CN108383896B - 一种片段法合成戈舍瑞林的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种片段法合成戈舍瑞林的方法，本发明的技术方案包括以下步骤：先分别合成第一片段H‑Arg‑Pro‑Azagly‑NH2和第二片段Pyr‑His‑Trp‑Ser‑Tyr‑D‑Ser(tBu)‑Leu‑OH，将第一片段和第二片段在偶联剂条件下偶联得到戈舍瑞林粗品，经过纯化和冻干得到戈舍瑞林纯品。本发明反应操作简单，后处理方便，无需催化还原，收率高，成本低等特点，具有可观的实际应用前景，可适用于工业化生产。

Description

一种片段法合成戈舍瑞林的方法
技术领域
本发明涉及一种多肽的制备方法，具体涉及一种片段法合成戈舍瑞林的方法。
背景技术
戈舍瑞林是一种合成的具有十肽结构的促黄体生成素释放激素的类似物，英文名：Goserelin，化学名：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2，分子式：C59H84N18O14，分子量：1269.4，上市药物中戈舍瑞林以醋酸盐形式存在。
戈舍瑞林长期使用可抑制垂体的促黄体生成激素的分泌，从而引起男性血清睾酮和女性血清雌二醇的下降，从而使激素敏感性肿瘤萎缩。可用于激素治疗的前列腺癌及绝经前及围绝经期的乳腺癌，也可用于子宫内膜异位症的治疗，如缓解疼痛并减少子宫内膜损伤。
与其它瑞林类药物相比，戈舍瑞林具有两个明显特征：第一是肽链碳端含有一个Azagly-NH2(NH2NHCONH2)基团；第二是6位D-Ser上带有tBu保护基。这两个特征导致戈舍瑞林很难通过传统的Fmoc逐步法固相合成策略来合成，为戈舍瑞林的合成提高了难度。
现有的戈舍瑞林合成方法主要通过氨基酸侧链选择性保护或者片段法两种。专利CN102653555A以Sieber树脂作为固相载体，依次与N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，水合肼反应得到Azagly-Sieber树脂，然后固相逐步法偶联得到Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-Sieber Resin。通过低浓度TFA切割树脂，钯碳氢化除去Bzl，NO2保护基，得到戈舍瑞林粗品。这种方法需要使用的Sieber树脂和钯碳价格较贵，不利于工业大生产。
专利CN101759777A，CN105884865A和CN104910257A采用片段法偶联得到戈舍瑞林。专利CN101759777A采用纯液相5+5片段缩合法。该路线中，首先通过液相合成分别得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH片段和H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2片段，然后在氯甲酸叔丁酯条件下缩合得到戈舍瑞林。其中H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2片段由Z-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2在钯碳条件下反应4天得到。纯液相合成法虽然也能得到目标产物，但反应步骤较多，洗涤旋蒸等操作繁杂，同时硝基氢化还原步骤所需时间较长，不适用于大规模生产。
专利CN105884865A公开了固相、液相结合的5+5片段缩合法。该路线中，首先通过固相方法得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH和Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH。Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH与盐酸氨基脲反应得到H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2片段。两个片段在氯甲酸叔丁酯条件下缩合，然后使用铁粉或者锌粉还原硝基得到戈舍瑞林。该方法中铁粉或锌粉还原硝基需要在水乙醇混合溶剂中回流3小时，高温可导致肽链中部分氨基酸发生消旋影响最终产品的分离。
专利CN104910257A公开了固相、液相结合的9+1片段缩合法。该路线以2-CTC树脂作为固相载体，按照常规固相逐步偶联得到H-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTC Resin，全保护裂解液TFA/DCM (1:4)切割后得到全保护9肽片段H-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH。9肽片段与盐酸氨基脲反应，然后选择性地除去Trt及钯碳条件下氢化还原除去Bzl和硝基得到戈舍瑞林。该方法仍然需要使用钯碳催化剂来实现侧链保护基的选择性脱除。
发明内容
本发明的目的是提供一种醋酸戈舍瑞林的固液相结合的合成方法，该醋酸戈舍瑞林的合成方法通过7+3片段分割方法，三肽片段H-Arg-Pro-Azagly-NH2和七肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-OH都可以通过使用常规的酸敏感性侧链保护基氨基酸偶联得到，不需要使用通过氢化还原才能除去的侧链保护基(Bzl和NO2)。相比其他专利方法，该方法不需要使用钯碳催化剂，铁粉或锌粉等金属试剂，具有操作简单，后处理方便，收率高，纯度好，成本低等特点，可适用于大规模生产。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种片段法合成戈舍瑞林的方法，其合成步骤为。
步骤一：合成一个三肽片段H-Arg-Pro-Azagly-NH2。该三肽片段可以固相合成也可以液相合成。
其中，固相合成法以Fmoc Rink Amide MBHA Resin作为固相载体，由N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和Rink Amide MBHA Resin在DMAP催化剂下偶联，反应所得的树脂与水合肼反应得到Azagly-Resin。
用Fmoc-Pro-OH与Azagly-Resin反应得到Fmoc-Pro-Azagly-Resin，所使用的偶联剂为DIC+A或者B+A+C，其中A为HOBt或HOAt，B为HBTU、HATU、TBTU或PyBOP，C为DIPEA或NMM。
往Fmoc-Pro-Azagly-Resin加入DBLK（哌啶：DMF=1:4）去除Fmoc得到H-Pro-Azagly-Resin。由Fmoc-Arg(R1)-OH与H-Pro-Azagly-Resin反应得到Fmoc-Arg(R1)-Pro-Azagly-Resin，其中R1= H，pbf或Mtt，所使用的偶联剂为DIC+A或者B+A+C，其中A为HOBt或HOAt，B为HBTU、HATU、TBTU、TDBTU或PyBOP，C为DIPEA或NMM。
往Fmoc-Arg(R1)-Pro-Azagly-Resin加入DBLK（哌啶：DMF=1:4）去除Fmoc得到H-Arg(R1)-Pro-Azagly-Resin。
将裂解液按照树脂重量的10倍（w:v = 1:10）加入相应体积的量，除去树脂和侧链保护基。裂解试剂是：三氟乙酸、水、三异丙基硅烷，其中三氟乙酸的体积比例为85%-95%，优选90%-95%；水的体积比例为2.5%-7.5%，优选2.5%-5%；三异丙基硅烷的体积比例为2.5%-7.5%，优选2.5%-5%；更优选三氟乙酸：水：三异丙基硅烷的体积比为95:2.5:2.5。
将冷冻乙醚按照裂解液体积的10倍（v:v = 1:10）加入相应体积的量，沉淀，离心或过滤，得到H-Arg-Pro-Azagly-NH2。
液相合成法制备H-Arg-Pro-Azagly-NH2时，首先Fmoc-Pro-OH，氨基脲盐酸盐在偶联剂条件下得到Fmoc-Pro-Azagly-NH2，所使用的偶联剂为A+B+C或B+C+D，其中A为DIC、DCC或EDC·HCl，B为HOOBt、HOBt或HOAt，C为DIPEA或NMM，D为HBTU、HATU、TBTU、TDBTU或PyBOP。
Fmoc-Pro-Azagly-NH2用DBLK（哌啶：DMF=1:4）去除Fmoc得到H-Pro-Azagly-NH2。H-Pro-Azagly-NH2和Boc-Arg(pbf)-OH在偶联剂条件下得到Boc-Arg(pbf)-Pro-Azagly-NH2，所使用的偶联剂为A+B+C或B+C+D，其中A为DIC、DCC或EDC·HCl，B为HOOBt、HOBt或HOAt，C为DIPEA或NMM，D为HBTU、HATU、TBTU、TDBTU或PyBOP。
将裂解液按照Boc-Arg(pbf)-Pro-Azagly-NH2重量的10倍加入（m:v=1:10）加入相应体积的量，除去Boc和侧链保护基。裂解试剂是：三氟乙酸、水、三异丙基硅烷，其中三氟乙酸的体积比例为85%-95%，优选90%-95%；水的体积比例为2.5%-7.5%，优选2.5%-5%；三异丙基硅烷的体积比例为2.5%-7.5%，优选2.5%-5%；更优选三氟乙酸：水：三异丙基硅烷的体积比为95:2.5:2.5。
将冷冻乙醚按照裂解液体积的10倍（v:v = 1:10）加入相应体积的量，沉淀，离心或过滤，得到H-Arg-Pro-Azagly-NH2。
步骤二：合成一个七肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-OH。
以CTC Resin作为固相载体，由Fmoc-Leu-OH与CTC Resin在DIPEA条件下反应得到Fmoc-Leu-CTC Resin。
按照常规的固相合成方法，依照片段序列逐步连接Fmoc保护氨基酸后得到Pyr-His(R1)-Trp(R2)-Ser(R3)-Tyr(R4)-D-Ser(tBu)-Leu-CTC Resin。所述的Fmoc保护氨基酸是Fmoc-His(R1)-OH，Fmoc-Trp(R2)-OH，Fmoc-Ser(R3)-OH，Fmoc-Tyr(R4)-OH，Fmoc-D-Ser(tBu)-OH，Pyr-OH，其中R1=H，Trt或Boc；R2=H或者Boc；R3=H或Trt；R4=H或Trt。所使用的偶联剂为DIC+A或者B+A+C，其中A为HOBt或HOAt，B为HBTU、HATU、TBTU、TDBTU或PyBOP，C为DIPEA或NMM。
将裂解液按照树脂重量的10倍（w:v = 1:10）加入相应体积的量，选择性地除去树脂和侧链保护基。裂解试剂是：三氟乙酸、三异丙基硅烷、二氯甲烷，其中三氟乙酸的体积比例为5%-15%，优选5%-10%；三异丙基硅烷的体积比例为5%-15%，优选5%-10%；二氯甲烷的体积比例为80%-90%，优选85%-90%；更优选三氟乙酸：三异丙基硅烷：二氯甲烷的体积比为7.5:5:87.5。
将冷冻乙醚按照裂解液体积的10倍（v:v = 1:10）加入相应体积的量，沉淀，离心或过滤，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-OH。
步骤三：将七肽片段和三肽片段在偶联剂条件下偶联，经过纯化冻干得到目标产物醋酸戈舍瑞林。
七肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-OH和三肽片段H-Arg-Pro-Azagly-NH2反应得到，HPLC检测反应完成情况。所使用的偶联剂为A+B+C或B+C+D，其中A为DIC、DCC或EDC·HCl，B为HOOBt、HOBt或HOAt，C为DIPEA或NMM，D为HBTU、HATU、TBTU、TDBTU或PyBOP。
反应完全后，将三氟乙酸/乙醚混合液（v:v=2:98）按照反应液体积的10倍（v:v =1:10）加入相应体积的量，沉淀，离心或过滤，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2。
英文缩写 中文含义
Rink Amide MBHA Resin Rink Amide MBHA树脂
CTC Resin CTC 树脂
Azagly-Resin 氨基脲结构树脂
DMAP 4-二甲基吡啶
DIC 二异丙基碳二亚胺
DCC 二环己基碳二亚胺
EDC 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺
HOBt 1-羟基苯并三唑
HOAt 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
HOOBt 3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮
HBTU O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯
HATU 2-(7-氧化苯并三氮唑)-<i>N,N,N',N'</i>-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTU O-苯并三氮唑-<i>N,N,N',N'</i>-四甲基脲四氟硼酸
PyBOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
DIPEA <i>N,N</i>-二异丙基乙胺
NMM <i>N-</i>甲基吗啉
DBLK 20%哌啶的DMF溶液（v:v）
DMF <i>N,N</i>-二甲基甲酰胺
DCM 二氯甲烷
Bzl 苄基
Trt 三苯甲基
NO<sub>2</sub> 硝基
tBu 叔丁基
Boc 叔丁氧羰基
附图说明
图1：采用实施例5方法所得戈舍瑞林粗肽图谱。
图2：采用实施例6方法所得戈舍瑞林精肽图谱以及对应的数据。
图3：采用实施例6方法所得戈舍瑞林精肽MS图谱。
具体实施方案
下面给出实施例以对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
具体实施例说明。
实施例1：H-Arg(pbf)-Pro-Azagly-Resin的合成。
将741g取代度为0.54 mmol/g的MBHA Resin加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂2小时后，抽去DCM，DMF洗涤一次。加入2.5倍树脂层体积的5% TEA/DMF（v:v）混合溶液中和树脂5分钟后，抽去反应液，DMF洗涤两次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，茚三酮法检测呈阳性。
将648g Rink Amide Linker，432g HBTU在冰浴条件下溶于DMF中，加入到树脂中反应5分钟后，加入264mL NMM，室温反应2.5小时，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，DMF洗涤两次，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次。
加入2.5倍树脂层体积的DBLK去除Fmoc保护，室温反应30分钟后，DMF洗涤两次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，茚三酮法检测呈阳性。将512g N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和48.8g DMAP在冰浴条件下溶于DMF中，加入到树脂中，室温反应3小时，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，DMF洗涤两次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次。
加入DMF作为溶剂，慢慢加入400mL 85%水合肼，室温反应4小时后，DMF洗涤两次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，茚三酮法检测呈阳性。
将404g Fmoc-Pro-OH和162g HOBt在冰浴条件下溶于DMF中，加入186mL DIC预活化10-15分钟。将上述预活化反应液加入到树脂中，室温反应3小时，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，DMF洗涤两次，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次。
加入2.5倍树脂层体积的DBLK去除Fmoc保护，室温反应30分钟后，DMF洗涤两次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，茚三酮法检测呈阳性。将778g Fmoc-Arg(pbf)-OH和162g HOBt在冰浴条件下溶于DMF中，加入186mL DIC预活化10-15分钟。将上述预活化反应液加入到树脂中，室温反应3小时，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，DMF洗涤两次，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次。
加入2.5倍树脂层体积的DBLK去除Fmoc保护，室温反应30分钟后，DMF洗涤四次，甲醇洗涤三次，茚三酮法检测呈阳性。将反应所得树脂在真空条件下干燥12小时以上，称量得到H-Arg(pbf)-Pro-Azagly-Resin 1020g。
实施例2：H-Arg-Pro-Azagly-NH2的制备。
配置裂解试剂10L，其中TFA 9.5L，水 0.25L，三异丙基硅烷 0.25L，放入-20℃冰箱预冷30分钟以上。称取实施例1所述方法得到的肽树脂1000g，在搅拌条件下，将树脂缓慢加入到10L裂解试剂中，室温反应3小时。过滤树脂，收集滤液，将滤液缓慢加入到100L冷乙醚中沉淀，离心，冷乙醚洗涤3次，减压干燥得到粗肽H-Arg-Pro-Azagly-NH2 178g。
实施例3：H-Arg-Pro-Azagly-NH2的制备。
将12.6 g Fmoc-Pro-OH溶解到100 mL DMF溶剂中，冰水浴条件下加入8.6 gEDC·HCl，6.0 g HOBt，12.46 mL NMM。待称量物完全溶解后，缓慢加入5.0 g H-Azagly-NH2·HCl，反应混合液继续在25℃条件下反应。用薄层色谱板TLC监控反应进行，待反应完全后，用600 mL 5%磷酸水溶液中和。水相用400 mL DCM萃取，DCM有机相接着用200 mL水，200 mL饱和食盐水洗涤，洗涤完成后用无水硫酸钠干燥。过滤，减压旋蒸除去DCM得到固体，所得固体真空干燥，称重20.0g Fmoc-Pro-Azagly-NH2粗品，纯度66%。
往20.0g Fmoc-Pro-Azagly-NH2粗品中加入150 mL 20% PiP/DMF，室温条件下（26℃）反应2小时。减压旋蒸除去溶剂后，加入100 mL乙醚后有油状物析出。所得油状物用150mL石油醚乙醚混合液（v:v=2:1）洗涤三次，洗涤过程中有固体析出。所得固体过滤，并用乙醚洗涤，真空干燥得到13.2g H-Pro-Azagly-NH2粗品。
将13.2 g Boc-Arg(pbf)-OH粗品溶解到150 mL DMF溶剂中，冰水浴条件下加入7.8 g EDC·HCl，5.5 g HOBt，11 mL NMM。待称量物完全溶解后，缓慢加入13.2 g H-Pro-Azagly-NH2，反应混合液继续在25℃条件下反应。用薄层色谱板TLC监控反应进行，待反应完全后，用600 mL 5%磷酸水溶液中和。水相用400 mL DCM萃取，DCM有机相接着用200 mL水，200 mL饱和食盐水洗涤，洗涤完成后用无水硫酸钠干燥。过滤，减压旋蒸除去DCM得到固体，所得固体过硅胶柱纯化，得到17g Boc-Arg(pbf)-Pro-Azagly-NH2粗品，纯度94.6%。
配置裂解试剂200 mL，其中TFA 190 mL，水 5 mL，三异丙基硅烷 5 mL，放入-20℃冰箱预冷30分钟以上。往17g Boc-Arg(pbf)-Pro-Azagly-NH2中加入170 mL裂解试剂，室温反应2.5小时。往反应液中缓慢加入到1.7 L冷乙醚中沉淀，离心，冷乙醚洗涤3次，减压干燥得到粗肽H-Arg-Pro-Azagly-NH2 11.93g，粗品经过制备色谱柱纯化得到9.93g H-Arg-Pro-Azagly-NH2，纯度95.2%。
实施例4：H-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-CTC Resin的合成
将800g取代度为1.0-1.2 mmol/g的CTC Resin加入到固相反应器中，加入226gFmoc-Leu-OH，加入5L DCM使称量物完全溶解。加入448mL DIPEA，室温反应4小时后，加入800 mL 甲醇反应30分钟。反应结束后，DMF洗涤四次，甲醇洗涤三次。将反应所得树脂在真空条件下干燥12小时以上，称量得到Fmoc-Leu-CTC Resin 1073g，检测取代度为0.474mmol/g。
称取845g 取代度为0.474 mmol/g的400mmol Fmoc-Leu-CTC Resin加入反应器中，用DMF溶胀0.5小时。抽去DMF溶液，加入2.5倍树脂层体积的DBLK去除Fmoc保护，室温反应30分钟后，DMF洗涤六次，茚三酮法检测呈阳性。
将300g Fmoc-D-Ser(tBu)-OH和162g HOBt在冰浴条件下溶于DMF中，加入186mLDIC预活化10-15分钟。将上述预活化反应液加入到树脂中，室温反应2小时，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，DMF洗涤四次。
加入2.5倍树脂层体积的DBLK去除Fmoc保护，室温反应30分钟后，DMF洗涤六次，茚三酮法检测呈阳性。将484g Fmoc-Tyr-OH和162g HOBt在冰浴条件下溶于DMF中，加入186mLDIC预活化10-15分钟。将上述预活化反应液加入到树脂中，室温反应1.5小时，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，DMF洗涤四次。
加入2.5倍树脂层体积的DBLK去除Fmoc保护，室温反应30分钟后，DMF洗涤六次，茚三酮法检测呈阳性。将645g Fmoc-Ser(Trt)-OH和162g HOBt在冰浴条件下溶于DMF中，加入186mL DIC预活化10-15分钟。将上述预活化反应液加入到树脂中，室温反应1.5小时，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，DMF洗涤四次。
加入2.5倍树脂层体积的DBLK去除Fmoc保护，室温反应30分钟后，DMF洗涤六次，茚三酮法检测呈阳性。将512g Fmoc-Trp-OH和162g HOBt在冰浴条件下溶于DMF中，加入186mLDIC预活化10-15分钟。将上述预活化反应液加入到树脂中，室温反应1.5小时，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，DMF洗涤四次。
加入2.5倍树脂层体积的DBLK去除Fmoc保护，室温反应30分钟后，DMF洗涤六次，茚三酮法检测呈阳性。将743g Fmoc-His(Trt)-OH和162g HOBt在冰浴条件下溶于DMF中，加入186mL DIC预活化10-15分钟。将上述预活化反应液加入到树脂中，室温反应1.5小时，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，DMF洗涤四次。
加入2.5倍树脂层体积的DBLK去除Fmoc保护，室温反应30分钟后，DMF洗涤六次，茚三酮法检测呈阳性。将155g H-Pyr-OH和162g HOBt在冰浴条件下溶于DMF中，加入186mLDIC预活化10-15分钟。将上述预活化反应液加入到树脂中，室温反应1.5小时，反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后，DMF洗涤四次。
加入2.5倍树脂层体积的DBLK去除Fmoc保护，室温反应30分钟后，DMF洗涤四次，甲醇洗涤三次，茚三酮法检测呈阳性。将反应所得树脂在真空条件下干燥12小时以上，称量得到H-Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-CTC Resin 1050g。
实施例5：H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-OH的制备
配置裂解试剂10L，其中TFA 0.75L，三异丙基硅烷 0.5L，DCM 8.75L，放入-20℃冰箱预冷30分钟以上。称取实施例3所述方法得到的肽树脂1000g，在搅拌条件下，将树脂缓慢加入到10L裂解试剂中，室温反应1小时。过滤树脂，收集滤液，将滤液缓慢加入到100L冷乙醚中沉淀，离心，冷乙醚洗涤3次，减压干燥得到粗肽H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-OH 406g。
实施例6：戈舍瑞林粗肽的制备。
称取实施例4所述方法得到的粗肽H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-OH335g，将粗肽用3L DMF完全溶解，完全溶解后在-5℃条件下搅拌5-15分钟。加入68.5gHOOBt和80.5g EDC·HCl，搅拌10-15分钟后加入86 mL NMM。称取实施例2所述方法得到的粗肽H-Arg-Pro-Azagly-NH2 172g，将粗肽用2L DMF溶解后缓慢加入到反应液中。反应10-15分钟后，将反应温度调整至5℃反应4小时，反应时间以HPLC检测为准。
配置沉降试剂50L，其中TFA 1L，乙醚49L，放入-20℃冰箱预冷30分钟以上。将反应液缓慢加入到50L沉降试剂中沉淀，离心，冷乙醚洗涤3次，减压干燥得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2粗肽550g，HPLC纯度67.3%。
实施例7：戈舍瑞林精肽的制备。
将Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2粗肽550g，粗肽用10%乙腈水溶液溶解，过滤；纯化设备：汉邦P1600，色谱柱：DAC-150，C18，10μm，检测波长：220nm，流动相A相：0.1% TFA水溶液，流动相B相：0.1% TFA （20%水+80%乙腈）溶液，梯度：20%-50%，时间为60分钟，经过制备液相纯化，转盐，得到66g精肽。纯度99.2%，总收率14.9%。由MS确定结构为：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2。

Claims (8)

1.一种片段法合成戈舍瑞林的方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)合成第一片段H-Arg-Pro-Azagly-NH2；
(2)合成第二片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-OH；
(3)将第一片段和第二片段偶联得到目标产品戈舍瑞林；
步骤(1)中的第一片段的合成采用固相合成方法或液相合成方法；
①采用固相合成法时，由N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和氨基树脂在DMAP催化剂下偶联，由水合肼与所得树脂反应得到Azagly-Resin，然后依次连接Fmoc-Pro-OH和Fmoc-Arg(R1)-OH得到三肽片段树脂Fmoc-Arg(R1)-Pro-Azagly-Resin，所述的氨基树脂选自RinkAmide Am树脂，RinkAmide MBHA树脂，Knorr树脂或其组合，其中R1＝H或者Mtt；
②往Fmoc-Arg(R1)-Pro-Azagly-Resin加入DBLK进行脱Fmoc操作，DBLK由哌啶和DMF按照体积比1:4进行混合，得到H-Arg(R1)-Pro-Azagly-Resin；
③使用裂解试剂脱除树脂和侧链保护基，得到第一片段H-Arg-Pro-Azagly-NH2
所述步骤(2)中的第二片段的合成采用固相合成方法为：
A、以CTC树脂为固相载体，起始氨基酸为Fmoc-Leu-OH，按片段序列依次连接Fmoc保护氨基酸后得到七肽片段树脂，所述的Fmoc保护氨基酸是Fmoc-His(R1)-OH，Fmoc-Trp(R2)-OH，Fmoc-Ser(R3)-OH，Fmoc-Tyr(R4)-OH，Fmoc-D-Ser(tBu)-OH，H-Pyr-OH，其中R1＝H，Trt或Boc；R2＝H或者Boc；R3＝H或Trt；R4＝H或Trt；
B、使用裂解试剂脱除树脂和侧链保护基得到第二片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-OH。
2.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法，其特征在于：步骤(1)所述液相合成第一片段，其方法为：
一、由Fmoc-Pro-OH与氨基脲盐酸盐在偶联剂条件下偶联得到Fmoc-Pro-Azagly-NH2；
二、往Fmoc-Pro-Azagly-NH2加入DBLK进行脱Fmoc操作，DBLK由哌啶和DMF按照体积比1:4进行混合，得到H-Pro-Azagly-NH2；
三、H-Pro-Azagly-NH2和Boc-Arg(pbf)-OH在偶联剂条件下偶联得到Boc-Arg(pbf)-Pro-Azagly-NH2；
四、使用裂解试剂脱除Boc-Arg(pbf)-Pro-Azagly-NH2的Boc和侧链保护基，得到第一片段H-Arg-Pro-Azagly-NH2。
3.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法，其特征在于步骤③中使用的裂解试剂为三氟乙酸、水和三异丙基硅烷的组合。
4.根据权利要求2所述的戈舍瑞林的合成方法，其特征在于：
(1)步骤一和三中使用的偶联剂条件为A+B+C或B+C+D，其中A为DIC、DCC或EDC·HCl，B为HOOBt、HOBt或HOAt，C为DIPEA或NMM，D为HBTU、HATU、TBTU、TDBTU或PyBOP；
(2)步骤四中使用的裂解试剂为三氟乙酸、水和三异丙基硅烷的组合。
5.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法，其特征在于步骤(2)中使用的裂解试剂为三氟乙酸、三异丙基硅烷、二氯甲烷的组合。
6.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法，其特征在于步骤(3)中第一片段和第二片段在偶联剂条件下进行偶联，所使用的偶联剂为A+B+C或B+C+D，其中A为DIC、DCC或EDC·HCl，B为HOOBt、HOBt或HOAt，C为DIPEA或NMM，D为HBTU、HATU、TBTU、TDBTU或PyBOP。
7.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法，其特征在于步骤(3)中第二片段与第一片段的用量摩尔比为1:1.2-1.5。
8.根据权利要求1所述的戈舍瑞林的合成方法，其特征在于步骤(3)中液相偶联反应完成后，用10倍反应液体积的三氟乙酸/乙醚混合液沉淀，离心或过滤得到戈舍瑞林粗品，其中三氟乙酸/乙醚混合液中三氟乙酸的体积百分含量为2～5％。
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