DK149862B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af lh-rh-analoge dekapeptidamider eller et salt eller et metalkompleks deraf - Google Patents

Description

i 149862

Den foreliggende opfindelse angår den ændring ved analogif remgangsmåden ifølge patent nr. 148.305 til fremstilling af et LH-RH-analogt nonapeptidamidderivat med den almene formel 1' 2' 3' 4'

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R -R -R -Arg-Pro-NH-R III

1' 2' hvor R er Tyr eller Phe, R er D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Nva, D-Abu, α-Aibu, D-Phe, D-Phg, D-Ser, D-Thr eller D-Met, 3' 4' R er Leu, Ile eller Nle og R er en alkylgruppe med 1-3 kulstofatomer som kan være substitueret med en hydroxylgruppe, at der fremstilles et hidtil ukendt dekapeptidamid med kraftig ovulationsfremkaldende virkning, og med den almene formel

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R1-R2-R^-Arg-Pro-Gly-NH2 I

hvor R1 er Tyr eller Phe, R2 er D-Nle, D-Nva, D-Abu, D-Phe, D-Ser, D-Thr eller D-Met og R^ er Leu, Ile eller Nle eller et salt eller et metalkompleks deraf.

I nærværende beskrivelse og krav er aminosyrer, peptider og deres aktiverede karboxylgrupper eller beskyttelsesgrupper betegnet med forkortelser som er almindeligt anvendt inden for det særlige fagområde eller som er vedtaget af Committee in Biochemical Nomenclature of IUPAC-IUB. Aminosyrer er i L-konfiguration medmindre andet er angivet.

Der anvendes således følgende forkortelser:

Abu: a-Aminosmørsyre

Arg: Arginin BOC: t-Butoxykarbonyl

Bzl: Benzyl DCC: Ν,Ν'-Dicyklohexylkarbodiimid

Gly: Glycin

His: Histidin HONB: N-Hydroxy-5-norbonen-2,3-dikarboximid

Ile: Isoleucin

Leu: Leucin

Nle: Norleucin 2 U9862

Nva: Norvalin

Met: Metionin OMe: Metylester OBzl: Benzylester ONB: N-Hydroxy-5-norbonen-2,3-dikarboximidester OSu N-Hydroxysuccinimidester

Phe: Fenylalanin

Pro: Prolin (Pyr)Glu: Pyroglutaminsyre

Ser: Serin

Thr: Treonin

Tos: Tosyl

Trp: Tryptofan

Tyr: Tyrosin

Det har været kendt i mange år at hypotalamus indeholder faktorer som på et højere niveau kontrollerer sekretionen af tropiske hormoner fra hypofysen. Efter isoleringen af et tyrotropin-stimulerende hormon (TRH) er der ekstraheret et hormon (LH-RH), som fremmer sekretionen af luteiniserende hormon, i ren form fra svin og får, og det har vist sig at være et dekapeptid med strukturen (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NI^ (A.V. Schally et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 43, 1334 (1971), R. Guillemin et al, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 69,278(1972)). Denne opdagelse er blevet fulgt af syntesen af et tilsvarende antal peptider og der har også været udført biologiske prøver på disse analoge peptider. Imidlertid formindsker selv en lille modifikation af den ovenfor viste aminosyresammensætning i alvorlig grad den fysiologiske virkning af peptidet og den ovenfor viste kemiske struktur har været anset som essentiel til frembringelse af maksimal fysiologisk virkning. (A.V. Schally et al, Biochem, Biophys.

Res. Commun., 4, 366, 1972).

3 149802

For nyligt har Monahan et al i "Biochemistry", bind 12, nr. 23, side 4616-4620, 1973, vist at blandt LH-RH-analogerne, såsom (Ala6)LH-RH, (D-Ala6)LH-RH, (Val6)LH-RH, (D-Val6)LH-RH, 6 6 (Pro )LH-RH og (D-Pro )LH-RH som blev syntetiseret af dem, udviste (D-Ala®)LH-RH den stærkeste aktivitet på 350-450% af virkningen af det oprindelige LH-RH. Endvidere kendes fra dansk patentansøgning nr. 2250/73 LH-RH-analoge nonapeptid-amidderivater med en virkning på op til 672% af LH-RH's virkning. Det fremgår desuden af litteraturen at LH-RH-analoger, der i 6-stillingen har en D-aminosyre med en sidekæde der fylder mere end D-Ala, er mindre kraftige end det oprindelige hormon. Til trods for de ovennævnte angivelser er det lykkedes at syntetisere polypeptider med formel I, der i 6-stillingen har en D-aminosyre med sidekæder der fylder mere end D-Ala, og ved afprøvning af deres LH-RH-virkning har det overraskende vist sig at de ifølge opfindelsen fremstillede peptider med formel I er mindst 1000% kraftigere end det oprindelige LH-RH og således også mere virksomme end de fra dansk patentansøgning nr. 2250/73 kendte. Den foreliggende opfindelse bygger på disse uventede opdagelser.

Det er således formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en analogifremgangsmåde til fremstilling af dekapeptidamidet med den almene formel I eller et salt eller et metalkompleks deraf.

Dekapeptidamidet med formel I fremstilles ifølge opfindelsen ved at et reagens A - L-pyrbglutaminsyre eller et peptidfragment som indeholder fra 1 til 10 aminosyrer af den i formel I viste aminosyresekvens, regnet fra den N-terminale ende, og som har en L-pyroglutaminsyreenhed (dvs. (Pyr)Glu-) i sin N-terminale ende - kondenseres med et reagens B - en aminofor-bindelse som svarer til den resterende del af det ovennævnte dekapeptidamid - hvilke reagenser A og B eventuelt er beskyttede, hvorefter man fjerner eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper og om ønsket omdanner det dannede produkt til et salt eller et metalkompleks deraf.

Således er reagens A L-pyroglutaminsyre eller et peptidfragment som har en L-pyroglutaminsyreenhed i sin N-terminale ende og som samtidigt regnet derfra omfatter en del af aminosyresékven-sen med formel I, og reagenset B, som kondenseres med reagenset A, er en aminoforbindelse som svarer til den resterende del af dekapeptidamidet I, reagenserne A og B er eventuelt beskyttede.

U98G2 4

De grundliggende kombinationer af reagens A og reagens B er eksemplificeret i følgende tabel 1.

__Tabel 1_ N\^eagens

Kom-^^x. (A) (B) bination^__ 1 (Pyr)Glu-OH H-His-Trp-Ser-R"^-R2 R ^-Arg-Pro-Gly-HH2 2 (Py r) Glu-Hi s- OH Η-ΤΓρ-δβΓ-Η1^2^ 3-

Arg-Pro-G-ly-M^ 3 (Pyr)Glu-His- H-Ser-R^ -R2-R"*-Arg-

Trp-OH Pro-Gly-KH2 4 (Pyr)Glu-His- H-R^-R2-R^-Arg-Pro-

Trp-Ser-OH Gly-NH2 5 (Pyr)Glu-His- H-R2-R^-Arg-Pro-

Trp-Ser-R1-OH Gly-UH2 6 (Pyr)Glu-His- H-R3-Arg-Pro-Gly-

Trp-Ser-R^-R2~0H JSHg 7 (Pyr)Glu-His- H-Arg-Pro-Gly-NH2

Trp-Ser-R ^-R 2-

R3-0H

8 (Pyr) Glu-His-Trp- H-Pro-Gly-IiH2

Ser-R1-R2-R 3-Arg-

OH

9 (Pyr)Glu-His-Trp- H-Gly-JSHg S er-R^R 2-R 3-Arg-

Pro-OH

10 (Pyr)Glu-His-Trp- NH^ S e r-R1-R 2-R 2-Ar g-

Pro-Gly-OH _ 5 149862

Kondensationsreaktionen ifølge den foreliggende opfindelse kan gennemføres ved kendte kondensationsmetoder for dannelse af peptidbindinger. Blandt sådanne kondensationsmetoder er DCC/HONB-processen (belgisk patentskrift nr. 796.399), azidprocessen, kloridprocessen, blandet syreanhydridprocessen, DCC-processen, aktiv esterprocessen, Woodward reagens K-pro-cessen, karbodiimidazolprocessen, oxydations-reaktionsproces-sen og andre metoder (The Peptides, Vol 1, 1966, Schrbder og Lubke, Academic Press, New York, USA.

Før kondensationsreaktionen kan man beskytte de karboxyl- og aminogrupper der ikke skal involveres i den påtænkte reaktion eller man kan aktivere de karboxyl- og/eller de aminogrupper der skal tage del i reaktionen på i og for sig kendt måde. Karboxylgrupperne i udgangsmaterialet kan beskyttes i form af metalsalte (fx natrium- og kaliumsalte) eller estere (fx metyl-, ætyl-, benzyl-, p-nitrobenzyl-, t-butyl-eller t-amylestere).

Beskyttelsesgrupper for aminogrupper i udgangsmaterialerne kan være hvilke som helst konventionelle beskyttelsesgrupper for aminogrupper ved peptidsyntese, fx benzyloxykarbonyl, t-butoxykarbonyl eller isobomyloxykarbo-nyl. Iminogruppen i histidin kan beskyttes med en hvilken som helst beskyttelsesgruppe såsom benzyl, tosyl, 2,4-dinitrofenol, t-butoxykarbonyl eller karbobenzoxy. Hydroxylgruppen i serin kan beskyttes.med en konventionel beskyttelsesgruppe såsom benzyl, p-butyl eller andre æterdannende grupper. Hydroxylgruppen i tyrosin kan beskyttes med benzyl, t-butyl eller andre æterdannende grupper. Guanidin- gruppen i arginin kan beskyttes med sådanne grupper som nitro, tosyl, karbobenzoxy isobomyloxykarbonyl eller adamantyloxy-karbonyl. Som eksempler på aktiverede karboxylgrupper i udgangsmaterialer kan nævnes det tilsvarende anhydrid, azid eller aktive estere (estere med alkoholer, fx pentaklorfenol, 2,4,5-triklorfenol, 2,4-dinitrofenol, cyanometylalkohol, p-nitro-fenol, N-hydroxy-5-norbonen-2,3-dikarboximid, N-hydroxysuccin-imid, N-hydroxyftalimid eller N-hydroxybenztriazol). De aktiverede aminogrupper i udgangsmaterialer kan fx være tilsvarende fosforsyreamider.

Følgende tabel viser nogle eksempler på kombinationer af sådanne former af karboxyl- og aminogrupper i materialerne A og B.

6 149862

Tabel 2

Kombinations-_Udgangsmateriale_ eksempler (A) (B) COOH nh2 cooh nh2 lx fri beskyttet beskyttet fri 2 aktiveret beskyttet fri fri 3 fri beskyttet beskyttet aktiveret NB: I tilfældet betegnet med x, er der fortrinsvis et de- hydreringsmiddel til stede i reaktionssystemet (fx et karbodiimidreagens såsom dicyklohexylkarbodiimid). En praktisk udførelsesform for denne opfindelse kan skrives på følgende måde.

149862

(D

n CQ

H S

I <D Φ O

H W P ·Η Φ H ffi -g -P Φ •P P P3 >>8 8¾ M > H S Φ

rap O P

Φ ffl N ·Η

,Ω S Φ X

η X ra

£ H P *H H

<M Φ Od -P '-'-P

MM {Xj <M N >» g ΉΉ M cd S ΦΗ i cdw i φ ft cd'-' >> >» Φ rQ ft-Pfe

ΗΦΦ H ra >> 3 cd M

O ra ft O Η X m fri I H ft'-' I Φ O b0 P Od

0 (D d Ih O P P Od 01 ·> φ M

p SPM P Sti Μ Φ'ΰΗ S

ft P boE ft >>> S « g H i 1 Φ ra I PM I H cd Φ >> CM bO Ό Φ H CM bO 81 ί>> Φ !> Η O pcpMCdOP βΗ H -P\- 1:5

'Z — < S —C \ O -P Φ P I

I ^ I _ H o I >>PO o

ro -^ ro o o Λ1 ί>5-Ρ P

aj oj MP P rawed ft i i ch ft φ φ ra i

cv] od P I ,Ω P ί>> bO

cd cd Φ CM W) Sh P

i SHOP CHSed <

n oh la - <! cd -p „J

•Η Φ I H cd ΓΟ p ro φ x cd cd pq cd ra cm i rag I H H I od SO cm ®ud cd ΦΜ M S Sfri ,1

'd-'v. i P co H

SO Η φ Ό Od

O O Μ *θ«Η Φ I

W P i 1¾ cd S P

--Φ ^ CQ

CQ 1 φ q £* É ftai μ Eh

ft O Φ I >- E-· I

S M ft +3 h i i ω

Jh N ft hnid w rj

bO O 3 fri-P ft Η M

w o P ra cd M i φ Ω bo φ fri *d i 3

ra ra p φ 3 H

Η X Φ _ X 8 H o Φ ch ra S 'H c5 Τ'

-P—' Η Φ'-' S C' P

-P Φ o P >> >1 S +5 ep ΦΗ'-' >> fri fri o -P S ft-P P ft ^ ra H >> ftfri O ^ Φ +3 fri ¢=(3+3 p cd ra ra P 'd cd i, ra Φ H bo Φ ra H S p φ ra P >»

Μ Φ i S Φ H

i -d Η P ra fri cd h P s cd φη ra-p cd φ o i π <d h cd i

CQ fri P «H-P-Pfri P

φ Φ

+ CQ CQ

e „ & ^ & EH -* EH ->EH -

CQ CQ CQ

*n\ ·Η *H

MM M

i 1 i S 2 3

HH H

S3 O O

/-S /-’N

P P P

ί>ϊ

Pk 04 P-i

Sw/ s-/ V-/ 149862 δ

Denne reaktion kan gennemføres i nærværelse af et opløsningsmiddel. Opløsningsmidlet kan vælges fra dem der er kendt som anvendelige for peptidkondensationsreaktioner, illfilfi Sil11 ^er vandfrit eller vandigt dimetyl- formamid, dimetylsulfoxyd, pyridin, kloroform, dioxan, di-klormetan, tetrahydrofuran og passende blandinger af sådanne opløsningsmidler.

Reaktionstemperaturen kan vælges indenfor det område der er kendt som anvendeligt til reaktioner der fører til dannelse af peptidbindinger, dvs. normalt indenfor området fra ca.-20°C til ca. 30°C. Desuden kan prekursormaterialer-ne (beskyttede peptider) for forbindelserne med formel i også let fremstilles ved synteseprocesser i fast fase.

Efter at den ønskede kondensationsreaktion er tilendebragt kan man fjerne beskyttelsesgrupper ved kendte metoder dersom produktet bærer sådanne. Blandt sådanne kendte metoder er katalytisk reduktion i nærværelse af en katalysator såsom palladiumsort, palladium-på-kulstof, platin eller lignende, solvo-lyse ved hjælp af hydrogenfluorid, trifluoreddikesyre eller lignende og reduktion med metallisk natrium i flydende ammoniak.

Det således vundne peptid med formel I kan udvindes fra reaktionsproduktblandingen ved metoder der er kendte fra udvinding af peptider, fx ved ekstraktion, fordelingskromatografi eller søjlekromatografi.

Den foreliggende reaktion kan gennemføres på i og for sig kendt måde i fast fase.

Peptidet med formel I kan også udvindes i form af et salt eller en metalkompleksforbindelse.

Som syrer der er istand til at danne salte med peptider med formel I kan nævnes uorganiske syrer såsom saltsyre, brombrintesyre, perklorsyre, salpetersyre, tiocyansyre, svovlsyre og fosforsyre samt organiske syrer såsom myresyre, eddikesyre, propionsyre, glykolsyre, mælkesyre, pyrodruesyre, oxalsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, antranylsyre, kanelsyre, naftalensulfonsyre eller sulfanylsyre.

De metaller der er i stand til at danne metalkompleksforbindelser med peptidet med formel I indbefatter bl.a. zink, nikkel, kobolt og jern. En sådan metalkompleksforbindelse kan fremstilles på konventionel måde, fx ved at omsætte et peptid med 149862 9 formel I med hydroxydet eller oxydet af et metal af den ovennævnte art ved pH ca. 6-8.

De ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser med formel I har en Ifl-RH—(luteiniserende hormon-stimulerende hormon)-virkning og de er således i stand til at fremme sekretionen af LH (luteiniserende hormon) og FSH (follikel stimulerende hormon). Polypeptider med formel I er således nyttige som lægemidler til fremkaldelse af ovulationer hos kvinder og hundyr (fx rotter, får, svin, køer, hopper, vagtler eller høns). Peptiderne kan også anvendes til andre farmakologiske formål hvortil der har været anvendt konventionelle præparater af LH-RH, LH og FSH.

Idet LH-RH-virkningen af polypeptiderne med formel I er ca. 10-25 gange så stor som naturligt forekommende LH-RH kan den anvendte dosis ved hver indgift bestemmes på grundlag af det nævnte forhold mens man også tager andre faktorer i betragtning (fx det under behandling værende individ og arten af sygdommen). Fx kan en passende dosis vælges inden for området ca. 5 ng (nanogram) til 10 μg pr. dag pr. kg legemsvægt.

Polypeptiderne med formel I indgives først og fremmest ad ikke-oral vej (fx ved indsprøjtning eller ad rektal eller vaginal vej) selv om de indgives oralt i visse tilfælde.

Anvendelige dosisformer indbefatter fx injektionsblandinger, suppositorier, pessarer og pulvere. Injektionsblandingerne kan fremstilles ved at man opløser ca. 10 mikrogram til 500 mikrogram af et polypeptid med formel I i 1 ml fysiologisk saltopløsning. Polypeptiderne med formel I kan også tilberedes i form af frysetørrede ampulprodukter med mannitol tilsat som excipiens således at man kan indgive dem i form af på stedet fremstillede injektionsblandinger.

De peptidudgangsmaterialer der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan frenstilles enten på kendt måde for peptidsyntese eller ved at anvende sådanne metoder som måtte være nødvendige.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere i det følgende ved hjælp af nogle eksempler.

I disse eksempler betegner følgende forkortelser Rf-værdien ved tyndlagskromatografi på silikagel med følgende opløsningsmiddelsystem.

Rf1: kloroform/metanol/eddikesyre, 9:1:0,5 o

Rf : ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand, 50:10:3:5

Rf3 n-butanol/ætylacetat/eddikesyre/vand, 1:1:1:1.

149862 ίο

Eksempel 1 (Pyr)Glu-His -Trp-Ser-Phe-(D )-Nva-Leu-Arg-Pro-Gly-NHg a) Z-(D)-Nva-Leu-Arg(N02)-Pro-Gly-N^

Til en opløsning af 380 mg Z-(D)-Nva-0H, 690 mg H-Leu-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 og 300 mg HONB i 5 ml dimetyl-formamid sættes 340 mg DCC ved 0°C under omrøring. Blandingen omrøres i 2 timer ved 0°C og i yderligere 10 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen filtreres til fjernelse af det dannede dicyklohexylurinstof og filtratet inddampes til tørhed. Den resulterende remanens opløses i 100 ml kloroform og opløsningen vaskes med 4%s vandigt natriumbikarbonatopløsning og vand. Den vaskede opløsning tørres over vandfrit magniumsulfat og inddampes til tørhed. Derefter tritureres remanensen med en blanding af 25 ml ætylacetat og 25 ml æter hvorved der vindes et hvidt pulver som opsamles ved filtrering og genudfældes fra ætanol/æter: udbytte 1,12 g, ajp = -50,5° (c = 1,1 i metanol), Rf^" = 0,32.

Beregnet for ^32Η5209Ν10: C 53,32, H 7,27, N 19,43 Fundet: C 53,49, H 7,56, N 19,19%.

b) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-(D)-Nva-Leu-Arg-Pro-Gly-N^ 1,0 g Z-(D)-Nva-Leu-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 opløses i 10 ml 25%s hydrogenbromid i eddikesyre og opløsningen omrøres i 50 minutter. Reaktionsblandingen fortyndes med 200 ml tør æter hvilket giver et bundfald som opsamles ved filtrering og vaskes grundigt med tør æter. Det opsamlede pulver tørres over natrium-hydroxyd under nedsat tryk. Dette pulver opløses i 10 ml dimetyl-formamid sammen med 1,0 g (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH og 440 mg HONB. Opløsningen afkøles til 0°C og der tilsættes 400 mg DCC under omrøring. Blandingen omrøres i 6 timer ved 0°C og i yderligere 16 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen filtre

II

149862 res til fjernelse af det dannede dicyklohexylurinstof og filtratet tritureres ved tilsætning af 100 ml æter hvorved der vindes et bundfald som opsamles ved filtrering. Det opsamlede bundfald. opløses i 10%s vandigt ætanol og opløsningen anbringes på en kolonne af polystyrenharpiks ("Amberlite" XAD-2 (150-250 mesh, 35 x 25 cm) "Amberlite" er et i Danmark indregistreret varemærke) og kolonne* elueres ved gradientmetoden med 10%s vandigt ætanol og 100%s ætanol (500:550 ml). Hovedfraktionen (380-220 ml) opsamles og inddampes til tørhed. Remanensen opløses i 5 ml varm metanol og genudfældes ved tilsætning af ætylacetat hvorved man vinder det beskyttede dekapeptidamid. 1,41 g, = -35,4° (c = 0,12 i metanol, Rf2 =? 0,20» Rf^ = 0,56.

500 mg af det beskyttede dekapeptidamid opløstes i 5 ml vandfrit hydrogenfluorid sammen med 0,5 ml anisol ved -70°C.

i 30 minutter

Efter at have været omrørt/ved -5°C fjernedes hydrogenfluoridet ved inddampning. Den resulterende remanens opløses i 20 ml vand og opløsningen ekstraheres to gange med 10 ml ætylacetat. Det vandige lag påføres en kolonne af karboxymetylcellulose (2 x 35 cm) og kolonnen elueres ved gradientelueringsmetoden under anvendelse af en ammoniumacetatpuffer som elueringsmiddel (0,05M, pH 6,8 (500 ml) - 0,2M, pH 6,8 (500 ml)). Hovedfraktionen (420 ml - 680 ml) opsamles og frysetørres hvorved der vindes 22 et hvidt pulver i et udbytte på 380 mg, = -32,4° (c = 0,52 i 5%s eddikesyre), Rf2 = 0,05, Rf^ = 0,68.

Aminosyreanalyse: His 1,01} Arg 0,98; Trp 0,87; Ser 0,94;

Glu 1,00; Pro 1,02; Gly 1,00; Nva 1,01; Leu 1,00; Phe 0,97; (peptidindhold, 84%).

Eksempel 2 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Nle-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 ved fast fase-metode a) B OC-GIv-harpiks I 60 ml kloroform/ætanol (2:1) anbringes 10 g klor-metyl-harpiks (Cl-indhold 2,0 mmol/g) hvorefter der tilsættes 10,5 g BOC-Gly og 8,4 ml triætylamin. Blandingen omrøres ved 149362 12 stuetemperatur i 1 1/2 time og opvarmes derpå i 24 timer.

Harpiksen opsamles ved filtrering og vaskes grundigt med dimetylformamid og yderligere med ætanol, vand, ætanol og æter i den nævnte rækkefølge hvorefter den tørres. Udbytte 17,55 g· Aminosyreanalyse viser at denne harpiks indeholder 0,88 mmol/g BOC-Gly.

b) (Pyr)Glu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Nle-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-harpiks

Reaktionsbeholderen til et automatisk peptidsyntese-apparat ( model "APS-800" Simadzu Seisakusho, Japan) fyldes med 2,177 g af den i eksempel 2 a) vundne BOC-Gly-har-piks og harpiksen kvældes med diklormetan i 12 timer. Derpå tilføres følgende aminosyrer i den følgende cyklus.

BOC-Pro, BOC-Arg(Tos), BOC-Leu, BOC-D-Nle, BOC-Tyr-(Bzl), BOC-Ser(Bzl), BOC-Trp, BOC-His(Tos), (Pyr)Glu.

Diklormetan (3 minutter x 3)--- 50% trifluoreddike-syre/diklormetan (10 minutter og 30 minutter) —> diklormetan (3 minutter x 3)-> ætanol (3 minutter x 3)-^ diklormetan (3 minutter x 3)-^ 10% triætylamin/kloroform (10 minutter)-kloroform (3 minutter x 3)-> diklormetan (3 minutter x 2)-BOC-aminosyreanhydrid (syntetiseret fra BOC-amino- syre og. DCC på konventionel måde)(30 minutter og 60 minutter) —> acylering (med eddikesyréanhydrid i diklormetan og triætylamin) (1 time) — ,> diklormetan (3 minutter x 3) /"kun (Pyr)Glu kondenseres direkte med DCC i dimetylformamid7.

Til sidst vaskes harpiksen med ætanol, kloroform og dimetylformamid. Derpå vaskes den med æter og tørres* Udbytte 6,20 g.

c) (Pyr)Glu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Nle-Leu-Arg (Tos) -Pro-Gly-NH2 I 50 ml ammoniakmættet metanol suspenderes 2,622 g af den i eksempel 2 b) fremstillede harpiks og suspensionen omrøres ved stuetemperatur i 70 timer.

13 149882

Harpiksen opsamles ved filtrering og vaskes med dimetylformamid. Filtratet og vaskevæskerne forenes, koncentreres til tørhed under nedsat tryk og behandles med æter. Proceduren giver 1,187 g af et råt pulver.

En portion på 588 mg af dette produkt renses på en tør kolonne af 50 g silikagel under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af metanol og kloroform som fremkalder, hvorved der vindes 186 mg af det ønskede produkt.

d) (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nle-Leu-Arg-Pro-Gly-NHg I nærværelse af 0,2 ml. anisol og 0,2 ml merkapto-ætanol opløses 173,3 mg af det i eksempel 2 c) vundne beskyttede peptid i 5 ml tørt hydrogenfluorid og opløsningen omrøres ved 0°C i en time. Derpå koncentreres den til tørhed under nedsat tryk og koncentratet opløses i 20 ml vand. De uopløselige bestanddele filtreres fra og filtratet føres gennem en kolonne (1,5 cm i diameter x 20 cm) af en stærk basisk anionbytterhar-piks ("Amberlite" IRA-410 acetatform). Derpå renses effluenten ved hjælp af karboxymetylcellulose (1,5 x 22 cm, gradientelue-ringsmetode under anvendelse af 0,005M til 0,2M ammoniumacetat med pH 6,8) og polystyrenharpiks "Amberlite" XÅD-2, 1,5 x 7,5 cm, gradienteluering under anvendelse af 5% - 70% vandigt ætanol). Eluatet underkastes yderligere gelfiltreringskromatografi på "Sephadex" LH-20 (0,9 x 53,5 cm, 0,1N eddikesyre) ("Sephadex" er et i Danmark indregistreret varemærke).Proceduren giver 24 , / 39 mg af den ønskede forbindelse med = -40,5° (c = 0,5 i 5%s vandigt eddikesyre).

Aminosyreanalyse (sur hydrolyse i nærværelse af tioglykolsyre)

Glu 0,97; His 0,97; Trp 0,94; Ser 0,88; Tyr 1,0; Leu 1,00;

Nle 1,06; Arg 1,03; Pro 1,00; Gly 1,03; (87%s genvinding).

Eksempel 3-13

Ved anvendelse af procedurer svarende til den i eksempel 2 beskrevne med den undtagelse af at der anvendes de udgangsmaterialer der er angivet i følgende tabel i stedet for dem der anvendes i eksempel 2 fremstilles de i tabellen angivne dekapeptidamider med formel I.

149862 14 +3

<D

•d

<D

03 p φ φ ω ω •η t - f f ? ί +3 0 o o o o g *__m__s__§__§ S <d S' I g ^

gw H CO <! &; EH

®, S I I I I

si 4 *?h i *? *? 0) ft I O tsi o o o H S O o pq o o o (il® O pq^ pq pq pq •H M pq-- ------— ?h 44 /—

<D Φ Η Η Η H

•PH N N N N

cd H N pq pq pq pq g da - w . w —

to 3 ·—· u P ^ P

bOCD Pi >3 i>3 >? >»

dfl S ÉH Ért Ert EH

S H I i i i bQU I o o o o

ir} o O O O O O

gen o W pq pq pq .

__J_ffl_______ (tl · »> «ffv »9\ «ft ** ··* ··» ·*> •t' · ** ··> Λ ··» ** *·*

Si rlrlHI^ O CM O f- CD WHOMD ΟΟΟΟΟΛΟΟ i" ocnocn ooaocncn oaoaocncri σ>οοσ>σ\ ri M f· » A ·*·*<»···* »» f «· ή i< f> «·<·«· r

HHHO HOHOO OOHOO OHHOO

g .ttOPnopi ftffcopsiq sop o cd ^ sop d >jp ® p Φ P Φ in (D >s p Φ P > >5 P +4 Η H >j

. ® <JCQFm-q <4 CO FM <4 Eh =aj ra FP Ϊ3 Eh < E-h O Cb H

H H

>3 -.r -...................-............

CD M CMC~OtO\VQ vocnocrlO O CM O H CO rllACMOO

o o crv o o cr> cncoooao ooaoocn o σ\ cn o o jQ £* .«v* ·*·»«»- «%, ** ·% e% ·* ** ι» »* ι» f· Λ r r ·· ^ f«

•H HOHriO O O HO ri r{ O Η Η O Η O O Η H

tf Sj <q ω a d >a ^ m a d >i d m ft d >j d ra ft p o d E+ Ή Si HH >s Ή C( Η H ® -Η p Η Η Φ Ή h ® C) ®

PdEHOOEd K ΕΗΰώΡ ΚΒΰΰΡ M EH GQ PM Η -— ; ^ 1 44 ^ S Irt o o o o O >S CO CM m S 01 φ + κΓ CO £

W ^.+3 Φ i" 1" V V

•ej- in tao P i 1 1 N,P^5&______ in rt rt d d d pci φ S ω φ •Η p H PI ^ S_______ —_____— cd---— p d ® % •ri CM - φ +1 j> +h +3— OS ra -=4 S3 ^ ftH 1 Λ Λ Λ

φ^- ρ ρ ρ Q

a---------— j§ Η ρ ρ u £ s r__5__i? _i? £ å ΜΗ ^ ^ ^ ω 44 Φ η a 15 149362

-P

O)

Ti o +* ί W Q) d 3 d Φ

i-3 Q) Q) <D H

•Hl p (-3 1-1 H

O I I i i +3 0 o o o o •b pq o o o o c __m pq m pq 0)--- > ω φ +5 © d d CM H -d ,2 £ 5 8h n i i 7.1 ti® ή 9 9 9 9

H §* O O O O O

ds S o o o o

•HM n - Pi__«__3__W

k ^ ^ ^

® ω C* Η Η H

• m μ N N N

a’H m w S S

Μ Θ y 'd" y_t ‘ cd d M® b >> £ >2

d x> S EH £-f Ph P

ro Η I I I I

bød I O O O O

•ti O O O O O O

0·Η O pq pq pq pq .

Im______ ω (ricricrico'xi ocvicocho ωόοόοο ocoocooo >, cnGOcncncn ocncnc-o cncncno ocoocncn i ·% ·**··* ·* r ·* ι» »* ·%·>**··» ·*·***·* «* (3 ooooo hooch o oo h h o h o o S bO d O d d bO d O H d bO d O d bO d O d d S d Φ d Φ >5 d Φ d Φ !>; d 1’ d 4) +J 0) d +3 >ϊ

fj «aj 02 P id H < 02 PM ^ Ch <q 02 P P *=i! 02 P <! P

S* r· or, 99v g *V * ». «θ' ·»·» ·»·*«» «*·«·» o·®··» • •»••».•λολολ

S O C— O H O OOCncnOO O t> H O OO OCMtnOOO

g ocoooo cr>oocr>oo o co o o σ> οφοοφ

"d i—I O i—It—li—I OOOHH HOHHH HOHHO

< ω p d >·.. φ ω p d i>s d ω p d >5 φ m p d >j φ •H d Η Η X! ·Η d Η Η Φ HdHHd z! d O 'ij 1-1 Μροορ Wdtsad ji!E-<cticbpq ιχιηοοη 0)

— I

m Sri • dO o o o o O > Ol H- O in in j| φ ·'·» -I n

0 to C\1 0J CTv CO

—/ ^.+3 <u LTi H· CO

-tf in bO d I I I I

Cvip H >>

« HtJ W

•ti ^oJ d d d © 1 Η P P H_ *2 ni Φ -P Φ d

Ti _ ^ X! <0 p P

+?C “ pq g FM <!

P<H I I I I

2"- P P R Q

H d d Φ d © & >> >> P >5 Q 1 e-t__eh__ρ__e-i_ i a φ tQ H C— 00 C?\ o

P Φ H

W ft 16_ 149862 -p

<D

TJ

CD

US s- S h ni H & y -p o q ο o

« a_ % S I

P Ph CD cd > , ® <D H !> gcvi Η τη s {ξϊ n , S i i i

Η I Q P

Φ Q I Η I I

ΦΡ< I ΟΝ Ο O

H S O O pq Ο O

cfl CD O PQ'-' PQ pq •H w pq------- <D 0)

-P H

• ca -H n a ΰ B0 ΰ ® ® ® bO O) U β β b g S % hflk I g g g g«s g § § . s I PQ----

Si «4 t-CTkVQ Hcnon OCTiOOCTi P cncocncri ooooo οοοοσχη r) ^ r1 r λ ^ ^ »· <« r ® 2

Η OHOO . HOHN HOHOO

ca β «ho® -ρ o <d wjfnocaa) β Ph 0) Pi H h ® hH P Φ p > Æ ® <jcqp>h&i <jjcapqs <p co p1h N Ph

H

6ΛΟΛ.Ο·»·». «#.&1, 0161« «»tO'XtCSO1·1 n cot^ootM Oricvi or~ vovoOcocm o cnooooo ooooocri cncoocTicn d ~ ~ ~ ~

•Η OOHHH HOHHO OOHOO

.1 CD Pi 2 >3 0 CO Pi 3 >j CD CO P)^ >s0) •H Pi Η Η β Ή P) Η Η il Ή if Η ri Η

WehcPOPM pq εη cp ο pq M ch cu ώ h Φ i x

in PH

r. CO Xf O O O

O > t) m H in π o #· »» ^

Orø ni m in w -^R-P ω tn in tn 4 UMiDP 1 1 1 CVl Q -H >> σ Ητί tø tn, φ ω ω

« ® H H H

*| {2i iSj__H

'b fn ω cd •H OJ <1) H !> P'- øi Ki fe !?", P(H i i i CD'·— Q R n & ———---

»d Η Φ CD <D

cd pq β β β fl pH__Pj__Ph_ å tø H i nj Ώ ^ 0 ri M ri

WP1 J

2 17 149862

Biologisk forsøgsrapport

Der er foretaget en bestemmelse af de omhandlede forbindelsers ovulationsfremkaldende virkning ved anvendelse af den metode, der er beskrevet i J.Med.Chem. 16, 1144-1147 (1973). Til sammenligning bestemtes virkningen af forbindelser kendt fra dansk patentansøgning nr. 2250/73 og fra Monahan et al, Biochemistry, bind 12, nr. 23, side 4616-4620 (1973).

Som reference sammenlignedes der med virkningen (=100%) af LH-RH = (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-.Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2. Resultaterne fremgår af følgende tabel: (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R^-R^-R^-Arg-Pro-Gly-NE^

Ovulationsfremkaldende virkning (%) R1 R2 R3 (LH-RH = 100)

Phe D -Nva Leu 1800

Tyr D -Nle Leu 2200

Tyr D -Ser Leu 2700

Tyr D -Abu Leu 2500

Tyr D -Nva Leu 2500

Tyr D -Thr Leu 2400

Tyr D -Phe Leu 2800

Tyr D -Met Leu 2500

Phe D -Phe Leu 2000

Tyr D -Abu Ile 1200 *(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3 672 *«(D-Ala6)-LH-RH_· 350-450_ 1 2 forbindelse kendt fra dansk patentansøgning nr 2250/73.

2 forbindelse kendt fra Monahan et al.

EDj-q for LH-RH er 215 - 12 ng/100 g legemsvægt (rotte).