CN112500455A - 一种多肽固液组合合成戈那瑞林的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多肽固液组合合成戈那瑞林的方法，该种多肽固液组合合成戈那瑞林的方法包括以下步骤：1)用多肽固相法合成化合物1：Boc‑Pyr‑His(Boc)‑Trp(Boc)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑Gly‑Leu‑OH；2)用多肽液相法合成化合物2：H‑Arg(pbf)‑Pro‑Gly‑NH2；3)在液相中合成化合物3：Boc‑Pyr‑His(Boc)‑Trp(Boc)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑Gly‑Leu‑Arg(pbf)‑Pro‑Gly‑NH2；4)合成戈那瑞林粗品：Pyr‑His‑Trp‑Ser‑Tyr‑Gly‑Leu‑Arg‑Pro‑Gly‑NH2，本发明用CTC树脂合成片段，结合液相法合成戈那瑞林，CTC树脂合成片段可以方便自动化生产，CTC树脂可以回收重复利用，极大降低了用Rink树脂进行固相合成的成本，Rink树脂的价格要比CTC树脂高很多，并且不能回收再次使用；适合大规模工业化生产，没有剧烈的化学反应，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种多肽固液组合合成戈那瑞林的方法。
背景技术
戈那瑞林，其氨基酸序列为：5—氧化脯氨酰一L一组氨酰一L一色氨酰一L一丝氨酰一L一酪氨酰一甘氨酰一L一亮氨酰一L一精氨酰一L脯氨酰一甘氨酰胺(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)，分子式为C55H75N17O13，分子量为1182.33。
戈那瑞林为人工合成的促性腺激素释放素，属肽类化合物，为十肽。该品能刺激垂体合成和释放卵泡刺激激素合黄体生成激素(FSH和LH)。临床上主要用于鉴别诊断男性或女性由于下丘脑或垂体功能低下所引起的生育障碍，性腺萎缩性的性腺功能不足、乳溢性闭经、原发和继发性闭经、绝经和早熟绝经、垂体肿瘤，垂体的器官损伤和事实上的下丘脑功能障碍等。
适应症包括：1)用于诊断下丘脑-垂体-生殖腺功能障碍；
2)治疗闭经与促性腺激素分泌不足和多滤泡性卵巢引起的不孕症；
3)戈那瑞林或其同类物布舍瑞林、戈舍瑞林、亮丙瑞林、那法瑞林和曲普瑞林还可用于避孕、隐睾症、恶性肿瘤(尤其前列腺癌)、延迟的和提前的青春期；
4)还可用于子宫内膜异位；
5)用于促排卵以治疗下丘脑性闭经所致不孕、原发性卵巢功能不足，特别是对氯米芬无效的患者；
6)还用于小儿隐睾症及雄激素过多、垂体肿瘤等。作为兽药，其可以促使动物腺垂体释放促卵泡素和促黄体素，用于治疗奶牛的卵巢机能停止，诱导奶牛同期发情。
现有技术中关于戈那瑞林合成方法报道较少，其中，中国发明专利申请201710439767.8报道了一种固相合成法合成戈那瑞林的方法，该专利采用RinkAmideAM树脂为固相载体，缩合剂调件为HBTU/HOBt/DIPEA，Fmoc氨基酸为单体，哌啶为脱保护试剂，然后从C端到N端逐一进行偶联，直至合成保护戈那瑞林树脂肽链，最后，裂解得到戈那瑞林。此方法采用了易制毒试剂哌啶，所用的Rink树脂价格较贵，且不能回收再次使用，最后一个氨基酸5-氧脯氨酸不易溶于常用于多肽合成的非质子溶剂。
捷克专利CZ2014976A3采用了类似的氨基酸单体和Rink树脂为载体的合成方法。
美国专利US4024248提及了戈那瑞林类似物可以采用片段缩合的方法：
将片段分为Pyr-His-Trp和Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2或Pyr-His-Trp-Ser和Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，然后采用叠氮法进行缩合，缩合片段未经保护，副反应较多，成本较高。
发明内容
基于此，有必要针对背景技术中存在的问题，提供一种多肽固液组合合成戈那瑞林的方法。
本发明的技术方案是构造一种多肽固液组合合成戈那瑞林的方法，包括以下步骤：
1)用多肽固相法合成化合物1：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-OH；
2)用多肽液相法合成化合物2：
H-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
3)在液相中合成化合物3：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
4)合成戈那瑞林粗品：
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
在其中一个实施例中，步骤1)化合物1可以通过固相法从C到N末端的顺序合成，其步骤包括：
1)以CTC树脂为固相载体；
Boc-Pyr-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH为氨基酸单体；
HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种为缩合剂；
哌嗪溶液为脱帽试剂，溶剂为偶极非质子溶剂，哌嗪溶液的质量浓度为2-5％；
从C到N末端依次合成：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-CTC树脂；
2)用三氟乙酸/二氯甲烷溶液切割，浓缩后用水析出，得到化合物1：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-OH。
在其中一个实施例中，步骤2)化合物2可以通过液相法合成：
以Fmoc-Pro-OH，H-Gly-NH2.HCl，Fmoc-Arg(pbf)-OH为氨基酸单体；
缩合剂为HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC等其中的一种；
活化剂为HOSu或HOBt；
有机碱主要为DIEA或TEA；
依次合成：
1)Fmoc-Pro-Gly-NH2；
2)H-Pro-Gly-NH2。
在其中一个实施例中，以Fmoc-Arg(pbf)-OH，H-Pro-Gly-NH2为氨基酸单体，缩合剂为HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种；
活化剂为HOSu或HOBt；
有机碱主要为DIEA或TEA；
依次合成：
1)Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
2)H-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2。
在其中一个实施例中，步骤3)化合物3可以通过液相法合成：
以化合物1和化合物2为合成片段；
缩合剂为HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种；
活化剂为HOSu或HOBt；
有机碱主要为DIEA或TEA；
合成化合物3：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
化合物1和化合物2的摩尔比为1：1.01—1：1.5；
化合物2和缩合剂、活化剂及有机碱的摩尔比＝1：1：1：1。
在其中一个实施例中，由化合物3获得粗品的步骤如下：
1)取烧瓶，称化合物3投入，加入切肽试剂(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5)切割，得到含有戈那瑞林粗品的TFA溶液；
2)浓缩TFA溶液至少量，加入乙醚；
3)离心，真空干燥得戈那瑞林三氟乙酸盐粗品。
在其中一个实施例中，化合物3合成步骤如下：
1)取化合物1和缩合剂溶于DMF，加入活化剂和有机碱溶解，-10～5℃冷浴5～15min；
2)另取化合物2溶于THF中，反应1.5～2.5h，HPLC检测反应完全。浓缩，加入盐酸溶液，析出类白色固体，过滤，水洗至中性；
3)真空干燥，得到化合物3。
在其中一个实施例中，使用后的树脂回收步骤如下：
1)将树脂用DMF洗涤；
2)甲醇洗涤，抽去滤液，真空干燥；
3)另配置二氯亚砜的DCM溶液，加入装有树脂的固相合成反应器中，反应2h后，抽去反应液，DCM洗涤。
进一步地，戈那瑞林粗品纯度可以达到90％以上，可以由化合物3溶于TFA溶液中进行反应得到，反应完成后浓缩，加入醚类试剂析出，过滤即得到戈那瑞林粗品。
本发明的优点和有益效果如下：
用CTC树脂合成片段，结合液相法合成戈那瑞林，CTC树脂合成片段可以方便自动化生产，CTC树脂可以回收重复利用，极大降低了用Rink树脂进行固相合成的成本，Rink树脂的价格要比CTC树脂高很多，并且不能回收再次使用；没有使用经典的哌啶为脱帽试剂，哌啶成本高，液体不易保存，难管理，避免了易制毒试剂的使用，适合大规模工业化生产，没有剧烈的化学反应，降低了生产成本。
附图说明
图1为本发明的化合物1的HPLC图谱。
图2为本发明的脱保护化合物1的MS图谱。
图3为本发明的Fmoc-Pro-Gly-NH2.HCl的HPLC图谱。
图4为本发明的H-Pro-Gly-NH2的HPLC图谱。
图5为本发明的Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2.HCl的HPLC图谱。
图6为本发明的H-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2的HPLC图谱。
图7为本发明的H-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2.的MS图谱。
图8为本发明的化合物3的HPLC图谱。
图9为本发明的戈那瑞林粗品的HPLC图谱。
图10为本发明的戈那瑞林的MS图谱。
图11为本发明的另一实施例的化合物1的HPLC图谱。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的首选实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
本发明权利要求书和说明书中出现物质的英文缩写对应的中文名称见表1。
表1：本发明中出现物质的英文缩写对应的中文名称表
| 英文缩写 | 中文名称 |
| Fmoc | 9-芴甲氧羰基 |
| Pbf | 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃基 |
| HOBt | 1-羟基苯并三唑 |
| Boc | 叔丁氧羰基 |
| tBu | 叔丁基 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| TIS | 三异丙基硅烷 |
| DIEA | N,N-二异丙基乙胺 |
| HBTU | O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯 |
| IPA | 异丙醇 |
| DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
| Gly | 甘氨酸 |
| Leu | 亮氨酸 |
| Pro | 脯氨酸 |
| Ser | 丝氨酸 |
| Arg | 精氨酸 |
| Pyr | 焦谷氨酸 |
| Trp | 色氨酸 |
| His | 组氨酸 |
| Tyr | 酪氨酸 |
| THF | 四氢呋喃 |
| DCC | 二环己基碳二亚胺 |
| TEA | 三乙胺 |
| HOSu | N-羟基琥珀酰亚胺 |
一种多肽固液组合合成戈那瑞林的方法，包括以下步骤：
1)用多肽固相法合成化合物1：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-OH；
2)用多肽液相法合成化合物2：
H-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
3)在液相中合成化合物3：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
4)合成戈那瑞林粗品：
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
优选地，步骤1)化合物1可以通过固相法从C到N末端的顺序合成，其步骤包括：
1)以CTC树脂为固相载体；
Boc-Pyr-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH为氨基酸单体；
HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种为缩合剂；
脱帽试剂为质量浓度为2％～5％的哌嗪溶液，溶剂为偶极非质子溶剂；
更进一步优选地，脱帽试剂的溶剂为DMF，哌嗪的质量浓度为3％；
所述哌嗪溶液的体积优选为按树脂的质量计算，每g树脂6ml脱帽试剂；所述脱帽的时间优选的为10～30min，更优选的为20min。
从C到N末端依次合成：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-CTC树脂；
2)用三氟乙酸/二氯甲烷溶液切割，浓缩后用水析出，得到化合物1：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-OH。
化合物1具体合成过程如下：
投料表如下：
| 名称 | 分子量 | 质量mg |
| CTC resin | 取代度(1.0mmol/g) | 10000 |
| Fmoc-Leu-OH | 353.4 | 3887.4 |
| Fmoc-Gly-OH | 297 | 5940 |
| Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 459.5 | 9190 |
| Fmoc-Ser(tBu)-OH | 383.4 | 7668 |
| Fmoc-Trp(Boc)-OH | 526.6 | 10532 |
| Fmoc-His(Boc)-OH | 477.51 | 9550.2 |
| Boc-Pyr-OH | 229.2 | 4584 |
| HBTU | 379.24 | 7205.56 |
| DIEA | 129.24 | 3101.76 |
一、Leu-树脂的合成；
1).称10gCTC树脂于100ml固相合成反应器中，取Fmoc-Leu-OH于150ml三角瓶中，100ml量筒量取DCM 40ml，摇匀，加DIEA16.5ml，摇匀溶解，倒入反应器开始反应。反应1h时，用抽滤装置抽去反应液，用DMF洗4次；
2).量取60ml脱帽试剂哌嗪溶液，倒入反应器中，反应20min。随后，抽去反应液，DMF洗涤4次。
3).茚三酮检测：取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴茚三酮溶液，在110℃干式加热器中加热3min，阳性。
二、Gly-Leu-树脂的合成：
1).得到Leu-树脂后，向反应体系中添加第二氨基酸保护单体Fmoc-Gly-OH、缩合剂HBTU和碱DIEA，溶剂为DMF，反应时间为2小时，反应完成后，用DMF洗涤4遍；
2).反应完全的检测：取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴茚三酮溶液，在110℃干式加热器中加热3min，阴性。
3).得到Fmoc-Gly-Leu-树脂后，量取60ml脱帽试剂哌嗪溶液，倒入反应器中，反应20min。随后，抽去反应液，DMF洗涤4次。
4).茚三酮检测：取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴茚三酮溶液，在110℃干式加热器中加热3min，阳性。
5).获得Gly-Leu-树脂后，按照上述缩合反应方法，依次在Gly-Leu-树脂上连接氨基酸保护单体：
Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-His(Boc)-OH和Boc-Pyr-OH后获得：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-树脂。然后将保护多肽从树脂上切割下来，方法如下：
加1％TFA/DCM溶液80ml，摇摆反应10min，收集反应液，重复6次，浓缩反应液，加10％柠檬酸溶液，析出白色固体，过滤，水洗至中性，真空干燥。得到化合物1：Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-OH，14.7g，纯度93.6％，收率81％。(RP-HPLC图见图1；其裂解的无保护样品MS图见图2)
参照图1，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5 C18 column4.6*250mm；
A：5％乙腈/H2O溶液，0.1％TFA；B：乙腈，0.1％TFA(HPLC)；
梯度0～30min，B70％～90％；λ＝210nm；流速＝1.0ml/min；
优选地，步骤2)化合物2可以通过液相法合成：
以Fmoc-Pro-OH,H-Gly-NH2和Fmoc-Arg(pbf)-OH为氨基酸单体；
缩合剂为HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种；
活化剂为HOSu或HOBt；
有机碱主要为DIEA或TEA；
依次合成：
1)Fmoc-Pro-Gly-NH2；
2)H-Pro-Gly-NH2；
3)Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
4)H-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2。
具体地，化合物2的合成过程如下：
1).合成Fmoc-Pro-Gly-NH2：
称Fmoc-Pro-OH：100mmol，33.7g；BOP：110mmol，49g溶于500mlDMF中，冷浴10min，加入TEA：110mmol，12g。然后称取H-Gly-NH2.HCl：110mmol，12g，用100mlDMF+12gTEA溶解，倒入上述反应液，反应2h，HPLC显示反应完全，加入0.5M盐酸析出，过滤，得白色固体产物，真空干燥，得产物47.2g，纯度99.1％，收率110％。(RP-HPLC图见附图3)。
参照图3，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mm；
A：5％乙腈/H2O溶液，0.1％TFA；B：乙腈，0.1％TFA(HPLC)
梯度0～30min，B50％～90％；λ＝210nm；流速＝1.00ml/min。
2).合成H-Pro-Gly-NH2：
将产物用二乙胺500ml溶解，搅拌30min，HPLC显示反应完全。浓缩除去二乙胺，加石油醚析出，得到黄色稠状产物，H-Pro-Gly-NH2，纯度92.9％，真空干燥。(RP-HPLC图见图4)
参照图4，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5 C18 column4.6*250mm
A：5％乙腈/H2O溶液，0.1％TFA；B：乙腈，0.1％TFA(HPLC)；
梯度0～10min，B30％～60％；λ＝210nm；流速＝1.00ml/min。
3).合成Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2.HCl；
将Fmoc-Arg(Pbf)-OH：80mmol，52g用400ml DMF溶解，加入BOP：88mmol，39g，溶解后冰浴，然后加入TEA：88mmol，9g，另上述H-Pro-Gly-NH2用DMF50ml溶解加入到以上溶液中，2h后，HPLC显示反应完全，加入0.5M盐酸析出，过滤，得白色固体产物，真空干燥，得产物70.1g，纯度91.1％，收率104.6％。(RP-HPLC图见图5)
参照图5，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5 C18column 4.6*250mm；
A：5％乙腈/H2O溶液，0.1％TFA；B：乙腈，0.1％TFA(HPLC)；
梯度0～30min，B55％～65％；λ＝210nm；流速＝1.0ml/min。
4).合成H-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2
将Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-NH2溶于300ml二乙胺，反应30min，TLC显示反应完全，浓缩至少量，加石油醚析出，过滤，真空干燥，得到化合物2类白色固体56.9g，纯度97.5％，收率122％。(RP-HPLC图见图6，MS图见图7)。
参照图6，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mm；
A：5％乙腈/H2O溶液，0.1％TFA；B：乙腈，0.1％TFA(HPLC)；
梯度0～30min，B0％～10％；λ＝210nm；流速＝1.00ml/min。
合成化合物3：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
化合物1和化合物2的摩尔比为1：1.01—1：1.5；
化合物2和缩合剂、活化剂及有机碱的摩尔比＝1：1：1：1。
具体地，化合物3合成过程如下：
1).取化合物1：5mmol，6.4g和BOP：5.5mmol，2.4g溶于10mlDMF，加入活化剂HOBt和有机碱DIEA溶解，-5℃冷浴10min，
2).另取化合物2：5.5mmol，2.8g，溶于5ml THF中，反应2h，HPLC检测反应完全。
3).过滤除去白色固体，浓缩，加入0.5M盐酸溶液，析出类白色固体，过滤，水洗至中性。
4).真空干燥，得产物戈那瑞林前体(化合物3)：4.1mmol，11.5g，产率126.4％，纯度89.1％。(RP-HPLC图见图8)。
参照图8，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mm；
A：5％乙腈/H2O溶液，0.1％TFA；B：乙腈，0.1％TFA(HPLC)；
梯度：0～30min，B：70％～90％；λ＝210nm；流速＝1.0ml/min。
进一步地，戈那瑞林粗品纯度可以达到90％以上，可以由化合物3溶于TFA溶液中进行反应得到，反应完成后浓缩，加入醚类试剂析出，过滤即得到戈那瑞林粗品。
具体地，取100ml圆底烧瓶，称戈那瑞林前体2mmol投入，加入切肽试剂(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5)切割，得到含有戈那瑞林粗品的TFA溶液。
浓缩TFA溶液至少量，加入乙醚。离心，真空干燥得戈那瑞林粗品1.8g，纯度91.4％，收率75.1％。(RP-HPLC图见图9，MS图谱见附图10)
参见图9，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mm；
流动相：缓冲液：0.1M磷酸，三乙胺调节pH至3，缓冲液:乙腈＝85：15；
等度洗脱；λ＝220nm；流速＝1.0ml/min。
实施例2
与上述实施例的不同之处在于，树脂回收：
将实施例1的树脂用DMF洗涤，甲醇洗涤，抽去滤液，真空干燥。另配置二氯亚砜的DCM溶液(二氯亚砜4ml，DCM＝80ml)，加入装有树脂的100ml固相合成反应器中，反应2h后，抽去反应液，DCM洗涤。
投料表如下：
| 名称 | 分子量 | 质量mg |
| CTCresin | 取代度(1.0mmol/g) | 10000 |
| Fmoc-Leu-OH | 353.4 | 3887.4 |
| Fmoc-Gly-OH | 297 | 5940 |
| Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 459.5 | 9190 |
| Fmoc-Ser(tBu)-OH | 383.4 | 7668 |
| Fmoc-Trp(Boc)-OH | 526.6 | 10532 |
| Fmoc-His(Boc)-OH | 477.51 | 9550.2 |
| Boc-Pyr-OH | 229.2 | 4584 |
| HBTU | 379.24 | 7205.56 |
| DIEA | 129.24 | 3101.76 |
一、Leu-树脂的合成：
1).称10gCTC树脂于100ml固相合成反应器中，取Fmoc-Leu-OH于150ml三角瓶中，100ml量筒量取DCM40ml，摇匀，加DIEA16.5ml，摇匀溶解，倒入反应器开始反应。反应1h时，用抽滤装置抽去反应液，用DMF洗4次；
2).量取60ml脱帽试剂哌嗪溶液，倒入反应器中，反应20min。随后，抽去反应液，DMF洗涤4次。
3).茚三酮检测：取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴茚三酮溶液，在110℃干式加热器中加热3min，阳性。
二、Gly-Leu-树脂的合成：
1).得到Leu-树脂后，向反应体系中添加第二氨基酸保护单体Fmoc-Gly-OH、缩合剂HBTU和碱DIEA，溶剂为DMF，反应时间为2小时，反应完成后，用DMF洗涤4遍；
2).反应完全的检测：取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴茚三酮溶液，在110℃干式加热器中加热3min，阴性。
3).得到Fmoc-Gly-Leu-树脂后，量取60ml脱帽试剂哌嗪溶液，倒入反应器中，反应20min。随后，抽去反应液，DMF洗涤4次。
4).茚三酮检测：取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴茚三酮溶液，在110℃干式加热器中加热3min，阳性。
5).获得Gly-Leu-树脂后，按照上述缩合反应方法，依次在Gly-Leu-树脂上连接氨基酸保护单体：
Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-His(Boc)-OH和Boc-Pyr-OH后获得：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-树脂。然后将保护多肽从树脂上切割下来，方法如下：
加1％TFA/DCM溶液80ml，摇摆反应10min，收集反应液，重复6次，浓缩反应液，加10％柠檬酸溶液，析出白色固体，过滤，水洗至中性，真空干燥。得到化合物1：Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-OH，13.8g，纯度90.9％，收率76％。(RP-HPLC图见图11)。
参照图11，分析方法如下：
安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mm；
A：5％乙腈/H2O溶液，0.1％TFA；B：乙腈/H2O，0.1％TFA(HPLC)；
梯度0～30min，B70％～90％；λ＝210nm；流速＝1.00ml/min。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种多肽固液组合合成戈那瑞林的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用多肽固相法合成化合物1：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-OH；
2)用多肽液相法合成化合物2：
H-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
3)在液相中合成化合物3：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
4)合成戈那瑞林粗品：
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
2.根据权利要求1所述的一种多肽固液组合合成戈那瑞林的方法，其特征在于：步骤1)中，化合物1可以通过固相法从C到N末端的顺序合成，其步骤包括：
1)以CTC树脂为固相载体；
Boc-Pyr-OH，Fmoc-His(Boc)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH为氨基酸单体；
HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种为缩合剂；
哌嗪溶液为脱帽试剂，溶剂为偶极非质子溶剂，哌嗪溶液的质量浓度为2-5％；
从C到N末端依次合成：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-CTC树脂；
2)用三氟乙酸/二氯甲烷溶液切割，浓缩后用水析出，得到化合物1：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-OH。
3.根据权利要求1所述的一种多肽固液组合合成戈那瑞林的方法，其特征在于：步骤2)中，化合物2可以通过液相法合成：
以Fmoc-Pro-OH，H-Gly-NH2.HCl，Fmoc-Arg(pbf)-OH为氨基酸单体；
缩合剂为HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC等其中的一种；
活化剂为HOSu或HOBt；
有机碱主要为DIEA或TEA；
依次合成：
1)Fmoc-Pro-Gly-NH2；
2)H-Pro-Gly-NH2；
3)Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
4)H-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2。
4.根据权利要求1所述的一种多肽固液组合合成戈那瑞林的方法，其特征在于：步骤3)中，化合物3可以通过液相法合成：
以化合物1和化合物2为合成片段；
缩合剂为HBTU、HATU、TATU、TBTU、PyBOP、BOP、DIC、DCC其中的一种；
活化剂为HOSu或HOBt；
有机碱主要为DIEA或TEA；
合成化合物3：
Boc-Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-NH2；
化合物1和化合物2的摩尔比为1：1.01—1：1.5；
化合物2和缩合剂、活化剂及有机碱的摩尔比＝1：1：1：1。
5.根据权利要求1～5任一项所述的种多肽固液组合合成戈那瑞林的方法，其特征在于，化合物3合成步骤如下：
1)取化合物1和缩合剂溶于DMF，加入活化剂和有机碱溶解，-10～5℃冷浴5～15min；
2)另取化合物2溶于THF中，反应1.5～2.5h，HPLC检测反应完全。浓缩，加入盐酸溶液，析出类白色固体，过滤，水洗至中性；
3)真空干燥，得到化合物3。
6.根据权利要求1所述的一种多肽固液组合合成戈那瑞林的方法，其特征在于，戈那瑞林粗品纯度可以达到90％以上，可以由化合物3溶于TFA溶液中进行反应得到，反应完成后浓缩，加入醚类试剂析出，过滤即得到戈那瑞林粗品。
7.根据权利要求7所述的种多肽固液组合合成戈那瑞林的方法，其特征在于，由化合物3获得粗品的步骤如下：
1)取烧瓶，称化合物3投入，加入切肽试剂(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5)切割，得到含有戈那瑞林粗品的TFA溶液；
2)浓缩TFA溶液至少量，加入乙醚；
3)离心，真空干燥得戈那瑞林三氟乙酸盐粗品。
8.根据权利要求1～2任一项所述的种多肽固液组合合成戈那瑞林的方法，其特征在于，使用后的树脂回收步骤如下：
1)将树脂用DMF洗涤；
2)甲醇洗涤，抽去滤液，真空干燥；
3)另配置二氯亚砜的DCM溶液，加入装有树脂的固相合成反应器中，反应2h后，抽去反应液，DCM洗涤备用。
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