CN104371008B - 片段缩合制备特利加压素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特利加压素的片段缩合方法，固相制备特利加压素的全保护第一肽片段序列树脂，环化形成二硫键，然后将环化的全保护第一肽片段序列从树脂上裂解下来；液相中环化的全保护第一肽片段序列与H‑Gly‑NH2缩合得到环化的全保护第二肽片段序列；液相或者固相制备特利加压素的第三肽片段序列；环化的全保护第二肽片段序列脱氨基端保护后与第三肽片段序列缩合，然后脱去所有保护基得到特利加压素粗品，纯化转盐得到产品醋酸特利加压素；第一肽片段序列为特利加压素序列中的第4‑11位氨基酸，第二肽片段序列为特利加压素序列中的第4‑12位氨基酸，第三肽片段序列为特利加压素序列中的第1‑3位氨基酸。
Description
技术领域
本发明涉及制药领域，具体地说，涉及一种醋酸特利加压素的制备方法。
背景技术
特利加压素的化学名称为三甘氨酰赖氨酸加压素，结构式如下：
它是一种新型的人工合成的长效血管加压素制剂，主要用于胃肠道和泌尿生殖系统的出血，如食道静脉曲张、胃和十二指肠溃疡、功能性及其它原因引起的子宫出血、生产和/或流产等等引起的出血的治疗，与血管加压素相比，它作用持久，不引起危险性并发症。
目前特利加压素的制备方法主要以固相缩合为主。例如专利CN1865282B和CN101693738A和201310214366.4，均以Rink Amide或者Sieber树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt或PyBOP/HOBt/DIEA为缩合剂，依次逐个接上氨基酸，裂解获得还原型粗品，氧化获得特利加压素粗品，最后HPLC进行分离纯化，获得目标产物。
以上方法有如下一些问题：a)固相合成随着肽链的增长，偶联越来越困难，尤其是最后几个氨基酸的缩合；最近另一申请专利《一种特利加压素及其杂质的超高效液相色谱检测方法》(专利申请号：201310673625.X)指出逐个固相合成会出现多个氨基末端的缺陷肽。b)使用Rink Amide或者Sieber树脂羧基端氨基酸取代值不能太高，合成不经济；并且两种树脂相对于2-氯-三苯甲基氯树脂价格不菲，尤其后者。c)液相氧化二硫键反应时间较长，产生较多废液。所以本领域技术人员仍然期待以高产品收率获得具有良好品质的产品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有制备方法收率低，而且产品纯化困难，不易得到高纯度的特利加压素的缺点，提供一种片段缩合制备特利加压素的方法，提高了产率和纯度；由于采用2-氯-三苯甲基氯树脂和固相环化使得成本降低，利于大规模生产。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
方案一：
一种特利加压素的片段缩合方法，固相制备特利加压素的全保护第一肽片段序列树脂，在固相中使用I2氧化两个半胱氨酸形成二硫键，然后将环化的全保护第一肽片段序列从树脂上裂解下来；液相中环化的全保护第一肽片段序列与H-Gly-NH2缩合得到环化的全保护第二肽片段序列；液相或者固相制备特利加压素的第三肽片段序列；环化的全保护第二肽片段序列脱氨基端保护后与第三肽片段序列缩合，然后脱去侧链保护得到特利加压素粗品，经纯化转盐得到产品醋酸特利加压素；
第一肽片段序列为特利加压素序列中的第4-11位氨基酸，
第二肽片段序列为特利加压素序列中的第4-12位氨基酸，
第三肽片段序列为特利加压素序列中的第1-3位氨基酸。
上述特利加压素的片段缩合方法具体包括如下步骤：
a.固相制备特利加压素的全保护第一肽片段序列树脂；
所述的全保护第一肽片段序列为：
Fmoc-Cys(R1)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(R1)-Pro-Lys(Boc)-OH，
其中，R1为Trt或者Acm；
I2氧化全保护第一肽片段序列树脂，使得第4和第9位的半胱氨酸形成二硫键，得到环化的全保护第一肽片段序列树脂；将环化的全保护第一肽片段序列从固相树脂上裂解；
b.将步骤a得到的脱除了固相树脂的环化的全保护第一肽片段序列与H-Gly-NH2缩合得到环化的全保护第二肽片段序列；
c.液相或者固相合成特利加压素的第三肽片段序列；
所述的第三肽片段序列为：R2-Gly-Gly-Gly-OH，其中R2为Boc或者Fmoc；
d.脱除步骤b得到的环化的全保护第二肽片段序列的氨基端保护基，然后与步骤c得到的第三肽片段序列缩合得到全保护特利加压素；
e.将全保护特利加压素裂解脱去所有保护基得到特利加压素粗品；
f.特利加压素粗品经纯化转盐得到醋酸特利加压素。
步骤a中，全保护第一肽片段序列树脂是由氨基酸依次偶联在固相树脂上获得的，其中，所用的固相载体为酸敏感树脂，优选为2-氯-三苯甲基氯树脂；
固相制备特利加压素的全保护第一肽片段序列树脂的过程中，所使用的氨基脱保护试剂为20％哌啶的DMF溶液(V/V)、或者1％DBU的DMF溶液(V/V)；优选20％哌啶的DMF溶液(V/V)；
所用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；待偶联的氨基酸与HOBt的摩尔比是1:1。
使用的二硫键氧化剂为I2，二硫键与I2摩尔比为1:5～10，溶剂为DMF或者DCM。优选二硫键与I2摩尔比为1:6。反应时间优选为2小时。
使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物。优选体积百分含量为0.5～1％TFA的DCM溶液。
步骤b中，缩合反应使用的缩合剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者EDC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合，优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；缩合反应的溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合，优选DMF。
步骤c中，
液相合成Boc-Gly-Gly-Gly-OH的方法是，首先Boc-Gly-OH与H-Gly-OMe反应得到Boc-Gly-Gly-OMe，脱去Boc保护后与Boc-Gly-OH反应得到Boc-Gly-Gly-Gly-OMe，皂化得到Boc-Gly-Gly-Gly-OH；
液相合成Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH的方法是，首先Fmoc-Gly-OH与H-Gly-OtBu反应得到Fmoc-Gly-Gly-OtBu，脱去Fmoc保护后与Fmoc-Gly-OH反应得到Fmoc-Gly-Gly-Gly-OtBu，然后TFA:DCM按体积比1:1反应，得到Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH。
固相合成R2-Gly-Gly-Gly-OH的方法是，Fmoc-Gly-OH与2-氯-三苯甲基氯树脂反应得到肽树脂，脱去Fmoc保护后与Fmoc-Gly-OH反应得到二肽树脂，再脱去Fmoc保护后与R2-Gly-OH反应得到三肽树脂；用裂解剂将R2-Gly-Gly-Gly-OH从固相树脂上裂解，得到R2-Gly-Gly-Gly-OH，其中，所述的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物。
步骤d中，氨基脱保护为16％的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；缩合反应使用的缩合剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者EDC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合，优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；缩合反应的溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合，优选DMF。
步骤e中，全保护特利加压素裂解使用的裂解液为TFA与H2O按体积比95:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhoH与H2O按体积比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H2O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。优选TFA与EDT与TIS与H2O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。
步骤f中，纯化为反相高效液相色谱纯化换盐，即色谱柱为C18柱；流动相为醋酸水溶液和乙腈水溶液。
方案二：
一种特利加压素的片段缩合方法，固相制备特利加压素的全保护第四肽片段序列树脂，在固相中使用I2氧化两个半胱氨酸形成二硫键，然后将环化的全保护第四肽片段序列从树脂上裂解下来；液相中环化的全保护第四肽片段序列与H-Gly-NH2缩合，然后脱去侧链保护得到特利加压素粗品，经纯化转盐得到产品醋酸特利加压素；
第四肽片段序列为特利加压素序列中的第1-11位氨基酸。
上述特利加压素的片段缩合方法具体包括如下步骤：
a.固相制备特利加压素的全保护第四肽片段序列树脂，
所述的第四肽片段序列为：
R2-Gly-Gly-Gly-Cys(R1)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(R1)-Pro-Lys(Boc)-OH，其中R1为Trt或者为Acm，R2为Boc或者Fmoc；
I2氧化全保护第四肽片段序列树脂，使得第4和第9位的半胱氨酸形成二硫键，得到环化的全保护第四肽片段序列树脂；将环化的全保护第四肽片段序列从固相树脂上裂解；
b.将步骤a得到的脱除了固相树脂的环化的全保护第四肽片段序列与H-Gly-NH2缩合得到全保护特利加压素；
c.将全保护特利加压素裂解脱去所有保护基得到特利加压素粗品；
d.特利加压素粗品经纯化转盐得到醋酸特利加压素。
步骤a中，全保护第四肽片段序列树脂是由氨基酸依次偶联在固相树脂上获得的，其中，所用的固相载体为酸敏感树脂，优选为2-氯-三苯甲基氯树脂；
固相制备特利加压素的全保护第四肽片段序列树脂的过程中，所使用的氨基脱保护试剂为20％哌啶的DMF溶液(V/V)、或者1％DBU的DMF溶液(V/V)；优选20％哌啶的DMF溶液(V/V)；
所用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；待偶联的氨基酸与HOBt的摩尔比是1:1。
使用的二硫键氧化剂为I2，二硫键与I2摩尔比为1:5～10，溶剂为DMF或者DCM。优选二硫键与I2摩尔比为1:6。反应时间优选为2小时。
使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物。优选体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液。
步骤b中，缩合反应使用的缩合剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者EDC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合，优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；缩合反应的溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合，优选DMF
步骤c中，全保护特利加压素裂解使用的裂解液为TFA与H2O按体积比95:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhOH与H2O按体积比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H2O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。优选TFA与EDT与TIS与H2O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。
步骤d中，纯化为反相高效液相色谱纯化换盐，即色谱柱为C18柱；流动相为醋酸水溶液和乙腈水溶液。
有益效果：本发明相对现有技术具有以下优点：
1、本发明利用高荷载量(>0.8mmol/g树脂)的树脂为起始原料，先采用标准的固相肽合成(SPPS)技术合成选定结构的高纯度肽片段，再采用液相缩合技术使肽片段缩合，从而获得高纯度(>99％)、高收率(>40％)的目标肽；
2、相比较固相合成特利加压素的工艺，本发明：
a.2-氯-三苯甲基氯树脂重复使用方法简便，相比Rink Amide树脂价格低廉；每个片段可使用高荷载量(>0.8mmol/g树脂)的固相载体，相比较Rink Amide树脂荷载量限制(0.25-0.4mmol/g树脂)，物料通量增加；
b.氨基酸及试剂投量为1.5-2倍量，远低于固相肽合成常规的3-4倍甚至5倍过量，节约物料成本；
c.固相环化利用固相载体假稀释作用，使得环化产率提高，减少反应时间。
3、采用超酸敏感型树脂合成的10个或10个左右氨基酸的侧链保护肽片段序列纯度非常高，不必用色谱技术纯化，只需要进行沉淀、研磨即可使用；片段液相偶合，其杂质主要为未偶合的片段，而不是缺少一个或数个氨基酸的缺陷肽，在最终高效液相色谱纯化中容易得多，从而减少制备次数，降低了特利加压素的制备成本，有利于实现规模化、产业化生产。
附图说明
图1为本发明制备的特利加压素粗肽分析色谱图；
图2为本发明制备的特利加压素纯肽分析色谱图；
图3为本发明制备的特利加压素纯肽质谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明中，合成特利加压素所涉及的目的肽及中间体的各个肽片段的氨基酸序列见表l。本发明中肽片段组合方式见表2。本发明所涉及氨基酸的缩写见表3。本发明中所使用的物料缩写的含义见表4。
表1 特利加压素相应的编码氨基酸序列
| 肽序号 | 氨基酸序列 | 特利加压素相应的编码氨基酸序 |
| 特利加压素(目标肽) | H-GGGc[CYFQNC]PKG-NH2 | 1-12 |
| 第一肽片段序列 | c[CYFQNC]PK-OH | 4-11 |
| 第二肽片段序列 | c[CYFQNC]PKG-NH2 | 4-12 |
| 第三肽片段序列 | H-GGG-OH | 1-3 |
| 第四肽片段序列 | H-GGGc[CYFQNC]PK-OH | 1-11 |
表2 组合方法
表3：本专利所涉及氨基酸的缩写
| 氨基酸 | 单字母缩写 | 三字母缩写 |
| 天冬酰胺 | N | Asn |
| 半胱氨酸 | C | Cys |
| 谷氨酰胺 | Q | Gln |
| 甘氨酸 | G | Gly |
| 赖氨酸 | K | Lys |
| 苯丙氨酸 | F | Phe |
| 脯氨酸 | P | Pro |
| 酪氨酸 | Y | Tyr |
本文中，“取代值”指的是单位量的树脂负载的物质的数量，单位为“mmol/g”。
表4 本发明所使用的物料缩写含义
| 英文缩写 | 全称 |
| Fmoc | 9-芴甲氧羰基 |
| 2-CTC Resin | 2-氯-三苯甲基氯树脂 |
| RP-HPLC | 反相高效液相色谱 |
| DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
| NMP | N-甲基吡咯烷酮 |
| DMSO | 二甲基亚砜 |
| DCM | 二氯甲烷 |
| DIEA | N,N-二异丙基乙胺 |
| HOBt | 1-羟基苯并三氮唑 |
| HOAt | 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑 |
| PyBOP | 六氟磷酸苯并三氮唑-1-基-氧基三吡咯烷基 |
| EDC | 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺 |
| HBTU | 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐 |
| DIC | N,N-二异丙基碳二亚胺 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| EDT | 1，2-乙二硫醇 |
| TIS | 三异丙基硅烷 |
| Boc- | 叔丁氧羰基 |
| -Acm | 2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基 |
| -tBu | 叔丁基 |
| -Trt | 三苯甲基 |
实施例1：三片段制备醋酸特利加压素。
1.树脂制备
1.1制备Fmoc-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.84mmol/g树脂，1eq)加入150mL多肽合成器，用60mL DCM洗涤树脂。抽干溶剂，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(1.3eq)和DIEA(2.5eq)的30mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10mL(2ml/g树脂)对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。抽干溶剂，用3×50mL DMF、3×50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得6.08g Fmoc-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷载量为0.5mmol/g。
1.2制备Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.84mmol/g树脂，1eq)加入150mL多肽合成器，用60mL DCM洗涤树脂。抽干溶剂，加入Fmoc-Gly-OH(1.3eq)和DIEA(2.5eq)的30mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10mL(2ml/g树脂)对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。抽干溶剂，用3×50mL DMF、3×50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得5.78g Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷载量为0.6mmol/g。
2.片段制备
2.1肽片段Fmoc-AA(4-11)-OH(已环化)的制备：
向150mL肽反应室中加入5g Fmoc-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂。加入60mL DCM搅拌溶胀树脂，抽干。用2×50mL 20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，茚三酮试验测定。
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Pro-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq)、HOBT(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mL DMF洗涤树脂。
依次用Fmoc-保护的氨基酸Cys(Trt)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、Phe、Tyr(tBu)、Cys(Trt)各2eq，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，加入6当量的I2/DMF，反应2小时，抽干，反复使用DMF洗涤，抽干树脂床，用3×50mL DMF、3×50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得9.48g树脂结合肽。
用100mL l％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL 0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10mL体积，然后用10mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约10mL。加入100mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得4.33g纯度95％Fmoc-AA(4-11)-OH(已环化)，产率93％。
上述制备的片段Fmoc-AA(4-11)-OH(已环化)的结构如下：
分子式：C106H115N11O16S2，分子量：1861.7959
2.2肽片段Fmoc-AA(1-3)-OH的制备：
向150mL肽反应室中加入5g Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。在60mL DCM中溶胀树脂，抽干。用2×50mL 20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂。用50mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，茚三酮试验测定。
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Gly-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-Gly-OH(2eq)、HOBt(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mL DMF洗涤树脂。用Fmoc-Gly-OH 2eq，对所述肽片段重复该操作过程。反应后，不脱去脱去N末端Fmoc保护，3×50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得6.34g树脂结合肽。
用100mL l％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL 0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约8mL体积，然后用10mL乙醇重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约8mL。加入50mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约50mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得1.22g纯度99％的Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH，产率99％。
上述制备的肽片段Fmoc-AA(1-3)-OH的结构如下：
Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH
分子式：C21H21N3O6，分子量：411.14。
2.3肽片段Boc-AA(1-3)-OH的固相制备:
向150mL肽反应室中加入5g Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。在60mL DCM中溶胀树脂，抽干。用2×50mL 20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂。用50mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，茚三酮试验测定。
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Gly-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-Gly-OH(2eq)、HOBt(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mL DMF洗涤树脂。后用Boc-Gly-OH 2eq，对所述肽片段重复该操作过程。反应后，不脱去脱去N末端Boc保护，3×50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空抽滤干燥至恒重，获得5.9g树脂结合肽。
用100mL l％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL 0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约8mL体积，然后用10mL乙醚重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约8mL。加入50mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约50mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得859mg纯度99％的Boc-Gly-Gly-Gly-OH，产率99％。
上述制备的肽片段Boc-AA(1-3)-OH的结构如下：
Boc-Gly-Gly-Gly-OH
分子式：C11H19N3O6，分子量：289.13。
3.片段缩合过程
3.1通过液相缩合片段制备Fmoc-AA(4-12)-NH2(已环化)
100mL圆底烧瓶中加入1.04g Fmoc-AA(4-11)-OH(已环化)(0.56mmol)、0.31gH-Gly-NH2·HCl(2.8mmol)和0.378g HOBt(2.8mmol)。将所述固体溶解于20mL DMF，加入0.89mL DIEA(5.6mmol)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入1.062gHBTU(2.8mmol)。在0℃搅拌反应混合物1小时，然后升至室温，再搅拌1小时。加入60mL水从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×20mL水洗涤，干燥获得1.12g粗品Fmoc-AA(4-12)-NH2(已环化)。在室温下用100mL MTBE研磨所述固体3小时，真空过滤收集，干燥获得1.06gFmoc-AA(4-12)-NH2(已环化)，收率99％。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE＝80:6:6；UV，碘检测；
Fmoc-AA(4-11)-OH(已环化)，Rf：0.33；
Fmoc-AA(4-12)-NH2(已环化)，Rf：0.48。
制备的Fmoc-AA(4-12)-NH2(已环化)的结构如下：
分子式：C108H119N13O16S2，分子量：1917.83。
3.2制备H-AA(4-12)-NH2(已环化)
在50mL圆底烧瓶中加入合成的1.06g Fmoc-AA(4-12)-NH2(已环化)，加入20mLDMF溶解，滴加哌啶至最终浓度16％，反应2小时，TLC监测，反应完全后加入冰水沉淀产物，冰水洗涤2遍，真空干燥。加入60mL冷MTBE搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到0.92g H-AA(4-12)-NH2(已环化)，收率98％。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE＝80:6:6；UV，碘检测；
Fmoc-AA(4-12)-NH2(已环化)，Rf：0.48；
H-AA(4-12)-NH2(已环化)，Rf：0.36。
制备的H-AA(4-12)-NH2(已环化)的结构如下：
分子式：C93H109N13O14S2，分子量：1695.765。
3.3Boc-AA(1-3)-OH与H-AA(4-12)-NH2(已环化)得到Boc-AA(1-12)-NH2(已环化)
将0.18g Boc-AA(1-3)-OH(0.6mmol)与0.92g H-AA(4-12)-NH2(已环化)(0.54mmol)、81mg HOBt(0.6mmol)和198uL DIEA(1.2mmol)加入50mL圆底烧瓶中，并加入10mLDMF。将生成的溶液搅拌冷却至0-5℃。向该冷却溶液中加入228mg HBTU(0.6mmol)。在冰浴下搅拌15分钟，去除冰浴，继续搅拌3小时。将反应化合物冰浴冷却，并加入20mL冰水沉淀肽。真空过滤收集固体，干燥获得1.009g Boc-AA(1-12)-NH2(已环化)，收率95％。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE＝80:6:6；UV，碘检测；
Boc-AA(1-3)-OH，Rf：0.19；
H-AA(4-12)-NH2(已环化)，Rf：0.36；
Boc-AA(1-12)-NH2(已环化)，Rf：0.46。
制备的Boc-AA(1-12)-NH2(已环化)的结构为：
分子式：C104H126N16O19S2，分子量：1966.88。
4.特利加压素的裂解及纯化
4.1通过去除侧链保护Boc-AA(1-12)-NH2(已环化)制备特利加压素粗肽
在250mL圆底烧瓶中加入三氟乙酸/水/三异丙基硅烷/1,2-乙二硫醇(92.5:2.5:2.5:2.5)溶液50mL，并冷却至0℃。向该冷却溶液中加入1.009g Boc-AA(1-12)-NH2(已环化)。在0℃搅拌所述淤浆直到所述固体溶解(约5分钟)，然后升至室温，搅拌3小时。将该溶液加入0℃乙醚70mL沉淀所述肽。以3000rpm离心旋转淤浆5分钟，从所述固体倾析乙醚。将所述固体再悬浮于50mL乙醚中，以3000rpm离心旋转5分钟，倾析乙醚。重复该过程一次，然后将固体溶解于含有1％乙酸的1:l水/乙腈30mL中，在室温下保存24小时。将该溶液冷冻，然后冷冻干燥获得617mg特利加压素粗肽，产率98％。特利加压素粗肽的色谱图见图1。
4.2HPLC纯化特利加压素粗肽
45mg特利加压素粗肽经制备型HPLC纯化产生全长特利加压素纯品21.6mg，产率48％。
HPLC纯化条件：色谱柱：Waters C18250×19,5u,130A；流速：8mL/min；检测：UV，220nm；流动相：A.80％乙腈/水；B.0.25％醋酸/水；方法：10％A，5min；10％-30％A，10min；30-60％A，40min。
特利加压素纯肽色谱图见图2，纯肽质谱图见图3。
特利加压素的结构如下：
分子式：C52H74N16O15S2，分子量：1226.51。
实施例2：两片段制备特利加压素。
1.树脂制备
制备Fmoc-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂同实施例1。
2.片段制备
肽片段Boc-AA(1-11)-OH(已环化)的制备
向150mL肽反应室中加入5g Fmoc-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂。加入60mL DCM搅拌溶胀树脂，抽干。用2×50mL 20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，茚三酮试验测定。
同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Pro-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq)、HOBT(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于25mL DMF中。氩气保护下把该溶液冰浴冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mL DMF洗涤树脂。
依次用Fmoc-保护的氨基酸Cys(Trt)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、Phe、Tyr(tBu)、Cys(Trt)、Gly、Gly各2eq，最后一个氨基酸为Boc-Gly-OH对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，加入6当量的I2/DMF，反应2小时，抽干，反复使用DMF洗涤，抽干树脂床，用3×50mL DMF、3×50mL DCM、3×50mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得9.48g树脂结合肽。
用100mL l％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL 0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约10mL体积，然后用10mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约10mL。加入100mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得4.35g纯度95％Boc-AA(1-11)-OH(已环化)，产率91％。
上述制备的片段Boc-AA(1-11)-OH(已环化)的结构如下：
分子式：C102H122N14O19S2，分子量：1910.85。
3.片段缩合过程
Boc-AA(1-11)-OH(已环化)与Gly-NH2·HCl反应制备Boc-AA(1-12)-NH2(已环化)
100mL圆底烧瓶中加入1.146g Boc-AA(1-11)-OH(已环化)(0.6mmol)、0.33gGly-NH2·HCl(3mmol)和0.405g HOBt(3mmol)。将所述固体溶解于20mL DMF，加入0.99mL DIEA(6mmol)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入1.138gHBTU(3mmol)。在0℃搅拌反应混合物1小时，然后升至室温，再搅拌1小时。加入60mL水从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×20mL水洗涤，干燥获得1.23g粗品Boc-AA(1-12)-NH2(已环化)。在室温下用100mL MTBE研磨所述固体3小时，真空过滤收集，干燥获得1.156g Boc-AA(1-12)-NH2(已环化)，收率98％。
反应过程TLC控制，TLC条件：氯仿/甲醇/TFE＝80:6:6；UV，碘检测；
Boc-AA(1-11)-OH(已环化)，Rf：0.30；
Boc-AA(1-12)-NH2(已环化)，Rf：0.46。
制备的Boc-AA(1-12)-NH2(已环化)的结构为：
分子式：C104H126N16O19S2，分子量：1966.88。
4切割与纯化同实施例1。
Claims (2)
1.一种特利加压素的片段缩合方法，其特征在于，固相制备特利加压素的全保护第一肽片段序列树脂，在固相中使用I2氧化两个半胱氨酸形成二硫键，然后将环化的全保护第一肽片段序列从树脂上裂解下来；液相中环化的全保护第一肽片段序列与H-Gly-NH2缩合得到环化的全保护第二肽片段序列；液相或者固相制备特利加压素的第三肽片段序列；环化的全保护第二肽片段序列脱氨基端保护后与第三肽片段序列缩合，然后脱去所有保护基得到特利加压素粗品，纯化转盐得到产品醋酸特利加压素；
第一肽片段序列为特利加压素序列中的第4-11位氨基酸，
第二肽片段序列为特利加压素序列中的第4-12位氨基酸，
第三肽片段序列为特利加压素序列中的第1-3位氨基酸；
具体包括如下步骤：
a.固相制备特利加压素的全保护第一肽片段序列树脂；
所述的全保护第一肽片段序列为：
Fmoc-Cys(R1)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(R1)-Pro-Lys(Boc)-OH，
其中，R1为Trt或者Acm；
使用I2氧化全保护第一肽片段序列树脂，使得第4和第9位的半胱氨酸形成二硫键，得到环化的全保护第一肽片段序列树脂；将环化的全保护第一肽片段序列从固相树脂上裂解；
b.将步骤a得到的环化的全保护第一肽片段序列与H-Gly-NH2缩合得到环化的全保护第二肽片段序列；
c.液相或者固相合成特利加压素的第三肽片段序列，
所述的第三肽片段序列为：R2-Gly-Gly-Gly-OH，其中R2为Boc或者Fmoc；
d.脱除步骤b得到的环化的全保护第二肽片段序列的氨基端保护基，然后与步骤c得到的第三肽片段序列缩合得到全保护特利加压素；
e.将全保护特利加压素裂解脱去所有保护基得到特利加压素粗品；
f.特利加压素粗品经纯化转盐得到醋酸特利加压素；
步骤a中，全保护第一肽片段序列树脂是由氨基酸依次偶联在固相树脂上获得的，其中，所述的固相树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂；
固相制备特利加压素全保护第一肽片段序列树脂的过程中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；
所用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；
使用的二硫键氧化剂为I2，二硫键与I2摩尔比为1∶5～10，溶剂为DMF或者DCM；
使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1∶2∶7的混合物；
步骤b中，缩合反应使用的缩合剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA的组合、或者EDC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；缩合反应的溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合；
步骤c中，
液相合成Boc-Gly-Gly-Gly-OH的方法是，首先Boc-Gly-OH与H-Gly-OMe反应得到Boc-Gly-Gly-OMe，脱去Boc保护后与Boc-Gly-OH反应得到Boc-Gly-Gly-Gly-OMe，皂化得到Boc-Gly-Gly-Gly-OH；
液相合成Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH的方法是，首先Fmoc-Gly-OH与H-Gly-OtBu反应得到Fmoc-Gly-Gly-OtBu，脱去Fmoc保护后与Fmoc-Gly-OH反应得到Fmoc-Gly-Gly-Gly-OtBu，然后TFA∶DCM按体积比1∶1反应，得到Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH；
固相合成R2-Gly-Gly-Gly-OH的方法是，Fmoc-Gly-OH与2-氯-三苯甲基氯树脂反应得到肽树脂，脱去Fmoc保护后与Fmoc-Gly-OH反应得到二肽树脂，再脱去Fmoc保护后与R2-Gly-OH反应得到三肽树脂；用裂解剂将R2-Gly-Gly-Gly-OH从固相树脂上裂解，得到R2-Gly-Gly-Gly-OH，其中，所述的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1∶2∶7的混合物；
步骤d中，氨基脱保护为体积百分含量16％的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；缩合反应使用的缩合剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA的组合、或者EDC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；缩合反应使用的反应溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合。
2.一种特利加压素的片段缩合方法，其特征在于，固相制备特利加压素的全保护第四肽片段序列树脂，在固相中使用I2氧化两个半胱氨酸形成二硫键，然后将环化的全保护第四肽片段序列从树脂上裂解下来；液相中环化的全保护第四肽片段序列与H-Gly-NH2缩合，然后脱去所有保护基得到特利加压素粗品，经纯化转盐得到产品醋酸特利加压素；
第四肽片段序列为特利加压素序列中的第1-11位氨基酸；
具体包括如下步骤：
a.固相制备特利加压素的全保护第四肽片段序列树脂，
所述的第四肽片段序列为：
R2-Gly-Gly-Gly-Cys(R1)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(R1)-Pro-Lys(Boc)-OH，其中R1为Trt或者为Acm，R2为Boc或者Fmoc；
使用I2氧化全保护第四肽片段序列树脂，使得第4和第9位的半胱氨酸形成二硫键，得到环化的全保护第四肽片段序列树脂；将环化的全保护第四肽片段序列从固相树脂上裂解；
b.将步骤a得到的脱除了固相树脂的环化的全保护第四肽片段序列与H-Gly-NH2缩合得到全保护的特利加压素；
c.将全保护的特利加压素裂解脱去全部保护基得到特利加压素粗品；
d.特利加压素粗品经纯化转盐得到醋酸特利加压素；
步骤a中，全保护第四肽片段序列树脂是由氨基酸依次偶联在固相树脂上获得的，其中，所述的固相树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂；
固相制备特利加压素的全保护第四肽片段序列树脂的过程中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；
所用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；
使用的二硫键氧化剂为I2，二硫键与I2摩尔比为1∶5～10，溶剂为DMF或者DCM；
使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1∶2∶7的混合物；
步骤b中，缩合反应使用的缩合剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA的组合、或者EDC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；缩合反应的溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合。
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