JP2018506280A - 免疫調節薬 - Google Patents
免疫調節薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018506280A JP2018506280A JP2017541326A JP2017541326A JP2018506280A JP 2018506280 A JP2018506280 A JP 2018506280A JP 2017541326 A JP2017541326 A JP 2017541326A JP 2017541326 A JP2017541326 A JP 2017541326A JP 2018506280 A JP2018506280 A JP 2018506280A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- chain variable
- antibody
- variable region
- region sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、PD−1に特異的に結合する抗体、それをコードする核酸、及びその治療用組成物を提供する。この作用物質は、新生物疾患及び感染性疾患の治療のために、PD−1媒介免疫抑制を阻害し、また細胞及びサイトカイン媒介免疫を向上させる。【選択図】図1
Description
本発明は、PD−1に特異的に結合するモノクローナル抗体及びその治療用組成物を提供する。この作用物質は、癌及び感染性疾患を含める様々な免疫機能不全関連疾患の治療のために、T細胞及びNK細胞機能を向上させて細胞及びサイトカイン媒介免疫を増加させる。
関連出願の相互参照
関連出願の相互参照
本出願は、本明細書にその内容の全体が参照として組み込まれる、2015年2月6日に出願された米国仮出願第62/113,132号の優先権を主張するものである。
プログラム死1(PD−1)は、CD28、CTLA−4、PD−1、ICOS、及びBTLAを含む、受容体のCD28ファミリーの一員である(Freeman et al.(2000)J Exp Med 192:1027−34;Latchman et al.(2001)Nat Immunol 2:261−8)。PD−1は、免疫病理学的状態の進行中に活性化T細胞及びB細胞上で主に上方制御される、誘導性免疫抑制受容体である。PD−1が、そのリガンドであるPD−L1との相互作用することにより、TCR及びBCRが媒介する増殖、及びサイトカイン産生の阻害、ならびに固有のPD-1が媒介する、免疫レセプターチロシン阻害モチーフ(ITIM)の陰性シグナル伝達による、抗原特異的T細胞のアポトーシスの誘発がもたらされる(Agata et al.(1996)Int.Immunol.8:765、Unkeless and Jin.(1997)Curr.Opin.Immunol.9:338−343、Okzaki et al.(2001)PNAS 98:13866−71、Dong et al.(2002)Nat.Med.8:793−800)。PD−L1は、細胞表面糖タンパク質であり、PD−1に対する主要なリガンドである。PD−L1はまた、細胞活性化の後に、リンパ組織及び非リンパ抹消組織上でも誘導可能である。PD−L1は、免疫細胞に加えて、癌細胞及びストローマ細胞を含む様々な病的細胞型において上方制御され、疾患の悪化の過程における免疫抑制に積極的な役割を果たす(Iwai et al(2002)PNAS 99:12293−7、Ohigashi et al.(2005)Clin Cancer Res 11:2947−53)。PD−L1の上方制御は、種々の癌及びウイルス感染において臨床転帰不良と関係している(Hofmeyer et al.(2011)J. BioMed. Biotech.2011:1−9、McDermott and Atkins.(2013)Cancer Med.2:662−73)。抗体によるPD−1またはPD−L1の封鎖は、CD8 T細胞浸潤、CTL活性化を促進し、前臨床及び臨床現場におけるTh1サイトカインIFN−ガンマの存在を増加させた(Zhou et al.(2010)J.Immunol.185:5082−92、Nomi et al.(2007)Clin Cancer Res.13:2152−7、Flies et al.(2011)Yale J. Bio.Med.48:409−21、Zitvogel and Kroemer.(2012)OncoImmunol.1:1223−25)。
本発明のPD−1抗体は、免疫調節剤として使用され、単剤療法として使用されるとき、または他の免疫抑制分子に対する抗体と併用されるときに有効であり得る。
本発明は、PD−1に結合する抗体及び結合タンパク質を提供する。本発明のある特定の実施形態において、これらの抗体はPD−1に結合し、PD−L1との相互作用を遮断する。PD−1がPD−L1と相互作用することを遮断することによって、このような抗体は、免疫抑制を低減または阻害するのに有用である。
一実施形態において、本発明は、PD−1に結合する抗体または断片を提供し、これは、配列番号6、配列番号16、配列番号26、または配列番号36を含む重鎖可変ドメインを含む。このような実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号6、配列番号16、配列番号26、または配列番号36と少なくとも80%、または少なくとも85%、または少なくとも90%、または少なくとも95%同一である。これら抗体は、配列番号10、配列番号20、配列番号30、配列番号40、配列番号44、配列番号48、配列番号52、配列番号56、配列番号60、配列番号64、配列番号68、配列番号72、配列番号76、配列番号80、配列番号84、配列番号88、配列番号92、配列番号96、配列番号100、配列番号104、配列番号108、配列番号112、配列番号116、配列番号120、配列番号124、配列番号128、配列番号132、配列番号136、配列番号140、配列番号144、配列番号148、配列番号152、配列番号156、配列番号160、配列番号164、配列番号168、配列番号172、配列番号176、配列番号180、配列番号184、配列番号188、配列番号192、配列番号196、配列番号200、配列番号204、配列番号208、配列番号212、配列番号216、配列番号220、配列番号224、配列番号228、配列番号232、配列番号236、配列番号240、配列番号244、または配列番号248を含む軽鎖可変ドメインをさらに含むことができる。このような実施形態において、軽鎖可変ドメインは、配列番号10、配列番号20、配列番号30、配列番号40、配列番号44、配列番号48、配列番号52、配列番号56、配列番号60、配列番号64、配列番号68、配列番号72、配列番号76、配列番号80、配列番号84、配列番号88、配列番号92、配列番号96、配列番号100、配列番号104、配列番号108、配列番号112、配列番号116、配列番号120、配列番号124、配列番号128、配列番号132、配列番号136、配列番号140、配列番号144、配列番号148、配列番号152、配列番号156、配列番号160、配列番号164、配列番号168、配列番号172、配列番号176、配列番号180、配列番号184、配列番号188、配列番号192、配列番号196、配列番号200、配列番号204、配列番号208、配列番号212、配列番号216、配列番号220、配列番号224、配列番号228、配列番号232、配列番号236、配列番号240、配列番号244、または配列番号248と少なくとも80%、または少なくとも85%、または少なくとも90%、または少なくとも95%同一である。
別の実施形態において、本発明は、PD−1に結合する抗体またはその断片を提供し、ここで重鎖は、配列番号1、配列番号11、配列番号21、または配列番号31を有するCDR−1H(Kabat)と、配列番号3、配列番号13、配列番号23、または配列番号33を有するCDR−2H(Kabat)と、配列番号5、配列番号15、配列番号25、または配列番号35を有するCDR−3Hとを含む。別の実施形態において、PD−1に結合する抗体またはその断片を提供し、ここで重鎖は、配列番号2、配列番号12、配列番号22、または配列番号32を有するCDR−1H(Chothia)と、配列番号4、配列番号14、配列番号24、または配列番号34を有するCDR−2H(Chothia)と、配列番号5、配列番号15、配列番号25、または配列番号35を有するCDR−3Hとを含む。別の実施形態において、PD−1に結合する抗体またはその断片を提供し、ここで軽鎖は、配列番号:7、配列番号:17、配列番号: 27、配列番号:37、配列番号:41、配列番号:45、配列番号:49、配列番号:53、配列番号:57、配列番号:61、配列番号:65、配列番号:69、配列番号:73、配列番号:77、配列番号:81、配列番号:85、配列番号:89、配列番号:93、配列番号:97、配列番号:101、配列番号:105、配列番号:109、配列番号:113、配列番号:117、配列番号:121、配列番号:125、配列番号:129、配列番号:133、配列番号:137、配列番号:141、配列番号:145、配列番号:149、配列番号:153、配列番号:157、配列番号:161、配列番号:165、配列番号:169、配列番号:173、配列番号:177、配列番号:181、配列番号:185、配列番号:189、配列番号:193、配列番号:197、配列番号:201、配列番号:205、配列番号:209、配列番号:213、配列番号:217、配列番号:221、配列番号:225、配列番号:229、配列番号:233、配列番号:237、配列番号:241、または配列番号:245を有するCDR−1Lと、配列番号:8、配列番号:18、配列番号:28、配列番号:38、配列番号:42、配列番号:46、配列番号:50、配列番号:54、配列番号:58、配列番号: 62、配列番号:66、配列番号:70、配列番号:74、配列番号:78、配列番号:82、配列番号:86、配列番号:90、配列番号:94、配列番号:98、配列番号:102、配列番号:106、配列番号:110、配列番号:114、配列番号:118、配列番号:122、配列番号:126、配列番号:130、配列番号:134、配列番号:138、配列番号:142、配列番号:146、配列番号:150、配列番号:154、配列番号:158、配列番号:162、配列番号:166、配列番号:170、配列番号:174、配列番号:178、配列番号:182、配列番号:186、配列番号:190、配列番号:194、配列番号:198、配列番号:202、配列番号:206、配列番号:210、配列番号:214、配列番号:218、配列番号:222、配列番号:226、配列番号:230、配列番号:234、配列番号:238、配列番号:242、または配列番号:246を有するCDR−2Lと、配列番号:9、配列番号:19、配列番号:29、配列番号:39、配列番号:43、配列番号:47、配列番号:51、配列番号:55、配列番号:59、配列番号:63、配列番号:67、配列番号:71、配列番号:75、配列番号:79、配列番号:83、配列番号:87、配列番号:91、配列番号:95、配列番号:99、配列番号:103、配列番号:107、配列番号:111、配列番号:115、配列番号:119、配列番号:123、配列番号:127、配列番号:131、配列番号:135、配列番号:139、配列番号:143、配列番号:147、配列番号:151、配列番号:155、配列番号:159、配列番号:163、配列番号:167、配列番号:171、配列番号:175、配列番号:179、配列番号:183、配列番号:187、配列番号:191、配列番号:195、配列番号:199、配列番号: 203、配列番号: 207、配列番号:211、配列番号:215、配列番号:219、配列番号:223、配列番号:227、配列番号:231、配列番号:235、配列番号:239、配列番号:243、配列番号:247を有するCDR−3Lと、を含む。
本発明はまた、例えば、造影剤、治療薬、または細胞傷害性剤が挙げられるが、これらに限定されない、抗体のコンジュゲートも提供する。
本発明は、抗体及びコンジュゲート、ならびに製薬上許容し得る担体を含む組成物をさらに提供する。
本発明は、本発明の抗体または断片の有効量を投与することを含む、対象においてPD−1のPD−L1との相互作用を阻害する方法を提供する。本発明は、本発明の抗体または断片の有効量を投与することを含む、PD−1によって媒介される免疫抑制を阻害する方法をさらに提供する。
本発明は、対象に本発明の抗体または断片の有効量を投与することを含む、PD−1を発現する細胞または組織に対して免疫応答を刺激する方法をさらに提供する。ある特定の実施形態において、PD−1を発現する細胞または組織は、新生細胞または感染細胞である。
PD−1の免疫細胞上でのPD−L1との相互作用は、免疫細胞による増殖及びサイトカイン産生が阻害される。PD−L1はまた、癌を含む種々の組織において誘導可能でありかつ上方制御される。PD−1及びPD−L1は共に、免疫抑制において役割を果たす。本発明は、PD−1に結合し、PD−L1との相互作用を遮断する新規の抗体、またはこのような抗体の抗原結合断片を提供する。本発明の実施形態において、抗体は免疫抑制を低下させるかまたは阻害する。
本発明の新規の抗体は、表1及び添付の配列表に記述されており、これらは、重鎖及び軽鎖CDR(Kabat及びChothiaの識別システムに従って識別)、ならびに完全な重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を説明している。最初の2つの重鎖CDRは、Kabat及びChothiaの一般的なシステムに従って識別され、その結果、区別できるが重なり合う、CDRの位置が提供される。多数の重鎖及び軽鎖の比較することで、多くのCDR配列の中で著しい類似性が示される。したがって、多くのCDRを混合し、配列内でマッチングさせることができると予想される。
抗体は、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、及び/または付加を有することができる。ある特定の実施形態において、これらの抗体は、上述した重鎖可変ドメインのうちの1つと、上述した軽鎖可変ドメインのうちの1つとを含む。ある特定の実施形態において、PD−1抗体またはその結合断片は、表1で説明したCDR及び可変ドメイン配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を有する、1つ以上のCDRまたは1つ以上の可変ドメインを含む。
「同一性」とは、ギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れた、2つのアミノ酸または核酸配列により共有されている、同一の位置の数または割合を指し、2つの配列の最適アライメントのために導入される必要がある。「実質的に同一である」は、保存的アミノ酸置換、例えば、同一クラスの別のアミノ酸に対するアミノ酸置換(例えば、グリシンに対するバリンに、リシンに対するアルギニン等)によって、またはタンパク質の機能を破壊しないアミノ酸配列の位置における1つ以上の非保存的置換、欠失、もしくは挿入によってのみ異なるアミノ酸配列を意味する。アミノ酸置換は、場合によっては、(a)置換の領域におけるペプチド主鎖の構造、(b)標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖の嵩を維持することで効果がそれ程大きく異ならない置換を選択することによって行うことができる。例えば、天然の残基は、側鎖の性質に基づいてグループ:(1)疎水性アミノ酸(ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン);(2)中性親水性アミノ酸(ステイン、セリン、及びスレオニン);(3)酸性アミノ酸(アスパラギン酸及びグルタミン酸);(4)塩基性アミノ酸(アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、及びアルギニン);(5)鎖配向に影響を及ぼすアミノ酸(グリシン及びプロリン);ならびに(6)芳香族アミノ酸(トリプトファン、チロシン、及びフェニルアラニン)に分けることが可能である。これらのグループ内で行われる置換は保存的置換と見なすことができる。置換の例としては、アラニンに対するバリン、アルギニンに対するリジン、アスパラギンに対するグルタミン、アスパラギン酸に対するグルタミン酸、システインに対するセリン、グルタミンに対するアスパラギン、グルタミン酸に対するアスパラギン酸、グリシンに対するプロリン、ヒスチジンに対するアルギニン、イソロイシンに対するロイシン、ロイシンに対するイソロイシン、リジンに対するアルギニン、メチオニンに対するロイシン、フェニルアラニンに対するロイシン、プロリンに対するグリシン、セリンに対するスレオニン、スレオニンに対するセリン、トリプトファンに対するチロシン、チロシンに対するフェニルアラニン、及び/またはバリンに対するロイシンの置換が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、アミノ酸配列は、本明細書に開示されるアミノ酸配列と、少なくとも80%、または少なくとも85%、または少なくとも90%、または少なくとも95%同一である。配列類似性を決定するための方法及びコンピュータプログラムは一般に入手可能であり、GCGプログラムパッケージ(Devereux et al.,Nucleic Acids Research 12:387,1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403(1990))、及びALIGNプログラム(バージョン2.0)が挙げられるが、これらに限定されない。周知のスミス・ウォーターマンアルゴリズムもまた、類似性を決定するために使用されてもよい。BLASTプログラムは、NCBI及び他のソースから公開されている(BLAST Manual,Altschul,et al.,NCBI NLM NIH,Bethesda,Md.20894;BLAST 2.0 at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。配列の比較において、これらの方法は、様々の置換、欠失、及び他の修飾を調査する。保存的置換は、通常、以下の郡内の置換が挙げられる:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン;セリン、スレオニン;リシン、アルギニン;及びフェニルアラニン、チロシン。
本発明の抗体はまた、その結合特性が、直接変異、親和性成熟法、ファージディスプレイ、または鎖シャフリングの方法によって改善されたものも含む。親和性及び特異性は、CDRを突然変異させて、所望の特性を有する抗原結合部位をスクリーニングすることによって修正または向上されてもよい。CDRは様々な方法で突然変異される。1つの方法は、個々の残基または残基の組み合わせをランダム化することで、別様においては同一である抗原結合部位の母集団において、20個のアミノ酸全てが特定の位置に見出されるようにすることである。あるいは、エラープローンPCR法によって、突然変異がCDR残基の一連の範囲にわたって誘導される(例えば、Hawkins et al.,J.Mol.Biol.,226:889−896(1992)を参照のこと)。例えば、重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を含有するファージディスプレイベクターを、大腸菌(E.coli)の突然変異誘発株中で増殖させてもよい。(例えば、Low et al.,J.Mol.Biol.,250:359−368(1996)を参照のこと)。これらの突然変異誘発の方法は、当業者に既知の多くの方法を例証するものである。
免疫原性を最小限に抑えるために、ヒト定常ドメイン配列を含む抗体が好ましい。抗体は、IgG、IgM、IgA、IgD、またはIgEなどの任意の免疫グロブリンクラス、及びそれらのサブクラスの一員であってもよく、またはこれらを組み合わせてもよい。抗体のクラスは、自然抗体のエフェクター機能(例えば、補体依存性細胞傷害性(CDC)及び抗体依存性細胞傷害性(ADCC))を最適化するように選択されてもよい。
本発明のある特定の実施形態は、PD−1結合抗体断片の使用を伴う。Fvは、全ての6つの超可変ループ(CDR)を含む完全な重鎖及び軽鎖可変ドメインを含有する最少の断片である。定常ドメインを欠如するために、可変ドメインは、非共有結合である。VH及びVLドメインを結合させて抗原結合部位を形成するリンカーを使用して、重鎖及び軽鎖を結合し、単一ポリペプチド鎖(「単鎖Fv」または「scFv」)にしてもよい。本発明の一実施形態において、リンカーは(Gly−Gly−Gly−Gly−Ser)3である。scFv断片は、全抗体の定常ドメインを欠如するために、これらは全抗体よりも大幅に小さい。scFv断片はまた、通常の重鎖定常ドメインと他の生体分子との相互作用がなく、ある特定の実施形態において望ましくない場合がある。
VH、VL、及び任意にCL、CH1、または他の定常ドメインを含有する抗体の断片も使用することができる。パパイン分解によって生成された抗体一価の断片は、Fabと称され、重鎖ヒンジ領域を欠如する。ペプシン分解によって生成された断片は、F(ab’)2と称され、重鎖ヒンジを保持し、二価である。このような断片も、組換え的に作製されてもよい。多くの他の有用な抗原結合抗体断片が当該技術分野において既知であり、二重特異性抗体、三重特異性抗体、単一ドメイン抗体、ならびに他の一価及び多価の形態が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、多価抗原結合タンパク質をさらに提供し、これらは、抗体、それらの抗原結合断片、及び抗体の抗原結合部分の全てまたは一部を含むタンパク質の形態とすることができるが、これらに限定されない。多価の抗原結合タンパク質は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であってもよい。用語特異性とは、特定の分子が結合することができる抗原決定基の異なる種類の数を指す。免疫グロブリン分子が1種類のみの抗原決定基に結合する場合、その免疫グロブリン分子は単一特異性である。免疫グロブリン分子が、異なる種類の抗原決定基に結合するならば、そのときはこの免疫グロブリンは、多重特異性である。
本発明の一実施形態において、PD−1結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定されるとき、少なくとも約102M−1s−1、少なくとも約103M−1s−1、少なくとも約104M−1s−1、少なくとも約105M−1s−1、または少なくとも約106M−1s−1の結合速度定数(Kon)を有する。一実施形態において、PD−L1結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定されるとき、102M−1s−1〜103M−1s−1、103M−1s−1〜104M−1s−1、104M−1s−1〜105M−1s−1、または105M−1s−1〜106M−1s−1の結合速度定数(Kon)を有する。
別の実施形態において、PD−1結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定されるとき、最大で約10−3s−1、最大で約10−4s−1、最大で約10−5s−1、または最大で約10−6s−1の解離速度定数(Koff)を有する。一実施形態において、PD−L1結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定されるとき、10−3s−1〜10−4s−1の、10−4s−1〜10−5s−1の、または10−5s−1〜10−6s−1の解離速度定数(Koff)を有する。
別の実施形態において、PD−1結合タンパク質は、最大で約10−7M、最大で約10−8M、最大で約10−9M、最大で約10−10M、最大で約10−11M、最大で約10−12M、または最大で約10−13Mの解離定数(KD)を有する。一実施形態において、結合タンパク質は、10−7M〜10−8Mの、10−8M〜10−9Mの、10−9M〜10−10Mの、10−10M〜10−11Mの、10−11M〜10−12Mの、または10−12M〜10−13Mの、その標的に対する解離定数(KD)を有する。
本明細書に記載される結合タンパク質は、造影剤、治療薬、または最小傷害性薬をさらに含むコンジュゲートであってもよい。一実施形態において、造影剤は、放射線標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、またはビオチンである。別の実施形態において、放射線標識は、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、または153Smである。さらに別の実施形態において、治療薬または細胞傷害性剤は、代謝抵抗物質、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、毒素、またはアポトーシス剤である。以下で論じる通り、免疫刺激性サイトカインは、特に重要である。
本明細書で例示するように、分子のPD−1結合部分は、抗体の抗原結合ドメインである。いくつかの新規の抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインならびにこれらを含む抗体が提供される。本発明によれば、PD−1結合部分は、PD−1に結合しまた免疫抑制を遮断する任意の作用物質とすることができる。これらとしては、本明細書で開示されるこれらの新規の抗体、ならびにPD―L1由来のペプチド及びタンパク質(PD−1の天然リガンド)に限定されない、抗PD−1抗体及び断片が挙げられる。
本発明の抗PD−1抗体は、予防または治療の目的で哺乳動物において使用される場合、製薬上許容し得る担体をさらに含む組成物の形態で投与されることが理解される。好適な製薬上許容し得る担体としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、スクロース、ポリソルベート、エタノール等、及びそれらの組み合わせのうちの1つ以上が挙げられる。製薬上許容し得る担体は、抗体の貯蔵寿命または有効性を向上させる、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤もしくは緩衝液などの少量の補助物質をさらに含む。
本発明の方法において、本発明の抗体または抗体断片の治療的有効量が、それを必要とする哺乳動物に投与される。本明細書で使用される場合、用語「投与する」は、求められる結果を得ることができる任意の方法によって、本発明の抗体を哺乳動物に送達することを意味する。これらは、例えば、静脈内または筋肉内で投与されてもよい。本発明の例示された抗体は、ヒトへの投与に特に有用であるが、これらは、他の哺乳動物に同様に投与されてもよい。本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物」は、ヒト、実験動物、家庭用ペット及び家畜動物が含むことを目的としているが、これらに限定されない。「治療的有効量」は、哺乳動物に投与されるとき、キナーゼ活性を阻害するなど、所望の治療効果を生じることで有効である、本発明の抗体の量を意味する。
本発明の抗体は、腫瘍または他の新生物疾患を阻害するために、ならびに免疫抑制に関連する他の病態を治療するために有用である。治療可能な腫瘍としては、原発腫瘍、転移性腫瘍、及び難治性腫瘍が含まれる。難治性腫瘍としては、単独の化学療法、単独の抗体療法、単独の放射線療法またはこれらの組み合わせによる治療に対して反応しないか、または耐性がある腫瘍が含まれる。難治性腫瘍はまた、このような作用物質による治療によって阻害されたように見えるが、治療が中断された後、最長5年で、場合によっては最長10年またはそれ以上で再発する腫瘍も包含する。本抗体は、血管が新生化腫瘍及び血管新生化されていない、または依然として実質的に血管新生化されていない腫瘍を治療するために有効である。
抗体により治療され得る固形腫瘍の例としては、乳癌、肺癌、結直腸癌、膵臓癌、神経膠腫、及びリンパ腫が挙げられる。このような腫瘍のいくつかの例としては、類上皮腫、扁平上皮腫(頭頚部腫など)、結直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳腫瘍、肺腫瘍(小細胞及び非小細胞肺腫瘍を含める)、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、及び肝臓腫瘍が含まれる。他の例としては、カポジ肉腫、CNSの新生物、神経芽細胞腫、毛細血管芽腫、髄膜腫ならびに脳転移、メラノーマ、胃腸ならびに腎癌及び肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫(好ましくは、多形膠芽腫)、及び平滑筋肉腫が含まれる。本発明の拮抗薬が有効である血管新生皮膚癌の例としては、悪性角化細胞、例えばヒト悪性角化細胞の増殖を抑制することによって治療することができる扁平細胞癌、基底細胞癌及び皮膚癌が挙げられる。
非固形腫瘍の例としては、白血病、多発性骨髄腫、及びリンパ腫が含まれる。いくつかの実施形態において、これらの腫瘍は、IL15などのサイトカインに対して非反応性であり得る。白血病のいくつかの例としては、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、赤血球性白血病、または単球性白血病が含まれる。リンパ腫のいくつかの例としては、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。
本発明のPD−1抗体は、ウイルス感染の治療でも使用される。PD−1のT細胞上の発現は、HIVのウイルス量及びHCVに感染した患者と相関し、PD−1の発現は、枯渇したウイルス特異的CD8+T細胞についてのマーカーとして特定されている。例えば、PD−1+CD8+T細胞は、エフェクター機能障害及びPD−1/PD−L1相互作用を遮断することによって復活され得るPD−1関連T細胞の枯渇を示す。これは、ウイルス特異的なCD8+T細胞が媒介する免疫の回復をもたらし、このことは、拮抗作用抗体を使用してPD−1シグナル伝達を妨害することが、T細胞のエフェクター機能を回復させることを示唆している。PD−1/PD−L1の封鎖に基づく免疫療法は、腫瘍抗原に対するT細胞寛容の破壊をもたらすのみならず、ウイルス特異的エフェクターT細胞を再活性化し、また慢性ウイルス感染における病原体を根絶するための戦略も提供する。したがって、本発明の抗体は、HCVならびにHIV、及びリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)が挙げられるが、これらに限定されない慢性ウイルス感染を治療するために有用である。
本発明の抗体は、好都合に、第2の作用物質と共に、それを必要とする患者に投与することができる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、抗新生物剤と共に対象に投与される。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、血管新生阻害剤と共に対象に投与される。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、抗炎症剤または免疫抑制剤と共に投与される。
抗新生物剤としては、細胞傷害性化学療法剤、標的小分子及び生体分子、ならびに放射線が挙げられる。化学療法剤の日限定的な例としては、シスプラチン、ダカルバジン(DTIC)、ダクチノマイシン、イリノテカン、メクロレタミン(ナイトロジェン・マスタード、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、ドキシルビシン(アドリアマイシン)、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、5−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル(タキソール)、ドセタキセル(タキソテール)、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラスチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、インターフェロンアルファ、ロイプロリド、メガストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシル・マスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、タキソール、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
標的小分子及び生体分子としては、チロシンキナーゼの調節物質などのシグナル伝達経路の構成成分の阻害剤及び受容体キナーゼの阻害剤、ならびに腫瘍特異的抗原に結合する作用物質が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍形成に関与する増殖因子受容体の非限定的な例としては、血小板由来増殖因子(PDGFR)、インスリン様増殖因子(IGFR)、神経増殖因子(NGFR)、及び線維芽細胞増殖因子(FGFR)に対する受容体、ならびに上皮細胞増殖因子受容体(EGFR、erbB1としても知られる)、HER2(erbB2)、erbB3、及びerbB4が含まれる上皮細胞増殖因子受容体ファミリーの受容体が挙げられる。
EGFR拮抗剤としては、EGFRに、またはEGFRリガンドに結合し、またリガンド結合及び/または受容体活性化を阻害する抗体が含まれる。例えば、この作用物質は、他のEGFRファミリーメンバーとの受容体の二量体またはヘテロ二量体の形成を遮断することができる。EGFRに対するリガンドとしては、例えば、EGF、TGF−αアンフィレグリン、ヘパリン結合EGF(HB−EGF)及びβレグルリン(betaregullulin)が挙げられる。EGFR拮抗剤はEGFRの細胞外部分に外的に結合することができ(これはリガンドの結合を阻害し得る、もしくは阻害し得ない)、または、チロシンキナーゼ領域に内的に結合することができる。EGFR拮抗剤としてはさらに、例えば、EGFRシグナル伝達経路の成分の機能を阻害することにより、EGFR依存性シグナル伝達を阻害する作用物質が挙げられる。EGFRに結合するEGFR拮抗剤の例としては、EGFRに特異的な抗体(及びその機能的等価物)等の生体分子、ならびに、EGFRの細胞質領域に直接作用する合成キナーゼ阻害剤等の小分子が挙げられるが、これらに限定されない。
小分子及び生物学的阻害剤としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びセツキシマブを含む上皮成長因子受容体(EGFR)の阻害剤、HER2の阻害剤(例えばトラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン(トラスツズマブ-DM1;T-DM1)及びペルツズマブ)、抗VEGF抗体及び断片(例えばベバシズマブ)、CD20を阻害する抗体(例えばリツキシマブ、イブリツモマブ)、抗VEGFR抗体(例えばラムシルマブ(IMC-1121B)、IMC-1C11、及びCDP791)、抗PDGFR抗体、ならびにイマチニブが挙げられる。低分子キナーゼ阻害剤は特定のチロシンキナーゼに特異的であることができるか、または2つ以上のキナーゼの阻害剤であることができる。例えば、化合物N-(3,4-ジクロロ-2-フルオロフェニル)-7-({[(3aR,6aS)-2-メチルオクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール-5-イル]メチル}オキシ)-6-(メチルオキシ)キナゾリン-4-アミン(XL647、EXEL-7647及びKD-019としても知られている)は、EGFR、EphB4、KDR(VEGFR)、Flt4(VEGFR3)及びErbB2を含む複数の受容体型チロシンキナーゼ(RTK)のin vitro阻害剤であり、かつ、SRCキナーゼの阻害剤でもあり、特定のTKIに対して腫瘍が非反応性となる経路に関係する。本発明の一実施形態において、必要な対象の治療には、rhoキナーゼ阻害剤の投与が含まれる。
ダサチニブ(BMS-354825;Bristol-Myers Squibb,New York)は別の、経口の生体利用可能なATP部位競合Src阻害剤である。ダサチニブはまた、Bcr-Abl(慢性骨髄性白血病(CML)またはフィラデルフィア染色体陽性(Ph+)急性リンパ性白血病(ALL))を有する患者にて使用するためのもので、FDA認可済み)、ならびにc-kit、PDGFR、c-FMS、EphA2、及びSFKsも標的とする。Src及びBcr-Ablの他の2つの経口チロシンキナーゼ阻害剤は、ボスチニブ(SKI-606)及びサラカチニブ(AZD0530)である。
本発明の一実施形態において、本発明のPD-1抗体は、慢性ウイルス感染症を治療するために抗ウイルス剤と組み合わせて使用される。例えば、HCVを治療するために、以下の作用物質を使用することができる。HCVプロテアーゼ阻害剤としては、ボセプレビル、テラプレビル(VX-950)、ITMN-191、SCH-900518、TMC-435、BI-201335、MK-7009、VX-500、VX-813、BMS790052、BMS650032及びVBY376が挙げられるが、これらに限定されない。HCV非構造タンパク質4B(NS4B)阻害剤としては、クレミゾール、ならびに、非限定的にベンゾイミダゾールRBI(B-RBI)及びインダゾールRBI(I-RBI)を含む他のNS4B-RNA結合阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。HCV非構造タンパク質5A(NS5A)阻害剤としては、BMS-790052、A-689、A-831、EDP239、GS5885、及びPP1461が挙げられるが、これらに限定されない。HCVポリメラーゼ(NS5B)阻害剤としては、ヌクレオシド類似体(例えばバロピシタビン、R1479、R1626、R7128)、ヌクレオチド類似体(例えばIDX184、PSI-7851、PSI-7977)、及び非ヌクレオシド類似体(例えばフィリブビル(filibuvir)、HCV-796、VCH-759、VCH-916、ANA598、VCH-222(VX-222)、BI-207127、MK-3281、ABT-072、ABT-333、GS9190、BMS791325)が挙げられるが、これらに限定されない。また、リバビリン、またはタリバビリン(ビラミジン;ICN 3142)等のリバビリン類似体、ミゾリビン、メリメポジブ(Merimepodib)(VX-497)、ミコフェノール酸モフェチル、及びミコフェノレートを使用することもできる。
ある特定の実施形態において、本発明の抗体の1回分の用量を、対象に、毎日、1日おき、数日おき、3日に1回、週に1回、週に2回、週に3回、または2週に1回投与する。他の実施形態では、化合物または組成物の2、3または4回分の用量を、毎日、数日おき、3日に1回、週に1回、または2週に1回、対象に投与する。いくつかの実施形態において、化合物または組成物の1回分の用量(または複数回の用量)を2日、3日、5日、7日、14日、または21日間投与する。ある種の実施形態において、投与量の化合物または組成物を1ヶ月、1.5ヶ月、2ヶ月、2.5ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月間またはそれ以上投与する。
投与方法としては、非経口、皮内、硝子体内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経鼻、硬膜外、経口、舌下、経鼻、脳内、腟内、経皮、経粘膜、直腸、吸入、または局所(特に耳、鼻、目、もしくは皮膚)が挙げられるが、これらに限定されない。投与方法は施術者の裁量に委ねられる。ほとんどの場合、投与により化合物を血流中に放出する。眼疾患の治療には、生物学的作用物質の硝子体内投与が好ましい。
特定の実施形態において、局所的に化合物を投与するのが望ましい場合がある。この投与は例えば、局所注入、局所適用により、注射により、カテ-テルにより、またはインプラント(このインプラントは多孔性、非多孔性、またはゲル状物質であり、シラスティック膜または繊維等が含まれる)により達成され得るが、これらに限定されない。このような例において投与は、化合物を実質的に血流中に放出することなく、選択的に局部組織を標的としてよい。
例えば、吸入器もしくはネブライザを使用、及びエアロゾル化剤を処方して、またはフルオロカーボンもしくは合成肺サーファクタント中での還流により、経肺投与もまた用いることができる。ある特定の実施形態において、従来の結合剤及びトリグリセリド等の賦形剤を用いて化合物を座薬として配合してよい。
別の実施形態において、化合物を小胞、特にリポソームとして送達する(Langer,1990,Science 249:1527-1533;Treat et al.,in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Bacterial infection,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365(1989);Lopez Berestein,ibid.,pp.317-327;通常同上の箇所を参照のこと)。
別の実施形態において、化合物を制御放出系にて送達する(例えば、Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984)を参照のこと)。Langer,1990,Science 249:1527-1533の説明にて考察されている制御放出系の例を使用してよい。一実施形態では、ポンプを使用してよい(Langer,supra;Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201;Buchwald et al.,1980,Surgery 88:507;Saudek et al.,1989,N.Engl.J.Med.321:574を参照のこと)。別の実施形態では、高分子材料を使用することができる(Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984);Ranger and Peppas,1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61を参照のこと;また、Levy et al.,1985,Science 228:190;During et al.,1989,Ann.Neurol.25:351;Howard et al.,1989,J.Neurosurg.71:105も参照のこと)。
上述の投与スケジュールは、例示の目的のためだけに提供するものであり、これらに限定されるべきではない。当業者は速やかに、あらゆる投与が本発明の範囲内にあることを理解するであろう。
本明細書において開示された発明原理の変形が当業者により行われ得ることが理解及び想定されるべきであり、また、このような変形は本発明の範囲に含まれるべきであることが意図される。
本出願の全体を通して、種々の出版物が参照されている。これらの出版物は、本発明が関係する現況技術をより完全に説明するために、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。以下の実施例において本発明をさらに説明するが、決して本発明の適用範囲を限定するものと解釈してはならない。
ファージディスプレイライブラリーからの、PD−L1に対する特異的高親和性抗体
高親和性を有する高PD−1抗体を、ファージディスプレイライブラリーを使用して入手した。一手順では、Dyaxライブラリーから増幅したファージFabを、ビオチン−抗hFc Ab及び磁気ストレプトアビジン(strep)ビーズによって捕捉した可溶性PD−1−Fc上でパンニングした。
高親和性を有する高PD−1抗体を、ファージディスプレイライブラリーを使用して入手した。一手順では、Dyaxライブラリーから増幅したファージFabを、ビオチン−抗hFc Ab及び磁気ストレプトアビジン(strep)ビーズによって捕捉した可溶性PD−1−Fc上でパンニングした。
第2の手順では、Dyaxライブラリーから増幅したファージFabを、チューブ固定化したPD−1−Fc上でパンニングした。
第3の手順では、Dyaxライブラリーから増幅したファージFabを、第1ラウンドでは、チューブ固定化したPD−1−Fc上でパンニングした。次いで、第2ラウンドでは、PD−1でトランスフェクトした293細胞上でパンニングした。
第4の手順では、Dyaxライブラリーから増幅したファージFabを、可溶性PD−1−Fc上でパンニングし、磁気ストレプトアビジンビーズによって捕捉した。
5つの特有なクローン(R3A1、R3A2、R4B3、R3B7、及びR3D6)を、さらなる特性化のためにIgGに変換した。これらの変異体の4つ(R3A1、R3A2、R4B3、及びR3D6)のアミノ酸配列を、表1の行1〜4に示す配列表に記載する。
抗体の特性化
5つの抗体の結合活性を、用量反応ELISAを用いて検討した。段階希釈した抗体を、固定化hPD−1−Fcに添加し、HRP結合抗hIgG Fab特異的抗体によって検出した。OD450の読み取りを、GraphPad Prism6を用いて、対数抗体濃度に対してプロットした。EC50を、「用量反応」(刺激)可変勾配(4つのパラメータ)」プログラムを用いて算出した。抗体はまた、固定化mPD−1−Fc及び他のFc−融合物にも添加して、hPD−1−Fcに対する特異性を決定し、また抗ヒトIgG fc特異的抗体(抗hFc Ab)に添加し、濃度測定の精度をチェックした。
5つの抗体の結合活性を、用量反応ELISAを用いて検討した。段階希釈した抗体を、固定化hPD−1−Fcに添加し、HRP結合抗hIgG Fab特異的抗体によって検出した。OD450の読み取りを、GraphPad Prism6を用いて、対数抗体濃度に対してプロットした。EC50を、「用量反応」(刺激)可変勾配(4つのパラメータ)」プログラムを用いて算出した。抗体はまた、固定化mPD−1−Fc及び他のFc−融合物にも添加して、hPD−1−Fcに対する特異性を決定し、また抗ヒトIgG fc特異的抗体(抗hFc Ab)に添加し、濃度測定の精度をチェックした。
リガンド及び受容体の相互作用を、用量反応ブロッキングELISAによって、段階希釈した抗体の存在下で検討した。段階希釈した抗体と受容体hPD−1の固定量(最終0.25μg/ml)の混合物を、リガンドhPD−L1を被覆したプレートに添加した。リガンド上に結合したhPD−1の量を、ビオチン抗ヒトPD−1ポリクローナル抗体(ヤギ)とのインキュベーション、その後のStrep−HRPとのインキュベーションによって定量化した。OD450読み取りを、GraphPad Prism6を用いて、対数抗体濃度に対してプロットした。IC50を、「用量反応」(刺激)可変勾配(4つのパラメータ)」プログラムを用いて算出した。
結果を図1〜7に示す。全ての5つの抗体は、可溶性人PD−1−Fcに結合することができ(図5)、リガンドPD−L1がPD−1に結合することを遮断することができる(図6)。R4B3は、ネズミPD−1に結合することができ(図7)、R3B7は、他のFc融合物に対して低い結合親和性を有する(図2〜4)。R3A1、R3A2、R4B3、及びR3D6を、軽鎖シャフリングを通しての親和性成熟に向かって進めた。
親和性成熟
軽鎖シャフリングを用いて、4つの有力候補の抗体の親和性を増大させた。より具体的には、R3A1、R3A2、R4B3、及びR3D6の重鎖を、κλ軽鎖プールと対を作り、軽鎖シャフリングライブラリーを構築した。このライブラリーをより高い親和性の抗体に対してパンニングした。ELISA陽性のクローンを配列決定した。特有なクローンを、競合ELISAによって比較した。これらの変異体のアミノ酸配列を、表1の行5〜56に示した配列表に記載する。
軽鎖シャフリングを用いて、4つの有力候補の抗体の親和性を増大させた。より具体的には、R3A1、R3A2、R4B3、及びR3D6の重鎖を、κλ軽鎖プールと対を作り、軽鎖シャフリングライブラリーを構築した。このライブラリーをより高い親和性の抗体に対してパンニングした。ELISA陽性のクローンを配列決定した。特有なクローンを、競合ELISAによって比較した。これらの変異体のアミノ酸配列を、表1の行5〜56に示した配列表に記載する。
有力候補の特性化
ELISA
R3A2シャフリングライブラリーからの2つの有力候補を、固相ELISAを用いて上記のように特性化した。結果を図8〜10に示す。A2_#1及びA2_#2は、hPD−1に強力に結合することができ(図8)、またリガンドPD−L1(図9)及びPD−L2(図10)がその受容体PD−1に結合することを遮断する。EC50及びIC50値を、表2に示す。
ELISA
R3A2シャフリングライブラリーからの2つの有力候補を、固相ELISAを用いて上記のように特性化した。結果を図8〜10に示す。A2_#1及びA2_#2は、hPD−1に強力に結合することができ(図8)、またリガンドPD−L1(図9)及びPD−L2(図10)がその受容体PD−1に結合することを遮断する。EC50及びIC50値を、表2に示す。
ビアコア(Biacore)
2つの有力候補の結合反応速度を、ビアコアT−200機器(GE Healthcare)上で表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて評価した。CM5チップを、ランニングバッファーHBSEP(ランニングバッファー)の10μl/mlで平衡化した。CM5チップの2つのフローセルを、1:1 NHS/EDCの注入で5分間活性化した。第2のフローセルを、10mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH5中で希釈したhPD−L1fcの5μg/mlで固定化し、30〜50RUの固定化タンパク質を得た。表面を、エタノールアミンの5分間の注入、続いてNSBレジューサーの5分間の注入で連続的に遮断した。
2つの有力候補の結合反応速度を、ビアコアT−200機器(GE Healthcare)上で表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて評価した。CM5チップを、ランニングバッファーHBSEP(ランニングバッファー)の10μl/mlで平衡化した。CM5チップの2つのフローセルを、1:1 NHS/EDCの注入で5分間活性化した。第2のフローセルを、10mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH5中で希釈したhPD−L1fcの5μg/mlで固定化し、30〜50RUの固定化タンパク質を得た。表面を、エタノールアミンの5分間の注入、続いてNSBレジューサーの5分間の注入で連続的に遮断した。
試料の泳動を、HBSEPランニングバッファー中で、30μl/分にて実行した。試料をランニングバッファー中で100〜1.37nMの濃度で段階希釈した。試料を、3分間の結合時間及び10分間の解離時間で、2つのフローセルにわたって注入した。再生を、20mMのHClの30秒間の注入による各結合サイクル後に行った。センサーグラムを各濃度について取得し、導出曲線を、Biaevaluationソフトウェアを用いて、ブランクフローセルを差し引いた状態で1:1のLangmuir結合モデルに当てはめた。結果を表3に示す。
抗PD−1抗体の細胞表面発現されたPD−1、PD−L1受容体への結合活性についてのフローサイトメトリー
有力候補抗体の、HEK293トランスフェクト細胞及びCD4ならびにCD8 T細胞中で表面発現されたPD−1またはPD−L1への結合活性を、Guava EasyCyte(商標)HTサンプリングフローサイトメーター(EMD Millipore)を用いて、製造元の指示に従って評価した。精製ヒトCD4及びCD8 T細胞を、抗CD3抗体被覆ビーズにより、1:5のビーズ対T細胞の比で4日間活性化し、その後、抗PD−1抗体で染色した。R−フィコエリスリン結合ヤギ抗ヒトIgG(カタログ番号109−116−098、Jackson ImmunoResearch)を2次抗体として用いて、一次抗体の結合を検出した。
有力候補抗体の、HEK293トランスフェクト細胞及びCD4ならびにCD8 T細胞中で表面発現されたPD−1またはPD−L1への結合活性を、Guava EasyCyte(商標)HTサンプリングフローサイトメーター(EMD Millipore)を用いて、製造元の指示に従って評価した。精製ヒトCD4及びCD8 T細胞を、抗CD3抗体被覆ビーズにより、1:5のビーズ対T細胞の比で4日間活性化し、その後、抗PD−1抗体で染色した。R−フィコエリスリン結合ヤギ抗ヒトIgG(カタログ番号109−116−098、Jackson ImmunoResearch)を2次抗体として用いて、一次抗体の結合を検出した。
HEK293細胞についての結果を図11に、CD4 T細胞については、図12に、CD8 T細胞については図13に示す。
サイトカイン産生及びT細胞増殖についてのSEB活性化PBMCアッセイ
抗PD−1抗体A2_#1及びA2_#2が、Th1サイトカイン分泌を増大させるための同等な活性を有することを確認した。PBMCを、LeukoPak(単球、リンパ球、血小板、血漿、ならびに赤血球を含む高濃度の血液細胞を含有する濃縮白血球アフェレーシス)から、Histopaque−1077(Sigma)を用いて、製造元の指示に従って単離した。PBMCを、IMDM(2mMのグルタミン、25mMのHEPES、3.024g/Lの重炭酸ナトリウムで補充したイスコフ改変ダルベッコ培地、技術カタログ番号31980−097)及び10%のウシ胎児血清(FBS、カタログ番号SH30396.03、HyClone)を含有する96ウェルプレートのウェル当たり2×104個で培養し、0.1ug/mLのSEB(ブドウ球菌エンテロトキシンB、Sigma)で5〜7日間活性化した。有力候補抗PD−1抗体のSEB活性化PBMC中でのサイトカイン産生に及ぼす効果を、培地中に放出されたサイトカインの測定によって評価した。7日目に、上清を回収し、DuosetELISAキット(R&D Systems)を用いて製造元の指示に従ってIL−2及びIFNγの測定を行った。
抗PD−1抗体A2_#1及びA2_#2が、Th1サイトカイン分泌を増大させるための同等な活性を有することを確認した。PBMCを、LeukoPak(単球、リンパ球、血小板、血漿、ならびに赤血球を含む高濃度の血液細胞を含有する濃縮白血球アフェレーシス)から、Histopaque−1077(Sigma)を用いて、製造元の指示に従って単離した。PBMCを、IMDM(2mMのグルタミン、25mMのHEPES、3.024g/Lの重炭酸ナトリウムで補充したイスコフ改変ダルベッコ培地、技術カタログ番号31980−097)及び10%のウシ胎児血清(FBS、カタログ番号SH30396.03、HyClone)を含有する96ウェルプレートのウェル当たり2×104個で培養し、0.1ug/mLのSEB(ブドウ球菌エンテロトキシンB、Sigma)で5〜7日間活性化した。有力候補抗PD−1抗体のSEB活性化PBMC中でのサイトカイン産生に及ぼす効果を、培地中に放出されたサイトカインの測定によって評価した。7日目に、上清を回収し、DuosetELISAキット(R&D Systems)を用いて製造元の指示に従ってIL−2及びIFNγの測定を行った。
IL−2分泌についての結果を図14にしめし、IFNγについての結果を図15に示す。IFNγのレベルにおける著しい増加を、有力候補抗PD−1抗体のA2_#1及びA2_#2を含む培養物で観察した。
サイトカイン産生及びT細胞増殖についての混合リンパ球反応アッセイ
抗PD−1抗体A2_#1及びA2_#2が、CD4 T細胞の増殖を増大させるための同等な活性を有することを確認した。全血から単離されたヒトCD4 T細胞を、抗PD−1抗体の存在下で、抗CD3抗体及びPD−L1−Fc被覆ビーズで4日間刺激した。増殖を、増殖マーカーKi67染色によって測定した。
抗PD−1抗体A2_#1及びA2_#2が、CD4 T細胞の増殖を増大させるための同等な活性を有することを確認した。全血から単離されたヒトCD4 T細胞を、抗PD−1抗体の存在下で、抗CD3抗体及びPD−L1−Fc被覆ビーズで4日間刺激した。増殖を、増殖マーカーKi67染色によって測定した。
結果を図16に示す。CD4 T細胞の増殖における増加を、抗PD−1抗体のA2_#1及びA2_#2を含む培養物で観察した。
抗PD−1抗体A2_#1及びA2_#2が、混合リンパ球反応におけるTh1サイトカイン分泌を増加させるための同等な活性を有することを確認した。未成熟単球由来樹状細胞(mo−DC)を、CD14陽性細胞を、10%のFBSで補充したIMDM中で、150ng/mlのGM−CSF及び50ng/mLのIL−4と共に6〜7日間培養することによって生成した。CD4陽性細胞は、RosetteSepヒトCD4濃縮キット(StemCell Technologies)を用いて全血から陰性単離した。mo−DC及びCD4陽性細胞を、次いで、mo−DC対CD4細胞の1:10の比で、それぞれ共培養した。抗PD−1抗体の遮断機能を判定するために、徐々に増加する量の抗PD−1抗体を、共培養の開始時に添加した。7日目に、上清を回収し、分泌されたIFNγの測定をELISAによって行った。
結果を図17に示す。IFNγのレベルにおける著しい増加を、抗PD−1抗体A2_#1及びA2_#2の変異体との培養物中で観察した。
Claims (25)
- 表1に記述するCDR−1H、CDR−2H、及びCDR−3Hを有する重鎖可変ドメインを含む、PD−1に結合する抗体またはその断片。
- 表1に記述するCDR−1L、CDR−2L、及びCDR−3Lを有する軽鎖可変ドメインを含む、PD−1に結合する抗体またはその断片。
- 表1に記述するCDR−1L、CDR−2L、及びCDR−3Lを有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項1に記載の抗体またはその断片。
- 表1に記述する重鎖可変領域配列、または、表1に記述する前記重鎖可変領域配列に少なくとも80%同一であるような保存的置換を有する、表1に記述する重鎖可変領域配列を含む、PD-1に結合する抗体またはその断片。
- 表1に記述する前記重鎖可変領域配列と少なくとも85%同一であるような保存的置換を有する、表1に記述する重鎖可変領域配列を含む、請求項4に記載の抗体またはその断片。
- 表1に記述する前記重鎖可変領域配列と少なくとも90%同一であるような保存的置換を有する、表1に記述する重鎖可変領域配列を含む、請求項4に記載の抗体またはその断片。
- 表1に記述する前記重鎖可変領域配列と少なくとも95%同一であるような保存的置換を有する、表1に記述する重鎖可変領域配列を含む、請求項4に記載の抗体またはその断片。
- 表1に記述する軽鎖可変領域配列、または、表1に記述する前記軽鎖可変領域配列に少なくとも80%同一であるような保存的置換を有する、表1に記述する軽鎖可変領域配列を含む、PD-1に結合する抗体またはその断片。
- 表1に記述する前記軽鎖可変領域配列と少なくとも85%同一であるような保存的置換を有する、表1に記述する軽鎖可変領域配列を含む、請求項8に記載の抗体またはその断片。
- 表1に記述する前記軽鎖可変領域配列と少なくとも90%同一であるような保存的置換を有する、表1に記述する軽鎖可変領域配列を含む、請求項8に記載の抗体またはその断片。
- 表1に記述する前記軽鎖可変領域配列と少なくとも95%同一であるような保存的置換を有する、表1に記述する重鎖可変領域配列を含む、請求項8に記載の抗体またはその断片。
- 表1に記述する軽鎖可変領域配列、または表1に記述する前記軽鎖可変領域配列と少なくとも80%同一であるような保存的置換を有する、表1に記述する軽鎖可変領域を含む、請求項4に記載の抗体またはその断片。
- 表1に記述する前記軽鎖可変領域配列と少なくとも85%同一であるような保存的置換を有する、表1に記述する軽鎖可変領域配列を含む、請求項12に記載の抗体またはその断片。
- 表1に記述する前記軽鎖可変領域配列と少なくとも90%同一であるような保存的置換を有する、表1に記述する軽鎖可変領域配列を含む、請求項12に記載の抗体またはその断片。
- 表1に記述する前記軽鎖可変領域配列と少なくとも95%同一であるような保存的置換を有する、表1に記述する軽鎖可変領域配列を含む、請求項12に記載の抗体またはその断片。
- 造影剤、治療薬、または細胞傷害性剤をさらに含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の抗体または断片のコンジュゲート。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載の抗体可変ドメインまたは断片をコードする単離された核酸。
- 請求項17に記載の核酸を含む核酸ベクター。
- 請求項17に記載の核酸を含む原核または真核宿主細胞。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載の抗体または断片と、製薬上許容し得る担体とを含む組成物。
- 有効量の請求項1〜15のいずれか一項に記載の抗体または断片を投与することを含む、対象における、PD-1のPD-L1との相互作用の阻害方法。
- 有効量の請求項1〜15のいずれか一項に記載の抗体または断片を投与することを含む、対象における、PD-1により媒介される免疫抑制の阻害方法。
- 有効量の請求項1〜15のいずれか一項に記載の抗体または断片を対象に投与することを含む、PD-1を発現する細胞に対する免疫応答の刺激方法。
- PD-1を発現する前記細胞が腫瘍細胞である、請求項23に記載の方法。
- PD-1を発現する前記細胞がウイルスに感染している、請求項23に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562113132P | 2015-02-06 | 2015-02-06 | |
US62/113,132 | 2015-02-06 | ||
PCT/US2016/017021 WO2016127179A2 (en) | 2015-02-06 | 2016-02-08 | Immunomodulatory agents |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018506280A true JP2018506280A (ja) | 2018-03-08 |
Family
ID=56564893
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017541326A Pending JP2018506280A (ja) | 2015-02-06 | 2016-02-08 | 免疫調節薬 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20180244779A1 (ja) |
EP (1) | EP3253413A2 (ja) |
JP (1) | JP2018506280A (ja) |
CN (1) | CN107708732A (ja) |
EA (1) | EA201791768A1 (ja) |
WO (1) | WO2016127179A2 (ja) |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PT3081576T (pt) | 2013-12-12 | 2019-10-15 | Jiangsu Hengrui Medicine Co | Anticorpo pd-1, fragmento de ligação ao antigénio do mesmo e aplicação médica do mesmo |
TWI693232B (zh) | 2014-06-26 | 2020-05-11 | 美商宏觀基因股份有限公司 | 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法 |
TWI773646B (zh) | 2015-06-08 | 2022-08-11 | 美商宏觀基因股份有限公司 | 結合lag-3的分子和其使用方法 |
HUE056201T2 (hu) | 2015-07-30 | 2022-02-28 | Macrogenics Inc | PD-1-hez kötõdõ molekulák és alkalmazásukra szolgáló eljárások |
KR20220131277A (ko) | 2015-09-01 | 2022-09-27 | 아게누스 인코포레이티드 | 항-pd-1 항체 및 이를 이용하는 방법 |
AU2016332725A1 (en) | 2015-09-29 | 2018-03-22 | Celgene Corporation | PD-1 binding proteins and methods of use thereof |
TWI758267B (zh) | 2015-12-14 | 2022-03-21 | 美商宏觀基因股份有限公司 | 對於pd-1和ctla-4具有免疫反應性的雙特異性分子及其使用方法 |
RU2756236C2 (ru) | 2016-06-20 | 2021-09-28 | Кимаб Лимитед | PD-L1 специфические антитела |
EP3515943A4 (en) | 2016-09-19 | 2020-05-06 | Celgene Corporation | METHODS OF TREATING VITILIGO WITH PD-1 BINDING PROTEINS |
US10751414B2 (en) | 2016-09-19 | 2020-08-25 | Celgene Corporation | Methods of treating psoriasis using PD-1 binding antibodies |
BR112019005316A2 (pt) | 2016-09-21 | 2019-09-03 | Cstone Pharmaceutical Suzhou Co Ltd | anticorpos monoclonais para morte programada 1 (pd-1) |
US10597454B2 (en) * | 2016-10-15 | 2020-03-24 | Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd | PD-1 antibodies |
CA3046082A1 (en) | 2016-12-07 | 2018-06-14 | Agenus Inc. | Antibodies and methods of use thereof |
CN110621338B (zh) | 2016-12-27 | 2023-06-27 | 洛克菲勒大学 | 广谱中和抗hiv-1抗体及其使用方法 |
US20210382037A1 (en) * | 2017-07-10 | 2021-12-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Identification and use of cytotoxic t lymphocyte (ctl) antigen-specific target cell killing enhancer agents |
WO2020106461A2 (en) * | 2018-11-08 | 2020-05-28 | Celldex Therapeutics, Inc. | Anti-mertk antibodies and methods of use thereof |
EP3998081A4 (en) | 2019-07-05 | 2023-07-12 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | TREATMENT OF BLOOD CANCER WITH PD-1/CD3 DUAL SPECIFICITY PROTEIN |
EP4011918A4 (en) | 2019-08-08 | 2023-08-23 | ONO Pharmaceutical Co., Ltd. | DUAL SPECIFIC PROTEIN |
GB202107994D0 (en) | 2021-06-04 | 2021-07-21 | Kymab Ltd | Treatment of cancer |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7871610B2 (en) * | 2003-08-12 | 2011-01-18 | Dyax Corp. | Antibodies to Tie1 ectodomain |
CN101094869A (zh) * | 2004-08-03 | 2007-12-26 | 戴埃克斯有限公司 | Hk1结合蛋白 |
US7985715B2 (en) * | 2004-09-11 | 2011-07-26 | Receptors Llc | Combinatorial artificial receptors including peptide building blocks |
SI2161336T1 (sl) * | 2005-05-09 | 2013-11-29 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | Humana monoklonska protitelesa za programirano smrt 1 (PD-1) in postopki za zdravljenje raka ob uporabi anti-PD-1 protiteles samih ali v kombinaciji z drugimi imunoterapevtiki |
US9631191B2 (en) * | 2012-12-04 | 2017-04-25 | Alexey Gennadievich Zdanovsky | System for production of antibodies and their derivatives |
JO3405B1 (ar) * | 2013-01-09 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها |
-
2016
- 2016-02-08 EP EP16747421.2A patent/EP3253413A2/en not_active Withdrawn
- 2016-02-08 EA EA201791768A patent/EA201791768A1/ru unknown
- 2016-02-08 CN CN201680019824.0A patent/CN107708732A/zh active Pending
- 2016-02-08 JP JP2017541326A patent/JP2018506280A/ja active Pending
- 2016-02-08 US US15/549,016 patent/US20180244779A1/en not_active Abandoned
- 2016-02-08 WO PCT/US2016/017021 patent/WO2016127179A2/en active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2016127179A3 (en) | 2016-10-27 |
EP3253413A2 (en) | 2017-12-13 |
WO2016127179A2 (en) | 2016-08-11 |
US20180244779A1 (en) | 2018-08-30 |
EA201791768A1 (ru) | 2018-07-31 |
CN107708732A (zh) | 2018-02-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7279142B2 (ja) | 免疫調節剤 | |
JP2018506280A (ja) | 免疫調節薬 | |
JP6966176B2 (ja) | ヒトポリオウイルス受容体(pvr)に特異的な抗体 | |
EP3411068A2 (en) | Bispecific binding proteins for pd-l1 and kdr | |
CN109160950B (zh) | 人抗vegfr-2/kdr抗体 | |
JP2023520587A (ja) | 癌及び感染症の治療のためのNKp46に対する抗体及びそのコンストラクト | |
WO2023006040A1 (zh) | 抗pvrig/抗tigit双特异性抗体和应用 | |
WO2022132202A1 (en) | Combination therapy for the treatment of cancer | |
JP2017531434A (ja) | ヒト 抗vegfr−2/kdr 抗体s | |
CN116829591A (zh) | 针对cd112r的抗体及其用途 |