UA125611C2 - Біспецифічні молекули, що мають імунореактивність відносно pd-1 і ctla-4, і способи їх застосування - Google Patents

Біспецифічні молекули, що мають імунореактивність відносно pd-1 і ctla-4, і способи їх застосування Download PDF

Info

Publication number
UA125611C2
UA125611C2 UAA201806826A UAA201806826A UA125611C2 UA 125611 C2 UA125611 C2 UA 125611C2 UA A201806826 A UAA201806826 A UA A201806826A UA A201806826 A UAA201806826 A UA A201806826A UA 125611 C2 UA125611 C2 UA 125611C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
cancer
binding
sti
domain
bispecific
Prior art date
Application number
UAA201806826A
Other languages
English (en)
Inventor
Леслі С. Джонсон
Лесли С. Джонсон
Гурунад Редді Чічілі
Гурунад Редди Чичили
Калпана Шах
Мотте-Мос Росс Ла
Пол А. Мур
Еціо Бонвіні
Эцио Бонвини
Скотт Кьоніг
Скотт Кёниг
Original Assignee
Макродженікс, Інк.
Макродженикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Макродженікс, Інк., Макродженикс, Инк. filed Critical Макродженікс, Інк.
Publication of UA125611C2 publication Critical patent/UA125611C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід стосується біспецифічної молекули, яка містить: (A) один або більше сайтів зв’язування епітопу, здатних до імуноспецифічного зв’язування з епітопом PD-1, що включає домен VH mAb PD-1 6-I VH (SEQ ID NO:86) і домен VL mAb PD-1 6-SQ (SEQ ID NO:87); і (B) один або більше сайтів зв’язування епітопу, здатних до імуноспецифічного зв’язування з епітопом CTLA-4, що включає домен VH mAb 3 CTLA-4 (SEQ ID NO: 90) і домен VL mAb 3 CTLA-4 (SEQ ID NO: 91).

Description

ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
ІО00О1) Дана заявка є частковим продовженням і претендує на пріоритет згідно із заявкою на патент США із серійним номером Мо 62/266 944 (яка подана 14 грудня 2015, на розгляді), яка повністю включена у дану заявку.
ПОСИЛАННЯ НА ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
І0002| Дана заявка включає один або більше переліків послідовностей у відповідності зі
Зводом федеральних нормативних актів США (С.Р.В., 37, 1.821 їі далі), які представлені на машинозчитувальних носіях (назва файлу: 1301 0134РСТ 5Т25.хХі, створений 4 грудня 2016, розмір - 186,040 байтів); зазначений файл повністю включений у дану заявку за допомогою посилання.
ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ
ЇО00О3| Даний винахід відноситься до біспецифічних молекул (наприклад, діатіл, біспецифічних антитіл, трьохвалентних сполучних молекул і т. д.), які містять щонайменше один сайт зв'язування епітопу, що має імуноспецифічність по відношенню до епітопу РО-1, і щонайменше один сайт зв'язування епітопу, що має імуноспецифічність по відношенню до епітопу СТІ А-4 (тобто "молекул, біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4"). Даний винахід відноситься до таких молекул, біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4, що містять два сайти зв'язування епітопу, що мають імуноспецифічність по відношенню до одного (або двох) епітопу (епітопів) РО-1, і два сайти зв'язування епітопу, що мають імуноспецифічність по відношенню до одного (або двох) епітопу (епітопів) СТІ А-4. Даний винахід також відноситься до таких молекул, біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4, які додатково містять Ес- фрагмент імуноглобуліну. Біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом здатні одночасно зв'язуватися з РО-1 і СТІ А-4, зокрема, коли зазначені молекули розташовані на поверхні клітин людини. Винахід відноситься до фармацевтичних композицій, які містять зазначені біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули, і способів, які включають застосування зазначених біспецифічних молекул у лікуванні раку й інших захворювань та станів. Даний винахід також відноситься до способів, які включають застосування таких біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул для стимуляції імунної відповіді.
Коо) РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
І. Відповідь імунної системи на рак
І0004| Імунна система ссавців має природну здатність розпізнавати і знищувати ракові клітини (Тораїїап, 5.С. еї аї. (2015) "Іттипе СПпесКроїпі Віоскаде А Соттоп ЮОепотіпайог
Арргоаси о Сапсег Тпегару," Сапсег Сеї!Ї 27:450-461). Імунна система здорових суб'єктів перебуває в стані спокою, та її активність пригнічується сукупністю різних інгібуючих рецепторів і лігандів. Такі шляхи "контрольних точок" регуляції імунної відповіді важливі у підтримці автотолерантності (тобто запобіганні атаки імунної системи суб'єкта проти нього/ї власних клітин - "автоїмунної" реакції) й обмеженні супутнього ушкодження тканини під час протимікробних або протиалергійних імунних відповідей. Після розпізнавання ракового антигена, виявлення мікробного патогена або присутності алергена ряд активуючих рецепторів і лігандів викликає активацію імунної системи. Така активація призводить до активації макрофагів, клітин-природніх кілерів (МК-клітин) й антиген-специфічних цитотоксичних Т-клітин і стимулює вивільнення різних цитокінів, дія яких спрямована на боротьбу з виявленою загрозою здоров'ю суб'єкта (Юопо, С. еї аї. (2003) "ттипе Кедшайоп Бу Моме! Совіїтиіаюгу МоїІесшціев,"
ІттипоїсЯ. АВез. 28 (1):39-48; Мідіена, М. єї а). (2007) "Моашіайнтд Со-ебйтшайоп,"
Мешйгоїпегарешіісв 4:666-675; Коптап, А.). еї а. (2007) "СпесКроіїпї ВіосКаде іп Сапсег
Ітітипоїпегару," Айм. Іттипої. 90:297-339). Імунна система здатна повертатися у свій нормальний стан спокою, коли компенсаторні інгібуючі імунні сигнали переважають над активуючими імунними сигналами. 0005) Таким чином, можна вважати, що патологічний стан при раковому захворюванні (їі, фактично, патологічний стан при інфекційних захворюваннях) відображає нездатність до адекватної активації імунної системи суб'єкта. Така нездатність може відображати неадекватну презентацію активуючих імунних сигналів або неадекватну здатність послабляти інгібуючі імунні сигнали у суб'єкта. На основі деяких прикладів дослідники визначили, що ракові клітини можуть імунну систему щоб вислизати від виявлення імунною системою (Тораїйап, 5.Ї. еї аї. (2015) "Іттипе СпескКроїіпі Віоскаде: А Соттоп ЮОепотіпайїг Арргоасі юю Сапсег Тнегару," Сапсег СеїЇ 27:4А50-461).
І0006| Особливе значення має зв'язування між лігандами В7-1 (СО80) і В7-2 (СО86), які експресуються на поверхні антиген-презентуючої клітини, і рецепторами СО28 і СТІ А-4 СраАТт- бо лімфоциту (ЗПагре, А.Н. еї аї. (2002) "Тпе В7-С028 Зирепатіу," Маїшге Веу. Іттипої!. 2:116-126;
ропо, С. еї аї. (2003) "Іттипе Редшіайоп Бу Моме! Совіїтиіатюту Моїіесціев," Іттипо/!од. Нез. 28 (1):39-48; І Іпаієу, Р.5. єї аї. (2009) "ТНе Сіїпіса! ОБШІйу ОО Іппірйіпа СО28-теадіатейд Созійтшайоп,"
Іттипої. Вем. 229:307-321). Зв'язування В7-1 або В7-2 з СО28 стимулює активацію Т-клітин; зв'язування В7-1 або В7-2 з СТІ А-4 інгібує активацію Т-клітин (Юопо, С. еї аї. (2003) "Іттипе
Ведшіаноп ру Моме! Совіїтшаюгу Моїіесшціев," Іттипоїод. Нев. 28 (1):39-48; І іпаІєу, Р.5. еї аї. (2009) "ПНне Сіїпіса! ОБІйу ОГ Іппірйіпд СО28-тваїаїва Созіїтшайоп," Іттипої. Вем. 229:307-321;
Стеепмаїй, А.9. еї аї. (2005) "не В7 Ратіїу Вемізпйед," Апп. Нем. Іттипої. 23:515-548). Ср28 конститутивно експресується на поверхні Т-клітин (Ого55, у., еї аІ. (1992) "Ідепіййсацоп Апа
Оівшібшіоп ОГ Те Совіїтціаюту Несеріої СО28 Іп Те Моизе," 9). Іттипої. 149:380-388), а експресія СТГ А-4 швидко підвищується після активації Т-клітин (Гіпзієу, Р. еї аї. (1996) "ІпігасеїшШаг Тганіскіпд ОЇ СТІ А4 Апа Росаї І осаїїгайоп Тоулагаз Зйез ОЇ ТСА Епдадетепі,"
Іттипйу 4:535-543). Оскільки рецептор СТІ А-4 має більше високу афінність (ЗПпагре, А.Н. еї аї. (2002) "Тпе В7-С028 Зирепатіу, Маїшге Веум. Іттипої. 2:116-126; Тораїїап, 5.Ї. еї аї. (2015) "Іттипе СпескКроїіпі Віоскаде: А Соттоп ЮОепотіпайг Арргоасі о Сапсег ТНегару," Сапсег СеїЇ 27:4А50-461), зв'язування лігандів спочатку призводить до проліферації Т-клітин (через СО28), а потім їх інгібування (в результаті початку експресії СТІ А-4), викликаючи, таким чином, пригнічення ефекту, коли проліферація більше не потрібна.
І. СТІ А-4
І0007| Цитотоксичний пов'язаний з Т-лімфоцитами білок-4 (СТІ А-4; СО152) являє собою мембранний білок І типу з одним трансмембранним доменом, що утворює зв'язаний дисульфідним зв'язком гомодимер (5спучагія У.С., еї а!. (2001) "Зіпистшга! Вазів Гог Со-Зіітшайоп
Ву Те Нитап СТІ А-4/87-2 Сотрієх," Маїште 410:604-608). Були охарактеризовані варіанти альтернативного сплайсингу, що кодують різні ізоформи, включаючи розчинну ізоформу, яка функціонує як мономер (Мадівігейй сх., еї аі. (1999) "А боїЇшбіе Бопт ОЇ СТІ А-4 Сепегаїєд Ву
АПНегпаїїме Зріїсіпу Із Ехргеззєед Ву Мопвіїтціага Нитап Т СеїЇв," Єиг. у. Іттипої. 29:3596-3602;
Оакз М.К. єї аї. (2000) "А Маїїме 5оЇшбіе опт ОЇ СТІ А-4," СеїЇ Іттипої! 201:144-153). 0008) СТІ А-4 у першу чергу є внутрішньоклітинним антигеном, експресія якого на поверхні клітини суворо регулюється обмеженою міграцією до клітинної поверхні та швидкою інтерналізацією (АїІедге М-Ї, еї аї., (1996) "Ведшаїйоп ОЇ Зипасе Апа Іпігасеїїшаг Ехргеввіоп ОЇ
СТ А4 Оп Моивзе Т СеїІв," У. Іттипої. 157:4762-4770; І іпвІєу, Р.5. еї аї. (1996) "ІпігасеїїІшаг
Тганіскіпу ОЇ СТІ А-4 Апа Росаї І осаїїгайоп Тоулага5 5пез ОЇ ТОВ Епдадетепь" Іттипйу 4:535- 543). СТІ А-4 експресується на низьких рівнях на поверхні наївних ефекторних Т-клітин (АГеаге,
М.ГЕ., еї аї. (1996) "Недшаїйоп ОЇ 5ипасе Апа ІпігасеїІшаг Ехргезвзіоп ОЇ СТІ А4 Оп Моизе Т Сеїв,"
У ТІттипої 157:4762-70) і конститутивно експресується на регуляторних Т-клітинах (Ууапо, Х.В., еїаї. (2002) "Ехргезвіоп ОЇ СТІ А-4 Ву Нитап Мопосуїев," Зсапа. У. Іттипої. 55:53-60).
Ї0О009| Позаклітинна область СТІ А-4 містить єдиний позаклітинний домен Ід (М), за яким слідує трансмембранна ділянка (ТМ) та невеликий внутрішньоклітинний цитоплазматичний хвіст (37 амінокислот). Внутрішньоклітинний хвіст містить два тирозинових мотиви, які взаємодіють з декількома внутрішньоклітинними білками, включаючи ліпідкіназу фосфатидилінозитол-З-кіназу (РІЗК), фосфатази 5НР-2 і РРІА і клатринові адапторні білки АР-1 і АР-2 (Вида, С.Е. єї а!. (2003) "Опіїуїпа Сопсерів Іп СО28, ІСО5 Апа СТІ А4 Со-Несеріог Зідпаїйпо," Маї Вем Іттипої!. 3:544-56).
СТІ А-4 близький до СО28, при цьому ідентичність двох зазначених білків на амінокислотному рівні становить приблизно 29 95 (Нагрег, К. (1991) "СТІ А-4 Апа СОр28 Асіїмаіїєд Іутрпосуїє
Моїіесшез Аге Сіозеіу Неїаїєд Іп Моизе Апа Нитап Ав То бедиєпсе, Меззаде Ехргеззіоп, Сепе БнисшШшге, Апа Спготозотаї І осайіоп," У. Іттипої. 147:1037-1044). 00101 При активації наївної ефекторної Т-клітини через її Т-клітинні рецептори (ТОВ) СТІ А- 4 залучається до клітинної поверхні (І іпвієу, Р.5., еї аї. (1996) "ІпігасеїІміаг Ттаніскіпу ОЇ СТІ А-4
Апа Росаї І осаїїганоп Тоулагаз Зйе5 ОЇ ТСОА Епдадетепі," Іттипйну 4:535-43). З моменту початку експресії СТІ А-4 на поверхні Т-клітин він конкурує з СО28 (що конститутивно експресуються на
Т-клітинах) за зв'язування з СО80/СО86, виключаючи, таким чином, подальший сигнальний шлях, опосередковуваний ТСК і, таким чином, пригнічуючи будь-який подальший розвиток Т- клітинної відповіді за ТСЕ-сигнальним шляхом (Са!їтепо, В.М., єї а!. (2000) "СТІ А-4 (20152) Сап
ІппіБй т Сеї/ Асіїмайоп Ву Тмжо ОіїйШегепі Меснапізт5 ЮОерепаїпуд Оп 5 І емє! ОЇ СеїЇ Бипасе
Ехргезвіоп," ) Іттипої! 165:1352-6;СНцапо, Е., вї а. (1999) "Ведшиіайоп ОЇ Суїююхіс Т І утріосуїв-
А5з5осіаїєд Моїесшів-4 Ву 5гс Кіпазев," ) Іттипої! 162:1270-7). Таким чином, СТІ А-4 діє в якості негативного регулятора активації ефекторних Т-клітин, який знижує ефекторну функцію та визначає ефективність та тривалість Т-клітинної відповіді (І іпвієу, Р.5., еї аї. (1996) "Іпігасеї шаг
Тганіскіпд ОЇ СТІ А-4 Апа Росаї І осаїїгайоп Тоумага5 5пйез ОЇ ТСА Епдадетепі," Іттипйу 4:535- 43). бо ІЇ0011| Крім того, СТІ А-4 може відігравати роль у посиленні негативного впливу регуляторних Т-клітин в імунній відповіді на рак (Таї, У.Т., єї аї., (2012) "Роїепі іп міїго Апа іп мімо
Асімпу ОГ Ап Бс-Епдіпеетед Нитапігей Апіі-пт1.24 Апіроду Адаїпві Мийіріє Муеіота уміа
Айцдтепієд Емесіог Рипсійоп," Віоса 119:2074-82). СТІ А-4 має набагато більше високу афінність відносно білків сімейства В7 у порівнянні з СО28 і, таким чином, його експресія на Т-клітині визначає перевагу негативної регуляції зазначеної Т-клітини (АЇйївбоп, У.Р., еї аї. (1995) "Мапіршайоп ОЇ Совзіїтиіаюгу зідпаІіє То Епнапсе Апійштог Т-СеїЇ Незропзев," Сцт Оріп Іттипої 7:682-6). Механізм участі СТІ А-4 у супресорній функції регуляторних Т-клітин не до кінця з'ясований, але експресія СТІ А не регуляторних Т-клітинах підсилює супресорну функцію цих клітин (Таї, М.Т., еї аі., (2012) "Роїепі іп міго Апа іп мімо Асіїмйу ОЇ Ап ЕРс-Епаіпеетед Нитапіей
Апіі-пт1.24 Апіїроду Адаїпзі Мийіріє Муєіота міа Аидітепівєдй ЕпПесіог ЕРипсійоп," Віоса 119:2074- 82). 0012) Повідомляється, що блокування СТІ А-4 підсилює Т-клітинні відповіді іп міго (УМаїшпав,
Т.С., еї аІ. (1994) "СТІ А-4 Сап Еипсіп Ав А Медаїїме Недшіаюг Ої Т Сеї| Асіїмайоп," Іттипйу 1:405-413) і іп мімо (Кеагпеу, Е.К., еї аї. (1995) "Апіїдеп-Оерепаепі Сіопа! Ехрапзіоп Ої А Тгасе
Роршіайоп ОЇ Апіідеп-Зресіїс СО4-Т1 Сеїв іп мімо Із Юерепдепі Оп СО28 Совіітшціайоп Апа
Іппібеа Ву СТІ А-4," У. Іттипої. 155:1032-1036). У зв'язку з цим було зроблене припущення, що блокування СТІ А-4 за допомогою антитіл проти СТІ А-4 зможе забезпечити нові способи лікування захворювань, зокрема, захворювань людини, при яких стимуляція імунної системи повинна виявляти сприятливий ефект, наприклад, для лікування ракових й інфекційних захворювань (див. І еасп, О.К. еї аІ. (1996) "Еппапсетепі ОЇ Апійитог Іттипйу Ву СТІ А-4
ВіосКкаде," бсіеєпсе 271:1734-1736 і міжнародні публікації згідно з РСТ Мо УМО 01/14424; МО 00/37504). Розробка блокаторів функції СТІ А-4 була зосереджена на застосуванні моноклональних антитіл, таких як іпілімумаб (див. наприклад, Нооді, Е.5., еї аї., (2003) "ВіоІодіс
Асіїміу ОЇ Суюїохіс Т І утрпосуїе-Авзосіаїей Апіідеп 4 Апіїбоду ВіосКаде Іп Ргеміоизіу Массіпаїва
Меїавіаєйс МеІапота Апа Омагіап Сагсіпота Раїйєпів5," Ргос. Май. Асай. сі. (США) 100:4717- 4717) і тремелімумаб (Кіра5, А. еї аїЇ. (2005) "Апійиптог Асіїмйу п Меіапота Апа Апіі-5евїї
Везропзе5 Іп А РІПавзе | Та! МУйй Те Апії-Суїюїохіс Т Іутрпосуїе-Авзосіаїейд Апіїдеп 4
Мопосіопа! Апіїбоду СР-675,206," Опсоодівії 12: 873-883).
І. Рецептор програмованої загибелі 1 ("РО-1")
Зо 00131 Рецептор програмованої загибелі 1 ("РО-1", також відомий як "СО279"), є мембранним білком І типу з великого сімейства СО28/СТІ А-4 Т-клітинних регуляторів, які здійснюють негативну регуляцію широкого спектра імунних відповідей (Ізпіда, М. еї аї. (1992) "Іпдаисей
Ехргезвіоп ОЇ РО-1, А Моме! Метбег ОЇ Те Іттиподіобиїп Сепе 5ирепатіу, Ороп Ргодгаттей
Се! Оєаїй, ЕМВО 3. 11:3887-3895; публікації заявки на патент США Мо 2007/0202100; 2008/0311117; 2009/00110667; патенти США Мо 6808710; 7101550; 7488802; 7635757; 7722868; міжнародна публікація згідно з РСТ Мо МО 01/14557). 0014) Взаємодії рецептор-ліганд системи РО-1, очевидно, є ще більше складними, ніж взаємодії системи СО28/СТІ А-4. РО-1 експресується на клітинній поверхні активованих Т- клітин, В-клітин і моноцитів (Адаїа, У. еї аіІ. (1996) "Ехргезбзіоп ОЇ Те РО-1 Апіїдеп Оп ТНе
Бипйасе ОЇ Біїтшага Моизе Т Апа В Гутрпосуїев," Іпї. Іттипої. 8 (5):765-772; Хата?гакі, Т. еї аї. (2002) "Ехргезвіоп ОЇ Ргодгаттеєй Овєаїй 1 Гідапаз Ву Мигіпе Т-Сеїв Апа АРС," У. Іттипої. 169:5538-5545), а також експресується на низькому рівні в Т-клітинах-природніх кілерах (МК- клітинах) (МізПпітига, Н. єї а. (2000) "Расіїнайоп ОЇ Веїа 5еїесіоп Ап Модіїїсайоп ОГ Розіййїме зеїесіп Іп Тпе Тпутив ОЇ Ра-1-Оеїїсієпі Місе," У. Ехр. Мед. 191:891-898; Мапіп-Огог2со, М. еї а). (2007) "Іппірйогу Совіїтиайоп Апа Апії-Титог Іттипйу," Зетіп. Сапсег Віо!. 1 7(4):288-298). 0015) Позаклітинна ділянка РО-1 складається з єдиного імуноглобулінового домену (Ід) М, ідентичного на 23 95 еквівалентному домену СТІ А-4 (Мапіп-Ого2со, М. еї аї. (2007) "Іппірйогу
Совіїтиайоп Апа Апії-Титог Іттипйу," Зетіп. Сапсег Віої. 17 (4):288-298). За позаклітинним доменом ІдМ слідує трансмембранний домен і внутрішньоклітинний хвіст. Внутрішньоклітинний хвіст містить два сайти фосфорилювання, розташованих в імунорецепторному інгібуючому мотиві на основі тирозину й імунорецепторному перемикаючому мотиві на основі тирозину, що дає підстави вважати, що РО-1 негативно регулює ТСК-сигнали (Ізпіда, У. еї аї. (1992) "Іпаисей
Ехргезвіоп ОЇ РО-1, А Моме! Метбег ОЇ Те Іттиподіобиїп Сепе 5ирепатіу, Ороп Ргодгаттей
Сеїї Овсашт, ЕМВО 3. 11:3887-3895; ВіапК, С. еї аІ. (2006) "Сопііршіоп ОЇ Те РО-Г1/РО-1
Раїйулау То Т-СеїЇ Ехнаизійп: Ап Орааїе Оп Ітріїсайопе Рог Спгопіс ІпТесіопе Апа Титог Емавіоп
Сапсег," Іттипої!. ІттипоїНег. 56 (5):739-745). 0016) РО-1 здійснює інгібування імунної системи шляхом зв'язування з В7-НІ1 і В7-ОС (також відомими як РО-І-1 ії РО-І 2, Нііез, О.В. еї а)ї. (2007) "пе Мем В75: Ріауіпу а Рімоїа! Роїе іп Титог
Іттипйу," У. ІттипоїНег. 30 (3):251-260; патенти США Мо 6803192; 7794710; публікації заявок на (510) патенти США Мо 2005/0059051; 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0313687; міжнародні публікації РСТ Мо УМО 01/39722; УМО 02/086083). 00171 В7-НІ ї В7-ОС широко експресуються на поверхні багатьох типів тканин людини і миші, таких як серце, плацента, м'язи, ембріональна печінка, селезінка, лімфатичні вузли і тимус, а також печінка, легені та нирки, в острівцевих клітинах підшлункової залози і тонкому кишечнику миші (Магіп-Ого2со, М. еї а!. (2007) ""ппірйогу Совіїтиціайцоп Апа Апії-Титог Іттипйу,"
Зетіп. Сапсег Віої. 17 (4)288-298). У людей експресія білка В7-НІ була виявлена в ендотеліальних клітинах (Спеп, У. еї аї. (2005) "Ехргезвіоп ої В7-НІ1 іп Іпїаттайїйогу Непа! Тибшаг
Ерітеїїа! СеїїІв," Мерпгоп. Ехр. Мерпгої. 102:е81-е92; де Наї), 5. еї аї. (2005) "Вепа! Тиршіаг
Еріїеїйа! Сеїїє Моашіаїе Т-Сеї! Везропзез Міа ІСО5-Ї Апа В7-НІ" Кідпеу Іпї. 68:2091-2102;
Малапеї, М.М. еї а!. (2002) "В7-НІ Із Ехргеззєд Ву Нитап ЕпаоїНеїа! Се Апа Зирргез5ез Т-Сеї
СуїюкКіпе Зупіпевів," ). Іттипої. 169:3581-3588), міокарді (Вгом/п, у.А. еї аї. (2003) "ВіосКаде ОЇ
Ргодгаттей ОЮеаїй-1 Іідапд5 Оп Оепайіс Се Епнапсез Т-Сеї| Асіїмайоп Апа СуюкКіпе
Ргодисійоп," У. Іттипої. 170:1257-1266), синцитіальному шарі трофобласту (Реїгоїї, М.О. еї аї. (2002) "В7 Гатійу МоїІесшев: Моме! Іттипотоашіаютв5 Аї Те Маїегпа!-Реїа! Іпіепасе," Ріасепіа 23:595-5101). Ці молекули також експресуються резидентними макрофагами деяких тканин, макрофагами, активованими інтерфероном (ІЕМ)-у або фактором некрозу пухлини (ФНП)-а (Гасптап, У. еї аї. (2001) "РО-12 І5 А 5есопа І ідапа Рог РО-1 Апа Іппіріїв Т-Сеї! Асіїмайоп," Маї.
Іттипої! 2:261-268), й у пухлинах (опа, Н. (2003) "В7-НІ Рашуау Апа Ії Воїє Іп Тне Емазіоп ОЇ
Титог Іттипійу," У. Мої. Меа. 81:281-287). 0018) Було виявлено, що взаємодія між В7-НІ1 їі РО-1 призводить до передачі критичного ко- стимулюючого негативного сигналу на Т- і В-клітини (Магііп-Ого2со, М. еї аї. (2007) "Іппірйогу
Совіійтиайоп Апа Апіі-Титог Іттипйу, Зетіп. Сапсег Віоії. 17 (4):288-298) і діє як індуктор клітинної загибелі (Ізпіда, У. еї аІ. (1992) "Іпдисей Ехргезвіоп ОЇ РО-1, А Моме! Метбрег ОЇ Те
Ітітиподіобиййп бепе Зирегатіу, Ороп Ргодгаттеа Се ЮОеай, " ЕМВО .. 11:3887-3895;
Ю БГ,риані,5.К. еї а!. (2005) "Тне Ваіапсе Ої Іттипе Незропзев: Совіїтшайоп Мегзе Соіппібйіоп," у).
Моїес. Мед. 83:193-202). Більше конкретно, було виявлено, що взаємодія між рецептором РО-1 і лігандом В7-НІ у низьких концентраціях призводить до передачі інгібуючого сигналу, який сильно пригнічує проліферацію антиген-специфічних СО8-Т-клітин; при більше високій концентрації взаємодія з РО-1 не інгібує проліферацію Т-клітин, але значно знижує продукцію
Зо множини цитокінів (Зпагре, А.Н. еї аї. (2002) "пе В7-С028 Бурепатійу," Маїшге Веум. Іттипої. 2:116-126). Було виявлено, що проліферація та продукція цитокінів як у спочиваючих, так і раніше активованих СО4 і СО8 Т-клітинах, і навіть у нативних Т-клітинах з пуповинної крові пригнічується розчинними гібридними білками В7-НІ1-Ес (Егеетап, С... єї аі. (2000) "Епдадетепі
ОЇ Те РО-1 Іттипоїіппірйогу НКесеріог Ву А Моме! В7 Ратйу Метрег Іеадб5 То Медаїїме
Веашаїйоп ОЇ І утрпосуїе Асіїмайіоп," ). Ехр. Мед. 192:1-9; І азсптап, У. еї аї. (2001) "РС-І2 ІЗ А зЗесопа Гідапа Рог РО-1 Апа Іппібії5 Т-СеїІ Асіїмайоп," Маште Іттипої. 2:261-268; Сапе", Ї. єї аї. (2002) "РО-1:РО-Ї. Іппірйогу Раїпжау АНесів Воїп СОА(я) апа СОВ8() Т-сеїїв Апа І5 Омегсоте Ву
І -2," Єшг. У. Іттипої. 32(3):634-643; ЗНагре, А.Н. евї а!. (2002) "Тне В7-С028 Зирепатіїу," Маїшиге
ВНеу. Іттипої. 2:116-126). (0019) Участь В7-НІ ї РО-1 у пригніченні активації та проліферації Т-клітин указує на те, що зазначені біомолекули можуть служити в якості терапевтичних мішеней для лікування запалення та раку. У зв'язку з цим було запропоновано застосування антитіла проти РО-1 для лікування інфекцій та пухлин і для позитивної регуляції набутої імунної відповіді (див. публікації заявок на патенти США Мо 2010/0040614; 2010/0028330; 2004/0241745: 2008/0311117; 2009/0217401; патенти США Мо 7521051; 7563869; 7595048; міжнародні публікації РСТ Мо М/О 2004/056875; УМО 2008/083174). Були описані антитіла, здатні специфічно зв'язуватися з РО-1 (Адаїа, Т. єї а. (1996) "ЕЄхргезвзіоп ОЇ Те РО-1 Апіїдеп Оп Те Бипасе ОЇ Біітціаїед Моизе Т Апа
В Гутрпосуїев," Іпі. Іттипої. 8 (5):765-772; апа Вегдег, В. єї аї. (2008) "Рназе І Заїеїу Апа
РіпаптасокКіпеїйс Бішау ОЇ СТ-011, А Нитапігей Апіїроду Іпіегасіїптд УА РО-1, Іп Райепів М Аймапсед Нетаїйоіодіс Маїїдпапсієв5," Сіїй. Сапсег Вев. 14 (10):3044-3051; див. також патенти
США Мо 8008449 і 8552154; публікації патентів США Мо 2007/0166281; 2012/0114648; 2012/0114649; 2013/0017199; 2013/0230514 і 2014/0044738 і міжнародні патентні публікації згідно з РСТ Мо МО 2003/099196; УМО 2004/004771; МО 2004/056875; УМО 2004/072286; УМО 2006/121168; УМО 2007/005874; МО 2008/083174; МО 2009/014708; УМО 2009/073533; МО 2012/135408, МО 2012/145549 і УМО 2013/014668).
І0020| Однак незважаючи на всі такі досягнення рівня техніки, залишається необхідність у поліпшених композиціях, здатних більше активно направляти імунну систему організму проти ракових клітин або інфікованих патогеном клітин, зокрема, при більше низькій терапевтичній концентрації та/(або зі зниженими побічними ефектами. Незважаючи на те, що придбаний бо імунітет може бути потужним механізмом захисту проти раку та захворювання, його дії часто перешкоджають механізми імуносупресії/зникання від імунної відповіді в мікрооточенні пухлини, такі як експресія РО-1 і СТІ А-4. Більше того, ко-інгібуючі молекули, що експресуються пухлинними клітинами, імунними клітинами і стромальними клітинами у пухлинному оточенні можуть суттєво послабляти Т-клітинні відповіді проти ракових клітин. Крім того, застосування антитіл проти СТІ А-4 викликає добре відомі побічні ефекти, називані "імуноопосередкованими небажаними явищами" (НЯ). Імуноопосередковані небажані явища (НЯ) включають коліт/діаарею, дерматит, гепатит, ендокринопатії та запальну міопатію. Було описано, що ці окремі побічні ефекти виникають через порушення імунологічної толерантності при блокуванні
СТІ А-4 (0і Сіасото, А.М., єї аї. (2010) "Тне Етегдіпуд Тохісйу Ргойевз ОЇ Апіі-СТІ А-4 Апііродієв
Асгов55 Сііїпіса! Іпаісайопе," бетіп Опсої. 37:499-507). Таким чином, способи терапевтичного лікування, що дозволяють уникнути зазначених обмежень, мали би величезну перевагу.
ІЇО021| Як докладно описано нижче, даний винахід вирішує описане завдання шляхом забезпечення біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул. Такі біспецифічні молекули здатні зв'язуватися з молекулами РО-1 і СТІ А-4, які присутні на поверхні виснажених і толерантних інфільтруючих пухлини лімфоцитів й інших типів клітин, і, таким чином, порушувати здатність таких молекул клітинної поверхні відповідати на відповідні ліганди. Таким чином, біспецифічні по відношенню до РО-1ї х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом діють, блокуючи оопосередковуване РЮО-1- і СТІ А-4 пригнічення імунної системи для забезпечення активації або продовження активації імунної системи. Зазначені властивості дають можливість застосування таких біспецифічних молекул у стимуляції імунної системи і, зокрема, у лікуванні раку та пов'язаних з патогеном захворювань та станів. Даний винахід спрямований на досягнення зазначених й інших цілей.
КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
І0022| Даний винахід спрямований на біспецифічні молекули (наприклад, діатіла, біспецифічні антитіла, трьеохвалентні сполучні молекули і т. д.), що містять щонайменше один сайт зв'язування, що має імуноспецифічність по відношенню до епітопу РО-1, і щонайменше один сайт зв'язування, що має імуноспецифічність по відношенню до епітопу СТІ А-4 (тобто "біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули"). Даний винахід відноситься до таких молекул, біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4, які містять два сайти зв'язування
Зо епітопу, що мають імуноспецифічність по відношенню до одного (або двох) епітопу (епітопів)
РО-1, і два сайти зв'язування епітопу, що мають імуноспецифічність по відношенню до одного (або двох) епітопу (епітопів) СТІ А-4. Даний винахід також спрямований на такі біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули, які додатково містять Ес-фрагмент імуноглобуліну.
Біспецифічні по відношенню до РЮО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом здатні одночасно зв'язуватися з РО-1 і СТІ А-4, зокрема, у тому вигляді, в якому зазначені молекули розподілені на поверхні клітин людини. Винахід спрямований на фармацевтичні композиції, які містять такі біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули, і способи, які включають застосування таких біспецифічних молекул для лікування раку й інших захворювань та станів.
Даний винахід також відноситься до способів, які включають застосування таких біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул для стимуляції імунної відповіді. 0023) Більше докладно, винахід забезпечує біспецифічну молекулу, яка містить один або більше сайтів зв'язування епітопу, здатних імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом (епітопами)
РО-1, й один або більше сайтів зв'язування епітопу, здатних імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом (епітопами) СТІ А-4, де зазначена молекула містить: (А) варіабельний домен важкого ланцюга та варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, яке зв'язується з РО-1; і (В) варіабельний домен важкого ланцюга та варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, яке зв'язується з СТІ А-4; де зазначена біспецифічна сполучна молекула являє собою: (ї) діатіло, де зазначене діатіло являє собою ковалентно зв'язаний комплекс, який містить два, три, чотири або п'ять поліпептидних ланцюгів; або (ї) трьеохвалентну сполучну молекулу, де зазначена трьохвалентна сполучна молекула являє собою ковалентно зв'язаний комплекс, який містить три, чотири, п'ять або більше поліпептидних ланцюгів.
І0024| Винахід відноситься до варіанта реалізації таких біспецифічних молекул, де зазначена біспецифічна сполучна молекула проявляє активність, що перевищує активність двох моноспецифічних молекул, одна з яких містить варіабельний домен важкого ланцюга та варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, яка зв'язується з РО-1, й інша з яких містить варіабельний домен важкого ланцюга та варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, яка бо зв'язується з СТІ А-4.
(0025) Винахід відноситься до варіанта реалізації всіх таких біспецифічних молекул, де зазначена молекула викликає менше імуноопосередкованих небажаних явищ при введенні суб'єкту, що потребує зазначеного введення, у порівнянні з ЇНЯ, викликаними введенням моноспецифічного антитіла, яке зв'язується з СТІ А-4, такого як іпілімумаб. 0026) Винахід додатково відноситься до варіанта реалізації таких біспецифічних молекул, де зазначена молекула містить Ес-фрагмент. Винахід додатково відноситься до варіанта реалізації таких біспецифічних молекул, де зазначений Ес-фрагмент являє собою варіант Ес- фрагмента, який містить: (А) одну або більше модифікацій амінокислот, які знижують афінність зазначеного варіанта
Ес-фрагмента по відношенню до ЕсукК, й/або (В) одну або більше модифікацій амінокислот, які збільшують час напівжиття в сироватці крові зазначеного варіанта Ес-фрагмента.
І0027| Винахід додатково відноситься до варіанта реалізації таких біспецифічних молекул, де модифікації, що призводять до зниження афінності зазначеного варіанта Ес-фрагмента по відношенню до ЕсукК, включають заміну Г234А; І235А або 1234А і 1І235А, де нумерація відповідає ЕО-індексу за Кабатом. (0028) Винахід додатково відноситься до варіанта реалізації таких біспецифічних молекул, де модифікації напівжиття, що призводять до збільшення часу, варіанта Ес-фрагмента в сироватці крові, включають заміну М252У; М252У і 52541; М252МУ і Т256Е; М252У, 52541 і
Т256Е або К2880 і Н4З5К, де нумерація відповідає ЄО-індексу за Кабатом (Кабаю.
І0029| Винахід додатково відноситься до варіанта реалізації всіх таких біспецифічних молекул, де зазначена молекула являє собою діатіло та містить два сайти зв'язування епітопу, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом РО-1, і два сайти зв'язування епітопу, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом СТІ А-4.
ІЇ0О30О| Винахід додатково відноситься до варіанта реалізації всіх таких біспецифічних молекул, де зазначена молекула являє собою трьохвалентну сполучну молекулу та містить два сайти зв'язування епітопу, здатних імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом РО-1, й один сайт зв'язування епітопу, здатний імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом СТІ А-4.
І0031| Винахід додатково відноситься до варіанта реалізації всіх таких біспецифічних
Зо молекул, де зазначена молекула здатна зв'язуватися з молекулами РО-1 і СТІ А-4, присутніми на клітинній поверхні.
І0032| Винахід додатково відноситься до варіанта реалізації всіх таких біспецифічних молекул, де зазначена молекула здатна одночасно зв'язуватися з РО-1 і СТІ А-4.
ЇООЗЗ| Винахід додатково відноситься до варіанта реалізації всіх таких біспецифічних молекул, де зазначена молекула здатна стимулювати клітини імунної системи, зокрема, де зазначена стимуляція призводить до: (А) проліферації імунних клітин і/або (В) продукції та/або вивільнення імунними клітинами щонайменше одного цитокіну та/або (С) продукції та/або вивільнення імунними клітинами щонайменше однієї літичної молекули й/або (р) експресії імунними клітинами щонайменше одного маркера активації.
І0034| Винахід додатково відноситься до варіанта реалізації всіх таких біспецифічних молекул, де клітина імунної системи являє собою Т-лімфоцит або природню клітину-кілер (МК- клітину).
ІЇ00О35| Винахід додатково відноситься до варіанта реалізації всіх таких біспецифічних молекул, де сайти зв'язування епітопу, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом РО-1, містять: (А) МН-домен РО-1 тАбБ 1 (5ЕО І МО:47) і МІ -домен РО-1 тА 1 (5ЕО ІЮ МО :48); або (В) МН-домен РО-1 тАбБ 2 (5ЕО І МО:49) і МІ -домен РО-1 тАБ 2 (5ЕО ІЮ МО:50); або (С) МнН-домен РО-1 тАБ З (ЗЕО ІЮ МО:51) і МІ -домен РО-1 тАБ З (З5ЕО ІО МО:52); або (Б) МнН-домен РО-1 тАБ 4 (ЗЕО І МО:53) і МІ -домен РО-1 тАБ 4 (5ЕО ІО МО:54); або (Е) МН-домен РО-1 тАбБ 5 (5ЕО ІО МО:55) і МІ -домен РО-1 тА 5 (5ЕО ІЮ МО:56); або (Е) Мн-домен РО-1 тАб 6 (ЗЕО ІЮ МО:57) і МІ -домен РО-1 тАб 6 (5ЕО ІО МО:58); або (б) МнН-домен РО-1 тАбБ 6-І МН (ЗЕО ІЮ МО:86) і Мі-домен РО-1 тАБ 6-50 МІ (5ЕО ІО
МО:87); або (Н) МнН-домен РО-1 тАБ 7 (ЗЕО І МО:59) і МІ -домен РО-1 тАБ 7 (ЗЕО ІЮ МО:60); або (І) Мн-домен РО-1 тАБ 8 (ЗЕО ІО МО:61) і МІ -домен РО-1 тА 8 (ЗЕО ІЮ МО:62).
І0036| Винахід додатково відноситься до варіанта реалізації всіх таких біспецифічних молекул, де сайт (сайти) зв'язування епітопу, здатний імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом бо СТІ А-4, містить:
(А) МН-домен СТІ А-4 тАбБ 1 (5ЕО ІЮО МО:76) і МІ -домен СТІ А-4 тАбБ 1 (ЗЕО ІО МО:77); або (В) МН-домен СТІ А-4 тАбБ 2 (5ЕО ІО МО:78) і МІ -домен СТІ А-4 тАБ 2 (ЗЕО І МО:79); або (С) МнН-домен СТІ А-4 тАБ З (З5ЕО ІЮ МО:90) і МІ -домен СТІ А-4 тАБ З (5ЕО 10 МО:91).
І00ОЗ37| Винахід додатково відноситься до таких біспецифічних молекул, де: (А) сайти зв'язування епітопу, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом РО-1, містять
МН-домен РО-1 тАБб 6-І МН (ЗЕО ІЮ МО:86) і МІ -домен РО-1 тА 6-50 (5ЕО ІО МО:87) і (В) сайт (сайти) зв'язування епітопу, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом СТІ А-4, містить (містять) МН-домен СТІ А-4 тАБб З (ЗЕО ІЮ МО:90) і МІ -домен СТІ А-4 тАБ З (5ЕО І0
МО:91).
І0ООЗ8) Винахід додатково відноситься до варіанта реалізації всіх зазначених біспецифічних молекул, де зазначена молекула містить: (А) два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність 562 ІЮ МО:95, і два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність 5ЕО ІЮ МО:96; або (В) два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність 5622 ІЮ МО:97, і два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність 5ЕО ІЮ МО:98; або (С) два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність зЕО ІЮ МО:99, і два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність ЗЕО ІЮ МО:100; або (Юр) два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність 5600 ІЮ МО:102, і два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність ЗЕО ІЮ МО:103; або (Е) два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність «ЕС ІЮ МО:101, і два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність ЗЕО ІЮ МО:100; або (Є) один поліпептидний ланцюг, що має послідовність ЗЕО ІЮО МО:104, один поліпептидний ланцюг, що має послідовність 5ЕО 10 МО:105, один поліпептидний ланцюг, що має послідовність ЗЕО ІЮ МО:106, і один поліпептгидний ланцюг, що має послідовність ЗЕО ІЮ
МО:107; або (с) один поліпептидний ланцюг, що має послідовність ЗЕО ІЮ МО:108, один поліпептидний ланцюг, що має послідовність 5ЕО 10 МО:105, один поліпептидний ланцюг, що має послідовність ЗЕО ІЮ МО:109, і один поліпептидний ланцюг, що має послідовність ЗЕО ІЮ
МО:107.
ЇОО39| Винахід додатково відноситься до таких біспецифічних молекул, де зазначена молекула містить альбумін-сполучний домен, зокрема, деімунізований альбумін-сполучний домен.
І0040)| Винахід додатково відноситься до фармацевтичної композиції, яка містить ефективну кількість будь-якої з таких біспецифічних молекул і фармацевтично прийнятний носій.
І0041|| Винахід додатково відноситься до застосування такої фармацевтичної композиції або будь-якої з описаних вище біспецифічних молекул для стимуляції імунної відповіді у суб'єкта, що має потребу в цьому, зокрема, де зазначена молекула здатна стимулювати клітини імунної системи і, зокрема, стимуляцію природніх клітин-кілерів (МК-клітин) і/або Т-лімфоцитів. Винахід, зокрема, відноситься до варіантів реалізації де зазначена стимуляція призводить до проліферації імунних клітин, продукції та/(або вивільнення імунними клітинами цитокінів (наприклад, ІРЄМУу, 1-2, ТМЕа і т. д.), продукції та/або вивільнення імунними клітинами літичних молекул (наприклад, гранзиму, перфорину та т. д.) й/або експресії імунними клітинами маркерів активації (наприклад, СО69, СО25, СО107а і т. д.). Винахід додатково відноситься до способів лікування раку або інших захворювань, які включають застосування або введення будь-якої з описаних вище біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул для стимуляції опосередкованої імунною системою відповіді. Винахід, зокрема, відноситься до варіантів реалізації в яких стимулююча імунну систему активність будь-якої з описаних вище біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул перевищує активність, забезпечувану спільним або комбінованим уведенням окремого антитіла проти РО-1 й окремого антитіла проти
СТІ А-4 (зокрема, де такі антитіла є моноспецифічними відносно до зазначених молекул).
Винахід також відноситься до варіантів реалізації, при яких у клітинах імунної системи, зокрема, природніх клітинах-кілерах (МК-клітинах) і/або Т-лімфоцитах, стимульованих описаними вище біспецифічними по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекулами, спостерігається посилена проліферація, змінена продукція та/або вивільнення цитокінів (наприклад, ІЄМУу, 1-2, ТМЕа і т. д.), змінена продукція та/(або вивільнення літичних молекул і/або змінена експресія маркерів активації у порівнянні з такими клітинами, стимульованими спільним або комбінованим уведенням окремого антитіла проти РО-1 й окремого антитіла проти СТІ А-4. Винахід також відноситься до варіантів реалізації, в яких описані вище біспецифічні по відношенню до РО-Ї х
СТІ А-4 молекули рідше викликають імуноопосередковані небажані явища. Винахід додатково бо відноситься до варіантів реалізації в яких будь-яка з описаних вище біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул застосовується для лікування захворювання або стану, пов'язаного із супресією імунної системи, зокрема раку або інфекції. 0042) Винахід додатково відноситься до такого застосування для лікування захворювання або стану, пов'язаного із супресією імунної системи, або застосування в лікуванні зазначеного захворювання або стану. Винахід, зокрема, відноситься до такого застосування в лікуванні захворювання або стану, пов'язаного із супресією імунної системи, або до такого застосування, де зазначене захворювання або стан являє собою рак або інфекцію (зокрема, інфекцію, що характеризується присутністю бактеріального, грибкового, вірусного або протозойного патогена). 0043) Винахід, зокрема, відноситься до такого застосування, де: (А) зазначене застосування являє собою лікування раку та зазначений рак характеризується присутністю ракової клітини, вибраної з групи, що складається з клітини: пухлини надниркової залози, асоційованого зі СНІДом раку, альвеолярної саркоми м'яких тканин, астроцитарної пухлини, раку сечового міхура, раку кістки, раку головного та спинного мозку, метастатичної пухлини головного мозку, раку молочної залози, пухлини каротидного тільця, раку шийки матки, хондросаркоми, хордоми, хромофобної нирково-клітинної карциноми, світлоклітинної карциноми, раку товстої кишки, раку товстої та прямої кишки, шкірної доброякісної фіброзної гістіоцитоми, десмопластичної дрібнокруглоклітинної пухлини, епендимоми, саркоми Юінга, позахребетної мукоїдної хондросаркоми, недосконалого кісткового фіброгенезу, фіброзної дисплазії кістки, раку жовчного міхура або раку жовчної протоки, раку шлунка, гестаційної трофобластичної хвороби, ембріонально-клітинної пухлини, раку голови і шиї, гепатоклітинної карциноми, пухлини острівцевих клітин підшлункової залози, саркоми Капоші, раку нирки, лейкозу, ліпоми/доброякісної ліпоматозної пухлини, ліпосаркоми/злоякісної ліпоматозної пухлини, раку печінки, лімфоми, раку легенів, медулобластоми, меланоми, менінгіоми, множинної ендокринної неоплазії, множинної мієломи, мієлодиспластичного синдрому, нейробластоми, нейроендокринних пухлин, раку яєчників, раку підшлункової залози, папілярної тиреокарциноми, пухлини паращитовидної залози, педіатричного раку, пухлини оболонок периферичних нервів, феохромоцитоми, пухлини гіпофіза раку передміхурової залози, задньої увеальної меланоми, рідкого гематологічного розладу, метастатичного раку нирки, рабдоїдної
Зо пухлини, рабдоміосаркоми, саркоми, раку шкіри, саркоми м'яких тканин, плоскоклітинного раку, раку шлунка, синовіальної саркоми, раку яєчка, раку вилочкової залози, тимоми, метастатичного раку щитовидної залози і раку матки; або (В) зазначене застосування являє собою застосування в лікуванні інфекції та зазначена інфекція являє собою хронічну вірусну, бактеріальну, грибкову та паразитарну інфекцію, яка характеризується присутністю вірусу Епштейна-Бара, вірусу гепатиту А (НАМ); вірусу гепатиту В (НВ); вірусу гепатиту С (НСМ); вірусів герпесу (наприклад НЗМ-1, НБУ-2, ННУ-6, СММУ), вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), вірусу везикулярного стоматиту (М5М), бактерій класу ВавсійЇ, бактерій роду Сйгобасієг, холерного вібріона, дифтирійної палички, ентеробактерій, гонококів, бактерії виду Неїїсобрасіег руїогі, бактерій роду КіІебзієїІа та І едіопеїІа, менінгококів, мікобактерій, псевдомонад, пневмококів, рикетсій, сальмонел, бактерій роду Зегтайа, стафілококів, стрептококів, правцевої палички, грибів роду АзрегоїПив (А. тТитідайив, А. підег і т. д.), грибів виду
Віавтотусез аегтаййідіє, грибів роду Сапаїда (С. аірісап5, С. Кгизеї, С. діабгата, С. ігорісаї5 і т. д.), грибів виду Стгуріососси5 пеоїогптапв, грибів роду Мисогаїез (тисог, арзіаіа, гпігорив5), грибів видів Брогоїнйгіх звепепкії, Рагасоссідіоіїдев Бгазійепвії, Соссідіоіїдеє5 іпитйй ії Нівіоріазта сарзшіацшт, бактерій, що викликають лептоспіроз, бактерій виду Воітеїїа ригддогегі, гельмінтів (нематод, стрічкових хробаків, трематод, плоских червів (наприклад, шистосом), кишкових лямблій, червів роду ТгіспіпеІПа, амеб виду Оіепіатоеба Егадіїїх, трипаносом видів Ттурапозхота ргисеї та Ттурапозопта сгилі або протистів виду І еізптапіа допомапі. (0044) Винахід, зокрема, відноситься до такого застосування в лікуванні раку, де зазначений рак являє собою рак товстої та прямої кишки, гепатоклітинну карциному, гліому, рак нирки, рак молочної залози, множинну мієлому, рак сечового міхура, нейробластому, саркому, неходжкінську лімфому, недрібноклітинний рак легенів, рак яєчника, рак підшлункової залози, рак прямої кишки, гострий мієлоїдний лейкоз (ГМЛ), хронічний мієлоїдний лейкоз (ХМЛ), В- клітинний гострий лімфобластний лейкоз (В-ГЛЛ), хронічний лімфобластний лейкоз (ХЛЛ), волосистоклітинний лейкоз (ВКЛ), бластоїдну плазмоцитоїдну дендритоклітинну неоплазію (БПДН), неходжкінські лімфоми (НХЛ), включаючи мантійноклітинний лейкоз (МКЛ) і дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому (ДКЛЛ), ходжкінську лімфому, системний мастоцитоз або лімфому Беркіта.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ бо 00451 На Фігурі 1 представлене схематичне зображення типового ковалентно зв'язаного діатіла, що містить два сайти зв'язування епітопу та складається з двох поліпептидних ланцюгів, кожний з яких містить стимулюючий утворення гетеродимеру домен Е-соїЇ або К-соїЇ (альтернативні стимулюючі утворення гетеродимеру домени представлені нижче). Цистеїновий залишок може бути присутнім у лінкері та/"або в стимулюючому утворення гетеродимеру домені, як показано на Фігурі ЗВ. МІ- ії МН-домени, які розпізнають той самий епітоп, показані за допомогою однакового візерунка або кольору.
І0046| На Фігурі 2 представлене схематичне зображення типової ковалентно зв'язаної молекули діатіла, що містить два сайти зв'язування епітопу та складається 3 двох поліпептидних ланцюгів, кожний з яких містить СН2- ії СНЗ-домен таким чином, що зв'язані ланцюги утворюють цілий Ес-фрагмент або частину Ес-фрагмента. МІ- і МН-домени, які розпізнають той самий епітоп, показані з використанням однакового візерунка або кольору.
І0047| На Фігурах ЗА-3С представлені схематичні зображення, що показують типові ковалентно зв'язані тетравалентні діатіла, що містять чотири сайти зв'язування епітопу та складаються з двох пар поліпептидних ланцюгів (тобто всього з чотирьох поліпептидних ланцюгів). Один поліпептид кожної пари містить СН2- і СНЗ-домен таким чином, що зв'язані ланцюги утворюють цілий Ес-фрагмент або частину Ео-фрагмента. МІ- і МН-домени, які розпізнають той самий епітоп, показані з використанням однакового візерунка або кольору. Дві пари поліпептидних ланцюгів можуть бути однаковими. У таких варіантах реалізації, де дві пари поліпептидних ланцюгів є однаковими і Мі-- ї МН-домени розпізнають різні епітопи (як показано на Фігурах ЗА-3В), отримана в результаті молекула містить чотири сайти зв'язування епітопу й є біспецифічною та бівалентною стосовно кожного зв'язаного епітопу. Згідно з такими варіантами реалізації, де МІ- і МнН-домени розпізнають той самий епітоп (наприклад, на обох ланцюгах використовуються однакові СОК-ділянки Мі -домену й однакові СОК-ділянки МН-домену), отримана в результаті молекула містить чотири сайти зв'язування епітопу й є моноспецифічною та тетравалентною стосовно єдиного епітопу. В якості альтернативи, дві пари поліпептидів можуть різнитися. Згідно з такими варіантами реалізації, де дві пари поліпептидних ланцюгів різняться та Мі- і МН-домени кожної пари зазначених поліпептидів розпізнають різні епітопи (як показано з використанням візерунка, що різниться, і кольору на Фігурі 3ЗС), отримана в результаті молекула містить чотири сайти зв'язування епітопу й є тетраспецифічною та
Зо моновалентною стосовно кожного зв'язаного епітопу. На Фігурі ЗА показане діатіло, що містить
Ес-фрагмент, яке містить пептидний стимулюючий утворення гетеродимера домен, що містить цистеїновий залишок. На Фігурі ЗВ показане діатіло, що містить Ес-фрагмент, яке містить стимулюючі утворення гетеродимера домени Е-сої і К-соїЇ, що містять цистеїновий залишок, і лінкер (необов'язково з цистеїновим залишком). На Фігурі ЗС показане діатіло, що містить Ес- фрагмент, яке містить домени антитіла СНІ і СІ. 00481) На Фігурах 4А і 48 представлені схематичні зображення типової ковалентно зв'язаної молекули діатіла, що містить два сайти зв'язування епітопу та складається з трьох поліпептидних ланцюгів. Два з поліпептидних ланцюгів містять СН2- і СНЗ-домен таким чином, що зв'язані ланцюги утворюють цілий Ес-фрагмент або його частину. Поліпептидні ланцюги, що містять МіІ- і МН-домен, додатково містять стимулюючий утворення гетеродимера домен. МІ - і
МН-домени, які розпізнають той самий епітоп, показані з використанням однакового візерунка або кольору.
І0049| На Фігурі 5 представлене схематичне зображення типової ковалентно зв'язаної молекули діатіла, що містить чотири сайти зв'язування епітопу та складається з п'яти поліпептидних ланцюгів. Два із зазначених поліпептидних ланцюгів містять СН2- і СНЗ3-домени таким чином, що зв'язані ланцюги утворюють Ес-фрагмент, який містить цілий Ес-фрагмент або його частину. Поліпептидні ланцюги, що містять зв'язані МІ - ії МН-домени, додатково містять стимулюючий утворення гетеродимера домен. МІ- і МН-домени, які розпізнають той самий епітоп, показані з використанням однакового візерунка або кольору.
І0О50| На Фігурах бА-6Е представлені схематичні зображення типових трьохвалентних сполучних молекул, що містять Ес-фрагмент, які містять три сайти зв'язування епітопу. На
Фігурах 6А і 68 схематично показані домени трьохвалентних сполучних молекул, що містять два домени зв'язування по типу діатіла та домен зв'язування по типу Габ-фрагмента, з різним розподілом доменів, де домен зв'язування по типу діатіла розташований з боку М-кінця або з боку С-кінця стосовно Ес-фрагмента відповідно. Молекули на Фігурах бА і 6В містять чотири ланцюги. На фігурах 6С і 60 схематично зображені домени трьохвалентних сполучних молекул, що містять два домени зв'язування по типу діатіла, розташованих з боку М-кінця стосовно Ес- фрагмента, і приєднаний домен зв'язування по типу Бар або домен зв'язування по типу 5сЕм відповідно. На Фігурах 6Е і 6Е схематично показані домени трьохвалентних сполучних молекул, бо що містять два домени зв'язування по типу діатіла, розташованих з боку С-кінця стосовно Ес-
фрагмента, і домен зв'язування по типу Раб, де легкий ланцюг і важкий ланцюг з'єднаний через поліпептидний спейсер або домен зв'язування типу 5сЕм відповідно. Трьохвалентні сполучні молекули на Фігурах 6С-6Е містять три ланцюги. Мі- і МН-домени, які розпізнають той самий епітоп, показані за допомогою однакового візерунка та кольору.
ЇОО51| Фігура 7 ілюструє принципи даного винаходу, демонструючи, що приклад біспецифічної молекули (біспецифічна по відношенню до РО-1 х | АС-3 молекула, позначена як
ОСАКТ А) здатний стимулювати продукцію цитокінів до рівня, що перевищує рівень, спостережуваний при спільному або комбінованому введенні вихідних антитіл проти РО-1 і | АС-
З. Показані профілі секреції ІЕМУ для мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК) типового донора, які стимулювали ЗЕВ (0,5 нг/мл) й обробляли прикладом біспецифічної молекули (біспецифічна по відношенню до РО-1 х І! АС-3 молекула САКТ А) або антитілами проти РО-1 і ГАО-3 окремо або в комбінації. 0052) На Фігурах 8А-80 показані результати дослідження за допомогою твердофазного ІФА на основі вимірювання зв'язування сполучних молекул у серійних розведеннях з СТІ А-4 і РО-1 людини. На Фігурах 8А-88 показані ламані зв'язування СТІ А-4 тА З С4Р, ОАВТ 0, ТВІОЕМТ А або САКТ В з розчинним НСТІ А-4-Амі-Нів (1 мкг/мл) (Фігура 8А) або ПРО-1-НІів (1 мкг/мл) (Фігура 88), нанесеним на планшети-підкладки. Козячі Ес-специфічні кон'юговані з НЕР антитіла проти імуноглобуліну людини (1:10,000) використовували в якості вторинної детектуючої молекули для виявлення зв'язування. На Фігурах 80-80 показані результати дослідження впливу зміни доменів зв'язування та їх розподілу на зв'язування. Біспецифічні по відношенню до РО-Ї х
СТІ А-4 молекули, що містять домени зв'язування СТІ А-4 антитіла СТІ А-4 тАбБ 1 (наприклад, рАКТ В) і СТІ А-4 тАБ З (наприклад, САКТ С і БАКТ Б), інкубували у присутності розчинного
РО-1 людини (Фігура 8С) або розчинного СТІ А-4-Амі-Ніз людини (Фігура 80), нанесеного на планшет-підкладку. Козячі-Єсу-специфічні кон'юговані з НКР антитіла проти імуноглобуліну людини використовували в якості вторинної детектуючої молекули для виявлення зв'язування із застосуванням хемілюмінесцентного субстрату РІСО.
І0053)| На Фігурах 9А-9Е показані результати оцінки здатності ОАКТ О, ТКІОЕМТ А, РО-1 тАр 6 с4Р і СТІ А-4 тАБ З О4Р і контрольної молекули ТКІОЕМТ (що має два сайти зв'язування
Е5М й один сайт зв'язування СТІ А-4) блокувати зв'язування ліганду з РО-1 і СТІ А-1, окремо й у
Зо комбінації. Блокування зв'язування РО-11 з РО-1 оцінювали за допомогою твердофазного ІФА у присутності рівної кількості нерелевантного антигена (Фігура 9А) й у присутності рівної кількості
СТІ А-4 (Фігура 98), а блокування зв'язування В7-1 з СТІ А-4 оцінювали у присутності рівної кількості нерелевантного антигена (Фігура 9С) й у присутності рівної кількості РО-1 (Фігура 9У,а також у присутності чотириразової концентрації РО-1 (Фігура 9Е).
І0054| На Фігурах 10А-108 показані результати оцінки здатності ОАКТ В, АКТ 0, ТКІОЕМТ
А, антитіл проти СТГ А-4 СТІ А-4 тАБ 1, СТІ А-4 тАБ 3 О4Р ії контрольного антитіла підс зв'язуватися з клітинами СНО, що експресують СТІ А-4 яванського макака (Фігура 10А) або
СТІ А-4 людини (Фігура 108). Зв'язування виявляли за допомогою Ес-специфічних вторинних антитіл проти імуноглобуліну людини. 0055) На Фігурах 11А-118 показані результати оцінки здатності ОАКТ С, ВАКТ 0, БАКТ Е,
ТКІОЕМТ А, антитіл проти СТІ А-4 СТІ А-4 тАБ 1, СТІ А-4 тАБ З СТАА й антитіла проти РО-1
РО-1 тА 6 С4Р зв'язуватися з клітинами Уигкаї (які експресують на своїй поверхні пиСТтІ А-4, але не експресують РО-1). Зв'язування молекул САКТ і ТКІОЕМТ з СТІ А-4 людини виявляли за допомогою Ес-специфічних вторинних антитіл проти імуноглобуліну людини (сортування клітин з активованою флуоресценцією, ГАС5). На Фігурі 11А показані результати оцінки САКТ С,
РАВТ р, САВТ Е, СТІ А-4 тАБ 1, СТІ А-4 тАбБ З С1АА і РО-1 тА 6 с4Р. На Фігурі 118 показані результати оцінки СТІ А-4 тАБ 1, СТІ А-4 тАБ З СТАА, РО-1 тА 6 С4Р і ТКІОЕМТ А. 0056) На Фігурах 12А-128 показані результати оцінки здатності ОАКТ О, ТКІОЕМТ А й антитіл проти СТІ А-4 СТІ А-4 тАбБ 1, СТІ А-4 тАБ З С1ТАА блокувати ліганди СТІ А-4 В7-1 і В7-2 у клітинному аналізі. Мічені гістидином (Ні) похідні В7-1 і В7-2 інкубували у присутності клітин
УйиЖКаї ії штучних антиген-презентуючих клітин (Рготеда). Зв'язування Ніб-В7-1 і Нівз-В7-2 виявляли із застосуванням антитіла проти Ні. Результати оцінки показані на Фігурі 12А (Нібз-8В7- 1) ї Фігурі 128 (Ніб5-В7-2).
І0057| На Фігурі 13 показані результати оцінки здатності ОАКТ С, САКТ 0, ТКІОЕМТ А,
СТІ А-4 тАБ 3 С1ТАА ії РО-1 тАБ 6 О4Р обертати інгібуючий сигнал контрольної точки імунної відповіді СТІ А-4, як показано в аналізі репортерного гена на клітинах І -2/ ис-Читкаї-СТтІ А-4 на основі підвищеної експресії люциферази. Клітини 1 -2/ ис-Чииїкаї-СтТІ А-4 інкубували у присутності зазначених сполучних молекул (К:5-1:0,3) протягом 30 хв. при температурі 37 "С, після чого додавали штучні антиген-презентуючі клітини Ка) та продовжували інкубувати бо протягом б годин. Обіг інгібуючого сигналу контрольної точки імунної відповіді СТІ А-4 визначали за допомогою люциферазного аналізу.
І0О58)| На Фігурі 14 показані результати оцінки здатності ОАКТ 0, ТКІОЕМТ А, РО-1 тАБ 6
С4Р ії СТГА-4 тАр 3 О1ТАА зв'язуватися з клітинами МБО, експресуючими РО-1, але не експресуючими СТІ А-4. Сполучні молекули інкубували у присутності клітин і вимірювали середній коефіцієнт флуоресценції клітин.
І0059)| На Фігурах 15А-15В8 показані результати оцінки здатності ОАКТ 0, ТКІОЕМТ А, РО-1 тА 6 с4Р і СТІ А-4 тАБ З С1АА блокувати зв'язування між РО-1 і його лігандами РО-І1 і РО-І2 у клітинному аналізі. РО-І1-РЕ або РО-І2-РЕ інкубували у присутності зазначених сполучних молекул й оцінювали їх здатність зв'язуватися з клітинами М5О-РО-1 шляхом сортування клітин з активованою флуоресценцією (БАС5). Фігура 15А (РО-І 1); Фігура 158 (РО-І 2).
І0060)| На Фігурі 16 показані результати оцінки здатності ОАКТ 0, ТКІОЕМТ А, СТІ А-4 тАБ З
СТАА і РО-1 тА 6 с4Р блокувати інгібування імунної відповіді, що відбувається в результаті взаємодії РО-1/РО-І1. Сполучні молекули інкубували у присутності клітин РО-І1-СНО й ефекторних клітин дигКаї й оцінювали їх здатність блокувати інгібування імунної відповіді (шляхом блокування взаємодії РО-1/РО-І1) на основі ступеня спостережуваної активації, опосередкованої СОЗ (як показано за допомогою підвищеної експресії люциферази в аналізі на клітинах МЕАТ-Іис/РО-1 Ууижаї; Рготеда).
І00О61) На Фігурі 17 показані результати оцінки здатності ОАКТ 0, ТКІОЕМТ А й антитіла- негативного контролю зв'язуватися одночасно з РО-1 і СТІ А-4 у ферментаційному аналізі комплементації білкових фрагментів, ОізсомегХ. Аліквоти суспензії клітинної лінії 0205 СТІ А- 4(1-195)-РК. РО-1(1-199)-ЕА, клону Ж9, поміщали у чотирьох повторах в концентрації 5,000 клітин/ямку в культуральне середовище для планшетів Обізсомегх СР5 на 384-ямкові планшети.
Клітинам дозволяли прикріплюватися протягом 4 годин при 37 "С/595 СО». Потім кожну зі сполучних молекул у серійних розведеннях 1:3 (11 точок) додавали до клітин РО-1-СТІ А-4 і зразки АКТ О і ТКІОЕМТ А додавали до клітин РО-1-ІЇ АС-3. Планшети інкубували протягом ночі (16 годин) при 37 "С/5 95 СбО». Виявляючий реагент РайНипіег додавали в ямки і планшет потім інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі в темряві та дані зчитували на люмінометрі Епмівіоп.
І0062| На Фігурі 18 показані результати оцінки здатності ОАКТ 0, ТКІОЕМТ А, СТІ А-4 тАБ З
Зо СТАА, РО-1 тАр 6 С4Р і комбінації СТ А-4 тАБр З СТАА/РО-1 тАБ 6 сп4Р (АБ Сотрбо 1) підсилювати відповідь в реакції змішаної культури лімфоцитів (ЗКЛ). Дендритні клітини моноцитарного походження одержували шляхом обробки СО14- моноцитів гранулоцитарно- макрофагальним колонієстимулюючим фактором (ЗМ-С5Е), уведеним на 1 день періоду інкубування) й 1-4 (уведеним на 7 день періоду інкубування). На 8 день періоду інкубування запускали реакцію ЗКЛ шляхом інкубували СО4-Т-клітин з дендритними клітинами моноцитарного походження (наданими на 8 день періоду інкубування) і сполучних молекул проти СТІ А-4 і РО-1 (наданих на 8 день періоду інкубування). Вивільнення ІЕМ-у представлено у вигляді графіка на Фігурі 18. Було виявлено, що як біспецифічні ОАКТ 0, так і молекули
ТКІОЕМТ, підсилюють відповідь у реакції ЗКЛ однаковою мірою або дещо більше у порівнянні з комбінацією окремих вихідних антитіл. Представлені дані включають сім груп стовпців (кожна з яких відноситься до різних сполучних молекул: контрольний пІдс4; РО-1 тА 6 с4Р; СТІ А-4 тАбр З С1АА; комбінація СТІ А-4 тАБ З СТАА/РО-1 тА 6 С4Р (АБ Сотрбо 1); ПОАВТ 0; ТВІОЕМТ
А і контрольний ПІдС1, ліворуч праворуч відповідно); кожна група складається з шести стовпців (кожний відноситься до різної концентрації представленої молекули: 0,016, 0,08, 0.4, 2, 10 або нМ, ліворуч праворуч відповідно). 0063 На Фігурах 19А-190 показаний ефект уведення САВТ 0, ТВІОЕМТ А, СТІ А-4 тАБ З
СТАА, РО-1 тАБ 6 СР ії комбінації СТІ А-4 тА 1/РО-1 тАБ 1 (АБ Сотбо 1) на Т-клітинні відповіді за допомогою аналізу повторної стимуляції ентеротоксином 5(арпуіососси5 ашцйгеив5 типу В (ЗЕВ). На Фігурах 19А-198 показані точкові діаграми даних сортингу, які активуються 50 флуоресценцією клітин (ГАС), що відображають експресію такими МКПК РО-1 залежно СТІ А-1 під час відсутності (Фігура 19А) або у присутності (Фігура 198) стимуляції ЗЕВ. На фігурі 19 показаний ефект стимуляції ЗЕВ на секрецію ІЕМ-у. МКПК стимулювали ентеротоксином типу В еарпуіососси5 аийгецив5 (ЗЕВ) у концентрації 0,5 нг/мл протягом 48 годин. Клітини потім збирали, промивали і заново поміщали на 96-ямкові планшети з антитілами в різних концентраціях у присутності свіжого ЗЕВ на додаткові 48 годин. Супернатант потім збирали й аналізували продукцію ІЕМ-у за допомогою проточної цитометрії/твердофазного ІФА. Як біспецифічні ОАКТ, так і білок ТКІОЕМТ, показали підвищену відповідну продукцію ІЕМ-у, яка відповідала сумарній відповіді, спостережуваній при введенні комбінації окремих вихідних тАб. Подібні результати спостерігалися в аналізі стимуляції ЕВ, у якому МКПК культивували з високою концентрацією бо (500 нг/мл) ЕВ протягом 72 годин. Представлені шість груп стовпців, кожна з яких відноситься до різних молекул зв'язування. Кожна група складається із семи стовпців, які відображають результат, отриманий при використанні сполучної молекули в концентрації 25 нМ, 6,25 нМ, 1,56
НМ, 0,39 НМ, 0,09 нМ, 0,02 нМ або 0,006 нМ (ліворуч праворуч відповідно). На Фігурі 190 показане вивільнення 1-2 для типового донора. МКПК стимулювали 0,5 нг/мл ЗЕВ протягом 48 годин, збирали, промивали і заново поміщали в 96-ямкові планшети зі свіжим ЗЕВ у присутності або САКТ 0, ТКІОЕМТ А, СТІ А-4 тАБ З СТАА, РО-1 тАБ 6 с4Р, або комбінації СТІ А-4 тА З
СТАА/РО-1 тАБ 6 с4Р (Ар Сотбо 1) на додаткові 48 годин і вимірювали 1-2, що вивільнився.
Представлені сім груп стовпців, кожна з яких відноситься до різних сполучних молекул або станів. Кожна група складається з трьох стовпців, що відображають результат, отриманий при використанні сполучної молекули в концентрації 0,5 нМ, 5 нМ або 50 нМ відповідно (ліворуч праворуч). При використанні антитіл у комбінації кожне антитіло додавали при зазначеній концентрації таким чином, що загальна концентрація антитіла, що додається, подвоювалася. 00641 На Фігурах 20А-208 показана активність біспецифічних по відношенню до РО-Ї х
СТІ А-4 молекул на моделі хвороби "трансплантат проти хазяїна" (ХТІПХ) у мишей МО із трансплантованими МКПК. Підрахунок СОЗ Т-клітин здійснювали шляхом сортування клітин з активованою флуоресценцією (БАС) в день дослідження (Фігура 20А) у мишей, які одержували рАКТ О у дозі 50 мг/кг або 500 мг/кг (Фігура 20А). За виживаністю стежили протягом усього дослідження; дані представлені на графіку у вигляді відсоткової виживаності на Фігурі 208. 0065) На Фігурах 21А-21С показані графіки залежності концентрації в сироватці від часу для яванських макак (позначених за допомогою б-тизначного буквено- цифрового коду), які одержували БАКТ О в концентрації 50 мг/кг на 1, 8 і 15 добу дослідження (Фігура 21А), ОАКТ ОО в концентрації 75 мг/кг на 1, 8 і 15 добу дослідження (Фігура 218) або Тгтідепі А в концентрації 5 мг/кг на 1 добу дослідження (Фігура 21С).
ЇОО6б| На Фігурах 22А-228 показаний ефект уведення ЮАКТ О на абсолютний вміст лімфоцитів (АВЛ) у яванських макак, яким проводили лікування. На Фігурі 22А показане АВЛ у тисячах клітин/мкл (тис. кл./мкл). На Фігурі 228 показана відсоткова зміна АВЛ, нормована до значення для 1 доби (01).
І0067| На Фігурах 23А-23В показана проліферація СО4 «Т-клітин і зайнятість рецептора РО-1 на Т-клітинах у яванських макак, яким уводили БАКТ О в концентрації 50 мг/кг (Фігура 23А) або
Зо рАКТ 0 в концентрації 75 мг/кг (Фігура 238). 0068) На Фігурах 24А-248 показаний ефект уведення ОАКТ О на проліферацію СО4тТ- клітин у яванських макак, яким уводили БАКТ О в концентрації 50 мг/кг (Фігура 24А) або ОАКТ О в концентрації 75 мг/кг (Фігура 248В).
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Ї0069| Даний винахід спрямований на біспецифічні молекули (наприклад, диіатіла, біспецифічні антитіла, трьохвалентні сполучні молекули і т. д.), що містять щонайменше один сайт зв'язування, що має імуноспецифічність по відношенню до епітопу РО-1, і щонайменше один сайт зв'язування, що має імуноспецифічність по відношенню до епітопу СТІ А-4 (тобто "біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули"). Даний винахід відноситься до таких біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул, які містять два сайти зв'язування епітопу, що мають імуноспецифічність по відношенню до одного (або двох) епітопу (епітопів)
РО-1, і два сайти зв'язування епітопу, що мають імуноспецифічність по відношенню до одного (або двох) епітопу (епітопів) СТІ А-4. Даний винахід також спрямований на такі біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули, які додатково містять Ес-фрагмент імуноглобуліну.
Біспецифічні по відношенню до РЮО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом здатні одночасно зв'язуватися з РО-1 і СТІ А-4, зокрема, у тому вигляді, в якому зазначені молекули розподілені на поверхні клітин людини. Винахід спрямований на фармацевтичні композиції, які містять такі біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули, і способи, які включають застосування таких біспецифічних молекул у лікуванні раку й інших захворювань та станів.
Даний винахід також відноситься до способів, які включають застосування таких біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул для стимуляції імунної відповіді. 0070) Для активації Т-клітин потрібні два окремі сигнали (МідіїенНа, М. еї аї. (2007) "Моадиіасіпу
Со-5іітшианоп," Мешигоїпегарешісв 4:666-675; Коптап, А./). еї а). (2007) "СпесКроїпі ВіосКаде іп
Сапсег Іттипоїпегару," Аду. Іттипої. 90:297-339)3. Перший сигнал забезпечує молекула Т- клітинного рецептора (ТОК), що експресується на поверхні Т-клітини, яка розпізнала пептидний антиген, пов'язаний з людським лейкоцитарним антигеном (НІ А), що експресується на поверхні антиген-презентуючої клітини (АПК). Другий сигнал забезпечується взаємодією когнатних пар ко-стимулюючих лігандів В7-1 і В7-2, що експресуються на АПК, та їх відповідних рецепторів сра28 і СТІ А-4, що експресуються на Т-клітинах. бо 0071) Зв'язування молекул В7-1 і В7-2 з СО28 стимулює проліферацію Т-клітин і додатково викликає підвищену експресію СТІ А-4. СТІ А-4 є негативним регулятором, який конкурує з В7-1 і
В7-2 за зв'язування з СО28. Таким чином, відповідь на захворювання включає дві фази: початкова фаза включає стимуляцію проліферації Т-клітин; наступна фаза "зводить нанівець" імунну відповідь та повертає імунну систему суб'єкта в стан спокою. Антитіла, які зв'язуються з сОр28, можуть імітувати зв'язування В7-1 або В7-2 і, таким чином, викликати або підсилювати ефекторні функції Т-клітин і виникнення імунної реакції, спрямованої на ліквідацію пухлини; такі антитіла є ко-стимулючими. Напроти, антитіла, які блокують зв'язування СТІ А-4 з В7-1 і В7-2, можуть запобігати поверненню Т-клітин у стан спокою; підтримуючи, таким чином, безперервну проліферацію зазначених Т-клітин, що може призводити до автоїмунної реакції та розвитку "імуноопосередкованих небажаних явищ" (ІНЯ) (Умапо, Г. еї аї. (Магсй 7, 2011) "МІЗТА, А Моме!
Моизе 4 Зирепатіу Гідапа Тнаї Медаїмеу Реашіатєвз Т-Сеї| Вевзропзев5," У. Ехр. Мед. 10.1084/ет.20100619:1-16; І ерепієв, В. єї а. (2008) "Те Боїє Ої Медаїїме Совіїтиіаюгтв5 Юигіпд
Рагавіййс Іптесійоп5," Епдостіпе, Меїаброїїс в Іттипе Оізогдегв-Огид Тагдеїв 8:279-288). Особливо важливе значення має зв'язування між лігандами В7-1 (СО80) і В7-2 (СО86) антиген- презентуючої клітини і рецепторами СО28 і СТІ А-4 СВА"Т-лімфоцита (Зпагре, А.Н. еї аї. (2002) "Те В7-С028 Бирепатіу, Майте Нем. Іттипої. 2:116-126; опо, С. єї аї. (2003) "Іттипе
Веашайоп ру Моме! Совіїтшаюгу Моїіесцев," Іттипоїоа. Рез. 28 (1):39-48; І іпаІєу, Р.5. еї аї. (2009) "ТНе Сіїпіса! НУ ОГ Іппібйіпу СО28-теадіаїейа Совіїтиіайноп," Іттипої. Вем. 229:307-321).
Зв'язування В7-1 або В7-2 з СО28 стимулює активацію Т-клітин; зв'язування В7-1 або В7-2 з
СТІ А-4 інгібує зазначену активацію (Оопд, С. еї а). (2003) "Іттипе Кедшіайоп Бу Момеї
Совіїтиаюгту Моїіесшіев," Іттипоіод. НКев5. 28 (1):39-48; І іІпаІєу, Р.5. еї аї. (2009) "ТНе Сііпіса
ОШйу ОГ Іппібйіпу СО28-теаіатей Совіїтшиайоп," Іттипої. Вем. 229:307-321; Стеепмаїа, В.. еї а. (2005) "Те В7 Ратйу ВАемізпйейд, Апп. Нем. Іттипої. 23:515-548). С028 конститутивно експресується на поверхні Т-клітин ((го55, «)., еї аї. (1992) "Ідепійісайоп Апа рівзігіршіоп ОЇ Те
Созіїтціаюгу Весеріог СО28 Іп Те Моизе," У. Іттипої. 149:380-388), тоді як експресія СТІ А-4 стимулюється відразу після активації Т-клітин (І іпвзіеу, Р. еї аї. (1996) "ІпігасеїІшіаг ТганісКіпд ОЇ
СТІ А4 Апо Росаї І осаїїгайоп Томжмагав 5пйе5з ОЇ ТСА Епдадетепі," Іттипйу 4:535-543). Оскільки рецептор СТІ А-4 має більше високу афінність (Зпагре, А.Н. еї аї. (2002) "Пе В7-С028 зЗирепатіу, Майте ВНем. ІттипоїЇї. 2:116-126), зв'язування лігандів спочатку викликає
Зо проліферацію Т-клітин (через СО28), а потім її інгібує (в результаті початку експресії СТІ А-4), пригнічуючи, таким чином, ефект, коли проліферація більше не потрібна.
І0072| Поряд з описаними вище взаємодіями, другий набір рецепторів і сполучних лігандів функціонує як інгібітор імунної системи, діючи, таким чином, в якості гальма для вповільнення опосередкованого СЮО28/87-1/87-2 посилення імунної відповіді. Зазначена додаткова відповідь включає зв'язування рецептора білка програмованої клітинної загибелі-ї (РО-1), що експресується на поверхні Т-клітин, з відповідними лігандами: РО-І1, що експресується на антиген-презентуючих клітинах (АПК), ії РО-Ї2, що експресується на епітеліальних клітинах (Спеп Г. еї аї. (2013) "МоіІесшаг Меснапізтв5 ОЇ Т-Сеї!! Со-еіітиїанйоп Апа Со-Іппірйіоп," Маїшйге
Веміємв Іттипоіоду 13 (4):227-242). На відміну від антитіл-агоністів, які зв'язуються з СО28, забезпечуючи безпосередню стимуляцію Т-клітинних відповідей, антитіла, які зв'язуються з РО- 1 або РО-Ї1, діють як антагоністи або блокують залучення РО-1/РО-І1 і, таким чином, підтримують активацію Т-клітин шляхом запобігання передачі негативного сигналу Т-клітинам. У такому випадку антитіла, які зв'язуються з РО-1 або РО-1І1, підсилюють або підтримують проліферацію, цитотоксичність та/або секрецію цитокінів Т-клітин. У сукупності, антитіла- агоністи, такі як антитіла проти СО28, спрямовані на позитивні сигнальні шляхи і, таким чином, є ко-стимуляторами, тоді як антитіла-антагоністи, такі як антитіла проти СТІ А-4 й антитіла проти
РО-1, спрямовані на негативні сигнальні шляхи і називаються інгібіторами контрольних точок імунної відповіді. 0073) Як описано вище, СТІ А-4 і РО-1 являють собою канонічні інгібуючі імунну відповідь контрольні точки, які проявляють різні інгібуючі ефекти на активацію Т-клітин. Біспецифічні по відношенню до РО-1ї х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом здатні зв'язуватися з молекулами клітинної поверхні РО-1 і СТІ А-4, які присутні на поверхні лімфоцитів і, таким чином, порушувати здатність зазначених молекул клітинної поверхні відповідати на їх відповідні рецептори. Не обмежуючись якою-небудь теорією або механізмом, автори винаходу вважають, що зв'язування РО-1 може призводити до припинення інгібування Т-клітин (наприклад, у місцях локалізації пухлини і/або в результаті інфекції) і що зв'язування СТІ А-1 може стимулювати поліклональну активацію та стимуляцію. У такому випадку біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом здатні послабляти опосередковане РО-1 і СТІ А-4 інгібування імунної системи і забезпечувати тривалу активацію імунної системи. У даній заявці бо було показано, що біспецифічні молекули, які спрямовані на два імуномодулюючі шляхи, є більше активними у порівнянні з комбінацією роздільних антитіл. Даний винахід також забезпечує біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули з відношенням зв'язування
РО-1:СТІ А-4, що становлять 1:1, 1:2, 2:2 і 21, які дозволяють повне блокування як РО-1, так і
СТІ А-4, а також блокування, що поширюється на СТІ А-4 при його ко-експресії з РО-1. Таким чином, біспецифічні по відношенню до РО-1ї х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом забезпечують несподівану перевагу у порівнянні з комбінацією окремих антитіл проти РО-1 і проти СТІ А-4. Додатково, біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом можуть забезпечувати стимуляцію імунної відповіді зі зниженим ризиком імуноопосередкованих небажаних явищ.
І. Антитіла та їх сполучні домени (0074) Антитіла згідно з даним винаходом являють собою молекули імуноглобулінів, здатні специфічно зв'язуватися з мішенню, такою як вуглевод, полінуклеотид, ліпід, поліпептид і т. д., щонайменше через один сайт розпізнавання антигена, розташований у варіабельному домені зазначеної молекули імуноглобуліну. У даній заявці терміни "антитіло" й "антитіла" відносяться до моноклональних антитіл, мультиспецифічних антитіл, антитіл людини, гуманізованих антитіл, синтетичних антитіл, гібридних антитіл, поліклональних антитіл, камелізованих (верблюжих) антитіл, одноланцюгових Ем-фрагментів (5сЕм), одноланцюгових антитіл, Еар-фрагментів,
Кабр")-фрагментів, зв'язаних дисульфідним зв'язком біспецифічних Ем-фрагментів (5агЕм), інтратіл і сполучних епітоп фрагментів будь-яких із перерахованих вище молекул. Зокрема, термін "антитіло" включає молекули імуноглобулінів й імунологічно активні фрагменти молекул імуноглобулінів, тобто молекули, які містять сайт зв'язування епітопу. Молекули імуноглобулінів можуть бути будь-якого типу (наприклад, да, ЧЕ, І9М, Ідо, ІдА і Іду), класу (наприклад, Ідсі,
Ід», Ідсз, ІдСз4, ІдАх і ІдАг) або підкласу. У даній заявці вважається, що Ес-фрагмент належить відноситься до конкретного ізотипу, класу або підкласу ІДС, якщо його амінокислотна послідовність має найбільшу гомологію із зазначеним ізотипом у порівнянні з іншими ізотипами
ІС. Було показано, що крім відомих способів застосування антитіл у діагностиці, антитіла застосовні як терапевтичні агенти. Антитіла здатні імуноспецифічно зв'язуватися з поліпептидом або білююом або небілювою молекулою завдяки присутності в такій молекулі конкретного домену або фрагмента або структури ("епітопу"). Молекула, що містить епітоп може
Зо мати імуногенну активність, що викликає відповідну продукцію антитіла у тварини; такі молекули називаються "антигенами". Останні декілька десятиліть спостерігається жвавий інтерес до терапевтичного потенціалу антитіл, й антитіла стали одним із провідних класів одержуваних біотехнологічним шляхом лікарських засобів (Спап, С.Е. єї аї. (2009) "Тпе Озе ОЇ Апіібодієв Іп
Те Тгєаітепі ОЇ Іптесіои5 Оізеазев, " 5іпдароге Мей. 9. 50(7):663-666). Більше 200 лікарських засобів на основі антитіл були схвалені для застосування або перебувають у стадії розробки.
Ї0075| Термін "моноклональне антитіло" відноситься до гомогенної популяції антитіл, де зазначене моноклональне антитіло складається з амінокислот (природних і неприродних), які залучені в селективне зв'язування антигена. Моноклональні антитіла є високо специфічними і спрямовані проти єдиного епітопу (або антигенного сайту). Термін "моноклональне антитіло" включає не тільки інтактні моноклональні антитіла та повнорозмірні моноклональні антитіла, але також їх фрагменти (такі як Раб, Раб", Е(аб)2 Ем), одноланцюгові антитіла (5СЕм), їх мутанти, гібридні білки, що містять частину антитіла, гуманізовані моноклональні антитіла, химерні моноклональні антитіла та будь-які інші модифіковані конфігурації молекули імуноглобуліну, що мають сайт розпізнавання антигена, необхідну специфічність та здатність зв'язуватися з антигеном. Мається на увазі, що даний винахід не обмежує джерело антитіла або спосіб його одержання (наприклад, одержання з використанням гібридоми, фагового відбору, рекомбінантної експресії, трансгенних тварин і т. д.). Термін включає цілі імуноглобуліни, а також фрагменти і т. д., описані вище, у рамках визначення "антитіло". Способи одержання моноклональних антитіл відомі в даній області техніки. Один спосіб, який можна використовувати, являє собою спосіб за Колером (КопПіег, 5. еї аї. (1975) "Сопіїписи5 Синиге5 ОЇ
Ризед СеїЇє бесгейпуд Апібоду ОЇ Ргедейпеа Зресійсну, " Майте 256:495-497) або його модифікацію. Зазвичай моноклональні антитіла виробляють у мишей, пацюків або кроликів.
Антитіла одержують шляхом імунізації тварини імуногенною кількістю клітин, клітинних екстрактів або білкових препаратів, які містять бажаний епітоп. Імуноген може являти собою, але не обмежується зазначеними, первинні клітини, клітинні лінії, що культивуються, ракові клітини, білки, пептиди, нуклеїнові кислоти або тканини. Клітини, використовувані для імунізації, можна культивувати протягом періоду часу (наприклад, щонайменше 24 годин) до їх застосування в якості імуногена. Клітини можна застосовувати в якості імуногенів самостійно або в комбінації з неденатуруючим ад'ювантом, таким як Ківі (див. наприклад, Уеппіпд5, М.М. 60 (1995) "Веміем/ ої беїєсівєй Адіимапів Овєей іп Апіроду Ргодисіоп," ІП АВ У. 37(3)119-125). У цілому, клітини слід зберігати інтактними і переважно життєздатними при використанні в якості імуногенів. Інтактні клітини можуть дозволити краще виявлення антигенів в імунізованої тварини у порівнянні зі зруйнованими клітинами. Застосування денатуруючих або жорстких ад'ювантів, наприклад, ад'юванта Фрейнда, може призводити до розриву клітин і, таким чином, не рекомендується. Імуноген можна вводити багаторазово з періодичними інтервалами, наприклад, два рази на тиждень або один раз на тиждень, або можна вводити таким чином, щоб підтримувати життєздатність у тварини (наприклад, у тканинному рекомбінанті). В якості альтернативи, існуючі моноклональні антитіла та будь-які інші еквівалентні антитіла, що мають імуноспецифічність по відношенню до бажаного патогенного епітопу можна секвенувати й одержувати рекомбінантним шляхом за допомогою будь-яких способів, відомих в даній області техніки. Відповідно до одного варіанта реалізації винаходу таке антитіло секвенують та полінуклеотидну послідовність потім клонують у вектор для експресії або ампліфікації.
Послідовність, що кодує антитіло, яке цікавить, можна підтримувати у векторі в хазяйській клітині, і хазяйську клітину потім можна розмножувати і заморожувати для майбутнього застосування. Полінуклеотидну послідовність такого антитіла можна застосовувати для генетичних маніпуляцій для створення моноспецифічних або мультиспецифічних (наприклад, біспецифічних, триспецифічних і тетраспецифічних) молекул згідно з винаходом, а також молекул з оптимізованою афінністю, химерного антитіла, гуманізованого антитіла та/або кананізованого (собачого) антитіла для поліпшення афінності або інших характеристик антитіла.
Загальний принцип у гуманізуванні антитіла включає збереження основної послідовності антиген-сполучної частини антитіла при заміні частини антитіла не людського походження, що залишилася, на послідовності антитіла людини.
І0076| Природні антитіла (такі як антитіла ІДС) складаються з двох легких ланцюгів, об'єднаних із двома важкими ланцюгами. Кожний легкий ланцюг містить варіабельний домен (М) ії константний домен (СІ). Кожний важкий ланцюг містить варіабельний домен (МН), три константні домени (СНІ, СН2 ї СНЗ) і шарнірну ділянку, розташовану між доменами СНІ їі СН2.
Основною структурною одиницею природних імуноглобулінів (наприклад, ІДС), таким чином, є тетрамер, що містить два легкі ланцюги і два важкі ланцюги, які зазвичай експресуються у вигляді глікопротеїну з молекулярною масою приблизно 150,000 Да. Амінокінцева ("М-кінцева")
Зо частина кожного ланцюга містить варіабельний домен, що складається приблизно з 100-110 або більше амінокислот, що відповідають у першу чергу за розпізнавання антигена. Карбоксикінцева ("С-кінцева") частина кожного ланцюга визначає константну область, при цьому легкі ланцюги мають єдиний константний домен, а важкі ланцюги зазвичай містять три константні домени і шарнірну ділянку. Таким чином, структура легких ланцюгів молекули ІдСсї являє собою п-МІ-С1-с, і структура важких ланцюгів (ДС. являє собою п-МН-СНІ-Н-СН2г-СНЗ-с (де Н являє собою шарнірну ділянку, а п і с являють собою М-кінець та С-кінець поліпептиду відповідно).
Варіабельні домени молекули до складаються з гіперваріабельних ділянок (СОК), які містять залишки, що контактують з епітопом, і сегменти, що не являють собою СОК, називані каркасними ділянками (ЕК), які в цілому підтримують структуру та визначають таку орієнтацію петель СОК, яка дозволяє зазначене контактування (незважаючи на те, що конкретні каркасні залишки можуть також контактувати з антигеном). Таким чином, домени М. і МН мають структуру п-ЕВ1-СОА81-ЕН2-СОН2-ЕВЗ3-СОВЗ3-ЕВа4-с. Поліпептиди, які являють собою або можуть служити в якості першого, другого та третього СОК легкого ланцюга антитіла, позначаються у даній заявці як домен СОН, домен СОВІ2 і домен СОНІЗ відповідно. Аналогічно, поліпептиди, які являють собою або можуть служити в якості першого, другого та третього СОК важкого ланцюга антитіла позначаються у даній заявці як домен СОВНІ1, домен СОВНа2 і домен СОКНЗ відповідно.
Таким чином, терміни домен СОКІ1, домен СОКІ2, домен СОКІЗ, домен СОКНІ, домен СОКНА і домен СОКнЗ відносяться до поліпептидів, які при вбудовуванні у білок надають йому здатність зв'язуватися з конкретним епітопом, незалежно від того, чи являє собою зазначений білок антитіло, що містить легкі та важкі ланцюги, діатіло або молекулу зв'язування з єдиним ланцюгом (наприклад, 5сЕМм, а ВітТе і т. д.) або білок іншого типу. Відповідно при використанні у даній заявці терміну "сполучний епітоп фрагмент" означає фрагмент антитіла, здатний імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом, і термін "сайт зв'язування епітопу" відноситься до частини молекули, що містить сполучний епітоп фрагмент. Сполучний епітоп фрагмент може містити 1, 2, З, 4, 5 або всі 6 із доменів СОЕ. зазначеного антитіла та, незважаючи на здатність імуноспецифічно зв'язуватися із зазначеним епітопом, може проявляти імуноспецифічність, афінність або селективність по відношенню до такого епітопу, який відрізняється від епітопу зазначеного антитіла. Однак переважно сполучний епітоп фрагмент містить всі 6 із доменів
СОК зазначеного антитіла. Сполучний епітоп фрагмент антитіла може являти собою єдиний 60 поліпептидний ланцюг (наприклад, 5сЕм) або може містити два або більше поліпептидних ланцюгів, кожний з яких містить амінокінець та карбоксикінець (наприклад, діатіло, Еар- фрагмент, Раро-фрагмент і т. д.). Якщо спеціально не зазначено, домени білкових молекул, описаних у даній заявці, розташовані в напрямку від М-кінця до С-кінця.
І0077| Винахід, зокрема, включає біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 сполучні молекули, що містять один, два або більше двох одноланцюгових фрагментів варіабельного домену ("5сЕу") антитіла проти РО-1 й один, два або більше двох одноланцюгових фрагментів варіабельного домену антитіла проти СТІ А-4. Одноланцюгові фрагменти варіабельного домену отримані шляхом зв'язування варіабельного домену легкого та важкого ланцюга за допомогою короткого лінкерного пептиду. Лінкери можна модифікувати для забезпечення додаткових функцій, наприклад, для можливості приєднання лікарських засобів або приєднання до твердих підкладок. Одноланцюгові варіанти можуть бути отримані або рекомбінантним, або синтетичним шляхом. Для синтетичного одержання 5сЕм можна застосовувати автоматичний синтезатор.
Для рекомбінантного одержання 5сЕм у підходящу хазяйську клітину - еукаріотичну, таку як клітину дріжджів, рослин, комах або ссавців, або прокаріотичну, таку як Е. соїї - можна вводити підходящу плазміду, що містить полінуклеотид, що кодує 5сЕм. Полінуклеотиди, що кодують потрібний 5сЕм, можна одержати за допомогою стандартних процедур, таких як лігування полінуклеотидів. Отриманий в результаті 5сСЕм можна виділяти із застосуванням стандартних методів очищення білка, відомих в даній області техніки.
І0078| Винахід, зокрема, також включає біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули, які містять гуманізовані антитіла проти РО-1 і проти СТІ А-4. Термін "гуманізоване" антитіло відноситься до гібридної молекули, в цілому отриманої за допомогою рекомбінантних методів і такої, що містить сайт зв'язування антигена імуноглобуліну з видів не людського походження зі збереженою структурою імуноглобулінової молекули, заснованої на структурі та/або послідовності імуноглобуліну людини. Полінуклеотидну послідовність варіабельних доменів такого антитіла можна застосовувати для генетичної маніпуляції для створення таких похідних і для поліпшення афінності або інших характеристик зазначеного антитіла. Загальний принцип у гуманізуванні антитіла включає збереження основної послідовності антиген- сполучної частини антитіла при заміні частини антитіла не людського походження, що залишилася, на послідовності антитіла людии. Існує чотири загальні етапи гуманізування
Зо моноклонального антитіла: (1) визначення нуклеотидної та передбаченої амінокислотної послідовності варіабельних доменів легкого та важкого ланцюга вихідного антитіла; (2) проектування гуманізованого антитіла або канінізованого (собачого) антитіла, тобто ухвалення рішення про те, яка каркасна ділянка антитіла буде використовуватися під час процесу гуманізування або канінізування; (3) фактичне здійснення методів/технологій гуманізування або канінізування та (4) трансфекція й експресія гуманізованого антитіла. Див., наприклад, патенти
США Мо 4 816 567; 5 807 715; 5 866 692 і 6 331 415.
І0079| Сайт зв'язування антигена може містити повнорозмірний варіабельний домен, злитий з константним доменом, або тільки гіперваріабельні ділянки (СОК) зазначеного варіабельного домену, привиті до підходящих каркасних ділянок. Сайти зв'язування антигена можуть являти собою сайти дикого типу або сайти, модифіковані з допомогою однієї або більше амінокислотних замін. Це дозволяє позбутися константної області, що є імуногеном у суб'єктів, що представляють собою людей, але ймовірність виникнення імунної відповіді на чужорідний варіабельний домен зберігається (І ориаіїйо, А.Р. еї аї. (1989) "Моизе/Нитап Спітегіс Мопосіопаї
Апіїбоду Іп Мап: Кіпеїйс5 Апа Іттипе Кезропзе," Ргос. Май. Асай. Зсі. (США) 86:4220-4224).
Інший підхід фокусується не тільки на забезпеченні константних областей людського походження, але і на модифікуванні варіабельних доменів, а також їх реконструкції з максимальним наближенням до форми людського походження. Відомо, що варіабельні домени як важких, так і легких ланцюгів містять три гіперваріабельні ділянки (СОК), що відрізняються залежно від конкретного антигена та визначають здатність зв'язування. Зазначені домени фланковані чотирма каркасними ділянками (ЕК), які є відносно консервативними для даного виду та приблизно забезпечують підтримку для СОК. При створенні антитіл не людського походження, спрямованих на конкретний антиген, варіабельні домени можна "реконструювати" або "гуманізувати" шляхом щеплення СОК, отриманих від антитіла не людського походження, до ЕК, присутнім у людському антитілі, яке підлягає модифікуванню. Було описане застосування зазначеного підходу до різних антитіл зай, К. еї а. (1993) Сапсег Кез 53:851-856.
Віесптапп, Г. еї аї. (1988) "Незпаріпд Нитап Апіїродіе5 Тог Тпегару," Маїште 332:323-327;
Мептоеуєп, М. єї аї. (1988) "Незпаріпд Нитап Апіїродіев: Стайіпуд Ап Апійузогуте Асіїмпу,"
Зсіепсе 239:1534-1536; Кешерогоцои, С. А. єї аї. (1991) "Нитапігайоп ОЇ А Моизе Мопосіопаї
Апіїроду Ву Саг-дгайіпуд: Те Ітропапсе ОЇ Егатемжоїк Незідцез Оп І оор Сопіоптаїоп," Ргоївїп 60 Епаіпеєтіпу 4:773-3783; Маєда, Н. єї а)ї. (1991) "Сопвігисіоп ОЇ Везпарей Нитап Апііродієз УМ
Нім-пешгаїїгіпд Асіїмйу, Нитап Апіїродієє Нубідота 2:1124-134; Соптап, 5. 0. еї аї. (1991) "Везпаріпуд А Тпегарешіс СО4 Апіїроду," Ргос. Май). Асай. 5сі. (США) 88:4181-4185; Тетреві, Р.Н. еї а. (1991) "ВезПпаріпу А Нитап Мопосіопаї! Апіїроду То Іппірії Нитап Незрігаюгу Зупсуйаї! Міги5
Іптесійоп іп мімо," Віо/Гесппоіоду 9:266-271; Со, М. 5. еї аї. (1991) "Нитапігед Апіїродієв Гог
Апіїміга! Тпегару," Ргос. Маї. Асад. Зсі. (США) 88:2869-2873; Сапег, Р. евї аї. (1992) "Нитапігайвоп
ОГ Ап Апіїі-р185пег2 Апіїбоду Бог Нитап Сапсег Тпегару," Ргос. Маї). Асад. Зсі. (США) 89:4285- 4289; Со, М.5. еї аї. (1992) "Спітетіс Апа Нитапігед Апіїбодіев М/ЙН Зресіїісйу Бог Тне СОЗЗ
Апіїдеп," У. ІттипоїЇ. 148:1149-1154. Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу гуманізовані антитіла зберігають всі послідовності СОК (наприклад, гуманізоване мишаче антитіло, яке містить всі шість СОК від мишачих антитіл). Згідно з іншими варіантами реалізації гуманізовані антитіла містять один або більше СОК (один, два, три, чотири, п'ять або шість), які відрізняються за послідовністю від вихідного антитіла.
І0080| Був описаний ряд молекул "гуманізованих" антитіл, що містять сайт зв'язування антигена, який походить з імуноглобуліну не людського походження, включаючи гібридні антитіла, що містять варіабельний домен і пов'язані з ним гіперваріабельні ділянки (СОК) гризунів або модифікований варіабельний домен і пов'язані з ними гіперваріабельні ділянки (СОК) гризунів, злиті з константними доменами імуноглобуліну людини (див. наприклад, М/іпіег еї аї. (1991) "Мап-таде Апііродієв," Маїште 349:293-299; І оридію еї аї. (1989) "Моизе/Нитап
Спітегіс Мопосіопа! Апіїбоду Іп Мап: Кіпеїїсв Апа Іттипе Незропзе," Ргос. Маї!. Асай. зсі. (США) 86:4220-4224 (1989), пам єї аї. (1987) "СНагасіеггайоп ОЇ А Моизе/Нитап СпНітегіс
Мопосіопаї! Апііроду (17-1А) То А Соїоп Сапсег Титог-Ав5осіаїейд Апіїдеп," У. Іттипої!. 138:4534- 4538, Вгом/п еї аїЇ. (1987) "Титог-Зресіїс Сепеїїсайу Епаіпеетед Мигіпе/Нитап СнНітегіс
Мопосіопа! Апіїбоду," Сапсег Вевз. 47:3577-3583). Інші посилання описують СОК гризунів, привитих до підтримуючої каркасної ділянки (ЕК) людини до злиття з підходящим константним доменом людського антитіла (див. наприклад, Кіесптапп, Г. еї аї. (1988) "Кезпаріпд Нитап
Апіїродієб ог Тпегару," Маїште 332:323-327; Мептоеуеп, М. єї аї. (1988) "ВезПпаріпд. Нитап
Апіїродієв: Стайіпуд Ап Апійузогуте Асіїмйу, Зсієпсе 239:1534-1536; апа уЧопев5 еї аї. (1986) "Веріасіпд Те Сотріетепіаніу-Оеїеттіпіпд Ведіопе іп А Нитап Апіїбоду М/йН Тпозе Егот А
Моивзе," Маїште 321:522-525). В іншому посиланні описані СОК гризунів, які підтримуються
Зо рекомбінантно "венованими" каркасними ділянками гризунів. Див., наприклад, публікацію європейського патенту Мо 519,596. Зазначені "гуманізовані" молекули сконструйовані таким чином, щоб мінімізувати небажану імунну відповідь відносно молекул антитіл гризунів, спрямованих проти імуноглобуліну людини, що обмежує тривалість й ефективність терапевтичного застосування зазначених фрагментів у реципієнтів, що представляють собою людей. Інші способи гуманізації антитіл, які також можна застосовувати, описані в джерелі
Рацйднепу еї а!. (1991) "Роїтутегазе Спаїп Неасійоп ГРасіїнасев Те Сіопіпу, Саг-дгайіпо, Апа Варій
Ехргезвіоп ОЇ А Мигіпе Мопосіопа! Апіїроду бігесієд Адаіпзї Те СО18 Сотропепі ОЇ І еиКосуїє
Іптедііп5," Мисі. Асід5 Нев. 19:2471-2476 й у патентах США Мо 6180377; 6054297; 5997867 і 5866692.
ЇЇ. Рецептори Есу (Есукз) (0081) СнНаг- і СНЗ-домени двох важких ланцюгів взаємодіють з утворенням Ес-фрагмента, який являє собою домен, розпізнаваний клітинними рецепторами Ес, включаючи, але не обмежуючись Ес-рецепторами гамма (ЕсукК5). МУ даній заявці термін "Ес-фрагмент" застосовується для визначення С-кінцевої ділянки важкого ланцюга Ідс. Амінокислотна послідовність домену СН2-СНЗ прикладу людського ЇдДС1 являє собою (ЗЕО ІЮ МО:1): 231 240 250 260 270 280
АРЕГ ГГ ЯаРБЗМ РІ ЕРРКРКОТ І МІЗАТРЕМТ СММУМОУЗНЕО РЕУКЕМУММО 290 300 310 320 330
СМЕМНМАКТК РЕЕЄОУМЗТУ АУУБЗМІ ТМІ Н ОБУ МЕОКЕМУК СКУЗМКАЇГ РА
340 350 360 370 380
РІЕКТІЗКАК СОРВЕРОММТ І РРОВЕЕМТК МОМ5І ТС УК ЕМРБЗОІАМЕ 390 400 410 420 430
МЕЗМСОРЕММ УКТТРРМІ ОЗ СВСЗЕРІ КІ ТМОКЗАМООСЇ ММЕЗСЗУМНЕ
440 447
АЇ НМНУТОКЗ І 5І 5РОХ при нумерації відповідно до ЕО-індексу за Кабатом, де Х являє собою лізин (К) або відсутній. (0082) Амінокислотна послідовність домену СН2-СНЗ прикладу 952 людини являє собою (ЗЕО ІЮ МО:г): (510) 231 240 250 260 270 280
АРРМА-ВРБМ РІ РРРКРКОТ І МІЗАТРЕМТ СМММОУ5ЗНЕО РЕМОЕЄМУ УМО 290 300 310 320 330
СМЕМНМАКТК РЕЕЄОЕЄЕМЗТЕ ВУМБУІТУУН ОБУ МЕОКЕМК СКУЗМКИаї РА 340 350 360 370 380
РІЕКТІЗКТК СОРРБЕРОММТ І РРОВЕЄЕМТК МОМ5І ТОЇ МК СЕМРБЗОІЗМЕ 390 400 410 420 430
МЕЗМСОРЕММ УКТТРРМІО5 ВСОЗЕРІ ЗК ТМОКЗАМООа,;, ММЕЗСЗУМНЕ 440 447
АЇ НМНУТОКЗ І 5І 5РОХ при нумерації відповідно до ЕМО-індексу за Кабатом, де Х являє собою лізин (К) або відсутній. (0083) Амінокислотна послідовність домену СН2-СНЗ прикладу людського ДОЗ являє собою (ЗЕО ІО МО:3): 231 240 250 260 270 280
АРЕГ ГГ ЯаРБМ РІ ЕРРКРКОТ І МІЗАТРЕМТ СММУМОУЗНЕО РЕМОЕКМ УМО 290 300 310 320 330
СМЕМНМАКТК РЕЕЄОУМЗТЕ ВУМУБЗМІ ТМІ Н ОУМІ МОКЕМК СКУЗМКАЇ РА
340 350 360 370 380
РІЕКТІЗКТК СОРРБЕРОММТ І РРОВЕЄЕМТК МОМ5І ТОЇ МК СЕМРЗОІАМЕ 390 400 410 420 430
МЕББЗООРЕММ УМТТРРМІО5 ВСОЗЕРІ УЗКІ ТМОКЗАМООС МІЕЄСЗУМНЕ 440 447
АЇ НМАЕТОКЗ І 5І 5РОХ при нумерації відповідно до ЕО-індексу за Кабатом, де Х являє собою лізин (К) або відсутній. (0084) Амінокислотна послідовність домену СН2-СНЗ прикладу людського ЇдД4 являє собою (ЗЕО ІЮ МО:4): 231 240 250 260 270 280
АРЕНІ ааРБМУ РІ ЕРРКРКОТ І МІЗАТРЕМТ СУММОУМБОЕО РЕМОЄМУ УМО
Коо) 290 300 310 320 330
СМЕМНМАКТК РЕЕЄОЕМЗТУ ВУМУБМІ ТМІ Н ОБУ МЕОКЕМК СКУЗМКаЇ Р 340 350 360 370 380
ЗІЕКТІЗКАК СОРАВЕРОМУМТ І РРЗОЕЕМТК МОМБ5І ТОЇ МК ЧаЕМРБОІАМЕ 390 400 410 420 430
МЕЗМСОРЕММ УКТТРРМІ ОЗ СВСЗЕРІ МА ТМОКЗАМОвєаС ММЕЗСЗУМНЕ 440 447
А НМНУТОКБІ БІ Бах при нумерації відповідно до ЕО-індексу за Кабатом, де Х являє собою лізин (К) або відсутній. 0085) Протягом даної заявки нумерація залишків у константній області важкого ланцюга Ідс являє собою нумерацію згідно ЕО-індексу згідно з Кабатом (КавБбаї єї а!., Зедиепсевз ої Ргоївїп5 ої
Іттипоїодіса! Іпієгеві, 5" Ей. Рибіїс Неанкйп Бегмісе, МНІ, МО (1991) ("Кабраї"), де зазначене джерело спеціально включене у дану заявку за допомогою посилання. Термін "ЕО-індекс за
Кабатом" відноситься до нумерації (91 людини за європейською системою нумерації антитіл.
Амінокислоти з варіабельних доменів зрілих важких і легких ланцюгів імуноглобулінів позначені за допомогою номера положення амінокислоти в ланцюзі. Кабат описав численну кількість амінокислотних послідовностей антитіл, ідентифікував консенсусні амінокислотні послідовності для кожної підгрупи і привласнив кожній амінокислоті номер залишку. СОК ідентифіковані, як визначено за Кабатом (слід розуміти, що СОКНІ починається на п'ять залишків раніше відповідно до нумерації Чотія (Споїйпіа, С. 8. ГезК, А. М. (1987) "Сапопіса! 5ігисіиге5 Тог Те
Нурегмагіабріє гедіоп5 ої іттиподіориїїпв," у. Мої. Віої. 196:901-917). Схема нумерації за Кабатом поширюється на антитіла, не включені у перелік перерахованих ним антитіл, шляхом вирівнювання антитіла, яке цікавить, з однієї з консенсусних послідовностей за Кабатом з посиланням на консервативні амінокислоти. Зазначений спосіб присвоєння залишкам номерів став стандартним в даній області техніки і дозволяє легко ідентифікувати амінокислоти в еквівалентних положеннях в різних антитілах, включаючи гібридні або гуманізовані варіанти.
Наприклад, амінокислота у положенні 50 легкого ланцюга антитіла людини займає положення, еквівалентне амінокислоті у положенні 50 легкого ланцюга антитіла миші.
Ї0086| Поліморфізми були виявлені у декількох різних положеннях в межах константних бо областей антитіла (наприклад, положеннях у Ес-фрагменті, включаючи, але не обмежуючись положеннями 270, 272, 312, 315, 356 і 358 при нумерації відповідно до ЕЄЮ-індексу за Кабатом) і, таким чином, можуть бути невеликі відмінності між представленою послідовністю та послідовностями згідно з попереднім рівнем техніки. Поліморфні форми імуноглобулінів людини були добре охарактеризовані. У цей час відоме 18 Сст-алотипів: 1 т (1, 2, 3, 17) або С1т (а, х, 7), б2т (23) або с2т (п), Зт (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) або СЗт (61, с3, 63, БО, 63, 64, 5,1, 91, с5, М, м, 95) (І еяїгапс, єї а)І., "Те Нитап Ідсаї 5!ибсіаззев: МоїІесшаг Апаїувів
ОГ Бігисішйге, Рипсіоп Апа Ведиайоп." Регдатоп, Охгога, стор. 43-78 (1990); І еїтапс, Сх. єї аї., 1979, Нит. Сепеї.: 50, 199-211). Спеціально передбачається, що антитіла згідно з даним винаходом можуть включати будь-який алотип, ізоалотип або гаплотип будь-якого гена імуноглобуліну та не обмежуються алотипом, ізоалотипом або гаплотипом послідовностей, представлених у даній заявці. Більше того, у деяких експресійних системах С-кінцевий амінокислотний залишок (виділений жирним шрифтом вище) домену СНЗ3 може видалятися посттрансляційно. Таким чином, С-кінцевий залишок домену СНЗ є необов'язковим амінокислотним залишком у біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекулах згідно з винаходом. Даний винахід спеціально включає біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули з відсутністю С-кінцевого залишку СНЗ-домену. Також даний винахід спеціально включає такі конструкції, які містять С-кінцевий залишок, що являє собою лізин, домену СНЗ.
І0087| Як зазначено вище, Ес-фрагмент природних антитіл ДС здатний зв'язуватися з клітинними Ес-гамма рецепторами (ЕсукК). Таке зв'язування призводить до передачі імунній системі активуючих або інгібуючих сигналів. Здатність такого зв'язування стимулювати діаметрально протилежні функції відображає структурні відмінності різних Есук і, зокрема, вказує на те, містить зв'язаний ЕсукК імунорецепторний активуючий мотив на основі тирозину (ІТАМ) або імунорецепторний інгібуючий мотив на основі тирозину (ІТІМ). Залучення різних цитоплазматичних ферментів до зазначених структур визначає результат Есук- опосередкованих клітинних відповідей. ІТАМ-вмісні ЕсуК включають ЕсукКіІ, ЕСсуУКкПА, ЕсукША й активують імунну систему при зв'язуванні з ЕРсо-фрагментом. ЕсукКіІІВ являє собою єдиний відомий на сьогодні природний ІТІМ-вмісний Есук; він діє таким чином, щоб послабляти або пригнічувати імунну систему при зв'язуванні з Ес-фрагментом. Нейтрофіли людини експресують ген ЕсукІІА. Кластеризація ЕсуКкПА шляхом утворення імунного комплексу або поперечного
Зо зв'язування специфічних антитіл служить для агрегації ІТАМ з пов'язаними з рецептором кіназами, які полегшують фосфорилювання ІТАМ. Фосфорильований ІТАМ служить в якості докінг-сайту для БЗук-кінази, активація якої призводить до активації наступних субстратів (наприклад, РізК). Клітинна активація призводить до вивільнення протизапальних медіаторів.
Ген ЕСуУКІІВ експресується у В-лімфоцитах; його позаклітинний домен на 96 95 ідентичний
ЕсукПпА і таким самим чином зв'язується 3 комплексами /дсСс. Наявність ІТІМ у цитоплазматичному домені ЕсукіІїВ визначає цей інгібіторний підклас Есук. Недавно була встановлена молекулярна основа описаного інгібування. При ко-лігуванні з активуючим Есук мотив ІТІМ рецептора ЕсукКІІВ фосфорилюється та залучає 5Н2-домен інозитолполіфосфат-5'- фосфатази (ЗНІР), яка гідролізує фосфоінозитолові месенджери, що вивільняються в результаті активації тирозинкінази, опосередкованою ІТАМ-вмісним ЕсукК, що в результаті запобігає вхід внутрішньоклітинного Са. Таким чином, поперечне зв'язування ЕсуКІІВ гасить активуючу відповідь на лігування ЕсукК і пригнічує клітинну чутливість. Таким чином, припиняється активація та проліферація В-клітин і секреція ними антитіл.
ІП. Біспецифічні антитіла, мультиспецифічні діатіла та діатіла ОАКТФ
І0088| Здатність антитіла зв'язуватися з епітопом антигена залежить від присутності й амінокислотної послідовності МІ- і МН-доменів антитіла. В результаті взаємодії легкого та важкого ланцюга антитіла та, зокрема, взаємодії його МІ-- ії МН-доменів, утворюється один із двох сайтів зв'язування епітопу природного антитіла, такого як їд0. Природні антитіла здатні зв'язуватися тільки з одним видом епітопу (тобто вони є моноспецифічними), незважаючи на те, що вони можуть зв'язуватися з численною кількістю копій епітопів даного виду (тобто проявляють бівалентність або мультивалентність).
І0089| Домени зв'язування антитіл і біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом зв'язуються з епітопами "їімуноспецифічним" чином. У даній заявці зазначено, що антитіло, діатіло або інша сполучна епітоп молекула "імуноспецифічно" зв'язується з ділянкою іншої молекули (тобто епітопом), якщо вона реагує або зв'язується частіше, швидше, з більшою тривалістю та/або з більшою афінністю із зазначеним епітопом у порівнянні з альтернативними епітопами. Наприклад, антитіло, яке імуноспецифічно зв'язується з вірусним епітопом, являє собою антитіло, яке зв'язується з даним вірусним епітопом з більшою афінністю, авідністю, з більшою швидкістю та/або з більшою тривалістю у порівнянні з бо імуноспецифічним зв'язуванням з іншими вірусними епітопами або невірусними епітопами. При зустрічі зазначеного визначення також необхідно розуміти, що, наприклад, антитіло (або фрагмент або епітоп), яке імуноспецифічно зв'язується з першою мішенню, може або не може специфічно або переважно зв'язуватися з другою мішенню. У зв'язку з цим "імуноспецифічне зв'язування" не обов'язкове потребує виняткового зв'язування (незважаючи на те, що може включати виняткове зв'язування). У цілому, посилання на зв'язування відноситься (але не обов'язково) до "імуноспецифічного" зв'язування. Зазначено, що дві молекули здатні зв'язуватися один з одним з "фізіологічною специфічністю", якщо таке зв'язування характеризується специфічністю, з якою рецептори зв'язуються з їх відповідними лігандами.
І0О090)| Один аспект згідно з даним винаходом заснований на знанні того, що функціональну активність антитіл можна підвищувати шляхом створення мультиспецифічних молекул на основі антитіл, які можуть одночасно зв'язуватися з одним або більше епітопами (епітопом) РО-1, а також одним або більше епітопами (епітопом) СТІ А-4. Для молекул, що містять більше одного сайту зв'язування епітопу, імуноспецифічного по відношенню до епітопу РО-1, зазначені епітопи можуть бути ідентичні один одному, перекриватися або бути окремими один від одного; зв'язування з одним таким епітопом може конкурувати або не конкурувати зі зв'язуванням з іншими такими епітопами. Аналогічно, для молекул, що містять більше одного сайту зв'язування епітопу, імуноспецифічного по відношенню до епітопу СТІ А-4, такі епітопи можуть бути ідентичні один одному, перекриватися або бути окремими один від одного; зв'язування з одним таким епітопом може конкурувати або не конкурувати зі зв'язуванням із другим таким епітопом.
Спеціально передбачено, що зазначені характеристики можна незалежно змінювати з одержанням біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул, які, наприклад, мають: (1) здатність зв'язуватися з двома ідентичними епітопами РО-1 і з: (а) двома ідентичними епітопами СТІ А-4; або (р) двома епітопами, що перекриваються СТІ А-4; або (с) двома окремими епітопами СТІ А-4; або (2) здатність зв'язуватися з двома епітопами, що перекриваються РО-1 і з: (а) двома ідентичними епітопами СТІ А-4; або (р) двома епітопами, що перекриваються СТІ А-4; або
Зо (с) двома окремими епітопами СТІ А-4; або (3) здатність зв'язуватися з двома окремими епітопами РО-1 і з: (а) двома ідентичними епітопами СТІ А-4; або (р) двома епітопами, що перекриваються СТІ А-4; або (с) двома окремими епітопами СТІ А-4.
І0091| Для одержання молекул, що мають більше високу здатність зв'язування у порівнянні з природними антитілами, була розроблена велика кількість різних рекомбінантних біспецифічних антитіл (див. наприклад, міжнародні публікації згідно з РСТ Мо МУ/О 2008/003116, УМО 2009/132876, МО 2008/003103, УМО 2007/146968, МО 2009/018386, МО 2012/009544, МО 2013/070565), у більшості з яких використовуються лінкерні пептиди для злиття додаткового епітопзв'язуючого фрагмента (наприклад, 5сЕм, МІ, МН ії т. д.) з антитілом або для злиття в межах його каркасної структури (ІА, ІдО, І9ЗЕ, да або І9М) або для злиття декількох сполучних епітоп фрагментів (наприклад, два Бар фрагмента або 5сЕм). В альтернативних формах використовуються лінкерні пептиди для злиття епітопзв'язуючого фрагмента (наприклад, 5сЕм,
МІ, МН і т. д.) з доменом димеризації, таким як домени СН2-СНЗ або альтернативні поліпептиди (МО 2005/070966, УМО 2006/107786А УМО 2006/107617А, УМО 2007/046893). Публікації згідно з
РСТ Мо УМО 2013/174873, УМО 2011/133886 і УМО 2010/136172 описують триспецифічне антитіло, в якому домени СІ. ії СНІ були переміщені з відповідних природних положень, і домени Мі. і МН були змінені (МИМО 2008/027236; МО 2010/108127) таким чином, щоб забезпечити можливість зв'язування зазначеного антитіла з більше ніж одним антигеном. Публікації РСТ Мо УМО 2013/163427 ії МО 2013/119903 описують модифікацію домену СН2 таким чином, щоб він містив адукт гібридного білка, що має домен зв'язування. Публікації РСТ Мо УМО 2010/028797, МО 2010028796 і УМО 2010/028795 описують рекомбінантні антитіла, Ес-фрагменти яких були замінені на додаткові МІ- ії МН-домени таким чином, щоб утворювалися трьохвалентні сполучні молекули. Публікації згідно з РСТ Мо М/О 2003/025018 і УМО 2003012069 описують рекомбінантні діатіла, окремі ланцюги яких містять 5сЕм-домени. Міжнародна публікація згідно з РСТ Мо М/О 2013/006544 описує мультивалентні Рар-молекули, синтезовані у вигляді єдиного поліпептидного ланцюга та потім піддані протеолізу з одержанням гетеродимерних структур.
Публікації згідно з РСТ Мо УУО 2014/022540, УМО 2013/003652, МО 2012/162583, УМО 60 2012/156430, МО 2011/086091, МО 2008/024188, МО 2007/024715, МО 2007/075270, МО
1998/002463, УМО 1992/022583 і УМО 1991/003493 описують додавання додаткових доменів зв'язування або функціональних груп до антитіла або до частини антитіла (наприклад, додавання діатіла до легкого ланцюга антитіла, або додавання додаткових доменів Мі. і МН до легких або важких ланцюгів антитіла, або додавання гетерологічного гібридного білка, або зчеплення декількох Рар-доменів один з одним).
І00921 У рівні техніки також описана можливість одержувати діатіла, які відрізняються від таких природних антитіл здатністю зв'язуватися з двома або більшим числом різних епітопів (тобто такі, що проявляють біспецифічність або мультиспецифічність, крім бівалентності або мультивалентності) (див. наприклад, Ноїїдег еї а. (1993) "Оіародіев": Зтаї! Вімаієпі Апа
Візресійс Апіїбоду Егадтепів, Ргос. Май. Асай. Зсі. (США) 90:6444-6448; 05 2004/0058400 (Ноїїпдег єї аІ.); 005 2004/0220388 / МО 02/02781 (Мепепвз еї аї.); АЇї еї аІ. (1999) РЕВ5 І ей. 454(1-2):90-94; 1 и, О. ег а). (2005) "А Ешіу Нитап Ресотрбіпапі Іда-ІїКе Візресіїїс Апіїроду То Воїн
Тне Ерідента! Стоули Расіог Весеріог Апа Тне Іпзшіп-Гіке СтоулЛи Расіюог Весеріог Рог Епнапсеєйд
Апійитог Асіїмпу," У. Віої. Спет. 280 (20):19665-19672; МО 02/02781 (Мепепз вї аї.); Оіаївеп, Т. еї аї. (2004) "Сомаіепі Оівиніде-ІіпКей Апіі-сеа Оіароду Айомує Зпе-Зресіїс Сопішдайоп Апа
Вадіоіабеїїпд Рог Титог Тагдеїїпа Арріїсайоп5," Ргоївіп Епо. Оев. Зеї. 17 (1):21-27; Ми, А. еї аї. (2001) "Мийітегігайоп ОЇ А Спітегіс Апії-саго Зіпдіе Спаійп Рм-ЕРм Ривіоп Ргоїєїп І5 Меаіаїва
Тптоцд Магіабіе Оотаїп Ехспапде," Ргоївїп Епдіпеегіпу 14 (2):11025-1033; Азапо еї аї. (2004) "А
ОРіароду Рог Сапсег Іттипоїпегару Апа 5 ЕРипсіпа! Еппапсетепі Ву Ривіоп ОЇ Нитап Ес
ЮОотаїп," Абвігасі ЗР-683, У. Віоспет. 76(8):992; ТаКетига, 5. еї аі. (2000) "Сопвіисіоп ОТГ А
Біароду (Зтаї! Весотрбіпапі Візресіїїс Апіїроду) Овіпд А Веїоідіпуд бЗузієт, Ргоїєїп Епа. 13 (8):583-588; Ваєнцепіе, Р.А. евї а!. (2009) "Візресіїїс Т-СеїЇ Епдадіпд Апіїродієз Бог Сапсег ТНегару,"
Сапсег Вез. 69(12):4941-4944).
І0093| Основою дизайну діатіла є похідна антитіла, відома як одноланцюговий фрагмент варіабельного домену (5СЕм). Такі молекули одержують шляхом зв'язування варіабельного домену легкого та/"або важкого ланцюга за допомогою короткого сполучного пептиду. У публікації Віга еї аїЇ. (1988) ("Зіпдіе-СНаіїп Апіїдеп-Віпаіпуд Ргоїєїпв," Зсієпсе 242:423-426, описаний приклад сполучних пептидів, які забезпечують зв'язок довжиною приблизно 3,5 нм між карбокси-кінцем одного варіабельного домену й аміно-кінцем іншого варіабельного домену.
Зо Були створені та використовувалися лінкери з іншими послідовностями (Віга еї аї. (1988) ("Зіпаіє-СНнаіп Апіїдеп-Віпаїпа Ргоївіпв," Зсівєпсе 242:423-426). Лінкери, у свою чергу, можна модифікувати для одержання додаткових функцій, таких як приєднання лікарських засобів або приєднання до твердих підкладок. Одноланцюгові варіанти можуть бути отримані або рекомбінантним, або синтетичним шляхом. Для одержання 5сЕм синтетичним шляхом можна застосовувати автоматичний синтезатор. Для одержання 5сЕм рекомбінантним шляхом можна вводити підходящу плазміду, що містить полінуклеотид, який кодує 5СЕм, у підходящу клітину- хазяїна - еукаріотичну, таку як клітини дріжджів, рослин, комах або ссавців, або прокаріотичну, таку як Е. соїї. Полінуклеотиди, що кодують цільовий 5сЕм, можуть бути отримані за допомогою стандартних процедур, таких як лігування полінуклеотидів. Отриманий в результаті 5СЕм можна виділяти із застосуванням стандартних методів очищення білка, відомих в даній області техніки.
І0094| Одержання біспецифічних сполучних молекул (наприклад, не моноспецифічних діатіл) забезпечує значну перевагу у порівнянні з антитілами, включаючи, здатність до "транс" зв'язування, достатнього для ко-лігування та/або забезпечення співлокалізації різних клітин, які експресують різні епітопи, і/або здатність до "цис"-зв'язування, достатнього для ко-лігування та/або забезпечення співлокалізації різних молекул, що експресуються однією і тією самою клітиною, але не обмежуючись перерахованим. Таким чином, існують різні варіанти застосування біспецифічних сполучних молекул (наприклад, не моноспецифічних діатіл), включаючи терапію й імунологічну діагностику. Біспецифічність забезпечує дуже гнучкі можливості у проектуванні та конструюванні діатіл для різних додатків, забезпечуючи підвищену авідність до мультимерних антигенів, поперечне зв'язування різних антигенів і таргетоване націлювання на конкретні типи клітин на підставі присутності обох антигенів-мішеней. Завдяки своїй підвищеній валентності, низькій швидкості дисоціації та швидкому всмоктуванню з кровотока (для діатіл малого розміру, «50 кДа або менше), молекули діатіл, відомі в даній області техніки, також показали особливу застосовність в області візуалізації пухлин (Ейгдегаїй еї аі. (1997) "Ітргомед Титоиг Тагдеїїпуд Ву Оізиїрніде егабіїїей Оіародієз Ехргеззедй Іп Ріспіа равюгів," Ргоївіп Епд. 10:1221).
І0095| Можливість створювати біспецифічні діатіла призвела до їх застосування для ко- лігування двох клітин ("транс»-зв'язування), наприклад, шляхом ко-лігування рецепторів, що присутні на поверхні різних клітин (наприклад, поперечного зв'язування цитотоксичних Т-клітин бо з пухлинними клітинами) (5іаег2 еї аї. (1985) "Нубгіа Апіїбодієз Сап Тагдеї Зйе5з Рог Айаск Ву Т
Сеїїв," Маїште 314:628-631, апа Ноїїїдег еї аї. (1996) "Зресіїїс Кіїййпу ОГ Гутрпота СеїІв Ву
Суїюохіс Т-СеїІз Медіаїєд Ву А Візресіїїс Ріароду," Ргоїєїп Епа. 9:299-305; Магуіп еї аї. (2005) "ВНесотбіпапі Арргоаснев То Іда-іїКе Візресіїїс Апіїрбодієв," Асіа Рпаптасої. біп. 26:649-658). В якості альтернативи або додатково, біспецифічні діатіла можна застосовувати для ко-лігування молекул, таких як рецептори і т. д., які присутні на поверхні однієї і тієї самої клітини ("цис"- зв'язування). Ко-лігування різних клітин і/або рецепторів можна застосовувати для модулювання ефекторних функцій та/(або сигнального шляху клітини імунної системи. Однак плата за ці переваги висока. Утворення таких не моноспецифічних діатіл потребує успішного сполучення двох або більше окремих і різних поліпептидів (тобто для утворення зазначених не моноспецифічних діатіл потрібно, щоб вони формувалися шляхом гетеродимеризації поліпептидних ланцюгів різних видів), на противагу моноспецифічним діатілам, які утворюються шляхом гомодимеризації ідентичних поліпептидних ланцюгів. Оскільки необхідно забезпечувати щонайменше два різні поліпептиди (тобто два види поліпептидів) для утворення не моноспецифічного діатіла, й оскільки гомодимеризація таких поліпептидів призводить до одержання неактивних молекул (ТаКептига, 5. еї аЇ. (2000) "Сопвігисіоп ОЇ А Оіарсду (Зтаїї
Весотрбіпапі Візресіїс Апіїбоду) Овіпд А Веїоїдіпд БЗувієт, Ргоїєїп Епа. 13 (8):583-588), одержувати такі поліпептиди потрібно таким чином, щоб запобігти утворенню ковалентного зв'язку між поліпептидами одного виду (тобто, щоб запобігти гомодимеризації) (ТаКетига, 5. еї а!. (2000) "Сопвігисіоп ОЇ А Оіароду (Зтаї! Ресотрбіпапі Візресіїїс Апіїроду) Овіпа А Нейіаіпд
Зузієт, Ргоїєїпй Епа. 13 (8)583-588). Відповідно, у рівні техніки була запропонована нековалентне сполучення таких поліпептидів (див. наприклад, Оїаїзеп еї аї. (2004) "СомаІепі різиніде-І іпкей Апіі-свєа Оіароду АйПомуз 5ійе-бЗресіїйс Сопішдайоп Апа Радіоіабеїпуд Рог Титог
Тагаеїйпа Арріїсайопе," Ргої. Епдг. ЮОев. 5евї. 1721-27; Азапо еї а!. (2004) "А біароду Рог Сапсег
Іттипоїпегару Апа Ії Рипсіопа! Епнапсетепі Ву Ривіоп ОЇ Нитап Ес ботаїп," Арвігасі ЗР-683, у. Віоспет. 76(8):992; ТаКетига, 5. еї а). (2000) "Сопвіпосіюп ОЇ А Оіабсаду (Зтаї! Весотрбіпапі
Візресійс Апіїроду) Овіпу А Вейідіпуд Зузіет," Ргоївїп Епо. 13 (8):583-588; 1 1, 0. еї аї. (2005) "А
ЕшШу Нитап ВАесотріпапі Ідс-ІКе Вівресіїс Апіроду То Воїй Те Еріденпта! Сптоули Расіог
Весеріог Апа Те Інзшіп-ГіКе Сптомлйи Расіог Весеріог Бог Еппапсей Апійитог Асіїмйу," у. Віо!.
Спет. 280(20):19665-19672).
Ко) ЇО096|Ї Однак роботи в даній області техніки підтвердили, що біспецифічні діатіла, які складаються з нековалентно зв'язаних поліпептидів, нестабільні та легко дисоціюють з утворенням нефункціональних мономерів (див. наприклад, І и, О. еї аї. (2005) "А Ешіу Нитап
Весотрбіпапі Іда-ІКе Вівзресіїїс Апіроду То Воїй Те Ерідепта! Стоули Расіог НРесеріог Апа Те
Іпвзиїїп-Г ке Стоули Расіог Ресеріог Бог Епнапсед Апійштог Асіїмпу," у. Вісі. Спет. 280 (20):19665- 19672). 0097) У процесі рішення даного завдання в даній області техніки був досягнутий успіх у розробці стабільних ковалентно зв'язаних гетеродимерних не моноспецифічних діатіл, названих діатілами СОАКТФ (Оца! Айпійу Ке-Тагдейпуд Кеадепіб5, ре-спрямовані реагенти з подвійною афінністю); див., наприклад, публікації патентів США Мо 2013-0295121; 2010-0174053 ї 2009- 0060910; публікації європейських патентів Мо ЕР 2714079; ЕР 2601216; ЕР 2376109; ЕР 2158221 і міжнародні публікації згідно з РСТ Мо УМО 2012/162068; УМО 2012/018687; УМО 2010/080538 і
Зіоап, О.О. єї аї. (2015) "Тагдеїпуд НІМ Везегмоїіг іп ІпїТесієа СО04 Т Се Бу Юпа!І-Аніпйу Ве-
Тагдеїіпу Моїіесцез (Оапв) ІНаї Віпа НІМ ЕпиєІоре апа Рестий Сушююхіс Т СеїІв," Ріо Раїса. 11 (11)уе1005233. дої: 10.137 1/Лошпаї.рра!ї.1005233; АЇ Низзаїпі, М. еї а. (2015) "Тагдейпду СО123 Іп
АМІ Овзіпа А Т-Сеї! Сігесієа ЮцаІ-Аніппу Ве-Тагдеїіпд (БАКТФ) Ріаногт, " Віоса рії: рБіоса-201 4- 05-575704; Спіспіїї, С.А. еї аї. (2015) "А СОЗхса123 Візресіїїс САВТ Рог Веадігесіїпда Нові Т СеїЇв
То Мувіодепоиз І еоКетіа: Ргесіїпіса! Асіїміу Апа Заїеїу Іп Моппитап Р'іїтаїев," Зсі. Тгапві. Мед. 7 (289):289гав2; Моотге, Р.А. еї аї. (2011) "Арріїсайоп ОЇ Юца! Айіппу Неїагодеїйпо МоїІесшев5 То
Аспієме Оріїта! Неадігесієд Т-Сеї! Кіїпу ОЇ В-Сеїї Гутрпота," Віоосд 117 (17):4542-4551; Меїї,
М.С. єї аї. (2010) "ТПнегарешііс Сопігої ОЇ В Сеї! Асіїмайоп Міа Весгийтепі ОЇ Есдатта Ресеріог Іїр (СОЗ2В) Іппіріюгу Рипсійоп М/ЙН А Момеї! Візресіїс Апіїбоду Зсаноїд," Ап АНпешт. 62 (7):11933- 1943; ЧопМ5ОпП, 5. еї а. (2010) "Епнесюг Сеї! Вестийтепі МУйй Моме! Ем-Вазедй Юпа!І-АнНіпйу Ве-
Тагдеїйпа Ргоїєїп Їєад5 То Роїєпі Титог Суюіувіз Апа іп мімо В-Сеї! Оерієїйоп," ). Мої. Віо). 399(3):436-449). Такі діатіла містять два або більше ковалентно об'єднаних поліпептидів і включають вбудовування в кожний з використовуваних видів поліпептидів одного або більше цистеїнових залишків, що створюють можливість утворення дисульфідних зв'язків і, таким чином, ковалентного зв'язування однієї або більше пар таких поліпептидних ланцюгів один з одним. Наприклад, було показано, що додавання цистеїнового залишку до С-кінця такої конструкції дозволяє утворюватися дисульфідному зв'язку між задіяними поліпептидними бо ланцюгами, який стабілізує отримане в результаті діатіло, без впливу на характеристики зв'язування діатіла. 0098) Багато варіантів таких молекул описано (див. наприклад, публікації патентів США Мо 2015/0175697; 2014/0255407; 2014/0099318; 2013/0295121; 2010/0174053; 2009/0060910; 2007- 0004909; публікації європейських патентів Мо ЕР 2714079; ЕР 2601216; ЕР 2376109; ЕР 2158221; ЕР 1868650 і міжнародні публікації згідно з РСТ Мо УМО 2012/162068; УМО 2012/018687;
УМО 2010/080538; УМО 2006/113665) і запропоновано у даній заявці. 0099) В даній області техніки відомі альтернативні конструкції для застосування у випадках, коли потрібна тетравалентна молекула, але Ес-фрагмент не потрібний, включаючи, без обмеження, тетравалентні тандемні антитіла, також називані "ТапаАб" (див. наприклад, публікації патентів США Мо 2005-0079170, 2007-0031436, 2010-0099853, 2011-020667 2013- 0189263; публікації європейських патентів Мо ЕР 1078004, ЕР 2371866, ЕР 2361936 і ЕР 1293514; публікації згідно з РСТ Мо МУО 1999/057150, МО 2003/025018 і УМО 2013/013700), які утворені шляхом гомодимеризації двох ідентичних ланцюгів, кожний з яких містить домен МНІ,
МІ1, МН2 і МІ2.
ІМ. Переважні біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули 00100) Один варіант реалізації даного винаходу відноситься до молекул, біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4, які здатні зв'язуватися з "першим епітопом" і "другим епітопом", де зазначені епітопи не ідентичні один одному. Такі біспецифічні молекули містять домени "МІ/15/«МНІ1", які здатні зв'язуватися з першим епітопом, і домени "МІ 2""МНа2", які здатні зв'язуватися з другим епітопом. Позначення "МІ1" ї "МНІ" відносяться, відповідно, до варіабельного домену легкого ланцюга та варіабельного домену важкого ланцюга таких біспецифічних молекул, де зазначені домени зв'язуються з "першим" епітопом. Аналогічно, позначення "МІ 2" ії "МН2" відносяться, відповідно, до варіабельного домену легкого ланцюга та варіабельного домену важкого ланцюга таких біспецифічних молекул, де зазначені домени зв'язуються з "другим" епітопом. Не має значення, чи позначений конкретний епітоп як перший або як другий епітоп; такі позначення важливі тільки з погляду присутності й орієнтації доменів поліпептидних ланцюгів молекули зв'язування згідно з даним винаходом. Відповідно до одного варіанта реалізації винаходу один такий епітоп являє собою епітоп РО-1 людини, а інший такий епітоп являє собою епітоп СТІ А-4. Згідно з конкретними варіантами реалізації винаходу
Зо біспецифічна молекула містить більше двох сайтів зв'язування епітопів. Такі біспецифічні молекули зв'язуються щонайменше з одним епітопом РО-1 і щонайменше одним епітопом
СТІ А-4 і можуть додатково зв'язуватися з додатковими епітопами РО-1 і/або додатковими епітопами СТІ А-4. 00101) Даний винахід, зокрема, відноситься до молекул, біспецифічних по відношенню до
РО-1 х СТІ А-4 (наприклад, біспецифічних антитіл, біспецифічних діатіл, трьохвалентих сполучних молекул і т. д.), що містять сполучні епітоп фрагменти антитіла, які забезпечують їх здатність координовано зв'язуватися щонайменше з одним епітопом РО-1 і щонайменше з одним епітопом СТІ А-4. Вибір МІ- і МН-доменів для поліпептидних доменів таких молекул координується таким чином, щоб Мі-домен і МН-домен одного і того самого поліпептидного ланцюга не могли утворювати сайт зв'язування епітопу, здатний зв'язуватися з РО-1 або з
СТІ А-4. Вибір зазначених доменів додатково координується таким чином, щоб складання поліпептидних ланцюгів, які утворюють зазначені біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули, відбувалися з утворенням щонайменше одного функціонального сайту зв'язування антигена, специфічного по відношенню до щонайменше одного епітопу РО-1, і щонайменше одного функціонального сайту зв'язування антигена, специфічного по відношенню до щонайменше одного епітопу СТІ А-4.
ІЇ00102| Даний винахід, зокрема, відноситься до таких молекул, біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4, які проявляють активність, що перевищує зазначену активність двох моноспецифічних молекул, одна з яких містить варіабельний домен важкого ланцюга та варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, яке зв'язується з РО-1, й інша з яких містить варіабельний домен важкого ланцюга та варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, яке зв'язується з СТІ А-4. Приклади такої активності включають ослаблення активності РО-ї, ослаблення активності СТІ А-4, посилення активації імунної системи, посилення ефекторної функції, посилення протипухлинної активності. У даній заявці зазначене ослаблення активності відноситься до зниження на 10 95 або більше, зниження на 20 95 або більше, зниження на 50 95 або більше, зниження на 8095 або більше або зниження на 9095 або більше інгібуючої активності РО-1 і/або СТІ А-4 або повного усунення такої інгібуючої активності РО-1 і/або СТІ А- 4. У даній заявці зазначене посилення активності відноситься до посилення на 10 95 або більше, посилення на 20 95 або більше, посилення на 50 95 або більше, посилення на 80 95 або більше бо або посилення на 90 95 або більше стимулюючої імунну систему активності, опосередкованої або залежної від експресії або присутності РО-1 і/або СТІ А-4, у порівнянні з активністю, яку проявляють дві моноспецифічні молекули, одна з яких містить варіабельний домен важкого ланцюга та варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, яке зв'язується з РО-1, й інша з яких містить варіабельний домен важкого ланцюга та варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, яке зв'язується з СТІ А-4. Приклади активності, що призводить до активації імунної системи, включають, але не обмежуються наступними, проліферацію клітини імунної системи (наприклад, Т-лімфоцитів, природніх клітин-кілерів (МК-клітин)), продукцію та/або вивільнення імунними клітинами цитокінів, продукцію та/або вивільнення імунними клітинами літичних молекул (наприклад, гранзиму, перфорину та т. д.) й/або експресію імунними клітинами маркерів активації. Цитокіни, які вивільняються при активації імунної системи, відомі в даній області техніки і включають, але не обмежуються наступними: ІЕМу, І/-2 і ТМЕа, (див. наприклад, УЧапемжау, С.А. еї аїЇ. 2011) Іттипобіоіоду" 8 ей. Сапапа 5сіепсе Рибіїзпіпод, МУ;
Вапуег, 9.Г. (2000) "СуюкКіпе5 іп іппаїе апа адаріїме іттипійу," Вем Іттиподепеї. 2:359-373).
Маркери активації, що експресуються імунними клітинами, відомі в даній області техніки і включають, але не обмежуються наступними: СО69, С025 і СО107а (див. наприклад, чапеуау,
С.А. еї аї. (2011) Іттипобіоіоду" 8Ій ей. Сапапа 5сіепсе Рибіїєпіпу, МУ; ЗПіркома, М. і УМіеїапа, Е. (2012) "Бипасе таїКегв ої Іутрпосуїе асіїмайоп апа такегз ої сеї! ргоїїїтегайоп," Сіп Спіт Асіа 413:1338-1349).
А. Біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 антитіла 00103) Даний винахід включає біспецифічні антитіла, здатні одночасно зв'язуватися з РО-1 і
СТІ А-4. Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу біспецифічне антитіло, здатне одночасно зв'язуватися з РО-1 і СТІ А-4, одержують за допомогою будь-якого зі способів, описаних у міжнародних публікаціях згідно з РСТ Мо МО 1998/002463, МО 2005/070966, УМО 2006/107786 МО 2007/024715, МО 2007/075270, МО 2006/107617, МО 2007/046893, МО 2007/146968, МО 2008/003103, МО 2008/003116, МО 2008/027236, МО 2008/024188, МО 2009/132876, МО 2009/018386, МО 2010/028797, МО2010028796, МО 2010/028795, МО 2010/108127, МО 2010/136172, МО 2011/086091, МО 2011/133886, МО 2012/009544, МО 2013/003652, МО 2013/070565, МО 2012/162583, МО 2012/156430, МО 2013/174873 і МО 2014/022540, кожна з яких у такий спосіб повністю включена у дану заявку за допомогою
Зо посилання.
В. Біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 діатіла без Ес-фрагментів 00104) Один варіант реалізації даного винаходу відноситься до біспецифічних діатіл, які містять та, найбільше переважно, складаються з, першого поліпептидного ланцюга та другого поліпептидного ланцюга, послідовності яких дозволяють поліпептгидним ланцюгам ковалентно зв'язуватися один з одним з утворенням ковалентно зв'язаного діатіла, яке здатне одночасно зв'язуватися з РО-1 і СТІ А-4.
ІЇ00105| Перший поліпептидний ланцюг такого варіанта реалізації біспецифічних діатіл містить "у напрямку від М-кінця до С-кінця) М-кінець, Мі -домен моноклонального антитіла, здатний зв'язуватися з РО-1 або СТІ А-4 (тобто МРО-1 або МІ СТІ А-4), перший проміжний спейсерний пептид (лінкер 1), МН-домен моноклонального антитіла, здатний зв'язуватися з
СТІ А-4 (якщо зазначений перший поліпептидний ланцюг містить МІ РО-1) або з РО-1 (якщо зазначений перший поліпептидний ланцюг містить МІ СТІ А-4), другий проміжний спейсерний пептид (лінкер 2), що необов'язково містить цистеїновий залишок, що стимулює утворення гетеродимеру домен, і С-кінець (Фігура 1). 00106) Другий поліпептидний ланцюг зазначеного варіанта реалізації біспецифічних діатіл містить "у напрямку від М-кінця до С-кінця) М-кінець, Мі -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 або СТІ А-4 (тобто Мі ро-ї або Мі стіл, де МІ -домен не включений у перший поліпептидний ланцюг діатіла), проміжний спейсерний пептид (лінкер 1), МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з СТІ А-4 (якщо зазначений другий поліпептидний ланцюг містить Мі гої) або з РО-1 (якщо зазначений другий поліпептидний ланцюг містить Мі стіл-4), другий проміжний спейсерний пептид (лінкер 2), що необов'язково містить цистеїновий залишок, що стимулює утворення гетеродимеру домен, і С-кінець (Фігура 1).
Ї00107| Мі-домен першого поліпептидного ланцюга взаємодіє з МН-доменом другого поліпептидного ланцюга з утворенням першого функціонального сайту зв'язування антигена, специфічного відносно першого антигена (тобто РО-1 або СТІА-4). Аналогічно, Мі-домен другого поліпептидного ланцюга взаємодіє з МН-доменом першого поліпептидного ланцюга з утворенням другого функціонального сайту зв'язування антигена, специфічного відносно другого антигена (тобто СТІ А-4 або РО-1). Таким чином, вибір МІ- і МН-доменів першого та 60 другого поліпептидних ланцюгів координують таким чином, щоб два поліпептидні ланцюги діатіла разом містили МІ- і МН-домени, здатні зв'язуватися як з епітопом РО-1, так і з епітопом
СТІ А-4 (тобто спільно містили Мі ро-1/УНро-ї і Мі сті а-а/МНеті Ал). (00108) Довжина проміжного лінкерного пептиду (лінкер 1, який розділяє зазначені МІі- і МН- домени) найбільше переважно вибрана таким чином, щоб по суті або повністю запобігати зв'язуванню МІ/- і МН-доменів поліпептидного ланцюга один з одним (наприклад, довжина проміжного лінкера становить від 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або 9 амінокислотних залишків). Таким чином, МІ- і МН-домени першого поліпептидного ланцюга по суті або повністю не здатні зв'язуватися один з одним. Аналогічно, Мі-- і МН-домени другого поліпептидного ланцюга по суті або повністю не здатні зв'язуватися один з одним. Переважний проміжний спейсерний пептид (лінкер 1) має послідовність (ЗЕО ІЮ МО:5): ОСОБОСОО. 00109) Довжину та склад другого проміжного спейсерного пептиду (лінкер 2) вибирають на основі вибору одного або більше поліпептидних доменів, що сприяють зазначеній димеризації (тобто "сприятливих утворенню гетеродимеру доменів"). Зазвичай другий проміжний спейсерний пептид (лінкер 2) містить 3-20 амінокислотних залишки. Зокрема, коли використовуваний стимулюючий утворення гетеродимеру домен (домени) містить/не містить цистеїновий залишок, використовується другий цистеїнвмісний проміжний спейсерний пептид (лінкер 2). Другий цистеїнвмісний проміжний спейсерний пептид (лінкер 2) містить 1, 2, З або більше цистеїнів. Переважний цистеїнвмісний спейсерний пептид (лінкер 2) має послідовність
ЗЕО Ір МО:6: особ. В якості альтернативи, Лінкер 2 не містить цистеїн (наприклад, ССС, свав (5ЕО І МО:7), ГГ асеавБа (5ЕО 0 МО:8), СсСсЗИаСсИаБИаСсаИ (5ЕО І МО:9), АБТКа (5ЕО
ІЮО МО:10), ГЕРКО5 (5ЕО ІО МО:11) ії т. д.), і використовується цистеїнвмісний стимулюючий утворення гетеродимеру домен, як описано нижче. Необов'язково, використовують як цистеїнвмісний лінкер 2, так і цистеїнвмісний стимулюючий утворення гетеродимеру домен. 00110) Стимулюючі утворення гетеродимеру домени можуть являти собою СМЕРКЗС (5ЕО
ІЮ МО:13), або МЕРКЗС (5ЗЕБО І МО:14), або АЕРКЗС (ЗЕБО ІЮ МО:15) на одному поліпептидному ланцюзі та ЗЕМКСОСЕС (ЗЕО ІЮ МО:16) або ЕМАЕСЕС (ЗЕО ІЮ МО:17) на іншому поліпептидному ланцюзі (052007/0004909).
ІЇ00111| Згідно з переважним варіантом реалізації винаходу стимулюючі утворення гетеродимеру домени містять тандемно повторювані спіральні домени з протилежним зарядом, наприклад, спіральні домени "Е-соїї" (ЗЕО ІЮ МО:18: ЕМААЇ ЕК-ЕМААЇ ЕК-ЕМААЇ ЕК-ЕМААЇ ЕК), глутаматні залишки яких будуть мати негативний заряд при рН 7, і "К-спіральні" домени (5ЕО 10
МО:19: КМААЇ КЕ-КМААЇ КЕ-КМААЇ КЕ-КМААЇ КЕ), лізинові залишки яких будуть мати позитивний заряд при рН 7. Присутність таких заряджених доменів сприяє зв'язуванню між першим і другим поліпептидами і, таким чином, сприяє утворенню гетеродимеру. Можна застосовувати стимулюючі утворення гетеродимеру домени, які містять такі модифікації описаних вище послідовностей Е-сої і К-соїЇ, які забезпечують включення одного або більше цистеїнових залишків. Присутність таких цистеїнових залишків допускає ковалентне зв'язування спірального домену, присутнього на одному поліпептидному ланцюзі, з комплементарним спіральним доменом, присутнім на іншому поліпептидному ланцюзі, забезпечуючи, у такий спосіб ковалентне зв'язування поліпептидних ланцюгів один з одним і підвищуючи стабільність діатіла. Приклади таких переважних стимулюючих утворення гетеродимеру доменів, зокрема, включають модифікований домен Е-соїї, що має амінокислотну послідовність ЕМААСЕК-
ЕМААЇ ЕК-ЕМААГЕК-ЕМААГ ЕК (5БО 10 МО:20), ії модифікований домен К-соїї, що має амінокислотну послідовність КМУАДАСКЕ-КМААЇ КЕ-КМААЇ КЕ-КМААЇ КЕ (5ЕО 10 МО 21).
ІЇ00112| Як описано у міжнародній публікації патентної заявки МО 2012/018687, для поліпшення фармакокінетичних властивостей діатіл іп мімо, діатіло можна модифікувати таким чином, щоб воно містило поліпептидну частину білка, що зв'язується із сироваткою крові, на одному або більше кінцях зазначеного діатіла. У найбільше переважному варіанті така поліпептидна частина білка, що зв'язується із сироваткою, додана на С-кінці діатіла. Альбумін являє собою найпоширеніший білок у плазмі крові, час напівжиття якого в людей становить 19 діб. Альбумін містить декілька сайтів зв'язування малих молекул, які дозволяють йому нековалентно зв'язуватися з іншими білками й у такий спосіб збільшувати їх час напівжиття в сироватці. Альбумін-сполучний домен З (АВОЗ) білка С штаму 5ігеріососси5 (3148 складається з 46 амінокислотних залишків, що утворюють стабільну трьохспиральну нитку, і має високу специфічність зв'язування з альбуміном (Чопап5зоп, М.О. еї а. (2002) "Бігисіиге, Зресійсйну, Апа
Моде ОЇ Іпіегасіп Рог Васіевгіа! АІритіп-Віпаїпуд Модшіев," У. Віої. Спет. 277(10):8114-8120).
Таким чином, переважна поліпептидна частина білка, що зв'язується з сироваткою крові, для поліпшення фармакокінетичних властивостей діатіла іп мімо, являє собою альбумін-сполучний домен 3 (АВОЗ) білка б штамма Бігеріососсиз (148 (5БО І МО:г22): І АЕЄАКМІ АМА 60 ЕГОКМаМ5ОМ УКМІПОМАКО АЕСМУКАГІОЕ ІГААЇ Р.
Ї00113| Як описано у міжнародній публікації патентної заявки УМО 2012/162068 (яка включена у дану заявку за допомогою посилання), "деімунізовані" варіанти ЗЕО ІО МО:22 здатні послабляти або запобігати зв'язуванню ГКГС класу ІІ. За результатами комбінування мутацій наступні комбінації замін вважаються переважними для утворення такого деімунізованого АВО: 660/705-71А; 665/7055471А; 665/705579А; 64А/65А/71А; 64А/65А/71А-665; 64А/65А/71А-660; 64А/65А/71Ач466Е; 64А/65А/79А-665; 64А/65А/79А-660; 64А/65А/79А-66Е. Варіанти АВО, що мають модифікації /64А, Іб65А і 079А, або модифікації Мбб65, 7705 і 079А. Варіант деімунізованого АВО, що має амінокислотну послідовність:
ГАЄАКМІАМА ЕГОКМаУБОМ КМ ОввМАКо»о А" ЕСУКАПІОЕ ІГААЇГ Р (ЗЕО І МО:23), або амінокислотну послідовність:
ГАЄАКМІАМА ЕГОКМаУЗОМ МКМАваАєММАКТ МЕСУКАПІА?»Е ІГААЇ Р (ЗЕО ОО МО:24), або амінокислотну послідовність:
ГАЄАКМІАМА ЕГОКМаУБОМ УКМІ ІЗввМАКО?о МЕСУКАПІА?»Е ІГААЇ Р (ЗЕО 10 МО:25), зокрема, є переважними для використання в якості такого деімунізованого АВО і по суті проявляють зв'язування, що відповідає зв'язуванню молекули дикого типу, забезпечуючи при цьому ослаблення зв'язування молекул МНС класу ІІ. Таким чином, перший поліпептидний ланцюг такого діатіла, що містить АВО, містить третій лінкер (лінкер 3), переважно розташований з боку С-кінця стосовно домену Е-сої (або К-соїЇ) такого поліпептидного ланцюга таким чином, що розташовується між доменом Е-сої! (або К-соїЇ) й АВО (який переважно являє собою деімунізований АВО). Переважна послідовність для такого лінкера З являє собою 5ЕО ІЮ
МмО:7: ца.
С. Біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 діатіла, що містять
Ес-фрагменти 00114) Один варіант реалізації даного винаходу відноситься до біспецифічних діатіл, що містять Ес-фрагмент здатних одночасно зв'язуватися з РО-1 і СТІ А-4. Додавання домену СН2-
СНЗ ІдС до одного або обох з поліпептидних ланцюгів діатіла таким чином, що об'єднання ланцюгів зазначеного діатіла призводить до утворення Ес-фрагмента, підвищує біологічний час напівжиття та/або змінює валентність діатіла. Включення доменів СН2-СНЗ ІдсС в обидва поліпептидні ланцюги зазначеного діатіла дозволяє утворення дволанцюгового біспецифічного
Зо діатіла, що містить Ес-фрагмент (Фігура 2).
ІЇ00115| В якості альтернативи, включення доменів СН2-СНЗ дес тільки в один із поліпептидних ланцюгів діатіла дає можливість утворення більше складного чотирьохланцюгового біспецифічного діатіла, що містить Ес-фрагмент (Фігури ЗА-3С). На Фігурі
ЗС показане типове чотирьохланцюгове діатіло, що містить константний домен легкого ланцюга (СІ) та константний домен важкого ланцюга СНІ, однак в якості альтернативи можна застосовувати фрагменти таких доменів, а також інших поліпептидів (див. наприклад, Фігури ЗА і ЗВ, публікації патентів США Мо 2013-0295121; 2010-0174053 і 2009-0060910; публікації європейських патентів Мо ЕР 2714079; ЕР 2601216; ЕР 2376109; ЕР 2158221 їі міжнародні публікації згідно з РСТ Мо УМО 2012/162068; УМО 2012/018687; УМО 2010/080538). Таким чином, наприклад, замість домену СНІ можна застосовувати пептид, що має амінокислотну послідовність СМЕРКБЗО (ЗЕО ІЮ МО: 13), МЕРК5О (5ЕО ІЮО МО:14) або АЕРКБО (5ЕО ІЮО МО:15), отриманий з шарнірної ділянки Їд людини, а замість домену Сі можна застосовувати 6 С- кінцевих амінокислот легкого каппа-ланцюга імуноглобуліну людини, ЗЕМКОЕС (ЗЕО І МО:16) або ЕМАСЕС (ЗЕО ІЮ МО:17). Типове пептид-вмісне чотирьохланцюгове діатіло показане на
Фігурі ЗА. В якості альтернативи або додатково можна застосовувати пептид, що містить тандемні спіральні домени з протилежним зарядом, такі як спіральні домени "Е-сої!" (ЗЕО ІЮ
МО:18: ЕМААЇ ЕК-ЕМААЇ ЕК-ЕМААГ ЕК-ЕМААГЕК або 5ЕО ІЮ МО:19: ЕМААСЕК-ЕМААЇ ЕК-
ЕМААЇ ЕК-ЕМААЇ ЕК) і домени "К-сої" (ЗЕО ІЮ МО:20: КМААЇ КЕ-КМААЇ КЕ-КМААЇ КЕ-КМААЇ КЕ або 5ЕО І МО:21: КМААСКЕ-КМААЇ КЕ-КМААЇІ КЕ-КМААЇ КЕ). Приклад чотирьохланцюгового діатіла, що містить спіральний домен показаний на Фігурі ЗВ. (00116) Біспецифічні молекули, що містять Ес-фрагмент, згідно з даним винаходом можуть містити додаткові проміжні спейсерні пептиди (лінкери). Такі лінкери зазвичай вбудовують між стимулюючим утворення гетеродимеру доменом пептиду (наприклад, Е-соїї або К-соїї) і доменами СН2-СНЗ і/або між доменами СН2-СНЗ і варіабельним доменом (тобто МН або МІ).
Зазвичай додаткові лінкери містять 3-20 амінокислотних залишків. Лінкери, які можна застосовувати у біспецифічних молекулах, що містять Ес-фрагмент діатіла згідно з даним винаходом включають: (3030435 (5ЕО ІЮ МО:7), а4савБва (5ЕО Ір МОс8), асОоБОСаБацоа (5ЕО
ІО МО:9), АБТКа (5ЕО ІЮ МО:10), ОКТНТОСРРСР (5ЕО ІЮ МО:26), ЕРКЗОСОКТНТСРРОСР (5ЕО І
МО:27), ГЕРКБ5 (5ЕБО І МО 1), АРБББ5 (5ЕБО ІЮ МО:28) і АР55ЗРМЕ (5ЕО І МО:29), 60 ГЕРКЗБАЮКТНТСРРО 5ЕО ІЮ МО:30), ССС і 00. 5ЕО 1О МО:11 можна застосовувати замість соб або бос для полегшення клонування. Крім того, за амінокислотами ОО або 5ЕО І
МО:11 може відразу слідувати послідовність ЗЕ ІЮ МО:26 з утворенням альтернативних лінкерів: СОСОКТНТСРРСР (5БО ІО МО:31) і ГЕРК5БОКТНТСРРСР (5БО 10 МО:32).
Біспецифічні молекули, що містять Ес-фрагмент, згідно з даним винаходом можуть включати шарнірну ділянку (3 на додаток до лінкеру або замість нього. Приклади шарнірних ділянок включають: ЕРКЗЕСОКТНТСРРСР (5ЕО ІО МО:33) з (901, ЕВКССУЕСРРСОР (ЗЕО ІЮ МО:34) з
Ідсе, ЕЗКМОРРСОРБСР (ЗЕО ІЮ МО:35) з 9064 і ЕЗЄКУОРРСОРРОСР (ЗЕО ІЮО МО:36) варіант шарнірної ділянки Ідс4, що містить стабілізуючу заміну 5228Р (при нумерації відповідно до ЄО- індексу за Кабатом) для зниження швидкості обміну ланцюгів.
І00117| Як показано на фігурах ЗА-ЗС, біспецифічні діатіла, що містять Ес-фрагмент, згідно з винаходом можуть містити чотири різні ланцюги. Перший та третій поліпептидні ланцюги такого діатіла містять три домени: (ї) МІ 1-вмісний домен, (ії) МН2-вмісний домен, (ії) стимулюючий утворення гетеродимеру домен і (ім) домен, що містить послідовність СН2-СНЗ. Другий та четвертий поліпептидні ланцюги містять: (ії) МІ 2-вмісний домен, (ії) МН1-вмісний домен і (ії) стимулюючий утворення гетеродимеру домен, де зазначені стимулюючі утворення гетеродимеру домени сприяють димеризації першого/третього поліпептидних ланцюгів із другим/четвертим поліпептидними ланцюгами. Домени Мі і/або МН третього та четвертого поліпептидних ланцюгів і домени МІ і/або МН першого та другого поліпептидних ланцюгів можуть бути однаковими або можуть різнитися таким чином, щоб дозволяти тетравалентне зв'язування, яке є моноспецифічним, біспецифічним або тетраспецифічним. Позначення "МІ 3" і "МНУ" відносяться, відповідно, до варіабельного домену легкого ланцюга та варіабельного домену важкого ланцюга зазначеного діатіла, які зв'язуються з "третім" епітопом. Аналогічно, позначення "Мі 4" ії "МН4" відносяться, відповідно, до варіабельного домену легкого ланцюга та варіабельного домену важкого ланцюга зазначеного діатіла, які зв'язуються з "четвертим" епітопом. Загальна структура поліпептидних ланцюгів типових чотирьохланцюгових біспецифічних діатіл, що містить Ес-фрагмент, згідно з винаходом представлена в Таблиці 1:
Таблиця 1 молекула 7
НРО - Стимулюючий утворення гетеродимеру домен
Коо) 00118) Згідно з конкретним варіантом реалізації винаходу діатіла згідно з даним винаходом являють собою біспецифічні тетравалентні (тобто такі, що мають чотири сайти зв'язування епітопу) Ес-вмісні діатіла, які складаються з чотирьох (загальне число) поліпептидних ланцюгів (Фігури ЗА-3С). Біспецифічні тетравалентні Ес-вмісні діатіла згідно з винаходом містять два сайти зв'язування епітопу, що мають імуноспецифічність по відношенню до РО-1 (які можуть бути здатні зв'язуватися з одним або з різними епітопами РО-1), і два сайти зв'язування епітопу, що мають імуноспецифічність по відношенню до СТІ А-4 (які можуть бути здатні зв'язуватися з одним або з різними епітопами СТІ А-4). 001191 Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу біспецифічні діатіла, що містять Ес- фрагмент можуть містити три поліпептидні ланцюги. Перший поліпептид такого діатіла містить три домени: (ї) МІ. 1-вмісний домен, (ії) МН2-вмісний домен і (ії) домен, що містить послідовність
СН2г-СНЗ. Другий поліпептид такого діатіла містить: (ї) Мі 2-вмісний домен, (її) МНІ1-вмісний домен і (ії) домен, що сприяє гетеродимеризації й утворенню ковалентного зв'язку з першим поліпептидним ланцюгом зазначеного діатіла. Третій поліпептид такого діатіла містить послідовність СН2-СНЗ. Таким чином, перший та другий поліпептидні ланцюги такого діатіла з'єднуються разом з утворенням сайту зв'язування МІ 1//Нт, який здатний зв'язуватися з першим епітопом (тобто РО-1 або СТІ А-4), а також сайту зв'язування МІ 2//Н2, який здатний зв'язуватися з другим епітопом (тобто СТІ А-4 або РО-1). Перший та другий поліпептиди зв'язані один з одним через дисульфідний зв'язок, що включає цистеїнові залишки у відповідних третіх доменах. Слід зазначити, що перший та третій поліпептидні ланцюги поєднуються один з одним з утворенням Ес-фрагмента, який стабілізується через дисульфідний зв'язок. Такі біспецифічні діатіла мають підвищену активність. На Фігурах 4А і 4В показані структури таких діатіл. Такі біспецифічні діатіла, що містять Ес-фрагмент можуть мати будь-яку з двох орієнтацій (Таблиця 2):
Таблиця 2
НРО - Стимулюючий утворення гетеродимеру домен 001201 Згідно з конкретним варіантом реалізації винаходу діатіла згідно з даним винаходом являють собою біспецифічні бівалентні (тобто такі, що містять два сайти зв'язування епітопу)
Ес-вмісні діатіла, які в загальному складаються з трьох поліпептидних ланцюгів (Фігури 4А-4В).
Біспецифічні бівалентні Есо-вмісні діатіла згідно з винаходом містять один сайт зв'язування епітопу, що має імуноспецифічність по відношенню до РО-1, й один сайт зв'язування епітопу, що має специфічність по відношенню до СТІ А-4. 00121) Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу біспецифічні діатіла, що містять Ес- фрагмент можуть в загальному містити п'ять поліпептидних ланцюгів. Згідно з конкретним варіантом реалізації винаходу два з п'яти поліпептидних ланцюгів мають однакову амінокислотну послідовність. Перший поліпептидний ланцюг такого діатіла містить: (ї) МН1- вмісний домен, (ії) СНІ1-вмісний домен і (ії) домен, що містить послідовність СН2-СНЗ. Перший поліпептидний ланцюг може являти собою важкий ланцюг антитіла, який містить УНІ і константну область важкого ланцюга. Другий та п'ятий поліпептидні ланцюги такого діатіла містять: (і) МІ 1-вмісний домен і (ії) СІі-вмісний домен. Другий та/або п'ятий поліпептидні ланцюги такого діатіла можуть являти собою легкі ланцюги антитіла, які містять МІ1, комплементарний
МНІ першого/третього поліпептидного ланцюга. Перший, другий та/або п'ятий поліпептидні
Зо ланцюги можуть бути виділені з природного антитіла. В якості альтернативи, зазначені ланцюги можуть бути сконструйовані рекомбінантним шляхом. Третій поліпептидний ланцюг такого діатіла містить: (ї) МНІ-вмісний домен, (її) СНІ1-вмісний домен, (ії) домен, що містить послідовність СН2-СНЗ, (ім) Мі 2-вмісний домен, (м) МНЗ-вмісний домен і (мі) стимулюючий утворення гетеродимеру домен, де зазначені стимулюючі утворення гетеродимеру домени сприяють димеризації третього ланцюга з четвертим ланцюгом. Четвертий поліпептид таких діатіл містить: (ї) Мі З-вмісний домен, (її) МН2-вмісний домен і (ії) домен, що сприяє гетеродимеризації, й утворює ковалентний зв'язок із третім поліпептидним ланцюгом зазначеного діатіла.
І00122| Таким чином, перший, другий, третій та п'ятий поліпептидні ланцюги таких діатіл з'єднуються разом з утворенням двох сайтів зв'язування МІ1//Н1, здатних зв'язуватися з першим епітопом. Третій та четвертий поліпептидні ланцюги таких діатіл зв'язуються разом з утворенням сайту зв'язування МІ 2//Н2, який здатний зв'язуватися з другим епітопом, а також сайту зв'язування МІ З//НЗ, який здатний зв'язуватися з третім епітопом. Перший та третій поліпептиди зв'язані один з одним через дисульфідний зв'язок, що включає цистеїнові залишки у відповідних константних областях. Слід зазначити, що перший та третій поліпептидні ланцюги поєднуються один з одним з утворенням Ес-фрагмента. Такі біспецифічні діатіла мають підвищену активність. На Фігурі 5 показана структура таких діатіл. Слід розуміти, що домени
МІЛЛ/НІ, МІ 2//Н2 ії МЗЛ/НЗ можуть бути однаковими або можуть різнитися таким чином, щоб дозволити зв'язування, яке є моноспецифічним, біспецифічним або триспецифічним. Однак, як запропоновано у даній заявці, зазначені домени переважно вибрані таким чином, щоб забезпечувати зв'язування з РО-1 і СТІ А-4. 00123) МІ-- ї МнН-домени поліпептидних ланцюгів вибрані таким чином, щоб утворювати сайт зв'язування МІ //Н, специфічний по відношенню до бажаного епітопу. МІ Л/Н сайти зв'язування, утворені шляхом поєднання поліпептидних ланцюгів, можуть бути однаковими або різнитися таким чином, щоб дозволяти тетравалентне зв'язування, яке є моноспецифічним, біспецифічним, триспецифічним або тетраспецифічним. Зокрема, МіІ- і МН-домени можуть бути вибрані таким чином, що біспецифічне діатіло може містити два сайти зв'язування для першого епітопу та два сайти зв'язування для другого епітопу або три сайти зв'язування для першого епітопу й один сайт зв'язування для другого епітопу або два сайти зв'язування для першого епітопу, один сайт зв'язування для другого епітопу й один сайт зв'язування для третього епітопу (як зображено на Фігурі 5). Загальна структура поліпептидних ланцюгів типових п'ятиланцюгових діатіл, що містять Ес-фрагмент, згідно з винаходом представлена в Таблиці 3:
Таблиця З
МНо-МІ 1-СІ-СООН . ше МнНоМНІ-СНІ-СН2г-снНЗ-сОооНн
Біспецифічні молекули (2 х 2) МН»-УНІ-СНІ-СН2-СНЗ-МІ 2-УН2-НРО-СООН
МНо-МІ.1-СІ-СООоН
МН2-МІ 2-УН2-НРО-СООН
МН»-МІ 1-СІ-СООН
МнН»-уні-сні-сно-снЗ-СооН
Біспецифічні МН»-УНІ-СНІ-СН2-СНЗ-Мі 1-УН2-НРО-СООН молекули (3 х 1)
Мне могоссоон
МНо-МІ 2-УНІ-НРО-СООН
Мне могоссоон
МН»-уУніІ-СНіІ-Сно-СНЗ-СООН молекули (2 х 1х1) З-іїій ланцюг МнНоМНІ-СНІ1-СН2г-СНЗ-МІ 2-УНЗ-НРО-СООН
МНе-Мі1-СІ-СООН
МнНо-МІ 3-УН2г-НРО-СООН
НРО - Стимулюючий утворення гетеродимеру домен
І00124| Згідно з конкретним варіантом реалізації винаходу діатіла згідно з даним винаходом являють собою біспецифічні тетравалентні (тобто такі, що містять чотири сайти зв'язування епітопу) Ес-вмісні діатіла, які складаються з п'яти (загальне число) поліпептидних ланцюгів, що містять два сайти зв'язування епітопу, що мають імуноспецифічність по відношенню до РО-1 (які можуть бути здатні зв'язуватися з одним або з різними епітопами РО-1) і два сайти зв'язування епітопу, специфічних по відношенню до СТІ А-4 (які можуть бути здатні зв'язуватися з одним або з різними епітопами СТІ А-4). Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу біспецифічні тетравалентні Ес-вмісні діатіла згідно з винаходом містять три сайти зв'язування епітопу, що мають імуноспецифічність по відношенню до РО-1 (які можуть бути здатні
Зо зв'язуватися з одним або з двома або трьома різними епітопами РО-1) й один сайт зв'язування епітопу, специфічний по відношенню до СТІ А-4. Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу біспецифічні тетравалентні Ес-вмісні діатіла згідно з винаходом містять один сайт зв'язування епітопу, що має імуноспецифічність по відношенню до РО-1, і три сайти зв'язування епітопу,
специфічних по відношенню до СТІ А-4 (які можуть бути здатні зв'язуватися з одним або з двома або трьома різними епітопами СТІ А-4). р. Біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 трьохвалентні сполучні молекули, що містять Ес-фрагменти
І00125| Додатковий варіант реалізації даного винаходу відноситься до біспецифічних трьохвалентних сполучних молекул, що містять Ес-фрагмент, здатних одночасно зв'язуватися з епітопом РО-1 й епітопом, присутнім на СТІ А-4. Такі біспецифічні трьохвалентні сполучні молекули містять три сайти зв'язування епітопу, два з яких являють собою домени зв'язування по типу діатіла, які забезпечують сайт зв'язування А і сайт зв'язування В, й один з яких являє собою домен зв'язування по типу Раб-фрагмента (або домен зв'язування типу 5сЕм), який забезпечує сайт зв'язування С (див. наприклад, Фігури бА-6Е і заявки РСТ Мо РСТ/О515/33081 і
РСТ/О515/33076). Такі біспецифічні трьохвалентні молекули, таким чином, містять домени "МІ1"МНІ", які здатні зв'язуватися з першим епітопом, домени "МІ/2""МН2", які здатні зв'язуватися з другим епітопом, і домени "МІ 3" ії "МНЗ", які здатні зв'язуватися з "третім" епітопом такої трьохвалентної молекули. "Домен зв'язування по типу діатіла" являє собою тип сайту зв'язування епітопу, присутнього на діатілі та, зокрема, діатілі ФАКТ, як описано вище.
Кожний з "домену зв'язування по типу Бар" і "домену зв'язування по типу 5сСЕм" являє собою сайт зв'язування епітопу, який утворюється шляхом взаємодії Мі-домену легкого ланцюга імуноглобуліну та комплементарного МН-домену важкого ланцюга імуноглобуліну. Домени зв'язування по типу Бар відрізняються від домену зв'язування по типу діатіла тим, що два поліпептидні ланцюги, які утворюють домен зв'язування по типу Раб, містять тільки один сайт зв'язування епітопу, тоді як два поліпептидні ланцюги, які утворюють домен зв'язування типу діатіла містять щонайменше два сайти зв'язування епітопу. Аналогічно, домени зв'язування по типу 5сЕм також відрізняються від домену зв'язування по типу діатіла тим, що вони містять тільки один сайт зв'язування епітопу. Таким чином, при використанні у даній заявці домени зв'язування по типу Раб і по типу зсЕм відрізняються від домену зв'язування по типу діатіла. 00126) Зазвичай трьохвалентні сполучні молекули згідно з даним винаходом містять чотири різні поліпептидні ланцюги (див. Фігури бА-6В), однак молекули можуть містити меншу або більшу кількість поліпептидних ланцюгів, наприклад, в результаті злиття таких поліпептидних
Зо ланцюгів один з одним (наприклад, через пептидний зв'язок) або в результаті поділу таких поліпептидних ланцюгів з утворенням додаткових поліпептидних ланцюгів або в результаті поєднання меншої кількості або додаткових поліпептидних ланцюгів через дисульфідні зв'язки.
Фігури 6С-6Е ілюструють зазначений аспект даного винаходу за допомогою схематичного зображення таких молекул, що містять три поліпептидні ланцюги. Як представлено на Фігурах бА-6Е, трьохвалентні сполучні молекули згідно з даним винаходом можуть мати альтернативні варіанти орієнтації, при яких домен зв'язування по типу діатіла розташований з боку М-кінця (Фігури 6бА, 6С і 60) або С-кінця (Фігури 68, 6Е і 6Е) стосовно Ес-фрагмента.
І00127| Згідно з конкретними варіантами реалізації перший поліпептидний ланцюг таких трьохвалентних сполучних молекул згідно з даним винаходом містить: (і) МІ 1-вмісний домен, (ії)
УНа-вмісний домен, (ії) стимулюючий утворення гетеродимеру домен і (ім) домен, що містить послідовність СН2-СНЗ. Домени МІ1 ії МІ/2 розташовані з боку М-кінця або з боку С-кінця стосовно СН2-СНЗ-вмісного домену, як представлено в Таблиці 4 (див. також Фігури бА і 68).
Другий поліпептидний ланцюг таких варіантів реалізації трьеохвалентних сполучних молекул містить: (і) МіІ/2-вмісний домен, (ії) МНІ-вмісний домен і (ії) стимулюючий утворення гетеродимеру домен. Третій поліпептидний ланцюг таких варіантів реалізації трьеохвалентних сполучних молекул містить: (|) МНЗ-вмісний домен, (ії) СНІ-вмісний домен і (ії) домен, що містить послідовність СН2-СНЗ. Третій поліпептидний ланцюг може являти собою важкий ланцюг антитіла, який містить УНЗ і константну область важкого ланцюга, або поліпептид, який містить зазначені домени. Четвертий поліпептид таких варіантів реалізації містить: (і) МІ 3- вмісний домен і (ії) Сі -вмісний домен. Четверті поліпептидні ланцюги можуть являти собою легкий ланцюг антитіла, який містить МІ 3, комплементарний УМНЗ третьому поліпептгидному ланцюгу, або поліпептид, який містить зазначені домени. Третій або четвертий поліпептидний ланцюг може бути виділений з природних антитіл. В якості альтернативи, зазначені поліпептидні ланцюги можуть бути створені рекомбінантним шляхом, синтетичним шляхом або іншими способами. (00128) Варіабельний домен легкого ланцюга першого та другого поліпептидних ланцюгів відділені від варіабельних доменів важкого ланцюга зазначених поліпептидних ланцюгів за допомогою проміжного спейсерного пептиду, довжина якого занадто мала, щоб дозволити доменам МІ1/Л/Н2 (або доменам МІ2Л/НІ) зазначених ланцюгів з'єднуватися з утворенням бо сайту зв'язування епітопу, здатного зв'язуватися або з першим, або з другим епітопом.
Зо
Переважний проміжний спейсерний пептид (лінкер 1), використовуваний для цієї мети, має послідовність (БЕО ІЮ МО:5): зсоОо5505050. Інші домени трьохвалентних сполучних молекул можуть бути розділені одним або більше проміжними спейсерними пептидами (лінкерами), що необов'язково містять цистеїновий залишок. Зокрема, як представлено вище, такі лінкери, як правило, вбудовані між варіабельними доменами (тобто МН або Мі) і пептидними стимулюючими утворення гетеродимеру доменами (наприклад, Е-соїЇ або К-соїЇ) і між такими пептидними стимулюючими утворення гетеродимеру доменами (наприклад, Е-соїЇ або К-соїЇ) і доменами СН2-СНЗ. Приклад лінкерів, застосованих для створення трьоохвалентних сполучних молекул, представлені вище та також описані в заявках згідно з РСТ Мо: РСТ/О515/33081 і
РСТ/О515/33076. Таким чином, перша та друга поліпептидні ланцюги такої трьохвалентної сполучної молекули зв'язуються разом з утворенням сайту зв'язування МІ1/УНІ, здатного зв'язуватися з першим епітопом, а також сайту зв'язування Мі 2//Н2, який здатний зв'язуватися з другим епітопом. Третій та четвертий поліпептидні ланцюги таких трьеохвалентних сполучних молекул зв'язуються разом з утворенням сайту зв'язування МІ ЗЛ/НЗ, який здатний зв'язуватися з третім епітопом.
І00129| Як описано вище, трьохвалентні сполучні молекули згідно 3 даним винаходом можуть містити три поліпептиди. Трьохвалентні сполучні молекули, що містять три поліпептидні ланцюги, можна одержувати шляхом зв'язування доменів четвертого поліпептиду, розташованих з боку М-кінця стосовно УНЗ-вмісного домену третього поліпептиду (наприклад, за допомогою проміжного спейсерного пептиду (лінкера 4)) В якості альтернативи, використовують третій поліпептидний ланцюг трьохвалентної сполучної молекули згідно з винаходом, що містить наступні домени: (ї) МІ З-вмісний домен, (її) МНЗ-вмісний домен |і (іїї) домен, що містить послідовність СН2-СНЗ, де МІЗ ї МНЗ відділені один від одного проміжним спейсерним пептидом, довжина якого є достатньою (становить щонайменше 9 або більше амінокислотних залишків) для можливості сполучення зазначених доменів з утворенням сайту зв'язування епітопу. Один переважний проміжний спейсерний пептид, який можна застосовувати для цієї мети, має послідовність: Осо 5ОСс(ОО5(О(С((0О5 (ЗЕО ІЮ МО:37). 00130) Слід розуміти, що домени МІ1ТЛ/НІ, МІ 2//Н2 і МІЗ//НЗ таких трьохвалентних сполучних молекул можуть різнитися, забезпечуючи можливість зв'язування, яке є
Зо біспецифічним або триспецифічним. Однак, як запропоновано у даній заявці, зазначені домени вибрані таким чином, щоб забезпечувати трьохвалентну сполучну молекулу, здатну зв'язуватися з РО-1 і СТІ А-4. 001311) Зокрема, МІ- і МнН-домени можуть бути вибрані таким чином, щоб трьохвалентна сполучна молекула містила два сайти зв'язування РО-1 (які можуть бути здатні зв'язуватися з одним епітопом РО-1 або з різними епітопами РО-1) й один сайт зв'язування СТІ А-4, або один сайт зв'язування РО-1 і два сайти зв'язування СТІ А-4 (які можуть бути здатні зв'язуватися з одним епітопом СТІ А-4 або з різними епітопами СТІ А-4), або один сайт зв'язування для РО-1, один сайт зв'язування для СТІ А-4 й один сайт зв'язування для третього антигена, який не являє собою РО-1 або СТІ А-4. Загальна структура поліпептидних ланцюгів типових трьеохвалентних сполучних молекул згідно з винаходом представлена на фігурах бА-6Е і в Таблиці 4:
Таблиця 4
Чотирьохланцюгова - орієнтації
Чотирьохланцюгова - орієнтації
Таблиця 4 1-й варіант
НРО - Стимулюючий утворення гетеродимеру домен
Ї00132| Один варіант реалізації даного винаходу відноситься до біспецифічних трьохвалентних сполучних молекул, які містять два сайти зв'язування епітопу для РО-1 й один сайт зв'язування епітопу для СТІ А-4. 00133) Два сайти зв'язування епітопу для РО-1 можуть зв'язуватися з одним епітопом або різними епітопами. Інший варіант реалізації даного винаходу відноситься до біспецифічних трьохвалентних сполучних молекул, які містять один сайт зв'язування епітопу для РО-1 і два сайти зв'язування епітопу для СТІ А-4. Два сайти зв'язування епітопу для СТІ А-4 можуть зв'язуватися з одним епітопом або з різними епітопами СТІ А-4. Як описано вище, такі біспецифічні трьохвалентні сполучні молекули можуть містити три, чотири, п'ять або більше поліпептидних ланцюгів.
М. Константні домени і Ес-фрагменти 00134) У даній заявці запропоновані константні домени антитіла, застосовані для створення біспецифічних по відношенню до РО-1ї х СТІ А-4 молекул (наприклад, антитіл, діатіл, трьохвалентних сполучних молекул і т. д.) згідно з винаходом.
І00135| Переважний домен Сі являє собою Сі -домен каппа дб людини. Амінокислотна послідовність прикладу домену Сі -домену каппа людини являє собою (5ЕО 10 МО:38):
ВТУМААРБУРІ ЕРРБОЕОЇ КЗ аТАБУМСІЇ М МЕМРВАВЕАКМО МУКУМОМАГОБО МБОЕЗМУТЕОЮ
ЗКОБТУБІ 55 ТІ ТІ ЗКАЮМЕ КНКУМАСЕМТ НОСІ 55РУТК 5БЕМАИаЕС
І00136| В якості альтернативи, приклад Сі-домену являє собою Сі-домен лямбда до людини. Амінокислотна послідовність прикладу СІ -домену лямбда людини являє собою (5ЕО
ІО МО:39):
ОРКААРБЗМТІ ЕРРОЗБЕБГ ОА МКАТІ МСІІ5 ОЕМРОАМТМА МУКАОБЗОРУКА СМЕТТРОКО5
ММКУААБОМІ ЗІ ТРЕОМУКЗН АЗУЗСОМУТНЕ 5ТМЕКТМУАР ТЕС
І00137| Як запропоновано у даній заявці, біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з винаходом можуть містити Ес-фрагмент. Ес-фрагмент таких молекул згідно з винаходом може відноситися до будь-якого ізотипу (наприклад, Ідс1, Ідс2, ІдоЗ або Ідса).
Біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з винаходом можуть додатково містити СНІ1-домен і/або шарнірну ділянку. СНІ1-домен і/або шарнірна ділянка при їх наявності можуть відноситися до будь-якого ізотипу (наприклад, Іде, Ідс2, ІдДеЗ або Ідс4і) і переважно відносяться до того самого ізотипу, що і бажаний Ес-фрагмент.
ІЇ00138| Приклад СНі-домену являє собою СН домен Ідс1 людини. Амінокислотна послідовність прикладу СНІ домену ІдДО1 людини являє собою (5ЕО ІЮ МО:40):
АЗТКОРОМЕР ГАРБЗКОТООа СТААГОЯСІ МК ОМЕРЕРУТУ5 М/МЗОАІ ТОМ НТЕРАМ О55
СІ М5І 55УМТ МРБЗБЗЗІ аТОТ МІСМУМНКРЗ МТКМОКАМ
Ї00139| Приклад СНі-домен являє собою СН домен Ідб2 людини. Амінокислотна послідовність прикладу СНІ домену Ідое2 людини являє собою (5ЕО ІЮ МО:41):
АЗБТКОРОМЕР ГАРСЗА5ОТОЕ ЗТААГОСІ МК ОМЕРЕРМТУ5 М/МБЗОАІ ТИМ НТЕРАМІ О55
СІ М51 5554МТ МРЗЗМЕатТОТ УТОММОнНКкРЗ МТКМОКТУ
ІЇ00140| Приклад СНІ-домену являє собою домен СНІ Ідб4 людини. Амінокислотна послідовність прикладу СНІ1-домену Ідо4 людини являє собою (5ЕО 10 МО 42):
АЗБТКОРОМЕР ГАРСЗА5ОТОЕ ЗТААГОСІ МК ОМЕРЕРМТУ5 М/МБЗОАІ ТИМ НТЕРАМІ О55
СІ М5І 55УМТ МРБЗБЗЗІ акт УТОММОонНКкРЗ МТКМОКАМ
І00141| Один приклад шарнірної ділянки являє собою шарнірну ділянку ЇДС1 людини.
Амінокислотна послідовність прикладу шарнірної ділянки ЇД01 людини являє собою (5ЕО І
МО:33): ЕРК5СОКТНТСРРОР.
І00142| Інший приклад шарнірної ділянки являє собою шарнірну ділянку ЇДб2 людини.
Амінокислотна послідовність прикладу шарнірної ділянки Ї9052 людини являє собою (5ЕО І
МО:34): ЕВКССМЕСРРСР. 00143) Інший приклад шарнірної ділянки являє собою шарнірну ділянку ЇдД04 людини.
Амінокислотна послідовність прикладу шарнірної ділянки Ї9054 людини являє собою (5ЕО І
МО:35): ЕЗКУСОРРОСРЗСР. Як описано у даній заявці, шарнірна ділянка ІдсС4 може містити стабілізуючу мутацію, таку як заміна 5228Р. Приклад амінокислотної послідовності стабілізованої шарнірної ділянки Їдс4 являє собою (ЗЕО ІЮ МО:36): ЕЗКУСРРСРРОСР.
І00144| ЕРс-фрагмент молекул, що містять Ес-фрагмент (наприклад, антитіл, діатіл, трьохвалентних молекул і т. д.) згідно з даним винаходом може являти собою повний Ес- фрагмент (наприклад, повний Ес-фрагмент дос) або тільки частину Ес-фрагмента.
Необов'язково Ес-фрагмент молекули, що містить Ес-фрагмент згідно з даним винаходом не містить С-кінцевий амінокислотний залишок, що являє собою лізин. 00145) У класичних імунних реакціях взаємодія комплексів антиген-антитіло з імунними клітинами призводить до широкого спектра відповідей, що варіюють від ефекторних функцій, таких як залежна від антитіла цитотоксичність, дегрануляція гладких клітин і фагоцитоз, до імуномодулюючих сигналів, таких як сигнали, що регулюють проліферацію лімфоцитів і секрецію антитіл. Всі із зазначених взаємодій ініціюються через зв'язування Ес-фрагмента антитіла або імунних комплексів зі спеціалізованими рецепторами клітинної поверхні на гематопоетичних клітинах. Різноманітність клітинних відповідей, викликаних антитілами й імунними комплексами, є результатом структурної гетерогенності трьох Ес рецепторів Есукі (СбО64), Есук (20032) і ЕсукШ (0016). Есук! (СбО64), ЕсукПпПА (СОЗ2А) і сук (С016) є активуючими рецепторами (тобто стимулюють імунну систему); ЕСУКІІВ (СОЗ32В) є інгібуючим рецептором (тобто пригнічує імунну систему). Крім того, взаємодія з неонатальним Ес- рецептором (ЕсКп) опосередковує рециклювання молекул до з ендосом до клітинної поверхні таїх вивільнення в кров. Приклади амінокислотної послідовності ЇдС1 (5ЕО 10 МО:1), 952 (ЗЕО
ІО МО:2), ІЗ (ЗЕО ІЮ МО:3) й Ідс4 (5ЕО ІЮ МО:4) дикого типу представлені вище.
І00146| Модифікація Ес-фрагмента може призводити до зміни фенотипу, наприклад, зміни часу напівжиття в сироватці крові, зміни стабільності, зміни чутливості до клітинних ферментів або зміни ефекторної функції. Таким чином, може бути бажано модифікувати біспецифічну по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекулу, що містить Ес-фрагмент згідно з даним винаходом для зміни її ефекторної функції, наприклад, для посилення ефективності такої молекули в лікуванні раку. Зниження або усунення ефекторної функції є бажаним у певних випадках, наприклад, у випадку антитіл, механізм дії яких включає блокування або антагонізм, але не знищення клітин, що містять антиген-мішень. Підвищення ефекторної функції в цілому є бажаним, коли дія спрямована на небажані клітини, такі як пухлинні та чужорідні клітини, де Есук експресуються на низькому рівні, наприклад, на пухлиноспецифічні В-клітини з низьким рівнем ЕсукКІіїІВ (наприклад, клітини неходжкінської лімфоми, СіЇ і лімфоми Беркіта)». Молекули згідно з винаходом, що мають таку придбану або змінену ефекторну функціональну активність застосовні для лікування та/або запобігання захворювання, розладу або інфекції, при яких підвищення ефективності ефекторної функціональної активності зазначених молекул є бажаним.
І00147| Таким чином, згідно з конкретними варіантами реалізації Ес-фрагмент молекул, що містять Ес-фрагмент згідно з даним винаходом може являти собою інженерний варіант Ес- фрагмента. Незважаючи на те, що Ес-фрагмент біспецифічних молекул, які містять Ес- фрагмент згідно з даним винаходом може мати здатність зв'язуватися з одним або більше Ес- рецепторами (наприклад, Есук)), більше переважно, такий варіант Ес-фрагмента має змінене зв'язування з ЕсСуКІА (СО64), ЕсуКПА (СОЗ2А), ЕсукІІВ (СО328), ЕсуУкША (СО16ба) або ЕсукІІВ (СО16Б) (у порівнянні зі зв'язуванням, яке проявляє Ес-фрагмент дикого типу), наприклад, має підвищену здатність зв'язування з активуючим рецептором і/або має значно знижену здатність або не має здатності зв'язуватися з інгібуючим рецептором (рецепторами). Таким чином, Ес- фрагмент молекул, які містять Ес-фрагмент згідно з даним винаходом може містити деякі або всі з СН2 доменів і/або деякі або всі з СНЗ доменів повнорозмірного Ес-фрагмента або може містити варіант послідовності СНО і/або варіант послідовності СНЗ (який може містити, наприклад, одну або більше інсерцій й/або одну або більше делецій у порівнянні з доменами
СН2 або СНЗ повнорозмірного Ес-фрагмента). Такі Ес-фрагменти можуть містити, що не являють собою с поліпептидні частини або частини неприродних повнорозмірних Ес- фрагментів або можуть мати неприродну орієнтацію доменів СН2 і/або СНЗ (наприклад: два домени СН2 або два домени СНЗ або СНЗ домен, пов'язаний з доменом СНІ у напрямку від М- кінця до С-кінця, і т.д. бо І00148| Модифікації Ес-фрагмента, ідентифіковані як такі, що змінюють ефекторні функції,
відомі в даній області технікию, включаючи модифікації, які підвищують зв'язування з активуючими рецепторами (наприклад, ЕсукКПА (СО16А) і знижують зв'язування з інгібуючими рецепторами (наприклад, ЕсСукІІВ (СОЗ32В) (див. наприклад, 5іамеппадеп, -.В. еї аї. (2007) "Ес
Оріїтігайоп ОЇ ТНнегарешіс Апіїродіеє Еппапсез ТНеєїї АБійу То КіїЇ Титог Сеїє й Міго Апа
Сопігоїє Титог Ехрапвіоп Іп Мімо Міа Гом/-Айіпйу Асіїмайпуд Есдатта Несеріог5, " Сапсег Кев. 57(18):8882-8890). У Таблиці 5 перераховані приклади однієї, двох, трьох, чотирьох і п'яти замін (у порівнянні з амінокислотною послідовністю ЕС ІЮ МО:1) прикладів модифікацій, які підвищують зв'язування з активуючими рецепторами і/або знижують зв'язування з інгібуючими рецепторами.
Таблиця 5
Варіанти переважних активуючих замін Ес-фрагментів мо 77771 РУЯЄ ЇЇ о кзеатіРЗЯВ | 77777111 71 0270, с316б,РЗОБ ІВ | 77777771
І 1е3БР. 243, Вега, УЗО0гі РІО | 77777771 (00149) Приклади варіантів Ес-фрагментів (901 людини зі зниженим зв'язуванням з СО32В іабо підвищеним зв'язуванням з СО1Т6А включають заміни Е243Ї, К292Р, УЗ3001, М305І або
Р296Ї.. Зазначені амінокислотні заміни можуть бути присутніми у Ес-фрагменті ЇДО1 людини у будь-якій комбінації. Відповідно до одного варіанта реалізації винаходу варіант Ес-фрагмента
ІДО1 людини містить заміни Е243І, К292Р і УЗО01.. Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу варіант Ес-фрагмента Ідс1 людини містить заміну Е243І, К292Р, УЗО00І, М3О5І і Р296І. 001501 Згідно з конкретними варіантами реалізації винаходу Ес-фрагменти біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом переважно мають знижену (або по суті не мають) здатність зв'язуватися з ЕсуКІА (СО64), ЕсукПА (СОЗ2А), ЕсукІІВ (СО328), ЕсукША (СО16ба) або ЕсукПІВ (СО166) (у порівнянні зі зв'язуванням, що проявляється
Ес-фрагментом Ід! дикого типу (ЗЕО ІЮ МО:1). Згідно з конкретним варіантом реалізації винаходу біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом містять Ес-фрагмент Ідс, який має знижену ефекторну функцію, пов'язану з антитілозалежною клітинною цитотоксичністю (АЗКЦ). Згідно з переважним варіантом реалізації винаходу домени
СН2-СНЗ таких біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул містять будь-яку 1, 2, З або 4 із замін: /234А, 1235А, 0265А, М2970 і М2970. Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу домени СН2-СНЗ містять заміну М2970, заміну М2970, заміни І234А ії 1235А або заміну 0265А, оскільки зазначені мутації запобігають зв'язуванню ЕсСК. В якості альтернативи, використовується домен СН2-СНЗ природного Ес-фрагмента, який сам по собі має знижену (по суті не має) здатність зв'язування з ЕсуУКкША (СО1ба) і/або знижену ефекторну функцію (у порівнянні зі зв'язуванням й ефекторною функцією Ес-фрагмента Ідо1 дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО:1)). Згідно з конкретним варіантом реалізації винаходу біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом містять Ес-фрагмент Ідс2 (ЗЕО ІЮО МО:2) або Ес- фрагмент Ідс4 (5ЕБЕО І0О:МО:4). При використанні Ес-фрагмента 9054 даний винахід також включає введення стабілізуючої мутації, такої як заміна 5228Р у шарнірній ділянці, описана вище (див. наприклад, ЗЕО ІЮ МО:36). Оскільки заміни М2970, М2970), І 234А, І1235А і 0265А запобігають ефекторній функції, зазначені заміни переважно не використовуються при умовах, при яких ефекторна функція є бажаною.
І00151| Переважна послідовність 9031 для доменів СН2 ії СНЗ молекул, що містять Ес- фрагмент згідно з даним винаходом зі зниженою або усунутою ефекторною функцією буде містити заміни І 234А/ 235А (ЗЕО ІЮ МО:43):
АРЕААСОРБЗМ Р ЕРРКРКОТ І МІЗАТРЕМТ СУММУМОУЗНЕО РЕМКЕММУМУр СМЕМНМАКТК
РАВЕЕОМУМОТМ ВАУУБМІТМН ОбУМІМОКЕМУК СКУБМКАГЇ РА РІЕКТІЗКАК СОРВЕРОММТ
ІРРЗВЕЕМТК МОУБІ ТС УК СаЕМРБЗОІАМЕ М/ЕЗМООРЕММ УМКТТРРУСО5 равеЕгім5кіІ
ТУрКБАМООС ММЕЗСЗУМНЕ А НМНУТОКЗ5 І 5І 5РОХ де Х являє собою лізин (К) або відсутній.
ІЇ00152| Час напівжиття в сироватці крові білків, що містять Ес-фрагменти, можна підвищувати шляхом підвищення афінності зв'язування Ес-фрагмента по відношенню до ЕсКп.
Термін "час напівжиття" при використанні у даній заявці означає фармакокінетичну властивість молекули, яка являє собою показник середнього часу життя молекул після їх введення. Час напівжиття можна виражати як час, необхідний для виведення п'ятидесяти відсотків (50 95) відомої кількості молекули з організму суб'єкта (наприклад, пацієнта, що представляє собою людину або інших ссавців) або з його конкретного компартмента, наприклад, при вимірюванні в сироватці, тобто як час напівжиття в кровоносній системі або в інших тканинах. У цілому, підвищення часу напівжиття призводить до підвищення середнього часу утримання (СЧУ) молекули, що вводиться, у кровотоці.
Зо 00153) Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу біспецифічні по відношенню до РО- 1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом містять варіант Ес-фрагмента, де зазначений варіант Ес-фрагмента містить щонайменше одну амінокислотну модифікацію у порівнянні з Ес- фрагментом дикого типу, що забезпечує зазначеній молекулі збільшений час напівжиття (у порівнянні з молекулою, що містить Ес-фрагмент дикого типу). Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом містять варіант Ес-фрагмента дос, де зазначений варіант Ес-фрагмента містить збільшуючу час напівжиття амінокислотну заміну в одному або більше положеннях, вибраних із групи, що складається з 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435 і 436.
Численна кількість мутацій, здатних збільшувати час напівжиття молекули, що містить Ес- фрагмент, відомі в даній області техніки і включають, наприклад, М252У, 5254Т, Т256Е та їх комбінації. Див., наприклад, мутації, описані у патентах США Мо 6,277,375, 7,083,784; 7,217,797, 8,088,376; публікаціях патентів США Мо 2002/0147311; 2007/0148164 і міжнародних публікаціях
Мо УМО 98/23289; МО 2009/058492 і УМО 2010/033279, які повністю включені у дану заявку за допомогою посилання. Біспецифічні по відношенню до РО-Ї1 х СТІ А-4 молекули зі збільшеним часом напівжиття також включають молекули, що містять варіанти Ес-фрагментів із замінами двох або більше із залишків 250, 252, 254, 256, 257, 288, 307, 308, 309, 311, 378, 428, 433, 434, 435 і 436. Зокрема, дві або більше заміни вибрані з: 12500, М252У, 5254Т, Т256Е, К2880,
Т3070), М3О8Р, АЗ78У, М428І., М434А, НАЗ5К ії у4361І. 00154) Згідно з конкретним варіантом реалізації винаходу біспецифічні по відношенню до
РО-1 х СТІ А-4 молекули містять варіант Ес-фрагмента Ідс, який містить наступні заміни: (А) М252У, 5254Ті Т256Е; (В) М252У і 52541; (С) М252У і Т256Е; (0) Т2500 і М4281І; (Е) 13070 і МАЗ4А; (Р) АЗ78М і МАЗАА; (с) М4З4А і 4361; (Н) УЗО8Р і М434А або (510) () К2880 ії НАЗОК.
00155) Згідно з переважним варіантом реалізації біспецифічні по відношенню до РО-Ї х
СТІ А-4 молекули містять варіант Ес-фрагмента Ідс, який містить будь-яку 1, 2 або З із замін:
М252У, 52541 і Т256Е. Винахід додатково включає біспецифічні по відношенню до РО-Ї х
СТІ А-4 молекули, які містять варіант Ес-фрагмента, що містить: (А) одну або більше мутацій, які змінюють ефекторні функції та/або Есук; й (В) одну або більше мутацій, які збільшують час напівжиття в сироватці крові.
ІЇ00156| Переважна послідовність (91 для доменів СН2 ії СНЗ молекул, які містять Ес- фрагмент згідно з даним винаходом, що мають збільшений час напівжиття в сироватці крові, містить заміни М252У, 52541 і Т256Е (5ЕО ІО МО:80):
АРЕААСОРОЗМ РГЕРРКРКОТ ІМІТВЕРЕМТ СУММОУ5НЕО РЕУКЕМУМУМО СМЕМНМАКТК
РАВЕЕОМУМОТМ ВАУУБМІТМН ОбУМІМОКЕМУК СКУБМКАГЇ РА РІЕКТІЗКАК СОРВЕРОММТ
ІРРЗВЕЕМТК МОУБІ ТС УК СаЕМРБЗОІАМЕ М/ЕЗМООРЕММ УМКТТРРУСО5 равеЕгім5кіІ
ТУрКБАМООС ММЕЗСЗУМНЕ А НМНУТОКЗ5 І 5І 5РОХ де Х являє собою лізин (К) або відсутній.
І00157| Слід зазначити, що домени СН2-СНЗ послідовності «ЕО ІЮ МО:80 містять заміни амінокислот у положеннях 234 і 235 на аланін, таким чином, утворений Ес-фрагмент зв'язується слабкіше (або по суті не зв'язується) з ЕСсуКІА (СО64), ЕсукПА (СОЗ32А), ЕсукіІВв (СО32В),
ЕсукША (СО1Тба) або ЕсукПпІВ (СО165) (у порівнянні із зазначеним зв'язуванням для Ес- фрагмента дикого типу (ЗЕО ІЮО МО:1). Винахід також включає такі домени СН2-СНЗ ІДС, які містять залишки аланіну дикого типу, альтернативні та/або додаткові заміни, які модифікують ефекторну функцію й/або активність зв'язування Ес-фрагмента з ГУК.
І00158| Переважна послідовність Ідс4 для доменів СН2 і СНЗ молекул, які містять Ес- фрагмент згідно з даним винаходом зі збільшеним часом напівжиття в сироватці крові містять заміни М252У, 52541 і Т256Е (5ЕО ІО МО:81):
АРЕНСРОМ ЕРГЕРРКРКОТ ГМІТВЕРЕМТ СУММОУМБОЕО РЕМОЕЄМУМУУМО СМЕМНМАКТК
РАВЕЕЄОРМОТМ ВУУБ5МІТМІН ОбУМІМОКЕМК СКУ5МКОа РОБ 5ІЕКТІЗКАК СОРВЕРОММУТ
ІРР5БОЕЕМТК МОМУ5І ТС УК СаЕМРБЗОІАМЕ М/ЕЗМООРЕММ УКТТРРМГОБ разеЕнІмУЗнвІ.
ТУОКЗАУМОБС! ММЕЗСЗУМНЕ А НМНУТОКЗІБВІ ах де Х являє собою лізин (К) або відсутній.
Зо 00159) У випадку конкретних антитіл, діатіл і трьеохвалентних сполучних молекул, у яких перший та третій поліпептидні ланцюги, що містять Ес-фрагмент, не є ідентичними, бажано знижувати або запобігати виникненню гомодимеризації між доменами СН2-СНЗ двох перших поліпептидних ланцюгів або між доменами СН2-СНЗ двох третіх поліпептидних ланцюгів.
Домени СН2 і/або СНЗ таких поліпептидних ланцюгів не повинні бути ідентичними за послідовністю та переважно модифіковані таким чином, щоб сприяти об'єднанню двох поліпептидних ланцюгів. Наприклад, амінокислотну заміну (переважно, заміну на амінокислоту, що містить об'ємну бічну групу, що утворює "виступ", наприклад, триптофан) можна вводити в домен СН2 або СНЗ таким чином, щоб стеричний вплив запобігав взаємодії з модифікованим подібним чином доменом і примушував мутантний домен спаровуватися з доменом, у якому була створена комплементарна або адаптивна мутація, тобто "западина" (наприклад, заміна на гліцин). Такі набори мутацій можна вбудовувати у будь-яку пару поліпептидів, що містять домени СН2-СНЗ, які утворюють Ес-фрагмент, для забезпечення гетеродимеризації. Способи білкової інженерії, що сприяють гетеродимеризації у порівнянні з гомодимеризацією, добре відомі в даній області техніки, зокрема, стосовно до інженерії імуноглобулін-подібних молекул, і включені у дану заявку (див. наприклад, Кіддуау еї аї. (1996) "Кпорз-Іпіо-Ноїевз" Епдіпеегіпа Ої
Апіїброду СНЗ Ротаїпе Рог Неаму Спаїп Неїегодітетгігайоп," Ргоїєїп Епдг. 9:617-621, Амуеї! єї аї. (1997) "Маріє Неїегодітегт5 гот Ветоавїїтуд Те Юотаїп Іпіейасе ОЇ А Нотодітег Овіпд А
Ріаде бігріау І Іргагу," У. Мої. Вісі. 270: 26-35, апа Хіє єї а. (2005) "А Мем/ Гогтаї ОЇ Візресіїіс
Апіїбоду: Нідніу ЕНісіеєпі Неїегодітегігайоп, Ехрге5в5іоп Апа Титог Сеї! Г увів," у. Іттипої. Меїйоав 296:95-101; кожна з яких, таким чином, повністю включена у дану заявку за допомогою посилання).
І00160| Переважно "виступ" створюється шляхом модифікування Ес-фрагмента дос таким чином, щоб він містив модифікацію Т366УУ. Переважно "западина" створюється шляхом модифікування Ес-фрагмента дб таким чином, щоб він містив модифікацію 73665, ІЗ68А і
Уу407У. Для полегшення очищення гомодимеру третього поліпептидного ланцюга, що містить "западину", від кінцевої біспецифічної гетеродимерної молекули, що містить Ес-фрагмент, сайт зв'язування білка А, що містить "западину" доменів СН2 і СНЗ третього поліпептидного ланцюга переважно модифікують шляхом уведення амінокислотної заміни у положенні 435 (Н4З5К).
Таким чином, гомодимер, що містить "западину" третього поліпептидного ланцюга не буде 60 зв'язуватися з білком А, тоді як біспецифічний гетеродимер буде зберігати свою здатність
Зб зв'язуватися з білком А через сайт зв'язування білка А на першому поліпептидному ланцюзі.
Згідно з альтернативним варіантом реалізації винаходу третій поліпептидний ланцюг, що містить "западину", може містити амінокислотні заміни у положеннях 434 і 435 (МА434А/М435К).
І00161| Переважна амінокислотна послідовність ЇД1 для доменів СН2 і СНЗ першого поліпептидного ланцюга молекули, що містить Ес-фрагмент згідно з даним винаходом буде містити "таку, що містить виступ" послідовність (ЗЕО ІЮ МО:44):
АРЕААСОРБЗМ Р ЕРРКРКОТ І МІЗАТРЕМТ СУММУМОУЗНЕО РЕМКЕММУМУр СМЕМНМАКТК
РАВЕЕОМУМОТМ ВАУУБМІТМН ОбУМІМОКЕМУК СКУБМКАГЇ РА РІЕКТІЗКАК СОРВЕРОММТ
ІРР5ВЕЕМТК МОУБІМУСІ МК СаЕМРБЗОІАМЕ М/ЕЗМООРЕММ УКТТРРМОЗ равзенгіІчм5кіІ.
ТУрКБАМООС ММЕЗСЗУМНЕ А НМНУТОКЗ5 І БІ 5РОХ, де Х являє собою лізин (К) або відсутній.
І00162| Переважна амінокислотна послідовність Дс1 для доменів СН2 і СНЗ другого поліпептидного ланцюга молекули, що містить Ес-фрагмент згідно з даним винаходом, яка складається з двох поліпептидних ланцюгів (або третього поліпептидного ланцюга молекули, що містить Ес-фрагмент, який складається з трьох, чотирьох або п'яти поліпептидних ланцюгів), буде мати "таку, що містить западину" послідовність (ЗЕО ІЮ МО:45):
АРЕААСОРБЗМ Р ЕРРКРКОТ І МІЗАТРЕМТ СУММУМОУЗНЕО РЕМКЕММУМУр СМЕМНМАКТК
РАВЕЕОМУМОТМ ВАУУБМІТМН ОбУМІМОКЕМУК СКУБМКАГЇ РА РІЕКТІЗКАК СОРВЕРОММТ
ІРРОВЕЕМТК МОМБІЗСАМК СЕМРБЗОІАМЕ М/ЕЗМООРЕММ УКТТРРМУГОЗ равеЕнгіІм5кіІ
ТУКБАМООС ММЕЗСЗУМНЕ А НМАУТОКЗБ І 5І 5РОХ де Х являє собою лізин (К) або відсутній. 00163) Слід зазначити, що домени СН2-СНЗ послідовностей ЗЕО ІЮ МО:44 і БЕО ІЮ МО:45 включають заміни амінокислот у положеннях 234 і 235 на аланін і, таким чином, Ес-фрагмент, що утворюється, зв'язується слабкіше (по суті не зв'язується) з ЕСУКІА (СОб64), ЕсукПА (СОЗ32А),
Есукі!ів (СО0328), ЕсукША (СО16ба) або ЕсукПІВ (СО16Б5) (у порівнянні зі зв'язуванням для Ес- фрагмента дикого типу (ЗЕО ІЮ МО:1)). Винахід також включає такі домени СН2-СНЗ ІДС, які містять залишки аланіну дикого типу, альтернативні та/або додаткові заміни, які модифікують ефекторну функцію й/або активність зв'язування РУК Ес-фрагмента. Винахід також включає такі домени СН2-СНЗ, які додатково містять одну або більше збільшуючих час напівжиття амінокислотних замін. Зокрема, як описано вище, винахід включає такі, що містять "западину", і такі, що містять "виступ", домени СН2-СНВЗ, які додатково містять М252У/52541/1256Е.
І00164| Переважна амінокислотна послідовність (391 для додаткових доменів СН2 і СНЗ, що містять М252у/52541/1256Е першого поліпептидного ланцюга молекули, яка містить Ес- фрагмент згідно з даним винаходом буде мати "таку, що містить виступ" послідовність (ЗЕО ІЮ
МО:82):
АРЕААСОРБЗМ РГЕРРКРКОТ ІМІТВЕРЕМТ СУММОУ5НЕО РЕУКЕМУМУМО СМЕМНМАКТК
РАВЕЕОМУМОТМ ВАУУБМІТМН ОбУМІМОКЕМУК СКУБМКАГЇ РА РІЕКТІЗКАК СОРВЕРОММТ
ІРР5ВЕЕМТК МОУБІМУСІ МК СаЕМРБЗОІАМЕ М/ЕЗМООРЕММ УКТТРРМОЗ равзенгіІчм5кіІ.
ТУрКБАМООС ММЕЗСЗУМНЕ А НМНУТОКЗ5 І 5І 5РОХ де Х являє собою лізин (К) або відсутній.
І00165| Переважна амінокислотна послідовність 91 для додаткових доменів СН2 і СНЗ, що містять М252Уу/52541/1256Е другого поліпептидного ланцюга молекули, яка містить Ес- фрагмент згідно з даним винаходом, що містить два поліпептидні ланцюги (або третього поліпептидного ланцюга молекули, що містить Ес-фрагмент, який містить три, чотири або п'ять поліпептидних ланцюгів) буде мати "таку, що містить западину" послідовність (5ЕО ІЮ МО:83):
АРЕААСОРОЗМ РГЕРРКРКОТ ІМІТВЕРЕМТ СУММОУ5НЕО РЕУКЕМУМУМО СМЕМНМАКТК
РАВЕЕОМУМОТМ ВАУУБМІТМН ОбУМІМОКЕМУК СКУБМКАГЇ РА РІЕКТІЗКАК СОРВЕРОММТ
ІРРОВЕЕМТК МОМБІЗСАМК СЕМРБЗОІАМЕ М/ЕЗМООРЕММ УКТТРРМУГОЗ равеЕнгіІм5кіІ
ТУКБАМООС ММЕЗСЗУМНЕ А НМАУТОКЗБ І 5І 5РОХ де Х являє собою лізин (К) або відсутній.
І00166| Переважна амінокислотна послідовність Ід(4 для доменів СН2 і СНЗ, що містять
М252у/52541/1256Е першого поліпептидного ланцюга молекули, яка містить Ес-фрагмент згідно з даним винаходом, буде мати "таку, що містить виступ" послідовність (ЗЕО ІЮ МО:84):
АРЕНСРОМ ЕРГЕРРКРКОТ ГМІТВЕРЕМТ СУММОУМБОЕО РЕМОЕЄМУМУУМО СМЕМНМАКТК
РАВЕЕЄОРМОТМ ВУУБ5МІТМІН ОбУМІМОКЕМК СКУ5МКОа РОБ 5ІЕКТІЗКАК СОРВЕРОММУТ
ІРРБОЕЕМТК МОМБІМСІ МК СЕМРБЗОІАМЕ М/ЕЗМООРЕММ УКТТРРМІОЗ ОБЕРІГ УЗН.
ТУОКЗАУМОБС! ММЕЗСЗУМНЕ А НМНУТОКЗІБВІ ах де Х являє собою лізин (К) або відсутній.
І00167| Переважна амінокислотна послідовність ІдД4 для доменів СН2 ії СНЗ, що містять бо М252у/52541/1256Е другого поліпептидного ланцюга молекули, яка містить Ес-фрагмент згідно з даним винаходом, що містить два поліпептидні ланцюги (або третього поліпептидного ланцюга молекули, що містить Ес-фрагмент, який містить три, чотири або п'ять поліпептидних ланцюгів) буде мати "таку, що містить западину" послідовність (ЗЕО ІЮ МО:85):
АРЕНСРОМ ЕРГЕРРКРКОТ ГМІТВЕРЕМТ СУММОУМБОЕО РЕМОЕЄМУМУУМО СМЕМНМАКТК
РАВЕЕЄОРМОТМ ВУУБ5МІТМІН ОбУМІМОКЕМК СКУ5МКОа РОБ 5ІЕКТІЗКАК СОРВЕРОММУТ
ІРР5БОЕЕМТК МОУБІЗСАУК сСЕМРОЗОІАМЕ МЕЗМООРЕММ УМКТТРРМГОЗ равеЕнгімЗнві.
ТУОКЗАУМОБГС! ММЕЗСЗУМНЕ А НМАУТОКЗІБВІ ах де Х являє собою лізин (К) або відсутній. 00168) Слід зазначити, що домени СН2-СНЗ з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:84 і БЕО ІЮ МО:85 містять заміни М252у/52541/1256Е і, таким чином, утворюють Ес-фрагмент /д054, що забезпечує збільшення часу напівжиття в сироватці крові. Винахід також включає домени СН2-
СНЗ Ід, які містять залишки М252/5254/1256 дикого типу.
Ї00169| Домени СН2-СНЗ першого поліпептидного ланцюга переважно мають "таку, що містить виступ" послідовність, таку як послідовність БЕО ІЮ МО:44. Однак слід розуміти, що у першому поліпептидному ланцюзі можна застосовувати "такі, що містять западину" домени
СН2г-СНЗ (наприклад, 5ЕО ІЮ МО:45), на випадок чого "такі, що містять виступ" домени СН2-
СНЗ (наприклад, ЗЕО ІО МО:44) будуть використовуватися у другому поліпептидному ланцюзі молекули, що містить Ес-фрагмент згідно з даним винаходом, яка містить два поліпептидні ланцюги (або у третьому поліпептидному ланцюзі молекули, що містить Ес-фрагмент, який містить три, чотири або п'ять поліпептидних ланцюгів). 001701 Згідно з іншими варіантами реалізації винахід включає біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули, що містять СН2- і/або СНЗ-домени, які були сконструйовані таким чином, щоб сприяти гетеродимеризації на відміну від гомодимеризації, з використанням мутацій, відомих в даній області техніки, таких як мутації, описані у міжнародних публікаціях згідно з РСТ Мо УМО 2007/110205; УМО 2011/143545; УМО 2012/058768; УМО 2013/06867, всі з яких повністю включені у дану заявку за допомогою посилання.
МІ. Здатність зв'язування з РО-1
І00171| Відомі антитіла, які мають імуноспецифічність по відношенню до РО-1 (див. наприклад, заявки на патент США Мо 62/198,867; 62/239,559; 62/255,140, патенти США Мо 8,008,449; 8,552,154; міжнародні публікації патентів згідно з РСТ УМО 2012/135408;. УМО 2012/145549 і УМО 2013/014668). Переважна здатність зв'язуватися з РО-1, застосована для створення біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом, являє собою здатність зв'язуватися з безперервною або переривчастою (наприклад, конформаційною) частиною (епітопом) РО-1 людини (СО279) і, переважно, також здатність зв'язуватися з молекулою РО-1 одного або більше видів не людського походження, зокрема, видів приматів (особливо, таких видів приматів, як яванський макак). Додаткові бажані антитіла можуть бути отримані шляхом виділення гібридом із секрецією антитіла, викликаної застосуванням РО-1 або його пептидного фрагмента. Типовий поліпептид РО-1 людини (послідовність в МСВІ МР 005009.2; включаючи сигнальну послідовність з 20 амінокислотних залишків, показану підкресленою) і 268 амінокислотних залишків зрілого білка має амінокислотну послідовність (ЗЕО ІЮ МО:46):
МОІРОАРМ/РУМ МАМІ ОЇ СМ/А РОМ/ЕГО5РОВ РМУМРРТЕБРА ГІ МУМТЕСОМА
ТЕТО5ЕЗМТ5 ЕЗЕМІ МУМАМ ЗРУОМОТОКІГ А АЕРЕОВЗОРОа ОЮСВЕВМТОЇ.
РМаВОЕеЕНМ5МУ МААВАМОБЗИТ МІ СОАЇІБІ АР КАОІКЕБІ ВА ЕГАМТЕВВАЕ
МРТАНРБОРБЗР ВРАСОРОТІ М УС УУаСТ а5 І МІ УМУМІ АМ ІСЗВААВИТІ
САВВТОаОРІ К ЕОРБАМРУЕЗ МОМаБ ОРОМ/ ВЕКТРЕРРУР СУРЕОТЕМАТ
ІМЕРБОМИТ5 БРАННОИЗАВСИ РАБАОРІ ВРЕ ВИНОМ РІ. (00172) Переважні молекули, що зв'язуються з РО-1 (наприклад, антитіла), застосовані для створення біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом, містять МІ- і/або МН-домени моноклонального антитіла проти РО-1 людини "РО-1 тАбБ 1" (ніволумаб, реєстраційний номер СА5З:946414-94-4, також відомий як 524, ВМ5-936558,. ОМО- 4538, МОХ-1106 і доступний на ринку як ОРОЇМОФ від компанії ВгібїоІ-Муєгз Зацірб); "РО-1 тАБб 2" (пембролізумаб, (раніше відомий як ламбролізумаб), реєстраційний номер САБ:1374853-91- 4, також відомий як МК-3475, 5С2Н-900475 і доступний на ринку як КЕУТКОБАФ від компанії
МегесК); "РО-1 тАбБ 3" (ЕН12,2Н7; Сапа Рагрег), "РО-1 тА 4" (підилізумаб, реєстраційний номер
САБ: 1036730-42-3, також відомий як СТ-011, Сигеїесії) або будь-якого з антитіл проти РО-1 з
Таблиці 6 і, більше переважно, містять 1, 2 або всі З із СОК. Мі -домену і/або 1, 2 або всі З із
СОВн Мн-домену такого моноклонального антитіла проти РО-1. Додаткові антитіла проти РО-1, що мають унікальні властивості зв'язування, застосовані згідно зі способами і композиціями 60 згідно з даним винаходом, були недавно ідентифіковані (див. заявки на патенти США Мо
62/198,867; 62/239,559; 62/255,140). Зокрема, переважними є молекули, що зв'язують РО-1, які містять гуманізований УН і/або Мі домен антитіла проти РО-1 "РО-1 тА 5" (пПРО-1 тАБ 2,
Масгодепісв); "РО-1 тАБ 6" (ПРО-1 тАБ 7, Масгодепіс5); "РО-1 тАБ 7" (ПРО-1 тАБ 9,
Масгодепісз) або "РО-1 тА 8" (пПРО-1 тА 15, Масгодепісв) і більше переважно містять 1, 2 або всі З із ділянок СОКІ: Мі -домену і/або 1, 2 або всі З із ділянок СОКн МН-домену зазначеного гуманізованого моноклонального антитіла проти РО-1.
А. РО-1 тАБ 1 00173) Амінокислотна послідовність МН-домену РО-1 тАбБ 1 (ЗЕО ІЮ МО:47) показана нижче (залишки СОКНн підкреслені).
ОМОЇ МЕЗСаСО УММОРОВ5БІ ВІ ОСКАБИЇТЕ5 МЗОМНУУВОА РЕКС ЕМ МАМ М/КраЗКАУУ
АРБУКОВЕТІ 5АОМ5ЗКМТІ ЕЕ ГОММ5І ВАЄО ТАУУУСАТМО ОУУСОСТІ МТ У (00174) Амінокислотна послідовність МІ -домену РО-1 тАБ 1 (ЗЕО ІЮ МО:48) показана нижче (залишки СОК. підкреслені).
ЕІМІГТО5РАТ ІБІЗРОЕВАТ І5СВАБОБВУО ЗМІ АММООКР СОАРАЦІМО АЗМАВАТаИаІРА
ВЕЗИаБИаБИТО ЕТІ ТІЗ5І ЕР ЕОБЕАУУУСОО 554ММУРАТРСО аТКМЕїК
В. РО-1 тАБ 2 00175) Амінокислотна послідовність МН-домену РО-1 тАбБ 2 (ЗЕО ІО МО:49) показана нижче (залишки СОКНн підкреслені).
ОМОГ МОБОаМЕ УККРОАБУКМ 5БСКАБИаУТЕеЕТ МУУМУМУУВОА РОСС ЕУ/Мас, ІМРОМИаСТМЕ
МЕКЕКМАМТІ ТТО5ЗТТТАМ МЕ КБІОБОЮ ТАМУУСАВАО УВеОМмавгрУМУ СОСТТУТУ55 00176) Амінокислотна послідовність МІ -домену РО-1 тАБ 2 (ЗЕО ІЮ МО:50) показана нижче (залишки СОК. підкреслені).
ЕІМІГТО5РАТ ІБІЗРОЕВАТ ІЗСВАБКОМ5 Т50У5МІНМУМ ООКРООАРАВІ ІМ АБМІЕ5
СМРАНЕЗИаБа ЗаТОЕТІ ТІ 5 ЕРЕОБАМУ МСОН5ЗАОІ РІ ТРаСаИткУгв ІК б. РО-1 тАБ З
І00177| Амінокислотна послідовність МН-домену РО-1 тАбБ З (ЗЕО ІЮО МО:51) показана нижче (залишки СОКНн підкреслені).
ОМОГОО5САЕ І АКРОАБМОМ З5СКАБИУБЕТ З5УМІНМУУКОВ РОС ЕМІСУ ІМРЗТаЕТЕХУ
МОКЕКОКАТІ ТАОКЗЗОТАМ МОЇ 551 Т5ЕО БАУУУСАВМУА О5БЗауУНнНАМОМ МусОсТОУТУБо
Зо 00178) Амінокислотна послідовність МІ -домену РО-1 тАБ З (ЗЕО ІЮ МО:52) показана нижче (залишки СОК. підкреслені).
РІМЕІТО5РАБ ІТУ5БІІ ОВАТ ІЗСВАБОВУВ Т5ОУЗУМНУУМ ООКРООРРКІ ПІКРаБЗМ'ЕЗ
СІРАВЕЗОаБО 5 ТОЕТІ МІН РУЕЕЕОТАТУ МСОНЗМ/ЕІРУ ТРаОИткі ЕІ К 0. РО-1 тАБ 4
І00179| Амінокислотна послідовність МН-домену РО-1 тАБ 4 (ЗЕО ІЮ МО:53) показана нижче (залишки СОКНн підкреслені).
ОМОГ МОБОБЗЕ І ККРОАБУКІ 5БСКАБИаУТЕТ МУЯММУМУУВОА РОС ОМУМОИаМ ІМТОБЗОЕЗТУ
АЕЕРКОВЕМЕ 51 ЮСТ5УМТАМ ГОІТ5І ТАЕЮО ТаМУєСУВМУа УВА ЮОММ,ОС ТІ МТУ (00180) Амінокислотна послідовність МІ -домену РО-1 тАБ 4 (5ЕО ІО МО:54) показана нижче (залишки СОК. підкреслені).
ЕІМІГТО5РОЗ І5АБМаОВМТ ІТО5АНОВЗУО УММНУБООКРО КАРКІМІМАТ ЗМІ АБаМУРБЗА
ЕЗзОаБИаБИаТОМ СІ ТІМ ОРЕ ОБАТУМСООВ 55ЕРІ ТЕС ТКІ БІК
Е. РО-1 тА 5 00181) Амінокислотна послідовність МН-домену РО-1 тАбБ 5 (ЗЕО ІО МО:55) показана нижче (СОВн залишки підкреслені).
ЕМО! МЕ2ЗОСІЯ І МОРОСБІ ВІ 5БСААБаєМЕ5 5ЕЯМНУМАВОА РОаКаї ЕММАМ І55125М515У
АРТУКОВЕТІ ЗАОМАКМТІ М І ОММ5І АТЕО ТА МУМСАБІ 5 ОМЕОУМУСсОСТ ТУТУ55 (00182) Амінокислотна послідовність МІ -домену РО-1 тАБ 5 (ЗЕО ІЮ МО:56) показана нижче (залишки СОК. підкреслені).
ОМУМТО5РІЗ ІРМТ ЯОРАБ ІЗСН5ОБОБІ М НЗТОаМТМІ НМУ М'ОКРООБРО ГП ПМАМЗМАЕ зауУРєРОовЕЗа5 аЗатТОЕТІ КІ БАМЕАЕОМаМ УУС5ОТТНУР МТРаОСТКІЕ ІК
Е. РО-1 тА 6 00183) Амінокислотна послідовність домену МН РО-1 тАБ 6 (5ЕО ІЮ МО:57) показана нижче (залишки СОКНн підкреслені).
ОМОІ МОБалАЕ МККРИОаАБУКМ ЗСКАБИОУЗЕТ ЗУММММУУВОА РОСС ЕМХхИаМ
ІНР5БОБЕТУМ БОКЕКОВМТІ ТМОКОТОТАМ МЕ! 55185ЕО ТАМУУСАВЕН Уато5РЕАУМС ат МмгУз5 де Хі являє собою І або А. (00184) Амінокислотна послідовність домену МІ. РО-1 тАб 6 (ЗЕО ІЮО МО:58) показана нижче 60 (залишки СОК. підкреслені).
ЕІМГТО5РАТ І 5І5РОЕВАТ І 5СВАХІЕВМО МУаМ5ЕМММЕ ООКРООРРКІ. ГПІНААЗМХ»а5
СМРОНЕБабБа 5аТОЕТІ ТІВ БІ ЕРЕОБАУМ ЕСООБКЕМРУ ТЕО И,ТКМЕЇ Кк де: Хі являє собою М або 5 і Х2 являє собою О або Е; або
Хі являє собою М і Х2 являє собою С); або
Хі являє собою 5 і Х2 являє собою С); або
Хі являє собою 5 і Хо являє собою КЕ. 00185) Зокрема, варіанти реалізації амінокислотної послідовності РО-1 тАб 6 включають: (а) БЕО ІЮ МО:57, де Хі являє собою І, і 5ЕО ІО МО:58, де Хі являє собою М і Хо являє собою 0; або (Б) 5ЕО ІЮО МО:57, де Хі являє собою І, і 5ЕО ІЮ МО:58, де Хі являє собою 5 і Хо являє собою 0. (00186) Приклад антитіла МН-домену проти РО-1, позначений як "РО-1 тАбБ 6-І МН", містить
ЗЕО ІЮ МО:57, де Хі: являє собою І, і має амінокислотну послідовність (ЗЕО ІЮ МО:86):
ОМОЇ МОБСОАЕ УККРОАБУКМ 5БСКАБОУБОЕТ БУМУММУМУУВОА РОСС ЕУЛамМ ІНРЗ5ОБЕТМІ.
РОКЕКОАМТІ ТМОКОТОТАМ МЕ! 55І І 85ЕО ТАМУМСАВЕН УСТ5РЕАУМ СО ОСТІ МТУ55
І00187| Приклад Мі -домену проти РО-1, позначений як "РО-1 тАБ 6-50 МІ", містить 5ЕО ІЮ
МО:58, де Хі являє собою 5 і Х» являє собою ОС), і має амінокислотну послідовність (5ЕО ІЮ
МО:87):
ЕІМІГТО5РАТ І5І5РОЕНАТ І 5СВАБЕБМО МУОаМ5ЕМММР ООКРООРРКІ. ПІНААБМОСО
СМРОНЕБабБа 5атОЕТІТІВ Б ЕРЕОБАМУ ЕСООБКЕМРУ ТЕОСОИТКМЕЇ К 00188) Приклад антитіла проти РО-1, який містить МН-домен РО-1 тАБ 6-І ії МІ -домен РО-1 тАБ 6-50 позначений як "РО-1 тАБб 6-ІЗО." а. РО-1 тАБ 7 (00189) Амінокислотна послідовність МН-домену РО-1 тАб 7 (ЗЕО ІО МО:59) показана нижче (СОВн залишки підкреслені).
ЕМОЇ МЕБОСО І ХІАРОСБІ КІ 5СААБОЕТЕ5 ЗМІ УХ2МУВОА РОКИ ЕМУХзАТ ІБОСВСІСЯМТ УМ 5ОБУКОВЕТІ ЗАОМАКМОІ У І ОММ5ХАВАЕО ТАТУУСАНУСЯ ЕОСАМЕАУМ а ОСТІ МТУ55 де: Хі являє собою М або А; Хо являє собою 5 або б; Хз являє собою МУ або Т; Ха являє собою ГІ або А; або
Ко) Хі являє собою У, Хо являє собою 5, Хз являє собою У і Ха являє собою і ; або
Хі являє собою А, Х2 являє собою б, Хз являє собою 1 і Х« являє собою А. 00190) Амінокислотна послідовність МІ -домену РО-1 тАБ 7 (ЗЕО ІЮ МО:60) показана нижче (залишки СОК. підкреслені).
РІОМТО5РУОБ І 5АБМООВМТ ІТСВАБЕМІМ ХІМ АМ/МООКР СОКАРКІ Ї ІМХ» АКТІ АДОМРБ5
ВЕБабБабБато ЕТ ТІЗБІ ОР ЕОБЕАТУУСОН НУАМРМ/ТЕСО СТКІ БІК де: Хі являє собою 5 або М і Х» являє собою М або р; або Х: являє собою 5 і Х» являє собою
М; або
Хі являє собою М і Х» являє собою 0. 00191) Зокрема, варіанти реалізації РО-1 тАБб 7 включають: (а) БЕО ІО МО:59, де Хі являє собою У, Хо являє собою 5, Хз являє собою М і Ха являє собою І. і БЕО ІЮО МО:60, де Х: являє собою 5 і Х2 являє собою М; або (Б) 5ЕО ІО МО:59, де Хі являє собою А, Хо являє собою б, Хз являє собою Т і Ха являє собою А, і ЗЕО ІЮО МО:60, де Х: являє собою М і Хг2 являє собою 0.
Н. РО-1 тАБ 8 (00192) Амінокислотна послідовність МН-домену РО-1 тАбБ 8 (ЗЕО ІЮО МО:61) показана нижче (залишки СОКНн підкреслені).
ЕМОЇ МЕБОСО ІМАРОСБІ ВІ 5СААБОБТЕ5 5МИ5МУМВОА РОаКОЇ ЕММАА І5С30(4СБАОТМУ
АОБУКОВЕТІ БВОМАКМ5І М І ОММ5І ВАЕО ТАТУУСАНВОа ТМАМОУМУСсОС ТІ МТУ 00193) Амінокислотна послідовність МІ -домену РО-1 тА 8 (ЗЕО ІЮ МО:62) показана нижче (залишки СОК. підкреслені).
ІОМТО5РБОБ І5БАБМООВМТ ІТСВАБЕМІМ МУ АМУМООКР сСКАРКІ ІМО АКТІ АДОМРБ5
ВЕБабБабБато ЕТ ТІЗБІ ОР ЕОБЕАТУУСОН НУАМРМ/ТЕСО СТКІ БІК
І. Додаткові антитіла проти РО-1
І00194| Додаткові антитіла проти РО-1, які можна застосовувати для створення біспецифічних по відношенню до РО-1ї х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом, представлені в Таблиці 6.
Таблиця 6
Додаткові антитіла проти РО-1
РО1Т-17; РО1-28; РО1-33; РО1-35 і РО1-Е2 Патенти США Мо 7488802; 7521051 і 8088905; міжнародна патентна публікація згідно з РСТ УМО 2004/056875 1708; 203; 4НІ1; 504; 4А11; 703 і 5Е4 Патенти США Мо 8008449; 8779105 і 9084776; міжнародна патентна публікація згідно з РСТ УМО 2006/121168
ПРО-1,08А; пРО-1,09А; 109А; КОЗА; 409А; Н409А11; | Патенти США Мо 8354509; 8900587 і пЯ0О9А16; п409А17; кодон- оптимізований варіант!| 5952136; міжнародна патентна 109А і кодон-оптимізований варіант 409А публікація згідно з РСТ УМО 2008/156712 1ЕЗ;ТЕВ і 1НЗ Публікація патенту США 2014/0044738; міжнародна патентна публікація згідно з РСТ УМО 2012/145493
АРЕ1950; АРЕ1963 і АРЕ2ОБ58 згідно з РСТ УМО 2014/179664 аА1;сА2; авт; авВб; ант; Аг; 07; Н7; ЗН-АЯ; ЗН-АУ; | Публікація патенту США датнто; ватнті1; па2нН7; пОс2гНнІТО; ВОЗЕ12; ВО4Аб; | 2014/0356363; міжнародна патентна вабро; ватнто-На2гА-22-15; ВатнНтТо0-Н2гА-27-25;| публікація згідно з РСТ УМО датнто-3С; вВат1нто-16С; ват1нто-17С; ватнто-!| 2014/194302 192; Ват1нІ10-21С і Ват1н1то-2302
НІМ7789М; НіІМ7799М; НІМ7800М; Н2гМ7780М; | Публікація патенту США
Н2гм7788М; Н2гм7790М; нН2агмМ7791М; Н2гм7794М;| 2015/0203579; міжнародна патентна
На2гм7795М; Н2гмМ7796М; Н2гМ7798М; НаноООтТоР; | публікація згідно з РСТ УМО нахноозараг; НахнНооз5рР2; НахХНОО37Р2; | 2015/112800
НахнНо045Р2; НаХхНО0О48Р2; НАНООБ57Р2; НАНООбВР2;
НахХнеО119Р2; Нахнео120Р2; Нахпет128реаг;
НахХхпео135рг; НаХхп9145рг2; НАХН8992р; НаХп8999р і нахпооовр;
РО-1 тАБ 1; РО-1 тАБ 2; тАБ проти пПРО-1 2; РО-1 | Заявки на патент США Мо. 62/198,867 тА 3; РО-1 тАбБ 4; РО-1 тАБ 5; РО-1 тА 6; РО-1 | і62/239,559 тА 7; тАб проти ПРО-1 7; тАбБ проти РО-1 8; тАб проти РО-1 9; тАБ проти ПРО-1 9; РО-1 тАбБ 10; РО-1 тАБ 11; РО-1 тАБ 12; РО-1 тАБ 13; РО-1 тА 14;
РО-1 тАБ 15 і тАБ проти ПРО-1 15
У). Приклад антитіла проти РО-1 00195) Приклад антитіла проти РО-1, позначений як ""О-1 тАр 6 с4Р", містить: важкий ланцюг, що містить МН-домен РО-1 тАБ 6І (ЗЕО ІЮ МО:86), СНІ-домен Ідс4 (5ЕО ІЮ МО 42), стабілізовану шарнірну ділянку (ДО 4 (ЗЕО ІЮ МО:36) і домени СН2-СНЗ ІдС4 без С-кінцевого лізину (ЗЕО ІЮ МО:4), легкий ланцюг, що містить Мі -домен РО-1 таб 650 (ЗЕО ІЮ МО:87) і каппа-СІ (5ЕО ІО МО:38).
І00196| Амінокислотна послідовність цілого важкого ланцюга РО-1ї тА 6 Сс4Р (5ЕО ІО
МО:88) показана нижче.
ОМОГ МОБОАЕ УККРОАБУКМ 5БСКАБИаУЗЕТ 5БУМУММУМУУВОА РИСИ ЕУЛОаМ ІНРЗОБЕТУМ
РОКЕКОВМТІ ТМОК5ОТЗТАМ МЕ! 55ІА5ЕО ТАМУУСАВЕН УсТ5РЕАУМС ОСТІ МУЗА
ЗІКОаРОЗМЕРІ АРСЗА5О5ТЗЕЗ ТААГОСІМКО МЕРЕРУТУБМУ МСА Т5ОаМН ТЕРАМІ О55П0:
ЇМ5І5БУМТМ РБББІСТКТУ ТОМУМОНКРОМ ТКМОКАМЕЗК МаРРСОРРОРА РЕБРІ СОРБМУЕ
ІГРРРКРКОТІ МІ5БАТРЕМТСО МУУМОУБ5ОБЕОР ЕМОЕЄММУУМОрс МЕМНМАКТКР ВЕЄЕОЄМЗТУВ МУ5МІТМ НО ОУМІМОКЕМКОС КУЗМКОЇ РОБ ЕКТІЗКАКа ОРВЕРОММУТІ РРБОЕЕМТКМ
ОМ5ІТСІУКОа ЕМРБЗОІАМЕМ/ ЕЗМООРЕММУ КТТРРМІО5БО О5ЕРІ МВТ МОК5АУМОБаМ
МЕБСБМУМНЕА І НМНУТОКОБІ 5І 51 с
І00197| Амінокислотна послідовність цілого легкого ланцюга РО-1 тАр 6 Са4Р (5ЕО ІО
МО:89) показана нижче.
ЕІМІГТО5РАТ І5ІЗРОЕВАТ І5СВАБЕЗУМО ММаМ5ЕМММЕ ООКРООРРКІ ПІНААЗМОСО
СУРЗАЕБЗаБа ОТО ТІ5 БІЕРЕОРАММУ РЕСООБКЕМРУ ТРасатТкКМЕ! КАТУААРБЗМУЕ
ІЕРРБОБОЇК БОТАБМУСІЇ ММЕМРАЕБЕАКМ ОМКМОМАСГОВ СМ5ОЕЗМТЕО ОБКОЗТУ5І 5
ЗТ ТІ 5КАОУ ЕКНКУМАСЕМ ТНОСІ 55РМТ КЗЕМВИЕС
МІ. Здатність зв'язування з СТІ А-4 00198) Відомі антитіла, що мають імуноспецифічність по відношенню до СТІ А-4 (див. наприклад, патенти США Мо 6,984,720; 6,682,736; 7,034,121; 7,109,003; 7,132,281; 7,411,057; 7,605,238; 7,807,797; 7,824,679; 8,017,114; 8,143,379; 8,318,916; 8,491,895; 8,784,815 і 8,883,984; публікації патентів США 2009/0123477; 2009/0252741 і 2014/0105914; міжнародні публікації патентів згідно з РСТ Мо УМО 00/37504; МО 01/14424; УМО 01/54732; МО 2006/029219;. УМО 2006/066568 і УМО 2012/120125 і Таблицю 7). Переважно здатність зв'язування з СТІА-4, застосована для створення біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом, являє собою здатність зв'язуватися з безперервною або переривчастою (наприклад, конформаційною) частиною (епітопом) СТІ А-4 людини і переважно також включає здатність зв'язуватися з молекулами СТІ А-4 одного або більше видів не людського походження, зокрема, видів приматів (і, зокрема, таких видів приматів, як яванський макак). Додаткові бажані антитіла можуть бути створені шляхом виділення секретуючих антитіла гібридом, стимульованих за допомогою СТІ А-4 або його пептидного фрагмента. Типовий поліпептид
СТІ А-4 людини (послідовність МСВІ МР 005205,2; включаючи сигнальну послідовність з 35 амінокислотних залишків (показана підкресленою) і 188 амінокислотних залишків зрілого білка) має амінокислотну послідовність (ЗЕО ІЮ МО:75):
МАСІ СРОВНК АОІМГАТАТМ/ РСТІЇЕРІЕ ІРУЕСКАМНМ АОРАММІ АБЗ ВаїтлБЕМСЕУ АЗ5РОКАТЕМА МТМІВОАОБО МТЕМСААТУМ МОМЕЇТРГ ОО 5БІСТатТеБОаМ ОММ ті А
АМОТОСІЇМІСК МЕІЇМУРРРУМ 1 СсІ2МОаТОІМ МІОРЕРСРОБ ОРІІЇМ/ЛГААМ 0 5БОЇ ЕЕМ5НІ
ІГТАМ5І ЗКМІ ККАЗРІ ТТОМ МУКМРРТЕРЕ СЕКОЕБЕОРУРІ РІМ
І00199| Переважні сполучні з СТІ А-4 молекули (наприклад, антитіла), застосовані для створення біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом, містять МІ- і/або МН-домени моноклональних антитіл проти СТІ А-4 людини "пАбБ СТІ А-4 1" (іпілімумаб, реєстраційний номер СА5: 477202-00-9, також відомий як МОХО10 і доступний на ринку як МЕКМОМФ від компанії ВгібіоІ-Муєте баці); "пАБ СТІ А-4 2" (тремелімумаб, реєстраційний номер САБ5: 745013-59-6, також відомий як СР-675206); "тАБ СТІ А-4 3" (486, як представлено в таблиці 7) або будь-якого з інших антитіл проти СТІ А-4 з Таблиці 7 і, більше переважно, містять 1, 2 або всі З із СОК: Мі -домену і/або 1, 2 або всі З із СОКн МН-домену таких моноклональних антитіл проти СТІ А-4.
А. СТІ А-4 тАБ 1
І00200| Амінокислотна послідовність антитіла МН-домену тАбБ 1 проти СТІ А-4 (5ЕО ІО
МО:76) показана нижче (залишки СОКНн підкреслені).
ОМОЇ МЕЗССО ММОРОВБОІ ВІ ЗСААБаєТЕВ 5УТМНУМАОА РОКИ! ЕММТЕ ІЗМОСММКУУ
АРБУКОВЕТІ 5АОМЗКМТІ М ГОММ5І ВАЕО ТАІММСАВТОа ММ аРЕОММУ СО СТІ МТУ55
І00201| Амінокислотна послідовність Мі -домену тАБбБ 1 проти СТГ А-4 (5ЕО ІЮ МО:77) показана нижче (залишки СОМ. підкреслені).
ЕІМІТО5РЕТ ІБІЗРОЕВАТ ІЗСВАбОВУО 55МІАММООК РЕОАРВЦІМ САЕЗВАТИЇІР рагзазавзат рЕТІ ТІВ Е РЕОБЕАУУУСО ОУСа5ЗРМУТРа ОСТКМЕІК
В. СТІ А-4 тА 2
І00202| Амінокислотна послідовність МН-домену тАбБ2 проти СТІ А-4 (5ЕО ІЮ МО:78) показана нижче (залишки СОРНн підкреслені).
ОМОЇ МЕЗССО ММОРОВБІ ВІ ЗСААЗаЕТЕ5 5БМаМНУМУВОА РОКИ ЕУМАМ М/УраИазМКимУ
АОБУКОВЕТІ 5ВАОМОЗКМТІМ ТОММ5ЗІВАєО ТАМУУСАВОР ВОАТтІ УМ сМмруУМСсоатТтТ
УТУ55
І00203| Амінокислотна послідовність Мі -домену тАбБ2 проти СТІГА-4 (5ЕО ІЮ МО/:79) показана нижче (залишки СОМ. підкреслені).
БІОМТО5РОБЗ І5АБМООВАМТ ІТСВАБОБІМ ЗМІ ОМУМООКР ОаКАРКИ МА АББІОБаМУРБ5
ВЕЗОаБИаБИТО ЕТ ТІЗ5 ОР ЕОРАТУУСОО УУЗТРЕТЕРОР ИТКМУЕїІК б. СТІ А-4 тА З
І00204| Амінокислотна послідовність МН-домену тАБбБЗ проти СТІ А-4 (5ЕО ІЮ МО:90) показана нижче (залишки СОРНн підкреслені).
ОМОЇ МЕЗССО ММОРОВБОІ ВІ ЗСААБаєТЕВ 5УТМНУМАОА РОКИ! ЕММТЕ ІЗМУразмМкКНнУ во АрБУКОаВЕТМ 5АОМ5КМТІ М ГОММ5І ВАЕО ТАІММСАВТа М аРЕОММ СО СТІ МТУ
І00205| Амінокислотна послідовність Мі -домену тАБбБЗ проти СТГ А-4 (5ЕО ІЮ МО-91) показана нижче (залишки СОМ. підкреслені).
ЕІМІТО5РЕТ ІБІЗРОЕВАТ І5СВАБОБВУ 55БГГАММООК РООАРАВЦІМ сСАБЗВАТИЇІР рагзазавзат рЕТІ ТІВ Е РЕОБЕАУУУСО ОУСа5ЗРМУТРа ОСТКМЕІК р. Додаткові антитіла проти СТІ А-4
І00206| Додаткові антитіла проти СТГА-4, які можна застосовувати для створення біспецифічних по відношенню до РО-1ї х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом, представлені в Таблиці 7.
Таблиця 7
Додаткові антитіла проти СТІ А-4 патентна публікація згідно з РСТ МО 01/54732 1001; 162 і 486 Патенти США Мо 6984720; 7605238; 8017114; 8318916 і 8784815; міжнародна патентна публікація згідно з РСТ МО 01/14424 2.1.3; 3.1.1; 4.1.1; 4.8.1; 4.9.1; 4.10.2; 4.13.1; | Патенти США Мо 6682736; 7109003; 7132281; 414.35 6.1.1; 11.21; 11.6.1; 11.71; 12.2.1; | 7411057; 7807797; 7824679; 8143379; 8491895 12.3.1; 12.3.1.1; 12.91 ї 12.9.1.1 і 8883984; міжнародна патентна публікація згідно з РСТ УМО 00/37504
Зв10; 8Н5; 8Н5-181; 3810-4Е7; 789-1АЗ; 207- | Публікація патенту США 2014/0105914; 1010; 3810-6ЕЗ і 8Н5-1А1 міжнародна патентна публікація згідно з РСТ
МО 2012/120125
З.7ЕТ10А2; 43685; 44А7Р4; 4.6С1ЕЗ; | Публікація патенту США 2009/0123477; 4.7АВНВ; 4.7Е11Р1; 4.8Н10Н5; ТОМ2122 і | міжнародна патентна публікація згідно з РСТ та7ам2г422 МО 2006/066568
ІЇ3010; 11811; К4с4; КМ10 і 12 Публікація патенту США 2009/0252741; міжнародна патентна публікація згідно з РСТ
МО 2006/029219
Е. Приклади антитіл проти СТІ А-4
І00207| Приклад антитіла проти СТІ А-4, позначений як "СТІ А-4 тАБб З С1АА" містить важкий ланцюг, що містить МН-домен СТІ А-4 тАБ З (ЗЕО ІЮ МО:90), СНІ-домен ІдС1 (ЗЕО ІЮ
МО:40), шарнірну область Іс! (5ЕО ІЮ МО:33) і домени СН2-СНЗ ІдсС1 із замінами
І 234А/ 235А (5ЕО ІО МО:43). (00208) Амінокислотна послідовність цілого важкого ланцюга СТІ А-4 тАБ З СТАА (5ЕО І
МО:92) показана нижче.
ОМОЇ МЕЗССО ММОРОВБОІ ВІ ЗСААБаєТЕВ 5УТМНУМАОА РОКИ! ЕММТЕ ІЗМУразмМкКНнУ
АрРБУКОВЕТМ 5АОМОКМТІМ ГОММ5ІВАЄО ТАІМУСАВТО УМ ОаРЕОУМУСО атІМТУ5БА5 ТКаРБМЕРІА РБЗБОКЗТБОаСТ ААГОаСІУКОМ ЕРЕРУТУБУМУМ ЗОАІТ5ИаУНТ ЕРАМІО55ОЇ
М5ІЗБУМТМР 5Б5БІСТОТМІ СМУМНКРОМІ КМОКАМЕРКЗ СОКТНТСРРО РАРЕАДОаСРБ5
МЕГЕРРКРКО ТІМІЗАТРЕМ ТСУУУМОУМ5НЕ ОРЕМКЕММУМУМ рОаМЕМНМАКТ КРАЕЕОМУМ5ЗТ
УВМУБМІТМІ НОбУІМОКЕМ КСКУЗМКАЇ Р АРІЕКТІЗКА КОСОРВЕРОММ ТІ РРОВЕЕМТ
КМОМ5ІТСІМ КагМРБОІАМ ЕМЕЗМООРЕМ МУКТТРРУГО БОБЕР ЗК ГТУрК5АМмОО
СММЕ5СЗУМН ЕАНМНУТОК 5І 51 5РОК
І00209| Приклад альтернативного антитіла проти СТІ А-4, позначеного як "СТІ А-4 тАбБ З с4Р", містить важкий ланцюг, що містить МН-домен СТІ А-4 тАбБ З (ЗЕО ІЮ МО:90), СН 1-домен
ІЧ04 (5ЕО ІЮО МО:42), стабілізовану шарнірну область Ідс4 (5ЕО ІЮ МО:36) і домени СН2-СНЗ
Іц4 без С-кінцевого лізину (ЗЕО ІЮ МО:4). Амінокислотна послідовність цілого важкого ланцюга
СТІ А-4 тАБ З С4Р показана нижче (ЗЕО ІЮ МО:93).
ОМОЇ МЕЗССО ММОРОВБОІ ВІ ЗСААБаєТЕВ 5УТМНУМАОА РОКИ! ЕММТЕ ІЗМУразмМкКНнУ
АрРБУКОВЕТМ 5АОМОКМТІМ ГОММ5ІВАЄО ТАІМУСАВТО УМ ОаРЕОУМУСО атІМТУ5БА5
ТКаРБМЕРІА РОБАБЗТО5ЕЗТ ААгОаСІУКОМ ЕРЕРУТУБУМУМ БОАІТ5ОМНІ ЕРАМ ОБОЇ
М5ІБЗБУМТМР 5Б5Б5ІСТКТУТ СМУМОНКРОМІ КМОКАМЕЗКМ СРРОРРСОРАР ЕР СОаРБМУБІ
ЕРРКРКОТІМ ІЗВАТРЕМТСМ МУМОУБОЕОРЕ МОЕМУМУМУрамМ ЕМНМАКТКРА ЕЕОЕМЗТУВУ
М5МІТМІНОО УМЛІМОаКЕУКОСК УБМКОаІ РОВІ ЕКТІЗКАКОО РАЕРОМУТІР РБОЕЕМТКМО
МБІТСІУКИаЕ МРОЗБІАМЕЖМЕ 5МООРЕММУК ТТРРМ'ОБОС БЕР У5ВІ ТМ ОК5АМОБамММ
ЕЗСЗУМНЕАЇ НМНУТОКБІ 5 І БІ С (00210) Амінокислотна послідовність цілого легкого ланцюга СТІ А-4 тАбр З СТАА їі СТІ А-4 тА З с4Р (ЗЕО ІЮО МО:94) показана нижче.
ЕІМІТО5РЕТ ІБІЗРОЕВАТ І5СВАБОБВУ 55БГГАММООК РООАРАВЦІМ сСАБЗВАТИЇІР рагЕБазават ОРТІТІЗВЕ РЕОРАМУУСО ОМУа5БЗРМТРО ОСТКМЕІКАТ МААРБМУРІЕР
РБОЕБЕОЇ КИТ АБМУСІ!ММЕ МРАЕАКМОМУК МОМАГОБОаМО ОЕБЗМТЕОО5К О5ТУ5І1551т1.
ТІ ЗКАЮУЕКН КУМАСЕМТНО СІ 55Р УТКЕ МВОЕС 002111) Обидва з прикладів антитіл проти СТІ А-4, СТІ А-4 тАБ З С1АА і СТІ А-4 тАБ З СР, містять легкий ланцюг, що містить Мі -домен СТІ А-4 тАбБ З (ЗЕО ІЮ МО:91) і СІ. каппа (ЗЕО ІЮ
МО:38).
МІ. Приклади біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул
А. Приклади чотирьохланцюгових діатіл, які містять Ес-фрагмент, що мають домени Е/К-соїїЇ
І00212| Створювали три приклади біспецифічних по відношенню до РО-1ї х СТІА-4 чотирьохланцюгових діатіл, які містять Ес-фрагмент, що мають домени Е/К-сої), які сприяють утворенню гетеродимеру (позначені як "АКТ В", "АКТ С" і "ПАКТ 0"). Структура зазначених діатіл, що містить Ес-фрагмент, докладно описана нижче. Передбачається, що зазначені приклади біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 діатіл ілюструють даний винахід і жодним чином не обмежують його обсяг. 1. АВТ В
І(00213| САКТ В являє собою біспецифічне чотирьохланцюгове діатіло, що містить Ес- фрагмент, яке містить два сайти зв'язування, специфічних по відношенню до РО-1, два сайти зв'язування, специфічних по відношенню до СТІ А-4, варіант Ес-фрагмента /дс4, сконструйований для збільшення часу напівжиття, і домени Е/К-соїЇ, що сприяють утворенню гетеродимеру. Перший та третій поліпептидні ланцюги САКТ В містять (у напрямку від М-кінця до С-кінця): М-кінець, Мі -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з СТІ А-4 (МІСТІ А-4 СТ А-4 тАБ 1 М) (ЗЕБО ІЮ МО:77); проміжний лінкерний пептид (лінкер 1: ссавзациас;і(5ЕО ІЮ МО:5)); МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО- 1 (МНРО-1 РО-1 тАБ 6-І МН) (ЗЕО ІО МО:86); цистеїнвмісний проміжний лінкерний пептид
Зо (лінкер 2: СОБСОоСО (5ЕО ІЮО МО:6)); цистеїнвмісний домен, що сприяє утворенню гетеродимеру (Е-сої) (ЕМААСЕК-ЕМААЇ ЕК-ЕМААЇ ЕК-ЕМААГ ЕК (5ЕБО ІЮ МО:20)); стабілізовану шарнірну область Іде4 (5ЕО ІО МО:36); варіант домену СН2-СНЗ 1дс4, що містить заміни
М252у/52547Т/1256БЕ і такий, що не містить С-кінцевий залишок (ЗЕО ІЮ МО:81), і С-кінець. (00214) Амінокислотна послідовність першого та третього поліпептидних ланцюгів ОАКТ В являє собою (ЗЕО ІЮ МО:95):
ЕІМІТО5РЕТ ІБІЗРОЕВАТ ІЗСВАбОВУО 55МІАММООК РЕОАРВЦІМ САЕЗВАТИЇІР рвяезазиавОатТ ОРТІТІЗАЕ РЕОРАМУУСО ОмМавеРМУТРа ОсСТКМЕКас азасвасвчОомМої
МОБОАЕЄЕУМККР САБУКУЗСКА 5ОаУ5ЕТЗУМУМ МУМУУВОАРООС! ГЕМІСМІНРО ОБЕТУМІ СОКЕ
КОВМТІТМОК ЗТЗТАУМЕЇ!5 5ІВАБ5ЕОТАММ МСАВЕНУМОСТО РЕАУМУуУСОСТІ УтУЗБЗОвИаСИас
СЕМААСЕКЕМ ААГЕКЕМААЇ ЕКЕМААЇ ЕКЕ 5КМОРРОРРО РАРЕРІ асРО МРГ ЕРРКРКО
ТІМІТВЕРЕМ ТСУУМОМ5ОЕ ОРЕМОРММУМУМ рОамМЕМНМАКТ КРАЕЄОРМОТ МАУМБМІ ТМ
НОРМІ МОКЕМ КСКУ5МКОГР 5Б5ІЕКТІЗКА КООРВЕРОМУ ТІРРБОЕЕМТ КМОМБІ ТОМ
КаРУРБОІАМ ЕМЕЗМООРЕМ МУКТТРРУГО БрОаБЕР УЗА ГТУОКЗАУМОЕ аММЕЗСБУМН
ЕАІЇ НМНУТОК 51 51 5І С (00215) Другий та четвертий поліпептидні ланцюги САКТ В містять (у напрямку від М-кінця до С-кінця): М-кінець, МІ -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (МІ РО- 1 РО-1 тАБ 6-50 МІ) (5ЕО ІЮ МО:87); проміжний лінкерний пептид (лінкер 1: СОСОБОСОО (5ЕО
ІЮО МО:5)); МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з СТІ А-4 (МНСТІ А-4
СТІ А-4 тАБ 1 МН) (ЗЕО ІС МО:76); цистеїнвмісний проміжний лінкерний пептид (лінкер 2: осо (5ЕО ІЮО МО:6)); цистеїнвмісний сприятливий утворенню гетеродимеру домен (К-соїїЇ) (КМААСКЕ-КМААЇ КЕ-КУААЇ КЕ-КМААЇ КЕ (ЗЕО ІО МО:21) і С-кінець. (00216) Амінокислотна послідовність другого та четвертого поліпептидних ланцюгів ПОАКТ В являє собою (ЗЕО ІЮ МО:96):
ЕІМІГТО5РАТ І5ІЗРОЕВАТ І5СВАБЕЗУМО ММаМ5ЕМММЕ ООКРООРРКІ ПІНААЗМОСО
СУРЗАЕЗаБа ЗОаТОгТІТтІ5 5ІЕРЕОБАММ РГСООБКЕМРУ ТРОасаткУБІ! касаБасавОо
МОІЇМЕЗБОаСОМ МОРОВ5ОІ ВІЗ СААБаЕТЕ55 МТМНУМАОАР сКагЕММТРІ зУраммкУмМА рзуУкКавЕтІ: ВОМ5КМТІМІ ОММ5ІВАЄОТ АІММСАВТОаМУ гаРЕОУМУсСОСсС ті УтУЗЗааС ас саКкмМААСКЕ КМААЇ КЕКМА АЇ КЕКМААЇ К Е 2.ВАВТ С бо І(00217| ОСАКТ С являє собою біспецифічне чотирьохланцюгове діатіло, що містить Ес-
фрагмент, яке містить два сайти зв'язування, специфічних по відношенню до РО-1, два сайти зв'язування, специфічних по відношенню до СТІ А-4, варіант Ес-фрагмента /дс4, сконструйований для збільшення часу напівжиття, і домени Е/К-соїЇ, що сприяють утворенню гетеродимеру. Перший та третій поліпептидні ланцюги САКТ С містять («у напрямку від М-кінця до С-кінця): М-кінець, Мі -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з СТІ А-4 (МІСТІ А-4 СТ А-4 тАБ 3 МІ) (ЗЕБО 10 МО:91); проміжний лінкерний пептид (лінкер 1: ссавзациас;і(5ЕО ІЮ МО:5)); МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО- 1 (МНРО-1 РО-1 тАБ 6-І МН) (ЗЕО ІО МО:86); цистеїнвмісний проміжний лінкерний пептид (лінкер 2: СОБСОСО (5ЕО ІО МО:6)); цистеїнвмісний домен, що сприяє утворенню гетеродимеру (Е-сої) (ЕМААСЕК-ЕМААЇ ЕК-ЕМААЇ ЕК-ЕМААГ ЕК (5ЕБО ІЮ МО:20)); стабілізовану шарнірну область Іде4 (5ЕО ІО МО:36); варіант домену СН2-СНЗ 1дс4, що містить заміни
М252у/52547Т/1256БЕ і такий, що не містить С-кінцевий залишок (ЗЕО ІЮ МО:81); і С-кінець. (00218) Амінокислотна послідовність першого та третього поліпептидних ланцюгів ОАКТ С являє собою (ЗЕО ІЮ МО:97):
ЕІМІТО5РЕТ ІБІЗРОЕВАТ І5СВАБОБВУ 55БГГАММООК РООАРАВЦІМ сСАБЗВАТИЇІР рвяезазиавОатТ ОРТІТІЗАЕ РЕОРАМУУСО ОмМавеРМУТРа ОсСТКМЕКас азасвасвчОомМої
МОБОАЕМККР САБУКУЗСКА 5ОаУ5ЕТЗУМУМ МУМУУВОАРООС! ГЕМІСМІНРО ОБЕТУМІ СОКЕ
КОВМТІТМОК ЗТЗТАУМЕЇ!5 5ІВАБ5ЕОТАММ МСАВЕНУМОСТО РЕАУМУуУСОСТІ УтУЗБЗОвИаСИас
СЕМААСЕКЕМ ААГЕКЕМААЇ ЕКЕМААЇ ЕКЕ 5КМОРРОРРО РАРЕРІ асРО МРГ ЕРРКРКО
ТІМІТВЕРЕМ ТСУУМОМ5ОЕ ОРЕМОРММУМУМ рОамМЕМНМАКТ КРАЕЄОРМОТ МАУМБМІ ТМ
НОРМІ МОКЕМ КСКУ5МКОГР 5Б5ІЕКТІЗКА КООРВЕРОМУ ТІРРБОЕЕМТ КМОМБІ ТОМ
КаРУРБОІАМ ЕМЕЗМООРЕМ МУКТТРРУГО БрОаБЕР УЗА ГТУОКЗАУМОЕ аММЕЗСБУМН
ЕАІЇ НМНУТОК 51 51 5І С
І002191| Другий та четвертий поліпептидні ланцюги САКТ С містять (у напрямку від М-кінця до С-кінця): М-кінець, МІ -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (МІ РО- 1 РО-1 тАБ 6-50 МІ) (5ЕО ІЮ МО:87); проміжний лінкерний пептид (лінкер 1: СОСОБОСОО (5ЕО
ІО МО:5)); МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися СТІ А-4 (МНетідл-а СТІ А-4 тАБ З МН) (ЗЕО ІЮ МО:90); цистеїнвмісний проміжний лінкерний пептид (лінкер 2: ССОССОСО (ЗБЕО 10 МО:б6)); цистеїнвмісний сприятливий утворенню гетеродимеру домен (К-соїї)
Зо (КМААСКЕ-КМААЇ КЕ-КУААЇ КЕ-КМААЇ КЕ (5ЕО І МО:21) і С-кінець. (00220) Амінокислотна послідовність другого та четвертого поліпептидних ланцюгів ОАКТ С являє собою (ЗЕО ІЮ МО:98):
ЕІМІГТО5РАТ І5ІЗРОЕВАТ І5СВАБЕЗУМО ММаМ5ЕМММЕ ООКРООРРКІ ПІНААЗМОСО
СУРЗАЕЗаБа ЗОаТОгТІТтІ5 5ІЕРЕОБАММ РГСООБКЕМРУ ТРОасаткУБІ! касаБасавОо
МОІЇМЕЗБОаСОМ МОРОВ5ОІ ВІЗ СААБаЕТЕ55 МТМНУМАОАР сКагЕММТРІ зУравмкнмА рзуУкавЕту5 ВОМОКМТІМ ОММ5ІВАєОТ АІММСАВТаМУ гаРЕОУМсСОСсС ТІ МтУЗЗааС ас саКкмМААСКЕ КМААЇ КЕКМА АЇ КЕКМААЇ К Е
З. САВТО (00221| САКТ О являє собою біспецифічне чотирьохланцюгове діатіло, що містить Ес- фрагмент, яке містить два сайти зв'язування, специфічних по відношенню до РО-1, два сайти зв'язування, специфічних по відношенню до СТІ А-4, варіант Ес-фрагмента /дс4, сконструйований для збільшення часу напівжиття, і домени Е/К-соїЇ, що сприяють утворенню гетеродимеру. Перший та третій поліпептидні ланцюги САКТ О містять (у напрямку від М-кінця до С-кінця): М-кінець, Мі -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (Мі ро-ї
РО-1 тАБ 6-50 МІ) (5ЕО ІО МО:87); проміжний лінкерний пептид (лінкер 1: СОС5О6ООО (ЗЕ
ІО МО:5)); МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися СТІ А-4 (МНетідл-а СТІ А-4 тАБ З МН) (ЗЕО ІЮ МО:90); цистеїнвмісний проміжний лінкерний пептид (лінкер 2: СОСОСО (ЗЕО І МО:6)); цистеїнвмісний домен, що сприяє утворенню гетеродимеру (Е-соїї) (ЕМААСЕК-
ЕМААЇ ЕК-ЕМААЇ ЕК-ЕМААЇ ЕК (5ЕО ІЮ МО:20)); стабілізовану шарнірну область Ідш4 (5ЕО ІЮ
МО:36); варіант домену СН2-СНЗ ІдС4, що містить заміни М252Уу/52541/1256Е і такий, що не містить С-кінцевий залишок (5ЕО ІЮ МО:81); ії С-кінець. (00222) Амінокислотна послідовність першого та третього поліпептидних ланцюгів ОАКТ ОО являє собою (ЗЕО ІЮ МО:99):
ЕІМІГТО5РАТ І5ІЗРОЕВАТ І5СВАБЕЗУМО ММаМ5ЕМММЕ ООКРООРРКІ ПІНААЗМОСО
СУРЗАЕЗаБа ЗОаТОгТІТтІ5 5ІЕРЕОБАММ РГСООБКЕМРУ ТРОасаткУБІ! касаБасавОо
МОІЇМЕЗБОаСОМ МОРОВ5ОІ ВІЗ СААБаЕТЕ55 МТМНУМАОАР сКагЕММТРІ зУравмкнмА рзуУкавЕту5 ВОМОКМТІМ ОММ5ІВАєОТ АІММСАВТаМУ гаРЕОУМсСОСсС ТІ МтУЗЗааС сСОсСЕМААСЕК ЕМАА ЕКЕМА АГЕКЕМААЇЕ КЕЗКУМОРРОР РОСРАРЕРІ СС РОМБ ЕРРКР
КОТІМІТВЕР ЕМТСУУМОУМ5 ОБОРЕМОЄММУУ МУрамМЕМНМА КТКРАЕЄОЕМ З ТУВУМ5МІТ (510) МІНОСУІМОаК ЕУКСКУЗМКО І РББІЕЄКТІ5 КАКООРВЕРО ММТІРРБОЕЕ МТКМОМ5І То
ГУКагМУРБОЇ АМЕМЕБЗМООР ЕММУКТТРРМ ГО50Оа5ЕРІ М ЗАГТУОКЗАМУ ОБаМУгБОСБМ
МНЕАЇІ НМНУТ ОКБІ 5І 5І С 00223) Другий та четвертий поліпептидні ланцюги САКТ О містять (у напрямку від М-кінця до С-кінця): М-кінець, Мі -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з СТІ А-4 (Міста СТІ А-4 тАБ З МІ) (ЗЕО ІЮ МО:91); проміжний лінкерний пептид (лінкер 1: СбССОСЗОСОО (БЕ ІО МО:5)); МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (МНео-ї РО-1 тАб 6-Ї МН) (ЗЕО ІЮО МО:86); цистеїнвмісний проміжний лінкерний пептид (лінкер 2: ВбЗОСОСО (ЗБЕО 10 МО:б6)); цистеїнвмісний сприятливий утворенню гетеродимеру домен (К-соїї) (КМААСКЕ-КМААЇ КЕ-КУААЇ КЕ-КМААЇ КЕ (5ЕО І МО:21) і С-кінець. (00224) Амінокислотна послідовність другого та четвертого поліпептидних ланцюгів ОАКТ О являє собою (ЗЕО ІЮ МО:100):
ЕІМІТО5РЕТ ІБІЗРОЕВАТ І5СВАБОБВУ 55БГГАММООК РООАРАВЦІМ сСАБЗВАТИЇІР рвяезазиавОатТ ОРТІТІЗАЕ РЕОРАМУУСО ОмМавеРМУТРа ОсСТКМЕКас азасвасвчОомМої
МОБОАЕМККР САБУКУЗСКА 5ОаУ5ЕТЗУМУМ МУМУУВОАРООС! ГЕМІСМІНРО ОБЕТУМІ СОКЕ
КОВМТІТМОК ЗТЗТАУМЕЇ!5 5ІВАБ5ЕОТАММ МСАВЕНУМОСТО РЕАУМУуУСОСТІ УтУЗБЗОвИаСИас
СКМААСКЕКМ ААІ КЕКМУААЇ КЕКМААЇ КЕ
4. САВТ Е
І(00225| САКТ Е являє собою біспецифічне чотирьохланцюгове діатіло, що містить Ес- фрагмент, яке містить два сайти зв'язування, специфічних по відношенню до РО-1, два сайти зв'язування, специфічних по відношенню до СТІ А-4, варіант Ес-фрагмента І/дс1, сконструйований для зниження/усунення ефекторної функції та для збільшення часу напівжиття, і домени Е/К-соїї, що сприяють утворенню гетеродимеру. Перший та третій поліпептидні ланцюги САКТ Е містять (у напрямку від М-кінця до С-кінця): М-кінець, МІ -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (МЕРО-1 РО-1 тАБ 6-50 МІ) (5ЕО ІО
МО:87); проміжний лінкерний пептид (лінкер 1: сос5Оос5ОсОс (5БЕО ІЮ МО:5)); МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися СТІ А-4 (МНетпа- СТІ А-4 тАБ З МН) (5ЕО І
МО:90); цистеїнвмісний проміжний лінкерний пептид (лінкер 2: ОСОо(осо (5БО ІЮ МО:6)); цистеїнвмісний домен, що сприяє утворенню гетеродимеру (Е-сої) (ЕМААСЕК-ЕМААЇ ЕК-
ЕМААЇГ ЕК-ЕМААЇ ЕК (5ЕО ІО МО:20)); лінкер (ЗЕО ІО МО:30); варіант домену СН2-СНЗ ІДС1, що
Зо містить заміни І 235А/Л 235А/М252Уу/52541/1256Е і такий, що не містить С-кінцевий залишок (ЗЕО ІО МО:80); і С-кінець. (00226) Амінокислотна послідовність першого та третього поліпептидних ланцюгів ОАКТ Е (ЗЕО ІО МО:101) являє собою:
ЕІМІГТО5РАТ І5ІЗРОЕВАТ І5СВАБЕЗУМО ММаМ5ЕМММЕ ООКРООРРКІ ПІНААЗМОСО
СУРЗАЕЗаБа ЗОаТОгТІТтІ5 5ІЕРЕОБАММ РГСООБКЕМРУ ТРОасаткУБІ! касаБасавОо
МОІЇМЕЗБОаСОМ МОРОВ5ОІ ВІЗ СААБаЕТЕ55 МТМНУМАОАР сКагЕММТРІ зУравмкнмА рзуУкавЕтУ5 ВОМеКМТІМІ ОММ5ІВАЕОТ АІММСАВТаМУ гаРЕОУМсСОСсС ТІ МтУЗЗааС сСОсСЕМААСЕК ЕМААГЕКЕМА АГЕКЕМААЇ Е КІГЕРКБЗАОКТ НТСРРСОРАРЕ ААсСаРБМУНІЕ
РРКРКОТІМІ ТАЕРЕМТСММ МОУ5НЕОРЕМ КЕММУУМУраМЕ УНМАКТКРВАЕ ЕОУМЗ5ТУВУМ
ЗМІ ТМІНОСМУ ІМОКЕУКСКУМ 5МКАГРАРІЕ КТІЗКАКООР ВЕРОМУТІРР 5АЕЕМТКМОМ
ЗІТСІУКОаЕМ РБЗОІАМЕМЖМЕЗ МООРЕММУКТ ТРРМ'ОБОСе БЕРІМБ5КІТУО кКкЗАМСбсММЕ
ЗСЗММНЕАЇІ Н МНУТОК5БІ 5І ЗРО
І00227| Другий та четвертий поліпептидні ланцюги САКТ Е містять (у напрямку від М-кінця до С-кінця): М-кінець, Мі -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з СТІ А-4 (Міста СТІ А-4 тАБ З МІ) (ЗЕО ІЮ МО:91); проміжний лінкерний пептид (лінкер 1: СбССОСЗОСОО (ЗЕО І МО:5)); МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (МНРО-1 РО- 1 тАБ 6-І МН) (ЗЕО ІО МО:86); цистеїнвмісний проміжний лінкерний пептид (лінкер 2: СООССОСО (ЗБЕО 10 МО:б6)); цистеїнвмісний сприятливий утворенню гетеродимеру домен (К-соїї) (КМААСКЕ-КМААЇ КЕ-КУААЇ КЕ-КМААЇ КЕ (5ЕО І МО:21) і С-кінець. (00228) Амінокислотна послідовність другого та четвертого поліпептидних ланцюгів ОАКТ Е є такою самою, як амінокислотна послідовність другого та четвертого поліпептидних ланцюгів рРАВТ О (ЗЕО ІЮ МО 100).
В. Приклади чотирьохланцюгових діатіл, що містять Ес-фрагмент, які містять СІ /СНІ1- домени: ОАКТ Е
ІЇ00229| Був створений приклад біспецифічного по відношенню до РО-1ї х СТІА-4 чотирьохланцюгового діатіла, що містить Ес-фрагмент, який містить СГ/СНІ-домени і позначений як "САКТ Е". Структура зазначених діатіл, що містить Ес-фрагмент, докладно описана нижче. Передбачається, що зазначений приклад біспецифічного по відношенню до РО- 1 х СТІ А-4 діатіла ілюструє даний винахід і жодним чином не обмежує його обсяг. бо І(00230| ОСАКТ Е являє собою біспецифічне чотирьохланцюгове діатіло, що містить Ес-
фрагмент, яке містить два сайти зв'язування, специфічних по відношенню до РО-1, два сайти зв'язування, специфічних по відношенню до СТІ А-4, СІ /СНІ-домени і варіант Ес-фрагмента
Іц904, сконструйований для збільшення часу напівжиття. Перший та третій поліпептидні ланцюги
БАКТ Е містять (у напрямку від М-кінця до С-кінця): М-кінець; Мі -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з СТІ А-4 (Мі стід4 СТІ А-4 тАБ З МІ) (ЗЕО ІЮ МО:91); проміжний лінкерний пептид (лінкер 1: ССОБОСОО (5ЕО ІЮ МО:5)); МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (МНео-ї РО-1 тАБ 6-І МН) (ЗЕО ІЮ МО:86); проміжний лінкерний пептид (лінкер 2: ГООО5О (5БО ІЮ МО:8)); СНІ-домен Ід54 (5ЕО ІЮ МО:42); стабілізовану шарнірну область Ідс4 (5ЕО ІЮО МО: 36); варіант домену СН2-СНЗ ІдС4, що містить заміни
М252Уу/525471/1256БЕ і такий, що не містить С-кінцевий залишок (ЗЕО ІЮ МО:81), і С-кінець. (00231) Амінокислотна послідовність першого та третього поліпептидних ланцюгів ОАКТ Е являє собою (ЗЕО ІЮ МО:102):
ЕІМГТОБРИЕТ ІБІЗ5РОЕВАТ ІЗСААБОБУМ5 ЗЗР АММООК РООАРВІІМ сСАБЗНААТИЇР рвяезазиавОатТ ОРТІТІЗАЕ РЕОРАМУУСО ОмМавеРМУТРа ОсСТКМЕКас азасвасвчОомМої
МО5ОАЄЕУМККР САБУКУЗСКА 5ОаУЗЕТЗУМУМ МУМУУВОАРООС! ГЕМІСМІНРО ОБЕТУМІ СОКЕ
КОВМТІТМОК З ТЗТАММЕЇ!5 5ІВЗЕОТАМУ УСАВЕНУИТ5 РЕАУМУуУСОСТІ ТУ асо
САБТКОРОМЕ РІАРСЗНА5ОТО ЕБТААГОСІМ КОМЕРЕРМТМ БМУМ5ЗОАІ! 50 УНТЕРАМ О5
За М5І5Б5ММ ТУРБЗББІТК ТУТОМУОНнНКР 5МТКМОКАМЕ 5КМОРРСОРРО РАРЕРІ СРБ5
МЕГЕРРКРКО ТІМІТВЕРЕМ ТСУМУМОМ5ОЕ ОРЕМОЕЄЕММУМ рамМмЕМНМАКТ КРА!ЕЕЄОЕМ5ЗТ
МвАМУБМІТМІ НООУІМОаКЕМ КСКУЗМКОІР 5БІЕКТІЗКА КООРАВЕРОМУ ТІ РРЗОЕЕМТ
КМОМ5ІТСІМ КагМРБОІАМ ЕМЕЗМООРЕМ МУКТТРРМІО БОБЕР МА ГТУОКЗАУМОЕ
СММЕЗСОСЗУМН ЕАГНМНУТОК 51 51 51 с
І00232| Другий та четвертий поліпептидні ланцюги САКТ Е містять (у напрямку від М-кінця до С-кінця): М-кінець; Мі -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (Мі ро-ї
РО-1 тАБ 6-50 МІ) (5ЕО ІО МО:87); проміжний лінкерний пептид (лінкер 1: СООССБОССОО (ЗЕО
ІО МО:5)); МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися СТІ А-4 (МНетідл-а СТІ А-4 тАб З МН) (ЗЕО ІО МО:90); проміжний лінкерний пептид (лінкер 2: (0055 (5ЕО ІЮО МО:8)); СІ - домен каппа (5ЕО ІЮ МО:38) і С-кінець.
І00233| Амінокислотна послідовність другого та четвертого поліпептидних ланцюгів ОАКТ Е
Зо являє собою (ЗЕО ІЮ МО:103):
ЕІМІГТО5РАТ І5ІЗРОЕВАТ І5СВАБЕЗУМО ММаМ5ЕМММЕ ООКРООРРКІ ПІНААЗМОСО
СУРЗАЕЗаБа ЗОаТОгТІТтІ5 5ІЕРЕОБАММ РГСООБКЕМРУ ТРОасаткУБІ! касаБасавОо
МОІЇМЕЗБОаСОМ МОРОВ5ОІ ВІЗ СААБаЕТЕ55 МТМНУМАОАР сКагЕММТРІ зУравмкнмА рзУкавЕту5 ВОМЗ5КМТІМІ ОММ5ІВАЕОТ АЇМУСАВТОМ ГОаРЕОММУСОС ТІ МТУ5Б5І са аБаВвВТМААРБ МУРІЕРРБОЕО ІК5аТАБУММС 11 ММЕМРАЕБЕА КУМОМУКМОМАЇ ОБОаМБОЕЗМТ
ЕООБКОБТУ5 І 55ТІ ТІ КА ОМЕКНКММАС ЕМТНОСІ 556. УТКЗЕМАВСЕС
С. Приклади трьохвалентних сполучних молекул, що містять Ес-фрагменти
І00234| Були створені два приклади біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 чотирьохланцюгових трьохвалентних сполучних молекул, що містять Ес-фрагмент (позначених як "ТКІОЕМТ А" ї "(«КІОЕМТ В"). Структура зазначених трьохвалентних сполучних молекул, що містять Ес-фрагмент докладно описана нижче. Також нижче представлений трьеохланцюговий варіант, позначений як "ТКІОЕМТ С", який може бути створений. Зазначені приклади біспецифічних по відношенню до РО-ї х СТІ А-4 трьохвалентних сполучних молекул запропоновані для ілюстрації даного винаходу та жодним чином не обмежують його обсяг. 1. ТКІОЕМТ А (ТРИЗУБЕЦЬ А) (00235) ТКІСЕМТ А являє собою біспецифічну, чотирьохланцюгову, що містить Ес-фрагмент трьохвалентну сполучну молекулу, яка містить два сайти зв'язування, специфічних по відношенню до РО-1, один сайт зв'язування, специфічний по відношенню до СТІ А-4, варіант Ес- фрагмента Ідс4, що містить "виступ"/"'западину", сконструйований для збільшення часу напівжиття, домени Е/К-соїїЇ, що сприяють утворенню гетеродимеру, і СГ/СНІ1-домени. Перший поліпептидний ланцюг ТКІОЕМТ А містить (у напрямку від М-кінця до С-кінця): Мі -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (Мі го РО-1 тА 6-50 МІ) (5ЕО І
МО:87); проміжний лінкерний пептид (лінкер 1: сос5Оос5ОсОс (5БЕО ІЮ МО:5)); МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (МНер- РО-1 тА 6-І МН) (ЗЕО І
МО:86); цистеїнвмісний проміжний лінкерний пептид (лінкер 2: ОСОо(осо (5БО ІЮ МО:6)); цистеїнвмісний домен, що сприяє утворенню гетеродимеру (Е-сої) (ЕМААСЕК-ЕМААЇ ЕК-
ЕМААЇ ЕК-ЕМААЇ ЕК (ЗЕО ІЮО МО:20)); стабілізовану шарнірну область Ід54 (ЗЕО ІЮО МО: 36); домен СН2-СНЗ Ід04, що містить "виступ" і заміни М252Уу/52547Т/1256Е і такий, що не містить С- кінцевий залишок (ЗЕО ІЮ МО:84), і С-кінець. бо І00236| Амінокислотна послідовність першого поліпептидного ланцюга ТКІОЕМТ А являє собою (ЗЕО ІО МО:104):
ЕІМІГТО5РАТ І5ІЗРОЕВАТ І5СВАБЕЗУМО ММаМ5ЕМММЕ ООКРООРРКІ ПІНААЗМОСО
СУРЗАЕЗаБа ЗОаТОгТІТтІ5 5ІЕРЕОБАММ РГСООБКЕМРУ ТРОасаткУБІ! касаБасавОо
МОГМО5ОАЕМ ККРОАБУКУ5 СКАБОаМОЕТ5 УМУММУМУМАВОАР СОС ЕМСОМІ НРЗОЗЕТУМ О ОКеЕКОВМТІТ МОКЗТЗТАМУМ Б! 55ІА5ЕОТ АМУУСАВЕНУ СаТ5РЕАУМУСО атіУтУзаа
СОасСОЕМААСЕ КЕМААЇ ЕКЕМ ААГЕКЕМААЇ ЕКЕЗКМОРРО РРОРАРЕБ С аРБУРБІ ЕРРК
РКОТІМІТВЕ РЕМТСУММОМ 5ОЕБЕОРЕМОРМ УУМУУрамЕУМНМ АКТКРАЕЄОЕ МЗТУВУМУБМІ
ТМІНООСУМІ Ма КЕМКСКУБМК СІ РОБІЕЄКТІ ЗКАКСОРАВЕР ОММТІРРБОЕ ЕМТКМОМУБІЛМ
СІУКаЕМРБО ІАМЕМЖМЕЗМОО РЕММУКТТРР Мі ОБООБЕРІ М5ВІТУОКО5А МмОБєамМмУБг5о5
ММНЕАЇ НМНУ ТОКБІ 5І 5І С
І00237| Другий поліпептидний ланцюг ТКІСЕМТ А містить (у напрямку від М-кінця до С- кінця): М-кінець, МІ -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (МІ ро-ї РО-1 тА 6-50 МІ) (ЗЕО ІЮ МО:87); проміжний лінкерний пептид (лінкер 1: СбО6О5ОООО (ЗЕО ІЮ
МО:5)); МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (МНео-ї РО-1 тА 6-Ї
МН) (ЗЕО ІО МО:86); цистеїнвмісний проміжний лінкерний пептид (лінкер 2: СОСОоСО (5ЕО ІЮ
МО:6)); цистеїнвмісний сприятливий утворенню гетеродимеру домен (К-сої) (КМААСКЕ-
КМААЇ КЕ-КУААЇ КЕ-КМААЇ КЕ (ЗЕО ІО МО:21)) і С-кінець.
І00238| Амінокислотна послідовність другого поліпептидного ланцюга ТКІОЕМТ А являє собою (ЗЕО ІО МО:105):
ЕІМІГТО5РАТ ІЗІ5РОЕВАТ І5СВАБЕЗУМО ММОаМ5ЗЕММУУЕ ООКРООРРКІ ІІНААЗМОСО аУРЗАЕЗаБа ЗБатТОгТІТтІ5 51ЕРЕОБРАМУ ЕСООБКЕМРУ тТРасатТКкМЕ КкКасаЗааИасО
МОГМО5ОАЕМ ККРОАБУКУ5 СКАБОаМОЕТ5 УМУММУМУМАОАР СОС ЕУЛОМІ НРБЗОЗЕТУМ 0
ОКЕКОВМТІТ МОК5ОТЗТАМУМ Б! 55ІА8А5ЕОТ АМУУСАВЕНУ СТ5РЕАУМСО атіУтУЗас
СасакмМААСК ЕКМААЇ КЕКМ ААЇ КЕКМААЇ. КЕ (002391 Третій поліпептидний ланцюг ТКІОЕМТ А містить (у напрямку від М-кінця до С-кінця):
М-кінець; МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися СТІ А-4 (МНепда СТІ А-4 тА З МН) (ЗЕО І МО:90); СНІ-домен Ідс4 (ЗЕО ІЮ МО:42); стабілізовану шарнірну область
Іч04 (ЗЕО ІЮ МО: 36); домен СН2-СНЗ ІдС4, що містить "западину" і заміни М252Уу/52541/1256Е і такий, що не містить С-кінцевий залишок (ЗЕО ІЮ МО:81), і С-кінець.
Зо І00240| Амінокислотна послідовність третього поліпептидного ланцюга ТКІСОЕМТ А являє собою (ЗЕО ІО МО:106):
ОМОЇ МЕЗССО ММОРОВБІ ВІ 5СААБОЕТЕВ 5МТМНУМАВОА РОКИ ЕМУМТЕ ІЗУИВОССЗМКНУ
АрРБУКОВЕТМ 5ВОМ5КМТІМ ГОММ5ІВАЄО ТАІМУСАВТО УЛ ОРЕОМУУСВО атімтТУ5БА5
ТКаРБМЕРІА РОБАБОТОЕБЗТ ААгОасСІМКОМ ЕРЕРУМТУБУМУМ ЗА! Т5ОМНТІ ЕРАМІ О55(11
М5ІЗБ5УММТМР 55БІСТКТУТ СМУОНКРОМІ КУОКАМЕЗКМ ОСРРОРРСОРАР ЕР ааРБЗМБІ.
ЕРРКРКОТІ М ІТВЕРЕМТСМ УМОУ5БОБЕОРЕ МОРММУУУрамМ єЕМНМАКТКРА ЕЕОЕМЗТУВУ
М5МІТМІНОО УЛІМОаКЕМКОСК УБМКОЇ РОБІ ЕКТІЗКАКОО РАЕРОМУТІР РБЗОЕЕМТКМО
М5ІЗСАУКОЕ УРБЗОІАМЕЖМЕ 5МООРЕММУК ТТРРМ'ЮБОС ЕР М5ВІ ТМ оКЗАМОБаммУ
ЕЗСЗУМНЕАГЇ НМАУТОКБІ 5 І БІ С (00241| Четвертий поліпептидний ланцюг ТКІОЕМТ А містить (у напрямку від М-кінця до С- кінця): М-кінець; МІ -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з СТІ А-4 (Мі сті дл
СТІ А-4 тАбБ З МІ) (З5ЕО ІО МО:91); СІ -домен каппа (ЗЕО ІО МО:38) і С-кінець. (00242) Амінокислотна послідовність четвертого поліпептидного ланцюга ТКІОЕМТ А являє собою (ЗЕО ІО МО:107):
ЕІМІТО5РИЕТ ІБІЗРОЕВАТ І5СВАБОБВУ5 55БГАММООК РЕООАРВ ІМ сСАБЗАВАТИЇР рагБазават ОРТІТІ5ВЕ РЕОРАМУУСО ОУСа5БРМТРО ОСТКМУБІКАТ МААРБМРІЕР
РБОЕБЕОЇ КИТ АБМУСІ!ММЕ МРАЕАКМОМУК МОМАГОБОаМе ОБЕБЗМТЕОО5К О5ТУ5І 55171
ТІ ЗКАЮМЕКН КУМАСЕМТНО СІ 55РУТКОЕ МАСЕС 2. ТКІОЕМТ В (ТРИЗУБЕЦЬ В) (00243) ТКІОЕМТ В являє собою біспецифічну чотирьохланцюгову трьеохвалентну сполучну молекулу, що містить Ес-фрагмент, й яка містить два сайти зв'язування, специфічні по відношенню до РО-1, один сайт зв'язування, специфічний по відношенню до СТІ А-4, варіант Ес- фрагмента Ідс1!ї, що містить "виступ"/"западину", сконструйований для зниження/усунення ефекторної функції та для збільшення часу напівжиття, домени Е/К-сої, що сприяють утворенню гетеродимеру, і СГ/СНІ1-домени. Перший поліпептидний ланцюг ТКІОЕМТ В містить (у напрямку від М-кінця до С-кінця): МІ -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (Мі грі РО-1 тА 6-50 МІ) (5ЕО ІЮ МО:87); проміжний лінкерний пептид (лінкер 1: ссавзациас;і(5ЕО ІЮ МО:5)); МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО- 1 (МНер-ї РО-1 тАбБ 6-І МН) (ЗЕО ІЮ МО:86); цистеїнвмісний проміжний лінкерний пептид (лінкер бо 2: воСосо (5ЕО І МО:6)); цистеїнвмісний домен, що сприяє утворенню гетеродимеру (Е-соїї)
(ЕМААСЕК-ЕМААЇ ЕК-ЕМААЇ ЕК-ЕМААЇГ ЕК (5ЕО ІЮ МО 20)); лінкер (ЗЕО ІЮО МО: 31); домен СН2-
СНЗ ІДС, що містить "виступ" і заміни І 234А/Л 235А/М252У/52547Т/ Т256Е і такий, що не містить
С-кінцевий залишок (5ЕО ІЮ МО:82), і С-кінець. (00244) Амінокислотна послідовність першого поліпептидного ланцюга ТКІОЕМТ В являє собою (ЗЕО ІО МО:108):
ЕІМІГТО5РАТ І5ІЗРОЕВАТ І5СВАБЕЗУМО ММаМ5ЕМММЕ ООКРООРРКІ ПІНААЗМОСО
СУРЗАЕЗаБа ЗОаТОгТІТтІ5 5ІЕРЕОБАММ РГСООБКЕМРУ ТРОасаткУБІ! касаБасавОо
МОГМО5ОАЕМ ККРОАБУКУ5 СКАБОаМОЕТ5 УМУММУМУМАВОАР СОС ЕМСОМІ НРЗОЗЕТУМ О
ОКЕКОВМТІТ МОКОТОТАММ Б! 55ІА5ЕОТ АМУУСАВЕНУ СсСТ5РЕАУМУСО сті туба
СОасСОЕМААСЕ КЕМААЇ ЕКЕМ ААГЕКЕМААЇ ЕКаСИаОКТНІ СРРОРАРЕАА сОаРБЗМБІЕРР
КРКОТІМІТА ЕРЕМТСУММО М5НЕОРЕМКЕ МУУМУрамМЕМН МАКТКРАЕЄО УМ5ТУВУУБМ
ІТМІНОСУМІМ СКЕМКСКМУМЗМ КАЇРАРІЕКТ ІЗКАКООРАЕ РОММУТІРРЗА ЕЕМТКМОМ5І.
МСІУМКОаЕМРЗ ОІАМЕЖМЕЗМО ОРЕММУКТТР РМІОБООЗЕЕ 1У5КІТУрКке вУСбаМУг5о
ЗУМНЕАЇ НМН УТОКБІ БІ БР ак
І00245| Другий поліпептидний ланцюг ТКІОЕМТ В містить (у напрямку від М-кінця до С- кінця): М-кінець, МІ -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (МІ ро-ї РО-1 тА 6-50 МІ) (ЗЕО ІЮ МО:87); проміжний лінкерний пептид (лінкер 1: СбО6О5ОООО (ЗЕО ІЮ
МО:5)); МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (МНРО-1 РО-1 тАБ 6-І МН) (ЗЕО ІЮ МО:86); цистеїнвмісний проміжний лінкерний пептид (лінкер 2: ВбОСОСсО (560
ІЮО МО:6)); цистеїнвмісний сприятливий утворенню гетеродимеру домен (К-сої)) (КМААСКЕ-
КМААЇ КЕ-КУААЇ КЕ-КМААЇ КЕ (ЗЕО ІО МО:21)) і С-кінець. (00246) Амінокислотна послідовність другого поліпептидного ланцюга ТКІОЕМТ В є такою самою, як амінокислотна послідовність другого поліпептидного ланцюга ТКІОЕМТ А (5ЕО ІЮ
МО:105): (00247| Третій поліпептидний ланцюг ТКІОЕМТ В містить (у напрямку від М-кінця до С-кінця):
М-кінець; МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися СТІ А-4 (МНепда СТІ А-4 тА З МН) (ЗЕО ІЮ МО:90); СНІ-домен Ід1 (ЗЕО ІЮ МО:40); шарнірну область Ідс1 (ЗЕО ІЮ
МО:33); домен СН2-СНЗ ІдС1, що містить "западину" і заміни І 234А/ 235А/М252У/52541/1256Е і такий, що не містить С-кінцевий залишок (ЗЕО ІЮ МО:83), і С-кінець.
Зо (00248) Амінокислотна послідовність третього поліпептидного ланцюга ТКІСОЕМТ В являє собою (ЗЕО ІО МО:109):
ОМОЇ МЕЗССО ММОРОВБІ ВІ 5СААБОЕТЕВ 5МТМНУМАВОА РОКИ ЕМУМТЕ ІЗУИВОССЗМКНУ
АРБУКОВЕТМ 5ВОМ5КМТІМ ГТОММ5ІВАЄО ТАЇМУСАВТа УЛОаРЕОММУСО атімуТУ5БА5
ТКаРБМЕРІА РБЗБЗКЗТ5ИаСТ ААГОасСІМКОМ ЕРЕРУТУ5БМУМ ЗСОАІ!Т5ОаУНТІ ЕРАМІО55ОЇ
М5ІЗБУМТМР 55БІСТОТМІ СМУМНКРОМТ КУОКАМЕРКО СОКТНТСРРО РАРЕААСОаРБ5
МЕГЕРРКРКО ТІМІТВЕРЕМ ТСУММОУ5НЕ ОРЕМКЕММУУМУМ рамЕМНМАКТ КРАЕЄОММ5Т
УВМУБМІТМІ НОМ МОаКЕМ КСКУБЗМКАЇ Р АРІЕКТІЗКА КООРВЕРОМУ ТІ РРОВЕЕМТ
КМОМБІЗСАМ КагМРБОІАМ ЕМЕЗМООРЕМ МУКТТРРМГО 5ба5ЕР МК ІТУоКЗАМСО
СММЕБ5СОСЗУМН ЕАЇ НМАМУТОК 51 5І 5РОК
І00249| Четвертий поліпептидний ланцюг ТКІОЕМТ В містить (у напрямку від М-кінця до С- кінця): М-кінець; МІ -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з СТІ А-4 (Мі сті дл
СТІ А-4 тАбБ З МІ) (З5ЕО ІО МО:91); СІ -домен каппа (ЗЕО ІО МО:38) і С-кінець.
І00250| Амінокислотна послідовність четвертого поліпептидного ланцюга ТКІОЕМТ В є такою самою, як амінокислотна послідовність другого поліпептидного ланцюга ТКІОЕМТ А (ЗЕО
ІО МО:107). 3. ТВІОЕМТ С (ТРИЗУБЕЦЬ С) (00251) Як запропоновано у даній заявці, трьохвалентні сполучні молекули, які містять три поліпептидні ланцюги, можна створювати шляхом об'єднання сполучних доменів двох окремі поліпептидні ланцюгів в один ланцюг (наприклад, шляхом гібридизації кодуючих полінуклеотидів і т. д.). Одна біспецифічна трьеохланцюгова трьохвалентна сполучна молекула, що містить ЕРсо-фрагмент, яка може бути сконструйована, містить два сайти зв'язування, специфічних по відношенню до РО-1, один сайт зв'язування, специфічний по відношенню до
СТІ А-4, варіант Ес-фрагмента Ід04, що містить "виступ"/"'западину", сконструйований для збільшення часу напівжиття, і домени Е/К-сої, що сприяють утворенню гетеродимеру (ТКІСОЕМТ С"). Перший та другий поліпептидні ланцюги ТКІОЕМТ С можуть бути ідентичні першому та другому поліпептидному ланцюгу ТКІОЕМТ А, представленим вище. (00252) Якщо перший та другий ланцюги ідентичні першому та другому ланцюгу ТКІОЕМТ А, третій поліпептидний ланцюг ТКІОЕМТ С може містити (у напрямку від М-кінця до С-кінця): М- кінець; Мі -домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з СТІ А-4 (МІ СТІ А-4 СТІ А-4 (510) тАр 3 МІ) (ЗЕО ІЮ МО:91); проміжний спейсерний пептид (бСОС5ОоООо5ООсСО5 (5ЗЕО ІЮ
МО:37)); МН-домен моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з СТІ А-4 (Мі стіл СТІ А-4 тАб З МІ) (ЗЕО ІЮ МО:90); стабілізовану шарнірну область Ідс4 (ЗЕО ІО МО: 36); домен СН2-
СНЗ ІдСЯ4, що містить "западину" та заміни М252у/52541/1256Е і такий, що не містить С- кінцевий залишок (ЗЕО ІЮ МО:85), і С-кінець.
ІЇ00253| Таким чином, амінокислотна послідовність третього поліпептидного ланцюга
ТАІРЕМТ С являє собою (ЗЕО ІЮ МО:110):
ЕІМІТО5РИЕТ ІБІЗРОЕВАТ І5СВАБОБВУ5 55БГАММООК РЕООАРВ ІМ сСАБЗАВАТИЇР рвяезазиавзОатТ ОРТІТІЗВЕ РЕОРАМУМСО ОМаБОРМУТРа ОСТКМБІКасС саБССсОСаБаС па5ОМОЇМЕЗ аОаСУМОРОНО ІВІЗСААБОЕ ТЕ55УТМНУМ ВОАРОКОГЕМ МТРІЗУрИаБМ
КНУАОБУКИаАВ ЕТУЗАОМОКМ ТІМОММ5ІА АЕОТАІММСА ВТОУОаРЕОМ МУсОоатІіМТУ5
ЗЕЗКУОРРСОР РОРАРЕРІ СС РОМБ ЕРРКР КОТІМІТВЕР ЕМТСУММОУ5 ОБОРЕМОЕММУ
МУМОраТмМЕУНМА КТКРАЕЄОРМ БТУВУМ5МІТ МІНООСУМІМОаК ЕУКСКУЗМКОа І РББІЕКТІ5
КАКООРВЕРО МУТІРРБОЕЕ МТКМОМ5І С АМКаРМРБЗОЇ АМЕМЕБЗМООР ЕММУКТТРРМУ
ГгОоБРОаБЕРГМ ЗА ТМОКЗАМУ ОБЕММЕ5СОСЗМ МНЕАІ НМАМТ ОКОІ 5І БІ а
ЇХ. Способи одержання (00254) Біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом найбільше переважно одержують шляхом рекомбінантної експресії молекул нуклеїнової кислоти, що кодують зазначені поліпептиди, як добре відомо в даній області техніки.
І00255| Поліпептиди згідно з винаходом можна успішно одержувати із застосуванням твердофазного пептидного синтезу (МеггійеЯ, В. (1986) "Зоїй РНназе БЗупіпевів," Зсієпсе 232 (4748):341-347; Ноцдніеп, В.А. (1985) "Сепега! Меїйод Рог Те Варій 5оїіід-Рназе 5упіпевів. ОЇ
Іагде Митбегз ОЇ Реріїдев: З5ресіїйсну ОГ Апііїдеп-Апіїроду Іпіегасіюп Аї Тне І єме! ОГ Іпаїмідца!
Атіпо Асідв," Ргос. МаїЇ. Асад. Зсі. (США) 82 (15):5131-5135; Сапезап, А. (2006) "Зоїїа-РНназе зЗупіпевзів Іп Тпе Тмепіу-Рігві Сепіигу," Міпі Нем. Мед. Спет. 6(1):3-10).
І00256| В якості альтернативи, антитіла можна одержати рекомбінантним шляхом й експресувати за допомогою способу, відомого в даній області техніки. Антитіла можна одержувати рекомбінантним шляхом, виділяючи спочатку антитіло, отримане від тварини- хазяїна, визначаючи його генну послідовність та використовуючи зазначену генну послідовність для рекомбінантної експресії антитіла в хазяйських клітинах (наприклад, клітинах СНО). Інший
Зо спосіб, який можна використовувати, являє собою експресію послідовності антитіла в рослинах (наприклад, тютюні) або молоці трансгенних тварин. Були описані підходящі способи рекомбінантної експресії антитіл у рослинах або молоці (див. наприклад, Рееїег5 еї аї. (2001) "Ргодисіюп ОЇ Апіїродієз Апа Апіїроду Егадтепів Іп Ріапів," Массіпе 19:2756; І опрега, М. еї аї. (1995) "Нитап Апііродіез ЕГгот Тгапздепіс Місе," Іпї. Неум. Іттипої! 13:65-93; апа РоїоскК еї а). (1999) "Ттапздепіс МіїК Аз А МеїШтоай Рог Тне Ргодисіюп ОЇ Весотрбіпапі Апііродієв," У. Іттипої
МеїфШоа5 231:147-157). Підходящі способи створення похідних антитіл, наприклад, гуманізованого антитіла, одноланцюгового антитіла та т. д., відомі в даній області техніки і були описані вище. Відповідно до іншого альтернативного варіанта, антитіла можуть бути отримані рекомбінантним шляхом за допомогою технології фагового дисплею (див., наприклад, патенти
США Мо 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 6,265,150; і М/іпіег, 0. еї а). (1994) "МакКіпу Апіїбодієз Ву
Рпаде Оізріау Тесппоіоду," Аппи. Нем. Іттипої. 12.433-455).
І00257| Вектори, які містять полінуклеотиди, що цікавлять (наприклад, полінуклеотиди, що кодують поліпептидні ланцюги біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом), можна вбудовувати в хазяйську клітину за допомогою будь-якого з ряду підходящих способів, включаючи електропорацію, трансфекцію з використанням хлориду кальцію, хлориду рубідію, фосфату кальцію, ЮОЕАЕ-декстрану або інших речовин; бомбардування мікрочастинками; ліпофекцію й інфекцію (наприклад, де вектор являє собою інфекційний агент, такий як вірус вісповакцини). Вибір векторів або полінуклеотидів для введення часто залежить від характеристик хазяйської клітини. (00258) Будь-яку хазяйську клітину, здатну експресувати на підвищеному рівні гетерологічну
ДНК, можна застосовувати для експресії поліпептиду, що цікавить, або білка. Необмежуючі приклади підходящих хазяйських клітин ссавців включають, але не обмежуються клітинами
СО5, Нега і СНО.
І00259| Винахід включає поліпептиди, які містять амінокислотну послідовність біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом. Поліпептиди згідно з даним винаходом можуть бути отримані за допомогою процедур, відомих в даній області техніки. Поліпептиди можуть бути отримані шляхом протеолітичної або іншої деградації антитіл, за допомогою рекомбінантних способів (тобто у вигляді окремих або гібридних поліпептидів), як описано вище, або за допомогою хімічного синтезу. Поліпептиди антитіл, зокрема, короткі бо поліпептиди розміром до приблизно 50 амінокислот, зручно одержувати шляхом хімічного синтезу. Методи хімічного синтезу відомі в даній області техніки й є комерційно доступними. 00260) Винахід включає варіанти біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул, що містять функціонально еквівалентні поліпептиди, які значно не впливають на властивості зазначених молекул, а також варіанти, що мають підвищену або знижену активність.
Модифікація поліпептидів відноситься до стандартної практики в даній області техніки і не має потреби в докладному описі у даній заявці. Приклади модифікованих поліпептидів включають поліпептиди з консервативними замінами амінокислотних залишків, з однією або більше делеціями або додаваннями амінокислот, які не виявляють значного негативного впливу на функціональну активність, або з використанням хімічних аналогів. Амінокислотні залишки, які можна заміняти один на одного в якості консервативних замін, включають, але не обмежуються наступними: гліцин/аланін; серин/треонін; валін/ізолейцин/лейцин; аспарагін/глутамін; аспарагінова кислота/глутамінова кислота; лізин/аргінін і фенілаланін/тирозин. Зазначені поліпептиди також включають глікозильовані та неглікозильовані поліпептиди, а також поліпептиди з іншими пост-трансляційними модифікаціями, такими як, наприклад, глікозилювання різними цукрами, ацетилування та фосфорилювання. Переважно, амінокислотні заміни є консервативними, тобто заміняюча амінокислота має хімічні властивості, подібні з властивостями вихідної амінокислоти. Такі консервативні заміни відомі в даній області техніки, їх приклади були запропоновані вище. Амінокислотні модифікації можуть варіювати від зміни або модифікування однієї або більше амінокислот до повної реконструкції ділянки, такої як варіабельний домен. Зміни у варіабельному домені можуть призводити до зміни афінності зв'язування та/або специфічності. Інші способи модифікування включають застосування методів комбінації, відомих в даній області техніки, включаючи, але не обмежуючись, ферментативні способи, окисне заміщення та хелатування. Модифікації можна використовувати, наприклад, для приєднання міток для імунологічного аналізу, такого як приєднання радіоактивних фрагментів для радіоіїмунологічного аналізу. Модифіковані поліпептиди можна одержувати за допомогою загальноприйнятих в даній області техніки методів і піддавати скринінгу за допомогою стандартних аналізів, відомих в даній області техніки.
І00261| Винахід включає гібридні білки, які містять один або більше з поліпептидів або антитіл згідно з даним винаходом. Відповідно до одного варіанта реалізації винаходу запропонований гібридний поліпептид, який містить легкий ланцюг, важкий ланцюг або легкий та важкий ланцюг. Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу гібридний поліпептид містить гетерологічний константний домен імуноглобуліну. Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу гібридний поліпептид містить варіабельний домен легкого ланцюга та варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, отриманого з привселюдно доступної депонованої гібридоми. З метою даного винаходу, гібридний білок антитіла містить один або більше поліпептидних доменів, які специфічно зв'язуються з РО-1 і/або СТІ А-4, й іншу амінокислотну послідовність, до якої він не приєднаний у нативній молекулі, наприклад, гетерологічну послідовність або гомологічну послідовність з іншої ділянки.
Х. Способи застосування біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом (00262) Даний винахід включає композиції, включаючи фармацевтичні композиції, які містять біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом (наприклад, біспецифічні антитіла, біспецифічні діатіла, трьохвалентні сполучні молекули і т. д., поліпептиди, отримані з таких молекул, полінуклеотиди, які містять послідовності, кодують такі молекули або поліпептиди, й інші агенти, описані у даній заявці.
І00263| Як обговорюється вище, РО-1 і СТІ А-4 відіграють важливу роль в негативній регуляції імунних відповідей (наприклад, проліферації, функціонування та гомеостазу імунних клітин). Біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом здатні інгібувати функцію РО-1 й у такий спосіб обертати опосередковане РО-1 пригнічення імунної системи. Крім того, біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом здатні інгібувати функцію СТГ А-4 й у такий спосіб стимулювати імунну систему шляхом блокування пригнічення імунної системи, опосередкованого РО-1 і СТІ А-4.
Біспецифічні по відношенню до РО-Ї х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом також дозволяють повністю блокувати РО-1 і СТІ А-4, а також переважно блокувати СТІ А-4 при його ко-експресії з РО-1. Таким чином, біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з винаходом застосовані для ослаблення Т-клітинного виснаження та/або для посилення імунної відповіді (наприклад, імунної відповіді, опосередкованої Т-клітинами і/або природніми клітинами-кілерами (МК-клітинами)) суб'єкта. Зокрема, біспецифічні по відношенню до РО-1 х
СТІ А-4 молекули згідно з винаходом можуть застосовуватися для лікування будь-яких бо захворювань або станів, пов'язаних з небажаною супресією імунної системи, включаючи рак і захворювання, які пов'язані з присутністю патогена (наприклад, бактеріальної, грибкової, вірусної або протозойної інфекції).
І00264| Ракові захворювання, які можна лікувати за допомогою біспецифічних по відношенню до РО-1ї х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом, включають ракові захворювання, які характеризуються присутністю ракової клітини, вибраної з групи, що складається 3 клітини: пухлини надниркової залози, асоційованого зі СНіДом раку, альвеолярної саркоми м'яких тканин, астроцитарної пухлини, раку сечового міхура, раку кістки, раку головного та спинного мозку, метастатичної пухлини головного мозку, раку молочної залози, пухлини каротидного тільця, раку шийки матки, хондросаркоми, хордоми, хромофобної нирково-клітинної карциноми, світлоклітинної карциноми, раку товстої кишки, раку товстої та прямої кишки, шкірної доброякісної фіброзної гістіоцитоми, десмопластичної дрібнокруглоклітинної пухлини, епендимоми, саркоми Юінга, позахребетної мукоїдної хондросаркоми, недосконалого кісткового фіброгенезу, фіброзної дисплазії кістки, раку жовчного міхура або раку жовчної протоки, рак шлунка, гестаційної трофобластичної хвороби, ембріонально-клітинної пухлини, раку голови і шиї, гепатоклітинної карциноми, пухлини острівцевих клітин підшлункової залози, саркоми Капоші, раку нирки, лейкозу, ліпоми/доброякісної ліпоматозної пухлини, ліпосаркоми/злоякісної ліпоматозної пухлини, раку печінки, лімфоми, раку легенів, медулобластоми, меланоми, менінгіоми, множинної ендокринної неоплазії, множинної мієломи, мієлодиспластичного синдрому, нейробластоми, нейроендокринних пухлин, раку яєчників, раку підшлункової залози, папілярної тиреокарциноми, пухлини паращитовидної залози, педіатричного раку, пухлини оболонок периферичних нервів, феохромоцитоми, пухлини гіпофізу, раку передміхурової залози, задньої увеальної меланоми, рідкого гематологічного розладу, метастатичного раку нирки, рабдоїдної пухлини, рабдоміосаркоми, саркоми, раку шкіри, саркоми м'яких тканин, плоскоклітинного раку, раку шлунка, синовіальної саркоми, раку яєчка, раку вилочкової залози, тимоми, метастатичного раку щитовидної залози і раку матки. (00265) Зокрема, біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом можна застосовувати в лікуванні раку товстої та прямої кишки, гепатоклітинної карциноми, гліоми, раку нирки, раку молочної залози, множинної мієломи, раку сечового міхура,
Зо нейробластоми; саркоми, неходжкінської лімфоми, недрібноклітинного раку легенів, раку яєчників, раку підшлункової залози і раку прямої кишки. (00266) Інфекції, які можна лікувати за допомогою біспецифічних по відношенню до РО-1 х
СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом, включають хронічні вірусні, бактеріальні, грибкові та паразитарні інфекції. Хронічні інфекції, які можна лікувати за допомогою біспецифічних по відношенню до РО-1ї х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом, включають інфекції, викликані вірусом Епштейна-Бара, вірусом гепатиту А (НАМ); вірусом гепатиту В (НВМ); вірусом гепатиту С (НСМ); вірусами герпесу (наприклад НОМ-1, НБМ-2, ННУ-6, СМУ), вірусами імунодефіциту людини (ВІЛ), вірусом везикулярного стоматиту (У5М), бактеріями класу Васії, бактеріями роду Сіїгобасіег, холерним вібріоном, дифтирійною паличкою, ентеробактеріями, гонококами, бактеріями виду Неїїсобасіег руїогі, бактеріями роду Кіерзієйа та ІедіопеїйІа, менінгококами, мікобактеріями, бактеріями роду Рзхеидотопах5, пневмококами, рикетсіями, сальмонелами, бактеріями роду Зеїтайа, стафілококами, стрептококами, правцевою паличкою, грибами роду Азрегойш5 (А. типтідайи»5, А. підег і т. д.), грибами виду Віазіотусе5 дептайіаів, грибами роду Сапаїда (С. аІрісапе, С. Кгивеї, С. діаргайа, С. ігорісаїї5 і т. д.), грибами виду
Стуріососси5 пеоїогтап5, грибами роду МисогаІе5 (тисог, абвзідіа, гпігори5), грибами видів
Зрогоїнгіх зсеПепкії, Рагасоссідіоїдев5 бБгавіїйепвів, Соссідіоїдев іттії5, Нівіоріазта сарзшайшт, бактеріями, що викликають лептоспіроз, бактеріями виду Вогтеїйїа Бигдаогегі, гельмінтами (нематодами, стрічковими хробаками, трематодами, плоскими хробаками (наприклад, шистосомами), кишковими лямбліями, хробаками роду Тгіспіпеа, амебами виду Оіепіатоебра
Егадіїз, трипаносомами видів Тгурапозота ргисеі та Тгтурапозота сгилі, і протистами виду
Ї еїівптапіа допомапі.
ХІ. Фармацевтичні композиції
І00267| Композиції згідно з винаходом включають нефасовані композиції лікарського засобу, застосовані у виготовленні фармацевтичних композицій (наприклад, неочищені або нестерильні композиції), і фармацевтичні композиції (тобто композиції, що підходять для введення суб'єкту або пацієнту), які можна застосовувати в приготуванні одиничної форми дозування. Такі композиції містять профілактично або терапевтично ефективну кількість біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом або комбінацію таких агентів і фармацевтично прийнятний носій. Переважно, композиції згідно з винаходом містять бо профілактично або терапевтично ефективну кількість біспецифічних по відношенню до РО-Ї х
СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом і фармацевтично прийнятний носій. Винахід також включає такі фармацевтичні композиції, які додатково містять друге терапевтичне антитіло (наприклад, пухлино-специфічне моноклональне антитіло), яке специфічне по відношенню до конкретного ракового антигена, і фармацевтично прийнятний носій.
І00268| Згідно з конкретним варіантом реалізації винаходу термін "фармацевтично прийнятний" означає, що зазначена речовина схвалена регулювальним органом федерального уряду або уряду штату США або перерахована у Фармакопеї США або інших у цілому визнаних фармакопеях для застосування у тварин і більше конкретно, у людини. Термін "носій" відноситься до розріджувача, ад'юванта (наприклад, адюванта Фрейнда (повного та неповного), допоміжної речовини або наповнювача, з яким уводять терапевтичний агент. У цілому, інгредієнти композиції згідно з винаходом забезпечуються або роздільно, або у змішаному вигляді в одиничній формі дозування, наприклад, у вигляді сухого ліофілізованого порошку або безводного концентрату в герметично запечатаному контейнері, такому як ампула або саше з вказівкою кількості активного агента. Коли композицію передбачається вводити шляхом інфузії, її можна дозувати за допомогою інфузійного флакона, що містить стерильну воду або сольовий розчин фармацевтичного ступеня чистоти. Коли композицію вводять шляхом ін'єкції, може бути надана ампула зі стерильною водою для ін'єкцій або сольовим розчином для того, щоб інгредієнти можна було змішати до введення.
І00269| Винахід також забезпечує фармацевтичний комплект або набір, який містить один або більше контейнерів, заповнених біспецифічними по відношенню до РО-1ї х СТІА-4 молекулами згідно з даним винаходом, окремо або із зазначеним фармацевтично прийнятним носієм. Крім того, один або більше інших профілактичних або терапевтичних агентів, застосованих для лікування захворювання, також можуть бути включені у фармацевтичний комплект або набір. Винахід також забезпечує фармацевтичний комплект або набір, який містить один або більше контейнерів, наповнених одним або більше з інгредієнтів фармацевтичних композицій згідно з винаходом. Необов'язково до зазначеного контейнера (контейнерів) може додаватися пояснення у вигляді, рекомендованого державним органом, що регулює виготовлення, застосування або реалізацію фармацевтичних препаратів або біологічних продуктів, де зазначене пояснення відображає схвалення зазначеним органом виготовлення, застосування або реалізації зазначеного виробу для введення людині.
І00270| Даний винахід забезпечує набори, які можна застосовувати в зазначених вище способах. Набір може містити будь-яку з біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом. Набір може додатково містити один або більше інших профілактичних і/або терапевтичних агентів, застосованих для лікування раку, в одному або більше контейнерах.
ХІІ. Способи введення 00271) Композиції згідно з даним винаходом можуть бути представлені для лікування, профілактики і пом'якшення одного або більше симптомів, пов'язаних із захворюванням, розладом або інфекцією шляхом уведення суб'єкту ефективної кількості гібридного білка або кон'югованої молекули згідно з винаходом або фармацевтичною композицією, що містить гібридний білок або кон'юговану молекулу згідно з винаходом. Згідно з переважним аспектом, такі композиції є по суті очищеними (тобто по суті не містять речовини, які обмежують ефективність зазначених композицій або викликають небажані побічні явища). Згідно з конкретним варіантом реалізації винаходу суб'єкт являє собою тварину, переважно ссавця, такого як ссавець, що не є приматом (наприклад, бика, свиню, коня, собаку, гризуна та т. д.), або такого, що є приматом (наприклад, мавпу, таку як яванський макак, людину та т. д.). Згідно з переважним варіантом реалізації, суб'єкт являє собою людину.
І00272| Різні системи доставки відомі та можуть використовуватися для введення композицій згідно з винаходом, наприклад, інкапсулювання в ліпосомах, мікрочастинки, мікрокапсули, рекомбінантні клітини, здатні експресувати антитіло або гібридний білок, опосередкований рецептором ендоцитоз (див., наприклад, Уми єї а!. (1987) "Кесеріог-Медіаїеа Іп
Міо СбСепе Тгапвіоптайоп Ву А Боїшрбіе ОМА Сатієг бувзіет," У. Віої. Спет. 262:4429-4432), конструювання нуклеїнової кислоти у вигляді частини ретровірусного або іншого вектора та т. п.
І00273| Способи введення молекули згідно з винаходом включають, але не обмежуються наступними, парентеральне введення (наприклад, внутрішньошкірне, внутрішньом'язове, внутрішньочеревинне, внутрішньовенне та підшкірне), епідуральне та крізьслизове введення (наприклад, інтраназальний та пероральний спосіб уведення). Згідно з конкретним варіантом реалізації винаходу біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом вводять внутрішньом'язово, внутрішньовенно або підшкірно. Композиції можна 60 вводити за допомогою будь-якого зручного способу, наприклад, шляхом інфузії або болюсної ін'єкції шляхом абсорбції через епітелій або шкірнослизові вистілки (наприклад, слизову ротової порожнини, слизову прямої кишки і кишківника та т. д.) і можна вводити разом з іншими біологічно активними агентами. Введення може бути системним або місцевим. Крім того, також можна застосовувати легеневе введення, наприклад, шляхом застосування інгалятора або небулайзера та лікарської форми з аерозольним агентом. Див., наприклад, патенти США Мо 6,019,968; 5,985, 320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540 і 4,880,078 і міжнародні публікації згідно з РСТ Мо УМО 92/19244; МО 97/32572; МО 97/44013; УМО 98/31346 і
УМО 99/66903, кожна з яких повністю включена у дану заявку за допомогою посилання.
І00274| Згідно з винаходом також запропоновано, що препарати біспецифічних по відношенню до РО-1ї х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом упаковані в герметично запечатаний контейнер, такий як ампула або саше з вказівкою кількості молекул. Відповідно до одного варіанта реалізації винаходу такі молекули поставляються у вигляді сухого ліофілізованого порошку або безводного концентрату в герметично запечатаному контейнері та можуть бути відновлені, наприклад, за допомогою води або сольового розчину до підходящої концентрації для введення суб'єкту. Переважно, біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом представлені у вигляді сухого стерильного ліофілізованого порошку в герметично запечатаному контейнері. (00275) Ліофілізовані препарати біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом слід зберігати при температурі між 2 "С і 8 С в їх оригінальному контейнері, і молекули слід вводити в межах 12 годин, переважно в межах 6 годин, в межах 5 годин, в межах З годин або в межах 1 години після їх відновлення. Згідно з альтернативним варіантом реалізації винаходу такі молекули представлені у рідкому вигляді в герметично запечатаному контейнері з вказівкою кількості та концентрації зазначеної молекули, гібридного білка або кон'югованої молекули. Якщо такі біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули надані у рідкому вигляді, вони переважно поставляються в герметично запечатаному контейнері.
І00276| Кількість зазначених композицій згідно з винаходом, яка буде ефективною в лікуванні, запобіганні або пом'якшенні одного або більше симптомів, пов'язаних з розладом, можна визначити за допомогою стандартних клінічних методів. Точна доза для застосування у
Зо лікарській формі також залежить від способу введення та важкості стану, і повинна вирішуватися відповідно до думки практикуючого лікаря й умов для кожного пацієнта. Ефективні дози можна екстраполювати на основі кривих залежності ефекту від дози, отриманих за результатами тест-систем іп міго або тест-систем на основі тваринної моделі.
І00277| У даній заявці "ефективна кількість" фармацевтичної композиції відповідно до одного варіанта реалізації винаходу являє собою кількість, достатню для досягнення сприятливих або бажаних результатів, включаючи, але не обмежуючись зазначеними, клінічні результати, такі як зниження симптомів, що є результатом захворювання, ослаблення симптому інфекції (наприклад, вірусного навантаження, лихоманки, болі, сепсису та т. д.) або симптому раку (наприклад, проліферації ракових клітин, присутності пухлини, пухлинних метастазів і т. д.), забезпечуючи, таким чином, підвищення якості життя страждаючих захворюванням суб'єктів, зниження дози інших медикаментів, необхідних для лікування захворювання, посилення ефекту іншого медикаменту, наприклад, шляхом таргетування й/або інтерналізації, затримку прогресування захворювання та/або збільшення часу виживаності суб'єктів. (00278) Ефективну кількість можна вводити в рамках одного або більше введень. З метою даного винаходу, ефективна кількість лікарського засобу, сполуки або фармацевтичної композиції являє собою кількість, достатню для: знищення та/або зниження проліферації ракових клітин і/або для усунення, зниження та/або затримки розвитку метастазу з первинного сайту ракової пухлини або зниження проліферації (або ефекту) інфекційного патогена та зниження і/або затримки розвитку опосередкованого патогеном захворювання, прямо або побічно. Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу ефективної кількості лікарського засобу, сполуки або фармацевтичної композиції може досягатися або не досягатися разом з іншим лікарським засобом, сполукою або фармацевтичною композицією. Таким чином, "ефективну кількість" можна розглядати в контексті введення одного або більше хіміотерапевтичних агентів, і можна вважати, що один агент забезпечується в ефективній кількості, якщо зазначений агент разом з одним або більше іншими агентами може дозволити або дозволяє досягти бажаний результат. Незважаючи на індивідуальні відмінності у потребах, визначення оптимальних діапазонів ефективної кількості кожного компонента знаходиться в межах компетентності фахівця в даній області техніки.
І00279| Для біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул, включених згідно з бо винаходом, дозу, що вводиться пацієнту, переважно визначають на основі маси тіла (кг)
суб'єкта-реципієнта. Для біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул, включених згідно з винаходом, доза, що вводиться пацієнту, як правило, становить від приблизно 0,01 мкг/кг до приблизно 150 або більше мг/кг маси тіла суб'єкта. (00280) Дозу та частоту введення біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом можна знижувати або змінювати шляхом посилення захоплення молекули та її проникнення в тканини за допомогою модифікацій, таких як, наприклад, ліпідизація.
І00281| Доза, що вводиться пацієнту, біспецифічної по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з винаходом длия її застосування в якості монотерапії може бути розрахована. В якості альтернативи, молекулу можна застосовувати в комбінації з іншими терапевтичними композиціями, і доза, що вводиться пацієнту, буде нижче у порівнянні з використанням зазначеної молекули в якості монотерапії. (00282) Фармацевтичні композиції згідно з винаходом можна вводити місцево в область, яка потребує лікування, що може досягатися, наприклад (без обмеження), шляхом локальної інфузії, ін'єкції або за допомогою імплантата, де зазначений імплантат складається з пористого, непористого або гелевидного матеріалу, включаючи мембрани, такі як силастикові мембрани або волокна. Переважно, при введенні молекули згідно з винаходом слід звертати увагу на те, щоб використовувалися матеріали, до яких молекули не абсорбуються. (00283) Композицію згідно з винаходом можна доставляти у везикулі, зокрема, ліпосомі (див.
І апдег (1990) "Мем Меїнодз ОЇ Огид Овєїїмегу," Зсіеєпсе 249:1527-1533); Тгеаї єї а!., в Гірозотез іп
Ше Тнегару ої Іпіесійив Різеазе апа Сапсег, І оре7-Вегевівіп, а також РіаіІег (едв5.), І і55, Мем/
Уогк, стор. 353-365 (1989); І оре2-Вегезіеїп, ірід., стор. 317-327).
І00284| Коли композиція згідно з винаходом являє собою нуклеїнову кислоту, що кодує біспецифічну по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекулу згідно з даним винаходом, зазначену нуклеїнову кислоту можна вводити іп омімо для забезпечення експресії кодованої їй біспецифічної по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули шляхом вбудовування зазначеної нуклеїнової кислоти у вигляді частини підходящого вектора експресії на основі нуклеїнової кислоти і введення зазначеного вектора таким чином, щоб зробити його внутрішньоклітинним, наприклад, шляхом застосування ретровірусного вектора (див. патент США Мо 4980286) або
Зо шляхом безпосередньої ін'єкції або за допомогою бомбардування мікрочастинками (наприклад, генної гармати; ВіоїїстієЄ, Юбироп) або шляхом покриття ліпідами або рецепторами клітинної поверхні або трансфікуючими агентами або шляхом його введення в сполуці з подібним гомеобоксу пептидів, який, як відомо, входить в ядро (див. наприклад, Чоїйої єї аї. (1991) "Апіеппаредіа Нотеоброх Реріїде Недшаїе5з Мешга! Могрподепезвів," Ргос. Маї!. Асад. сі. (США) 88:1864-1868) і т. д. В якості альтернативи, нуклеїнову кислоту можна вводити всередину клітини і вбудовувати в ДНК хазяйської клітини для експресії шляхом гомологічної рекомбінації.
І00285| Лікування суб'єкта за допомогою терапевтично або профілактично ефективної кількості біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом може включати один курс лікування або, переважно, може включати серію курсів лікування.
Згідно з переважним прикладом, суб'єкт одержує лікування за допомогою зазначеного діатіла один раз на тиждень протягом приблизно від 1 до 10 тижнів, переважно, від 2 до 8 тижнів, більше переважно, приблизно від З до 7 тижнів, і ще більше переважно, протягом приблизно 4, 5 або 6 тижнів. Фармацевтичні композиції згідно з винаходом можна вводити один раз на день, два рази на день або три рази на день. В якості альтернативи, фармацевтичні композиції можна вводити один раз на тиждень, два рази на тиждень, один раз кожні два тижні, один раз на місяць, один раз на кожні шість тижнів, один раз на кожні два місяці, два рази на рік або один раз на рік. Слід також мати на увазі, що ефективну дозу молекул, застосовуваних для лікування, можна підвищувати або знижувати протягом конкретного лікування.
ХІІ. Приклади варіантів реалізації (00286) Винахід, зокрема, відноситься до варіантів реалізації Е1-Е26:
ЕТ. Біспецифічна молекула, яка містить один або більше сайтів зв'язування епітопу, здатних імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом (епітопуми) РО-1, й один або більше сайтів зв'язування епітопу, здатних імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом (епітопами) СТІ А-4, де зазначена молекула містить: (А) варіабельний домен важкого ланцюга та варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, яке зв'язується з РО-1; і (В) варіабельний домен важкого ланцюга та варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, яке зв'язується з СТІ А-4; де зазначена молекула являє собою: 60 (ї) діатіло, де зазначене діатіло являє собою ковалентно зв'язаний комплекс, який містить два, три, чотири або п'ять поліпептидних ланцюгів; або (ї) трьеохвалентну сполучну молекулу, де зазначена трьохвалентна сполучна молекула являє собою ковалентно зв'язаний комплекс, який містить три, чотири, п'ять або більше поліпептидних ланцюгів.
Е2. Біспецифічна молекула згідно з варіантом реалізації ЕЇї, де зазначена молекула проявляє активність, що перевищує зазначену активність, яку проявляють дві моноспецифічні молекули, одна з яких містить зазначений варіабельний домен важкого ланцюга та зазначений варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, який зв'язується з РО-1, й інша з яких містить зазначений варіабельний домен важкого ланцюга та зазначений варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, який зв'язується з СТІ А-4.
ЕЗ. Біспецифічна молекула згідно з варіантом реалізації ЕТ! або Е2, де зазначена молекула викликає менше імуноопосередкованих небажаних явищ (ІНЯ) при введенні суб'єкту, що потребує зазначеного введення, у порівнянні з такими іНЯ, викликаними введенням моноспецифічного антитіла, яке зв'язується з СТІ А-4.
Е4. Біспецифічна молекула згідно з варіантом реалізації ЕЗ, де зазначене моноспецифічне антитіло, яке зв'язується з СТІ А-4, являє собою іпілімумаб.
Е5. Біспецифічна молекула згідно з будь-яким із варіантів реалізації Е1-Е4, де зазначена молекула містить Ес-фрагмент.
Еб. Біспецифічна молекула згідно з варіантом реалізації Е5, де зазначений Ес- фрагмент являє собою варіант Ес-фрагмента, який містить: (А) одну або більше амінокислотних модифікацій, що знижують афінність варіанта Ес- фрагмента по відношенню до Есук, й/або (В) одну або більше амінокислотних модифікацій, що збільшують час напівжиття варіанта
Ес-фрагмента в сироватці крові.
Е7. Біспецифічна молекула згідно з варіантом реалізації Еб, де зазначені модифікації, що знижують афінність варіанта Ес-фрагмента по відношенню до ЕсукК, включають заміну І 234А;
Ї 235А, або 1 234А і | 235А, де зазначена нумерація відповідає ЕО-індексу за Кабатом.
Е8. Біспецифічна молекула згідно з варіантом реалізації Еб або Е7, де зазначені модифікації що збільшують час напівжиття варіанта Ес-фрагмента в сироватці крові,
Зо включають заміну М252У; М252У і 5254Т; М252У і Т256Е; М252У, 52541 і Т256Е; або К2880 і
Н4ІЗ5К, де зазначена нумерація відповідає ЕЮО-індексу за Кабатом.
Е9У. Біспецифічна молекула згідно з будь-яким із варіантів реалізації Е1-Е8, де зазначена молекула являє собою зазначене діатіло та містить два сайти зв'язування епітопу, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом РО-1, і два сайти зв'язування епітопу, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом СТІ А-4.
Е10. Біспецифічна молекула згідно з будь-яким із варіантів реалізації Е1-Е8, де зазначена молекула являє собою зазначену трьохвалентну сполучну молекулу та містить два сайти зв'язування епітопу, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом РО-1, й один сайт зв'язування епітопу, здатний імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом СТІ А-4.
Е11. Біспецифічна молекула згідно з будь-яким із варіантів реалізації Е1-Е10, де зазначена молекула здатна зв'язуватися з молекулами РО-1 і СТІ А-4, присутніми на клітинній поверхні.
Е12. Біспецифічна молекула згідно з будь-яким із варіантів реалізації Е1-Е11, де зазначена молекула здатна одночасно зв'язуватися з РО-1 і СТІ А-4.
Е13. Біспецифічна молекула згідно з будь-яким із варіантів реалізації Е1-Е12, де зазначена молекула здатна стимулювати клітини імунної системи.
Е14. Біспецифічна молекула згідно з варіантом реалізації Е13, де зазначена стимуляція імунних клітин призводить до: (А) проліферації імунних клітин і/або (В) продукції та/або вивільнення імунними клітинами щонайменше одного цитокіну, і/або (С) продукції та/"або вивільнення імунними клітинами щонайменше однієї літичної молекули, й/або (р) експресії імунними клітинами щонайменше одного маркера активації.
Е15. Біспецифічна молекула згідно з варіантом реалізації Е13 або Е14, де зазначена клітина імунної системи являє собою Т-лімфоцит або природну клітину-кілер (МК-клітину).
Е16. Біспецифічна молекула згідно з будь-яким із варіантів реалізації Е1-Е15, де зазначені сайти зв'язування епітопу, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом РО-1, містять: (А) МН-домен РО-1 тАбБ 1 (5ЕО І МО:47) і МІ -домен РО-1 тА 1 (5ЕО ІЮ МО :48); або (В) МН-домен РО-1 тАбБ 2 (5ЕО ІО МО:49) і МІ -домен РО-1 тАБ 2 (5ЕО ІЮ МО:50); або (С) МнН-домен РО-1 тАБ З (ЗЕО ІЮ МО:51) і МІ -домен РО-1 тАБ З (З5ЕО ІО МО:52); або (510) (Б) МнН-домен РО-1 тАБ 4 (ЗЕО І МО:53) і МІ -домен РО-1 тАБ 4 (5ЕО ІО МО:54); або
(Е) МН-домен РО-1 тАбБ 5 (5ЕО ІО МО:55) і МІ -домен РО-1 тА 5 (5ЕО ІЮ МО:56); або (Е) Мн-домен РО-1 тАб 6 (ЗЕО ІЮ МО:57) і МІ -домен РО-1 тАб 6 (5ЕО ІО МО:58); або (б) МнН-домен РО-1 тАбБ 6-І МН (ЗЕО ІЮ МО:86) і Мі-домен РО-1 тАБ 6-50 МІ (5ЕО ІО
МО:87); або (Н) МнН-домен РО-1 тАБ 7 (ЗЕО І МО:59) і МІ -домен РО-1 тАБ 7 (ЗЕО ІЮ МО:60); або (І) Мн-домен РО-1 тАБ 8 (ЗЕО ІО МО:61) і МІ -домен РО-1 тА 8 (ЗЕО ІЮ МО:62).
Е17. Біспецифічна молекула згідно з будь-яким із варіантів реалізації Е1-Е16, де зазначений сайт (сайти) зв'язування епітопу, здатний імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом СТІ А-4, містить: (А) МН-домен СТІ А-4 тАбБ 1 (5ЕО ІЮО МО:76) і МІ -домен СТІ А-4 тАбБ 1 (ЗЕО ІО МО:77); або (В) МН-домен СТІ А-4 тАбБ 2 (5ЕО ІО МО:78) і МІ -домен СТІ А-4 тАБ 2 (ЗЕО І МО:79); або (С) МнН-домен СТІ А-4 тАБ З (З5ЕО ІЮ МО:90) і МІ -домен СТІ А-4 тАБ З (5ЕО 10 МО:91).
Е18. Біспецифічна молекула згідно з варіантом реалізації Е17, де: (А) зазначені сайти зв'язування епітопу, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом РО- 1, містять МН-домен РО-1 тА 6-І МН (ЗЕО ІЮ МО:86) і Мі -домен РО-1 тА 6-50 (5ЕО ІО
МО:87) і (В) зазначений сайт (сайти) зв'язування епітопу, здатний імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом СТІ А-4, містять (містять) МН-домен СТІ А-4 тАбБ З (ЗЕО ІЮО МО:90) і МІ -домен СТІ А-4 тА З (ЗЕО ІЮ МО:91).
Е19. Біспецифічна молекула згідно з будь-яким із варіантів реалізації Е1-Е18, де зазначена молекула містить: (А) два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність 562 ІЮ МО:95, і два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність 5ЕО ІЮ МО:96; або (В) два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність зЕО ІЮ МО:97, і два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність 5ЕО ІЮ МО:98; або (С) два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність зЕО ІЮ МО:99, і два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність ЗЕО ІЮ МО:100; або (Юр) два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність ХЕО ІЮ МО:102, і два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність ЗЕО ІЮ МО:103; або (Е) два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність «ЕС ІЮ МО:101, і два поліпептидні ланцюги, що мають послідовність ЗЕО ІЮ МО:100; або (Є) один поліпептидний ланцюг, що має послідовність БЕО ІЮ МО:104, один поліпептидний ланцюг, що має послідовність 5ЕО 10 МО:105, один поліпептидний ланцюг, що має послідовність ЗЕО ІЮ МО:106, й один поліпептидний ланцюг, що має послідовність ЗЕО 10
МО:107; або (сб) один поліпептидний ланцюг, що має послідовність БЕО ІЮ МО:108, один поліпептидний ланцюг, що має послідовність 5ЕО 10 МО:105, один поліпептидний ланцюг, що має послідовність ЗЕО ІЮ МО:109, й один поліпептидний ланцюг, що має послідовність 5ЕО 10
МО:107.
Е20. Фармацевтична композиція, яка містить ефективну кількість біспецифічної молекули згідно з будь-яким із варіантів реалізації Е1-Е19 ії фармацевтично прийнятний носій.
Е21. Біспецифічна молекула згідно з будь-яким із варіантів реалізації Е1-Е19, де зазначена молекула застосовується для активації стимуляції опосередкованої імунною системою відповіді у суб'єкта, що має потребу в цьому.
Е22. Біспецифічна молекула згідно з будь-яким із варіантів реалізації Е1-Е19, де зазначену молекулу застосовують для лікування захворювання або стану, пов'язаного із супресією імунної системи.
Е23. Біспецифічна молекула згідно з варіантом реалізації Е22, де зазначене захворювання або стан являє собою рак або інфекцію.
Е24. Біспецифічна молекула згідно з варіантом реалізації Е23, де зазначений рак характеризується присутністю ракової клітини, вибраної з групи, що складається з клітини: пухлини надниркової залози, асоційованого зі СНІДом раку, альвеолярної саркоми м'яких тканин, астроцитарної пухлини, раку сечового міхура, раку кістки, раку головного та спинного мозку, метастатичної пухлини головного мозку, раку молочної залози, пухлини каротидного тільця, раку шийки матки, хондросаркоми, хордоми, хромофобної нирково-клітинної карциноми, світлоклітинної карциноми, раку товстої кишки, раку товстої та прямої кишки, шкірної доброякісної фіброзної гістіоцитоми, десмопластичної дрібнокруглоклітинної пухлини, епендимоми, саркоми Юінга, позахребетної мукоїдної хондросаркоми, недосконалого кісткового фіброгенезу, фіброзної дисплазії кістки, раку жовчного міхура або раку жовчної протоки, раку бо шлунка, гестаційної трофобластичної хвороби, ембріонально-клітинної пухлини, раку голови і шиї, гепатоклітинної карциноми, пухлини острівцевих клітин підшлункової залози, саркоми
Капоші, раку нирки, лейкозу, ліпоми/доброякісної ліпоматозної пухлини, ліпосаркоми/злоякісної ліпоматозної пухлини, раку печінки, лімфоми, раку легенів, медулобластоми, меланоми, менінгіоми, множинної ендокринної неоплазії, множинної мієломи, мієлодиспластичного синдрому, нейробластоми, нейроендокринних пухлин, раку яєчників, раку підшлункової залози, папілярної тиреокарциноми, пухлини паращитовидної залози, педіатричного раку, пухлини оболонок периферичних нервів, феохромоцитоми, пухлини гіпофізу, раку передміхурової залози, задньої увеальної меланоми, рідкого гематологічного розладу, метастатичного раку нирки, рабдоїдної пухлини, рабдоміосаркоми, саркоми, раку шкіри, саркоми м'яких тканин, плоскоклітинного раку, раку шлунка, синовіальної саркоми, раку яєчка, раку вилочкової залози, тимоми, метастатичного раку щитовидної залози і раку матки.
Е25. Біспецифічна молекула згідно з варіантом реалізації Е24, де зазначена інфекція характеризується присутністю бактеріального, грибкового, вірусного або протозойного патогена.
Е26. Біспецифічна молекула згідно з варіантом реалізації Е25, де зазначена інфекція характеризується наявністю вірусу Епштейна-Бара, вірусу гепатиту А (НАМ); вірусу гепатиту В (НВ); вірусу гепатиту С (НСМ); вірусів герпесу (наприклад НЗМ-1, НОУ-2, ННУ-6, СММУ), вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), вірусу везикулярного стоматиту (М5М), бактерій класу ВавсійЇ, бактерій роду Сйгобасієг, холерного вібріона, дифтирійної палички, ентеробактерій, гонококів, бактерій виду Неїїсобрасіег руїогі, бактерії родів Кіерзієйа та ІедіопеЇа, менінгококів, мікобактерій, псевдомонад, пневмококів, рикетсій, сальмонел, бактерій роду зЗеїтаїйа, стафілококів, стрептококів, правцевої палички, грибів роду Азрегайи5 (А. титідайи»5, А. підег і т. д.), грибів виду Віавіотусев дептайіаді5, грибів роду Сапаїйда (С. аІрісапв, С. Кгивеї, С. аіабгаїйа,
С. ігорісаїїв5 і т. д.), грибів видів Стгуріососси5 пеоїогітап5, грибів роду Мисогаїез (тисог, арвзіаіа, гпігорив), грибів видів брогоїнгіх з5сНепкії, Рагасоссідіоіїдев5 Бгавзіїйєпвів, Соссідіоїдев5 іттіїв,
Нісіоріахта сарзшціашт, бактерії, що викликає лептоспіроз, бактерій виду Вогтеїйа Бигуддогегі, гельмінтів (нематод, стрічкових хробаків, трематод, плоских червів (наприклад, шистосом), кишкових лямблій, червів роду ТгіспіпеПа, амеб виду Оіепіатоебва Егадіїїх, трипаносом видів
Тгурапозота Бгисеї та Ттурапозота сги?і, і протистів виду І еїізптапіа допомапі.
ПРИКЛАДИ
Зо І00287| Описаний в цілому винахід буде більше доступний для розуміння після ознайомлення з наведеними нижче прикладами. Наступні приклади ілюструють різні способи застосування композицій у способах діагностики або лікування згідно з винаходом. Приклади наведені як ілюстрація та жодним чином не обмежують обсяг даного винаходу.
Приклад 1
Біспецифічні молекули забезпечують підвищену стимуляцію імунних відповідей (00288) Біспецифічна молекула, що має специфічність відносно окремих білків клітинної поверхні, що регулюють два імуномодулюючих шляхи, РО-1 і ГАС-3, була створена та позначена як "САКТ А". (00289| САКТ А являє собою біспецифічне чотирьохланцюгове діатіло, що містить Ес- фрагмент, яке містить два сайти зв'язування, специфічних по відношенню до РО-1, два сайти зв'язування, специфічних по відношенню до 1АС-3, варіант Рсо-фрагмента /дс4, сконструйований для збільшення часу напівжиття, і цистеїнвмісні домени Е/К-соїЇ, що сприяють утворенню гетеродимеру. Як описано більше докладно нижче, ПАКТ А має специфічність зв'язування (тобто домени МН і МІ) гуманізованого антитіла проти РО-1 (пРО-1 тА 6) і гуманізованого антитіла проти ГГ АС-3 (НІ АС-3 тА 1). Амінокислотна послідовність першого та третього поліпептидних ланцюгів ОАКТ А являє собою (5ЕО ІЮ МО:63):
РІОМТО5РОЗ І 5АБУМаОВМТ ІТСВАБОВУМ5 5ММАМУМООКР СОКАРКИЦ ІМ АБУВУТОаМРБ вЕБаБОаБаТО БЕТІТІ55БОР ЕОБАТУУСОО НУБТРМУТРаСсС сатТКкІБІКаса БОСИСОМОЇМ
ОБСОАЕМККРОа АБУКУЗСКАб5 СУБЕТЗУМУММ МУМАОАРООСІ ЕУМЛОМІНРЗО ЗЕТМІ ВОКЕК
ОАМТІТМОКО5 ТЗ5ТАУМЕ! 55 ІВЗЕОТАМУУ САВЕНУСТОР БАУУуСсОСТМ тУзБОСССОаас
ЕМААСЕКЕМА АГЕКЕМААЇ Е КЕМААГЕКЕВ5 КМОаРРСОРРСОР АРЕР СРБОМ БГЕРРКРКОТ
ІЇМІТВЕРЕМТ СУММОУБОЕО РЕМОРММУМУО СМЕМНМАКТК РА!ЕЄОРМЗТМ вУУБМІТМІН
ООУІМОКЕМК СКУБМКОЇ РО БІЕКТІЗКАК СОРВЕРОМУТ ІРРБОЕБЕЕМТК МОМ5І ТС УК
СЕМРБООІАМЕ М/ЕЗМСООРЕММ УКТТРРМОБ БОБЕР МВА ТМОКЗАМОБЯ МУєЗСЗУМНЕ
АЇ НМНУТОКЗ І 51 5І С
І00290| У послідовності 5ЕБО ІО МО:63 амінокислотні залишки 1-107 відповідають амінокислотній послідовності домену МІ. гуманізованого моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з | Ас-3 (ПІ АС-3 тАб 1); залишки 108-115 відповідають проміжному спейсерному пептиду (лінкер 1: ссс5БОСОО (560 ІО МО:5)); залишки 116-234 відповідають МН-домену 60 моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО-1 (ПРО-1 тА 6, 5ЕО ІЮО МО:57, де Хі являє собою І); залишки 235-240 відповідають проміжному спейсерному пептиду (лінкер 2: восСооо (560 ІО МО:6)); залишки 241-268 відповідають цистеїнвмісному домену, що сприяє утворенню, гетеродимеру (Е-сої) (ЕМААСЕК-ЕМААГ ЕК-ЕМААГ ЕК-ЕМААІ ЕК (5ЕО ІЮ МО:20)); залишки 269-280 відповідають стабілізованій шарнірній області Ідс4 (ЗЕО ІЮО МО:36); залишки до 281-496 відповідають варіанту домену СН2-СНЗ ІдСс4, що містить заміни
М252Уу/525471/1256БЕ і такий, що не містить С-кінцевий залишок. (00291) Амінокислотна послідовність другого та четвертого поліпептидних ланцюгів ПОАКТ А являє собою (ЗЕО ІЮ МО:64):
ЕІМІГТО5РАТ ІЗІ5РОЕВАТ І5СВАБЕЗУМО ММОаМ5ЗЕММУУЕ ООКРООРРКІ ІІНААЗМОСО
СУРЗАЕЗаБа ЗБатТОгТІТтІ5 51ЕРЕОБРАМУ ЕСООБКЕМРУ тТРасаткУБІ КкасаБасавОо
МОГМО5ОАЕМ ККРОАБУКУ5 СКАБОаМТЕТО МММОМУУАВОАР СОС ЕМУМарІ МРОМОаМмТтІММ
ОКЕРЕСАМТМТ ТОТ5ТЗТАММ Б АБІАБООТ АМУУСАВЕАО МЕМРруУмусоОос птУЗЗасс ас саКкмМААСКЕ КУААЇ КЕКМА АЇ КЕКМААЇ К Е
І00292| У послідовності 5ЕБО ІО МО:64 амінокислотні залишки 1-111 відповідають амінокислотній послідовності МІ -домену моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з РО- 1 (пРО-ІтптАБ 6, 5ЕО ІО МО:58, де Хі являє собою З і Хг являє собою ФО); залишки 112-119 відповідають проміжному спейсерному пептиду (лінкер 1: ссОо5ОСОО (5ЕО ІЮО МО:5)); залишки 120-237 відповідають МН-домену гуманізованого моноклонального антитіла, здатного зв'язуватися з ГАС-3 (ПІАС-З птАБ 1); залишки 238-243 відповідають цистеїнвмісному спейсерному лінкерному пептиду (лінкер 2: сОоСбОо(ос(о (5БО ІЮ МО:6)); залишки 244-271 відповідають цистеїнвмісному сприятливому утворенню гетеродимеру домену (К-спіральному) (КМААСКЕ-КМААЇ КЕ-КУААЇ КЕ-КМААЇ КЕ (ЗЕО ІО МО:21)).
І00293| Здатність ОАКТ А стимулювати Т-клітини оцінювали в аналізі з використанням ентеротоксину типу В 5іарпуіососси5 ацйгеив5 ("ЕВ"). ЕВ являє собою мікробний суперантиген, здатний активувати значну частину Т-клітин (5-30 95) в з«ЕВ-чутливих донорів. 5ЕВ зв'язується з молекулою МНС ІІ за межами пептид-сполучної петлі та, таким чином, ЗЕВ-сигнал залежить, але не обмежується МНС ІІ й опосередковує ТОК. ЗЕВ-стимуляції Т-клітин призводить до олігоклональної проліферації Т-клітин і продукції цитокінів (незважаючи на те, що може спостерігатися варіабельність, залежна від донора). В межах 48 годин після 5ЕВ-стимуляції у
Зо МКПК спостерігається позитивна регуляція РО-1 і ГАС-3, при цьому на 5 добу (після вторинної стимуляції шляхом культивування в 96-ямковому планшеті у присутності ЗЕВ) спостерігається додаткова стимуляція зазначених білків. Позитивна регуляція білків контрольних точок імунної відповіді РО-1 і ГАС-3 після ЗЕВ-стимуляції МКПК обмежує вивільнення цитокіну при повторній стимуляції ЗЕВ. Здатність ЮСАКТ А підсилювати вивільнення цитокіну шляхом інгібування контрольної точки імунної відповіді оцінювали і порівнювали з активністю вихідних антитіл по відношенню до РО-1 і ГАС-3 окремо й у комбінації.
І00294| Коротко, МКПК очищали із суцільної крові, отриманої від здорових донорів при інформованій згоді (Віоіодіса! Зресіаку Согрогайоп) з використанням методу центрифугування в градієнті щільності фікола РісоїІ-Радие Ріи5 (СЕ Неайвсаге) відповідно до інструкцій виробника та потім очищали Т-клітини з використанням набору для одержання Т-клітин людини
БупареадетФ (Ійе Тесппоіодіех) відповідно до інструкцій виробника. Очищені МКПК культивували в середовищі КРМІ з додаванням 10 95 термоінактивованої ембріональної бичачої сироватки (ЕБС) і 1 95 пеніциліну/стрептоміцину в об'ємних флаконах Т-25 протягом 2-3 днів окремо або разом з 5ЕВ (Зідта-Аїйгісп) у концентрації 0,5 нг/мл (первинна стимуляція).
Наприкінці першого циклу 5ЕВ-стимуляції МКК промивали два рази фосфатно-сольовим буфером (ФСБ) і відразу висіювали на 9б-ямкові планшети для тканинних культур в концентрації 1-5 х 105 клітин на ямку просто в середовищі, в середовищі, що містить контрольне антитіло, в середовищі, що містить ЕВ в концентрації 0,5 нг/мл (вторинна стимуляція) під час відсутності антитіла, або середовищі, що містить ЗЕВ і БАКТ А, контрольний до або антитіло проти РО-1 -/- тАБ проти ГГ АО-3 і культивували протягом додаткових 2-3 днів. Наприкінці другої стимуляції супернатанти збирали для вимірювання секреції цитокінів із застосуванням наборів для твердофазного ІФА клітин людини ЮиозЗеї для ІЄМу, ТМЕа, 1-10 ї 1-4 (880 5бувієтв) відповідно до інструкцій виробника.
І00295| У зазначених аналізах САКТ А (біспецифічну по відношенню до РО-1 х І да-3 молекулу) й антитіла проти РО-1 і ГАО-3 використовували в концентрації 0,0061, 0,024, 0,09, 0,39, 1,56, 6,25 або 25 нМ. Для зазначених досліджень, в яких використовували комбінацію антитіл, кожне антитіло забезпечували в зазначеній концентрації, таким чином, що загальна концентрація антитіл у два рази перевищувала концентрацію, використовувану для кожного антитіла (тобто 0,0122, 0,048, 0,18, 0,78, 3,12, 12,5 або 50 нМ). На Фігурі 7 показані профілі бо секреції ІЕМУ для ЗЕВ-стимульованих МКПК від типового донора (0: 56041). Подібні результати спостерігалися для біспецифічних по відношенню до РО-1 х ГГ АСі-3 молекул, що містять МН/ МІ - домени від альтернативних антитіл проти РО-1 і ГАс-3, і для біспецифічних по відношенню до
РО-1 х ГАС-3 молекул, що мають альтернативні структури (див. наприклад, Фігуру З3С), у декількох донорів. 00296) Результати зазначених досліджень демонструють, що біспецифічні по відношенню до РО-1 х ГАС-3 молекули значно підсилюють продукцію ІЕМу в ЗЕВ-стимульованих МКПК при повторній стимуляції. Зазначені результати показують, що біспецифічні молекули, спрямовані на два імуномодулюючих шляхи, є більше активними у порівнянні з комбінацією окремих антитіл, спрямованих на ті самі шляхи.
Приклад 2
Біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули
І00297| Біспецифічні молекули, що мають специфічність по відношенню до РО-1 ії СТІ А-4, можна створювати за допомогою способів, запропонованих у даній заявці та відомих в даній області техніки. Загальна структура поліпептидних ланцюгів декількох біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул представлена в Таблиці 8. Зокрема, можна одержувати молекули біспецифічних бівалентних діатіл, які містять два поліпептидні ланцюги, що мають один сайт зв'язування для РО-1 й один сайт зв'язування для СТІ А-4, де зазначені поліпептидні ланцюги мають загальну структуру Варіанта І (також див., наприклад, Фігуру 1). Можуть бути створені молекули біспецифічних бівалентних діатіл, які містять три поліпептидні ланцюги, що мають один сайт зв'язування РО-1, один сайт зв'язування СТІ А-4 і Ес-фрагмент, де зазначені поліпептидні ланцюги мають загальну структуру Варіанта ІІ (див. також, наприклад, Фігуру 4А).
Можуть бути створені молекули біспецифічних тетравалентних діатіл, які містять чотири поліпептидні ланцюги, що мають два ідентичні сайти зв'язування РО-1, два ідентичні сайти зв'язування СТІ А-4 і Ес-фрагмент, де зазначені поліпептидні ланцюги мають загальну структуру
Варіантів ШІ або ІМ (також див., наприклад, Фігури ЗА-3С). Крім того, можуть бути створені біспецифічні трьохвалентні молекули, які містять чотири поліпептидні ланцюги, що мають два сайти зв'язування РО-1 й один сайт зв'язування СТІ А-4 (або два сайти зв'язування СТІ А-4 й один сайт зв'язування РО-1) і Ес-фрагмент, де зазначені поліпептидні ланцюги мають загальну структуру Варіанта М (також див., наприклад, Фігуру бА). Крім того, можуть бути створені
Зо біспецифічні бівалентні молекули антитіла, які містять чотири поліпептидні ланцюги, що мають один сайт зв'язування РО-1, один сайт зв'язування СТІ А-4 і Ес-фрагмент, де зазначені поліпептидні ланцюги мають загальну структуру Варіанта МІ (також див., наприклад, патент
США Мо 7,695,936 і міжнародну публікацію патенту згідно з РСТ УМО 2011/143545).
Таблиця 8 ен ше 333- ланцюг оо дввшй МІ1) -(лінкер 1) - (МН) - (лінкер 2) - (НРО
МІ 2) - (лінкер 1) - (МНІ) - (лінкер 2) - (НРО (МІ1) - (лінкер 1) - (МН2) - (лінкер 2) - (НРО) - (лінкер 3) - (модифікований домен СН2-СНЗ
МІ 2) - (лінкер 1) - (МНІ) - (лінкер 2) - (НРО (лінкер 3) - (модифікований домен СН2-СНЗ) (МІ) - (лінкер 1) - (МН) - (лінкер 2) - (НРО) - (лінкер 3) - (Домен
Третій Снг-СсНнЗ (МІ 2) - (лінкер 1) - (МНІ) - (лінкер 2) - (НРО) (МІ1) - (лінкер 1) - (МН) - (лінкер 2) - (СНІ) - (Шарнір) - (Домен
ІМ Третій Снг-СсНнЗ (МІ 2) - (лінкер 1) - (МНІ) - (лінкер 2) - (СІ) (МІ1) - (лінкер 1) - (МН2) - (лінкер 2) - (НРО) - (лінкер 3) - (модифікований домен СН2-СНЗ
М МІ.2) - (лінкер 1) - (МНІ) - (лінкер 2) - (НРО
МНЗ) - (СНІ) - (шарнір) - (модифікований домен СН2-СНЗ
МІ) - (лінкер 1) - (МН2) - (лінкер 2) - (НРО) - (лінкер 3) - бо
Таблиця 8
ПСИ і--ві ПИ ЗИ ланцюг 01111111 | (модифікованийдоменСНа-СНУ)ЇГ/: 77777771
МІ 2) - (лінкер 1) - (МНІ) - (лінкер 2) - (НРО (МІ 3) - (лінкер 4) - (МНЗ) - (СНІ) - (Шарнір) - (модифікований домен СН2-СНЗ
МНІ) - (СНІ) - (шарнір) - (модифікований домен СН2-СНЗ м
На) - (СНІ) - (шарнір) - (модифікований домен СН2-СНЗ
НРО - Стимулюючий утворення гетеродимеру домен (00298) Для кожного варіанта біспецифічних молекул, представлених у таблиці 8: (а) МІ 1 ї МНІ являють собою варіабельні домени антитіла проти РО-1, і МІ 2 ї МН2 являють собою варіабельні домени антитіла проти СТІ А-4; або (Б) МІ! ї МНІ являють собою варіабельні домени антитіла проти СТІ А-4, і МІ2 ї МН2 являють собою варіабельні домени антитіла проти РО-1.
Для варіантів М ї МІ: МІЗ ії МНЗ3 являють собою варіабельні домени антитіла проти РО-1 або являють собою варіабельні домени антитіла проти СТІ А-4.
І00299| Лінкери, які стимулюють утворення гетеродимеру домени і константні області (наприклад, СНІ, шарнірна ділянка домени СН2г-СНЗ), застосовані в створенні таких біспецифічних молекул, представлені вище. Зокрема, як докладно описано у даній заявці, домени СН2-СНЗ молекул, перший та третій поліпептидні ланцюги яких не ідентичні, модифікують таким чином, що зазначені модифікації сприяють гетеродимеризації та знижують або запобігають гомодимеризації, наприклад, шляхом модифікації доменів СН2-СНЗ одного ланцюга таким чином, щоб він містив "западину", і модифікації доменів СН2-СНЗ на іншому ланцюзі таким чином, щоб він містив "виступ". Як докладно описано вище, шарнірна ділянка та/або домени СН2-СНЗ можуть містити амінокислотні заміни, які стабілізують біспецифічні молекули і/або змінюють їх ефекторні функції та/або збільшують час їх напівжиття в сироватці крові.
Приклад З
Універсальні біспецифічні адапторні молекули ("ОВА")
ІЇ0О300| В якості альтернативи, може бути сконструйована біспецифічна молекула (наприклад, біспецифічне антитіло, біспецифічне діатіло, трьохвалентна сполучна молекула та т.д.), що містить один сайт зв'язування епітопу, який специфічно зв'язується з РО-1 (або СТІ А- 4), і другий сайт зв'язування епітопу, який специфічно зв'язується з гаптеном, наприклад, ізотіоціанатом флуоресцеїну (також відомим як фторізотіоціанат, або РІТС). Така біспецифічна молекула служить як молекула універсального біспецифічного адаптора ("ОВА"), здатного ко-
Зо лігувати домен зв'язування, специфічний по відношенню до РО-1 (або СТІ А-4), з кон'югованими з флуоресцеїном сполучними молекулами (наприклад, антитілом, 5сЕм і т. д.), специфічними по відношенню до СТІ А-4 (або РО-1). Наприклад, РІТС-реактивну групу такої універсальної біспецифічної адапторної молекули можна застосовувати для зв'язування з міченим РБІТС антитілом, яке зв'язується з СТІ А-4 (або РО-1), створюючи у такий спосіб універсальну біспецифічну адапторну молекулу, яка адаптована для зв'язування з РО-1 і СТІ А-4. Такі універсальні біспецифічні адапторні молекули застосовані для швидкої оцінки біспецифічних молекул.
І00301| Антитіло проти флуоресцеїну, 4-4-20 ("тАБ 4-4-20"), можна застосовувати в якості джерела РІТС-специфічних доменів зв'язування (Сгирег, М. еї аІ. (1994) "Ейісіепі Титог СеїЇ
Гузі5 Меаіасгей Ву А Візресійс 5іпдіє Спаіп Апіроду Ехргеззей Іп ЕзсПегіспіа сої, " У. Іттипої. 152(11): 5368-5374).
Ї00302| Амінокислотна послідовність варіабельного домену важкого ланцюга тАб 4-4-20 (ЗЕО ІЮ МО:65) (залишки СОКн підкреслені):
ЕМКІ ОЕТОаСИ Ї МОРОВРМКІ. 5СУМАБаєтТЕ5 ОМУММУУУВО РЕК ЕМ МАО ІВМКРУММЕТ хУу5ОоОБУКаВЕ ТІЗНОО5КОО УМ ОМММІ АМ ЕОМСІМУСТа ухамМмОоУМУсвОо ат 00303) Амінокислотна послідовність варіабельного домену легкого ланцюга тАр 4-4-20 (ЗЕО ІЮ МО:66) (залишки СОН. підкреслені):
ОМУМТОТРЕ5 ІРУБІ ФрОАБ ІЗСНА5ЗБОБІ М НЗМОаМТМІ ВАМ М ОКРООБРК МИУКУМАЕ зауУРєРОовЕЗа5 аЗИатТОЕТІКІ БАМЕАЕОГ ЯМ МЕС5ЗОЗТНУР М/ТРСсСИткКІ ЕЕ ІК
Ї00304| Можна застосовувати будь-які біспецифічні структури, запропоновані у даній заявці (див., наприклад, Таблиці 1, 2, З і 4). Переважні біспецифічні молекули містять тільки один сайт зв'язування гаптену (наприклад, флуоресцеїну) та зв'язуються з єдиним міченим гаптеном антитілом, забезпечуючи у такий спосіб в отриманих комплексах відношення універсальна адапторна біспецифічна молекула:мічене гаптеном антитіло, що становить 1:1. Такі універсальні біспецифічні адапторні молекули можна створювати з використанням, наприклад,
МІ- ї МН-доменів антитіла проти РО-1 й антитіла проти флуоресцеїну. Переважно, така універсальна біспецифічна адапторна молекула являє собою ковалентно зв'язане діатіло або трьохвалентну сполучну молекулу, що містить два, три, чотири, п'ять або більше поліпептидних ланцюгів. Типові універсальні біспецифічні адапторні молекули, які можна створювати, представлені нижче.
А. СОВА 1 00305) Одна з універсальних біспецифічних адапторних молекул, яка може бути створена, являє собою ковалентно зв'язане діатіло, що складається з двох поліпептидних ланцюгів і містить один сайт зв'язування епітопу РО-1 й один сайт зв'язування флуоресцеїну ("ОВА 17"). 00306) Перший поліпептидний ланцюг ШВА 1 містить (у напрямку від М-кінця до С-кінця): М- кінець, Мі-домен тА 4-4-20 (5БО ІЮ МО:66), проміжний спейсерний пептид (лінкер 1, сававацаса (5ЕБЕО ІЮО МО:5)), МН-домен РО-1 тА 6 (ЗЕО ІЮ МО:57, де Хі являє собою І)), проміжний спейсерний пептид (лінкер 2, СОСОсОо (560 ІО МО:6)), що стимулює утворення гетеродимеру Е-соїї домен: ЕМААЇ ЕК-ЕМААЇ ЕК-ЕМААЇ ЕК-ЕМААЇ ЕК (ЗЕО ІО МО:18)) і С-кінець.
І00307| Таким чином, амінокислотна послідовність першого поліпептидного ланцюга ОВА 1 являє собою (ЗЕО ІЮ МО:67):
ОМУМТОТРЕ5 ІРУБІ ФрОАБ ІЗСНА5ЗБОБІ М НЗМОаМТМІ ВАМ М ОКРООБРК МИУКУМАЕ
ЗауУРОВЕЗав аБОаТОРТІКІ З5АМЕАЕСІ СМ УЕСБОБТНУР МТРОасаТткіЕ ІКОСОСОСЗОС,СИС
ОМОГМОБОАЕ МККРОАБУКМ З5СКАБОаХУОЕТ ЗУМУММУМУМУВОА РОСС ЕУЛИаМ ІНРЗОЗЕТМІ
ВОКЕКОВМТІ ТУМОКЗТЗТАМ МЕ! 55185ЕО ТАМУУСАВЕН мМаТ5РЕАУУМса ості УТУББа аСОсаєЕМААЇ ЕКЕМААГЕКЕ УААГЕКЕМАА ЕК (00308) Другий поліпептидний ланцюг ОВА 1 містить (у напрямку від М-кінця до С-кінця): М-
Ко) кінець, Мі-домен РО-1 тАБб 6 (ЗЕО ІЮ МО:58, де Хі являє собою 5 і Х? являє собою О)), проміжний спейсерний пептид (лінкер 1, сОос5Сс(ООеО (5ЕБО І МО:5)), МН-домен тАб 4-4-20 (ЗЕО І МО:65)), проміжний спейсерний пептид (лінкер 2, сОоС(о(ос(о (5БО ІЮ МО:6)), що стимулює утворення гетеродимеру К-соїЇ домен: КМААЇ КЕ-КМААЇ КЕ-КМААЇ КЕ-КМААЇ КЕ (5ЕО
ІО МО:19)) і С-кінець.
І00309| Таким чином, амінокислотна послідовність другого поліпептидного ланцюга ВА 1 являє собою (5ЕО 10 МО:68):
ЕІМІГТО5РАТ І5ІЗРОЕВАТ І5СВАБЕЗУМО ММаМ5ЕМММЕ ООКРООРРКІ ПІНААЗМОСО
СУРЗАЕЗаБа ЗОаТОгТІТтІ5 5ІЕРЕОБРАММ РГСООБКЕМРУ ТРасаткУБІ КкасасаБааас
ЕМКІГОЕТаССО ІМОРЕВРМКІ 5СМАБОаЕТЕВ ОММУММУМУМВОБ РЕКОГЕМУМАО ІВМКРУММУЕТ мУу5ОБУКОаВЕ ТІЗНОО5КОО УМ ОМММАМ ЕєОМамУСста 5УухамМмОоУмсоОо ат5УТУЗЗаа
СасиакКМАдАІК ЕКУААЇ КЕКМ ААЇ КЕКМААЇ. КЕ
В. ВА 2 00310) Як запропоновано вище, вбудовування доменів СН2-СНЗ до в один поліпептидний ланцюг діатіла, такого як ШВА 1, може дозволити утворення більше складного чотирьохланцюгового біспецифічного діатіла, що містить Ес-фрагмент. Таким чином, друга універсальна біспецифічна адапторна молекула, яка може бути створена, являє собою ковалентно зв'язане діатіло, що складається з чотирьох поліпептидних ланцюгів, які містять два сайти зв'язування епітопу РО-1, два сайт зв'язування флуоресцеїну та Ес-фрагмент (ОВА 27").
Слід зазначити, що ОВА 2 може зв'язуватися з двома міченими флуоресцеїном молекулами через два сайти зв'язування флуоресцеїну.
І00311) Перший та третій поліпептидні ланцюги ШВА 2 містять (у напрямку від М-кінця до С- кінця): М-кінець, М -домен тАб 4-4-20 (5ЕО ІЮ МО:66), проміжний спейсерний пептид (лінкер 1, сававацаса (5ЕБЕО ІЮО МО:5)), МН-домен РО-1 тА 6 (ЗЕО ІЮ МО:57, де Хі являє собою І)), проміжний спейсерний пептид (лінкер 2, СОСОсОо (5ЕБЕО ІЮ МО:7)), що стимулює утворення гетеродимеру домен Е-сої: ЕМААГЕК-ЕМААГЕК-ЕМААІ ЕК-ЕМААГ ЕК (5ЕБЕО 10 МО':18),, проміжний спейсерний пептид (лінкер 3, СССОКТНТСРРСР (5ЕО ІО МО:З31)), Ес-фрагмент
І9О1, що містить заміни І 234А/ 235А (ЗЕО ІЮ МО 43), де Х являє собою К), і С-кінець.
І00312| Таким чином, амінокислотна послідовність першого та третього поліпептидних ланцюгів ОВА 2 являє собою (5ЕО І МО:69): (510) ОМУМТОТРЕ5 ІРУБІ арОАБ ІЗСНЗБОБІМ НОМОМІМІ АХ М'ОКРООБРК МИМКУЗМАЕ
ЗауУРОоВЕЗав аБОаТОгТІКкІ 5АМЕАЕЄОІ ЯМ МЕС5О5ТНУР МТРОасаТткІЕ ІКОСОСОаЗОаСИаС
ОМОГМО5ОАЕ УМККРОАБУКМ 5СКАБОМОЕТ 5УМУММУМУУВОА РОСС ЕММ ІНРБОБЕТУМІ
БОКЕКОВМТІ ТМОКЗТЗТАМ МЕ!551А85ЕО ТАМУУСАВЕН УСсаТОРЕАМУМУсС ОСТІ МТУ5Ба сСОссОаЕМАА! ЕКЕМААГЕКЕ МААГЕКЕМАА ГЕКОасСООКТН ТоРРСОРАРЕА АСаРБУРБІ ЕР
РКРКОТІМІЗ АТРЕМТСУМУМ ОМ5НЕОРЕМК ЕМУУМУрамЕМ НМАКТКРАЕЕ ОУМЗТУВУМ5
МІ ТМЕНОЮСУМУ! МакКЕМУКСКУЗ МКАГРАРІЕК ТІЗКАКООРА ЕРОМУТІРР5 ВЕЕМТКМОМ5
ІТС УКаРМР ЗОІАМЕМЖМЕЗМ СОРЕММУКТТ РРМОБОрОаБЕ РІЗКІ ТУОК 5АМУООСММУЕ5
С5УМНЕА НМ НУТОКОБІ 5І 5 РОК
І00313) Другий та четвертий поліпептидні ланцюги ОВА 2 ідентичні другому поліпептидному ланцюгу ОВА 1. Таким чином, кожний з другого та четвертого поліпептидних ланцюгів ОВА 2 має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:68. б. ОВА З (00314) Третя універсальна біспецифічна адапторна молекула, яка може бути створена, являє собою ковалентно зв'язане діатіло, що складається з трьох поліпептидних ланцюгів і містить один сайт зв'язування епітопу РО-1, один сайт зв'язування флуоресцеїну та Ес- фрагмент ("ОВА 3"). 00315) Перший поліпептидний ланцюг ШВА З містить (у напрямку від М-кінця до С-кінця): М- кінець, Мі-домен тА 4-4-20 (5БО ІЮ МО:66), проміжний спейсерний пептид (лінкер 1, сававацаса (5ЕБЕО ІЮО МО:5)), МН-домен РО-1 тА 6 (ЗЕО ІЮ МО:57, де Хі являє собою І)), проміжний спейсерний пептид (лінкер 2, СОСОсОо (560 ІО МО:6)), що стимулює утворення гетеродимеру домен Е-сої: ЕМААГЕК-ЕМААГЕК-ЕМААІ ЕК-ЕМААГ ЕК (5ЕБЕО 10 МО':18),, проміжний спейсерний пептид (лінкнер 3, (ССОКТНТСРРСОР (5ЕО ІЮ МО:31)), "що містить "виступ"" Ес-фрагмент Ідс1, що містить заміни І 234А/Л.235А (ЗЕО ІОЮО МО:44, де Х являє собою
КУ), і С-кінець.
ІЇ00316)| Таким чином, амінокислотна послідовність першого поліпептидного ланцюга ОВА З являє собою (ЗЕО ІЮ МО:70):
ОМУМТОТРЕ5 ІРУБІ ФрОАБ ІЗСНА5ЗБОБІ М НЗМОаМТМІ ВАМ М ОКРООБРК МИУКУМАЕ
ЗауУРОВЕЗав аБОаТОРТІКІ З5АМЕАЕСІ СМ УЕСБОБТНУР МТРОасаткіЕ ІКОСОСЗОа,Иа,С
ОМОГМОБОАЕ МККРОАБУКМ З5СКАБОаХУОЕТ ЗУМУММУМУМУВОА РОСС ЕУЛИаМ ІНРЗОЗЕТМІ
Коо) ВОКЕКОВМТІ ТУМОКЗТЗТАМ МЕ! 55185ЕО ТАМУУСАВЕН мМаТ5РЕАУУМса ості УТУББа сСОссОаЕМАА! ЕКЕМААГЕКЕ УМААГЕКЕМАА ГЕКаСИаОКТН ТоОРРСОРАРЕА дОааРБМБГЕР
РКРКОТІМІЗ АТРЕМТСУУММ ОУ5НЕОРЕМК ЕМУУМУрамЕМ НМАКТКРАЕЕ ОУМЗТУВУМ5
МІ ТМЕНООУУІ МОакКЕУКСКУЗ МКАГРАРІЕК ТІЗКАКООРА ЕРОМУТІРР5 ВЕЕМТКМОМУ5
ЇМУСІМКОаЕМР 5ОІАМЕМЖМЕЗМ СОРЕММУКТТ РРМОБОрОаБЕ РІЗКІ ТУОК БАМООСММУЕ5
С5УМНЕАГ НМ НУТОКОІ 5І 5 РОК
І00317| Другий поліпептидний ланцюг ОВА З може бути ідентичний другому поліпептидному ланцюгу ВА 1. Таким чином, другий поліпептидний ланцюг ОВА З має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:68. (00318) Третій поліпептидний ланцюг ОВА З містить (у напрямку від М-кінця до С-кінця): М- кінець, спейсерний пептид (лінкер 3, ОКТНТСРРСР (5ЕО ІЮ МО:26)), що містить "западину" Ес- фрагмент Ідс1 із замінами І 234А/ 235А (ЗЕО ІЮ МО:45, де Х являє собою К), і С-кінець. 00319) Таким чином, амінокислотна послідовність третього поліпептидного ланцюга ОВА З являє собою (ЗЕО ІЮ МО:71):
ОКТНТСРРСОР АРЕДАСОРБЗМ БГЕРРКРКОТ ІГМІЗВАВТРЕМТ СУУММОУМ5НЕО РЕУКЕМУ УМО
СМЕМНМАКТК РЕЕЕОУМОТУ ВАМУБМІТМІН О0ОУМІМОаКЕМК СКУМ5МКАГРА РІЕКТІЗКАК
СОРВЕРОМУТ ІГРРОВЕЄЕМТК МОМУ5ІЗСАМУК СЕМРБЗОІАМЕ М/ЕЗМООРЕММ УМКТТРРМІ 05 равегн ук ТМОКЗАМСОСС ММЕЗСЗУМНЕ АІ НМАУТОКЗ5 І 5І РОК р. ОВА 4 (00320) Четверта універсальна біспецифічна адапторна молекула, яка може бути створена, являє собою ковалентно зв'язану трьеохвалентну сполучну молекулу, що складається з чотирьох поліпептидних ланцюгів і містить два сайти зв'язування епітопу РО-1, один сайт зв'язування флуоресцеїну та Ес-фрагмент (ОВА 4").
І00321| Перший поліпептидний ланцюг ОВА 4 ідентичний першому поліпептидному ланцюгу
ВА 3. Таким чином, перший поліпептидний ланцюг ОВА 4 має амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:70. (00322) Другий поліпептидний ланцюг ОВА 4 ідентичний другому поліпептгидному ланцюгу
ВА 1. Таким чином, другий поліпептидний ланцюг ОВА 4 має амінокислотну послідовність БЕО
ІО МО:68. (00323) Третій поліпептидний ланцюг ВА 4 містить (у напрямку від М-кінця до С-кінця): МН- 60 домен РО-1 тАБ 6 (5ЕО ІЮ МО:57, де Хі являє собою І), СНІ домен Ідеї (ЗЕО ІЮО МО:40),
шарнірну область Ідс1 (ЗЕО ІЮ МО:33), що містить "западину", Ес-фрагмент Ідс1 із замінами
ІЇ234А/ 235А (5ЕО ІО МО:45, де Х являє собою К) і С-кінець. (00324) Таким чином, амінокислотна послідовність третього поліпептидного ланцюга ШВА 4 являє собою (ЗЕО ІЮ МО:72):
ОМОГ МОБОАЕ УККРОАБУКМ 5БСКАБИаУЗЕТ 5БУМУММУМУУВОА РИСИ ЕУЛОаМ ІНРЗОБЕТУМ
РОКЕКОВМТІ ТМОК5ОТЗТАМ МЕ! 55ІА5ЕО ТАМУУСАВЕН УсТ5РЕАУМС ОСТІ МУЗА
ЗІКОРОЗМЕРІ АРБЗБЗКОТ5ОСС ТААГОесСіМкКО МЕРЕРУТУБМУ МБОаАІ!Т5ОаМН ТЕРАМ О5505
ЇМ5І5БУМТМ РБОББІСТОГМ ІСМУМНКРОМ ТКУМОКАМЕРК 5СОКТНТСРР СРАРЕАДАСаР
ЗМЕГЕРРКРК ОТІМІЗВТРЕ МТСУММУОУ5Н ЕОРЕМКЕМММ УМрамЕМНМАК ТКРАЕЄОУМ5
ТУВУМ5МІ ТМ ІНОСУЛМОКЕ УКСКУБМКАЇ РАРІЕКТІЗК АКОСОРВЕРОМ МТ РРОВЕЕМ
ТКМОУБІ СА УКагМРБЗОІА МЕМЕБЗМООРЕ ММУКТТРРМІ О5ОСаБЕРІ МБ КІТУОКЗАМО
ОСММЕБСЗУМ НЕАЇ НМАМТО КО 5І 5РаК (00325) Четвертий поліпептидний ланцюг ОВА 4 містить (у напрямку від М-кінця до С-кінця):
МІ-домен РО-1 тАр 6 (ЗЕБЕО ІЮ МО:58, де Хі являє собою 5 і Х» являє собою С), СІ -домен (наприклад, каппа-домен Ідс (5ЕО ІО МО:38)) і С-кінець. 00326) Таким чином, амінокислотна послідовність четвертого поліпептидного ланцюга ОВА 4 являє собою (ЗЕО ІЮ МО:73):
ЕІМІГТО5РАТ І5ІЗРОЕВАТ І5СВАБЕЗУМО ММаМ5ЕМММЕ ООКРООРРКІ ПІНААЗМОСО
СУРЗАЕБЗаБа ОТО ТІ5 БІЕРЕОРАММУ РЕСООБКЕМРУ ТРасатТкКМЕ! КАТУААРБЗМУЕ
ІЕРРБОБОЇК БОТАБМУСІЇ ММЕМРАЕБЕАКМ ОМКМОМАСГОВ СМ5ОЕЗМТЕО ОБКОЗТУ5І 5
ЗТ ТІ 5КАОУ ЕКНКУМАСЕМ ТНОСІ 55РМТ КЗЕМВИЕС
Е. ВА 5
І00327| П'ята універсальна біспецифічна адапторна молекула, яка може бути створена, являє собою ковалентно зв'язану трьохвалентну сполучну молекулу, що складається з трьох поліпептидних ланцюгів і містить два сайти зв'язування епітопу РО-1, один сайт зв'язування флуоресцеїну та Ес-фрагмент ("ОВА 4", див., наприклад, Фігуру 60-60). 00328) Перший поліпептидний ланцюг ОВА 5 ідентичний першому поліпептидному ланцюгу
ВА 3. Таким чином, перший поліпептидний ланцюг ОВА 5 має амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:70.
Зо І00329| Другий поліпептидний ланцюг ОВА 5 ідентичний другому поліпептидному ланцюгу
ВА 1. Таким чином, другий поліпептидний ланцюг ОВА 5 має амінокислотну послідовність БЕО
ІО МО:68.
І00330І Третій поліпептидний ланцюг ВА 5 містить (у напрямку від М-кінця до С-кінця): Мі - домен РО-1 тАБб 6 (ЗЕО ІЮ МО:58, де Хі являє собою 5 і Х»2 являє собою СО), проміжний спейсерний пептид (лінкер 4, СОСОСОБОСОСО5БОС(ОЗОЗ (5ЕО ІЮО МО:37)), МНн-домен РО-1 тАбБ 6 (ЗЕО ІО МО:57, де Хі являє собою І), СНІ домен Ідс1 (5ЕО ІЮ МО:40), шарнірну область ІдСс1 (ЗЕО ІЮ МО:33), що містить "западину", Есо-фрагмент ІдсС1 із замінами І 234А/235А (5ЕО ІО
МО:45, де Х являє собою К) і С-кінець. 00331) Таким чином, амінокислотна послідовність третього поліпептидного ланцюга ОВА 5 являє собою (ЗЕО ІЮ МО:74):
ЕІМІГТО5РАТ І5ІЗРОЕВАТ І5СВАБЕЗУМО ММаМ5ЕМММЕ ООКРООРРКІ ПІНААЗМОСО
СУРЗАЕЗаБа ЗОаТОгТІТтІ5 5ІЕРЕОБРАММ РГСООБКЕМРУ ТРасаткУБІ КкасасаБааас заспса5БОМОЇ МОБОАЕМККР САБУКУЗБСКА 5аУ5ЕТЗУМУМ ММУУВОАРИООа ГГЕУЛОаМмІНР5
ОБЕТМІСОКЕ КОВМТІТМОК ЗТЗТАММЕЇ!5 5ІАБЗЕОТАМУ УСАВЕНУСТО РЕАУМУСОСТІ.
МТУ5ЗАБТКО РБЗБМЕРІАРБб5 К5ІБаСТААЇ саСІМКОМЕРЕ РМТУБМУМЗИаА ІТ5аМУНТЕРА
М'ОБ5Б5О1М5І 5БЗМУТУРБЗБЗЗ ГСТОТМІСММ МНнКРУОМТКМО КАМЕРКЗСОК ТНТСРРОСРАР
ЕААСОРОМУМЕРЇ ЕРРКРКОТІМ ІЗАТРЕМТСМ МУОУ5НЕОРЕ УКЕММУУрамМ ЕМНМАКТКРА
ЕЕОУМО5ТУВМ УБ5МІТМІНОЮО УМІМОКЕМУКОСК УЗМКАЇ РАРІ ЕКТІЗКАКОО РЕЕРОММТІ Р
РЗОВЕЕМТКМО У5БІЗСАУКОЕ УРЗОІАМЕЖМЕ ЗМООРЕММУК ТТРРМІОБОС ЕР УЗКІТУ рКЗАУМООСММ Е5СЗУМНЕАЇ. НМАУТОКОБІ 5 І РОК (00332) Антитіла проти СТІ А-4 можна мітити флуоресцеїном з використанням стандартних способів. Коли таку мічену молекулу інкубують у присутності універсальної біспецифічної адапторної молекули, представленої вище, що має сайт зв'язування епітопу, який зв'язується з
РО-1, і сайт зв'язування епітопу, який зв'язується з флуоресцеїном, утворюються біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули, які можна оцінювати, як описано нижче. 00333) З урахуванням принципів, запропонованих у даній заявці, очевидно, що різні МН- домени, Мі-домени, лінкери, що сприяють утворенню гетеродимеру домени і/або константні домени дО можна застосовувати для створення альтернативних універсальних біспецифічних адапторних молекул. Наприклад, МУН- і Мі-домени антитіла проти СТІ А-4 й/або іншого антитіла бо проти РО-1 можна застосовувати замість УН- і Мі-доменів використовуваного антитіла проти
РО-1 для створення альтернативних або еквівалентних універсальних біспецифічних адапторних молекул. В якості альтернативи, УН- і Мі -домени антитіла проти СТІ А-4 можна застосовувати замість МН- і Мі -доменів антитіла проти флуоресцеїну для створення біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул, що мають загальну структуру, що відповідає варіантам І, Ії, ПІ, М ї МІ, запропонованим вище. Такі біспецифічні по відношенню до
РО-1 х СТІ А-4 молекули можна безпосередньо використовувати прямо в аналізах, описаних нижче.
Приклад 4
Аналізи (00334) Біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули згідно з даним винаходом можна характеризувати за допомогою будь-якого з різних способів. Зокрема, можна аналізувати здатність біспецифічних по відношенню до РО-1ї х СТІ А-4 молекул згідно з винаходом імуноспецифічно зв'язуватися з молекулами РО-1 і СТІ А-4 (наприклад, у тому вигляді, в якому вони є присутніми на клітинній поверхні та т. д.), і/або можна визначати кінетику зв'язування при взаємодії з антигеном. Коли біспецифічні молекули містять Ес-фрагмент (або його частину), можна аналізувати їх здатність забезпечувати взаємодію Ес-Есук, наприклад, специфічне зв'язування Ес-фрагмента (або його частини) з Есук, опосередковувати ефекторну функцію, передачу сигналу та т.д. Імуномодулюючу активність та/або протипухлинну ефективність іп мімо біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з винаходом можна оцінювати із застосуванням іп міїго й іп мімо аналізів, відомих в даній області техніки.
А. Одержання імунних клітин і клітин, що експресують РО-1 і/або СТІ А-4 1. Виділення МКПК і субпопуляций імунних клітин із суцільної крові людини
І00335| МКПК виділяли із суцільної крові здорових донорів, що являють собою людей, із застосуванням, наприклад, центрифугування в градієнті фікола. Коротко, суцільну кров розводили у співвідношенні до 1:11 у стерильному фосфатно-сольовому буфері (ФСБ).
Розведену кров (35 мл) нашаровували на 15 мл розчину РісоїІ-Радие"М Ріцз у пробірці на 50 мл і пробірки центрифугували при 400 х д (1320 об./хв.) протягом 30 хвилин з гальмуванням.
Лейкоцитарну плівку між двома фазами збирали у пробірки на 50 мл і центрифугували при 600 х 9 (1620 об./хв.) протягом 5 хвилин. Супернатант виливали і клітинний осад промивали З рази за
Зо допомогою ФСБ (наприклад, шляхом центрифугування пробірок при 600 х д (1620 об./хв.) протягом 5 хвилин). Кількість життєздатних клітин визначали за допомогою барвника трипанового синього. МКПК ресуспендували у повному живильному середовищі (наприклад,
ВРМІ 1640, 10 95 ЕБС, 1 95 пеніцилін/стрептоміцин) й інкубували при 37 "С у присутності 5 95
СО» протягом ночі або додатково обробляли для виділення бажаної субпопуляції імунних клітин, таких як Т-клітини, (наприклад, регуляторні Т-клітини, СО8-клітини, СО4-клітини), МК- клітини, дентдритні клітини і моноцити, як описано нижче.
ІЇ00336| Певні субпопуляції імунних клітин швидко виділяли з МКПК із застосуванням комерційного набору для одержання зазначених субпопуляцій (наприклад, набору для виділення Т-клітин людини Опісиспей"Мм для виділення Т-клітин, СО4 Т-клітин, СЮО8 Т-клітин, моноцитів, дендритних клітин (І їе Тесппоіодіе5/ пептовізпег Зсіепіййс); набору для виділення регуляторних Т-клітин (С0О44/С6025-4) ОУМАВЕАОБЯ!У Кедшаюгу СОр4-/Сс035-1 сеї (ТпептоРізпег) і т. д.), відповідно до інструкцій виробника. Після виділення субпопуляцію імунних клітин (наприклад, Т-клітин) ресуспендували у підходящому повному культуральному середовищі (наприклад, КРМІ 1640, 1095 ЕБС, 1 95 пеніцилін/стрептоміцин), в яке можна додавати цитокіни (наприклад, ІЇ/-2, ЯМ-СЕ, 1/-4, ТМЕ-а та т. д.), й інкубували при 37 "С у присутності 5 95 СО» протягом ночі. Як запропоновано у даній заявці, такі очищені субпопуляції застосовані для оцінки експресії на клітинній поверхні РО-1 і/або СТІ А-4 і для оцінки стимулюючої імунну систему активності біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з винаходом. 2. Виділення МКПК із суцільної крові яванського макака або макака-резус
І00337| МКПК яванського макака або макака-резус виділяли із суцільної крові, наприклад, з використанням центрифугування в градієнті Фікола. Коротко, суцільну кров розводили по відношенню до 1:3 у стерильному ФСБ. Розведену кров (35 мл) нашаровували на 15 мл 90 95 розчину РісоїІ-радиейт Ріи5 (90 мл Фіколла ї- 10 мл ФСБ) у 50 мл поліпропіленовій центрифужній пробірці та центрифугували при 931 х д (2000 об./хв.) протягом 30 хвилин при кімнатній температурі з гальмуванням. Лейкоцитарну плівку між двома фазами збирали і переносили у чисту пробірку на 50 мл і промивали 45 мл ФСБ за допомогою центрифугування пробірок при 600 х д (1620 об./хв.) протягом 5 хвилин. Супернатант виливали й осад промивали
Зх ФСБ. МКПК яванських макак або макак-резус потім ресуспендували у 30 мл повного 60 живильного середовища та кількість життєздатних клітин визначали за допомогою виключення барвника трипанового синього. (00338) Конкретні субпопуляції імунних клітин можна легко виділити з МКПК примата, що не представляє собою людини, із застосуванням комерційного набору для одержання зазначених субпопуляцій (наприклад, наборів для виділення пан-Т-клітин, СО4-Т-клітин і СО4-4/С025 регуляторних Т-клітин (Мійепу! Віоїесі)), відповідно до інструкцій виробника. В якості альтернативи, можна застосовувати сортинг на основі проточної цитометрії із застосуванням специфічних тАб приматів, що не представляють собою людей, або крос-реактивних тАб для сортингу. 3. Одержання незрілих або зрілих дендритних клітин людини мієлоїдного походження (тос) з виділених моноцитів людини
Ї00339| Моноцити людини виділяли з отриманих від донора очищених МКПК із застосуванням комерційного набору для їх одержання, наприклад, набору для одержання моноцитів людини Мпіоиспей"м (|Шйе ТесппоіІодіе5/ пегтоРізпег Зсієпіййс) відповідно до інструкцій виробника. Запускали диференціювання виділених моноцитів людини в незрілі мДК людини шляхом їх культивування (наприклад, у мінімальному есенційному середовищі альфа з нуклеозидами (МЕМ) з додаванням 2595 АВ-негативної сироватки людини і 1 95 пеніциліну/стрептоміцину) протягом 5-7 днів у присутності рекомбінантного гранулоцитарно- макрофагального колонієстимулюючого фактора людини (наприклад, НС М-С5Е; Рергоїеси, 100 нг/мл) і рекомбінантного інтерлейкіну-4 людини (ПІ! -4; Рергоїесі, 40 нг/мл). Незрілі мДК збирали і промивали ФСБ за допомогою центрифугування пробірок при 600 х 9 (1620 об./хв.) протягом 5 хвилин для використання як стимулюючих клітин в аналізі алогенної реакції змішаної культури лімфоцитів (ало-ЗКЛ), такої як аналізи, описані нижче. 00340) У конкретних експериментах з використанням ало-ЗКЛ диференціювання незрілих
МДК індукували шляхом додавання ТМЕса або коктейлю додаткових цитокінів (ІЕМУу, І--1рД) і мітогенів (ЛІС) протягом двох додаткових днів культивування (див. наприклад, Нап, Т. (2009) "ЕмаїІнайоп ої З Сіїпісаї Оєпагййс Сеї!Ї Майштайоп РгоїосоіЇ5 Сопіаійпіпд ГРО апа Ми-датта," У
Іптипоїйег 32:399). Чистоту, ступінь дозрівання й активацію мДК можна оцінювати за допомогою проточної цитометрії із застосуванням одного або більше з наступних антитіл: анти-
СОр14, анти-СО80, анти-СО83, анти-СО86, анти-НІ А-ОК і підходящих контролів ізотипів. Дані
Зо проточної цитометрії в ході такої оцінки можна одержувати на приладі ЕАС5ЗСаїїри"/Ропезза (Весіоп Оіскім5Оп/ВО Віозсіепсе5) й аналізувати за допомогою програми Ріомуо 5опмаге (Ттєевіаг). 4. Експресія РО-1 і СТІ А-4 00341) Клітини, що експресують РО-1 і/або СТІ А-4, можуть бути створені із застосуванням способів, відомих в даній області техніки. Наприклад, клітини (такі як МБО, УигКкаї, СНО та т. д.) можуть бути отримані таким чином, щоб вони експресували РО-1 і/або СТІ А-4, із застосуванням ретровірусних векторів, що містять підходящий ген (наприклад, гена РО-1). В якості альтернативи, клітини імунної системи можна стимулювати для індукції або підвищення експресії РО-1 і/або СТІ А-4. Коротко, очищені клітини імунної системи (наприклад, МКПК, Т- клітини, дендритні клітини і т. д.) виділяли, як описано вище, культивували протягом 2-6 днів у присутності або під час відсутності мітогена й оцінювали експресію РО-1 і/або СТІ А-4 у неопрацьованих (наївних) і стимульованих клітинах, наприклад, з використанням проточної цитометрії. Комерційні антитіла проти РО-1 й антитіла проти СТІ А-4 можна застосовувати для попередньої оцінки патерну експресії в наївних клітинах й у відповідь на стимуляцію мітогена.
Додатково або необов'язково можна застосовувати біспецифічні по відношенню до РО-Ї х
СТІ А-4 молекули згідно з винаходом. (00342) Мітогени, які можна застосовувати для таких досліджень, добре відомі в даній області техніки і включають, але не обмежуються наступними: гранули СО3/С028, ліпополісахариди (ЛПС), ентеротоксин типів А-Е ейарпуіососси5 ацйгеи5 (наприклад, ЗЕВ), форбол міристат ацетат (РМА), фітогемаглютинін (РНА), конканавалін А (сопА), мітоген лаконоса (РМ/М) і т. д. Мітоген (мітогени), ідентифікований як викликаючий/підвищуючий експресію РО-1 і/або СТІ А-4, можна застосовувати у функціональних аналізах для оцінки стимулюючої активності біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з даним винаходом. Див., наприклад, аналізи "ЗЕВ" і "ЗКЛ", описані у даній заявці.
В. Аналізи зв'язування 00343) Імунологічні аналізи, які можна застосовувати для аналізу імуноспецифічного зв'язування з молекулами РО-1 або СТІ А-4, крос-реактивності зв'язування або взаємодій Ес-
ЕсукК включають, але не обмежуються наступними, конкурентні та не конкурентні аналітичні системи із застосуванням методів, таких як Вестерн блотинг, радіоіїмунологічні аналізи, бо твердофазний ІФА (твердофазний імунологічний аналіз), імунологічний аналіз по типу "сендвіч",
аналізи імунопреципітації, реакції преципітації, реакції дифузійної преципітації в гелі, імунохроматографічні аналізи, імунодифузійні аналізи, реакції аглютинації, аналіз фіксації комплемента, радіоїмунні аналізи, флуоресцентні імунологічні аналізи й імунологічні аналізи на основі білка А та т. д. (див. наприклад, А!йзибеї еї аїЇ., 2008, Сигтепі РгоїосоЇ5 іп МоїІесшіаг
Віоіоду). Афінність зв'язування з антигеном-мішенню, як правило, вимірюють або визначають за допомогою стандартних аналізів антитіло-антиген, таких як конкурентні аналізи Віасоге, аналізи насичення або імунологічні аналізи, такі як твердофазний ІФА або РІА. Сортування клітин з активованою флуоресценцією (БАС5) із застосуванням методів, відомих фахівцю в даній області технікию, використовували для імунологічних або функціональних аналізів для характеристики біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з винаходом.
І00344| Наприклад, МКІПК можна одержувати, як описано вище. У випадку, коли бажані підтипи імунних клітин (наприклад, Т-регуляторні, Т-хелперні, АПК ї т. д.-) можна виділити з очищених МКПК, у зазначених виділених клітинах потім оцінюють експресію РО-1 і СТІ А-4 для різних підтипів клітин (наприклад, Т-регуляторних, Т-хелперних, АПК і т. д.) шляхом спільного фарбування й аналізу шляхом сортування клітин з активованою флуоресценцією (БАС5), як описано нижче. 1. Зв'язування з клітинною поверхнею (аналіз насичення) 00345) Здатність біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул зв'язуватися з
РО-1 і/або СТІ А-4, що експресуються на клітинній поверхні, можна виміряти в аналізах на основі насичення/розведення із застосуванням клітини, яка експресує РО-1 і/або СТІ А-4 (клітини-мішені). Такі клітини можуть являти собою клітини імунної системи, стимульовані таким чином, щоб вони експресували РО-1 і/або СТІ А-4, або клітинну лінію (наприклад, клітини М5О), отриману таким чином, щоб вона стабільно експресувала на підвищеному рівні молекули РО-1 іабо СТІ А-4. Коротко, клітини-мішені, що культивуються (наприклад, клітини МБО з експресією
РОТУ) збирали і ресуспендували (наприклад, в концентрації приблизно 5 х 106 клітин/мл) у блокувальному буфері (наприклад, РГАСЗ-буфері з додаванням 10 95 сироватки АВ людини).
Біспецифічну по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекулу, антитіло проти РО-1, антитіло проти
СТІ А-4 або комбінацію антитіла проти РО-1 і антитіла проти СТІ А-4 готовили для розведення в окремому титраційному мікропланшеті, починаючи з однакових молярних концентрацій
Зо (наприклад, 20 нМ у загальному об'ємі 200 мкл), і потім здійснювали серійне розведення (наприклад, 1:4, 1:5, 1:10 ї т. д.) 5-12 разів для одержання 5-12-точкової кривої. Максимальна початкова концентрація у всіх експериментах визначалася дослідним шляхом. Однаковий об'єм (наприклад, 50 мкл) кожного розведення додавали в новий титраційний мікропланшет і клітини- мішені додавали в кожну ямку (наприклад, в концентрації 0,25 х 105 клітин на ямку) й інкубували (наприклад, при 4-25 С протягом 30-120 хвилин). Клітини промивали 1-3 рази (наприклад, титраційний мікропланшет відкручували при 600 х д (1620 об./хв.) протягом 5 хвилин і потім промивали у блокувальному буфері та знову відкручували) і ресуспендували у блокувальному буфері. Для вторинного фарбування вибирали підходящий вторинний реагент, наприклад, козячі Ес-специфічні антитіла проти імуноглобуліну людини, кон'юговані з АРС, які можна застосовувати для виявлення людських первинних антитіл, у той час як козячі Ес-специфічні до проти імуноглобуліну миші, кон'юговані з АІеха Рішог 647, використовували для виявлення мишачих первинних антитіл. Вибраний вторинний реагент розводили у блокувальному буфері та на основі концентрації кожного окремого вторинного реагента готовили стоковий розчин і суміш вторинного реагента в однаковому об'ємі на ямку аліквотували в окремі ямки й інкубували (наприклад, при 4-257С протягом 30-120 хвилин). Клітини промивали, як описано вище, і ресуспендували у блокувальному буфері. Пофарбовані клітини аналізували за допомогою проточної цитометрії. Дані проточної цитометрії можна одержувати на приладі
ЕАСЗСаїїриг/Бопезза (Весюп біскім5Оп/Ропевзза), аналізувати у вигляді середньої інтенсивності флуоресценції із застосуванням програми Ріоул)о зоїмаге (Тгєевіаг) і наносити на графік і нормувати з використанням функції "Іод(агоніст) - ефект - змінний нахил (чотири параметри)" у програмі Ргізітб (сгарпрад). 2. Аналізи зв'язування рецептор/ліганд і сигнального шляху (00346) Аналізи, які можна застосовувати для оцінки здатності біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з винаходом модулювати (наприклад, блокувати, інгібувати, стимулювати і т. д.) зв'язування ліганду та сигнальні шляхи, описані більше докладно нижче. а. Зв'язування рецептор РО-1/ліганд
І00347| Здатність біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул інгібувати зв'язування РО-1 з РО-І1 і/або РО-/2 можна оцінити з використанням клітин, які експресують
РО-1 (клітин-мішеней). Такі клітини можуть являти собою клітини імунної системи, стимульовані бо таким чином, щоб вони експресували РО-1, або клітинну лінію, отриману таким чином, щоб вона експресувала молекули РО-1, наприклад, М5О-клітини, трансфіковані за допомогою ретровірусу геном РО-1 людини. Коротко, РО-1 клітини, що експресують (наприклад, МБО/РОСО1 (М5О-
РО1У)) збирали і ресуспендували (наприклад, в концентрації приблизно 1,5 х 105 клітин/мл) у блокувальному буфері (наприклад, ГЕАСЗ-буфер з додаванням 10 95 сироватки АВ людини) і висіювали на титраційний мікропланшет (наприклад, в концентрації 0,25 х 105 клітин на ямку).
Біспецифічну по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекулу, антитіло проти РО-1, антитіло проти
СТІ А-4 або комбінацію антитіла проти РО-1 й антитіла проти СТІ А-4 готовили для розведення в окремому титраційному мікропланшеті, починаючи з однакової молярної концентрації (наприклад, 20 нМ у загальному об'ємі 200 мкл) і здійснювали серійні розведення (наприклад, 1:4, 1:5, 1:10 ї т. д.) 5-12 разів для одержання 5-12-точкової кривої. Максимальну початкову концентрацію у всіх експериментах визначали емпіричним шляхом. Однаковий об'єм (наприклад, 50 мкл) кожного розведення додавали в кожну ямку титраційного мікропланшета, що містить клітини-мішені. Для оцінки інгібування зв'язування РО-Ї1 в кожну ямку додавали розчинний гібридний білок РО-І 1 (наприклад, ПРО-Ї 1 (В7НІТ) ТЕМ-НІдС1-Рс-біотин (АпсеїЇ)), за винятком незабарвлених ямок негативного контролю, й інкубували (наприклад, при 4-257С протягом 30-120 хвилин). Для оцінки інгібування зв'язування РО-Ї2 в кожну ямку додавали розчинний гібридний блок РО-І 2 (наприклад, СО273 (РО-І 2) тиЇдс/біотин (АпсеїЇ)), за винятком незабарвлених ямок негативного контролю, й інкубували (наприклад, при 4-25 "С протягом 30- 120 хвилин). Клітини промивали 1-3 рази (наприклад, титраційний мікропланшет відкручували при 600 х 9 (1620 об./хв.) протягом 5 хвилин і потім промивали блокувальним буфером і знову відкручували). Клітини ресуспендували у блокувальному буфері. Додавали підходящий вторинний реагент (за винятком незабарвлених ямок негативного контролю) для виявлення гібридного білка РО-Ї1 або РО-І2 (наприклад, стрептавідин-РЕ мічений вторинний реагент (ебіозсіепсе5)) й інкубували (наприклад, при 4-25"С протягом 15-120 хвилин). Клітини промивали, як описано вище, і ресуспендували у блокувальному буфері. Пофарбовані клітини можна аналізувати за допомогою проточної цитометрії. Дані проточної цитометрії можна одержувати на приладі ЕАСзсаїїриг/Ропезза (Весіоп біскімМм5Оп/Ропезбза) й аналізувати зниження середньої інтенсивності флуоресценції мічених 5РО-11 або 5РО-1І2 у присутності біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул, антитіла проти РО-1, антитіла проти
Зо СТІ А-4 або комбінації антитіла проти РО-1 й антитіла проти СТІ А-4 із застосуванням програми
Номао зоїмаге (Тгєесвіа|) і наносити на графік і нормувати з використанням функції "Іод(агоніст) - ефект - змінний нахил (чотири параметри)" у програмі Ргізітб (сгарпрад). р. Зв'язування рецептор/ліганд СТІ А-4
І00348| Здатність біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул інгібувати зв'язування СТІ А-4 з СОВ8О і/або СО86 можна оцінити із застосуванням клітин, які експресують
СТІ А-4 (клітини-мішені). Такі клітини можуть являти собою клітини імунної системи, стимульовані таким чином, щоб вони експресували СТІ А-4, або клітинну лінію, отриману таким чином, щоб вона експресувала СТІ А-4, наприклад, М5О-клітини, трансфіковані за допомогою ретровірусу геном СТІ А-4 людини. Коротко, клітини, що експресують СТІ А-4 збирали і ресуспендували у блокувальному буфері (наприклад, РАС5-буфері з додаванням 10 95 сироватки АВ людини) і висіювали на титраційний мікропланшет (наприклад, в концентрації 0,25 х 105-1,0 х 106 клітин на ямку). Біспецифічну по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекулу, антитіло проти РО-1, антитіло проти СТІ А-4 або комбінацію антитіла проти РО-1 й антитіла проти СТІ А-4 готовили для розведення в окремому титраційному мікропланшеті, починаючи з однакової молярної концентрації (наприклад, 20 нМ у загальному об'ємі 200 мкл) і здійснювали серійні розведення (наприклад, 1:4, 1:5, 1:10 ії т. д.) 5-12 разів для одержання 5-12-точкової кривої. Максимальну початкову концентрацію у всіх експериментах визначали емпіричним шляхом. Кожне розведення в однаковому об'ємі (наприклад, 50 мкл) додавали в кожну ямку титраційного мікропланшета, що містить клітини-мішені. Для оцінки інгібування зв'язування
СО80 в кожну ямку, за винятком незабарвлених ямок негативного контролю, додавали розчинний гібридний білок СО80О (наприклад, ПСО80-тиЇд-біотин (АСІРОСЕМФ))) й інкубували (наприклад, при 4-25 "С протягом 30-120 хвилин). Для оцінки інгібування зв'язування СО86б в кожну ямку, за винятком незабарвлених ямок негативного контролю, додавали розчинний СО86б гіоридний білок (наприклад, НСО86-тиїд-біотин (АОІРОСЕМФ))) й інкубували (наприклад, при 4- 25"С протягом 30-120 хвилин). Клітини промивали 1-3 рази (наприклад, титраційний мікропланшет відкручували при 600 х д (1620 об./хв.) протягом 5 хвилин і потім промивали блокувальним буфером і знову відкручували). Клітини ресуспендували у блокувальному буфері.
Додавали підходящий вторинний реагент для виявлення СО80О або СО86 гібридного білка (наприклад, стрептавідин-РЕ мічені вторинні (еВіозсіепсе5)), за винятком незабарвлених ямок бо негативного контролю, й інкубували (наприклад, при 4-25 "С протягом 15-120 хвилин). Клітини промивали, як описано вище, і ресуспендували у блокувальному буфері. Пофарбовані клітини можна аналізувати за допомогою проточної цитометрії. Дані проточної цитометрії можна одержувати за допомогою системи РГАсСбзсаїїриг/Рогпезза (Весіоп ОісКіпзоп/Бопевзза) й аналізувати зниження середньої інтенсивності флуоресценції мічених СО86б або СО80 у присутності біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул, антитіла проти РО-1, антитіла проти СТІ А-4 або комбінації антитіла проти РО-1 й антитіла проти СТІ А-4 із застосуванням програми Ріоуо зоймжаге (Ттеебіагї) і наносити на графік і нормувати з використанням функції ""од(агоніст) - ефект - змінний нахил (чотири параметри)" у програмі
Ргізтб зоїмаге (Старпрад).
С. Репортерні аналізи (00349) Функціональну активність біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул у блокуванні взаємодії РО-1 з РО-Ї1 можна оцінювати із застосуванням комерційно доступної репортерної системи, розробленої компанією Рготеда, відповідно до рекомендацій виробника.
Коротко, використовували дві клітинні лінії, створені таким чином, щоб вони функціонували або в якості стимулюючої лінії, або в якості репортерної клітинної лінії. Стимулюючу лінію створювали з вихідної лінії СНО таким чином, щоб вона експресувала молекули РО-1І1 і Т- клітинний активатор, який являє собою пов'язане з мембраною тАб-агоніст проти СОЗ клітини
СНО/РОІ 1). Репортерну клітинну лінію створювали з вихідної лінії клітин СОЗУигкаї таким чином, щоб зазначена лінія експресувала люциферазну репортерну конструкцію під контролем транскрипції ядерного фактора активованих Т-клітин (МЕАТ) |клітини МЕАТ-Ішс2/РО0-1 Уижаїй.
При спільному культивуванні разом анти-СОЗ агоніст, що експресується на клітинній лінії СНО-
РОЇ, запускає експресію люциферази через шлях передачі сигналу МЕАТ, опосередковану залученням сигнального комплексу ТСК/СОЗ, присутнього в клітинній лінії Фигка-МЕАТ-Іис/РО-1.
Під час відсутності антитіл проти РО-1 або РО-Ї1 люцифераза експресується на рівні, обумовленому активністю сигнального шляху ТСК/СОЗ3, але пригнічується або інгібується при наявності шляху РО-1/РО-І1, який діє як "гальмо". У присутності молекул, які інгібують сигнальний шлях РО-1/РО-І 1 (наприклад, антитіла проти РО-1 або РО-1 1), цей інгібуючий шлях, або "гальмо", вимикається, дозволяючи підвищення експресії люциферази, яке можна виміряти.
Відповідно, інгібуючу РО-1 активність біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул
Зо можна оцінювати шляхом культивування клітин СНО/РОЇ1 з МЕАТ-Ішс2/РОТ дитжаї (ЗН-О5).
Коротко, клітини СНО-РОЇ 1 висіювали на титраційний мікропланшет (наприклад, в концентрації 4,0 х 107 клітин на ямку) і культивували протягом ночі (наприклад, у середовищі ЕРМІ, що містить 1095 ЕБС і 100 мкг/мл гігроміцину В ії 500 мкг/мл 05418). Наступного дня готовили аналітичний буфер (наприклад, середовище КРМІ з додаванням 2 95 ЕБС) і серійні розведення біспецифічної по відношенню до РО-1ї х СТІ А-4 молекули або антитіла проти РО-1 в аналітичному буфері, що включають 5-12 точок, з максимальним розведенням при однаковому молярному еквіваленті (наприклад, 100-200 нМ) й одержували 5-12 серійних розведень (наприклад, 1:4, 1:5, 1:10 ї т. д.). На наступному етапі частину культурального середовища видаляли з титраційного мікропланшета, що містить адгезивні клітини СНО/РОЇ 1, й аліквоти кожного розведення додавали до зазначених клітин СНО/РОГ 1. Культивовані клітини МЕАТ-
Інсг/Р0-1 Уиккаї збирали і ресуспендували в аналітичному буфері та додавали (наприклад, в концентрації 5,0 х 107 клітин на ямку в об'ємі 40 мкл на ямку) до клітин СНО/РОЇІ 1. Культури спільно інкубували (наприклад, протягом б годин при 37 "С). Наприкінці інкубування відновлювали субстрат Віо-сСІо (Рготеда) і додавали в титраційний мікропланшет кімнатної температури. Після інкубування (наприклад, протягом 5-10 хвилин) зчитували оптичну щільність кожної ямки на багатоканальному зчитувачі для планшетів МІСТОК "М ХА (Регкіп ЕІтег Ж2030- 0040) при довжині хвилі 450 нм із одержанням значень у відносних одиницях люмінесценції (КО) в якості вихідних даних. Дані потім можна наносити на графік і нормувати з використанням функції ""юд(агоніст) - ефект - змінний нахил (чотири параметри)" за допомогою програми Ргізтб (огарпрад). 00350) Подібні репортерні аналізи доступні для сигнального шляху СТІ А-4 (наприклад,
СТІ А-4 ВіосКаде Віоаззау КИ (Рготеда)) і/або можуть бути легко створені для оцінки функціональної активності біспецифічних по відношенню до РО-1ї х СТІ А-4 молекул у блокуванні взаємодій СТІ А-4 за допомогою відповідного ліганду (лігандів).
Ор. Аналізи імуномодулюючої активності
ІЇ00351| Аналізи, які можна застосовувати для оцінки імуномодулюючої активності біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з винаходом, включають аналізи мітогенної стимуляції, такі як "ЗЕВ"-аналіз, описаний вище, й аналіз реакції в змішаній культурі лімфоцитів (ЗКЛ), такий як аналізи, описані більше докладно нижче. Очікується, що здатність 60 біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з винаходом модулювати інгібуючі шляхи як РО-1, так ії СТІ А-4, буде призводити до посиленої стимуляції в аналізах у порівнянні з антитілом проти РО1 й антитілом проти СТІ А-4 окремо або в комбінації. 00352) МКПК або Т-клітини виділяли з крові здорового донора (донорів) - з крові того самого пацієнта (автологічні клітини) або неспоріднених пацієнтів (алогенні клітини) - за допомогою центрифугування в градієнті Фікола РісоП-Радие"М, як описано вище, і ресуспендували у повному живильному середовищі. Для аналізів за допомогою ало-ЗКЛ, у яких використовуються
МДК, моноцити очищали і диференціювали, як описано вище. Для однобічного (односпрямованого) аналізу за допомогою реакції ало-ЗКЛ клітини-респондери (наприклад,
МКПК) співкультивували зі стимулюючими клітинами в титраційному мікропланшеті. Залежно від контексту, стимулюючі клітини являли собою дендритні клітини (ДК), автологічні МКПК (для реакції авто-ЗКЛ, тобто негативний контроль) або алогенні МКПК (для реакції ало-ЗКЛ, тобто позитивний контроль). Відношення клітини-респондери:стимулюючі клітини, як правило, становить 1:11 або 2:11, але може варіювати. Співкультивування здійснювали у присутності однакової молярної кількості біспецифічної по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули, антитіла проти РО-1, антитіла проти СТІ А-4, комбінації антитіла проти РО-1 й антитіла проти СТІ А-4 або відповідних ізотипів тАБб у серійних розведеннях (наприклад, 1:4 1:5, 1:10 і т. д.). Серійні розведення антитіла можна приготувати, як описано вище. Крім того, контрольні популяції клітин одного типу, стимульовані з додаванням або без додавання тАб проти СОЗ я/- СО28, можна застосовувати в якості контролів у таких експериментах. Стимулюючі клітини (стимулятори) попередньо опромінювали (наприклад, при 45 Грей |Су| (4500 рад) із застосуванням апарата для опромінення Сатітасеж 3000 ЕїІап Віоод/Сеї! Іггааіатг (Тпегаїгопіс5)) для запобігання проліферації зазначених стимулюючих клітин і можливості вимірювання проліферації тільки респондерної клітини (респондера). Через 5-7 діб (час коректують для забезпечення експресії РО-1 і СТІ А-4 під час аналізу), додавали (ІЗНІ|-тимідин (наприклад, 1 мкКі/ямку (РегКіп ЕІтег)) на додаткові 18-48 годин. Вимірювали радіоактивність включеної в ДНК мітки (наприклад, за допомогою ВД-сцинтиляційного лічильника ТО;Соипі МХТ (Регкіп ЕІтег)). Результати виражали або як середнє число імпульсів на хвилину (срт), або як коефіцієнт стимуляції (5), що дозволяло порівнювати результати від різних донорів. 5І розраховували у такий спосіб: середнє число імпульсів на хвилину (срт) для стимульованих клітин, ділене на середнє срт для нестимульованих клітин. Відповіді в ЗКЛ вважали позитивними, коли 5І становив 23 для викликаної МКПК стимуляції та 51 2 6 для викликаної ДК стимуляції. В якості альтернативи, проліферацію можна вимірювати із застосуванням аналізу проліферації на основі СЕЕБЕ (ВоКк5, М.А., еї аїЇ. (2010) "Ап орійпілгеа СЕБЕ бБазей Т-сеї вирргевзвіоп аззау (0 емаЇнаїє Ше зирргезбвіме сарасійу ої гедшіайгу Т-сеї5 іпдисед Бу питап Ююіегодепіс депапйііс сеїІв," Зсапа у Іттипої! 72:158-168). 00353) Додаткові аналізи за допомогою реакції ЗКЛ, які можна застосовувати для оцінки стимулюючої імунну систему активності біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з винаходом, відомі в даній області техніки. Див., наприклад, Рамієв5, 9.К. еї аї. (2011) "Іпдисіоп ої айПоапіідеп-5ресіїс апегду іп питап регірпега! ріоод топописієаг сеї Бу аПоапіїдеп війтшайоп мій со-5іїтціаюгу зідпа! рБіосКаде," уошиттаї ої Мізцаїй2ей Ехрегітепів : доме, (49), 2673; Ктиївбеек, А.М., єї а!. (2004) "РгоїГегаїййме Авзауз ог Т сеї! Еипсійоп," битепі Ргоїосоїв іп Іттипоїоду, 60:11:3.12.1-3.12.20; МаїІдгеп, А.С. еї аї. (2006) "Тпе Оігесі Раїпжау ОЇ Нитап Т-
Сеїї АПогесодпійіоп Ів Мої Тоїегігей Ву Бійтшіанйоп М/йй АїПодепеїс Регірпега! Віоосд Мопописівєаг
Сеїїв Ітадіатє5з М/йН Нідп-Юозе ОПгаміоієї" Ва. Зсапа У ої Іттипої! 63:90-96; І еміївКу, «). еї аї. (2009) "Пе Нитап "Тед МІВ" Іттипе Мопійгіпд ог ЕРохр3-ї гедшіайогу сеї! депегаїйоп,
Тгапз5ріапіайоп 88:1303-11.
Е. Протипухлинні аналізи іп мімо
І00354| Протипухлинну активність біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул згідно з винаходом можна оцінювати на різних тваринних моделях, відомих в даній області техніки. Очікується, що лікування біспецифічними по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекулами згідно з винаходом буде інгібувати утворення пухлини і/або ріст пухлини більшою мірою у порівнянні з лікуванням антитілом проти РО й антитілом проти СТІ А-4 окремо або комбінацією таких антитіл.
ІЇ00355| Зокрема, можна застосовувати мишачі моделі пухлинних ксенотрансплантатів.
Коротко, мишам імплантують лінію ракових клітин або пухлинні клітини, що цікавлять, і лікують за допомогою (ї) біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул, (ії) антитіла проти
РО-1, (ії) антитіла проти СТІ А-4, (ім) комбінації антитіла проти РО-1 й антитіла проти СТІ А-4 і (м) контролю з відсутністю лікування, який може являти собою окремо наповнювач і/або нерелевантне антитіло. Лікування можна починати до імплантації (наприклад, за 1 день (тобто - 60 1 доба)); в день імплантації (тобто 0 доба) або після формування пухлини (наприклад, 7 доба).
Тваринам можна проводити один курс лікування або декілька курсів лікування (наприклад, щотижня після імплантації). За тваринами спостерігають протягом тривалого часу для визначення іп мімо ефекту зазначених молекул на формування та/або ріст пухлини. За ростом пухлин можна стежити шляхом їх вимірювання та визначення об'єму (висота х ширина х довжина). Підданих лікуванню тварин, у яких спостерігається повна регресія пухлини, можна застосовувати для оцінки пухлина-специфічної імунної відповіді шляхом повторної стимуляції з використанням тих самих або пухлинних клітин і нерелевантних пухлинних клітин як контролю.
Крім того, зазначені моделі можна модифікувати із забезпеченням способу лікування, комбінованого зі стандартними методами лікування, такими як хіміотерапія, променева терапія тат. п.
Ї00356| Численна кількість ракових клітинних ліній, які можна трансплантувати і використовувати на таких моделях ксенотрансплантата, відома в даній області техніки.
Зазначені лінії включають, але не обмежуються наступними: клітини раку товстої та прямої кишки МО5Т8, 5УМ480 і 5УУ620; клітини раку шлунка АО5; клітини меланоми ШАСС-62, А2058 і
ГОХ ІММІ; клітини раку передміхурової залози 22гу; клітини раку підшлункової залози А5РО-1 і
ВхРео-3; клітини раку нирки Сакі-1, А498 ії 786-0; клітини раку сечового міхура НТ-1197; клітини раку молочної залози 471, МОА-МВ-231; клітини раку легень АБбБ49, УУХЗ22; клітини фібросаркоми НТІ1080; клітини НВІ-2 мантійноклітинної лімфоми людини; клітини лімфоми
Беркіта Каї)ї. Зокрема, переважними є моделі, отриманого від пацієнта ксенотрансплантата (РОХ). Такі ракові клітинні лінії або отримані від пацієнта пухлини трансплантують лінійним мишам з імунодефіцитом (наприклад, мишам Миде, мишам 5сідй, мишам МОБ, нульовим за Кад 1 мишам і т. д. (див. наприклад, Веїї2агіо, 9У.Е., (2009) "Іттиподеїйсіепі Моизе Моаеї5: Ап
Омегліем," Вепіпат Ореп 1874-2262/09) або гуманізованим мишам, таким як трансгенні миші з
НГА-А2 людини (див. наприклад, ЗпийКя, Ї.О., еї аї. (2012) "Нитапігей тісе ог іттипе 5уїет іпмевіїдайоп: ргодгев55, рготібве апа сНаІІепде5," Маїште Нем Іттипо! 12:786-798), як описано вище. Крім того, для оцінки молекул, що модулюють контрольні точки імунної відповіді, мишам з імунодефіцитом можна трансплантувати компоненти імунної системи людини (наприклад, відновлювати імунну систему за допомогою МКПК, стовбурових клітин, прогеніторних імунних клітин людини і т.д.) до або одночасно з імплантацією бажаних пухлинних клітин і лікуванням, як докладно описане вище.
Приклад 5
Дослідження зв'язування біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул
І00357| Створювали декілька біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул, включаючи діатіла, які містять Ес-фрагмент і трьохвалентні молекули, які містять Ес-фрагмент, що мають чотири поліпептидні ланцюги. Створювали три діатіла, що мають чотири поліпептидні ланцюги і містять домени Е/К-соїЇ, які сприяють утворенню гетеродимеру, і позначали їх як "ПАКТ В", "АКТ С" ї "ПАКТ 0". Створювали одне діатіло, що має чотири ланцюги і містить домени СНІТ/Сі, і позначали його як "ОАКТ Е". Створювали дві трьохвалентні сполучні молекули, що мають чотири ланцюги і містять домени Е/К-соїЇ, які сприяють утворенню гетеродимеру, і домени СНІ1І/СІ,, і позначали зазначені молекули як "ТКІОЕМТ А" ії "ТКІОЕМТ В". (003581 Крім того, було створено декілька антитіл, що мають специфічність по відношенню до РО-1 або СТІ А-4. Створювали одне антитіло, специфічне по відношенню до РО-ї, і позначали його як "РО-1 тАБ 6 с4Р". Створювали три антитіла, специфічні по відношенню до
СТІ А-4, і позначали їх як "СТІ А-4 тА 1", "СТІ А-4 тАБ З С1ТАА" і "СТІ А-4 тАБ З (14Р". 00359) Структура й амінокислотні послідовності зазначених біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул, антитіл проти РО-1, антитіл проти СТІ А-4 представлені вище та підсумовані в Таблиці 9 нижче.
Таблиця 9 1 95
СТІ А-4 тАБ 1 2 96 Домени /Е/К-соїї; рАНТ В РО-1 тАЬ 6-ІЗО юс (УТ) З 95 | див. Фігуру ЗВ 4 96 1 97
СТІ А-4 тАБЬ З РО- 2 98 Домени /- Е/К-соїї;
АНТ С 1 тА 6-ІЗО 94 З 97 див. Фігуру ЗВ 4 98
Таблиця 9 1 99
РО-1 тАБ 6-ІБО 2 100 Домени /-Е/К-соїї;
БАНТ СТІ А-4 ТАБ З юса (УТЕ) З 99 див. Фігуру ЗВ 4 100 1 102
СТІ А-4 тАБЬ З РО- 2 103 СуСНІ1; див.
ОАНТЕ 1 тАь 6-ІЗО юс (УТ) З 102 | ФігурузС 4 103 1 101
ОАВТ Е РО-1 тАБ 6-ІБО Ідс1 2 100 Домени /-Е/К-соїї;
СТІ А-4 тАБ З (АА/УТЕ) З 101 див. Фігуру ЗВ 4 100 1 104 а.
Домени Е/К-сої і
РО-1 тА 6-ІЗО 2 105 ,
ТВІОЕМТ А СТІ А-4 тАЬ З І4с4 (МУТЕ) З 106 вис див. 4 107 УРУ 1 108 а.
Домени Е/К-сої і
РО-1 тА 6-ІЗО Ідс1 2 105 ,
ТНІОЄМТВ ) стід4 ть З (АА/УТЕ) З 109 | СІСНІ; див.
Фігуру бА 4 107 і 88 природна
Сар тА 6 РО тдьв-ІЗО да4 5 ва структура
А 89 антитіла природна
СТІА-4 тАБ| СТІА-4 тАб 1 ж антитіла і За природна
СТІ А-4 тА 2 94
З СІАА СТІ А-4 тАБ З ІЯса1 (АА) З 92 структура антитіла 4 94 і 33 природна
СТА ТАБ сті А4 тА З ІдсА К ЗА | структура
З бар З 33 антитіла 4 94
Її Молекули, які містять Ес-фрагменти Ідб4, також включають стабілізовану шарнірну область ІдО4. "« така сама амінокислотна послідовність, як в іпілімумабу (див., наприклад, базу даних
ЗО 120 структур ІМОТ, номер доступу 8568 Н і8568 І)
І00360| Додаткові біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули, які містять альтернативні сайти зв'язування епітопу РО-1 і/або СТІ А-4, можна легко створювати шляхом включення різних МН- і МіІ-доменів. Аналогічно, можуть бути створені молекули, які містять альтернативні лінкери, Ес-фрагменти і/або мають альтернативні структури, як запропоновано у даній заявці (див. наприклад, Таблицю 8).
А. Дослідження зв'язування за допомогою твердофазного ІФА
ІЇ00361| Дослідження за допомогою твердофазного ІФА проводили для вимірювання зв'язування сполучних молекул у серійних розведеннях (антитіло СТІ А-4 тАБ З С4Р, АВТ 0,
ТАІРЕМТ А або САКТВ) з розчинним НСТІ А-4-Амі-Нів (1 мкг/мл) або пРО-1-НІів (1 мкг/мл), який був нанесений на планшети-підкладки. Козячі Ес-специфічні антитіла проти імуноглобуліну людини, кон'юговані з НКР, (1:10,000) використовували в якості вторинної детектуючої молекули для виявлення зв'язування. Результати такого дослідження показані в Таблиці 10 і на
Фігурах 8А-88. Дані показують, що зв'язування з РО-1 і СТІ А-4 біспецифічних по відношенню до
РО-1 х СТІ А-4 молекул, які містять два сайти зв'язування для РО-1 і СТІ А-4 (наприклад, ОАКТ р їі АКТ В), було подібно зі зв'язуванням їх відповідних вихідних антитіл проти РО-1 і проти
СТІ А-4. Зв'язування з РО-1 біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул, які містять два сайти зв'язування для РО-1 й один сайт зв'язування для СТІ А-4 (наприклад,
ТКІОЕМТ А), було подібно зі зв'язуванням вихідного антитіла проти РО-1, а зв'язування з СТІ А- 4 було знижено у порівнянні зі зв'язуванням вихідного антитіла у зв'язку зі зниженою авідністю трьохвалентної молекули, що містить тільки один сайт зв'язування для СТІА-4. Подібні результати зв'язування спостерігалися для САКТ Е і ТКІОЕМТ В, які містять СНІ Ідс1 і/або (АА/УТЕ) Ес-фрагменти Ідс1.
Таблиця 10 (нм) (00362) Ефект зміни розподілу та сполучення доменів на зв'язування досліджували шляхом інкубування біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул, які містять домени зв'язування СТІ А-4 антитіла СТІ А-4 тАБ 1 (наприклад, САКТ В) і СТІ А-4 тАБ З (наприклад, рАКТ С і бАКТ 0) у присутності розчинного РО-1 людини (Фігура 8С) або розчинного СТІ А-4 людини-Амі-Нів (Фігура 80), які наносили на планшети-підкладки. Козячі Есу-специфічні антитіла проти імуноглобуліну людини, кон'юговані з НЕР, використовували в якості вторинних детектуючих молекул для виявлення зв'язування із застосуванням хемілюмінесцентного субстрату РІСО. Результати показують, що біспецифічні по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекули, які містять домени зв'язування СТІ А-4 антитіла СТІ А-4 тАБ 1 (наприклад, САКТ В) і
СТІ А-4 тАБ З (наприклад, ОАКТ С і БАКТ Б), зв'язувалися з СТІ А-4 подібним чином. Було виявлено, що зв'язування з РО-1 або СТІ А-4 значно не змінювалося залежно від розподілу сполучних доменів, тобто їх розташування на першому або другому ланцюзі (для порівняння -- зв'язування САКТ С і АКТ 0).
В. Дослідження блокування за допомогою твердофазного ІФА
І00363| Проводили серію твердофазних ІФА для оцінки здатності біспецифічних молекул згідно з винаходом блокувати зв'язування ліганду з РО-1 і СТІ А-1, окремо й у комбінації.
Блокування зв'язування РО-11 з РО-1 оцінювали у присутності рівної кількості нерелевантного антигена та рівної кількості СТІ А-4. Планшети покривали сумішшю міченого гістидином (Нів) розчинного РО-1 людини (5ПРО-1) і міченого Ні5 нерелевантного антигена (іггАд), 1:11, (2 мкг/мл кожного) або сумішшю 5ПРО-1 ії міченого Ні5 розчинного СТІ А-4 людини (5НСТІА-4), 1:71, (2
Зо мкг/мл кожного). РО-1 тАбр 6 с4Р, САКТ 0, ТКІОЕМТ А або контрольну молекулу ТКІСЕМТ (що містить два сайти зв'язування для К5М й один сайт зв'язування для СТІ А-4) в зазначеній концентрації попередньо змішували протягом 5 хв. із міченим біотином РО-І 1 в концентрації б мкг/мл і додавали у планшети. Зв'язування РО-І/1 виявляли із застосуванням кон'югованого з
НЕР стрептавідину (1:3,000). Результати оцінки представлені на Фігурах 9А-9В. Було виявлено, що всі з досліджених сполучних РО-1 молекул були здатні інгібувати зв'язування РО-І 1 сРОр-1.
І00364| Блокування зв'язування В7-1 з СТІ А-4 оцінювали у присутності рівної кількості нерелевантного антигена та рівної або більшої в чотири рази кількості РО-1. Планшети покривали сумішшю 5ИСТІА-4 і ітАд (2 мкг/мл кожного), 1:11, сумішшю 5ПСТІА-4 5ПРО-1 (2 мкг/мл кожного), 1:11, або сумішшю 5пСТІ А-4 (0,8 мкг/мл) і 5пРО-1 (3,2 мкг/мл), 1:4. РО-1 тА 6 саР, САВТ 0, ТВІОЕМТ А, СТІ А-4 тАБ 3 С4Р або контрольну молекулу в зазначеній концентрації попередньо перемішували протягом 5 хв. із міченим біотином В7-1 в концентрації 0,2 мкг/мл і додавали у планшети. Зв'язування В7-1 виявляли із застосуванням кон'югованого з
НЕР стрептавідину (1:3,000). Результати оцінки представлені на Фігурі 9С-9Е. Було виявлено, що всі з досліджених сполучних СТІ А-4 молекул були здатні інгібувати зв'язування В7-1 з СТІ А- 4. Було виявлено, що блокування зв'язування В7-1 молекулою ТКІОЕМТ А підсилювалося в результаті взаємодії його РО-1-зв'язуючого фрагмента з іммобілізованим РО-1 (для порівняння - контрольна молекула ТКІОЕМТ, яка не зв'язується з РО-1) (Фігура 90). Більше того, було виявлено, що при відношенні СТІ А-4:РО-1, що становило 1:4, де дані умови краще імітують відносний рівень експресії, спостережуваний у стимульованих клітинах (див. Фігуру 19А), блокування зв'язування В7-1 молекулою ТКІЮОЕМТ А додатково підсилювалося (тобто крива
ТКІОЕМТ А була додатково зміщена у порівнянні з кривою контрольної молекули ТКІОЕМТ, яка не зв'язується з РО-1) (Фігура 9Е). 00365) Результати зазначених досліджень за допомогою твердофазного ІФА демонструють, що всі з досліджених сполучних РО-1 молекул були здатні інгібувати зв'язування РО-І1 з РО-1 (Фігури 9А-98). Всі зазначені молекули є бівалентними по відношенню до РО-1 і проявляли подібні профілі інгібування. Всі з досліджених СТІ А-4-сполучних молекул були здатні інгібувати зв'язування В7-1 з іммобілізованим СТІ А-4 (Фігура 9С-9Е), при цьому молекули, які містять два сайти зв'язування РО-1 й один сайт зв'язування СТІ А-4, викликали більше сильне інгібування у присутності РО-1 (Фігура 90-9Е). Таким чином, трьохвалентні молекули, які містять єдиний сайт зв'язування СТІ А-4, викликають опосередковане РО-1 блокування лігандів СТІ А-4, демонструючи, що взаємодію СТІ А-4 можна адаптувати шляхом коректування валентності.
С. Дослідження ВІАСОКЕФ (00366) Афінність зв'язування ОАКТ А, ТКІОЕМТ А і СТІ А-4 тАБ 1 з СТІ А-4 людини й яванського макака досліджували із застосуванням аналізу ВІАСОКЕФ. Коротко, мічений Нівб розчинний СТІ А-4 (позаклітинну частину СТІ А-4 людини або яванського макака зливали з пептидом, що містить гістидин) захоплювали на іммобілізовані молекули проти пентагістидину (пента-Ніз) і потім молекули зв'язування СТІГА-4 в різних концентраціях (12,5-200 нм) пропускали вздовж іммобілізованих білків СТІ А-4. Кінетику зв'язування визначали за допомогою аналізу ВІАСОКЕФ (афінність за моделлю зв'язування Ленгмюра 1:1 (одночасна апроксимація Ка/ка); або авідність за допомогою роздільної апроксимації кривих Ка/ка, 1:1).
Розраховані Ка, Ка і Ко від зазначених досліджень представлені в Таблиці 11.
Таблиця 11 х105 х107 (НМ) х105 х10з (НМ) СтАЯтАрі! 7 | 66 | 89 | 14 | 70 | 13 | 13 " авідність за роздільною апроксимацією кривих Ка/ка, 1:1 я афінність за моделлю зв'язування Ленгмюра, 1:1
І00367| САКТ О є бівалентним по відношенню до СТІ А-4 і проявляє афінність зв'язування з
СТІ А-4 людини й яванського макака в межах приблизно 2-4-кратної афінності СТІ А-4 тАБбБ 1.
ТКІОЕМТ А, який є моновалентним по відношенню до СТІ А-4, має більше низьку афінність як по відношенню до СТІ А-4 людини, так і СТІ А-4 яванського макака, що є очікуваним зважаючи на його знижену авідність. (00368) Афінність зв'язування САКТ А, ТКІОЕМТ А, РО-1 тА 6 С4Р і СТІ А-4 тАБ З С1АА з
РО-1 людини досліджували із застосуванням аналізу ВІАСОКЕФ. Молекули зв'язування захоплювали на іммобілізовані Е(аб)»2 козячі Ес-специфічні антитіла проти імуноглобуліну людини і потім мічений Ніх розчинний РО-1 людини в різних концентраціях (6,25-100 нм)
Зо пропускали вздовж іммобілізованих сполучних молекул і кінетику зв'язування визначали за допомогою аналізу ВІАСОКЕФ (апроксимація кривих зв'язування з використанням рівняння
Ленгмюра, 1:1). Розраховані Ка, Ка і КО від зазначених досліджень представлені в Таблиці 12 (п.а4. - не піддається виявленню).
Таблиця 12 х105 х107 (НМ)
ОТВФЕМТА /-/-/-7777777717171Ї71171717171752/ |77711716811|71111131 003691 Всі з ПОАКТ А, ТКІОЕМТ А, РО-1 тАБ 6 с4Р є бівалентними по відношенню до РО-1 і мають порівнянні афінності зв'язування. Як й очікувалося, СТІ А-4 тАр З СТАА не проявляло якого-небудь зв'язування з РО-1 людини, що піддається виявленню. р. Клітинні аналізи СТІ А-4
І00370| Оцінювали зв'язування САКТ В, БАКТ 0, ТАКІОЕМТ А, антитіла проти СТІ А-4 СТІ А-4 тА 1, СТІ А-4 тАБ З С4Р і контрольного антитіла пІдс з клітинами СНО, експресуючими СТІ А- 4 яванського макака (супоСТІ А-4) або СТІ А-4 людини (пиСТтІіА-4). Результати цієї оцінки показані на Фігурах Т0А-108. Сполучні молекули інкубували у присутності клітин СНО, які експресували або СТІ А-4 яванського макака (Фігура 10А), або СТІ А-4 людини (Фігура 108В).
Зв'язування із зазначеними клітинами виявляли за допомогою вторинних антитіл проти Ес імуноглобуліну людини. Результати показують, що всі досліджені молекули були здатні зв'язуватися з СТІ А-4 людини й яванського макака, що експресуються на поверхні клітин СНО.
В антитіл проти СТІ А-4 спостерігалися подібні профілі зв'язування з пиСТтІ А-4; у бівалентних біспецифічних молекул ВАКТ В і ВАКТ О спостерігалося небагато більше слабке зв'язування, а в трьохвалентної сполучної молекули ТКІОЕМТ А, яка є моновалентною по відношенню до
СТІ А-4, спостерігалося більше слабке зв'язування у порівнянні з молекулами з більше високою валентністю по відношенню до СТІ А-4. Контрольне антитіло не зв'язувалося. Подібні результати були показані у випадку зв'язування з супоСтТі А-4.
І00371| Оцінювали зв'язування ОАКТ С, САКТ 0, САКТ Е, ТКІОЕМТ А, антитіл проти СТІ А-4
СТІ А-4 тАБ 1, СТІ А-4 тАБ З С1АА й антитіла проти РО-1 РО-1 тАбБ 6 С4Р з клітинами ЧУигкаї, які експресують на своїй поверхні пиСтІ А-4, але не експресують РО-1. Зв'язування молекул
БАКТ і ТКІОЕМТ з СТГА-4 людини виявляли за допомогою вторинних АБ проти Ес імуноглобуліну людини (ЕАС5-аналіз). Результати оцінки показані в Таблиці 13 і на Фігурі 11А (РАВТ С, АВТ 0, САВТ Е, СТІ А-4 тАБ 1, СТІ А-4 тАБ З СТАА ії РО-1 тА 6 с4Р) і Фігурі 118 (СТІ А-4 тАБ 1, СТІ А-4 тАБ З СТАА, РО-1 тАбБ 6 с4Р і ТКІОЕМТ А). Як показано на Фігурах 11А-118, антитіло РО-1 не зв'язувалося з СТІ А-4, але всі досліджувані молекули зв'язування
СТІ А-4 були здатні зв'язуватися з пиСтТІ А-4, що експресується на поверхні клітин ЧигКкаї. В антитіл проти СТІ А-4 спостерігалися подібні профілі зв'язування; у бівалентних біспецифічних молекул ВАКТ С, БАКТ О і САКТ Е спостерігалося більше слабке зв'язування з клітинами
УйигКаї, а в трьохвалентної сполучної молекули ТКІОЕМТ А, яка є моновалентною по відношенню до СТІ А-4, спостерігалося більше слабке зв'язування у порівнянні з молекулами з більше високою валентністю по відношенню до СТІ А-4.
Таблиця 13
Коо)
І00372| Оцінювали здатність ПОАКТ 0, ТКІОЕМТ А й антитіл проти СТІ А-4 СТІ А-4 тА 1,
СТІ А-4 тАр 3 С1АА блокувати ліганди СТІ А-4 В7-1 і В7-2. Мічені Нібх похідні В7-1 і В7-2 інкубували у присутності клітин СТІ А-4-УигКаї. Зв'язування Ніб-В7-1 і Ніб-В7-2 виявляли із застосуванням антитіл проти Ні5. Результати цієї оцінки показані на Фігурі 12А (Нібз-В7-1) і
Фігура 128 (Нібз-В7-2). Було виявлено, що всі досліджувані молекули були здатні інгібувати зв'язування В7-1 і В7-2 з СТІ А-4, що експресуються на поверхні клітин УигКкаї. В антитіл проти
СТІ А-4 спостерігалися подібні профілі інгібування; бівалентна біспецифічна молекула ПОАКТ 0 була трохи менше активним інгібітором, а трьеохвалентна сполучна молекула ТКІОЕМТ А, яка є моновалентною по відношенню до СТІ А-4, була менше активною у порівнянні з будь-якою з молекул, що мають більше високу валентність по відношенню до СТІ А-4. Контрольне антитіло зовсім не викликало інгібування. Результати досліджень за допомогою твердофазного ІФА, описаних вище, припускають, що ТКІОЕМТ А та подібні молекули, які містять два сайти зв'язування РО-1 й один сайт зв'язування СТІ А-4, могли би бути більше активними інгібіторами у присутності РО-1. 00373) Аналіз репортерного гена на клітинах ІІ -2/ ис Уижкаї-СтТІ А-4 використовували для оцінки здатності ОАКТ С, САКТ 0, ТКІОЕМТ А, СТІ А-4 тАбБ З СТАА і РО-1 тАбБ 6 с4Р обертати інгібуючий сигнал контрольної точки імунної відповіді СТІ А-4, як показано за підвищеною експресією люциферази. Клітини ІІ -2/ ис-дуииКкаї-СТІ А-4, таким чином, інкубували у присутності таких молекул (К:5-1:0,3) протягом 30 хв. при 37 "С, після чого додавали штучні антиген- презентуючі клітини Ка|її та продовжували інкубувати протягом б годин. Штучні антиген-
презентуючі клітини активують комплекс ТСК/СОЗ на репортерних клітинах УиїКкаї. Результати оцінки показані на Фігурі 13. Всі з досліджених молекул зв'язування СТІ А-4 були здатні обертати інгібуючий сигнал контрольної точки імунної відповіді СТІ А-4, як визначено за результатами люциферазного аналізу. Молекула ТКІОЕМТ А, яка є моновалентною по відношенню до СТІ А-4, була менше активною в цьому аналізі у порівнянні з будь-якою з молекул, що мають більше високу валентність по відношенню до СТІ А-4. Контрольне антитіло зовсім не викликало інгібування. Результати дослідження за допомогою твердофазного ІФА, описані вище, припускають, що ТКІОЕМТ А та подібні молекули, які містять два сайти зв'язування РО-1 й один сайт зв'язування СТІ А-4, можуть бути більше активними у присутності
РО-1.
Е. Клітинні аналізи РО-1
І00374| Оцінювали здатність ПОПАКТ О, ТКІОЕМТ А, РО-1 тА 6 с4Р і СТІ А-4 тАБ З СТАА зв'язуватися з клітинами МБО, що експресують РО-1, але не експресують СТІ А-4. Сполучні молекули інкубували у присутності клітин і вимірювали середній коефіцієнт флуоресценції клітин. Результати цієї оцінки представлені на Фігурі 14. Як й очікувалося, антитіло СТІ А-4 не зв'язувалося. Було виявлено, що всі біспецифічні сполучні молекули були здатні зв'язуватися з
РО-1, що експресуються на поверхні клітин М5О. Всі біспецифічні молекули є бівалентними по відношенню до РО-1 і зв'язувалися з клітинами МЗО подібним чином. 00375) Оцінювали здатність ПОПАКТ О, ТКІОЕМТ А, РО-1 тА 6 с4Р і СТІ А-4 тАБ З СТАА блокувати зв'язування між РО-1, що експресуються на клітинній поверхні, та його лігандами РО-
Ї1 ї РО-І2. РО-І 1-РЕ або РО-І2-РЕ інкубували у присутності зазначеної сполучної молекули й оцінювали її здатність зв'язуватися з клітинами М5О-РО-1 шляхом сортування клітин з активованою флуоресценцією (ЕГАС5). Результати цієї оцінки представлені на Фігурі 15А (РО-
І) ї Фігурі 158 (РО-І2). Як й очікувалося, антитіло СТІ А-4 не викликало інгібування, а всі з досліджених сполучних РО-1 молекул були здатні інгібувати зв'язування як РО-1 1 (Фігура 15А), так і РО-І2 (Фігура 158), з РО-1, що експресуються на поверхні клітин МО. Всі сполучні РО-1 молекули є бівалентними по відношенню до РО-1 і мали подібні профілі інгібування.
І00376| САВТ 0, ТВІОЕМТ А, СТІ А-4 тАБб 3 С1ТАА і РО-1 тАБ 6 С4Р також оцінювали в репортерному аналізі блокування РО-1. Зазначені сполучні молекули інкубували у присутності
Зо клітин РО-Ї1-СНО й ефекторних клітин «игкаї і здатність сполучних молекул блокувати інгібування імунної відповіді (шляхом блокування взаємодії РО-1/РО-І1) оцінювали шляхом спостереження ступеня СЮОЗ-опосередкованої активації (як показано за підвищеною експресією люциферази в аналізі на клітинах МЕАТ-Ійс/РО-1 УдигКкаї Рготеда). Результати цієї оцінки представлені на Фігурі 16. Всі з досліджених зв'язуючих РО-1 молекул були здатні обертати інгібуючий сигнал контрольної точки імунної відповіді РО-1, як показано за підвищеною експресією люциферази. Всі сполучні РО-1 молекули є бівалентними по відношенню до РО-1 і мали подібну здатність інгібувати опосередковане РО-1 блокування Т-клітинного сигнального шляху. Антитіло СТІ А-4 зовсім не викликало інгібування зазначеної системи.
Е. Клітинні аналізи СТІ А-4/Р0О-1
І00377| Перевіряли здатність ОАКТ 0, ТКІОЕМТ А й антитіла, що являє собою негативний контроль, одночасно зв'язуватися з РО-1 і СТІ А-4 у ферментаційному аналізі комплементації білкових фрагментів, Оізсомегх. Коротко, аліквоти клітин лінії 0205 СТІ А-4(1-195)-РК РО-1(1- 199)-ЕА 29 висіювали у чотирьох повторах в концентрації 5,000 клітин/ямку в середовищі для посіву Оізсомегх СР5 на 384-ямкові планшети. Клітинам дозволяли прикріплюватися протягом 4 годин при 37 "С/5 95 СО». Потім до клітин РО-1-СТІ А-4 додавали кожну з молекул зв'язування в серійних розведеннях 1:3 (11 точок). Планшети інкубували протягом ночі (16 годин) при 37 "С / 596 СО». В ямки додавали реагент для виявлення РаїйНипіег і потім інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі в темряві та потім планшет зчитували на люмінометрі
Епмізіоп. Результати цієї оцінки представлені в Таблиці 14 і на Фігурі 17 (клітинна лінія 0205
СТІ А-4(1-195)-РК. РО-1(1-199)-ЕА 29). Для обох біспецифічних молекул САКТ О і ТКІОЕМТ А було показано порівнянне одночасне залучення молекул РО-1 і СТІ А-4 на клітинах, у яких ко- експресуються обидва рецептора, як показано за допомогою ферментаційного аналізу комплементації білкових фрагментів, що вказує на те, що біспецифічні молекули згідно з винаходом здатні одночасно зв'язуватися з РО-1 і СТІ А-4, і додатково вказує на те, що приєднання через РО-1 компенсує знижену авідність молекули ТКІОЕМТ А по відношенню до
СТІ А-4 при експресії обох рецепторів-мішеней. Це відкриття узгоджується з результатами досліджень інгібування за допомогою твердофазного ІФА, описаними вище. Негативний контроль не викликав значного підвищення сигналу на клітинній лінії РО1-СТІ А4. Інкубування у присутності більше високої концентрації ТКІЮОЕМТ А призводило до сильного підвищення бо сигналу в клітинній лінії 0205 з димеризацією РО1-СТІ А4 (5:8-12,7). Відповідь для ОАКТ О у дослідженні дозозалежного ефекту на клітинній лінії РО-1-СТІ А-4 був меншим за величиною (5:8-9,2), але значення ЕСво були подібними для обох зазначених молекул (ЕСво-20 пкМ).
Таблиця 14 11111111 | Негативнийконтроль | ТНЮЄЕМТА | АВТО -/ 00378) Оцінювали здатність ПОАКТ 0, ТКІОЕМТ А, СТІ А-4 тАБ З СТАА, РО-1 тА 6 с4Р і комбінації СТІ А-4 тА З СТАА/РО-1 тА 6 с4Р (АБ Сотрво 1) підсилювати відповідь в реакції змішаної культури лімфоцитів (ЗКЛ). Дендритні клітини моноцитарного походження створювали шляхом обробки СО14-- моноцитів (виділених із МКПК за допомогою набору позитивної селекції
Міпцепуї) М-СЗЕ (100 нг/мл) й ІІ -4 (10 нг/мл) і наступного культивування клітин протягом 7 днів.
На 7 добу клітини збирали і висіювали на 96-ямкові планшети і культивували протягом 24 год.
На 8 добу СО4--Т-клітини (виділені шляхом негативної селекції із застосуванням набору
МукКепуї) висіювали в концентрації 200,000 клітин на ямку, додавали досліджувані вироби і культивували протягом З днів. Потім вимірювали рівень ІЕМ-д у супернатантах культур із застосуванням наборів для твердофазного ІФА клітин людини Юпо5беї для ІЕМ-у (КО Зувіетв) відповідно до інструкцій виробника. При використанні антитіл в комбінації кожне з даних антитіл додавали в зазначеній концентрації таким чином, що загальна концентрація антитіла, що додається, подвоювалася. Вивільнення ІЕМ-у представлено у вигляді графіка на Фігурі 18. Було виявлено, що як біспецифічні ПОАКТ 0, так і молекули ТКІОЕМТ А підсилювали відповідь у ЗКЛ тією самою мірою або дещо більше у порівнянні з комбінацією окремих вихідних антитіл.
І00379| Здатність ПАКТ 0, ТКІОЕМТ А, СТІ А-4 тАБ З СТАА, РО-1 тА 6 С4Р і комбінації
СТІ А-4 тАБ 1/РО-1 тАБ 1 (АБ Сотбо 1) підсилювати вивільнення цитокіну за допомогою інгібування контрольних точок також оцінювали в аналізі повторної стимуляції ентеротоксином типу В ебарпуіососси5 ацйгеи5 (ЗЕВ). В цілому, МКПК очищали із суцільної крові здорових донорів (наприклад, за допомогою методу центрифугування в градієнті щільності РісоїІ-Радие
Ріиз (СЕ Неайсаге) відповідно до інструкцій виробника). Очищені МКІПК культивували в середовищі КРМІ з додаванням 10 95 термоінактивованої ЕБС і 1 95 пеніциліну/стрептоміцину в об'ємних флаконах Т-25 протягом 2-3 днів під час відсутності або у присутності ЕВ (наприклад,
Зідта-Аїйгісп) в концентрації 0,5 нг/мл (первинна стимуляція). Наприкінці першого циклу ЗЕВ- стимуляції МКПК промивали два рази ФСБ і відразу висіювали на 9б6-ямковий планшет для
Зо тканинних культур в концентрації 1-5 х 105 клітин на ямку просто в середовищі, в середовищі з контрольним або досліджуваним виробом, в середовищі з 5ЕВ в концентрації 0,5 нг/мл (вторинна стимуляція) і без антитіла або в середовищі з ЗЕВ і контрольним ІдсС або досліджуваним виробом і культивували протягом додаткових 2-3 днів. Наприкінці вторинної стимуляції супернатанти збирали для вимірювання секреції цитокінів (наприклад, (із застосуванням наборів для твердофазного ІФА клітин людини Юиоз5еї для ІЄМУу, І--2, ТМРа, І-- 10 ї 1-4 (К2О бузіетв) відповідно до інструкцій виробника). 00380) На Фігурах 19А-198 показані точкові графіки розподілу флуоресціюючих точок на сортері клітин з активованою флуоресценцією (БАС5), що відображають експресію РО-1 залежно від експресії СТІ А-1 такими МКПК під час відсутності (Фігура 19А) або у присутності (Фігура 198) 5ЕВ-стимуляції. На Фігурі 19С показаний ефект 5ЕВ-стимуляції на секрецію ІЕМ-у.
МКПК стимулювали ентеротоксином типу В барпуіюососси5 ацйгеи5 (ЗЕВ) в концентрації 0,5 нг/мл протягом 48 годин. Потім клітини збирали, промивали і заново висіювали на 96-ямкові планшети, що містять антитіла в різних концентраціях зі свіжим ЗЕВ, на додаткові 48 годин.
Супернатант потім збирали й аналізували продукцію ІЕМ-у за допомогою проточної цитометрії твердофазного ІФА. Як біспецифічні САКТ, так і білок ТКІОЕМТ показали підвищену відповідну продукцію ІЕМ-у, яка відповідала сумарній відповіді, спостережуваній при введенні комбінації окремих вихідних тАбБ. Подібні результати спостерігалися в аналізі 5ЕВ-стимуляції, в якому
МКПК культивували у присутності високої концентрацій (500 нг/мл) ЗЕВ протягом 72 годин. Щоб додатково досліджувати вплив біспецифічної по відношенню до РОТ х СТІ А-4 молекули на Т- клітинну відповідь, МКК стимулювали 5ЕВ в концентрації 0,5 нг/мл протягом 48 годин, збирали, промивали і повторно висіювали на 96-ямкові планшети у присутності свіжого 5ЕВ і або САКТ 0, ТКІОЕМТ А, СТІ А-4 тАБ З СТАА, РО-1 тАБ 6 с4Р, або комбінації СТІ А-4 тА З
СТАА / РО-1 тА 6 С4Р (АБ Сотрбо 1) на додаткові 48 годин і вимірювали ІІ -2, що вивільнився (Фігура 190). На Фігурах 19А-190 показано, що введення біспецифічних по відношенню до РО1 х СТІ А-4 молекул призводило до значного посилення Т-клітинних відповідей. При використанні антитіл в комбінації кожне антитіло додавали в зазначеній концентрації таким чином, що загальна концентрація антитіла, що додається, подвоювалася.
Приклад 6
Дослідження іп мімо
А. Активність біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул на мишачій моделі хтТПх
І00381| Активність типової біспецифічної по відношенню до РОЇ х СТІ А-4 бівалентної молекули, ОАКТ 0, оцінювали на моделі хвороби "трансплантат проти хазяїна (ХТПХ)» на мишах МО із трансплантованими МКПК. План дослідження представлений в Таблиці 15.
Таблиця 15
Група | М/стать Лікування Доза Спосіб/режим Клітинний трансплантат (мкг/кг) введення (трансплантати)
Ат матох МклкРиЕт оАВТО ІММ/070 х 7 МКПК (ІР, ТЕТ) оАВТО ІММ/070 х 7 МКПК (ІР, ТЕТ) (00382) Кількість СОЗяТ- клітин підраховували шляхом сортування клітин з активованою флуоресценцією (ГАС5) на 14 день дослідження, дані представлені у вигляді графіка на Фігурі 20А. За виживаністю стежили протягом усього дослідження, дані представлені як відсоткова виживаність на графіку на Фігурі 208. У тварини, що одержувала лікування САКТ О в концентрації 500 мкг/кг, спостерігався підвищений ріст Т-клітин і посилення ХТПХ, що узгоджується з посиленням Т-клітинної імунної відповіді.
В. Токсикологічне та фармакокінетичне дослідження біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул 00383) Профіль безпеки типової біспецифічної по відношенню до РО1 х СТІ А-4 бівалентної молекули, АКТ 0, ї типової біспецифічної по відношенню до РОЇ х СТІ А-4 трьохвалентної молекули, ТКІОЕМТ А, оцінювали в дослідженні доз у яванських макак (без відповідності вимогам СР - Зводу міжнародних вимог до лабораторних досліджень). Додатково перевіряли деякі маркери фармакодинамічної активності.
ІЇ00384| У даному дослідженні оцінювали потенційну токсичність біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул при введенні шляхом багаторазових внутрішньовенних інфузій. План дослідження представлений в Таблиці 16.
Таблиця 16
Група Досліджуваний Доза (мг/кг) Дні введення Кількість тварин виріб дози 1 Контроль 1,8,15 1 самець, 1 самка 2 рРАНТО 50 1,8,15 З самця, З самки
З рРАНТО 75 15, 22, 29 З самця, З самки 4 ТВІОЕМТ А 5 1 2 самця, 1 самка
ІЇ00385| Таким чином, між введенням дози 50 мг/кг і підвищенням дози до 75 мг/кг забезпечували 2-тижневий інтервал. У даному дослідженні оцінювали наступні параметри і кінцеві критерії: клінічні ознаки, масу тіла, споживання їжі, температуру тіла, клінічні патологічні параметри (коагуляцію, клінічні хімічні показники і гематологічні дані до введення дози і через 23 години після введення дози для груп 1-3; до 22 доби для групи 4), біоаналітичні та токсикокінетичні параметри, дані проточної цитометрії (до введення дози і через 23 години після введення дози), цитокіни (через 2, 6, 22 годин після введення дози). Антитіла проти лікарського засобу оцінювали тільки для групи 4 на 8, 15 і 22 добу. Розтин проводили через 48 годин після введення 3-0ї дози тільки для груп 1-3. Зв'язування й активність іп мімо біспецифічних по відношенню до РО-1 х СТІ А-4 молекул також оцінювали, як описано нижче.
І00386| Всі тварини виживали до моменту планового усипляння. Не спостерігалося небажаних клінічних явищ у тварин, що одержували З дози аж до 75 мг/кг/ тиждень. Зокрема, не спостерігалося діареї. Гістопатологічні зміни також були незначними. Спостерігалося підвищення рівня глобуліну в лікувальних групах і спостерігалося збільшення органної маси селезінки і вилочкової залози в групах 2-3 (див. Таблицю 17, розтин тварин із групи 4 не проводили), що було очікувано при стимуляції імунної системи. Графіки залежності концентрації в сироватці від часу для кожної лікувальної групи показані на Фігурах 21А-21С й узгоджуються з даними для молекул, що містять Ес-фрагменти людини, у яванських макак.
Таблиця 17 виріб (мг/кг) тіла залози:маса тіла 11 | Контроль | 0 | 0,080(середнє,п-2) )| 0035(середнє,п-2)
І00387| Повідомлялося, що підвищення абсолютного вмісту лімфоцитів (АВЛ) після лікування антитілом проти СТІ А-4 іпілімумабом, очевидно, корелює з клінічним сприятливим ефектом і загальною виживаністю (див. наприклад, Ки, .У., еї аїЇ. (2010) "ЗіпоІе-Іп5ійШшіоп
Ехрепепсе М/йА ІріїтитАбр Іп Адуапсед Меіапота Раїйепі5 іп Те Сотраззіопаїє Ове бЗеціпа:
Гутрпосуїе Сошпі Айег 2 Бозез Соїтеїіаге5 М/ЙН Зигуіма!" Сапсег 116(7):1767-1775), що вказує на те, що АВЛ може бути корисним фармакодинамічним (ФД) кінцевим критерієм оцінки. АВЛ перевіряли в кожній з описаних вище груп до лікування та після проведення лікування на 2, 8, 9, 15 ї 16 добу. Зайнятість сайтів зв'язування АКТ О або ТКІОЕМТ А на РО-1 --Т-клітинах визначали шляхом вимірювання середньої інтенсивності виявленої флуоресценції (СІФ) антитіл проти імуноглобуліну людини /дое4, пов'язаних з АЇеха 48854, у популяціях СО4ч/РО-1- і
СО85/РО-1-Т-клітин при двох умовах для кожного зразка крові мавпи. При першій умові використовували значення СІФ, отримані у присутності надлишку ОАКТ О або ТКІОЕМТ А для визначення максимальної інтенсивності зв'язування САКТ 0 або ТКІОЕМТ А на РО-1-- клітинах в межах кожної клітинної популяції. При другій умові використовували значення СІФ, отримані у присутності надлишку негативного контролю, для визначення інтенсивності зв'язування РО-1--
Зо клітин в межах кожної клітинної популяції у тварини, що одержувала лікування ОАКТ О або
ТКІОЕМТ А, на момент збору зразків. Відмінність між двома умовами використовували для розрахунків 95 зайнятості сайтів зв'язування АКТ О або ТКІОЕМТ А на підтипах РО-1--Т-клітин у тварин, що одержували лікування САКТ О або ТКІОЕМТ А, як слідує далі:
Її СЕф внявленого АпісНооЯку З Ї
Зо Займятість сайтів зв'язування АВТО аа с у ррневост надлишку АБИ і а да
ТВНЖАЙ А на суйтетуляції ВНІ» Т-клітин 7 Ї (Ів виввленого Ап Ну од я у присутності | | І надлишку ЮАКІТ 0 збо ТКІЮЄМТ А і (00388) Абсолютний вміст і відсоткова зміна, нормовані до 1 доби, представлені на графіку на Фігурі 22А (у тисячах клітин /мкл (тис./мкл)) і на Фігурі 22В (відсоткова зміна АВЛ, нормована до 1 доби (01)). У кожній з лікувальних груп, що одержували САКТ 0, відразу після лікування спочатку спостерігалося зниження АВЛ із наступним підвищенням АВЛ до рівня, що значно перевищує вихідний рівень. Подібна тенденція спостерігалася в лікувальній групі ТКІОЕМТ А, яка одержувала тільки одну більше низьку дозу. 003891 Крім того, проліферацію СО4--Т-клітин і зайнятість РО-1 на Т-клітинах перевіряли для описаних вище груп 1-3. Коротко, СОЗ3ч4/РО-1--Т-клітини аналізували за допомогою ГАС5 для оцінки відсотка клітин, зв'язаних ОАКТ ОО. В 96б-ямковий планшет із глибокими ямками додавали сорок мікролітрів молекул негативного контролю (респіраторно-синцитіальний вірус (КМУ) х флуоресцеїн-Ідс4/кЕс САКТ) або досліджуваного виробу (АКТ О або ТКІОЕМТ А) в концентрації 35 мкг/мл. Потім в кожну ямку додавали по 100 мікролітрів добре перемішаної антикоагульованої суцільної крові, ретельно перемішували за допомогою піпетки й інкубували в темряві протягом 45-75 хвилин при температурі навколишнього середовища. Потім в кожну ямку додавали 100 мікролітрів лізуючого розчину їх ВО БАС5 і перемішували за допомогою піпетки; потім планшет інкубували в темряві протягом додаткових 10-20 хвилин при температурі навколишнього середовища. Планшет потім центрифугували при 400 х д протягом 5 хвилин і супернатант виливали. В кожну ямку додавали 100 мікролітрів РАС5-буфера та перемішували для здійснення етапу відмивання. Планшет потім центрифугували при 400 х д протягом 5 хвилин і супернатант виливали. Клітинний осад ресуспендували у двадцяти мікролітрах суміші антитіл панелі 1 й інкубували протягом 30-60 хвилин при температурі навколишнього середовища. Планшет промивали, як у попередніх етапах відмивання. Наприкінці інкубування планшет знову промивали і клітинний осад остаточно ресуспендували в 300 мікролітрах ЕАС5- буфера та зразки аналізували за допомогою клітинного аналізатора ВО РБАСзЗсСапіюо І.
Результати аналізу показані на Фігурах 23А-238В. 00390) Як показано на Фігурі 23А (для САКТ 0, що вводиться в концентрації 50 мг/кг) і Фігурі 23В (для САКТ 0, що вводиться в концентрації 75 мг/кг), зайнятість РО-1 (тобто зв'язування рАКТ БЮ) була максимальною протягом лікування для групи 2 їі 3. Проліферацію СЮО4-Т-клітин оцінювали за допомогою ГАСЗ на основі ко-експресії Кі-67 (клітинного маркера проліферації).
І00391| Двадцять мікролітрів суміші антитіл А (що містять антитіла, які зв'язуються з маркерами клітинної поверхні: СО45, СОЗ, СО4 і СО8) додавали в 96б-ямковий планшет із глибокими ямками. Потім в кожну ямку додавали по п'ятдесят мікролітрів добре змішаної антикоагульованої суцільної крові, ретельно перемішували за допомогою піпетки й інкубували в темряві протягом від 15 до 45 хвилин при температурі навколишнього середовища. Потім в кожну ямку додавали по 500 мікролітрів лізуючого розчину їх ВО ЕАСЗ І і перемішували за допомогою піпетки; потім планшет інкубували в темряві протягом додаткових 10-20 хвилин при температурі навколишнього середовища. Планшет центрифугували при 1200 об./хв. протягом 5 хвилин і супернатант виливали. Потім в кожну ямку додавали по 500 мікролітрів РАСЗ-буфера та перемішували для здійснення етапу відмивання. Планшет потім центрифугували при 1200 об./хв. протягом 5 хвилин і супернатант виливали. Клітинний осад ресуспендували в суміші антитіл В (що містять антитіла, які зв'язуються з внутрішньоклітинним маркером Кі-67) або ресуспендували в композиції ізотипів антитіл (що містять контрольні ізотипи в якості
Зо внутрішньоклітинного маркера) й інкубували в темряві протягом від 15 до 45 хвилин. Після промивання клітинний осад ресуспендували в 300 мікролітрах БАС5З-буфера та зразки аналізували за допомогою клітинного аналізатора ВО РАС5ЗСапіо ІІ. За даними аналізу за допомогою панелі внутрішньоклітинного фарбування Т-клітин відсоток СО4- і СОв- клітин визначали як фракцію від загальних пофарбованих на СО45-- лейкоцитів. Вважали кількість Кі 67 клітин у фракції пофарбованих на СО4- клітин, і відсоток СО4ч/Кі 67-Т-клітин (проліферативних СО4 Т-клітин) визначали як фракцію від загальних СО4-- клітин. Аналогічно, відсоток СОв/Кі 67-Т-клітин (проліферативних СО8 Т-клітин) визначали як фракцію від загальних СО8-- клітин. Результати аналізу показані на Фігурах 24А-248. 00392) Як показано на Фігурах 24А-24В, проліферація СО4Т-клітин значно підсилювалася при лікуванні в лікувальних групах 2 і З протягом лікування. Результати даного дослідження вказують, що введення яванським макакам біспецифічної по відношенню до РОЇ х СТІ А-4 молекули добре переноситься в концентрації аж до 75 мг/кг, що значно перевищує дозу 5 мг/кг, при якій були описані небажані явища в яванських макак, що одержували лікування іпілімумабом. Молекули мали сприятливий фармакокінетичний профіль, і спостерігався ряд маркерів фармакодинамічної активності, включаючи підвищення кількості лімфоцитів, підвищення рівня глобуліну, підвищення маси органів селезінки і вилочкової залози, підвищення проліферації Т-клітин (як кількості Т-клітин, так й експресії Кі-67) і максимальну зайнятість РО-1 на Т-клітинах.
І00393| Всі публікації та патенти, згадані у даній заявці, включені у дану заявку за допомогою посилання тією самою мірою, як якби було конкретно й окремо зазначено, що кожна окрема публікація або патентна заявка повністю включена за допомогою посилання. Слід розуміти, що в той час як даний винахід був описаний у зв'язку з конкретними варіантами реалізації, можливі додаткові модифікації. Передбачається, що будь-які варіації, способи застосування або адаптації згідно з винаходом, які в цілому відповідають ідеям даного винаходу, включені у дану заявку. Дана заявка включає такі відступи від винаходу, які перебувають в межах відомої або звичайної практики в області техніки, до якої відноситься даний винахід, й як застосовані до основних ознак, викладених вище у даній заявці.
ВЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«У» асо Яїкт, ВС.
Зовахгов, Бе 5.
Свієві34, Бибик йефу
Знай, Каїрапа із Месте-Мойе, Жов
Моб, Раоі А.
Вопиіні, КХїйЇ
Есвеаів, ЗСОКЕ «105 Біспецийічні щмелекули, Що вають імумореактивність го) яідновенню де РО» і сСтаАха, Її способи їх Застосування «-33йз 1383, 83 «їі505 Неелугва, а «і53їз званий хівах 15 «і7йх Бахептсїв, версія 3.5 «ох і «вії» 83 «каїйх БІЛ «2135 Нева завале ха «3215 ВІБС ЕБАТВЕ чежа» 411-487) «вай» Дюмен СМІеСНІ прикладу ХдБі пюдене кеВ «ІІ» МІЗС КЕЕАТЦВЕ «дайУ ап. СІК «333» Хав являє собою лізин (Кк) вбе відсутній «ай» 1
ЇВ Рго бій ем їв Фіу біу бго Хег Уві Баш іви Вп Рго Ве Гу і 5 ї8 15 рра вух Аа ТВгозео Мей Ї16 бек бери Те обее бів Ма ТВг Су» Уаї ше ко їх 3а
УЗА МВі в«р уаї зве кіз ої) йжо РРО БВ Маі фу ВНБ АБИ ТРО Тук
КЗ 40 45 маї Або Біу чаї З; Уві МНів ба Аїз ух ТАГ бує Бго АВ БО ЩІ (ща 55 58 чів Тук йжа бер їВг отТуг Акв уві Мві бек маї сец ївб о Ущі ва Ні
Тв я ва бін ах Тго Беб Ахообіу ух бін Тут фуб5 Суз був Уві бек Ай Ку 85 за 95 із веу го із Бго Хі 53 бує Тиг о Ї1в бБеб бух діа ув ЇМ БІ ! ча 165 це
Рго аАгв бів Бго бій Уаі Туб ТВР без Ро Бго бег дев Би Я мех 315 136 І:
Таб бух Ах бій Уві бегх фен ТНК о Суз вер уяа вух 0ІУ ББе Тук Вго ї3а ї55 86
Зек йди ї1іж діа Уві біз Тер Бір бек Ав соїу бій Вго 530 В5и аа ї45 158 155 ї5а
ТУР бух Твг о ТВ Бра Ро Узі рео Авробег абв біу заг бно вве їв їб65 178 її
Тук ее суб вец ТвБ Май Ар обу хве ак То Біб ія ЗМУ ха Майї їв 185 ї58
Ре бек суз чек Маії Меж Ні пів йїв ви Ні дей Нія Тут ТВЕ ЩІ ї955 ва 595 іув зег ібн) бек іжу Бер рРО Щіу Хва ів аа каійх З «в» ще «ах БІЖЕ «ЖІ Нолюо задівве «Зх «231 МІС БЕДТОВЕ хай» 1).
«933» Домен СНІ-СНІ прикладу їщО? людини «аах «й3і» ІБ ЕБАТОВЕ «вай ІА. ЗЕ) «335 ЖХаа являє собою лізни (КК) або відсутній «ад95 з
Аїз Бео рго Уві Аза біу Бго бег Узі Ре іо БВ РКО Бере фує бро ї 5 38 15 іт Ав ТК їви Мей бів Зег Ага ТВ оБео біз Уві Твг Куб Уві Уа) ! за 35 ЗВ
Уві бер Уаі зве Ніх бін дер Ро (ін Маї бій Бе Аа Тер Туб УВІ 358 за 45
Ав» біу Укі бій аз Мі Аєв Аїз вуз ТВг фу Рго Ак бі: Бі щи
За 25 ке
Рне аж бек Те Ре АР УВІ Маі баб уві ев Те о маї Узі Ні бій 75 75 ща
Акр Тгр вве Ахп бір Бужх БІ Тук бух Суз ух уаї баг й5оп бух БУ 85 за 95 ім Бго дів Рго їі біш бух Тбб С36 баг губ Твг обу б3іу бів вго тав 105 318
Аге Бій бро бій Маї Ту ТВ фей Рго ргро дае Ав вів бід Ме ТВе 115 338 335 ух дав ів Маії баб їжи ТВг бух еп Узі буз бі вне Ту Бра 5ег
В 155 зд
Ар 3 бБег Уві бів Тер Бій беб Аха біу біп Бге біб АБа ев тує 185 ї5а 155 168
Муз Те ти Рг БРО МОЇ іву дор зве Ав бі бер Ре Вп фе тує ї155 та 75 аб іух іяо ТВг оМаії дшроїух баг АвЕ ТТ? бі» бів бі Ав узі РА за 185 КЗ
Бех сук баг уві Мес Ні січ Аів ер ніх вп Нія Туб Те Бій вух 135 КЗ «5 бебр івц баг Бей ев рго 01у Хав ів кН «тій» З «а У «их БІЛОК хаі3» Ново карієенпя «аву «жі ВІБ5С БЕАТИДЕ «заз ї33..4317) «853» Домен ЄНО-СНЗ прикладу ЇДб3 людини хІВ» «їз МЗС КЕАТОКЕ «аа и, С «ЯЗ Ха являє собзе лізин Кк) або відсутній «ках З аів бго бів їви їво біб 51 Бго бек узі РБе бе Бе бо ко ух 1 КУ 38 15
Бго ух да Тве ем Меї Щі бег ак ТАгорРРо бій уві Тве Су: Маі 28 25 за
МВІ Майї Ах Мзі Зек Ні бів др Вго бін узі біп Рпе бух Тер Тут ше за 45
Узі Азов щі ді біб У Ні Ах" Ді фу Те фу Бра АкЕ 1 53у ща 55 ща
Фів Тук да Яви ТВЄ РБе Арно Май Маф бер уаф ей ТР УЖЕ Кец Ні щу та 85 ща
Бій дер Ткр о уви ай біУ 1Уу5 біо Туг бух Су іух Уді Зве доп ув йо за З5
Кіз бео Бко Аза Рбго БТів біб о фує Те Щіе баб бух ТВ? о фух о3у Фів їв 185 ща
Бгто АБи біз Бу Біб уві Туб ТВ гео Беро Бе беє Ав о б3в 35) Ме її5 158 325
Те ух дв бій мві 5ег ів ТвКобСух і) Уві Був БІУ Ре Тук Бго 1338 їз 348
Хае Аво їів Аїз Уві 530 Тер об) беб Хеб біу Бій Бе біз Аза Ав 145 Ка 155 ї68
Ту АБа ТВге о ТВР оБго бго МебЄ беб дзр зег Або Щ1у бек Ра ве їв 1855 57 Ух
Тук бек уз сец ТР М8і Ар о буз зег АгРи ЇРБ бій бів біу дбв Ще 1858 їх аа вив Зег Сух бе маЗ3 Мей Мі 010 Азз ім МНі5 Абп АгРЕ Ра Ве БІВ їз 288 7585
Гух бег без бег ів Заг реко 03іу Хва 38 ї5 «0 в ка1із 337 «їх» БІЛОК «Із Мещо харікне «АЖ «ааїх МКС КЕАТИКЕ «вай» (33,51 «Жа3» Домен СМНЯ-КНЯ прикладу ХибБо людини ха» «82» МЕС КЕАТЦКЕ «ааЖх 73. 5 «ХХ Хазв являє собою лізин (ЕК) або відсутній «4005 4
Аіа Рго Фів Ре ізи БЩ3іу біу Бго баг Уві Ро їбси Ве бро бро Гуз ії 5 їі8 ії5 го уз Ахр їй о іви Меї хів его АРе Те Бго бів Уві ТВг був Уві
Уаї маі Ах мМаі деб? біз біц Або Бго біб Уві бій ВВ АБа Тев Тує ча щк
Ма) йзв 8іу Уві біб Уві Ніз Аз о АЇа Бує ТВР Оу го АгРЕ біз 10 ще 5 ка біп рве дклодег Те Туг агв маї маї Чег Уві їв Те Уді йен Ні 5: Кг 75 ща іп ах; то фен Ах біу Су Бій Тук бує бує їух Уві бек деп Куб
Щі ія) бео беб бав ів біз бу їВе бів бек уз Аза уз Біб 51 1аа їа5 її8
ВгРа АгЕ Зі) вго бій уві Тук ТБК о їви Рг бго бБег бій їв и мех ще 128 УяУ
Те Був дв біл Уві бБег сен Тв бух беи Маі бух БУ рве Тук Рг ща 135 348
ЗМ АБО їів Аіфз Маі бій ТР б); бегб йбБа бі Бій бро бів дев Яви 185 За 155 ї658
Тук бує ТК Ти Рго БгРО Уві Се: Я5о Чек А) біу бек Бне Ра ви
Мао 178 775
Тук бе дер ін Тйг Уві Ар ух Бег агро їго Бій біб біу Аза чаї 188 ї8х т вне Баг Сух бег уві Меї Мі5 бій Аза їеи Нія ЯБи Ні Туг Тк Ів 95 288 285
Суб зас Беу Заг о іжу баг ім бі Хав хй185 5 хгіїф» й «ах БЕЖ «Їх Вучна послідовність «90» «аа» Провіжний спейсерний пептид глінкер 11 «888» 5 5іУ біу Біу чег Бі біу Бім щу 1: 5 «яіВх б «дії 5 «жів БУЛОК «335 Штучна послідовність «ай» «885» Цистеїн-вмісний спейсерний пейтид (Слінкер 23 «вав» Є щі у Сух біу У - х «ау 7 «їх й еАїУ» БІДЖ «МІЯ» штучна послідовність 58385 «2255 Альтернативний спейсерний пептид (лінкер 81 «ах і Оіу фу бер «ма» 8 «хм» 5 «Ях БІЖЖ «245» Штучна послідовність ха» хй25» Альтернативний спейсерний пептид (лінкев 2) «3885 Я ви біу п1у б1у Бек біу ї 5 «йо» 8 «вії і «яїах БІЛОК каї5х Втучня песлідевність «ВІО» «223» Анетернатевний єпейсерний пептид (лінкер 2) «воду З
ФК у У бек БУ Шіу У чек Ту біу бу ї 5 ї8 каїаз 18 «а1їз 5 тез БЕК «За» Штучна послідовність свй «А3» Альтернативний спейсврний пептид (вінкер 5) «885 за
Аїз зек Тк уз 9ІуУ
Ж в: «мах кі» в «аїяз БІЛОК «жі» Вучна послідовність ках «ШИЯ» Альтернативний спейсерний пептид (лінкер 2 заваз зі іва бі бго суб бер бер «ах 2 «жі» 5 «ав БІЛОК «йі3У ВШтучни весла» чех «ЯЗ Алютернатинний снейсерний денптид (лінкев 5)
«бах 35 діа Рго Зег Бек Зег і 5 «іа 13 «Щ3ї» 7 «8іхх5 БІЛОК «2335 Щтучна послідовність х 2 зв ? «293» Домен. що сприяє утворенню гетеродинара «085 піу Уві бід бро фух баг Суб і 5 х2185 18 «211» 5 «21» БІЛОК «2135 Номо зарівнх «ах «алі МІС РЕАТШНЕ «Ва (3.6) «8232 Домен, 8 єприве утворенню гетеродимера шарнірної облаєті Тро людини «чав» 38
Уві бій вге ух беб Сух ї 5 «хівз 15 «531» 8 «235» БІЛОК к815» Нощо зврівна «32Й» «віх МІК РЕАТИВЕ «ааах (ОВ «23: Домем, що сприве утворенню гетеродимера щшарнірної області ЇрО медини «4085 35
Аіїв біб вро бух бат Сух 1 х з «аа» 165 «ах 5 с х813» БІЛОЮ з «иАЗ» МНоще зарієпа «З2В2 «жі МЕ РЕАТОВНЕ
ОО хИййВ 43,5 «283» Домен, що сприяє утворенню гетеродимера легкого ланцюга каппа імуноглобуліну людими з жав» ів
Бім рве Ахп Біу 10 Су 1 5 «аз 17 «ії» 6 «і3з БІЛОК «2135 Мощо «арієпе «ах «291 МІС ББАТИВЕ ках Т..(83 «Вй3» Домен, що сприве утворенню гетвродимера легкого лануюга каппа імуноглобуліну людини «аа» 17
Рве Ах Ага Біу біс Сух ї 5 квійх 38 киїї 8 «8125 БІЛОК «14 йтучна послідовність «ча» «жа» Домен, що сприяє утворенню гетеродимевра Е-соїі1 «ява» 18 біз Маі Аза Аза цец 51) ух біз Мі діа Аза феи біз фух біб Уві і 5 18 15
Аія дія фев бів ух біб маї ів Аїв ів) 039 ух а як с єв а с хЙІх 48 «85» Вік «215» Штучна послідевність «ах «ЯЯЗ» Домен, що сприяє утворенню гетеродинера Каса «аа» 5
Ку Уаї дія дів їжи 15 бій ух Уві їз діа фено іух бін їу5 Уві і 5 18 15 лів Аїз ви бух Пів ух чаї Аіа дів ви Був 1 за 5 «в1й» зо «2511 75 «215» БІЛОК «213» фтучна послідовність «258» «223» Цистеїн-вмісний домен, що сприяє утворенню гетеродимера Е-соїї «ащах га
Зіз Узі АіЗ Аїва Су5 бій фу бі: мазі Аза Аза іви Бі Бук БІ Узі 1 і 18 15
Аза дів цен бі) ух бін уаї Аіїз АЗіз ей бід фу за 25 «2ї18х і «211 58 «ій БЕЛОК «Ж» Штучна послідовність «дах «283» Цистеїн-вмщісний домен, що сприяє утворенню гетеродимера К-соії «аа» і цу маї 8із Аїа Сух ух біз фу: МаЗі АТа Ді ісз фу біб їух Уаї 1 5 18 15
А1а Аів іео ув чіц бує Уаії Аїз Аза цей ув боїв а 85 «хів 83 ха ав хх БЕЛОК «аїїах ЗЕверісессия бузваїастіае «аж «й» ВНІС КЕАТОВЕ «Ж» 43)..45) Й «923» йвьбумін-зв'язуючий домен 3 САВИЗ) Білка б штаму 5бРерсососснВ 0 ЯщаВ «Аа 35 ів ів біб Аів Суб Уїжі іез Аіз бай Аго бій іо Ахр бух Тув Оу х. х 3 15 уві баг дбав Тук Туг мб Ах бен ЇіЇ5 Ар дп А1в фу бве дів щи 78 25 за
Фіу Чаї Куб Аа ім її. йбр 1 516 їз Аїа ЇВ Бе орто ше 5 48 45 «ій 23 «Мі 85 «Жя» БІЛОК «8Ї3» штучна послідовність сЕЯВ» «255» Деїнунізований варівнт вльбумін-за йзуючого домену З САВО3) білка й штаму Зсгевтосоксий 5148 «а» 3
Ки із 530 Аїз вує Уй) іо АЇЗ ба Аве 5)ю ев Азрофує Ту ЩУ їх 5 їв її
Маї баг бер Тув Ту Куз Ах бен Ї3і2 А5р два АЇВ їух Яве дів 53 28 25 за піу уні ух АТа їжи (іє Аво бі ів іє) Ата АЇв бе Бко 45 «3» 8
«її» 6 «ій» ВІЛОК «913» Штучна послідовність «Я» «ЯЖЯ» Деїмунізованнй зарівнт альбумій-зв'язуючого домену 3 (АБОЗ) білка штаму зЗфеертосвста ФВ кава 4 їен аіз бій АВ 1у5 УВІ їви вів Ак АгРЕ ОЇ ія) АВ бух Ту У ї 5 18 15
Уві Чег Або Туг Тугє Кук дбп Аіїв діа Ахва ази діз Бух Тв мі іш 28 55 за сіу Маї фУу5 АіЗ іецз Хіє із біб; їі бе Аів із їв Бго за 85 «Мах 25 «335 45 «Жїа» БІЛОК «5135 Штучна послідовність
ХВО
«ае3х деімунізований ззврівнт звобумін-е язуючого домену З САБОЗ) білка ва втаму ЗжРЕВТОКОССИиХ БІЯВ «дах 95
Кен ліз бін дів бу» Мві іви Аївз вв Ага бів Кен Ар гуз Тут" У ї 5 їв 5
Узі ЗаБ аеро Тук Тук Куб Ат ім іє бЗве д5п АЇЗ фу Зк Мі 30 а 75 За
Зіу Узі суб Аз без Мі Афба пів їі фей Аївз Аза їво Ро 35 За ях ках 26 «В о «їз ВІЛОЖ «аїїх Штучна послідовність «З38 «ажаз Проміжний спейсевний ліневю
«ай» б дав куб Тйе Ні тн" був Ро Ре Сух Рго
Во 5 їв «Іва 2 «іх 15 «вій БІЛОК «аї3» штучна послідовність хх «2335 Проміжний стпейсерний лінкер «даах 27
Бій БРо бух заг о Су5 Або іуз ТВР Ні ТнРОСує бра о Рго Су ВГ ї 5 Ко їх «і» 28 с 5 «812» БІЛОК к13» Виучна поспідовність «ааВх «ЖЯЗе проміжний спейсерний лінкер «аа» 28
Аіасвко Зав бак Яег зах 39 «її 8 «ях БІК «тах щЩууУчна послідовність «ІВ «аа» Праміжний сленксейний лікер «4805 58
Аіз вро бек 5ег бек Рко Меє Бі3з 5 хаїВх За хя1їх ї5 кий БІЛОК хаЇЯ» Штучна послідовність «Зах
«823» Провіжний спейсерний лікер «авйх В ів вів Вго бу баг Аіа бер бух Твге о Ніє Тег Сух РРО вго Сух 31 5 16 15 «ах ж «Бі 3 «ий БШЮК «33» Втучна послідевнУсть «ВХ «ЯХ Проміжний спейсерний діякее кава 3 йіу бі Біу Або їу5 ТВе Мі ТВРОСух вро рго Сух Вега ї 5 ї8 «ї0х 35 о 16 «8125 БІЛОК «хаЗ» Штучна послідовність «иа» «83» Проміжний спейсерний лінкай «ов» 33 іва бі: Рго ух дек Заг Ахр рух ТВе Ні ТВе був рго го Суб рго і 5 10 ї5 «іа» 3 «Ві В «ах БІЛОЮ «3135 НОМ зарівпх хдеВЕ «айїх МЗС КБАТКЕ «Яах ОС «ЙЯ3х Приклад варнірної області ЇВ хавах 33 іш го бух бер Сух Ар був ТВг нів ТВк Су Мго БРО Суб го
Еш 5 їв 15
«аїВ» 34 кВ Ех З «йійУ БІЛОЖ «е3аЗ Нота заржевх «Кай «ЗЛЕ ВІ5Є БЕАТИЩЕ «ий» 3..438) хуй» пПраклад вернірнаї збавсті Крщ? «4ваах З
Зінв Аге Бу бух бух МН Біб Суб ргРо вго Куб Вго 1 - 5 38 «Зі» Зх каїх 3 «ях БІК «215 Мещво завіс: кг» «ай МІ5Є РЕАТОВЕ «кайах 3 «Ящах Приклад шарнірної області ТЕба «дав» 35 бір бек бує Тук бїу Ре бгУ Сух го баг Сук го о 5 їя хаї1йх ЗБ «КІЗ 3 «щі БІЛЖ «8335 штучна вослідзвність : каЯ» «223» берізнт вернірної обвасєті ТЕ, що містить стабілізуючу заміну 5АОВЕ «ах ЗВ 5іц Заг вух ТУР біу Рко рго Суб Рга Рго Сух Вга
З 5 18 крій» 37 киїїх 35 «їй БЕЛОК «із ЦЩучна послідовність
«736У «ЯЯЯ» Проміжний спейсерний пентид о хава» ЗУ
Зі біу ЩіуУ у 5ег бі біш У біу беє біу і бі Біш баг 4 5 ї8 15 - «й» 8 ситі 307 з «а» БІК «ї35 Ново зарієй» «ав «аеіх МІЖ БЕАЧТЕ «Вих гЩ..(173 «кеах Приклад Сі-домену капа Теб людини хайах ЗВ аАгЕ Тег Маі віз Аіз рго Зеб уві рве бів Ре Вбо бро Бвбе д5а ЩІ 1 5 їв ве біп ес бух Заг біу ТБК аіз 5ег Уві Мі Суб сем: іву Ав дп ВВе
Яй З за
Тук Рг АгЕ піц Аза фу Уві 5315 Тїкр Бук Уді Ар о дао Дів їв ЩО шо ХЕ ща аа дев біу Ави ве бій Щіб бег узі Тне біз бів лев бек рух дер Яат ща 5 5
ТнРОТує БР ви Бег бек Те без Тйг оїе) бек у віз дер Ту БІВ
Безе ж 78 ТЕ ва їує Ніх їуз Маї Тук Аів Суз бій мві Тв» Мі бій Біу іо Заг Зак 85 аа як го Узі Те ух бег Ре Аха Арк обі ів сСуз 188 195 каійх ЗВ «гії» Ва «ЖІ» БІЛОК
«і3х Ното зарікп; «хх «Ваїз МІС КЕАТИЙЕ «вай (3)..1384) «83» Приклад Сі-домену лямбда ЇдО людини - хадах З піз Бго їу5 дів Аа Рго заг о Маї Таб оіео Ре рго бго бег Бек 61) її 5 їй 15 ої іви бів дів Ах бух лій Твгоївец Уві Суб фен Ї16 5ег Ар впе 28 5 за
Тут ВБго б5іу Аіз Уа) Твг узі Аза Тер (ух Аза Абро5Зег бек Рго Мазі 35 48 85
Ку Аза бБіу ма1ї бій ТВг о ТВге о Рко бек офу5 бій 5ег Ап Ап бух Тут
Бо
Аіа Аза бег бег оТук рен бек ів) Твг о бге бі) біб ТКр уз бек НІ 85. 7а ТВ що
Ак ойег о Тук беє Сух Бів Уві ТВг Ні 630 біу бег Тиг мМа3і біо Куб 85 за 5
Так Уві Азіа Рро ТВе 1) Сух 5ег 38 «і» яв «ії» 98 «а1йх БІЛОК «533» Нопюі 5арієпь «2503 «3313 МІ5С БЕАТЦВЕ «233» 43..198) сай3» Домен СМ ївбі людини «ра» 48 біз бек Те фу піу Рго бе" Маї Ре Бро ви із Бго беб бек Су 3 5 18 15
Баб ТВе Хег біу біу ТК Азія діз ев 5Біу Сух і УВі бух АЖВ Туг ! 28 25 за ве Бей бій бго мі ТВб о Уа) Заєе Тер одвп бев У АБа бец тТве Зев 35 48 45
Біу чаї Ні5 Те Бне Рго дів Уві іси бів баб Бек Щіу бею Туг Зек ва ів о бег бек уві Уа) Тк Уві Рг бек бег збвгоіви віу Твбовій Тве 5 та 75 ща
Ту Щ16 Сух Аби Уві Аби Ні вух Рго Бек да ТНг фу Маі Ашв Був ва За ща аге Ма кеіяз «їз ЗВ «ах БІК «8155 Мово 5зарієне клав х «У8ї5 МРС КЕАТОВЕ «3325 13..98) «ай» Довен СНУ ї865 людини ещох а дів баг ТВгР обу БІ1у вгоОо бек о уайї Бе Бе фев йіа Бе Сук 5еРК АгЕ і 5 38 15
Веб Тв 5ег бід Бек ТВг о АїЗ Аїа без Б1Уу Суз без Уві Куб йбр тує ! за 25 а
Ре Бго біб Рго узі Твб ові Заг Тгр Ах зем біу діа бе) Те бе
КУ ча 45 іу Уві Ні Таб о бпа Рко дів УВІ їец бій зве Звге біу ев Туг бек 5 55 а
Кіеа бЗем дев уві Узі ТВг о Маї Бго бек бвг Аха Ва бфу ТВ? Обід тТве ва за В а їТуг ТВг Суз Ап Уві Ахв Ні (ух Рго бек Абп ТВк бух Узі Ар ув 85 ща 35
ТнеЕ УВУ «їй» 45 «іх: ЗВ «из БЕЖ «а» Нове зарієпа «аа» «2315 МІ5Є КЕАТуВЕ «ЯЯ» 63..(98) «ййЗ» Домен СНІ їКЧЯ людини хх 42 ді бег їнг?офу5 біу Ро бер узі Бре го ісо Аїз Бо Сух Звг Ага 3 5 за їх заг оїне зегб сіб леб Тиб Аів АЇв сво пі ух ів) Узі бує бр отук що ке 25 35
Бе го бі: Бго Уві їВе Ма) бек ТгРр Аби его біу А1а фео Тве баг : 35 50 5
Зіу Маі ніх ТВе Ре рРко Аза Уаї ев ій бек бег Щіу бец Тує бег за За ЩА цем бег бег уві ув) їбе Маі рго бек дек чего івц ЗІУ ТАБ фу ТВе 7а 75 За
Тук Тис Суз Ази Уві А5р Мі бух го бег Ах ТВР оіух Уві ар ух 85 о 35
АгВ Уві
«ах 43 «иа» У «ія» БІЛОЮ «8131» йтучна послідавність
Ай» «гаї домени СМНО-СНЯ Тнбі, що містять заміни ЯМА її БХЗБА іїза Кабатомі хЯдЯХ «а3їз МІС РЕДТИКЕ «3225 3173..4337)3 «ЖІ» Ха валяк собою лізин СК) або відсутній «ах 43
Аів рго бій Аза їз іу б1у го Беб уаї Ре без Ре Рго РРО Бух ї 5 їв 15
Бго Бу5 й5о) Те Бей Меб 16 бЗаб АРе Те о БРо Біб ММ тТВе Сух Уві «8 25 о уаі Уві Ав Уа! бек Ні бій Абр Рго бій маі уз бе Аза ТР Туг зк 48 45
Маї др бі Уві біб узі Ні йхи Аіа бух Те Бук Вео дев бі Бу е ща бів Ту Аби бе Те Тує дев Уві Узі бер Маї гей ТВР УВІ Гей іє в та 5 ва
Зіп Ахо Тер оіец два б3у Бу5 10 Тук бує Сух фу уві бе Ах ух а за 5
Аіз вен вго Аїз БРо Зв біо ух ве Ї3і6 бек оїух йіз бує Б1У Б 3188 35 315
РРО АР бів бго бів Уві Ту Твгоїеи бро го бер ЯгРЕ бів 5195 Меє
ЩІ Зо ї35
Тнг бух дк Щій Уві бе ву Таб Суб без МАЖ бує біу Ве Ту Бро
В 135 ї48 его вав Хів Аза Мі 63 Тер бін Зес Ака бі ій го Б3ій Ап Ав 145 158 Ух а
ТУР мух Те Те Бо Око Узі сез др бек двр Бі бБег РБе бе се ї65 НИ ТБ
Тук Як у іец Так Уві Азо фух Звг Абд їгр ів бій бу ба чаї іка 185 за рве бег Сух бег уаі Ме ні« бі йіз цец Ні ба Ні Ту Те ІВ 135 ке 5 іїу5 Баг зи бек іви бек го Б1уУ ЖХва зів 215 «105 а «іх 5 «ай БІЛОЮ «213» йтучна послідовність ах» «та3з Домени, що ністать "вистув" СНУ-СМа Те «гав «2215 МІС БЕАТОКЕ «й» ї2і173),.ї2473 «2835 Хаа являє собою лізин (КУ збо відсутній «аа» 44 із Бе біз 8їз Аза Біу іму бге бек Уві ВБе лев Бе Бго ВгОо Су
Х 5 ї8 ї5
Рг Куб Абр Таг обею Меє Се Зеб Або Те Рго біз Узі Твк бух Уві за 25 за тв уві Ако Уві Баг Ні Бім й«в Рго Бі Узі Куб Бе Ябп ТО Туг : жа В 45
Узі АБО У УЛЬ 53 УФ ніх деп дів ух ТВг бух БРО АРв бів Б1Ш за 55 ва
Бі Тут Аки бат Таб Тув дев чаї Узі бас Уаї іви ТБг Мі Сей Ні за 75 ва сів Ахр о їКв гео дяй 01У Бу 53) Тут Суб Су фу Умі 5ег АБИ ув йо ЗВ 55 віз сви Бра діа Рео Ще ЗИ бух ТР Ї3е бек бух Ах ух Бу вул т86 щ5 318
Без Аги пін Бео біз Уві Туг Твг ів) Бко Рг Зев ги бій 51 Меє
ЩЕ КІ 125
ТВе руз аа іп Узі бег ів) ТеРроСу5 кец Уа3 фу Б1у РВе Туг РКО 138 135 148
Хеє Ахв сів дів чі 510 Тео біб; зве дяй біу бій Рко бів ха Ай 145 158 ї55 вт
Тук їу5 Твг Таг о Рего бго Уві гео дер баг" Азробіу ес Ре вве Геї 155 Тв 375
Тут Бог ух фей Те За) Або ух бек дги ТРО Біп о біп біу ази Узі ї8а 185 ТОВ пе ва" Сух Бас Уяі Меї Ні біб Аїз бен Ні Аза Ні Тує ТвК 5)А
Що їх зва 295 ух 5ег бе) 5ер іею заг ро б1у Хав зів 15 «іа» «аїї»х їУ «ЖЯ3й БІЛОК 3» Штучна послідовність «ДО» «883» Домени, що містять» "Ззаладину" СНІ-СНЗ Тв «еще «М ВТС БЕАТОВЕ «айЖ» (5353..433
«833У Хаа явля собою лізин ЇК) ябо відсутній «Ва» 5 дів Бко 15 Аза діз бі 61У Бго бек Уді Ре бе Ре Бо бро Бук ї 5 18 15
Бга куб Аз ТВг ої Меб ї3іе Зве аб Те обра сів Мві Тв осСуз Уві ха 25 за
Ма Маі й5р Уві Зег ніх Зі й5р рРго Біш Уві цуз Ре дей ТР Тут 35 за аз
Уаї ази біз чаї біб Уві Нія дей Аза уз ТВ бух бро Аг Бі 51у 5а 55 а сія Ту бай Хеб Твг оТує Агро оМаі Маі бек Уві ви Тйг о Маі івц Ні 78 75 ка він Або Тер бе д5п біу бух бій Тут губ Сух ух УВ3і бетР Акп уз 85 за З дів Гей о Бго діа го Іі ін гух ТВг ОїЇіє бег о бу5 дів бух Зі бів 188 185 ща
РО АВ Зіц Рго бів Уді Туб Те о іев бро Рг бег Агрв 1 ВЗ. мех 3ї5 зай 125
ТТН» ух Ах бій МВ) Чего ін Зег бух іа Уві фу біу Ве тук Вро 38 їж за зем дер їів 813 Маі бій ТКр бо бег Ах» 51У бів РО 03 Ах Аа зах ї5а8 155 158
Тук Куб Тв ОТве бко Бго У3і мен Ахр Зег Акр СТу бек Ре Ре Ге 165 178 Щ75
Узі заг зу іви Вк Уаі йча фу Заг АРе їво вів бів біу деп чаї ї88 і85 ї5а
Бне ее Суб бек УЩі Ме Ні бів Аїв ім Нів деп АгБи Тук Твк оБІЮ ї55 жав 85 мух ЗВ Ген бек ін бек Бко Біу Хва ів з «іх 45 «Ах ВВ «тій» БІНОК кхі3з Моє зарівах
СІВ
«й» ВІ5С КЕАТуКЕ «28» 413..1Х883 «235 Бб-ї людяни. включаючи сигнальну песлідсвність (послідеовніст» в СВІ ще БО. «ІВ» «281» ЗІОМАЮ «АЖ 33-38 «йМіх Сигнальна послідовність «дав» 9
Неї Бій іє Рко бій Аза Бе ТРо Бо Маф Бі Тез Аза ад фев іп і 5 їв 15
Бен Му гр о Агв бро б31у Тер Ре іев йБо Зег Рго Ар оАРЕ га твор 28 5 за
Аза обго БР їне БВ Заг ВеБо біз ем іез уві уві ТВ ОЩін Біх Ар пи 48 ах ви діа ТВ рве тТйг Сух бХеб Ве баг ха ТВК оба бі бег Ре чаї ха 55 що їви Аха Тр оТує Ага Веї бек обео баг о Авап Біб ТВг одер був Кен Аза
ВЕ: та 75 ва дів вва вка бій Ах Агро зве бів Рго біу біл дбр Сух дед вне Абе що За 55
Уаї тТве Бій бе) Беб Ахп б1у Абе Абе Ре Нія Меї бЗег узі Уа ГЕ за 185 ща
Аіз Аг АгЕ ап Ах бев о біу ТВг Ту бец Суб біу Афа їі Зек ев
АВ 355 дів рго ух Аїв пів ї15 зуб 010 5егоіжи АБИ За біо їм Аг чаї 130 35 їдза
Тве бів Абе Ар дів бів маі Рго Твг Аза ніх Рге бек бго Берг го ї45 158 155 ї45
Ав рго А1ія пі бій бе 5) ТВе гец Уві Уаі щ1у Маї Уві Оу ЩІУ 155 378 375 ім іви 5іу бек іви Маї їви бен узі ТР о Уаї ев Аїа УВІ Ті Сує 188 155 158 ес ги Аїа Аїа аге Б1у Таг о Жіе біу аіз АгЕ Ася Тне біу ій его ї5 зав 285 іви іух бій а5р рга Зеб дів Уві Бго Уві Ре беб? УВІ Або Тує Щу 18 25 ке сів іви Ар оРБе бів Тго Ав обій був Те Рго бі) бро го уві Вго 245 238 235 48
Сух чаї Рго бін бів Тнг обі Ту ія Те ї1е Маї не рго бек ФІу 245 258 ка
Меї З1у ТР обек бак Рго А1з дев Аби Фіу бек дів а5р фу вго РЕ 26 255 Кг
Бер Аїа бій рго їви РЕ Рко біз вав ЗіУу Ні Куб бе? Тро Бго ву
В аа Во «2385 85 «жі 333 «533» БІЛОК «Жах Ново «аріепа хигах ка2іх МІЯЄ ЕЕАТОДЕ сок Еф «аЖ3» Мі-домен вититіяз проти РО-ї людиня РО-ї ВАВ 1 Єміволуюає) «дай» 47
Зі Ма Зі це) чаї БО Бех бі Б1У бі чі і іп о Бго бу век ї 5 ІВ їч баг Бен) АгЕ Бе» зо Сух Гуз Від бек Оіу Сів їВе ре бжг дк Хек 28 Кс ке сОіУ Мах Віз т? Маі БгРа біб із Рго 03у суб пі» бе бів Те Уві 35 а 5
Акта чаї Кі ТР Ту: дер Біу Бог Бух Акя Туб Туг А1З Яр Заг Уві
Бе ім щу АБВ БВ о їВе Хі бже Аве Ар Ал бве о фух дяб Тс бе вне
Вк та тк Ва
Бе бій Мет й5п Заб фе Аг Аїа Біб Абе о їВе Аза Мі Ту ТУР Су 85 8 95
Аіз Тег Ах» дер Ахв о Тук Тр обту ій БІУ ТОК ів маії ТК узі Заг 90 за ща
Зак каійз 4 «а 387 «2425 БІЛОК каії» Ножо харієве «ВУ «33їх МІЩС ЕЕАТЦВЕ «аа 4... 087) «аа3х мі»домен аититіяз проти БОеї людини РО тав і єміволичаої «за» ав бів Се Мі Би тТвб бів бек рго Азія ТНБ оіец беб їв Бек Бе фу
ЕЗЕ 5 за ї5 ій АРЕ Аза Тйг без ба Суб Аве Аза бев ія баг оаї беб Зав Туг а їх за іви вів гро Туб бів бів бух Рго Біт бій Аза Рго АРД бе іво Те
Зя 48 45
Туб АБр Аза бек Аа Аге АВ ТВе о боіу Ті рко Аа Аг Ре зег щу 5а 55 ща себ сбіу бе б3іу ТБ Аве бе ївеоіев ТВ Кі бек баб бе 51 га
БЕ 78 75 ва
Бі: й5о Ре Аза УВІ Туг Тур буз бій бір бек 5ег АБ Тр РКО Аг 55 98 Зк
Тве Вне біу Біз Збу ТВе іує мМаї бів ще ук 188 15 «Ох 45 «ВІ» За «ий БІЯОК «835» Штучна послідовність «аа» «ЗІЗ» Мр-довен гуманіжуваного зититіла проти РОЇ людини РЕЯ дб У іпамброолізумаві «вах 8 щі» маі біб їн маі біп беб Бі УЗ бій Маї бух бує Рко біу їз і 5 їа ї5
Зег чаї ух Уві бек Сух їуз Ада Бас біу Туг ТВР о БнНе ТВгБ о Аха Тут 28 25 за
Ту" Меб Ту Тгв Уві Аги бів Аза Рго Оіу Бій бі їв біб ТО Меє за Бе щіу віч Гів Ах ко бе Дхп б1у 01іу ТВгБ Або вне дб б бук вна ча 55 Ба
Кух Аби Аг Уві ТВ оби Те Тве Ах о беб бан ТВРОТВе ТК Аз Тує
55 та 75 за
Меж біз ке) ім 5еБ ін біб бле ар Ахи ТВК о Аїв Маф їУук Туб Суз за 35 віз ак йгв Ах Тук ги Ре або Мет піу Ре Або Туг ТР; обіу бій за і85 о сі Те Те уві Те узі баг За : 115 138 «ій 58 «І» ЗВ «812» БІЛОК «213 Штучна послідовність «АВ» «235» Мі«денен гуманізованого знтитійа проти РО-3і пюдини РОЇ АВ 5
Сповбролізумай «аа» 58 13 Гі Узі їви ТБ сія Зеб Бго від ТР їси бек бец баб Ргао щу ї 5 ів ї5 біз аг АіЗ ТР о іБи Хес Суб зги із бег ух біу Уві баб їве бек 28 Ка за
СТУ Туг зве Тук ве Міх Тер Туг бів бів уз БгРо бі бій Аза ро 5 за 45
АгЕ іс іви 1 Туг їви дів беб Тук ї2и біб чег БІу Уві Бге Аза а 55 Ба
АГЕ Бе бег біу бек п1у Зек біу Твг а5р Рне Тнгоїец Те Хів бе 5 та 75 що
Баг їви Бій Бео бін др Ре йіа УЗ Туг Ту бу5 Біб Міх бек кр 5 за 5
Ахроїен го беи Те о вбе біу піу 6іУ Таб оБух Уві бів ів ув їй О5 133
«вій» 51 «ай» БЕЛОК «15» Мих тезсцінце «ах «82із МІС РЕАТШКЕ «ах С НАМ «3835 УН-ДдОоМен мищачегсо антитіла проти РО-Я людини РО-3 ЖАВ З
ТЕНІЗ. ЗНО) «аа 51 іп уві бів ес бів ів бе бі віз бій їв дія буз Рео 1їу діа 1 5 та ї5 зве Уві бі Меб бег оСує ух А1а бе біу Тут его Бйе ТвР бек баг за 25 38
Тер Ті Міз тво Узі ух іл о АевВ о Вго і бів Бі» без яЯ31й тт Ме
І 35 48 5 піу Тут Зіе Туг го бек ТВРОбіу Ра ТвР ОбіВ Тут йшли ої бує РЕ ща 55 а іу5 АВ МКух Аза Їйг оси їй Аїз Абр обу беб бев бег ТК Аза Туг ще КЗ 75 ща
Меє бій Без бег бевР обец ЇВР бек ім Ар бек Азїз Маї Туб Тук Сух ях за ЗЕ
Аїз Аги їга АК Або Зег обев Шіу Тув Ні Аза Ме дво Тук Тео Біу тав ї85 ще іп у т озег Уві Те Уві бек ее 128 кіз 55 «23» «йійх БЕЛШК «213» Му5 виБси308
Ех «Яїз ВІ КЕАТКЕ «да Г.С «йи3» УНе-домеМм мишщачего вититіла вроти Кб-ї людини ВОЗ тав З
СЕНТ З. ЗНУ «каайх 39
АБ Ще Узі бе Те Щіб бег бго дів бвг о бей Твг Уа бек бе У ї 5 ко 45 бій АгЕ о Аія Таб о їЇзе Хваб бух аг йівз бек бій бЗеб Маі его оїве бе за 35 за
Зіу Тук ЯБе Тук Мей Ніх Тео Тук бій бій ух рРге Біу бів Бко рге їх а Зх мб Би фез 16 бух БВе п3у беб Аа іву біз зас 8іу їі вро діз а ща 5
Агд рВе бек біу бек б1іу бе? піу Тиг Ар Вйв ТВ вви йбап Кі Ні
БЕ. та 7 о
Бра маї б5и 515 бів А5в Те Аза тве Туб Туб Сух бів Ні бек Тер в5 за а5 офі Щі6 Бге тує Тве Рве бі біу бі Тв офує ви Біб її Бух за5 за5 318 «818» 3 «і МУ «ій» БЛОК «2і3х йтучна послідовність каах «а2ї» УН-дюЮМен гуманізовзного знтетіла проти РО» людини БОЇ МАЮ Я івідвлізумав) «48005 55 ів УВІ бів іви УВІ біб хебоіу бег бін ів бує вух го бу ів їх З 10 15 хаб маї Був (18 бек Сук бух Аїз За 01у Тук Тйг Вів ТР Ах Туг а а 38 біу Меє дши Те Уві Ра бів Аїа го біу Бій 03іу бе) бій Тер мех о Зо 45 біу їв Кі Ап ТВг йхр бев біу бій беб Те о Тук дів бів 615 ВКе ща 55 а уз біу АгЕ Бе УВІ Бе Зег о іви йхв Тнге Зеє Уві Ажп ТР ОАІВ Тут ща та 75 ща
Кви Ав Ме Те бек без Тк Аза ж Ар ТБ Об1уУ Меї Тув Ре Суб
ЗВ 5
УВУ Агв УВА біу Тук Азр Аза Кеа Аза Туб Тго ШУ Бій 01уУ Твеб Кви зай їх кЖе
Узі тТагРоУаі бе Зек 115 «Жах 56 «із ї05 илях БІЛОК «813» штучна послідовність каз» 22235 УН-ДдОоМмен гумавнізованого знтитіла зротив РО-ії людизи РО-ї паб Я
Й спіднлізумай) «аааз ка 5: Тіє Узі цец їйк бів бег Бго бегх беР ен Зеєг діа бЗег УВІ біу ї 5 ї8 15 дар агЕ Уві Те ів Те Сух Заг дів Абе зве Зав Узі баб Тук Ме за 5 за
Ні те Ре бів біз бух Вго біу вуз йіа Рго Був це ТРо ї1е Туг ав 45
АРВ ТАК 5ег й ес Аїда баг біу чаї ВгРо баг аРЕ Бе баг іу Заг ше 55 ва пі зве біу ТБ баг Тук Суб фер Те Те йжа беб ви бів Рго 3 в. та 75 ха
Ар оРВе Аза Те Туг Туг Сує біз бій АРв беб бек Ве Ре бец Таг 85 за Ох ва пі бі 5іуУ Тек фу бец біб її Був 18 85 «а» я «ЖІ каїну КЕДОК «Аї3» йтучна послідовність «238» «да3» Ун-домен гуманізованого знтитіла проти Рі людини СРО де і «9880йх 35 біз Уаі Іо ізо Узі біб беб пі 1уУ бі їжу Уа) бів бго біу зу ї х їв 15
Зег ви АБО фо 5вг Суб Аі8 Аза бек біу РнНе УВІ РБе баг зав РАВ ча 5 ЗВ піу Меї міх Тер мві Ага бів дів вро бім бу БІіУ ів Зі тре Уві 35 аа ак
Аза тук 31с бок бег біу Хек Меї Чек І18 бег Ту? Аза дер Тіг Уві лк вк що
Кух бі Ага РН Твб бів Зеб АРЕ Аще Ах АЇЗ фу Аа ТВ Бе Ту? в 7а 75 ва їви бів Меє Ах» Заг сер АгЕ Так бів Ахе Те АЇВ ко Тук Тук Суз 85 за ах діз заг іви бег Ах) Туєб Ве Арі ТУг ТР обБіу бів Б1у Те тве Уві 188 395 а
ТвВе Уві Зак Хег
«-Зів» 55 кЖіЯз 35 «83їй» КЕЛОК «ві3» Втучна послідовність «Ящь каЖі» й едовен гуманізованого внтитіяв ппети РО»3 людини 8055 Ай «ах 55 йзво Уві Ууаї Меб їнг бій бек Рга фе) бог ви Рго Уві ТВг ів ЩІ ї к їв 15 ціп йго й)з бек іє зе Сук АгЕ бек вег Бін зЗек іви Уві ніє 5ег
КІ 25 Зв
ТВе о біу аза ТВб оТує бен Ні Тер оТук вв Зій Суб бро щіу бів бег за 45
Бго біл я їво їі Тук ГЕ Узі Зак ап АбЕ Ре бек і1у Уа) ко ща 55 Ба
АБИ йгЕ РКе бег біу зе біу бег 61у ТВе Ар Рне їбБг ген рух Ті в те 75 ва ее Аге узі бій дів бій Ахр маї біу УЩі Туг Туг Суб бек 30 Те я зе 55
ТР Ні Узі рРго Їбр о Тве рКе Щі; бів бБу ТБ був ми БО ЖК16 бух з ї105 6 «18 5У кіз хйійз БІЛОК «аї3» Штучна послідовність «Жах «да» УН-домен гуманізованого антитіла проти БОЇ людини «РОЗ ва в) «228 «иаїв ВІ РЕАТЦВЕ «дай» анІ.. 48) «аа Хва явлва себею ізолейцин (1) збо зланін 14)
«490» 37
Зів Уві 51 Мей уві бій бег біу Дія біз Маії (ух ух Рго бі дів 3 5 18 15
Зег Маї уз Узі баг бух Кух ліва Бек Біу Тук зЗвк рРНе Те бек Туг й 15 За
Тев Мет Ап То Уві Агро бів Аіз Рго піу бів біу беи біб Трр Хва 35 за зх біу маї Ї15 Ні Рго бег о Ахор о бає біб ТВРоїго іео Аза дій ух ВНа а ХУ ща іу« Ар Ав УВІ Те ожіє ТВг Узі Абр о фух бег Те Заг Тве Аїа Тук 55 та 75 ха
Мат бій; їец бег баг о іви древо дев о біц А5р їв: о Азїа Маі тує Туг Кув за з5
Аі8 Ан біб нія Тув Біу Те бак рго Рре Аїа Ту Тео біу бів біу жа 1985 ца
ТвВг фев Узі ТВК" Уді бег 5ег м саійх 5 хі ЗМ к2іїзх БІК «2115 Штучна послідовність «528» «223» Мі-домен гуманівовнаного зититіла проти РО-3 людини (КО-ї тА 6) «зах «В3іх МЗС БЕАТЦВЕ «иа» (365)..12655 к223» Хаз являє собою зспаврагін (М) або сернн (53 «Тай «Ж3ї» ВІБС БЕАТНВЕ «243» (583,.,58) «ЖИ3» Хва являє собою глутамів (3) 8бо зргімін (8)
кава» 58 біз ів Маї (ви ТвЄ бій бЗев бе дія Тве огви Звг об» зве ро 0іу ї а їй 15 510 Агв Аза ТВгоївин бек бух АгЕ Аза Хаа бів бег уаії Абр Аа Туг а 45 за 5іу Меї бег Рие Меї Ах Тгр о РВе бБіп бій уз Рго 0іу бій Рго Рго 35 за 25 ух Мен ієм Ге Ні АЇз Аїа бегб Аби Ха 5іу бек Біу Мі Бро Заг а 55 ба агв вне баг: біу бек 515 бег Біу Твг Ар бе Тег о бец ТВг о їів За
З 75 НІ.
Бер бен біб Ро Фі й Ве Азїа Ма Ту Яме Суз бів сіб бек їу5 ве 98 ах
ЗМ ма) ра їуг тТнг вне піу піу 6іу Тиг бух ма)ї БІШ 1 Ку їо8 195 КК «вій» З «2іїз 3198 «232з КТЛОК «313» Дтучна послідовність кеВ» «2835 УН-доменм гумзнізованого антитіла проти Рі людини (РБ-ї тА і «228У «33125 МІС КЕАТУВЕ «2233 (123..113) «223» Хаа являє собою вадін (У) або зламів (А) «205 кі» МЕС РЕАТИВЕ «2325 (353..(35)3 а2їх Хва являє собою серин (5) або гліцмв (53 «ЖАВ» «231» МІЗС ЕЕАТОНЕ «йдяз АВ)..148У «ЯХУ» Ха авляє собою валін (М) збо треонін СТ)
кайіх МІ КЕБАТНЕ «243 ВБР. ВБ «83» Хаа являє собою лейцин (1) або аламін їду «аа» 59
Зів уві бій ієц Уді Бі бег Бім Бі біу ен Хза йкв Рго біу у 3 5 38 15
Зеб'ієм ух іви его бує дід дів бек Б1у Рів ТВг о БНе баг бегБ Тук 28 КЗ за ій Уві Хаз їгр мазі АгЕ бій Аза ро Ф1у уз Б3уУ їец бів їго Хаз 35 48 За
Атїа Тег ї16 бег біу Б1У біуУу Бім Ап Те Тує Тує его дер Заг Уді 5 пе мук ЩУ АгЕ Ре Твгожхіє 5ег АгЕ Аер Ап АЇВ уз Ажий Яви во Тук 7а 75 ще
Кем'є)ів МУ Абе беє Хав Абе діа бін Азр Тк Аїа Те тує Тут бух 85 ча 5
Аіа Аке Туг Біу РН Ав 51 А1а Тер оРве Аза Тує Тгробіу бів ЩІ1у їв 155 я
ТиР фан Уві Тр оМаії бек бег 335 «їй» ва «її» 187 «жах ВЕЛОК «лій Штучна послідовність каву «23» Уф-домен гуманізованого знтитіла проти РО-ї людини (РЙ-З дев У) ка» «іх МЕ5С БЕАТІЖЕ сйзйх 3.4 «2432 Хаз авАає собою серим (5) збо зспарагін (М)
«825» ВТ КЕАТуКЕ «аж (585..158) «233» Хзва явдяє собою зспарагін (М) або зслартат (03 «ай 60
Аза їіїз бі Меї Те бій бе Вго Зве Зве о їво ЗегоАїа бег уаї Б1у її З НК 15
Або ага уві Те Бів Те Суб Абв Ада беб 53О Аа ів Тук Хза Ту : 28 а за їви дія ТероТук 518 БІЙ Вуз Рго 81у уз 41а Рго фуя Кен о кей тів 35 а 5
Туе Хва Аїа бує ЇВг осей дід йіх біу Ма) бро бек АбРЕ Ре бе біу ща ЗЕ о 5ак'б1іу зЗег Піу Тйг Ахр Ре Таб бен) Таб Кіе бег оБег рей бій рго в за 75 во біс авр вве Аїва ТВе Тук Тує Суб біп Ні Ні туг дія Уві ву Тер за 25
Твиб Рве йіу біп бу їТйб вух мез біб Хе бух чав 195 «2їйз Бі «їз МІ хЗі22: ВІЛ «813» штучна послідовність «ВУ «223» МНА-домен гуманізованого антитіла проти РОЇ людини (Б0О-3 маАВ 8) «асо: Ві
Бій маї бів Кез Уві бін бенк «1у біу бім бен Уаі дк рго іу біх 1 Бу іа 15
Зег без Аг Гец бек Суб Аїа Аза дес сіу Ре ТВе Ре бег ее Тує 28 275 за іви Тів баб Тео Узі Агв бів Аза Рго біу уз Біб ев 530 тра; Уві зо 45
Аза дів Хі Зег бі 0іу Б1У Аза Ар ТАК о Тук Ту Аза бр баг Маї 5В 55 «В іуб5 5іу ге Ре Тв? Гі бе" Ав о аАхр о дки Аїз ух Або бек ву Туг 5. та 75 8 во 5іа мех дп бає феб АвЕ Аза бів Ав Твг о Афа ТВРоТук Тук Сух 85 за 35 ів Ав АгРЕ БІіУ ТК Ту Айа Меї АброТук Тгр о бІу Бі 0іу не вес 198 їв ще
Узі Тнг мві бег баг «ів 5 «із 369 «32: БІЛОК «кжіЗ» Штучна песлідовність «вай кааЯ» «домен гуманізованого внититіла проти РО-Я людини (РО-і де Я) «вва» ва
Ар їі бій Меї ТР опів зве БгРо бек бек іо бек дів зЗег угі біу 1 х ї8 15 дер Авк Уаі Те бів Твг оСує Агро діЗ бек бін доба ї16 Туг Ах отТув за Ко За ке: Аїа тТгРОо Туг бів 5)в їу5 го 1у ух Азіа вга фу во Бец Щ1в 35 48 85
Тук Ажи діз ух ТНг о іец Аїз із біу Уві Рго бек дРЕ Би Хет Б1У ше: 55 Ба
Зебг біу бег 0іу Тиге Або Ре ТР обец їн бів бек обег іви бів го 5. 78 75 яв
Фі йзи Ре дів Тве Тує Тує Суз Біб ніх Мі Ту йїз Уві РРО їгр й ЗВ з5 тТве вве біу бів бі» ТВ бух фев 5Зій Бі ух ї8о З85 «538» 83 «вії: 45 «вія БІОЖ «313У йтучна послідовність «Й» «Іа» Перший або третій поліпейтийні ланцюги РОТ х АБЗ АВТ А «ах в
Ар їі бів Меї Те бів бегб Бго беє баб бе) Зеєв йіз бБег уві У ї 5 їв ї5
А«о бгв уаі ТвБ оЗів ТВе бує АРрв Аіз бек бій Ахр Уві бек Заг УВУ 28 5 За
УВІ із ТР о Тук бів бій гує вБгРо О1у уз дій БО ух іей овен 18 ай 435
Туг Зег АЇв Бек Туг ага Тус ТНе сту Маї ко бБеб агЕ Бе хе щу ши 55 Ба
Баг Біб баб біу Твб Ав бив Твг ів ТВге обі бегб бегб їв бій ВКо 78 я ща піз Ав Ве дід їВе тую Тут Сух Вів бій Нія Ту бек Те о рко Тер 85 ва Зк їве рве 31К бі 03Уу Те бух ен біз Ме вух 01» Б1У ФЩІу Зег ву зов 355 щмя пу Щі піу віп уаі пів сез уві бів 5еб біУ Аза бій Маі уз Був ща 128 125
Бго іу дів бек Уві їуз Узі бег Сух Сук Афа бег бБіу Туг бек Бае
338 Хх35 ща
ТВрРовав Тур їБр Мей дви ТРб Уві агро бій Афа Рго Б3у іп оту цей 145 ї58 їщ ї58 бін їв бе бі Маї Хі Щі бе баг оабр Хеб бій ТВг оТгр без Або : 155 в 175 ів іх Ве рух Ар оаАвя Уі Тег іє ТВБ УВІ Др бух 5еЕ ТВге Берг ї88 і85 ї38
ТвВе дів ТУує МеЖ біб фей баб беб би АБд оЗев біб АБр о Тве дів Мві 355 аа 205
Туг Тує Сух Дів Аг Бій Ні5 Тут 1у Те бек Рго Рв із Туг Тер 218 215 238
Зіу біп Фіу ТИГР іс Уві Тне ча) Заг бек БІ» Біу Су біУу щу ТУ 225 23 235 2488 сіб мі із Азія Сує 1 Ббух біз ма) йТа Азія їео а Бу 630 Мі 245 258 255 дів Аза бен бін бух Бій У Ат діа ви 01 бух 10 Беб бух Тук
Бо 255 273
Оу Бго Рго Суб Бго Бра Суб Рео Аїз Ргро бід Ре ів) 01іУ щу Вго 275 га 785
Бев Маі Ре ів Ре Бгто Рез Гуз рго бує АзроТвг озбец Ту Фів ТБ
За 535 БК
Ав і вго біз Ма ТВгобух Уві уві Узі Абе Уаі бБег бів Бін Ах зо З15 за
Рго бін Уаі бїій Бе два Тео Тут Уві Ар біу уві бій чаї Ні Ап
Зах за 335
Аїз Куб Тве ух Рго йгв бБіч 01) Бій Ре би бек Тйг Ту Ага чаї
Бе 345 з5а маі Зак маії бец Тйг о Маї бео Ні біз АБ ТБроіец ббп біу бух бід 355 з65а 85
Тук їуз Суз цуз Уаї бег АБ5п о іуз біу їв Рго баг 5ег Бе біц Гуя 3978 375 зва
Тве Іїе бег цуб Аїа суб 01у біп Рго АгЕ бі) вго біп Уві Тут ТНе 385 зай 95 ва іку Рго Рко Зег бій бі» бі) мес Тйб уз Або бів Маї бер зіву ТА зах 418 415
Су їец маі Суз 01у не Тук Рго 5ег Ар 112 Аїз мазі бів Те оц дав 425 аза его дай бі Бі го бів АБО АБа Туб бує ТВРОТВе обро вго Маі Бей 835 їзда 345
АзробЗег о д5р о біу баг Бра Ре іеч Туб бег Абд івец тТве Уа) Абр о Бух ак 455 зба его АгЕ То піп бів» бім Аєп Уві РЕ Хег Сух 5Звеи Ууаї Меж Ні бій 465 379 475 зва
М їжи Ні Абп Ні Тує Тег бів рух бек іви бег іву Заг їв біу 485 за 435 «іа» ай «вії» 571 «ій» БІЛОК «2А3У Штучна послідовність кла «383» Другиб зба четавртий поліпептидні ланцюги РИ-1 х 1-3 АВТ й «аа» Ба із ї3є маз цем Те бій бегорко Аїа ТБ обез чего оїец бег Рко біу 1 М 19 ії15 сім Агд їв ТагРобе) бек Су Агв Аз беб о біц бек Уа) АБройва тує
28 5 за піу Меї чего вне Мей Абе Тер о Бпе біл біп ух Рго біу віп Рго Бга за 45 їух івц іво ї1е Ні5 Аза лів бег й5а бів біу 5ег біу Мі бро Зег що 55 ща
Агро Ре бек біу бе» піу чего біу Тйе дер бе Те фей Тве Ї3ів Зег 78 75 ва
Бек іен біц Рго пір Аз Рне Аза Маії Туг Ре Суб біп бін Зб |у ях па 95 бів Уві Бго Тук ТБ Ре біу йіу біу Тігб губ Улі біб» Ті Куб 5іу 188 185 о сіу біу бег біу бБіу 5іу б8іу іп Узі біп бец Уаі біп 5ег Фіу Аїа 115 158 55 сів уаї уз бу БгОо біу Аїа Зег Уві Гуз Мі бер Су іу5 Аза Явг і38 155 148 біу Тук Твг Ре Тне дхр Туг Або Мех Ахр Тер омМаі АБд бів Аїва бго 143 їв 155 1658 біу бій б3іу їец 010 Ткр Меї біу йзр Ті Аба Рго Ахр о Аєп біу Уа1 165 178 ї75
Твб о фів Тує Абп бів Куб Ре біб біу Абд уаї ТАК о Мес Тве Тве Абр 186 155 ї1за
Тве Заг ТвВгобеє Твгб Аза Тук Меє біб іо Агя бек обам Абе Зег Ар 195 288 785
Азв тн Аза Маі Тує тТук був Аза Абе 61» Аза Ар Туг ВБе Туг вла ів 215 38
Ар о Тукє гр обіу бів сіу Те Тв? о без ТВг? Узі ев зве 6ї1у Біу Сув 235 230 235 248 щі б1у Б3У ух Уа Аза АТ Кує ух Бій Кух МЕ АТе Атіа ва Кух 245 -5а ха 5із їух чаї дів діа їси уз біз їух уві діз Віз Без ув 535 я 255 за «-83ах 65 «кеії» У «їй БІЛОК «ЯМЯ» цє тважеиіх «дах «231» МЕС РЕАТВЕ «ах 5...) «ЖЯ3» ЖНдонаен таб 4545 ай «зах Б
Он Уві Куб ви Ар бів ТР ОБіу щі 53Уу іви Узі ій рго щу АгЕ ї х КУ 15 бго Мет фуб бен Зек сСув ма1ї Аза бег біу Ре ТВ Бала Зее дер Тусє
Я 5 за
Тер меж Або їкр Уві ев бій Зек вго 61) Муз Фу Бео 0ІЮ Тер ма ще 35 за як
Аїз вів ї16 дке АБ бух РКО Тур Ав Ту бі) ТВР о Тує Тур ча? Ар
Ба зв Уві Сук Біу дгЕ РК ТВР тів ве де Ар Ах Бек бує баг бек
Уві Ту іео біб Меє дян Абй їеб Ага уві бій ахр Ме біу ї18 тує де за Зк
Туг бух ТВР о біу зак Туг Ту 0іу МЕЖ Ар Тук Тр о бщіу бій піу ТВР 108 385 ще зве Маї ТвгР Уві бек бек 435 ків» б каві» З «ах БІЛОК «ВІЗ» Му вюбеніне «Йов х «31 МІ5С БЕЕАТНАЕ «вай Ср. «03» МрАДОМеН ЖАВ Я В хай» 5
Ахв уві ві Мебє твРобій їйгк о Бео ВБНБ беб ігр рко Ущі бек ви ЩІУ ї 5 18 їх
Ах Бій дів бег тів бек Сує АгБ Зег бег бів бек ія) Маї Ні 5ег за Ка їв
Ав піу Аби Те оТув ія беБ ЗгвоТує ву Б3б бух Рго біу бів баг 88 45
Рго уз Ущі во Ї1« Туг ух Маї бек йхп АгЕ рве Зег піу уві бго 5В 5 ща
АхВ'АгЕ Бне ває Оіу его біу зЗек п3іу Те дв Бве ТВг ом бух 18 а та 75 ва
Бек аг УЗІі бів із біс Ар івиу біу Маі Тук Бе Сух бек щію ек 85 за З5
ТР ні мі Рго Тео їйеб рве Б1іу щу 61У ТББ оку се 1) Ще Ку 188 їх ща «13» БІ «а» 53 хи» БІЛИК 813» Штучна послідовність аа еТВї» Перший поліпентидний ланцюг Універсальної біспецибічної здапторної мовекуви
ПВА
«ЯЗ 57 дероуві маі Меї Тне Бій ТВе бро БВе Зве фе) ко Уді Зк фев бі 1 й їй 135
Ав іп Аіз бег (3іе баб Суб АРЕ бек Зб бій Зег іви Ууаї Ні бек і жа зх за
Ав а1у бан Те о Тує ви АгРе Та Тук Гео Бі ух ро Ку віп бек ча 45
Бгосфух уві ів Щі Ту" фу Маі Заг Ав АгЕ Ве Ба" БіУу Мі Вго 5а зе Ба
Яр Аге Бе бег 0іу баг йіу Заг біж ТВг одяр Вве Тв це) вух Хів та 75 да
Звк-йгЕ Маі 61) А1в біз Ахи ер Пі Уві Тує ВЕ Суб бер Вій Зв
Те ніх Маі Бго Тео Тве ВБе іму біу Б3іу Твг о вує іви Бій їз6 Бує 195 185 а бі Бі Біу бер піч біу Шіу біж 5ій Узі бів ісв Маї бів зве Щ3У 315 128 325 ді біо мві Куб іух РО б1у дія бе УЖі фує УВІ бе Сух їуз АЇЗ 338 ї35 їй
За О1у Тут бег БВ Твг бек Ту» Тгр Ме дл їБо УВА дв Бі Аа 145 155 55 159 га щу пів щ3у їз Бій Тер їів 53у Уві Їіе Ніх Ро бер др баг 155 Тв 175 біц Те оїгроїву Ахв біб їує Бй5 їуб5 Ахе древо Маі ТВг Хі те узі зва ї85 іа
АВ бух Берг ТВг оба" Тйгб оАїа Тук Меї бій фен бер беб ви йгд За 195 зва 285
Зій Ар їВг лід Узі Туг Тус Сух дів Аге обі НІ5 Тут 0Іу Тиг зег 218 25 228
Рго Ве діа Ту Тер о йбіу біп бі Таб без мМаї Тиб Уаї беб заг Б1У 225 238 235 2748 біу Суз біу біу 5іу біз Маії Аїа Аів без біц Кух біз маії Аза Аза 285 258 255 іеч бів їуз бід Уві Аід Аа іви біз їу5 біб Уаї Аїа Аїфзв бай 03у 258 255 278 ух «-й1а» 68 «2115 578 «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність «ах «ЗИЯЗ» Допугий поліпептидний ланцюг універсальної біспецифічної здапторної. молавкули
ІВА-3 «яйа» 58 і) Те уаії сви Тиге о бівз баб РКО Аза Тс обо бег зви бег бко Б1у ї 5 їо 15
Зіц Ага Аіїа ТВгоієн беє Су5 Ага Аза бебг біб бег Уві Ахр о АБА Туг 28 25 за піу Меї бак Рпе Меї Ап Тер Бе бів біп уз Рго 5іу віп Бго Рко за 45 іїув'їез мезо ї1іе ніх АЇа АЇа Зег Ах» бій 0і1у бег біу маї Рко баг сотка 55 56
Ага ре Зег біу бег біу бег біу Те АБр Ре ТВгоїви Торг Тів 5ег
Б 78 ув ва
Бех іецу біз Рго біб Ар Бпе діа Узі Тує Ре Сух віп бій заг бух ях за 95 сіб Ма) Ро Туг Тне бве Біу біу 51Уу ТВгофух Уаі біз їїе бух біу їв 185 118 сіу віу Щ1У Якг бі біу біу біу ази Уві ух фей Ар обі Твнг о біу і 315 18 ї25
Зіу біу ев узі біл Рго 0)У Агро Бго Меї ук ви Зег Сух Узі Аза 3 135 148
Зег б1у Ре Те Ре яке АкроТугє Тер оМеї АБа Тер омаї др бій щеб 145 ЗУ 155 168
Бго бій бух біу їжи Зі)» Тгромаї дів бів жів АгРЕ й фух го Тук 165 1708 175
АхвпоТув щі Тйе о Туб Тут 5ег АброЗег уаї фу5 Біу Асд Бе Твг Х1е і88 1855 136
Зак Аг Ах одхр о бег їіує его бвге Уаі Ту сецз бій Меї Ах Ав Сеи 195 288 295
АгЕ Уві бід дер Мет 031уУ 16 Тук Тут Сух ТР ОБУ бе Тує Ту" 65іу
Меб Ав оїує Тер обіу 51в б3уУ Таб о бег Маі ТВ Маії Зег зе О1у біу в: 238 235 зАв сСує Біу Б1у 01у їу5 УМаі ліз Аїд іец кує бів їуз маї діа Аїа во 245 258 255
Туз Ш3и фух маі Аїа Аза ви ух біс гфує УЩі Аза дія фей ух 10 2658 255 276 «кій» 59 «ЖІ 55 «Жах БІДОК «313 Штучна послідовність
«аа» хай3» Цереий та тодетій поліпентидні ланцюги універсальної Біспецивічмої здапторної молекули . ПВА «408» 58 дев УТ Уві Меї Твг бів Того БРго Ва Зег Кен бго маї бек без у ї Кк їй 15
Азр.бійп Аїз Зег її5 бег Сух дгРя его бек бій бек іви Узі Ні5 5ег : 20 25 за
Ап біу дей Те о Тук і) Абв Тер Тубк о сво бів уз Рго біу бів Зег 48 45
Рго бух Маї іжи Щіе Тук су« Маі бег д5п Агд Ве бег біу маі рго
Бо За 5
Ахр'АРЕ Ре бег біу бЗег біу бек б3іу Тег Дяр Впе Те бен ім5 Т1в в 78 75 ва
ЗексАги Узі бі» Аз бій Ар оіву б3іу Маї Тук Рме Суб бее бів Зег 85 8 КІ
Те міх Маі Бго Тер Таб о вВе біу БіУ біу ТВг губ ев біб бів Гуз зо 1855 318 а1у біу б5іу бег біу бі біу біу Бій ма) Бій йен Ма) бів бег біу 1ї15 138 135
Аіїз біз Узі іу5 уз Рез 01у Діз бек Уві іу5 Уві бег Сує Кух дів аза 135 140
Заг біу Тут бак Ра Тв обве Тує Тер о Меї Аза Тероуаі Агв бів Аїа 145 150 155 і65а
Вез біу Біп біу цво біо Тгр Її З1у Ма3ї 18 Ні Рко баб АБр о щеб з85 170 175 бій тТвг о Тер оївев Ар обі ух ВБе бух Ар оАгв Майї Твг о ї1в ТНг Узі 188 185 158
Ах Куз бег ївг Зег о ЇїВе із Те МОЖ Зрб іву бек Бак їв йгд Зак їх ве ях біс аб Те Аз Уві Тує Тук Суб із дев Бі Ні Тек біу Тве бек
Бге Бве віз Тук Тв Бі Бін бі Же фев УВІ Тек жа бек бек щу
АВ ав КК жа щіУу Су щу біж Біу Щі» УВІ віз біз бен пів уз Бі УІ дів 83 зах КО аЖЕ ів Біч бух Сі жі віз віз во б фуз бію УЮ йів й3іа зво о іч У щу 03у щі фу Те Ні ТВР оКух Рее БРОо Су БРе Аля РО
КУ На «Мо Аїз віз у Біу Бе ев УЖі Бе ів: Рве Бе Бго ух РКО Куб
Ко «5 за
Ар Тк іви Мей Біб бек ав ТВК Бте Вів Узі Твг бух Уві Уві Уві
ЗВ ща Ма ЗВ
Ар Уві Зег ні біз ев Бго Б У бух бе дах Тео тує Уві А; 5 3 35 бі Уві бі: УВІ Ніє дев йїз бух ЇБк фу Бк ака Віб ів бій тує ма ви ж й Бек Те Тук акв Уа У8і бек Уві іс їй УМ ів Ніз іа Аа
Зм Зах
ТО ів Аа біх ВУ ЩО ТУує фу Су фу Уві ек дай губ дів Бе на ат ще
Бго біз Ро їі Біб бує Те 36 бег фу вів ух Бім іа Бо Ага зв зва 335 зва біз Вго біп Заї Туб ТВгб о Без Рео РРО бек АгЕ бів бій Меї Те Ку ав5 418 5
Азп бів уаії баг оїву Те бух без уаї бух піу Ви. Тук рРго 5ег Ар 425 425 аза
Ії діз уаі бій їбр бін бЗег Ап бі біб го бі) Ап Аа Туг Рух 335 ла 445
ТвгоїВг Рко Рго Уві іє) АБр Зег Ар б3іу бег Ре вне (ео Тує 5ег ака 455 зав із фе ТВг омаї Ар оїуз бег Аве Тгр бій бій Біу Ахп уві РКе 5ег 455 378 475 45
Суб баг Уві Меї Ні5 біз Аїз бец Ні5 Авп Ні Тут Таб обіп гу 5ег з8х за «95 їен 5ег ів бег Рго бБіу Кук ва «ійх 78 «тії» 583 «2125 БІК «2135 Штучна послідовністьв «238» «293» Перший поліпептядний лануює універсальної йіспецифічної здапторної молекули
ВА» «да» 78 : дер Уаі Уаї Меї Тиг бів ТВб о Рго ВВе бег геу Рго Маії Хег о їви 1у 3 5 ів 15
Ахе бій 818 бег ї)я бег Сух Абв зве бег о бій 5егоіву ма) Ні бе а ах за
А5пп о Біу аж ТВгоТує ви аби ТеротТук се бів уз Ро біу біп 5ег
Рго вух Уді іо 118 Туг ух Уді Зеє Ап Аке БВ бек б3у Маї Бей за ак Ба
АхродгЕ Ре бак 0іу баб: 01іу бек ЗЩ3у ТВг Аа Ре ТйгГ о кез бух Пе та 75 ща зе Аги УВі біс Азів біб Акросез а3у Мі Тук Бе Суб Же" бій баг і 85 За 5
ТВесонів Уві бко Тер о ївБе Бе ві 635 Щ1у їТВгб бух без 510 ів фув тав зо05 У
Щіу 01уУ 61у бег біу біу біу біу бів мві бій ву Уві бів бее 01У м їх 155
Аза біс аз ух кує Рго Біу Аів Заг Маі ух Маі Бе" Сух Куб Аїд ща Ах ї48
Зек Щіу Ту бег Бне ТВгбобеє Тук Тк; Ме ев ТР Уві Аке бів 4із їх ща 155 158
Рео бі Бій біу сви 851) Тео 238 б1у заз Хв Ні РРо боб Ахробек їх 578 175 зів ївВе Тгроіео Або біп бух Ре гук бер АсЕ Уві Те ія ТвК дю ї18е ївя 128
Ак бух беР Тег баб ТВг о Аіа тує Меї б) фев бек обег бе Абе бек 1955 Кз КІ
Бі: ав Тне Аа Маї Туб Тує Сук дія АкЕ 3) Ні Тут бі Тр бер зв 215 в
Бго Бе Аза Тут Тр Біу бін Ф1у Те фен Уві Тег Узі бет Хек під 225 238 235 Кон яіу Сух Біу біу бБіу біз уаї бів йіз сви 010 фух Фів Майї дів ів ша 858 455
Гев ін бух б3й і Аза Азфа ви БІ буз бі: УВІ Аїа ді ви 3
2-0 65 КК у щіу біт біу Ав Гуз ТВ нія ТВ Сує Ро БгРОо бу Вга йіз вра 75 КЕ ке біз ліз Аів бі біу БгРо беб Ма) Ре іжу бе Бе бро бух Бра Був
ОВ 35 а
Ат Твг обер Меє фі баг о АгБд ївк обГ) 5іб Маі ТБ о Сух Уві Уві Уві
За ща З за
Ар Ма бег Ніб біз 85р БгРо біз Узі ух Рв Ахи То Тут Уві дв 355 38 35
Фіу чаї Бі УЗ Ні Яхай Аів йух ТВ ух Вго Авр бі бій бів Тук зав Зах за деп Заг ТВе Туг АК о Маі Уві зве Маі ву ТВг о УЗІ Кен Ніб бі1й Ар
ЗЕ зве За
ТР ви би Щіу Буз Бім Ту бує Сух вух Уаї бег Абп вух Із їви зт ЗУ ЕВ
Бво Аза Рго Зо бін фу ТВБ о Їіж 5еБ іух Дія Суб біІу біз рко АгЕ
ЗЕ ще За зай бів Бко бів баї Тує ТИР їец БРо реко бег дгя бів бін Меї Те оф ув 405 За ій
Ав бій Узі бек бен Тер Суб сез Уві бух біу ВЕ Тук рез бег Ахо чо 425 а їзе Аіз Уаі б3і6 Тер обі бек Аа Бі бів го Бій) Ап Аби Туб вує аз ай ах
ТБ тТВе Бе Рго УВІ Бен Ар о зее др біу бег Ріе Ве фу Тук бек с 855 за
Кук іа пе маі Авріує бег Аке ТгРо біп бій бі ах УВІ Бра хе за 475 ке
Суз бег Маї Меї Ні бі: дів іец Ні Ахап Нія Тугк ТВгобів бух бе 485 заа з95 іви баг без зЗеб о рго бу Кух зав «й18зх 73 «2135 257 «5152 БІЛОК «2135 Штучна послідовність каоах «ваЗх Третій поліпентидний ланцюг універсальної біспецифічної адапторної ввлекули цвА-З «вав 7
АБр ух ТВРОНіб Те Суб Бео бго був Ргро Аза Бе 010 Аза Аїа у 1 5 18 15 біу рго баг Уві Ре іви бе го вгРОо ух вра Куб дер ТВг о беи Мет
Ко 25 30
Їїє бек Ав; ТвРОРго бі Узі ТВг оСух Маї Уаі Уаі Азр уві бек НІ зх 40 дз 510 дер орго 610 Уаї фуз Ре дп Тер о Туг Уві дбр біу ма) бів Уві а
Ніє Ап АЇв фує ТЬР огух Рео Аге Зі) біб бів Туб Ай бек Тве Туг 55 Уа 75 ва аг Уві Маі бек Узі бе Тиг о Маї їе) Ні бів йхи ївр осв Абп у 5 30 5
Муз бій Туг фу Сух у Уаії баг Ахп Бух Аїа іец Рко Аза Рко 112 і88 1а5 іа 5195 фух Твг Сів бег уз Аїа ух біу біп Рго Аг біз Рго бій Маї 115 128 125
Тує ЇВг офеб рго бро бег АгЕ бів біо Меї Те бух дбп бів Уві здає а 135 14 ів бек оСуз Аіз Ма1ї ух 0іУу Ре Тук Бго Заг др ів Аза Уві у 145 158 155 158
Тев біз баг Аєп біу Біп Бго біб Ай АБп тує фу ТВ ОТВРОбео РКко 365 178 175
Узі бео Або баг Ахр б3)у бек РБє РВе сец Уві бак офух во ТВг уд) і88 385 13
Ахріу5 бак АбЕ Тгробіп біп біу Ахп Ма) Рне баг бух Заг Уаї Меє ї55 а 285
Мі 15 Аїв їац МНіх Ап дри Ту Тк бій ух 5еб о іву Зк о бец бог а і 278
Рге біу куз
АВ
«8482 73 «11: а «2312» БІЛОК «215» Штучна послідовність хай» хРа3» Третій поліпейтидний ланцюг універсальної біспецифічної адвиторної волекули
ІКА-А «вах с бік Уві біп ев мі біп Зег б3іу Аіїа 013 Уві ух уз го щЩіу діа і З 18 15 бек уаії йу5 Маї Чек Сух ух Аід бег біу Туг его бпЕй ТВг о Зег Тує 23 85 за
Тее Меї Ахп Тер о Уді Аве бій діз Рго Бі 5ів біу Кей бів Тер Т1в е 45 щ5іу мазі Кіє нНіє Бго баг дер 5ег із ТР оте ія дер Бій вуз Ва
За 55 ща
Муз вар АБ Уаії Те іє ТВге о Уві Або Куб бек ТВе беє ТВе Аза Ту
БЕ КЕ 75 Б
Ме 5) іви бек баг ізо Агв оба біз др о Тве Аза Уві Тугв Тук Сує
За ЗБ діа Аг ів іх Туг йіУу Те Зак бре вве дів ук тб» біу щі ЩІ1У ! тва їа5 і38
Тве фен УЗІ Тк Маії бек бен дія бег ТВгофу5 іу рРго бар Уві вне 5 їх 335
Рго Кев Афа Рео ве о бег уз бег Тне баб Біу 5іу ТНг АтТа лів вки 138 135 142 1іу Сує Бан Мі ух Ар о Туг ре Рко біб Бе зі ТВг о Маї бек отее ах Бак Щ1У Аіа іа) Тв? Зеб о біу узі Ні Твг оба Бго Аїз Мяі во 185 178 175 бій беєе бег п1у Ме Тук бегб ви Берк бег Узі УЗ) ТВе Майї ВРО Хор іще їх ї88
Зак Зеє во бі їбеб бів ТвеоТує Хі бух Аа Уві Ах Ні ух го
Щ55 я 25
Зег АБап їйб руб УБ3Ї ар ух де Ма іч бро іух беб сСу5 Ахр гук 238 15 КК
ТвгоНіб Те о Сух Бге бро бух ко дів Бго бі) ів Аїз 1у Ту в дах ЗВ КК КЕ
Баг о Маі Ввж фен Ре рРго Рко бук Рео ух йза ТВг Бе Ме Діє Кег
У 55
Яги Твке обго біз уві ТВе Суб Уві маі У8і й5р Узі бег іх За Ар дБ ув
Рго бій маі (ух Ре Аза Тер о Туг Уві Азр о біу узі Біб ма) нія Ап 275 ве 285
АЇй бух ТВг о їу« Рго Агв біб бій бій Туг Аба баг ТвгоТуб Асд Уві зав 295 зав
Уаї бек уві мец тик о Маії іви Ні біп Абр Тер оїе) Ахап біу руб 5 за5 18 315 зай
Туг їу5 Суз бух уаії баг АБИ ух із ви Рго Аїа Рго бів бій ух 325 з38 335
Тне Ї1е ба бух дія ух 01у бів Ро АгРй біз Рко біб Маї Туб Таб зав 345 за ца) бго Вго беб АРи біз бій Меї Таб вух деп бів узі бего їв хег 355 зва ЗБ
Сух йіз Уві бух Б1У Ве Тук го аг Ахр 112 Аза уві біб Тв вів 37а 375 зва
Зег Аби біу бій Бго бій Ай Ап оТуб руб ТвВг оте Бра бго Узі Це 385 зва 395 азва а5р Заг Аа 0іу чего ра ба фей Узі Беб суб Бе) Тв Уві Ар гу заз з1й віх
Заг о Абв Тер обів бій б1у Авап Маї Ре бег Сук бек Уві Меї Ні БМ «38 25 ззе
Аїв іхи Між Депо АР Туб ТВ бій ух бе івн Зегб ів ве РРО Щу 48 445
Су «238» 73 «13» 538
«ай» БІЛОК «Ії тучна пасглідовністьв «ЯМИ» «ВІЗ Чезщертий лопілептидний ланцю" універсальної біслецивічної вдетторної молекули уп «ах 73
ЗМ жів узі бен Тйпг бій бак Бгро Аза ТР обеу Бер ев Заб рго Бу ії їх та ї5
ОІВ АгЕ Аза Тйг овен беб суз АБ Аза зве біо 5егб Узі АвроАбАи Тук за 5 за
Піу МЕЖ бек Бе Меї А5а їго ре бій Бія бух вге 01у бів Бго Бро за 45 іїуУ5 Сех ви Щіе Ні АТа Аза хаб Ази (ій Біу бег Бім Мі Бра ее
Ба 55 Ба
АгЕ Ре Зег йіу бек Бім бає 51У ТВР оАхроРве веб ово ТВг бі Зеб 5 В 75 Ви
Заг ви бі: бго біб Або Ре Аїв Заії тує вна Сук бів бій бек ух а 25 біз ма) вВго Ту Те Ре пір біу 41У ТВ о фух Маф біз ів бух АГЕ їв За їв
Те мві ліз їв Рго бак уві Вп (15 БНе рео бго бер ар 5 ів 5 кв їх їв Куб Бех ЩІУ Те дів Бег чні М8і Суб цеу гео АБ АБ рве тТуг за 335 3438 во Яке біз ів ух Уаії біз їБробує Заї Абр о деп дія Се бій баг 145 їха 355 165
Зіу Аза баг бів біб бек узі ТВг біс біп дер бЗег бух бер баки Те 152 ї7а8 175
Тугв Зег дво бек баг ТР? огей Тбг о фе» ЗБК бух Вів Або тує Біб бух ї88 ї85 іа нів вух маі Тут вів Суз Від Уві Те Ні бів біу ви бек о бег Рга ї55 зва ча
Уяі їВг вух баг на Аа АгЕ біуУу Бім Суб
Іа зї5 «ів 74 «й З75 «5155 БІЛОК «3 гучна послідовність «ЖЕ «383» Третій поліпептядний язанцюг універсальної біспецифічної адаптоарної молекули
МВА» «ах ОВ
Зів сів Узі іє) таб обій бе рео Аза Те о їез 5ер їву бев го у 1 5 та їх іч бга дія ТВгофбез бе Суб Агр дія 5ег біз бек Маі АВ АБа Тук а хх Ко біж Меб баг Бе Меї хв Тгр оре бій Бій губ Бгто біу ія Рго Бго
Б 45 45 йуз Би їв 118 Ні Аа дів беб АБа бів 53іу бог біу Уаї Бго Бе
В 55 Ба
АгЕ Бне бек Ф1у беб біу беб 0іу ТВК Ахб бе ТВг оіен Тв ія дет «5 та 75 во деко ім бів рге йій АхроРНе йіз Ма) ТуУуб Рпе суб бів Бій Бегб Був вх за 5 бів Уві Бго Туг Тк оРне біу біу б2У їй: бух Уві бів Ті бух 6ІУ іа Та ца аіу 01 Бір бог йщіу б3іу 81У біу баг аіу Щіу ЩШіу біу Бек бів Мі це 128 15 ів ін уві біз дек Оу Аза біо Маі ух Куб го ЗМЇу Аїа Бех Маі 58 135 140 їух Узі Берг Сух іуб5 йіВ Заг О1у Туг баг рве Таб бе? Тут Тер Меє 145 ї58 55 і159 йб5п Тго Заї Ра бів йіз бро й3іу Біб Зі бе бі: Тко Кі Бі МБ ї6х зв З
Ті Ніх бко беб Ахо Зак о біц ТТН Тер ів ах бій ух Ре бух Ахр ї8а 385 185
Агв Уві Те Ще ТНгоУа) Абробух Зеб ТВе бек ТВР АВ Тук МОЄ щі 155 ЗВО за5 із дак баб 1іви йкЕ бек біз Ав ТВР о АТа Уві Туг Туб Су Аа Аг
Ж ІВ 228
Зі: Мія Тут Ту ТВе бек Бго Ре діа Ту Тер щу бів б3Уу Твг ев
Уві їме Узі баг Бек Акта баг ТР Бу Щіу рго бек Маії не Рко ев 245 Ка 55 віз БгРо бегобег ух бек Тйг бек бі чту Тв Аза ліз ев Оу Сух 268 Ж а іги Уві губ дер Тув Ре РР 53: Бго УВІ ТвР Узі ее ТР Аяй ЗЕ спіу Віз ви Тйг бЗег бі узі Нія їТВе Ре РРО дів УВІ Гео 53ай баг а 455 зва
Бег біу йо Тук бег іву Зег бег Маі Уві ТВб Уві Бго бев Беб баг
Зв За 335 3985
Кер оку таг осів їв отїуб бів Сух ба уві ака Мі Бу РРО хек Аа зах з3а 335 твг. Туя уаі АБр о фує Агя Маі бЗіш Рго уз бег Сух Ахр Був ТВг Ні : 348 345 356 тТагРоСує РРО Рко Сує Бго діа Рго бій А1ї3 Аза йіу біу Рго Зве ма ! 355 зво 365
Бпе ів Вів бу б» фу Ро Куб Ахр о Твйг сен Меї 1316 бек Аге Твг 378 375 зва го 51» мМві Те бух Уаї Уві Маї Ахр маі б5ег Ні Біб Ар го бід 385 зей 395 488
Ууаї ух Ре Авп Тгр Ту Маї Ар обіу маї бій чаї Ні Ап АТа ух 2а5 418 815
Тнг фу Рго Ав біо 53. Бій Туг Аа Зек о ТВе о Тує дгд Маї Уаї бек 4220 435 аза уУаі бец ТвР Узі і:и Ні бій Аброїго їеу Ахпобіу бух біо Тук ух що аз 340 445
Су їу5 Маї бег деп іч Аів Ге) Рго Аїа бе ї1е біб Куб Те Х1е аа 355 466 вас обу аія ух біу біп Рко Агк Бій Рго бій Уаї Ту Так фей го 465 37й 4875 зва
Рго баб Агсв бів біб Меї Тк о су Ап бій чаї бек гей бак Сух А18 з85 дав 495
Уаії уз біу Ве Туг РКО бек Ар Ті АтТа уаії 65310 Тер біз бег Ап ще аа 5855 518 бБіу бів Рго бі Ахп о Ахай Туб ух ТВг о ТВйг о бго бро мМаї без бр баг 515 за 525
Ар біу хег РБе РВе іви уаї бег фух Це Те Уві Ар о іух 5ег АгЕ 538 535 50
Терібій бій б1у деп маї Ме бег Суб бег уві Меї Ні 019 Аїз їв
Ба5: 55 555 зва ніш Аз Аги о Туг ТВгобійп губ Зеб о бево беє ем 5ег Бра біу ух що «55 57а 75 «МВ» 75 «211» 223 «2435 БІЛОК «ЦИ: Нова барієп» «82Вх «ай МІС, БЕАТКЕ «2ййз 41)..(523) «ай» СТА-4 людини, яключаючи сигнальну послідовність (послідовність в СВІ : МР 805205.2) «2505 «9215 ВІаМА «ййй» (3)..434) «2235 Сигнальна послідовність «аа 75
Меї АЇз Су іеч біу ріж біп Аги Ні фу5 Аїв бів ви Ап зе Аїа і 5 18 15
ТвеЗАРВОТВе Терорго Суб Твгогеноіїео РВе РВе їв Меч Бе Це Рго их 28 5 за уаї Ре Сух ух Аза Меї Ніб мзі Аза б1і0 Ре Аза Уві Уа) без Аза о за 45 баг бег Ага Б1іу їі Аїв 5ег вве маії Су5 біз Тук Аза его бро Біу 58 З5 ва
УЗ Аза Тре біч Уа)! Аге Ма) Тни маї зей Ав б) А1а Азр о Зеє бів 57. 78 75 за уаї'їне бів Уві бух йза Аза Тис тує Меї Меї біу єп біб без тБг 85 за 5 бле фен дер дер бег ї1і1іє Суб Тк обіу Твг 5ег бег біу Ази бій Уві . їв 155 ла
Аз феу ТВг о бте бів біу ем Акк Афа Мех Ахр о ТВг о біу цеч Тук Тв 115 128 125
Суз уз МаЗі бі ієм Меб Туг Рго Рго Рго Тук Тує їз бі тіє 41У 138 135 145
Ахпт біу Типи біп Ї18 Туг маї Т16 Азр Рго біш Рго Су Рго Ахро5ег іЖу 156 155 168 дер бий без іец Тр оїіе Кей Аза Аза Маі бег баг біу сей вне Ре 165 178 175
Тугє бег РНе фец ів Те дів Маії беб ів) зак фу5 Меб ей тує Ку і88 185 196
Агроавк о рго Бу Тис о Тне біу Маї Туг маї бух Меж Ррго Рго ТВг б31м їз заа за5
ВБго бін Су5 бі фуз біп Ре біп Рго Ту Рпйє Ті Рго Ї1е Ахп ша 215 238 «8105 76 «якіх 18 «ті» БІЛОК «23 Ноща зарівпа «202 «9212 МІС ЕБАТУВЕ «Яд» (31..118) 72232 МН-домен антитіла протя СТЬА-4 людини СТЬА-4 АВ 1 (іпілімумаб) кава» 75 сів Уві біб цем маі бій бЗег 0іу Біу 51у Маї мМаі біп Рго Б1у АгЕ їх х їв 15 5ег Кен Ага іеч Бег Су5 АЗіз Аза бег Біу Ре Твк Ре баг 5ег Туг
У 28 25 38 тве Ме Ні Тер Маі дер бів дів Рго 01у ух бі їец 9535 Тгр Ма - 5 40 45
Тве Рне І1е Кег Тук Ахр 5)у Ап о Азпофує Тує Туєк Аів Абр бек Уві 56 55 бе іуш о1у Акв РБе Тк Ті 5ег Агд о АБр АБа бак офух дей ТВеоїев Тує 05 - 7а 75 ща ер бів Мей Ахп хек Ге Ага Аів біб А5ротТвйе латів бів Тугб Тує Суб - 85 за з5 із агЕ Тег обіу Террофео біу Рго Рне Ар о Туг Тер біу бів біу таг : 18а їв5 318 ім Мі ТВг о Уаії 5ек Зег 115 «2385 77 «241 388 «2ї3з БІЛОК «813» Ношо харієпх «20» «321» МІС РЕАТИКЕ «й (МК. (8) «хаїх УС-домен антитіла проти СТІА-4 людини СТЬА-4 жАВ 1 (іпілімумаб) «4085 77 51 Х1в ма) Тен Те пів бЗек вро 5іу Твгб овен бек оїви бЗае го біу 1 З 10 15 біз АгЕ Аза ТвВгомен бек Су АгЕ Лів 5ег біп ек уві біу 5ег 5ег ше 28 5 за
ТУБ ке Аїа Тео Ту іп біб ух Рго бі бів Аза го Агро їви ви ж ав 45
І1а-сТуг біу дія Рре дес Аг Аіа Тигбопіу Те Рко Ахр Агро вве бег
Зо 55 а біу зак обіу бен біу Тпгодбзр Ре їВгб бе Те ів 5ег Абд без 55 7а 75 яв риб 1 Ахр вп дія Маї Туб Ту Суб бів біп Тук біу зег бен Рго
В 8 за 35
Тер. Тв" Рне біу біп біу Тіг ух Маї біб 116 Куз - 188 185 «23вх В «2335 125 «ЗИ» БІЛОК «215 Ното харівлх «ях «22ї5 МІС РЕАТОКЕ «лаз 33..(1253 «йийї» УМН-домем антитіла проти СТІА-4 людини СТІА-Я тАб З
В (тремелімумаб) «ай» 78 вій маї бій бецп узі 030 бек б1іу біу бБіу маї Уві бів Рго біу Аг і 5 18 15
ЗеБ рез Ар о їец бег о Сух5 А1з Аза бег біу Ре Тйг оре баг баг Туг за сіу мес Ні» Тир Маї йся біп Аїа Рго біу уз Біу цей біц тер Уві ше: 48 45 діа УМаї Ї1є Тер Туг Аєр біу бек А5п (ух Туг Туг Аза Ар бек Уві а 55 ве іуЗ біу дев Ре Тйг Її бег Агв Азр деп ев фу Аха Таб ів) Туб 655 та 75 86 іенббіп Меї Абп бегоіво Абрв дів бій Абр Твб Аїз Уві Туб Тує Суз
З за а5
Аза АРК о Ахробго АгЕобім Аа Тв обев Тугб Тук Тугє Тує Туг Фу Мех 186 1985 це
Авр Маї тгробіу біз біу Таб Те Узі Твб о Уаії беєб 5ег
І 115 128 1235 «еВ» 7 «2ї3: 187 «йо БІЛОК каія» Ношо зарієпе «228» «22415 МІС РЕАТОВЕ «жа» (1). (187) «253» Мі-домен антитіла проти СТІА-4 людини СТ1А-ЯА тА ! (тремелімнумаб) «Ах 7
Ар їі біб Меї Тег бій 5ег Рго бе Зег іву баг АТа беб узі б1у і 5 18 15
АВ Агро Маї Те Ті: Те оСух Асв Афа бег біп бекб 18 деп о бесб Туг га 25 за іе А«р Тго Туг біп біп ує Рко піу ух Аза Рго уз сец ївн Ті 0 49 35
Туг Аїв Аза бБег бег їво бій бек біу Маї Рго бег АгЕ Рів 5еє бБ1у вв 5 ва
Зек біу Зег біу ТВг о А5р Ре Те бец ТВг іє бек бек Сей бій го ве то 7 Б біш'Абр вве Аіа Тиг оТуг Туг Суб бій біп Туб Туб бЗег Те Рго Ре 85 98 95
Те вве біу Ра бі ТВеб їу5 Уві бю ї16 ух 188 185 «й1аз Ве «із ЗУ «82: БІЛОК «21132 Штучна послідовність: шо
«823» Домени СНА-СМНЗ Єс-фрагменмту ЇКбі, що містять заміни МБО, е заб5ат і то5БЕ «226» «Из МЕС ЕБАТОВЕ «кжййх ї217у..4217) «7335 Хва являє собою лізин (КК) збо відсутній «вав; Ва дід бго 615 А1а діа З1іу біу Рго бег Уаї Ре ес Рве Рго Рго 5 ї 5 18 15
Бго бує Азр їВг Гео Тує Ї1е Те дев бім Рго бій Маї ТНе Сух Маї 29 25 за
Уаії Уаії А5ои уа)ї бек Ні бі АБ бео бі) Маї бух Ре Ап о ТероТук 38 40 ах
Уаї Азр б1іу мві бій Маї Мі5 Аяп АЇїв Куб Таб фу го Аг а Фі ве ев піп Тує дяпо бек о ТВе Туг Акя Маі Уві Зег Уаії іец Тк о Маї бе Ні та 75 я бій Ахр Тер ен Ахп біу у біб Туг фух Сух ух Маї 5ег деп ух 85 зв ях
Аіїа бе Рго Аза рео Ті 510 Бу Твг тів бегбобу5 Аїа губ с1іу бів іа 195 118
Бго Аге обі Рро бій Уві Туг Тйбоїви Рго Рева бег АбЕ біз бів Мет 5 158 325
ТВг огух дей біп Маі бек офєю ТВг оСуб бе узі у біу Ре тТуг Рго 138 135 140
БЗег Дер Ті Аза маії біб Тер біз зве А5зп о б1у Я1ї6 Рго біб Абп Ава 145 ї58 155 їва
Туг уз Ти Тве Бго Бго Маї де) дбр о Зеє Абр біу бег Рке Ре Ге зав 178 175
Тук бег Муз цен їВг омаї А5роіуя« Зег АгЕ Тор обіп біп бі Ах» Ма) ї5а 185 1938
Ре 5ег Су бег Уді Меї Ніх біб Аїз іеч Ні5 Ап Ні Тує Те бів 335 за 285
Муз Бег ку Бег Гец бе Рка біу Хва 216 315 «318» ВІ «в1їз 317 «їй БІЛОЖ «213» Штучна послідовність ках «223» Домени СНАСНЯ Бос-фрагменту Їрб4а, що містать Заміми МО52Х, за5ат і т25БЕ «га» «2215 МІТОК КЕАТИАЕ «222 (237),.(2173 «223» хава являє собою лізин (КК) або відсутній «яайх ві
Аіз Рго а43ій Ре бен біу біу Рго б5ег уаї РН без Ре Рго Рга Кух ї 5 18 іх бго бує Ар Тйгобеу Туг Кі ТвВгоАсек б1б Рго біц Маї Твг Суб Уві й 28 25 за
Маі1 Маї Ар Уві бек бів бій А5р о йго бі) Маї біб РБе Аяп Тер о Туг 49 45 чУаї дев біу Уаії бі) Уаі Ніх Ап Аза фу« Ти" фуз Рко Акв біцч віч 5а 15 658 біп ре дей Яке ТВг оТує АброМа1ї Маї бвге Маві ібц Тне Маії бец ні 55. 7а 75 ца іп Ар Тер оїей дев біу мух біу Тур їух Су їу» Маї 5ег деп Гу 85 ай з5 ціх Меч Рго Зег бек Тіє бій фу Таг о ї3іе бег їу5 Аї8 ух біу іп 188 185 та
Рго аг обій Рго бій Узі Туб ТВе орви ВгРо Рго бег бів бій Бі Мет 115 128 125
Те бух дей Пій Маі бебБ іви Те бух ео маї Ку біу Ре Тук Рга 158 135 138 заг Ахр о біе Аіз Мак 51) Теробій бег Аза 51уУ бій ко біб Ах Аа 145 ї58 ії 158
Тук цу Тийг о Тве оБго бро Узі Гео Ар баг Ахробіу бЗег Ре Бе ви 1655 178 173
Тук Явгт Агро ей Тпгбомаї Аброцух бак о АгЕ три бів 51) б1у Абб Уві зо ів і198
Рне Бег Сух Хаг Мазі Меї Ні піц Аїа без Ні Або Ні Тує Твг бів 155 288 285 іЇу5 бег іез бег їв) бек оїву біу Хава 318 15 «2152 В «2112 8 «214» БІЛОК «215» Штучна послідовність к228» 2235 Варіант домемів, що містять "виступ" СНЯ-СНІ Ес-фрагменту Їрой, що містить заміни МО5»У, 52581 ії ТЕ «Я» «2215 МІС БЕАТЦВЕ «ай» 9173.,(2173 «233» Хаз являє собою лізми (КК) збо відсутній «дай» и
АіЗз бго Зі Аіа АЗїа 01у біу Рго бЗеб уаї Рпе без ВВе Рео Рго і у5
З 5 18 15 реє ух АБО ТВ бен тує Тіз: тТве дев 30 рго бін узі Твк Су Уві та 5 за
Уаї чаї Аже Уаі Зеє Ні шій бер го БІ УВІ уз Бе йо Тго Тут аа 45 чаї Ав Біу Уві біз маі Ні Ахп Аза бух ТВе іх Ре Аве 056 Бу а 55 Ба піп Туг Ахи бегб Твбе о Ту дере чаї Уві бек Уві фею ТВгР Уві ви НІх 2 тв зе
Чіа Ар Твроіво ап бі уз Їй Тугб ух Сух бух Уві б5ег ди їу5 85 зе Зк кіз Бе) вго діа Рго хза Б) бух Те Хі бек губ дія Суб щу бів тво 5 138 га АР Біб Бго бів Уві Туб ТР обео; Бго го бЗег Абе йпьш фо мех ще ї2а 125
Тйе фу ява Щіп Уві бБег ія) Тер бух іви Уві Куб біу Рне Туг Рго їв 435 Я
Бег Абр тів Азія У) 53 Тер бів бек дп БІ бій Рго бін дяй Ай 155 ї15а ї55 тва
Тут Куб ТВеЕ Тбе РБго РКО Уві зву дб беєс йер біу Хек Бра Рее їв їб5 Тв 1У5
Тук Бег бух без ТВ" Уві Ар офух бек дге Тео бів піп б1у Авп чаї
НЯ У 158
Рпв его бух Бек Мві Меб міх біс Аз бец Мія Аєв Ні Ту ТВе бів 135 80 ща5
Ку» хек Бен бег ен бег Бго біу Хаз за ві5
«ія» ВЗ «а» 917 «тах БІЛОК «ізж Штучна послідовність «иа» хЕй3» Варізнт доменів, що містить "западину" СНО-СНЗ Ке«фрагнменту 180, що вістить заміни МО5ОЖ, 5АБАТ і Тз5БЕ «ЕН «ййі» ВІ5С РЕАТЦВЕ «ай ЯКУ), «Т2Жх Хаа Являє соїне лізмн СК) збо відсутній «ав» 83
Аіа Бо із віз Аіз Б1у 63у го вер Уаі Рбе ев Бе Бра ро Гуз 3 5 18 15
Без губ й5р ТВгоїво Туб 36 ТВе древо 530 Бго Тв ма3ї Те Суб Маї 28 25 зе чаї узі ев маї бег нії Бі) до бго бін Маї фує Ве да їв Туг як ча 45
Узі Ах Біу уві бі: маї Ні Ах Аів уз ТЕ іу5 БгРо АРЕ бі Бій 5а 55 8 їі Тур Ай бег Тнг тує Ак Уві Узі Бег Уві ви Та» УЖі во і5
Я та ув на біп йо ТгРрофен Ахв біу бух БО Тук бує Сух вуз Узі бег Ав Гу
За ЗУ
Аїв іви го Аїа Рге їі біб фуб5 Тк 038 бег о гу5 йіз фу біу Бій 188 385 138
Бга дво Бій Рсо бів Уаі Тує ТАБ оїву Ре РКО баг Абе Бі 53 Меє 115 3158 325
Тве вух йо іп Уві еб ве) бек Су дія УВі фу ЯЛу Рне Тут рко їз 135 ї48
За" Ахи їіе лій ча3 и ТР бфй бек ба щу бів ко 38 Ака Ап 85 ї156 155 з
ТуБ фу ТВе Тиг Ред орго Уві ви д5р Бег Ахр біу Бак Бе Ре Кеи іївх щу їв узі бег бух беу Тигр оУзі Або фух хек АБЕ Тр бій бів бі Ахв Уві
І5о 185 ї3а не баг Суз бБег уві Мей Ніє бів а13 фен Нів Ах Ан ТУуБ ТК ОІВ 1535 зав 295 мух бек би бек іо бег Рго біу Ха ке 215 «ій» НЯ сві 517 «83» БІЛОК «йіїйх Штучна послідовність «ХВ «333» Барізнт довеніїв, що містить бвистуй сне-СНІ Бе-фоагменту ТЕОЯ, що містить заміни МОБ, БІ54Т і ТаЗБЕ «23: ст3їУ МІС КЕАТУКЕ «ах (2375. «иа» ЖХаз являє собою лізин (СК) або відсутній «аа» ща
Дів Бере біс пе без біу п3у Рео бег Уві РМе без РНЕ Рго РРО фух ге 5 18 15
Рго бух Ар оТїйб о Гец тує Щі ТВгоаАгв біо Рко бі Уві Те осСух Ма)
В 5 а
Узі уві Ав Узі баг бій Ми Ар Бго Щі Уаі біб не Ав Тер отТує а ча 45 мні АБ ЗІу ММЗ) бір Уа) МНіх Аа віз ух ТР ОГух Бго Ага 1 Ву а 55 ва бів Бе Ахпобає ТВг оТуг АБд о Уаї Уві баб Уві бе ТвВб Уві ви Мі та У5 ще
Бій дз Тероіво айва біу уз біз Туб іу5 Суз бус МАЇ бек дБ губ я Зв 35
Біж фен бго бег беє ів 530 уз Таб іє Бек ух Лів Су БУ пів аа 385 ща
Бко вка бів рРго ів Уві Тує їВе бвц Ра Рез бек бій Яд 035 Ме ве о 135
ТвВг бує ха бій Уві бег іец ТРр Суб івц узі іже Ту Бпе Тук ВрРа ї3а 135 18
Зее Або ів Аів Уві біб Тер Біб бек ах Віу біп рко б313 бий дей 145 158 55 тка
Тук був ТВготТвг без Ро уз жен Ав обег дер о біу бек не БНе ви ї55 ух ї75
Ту баг дгж Бец ТВг УВі Авр бух бег ага їбо Біб Зів віу аа У їв 185 а
Рме бен бух Зак Уві Меє Ні біб Аїз Сео Мі Ай Нія Тує Тк ТА їх зав 205
Зуб бак Кіш Яке бао его бен 0іу Хаа гів чі5 каївх 85 ко що «ях БЖ «2435 йтучна послідовність «23ВУ «823» Варіант доменів, що містить Звпадину" оСна-сМЗ бс-Ффрагменту ТБ, що містить заміни МАВ, БІБАТ І ТоВВЕ хагах «ваїх МТС КЕАТОКЕ
«да (МТМ. ОЇ «2» Хва являє собою лізин (КУ) або відсутній «а0ах вх діа вео ії вна іо Бі БіУу Веб боб Уві Би іо Рйе го бро ух
Ро ух 850 ТНг обву Тук Ме Те ав біз Бе біб узі ТВге оСув Узі
Ко 8 за
Узі Уві бер УВІ баг бів Зіш Ахв Рго біз Узі Бій Ре йжй Тгур о Тук
Е 35 а 45
Уаі зв іу Ма31 біо) Маі Ні аа Аівз фу ТБ офух Рг Аве бів у ща КУ а сій РНе Ап бе ТВР Тує Ак Уаі Маї бе Маі іо Те Уві без НІЖ
Б Та 75 ва
Єіп дзр то іви зп біу кук ів Тук іУух Су ух Уві заг дян фу до зе 55
Я1у без ро бек бег бів 310 фу Тег 115 бев іух із ух Біу БІВ їде 105 пе го Аве бій бро бів Уві Ту ТР ів рРге рко бег дів Бів бі Меє 315 158 ії35
ТЬгорух до бій Узі бек ге: зве Сув Ада чаї ув Щіу Ре Ту Бго в 135 148
Бек Ахи Щіе дів Уві біз Тго 530 Хеб беап біу біз рко бів йхв Ап 145 ї58 155 ї58
Жук бух ТВЕ ТВг о Рго Бго Уві їси Аве бег Ар обіу баб Віа Ре фев 155 ЕЕ) ТУ
Уаі Бег Аг їМеу Тпг Узі зр вує бек дари Тра бів Бі бі Ах У ія 185 1
Ре бег Суз бек уві Межх Ні біб Аїз їву Ні Ап Ага Туб Тк 63 195 зав 285
Муз Зег сви бат ів его во 51у Хаз зів 815 «7310 5 «Вії» ЦЗ х2і3з БІЛОК «киії» Штучна гослідовність «а2ах «223» Ук-домен гуманізованого антитіла проти РО-і1 людини (РО-3 АВ о їЇ УМ) «483» 86 бій уві бій фен узі ців Зке біу дів біз Узі ух бух го 01іу Аїв ї 5 18 15 5ег уаі ух Узі бек Су5 Ку5 Аїа бек Біу Тук баг Рна ТЬге о Зек Тук за хх за
Тер Мат А5а Тер оуУуаї Яке бій Аза Бго біу біп біу бец біб Тер Тв 35 48 45 ім маї Гі Ні го Зег Ар бек бі ТИиг Тго бен А5р бів бух БвВе
Ба їУу5 Авр Аги Маі ТВгб їі Те Уві Авр о бух бек Твг обеє Те Аза Тут 5 7а 5 ща
Мес біз іс бвб Заг оіви гад о беєс біз Ав тТвг о Азя маі Тує Тук Су» во за 35 діа дев бін Ні Ту йіу Тег о5ег рРго Ре Аза Тут їго» б53іу біп аіу 180 185 118
Твгоїен Уяі Те Ма3їі 5вб баг 115 «2ійУ 87 «31їх МИ «ті3з БІЛОК
«213» Штучна песаздевність «ай3У УК-доМмен гунзмізованого антитіла проти РО-5 людини СРО АВ 5 50
М ка КУ іш Хе Уві ес Тег обій бБеб БРео Аза Тве бе) баб іву баб бра біу
Її 5 38 15 пі) АгЕ АТО ТБ гово Зег бує Ага АіЗ бе" із бе Узі Ар Ав тує й кое Кг піу Меї заг РНе МебЄ Ах їБр вНе бій бів був Бере піу бій вро Рео 35 Ява 45 ух фен без Ще Ніє Аїз АЗа Бег Ах бій щу баб фу май го бек ва дея Бе Кег біу сег Ф1Їу заг біу ТВг ойхр Ре ТВ оце) Те Щі бе
ЕзЗе Я яв 75 ща
Бег їви іч БРО бід йо Бе Аїз Уві Туг ре Суб Бій бів бек Бу вх За 5
Щі ад бро Тує ТВ Ре щ3іу бі Бі ТвгР бух уві 53іц Те Бу за 155 щчльа «аїій» Ва «илі» 445 «їй» БІЛОК «із ВтТучна поспідоаність «ах кай3» Нажкий ланцюг вититіяз прати РО-З людини РОЗ мдв б Бак чанах В біп Уві біб із) узі бів беєе біу Аїва бій узі уз бух Бго Бім дів ї КЕ ї8 15
Заг Уві ух Узі бек су5 іув А1іа б5ег біу Туг бек Ре ТВе бер Туб
З 5 КІЗ
Те Ме Я5в Тер оУВЕ Аге бій АТа Бгто іу біп 61уУ їв 010 Тев Пе ! 35 За 85 бі уаі їі Ні Рг зве Або аб бів Тв ТкКр бе) Ар А бух Рве
ЗЕ 5 «в вух Ахр АР УВІ ТВе іє ТАпгоУві Азр гу бЗег ТВ оЗше Те Аа Тує що за 5 зо
МеК біб мес бег бег іву Або зве біз дв Тве о діз узі Тук Тук Суб
За 55 ліз АР пів ніх Ту Б3іУу Таб обев БРо Бва Аїа Туб То бі бів БіУу чав 135 ще
Тве о іец уаі тег оМаї бег баб Аза бек ТВе бук Біу Рро бек Уві рве а АЖ
Бго іви Афз бго Суз бен дра бегб ТВе бегб біз Чеб ТИР ОАЇВ Аз ви 138 з 348
ЧУ Куб сеи Уві ух Або Тук Ба Бере біб Рей уві ТБк уві бек Тер 145 т5а 355 1658 депобеб Біт дів Бе: Те бек БУ Мазі Міє Тйг Бе Бо Аза Уа ев 185 Іа р бін зЗеє бег б1у іви Туб заг о Бви Зве зве Уві узі ТВе узі го 5еб ї158 їі85 1958
Зав бек іо ім ТКг офух ТК о Тук ТВК Сув Або Уді дер нія іух БГО їз5 зав 285
Бег Ази ТБг фу УВІ Ар іух Ага Узі 01 Зег бух Ту Біу рго рго зів 35 а
Ку го в Суз Без Афа Бго бій Ре ги б3іУу Біу бго беб уві вве 235 ве 235 зав іви Кер Бго ух Бо бух ДЕ о ТМг оіен меж їі 5ег йеЕ Те бо
КЕ ща 3
Щі: чаї Тв? Суз Уяі Маї чаї бр Уаі баг бів бів Або РРО 1 Мі
БО зб а бів Ввбе Ап Тгроїує Уві Або 51у Узі бій уаі Ні депо Аіз бує ТВ і 275 ща 85 їу5 го Аве бін бій бів» бе Аха бег ТИК Туг дкЕ Уві маї бек мві 298 7535 за ів їне Мві зез Між бів Ащо їкр ке) два йпім бу б3н Тут бух Сук 85 ма що 358 вух Маї заг дей фу Бі змец РРО бег ба» (18 бін фух Те їїв Зав зо 335 ух Аїз Бу БІ» біб Бго ГЕ біз Рг біп Маіф Туб Те во Бе Рро аа 345 ха
Зве бій бів біб Мек Тнг бух джипи біз Маї баг оїяо ТБе осСух вв МІ 355 зв 65 ув ТУ Бе Тук Рго баг ар Ті Аза меії 120 тер Біб Зеб йха щу
За 75 зва
Щі Рго Біб Ах АФ Тук ух ТАБ Тве Рго Бго Уві Кей Ар Зегв Ав
БАН 398 95 зав
ЗБу бе рве ри іє; Туг беє Агш ібн ТВРОМБі Ахросуз баб АбЕ ТРИ 3а5 418 415 щЩіб бій біу йб5п мі Бе Зеб Сух 5ег чаі Меї Мах БМ Аа вес НІ: 358 455 аа дев Ні Ту: ТР ОБбБів бух бог ів) бек ву баг о їіви Щ1у ах ча 4435 хоїйх ВЗ
«яз ІВ «ія БІЛОК «3» Штучна песлідовністі «ЖАВ» «223з йшгемнВ ванцюг амтитіна проти БОеі людини РО-Ю яд в дар «овУ ВЗ біс їі: Узі іа ТВбодія Зег бро віз Те осв бЗегб фено обек Рго Бу ї 5 1 ї5 іш аАсв Аза Тв сви Зекосує Аебр вів За ОБ бег о Уві Абр одн Тук а 755 30 біу Ме бег Рне Ме ами Тр вне бів бій вує Рго Біу Бій вго Рго
З аа 5
Куб іє: іо К1Є Ні5 йїв аїз бек хи бій БІ баб біу Уві Бі бек 5а 55 «в
АгЕ ВВе бег біу бег біу бБег біу ТВк Аза РБе тТиг Се Тбг бе Зеє «5 та 75 ва завів: бфб Бе бів» йза Бе їз Узі Туєб Ве був бів бій бек бу вх ча 25 «ін УЗВі Бго Туб Те вве сі Б1уУ бі Твг бує Уві 630 Ї1ів ух ЯКЕ ї85 5 36
Тег маі із Аза его Бае Уві Вне їі Ве бго вро Беб Ах 1 ік 28 425 їжи був Зк БІу Тк АЇв бегб Уві Маі Су (ен іви деп Аа ре Тук
Ії 33 в вго вра Бі Аїа гу чаї бів Тер бух Уді дер дей ів беи бій Заг 145 58 ж зва
Бі Ач Зак бБіп біз беб чаї Те бім біб Ар Зав о фує Аяй Зак ТНг їх кВ КЕ:
Туг бег Беу бегБ баб ївг без Твб гец бег бух Аїа Ар Туг біз ув ідо 185 1че
Ні суб маї Ту ліз Сух Біб маії Тег Ніб5 біп щ1іу бе 5еб бек Бго їз ща 205
Уві ТВе бух бег Ре Ахп Аги біш біз Суб 18 215 «іа» 90 «Ж1їз 15 «213 БІЛОК «213» Мих шозсиійх «2285 «22 МІС БЕАТуКЕ «аа (у. (8) «аа» УнН-домен знтитіла проти СТЬА-Я людини СТЬА-Я тА З «ав» чо бів Маі бів іви Уаі біб беб біу біу бБіу Маї Маї біп Рго біу Аг5 1 5 39 ї5
Зег Кец Аге Мей Бех Сухє АЗів Аза зЗек біу Ре Таб Ре бек Заг Тук та 25 за
Тве Меї Ні Тер Маї Агв бій Аза БРо 0іу уз біу їв) біз Тгр Уві : 35 48 45
Тиг рве Гі зве о Тук Азробіу бег Ап о 1у5 Ні Туг Аза Абр бег Маї ка в Ба
Кух біу Аги Рене Тие Узі бЗег Агк Аа Ахп обег о фух Ази ТВе оіву Тут 55 79 75 на іец бій Меї Ап бек іон Ага Азіз бій Ар тТВе дів ІЗе Туб Тук Сух за 35
Аїа Агд о Твг о біу Тгр ін біу бро РБе Авр о Тут Тер обіу бій 31у Те 186 та5 118
Кер уві їв: Мав беб Бек ! ї5 є» 8 «їх їаВ «Я» БІЛЮК «Х3Я5 Ви щибсцівх «Тай «015 ВІЗ РБАТуВЕ хжййв 3.38 «ЗА» Мі«домен знтятійв проти СТЬА»ЯА людини СТЬАха АВ З «айях З «іш Їі6 Уа) сви Таб бів баб Рго Фу ТР іо хев їв бек Бго щу і 5 38 35 біз АРБ Аза ТвКоївю бек бує АгЕ дів бе? бів бек Узі бев Хег баг 0 25 за
Рре ев Аїа Тгр Ту Бі ій бух го бі іп АбЗ РРО АРЕ Бей їеу за «5 їі: тТук ЩІУ Аїа бег бек АРЕ діа ТР біу Ї16 рко Ахв АгЕ Ре бек 58 5 Ба
СЩіу ха" біу бег Щ1у Тео Ахв о Бва ТВР бе) ТВг За Зеб о Абд бе БІ; в та 75 хо
Ргас бій Ар рле дія уві Туб Тук Сух ів бія Тук 01у бБег бек Вго 85 За 55
ТеВ ТР рве щу віп Біу Тв? огує чаї 830 Ї36 Ку їва ї5 «Яїй» З «яіі» Я «а» БІЛОК «Я335 бе зибсвіцх «Ви» «Киї» МІВ РЕАТЦКЕ
«ау ГУ..(448) «ЖА3У Важкий ланцюг йнтятіла проти СТА»Яа людини шАВ ОЗ оіАА «бах 92 піп Узі бів це Маі Біб 5ег біу біу сіу уаі ма) біп Бко Чіу Агв ії 5 їв 15 бебі Аг ви баб о Сух Аз Аїіз бев а1у Ре Твг бВе бе о бев Ту з 25 за
ТвгоМеф Ні Тев Узі Абе обі» А1а Рго біу Куб бік ів» бій Тр Уві 35 ча 45
ТвВе вббе Щі Зег тТуб Ахр о бБіу бег Ази бує Ніз Тук Азія дер Зег Уві за 5 ев зу біу акЕ Ре ТР оУаії Зв АгРЕ бер Або бек обу дей ТВе Кен Тук а 7З ва
Яво бі Мет Ахп о бегоієз АгЕ іа біц Ар Те Аза Г1е Тує Тує Суз 85 та 95
Аіа АгЕ ТНе Б1у Тгр ів йіу Рго Ре Ахр о Тує Тгр б1іу бів б1у Тве 38ва 185 ма іеи Уві Тнг о Уді бег беєб Аіз бер Тве Ку5 біу Рго бег Уаї Біне Вго 313 їй 1325
Меч дів Рго 5ег бек фув бек ТВге бев біу біу ТВг А1з АЇй ву б1у 8 ї35 ї48
Куб го Уві уз Ав Ту Ре бо бів Рго уаї ТвгоМві баг Тгр аа 145 ї15а 155 1658
Баг оіу Аїз їу Те бек біу Уві Ні ТВт Ре Бго діа Ма) се 51в і55 іУ8 1975
Жаг бен 5Зіу (ей Тує бЗег їв Беб Бек Уві Уаі Твг Ууаї Рго беркожве 380 ЇВ 138 дах бо біу ТагР обі» ТаРоТує Хі Суз Авт чаї Аж Ніб ух го 5ає ! 15 зав 85
Ах ТВго гу Маї Ав бух АгРЕ УВІ ЗІ Рго Кух ес Сух дхр бух ТНе 38 245 238
Мі їн Су рго Бо Сує Реа дія Рго бів Азія Аза Біх 01у БеБ Бер зах 238 235 288 чаї ве ви бе рго Без дуб КР Куб ди ТВгБ фіецз Меї ЩІ бек АгЕ ! 345 258 255
Твг обго 53» Уві Тбе о Сух Узі чаї Уві ах Уві Зеє Ні біз Азрорко 258 285 78
Бій Уаї ух Ре би Тко Тує Уві йзв Піу Уа біс уУші Нія Ах ДІВ 275 тва зно
Муз ТР бух Ро аРЕ біс ій біп тТук йхи Бек ТВг о Тув дк Уві уві ща а Зав 5Вг Маї Бен Ткгс Уаї ви Ні Зі Ако Тер ів йбп 61у Куб 53 Тут
За ща 315 Іа
КУу5 Суб іує Уві Хек Ав Гу АїЗз би Бго Аза го Ї36 ВВ бух ТАК 395 За БІ їіе бек бує АЇЗ Був Біб бій РРО Ав Бій Рго бій Маї Тут Те Гу 48 3485 За
Рг бБго Бег аед біз бїій Мет ТНге фує Ахп бій Уві Жег офец Тнг оСує
ЗБ 35 ія. УВІ бує 51у РНе Тук Бго Зеб дв ів Аза мі 3 ТР Бі Бег
ІВ 375 зве
Ак щу Біо Рго бій Ах ака тує ук ТТ Тве о бРо Ро мяї без дер
ЗВ 396 395 що зве Азв Бі» баб Вне РБе газ Туб Заг о іу5 во ТВРг о УЗЬ бер бух 5есе зач чо 315
Аг Тер біп біп біу за уаї Рне бег Сух бег Уаі Меїб ніх біц ліз 328 35 аза івн Ні Азп Ні Тує ТВг бій фує 5ег без бер Це Заг Рго Біу Тух а35 348 345 «кій» 93 «311» 434 «135 БІЛОК «135 Ми5 ти5сиію5 «230» «821» МІС БЕАТОКЕ «аз 4131..(944) «2235» Важкий ланцюг антитіла проти СТІ А-4 людини щаАВ З оде «да» 93 біп чаї бій се Уаі 515 бек обіу біу біу Уаї уаї біп Бго біу Аг ї 5 їі 15 ве фаз Агкоівц Зебк Суз Афз А1а зЗеабобіу Ве ТВг Рве 5ег 5ег Туг за 25 за
ТВе Мех нНіє Тер уза) Агв біл Аза бго 51у у5 біу без а10 Тер Уа)
Таке їЇтТв баг Туг А5р о біу бек Ап о їух Ні Туг Аіїз А5р Зег Узі 5а 55 ва бує б1у Агд Ви ТигоМді бек о АгЕ Ар Аа Зегс бує А5п ТВгоїфец Ту
Ба 78 75 ва іеч бій Меї А5п бек івц Агв Аза біз Ар Тиг Аїа 316 Тубє Туг Суб ва за 5
Аїз дев тТве о біу Тир оїви біу Рго вве дбр Тук Тго біу бій б1у ТР зво 395 118
Мео Уа тик Уаї бек бег Ата Зег ТВг Оу Біу Рго бек Маі РНЕ Рго
115 3128 125 іви АЗз вго Сух Зег о йкя бег о ТВе бег біб бЗеб ТВг Аза Аія бе б3у 338 135 138
Сух без мві Муз А5роТув Бне Бго біз Бго чаї Тве Уа1і беє Тер Аа 345 ї58 їз іва
Зег біу дів Бей ТБгобеєв а1іу Уві Ні ТВг о Рпе Рго дів мМаї Сео 531 ів 178 175
Заг обег 5)у фец Туг бег іео баг озЗек уві Ма) ТВг о Уаї Рго его 5ег 188 185 1950
Зви ко біу Твгофух ТВГ Ту ТвбоСух Ач Маї АБр НІ ух бго Заг 195 28а 285
Ап оТНе бух М81 Аби озіує Агя Маї бі) бег бух Тук Щіу Рг Рго Су 218 із за
Рго Рго бух Рго Аїз го бій бе ів (1у біу бро бег Уві Ре ке 225 за 235 282
Ре Бго рго цух Рго бух Ар о ТВг оівн Меї ї16 баб Абе ТВе Рг 3 2а5 258 55 чаї ТЕ бух уаі Маї Уа) Абр Маії бек бій бін Азр Рго 5) Уві бій 26а Ба 578 пе айва Тго о Туг Уві Ар біу узі Бій Уві МНі5 Ап Афа ух ТР Кух 75 зва 285 бго ббв біз бій біп Ре Ахв бек ТИР ОТує Абд Уаї Уві лег Мві Тео 258 235 зав
Твг Уаї ве НІ» бій Ахроїбробео АБа біу бм5 Бім Туг Куб Суб Гух за5 ца 315 328
УАі бек азп осух 0іу іви Рго бег бег Ті бід Куб Те Хів бе 1у5 325 338 335
Ада фу біу біп Рго АРЕ бін Рго бій Уаї Тут ТВг оце Рго Рго зе зав 345 з5а біп бБіц біц Меї ТВгофує Ак піп Уві беб ів) ТвгоСув бе Уві фух 355 зва зх
Біу Ре Туг Рго бек дер Ті Аза Узі Бій Тер біц бек Ахп біу ій 370 З зва
Вго бін Ав Абп о Тук бух ТВе Тве о рго Бго Маї сви дер бег Авр у що за 335 зао
ЗекоВБе Рве їжи Туг бек Агв фе Твг уві Ахрогує бек Аги Тер бій 405 ща віз сіб О1у деп Уаі Ре бег Сух бег уаї Меб Ніб бі) Ада Гей Мі Ап
Зв Зах 438
Ні Тув Тв» бів іух хек ви бег іен бег івгв щ31у аз 830 квівх а «їх і «8іЯ» БІЛОК «Х13» Вув висі» «й» «й2ї» МІС КЕЕАТОКЕ «235» ї1)..(215) «823» Легкий ланцюг внтитіла проти СТІА-а люлини маАбБ З БІАА Її яд З зар «аайх 94
Чі бів Маї іец ТВе бів баб бго б1іу ТВгоіяец бег ін баг Бго біу і 5 18 15 сії Агро Аїа Твгоїео Зег о Сух Аге Аза бег бій бег Узі баг бек бег 28 25 за
Ре ей іа Тер тує бів бій Куб Рро Біу біп діа Рго АгЕ ба Кей ї5 48 45 її Туг БУ АТа бат Зв ЯАгЕ Аїа ТВ Зі ія реко Бр Абд вла дог ще 55 ва піу бег іш Зк бБіУ ТВР др рве ТВР і ТР ОТ Зве дев ве; та 75 а га і; Ах Ре дів Ма) Тує Тут сух Біл бів Тує 03у бек баг Бе 85 за 5
Тер Те Ве Біу бів 31у ве бує ма бій Щіе Бу аев ТБ Ві Аїв тав 195 їла
Дів Рго бБег Уаі Ре бів РМе Рго го бе дов бів бій це ух Зег 115 158 125
ЗІУ Так Аз хек маї Уві Суб бе веб Акп деп Ве Ту" РО Аг ощИ
КУ іх 148 діа мув УВІ бій Тер уз Уві Ар дп Аза іву біп баг сіу Ава баг 185 ї58 55 зай пів 51; Зеб маії Те біб ЗіБ бер бек бух Аєв дае ТР ОТув 5бе фев іо 98 75
Бег зве ТВгоЄє: Те бе) бер бух йіз Ав Тук ій бує Ні фу5 Узі їка 385 їза
Ту Аза Сух Біо уяі Те Ні бій сіу бе ее ев Бро ма) Твг ув ї35 за -х55
Зев Ве Акп аги бу піч сСує
В вій
У 55 «ах У «815» БЕК «815» Штучна поспідовність «аа
«223» Перший айо третій поліпейвтидні ланцюги БАКТ В «ах 95 іш іє маї рей Твгб обіп бек о Рео біу ТвВгБогец Бег їец бБег Бго біу ї 5 16 15
Біч дге Аіа Тйг оїец Зег Су АгЕ Аіз бег бів бег Узі 0іу бек 5ег ча 25 за
Туг їжи Аіз Тер о Туб піп біп їух бго бім бій Ада бо Абе йо) во за 45 ї1е Туг біу Аїз вне Хег Абр Аза Твг о бБіу Щіє Ро А5р о Агв рве бег
Ба 55 ва біу баг біу бег дім ТИ Ахр Ре ТВк офео ТВг жів бек Аг гео 01 та 75 во
Рго бій хр ве Аз Уві Тує Туг Су« бій бій Туєб Біу бер бе бго 85 за 5
Тгтв ТНе Бе біу біп Бі Тпг о бух маі 513 016 уз (іу бі біу 5ег 180 1і88 16 5іу біу біу оїу біп чаї біп (ей маії Біп Як О1у Аза біз уві Сує 115 129 125 зу Рг біу Аїз бак оУаі Суб Уаї бег Сух цу Аїв бек біу Туг бег 136 135 140
РБе ТР обер Тує Тер Меї Ази їго Уві Агв біп Аза бро біу Бій 51У 135 ї58 і55 158
Кан бі Тер о ів біу Узі Ті Ні б о бве Ахробер 10 Те оТер Бей 165 5 175
Ар Фів Сух Ре гу« А5р йри Маї ТР Ті Тайе Узі АЗр бух бек Тр ї18а 185 ї3а бек Твг Аїа Тує Мет ої Гей бек бек їец Ага бек Бію Ахр ТВг Аза ї55 зв 295 чаї Ту: Туг Сух АЇв ЯБв піч Ні Ту Щу ТВг Хеб Рго Ббе Аза тує 8 215 228
Тер бі біп 61їу ТВ обво Уві ТВе ві бег бЗег бі Фу Суб Б1у БІ 255 23 235 зав біу із Уві діа А1їа Суб 31 бух бій Уві діа Аіа іо 630 Був БИ зав а 55 чаї АЗфа віз ій біб фу 01 Ма) Аїз А) із 535 їу5 бію зе Був еВ 265 о
Ту Біу бге вга Су РРО рго буз Рго Аза вга Бій бВе ів фу Я1У
Я 288 зах
Рез беРє Уві рРпе лес РБе Ро Рко їУу5 Рго бух дер ВР оівем Тук Ме
ТвР Аке ов рРо бів Маї Тбг осСух Маі Уві Узі Ахо Чаї бек Бій Я 385 зів ЗІ5 ЗО ар орре бів Уві Біб вна ей ТР отТує Узі Ар щу Уді бів уві нів 325 зза 335
А5а дів бух ївге бух ВБго АРи о біч біз пів Бне дхи 5еб Те о Туг АгЕ зак 358 ча Маї Хеав уаі Мем ТвР о Узі боб Мія 5310 Дер ої во Аа бі бух
ЗВ зво ЗБ
Зі) Туб Суб Сух у уві бек АБ ух Б1у ще РРО Зек бер Щі ТИ
ЗВ 375 зва
Туз Тве Біе з6к о гуз Аза уз ЩіУу бій бро АгРВ Бій Бео бів Уві Тук
Зах За ЗЕ дао
Те бен о Вго Бго баг дів бів бів Меї їБе бух да Біп Узі бер Сер ах 418 чі
ТВ» Сух пи Я Гук іу Ре Тук рго бек Ар Хі йіз Уві ої Тер ха 55 ЯЗ бій заг йха йіу Вів Бго бін йха Ах Тугб вух Твг о Тївб бго Бго Уві 455 аа 445 ін Абр бек Ахв біу Заг обнНе Ре ім Ту бег ке Кеи о їбе Уві Ар 455 ща іуб бег АРш Те обів Щі: біу АБ мМаї вве бек сСуз хек уві Мет нія а65 БУК 75 ЗВО пів Ат без Ні Аа Ніс Туєб ТвеР бій ух беб би бЗеє бе зак бе 85 за 495
Бі кій» зе «21 З «832 БІЛОК ха» Втучна послідовність «аж» хйиЗ» другий збо» четвертий поліпептидні ланцюги АВТ В «вай» Зк бій тів Уа) бец Те бів баб Бго Аза Тпг фен бер оіво баб бго щу
Х х ї18 ї5
ІЧ АгЕ АТ Тве ін бек Суз АгЕ АЇа Бег Бір Берг Уаї АБр дви Тут та 43 За
ТУ МежЖ бе Рі Меї Аза Тр бив біб бів бу5 Бео бі бів Рго Рго 5 ча 45
Муж цес ей Кі Ні Аза дів бек Абп біп біу бек б01у чаї Рго бег ща 55 ва дге Бне ее бі бек біб баг піу ТР Ах бе Тнг обец ТИР ЇЇ баб
55 З 75 а бек іви бів бро біз Азр о бре Аза Уві Тук не Сух бій біп бег ух ща зо З5 ців і во Тук Твг рве 01у біу БУ ТАБ о гуз Уа біз Ті уз ФУ 188 їх 118
Зіу Бі бег піу біж Біу біу біп Уві ціп Бен у 30 бек БУ у ме 128 125 біу Уві уві біп бго біу Агв боб Без Абе бер бег Кук АЇв Аїа 5ег за 35 зав
Оу БвВе тн» Рье бег о бег Турк Те Ме Ні ТРо У АРв бів Ата рго 345 ї58 155 168
Оіу ух б1У йви біб ТкроМві Твг вве 316 бег Туг Ар біу Ап асп їб55 178 175
Мує Туг Тук Аїз А5р бек Уві ув Б1у АгЕ бе їве Це зЗег АгЕ АБр то ї85 198 дача баг ух АБ Те фей Ту? ву БІ Мет йха бег о іви Абе вів щі 1955 КУ 285
Азов таг ДЗ 16 Ту Тує Сує Аза дРЕ ТВе о О1у То ву б3у Рго вне 218 215 з3а
Ахо Ту Тр обіу бій біу ТА? без: Узі твер уві бег бек біу Біу Сух ке За 35 4 бі біу Б1у ух маі дів йі8 Сух уз біо їх МІ АТа АТ ів ух «5 25 пів кує Уаї Аїа дія Бей бух бій бу узі Ада Аів ей бук БТ. зве зв 370 ка» 97 «мії 487
«ділз БІЛОК «7135 ВНучна послідовність ха» «ВИЗ» Першни або третій поліпелтидні ланцюги ВАТ Є «авах 30 тів Узі Кеш Те бій беб Бео біу ТВР о Бву Зек фе баг рго 0іу біз АгЕ Аїа ТВК оїви бек Суб Асад Аза бег бій бен М8аі Баг Заг Зек а 5 за
Бе сан йіз Тр Тує Бій іп ух Бго іу дій Аза ко ге ви феу ак чо 35
Тіє Туг Щ1у Айіа бег бек АБЕ дія ТР 01у їів бБго б5р Аг Ре Зев ща біу бек Фіу 5еБ о бту Твк дер Бра ТвВк фе Тве ів бек РЕ Бер щу в В 75 ва
РО СБії Ар о Бе вів Маі Туєс Тут Сух біп бій Туг біу Бе Баг Рго йЗ зв З
ТгроТвК вве іу бів бі Те уз Майї біб їіе уз б1у віу 61у бег 3ї88 185 її 5іУ ЩіУ Бу п3іу піп мі бій ів Уві біз бек біу Аза бі чаї ух 115 ї58 125 ув Бго 53іУ Аїв бек Уві У Уві бБег Сух бух Аіа бек Яїу Тук 5вг 138 ї35 Що
Ве Тв о бег оТуг Тер Мет Аха Тв; Уві Абе бій Аїв го Щіу БІВ у 145 ї5а 155 15 ів біс Те Це біу Узі Щ1іе НІ5 Вго бек Аз чек ід тТВг оте ви і55 178 ва
Ар обій ух РВе (ух АБО Абе Уві Те Хі ТВгб Уві бр фу баб Те ї89 155 398 паб о їйе аїз Туг о Меї бі» фе) бег баб ву АР Бек 510 Ар ТИР Аа 185 98 253 уві тут Туг Сух Аза Агро біз ніз Туб біу Тве Зегб о бго вне дів Тує ів 215 228
Тгр о аїх іа 515 Таб одез маї Ти" Уві бег бег Я1у 01у Сух Біу щіу 235 238 235 з23а сіу біз маї діз А1з Сух біз Куб Бі маї Аза Аза їе біб Гуз Бу 345 25а 235 уаі Аїа АТа і біо бух біц Уаі Аза Айа Се» біб уз бій бвг Сух 2658 755 78
Туг біу бго бго Суб рРго ро Суз Рга А1а Бго іш Рре се біу щу
ДУ зва 25
Рез бек узі Ре фен Влйе Ббо Вго уз Рг їуя Ар отТиБ Бе) Тук ї1в 9 235 за
Тве Агв біо Рго бі Уві ТР оСух Маі Уві Маї дер Уаі Зег бів 1) дер обга бій маї біз» рве деп Тер оТуб маі Ар біу М бір Уві ніх
Зах Зо 335
АБп дів рух ТВГ бує Бго Аг 03: 01 бій Ре джВв Бек Так Туг АГЕ зав 45 за маї Маї бер Уаї ем їВе Узі ес Ні біп Абр Тїгробен дхп 01у ух 355 БІ 365
Щі туго фу« Суч уз Маії 5ег Ахп о Куз біу без Бо бек бек Ще 53и
ЕЕ 375 зва іу5 Так хів 5еб уз Азїа фу біу біп Рго АР Біц Бго біп маф тує з85 338 395 488
Тв овец вго Рг бег бій біо о1іб Меб Тви ух Аха бін Маї зег ви дах 1 415
Тв о Сух без маї їує« Піу Ре Тут бго бег А5р іє Аїа Узі Би Тер зда 445 4438
Зі бег йеп біу біп рро біб Ах Аєп о Тук о фух ТВе ТВе Рго Рго Уві 415 448 445 іви Ар обег А5р о біу бег РБе Ре іви Ту бег АР ів Тв оМяі дер за 455 аа
Муз бег Аги Тер бій бі біу Аха маї ба бЗег Сує бег Уаі Меє Ні
БЕ ща 475 зве бій Аза фен Ні Ап Ні Туб ТвК біля уз Зек ви бег Кеу ек Це 85 498 435 у «21а» ч8 «2115 7 киії3» БІЛОК єеві1ї штучна послідовність «зайУ «а8іх Другий або четвертий поліпентидні ланцюги САЙТ С «айах За
Зі; тів Маї бец Твге біп о беге Без дія ТБ оре бак ба) бег рго 1у 1 5 18 15 біз агЕ Аїв ТВб оре баб Сух Аги о діз бек біз бег УВі Ахр Ап о Туг 28 25 за
ФУ Меї Заг вне Меж деп Тео Ре бів бій Куб го біу піп го Рго ла 45 зу Мез іез Щіє Мі5 Аза АВ бегб Авп бів біу бег Б3у Маі Рго бек а БІ ца
АгЕ ре баб біу Бех біу бек біу їВг о йщр Ре ТВгбоїец ТР Ті бек вк 78 75 ще
Бег їви ів БгРо сій яр Ре Аіа Маі Ту Ре Сух Бій бій ек ку ще За 35 іш Уві Рго Тут Те бБне біу О1Уу БТу ТБ бух Уві бі Сів бух У ї83 ї95 не пі іу Заг у іу біу 5іу бій Маї іп сез Уві біз бе» 53у 61У 115 ї2а ща пі Уві чаї бів ре 01у Ав бек ев дге бе) бе Суз АЇВ АТа ве ї3а 5 148 біу Ре тре Ве бек бег Тує Те Вес Ніз ТрРр Узі АРЕ пів Аїд Рго ї45 358 55 168 5іу уз ШіМ цец б3ю Тер Ма) ТВб РНе гів бек Тує йо біу Бек дан з55 їв 5
Му Ні Туг дів Ахр о бБег Узі уз біу йРЕ РНЕ ТЕ Уві Зик Аге др тя їв5 188 дви зеб о кух взя ТВг ов) Туб фей бій Меї Ай беб іши дея Аза БВ 155 288 а
Аза Тне д13 Ї18 Туг Туб Суб Аїв аАкр Тк о01у ТР іецз б1у бкео ВНе 2і8 215 ке
АБО Ту тга бі 515 Біу Тве фе) Ма3ї ТВе Узі бек хеб Біу біу Схб 335 аа 235 ай
Щіу Оіж б3іу кує УВІ Ада Аїв Сух ух бів су уві із Аіва ви фу 885 258 з щі фук чаї Аза Аїз Кен ух бій бух У азів Аа ви Куб ЩІ
БВ Бе 278
«жі» 59 «23ї» «о «ій БІЛОК «аі3З Бтучна послідовність «ХТО «2И3» Перший або третій поліпептидні ланцюги БАКТ чавах 55 біз їіє Маї (ей їйе біл бер рко дів Те оіец беб ее бек ко Ту о 5 їв ї5 піц Ага Аа ТВ ово бек Сує вер діа баг біз ев Уві Азов Аа Тує 8 5 за пі МебЄ хек Рре Меб да Тер о рРБе віп щЩ3л Бу5 бро Бі Біб бро рго 35 за «5
Кук ви із Хіє Ні а3а дів бев Ака піп 51 бег біу Маі Бе баг
В 55 Ба
Аги вве Заг Біу бек біу бег бі ТВе АзОа вна Те во ТР о Ї1в Бе вх В 75 ва
Бек фен ЩБо Вго Бій) Авр Бе Аїв Уві Туг Рие бух піп біп баг Буз я Зв За
Зі Уаі ВгРо Ту: ТР вве бі йіу Б1у ТВ офух Уві бін бе фу5 щу 188 385 ко
Бі» йіу бег іу Б1У Біт біу бій Маї біп ївн Уві 306 бек БУ у 115 158 325
Фіу мазі Уві бій Рко БіуУ Ага бег оїез Аев ою бег Сух Аїівз діа бег ща їх ав
З1у Бце ТВг о РНе Зек бек Тут Твк о Меє ніж Тер Уві АгЕ щій 8іа бго і58 155 ї58 піу вуз біУу Бей Біо тТкромаі Те ре Хі бе Тув ар БІіуУ баг Ай
165 178 Ку
Ку5 НІ Тує АЇТа Абу бек Уві уз Біу Агк РВеа ТВг Уві Заг Аг авр ї18а 385 їза
АБип Баг бух Ах ТБ Бе Туб мец бій Меїб беоп 5ег ін АгРЕ Аза 5) 155 зва 285
Ар оТве дія ї15 тує тТук Су Та АгЕ ТВгосТу Ти сво піу рго Рве зів 215 зай мер Тує Твр Б1уУ бій біу ТР бе Уаі Те Уаї Зег бег Біу б3іу КСух 225 5 235 248
Зіу Б1іу 0іу бі Уві Аза Аів Сує бір Кує біо Уаї Аїв дів бвей Щи 285 з5а 255 іух піц уві Аіз Аз іец віз бух біц Мазі Азїа Аза їі біб бух 515 а 255 аа жах фу Тут щу Рге Вго Суз Вео рго Су» Рго Аїз го бів Ре гей
ЖІ яв ан
О1У біу его Бах оуді Рве бен: Ре Рго Рео фу Рго іух Дер ТВг ем 298 235 зав
Ту Ше Те Абе біб Бго бів Ма) Твге о Суз Уві Уві Уві й5р маії бек зах ІВ 315 328 бів 41: Ар ого бі) маі бій Бе Ахп Тер о Тук Уві А5в п01у маї 18 325 З3В ЗВ
Уві Ні Ави діа іу5 ТБ офруз Рко Авк йпін бів біл бе Ажлобеакє ТВ за 345 58
Туг Аг Узі Уаі Зак узі Кен ТВР Узі іец Мія бій Ар Теробей Ап зва 385 йіу бу5 біб Туг фу Су бух Маі бек Ахп їух Біу ів РРО бер бек а 375 За
Ті« бі) вух ТВг їі бЗег ух дів ух біу Біб Бго АгЕ біб Вга бій 355 зза 335 чав маї Тук ТВР Мей Бго бго бег б18 бій бій Меб Тйг? буб5 Ах" 5іп Уг) 4а5 ча ч15
Зак оїви Те о Сух сечо Уві Бу біу Бі Туг Рго бек А5о Ті дія маї за за5 аа сі) Тер обі бего деп 01у бів Бго бій Аяп ббп Ту бує ТВг оТвВг о вго 448 45 го Маії ів б» Зег Ах біу баг вва вве ву Тук бег йгЕ бе Тне 458 355 а
Уві Ар іуз Заг АбЕ Тер Пій біз ту Ахп Маї ве бег Суб йве Маї 8е5 47в 45 зна
Мет Ні5 біб Аза сей мі Абп Ні Тук Тнг бій ух Зег іям бет Гео 485 438 «35
Баг сви аіїуУ «зів» 185 «231» 963 «3125 БІЛЖ «243» Штучна послідовність «248» «923» Другий або четвертий поліпептидні ланцюги БАКТ 0 «айаз зав
Що Щіе УБі іо Те бій бег о рго біу Те бен бег фе бек Бга б1у ії 5 ї8 15 бі АРЕ Аза ТР оїев бек Су АгЕ Дія беб бів Зег о мді 5ег бек баг 2 25 за вва фец Аіїз Ткр Ту «ій бій бу Рго біу віп Азіа Рго Агбд бе фей а аа 45
Ті Ту Біу із 5ег бег Аг Ада Тйг о біу Тіе Рго Ар Ага БВе Бег а 55 58 сіу бег біу Заг б3у Те АБИ рве ТВе їв Те Ті 5еБ Аг жи 83 та 75 ва
Ро сіб Акр ово Аіа Уві Туб тує Суб віп бій Тур Біу бен бе" вга ка зв 95
Тир о ТвР вне біу бій біу ТВгб о фує Маі 6519 Ків Куг Б31у біу іх зЗег зов з05 318 аіу ащіу біу біу біп Уаі 515 ін Уві іп бЗег Б1іуУ Аза 010 Уа) ух 115 128 125
Муз Ро піу Аза бегб Узі ух Уаі 5ег Су5 ув Аів бег піу Тук Баг 138 135 148 вве ТвгоЗег Тук Тер о Мех дяп ТгроЗаі Агд бій лів го б3іу дів Ту 145. 158 155 188 ів: 510 Тер Ті б31у Уві Тіе Ні Рго бег Ар беб бі) Те Тер обед 165 1978 175
Агр Бі бух Ре Ку Ар Абе уаії Твб Те ТВ Уві Аяр бух 5ег ТР з8а 185 за арх ТвВе дія Туг Меї біз ін обже Бех сей Арк бер бі) дер Тве лів 195 8 25
Узі Тут Тук Сх Аїв Аг бій Ні Тут біу Твг бек Рго Ре А1з Тує 218 2515 258
Тер Біу біп сіу Таб оїбец Уві ТВг Уві баг баг Біу 3у Су біу 1у ща 238 235 248
Оіу бух уві із Аїа Суб (ух бій бух Узі Аіа А18 Мей Куб 53 ух 245 258 355
Узі Аза із іви ух біз уз Уві біз йів без уз 53 зБа 55 «еїах 303 «і» 583 «ки БІЛОК каі33 Штучна посвідовність «Уа «333» Перший збе третій поліпепунані ванцюги ВАТ «кава І
Біб їі УЮ без Тве Щіб б5егб бре Аза Твк ів бегб івн ее Бра щу ї 5 їв ї5
Бі Аве Аза Ти єв бег Суб АгЕ йіа Зег бі; баг узі йвр о аяи Туг а 25 за
ЗКУ Мет Хег Ре Меї бев Тр о бве ів 530 фу го Бі 03 ге вро 35 ЯЗ 45 бух івуи без ЩІ Ні5 дів АзЗ Зегє дсп 313 бі баг бі Уві бго 5ег
За За 5
АРи Рна его біу бек бі беб о піу ТБ о Ако Бе ївБ оБею Те Фів бек 55 78 ТЕ ща
Заг фе) би Бго 03): Азр Ре Азія Узі Туб Ра був бів бій Зеб ув за 35 пів мі Рг Ту тве рве бі б1у бі ТБ вух УВІ 1) Тіє кух віу 388 та5 ца
Шу іу Баг біу Біу БУ Біу біп Узі бій ів У) біб беб щу у
Те ща 155 біу уві май бій Рго 5іу Агро баг вжи Аве фе бег бує Дів Аїв баг ха 5 ї43
ЗЕУ Ре Тве БЕ бек бе Тук Тве Мебє Ні Тко Уві Аг бів дів го ів 155 ій
ОіУ уз Б3У ев біб Тго Узі Те Ре тів бег їУг Або» щу баг Ахп
ЩО за МВ
Суб Міх Тус йіа Азр оче" Узі Су5 Зіу Яке Ре їнб Уві 5ег ЯсЕ Ар зай і85 138
Аки «ек ух Ахп о ТВгБ о їев Туб дви бій Меї бе баб їви врБ Аза о ї55 «ОО зо дао Тв о Аїз Ті їТує Тук Суз дів Аке ТВ? біб їв без Є1у га вне 18 15 ке
Дер Тує Тер біу біз 0іУ ТВР їв Узі Тпг У) Хек бег Б1у ЧЬУ Су ще 5 35 аа 5іу 5іт іу біс чиї Аїа від бух Біб Су біб Уві іа Азія Без БЩ1й а 258 зва
Суб Зі: уві від Аїя їеб бів бух бів УВІ Аїя Аа сео бів бух ву
Бо з85 78
ЗІ Бго бух заг АЇВ Ав о Був Тйг Ні Тс Сук го Рго су Вк діа ах5 ке 85
Вуз; бій Аза Аїз б1Уу Біу Бо баг Ма3ї Ве їв Рве Бео рго бує Вго
ЗВ за зва іух АБр ТР бен Тук Щі Твг Аж біб Бе бі) Уві Твгб бує Уві Маї 305 За І За
МАВ Ар ві бек Ні СІ Ах РРО біс У) уз бе Аха Тео тує ді 325 338 335
Ачр (Ту Уві бін чаі ніж АБа Аа бух Тйг бує го Ага біз «4 и
За 345 Зо
Тук ази ем ТВг о Тує ри чаї ча) баб Узі ей Те маі се) Ні бів
А5роїгр Кен дп біу уз Сів Тук кує бух ух мМаї бег яп фу5 дів з7а 375 зво іеч вбго Аза ко їіе біб руб ТВе ї31в бак о їу5 Аза бух бі ів Рго з85 3зза 335 заз
АгЕ Зі го бій уві Туб ТВгоїез Вго Бго бев Акв біб 51із Меї Те зв зів 415 уз А5а біб чаї 5ег івм ТНе Суб йео узі Суб сіу Ре Туб Бго ет 336 5 438
Ар ТТ Аза уві бій Тгр Бій бЗег Аза біу бій Рго бій Ай Ав Тує 835 438 845
Су ТВг ОТБгРОбго бро Уаі іен Або ес Абробіу 5ег вна Ре (ви Туг зо 435 428 зебофух дей Тег оУЗЕ Ар оїу5 бег Аге Теробіп бів біу Акп Майї РМе 455 ща 475 «в
Зег Су5 бег Уві Меї ніх біц А1ївз їжи Ні5 Аза Мі5 Тує ТВг бій ук
З85 4за 355 5ег іо бог без Зак Бго Біу зва «218» 105 «8115 557 «іх» БІД «2135 Штучна послідовність «8» к223» Перший або третій поліпелтидмі ланцюгь ВАТ Б «я0ааз 1853 бі Тіз Уві ву ТвВке біб беб Рко біу ТВг Кей бег се баг Вго Щ1у ї 5 18 15 біз Агв АТа Таб оїео боб Суб Асв Аа бег бій бек о Уді бек бви бек за 5 за вве беи діз Тго Туєб біп Бій Бу5 Ро б3іу біз Афа ЙО АРЕ Мей сец 35 за 5
Її1е Ту" Біу йіз бег бев ЯР Аза Те біу Щ16 рко Ар ге вве Бе
За 55 дао біт бег Бі ог Бу Ти Ар вне ТВе бви ТАВРО ее АРЕ о бви 83 «55 78 та во
Бго Біо йБр рве Аза Уві Тує Туг Суб бій бів Ту біу баг бек Рг
У За зх
Тер Тве Ба біб іп бу ТК був МІ о3їи Щі бу5 б31у Бі щіу Баг ща 305 36 оіу Біу 6Іу п1у біп Уві бів без ві бів зек Б3у Аіз Бін Маі Сух 158 ЩІ бух Бо біу Аіз Бег Узі бух Уаї бек бух бух Атїа бак 0іу Туг бБевт 3 335 їв
Ре Тик баг Тут Тер Меж Аби їБр УВІ Ага біб біз РРО щу біп 8іу 345 за 155 їі58 їез бів їгр бів біу Уві їі Ні Рго баг АБО Хек бів ТВе Тер Сей 1655 ї7а КУ бер бій фує Ре сУх бзр АСВ Уві Тв о їі1ів Те Уві Аброфух Зак ТВг їв 185 зва
Бег їй: Аіз Тує Мей біб Єви Зк бек фен Ага Зеб біз АхроївК КІЗ ї35 ОВ 5
УВІ тує Ту Суз 4ЇЗ Аве бій Ні Тує біу ТВР Заг Рго Рне Аза тус
Кз; 215 Ку
ТРО біб бів біу Те сво Маї Те Уві бек 5вБ ів Біу 03у біу бег -Ж5 238 35 за
Чіу віз баг ТВе уз 0іу бро бег Уаі Ре рго їв Абе Ро Ку зек 250 255
АгЕ Зак Тв? обек бів бег Те Аїв Аза без Оу Суб Кен УВІ був Авр
Ба 265 зв
Туг вве Бго Біб рко маї ТВе УІ Бек Тер дай беб Біу АВ без Те : ТЗ ВЕ 85
Зег бБіу маї Ні Тве вНе Бго 4А3фа Маі се) бів бег ЗаРб обіу фей Туг аа за ЗБ
Зев би зеб беє Узі Маї Таг Узі РРО баб Зак Бек бе) Ру ТВе бух 385 Зі ж За
ТБ Ту Те Сух Ахи маї АБИ Мі кує РГО бе" йба ТАг о бух Май Яр їух ага Ущі бій бег іу5 Тук біу Рго Вго Суз Вко Рго Сух Рко діа
ЗА 345 ЗБ
ВГ і: РНе ви Б1У Бщ3іУу Рг бе? Маї Ре ів Бе ргОо РБОо ух Бр 355 За зах
Куч Ар Того фе Тук Ті ТВе АБе біз вго бів уві Тве Суб Узі Уві
В ЗУ5 ЗВ
Уві Азр Уві Бек бів біз Ар вгРо 01) Узі бів бе Ах Тго Тує Уа)
Зяа зо м дав
Ар біу Узі бі: Узі Ніє Ап Дів бух Те о їує го аго біз БІВ ів
Зах зі8 5
Ре джи Бек ТиИг Тує Акр Маї Уві беє ма3і цец ТВР о маї бву Ні щи вай 455 али
АЖ Терієн дп щу зу 1 Туг фуб Сує бук Уа) баг АВ уз ВіУ
З35 45 44х
Мей бго бег зер Ще піц Кук ТВе Тіж баб бух дія бу5 61у бій Рго 45а ак» з88
АгРи біс рго іп узі Тує ТНе іо Рео рго его Біб іш 3 Ме Те 45 478 475 зва кує аби бій Маі бек оіви Те Суб ев уві фу« біу Ре Туг Ро 5ег 485 за 395 дер ї1іе Аза Маї біб тер обі бЗег Ахп о біу бій рго бій Аа Аа Ту зае за5 518 іух Тне Твк о рро Рго Уві рез АброЗеє Ар обіу б5ег бе вве Бей Тує 515 за 525
Бак оАгЕ їец ТВгозаії бр оїух баб Агро Тер обів біб біу аб уаї ВБе 538 535 5ай бег Суб Зег Уві Меє мі бій Аї8 іви Ні Ап Мі Тук Те сів Гує 45 зе 505 зей
Бег іеч Бех ів бак іо 0іу 5655 «41йх 183 «і» З5а «212» БІЛОК «ліз Штучна послідовність «32ах «223» Другий або четаертий повліпейтидні ванцюги ПАКТ Е «аа» 383
Зіч Ті маі їв Твгобій бег бв3 дія ТВб оба) баб се) беб бго щу 1 5 18 15 81) АР Аїа ТВб о бео бег Сух бер дів бек бій бег о Уаї АхроАБа Тук за 25 38
З1у Меї бег Ре Меї Ап Тгр Ре бів 5іп бух Вго Біу біп рго Бго «а 45 іу5 Бер іви іє Мі діа А бек Аза БІівп біУу ден Біу ча) Ре бек
ЗВ 55 ща йде вве Зек біу заго біу бег б3іу Те дер бів Тне іо ТВРОТ)в бек а 75 ща ек фіз БРіш Ро Бій Ахо о Бйе зів Уві Тук Бе бух ів іп баг ух ж Зв 55 піц узі БР Тук Те рна віу біу щіу ТВ огух Ма бів їТе Сух БУ
КЕ ня 3 пі Біу ба? 0іу Біу щу біу бій Уві Біб ви Уві 530 ве БУ щу ке: КК 35 ціу аб Уві Біп Рго бі Ага Заг ін Ага їіви хаб Сух Аза Аз бер ї3е 335 348 ціу ВН ТК Ве Зв хек о Тує ТЬе Меї Ні Тер уві дкв бій віз Ро 345. 358 355 з58
ЩіУу бух ЩіУ їв біз Тер Уві Те бе бів чег ТукоАбр Бім бек Ав їв 176 ЩУВ
Муз Ніж Тук Аз Ахр Бег УВІ бух ЗУ йсЕ Бе ТвР о Уві Бек АРЕ АЮ 156 5 іч8
АБ беб фу5 АБИ ТР оієв Ту фен бій Меї АБ баг ів Ага бів БВ 155 ва 385
Ан Те Аза Хе Ту тує Сух АіВ АВ Те БіУ ТР бо Біу го вве 218 215 3
АвроТує їгтр Щу бів О1У ТР о мец Майї Тне Узі бег баг без Б3уУ У ах. ща 335 зав
Б5іу зег Фіу Агк Тйг узі Аїа Аза бро бегб уаі Ре її Бе Бра Бго ах 25 В
Зег йбв Біб піп іє бух Бак біу Тв: йіз бег У) Узі Суб їі ви
Ко ЗБЕ во
Аа АБа вне Тук РРО АРВ біо Аїа вух Узі бів Тге Бук маї Ар АЖи
КК ев зх дій ів Бій Че" БіУ Ача зве бів бів бев Маї Те 1 біб Ав ще 298 а зва іух Ахр Бек Тпг оТук бег оби Бе» бег ТНг без Те обео Зеб бу АДа
Зах зів 5 ЗВ
Ар отут біс Кузх Ні фу« Уві Тук Аїа Сух бій мі ТИР нНіє Іо 1у 355 За 355 їви баг зак обго баф Те вух Зен ВБе Ах АРЕ БАЖ 1 Ку 348 з45 за «8їох ій4 311» 588 хиій» БІК «АЇ3х Штучна послідовність «аа «Я» Перший поліпентидний ланцюг ТЕТОЄМІ д свра» іа біц Ще Уві бен тТвк біб бек РРО Аза ТВ фе бе фен чеб ко бу є Я 5 18 15 біб АгРЕ АВ ТР о гву бек Сук АРе Аїз бее бій бевБ маї Аж дев Туг
Та 5 за б1у мес Зее Ре Меї Ахв Тр Ре біз бій бух Рго 0іу бій Бго Вго 35 За 45
Муз во фез хів Міх Аа іа Зегб Ах» іп бу ЕР 03у Ма ВРО бек с ще 55 Ба
АГЕ РН бег б3у бек біу Звге бі ТвВе д5р рве ТВР о Бем ве ЩІ бег 78 75 ща
Зеб омео біб Рго бій) Аєр о РБе АЗа МаЗі Тук Рбе Су5 бів бій 5ег Бу 8 за ак сі уаі Рго Тут ТйгоРБе піу біу сіу Тйг їуз Уаї бі) їїв (ує щ1у 185 185 118 5іу біу баг 01у біз бі бБіу біп Узі бій іви Ма) бій бег бу Аїд 115 120 325 бій уаі Сує Куб Ро біу Аіїй Бег уаї уз Мі бег Куб Куб Аїа 5ег 136 135 ї48 біу Тут бек Рме Тйг о баг о Туб тво Меї Ап Тго Маії Ар ів Аза Рго 145 ї58 155 168 бі бів біу гез зіз їгр Се біу Маї Ті Ніє Рго бек Ав бег бій 1655 178 175
Тв" Ттгв о бви дб5р біб вує Ріе су дор о Агв Маї ТВе Хі їрге уві Ар 185 ї55 198 зу Бег ТВг бек Тік Аза Туг Меї 030 веи бег бег їву Аги бек б) 195 280 285
Ар Те Аїа Уві Туг Туг Сує« Аза Аг 630 Ні Туг біу Те баг рго зів 2135 228
Бе АЇз Тук Тер а1у піп біу Твб фен Уві їйг Уві 5ег бек бі1у ЩІУ 225 230 235 2А5
Сух б1у біу біу біз Маї Аїз Аїз Сух біз уз біб Маї Аїа Атїа ев 745 258 255 біц бух аіз Маї Аїа Аїа ее) бі) бух біз Маї Аза із Се 03іц Куб 258 255 278 бін бег обу Туг біу Рго бго Сує Ро Рго бух Рго діа ребо бі вве зва 3285 іги біу Б1у вго бек Уві Ре іву Ве Рго го Ку5 Рго у5 Ар о Тве 738 295 ве
Мей Тує Тіе Тиг Аге бін Рго бій Уві ївгб Суз уві Уаії Маї Ахр Уві
З 16 Зі БУ
Зек бів біз Азр о БгРОо бів Ма) бій Ре о Азп Тер Тут МЗ3і Азр о біу Ма) 325 338 335 біз уаі Ні Аєп Аза фу« ТИР о Сух Рго АгЕ бів 010 біл Ре деп зер 348 345 за
ТвР Туг Аге Уаі Уві бек Маї їец ТНгомаї їеи Ні біп Ар Тер Бе 355 зва 365
Ахп біу уз біс Туг уз Суз ух Уві бБег Ахп оіух біу зем Рго бер за 373 БЕ
Зег Ті Бій фу їВе іє бог офуз Аїа уз Біу біз вго Аве щі го 385 398 395 488
Зіп Маї Тук ТвР обер бро Рго Зег біп бій біб Меї Тнг бух Ап вій 385 ч18 4315 чаї баг їео Тер оСу5 бе маі фу« 53у Вре Ту Рго бек Ар їі12 Дія зав аа аза
Уаї Фі Тер біз зве А5а б1у бій бго біз АБа Або Туг ув ТвгОтТВе «15 348 445
Рго Ра Уві ви дер зе дер піу Заг Ре рив фе Ту 5ег Аг Бен ака 45 450
Те Уві Аброїуб5 Бех Агд Тгробіяй біз біу Аза Уві Ре бак Сук Заг 485 495 475 зна
Маїі Меж ніх біз Аз бен Ні Ахп Міб Туг ТВг бів фує 5егт еп бек 485 498 495 ївм о бве Св біу «аїб2 5 «831» 279 «212» БІЛОК «тіл» Штучна послідовність «ах «223» другий поліпептидний ланцюг ТНКІОЄМТ А «аа» 105 сі 16 Узі фено Тне бів барв обео Афа Те обев баб грец Хебг рко щу 3 5 і8 11 бБіч Агж лія Тнгбоїео бак Су Аке Аза бег бій бЗег маї Авр да Тугб 26 25 38 біу Меб Звге вве Меї Аза Тер Ре бій біп бух Вго 5іу 53іп го вго 35 38 45 їух ів івеи 16 Ні А1в лів бве Аа бів біу Зег Ту уаї Ра бег (5а 85 68
Аг вне баг біу бег біу бек бім Тйг Абр ввйе Тигобец Твг Ї18 баг 55 78 ТЗ за
ЗаФб йац бій бео біб А5р оре діз узі Туг Ре Сух бів бій бек ух 85 за 95 бій мі Вго Тує Так Ре біу біу біу Тнг їух Маї 5) Х1е фуз5 51у 188 185 138 1у 5іу зег біу щіу бБіу біу біп маї пів сер уаіїі 10 бег бі д18 315 128 12
УВІ Бує ух Рго Б1іу Дів Зег М зу УВІ) бве Суб бу Аза бе ма 335 140
О1у Тук беє Ре Тим бегб Тугк Тер Меї дп Тер Уві Аге біп Аза рго з 358 155 150 біу Бій Біу це бір т? їі бі Уві Ше нія Ре бегб АБо бяк І ї6бх ї78 ТВ
ТВе Теробе; Або біб ух Ре фу Ахо ага Маі ТВР жів Твк мні дер ій 385 158
Муз бак Тне б5ее Те діз Ту Ме 5) Бей бег бег вен АгЕ Баг Бі ї95 2ва 285
А«в тТиг діз уаі Тук тТук Ссу5 бів АР бів нів Тук 61У Те о бве рко
ЩІ 215 288 тве йта Тук їва 3уУ 3 біу ТнР бе Уві ТВе о мадї баб дек БУ У за Ж КО суб БІУу б1у б1у ух маї Аїв 818 Суб ух 510 фу Узі Аза Аза їв а В 255
БУ5 1: бух Уві Аїз Аіз іс буз (1; ух Уві АївВ аїв ем ух 838 68 Б жа «йійх 5 кій БІЛОК «3 бтучна посліденністів «З0Вх «032 ТВетій поліпенйтидний язнуют ТКЯОЕМТ Я «403» 185
Бі» маії із Ме) МА3 513 бат бі 5іу 5іу Мі Узі бі го Біу бгд ї 5 18 15 лег бви АР фец бег Сує Аїа А1а бЗегобіу РВе ТР оре бег бег Туг та 5 ЗВ
ТВР Меє Міз їкр Уві Ав бів дів рго 61У фу Бін Кен бів тер Уяж ак
ТВЄ БВе Міо бер Ту дв іх 5ег Ак уз Мія Ту Кіз хв бек Уві ща ще ща їуг БЩіу АРЕ Рея ТВгОУВІ Зег дга вро дяв Зее Був дай Те квц о Тук газ та 75 ща
Мо бі Мей да бе бен Ак йіз біз йо Во вів тів їує їуб Сух 85 98 85 іа Аг Тигр обіу ТРр ово біу Рга Ре Ах Тує Тер щу бів б3іу тТье 180 185 338 бен Уві ТР Уві бе бек Аіа бек Твг осу5 О1у кко бек мві Впв го 315 ко 155 іви Аіз Бго Сує бе Аеж бБег ТВеб баб 10 бегб ТВг дія ді ев ТУ ща 35 аа
Суб ес Уві бух Ар Тут РНє Рко біз Рко Уві Те Уві 5ее о Тко Ява 45 58 155 ї5а бе» іу Аза ви тТве Хав біу Уаі Ні Таб РВе РРО Ага Уві фей Бі і1655 ув 375
Зв" озев Біу без Туг баг ген бег зег Уві Уа ТВе Уві Бе баб ее 188 тїа5 за зве обео ОІУ ТвгофУух Тв о Тук ТВ Суз дай Уві А5р Мі5 Бу Бго бе шк ав 205
Ай Те бух Уві йо бує АгЕ Маї Бій баг бух Тут Біу Рго рРго бух зів 5 чай реа Рго Суз Рго Ада РРО біз Ве беи бу Фу Бго бБеб ма РБе фе 235 еВ 235 ай ве гг Бго рух Рго фу дво ТВгоїейн Тук (16 ТК АР Бі Бео 51
Я5 Ж 255
Мазі Тк Суб зві Уві Уві Ахо УЖ чего бій біз Або вго 036 Уві бів зо 65 в
Тбе Ахи їБО Тут Уві йзр о б1у чаї біб Маї Ні деп дів уз ТК оСух 275 зва з
РРО АгЕ Біб бі) Фій ББе Ажа Бек ТВ Тук Абб Уві Узі баб Уай Се тва 285 за з ТвВе Уаї ів Ні Бій АБрЬ Тке Бер Аба Зіу бух Би Туб уз Ку ув
ЗВ: за Зі КУ
Уві зек ай бух ЦЩіІу їво Рго Бер зве Те бів був ТК ХО зве ух 355 за З35 дів губ бі пій Бо Агв й3і его 1 Узі Тує ТВРОоїеу вго го бек за За 358 бій біз бій мес ївеб бух Аа бів уві Зек без сег бує дів чві ух 355 ЗБ 35
ПІУ РВЕ Туг Рго бЗес Аза Ме Аіз Уві 53) Тер біб бЗег Або ТУ і за 375 зна
Рго бів Ап о йха Туг бує ТИР ТВе рго Бро Уві гей Або баг ав БІіу 385 В за5 зав
Зак Ре ББе бе: Уа Зак Ага МВ Твг ОУЖі Ахе бух бег АбЕ ТР; обій дах ча 5
Зі Оіу Аха Уві Ве зве Сує Заг Маї Меб Ні біб Аїа їв) Ні Ахв
Іа 25 38
АгЕ Тук ТВР ОІВ суз бе Кей баг во его без бу 435 з3а «аа: а «ЖЕ 315 «12х БІЛ «213 ВЖучинав послідовність «Я хйй3У Четвертий полізеттидний занинг ТАЗОМ й
«авах 187 бів ів Уві бе ТР обі Зеб ргро бін ТНР обев бек Ген Зеь о рго Віу і 5 18 15 ій ага Аіз ТпРОїец бег Суб АРЕ діа чає бій Хек Мі Хег бек Хеб 8 5 За
Ре без дів Тео їує 030 Бій фу Бе щіу бів Аа Рго Ага бен ви 35 40 45
Її тує й31у Аїв Бек Хегб Абе Аї1а ТВ об1у Бів Рго АброАги РВЕ бе 5а 35 ща
ОЗіу зЗев б3іу бег піу Тг а5р вне Твгобви Те Ї1і8 бер де во БІВ 55 а 75 що
Бго бів Азр о Бне віз Маї Туг Тук суб Бі біб Тує БЩ1у бен Зее Бра
За з5 ївроТве Рбе б)3у ів б1у ТК о фух узі іш Хіє Буз Ага Те жі дів аа 5 КЕ
АїЇв РКО бек УВІ Ре Те Рна Бго Рг бек Ар бів бів зви фує бар ще 158 525
Ку їпг дів бег маі Уаї Сух Кен зіву Аза Ал Ра Тує Бро ге БІ 158 і35 ї4а аіз їук узі бій Тео фух Маї Ах бе Аза їси бів дев 01у йхий бет 145 ї58 Мо о сій б бек мі ТР Бі бів Ар бек фу Акр о бег ТВе Тут ев во 1655 що 175
Беб ожак ївк о бем Тйг їв бе Су» Аїз Азо Ту" Біб Гуз Ніж ух УВІ 188 і85 ав
ТуУув Аза Сух піз Майї ТвРОНія З)б біу фе беКб бек Бга ма Твеи гух 195 588 КЕ
Заг. Ре д5п дсе пі біб Сух 218 215 кій?» ійЯ «5115 502 «2129 БІЛОК «2133 Цучна поспідоваїсть «20 «273» Перший поліпевтидний ламцює ТКХОЕМТ В «дах ЗОВ
Бі) ї3)іе чаї беу ТвВе бій беб рРго Аза Те о рец багоіви 5ег Рго б1у 1 в їй 15 бій Аг Айва Тео ів беєс о сух Або Аїа бе Біб беє Маї Аяр Аа Туг за а за б1у Меї бек Ре Мет Ап Тер вне біп бБіп бує бго Біу біп Рго Бго 48 45 ми їв іем Це Нія біз А18 бег дяй біп аіу Зег біу маї Річу бер -5а 55 ев
Аг ре бвг о біу бек б1іу бег біу ТВг оАвробне ТВгб офео Тве З1е бе
С 7а 75 ща бег івц біб рРго біз Ахр РБе д)а Уві Туг ле бух біп біт бег їу5 ще за 35 бій маї Ре) Тує ТВ вве біу б1у біу Таб бух у 61 Т1є ух у їв ї55 110 їіу біу зоб пбіу Біу біу бім біп узі біб їеи узі бій бег біу Аїа 31 129 1925 бій маі (ух іу5 рго біу Аїд бег о Уа) ух Маі бег Сух Ку5 Аза бег й 130 335 148
О1у Туг бБеє РКе ТВг о бег Тук ТеРр Меж Ахв Тер оУаії АКБ бій дів вго 345 158 135 150 біу біп біу без бі Тро ї1в ту Уві 116 Ні Рго бек Авр оЗеє біу 76 175
Тие Тер це А5робіп ух Ре губ Ар Агв Маї Тве Т3е Тве У81 Ар й їі80 і85 138 цу5 бвг Таб баб Тве діа Ту Меб біо ви его бег о Гец Агро бег 610 ! 185 аа 285 деротве Аїа Уаї Тує Туг Су« Аіз Агд бі Ніх Тує 01у Тиб обов вра 218 215 ай вне Аїз тує Тир о біу бів біу Тиг їв маї Те Узі бег бек Б1іу піу 225. 2за 235 748 суз Біу біу бі бій маі Аза Аіа Суз 610 Су5 біз Уві Аїз Аїа бец ах 250 255 бій у бій мазі із Аз івеб біб фуз 610 Маії діа азів сем 016 ух «ба Ба з7а біу біу бі Ахрв ух Те Нія Тбг оСу5 Вго Рго Суз Бра Аза Вго бів вух зва 285
Аза Азіа еіу бу бг Зег Узі рРає ев Ре рго Рго Ку Бго бу Ар 99 295 зва
ТвВгобецш туг Ще Тье Ага біо Ро бін Маї Те Су ма Ууаії Узі Ар
Зих за зії БЖ
Ммаі бек Ні бін Дер Рго бі) Уві уз ве дбав ТеРВ о Тує Маї Ар о1у й 325 за 335
Уві бій Уаї Ніб Ази діа бує ТВг Гуз Рго Агд бій 41 біп Тує Авп зав 345 з5а
Заєе Твг о Туг дк Маії Ууаї бЗве Маі ів Тк Узі ви Ні бів Ар Тер 355 зва 365 їец аАха біу вух Біб Тує бух Суз бух Уві ес бе іуя Діз ву бро та Зх ща дія Бго Тв 41 Муз ТВг обі Хек іу5 15 у У бів Рго ев 5
ЗиЗ За 395 за во Ще УВК Тук Тбг без РРО бро бек АгВ бів пі Ме Те Суб дей а: зів 5 зі Умі Зег ів Те Суб сен чаї Куб іїу На Тук бро ще Ар Ків дав СУ 838 ів Уві біз Тер ощи бек ап піу бів Бго бів хв Ал о Туб вух ТВг 835 448 що їве рго БРо уві ре) бо Боб АБО 031у бек на Ре фей Туб баб Бує
Бе 45 зе
Кен Тне ві Ахр бує беб дкв Тгробів бів 15 Ах Уві рве бев Су
Я зла 425 «ва баг Уві Меє Ні біз Айва іі Ні А5а іх Туг Те бів сух бег їву «85 498 в
Хаг ів баг Рго Б1уУ бух «В «їз 5 «йі» 448 «їх БІЛОК «ВХ» Штучна послідовність «зза» «235 Третій поліпейхтидний ланцюг ТАТВЕМТ В «Ой» 189 біб Маї ій бе Мві 40 бек біб біу біжу маї Уві бів рео Щіу Ага х. 5 10 15 чек іви ек ів Зеб Суб Аїз діа бег біу Ре ТВР ОБКа че кас Туг за а за
ТР мес ніх Тер зі Ага іп Азіа Бео бі бух ББу їв біз Тер Уві ке за 45
Те вве Ї1е бек Тук ах піу бог Акй ує Ні Ту" Діаз дзв бек УВІ 5а 55 ва їуз Біу йгЕ Ре їбг Уві Зеб агЕ Ахр Ах бег вух Ай ТВБ веб Тує ща ти 75 ва ін Біб Мет аАбп о бес ів Акр віз Щі Ар о ТВг олія Це тує Тує Кух за І дій Яке ТВгопіу ТК їео б3іу БгОо РБе ав Тук ТРр біу бів бу Тве 188 зяб що ів Ма) Тк чаї Зеб Хек аія бе ТвК обу біу РКО бЗеє Уа) ВБе бго м їх 425
Мец АіВ Рго бер бек оіує Бер Те бес БЩіу біу твР Аа АїВ іву БУ 138 135 345 бує іги уві ук Ахр Тук Ве рго бій бро Маі ТВг о Маї баг Тер ев 5 158 зе їж
Зек біу Аіа Мен ТВг обег біу Уві Ні5 ТВг о Бив Вго АзЗа УВІ іви БО 155 в 1975
Зег баб (у ба Ту Заг ви бер бек ув уві Те Уві Рг бег ке 158 Т85 за лаг ів біу ТвВе бій Таб оТує 16 Сух Ахп Узі за Ні Куб го Бар ї55 88 285 дк їве фу Уві Я5р ув АРВ Май Бі: Риб Кух бег КУБ АБроГує Тир 18 ей В
НЄ ТВе Суб вго Бей бує ВгО Аза го 43Ма Аза віз Б1у ЩІу реа бег 235 238 35 КЕ ж Бе фен рве Рг Рко ух РРО Гук Аза ТР фен Ту Щі ТБ АкЕ а зай 255 бі вгоа бів Уві ТвгосСу5 Уві ча) Узі й5р о Мадї хаг Ні 51» Ажр Вге
БО «5 кВ сі Уві ух Ре Ас їгВ Тут чаї А Віу ді 0305 Маї Ні Аж ІВ : КЕ зяа та5
Ку ТВР о Кух Рго йРЕ ТО ЩІ біли Тує дбп Берг ТВе Ту Ари Уа ВЕ
І 95 зиВ зве уві ви Тк Узі сво Ні бій Ав їКкр о беб дба бі Бу Біб Туг
За ща 315 зав бух бує Куб чаї бек Ап Гу Аїз ів Рго Абфа Рго Ї16 біз фу таг
ЗВ 338 аа їів Заг буз АЇв бух Ту Бій бго АБ Бі Ро бій Уві Те Те сей 348 3455 зла го Річ» дет Аг бій бів Меб їй бує деп бів Маї бер сви Хек Суб
Я зва 365
Аіа чаї су біу Бе Тук вго Зве дя Ще віз Уві Бо тер щи Зег
За 375 ЗО д5а біу піп Ро бій АБ Ав Тує бує Те о ТНе Реб Бо Уві бен Ар 385 38 зах зав
Зек Ар ціУ беб Ре РНе фей Уві беР фує івци Тнг Уві Ав Ку бог ах за ді
РЕ То щів біз біх ап Уві не баг буз беб уаї Мет Ні 615 дів ща аг 438 іез Ніз да ги Тув Те ій Куб баг іши бег без щеб Бго ім ух «35 48 ях
«35 ща «311» Бе «ХУ БЛОК «йї3» мучна леоспідовність хосВх ха73х Теетій поліпейтидниям ланцюг ТВІВЕМІ Є «звах ЩА бів їі мМаї бецу Тне бів бее бро бі Те Бей бек гео бек бро 31у ії 5 ї8 15
Зій йге Аза Тваг гео бев Сує А" Аія бек бій бе Узі 5ег аже 5еб а жо за
Ре їви біз Т"?б о Ту" пів бій бує Рго З3у Біб Яїа Рко Аг Кві ви 35 БІ Я її5 Ту 31у Аів баг бек Ар Аїа Твк о 5іу Їїе Бго зр Абе ВБе зер
За 55 Ба щЩіу бек сі Бег пію тТве Або Ве ТВР Оїецу ТР 16 беР Аке Бе Би 7 ТУ 50
Бр Зі або РНе Аїз Уаф Тує Тув Сук біп бів Туг біу Хек Зев Рго ща 95
Тер те вна бі бів Зі ТБ бух Уві 51) ів уз біх Бі ШУ БУ зва 385 8
Зег бі Бі Щіу біу бег Бі» б1у 01» 1у бег пів маі біп ізо маї 5 128 135 бін 5еге БіУ 61у бі чаї Уві Бій Вго біу АгРЕ бог іви св о фец 5ат яв 335 зе
Су йіз йіз Зек б1іу Ре тТпг Ре бер оберв Тут Таб оМех ніх Зтр маії ї45 158 і155 ЕЕ
Ага іп Аза Бо 53У Ку БіУу їв 531: Тгв Уві ТвРоБне їТі6 бек Ту 155 175 175
Ав БІ бек йо ух Ні Тук АЇз Ах бегб Ма1ї вух 01у АгРЕ РН Те ї8о ї85 138 узі Бек АгЕ ар Акп Зег бух Ав ТВе Бей Тук ен бів Ме Я 5ег 95 за 25
Беч аАБЕ Аіз бі: Яр тТВе Аїа Т1їе Тук Туг Сух Аза дРЕ ТВРОЗІУ ТРБ 218 ке 2 ієч бік рРго Рпе Ар Тує ТРе Ці бій 03у Тве фен ущі Те Уві ев 225 -3в 235 а
Щек ів баб вух Тут біу вро Бго Су Бго вро Сух го Аа Бго бій 2а5 в 255
Бе іву біу біу РРО бее узі Рна мео бле Бео БРо бу ВО ух Акр
Кк жах и7в
Твгобев Ту» Се ТР Аг; біз Во б3іц УВІ Твг бух УБІ Уві Уві Ар тт зно ях
Чаї бег бій 035 Абровко ій Уві бій Бе два Тео Тут Ма Ав У ява 595 зва
Уві біз Узі Ніє Ах Аза бух ТВг бух Рко Ав бій Бій бій Ре дев за: на 15 з38
Щек Тнг оТує Агро уаі Уаї Зегк Уві ен ТВг Уві ів Ні бій Ав Тер
І 33а КІ ів ав ФУ ух біс Тук ух Сук кує Маії бег Аз фу бір Бебі Бго 345 з58
Жан Хек бів бі їує ТБР ОЖ1і6 бек бух Аз ух біу біп Рго агЕ біз 35 655
Рго Бій ма Тут ТР бе Боб веб дев сів Зіб БТ Меб Те Суб дев
В 375 ща пів Маї хг оібц фег Су5 вів Мі уз 51іу Вб Тук Рго Бег Ащу Ще
Зав За дов
Аїв УЖЕ пи теРв об)» Зек дже (і бій Вео Що Ай деп Туб буд ТНК ах ща 5
Те орга бо У іФ; АЗо ве Ар бі баб ББе Рв із Маії бег Др іви ТВРОМаі Або вух Бак Абе Тр о51в бій біу АЖе Уві РБе бак Кук 335 845 445 хан щаї Ме ні ів вів івц міх ба Ага Ту Ме ій був яви ви 458 Б а5е бег ви бек фен Фу 5

Claims (29)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Біспецифічна молекула, яка містить: (А) один або більше сайтів зв'язування епітопа, здатних до імуноспецифічного зв'язування з епітопом РО-1, що включає домен МН тАБ РО-1 6-І МН (ЗЕО ІО МО: 86) і домен МІ. тАБ РО-1 6- О (5ЕО ПО МО: 87); і (В) один або більше сайтів зв'язування епітопа, здатних до імуноспецифічного зв'язування з епітопом СТІ А-4, що включає домен МН тАбБ З СТІ А-4 (ЗЕО ІЮ МО: 90) і домен МІ. тАБ З СТІ А- 4 (ЗЕО ІЮ МО: 91).
2. Біспецифічна молекула за п. 1, яка характеризується тим, що зазначена молекула містить Ес- фрагмент.
3. Біспецифічна молекула за п. 2, яка характеризується тим, що зазначений Ес-фрагмент являє собою варіант Ес-фрагмента, який містить: (А) одну або більше модифікацій амінокислот, що знижують афінність варіанта Ес-фрагмента відносно Есум, й/або (В) одну або більше модифікацій амінокислот, що збільшують час напівжиття варіанта Ес- фрагмента в сироватці крові.
4. Біспецифічна молекула за п. 3, яка характеризується тим, що зазначені модифікації, які знижують афінність варіанта Ес-фрагмента відносно ЕсукК, включають заміну І 234А, І 235А або Ї 234А і І 235А, де зазначена нумерація відповідає ЕЮО-індексу за Кабатом.
5. Біспецифічна молекула за п. З або 4, яка характеризується тим, що зазначені модифікації, які збільшують час напівжиття варіанта Ес-фрагмента в сироватці крові, включають заміну М252У; М252У ї 52541; М252МУ і Т256Е; М252У, 52541 і Т256Е або К2880 і Н4іЗ5К, де зазначена нумерація відповідає ЕЄЮ-індексу за Кабатом.
6. Біспецифічна молекула за будь-яким із пп. 1-5, яка являє собою антитіло, фрагмент антитіла, Зо одноланцюгову зв'язувальну молекулу, діатіло або біспецифічне антитіло, що залучає Т- клітини.
7. Біспецифічна молекула за п. 1, яка містить два поліпептидні ланцюги, кожний містить ЗЕО ІЮ МО: 99, і два поліпептидні ланцюги, кожний містить 5ХЕО 10 МО: 100.
8. Біспецифічна молекула за п. 1, яка містить один поліпептидний ланцюг, що містить зЕО ІЮ МО: 104, один поліпептидний ланцюг, що містить ЗЕО ІО МО: 105, один поліпептидний ланцюг, що містить 5ЕО ІЮ МО: 106, й один поліпептидний ланцюг, що містить ЗЕО ІЮ МО: 107.
9. Біспецифічна молекула за п. 1, яка містить два поліпептидні ланцюги, де кожний містить 5ХЕО ІО МО: 101, і два поліпептидні ланцюги, де кожний містить 5ЕО ІЮ МО: 100.
10. Біспецифічна молекула за п. 1, яка містить один поліпептидний ланцюг, що містить ЗЕО ІЮ МО: 108, один поліпептидний ланцюг, що містить ЗЕО ІО МО: 105, один поліпептидний ланцюг, що містить ЗЕО ІЮ МО: 109, й один поліпептидний ланцюг, що містить 5ЕО ІЮ МО: 107.
11. Біспецифічна молекула за будь-яким із пп. 1-10 для застосування як медикаменту.
12. Біспецифічна молекула за будь-яким із пп. 1-10 для сприяння стимуляції опосередкованої імунної відповіді або для лікування захворювання або стану, пов'язаного із супресією імунної системи.
13. Біспецифічна молекула за п. 12, яка характеризується тим, що захворювання або стан являє собою рак або інфекцію.
14. Біспецифічна молекула за п. 13, яка характеризується тим, що зазначений рак характеризується присутністю ракової клітини, вибраної з групи, що складається з клітини: пухлини надниркової залози, асоційованого зі СНІДом раку, альвеолярної саркоми м'яких тканин, астроцитарної пухлини, раку сечового міхура, раку кістки, раку головного та спинного мозку, метастатичної пухлини головного мозку, раку молочної залози, пухлини каротидного тільця, раку шийки матки, хондросаркоми, хордоми, хромофобної нирковоклітинної карциноми, світлоклітинної карциноми, раку товстої кишки, раку товстої та прямої кишки, шкірної доброякісної фіброзної гістіоцитоми, десмопластичної дрібнокруглоклітинної пухлини, епендимоми, саркоми Юінга, позахребетної мукоїдної хондросаркоми, недосконалого кісткового фіброгенезу, фіброзної дисплазії кістки, раку жовчного міхура або раку жовчної протоки, раку шлунка, гестаційної трофобластичної хвороби, ембріонально-клітинної пухлини, раку голови і шиї, гепатоклітинної карциноми, пухлини острівцевих клітин підшлункової залози, саркоми бо Капоші, раку нирки, лейкозу, ліпоми/доброякісної ліпоматозної пухлини, ліпосаркоми/злоякісної ліпоматозної пухлини, раку печінки, лімфоми, раку легенів, медулобластоми, меланоми, менінгіоми, множинної ендокринної неоплазії, множинної мієломи, мієлодиспластичного синдрому, нейробластоми, нейроендокринних пухлин, раку яєчників, раку підшлункової залози, папілярної тиреокарциноми, пухлини паращитовидної залози, педіатричного раку, пухлини оболонок периферичних нервів, феохромоцитоми, пухлини гіпофіза, раку передміхурової залози, задньої увеальної меланоми, рідкого гематологічного розладу, метастатичного раку нирки, рабдоїдної пухлини, рабдоміосаркоми, саркоми, раку шкіри, саркоми м'яких тканин, плоскоклітинного раку, раку шлунка, синовіальної саркоми, раку яєчка, раку вилочкової залози, тимоми, метастатичного раку щитовидної залози і раку матки.
15. Біспецифічна молекула за п. 13, яка характеризується тим, що зазначений рак характеризується присутністю ракової клітини, вибраної з групи, що складається з клітини: раку товстої та прямої кишки, раку легенів, раку шийки матки, раку голови та шиї, раку передміхурової залози, саркоми та тимоми.
16. Біспецифічна молекула за п. 13, яка характеризується тим, що зазначений рак характеризується присутністю ракової клітини, вибраної з групи, що складається з клітини: раку товстої та прямої кишки, гепатоклітинної карциноми, гліоми, раку нирки, раку молочної залози, множинної мієломи, раку сечового міхура, нейробластоми, саркоми, неходжкінської лімфоми, недрібноклітинного раку легенів, раку яєчника, раку підшлункової залози та раку прямої кишки.
17. Біспецифічна молекула за п. 13, яка характеризується тим, що зазначений рак характеризується присутністю ракової клітини, вибраної з групи, що складається з клітини: раку товстої та прямої кишки, раку шлунка, меланоми, раку передміхурової залози, раку підшлункової залози, раку нирки, раку сечового міхура, раку молочної залози, раку легенів, фібросаркоми, мантійноклітинної лімфоми людини, лімфоми Раджі Беркіта.
18. Біспецифічна молекула за п. 13, яка характеризується тим, що зазначена інфекція характеризується присутністю бактеріального, грибкового, вірусного або протозойного патогену.
19. Застосування біспецифічної молекули за будь-яким із пп. 1-18 для виготовлення медикаменту для сприяння стимуляції опосередкованої імунної відповіді або для лікування захворювання або стану, пов'язаного із супресією імунної системи.
20. Фармацевтична композиція, яка містить ефективну кількість біспецифічної молекули за Зо будь-яким із пп. 1-10 і фармацевтично прийнятний носій.
21. Фармацевтична композиція за п. 20 для застосування як медикаменту.
22. Фармацевтична композиція за п. 20 для сприяння стимуляції опосередкованої імунної відповіді або для лікування захворювання або стану, пов'язаного із супресією імунної системи.
23. Фармацевтична композиція за п. 22, яка характеризується тим, що захворювання або стан являють собою рак або інфекцію.
24. Фармацевтична композиція за п. 23, яка характеризується тим, що зазначений рак характеризується присутністю ракової клітини, вибраної з групи, що складається з клітини: пухлини надниркової залози, асоційованого зі СНІДом раку, альвеолярної саркоми м'яких тканин, астроцитарної пухлини, раку сечового міхура, раку кістки, раку головного та спинного мозку, метастатичної пухлини головного мозку, раку молочної залози, пухлини каротидного тільця, раку шийки матки, хондросаркоми, хордоми, хромофобної нирковоклітинної карциноми, світлоклітинної карциноми, раку товстої кишки, раку товстої та прямої кишки, шкірної доброякісної фіброзної гістіоцитоми, десмопластичної дрібнокруглоклітинної пухлини, епендимоми, саркоми Юінга, позахребетної мукоїдної хондросаркоми, недосконалого кісткового фіброгенезу, фіброзної дисплазії кістки, раку жовчного міхура або раку жовчної протоки, раку шлунка, гестаційної трофобластичної хвороби, ембріонально-клітинної пухлини, раку голови і шиї, гепатоклітинної карциноми, пухлини острівцевих клітин підшлункової залози, саркоми Капоші, раку нирки, лейкозу, ліпоми/доброякісної ліпоматозної пухлини, ліпосаркоми/злоякісної ліпоматозної пухлини, раку печінки, лімфоми, раку легенів, медулобластоми, меланоми, менінгіоми, множинної ендокринної неоплазії, множинної мієломи, мієлодиспластичного синдрому, нейробластоми, нейроендокринних пухлин, раку яєчників, раку підшлункової залози, папілярної тиреокарциноми, пухлини паращитовидної залози, педіатричного раку, пухлини оболонок периферичних нервів, феохромоцитоми, пухлини гіпофіза, раку передміхурової залози, задньої увеальної меланоми, рідкого гематологічного розладу, метастатичного раку нирки, рабдоїдної пухлини, рабдоміосаркоми, саркоми, раку шкіри, саркоми м'яких тканин, плоскоклітинного раку, раку шлунка, синовіальної саркоми, раку яєчка, раку вилочкової залози, тимоми, метастатичного раку щитовидної залози і раку матки.
25. Фармацевтична композиція за п. 23, яка характеризується тим, що зазначений рак характеризується присутністю ракової клітини, вибраної з групи, що складається з клітини: раку товстої та прямої кишки, раку легенів, раку шийки матки, раку голови та шиї, раку передміхурової залози, саркоми та тимоми.
26. Фармацевтична композиція за п. 23, яка характеризується тим, що зазначений рак характеризується присутністю ракової клітини, вибраної з групи, що складається з клітини: раку товстої та прямої кишки, гепатоклітинної карциноми, гліоми, раку нирки, раку молочної залози, множинної мієломи, раку сечового міхура, нейробластоми, саркоми, неходжкінської лімфоми, недрібноклітинного раку легенів, раку яєчника, раку підшлункової залози та раку прямої кишки.
27. Фармацевтична композиція за п. 23, яка характеризується тим, що зазначений рак характеризується присутністю ракової клітини, вибраної з групи, що складається з клітини: раку товстої та прямої кишки, раку шлунка, меланоми, раку передміхурової залози, раку підшлункової залози, раку нирки, раку сечового міхура, раку молочної залози, раку легенів, фібросаркоми, мантійноклітинної лімфоми людини, лімфоми Раджі Беркіта.
28. Фармацевтична композиція за п. 23, яка характеризується тим, що зазначена інфекція характеризується присутністю бактеріального, грибкового, вірусного або протозойного патогену.
29. Застосування фармацевтичної композиції за будь-яким із пп. 20-28 для виготовлення медикаменту для сприяння стимуляції опосередкованої імунної відповіді або для лікування захворювання або стану, пов'язаного із супресією імунної системи. До з а За ї івсе в-соні «Ше ц і Пюопізентниняй лемчю її сок «с Ше ання у жі і І й Ніниюл . Деожм ШОВ и Поліпентидний панцях 20 сосн ЯН рен Кеш КОНЯ Що ке : Н-сої денне і гвао кові ж Мне й Й г зівране діатню Мне вк Янь й З ск «МК дя Как щі с -щ й , ок ММ 7 Же Фнгура ї
МН. "ж ХЕ с ух ще щ не дах Кі с Й Н МПопілпентидний пенцех ск НН нс нн що сн; Фо і: М М: ії ЛПвеат ії Н а ГЮЕХ що М АМХ хх ЗК. ї 1 ЗМ НИТ ТМ КН щу с ї т МК І апічалтидний планую я Шо : Потмлалтидний панк є й Ї ШК ую і МН У і Зіобране діачию зо ЖК тм Каса з: Се;
СКК БЕ Є певне Міжхе о УК НК ОХ свед ве Не я З чн З
ЩО ОО МИ хх в ДИ
КЗ «ко в.
Но с Мн Ук З Фігура Є
БУ о ще скЖх «ее. син І х З не г ек Є. с НН і : БУ з Шия -о а сон КВ Я я ЧЕ Я Ше є : же а вн ЧИН З Мн, н Ще : ям й ск з НКУ ши чо шко ша дклвееннне нн Я Шия Фени м В ща пШНШ сши им - Ш що їх Мк с су Й у з ; Хровичнюєтьть. соді У ме.
Що ів НМ ох Ко сюм Квву, я с: ММ шо ет Й ММК пня згоду рай Мк шк шо жу Фігура ЗА
Домен но сирне УТВОДЯННЮ ТОНОМ оз пава ря спчвчо вай ще совно Й оон ВВ іх. Глен ланцюги 214 Лізи» З сені МЕККА ооо, й як о Й МНа ма ЗУ ЗЕЛИШКОМ ие МЕ кневн, ВИК спра сх Й . од . Фе фен В спря сх Й Мистяннові мно утво: патероцикУНВ Мене жещцщи ваних о БЕК нка склом оовюссоооо осо нос Лінкор сх, й. й іди аж и УДО. СОН одне Перо оікер з че опи фени М пиктавкоВих Б Запицім і Попінвитидні ланцюги 13 Ин ях ща в й мли НК ЗМ ом - ; я сехехи ВЕ ше Зх Біспецицична зетравалентна Бех 0 ООН Я денних ЩО чу вміве діла вавай сх доеневся ноу Є ник ля З Де ОСЕНІ чено 0 сжоеевья щ ; «Ах рве рекет зни Мне дет я». Ка: ч кн ОН Ег-демен 5 ше Де 4 | З Зеж СВ ння о аконненоннокй з с. дива МеВ СЕННЯ КУМ ЕМ ес ки КК ще 2 о зх 4 Фігура ЗВ хіх а Ми « дУЙ КУ МКУ ЖЕ КО хна М З КУ ЖИТ У т ЕМ НЕ НВе пос ЯЦІмяЄ НВ пи ЩЕ сих ХЕИУ
ТОМ. МИ КИСНІ зм. Хуст УУТКг й хз СЕМ Мих «Проти : евхерютх і НН т ер У хх ШИ рн й кв хну чт, ра ; чий «НІ к ше Кая Б Х КУ сн КА х У хо і ка Моя у Ж У КІ р; З я ши и що -й ЦИ се КУ З СЯ яп у сеож «Шк з Я : Я спец ВШ ї упо і Ї що х чі» АД ТМ, І ха КО ; Шу Ях І 3 УК сло се Хр З дей іа леж М ко су у : ах Е; «Б 5 | Ще дк жу о ; ки зе хну ех я З рай сх жди сх КАХ М. ХХ К ДУМКИ и У А МК У «А й КК м " пе Бе «ШИК .Є Ки Сини «в а а я ї МУПУС Те пи я и ВАТ т жом вв Я У Цлье, СКАН ЗНЯ Я Мошеннй М Чад Наче її МУ Зх ша ОС їх « ет пою ФК Не ска ся с ка ОМ ГОЛИ уд р сю Меч: х жа зона СНИ ра у хх хощк Я Ж ах ною З М Ні це сова м ІУ З в а я ха, 5, ОКО Е оо Ка Ех А що Й У о ня КН М ЗМ КАЖЕ куми, й КУ ЛИ МК: У ПАХ ДН яв ЧИ см Рава УМХ 5» ї Бе ША вх щ-ах ЖЕ у в вав СОЯ М х мч чна ян В х т хо хі т ОА З ма 0 кнура Фігура З ум мусив ще Мк Полеантиднии навіює З Ед !
ПМ . ; Х оо даже. СЯ ков Ме У о с ФОСДО ооо пава ча Е: ка КВН НН: ПІН мами Є сом томи КИ С, еко дюоокюо ооо Пічне | вв ооо юною й ! ВИХ ОКОМ Не Я Гн ! і див В ІЗ сою АКВА ОО ОО ТМ «ВЕК Я оккхкккК УКХ їх -е Н ще с су ше кН й УМ В І Гехчеитидний пани Шоннй ПрквИие 7 шк і КМ М Бе ІЗ ПНЯ й я І забої ЗА Я : й й ян Н Кий і у Н МА ї пу Я Н ших : : х ММ : ПОЛЕ ИЗНИЙ МВИНКН Я о ебов шо Пічкев З ! й ХМ : йо в, щ ш ще х снх Квест» КО Ї І х ї екон М маю х уки ма З Зіббане Речаміюне даті (вероя БМ "ер Ж ою вадах «КХ 5. М Ох ІН. ТК ї ЧИН кн ОО в ЗК. х т су тні ха сс ским вн а фа ши БО ех Фігура ЗА
Лін й «вх певне ЗИ сх су у а Я Н І мумійо Не НЕК КМУ о А ОГП ТИНИ ПЕНЦКМ з уххххх со Н й ссМХщ-я ДАВ «ххх Мо лк Н с У їх 1 х Праве ї «МИ: НН і їі Піншва сі 1 ДИН і що ккал «В ОО - і ФФК «ДИ рен М ТЕ мя пбоусаох ск Ух їх Ко Полив тсиамий пани я 0000 нашу я БО осн і іа ке; ВСЯ і КО і ДЕ, І ян Бінцвче З й Мо яко ее І Поліпентидний павнює З о сх КН ВЛ ТИДМИК ЛЕМ о КК» АК НН ВХ ек Н ти: СМІХ. ооо ХЕ ПМЖ ОК Шк в ; їі : : й бен Комона дна СОЯ Му наксвке кет» ов боже бю ко Ше Зо ев уунех КОЮ КВУ КО Ке сна Ох.
ЕК Кв КК росою, х.
СЕЖННВИК Є сон В АХА моти ту НН ня й я У оон ЕЕ уЄ Па и як ;; до о НЕ ід, ща Фігура В
Щк МК КИ Поліюгтидний ланцюг З сечу «ЩІ Й Хан жа нос щи ФОКК ст ; Полазеттядний тему 1 ; Ві Ше; КВ М, ча ьо хо о 7 ЗИТИтує ж : Ст есе со У ЗМ» ха БЕ Поданий песен погіпацтдняй пакцюж їх хи УЦИлк, Не жі чех ОО хх ОЦ дя ач НТ» ви Ко» ря р; СЕЗ ТА й у трхкреммеєту. т г ще щі Гюнт иадниК МЗННЕЄ З С ск ж щих іно ще я Жди ака я що ОХ КВН «ДВА» кв А ня аа в "ке ! УнХ Шо сен Ум: ЗК поніеетядний яВицюМ ДО пику ТА СЮ я І ;; Ку бля Н : Ос саму МАКИ ! шах Є мм І і пана , ув яю я е тю юю в ж юю в'я ж я юю юю юю в'я ж я яю тю юююю. Сеня ; й вк: дак МН К пе УМ Кі й Я ке ни яд во А ОБ я ЖхХ ШО тож о УК пттуром ту щ З НЕДО бе ла ки МАМІ: ЗК х у Зо ком нив НИ я рок їх. ще ти мож КІ У и, їх є що й що есеелннхх ТК, шим пою с Зх се ЩЕ і КОЖ одне СЛ СК в. сх БУ ом Ше і Уа в в щі Сеш ще Я ЩО МНЕ " іме й х хм. ; х Фігура 5
КВх ами ЖЖ Перша папі явниюх о "од хек КАВАДИ ог УМ І: Ше УЗ и осо оку, М : хі о М ДИ ре пав З х се пло коле Я «ах Дена помнвилицний памцкк Сея ОХ ДЕ вк ке Кия У пою МОНО реа мк ВЗН п ХМК ХОМ к дово МН до ; товки сни КК ВО. й Третій гани тидмий ЯеМНЮ С й Я, І й ішенцка СИ: Сх МАТ ВО ово сні СКМ се З Ше ця КО, ОВ В ЗКУ ху бос о що ОМ из я ке С й ЖИ УКХ КЕ пк Ж - ХВ.
УМ тк "5 ча Е 7", кіетварі в пом тяни я ЕНН ОС ння То Дах доми З УК ИЛуюценг ха или ; Оодеумк Мк зи АХ Ше КУ - СаВА сх щи аа А ц сих АЕаВКА я Ох у КМ из МН Ех тез хо й ОХ Оу ; КС о В Ко М й ЗУУКИХ ь ме Ме Ме сх, ж, Пенн МУ Що ооо ку г МАК Ме» З УМ Ки ЖК може сві Ме со Й ИН я пана ННЯ Ме з КЕ я Х ОМ Косюк Я я ПК, Я В Ям - КК Ох.
ОТАК с УК, м ! Ши і ОБ Духа ме жоуваеми За 3 й» о ЗУЦКУМ ДИВ плн ОК . на ! тма СКОВ мн, і ва нн У Фігура пд анн, У юю їЖехви ю ф вок - Х ох КВН НВ Цоою ХНУ ЖАХ «и х ОО : ем Мк З т. у «З кл і КО ще см МИ : ТЛАЙАА сх о в У ; МИ МЕ гм, ЦІЙ мис зо гаму Й З кА Гівриней полінеттюня пеня дик НВ ну АХА есюн Кк ха УЖ КУ х МІ ех х Покжвї шок ве в с Зх ПКУ ик Си КК КМ За. о ши ОО ря ха ск ОККО Кк пок Догчи попеюлтидиий З ИЙ ЩО ПОДЧНЯ й сві Мо вд, й навциЄ ТЕН гкЗК ВТ ми КК поки піщрнна ХАО Ж МУХТИх я Киї За У ЗК ван Ос КО КОЮ КМ КК и ме МУ МАШИНИ КЕ ТУ кщ : «ролет а ї пли КА не ї ! й ни ве : м ї Н "СК. ІЧ с х: я. - п3, що 1 Я ЗО 00 Мей поінентааннй ванумю ! : М Я
: у. Н Н М У ! я і Н Н па КК КК : Дюжокавізузакем я ОКА МИХ ооо 000СКМХ і ЧИ ДВ о сні ня мат я а о ОЙ ЯКО оон ме фе Мо Я пов Ул «КЗ на СДН КШ Кх Й СКК КАК В Ат «М пивни МОВ джу НЕ нев х пір нон МЕДИК ЮВ інве кх Зехеке» сайщ і ЗУ А ОА Зх іо Ма МИ ши Б С У Що СУМИ беж 0 Б Х ЖИ б Ж Н ОВ Хх З Н Мао ух да : ММ ТУх шк ж : у мк Са нн і : : фимосе межує еки ха тип дива гу Вігува БВ
Й Пед МЕМи укОуКОМиВ ДУ УМ пюУНІВ. мі пору Я - ех й УМ, КМ ХК У своем сич ВААВКЯ й я і жен М ТОК ОДА ДНТ «щи в НИ в ВО сок дай дд г Ума ми Н А м ялех «МКМ. вок хохну ссоссо шИМКХ» ях о Щ о МИ ра НН, сеї ся й с оо Ман хо Кох - ММ ни ПА ВО иа КК. д ДМ Я ТИ сну ММ С екв свй ї КНЕ ВУХ Ка ох Е Й ОЖМОУх, її пк я че дб пирик дощ х зе ГУ сен о УХА Е С: КК й ФУТ За чі дн «ее М Б.
ї 8. в КИ ук Н М : ОБ суки хх Н й мкм ще Н УК Момех зккаувкнняих Я ОО хо сУхУюККІВМА змеа ОКО оо йкодиюнх ЗИУБИКиХ З УКХ
ДИТ. М да А хакад З 5 ЗБЕ хх и сю пес ПДК ОА Кн задала г Яги Б Ох ИН сцх ОБО В с ДИ КО Ми о СС НЕК ВЕК оон ве ЗМ пух Ха Ж хи ни бив АКОМ 0 Щи сни. ВКМ у смі СМКХ Ту х шик Ж : х З Ж БО Во ту З о. 7 З ет ї М, доме Замки Н Ше ЗЕ ТУЯ ВІВ оснляннянняї чн. пк : УК шу се : ЗК се, Фігува БО о КБадучюк ВУД ЩЕ ТАКІЙ дівцяВ : посох «На ся я х ч ак Кл Хом, те У Хм м тд Й п оо: днк ку М. осо сі ДЕН й рН З КК стен 000 СОКИ ню КО КНТУ. ВИ о ем КБУ Я Б їЕ ОКХ ОМ хвала а БОЖКО кою ія ЗАИНК. Ж ОК ВО плин
ТА. м ДАН яЖю ж ней: ВВ ще НЕ ід. о "ом: І о ддеювювь, днини ес « ее МБО ; їх я Оу Юм яса КЗ Й ОЗ У ооо й М ті А гум ан я Н Ух те З сх У НЕ вух і Х й ко Ж М х ех Я СОЯ З». і я здо : ОО ше ля жа ; На Ше пе В і МЖК он додени то й ДУМ ММ М ДВиИПОМ ЦИХ свігУ : ігура БЕ ой ден ЗК иЗуюдихУ ЗА ТИ дих у пам Й и Я що д-к ПАК З о АХ со х жд 5 кам ХОДОМ сю пожи З і я ОО СО. кхдк 7 МК кре МИЗ і ке ру Ми й ІА сужж ТВ х А Н й Ук я ДИСКІВ ЗЕ Пюдже Ох хи жахи КК ОХ хо ее АН ссхВя я «ве 5555» х о УМОВ - с ОО ХОЖНЕ ЗУ й НЯ хз МЕ ОН ся Н НУ ІЗ хУ Х ххх Н х я або : дн лозу : ІК Й : 1 днк ую чтнннкх гігжхккі ЩА Дюк: жу куєник коза сих дол Фігура БЕ п- Жах КОН ВІНИМ тк ВІДНИХ ДЕ яв ВВ вкпую у КАК майя їх жамслюхо ї їх кв КАВА ВК. Ж Ів. й КИ: Я ЯК аг І ЗШ АЖ х ІІІ, де зт НЕК КЗ ПОН ж Я я нн ши НІ ОН ОН Й З їх 1 МІ Е ЯК КЕ яв: ЖЕ ТБ: КУН шує Не ВХ. НЕК ще Я: пе КОЖ дани В: п що пк сади ек МН ВЕ В В НК В а ВТ о о у но ВО МУ х Ж ще сх х й з х ся « х - ЗІ Ки КО з - Ж а Я ги г й ей Ка ої ще КЗ - г: ж ох ся Кей хо В с я «ї т -х У КЗ Б х ч ще с Я дО ВМ ВМОАКТ Я ВЕЖ КЗ ЛК КИ АВМ ОБИТ ВИЙ Ж ТАБ НМ АВ КАКЯ А ЩЕ ПИ НЕ ЯМ МАКУ Є ВЕК БОЮ НМ ВАВ т ВК КОЛИ ВМ ПАМ АВТ З КК М БАК НЯ АК ВК
Ж. Фігура 7
Звазування з іммобілізованим СТАВ
З. ше вач в я штеА я тлВ ЗАВ Щ Й Ка ее БАБІ В ух ках 2 я ев ме І | й й єв ТВ ЕМТ А а кльни й Я «ве ВАВТ В я І й Ки зах Е я І я ЕЕ і не В Ж й Я ллллАнн х практ їла як заг їв" іа" Концентрація (МІ Фігура ВА Зв'язування з Мммобінізованим РМ Бехта тя шахів? довід я -ке ВО-з АВ В ЯР не і Я е ПАТ В - М я сан ТАЮОЕМТА й і КД ке ржВт В пйдхій | у А - А 2 ї х іважіхонцентрація, НМ) Фігуза ЗВ
Покомття ПР ЛНіВ С шкг/млу детектування Богучпеацифічних знунті кози проти імувогпобуліну людини СИТО забвовая ї -е ПАКТ джосжес - АКТ 3885852: дня І К же ВАВТ Оовеооев К. зесоое К. ї кфонновоооогнюгоссоргососоковосоотееермолоссоогодосоовогзиоегоговсесегегесесгв з Но в і х ібоХ концентрація ВАКТ, нм! Фігува С Покриття МОСТА Я АУЮННВ ГЕ УВА, датактування Кохеспецифічних антизій кози проети імуноглобуліну людини СТО заз І -а- ПАКТ В дрнн Я ЗАВТО тування й що І и же ПАКТ о т зага: ' є У зво Н сх захв: я а -ї 3 ГУ 4 ї ЯБОХ (юзнивентрація САТ, ЯМИ Фігува ЗО інбебування зв'язування РІ з іммобіпізованим РЕМ ажминиНнья мав 4 мн оте Н й У ве те Би АВЕШЯЕ рвой і Зх ЦЕ вно я тео ват о ВК яке тцішет к завод» і-й ее КОНТЕНТ МепеКУта ТАНЕ Кк ал 2 ще 7 івожіконцентрація, НМ Фігура ЗА Іннібування зв'язування РІЗ з іммебілізованим РОМ і ТЕКА (віднецення дабавех ше пф фркккнесфратсоддреттснно сх У вп пав ОаВ - «й М вав аг 5 ве вВацт в Йо нео ; Н че ее тапжнт а тво8З і як же Коютропька моалекуна ТВНЖМУ ка З ЧИН -у 1 й 3 Х івсрчюзнуєнтрація.
КМ) Фігура ЗВ інббування зв'язування БУ з іммобізаванимМ СТА зви ! п и, зни Ве кота яв Зах й х й у, ее БАНТ В в і У х я твіимт ох З | і і" ей ТА тАВО ЕК захій й : х яке Комтрольне мепекула ТВА у М івдхіконцентрація, НМ) Фігура ЗО інйбування зв'язування 871 з іммобіпізованим студ ЯКО (віднови зах я ху махати й ч х че прин ення ж Гео) У Я з В і я факто Е захв? КУ що Йо вила й го ї х ме і ще у ія т су жАВІ ТИХ ши ке х яке КоВтреньна монекула ТОВ і Е чо
8. хе ств ИН
ТЕ. -1 У 3 ї У ізхеюонувнтюація, ВМ! Фігура ЗО ін(бування зв'язування 87-11 з нмобілізованнм СТА РЕНІ івідношщення НЯ) їхав і зх і я Ж не З о Я Ще о Бе скотукту А ІЗ їхраї ; х ее Кочюльна мопвкула ТАМ о вх ч чо - «КЕ не. ЕУ З 3 3 івдрчкенцвитеація, НМ) Фігура ЗЕ
Зв'язування з ОТеЕСТ А ЯЮНО НННЕ» МБО сан стідя тав -е СТА АВ ВЗЯВ 000лолоднннанняй ох век я ее ПАТ В Шон чнев докт га й же ВАВТ / рай УА й --е ТВІОЕНТ А рей Ж З те ввО / й 20006 / БК, й й вет дос й 18 зо че" Концентрація (НМ) Фігура 10А Зв'язування з НОСТІ АУСНО ТВО др» СТА Я АВ е оре штА-я АВ З ЗАВ и 40000 в ду он -- ВАКТ мов з зааван ен ВАВТ У уд я ке т -- ТВЮЕНКТ А / і ВО їх ї ак Х апа тє мідо в й Шин жк Кі я ок зво: ЗБ в гай й й ек КАВИ Алл зо ск б йо Кк кн ни та за заз Концентовців (НМ) Фігура ТОВ
Зкязування з клітинами дика Ам жабо І зе я де Р яв СтАЯ тав Фо 2ооовяі М ков тав дя й ! Я жу --к ВАВТЕ Я, «де ЗАВТО звана К; Ж МАН ! Ка У СТА ВАВ ОТАА ! сонна Ми й Я ЗАКТ о г - п Во їх оного сосни кни їв та" а? тв? Концентрація (МІ Фігува А Зв'язування з шитинами вика СТА вавват Що 4 ди ЗНОВ: Що Я і і й ее стіАя тарі У ! З Ж їх Ж щей У их дз З зво Є; ї Я ОвБ.ї АВ ая Є ! і / -йе ТВІИЕМІ К забав « й у; ке Туя тав ЗЛА М сс но же ВИНИ В ЗИ ИН за з р Ей Концентрація (НМ) жгувра В
Конкурентне зв'язування В ЗВО феоюеюннй, ; - і Фоосоюсосо те т 5. зн: в: о «ке ДТ я тав а ов ух. те пт вав) шАА К | х х я ПАВТ З 8 ! Х ше вич в не.
У х ; стенів імергативНИЙ кентретю) Н ан о ЕнЯах зрорівввня зоні пово зон зно св зав же яа? а? зве Концентоаців (НУ ВИ: 10 неви ек я К хх ; Фігура А Конкурентне зв'язування ВУЄ звавт 3 ех Ше: КЗ Ї 15ОВ що я СТІ А-Я АВ ЕФ) У -в- Стій а тА біда хх Е м Ко трюАУ АВ АКА з 18 М ! ж тк АВТ В Б х о ТАЮЕМТА Ж Х Я «ек о яв: Б же вівО (негативний контроль) я я яз я зано Но ямі В: 1188 уми Фігура 128
Бепортевний вналів блокування на клітинах Дика СТАВ авеоя 7» СТА Я ВАВ У ОТАА ро КОР ТАВ ВАВ шк КУ і ее бАвтТ х Ї же ВАБТО Ж х я ТВЮБМТ А ре ГУ зе віра й а М 48оз Ще Я « Ж о Щи Я пен си пн МИ 148 13 чат за: Концентрація СУМ фура "З Зв'язуваАННЯ З КЛІТИНаМмИи МОЗМ зво64 ВО тАв В пав ; й пе н щі т зва дні печені - ТВНЕм А « і а Ве ТА ТАКІ ВАВ 8 і я й 488 КВ їй я і зи ОКО дл. й п СОСНИ ши и ни ни а З з те тах Концентрація (МІ Фігура 14 інпбування зае'язування ОА хоФ8: : г п я ни и Ж з505 ши ше ше х «ве В.Я Ав шар В не СТА тА З ЗТАА В 1 х «ее ВАТ В гу Я ТВЮЕМТ А ков хх Й Со ссооляви.
НІ іон зн вк хек зх зиму за" та 1" їв че їв" Концентоація (НМ ФНгуза 15А інгібування зв'язування Ре 10805 є й а ЕК ШИ ши з ОЦЕ й ч тк З -е вті фтАВ В ар 5835 іх щ Б СТА Я тав УТ Ад г НН» хх -ае ВПАВ В х в ее ТНЮЕНТ А пах У й а м реннненнсрессннчронненнноннересссннння ВВ пе о зд ї з їв за! за Концентрація (НМ! Фігура 755 спюбереджювана СТО вктиваців івана на квітинах МЕА ТЛО З Зиткай т82а5 й чу Н шо Ж в'я В М хе ЗКУ і Сон пис Ж ВО тва дав й і. і р й І о сов 4 ! 5 ей СТГАЯ МАВ З ТА
ЕЕ. : йо х ш
К. ! р -е- ВАВТЮ в І ай я ТтВШЕМНТА В і и НИ їк 55 ік нні п ни: Зк НН за яд 8 кОнценТиаЗц НА «Фігура 16 Клітини дій СОС ЕС З ОВМТЬА Я, клон я З Згоди запо нк репо «веб Й рак в кп ї ра Я Є зовюо й О000яякн Негативний кодтроль щ «а Твен х кову в --е ЗАВІТ З ков во не в вв вик а у УК ТУ Р У У УКої уз удо? талії 33 яв зд Зк 1 днтиию ПУ! ФтУува 17
ПОТУ АВС я ЗУ ТЯ СО Ткпітини За» сх х Е її У я ВІН» ЕХ зх ам КЕ ТЕКУ те ЗХ ек чий о с ох їх | ї і | «В ще.
В. чвпзя НЕ. я 5 Б ВХ КУ їж ОО ї В У їх З З У | пен || А он ше ННІ с з з ІБК ІЙ ше ШІ Я з - Н з І Х Й «Є в М Є яМ що уз и НУ е «с я С «ж З Кк е ї2 о ще й «а ЕЕ ях ЩЕ 7 У ши де З Є КУ К й що Ф «т Кз Концентрація БМ ОТО ТОБІ Я ТВО Фігура 18 я х з Енея з18.5 ! аб -3 Й . БЕК 4 пн, наш й - єм М -4 Оу» тах «Коти ОЗ А цк од АК з жк о І Є мм Кс У УААН зн зн нн нн нн вннннн Не ПЕ ШИ Ка : Ху кеш з Я ТКА Ух
З. ях СКАН: ; 2 з а КО ОБО ле - ї Тувжии о, З Б наюч м-н жк Киеві "жухччї З мк кни не п засос: зво сплав тю мссасо» звоммввис за Ше с кх т Я ге. за за З во режннію Фігура ЗА тА я 2 » сор дині ек: ск ї хх мов ям, а З А Он ке . Н сни 000 ЗИ ОО о ВАДИ «У ж ок ков НИ - Овни ИН ї в ей З скан и Шк : «МОЖ Х Н Ку ЗЛАК сум: и сккіжкккю м ЗОМ, Х Й стаю. З З ее ВИШІ о суд их в ' НН мое а ЖИ, ІЗ : З Сей КТ. Ко оо хо хх ВІ «Ж Ух лох х У Б - тя ТИ, : пої й і . п ме т, х не зи киа ши ниви винними ення мини ники кі жим жи Ї ще: Й ще «у щ ее: ІЗ З за ча ВГ | Х сх ; нн Фігура ТОБ ок СТА Вивільнення ІМЕху чар а год Стимуляція ЗВ, БО німи ка зук 1 ве ом і туз ВМ і я щ- ЗБ КМ : | ях ме ан 2ко ех у ах ва пх : М Же З к же о0а нм Е В З, ще же ВОМ з Ох | У. КЗ ЗО0бІ НМ самі ВКА КК КХ Маки Я ЗЕ УКВ ЗХ ПЕК ох ОО КОНЯ Я В ІСІ ОКО ЯК Ж КОВО ПЕКИ З СЯ нах ВВ САКОВОЯ ОНА ОО пе Ве 5 ше Кк ЕМ ПК на ВИР О о Оп ен а В ОК Веоевюваню ПК У ВВ ос САН КАХ В ї о ї МКК ЗМК ВХ ОКО т ВКА ш ОО КО зле йо вне В
К. ук т. іже У. « ща Й й 5 Ей З о С СЯ С Ж Ф щ що а я щі жк гей х С КУ х її й а Ф ши Я и ФгУуза 9
Аналіз вивільнення інтерленкінух 1, чі ч 4 С однМ « за56 и ! НТ ЩО ем Я хна х. ху як ОВ КО КО ТЯ сх і БВ ЕКО КО ШІ ш.
І щш щ ой КОЖ НЕ: ех ВНИХ МОЗ І ВК Му ОО ай ЦО у С ДЖ. у у мо п ; ж х яв р с: ж: кис не НН НН Ко Я ях з я" Ф' ру а й х чх ще ще щх я я ри З «7 ж ой Си М з; Я ке з АК є їй п З х я Ще Ж Фігува 150 Збільшений піст Т-клітин чай ЗИ СИН і іс ї я жан гз х З я Що зов- В | пере й ї З зав Н ; З а г 4 г х і Б ма с я г 4 Же в помоднною Кай й г м пи й і ШИ з І теж 2 з ном зн нн Ка І, - ще ХВ нене у: я ее Кк я а ще - Я Ко а Я й шо Я з й «У ще ех ще що шк с «с Бо Фігура 20А
З й й п : п й щНк- отв и шк і Ве ВАВТ О (800 мак) в «в» ни че ВАКТ СОМ мкм г ' Кб ко , . ОЯтЕе те ПАКТ ів мкуки ї а діра флкюньк й Е тв ' Бо зе- Наповнювач 21 - ї зо) вах 28 за
4 р. «фут уучттрет у кун кт ке речі т хх че я за 35 35 35 40 45 Доба даслішжень Фігура 208
САНВТ ОБО мек таж тає гввах щ -йе павяє ї «ее БА З а ії -ке пев З зве т. й тан 18585 т я В, НИ я вв їж щ- ех З о ві 5 і 3 а 5 ен нн нн мин и мм З В 306 зве Зао чва 50 масо Фгура ЛА САН ОБ мюигко є ее і1вБяВ во ча я че А і 5 га Є вояк Е за. і З ес В: «фе 115555 Е 1 зе сх З й Ж фронтит рення з че запа зе дез 305 Час тоді Фігура 218
ТАКЮЕМТ А, Я мелкг 1875 ее 855 1354 от5552 -к 0000 В оо й х ще : я сей кл, зей | В 5 « й а ох ее: гоже КН: сс см Я яз х Ух їх «ви З Б Ж й ! 5
8. й 3 М Жов з Сі
Ка . м "8 и ня нні зона нн Бо зав аб Часів) Фігура 21С Ліюфоцити нини ше Е | т Ком тзюль (йо) і | ТОЖ БО меж ВАВТ 0 пев) "й во ТВ може ВАТ 0 (леді х ! яй ит Ай І ше ек ВНМУ д вв ій 5 дян мо дн Я Зм ТАМ А ге їх ВОК дж, й с бури Кя ЕЗ пок сни я шк що ше й їх Ши і Ж пов й х КУ й З З 17 34 т воідова) Фігура А Во Пімбфоцити - | й око Контроль іпел З і ; -- ши шу х жання х і: їв вх. ї В ояеяйе ДО мот ПАКТ Й (пев я ЩІ най НІЧ х :. ду и я с. обои нт те ТЕ мс ОАВТ О (пе)
Во. акт ха лей же яке бле ТКУ А пе) із ї ; й и ОЖ : у У ї ; й ке Я її яв КУ ж й х 3 ї В т щ- А 5 ве їдоба) Фігура 2
І Зайнатість реценторів ма СО монтинах, БО меле Ку Конт М їх ко : ; 5 те а МЯВО4, труна 1 я ШІ ру а.
ПОБЕЯ, прут З т ; - теку ї и «ИН І Ж а п ід АВТО Фо лава ее вон о о С оо ска х р, ва ссени й оо -к НОБЯЮВ, група я Е в . : «во ІЕВК, група 2 . Ж ве А, нече НТЯЗА?, трупа Х Ек 8 ; я ПЕОЄ, група х В Й ик еететкттснчтккух Вес потеєнкм в У НВБЕХ, грука 2 т Б Ре вості бу ІЗ ВЗВВ, група З В » Же Ки я ще в У т х часто Фігура 23А ж Зайнятість рецепторов ма спе клатках, ї Та мМгду Контроль В 5 | ах МІШБЯЯ, група 1 5 Ж ев за АБО, труна а 5 ча ще АВТО Ше 0 ДКЕОВОВ ооо оуодоююют сн «ж ДБАВ, група З Е в і ше рон мав нов ВХ я М ВЩАВ, група 5 Ж ве то МИВКОО гиупа З В ; М нв557, група З З ан НН ви КН й тах НОВ, груди З хх Овен в ВК осссолону Я» ЕМО, група З ; ШИ Ме « вс с Ка Мас боді Фігура 238
СІЯЯКМИУ клітини БО мкг Контрил» а МВВ, група 7 ж за УББ, грука во р ач АВТО З но З вс Й р. «й РКНМБ, група 2 Яков сей пн но я тав М1ВВАВ, трупа 2 в р ; ке ПВБЯУ, грува ща зве що ям ННОБА, група 2 ФУ Й ще УА дденянннсня В «у МВЕКЕ, групи 2 ! с ши сн «ве НІЯББО, група 2 м в В й ек о ще Фе Мас (год) Фігура 24А СЯ ЯУ клітини тк мгй , вах ге мок Контроль І А ха ВВА, група З ж і я жів, -В-НВББЗ, група / Мов вх б Щи щі ри Хм ри сн Й «к- 118558, грула З й Ком нн а лв- ПОВІВ, група З що и і «а МЯББО, група З МО ща ти ши БОБ? трупа З В ння пн | ЯМ ІВБщи, група З д'фонтюнню нн нан нні ее Мена, пен З й Кк нс я ЕЙ чЧасітоді Фігура 248 0 КомпютернаверстаО.Гергіль 00000000 77 дп Український інститут інтелектуальної власності", вул.
Глазунова, 1, м.
Київ -42,01601..-.
UAA201806826A 2015-12-14 2016-12-12 Біспецифічні молекули, що мають імунореактивність відносно pd-1 і ctla-4, і способи їх застосування UA125611C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562266944P 2015-12-14 2015-12-14
PCT/US2016/066060 WO2017106061A1 (en) 2015-12-14 2016-12-12 Bispecific molecules having immunoreactivity with pd-1 and ctla-4, and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA125611C2 true UA125611C2 (uk) 2022-05-04

Family

ID=59057441

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201806826A UA125611C2 (uk) 2015-12-14 2016-12-12 Біспецифічні молекули, що мають імунореактивність відносно pd-1 і ctla-4, і способи їх застосування

Country Status (26)

Country Link
US (3) US10954301B2 (uk)
EP (1) EP3389714A4 (uk)
JP (2) JP6955507B2 (uk)
KR (1) KR102424513B1 (uk)
CN (1) CN108367069B (uk)
AR (1) AR107781A1 (uk)
AU (2) AU2016370376B2 (uk)
BR (1) BR112018011781A2 (uk)
CA (1) CA3006462C (uk)
CL (1) CL2018001545A1 (uk)
CO (1) CO2018005932A2 (uk)
CR (1) CR20180318A (uk)
EA (1) EA201891178A1 (uk)
EC (1) ECSP18043564A (uk)
GE (1) GEP20217328B (uk)
HK (1) HK1255039A1 (uk)
IL (1) IL260021B (uk)
MA (1) MA44082A (uk)
MX (1) MX2018007089A (uk)
MY (1) MY196756A (uk)
PH (1) PH12018501220A1 (uk)
SG (1) SG11201804839WA (uk)
TW (2) TWI758267B (uk)
UA (1) UA125611C2 (uk)
WO (1) WO2017106061A1 (uk)
ZA (1) ZA201803472B (uk)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10201913303XA (en) 2015-07-13 2020-03-30 Cytomx Therapeutics Inc Anti-pd-1 antibodies, activatable anti-pd-1 antibodies, and methods of use thereof
GEP20217220B (en) 2015-11-18 2021-02-10 Merck Sharp & Dohme Pd1 and/or lag3 binders
GEP20207174B (en) 2015-11-18 2020-11-10 Merck Sharp & Dohme Ctla4 binders
JP7058219B2 (ja) 2015-12-07 2022-04-21 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｐｓｍａに結合するヘテロ二量体抗体
KR102424513B1 (ko) 2015-12-14 2022-07-25 마크로제닉스, 인크. Pd-1 및 ctla-4과의 면역반응성을 가진 이중특이적 분자, 및 이것의 사용 방법
EP3432924A1 (en) * 2016-03-23 2019-01-30 Novartis AG Cell secreted minibodies and uses thereof
US11542332B2 (en) 2016-03-26 2023-01-03 Bioatla, Inc. Anti-CTLA4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
KR20230051602A (ko) 2016-04-15 2023-04-18 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Icos 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
AR108377A1 (es) * 2016-05-06 2018-08-15 Medimmune Llc Proteínas de unión biespecíficas y sus usos
CA3026151A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
CN106977602B (zh) 2016-08-23 2018-09-25 中山康方生物医药有限公司 一种抗pd1单克隆抗体、其药物组合物及其用途
WO2018035710A1 (en) 2016-08-23 2018-03-01 Akeso Biopharma, Inc. Anti-ctla4 antibodies
CN106967172B (zh) 2016-08-23 2019-01-08 康方药业有限公司 抗ctla4-抗pd-1 双功能抗体、其药物组合物及其用途
EP3532504A1 (en) 2016-10-28 2019-09-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating urothelial carcinoma using an anti-pd-1 antibody
WO2018085555A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Bristol-Myers Squibb Company Activatable anti-ctla-4 antibodies and uses thereof
WO2018089293A2 (en) * 2016-11-08 2018-05-17 Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corporation Anti-pd1 and anti-ctla4 antibodies
IL269026B1 (en) 2017-03-31 2024-08-01 Bristol Myers Squibb Co Anti-PD-1 antibodies for the treatment of tumors in patients with a high tumor mutational burden (TMB)
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
CA3060989A1 (en) 2017-05-30 2018-12-06 Bristol-Myers Squibb Company Compositions comprising a combination of an anti-lag-3 antibody, a pd-1 pathway inhibitor, and an immunotherapeutic agent
MX2019012076A (es) 2017-05-30 2019-12-09 Bristol Myers Squibb Co Composiciones que comprenden un anticuerpo anti gen-3 de activacion del linfocito (lag-3) o un anticuerpo anti-lag-3 y un anticuerpo anti muerte celular programada 1 (pd-1) o anti ligando 1 de muerte celular programada (pd-l1).
MX2019012032A (es) 2017-05-30 2019-10-30 Bristol Myers Squibb Co Tratamiento de tumores positivos a gen 3 de activacion de linfocitos (lag-3).
EP3630840A1 (en) 2017-06-01 2020-04-08 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor using an anti-pd-1 antibody
EP3626745A4 (en) * 2017-09-01 2021-03-17 Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd. RECOMBINANT BISPECIFIC ANTIBODY
EP4219540A3 (en) 2017-10-10 2023-12-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Ctla-4 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2019075468A1 (en) 2017-10-15 2019-04-18 Bristol-Myers Squibb Company TUMOR TREATMENT METHODS
KR20200091382A (ko) * 2017-11-02 2020-07-30 시스트이뮨, 인코포레이티드 이중특이성 항체 및 이의 제조 및 사용 방법
EP3706778A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor
EP3706793A1 (en) * 2017-11-08 2020-09-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
KR20200109339A (ko) 2018-01-16 2020-09-22 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Tim3에 대한 항체를 사용하여 암을 치료하는 방법
CA3088542A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Bristol-Myers Squibb Company Compositions and methods of treating cancer
CA3096287A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Pascal Biosciences Inc. Cannabinoids and derivatives for promoting immunogenicity of tumor and infected cells
US11685781B2 (en) 2018-02-15 2023-06-27 Macrogenics, Inc. Variant CD3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
WO2019179421A1 (en) * 2018-03-19 2019-09-26 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel bispecific pd-1/ctla-4 antibody molecules
WO2019179391A1 (en) * 2018-03-19 2019-09-26 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel bispecific pd-1/ctla-4 antibody molecules
TW202003565A (zh) 2018-03-23 2020-01-16 美商必治妥美雅史谷比公司 抗mica及/或micb抗體及其用途
KR20200139724A (ko) 2018-03-30 2020-12-14 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
US12110337B2 (en) 2018-04-04 2024-10-08 Bristol-Myers Squibb Company Anti-CD27 antibodies and uses thereof
JP7439372B2 (ja) * 2018-06-21 2024-02-28 シャタック ラボ，インコーポレイテッド ヘテロ二量体タンパク質及びその使用
EP3826660A1 (en) 2018-07-26 2021-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 combination therapy for the treatment of cancer
CN109762068A (zh) * 2018-08-09 2019-05-17 源道隆（苏州）医学科技有限公司 一种可靶向ctla4和pd-1的单基因双特异性抗体及其应用
WO2020057610A1 (en) * 2018-09-20 2020-03-26 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel bispecific anti-ctla-4/pd-1 polypeptide complexes
JP2022512642A (ja) 2018-10-09 2022-02-07 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー がんを治療するための抗ＭｅｒＴＫ抗体
US20210338813A1 (en) 2018-10-19 2021-11-04 Bristol-Myers Squibb Company Combination Therapy for Melanoma
WO2020086724A1 (en) 2018-10-23 2020-04-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
WO2020102501A1 (en) 2018-11-16 2020-05-22 Bristol-Myers Squibb Company Anti-nkg2a antibodies and uses thereof
WO2020117992A1 (en) * 2018-12-04 2020-06-11 The Broad Institute, Inc. Improved vector systems for cas protein and sgrna delivery, and uses therefor
KR20210146349A (ko) 2019-03-28 2021-12-03 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
EP3946625A1 (en) 2019-03-28 2022-02-09 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
WO2020205516A1 (en) * 2019-03-29 2020-10-08 Xencor, Inc. Dosing of a bispecific antibody that binds pd1 and ctla4
WO2020243570A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and combination therapy
WO2020243563A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures for suitability to immuno-oncology therapy
EP3976832A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject suitable for an immuno-oncology (i-o) therapy
CN112010972B (zh) * 2019-05-31 2023-01-10 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 与人lag-3蛋白结合的抗体及其编码基因和应用
US20220365091A1 (en) * 2019-07-11 2022-11-17 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Intratumoral TFR Cells Curtail Anti-PD-1 Treatment Efficacy
CN112239506B (zh) * 2019-07-16 2023-09-26 复旦大学 一种抗PD-1及c-Met抗原的小分子双特异性抗体Diabody
WO2021055994A1 (en) 2019-09-22 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Quantitative spatial profiling for lag-3 antagonist therapy
CA3152263A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Julia SANTUCCI PEREIRA DEL BUONO Composite biomarker for cancer therapy
EP4055392A1 (en) 2019-11-05 2022-09-14 Bristol-Myers Squibb Company M-protein assays and uses thereof
WO2021092220A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject with a tumor suitable for a checkpoint inhibitor therapy
WO2021092221A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject with a tumor suitable for a checkpoint inhibitor therapy
AU2020380384A1 (en) 2019-11-08 2022-05-26 Bristol-Myers Squibb Company LAG-3 antagonist therapy for melanoma
WO2021097256A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Cohbar, Inc. Cxcr4 antagonist peptides
WO2021127554A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 Bristol-Myers Squibb Company Combinations of dgk inhibitors and checkpoint antagonists
US20230056230A1 (en) * 2019-12-23 2023-02-23 Macrogenics, Inc. Therapy for the Treatment of Cancer
US20230086099A1 (en) 2020-01-30 2023-03-23 Ona Therapeutics, S.L. Combination therapy for treatment of cancer and cancer metastasis
JP2023514152A (ja) 2020-02-06 2023-04-05 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｉｌ－１０およびその使用
CN115768465A (zh) 2020-03-06 2023-03-07 Ona疗法有限公司 抗cd36抗体及其治疗癌症的用途
WO2021194942A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ccr8 antibodies for treating cancer
MX2022013998A (es) * 2020-05-08 2023-02-16 Alpine Immune Sciences Inc Proteinas inmunomoduladoras inhibidoras de april y baff con y sin una proteina inhibidora de celulas t y metodos de uso de las mismas.
JP2023116826A (ja) * 2020-05-20 2023-08-23 中外製薬株式会社 抗原結合分子
AU2021316192A1 (en) * 2020-07-27 2023-02-23 Macrogenics, Inc. Methods for the use of a PD-1 x CTLA-4 bispecific molecule
CN111944760A (zh) * 2020-08-14 2020-11-17 广东先康达生物科技有限公司 一种分泌双特异性抗体的免疫细胞及其应用
AU2021331476A1 (en) 2020-08-28 2023-05-04 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 antagonist therapy for hepatocellular carcinoma
JP2023538955A (ja) 2020-08-31 2023-09-12 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 細胞局在シグネチャーおよび免疫療法
KR20230080460A (ko) 2020-10-05 2023-06-07 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 단백질을 농축시키는 방법
MX2023004493A (es) 2020-10-23 2023-05-10 Bristol Myers Squibb Co Terapia de agonista del gen-3 de activacion del linfocito (lag-3) para cancer de pulmon.
EP4236960A1 (en) 2020-10-28 2023-09-06 Ikena Oncology, Inc. Combination of an ahr inhibitor with a pdx inhibitor or doxorubicine
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
WO2022146948A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Subcutaneous administration of pd1/pd-l1 antibodies
WO2022146947A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2022184155A1 (zh) * 2021-03-05 2022-09-09 南京圣和药业股份有限公司 抗ctla-4抗体及其应用
US20240181052A1 (en) 2021-03-29 2024-06-06 Juno Therapeutics, Inc. Methods for dosing and treatment with a combination of a checkpoint inhibitor therapy and a car t cell therapy
WO2022212876A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
WO2023007472A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 ONA Therapeutics S.L. Anti-cd36 antibodies and their use to treat cancer
MX2024005053A (es) 2021-10-29 2024-05-10 Bristol Myers Squibb Co Terapia con antagonista del gen de activacion de linfocitos 3 (lag-3) para cancer hematologico.
US20230227779A1 (en) * 2022-01-19 2023-07-20 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Enhanced Chimeric Antigen Receptor Cells in Hypoxic Tumor Microenvironment
MX2024008831A (es) 2022-01-26 2024-07-25 Bristol Myers Squibb Company Terapia combinada para carcinoma hepatocelular.
KR20240141822A (ko) * 2022-02-10 2024-09-27 마크로제닉스, 인크. Pd-1 x ctla-4 이중특이적 분자와 조합된 b7-h3 항체-약물 접합체의 사용 방법
AU2023226078A1 (en) 2022-02-25 2024-08-22 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for colorectal carcinoma.
WO2023168404A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor
WO2023170549A1 (en) * 2022-03-07 2023-09-14 Medimmune Llc Treatment methods using ctla-4 and pd-1 bispecific antibodies
WO2023170606A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Alentis Therapeutics Ag Use of anti-claudin-1 antibodies to increase t cell availability
WO2023178329A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
WO2023196987A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
US20230326022A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Bristol-Myers Squibb Company Machine Learning Identification, Classification, and Quantification of Tertiary Lymphoid Structures
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
EP4310197A1 (en) 2022-07-21 2024-01-24 Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario Puerta de Hierro Majadahonda Method for identifying lung cancer patients for a combination treatment of immuno- and chemotherapy
WO2024069009A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Alentis Therapeutics Ag Treatment of drug-resistant hepatocellular carcinoma
WO2024114605A1 (zh) * 2022-11-29 2024-06-06 杭州阿诺生物医药科技有限公司 一种融合多肽及其用途
WO2024116140A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Medimmune Limited Combination therapy for treatment of cancer comprising anti-pd-l1 and anti-cd73 antibodies
WO2024137776A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for lung cancer
WO2024150177A1 (en) 2023-01-11 2024-07-18 Advesya Treatment methods for solid tumors
WO2024196952A1 (en) 2023-03-20 2024-09-26 Bristol-Myers Squibb Company Tumor subtype assessment for cancer therapy

Family Cites Families (332)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5985A (en) 1848-12-26 Pianoforte-action
US320A (en) 1837-07-31 John dainty
US3862925A (en) 1973-07-05 1975-01-28 American Home Prod Preparation of somatotropin release inhibiting factor and intermediates therefor
US3842067A (en) 1973-07-27 1974-10-15 American Home Prod Synthesis of(des-asn5)-srif and intermediates
JPS5726506B2 (uk) 1974-03-08 1982-06-04
US4105603A (en) 1977-03-28 1978-08-08 The Salk Institute For Biological Studies Peptides which effect release of hormones
ATE37983T1 (de) 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
EP0359096B1 (en) 1988-09-15 1997-11-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Antibodies having modified carbohydrate content and methods of preparation and use
CA2018248A1 (en) 1989-06-07 1990-12-07 Clyde W. Shearman Monoclonal antibodies against the human alpha/beta t-cell receptor, their production and use
AU6290090A (en) 1989-08-29 1991-04-08 University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
AU642932B2 (en) 1989-11-06 1993-11-04 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Protein microspheres and methods of using them
FR2656800B1 (fr) 1990-01-08 1992-05-15 Roussy Inst Gustave Nouvelles proteines produits par les lymphocytes humains, sequence d'adn codant pour ces proteines et applications pharmaceutiques et biologiques.
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
DE4014524A1 (de) 1990-05-07 1991-11-14 Boehringer Mannheim Gmbh Typ ii - restriktionsendonuklease swai
FR2664500B1 (fr) 1990-07-13 1994-10-28 Lille Ii Universite Droit Sant Procede de preparation d'une lipoproteine modifiee par incorporation d'une substance active lipophile, lipoproteine modifiee ainsi obtenue et composition pharmaceutique ou cosmetique la contenant.
US5972337A (en) 1990-11-01 1999-10-26 Cancer Research Fund Of Contra Costa 46 kilodalton human milk fat globule (HMFG) antigen, fragments and fusion protein
ES2181673T3 (es) 1991-05-01 2003-03-01 Jackson H M Found Military Med Procedimiento de tratamiento de las enfermedades respiratorias infecciosas.
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
US5843749A (en) 1991-07-26 1998-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ehk and Ror tyrosine kinases
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9225453D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
IL108501A (en) 1994-01-31 1998-10-30 Mor Research Applic Ltd Antibodies and pharmaceutical compositions containing them
JP3700859B2 (ja) 1994-05-06 2005-09-28 アンスティテュ ギュスタブ ルシ Ｌａｇ−３タンパク質の可溶性ポリペプチドフラクション；製造方法、治療用製剤、抗イディオタイプ抗体
ATE252894T1 (de) 1995-01-05 2003-11-15 Univ Michigan Oberflächen-modifizierte nanopartikel und verfahren für ihre herstellung und verwendung
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
AU710347B2 (en) 1995-08-31 1999-09-16 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
US5736152A (en) 1995-10-27 1998-04-07 Atrix Laboratories, Inc. Non-polymeric sustained release delivery system
US5942328A (en) 1996-02-29 1999-08-24 International Business Machines Corporation Low dielectric constant amorphous fluorinated carbon and method of preparation
PT885002E (pt) 1996-03-04 2011-07-14 Massachusetts Inst Technology Materiais e métodos para aumento da internalização celular
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
AU728911B2 (en) 1996-11-28 2001-01-18 Institut Gustave Roussy Mutants of the LAG-3 proteins, products for the expression of these mutants and use
EP0846571B1 (en) 1996-12-04 2001-04-11 Agfa-Gevaert N.V. Method for the formation of an improved heat mode image
ATE287257T1 (de) 1997-01-16 2005-02-15 Massachusetts Inst Technology Zubereitung von partikelhaltigen arzneimitteln zur inhalation
DE69840723D1 (de) 1997-02-11 2009-05-20 Immunomedics Inc Stimulation einer immunantwort durch antikörper, welche mit dem alpha-galaktosylepitop markiert sind
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP0900841A1 (en) 1997-06-18 1999-03-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) LAG-3 splice variants
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
NZ507381A (en) 1998-04-21 2003-12-19 Micromet Ag CD19xCD3 specific polypeptides and uses thereof
US7244826B1 (en) 1998-04-24 2007-07-17 The Regents Of The University Of California Internalizing ERB2 antibodies
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
AU747231B2 (en) 1998-06-24 2002-05-09 Alkermes, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
US7109003B2 (en) 1998-12-23 2006-09-19 Abgenix, Inc. Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
CZ303703B6 (cs) 1998-12-23 2013-03-20 Pfizer Inc. Monoklonální protilátka nebo její antigen-vázající fragment, farmaceutická kompozice obsahující tuto protilátku nebo fragment, bunecná linie produkující tuto protilátku nebo fragment, zpusob prípravy této protilátky, izolovaná nukleová kyselina kóduj
US20030187196A1 (en) 1998-12-30 2003-10-02 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
KR20060067983A (ko) 1999-01-15 2006-06-20 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
AU784045B2 (en) 1999-06-25 2006-01-19 Genentech Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
HUP0202882A2 (en) 1999-08-23 2002-12-28 Dana Farber Cancer Inst Inc Novel b7-4 molecules and uses therefor
IL147972A0 (en) 1999-08-23 2002-09-12 Dana Farber Cancer Inst Inc Ge Pd-1, a receptor for b7-4 and uses therefor
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
EP3214175A1 (en) * 1999-08-24 2017-09-06 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human ctla-4 antibodies and their uses
US6803192B1 (en) 1999-11-30 2004-10-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-H1, a novel immunoregulatory molecule
DK1234031T3 (en) 1999-11-30 2017-07-03 Mayo Foundation B7-H1, AN UNKNOWN IMMUNE REGULATORY MOLECULE
JP2003520828A (ja) 2000-01-27 2003-07-08 ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー Ｃｔｌａ４（ｃｄ１５２）に対する抗体、これを含む結合体、およびその使用
ATE336514T1 (de) 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
WO2002002781A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterodimeric fusion proteins
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7666424B2 (en) 2001-10-17 2010-02-23 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Methods of preparing and using single chain anti-tumor antibodies
US7740845B2 (en) 2000-10-18 2010-06-22 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Uses of monoclonal antibody 8H9
US7737258B2 (en) 2000-10-18 2010-06-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Uses of monoclonal antibody 8H9
US8501471B2 (en) 2000-10-18 2013-08-06 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Uses of monoclonal antibody 8H9
US8414892B2 (en) 2000-10-18 2013-04-09 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Uses of monoclonal antibody 8H9
ATE489395T1 (de) 2000-12-12 2010-12-15 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
WO2002086083A2 (en) 2001-04-20 2002-10-31 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods of enhancing cell responsiveness
WO2003011911A1 (en) 2001-07-31 2003-02-13 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Substance specific to pd-1
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
ATE346866T1 (de) 2001-09-14 2006-12-15 Affimed Therapeutics Ag Multimerische, einzelkettige, tandem-fv- antikörper
WO2003024191A2 (en) 2001-09-21 2003-03-27 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to cancer-associated antigen cytokeratin 8 and methods of use thereof
US7148038B2 (en) 2001-10-16 2006-12-12 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to cancer-associated antigen CD46 and methods of use thereof
AU2002337935B2 (en) 2001-10-25 2008-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
EP1456652A4 (en) 2001-11-13 2005-11-02 Dana Farber Cancer Inst Inc IMMUNOCELL ACTIVATION MODULATING SUBSTANCES AND USE METHOD THEREFOR
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
JP2006506323A (ja) 2002-04-12 2006-02-23 レイヴェン バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド インテグリンα−ｖ−β−６に結合する抗体およびその使用方法
AU2003230874A1 (en) 2002-04-16 2003-11-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
AU2003225294A1 (en) 2002-05-03 2003-11-17 Raven Biotechnologies, Inc. Alcam and alcam modulators
IL149820A0 (en) 2002-05-23 2002-11-10 Curetech Ltd Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency
US7351803B2 (en) 2002-05-30 2008-04-01 Macrogenics, Inc. CD16A binding proteins and use for the treatment of immune disorders
JP4488512B2 (ja) 2002-06-19 2010-06-23 レイベン バイオテクノロジーズ，インコーポレイティド 新規のｒａａｇ１０細胞表面標的および当該標的を認識する抗体ファミリー
DE10161767T1 (de) 2002-07-03 2018-06-07 Honjo Tasuku Immunopotenzierende Zusammensetzungen, die einen Anti-PD-L1 Antikörper enthalten
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
JP4757493B2 (ja) 2002-11-13 2011-08-24 レイベン バイオテクノロジーズ，インコーポレイティド 抗原ｐｉｐａおよびそれに結合する抗体
ATE514713T1 (de) 2002-12-23 2011-07-15 Wyeth Llc Antikörper gegen pd-1 und ihre verwendung
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7563869B2 (en) 2003-01-23 2009-07-21 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Substance specific to human PD-1
FI1897548T4 (fi) 2003-02-28 2024-09-03 The Johns Hopkins University T-solujen säätely
AU2004242846A1 (en) 2003-05-31 2004-12-09 Micromet Ag Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-CD3, anti-CD19 antibody constructs for the treatment of B-cell related disorders
ES2301099T3 (es) 2003-07-07 2008-06-16 The Scripps Research Institute Composiciones de parejas ortogonales lisil-arnt y aminoacil-arnt sintetasa y usos de las mismas.
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US7790855B2 (en) 2003-09-18 2010-09-07 Macrogenics, Inc. KID3 and KID3 antibodies that bind thereto
CA2545603A1 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Neonatal fc receptor (fcrn)-binding polypeptide variants, dimeric fc binding proteins and methods related thereto
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
DK1709081T3 (da) 2004-01-16 2011-06-06 Regeneron Pharma Fusionspolypeptider, der kan aktivere receptorer
WO2007046893A2 (en) 2005-10-19 2007-04-26 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating bioactive assemblies and uses thereof
KR20050082389A (ko) 2004-02-18 2005-08-23 메덱스젠 주식회사 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체를 포함하는 장기이식합병증 치료용 약제학적 조성물
SG155883A1 (en) 2004-06-03 2009-10-29 Novimmune Sa Anti-cd3 antibodies and methods of use thereof
CA2569692C (en) 2004-06-07 2015-07-21 Raven Biotechnologies, Inc. Transferrin receptor antibodies
AU2005254087B2 (en) 2004-06-15 2010-12-09 The New York Blood Center, Inc. Adjuvancy and immune potentiating properties of natural products of Onchocerca volvulus
EP2471813B1 (en) 2004-07-15 2014-12-31 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20070166281A1 (en) 2004-08-21 2007-07-19 Kosak Kenneth M Chloroquine coupled antibodies and other proteins with methods for their synthesis
WO2006021955A2 (en) 2004-08-23 2006-03-02 Mor Research Applications Ltd. Use of bat monoclonal antibody for immunotherapy
EP1793858A4 (en) 2004-09-08 2008-12-10 Univ Ohio State Res Found HUMAN MONOCLONAL ANTI-CTLA4 ANTIBODIES FOR CANCER TREATMENT
DE102004044786A1 (de) 2004-09-16 2006-04-06 Saurer Gmbh & Co. Kg Vorrichtung und Verfahren zum Ablegen eines Spinnkabels
AU2005295579B2 (en) 2004-10-15 2011-08-04 NortonLifeLock Inc. One time password
WO2007024249A2 (en) 2004-11-10 2007-03-01 Macrogenics, Inc. Engineering fc antibody regions to confer effector function
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
DE102004063494A1 (de) 2004-12-23 2006-07-13 Tegenero Ag Antikörper
EP1846767B1 (en) 2005-01-12 2012-06-06 MacroGenics West, Inc. Kid31 and antibodies that bind thereto
US7847070B2 (en) 2005-01-31 2010-12-07 Raven Biotechnologies, Inc. LUCA2 and antibodies that bind thereto
CA2596273C (en) 2005-02-02 2017-11-14 Raven Biotechnologies, Inc. Adam-9 modulators
WO2006084078A2 (en) 2005-02-02 2006-08-10 Raven Biotechnologies, Inc. Jam-3 and antibodies that bind thereto
JP5328156B2 (ja) 2005-02-03 2013-10-30 マクロジェニックス ウエスト， インコーポレイテッド オンコスタチンｍレセプターに対する抗体
MX2007009403A (es) 2005-02-04 2007-10-02 Raven Biotechnologies Inc Anticuerpos que se unen a epha2 y metodos para usar los mismos.
JP5011277B2 (ja) 2005-04-06 2012-08-29 アイビーシー・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ホモダイマー、ホモテトラマーまたはダイマーのダイマーのからなる安定に連結された複合体を発生させるための方法および使用
AU2006232310B9 (en) 2005-04-06 2011-07-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Improved stably tethered structures of defined compositions with multiple functions or binding specificities
ES2707152T3 (es) 2005-04-15 2019-04-02 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y usos de los mismos
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
NZ563193A (en) 2005-05-09 2010-05-28 Ono Pharmaceutical Co Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
PT2397156T (pt) 2005-06-08 2016-12-23 The President And Fellows Of Harvard College Métodos e composições para tratamento de infeções persistentes e cancro através da inibição da via de morte celular programada 1 (pd-1)
JP2006345852A (ja) 2005-06-16 2006-12-28 Virxsys Corp 抗体複合体
DK1907424T3 (en) 2005-07-01 2015-11-09 Squibb & Sons Llc HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO PROGRAMMED death ligand 1 (PD-L1)
AU2006269555A1 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Anti-CTLA-4 antibody and CpG-motif-containing synthetic oligodeoxynucleotide combination therapy for cancer treatment
US8217147B2 (en) 2005-08-10 2012-07-10 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
MY169746A (en) 2005-08-19 2019-05-14 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CA2633486C (en) 2005-12-16 2015-02-03 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
CA2644903A1 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant heavy chains and methods of using same
JP5474531B2 (ja) 2006-03-24 2014-04-16 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 操作されたヘテロ二量体タンパク質ドメイン
CA2654317A1 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Single-chain multivalent binding proteins with effector function
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
AT503889B1 (de) 2006-07-05 2011-12-15 Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F Multivalente immunglobuline
EP2511301B1 (en) 2006-08-04 2017-12-06 MedImmune Limited Human antibodies to erbb 2
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
WO2008140603A2 (en) 2006-12-08 2008-11-20 Macrogenics, Inc. METHODS FOR THE TREATMENT OF DISEASE USING IMMUNOGLOBULINS HAVING FC REGIONS WITH ALTERED AFFINITIES FOR FCγR ACTIVATING AND FCγR INHIBITING
AU2007331672A1 (en) 2006-12-15 2008-06-19 Ablynx N.V. Amino acid sequences that modulate the interaction between cells of the immune system
CN101663323A (zh) 2006-12-27 2010-03-03 埃默里大学 用于治疗传染病和肿瘤的组合物和方法
JP2010523478A (ja) 2007-03-22 2010-07-15 スローン − ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ モノクローナル抗体８ｈ９の使用
PL2155788T3 (pl) 2007-04-03 2013-02-28 Amgen Res Munich Gmbh Swoiste międzygatunkowe bispecyficzne czynniki wiążące
EP1987839A1 (en) 2007-04-30 2008-11-05 I.N.S.E.R.M. Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
WO2008145142A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Stable igg4 antibodies
JP2010190572A (ja) 2007-06-01 2010-09-02 Sapporo Medical Univ ＩＬ１３Ｒａ２に対する抗体およびこれを含む診断・治療薬
EP2170959B1 (en) 2007-06-18 2013-10-02 Merck Sharp & Dohme B.V. Antibodies to human programmed death receptor pd-1
CN101821288A (zh) 2007-06-21 2010-09-01 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
US20090028857A1 (en) 2007-07-23 2009-01-29 Cell Genesys, Inc. Pd-1 antibodies in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof
WO2009018386A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
US8062852B2 (en) 2007-10-01 2011-11-22 The Children's Hospital And Regional Medical Center Detection and treatment of autoimmune disorders
JP2011505372A (ja) 2007-11-30 2011-02-24 ブリストル−マイヤーズ スクウィブ カンパニー 抗ｂ７ｈ４モノクローナル抗体−薬物コンジュゲートおよび使用方法
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
HUE028536T2 (en) 2008-01-07 2016-12-28 Amgen Inc Method for producing antibody to FC heterodimer molecules using electrostatic control effects
CN101970499B (zh) 2008-02-11 2014-12-31 治疗科技公司 用于肿瘤治疗的单克隆抗体
EP2113255A1 (en) 2008-05-02 2009-11-04 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Cytotoxic immunoglobulin
US7565048B1 (en) 2008-05-30 2009-07-21 Ofs Fitel Llc Undersea optical fiber transmission systems
EP2282770B1 (en) 2008-06-04 2018-03-07 MacroGenics, Inc. Antibodies with altered binding to fcrn and methods of using same
JP5945096B2 (ja) 2008-07-04 2016-07-05 小野薬品工業株式会社 抗ヒトｐｄ−１抗体の癌に対する治療効果を最適化するための判定マーカーの使用
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
SI2350129T1 (sl) 2008-08-25 2015-11-30 Amplimmune, Inc. Sestavki PD-1 antagonistov in postopek njihove uporabe
AU2009288354A1 (en) 2008-08-26 2010-03-11 Macrogenics Inc. T-cell receptor antibodies and methods of use thereof
WO2010028795A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
WO2010028796A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Trispecific hexavalent antibodies
WO2010028797A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
CA2998281C (en) 2008-09-26 2022-08-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human anti-pd-1 antobodies and uses therefor
KR20110104032A (ko) 2008-12-19 2011-09-21 마크로제닉스, 인크. 공유결합형 디아바디 및 이의 용도
JP5844159B2 (ja) 2009-02-09 2016-01-13 ユニヴェルシテ デクス−マルセイユＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｄ’Ａｉｘ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ Ｐｄ−１抗体およびｐｄ−ｌ１抗体ならびにその使用
RU2504553C2 (ru) 2009-03-20 2014-01-20 Дженентек, Инк. Антитела к her
JP2010249130A (ja) 2009-03-27 2010-11-04 Sanden Corp 流体機械
CA2761233A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US8277919B2 (en) 2009-07-23 2012-10-02 VMO Systems, Inc. Reflective coating for an optical disc
EP2478110B1 (en) 2009-09-16 2016-01-06 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
TR201804897T4 (tr) 2009-10-07 2018-06-21 Macrogenics Inc Fukosi̇lasyon ölçüsünün deği̇şi̇mleri̇nden dolayi geli̇şmi̇ş efektör i̇şlevi̇ sergi̇leyen fc bölgesi̇ni̇ i̇çeren poli̇pepti̇tler ve bunlarin kullanimlarina yöneli̇k yöntemler
US20130017199A1 (en) 2009-11-24 2013-01-17 AMPLIMMUNE ,Inc. a corporation Simultaneous inhibition of pd-l1/pd-l2
DK3279215T3 (da) 2009-11-24 2020-04-27 Medimmune Ltd Målrettede bindemidler mod b7-h1
RU2580038C2 (ru) 2009-12-04 2016-04-10 Дженентек, Инк. Мультиспецифические антитела, аналоги антител, композиции и способы
GB201000467D0 (en) 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
PT2361936T (pt) 2010-02-25 2016-07-15 Affimed Gmbh Molécula que se liga a antigénio e utilizações desta
US20110206672A1 (en) 2010-02-25 2011-08-25 Melvyn Little Antigen-Binding Molecule And Uses Thereof
GEP201706660B (en) 2010-03-04 2017-04-25 Macrogenics Inc Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
US8802091B2 (en) 2010-03-04 2014-08-12 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof
EP2545078A1 (en) 2010-03-11 2013-01-16 UCB Pharma, S.A. Pd-1 antibody
AR080794A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
PT2560993T (pt) 2010-04-20 2024-09-16 Genmab As Proteínas contendo anticorpo heterodimérico fc e métodos para a produção das mesmas
US8876892B2 (en) 2010-04-21 2014-11-04 Medtronic, Inc. Prosthetic heart valve delivery system with spacing
CA2796633C (en) 2010-04-23 2020-10-27 Genentech, Inc. Production of heteromultimeric proteins
CA2738352A1 (en) 2010-04-28 2011-10-28 Mjsi, Inc. Offsetting dual flush adapter
JP6022444B2 (ja) 2010-05-14 2016-11-09 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ヘテロ二量体タンパク質ならびにそれを生産および精製するための方法
CN107253992B (zh) 2010-05-27 2022-03-11 根马布股份公司 针对her2的单克隆抗体
CA2802344C (en) 2010-06-18 2023-06-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
US20130189268A1 (en) 2010-06-22 2013-07-25 Precision Biologics, Inc. Colon and pancreas cancer specific antigens and antibodies
US20130115215A1 (en) 2010-07-14 2013-05-09 Hongxing Zhou Domain insertion immunoglobulin
AU2011286024B2 (en) 2010-08-02 2014-08-07 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
MX338953B (es) 2010-08-16 2016-05-06 Novimmune Sa Metodos para la generacion de anticuerpos multiespecificos y multivalentes.
RS59589B1 (sr) 2010-11-05 2019-12-31 Zymeworks Inc Dizajniranje stabilnog heterodimernog antitela sa mutacijama u fc domenu
JP5395824B2 (ja) 2011-02-16 2014-01-22 株式会社東芝 メモリシステム
MX352889B (es) * 2011-02-25 2017-12-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo de fc especifico para fcyriib.
GB201103955D0 (en) 2011-03-09 2011-04-20 Antitope Ltd Antibodies
MX341076B (es) 2011-03-31 2016-08-04 Merck Sharp & Dohme Formulaciones estables de anticuerpos para el receptor humano pd-1 de meurte programada y tratamientos relacionados.
CA2832389A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
CN103608040B (zh) 2011-04-20 2017-03-01 米迪缪尼有限公司 结合b7‑h1和pd‑1的抗体和其他分子
SG194620A1 (en) 2011-04-25 2013-12-30 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-b7-h3 antibody
WO2012156430A1 (en) 2011-05-17 2012-11-22 Trion Research Gmbh Vaccine preparation containing trifunctional antibodies with antigen immunogenicity enhancer properties
BR122016016837A2 (pt) 2011-05-21 2019-08-27 Macrogenics Inc moléculas de ligação a cd3; anticorpos de ligação a cd3; composições farmacêuticas; e usos da molécula de ligação a cd3
CN104080804B (zh) 2011-05-21 2017-06-09 宏观基因有限公司 去免疫化的血清结合结构域及其延长血清半衰期的用途
WO2012162583A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Design and construction of novel multivalent antibodies
WO2013003652A1 (en) 2011-06-28 2013-01-03 Sea Lane Biotechnologies, Llc Multispecific stacked variable domain binding proteins
KR20140058532A (ko) 2011-06-30 2014-05-14 겐자임 코포레이션 Ｔ-세포 활성화 억제제
EP2729488A4 (en) 2011-07-06 2015-01-14 Medimmune Llc PROCESS FOR PREPARING MULTIMANT POLYPEPTIDES
WO2013006867A1 (en) 2011-07-07 2013-01-10 Massachussetts Institute Of Technology Methods and apparatus for ultrathin catalyst layer for photoelectrode
US20140242081A1 (en) 2011-07-18 2014-08-28 Micromet Ag Dosing regimens for treatment of cea-expressing cancers
JP5938473B2 (ja) 2011-07-22 2016-06-22 アフィメート テラポイティクス アーゲー 多価抗原結合Ｆｖ分子
CA2840018C (en) 2011-07-24 2019-07-16 Curetech Ltd. Variants of humanized immunomodulatory monoclonal antibodies
US9701749B2 (en) 2011-08-11 2017-07-11 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Therapeutic agent for autoimmune diseases comprising PD-1 agonist
CA2846432A1 (en) 2011-09-23 2013-03-28 Amgen Research (Munich) Gmbh Bispecific binding molecules for 5t4 and cd3
CA2853114A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Abbvie Inc. Bispecific immunobinders directed against tnf and il-17
EP3674320A3 (en) 2011-10-27 2020-08-12 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
JP2014533249A (ja) 2011-11-07 2014-12-11 メディミューン，エルエルシー 多重特異性を持つ多価結合タンパク質およびその使用
AU2013216943B2 (en) 2012-02-10 2018-04-19 Research Corporation Technologies, Inc. Fusion proteins comprising immunoglobulin constant domain-derived scaffolds
WO2013163427A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibodies to treat hiv-1 infection
BR112014026740B1 (pt) 2012-04-27 2022-10-04 Bioatla, Llc Anticorpo, composição, método para fornecer um anticorpo com adcc realçada, e, uso de um anticorpo
WO2013169338A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Medimmune, Llc Ctla-4 variants
SG11201407190TA (en) 2012-05-15 2014-12-30 Bristol Myers Squibb Co Cancer immunotherapy by disrupting pd-1/pd-l1 signaling
WO2013174873A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
UY34887A (es) 2012-07-02 2013-12-31 Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware Optimización de anticuerpos que se fijan al gen de activación de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
WO2014022540A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
WO2014022759A1 (en) 2012-08-03 2014-02-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Agents that modulate immune cell activation and methods of use thereof
JP6403166B2 (ja) 2012-08-03 2018-10-10 ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート， インコーポレイテッド 単一抗原抗ｐｄ−ｌ１およびｐｄ−ｌ２二重結合抗体およびその使用方法
AU2013315019B2 (en) 2012-09-17 2017-06-01 Galectin Therapeutics, Inc. Method for enhancing specific immunotherapies in cancer treatment
KR102130865B1 (ko) 2012-10-02 2020-08-05 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 암을 치료하기 위한 항-kir 항체와 항-pd-1 항체의 조합물
US20150273056A1 (en) 2012-10-12 2015-10-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Enhancement of the immune response
WO2014066532A1 (en) 2012-10-23 2014-05-01 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-kir and anti-ctla-4 antibodies to treat cancer
US10034939B2 (en) 2012-10-26 2018-07-31 The University Of Chicago Synergistic combination of immunologic inhibitors for the treatment of cancer
JP2016503295A (ja) 2012-11-07 2016-02-04 ファイザー・インク 抗ｉｌ−１３受容体アルファ２抗体および抗体−薬物コンジュゲート
US9487587B2 (en) 2013-03-05 2016-11-08 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof
DK2970512T3 (en) 2013-03-12 2019-01-14 Biocon Ltd IMMUNO MODULATOR FUSION PROTEINS AND PROCEDURES FOR PRODUCING THEREOF
PL2968520T3 (pl) 2013-03-14 2022-01-03 Macrogenics, Inc. Dwuspecyficzne cząsteczki, które są immunoreaktywne wobec immunologicznych komórek efektorowych wykazujących ekspresję receptora aktywującego
ES2644022T3 (es) 2013-03-14 2017-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Combinación de un agonista de DR5 y un antagonista de anti-PD-1 y métodos de uso
KR101763352B1 (ko) 2013-03-15 2017-07-31 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드 항­ｌａｇ­3 결합 단백질
SG11201508528TA (en) 2013-05-02 2015-11-27 Anaptysbio Inc Antibodies directed against programmed death-1 (pd-1)
CA3175360C (en) 2013-05-31 2024-05-28 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind pd-1
US20160145355A1 (en) 2013-06-24 2016-05-26 Biomed Valley Discoveries, Inc. Bispecific antibodies
DK177790B1 (en) 2013-08-08 2014-07-07 Liqtech Internat A S A METHOD OF PRODUCING A CERAMIC FILTER MEMBRANE, A METHOD OF IMPROVING A CERAMIC FILTER MEMBRANE AND THE CERAMIC FILTER MEMBRANE OBTAINED BY THE METHOD
MX2016002273A (es) 2013-08-20 2016-05-31 Merck Sharp & Dohme Tratamiento de cancer con una combinacion de un antagonista de proteina de muerte programada 1 y dinaciclib.
AR097306A1 (es) 2013-08-20 2016-03-02 Merck Sharp & Dohme Modulación de la inmunidad tumoral
EP2839842A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
EP2840091A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
US10077305B2 (en) 2013-09-10 2018-09-18 Medimmune Limited Antibodies against PD-1 and uses thereof
CN112457403B (zh) 2013-09-13 2022-11-29 广州百济神州生物制药有限公司 抗pd1抗体及其作为治疗剂与诊断剂的用途
RS58705B1 (sr) 2013-09-20 2019-06-28 Bristol Myers Squibb Co Kombinacija anti-lag-3 antitela i anti-pd-1 antitela za lečenje tumora
EP3757130A1 (en) 2013-09-26 2020-12-30 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
EP3079772B1 (en) 2013-12-10 2020-02-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Immunohistochemical proximity assay for pd-1 positive cells and pd-ligand positive cells in tumor tissue
HUE046249T2 (hu) 2013-12-12 2020-02-28 Shanghai hengrui pharmaceutical co ltd PD-1 antitest, antigén-kötõ fragmense, és gyógyászati alkalmazása
US20160304969A1 (en) 2013-12-17 2016-10-20 Merck Sharp & Dohme Corp. Ifn-gamma gene signature biomarkers of tumor response to pd-1 antagonists
KR20160089531A (ko) 2013-12-17 2016-07-27 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 항-her2 항체를 사용하여 her2-양성 암을 치료하는 방법
DK3736292T3 (da) 2013-12-17 2024-07-22 Genentech Inc Anti-CD3-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse
RU2016129959A (ru) 2013-12-30 2018-02-02 Эпимаб Биотерепьютикс Инк. Иммуноглобулин с тандемным расположением fab-фрагментов и его применение
CA2936244A1 (en) 2014-01-21 2015-07-30 Medimmune, Llc Compositions and methods for modulating and redirecting immune responses
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
BR112016017174A2 (pt) 2014-01-28 2017-10-03 Bristol Myers Squibb Co Anticorpos anti-lag-3 para tratar malignidades hematológicas
HUE041469T2 (hu) 2014-02-04 2019-05-28 Pfizer PD-1 antagonista és VEGFR inhibitor kombinációja rák kezelésére
CU24481B1 (es) 2014-03-14 2020-03-04 Immutep Sas Moléculas de anticuerpo que se unen a lag-3
CN104974253A (zh) * 2014-04-01 2015-10-14 上海中信国健药业股份有限公司 抗ctla-4/pd-1双特异性抗体、其制备方法及应用
US20150307620A1 (en) 2014-04-16 2015-10-29 University Of Connecticut Linked immunotherapeutic agonists that costimulate multiple pathways
KR20230144099A (ko) 2014-05-15 2023-10-13 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-pd-1 항체 및 또 다른 항암제의 조합물을 사용한 폐암의 치료
TWI742423B (zh) 2014-05-29 2021-10-11 美商宏觀基因股份有限公司 特異性結合多種癌症抗原的三特異性結合分子和其使用方法
WO2015195163A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 R-Pharm Overseas, Inc. Pd-l1 antagonist fully human antibody
TWI693232B (zh) 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
WO2015200828A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 H. Lee Moffit Cancer Center And Research Institute, Inc. Conjugates for immunotherapy
RU2711141C2 (ru) 2014-07-22 2020-01-15 СиБи ТЕРЕПЬЮТИКС, ИНК. Антитела против pd-1
CN105330740B (zh) 2014-07-30 2018-08-17 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗pd-1抗体及其应用
KR102357893B1 (ko) 2014-08-05 2022-02-04 맵퀘스트 에스아 Pd-1 에 결합하는 면역학적 시약
SG10201901057UA (en) 2014-08-05 2019-03-28 Cb Therapeutics Inc Anti-pd-l1 antibodies
CA2957146A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Alligator Bioscience Ab Combination therapies with anti cd40 antibodies
JO3663B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
HUE048791T2 (hu) 2014-09-05 2020-09-28 Janssen Pharmaceutica Nv CD123 kötõszerek és alkalmazásaik
EA201790719A1 (ru) 2014-09-26 2017-07-31 Макродженикс, Инк. Биспецифические моновалентные диатела, которые способны связывать cd19 и cd3, а также их применения
CA2963991A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
AU2015327868A1 (en) 2014-10-03 2017-04-20 Novartis Ag Combination therapies
GB201419084D0 (en) 2014-10-27 2014-12-10 Agency Science Tech & Res Anti-PD-1 antibodies
WO2016069727A1 (en) 2014-10-29 2016-05-06 Five Prime Therapeutics, Inc. Combination therapy for cancer
US10822414B2 (en) 2014-11-11 2020-11-03 Sutro Biopharma, Inc. Anti-PD-1 antibodies, compositions comprising anti-PD-1 antibodies and methods of using anti-PD-1 antibodies
DK3789402T3 (da) 2014-11-20 2022-09-19 Hoffmann La Roche Kombinationsbehandling med T-celleaktiverende bispecifikke antigenbindende molekyler og PD-1-aksebindende antagonister
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
DK3237446T3 (en) 2014-12-22 2021-07-26 Pd 1 Acquisition Group Llc Anti-PD-1-antistoffer
BR112017015136A2 (pt) 2015-01-14 2018-01-30 Compass Therapeutics Llc polipeptídeo de construto de ligação ao antígeno imunomodulador multiespecífico, construto de ligação ao antígeno imunomodulador multiespecífico, conjugado, composição farmacêutica, método para tratar um indivíduo com câncer, método para inibir ou reduzir o crescimento de câncer, composição, célula, método de fazer um polipeptídeo de construto de ligação ao antígeno imunomodulador multiespecífico, vetor ou conjunto de vetores e kit
JP2018506280A (ja) 2015-02-06 2018-03-08 カドモン コーポレイション，リミティド ライアビリティ カンパニー 免疫調節薬
AU2016249395B2 (en) 2015-04-17 2022-04-07 Bristol-Myers Squibb Company Compositions comprising a combination of an anti-PD-1 antibody and another antibody
CN104987421A (zh) * 2015-05-13 2015-10-21 北京比洋生物技术有限公司 抗ctla-4和pd-1的双重可变结构域免疫球蛋白
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
TW201709929A (zh) 2015-06-12 2017-03-16 宏觀基因股份有限公司 治療癌症的聯合療法
WO2017011414A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
WO2017011413A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
PL3328419T3 (pl) * 2015-07-30 2021-12-27 Macrogenics, Inc. Cząsteczki wiążące pd-1 i sposoby ich zastosowania
US20190002563A1 (en) 2015-08-17 2019-01-03 Macrogenics, Inc. Bispecific Monovalent Diabodies That are Capable of Binding B7-H3 and CD3, and Uses Thereof
RU2731202C2 (ru) 2015-10-08 2020-08-31 Макродженикс, Инк. Комбинированная терапия для лечения рака
SG11201803520PA (en) 2015-11-03 2018-05-30 Janssen Biotech Inc Antibodies specifically binding pd-1 and their uses
KR102424513B1 (ko) 2015-12-14 2022-07-25 마크로제닉스, 인크. Pd-1 및 ctla-4과의 면역반응성을 가진 이중특이적 분자, 및 이것의 사용 방법
SG11201807474SA (en) 2016-04-25 2018-11-29 Medimmune Llc Compositions comprising coformulation of anti-pd-l1 and anti-ctla-4 antibodies
AR108377A1 (es) 2016-05-06 2018-08-15 Medimmune Llc Proteínas de unión biespecíficas y sus usos
SG10201913326UA (en) 2016-06-07 2020-02-27 Macrogenics Inc Combination therapy
CN109952112B (zh) 2016-09-21 2024-09-06 阿帕特夫研究和发展有限公司 Cd123结合蛋白和相关的组合物和方法
MA50948A (fr) 2016-12-07 2020-10-14 Agenus Inc Anticorps et procédés d'utilisation de ceux-ci

Also Published As

Publication number Publication date
GEP20217328B (en) 2021-12-10
CN108367069A (zh) 2018-08-03
AU2016370376B2 (en) 2023-12-14
IL260021A (en) 2018-07-31
CA3006462C (en) 2023-10-31
WO2017106061A1 (en) 2017-06-22
IL260021B (en) 2022-09-01
EA201891178A1 (ru) 2019-01-31
KR102424513B1 (ko) 2022-07-25
EP3389714A4 (en) 2019-11-13
US10954301B2 (en) 2021-03-23
MA44082A (fr) 2018-10-24
HK1255039A1 (zh) 2019-08-02
CR20180318A (es) 2018-09-19
JP2019506444A (ja) 2019-03-07
TW202208440A (zh) 2022-03-01
EP3389714A1 (en) 2018-10-24
AR107781A1 (es) 2018-06-06
AU2016370376A1 (en) 2018-06-21
KR20180086250A (ko) 2018-07-30
US20210130470A1 (en) 2021-05-06
SG11201804839WA (en) 2018-07-30
US20240084015A1 (en) 2024-03-14
CN108367069B (zh) 2022-08-23
CL2018001545A1 (es) 2018-10-05
MY196756A (en) 2023-05-03
JP2022001584A (ja) 2022-01-06
BR112018011781A2 (pt) 2018-12-04
TW201725215A (zh) 2017-07-16
AU2024201607A1 (en) 2024-04-11
PH12018501220A1 (en) 2019-01-28
US20190161548A1 (en) 2019-05-30
CO2018005932A2 (es) 2018-06-20
CA3006462A1 (en) 2017-06-22
ZA201803472B (en) 2019-01-30
JP6955507B2 (ja) 2021-10-27
MX2018007089A (es) 2019-01-30
ECSP18043564A (es) 2018-06-30
US11840571B2 (en) 2023-12-12
TWI758267B (zh) 2022-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA125611C2 (uk) Біспецифічні молекули, що мають імунореактивність відносно pd-1 і ctla-4, і способи їх застосування
US11945873B2 (en) Antitumor antagonists
JP7451627B2 (ja) キメラ受容体及びその使用方法
US20210115123A1 (en) Trispecific inhibitors for cancer treatment
JP7352473B2 (ja) がん細胞を標的化するキメラ抗原受容体のための方法および組成物
UA127372C2 (uk) Моноспецифічне pd-1-сполучне моноклональне антитіло
UA119673C2 (uk) Біспецифічне fc-діатіло, здатне імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом pd-1 і з епітопом lag-3, та його застосування
UA126657C2 (uk) ОДНОЛАНЦЮГОВА КОНСТРУКЦІЯ АНТИТІЛА ДО BCMA І CD3<font face="Symbol">e</font>
UA125577C2 (uk) Антигензв'язуюча молекула, які містить тримерний ліганд сімейства tnf
UA123310C2 (uk) Зв'язуюча lag-3 молекула та спосіб її застосування
US11066471B2 (en) Antibodies to MICA and MICB proteins
UA126441C2 (uk) Химерні антигенні рецептори, націлені на bcma, та способи їх застосування
UA121914C2 (uk) Молекула, що зв'язує pd1 і lag3
UA126275C2 (uk) Конструкція антитіла для cd70 та cd3
UA122676C2 (uk) Біспецифічна антигензв'язувальна молекула проти folr1 і cd3, що активує t-клітини
UA111612C2 (uk) Домени, які зв'язуються з деімунізованою сироваткою, і їхнє застосування для збільшення часу напівжиття в сироватці
AU2014229476A1 (en) Antibodies to MICA and MICB proteins
UA121844C2 (uk) Людське антитіло до cd27, спосіб його одержання та застосування
UA127450C2 (uk) Рекомбінантний поліпептид, що зв'язується з cd123
WO2019195409A1 (en) Proteins binding nkg2d, cd16 and an antigen associated with tumors, mdscs and/or tams
TWI793325B (zh) 對cd3具特異性之抗體及其用途
JP2018522904A (ja) キメラ抗原受容体及びキメラ抗原受容体が発現されたｔ細胞
US20230183342A1 (en) Antibodies to nkp46 and constructs thereof for treatment of cancers and infections
CN109321530B (zh) 一种安全型嵌合抗原受体t细胞及其用途
US11993659B2 (en) BCMA targetting antibodies, chimeric antigen receptors, and uses thereof