反应过程TLC控制，TLC条件： 氯仿/甲醇/TFE=80:6:6（5滴醋酸）； UV，碘检测； Rf： Fmoc-AA(25-28)-OH, 0.18；Rf: Fmoc-AA(25-28)-OtBu, 0.66。 
片段Fmoc-AA(25-28)-OtBu的结构如下（见表3序列9b）： 
Fmoc-Glu (OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asn (Trt)-COOtBu
分子式：C63H72N5O12，分子量：MW 1090.52。
3.2制备NH2-AA(25-28)-OtBu 
在50 mL圆底烧瓶中加入上述合成的Fmoc-AA(25-28)-OtBu 1.04g，加入DMF 16.8 mL溶解，滴加哌啶3.2mL至最终浓度16%，反应2小时，TLC监测，反应完全后将反应物加入100 mL冰水中沉淀产物，冰水洗涤过滤沉淀2遍，真空干燥。干燥产物加入冷冻MTBE 60 mL搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到NH2-AA(25-28)-OtBu 0.78g，收率95%。
TLC控制反应过程。TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf： NH2-AA(25-28)-OtBu, 0.17；Rf: Fmoc-AA(25-28)-OtBu, 0.66。 
制备的NH2-AA(25-28)-OtBu的结构如下（见表 3序列9c）： 
NH2-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu；
分子式：C48H62N5O10，分子量：MW 868.45。
3.3通过液相缩合片段Fmoc-AA(21-24)-OH与NH2-AA(25-28)-OtBu得到Fmoc-AA(21-28)-OtBu 
在50 mL圆底烧瓶中加入上述合成的NH2-AA(25-28)-OtBu 0.76g、Fmoc-AA(21-24)-OH 0.75g和HOBt 0.131g。将所述固体溶解于含有DIEA的DMF (15 mL)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入HBTU 0.367g。在0℃搅袢反应混合物1小时，然后升温至室温，再搅拌1小时。转移至250mL烧瓶中加入水(100mL)从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用水(20 mL)洗涤，并干燥获得1.81g粗品Fmoc-AA(21-28)-OtBu。在室温下用MTBE (100 mL)研磨所述固体3小时，真空过滤收集，并干燥获得1.33g Fmoc-AA(21-28)-OtBu，收率90%。
生产过程TLC控制，TLC条件： 
氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf：NH2-AA(25-28)-OtBu，0.17；Rf： Fmoc-AA(21-24)-OH，0.11；Rf: Fmoc-AA(21-28)-OtBu，0.71。
制备的Fmoc-AA(21-28)-OtBu的结构如下（见表3序列8b）： 
Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。
分子式：C91H120N9O20，分子量：MW 1658.86。 
3.4制备NH2-AA(21-28)-OtBu 
在50 mL圆底烧瓶中加入1.5合成的Fmoc-AA(21-28)-OtBu 1.24g，加入DMF 13.8 mL溶解，滴加哌啶至最终浓度16%，反应2小时，TLC监测，HPLC检定，反应完全后反应物加入60mL冰水中沉淀产物，冰水20 mL洗涤过滤沉淀2遍，真空干燥。加入冷冻MTBE 60 mL搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到NH2-AA(21-28)-OtBu 1.05g，收率97%。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf： NH2-AA(21-28)-OtBu, 0.20；Rf: Fmoc-AA(21-28)-OtBu，0.71。 
制备的NH2-AA(21-28)-OtBu的结构如下（见表3序列8c）： 
NH2-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。
分子式：C76H110N9O18，分子量：MW 1436.79。 
3.5通过液相缩合片段制备Fmoc-AA(17-28)-OtBu 
在100 mL圆底烧瓶中加入NH2-AA(21-28)-OtBu 1.00g、Fmoc-AA(17-20)-OH 0.816g和HOBt 0.104g。将所述固体溶解于含有DIEA（0.199g）的DMF (20 mL)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入HBTU 0.292g。在0℃搅袢反应混合物1小时，然后升温至室温，再搅拌1小时。加入水(60mL)从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用水(20 mL×2)洗涤，并干燥获得1.85g粗品Fmoc-AA(17-28)-OtBu。在室温下用MTBE (100 mL)研磨所述固体3小时，真空过滤收集，并干燥获得1.61g Fmoc-AA(17-28)-OtBu，收率91%。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf： NH2-AA(21-28)-OtBu, 0.20；Rf: Fmoc-AA(17-20)-OH, 0.10；Rf: Fmoc-AA(17-28)-OtBu, 0.36。 
制备的 Fmoc-AA(17-28)-OtBu的结构如下（见表 3序列7b）： 
Fmoc-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。分子式：C133H195N16O32，分子量：MW 2528.41。
3.6制备NH2-AA(17-28)-OtBu 
在50 mL圆底烧瓶中加入合成的Fmoc-AA(17-28)-OtBu 1.57g，加入DMF 16.8 mL溶解，滴加哌啶至最终浓度16%，反应2小时，TLC监测，HPLC检定，反应完全后反应物加入冰水中沉淀产物，冰水洗涤过滤沉淀2遍，真空干燥。加入冷MTBE 60 mL搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到NH2-AA(17-28)-OtBu 1.39g，收率97%。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf： NH2-AA(17-28)-OtBu, 0.11；Rf: Fmoc-AA(17-28)-OtBu, 0.36。 
制备的NH2-AA(17-28)-OtBu的 结构如下（见表3序列7c）： 
NH2-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。
分子式：C118H185N16O30，分子量：MW 2306.34。 
3.7通过液相缩合片段Fmoc-AA(10-16)-OH与NH2-AA(17-28)-OtBu得到Fmoc-AA(10-28)-OtBu 
在100 mL圆底烧瓶中加入NH2-AA(17-28)-OtBu 1.34g、Fmoc-AA(10-16)-OH 0.87g和HOBt 0.087g。将所述固体溶解于含有DIEA（0.165g）的DMF (15 mL)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入HBTU 0.242g。在0℃搅拌反应混合物1小时，然后升温至室温，再搅拌1小时。加入水(50mL)从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用水(20 mL×2)洗涤，并干燥获得1.933g粗品Fmoc-AA(10-28)-OtBu。在室温下用MTBE (50 mL)磁力搅拌沉淀3小时，真空过滤收集，并干燥获得 Fmoc-AA(10-28)-OtBu 1.74g，收率92%。
反应过程TLC控制。TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf：NH2-AA(17-28)-OtBu, 0.11；Rf: Fmoc-AA(10-16)-OH, 0.15；Rf: Fmoc-AA(10-28)-OtBu, 0.56。 
制备的Fmoc-AA(10-28)-OtBu的结构如下（见表3序列4b）： 
Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。
分子式：C169H263N24O39，分子量：MW 3259.93。 
3.8制备NH2-AA(10-28)-OtBu 
在50 mL圆底烧瓶中加入Fmoc-AA(10-28)-OtBu 1.73g，加入DMF 16.8 mL溶解，滴加哌啶至最终浓度16%，反应2小时，TLC监测，HPLC检定，反应完全后反应物加入60mL冰水中沉淀产物，冰水洗涤过滤沉淀2遍，真空干燥。加入冷MTBE 60 mL搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到NH2-AA(10-28)-OtBu 1.54g，收率96%。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf: Fmoc-AA(10-28)-OtBu, 0.56；Rf: NH2-AA(10-28)-OtBu, 0.18。 
制备的NH2-AA(10-28)-OtBu的结构为（见表3序列4c）： 
NH2-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。
分子式：C154H253N24O37，分子量：MW 3030.87。 
3.9通过液相缩合片段Ac-AA(1-9)-OH与NH2-AA(10-28)-OtBu得到Ac-AA(1-28)-OtBu 
在50 mL圆底烧瓶中加入NH2-AA(10-28)-OtBu 1.52g、Ac-AA(1-9)-OH 0.676g和75mg HOAt。将所述固体溶解于含有DIEA（0.143g）的DMF (15 mL)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入HBTU 0.209g。在0℃搅袢反应混合物2小时，然后升温至室温，再搅拌2小时。加入水(35mL)从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用水(20 mL)洗涤，并干燥获得2.321g粗品Fmoc-AA(10-28)-OtBu。在室温下用MTBE (50 mL)搅拌沉淀3小时，真空过滤收集，并干燥获得2.18g Fmoc-AA(1-28)-OtBu，收率94%。
生产过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf: NH2-AA(10-28)-OtBu, 0.18；Rf：Ac-AA(1-9)-OH, 0.13（无紫外显色，只有碘显色）；Rf: Ac-AA(1-28)-OtBu, 0.45。 
制备的Ac-AA(1-28)-OtBu的结构为（见表3序列1a）： 
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。
分子式：C232H386N33O63，分子量：MW 4642.80。 
4 制备胸腺肽α1粗肽 
4.1 通过去除侧链保护Ac-AA(1-28)-OtBu制备胸腺肽α1粗肽
在250 mL圆底烧瓶中加入三氟乙酸/水/三异丙基硅烷/1,2-乙二硫醇(92.5: 2.5: 2.5: 2.5(v/v/v/v%,)溶液50 mL，并冷却至0℃。向该冷却溶液中加入加入Ac-AA(1-28)-OtBu 2g。在0℃搅拌所述淤浆直到所述固体溶解（约5分钟），然后升温至室温，搅拌3小时。将该溶液加入0℃乙醚70 mL中沉淀所述肽。以3000 rpm离心旋转淤浆5分钟，从所述固体倾析乙醚。将所述固体再悬浮于乙醚(50 mL)中，以3000rpm离心旋转5分钟，倾析乙醚。重复该过程一次，然后将固体溶解于含有1%(体积)乙酸的1：l水／乙腈(30 mL)中，在室温下保存24小时。将该溶液冷冻，然后用冷冻干燥器冷冻干燥获得1.28mg胸腺肽α1粗肽，产率96%。胸腺肽α1粗肽的色谱图见图1。
4.2 HPLC纯化胸腺肽α1粗肽 
30 mg胸腺肽α1粗肽经制备型HPLC纯化产生全长胸腺肽α1纯品16.1mg，产率53.6%。
HPLC纯化条件：色谱柱：Waters C18 250×19, 5u, 130A；流速：8mL/min；检测：UV，210 nm；流动相：A．5%乙腈/H2O/0.05% TFA；B．80%乙腈/H2O/0.05% TFA；5%B，10分钟；5-15%B，10分钟；15-50%B，20分钟。胸腺肽α1纯肽色谱图见图2（色谱方法为2010版中国药典方法），纯肽质谱图见图3。 
胸腺肽α1的结构如下： 
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH。分子式：C129H215N33O55，分子量：MW：3107.5041。
本实施例五片段合成胸腺肽α1的工艺路线如图4所示。 
实施例二、四片段法制备胸腺肽α1
    1、树脂制备
1.1 Fmoc-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂的合成：同实施例一。
1.2 Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂的合成：同实施例一。 
1.3 Fmoc-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂的合成：同实施例一。 
    1.4制备Fmoc-Asn(Trt)-2-氯-三苯甲基树脂：由于直接合成Fmoc-AA(21-28)-OH，需要较低的树脂取代值。将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.8mmol/g树脂，1 eq.)加入150 mL多肽合成器，用60mL DCM洗涤溶胀树脂30分钟。抽干溶剂，加入Fmoc-Asn(Trt)-OH (1.3 eq，3.097g)和DIEA (2.5eq. 1.65mL)的30 mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10 mL（2ml/g树脂）对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。抽干溶剂，用3×60 mL DMF、3×60 mL DCM、3×60 mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得6.56g Fmoc-Asn(Trt)-2-氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷栽量为0.425 mmol/g。 
2.片段制备 
2.1片段Ac-AA(1-9)-OH的合成：同实施例一。
2.2 Fmoc-AA(10-16)-OH的合成：同实施例一。 
2.3Fmoc-AA(17-20)-OH的制备：同实施例一。 
2.4固相制备片段Fmoc-AA(21-28)-OH 
向150 mL肽反应室中加入5g Fmoc-Asn(Trt)-2-氯-三苯甲基树脂。在60 mL DCM中搅拌约30分钟溶胀树脂，然后抽干。用2×50 mL 20%哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用60 mLDMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物和残余哌啶，然后按茚三酮试验测定。    
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(1.5 eq.)、HOBt (1.5 eq.)和DIEA (1.5eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU (1.5 eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5 mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50 mL DMF洗涤树脂。
用Fmoc-保护的氨基酸Ala、Glu (OtBu)、 Glu(OtBu)、Val、Val、Glu(OtBu)各1.5当量，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，不脱去N末端Fmoc保护，用3×60 mL DCM、3×60 mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得8.77g树脂结合肽。 
用100 mL l% TFA的DCM处理约1小时，然后用2 × 50 mL 0.5%TFA的DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶（与TFA体积比1：1）上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10 mL体积，然后用10 mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约 10mL。加入100 mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100 mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得2.98g 纯度92% Fmoc-AA(21-28)-OH，产率88%。 
上述制备的片段Fmoc-AA(21-28)-OH的结构如下（表3序列8a）： 
Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-COOH (序列13a)。分子式：C87H112N9O20，分子量：MW：1602.80。
3片段缩合过程 
3.1通过Fmoc-AA(21-28)-OH与叔丁基三氯乙酰亚胺酯（TBTA）制备片段Fmoc-AA(21-28)-OtBu
在100 mL圆底烧瓶中加入1mmol Fmoc-AA(21-28)-OH（1.6g），加入DCM:DMF:TBTA=7:1:2溶液20 mL，加温至35℃磁力搅拌反应1小时，TLC监测，反应完全后，加入冷MTBE  80 mL沉淀产物，搅拌1小时去除TBTA，过滤沉淀，干燥，得到Fmoc-AA(21-28)-OtBu 1.61g，收率97%，92%HPLC纯。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE=9:0.5:0.5；UV，碘检测；Rf: Fmoc-AA(21-28)-OH, 0.16；Rf: Fmoc-AA(21-28)-OtBu, 0.71。 
片段Fmoc-AA(21-28)-OtBu的结构（序列8b）： 
Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。
分子式：C91H120N9O20，分子量：MW 1658.86。 
其余片段NH2-AA(21-28)-OtBu、Fmoc-AA(17-28)-OtBu、NH2-AA(17-28)-OtBu、Fmoc-AA(10-28)-OtBu、NH2-AA(10-28)-OtBu、Ac-AA(1-28)-OtBu的制备缩合同实施例一。 
4、胸腺肽α1的制备及纯化 
通过去除侧链保护Ac-AA(1-28)-OtBu制备胸腺肽α1粗肽及纯化胸腺肽α1粗肽与实施例一相同。
实施例四片段合成胸腺肽α1的工艺路线如图5所示。 
实施例三、四片段法制备胸腺肽α1
其余各步骤同实施例二。片段Fmoc-AA(21-28)-OH采用以下固相片段缩合制得：
向150 mL肽反应室中加入5g Fmoc-Asn(Trt)-2-氯-三苯甲基树脂。在60 mL DCM中搅拌约30分钟溶胀树脂，然后抽干。用2×50 mL 20%哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50 mLDMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物（二苯并富烯和其哌啶加合物）和残余哌啶，然后按茚三酮试验测定。    
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(1.5 eq.)、HOBt (1.5 eq.)和DIEA (1.5 eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU (1.5 eq.)，搅拌5分钟溶解。氩气保护下将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5 mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3x50 mL DMF洗涤树脂。
用Fmoc-保护的氨基酸Ala、Glu (OtBu)各1.5当量，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，脱去N末端Fmoc保护，投入Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-OH 2.577g（1.5 eq.），加入DIC(1.575 eq.)、HOBt（1.575 eq.），在冰浴下反应2小时，升温至室温反应2小时，用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。抽干树脂床，用3×60 mL DMF、3×60 mL DCM、3×60 mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得9.55g树脂结合肽。 
用100 mL l% TFA的DCM处理约1小时，然后用2 x 50 mL 0.5%TFA的DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶（与TFA体积比1：1）上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10 mL体积，然后用10 mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约 10mL。加入100 mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100 mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得3.23g纯度95% Fmoc-AA(21-28)-OH，产率95%。片段Fmoc-AA(21-28)-OH的结构如下（表3序列8a）： 
Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-COOH；
分子式：C87H112N9O20，分子量：MW：1602.80。
实施例四、四片段法制备胸腺肽α1
    1、树脂制备
Fmoc-Asn(Trt)-2-氯-三苯甲基树脂、Fmoc-Glu(OtBu)-2-氯-三苯甲基树脂、Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂、Fmoc-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂的合成方法同实施例一。
2 片段制备 
片段Ac-AA(1-9)-OH、Fmoc-AA(10-16)-OH、Fmoc-AA(25-28)-OH的制备方法同实施例一。
2.1固相制备片段Fmoc-AA(17-24)-OH 
向150 mL肽反应室中加入5g Fmoc-Glu(OtBu)-2-氯-三苯甲基树脂。在60 mL DCM中搅拌约30分钟溶胀树脂，然后抽干。用2×50 mL 20%哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用60 mLDMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物和残余哌啶，然后按茚三酮试验测定。    
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Val-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(1.5 eq.)、HOBt (1.5 eq.)和DIEA (1.5eq.)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU (1.5 eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5 mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50 mL DMF洗涤树脂。
用Fmoc-保护的氨基酸Val、Glu(OtBu)、Lys(Boc)、Lys(Boc)、Glu(OtBu)、Lys(Boc)各1.5当量，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，不脱去N末端Fmoc保护，用3×60 mL DCM、3×60 mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得8.77g树脂结合肽。 
用100 mL l% TFA的DCM处理约1小时，然后用2 × 50 mL 0.5%TFA的DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶（与TFA体积比1：1）上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10 mL体积，然后用10 mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约 10mL。加入100 mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100 mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得2.77g 纯度92% Fmoc-AA(17-24)-OH，产率90%。 
上述制备的片段Fmoc-AA(17-24)-OH的结构如下（表3序列6a）： 
Fmoc-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-COOH (序列9a)；分子式：C87H112N9O20，分子量：MW：1602.80。 
3片段缩合过程 
3.1 Fmoc-AA(25-28)-OtBu、NH2-AA(25-28)-OtBu的制备同实施例一。
3.2 通过液相缩合片段Fmoc-AA(17-24)-OH与NH2-AA(25-28)-OtBu得到Fmoc-AA(17-28)-OtBu。 
在100 mL圆底烧瓶中加入上述合成的NH2-AA(25-28)-OtBu 0.764g、Fmoc-AA(17-24)-OH 1.48g和HOBt 0.131g。将所述固体溶解于含有DIEA的DMF (15 mL)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入HBTU 0.367g。在0℃搅袢反应混合物1小时，然后升温至室温，再搅拌1小时。加入水(80mL)从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用水(20 mL)洗涤，并干燥获得1.81g粗品Fmoc-AA(17-28)-OtBu。在室温下用MTBE (100 mL)研磨所述固体3小时，真空过滤收集，并干燥获得1.33g Fmoc-AA(17-28)-OtBu，收率90%。 
生产过程TLC控制，TLC条件： 
氯仿/甲醇/TFE=80:6:6；UV，碘检测；Rf：NH2-AA(25-28)-OtBu，0.17；Rf： Fmoc-AA(17-24)-OH，0.13；Rf: Fmoc-AA(17-28)-OtBu，0.36。
制备的 Fmoc-AA(17-28)-OtBu的结构如下（见表 3序列7b）： 
Fmoc-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OtBu。分子式：C133H195N16O32，分子量：MW 2528.41。
其余片段NH2-AA(17-28)-OtBu、Fmoc-AA(10-28)-OtBu、NH2-AA(10-28)-OtBu、Ac-AA(1-28)-OtBu的制备缩合同实施例一。 
4、胸腺肽α1的制备及纯化 
通过去除侧链保护Ac-AA(1-28)-OtBu制备胸腺肽α1粗肽及纯化胸腺肽α1粗肽与实施例一相同。
本实施例四片段合成胸腺肽α1的工艺路线如图6所示。 

Claims (6)

1.一种固液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法，包括以下工艺步骤：
（1）将结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽的氨基端去保护，得NH2-KEKKEVVEEAEN-Y；
（2）采用液相片段缩合方法使结构为NH2-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽与结构为Fmoc-EITTKDL-COOH的侧链保护肽缩合，得到结构为Fmoc-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽；再脱去氨基Fmoc保护，得肽NH2-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y；
（3）采用液相片段缩合方法将肽NH2-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-SDAAVDTSS-COOH的侧链保护肽缩合，产生结构为Fmoc-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽，然后脱去氨基端Fmoc保护，并将氨基末端乙酰化，产生结构为Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽；
或采用液相片段缩合方法将肽NH2-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y与结构为Ac-SDAAVDTSS-COOH的侧链保护肽反应，产生结构为Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽；
（4）将肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y侧链保护肽的侧链和羧基去保护，得目标肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH；
上述Y为叔丁酯基、苄酯基、对硝基苄酯基或三苯甲基。
2.如权利要求1所述固液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法，其特征在于：结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽用以下方法合成：
（1）将结构为Fmoc-EAEN-COOH的侧链保护肽羧基端保护，得到结构为Fmoc-EAEN-Y的侧链保护肽；并将肽氨基端去保护，得结构为NH2-EAEN-Y的侧链保护肽；
（2）采用液相片段缩合方法，使肽NH2-EAEN-Y与结构为Fmoc-EVVE-COOH的侧链保护肽反应，产生结构Fmoc-EVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽；并对该肽氨基脱保护，得结构为NH2-EVVEEAEN-Y的肽片段；
（3）采用液相片段缩合方法，使肽NH2-EVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-KEKK-COOH的侧链保护肽反应，获得结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽；
上述Y为叔丁酯基、苄酯基、对硝基苄酯基或三苯甲基。
3.如权利要求1所述固液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法，其特征在于：结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽用以下方法合成：
（1）将结构为Fmoc-EVVEEAEN-COOH侧链保护肽羧基端进行保护，得到结构为Fmoc-EVVEEAEN-Y的侧链保护肽片段，并使该肽片段的氨基端去保护，得到结构为NH2-EVVEEAEN-Y的侧链保护肽；
（2）采用液相片段缩合方法，将侧链保护肽NH2-EVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-KEKK-COOH的侧链保护肽反应，得结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽；
上述Y为叔丁酯基、苄酯基、对硝基苄酯基或三苯甲基。
4.如权利要求3所述固液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法，其特征在于步骤（1）中的Fmoc-EVVEEAEN-COOH侧链保护肽用固相片段缩合工艺合成：将Fmoc-EVVE-COOH侧链保护肽在固相体系中以1.5eq缩合于肽树脂NH2-EAEN-resin上，进而裂解肽树脂得到Fmoc- EVVEEAEN-COOH侧链保护肽。
5.如权利要求1所述固液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法，其特征在于：结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽用以下方法合成：
（1）将结构为Fmoc-EAEN-COOH的侧链保护肽羧基端保护，得到结构为Fmoc-EAEN-Y的肽，并使肽氨基端去保护，得肽NH2-EAEN-Y侧链保护肽；
（2）采用液相片段缩合方法，使肽NH2-EAEN-Y与结构为Fmoc-KEKKEVVE-COOH的侧链保护肽反应，产生Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽；
上述Y为叔丁酯基、苄酯基、对硝基苄酯基或三苯甲基。
6.如权利要求1～5所述固相液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法，其特征在于：各肽片段是以2-氯代三苯甲基氯树脂为起始原料，采用经典的固相合成方法制得。
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