UA123310C2 - Зв'язуюча lag-3 молекула та спосіб її застосування - Google Patents

Зв'язуюча lag-3 молекула та спосіб її застосування Download PDF

Info

Publication number
UA123310C2
UA123310C2 UAA201711642A UAA201711642A UA123310C2 UA 123310 C2 UA123310 C2 UA 123310C2 UA A201711642 A UAA201711642 A UA A201711642A UA A201711642 A UAA201711642 A UA A201711642A UA 123310 C2 UA123310 C2 UA 123310C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
domain
binding
tumor
gas
epitope
Prior art date
Application number
UAA201711642A
Other languages
English (en)
Inventor
Мотте-Мос Росс Ла
Калпана Шах
Дуглас Х. Сміт
Дуглас Х. Смит
Лесіл С. Джонсон
Лесил С. Джонсон
Пол А. Мур
Еціо Бонвіні
Эцио Бонвини
Скотт Кеніг
Скотт КЕНИГ
Original Assignee
Макродженікс, Інк.
Макродженикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Макродженікс, Інк., Макродженикс, Инк. filed Critical Макродженікс, Інк.
Publication of UA123310C2 publication Critical patent/UA123310C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

точки, яка присутня на поверхні імунних клітин.
Даний винахід також відноситься до способів детекції ГАС-3, а також до способів застосування молекул, які зв'язують І АС-3, для стимуляції імунних відповідей.
Посилання на споріднені заявки
Згідно з даною заявкою спрошується пріоритет відповідно до заявок на видачу патенту США
Мо 62/255094 (що подана 13 листопада 2015 року; на розгляді) та Мо 62/172277 (що подана 8 червня 2015 року; на розгляді), кожна з цих заявок включена у даний документ за допомогою посилання у повному їх обсязі.
Посилання на перелік послідовностей
Дана заявка включає один або декілька переліків послідовностей відповідно до 37 С.Р.Н. 1.821 і далі, які розкриті на машинозчитуваному носії (назва файлу: 1301 0121РСТ Зедиепсе І ізііпд 51254ХІ, створений 18 травня 2016 року та має розмір 105774 байта), при цьому даний файл включений у даний документ за допомогою посилання у повному його обсязі.
Галузь техніки, до якої відноситься даний винахід
Даний винахід відноситься до зв'язуючих (ГАС-3 молекул, які містять зв'язуючий ГАС-3 домен вибраних антитіл до І дО-3: І АСІ-3 тАБ 1, І ДС-3 тА 2, І АС-3 тА 3, І АС-3 тАБ 4, І АС-
З тАБ 5 або ГАС-3 тА 6, які здатні зв'язуватися як з | АС-3 яванської макаки, так і з ГГ АС-3 людини. Даний винахід, зокрема, відноситься до зв'язуючих ГАС-3 молекул, які є гуманізованими або химерними версіями таких антитіл або які містять зв'язуючі ІГАс-3 фрагменти таких антитіл до ГАС-3 (особливо до імунокон'югатів, діатіл, ВІТЕ, біспецифічних антитіл і т. д.). Даний винахід, зокрема, відноситься до таких зв'язуючих | АС-3 молекул, які додатково здатні зв'язуватися з епітопом молекули, що бере участь у регуляції імунної контрольної точки, яка присутня на поверхні імунної клітини. Даний винахід також відноситься до способів застосування таких зв'язуючих ГАС-3 молекул для детекції ГАС-3 або для стимуляції імунної відповіді. Даний винахід також відноситься до способів комбінованої терапії, при яких зв'язуючу (АС молекулу, яка містить один або декілька зв'язуючих ГАС-3 доменів таких вибраних антитіл до ГАС-3, вводять у комбінації з однією або декількома додатковими молекулами, які ефективні у стимуляції імунної відповіді тим самим додатково підсилюючи, стимулюючи або підвищуючи таку імунну відповідь у суб'єкта.
Рівень техніки
Ї. Клітинні імунні відповіді
Імунна система людей та інших ссавців відповідає за забезпечення захисту від інфекції та захворювання. Такий захист забезпечується як гуморальною імунною відповіддю, так і клітинною імунною відповіддю. Гуморальна відповідь призводить у результаті до вироблення антитіл та інших біомолекул, які здатні розпізнавати та нейтралізувати чужорідні мішені (антигени). Для порівняння, при клітинній імунній відповіді відбувається активація макрофагів, натуральних кілерів (МК) ї антиген-специфічних цитотоксичних Т-лімфоцитів Т-клітинами та вивільнення різних цитокінів у відповідь на розпізнання антигена (Сбопо, С. еї аїЇ. (2003) "Іттипе
Веашаїйоп ру Моме! Созіїтшаюгу Моїесиіев, " Іттипо!са. Рез. 28 (1): 39-48).
Здатність Т-клітин оптимально опосередковувати імунну відповідь на антиген потребує двох різних сигнальних взаємодій (Мідіена, М. еїг а. (2007) "Моашайєпуд Со-бітшиіайоп, " МешоїПегарешісв 4: 666-675; Коптап, А) еї аї. (2007) "СпесКроїпі Віоскаде іп Сапсег
ІттипоїПегару, " Адм. Іттипої. 90: 297-339). По-перше, антиген, який дислокується на поверхні антиген-презентуючих клітин (АРС), повинний бути презентований антиген-специфічній наївній бра-Т-клітині. Таке презентування доставляє сигнал за допомогою Т-клітинного рецептора (ТОК), який змушує Т-клітину ініціювати імунну відповідь, яка буде специфічною до антигену, що презентується. По-друге, серія костимулюючих і коінгібуючих сигналів, опосредкованих взаємодіями між АРС і різними молекулами на поверхні Т-клітин, запускає спочатку активацію та проліферацію Т-клітин і в кінцевому підсумку їх інгібування. Таким чином, перший сигнал надає специфічність імунній відповіді, у той час як другий сигнал служить для визначення природи, величини та тривалості відповіді.
Імунна система жорстко контролюється костимулюючими та коінгібуючими лігандами та рецепторами. Такі молекули забезпечують другий сигнал для активації Т-клітин і забезпечують збалансовану мережу позитивних і негативних сигналів для максимізації імунних відповідей до інфекції, при цьому обмежуючи імунітет до "своїх" клітин (Умапо, Ї.. еї аї. (2011) "МІ5ТА, А Момеї
Моивзе Ід зирепатіїу ІГідапа Тнаї МедаїїмеІу Ведшіагез Т-Сеї! Незропзев, " У. Ехр. Мед. 10.1084 / |єт.20100619: 1-16; І ерепієзв, В. еї а). (2008) "Те Воїе ОЇ Медаїйме Совіїтиіаюгтв Вигіпа Рагавзіс
Іптесііоп5, " Епдостіпе, Меїароїїс б Іттипе бОізогаєт5-Югид Тагаєїв 8: 279-288). Інгібуючі шляхи, що важливі для збереження аутотолерантності та модулювання тривалості та величини імунних відповідей, спільно називають імунними контрольними точками. Особливе значення має зв'язування лігандів В7.1 (СО80) ії В7.2 (СО86) антиген-презентуючих клітин із рецепторами (610) с028 ії СТІ А-4 у СО4:-лімфоциті (Зпагре, А.Н. еї аІ(2002) "Пе В7-С028 Зирегпаптіу, " Маїиге
Вехм. Іттипої. 2:116-126; ЮОопа, б. єї аіІ. (2003) "Іттипе Редшиіайоп Бу Моме! Совіїти|іаюгу
Моїесшіев, " Ігптипоїод. Ке5. 28(1):39-48; І іпаїІєу, Р.5. єї аї. (2009) "Тне Сіїпіса! ЮННУу ОГ Іппібйіпа
СОр28-Медіаїєд Совійтиайоп, " Іттипої. Кем. 229:307-321). Зв'язування В7.1 або В7.2 з С0р28 стимулює активацію Т-клітин; зв'язування В7.1 або В7.2 з СТІ А-4 інгібує таку активацію (бопо,
С. еї а. (2003) ""птипе Кедшайоп Бу Моме! Созійтпшайогу МоїІесшціев, " Іттипоїод. Кез. 28(1):39- 48; Ііпаієу, Р.5. єї аї. (2009) "Те Сіїпісаї ШШІйЙу ОО Іппібйпд СО28-Меаїйастеа Совійпшіайоп, "
Ітітипої. Аеу. 229:307-321; Сгеепмжаїд, К.9. еї аІ. (2005) "пе В7 Ратійу Кемізйейд, " Апп. Кем.
Ітітипої. 23:515-548). СО28 конститутивно експресується на поверхні Т-клітин ((го55, 5., ега!І.(1992) "ІЗдепійісайоп Апа Оівігіршіоп ОЇ Тпе Созітшайгу Кесеріог СО28 Іп Те Моизе, " у.
Іттипої. 149:380-388), у той час як експресія СТІ А4 швидко зростає після активації Т-клітин (Оовієу, Р. єї аІ.(1996) "Іпігасеїшіаг Тганіскіпд ОЇ СТІ А4 Апа Росаї І осаїїгайоп Томжмагадв Зпйев ОЇ
ТСК Епдадетепі, " Іттипйу 4:535-543). Оскільки СТІ А-4 є більше високоафінним рецептором (ЗПпагре, А.Н. єї аї. (2002) "Пе В7-СО028 Зирегпаптйу, " Маїшге Кеум. Іттипої. 2:116-126), зв'язування спочатку ініціює проліферацію Т-клітин (за допомогою СО28), а потім інгібує її (за допомогою експресії СТІ А-4, що починається), тим самим послаблюючи ефект, якщо у проліферації більше немає необхідності.
Додаткові дослідження у лігандах рецептора СО28 призвели до виявлення й опису характеристик ряда споріднених молекул В7 ("суперсімейство В7") (ЗПпагре, А.Н. еї а1І.(2002) "Те В7-С0О28 ЗБирепатійу, " Маїшиге Кеу. Іттипої. 2:116-126; Стеепмаїа, В... єї аї. (2005) "Тне В7
Еатйу Кемізйеа, " Апп. Кем. Іттипої. 23:515-548; СоїІйп5, М. еї аІ. (2005) "Те В7 Ратійу ОЇ
Іттипе-Кедшиіаєгу Гідапах, " Сепоте Віої. 6:223.1-223.7; |оКе, Р. еї аї. (2004) "ЄЕтегдіпд
Меспапівзтв ОЇ Іттипе Недшіайоп: Тпе Ехієпаєд В7 Ратійу Апа Недшніайогу Т-СеїІ5." Апійгйі5 Кев.
Тег. 6:208-214; Коптап, А... еї аІ. (2007) "СпесКроїпі ВіосКаде іп Сапсег ІттипоїПпегару, " Адм.
Іттипої. 90:297-339; Ніез, О.В. еї аї. (2007) "Пе Мем В75: Ріауіпд а Рімоїаі! Роїве іп Титог
Іпитлипйу, "У. Іттипоїйег. 30(3):251-260; Адагпма!Ї, А. єї аі. (2008) "Те Воїе Ої Розійме
Со5ійтшиаюгу МоїІесшез Іп Тгапзріапіайоп Апа ТоїІегапсе, " Си. Оріп. Огдап Тгапеоріапі. 13:366- 372; Мапа, 5. еї а. (2004) "Со-5ідпаїїту МоІесцевз ОЇ Те В7-С028 Ратіїу Іп Розййме Апа Медаїїме
Кедшіайнйоп ОЇ Т Гутрпосуїє Кезропзев, " Місгорев Іп'есі. 6:759-766). У теперешній час існує декілька відомих членів сімейства: В7.1 (2080), В7.2 (СО86), індукований костимулюючий ліганд (ІСО5-І), ліганд програмованої смерті 1 (РО-І 1; В7-НІ), ліганд програмованої смерті 2 (РО-1 2;
В7-0С), В7-НЗ, В7-Н4 та В7-Нб (Соїїпв, М. еї аІ(2005) "не В7 Ратіу ОЇ Іттипе-Неашайогу
Мдапавз, " бепоте Віої. 6:223.1-223.7; Ріа|пік, М.Р. еї аї. (2012) "Ємоїшіоп ОЇ Те В7 Ратійу: Со-
Емоїшіоп ОЇ В7Нб Апа МкКрзо, Ідепійісайоп ОГ А Меж/ В7 Ратіїу Метрбег, В7Н7, Апа ої В7"5
Нівіогіса! КеіІайопзпір УМА Тпе МНС, " Ігптиподепеїйісз 64(8):571-90).
ІІ. Ген активації лімфоцитів З (" АС-3")
Ген активації лімфоцитів З кодує білок рецептора клітинної поверхні, який називають "І АС- 3" або СО223 (Ттівбеї, Р. еї а. (1990) "ГАС-3, А Момеї! І утріосуїе Асіїмайоп Сепе Сіозеїу Веїаїей
То СО4, у). Ехр. Мей. 171(5):1393-1405). | ДА-3 експресується у активованих СО4- і СОвж Т- клітин і МК-клітин і конститутивно експресується у плазмоцитоїдних дендритних клітин. ГАс-3 не експресується у В клітин, моноцитів або клітин будь-якого іншого протестованого типу (Ууоїктап, С.). еї аї. (2009) "дс-3 Кедша(ез Ріазтасуйюій Оепагйіс СеїЇ Нотеовіавів, " .).
Іттипої!. 182(4):1885-1891).
Було виявлено, що І АС-3 є близькоспорідненим Т-клітинному корецептору СА (Тгіевеї, Б. еї аї. (1990) " ДЕ-3, А Момеї І утрпосуїе Асіїмайоп Сепе Сіозеїу Кеїаїедй То СО04, у). Ехр. Мед. 171(5):1393-1405; С1го550, У.Е. єї аіІ. (2009) "Бипсійопайу Оівіпсі ГАС-3З апа РО-1 Зирзвгеї5 оп
Асіїмаїєд апа СпгопісаПу сіїтшіата СО8 Т-Сеї5, 7 У. Ітттипої. 182(11):6659-6669; Ниапо, С.Т. єї а!. (2004) "Воїє ОГІ Да-3 Іп Недшиіаюгу Т-Сеїї5, " Іттипйу 21:503-513; М/оїКтап, С.). еї аІ(2009) "ГАС-3 Кедшаїцез Ріазтасуйюід Оепагйіс СеїЇ Нотеовіавів, " У. Іттипої. 182(4):1885-1891). Як і
СОр4, ГАС-3 також зв'язується з молекулами МНС ІІ класу, але робить це зі значно більш 5о0 високою афінністю (УМогКітап, С... еї аІ. (2002) "Рпепоїуріс Апаїузіз ОЇ Тпе Мигіпе СО4-Неїаїва
Сіусоргоївіп, СО223 (І АС-3),7 Еицг. у. Іттипої. 32:2255-2263; Ниага, В. єї аї. (1995) "Сба/Ма|ог
Нівіосотраїйбійу Сотрієх Сіав5 ІІ Іпїегасіюп Апаїулей Мт С04-Апа І утріосуїе Асіїмайоп Сепе-
З (ГГ Аа-3)-Ід Ривіоп Ргоїеїп5, " Еиг. У. Іттипої. 25:2718-2721; Ниага, В. єї аї. (1994) "СейПІШаг
Ехргезвіоп Апа Тібзцие різшршіоп ОЇ Те Нитап І Да-3-Епсодеа Ргоївіп, Ап МНС Сіавзвз ІІ Гідапа, " Іттиподепеїйсз5 39:213-217).
Дослідження показали, що ГАО-3 відіграє важливу роль у негативній регуляції Т-клітинної проліферації, функції та гомеостазі (УМогКтап, С.9. еї аІ.(2009) "ГАО-3 Недшіаге5 Ріазтасуїйоіа
Репагійіс СеїЇ Нотеовіавів, " У). Іттипої. 182(4):1885-1891; М/оЖжЖтап, С... еї аї. (2002) "Синіпд
Едає: МоІесшаг Апаїувзіз ОЇ Те Медаїїме Ведшиіайгу Рипсіп ОЇ І утрпосуїе Асіїмайоп Сепе-3,7 у. бо Іттипої. 169:5392-5395; МогКтап, С... еї а. (2003) "Тне С04-Веїаіейд Моїієсше, ГГ да-3 (Срагг3),
Ведшіагез Тпе Ехрапвзіоп ОЇ Асіїмаїєйд Т-СеїІв5, " Єиг. 9. Іттипої. 33:970-979; МоїКтап, С.9. (2005) "Медаїїме Ведшіаїйоп ОЇ Т-СеїЇ Нотеовіавзіх Ву ГутрпПосуїе Асіїмайоп Сепе-3 (С0223)," 9. Іттипої. 174:688-695; Наппіевг, 5. єї а!. (1998) "СОЗ/ТСА Сотріех-Аззосіаїєд І утрпосуїе Асіїмайоп Счепе-З3
Моїесшіез Іпрпірбй СОЗ/ТСК Зідпаїйпу, " 9. Іттипої. 161:4058-4065; Ниага, В. еї аї. (1994) "Гутрпосуїе-Асіїмайоп Сепе З/Маїйог Нізтосотраїйбійу Сотрієх Сіавз ІІ Іпіегасіоюоп Модиіаез ТНе
Апіїдепіс Кезропзе ОЇ СО4-т І утрпосуїев, "7" Єиг. 9. Іттипої. 24:3216-3221).
Дослідження показали, що інгібування функції Г(АС-3 за допомогою блокади антитілами може звертати ГАС-3-опосередковане інгібування імунної системи та частково відновлювати ефекторну функцію (Сго550, У.Е. еї а. (2009) "Рипсііопайу Оівііпсі ГАс-3 апа РО-1 Зирзвеїв5 оп
Асіїмагєйд апа СНнгопіса|Пу 5іїтиіаїєай СО8 Т-Сеї5, 7 У. Іттипої. 182(11):6659-6669; Сіо550, У.Е. еї а!. (2007) " дДа-3 ВРеашаїез СО8--Т-СеїЇ Асситиіайоп Апа Емнесюг Рипсіп Юигіпд 5еїї Апа Титог
ТоІегапсе, " У. Сііп. Іпме5і. 117:3383-3392). Було виявлено, що ГАС-3 негативно регулює розмноження Т-клітин за допомогою інгібування ТСЕ-індукованих кальцієвих потоків і контролює розмір пулу Т-клітин пам'яті (Маїзилакі, 9. еї аІ(2010) "Типтог-Іп'Яйгайпуд МУ-ЕБЗО-1- Бресіїйс СО8-Т-СеїІз Аге МедаїїмеІму Ведшіаїєй Ву ГАС-3 апа РО-1 Іп Нитап Омагпап Сапсег, "
Ргос. Май. Асай. осі. (0О.5.А.) 107(17):7875-7880; МУоїКтап 0.9., еї а. (2004) " утрпосуїє
Асіїмайоп Сепе-3 (Сб0223) Недшайев Те 5іге ОЇ Те Ехрапаїпуд Т-СеїЇ Роршіайоп Роїомжміпд
Апіідеп Асіїмайоп іп мімо, " У. Іттипої. 172:5450-5455).
Тим не менш, незважаючі на всі такі попередні досягнення, зберігається потреба в удосконалених композиціях, що здатні сильніше змушувати імунну систему організму атакувати клітини злоякісної пухлини або клітини, що інфіковані патогеном, особливо у більш низьких терапевтичних концентраціях. Навіть незважаючі на те, що адаптивна імунна система може бути сильним захисним механізмом від злоякісної пухлини та захворювання, вона часто пригнічується імуносупресорними механізмами у пухлинному мікрооточенні, такому як експресія
ГАС-3. Крім того, коінгібуючі молекули, що експресуються пухлинними клітинами, імунними клітинами та стромальними клітинами у пухлинному середовищі, можуть домінантно послаблювати Т-клітинні відповіді на клітини злоякісної пухлини. Таким чином, зберігається потреба у високоактивних зв'язуючих ГАС-3 молекулах. Так, зокрема, існує потреба у зв'язуючих І АС-3 молекулах, які мають необхідний профіль кінетики зв'язування, зв'язують різні епітопи ГАС-3 і/або характеризуються активністю відносно окремого агента, що може підвищити терапевтичне значення для пацієнтів, що страждають від злоякісної пухлини або інших захворювань або станів. Даний винахід відноситься до вирішення цих та інших задач.
Коротке розкриття даного винаходу
Даний винахід відноситься до зв'язуючих ГАС-3 молекул, які містять зв'язуючий ГАС-3 домен вибраних антитіл до І дО-3: І АСІ-3 тАБ 1, І ДС-3 тА 2, І АС-3 тА 3, І АС-3 тАБ 4, І АС-
З тАБ 5 або ГдОо-3 тА 6, які здатні зв'язуватися як з | АС-3 яванскої макаки, так і з | АС-3 людини. Даний винахід, зокрема, відноситься до зв'язуючих І1А(С-3 молекул, які є гуманізованими або химерними версіями таких антитіл або які містять зв'язуючі ІГАс-3 фрагменти таких антитіл до ГАС-3 (особливо до імунокон'югатів, діатіл, ВІТЕ, біспецифічних антитіл і т. д.). Даний винахід, зокрема, відноситься до таких зв'язуючих | АС-3 молекул, які додатково здатні зв'язуватися з епітопом молекули, що бере участь у регуляції імунної контрольної точки, яка присутня на поверхні імунної клітини. Даний винахід також відноситься до способів застосування таких зв'язуючих ГАС-3 молекул для детекції ГАС-3 або для стимуляції імунної відповіді. Даний винахід також відноситься до способів комбінованої терапії, при яких зв'язуючу ГАС молекулу, яка містить один або декілька зв'язуючих ГАС-3 доменів таких вибраних антитіл до ГАС-3, вводять у комбінації з однією або декількома додатковими молекулами, які ефективні у стимуляції імунної відповіді, тим самим додатково підсилюючи, стимулюючи або підвищуючи таку імунну відповідь у суб'єкта.
Якщо детально, даний винахід відноситься до зв'язуючої | АС-3 молекули, яка здатна зв'язуватися як з ГАС-3 людини, так і з ГАО-3 яванської макаки, причому зазначена молекула містить три домени СОК важкого ланцюга: СОКНнНІ, СОВна2 і СОКНЗ, і три домени СОК легкого ланцюга: СОКІТ, СОНІ2, і СОР. З, причому: (А) (1) домен СОКНІ, домен СОКНа2 і домен СОКнНЗ являють ссобою СОК важкого ланцюга з
І ДИа-3 тА 1 і відповідно мають амінокислотні послідовності: зЗЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮО МО: 9 і ЗЕО
ІО МО: 10; (2) домен СОКІ1, домен СОКІ2 і домен СОКІЗ являють собою СОК легкого ланцюга з І АО-3
ТАБ 1 ї відповідно мають амінокислотні послідовності: зЕО ІЮ МО: 13, 5ЕО ІЮ МО: 14 і БЕО ІЮ
МО: 15; або (610) (В) (1) домен СОКНІ, домен СОКЬа2 і домен СОКнНЗ являють собою СОК важкого ланцюга з
НІ АС-3 тАБ 1 і відповідно мають амінокислотні послідовності: зЗЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮО МО: 9 і 5ЕО ІЮ МО: 10; і (2) домен СОКІ1, домен СОКІ2 і домен СОКІЗ являють собою СОК легкого ланцюга з ПІ АС-
З тАБ 1 і відповідно мають амінокислотні послідовності: 5ЕО ІЮ МО: 28, 5ЕО ІЮО МО: 14 і 5БЕО ІЮ
МО: 15; або (С) (1) домен СОКНІ, домен СОКНІ2 і домен СОКнНЗ являють собою СОЕ. важкого ланцюга з
І Да-3 тА 2 та відповідно мають амінокислотні послідовності: ЗЕО ІЮ МО: 31, ЗЕО ІЮО МО: 32 і 5ЕО ІЮ МО: 33; та (2) домен СОКІ1, домен СОКІ2 і домен СОВІЗ являють собою СОК легкого ланцюга з І АО-3 тА 2 та відповідно мають амінокислотні послідовності: 5ЕО ІЮ МО: 36, ЗЕО ІО МО: 37 і ЗЕО ІЮ
МО: 38; або (0) (1) домен СОКНІ, домен СОКНІ2 і домен СОКнНЗ являють собою СОЕ. важкого ланцюга з
І дДа-3 тА З та відповідно мають амінокислотні послідовності: зхЕО ІЮ МО: 41, 5ЕО ІЮ МО: 42 і 5ЕО ІЮ МО: 43; та (2) домен СОКІ1, домен СОКІ2 і домен СОКІЗ являють собою СОК легкого ланцюга з І АО-3 тА З та відповідно мають амінокислотні послідовності: 5ЕО ІЮ МО: 46, 5ЕО ІЮО МО: 47 і 5ЕО ІЮ
МО: 48; або (Е) 1) домен СОКНІ, домен СОКЬа2 і домен СОКнНЗ являють собою СОК важкого ланцюга з
І ДИа-3 тА 4 та відповідно мають амінокислотні послідовності: ЗЕО ІЮ МО: 51, ЗЕО ІЮО МО: 52 їі 5ЕО ІЮ МО: 53; та (2) домен СОКІ1, домен СОКІ2 і домен СОВІЗ являють собою СОК легкого ланцюга з І АО-3 тА 4 та відповідно мають амінокислотні послідовності: 5ЕО ІЮ МО: 56, ЗЕО ІО МО: 57 і ЗЕО ІЮ
МО: 58; або (Є) 1) домен СОКНІ, домен СОКНа2 і домен СОКнНЗ являють собою СОК важкого ланцюга з
І дДа-3 тА 5 і відповідно мають амінокислотні послідовності: 5ЕО ІЮ МО: 61, 5ЕО ІЮО МО: 62 і 5ЕО ІЮ МО: 63; та (2) домен СОКІ1, домен СОКІ2 і домен СОКІЗ являють собою СОК легкого ланцюга з І АО-3 тА 5 і відповідно мають амінокислотні послідовності: зЕО ІЮ МО: 66, 5ЕО ІЮ МО: 67 і 5БЕО ІЮ
МО: 68; або (С) (1) домен СОКНІ, домен СОКНна2 і домен СОКнНЗ являють собою СОЕ. важкого ланцюга з
І да-3 тА 6 УНІ і відповідно мають амінокислотні послідовності: ЗЕО ІЮО МО: 71, 5ЕО ІЮ МО: 72і 5ЕОІО МО: 73; та (2) домен СОКІ1, домен СОКІ2 і домен СОВІЗ являють собою СОК легкого ланцюга з І АО-3 тА 6 і відповідно мають амінокислотні послідовності: зЕО ІЮ МО: 76, 5ЕО ІЮ МО: 77 і БЕО ІЮ
МО: 78; або (Н) (1) домен СОКНІ1, домен СОКНа2 і домен СОКнНЗ являють СОК важкого ланцюга з ГАО-3
ПАБ 6 і відповідно мають амінокислотні послідовності: ЕС ІЮ МО: 71, 5ЕО ІЮ МО: 72 та ЗЕО І
МО: 73; та (2) домен СОКІ1, домен СОКІ2 і домен СОКІЗ являють собою СОК легкого ланцюга з ПІ АС-
З ПАБ 6 і відповідно мають амінокислотні послідовності: ЗЕО ІЮ МО: 87, 5ЕО ІЮ МО: 77 і ЗЕО І
МО: 78.
Даний винахід додатково відноситься до варіантів здійснення таких зв'язуючих ГАС-3 молекул, де варіабельний домен важкого ланцюга має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 5о0 6, ЗЕО ІЮО МО: 29, 5ЕО ІО МО: 39, 5ЕО ІЮО МО: 49 або 5ЕО ІЮО МО: 59.
Даний винахід додатково відноситься до варіантів здійснення таких зв'язуючих ГАС-3 молекул, де варіабельний домен легкого ланцюга має амінокислотну послідовність з ЗЕО ІЮ
МО: 11, БЕО ІО МО: 34, 5ЕО ІО МО: 44, 5ЕО ІЮО МО: 54 або 5ЕО ІЮО МО: 64.
Даний винахід додатково відноситься до варіантів здійснення таких зв'язуючих ГАС-3 молекул, де варіабельний домен важкого ланцюга має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 16, ЗЕО ІО МО: 18, 5ЕО ІО МО: 79 або 5ЕО ІЮ МО: 80.
Даний винахід додатково відноситься до варіантів здійснення таких зв'язуючих І Ао-3 молекул, де варіабельний домен легкого ланцюга має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 20, ЗЕО ІЮО МО: 22, 5ЕО ІЮО МО: 24, 5ЕО ІЮО МО: 26, 5ЕО ІО МО: 83 або 5ЕО ІЮ МО: 85. 10) Даний винахід додатково відноситься до варіантів здійснення всіх таких зв'язуючих І Ас-3 молекул, де молекула являє собою антитіло й особливо де молекула являє собою химерне антитіло або гуманізоване антитіло.
Даний винахід додатково відноситься до варіанта здійснення, де зв'язуюча ГАС-3 молекула являє собою біспецефічну зв'язуючу молекулу, що здатна одночасно зв'язуватися з | АС-3 людини та з другим епітопом, і, зокрема, відноситься до варіанта здійснення, де другий епітоп являє собою епітоп молекули, що бере участь у регуляції імунної контрольної точки, що присутня на поверхні імунної клітини (особливо де другий епітоп являє собою епітоп В7-НЗ, В7-
НА, ВТ А, С040, 20401, Ср47, Сб070, Сбр80, С086, 0094, 00137, С01371, 00226, СТІ А-4, галектину-9, СІТА, СІТАГ, ННІ А2, ІСО5, ІСОБІ,, КІВ, ГГ А,-3, ІП ІОНТ, МН І або ІІ класу, МКСога,
Мкага, ох40, ОХ40І, РОН, РО-1, РО-І 1, РО-І2, РУВ, 5ІВРа, ТОВ, ТІСІТ, ТІМ-3 або МІ5ТА, і, найбільше конкретно, де другий епітоп являє собою епітоп СО137, ОХ40, РО-1, ТІСІТ або ТІМ-
З).
Даний винахід додатково відноситься до варіанта здійснення таких зв'язуючих ГАс-3 молекул, де молекула являє собою діатіло й особливо де діатіло являє собою ковалентно зв'язаний комплекс, який містить два або три, або чотири, або п'ять або більше п'яти поліпептидних ланцюгів. Даний винахід додатково відноситься до варіанта здійснення таких зв'язуючих І АС-3 молекул антитіл, де молекула являє собою тривалентну зв'язуючу молекулу, причому тривалентна зв'язуюча молекула являє собою ковалентно зв'язаний комплекс, який містить три, чотири, п'ять або більше поліпептидних ланцюгів. Даний винахід додатково відноситься до варіанта здійснення таких зв'язуючих ГАС-3 молекул, де молекула включає Ес- ділянку. Даний винахід додатково відноситься до варіанта здійснення таких зв'язуючих ГАОш-3 молекул, де молекула містить альбумін-зв'язуючий домен і особливо деімунізований альбумін- зв'язуючий домен.
Даний винахід додатково відноситься до варіантів здійснення всіх таких зв'язуючих ГАС-3 молекул, де молекула включає Ес-ділянку (фрагмент, що кристалізується), та де Ес-ділянка являє собою варіантну Ес-ділянку, яка містить одну або декілька амінокислотних модифікацій, які зменшують афінність вариантної Ес-ділянки відносно Есук і/або збільшують період напівжиття у сироватці, та, більш конкретніше, де модифікації містять щонайменше одну амінокислотну заміну, яка вибрана з групи, що складається з: зо (1)1234А; (2)1235А; (3) 1234А і 1 235А; (4) М252У, М252У і 52547; (5) М252У і Т256Е; (6) М252У, 52541 і Т256Е; або (7) К2880 і НаЗ5К; причому зазначена нумерація відповідає ЕЄШО системі нумерації за Кабаї.
Даний винахід додатково відноситься до варіантів здійснення, де будь-які зв'язуючі | ДО-3 молекули, що описані вище, застосовуються для стимуляції Т-клітинної імунної відповіді. Даний винахід додатково відноситься до варіантів здійснення, де будь-яка з описаних вище зв'язуючих
ГАСб-3 молекул застосовується при лікуванні захворювання або стану, що асоційований з пригніченою імунною системою, особливо злоякісної пухлини або інфекції.
Даний винахід, зокрема, відноситься до такого застосування при лікуванні, або діагностиці, або прогнозуванні розвитку злоякісної пухлини, причому злоякісна пухлина характеризується присутністю клітини злоякісної пухлини, яка вибрана з групи, що складається з клітини: пухлини надниркової залози, злоякісної пухлини, що асоційована зі СНІДом, альвеолярної саркоми м'яких тканин, астроцитарної пухлини, злоякісної пухлини сечового міхура, злоякісної пухлини кісток, злоякісної пухлини головного та спинного мозку, метатастатичної пухлини головного мозку, злоякісної пухлини молочної залози, пухлин каротидного тільця, цервікальної злоякісної пухлини, хондросаркоми, хордоми, хромофобної нирково-клітинної карциноми, світло-клітинної карциноми, злоякісної пухлини товстої кишки, колоректальної злоякісної пухлини, шкірної доброякісної фіброзної гістіоцитоми, десмопластичної дрібнокруглоклітинної пухлини, епендимоми, пухлини Юінга, позаскелетної слизоподібної хондросаркоми, недосконалого кісткового фиброгенезу, фіброзної дисплазії кістки, злоякісної пухлини жовчного міхура або жовчовивідних шляхів, злоякісної пухлини шлунково-кишкового тракту, гестаційної трофобластичної хвороби, ембріонально-клітинної пухлини, злоякісної пухлини голови та шиї, гепатоклітинної карциноми, пухлини острівців підшлункової залози, саркоми Капоші, злоякісної пухлини нирки, лейкозу, ліпоми/доброякісної ліпоматозної пухлини, ліпосаркоми/злоякісної ліпоматозної пухлини, злоякісної пухлини печінки, лімфоми, злоякісної пухлини легені, 10) гранулобластоми, меланоми, менінгіоми, множинних ендокринних неоплазій, множинної мієломи, мієлодиспластичного синдрому, нейробластоми, нейроендокринних пухлин, злоякісної пухлини яєчника, злоякісної пухлини підшлункової залози, папілярної карциноми щитовидної залози, пухлини паращитовидних залоз, дитячої злоякісної пухлини, пухлини оболонки периферичного нерва, феохромоцитоми, пухлини гіпофіза, злоякісної пухлини передміхурової залози, увеальної меланоми заднього відділу ока, рідкісного порушення зі сторони кровотворної системи, ниркової метастатичної злоякісної пухлини, рабдоіїдной пухлини, рабдоміосаркоми, саркоми, злоякісної пухлини шкіри, саркоми м'яких тканин, плоскоклітинної злоякісної пухлини, злоякісної пухлини шлунка, синовіальної саркоми, злоякісної пухлини яєчка, тимусної карциноми, тимоми, метастатичної злоякісної пухлини щитовидної залози та злоякісної пухлини матки.
Даний винахід, зокрема, відноситься до такого застосування при лікуванні, або діагностиці, або прогнозуванні розвитку злоякісної пухлини, причому злоякісна пухлина являє собою колоректальну злоякісну пухлину, гепатоклітинну карциному, гліому, злоякісну пухлину нирки, злоякісну пухлину молочної залози, множинну мієлому, злоякісну пухлину сечового міхура, нейробластому; саркому, неходжкинську лімфому, недрібноклітинну злоякісну пухлину легені, злоякісну пухлину яєчника, злоякісну пухлину підшлункової залози, злоякісну пухлину прямої кишки, гострий мієлоїдний лейкоз (АМІ), хронічний мієлогенний лейкоз (СМІ), гострий В- лімфобластний лейкоз (В-АГІ), хронічний лімфоцитарний лейкоз (СІ), волосатоклітинний лейкоз (НСІ), новоутворення з бластних плазмоцитоїдних дендритних клітин (ВРОСМ), неходжкинські лімфоми (МНІ), включаючи мантійноклітинну лімфому (МС) ї дрібноклітинну лімфоцитарну лимфому (5), ходжкинську лімфому, системний мастоцитоз або лімфому
Беркітта.
Даний винахід додатково відноситься до варіантів здійснення, в яких будь-яка з вищеописаних зв'язуючих ГАС-3 молекул позначена міткою, що детектується, та застосовується у детекції ГАС-3.
Короткий опис креслень
На Фіг. 1 представлене схематичне зображення типового ковалентно зв'язаного діатіла з двома епітоп-зв'язуючими сайтами, що складається з двох поліпептидних ланцюгів, кожний з яких має домен з Е-спіраллю або К-спіралью, що сприяє утворенню гетеродимера. Цистеїновий залишок може бути присутній у лінкері та/або у домені, що сприяє утворенню гетеродимера, як показано на Фіг. ЗВ. Домени МІ і МН, які розпізнають один і той же епітоп, показані однаковим штрихуванням або заливкою.
На Фіг. 2 представлене схематичне зображення типової ковалентно зв'язаної молекули діатіла з двома епітоп-зв'язуючими сайтами, що складається з двох поліпептидних ланцюгів, кожний з яких має домен СН2 та СНЗ, так щоб асоційовані ланцюги утворювали всю Ес-ділянку або її частину. Домени МІ і МН, які розпізнають один і той же епітоп, показані однаковим штрихуванням або заливкою.
На Фіг. ЗА-3С представлені схематичні зображення, на яких показані типові чотирьохвалентні діатіла з чотирма епітоп-зв'язуючими сайтами, що складаються з двох пар поліпептидних ланцюгів (тобто всього чотирьох поліпептидних ланцюгів). Один поліпептид кожної пари має домен СНЕа та СНЗ, так щоб зв'язані ланцюги утворювали всю Ес-ділянку або її частину. Домени МІ і МН, які розпізнають один і той же епітоп, що показані однаковим штрихуванням або заливкою. Дві пари поліпептидних ланцюгів можуть бути однаковими.
Відповідно до таких варіантів здійснення, якщо домени МІ. і МН розпізнають різні епітопи (як показано на Фіг. ЗА- ЗС), молекула, що одержана у результаті, має чотири епітоп-зв'язуючі сайти і є біспецифічною та двовалентною відносно кожного зв'язуючого епітопу. Відповідно до таких варіантів здійснення, якщо домени МІ. ї МН розпізнають один і той же епітоп (наприклад, на обох ланцюгах задіяні однакові СОМ домену МІ. і однакові СОК домену МУН), молекула, що одержана у результаті, має чотири епітоп-зв'язуючі сайти та є моноспецифічною та чотирьохвалентною відносно одного епітопу. Альтернативно, дві пари поліпептидів можуть відрізнятися. Відповідно до таких варіантів здійснення, якщо домени Мі і МН кожної пари поліпептидів розпізнають різні епітопи (як показано на Фіг. 3С), молекула, що одержана у результаті, має чотири епітоп-зв'язуючі сайти та є тетраспецифічною та одновалентною відносно кожного зв'язуючого епітопу. На Фіг. ЗА показане Ес-діатіло, яке містить пептидний домен, що сприяє утворенню гетеродимера, що містить цістетїновий залишок. На Фіг. ЗВ показане діатело, що містить Ес-ділянку, яке містить Ес-ділянку та домени з Е-спіраллю та К- спіраллю, що сприяють утворенню гетеродимера, що містять цистеїновий залишок і лінкер (з необов'язковим цістеїновим залишком). На Фіг. ЗС показане діатіло, що містить Ес-ділянку, яке містить домени СНІ і СІ. антитіла. (610) На Фіг. 4А та 4В представлені схематичні зображення типової ковалентно зв'язаної (с;
молекули діатіла, яка має два епітоп-зв'язуючих сайти, що складаються з трьох поліпептидних ланцюгів. Два поліпептидних ланцюги мають домен СН2 та СНЗ, так щоб зв'язані ланцюги утворювали всю Ес-ділянку або її частину. Поліпептидні ланцюги, що містять домен МІ. і МН, додатково містять домен, що сприяє утворенню гетеродимера. Домени МІ і МН, які розпізнають один і той же епітоп, показані однаковим штрихуванням або заливкою.
На Фіг. 5 представлені схематичні зображення типової ковалентно зв'язаної молекули діатіла, яка має чотири епітоп-зв'язуючі сайти, що складаються з п'яти поліпептидних ланцюгів.
Два поліпептидні ланцюги мають домен СНаО2 тв СНЗ, так щоб зв'язані ланцюги утворювали Ес- ділянку, яка являє собою всю Ес-ділянку або її частину. Поліпептідні ланцюги, що містять з'єднані домени МГ. і МН, додатково містять домен, що сприяє утворенню гетеродимера. Домени
МІ їі МН, які розпізнають один і той же епітоп, показані однаковим штрихуванням або заливкою.
На Фіг. бА-6Е представлені схематичні зображення типових Ес-ділянок, що містять тривалентні зв'язуючі молекули, що мають три епітоп-зв'язуючих сайти. На Фіг. бА ії 6В відповідно схематично проілюстровані домени тривалентних зв'язуючих молекул, що містять два зв'язуючих домени за типом діатіл і зв'язуючий домен за типом Бар, що мають різні орієнтації доменів, в яких зв'язуючі домени за типом діатіла є М-кінцевими або С-кінцевими до
Ес-ділянки. Молекули на Фіг. бА та 6В містять чотири ланцюги. На Фіг. 6С та 60 відповідно схематично проілюстровані домени тривалентних зв'язуючих молекул, що містять два М- кінцевих до Ес-ділянки зв'язуючих домени за типом діатіла та зв'язучий домен Рар-типу, в якому легкий ланцюг і важкий ланцюг з'єднані за допомогою поліпептидного лінкерного спейсера, або зв'язуючий домен 5сЕм -типу. Для тривалентних зв'язуючих молекул на Фіг. 6Е і 6Е відповідно схематично проілюстровані домени тривалентних зв'язуючих молекул, що містять два сС- кінцевих до Ес-ділянки зв'язуючих домени за типом діатіла та приєднаний зв'язуючий домен
Еабр-типу або зв'язуючий домен 5сЕу-типу, в яких знаходяться зв'язуючі домени за типом діатіла.
Тривалентні зв'язуючі молекули на Фіг. 6С-6Е містять три ланцюги. Домени МІ і МН, які розпізнають один і той же епітоп, показані однаковим штрихуванням або заливкою.
На Фіг. 7А-7С показані характеристики зв'язування ГАС-3 тАб 1 і ГдО-3 тАбБ 6 з І АОо-3 яванської макаки. Криві зв'язування Віасоге для ПІ АС-3 тА 6 (1.1) (Фіг. 7А), ПГАС-3 тА 1 (1.4) (Фіг. 78) і ГАО-3 тАБ А (Фіг. 7С), які демонструють, що ПІ А(О-3 тА 6 (1.1) характеризується кращим зв'язуванням з ГАС-3 яванської макаки (КО -- одиниці відповіді).
На Фіг. вА-80 показано, що ГдО-3 тАбБ 1 і ГдО-3 тА 6 зв'язують епітоп, що відмінний від того, який зв'язується еталонним антитілом ГАС З тАБ А. Профілі зв'язування мічених ГАО-3 тА 1, ГАС-3 тА 6 і Г АО-3 тАБ А за відсутності конкурентного антитіла (Фіг. ВА), у присутності надлишкового ГАС-3 тА 1 (Фіг. 88), надлишкового ГАС-3 тА 6 (Фіг. 8С) або ГАО-3 тАБб А (Фіг. 80) (КИ -- одиниці відповіді).
На Фіг. 9А-9В показано, що виділені антитіла інгібують зв'язування розчинного ГАС-3 людини (5ПІГАС-3) з МН ІІ класу, за результатами визначення в аналізі ІФА. На Фіг. 9А показані криві інгібування для ГАС-3 тАБ 1, І АС-3 тАБ 2, І ДО-3 тА 3, І АС-3 тА 4 та ГАО-3 тА 5.
На Фіг. 98 показані криві інгібування для ГАС-3 тАБ А, гуманізованого ПІ АС-3 1 (1.4) і п АС-3 6 (11) (АЯСГО -- відносні одиниці люмінесценції).
На Фіг. 10А-10С показано, що виділені антитіла інгібують зв'язування 5пІ Ас-3 з поверхнею клітин Дауді, що експресують МНС ЇЇ класу. На Фіг. 10А показані криві інгібування для І АС-3 тА 1, ГАС-3 тА 2, ГАС-3 тА 3, І АО-3 тА 4, І ДО-3 тА 5 і еталонного антитіла І АС-3 тА
А. На Фіг. 108 показані криві інгібування для ГАс-3 тАБб 1, І АС-3 тАБб 6 і ГАС-3 тАБб А. На фіг. 10С показані криві інгібування ГАС-3 тАБ 1 ї гуманізованого ПГАС-3 1 (1.4), ПІ Да-3 1 (1.2), п да-3 1 (2.2), ПНІ АИ-3 1 (1.1). Кожна цифра являє собою окремий експеримент; МЕ -- середня інтенсивність флуоресценції.
На Фіг. 11А-11С показано, що експресія | АОс-3 підвищується у простимульованих СО4 Т- клітинах. Проточний цитометричний аналіз експресії ГАОш-3 на непростимульованих СО4- Т- клітинах (Фіг. 11А) та простимульованих СО3З/С028 гранулами СО4-- Т-клітинах від двох різних донорів (Фіг. 118 і 11С) відповідно на 11-у та 14-у добу. Всі клітини були спільно пофарбовані антитілом до СО4.
На Фіг. 12 (секції А-Р) показано, що виділені антитіла до ГАС-3 зв'язуються з простимулюваними, але не з непростимульованими Т-клітинами. Проточний цитометричний аналіз простимульованих СОЗ/С028 СО4- Т-клітин (секції А-С) і непростимульованих СО4 Т- клітин (секції О-Е), що позначені за допомогою І АО-3 тА 1 (секції А і Ю), ГАО-3 тАБ 2 (секції В і Е) або ГАО-3 тАБ З (секції С і Р). Всі клітини були спільно пофарбовані антитілом до СО4.
На Фіг. 13 (секції А-Ю) показано, що виділені антитіла до ГАС-3 зв'язуються із простимулюваними, але не з непростимульованими Т-клітинами. Проточний цитометричний (610) аналіз простимульованих СОЗ/С028 СО4-- Т-клітин (секції А-В) і непростимульованих СО4 Т-
клітин (секції С-Ю), що позначені за допомогою І АС-3 тА 4 (секції А і С) або ГАС-3 тАбБ 5 (секції В і 0). Всі клітини були спільно пофарбовані антитілом до СО4.
На Фіг. 14 (секції А-Ю) показано, що експресія ГАС-3 та РО-1 підвищується на мононуклеарних клітинах периферичної крові (РВМС), що простимульовані ентеротоксином типу В (ЗЕВ) Зіарпуіососси5 ашгеив, які були одержані від типового донора 0: 34765. Проточний цитометричний аналіз БЗЕВ-простимульованих РВМС від типового донора через 48 годин після первинної стимуляції (секції А-В), що позначені антитілами до ГАС-3З/до СОЗ (секція А) або антитілами до РО-1/до СОЗ (секція В), і на п'яту добу після ЗЕВ-стимуляції (секції С-Ю) клітини, що оброблені тільки ЗЕВ (секція С) або ізотипічним контрольним антитілом (секція 0) під час вторинної стимуляції, позначені антитілами до ГАС-3/до РО-1.
На Фіг. 15 (секції А-Ю0) показано, що експресія ГАС-3 та РО-1 підвищується на 5ЕВ- простимульованих РВМС від іншого типового донора 0: 53724. Проточний цитометричний аналіз ЗЕВ-простимульованих РВМС від типового донора через 48 годин після первинної стимуляції (секції А-В), що позначені антитілами до ГАс-3/до СОЗ (секція А) або антитілами до
РО-1/до СОЗ (секція В), і на п'яту добу після ЗЕВ-стимуляції (секції С-Ю) клітини, що оброблені тільки ЗЕВ (секція С) або ізотипічним контрольним антитілом (секція О), позначені антитілами до І АС-3/до РО-1.
На фіг. 16А-168 показано, що ГАС-3 тАбБ 1 здатне стимулювати вироблення цитокінів до рівнів, що порівнянні з обробкою антитілами до РО-1. Профілі секреції ІРМу (Фіг. 16А) і ТМЕга (Фіг. 168) у ЗЕВ-простимульованих РВМС, оброблених антитілами до ГГ АС-3 або до РО-1.
На Фіг. 17 показано, що ГАС-3 тАбБ 1 здатне стимулювати вироблення цитокінів до рівнів, що порівняні з обробкою антитілами до РО-1, і що обробка за допомогою ГАО-3 тАб 1 у комбінації з антитілами до РО-1 забезпечувала найбільше посилення вивільнення цитокінів.
Профілі секреції ІЕМу з ЗЕВ-простимульованих РВМС, оброблених антитілами до ГАО-3 ї до
РО-1 окремо та в комбінації.
На Фіг. 18А-188 показане зв'язування антитіл до ГГ АС-3: ПІ АС-3 тА 6 (1.1) і ГАС-3 тАБ А, з ендогенним ГАС-3, що експресований 5ЕВ-простимулюваним РВМС яванської макаки від двох донорів (Фіг. 18А та 188). Антитіло до РО-1, РО-1 тАБ А, було включено як позитивний контроль для ЗЕВ-стимуляції.
Докладне розкриття даного винаходу
Даний винахід відноситься до зв'язуючих (ГАС-3 молекул, які містять зв'язуючий ІГдо-3 домен вибраних антитіл до І дО-3: І АСІ-3 тАБ 1, І ДС-3 тА 2, І АС-3 тА 3, І АС-3 тАБ 4, І АС-
З тАБ 5 або ГАС-3 тА 6, які здатні зв'язуватися як з | АС-3 яванської макаки, так і з | АС-3 людини. Даний винахід, зокрема, відноситься до зв'язуючих ГАС-3 молекул, які є гуманізованими або химерними версіями таких антитіл або які містять зв'язуючі ІГАс-3 фрагменти таких антитіл до ГАС-3 (особливо до імунокон'югатів, діатіл, ВІТЕ, біспецифічних антитіл і т. д.). Даний винахід, зокрема, відноситься до таких зв'язуючих ГГ АС-3 молекул, які додатково здатні зв'язуватися з епітопом молекули, що бере участь у регуляції імунної контрольної точки, яка присутня на поверхні імунної клітини. Даний винахід також відноситься до способів застосування таких зв'язуючих ГАС-3 молекул для детекції ГАС-3 або для стимуляції імунної відповіді. Даний винахід також відноситься до способів комбінованої терапії, при яких зв'язуючу (АС молекулу, яка містить один або декілька зв'язуючих ГАС-3 доменів таких вибраних антитіл до ГАС-3, вводять у комбінації з однією або декількома додатковими молекулами, які ефективні у стимуляції імунної відповіді, тим самим додатково підсилюючи, стимулюючи або підвищуючи таку імунну відповідь у суб'єкта.
І. Антитіла та домени, що їх з'вязують
Антитіла за даним винаходом являють собою молекули імуноглобуліна, що здатні імуноспецифічно зв'язуватися з мішенню, такою як вуглевод, полінуклеотид, ліпід, поліпептид і т.д., за допомогою щонайменше одного епітоп-розпізнаючого сайту, що розташований у варіабельному домені молекули імуноглобуліна.
Термін "антитіло", що застосовуваний у контексті даного документа, позначає молекулу імуноглобуліну, що здатна імуноспецифічно зв'язуватися з поліпептидом або білком або небілююовою молекулою у зв'язку з наявністю на такій молекулі конкретного домену, або фрагмента, або конформації ("епітопу"). Молекула, що містить епітоп, може мати імуногенну активність, таку, що викликає відповідь з виробленням антитіл у тварини; такі молекули називають "антигеном"). Молекули, що містить епітоп, не обов'язково є імуногенними.
Зв'язуючі домени за даним винаходом зв'язуються з епітопами "їімуноспецифічним" чином. У контексті даного документа говорять, що антитіло, діатіло або інша епітоп-зв'язуюча молекула "Імуноспецифічно" зв'язується (або характеризується "специфічним" зв'язуванням) з ділянкою (610) іншої молекули (тобто епітопом), якщо вона вступає у реакцію або асоціюється частіше,
швидше, довше та/або з більшою афінністю з таким епітопом, відносно альтернативних епітопів. Наприклад, антитіло, яке специфічно зв'язується з епітопом (ГАс-3, є антитілом, яке зв'язує такий епітоп ГАС-3 з більшою афінністю, авідністю, легше та/або довше, ніж воно зв'язується з іншими епітопами І АС-3 або з відмінним від ГАС-3 епітопом. Також при прочитанні цього визначення буде зрозуміло, що, наприклад, антитіло (або фрагмент, або епітоп), яке імуноспецифічно зв'язується з першою мішенню, може специфічно або переважно зв'язуватися або не зв'язуватися з другою мішенню. Таким чином, "імуноспецифічне зв'язування" не обов'язково вказує (хоча і може включати) на виняткове зв'язування. Зазвичай, але не обов'язково, відсилання до зв'язування означає "специфічне" зв'язування. Кажуть, що дві молекули здатні зв'язуватися одна з одною "фізиоспецифічним" чином, якщо таке зв'язування характеризується специфічністю, з якою рецептори зв'язуються з їх відповідними лігандами.
Здатність антитіла імуноспецифічно зв'язуватися з епітопом може бути визначена, наприклад, за допомогою імуносаналізу.
Природні антитіла (такі як антитіла до) складаються з двох легких ланцюгів у комплексі з двома важкими ланцюгами. Кожний легкий ланцюг містить варіабельний домен (МІ) і константний домен (СІ). Кожний важкий ланцюг містить варіабельний домен (МН), три константних домени (СНІ, СН2 та СНЗ) і "шарнірний" домен ("Н"), що розташований між доменами СНІ ії СН2. Таким чином, основною структурною одиницею природних імуноглобулінів (наприклад, дсС) є тетрамер, що має два легких ланцюги та два важких ланцюги, що зазвичай експресуються у вигляді глікопротеїну з масою приблизно 150000 Да.
Амінокінцева ("М-кінцева") частина кожного ланцюга включає у себе варіабельний домен, що містить приблизно 100-110 або більше амінокислот, в основному відповідальних за розпізнавання антигена. Карбоксикінцева ("С-кінцева") частина кожного ланцюга визначає константну ділянку, причому легкі ланцюги мають один константний домен, а важкі ланцюги зазвичай мають три константних домени та шарнірний домен. Таким чином, структура легких ланцюгів молекули ІдС являє собою п-МІ -СІ -с, а структура важких ланцюгів Їдо являє собою п-
МН-СНІ-Н-СН2г-СНЗ-с (де п і с являють собою відповідно М-кінець і С-кінець поліпептиду).
Здатність антитіла зв'язувати епітоп антигена залежить від наявності та амінокислотної послідовності доменів МІ ї МН антитіла. У результаті взаємодії легкого ланцюга антитіла та важкого ланцюга антитіла та, зокрема, взаємодії його доменів Мі. ї МН утворюється один з двох епітоп-зв'язуючих сайтів природного антитіла. Природні антитіла здатні зв'язуватися тільки з одним видом епітопу (тобто вони є моноспецифічними), при цьому вони можуть зв'язувати декілька копій такого виду (тобто характеризуються бівалентністю або мультивалентністю).
Варіабельні домени молекули /ідс складаються з ділянок (СОК), що визначають комплементарність, які містять залишки, що вступають у контакт з епітопом, і сегменти, які не належать до СОК, що звуться каркасними сегментами (ЕК), які зазвичай підтримують структуру та визначають позиціонування петель СОМ з тим, щоб зробити такий контакт можливим (хоча деякі каркасні залишки також можуть вступати у контакт з антигеном). Таким чином, домени МІ і
МН мають структуру п-БВ1-СОВ1-ЕН2-СОН2-ЕВ3-СОВЗ3-ЕН4-с. Поліпептиди, які являють собою (або можуть виступати в їх ролі) перший, другий і третій СОМ легкого ланцюга антитіла, у даному документі відповідно позначені доменом СОКІ1, доменом СОКІ2 і доменом СОКІЗ.
Аналогічним чином, поліпептиди, які являють собою (або можуть виступати в їх ролі) перший, другий і третій СОК важкого ланцюга антитіла, у даному документі відповідно позначені доменом СОКнНІ1, доменом СОКНа2 і доменом СОКНнНЗ. Таким чином, терміни домен СОКІ1, домен
СОНІ2, домен СОКІЗ, домен СОРНІ, домен СОРНна2 і домен СОРНЗ відносяться до поліпептидів, які при включенні у білок призводять до того, що білок стає здатним зв'язуватися зі специфічним епітопом незалежно від того, чи є білок антитілом, що має легкий і важкий ланцюги, або діатілом, або одноланцюжною зв'язуючою молекулою (наприклад, 5сЕм, Віте і т. д.) або є іншим типом білка. Відповідно, термін "епітоп-зв'язуючий домен", що застосовується у контексті даного документа, позначає таку частину епітоп-зв'язуючої молекули, яка відповідає за здатність такої молекули імуноспецифічно зв'язувати епітоп. Епітоп-зв'язуючий фрагмент може містити 1, 2, 3, 4, 5 або всі б доменів СОК такого антитіла і, хоча він і здатний імуноспецифічно зв'язуватися з таким епітопом, може характеризуватися імуноспецифічністю, афінністю або селективністю у відношенні такого епітопу, який відрізняються від таких, у такого антитіла. Переважно, проте, епітоп-зв'язуючий фрагмент буде містити всі 6 доменів СОК такого антитіла. Епітоп-зв'язуючий фрагмент антитіла може являти собою окремий поліпептидний ланцюг (наприклад, 5сЕм) або може містити два або більше поліпептидних ланцюги, кожний з яких має амінокінець і карбоксикінець (наприклад, діатіло, Рар-фрагмент, Е(ар')»5-фрагмент і т. д.). (610) Термін "антитіло", що застосовується у контексті даного документа, охоплює моноклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла, антитіла людини, гуманізовані антитіла, синтетичні антитіла, химерні антитіла, поліклональні антитіла, камелізовані антитіла, одноланцюжні Ем5 (5сЕм), одноланцюжні антитіла, імунологічно активні фрагменти антитіла (наприклад, фрагменти антитіла, що здатні зв'язуватися з епітопом, наприклад, ЕРар-фрагменти, ЕРар'-фрагменти,
Кабр")2-фрагменти, Ем-фрагменти, фрагменти, що містять домен М. і/або Мн, або які містять 1, 2 або З ділянки (СОК), що визначають компліментарність, такого домену МІ (тобто СОМКІ1,
СОРІ2 і/або СОМКІ 3) або домену МН (тобто СОКнНІ, СОВРн2 і/або СОРНнЗ)), які специфічно зв'язують антиген і т.д., біфункціональні або мультифункціональні антитіла, біспецифічні Ем5 (загм), інтраантитіла та діатіла, що зв'язані дисульфідним містком, і епітоп-зв'язуючі фрагменти будь-яких з перерахованих вище. Так, зокрема, термін "антитіло" мають на увазі як такий, що охоплює молекули імуноглобуліну й імунологічно активні фрагменти молекул імуноглобуліну, тобто молекул, які містять епітоп-зв'язуючий сайт. Молекули імуноглобуліну можуть бути будь- якого типу (наприклад, Ідс, ІДЕ, ДМ, ІдО, ДА та Ідхи), класу (наприклад, Іден, ІДС», ІдСз, Ід,
ІдАї і ІдАг) або підкласу (див., наприклад, патентні публікації США Мо Мо 20040185045, 20050037000, 20050064514, 20050215767, 20070004909, 20070036799, 20070077246 і 20070244303). Останні декілька десятиліть спостерігається пожвавлення інтересу в терапевтичному потенціалі антитіл, а антитіла стають одним з лідируючих класів лікарських засобів, що одержані біотехнологічними методами (Спап, СЕ еї аї. (2009) "Тпе О5е ОЇ Апііродіе5 іп Те Ттєаїйтепі ОЇ Іпіесібив Оівеавев5, " Зіпдароге Мей. у. 50 (7): 663-666). Більше 200 лікарських засобів на основі антитіл були схвалені для застосування або знаходяться на стадії розробки.
До антитіл до | АС-3 за даним винаходом відносяться гуманізовані, химерні або канинізовані варіанти антитіл | АС-3 тАб 1, ГГ АС-3 тА 2, ГАС-3 тА З, І АС-3 тАб 4, І АС-3 тА 5 або І АС-
З тАБ 6.
Термін "химерне антитіло" позначає антитіло, в якому частина важкого та/або легкого ланцюга ідентична або гомологічна антитілу від одного виду (наприклад, миші) або класу або підкласу антитіла, у той час як решта ідентична або гомологічна антитілу іншого виду (наприклад, людині) або класу або підкласу антитіла, за умови, що вони характеризуються необхідною біологічною активністю. До химерних антитіл, що являють інтерес, за даним описом відносяться "приматизовані" антитіла, що містять антиген-зв'язуючі послідовності варіабельного домену, що одержані від примата, який відмінний від людини (наприклад, мартишкових, людиноподібних мавп, і т. д.), і послідовності константної ділянки людини.
Термін "моноклональне антитіло", що застосовується у контексті даного опису, позначає антитіло популяції практично однорідних антитіл, тобто окремі антитіла, що входять до складу популяції Є ідентичними, за винятком можливих антитіл, що мають мутаціями, що зустрічаються у природі, які можуть бути присутніми у незначній кількості, а термін "поліклональне антитіло", що застосовується у контексті даного документа, позначає антитіло, що одержане з популяції гетерогенних антитіл. Термін "моноклональне" вказує на характерну ознаку антитіла як такого, що є популяцією практично однорідних антитіл, і його не слід тлумачити як такий, що позначає одержання антитіла будь-яким конкретним способом (наприклад, за допомогою гібридоми, фагового відбору, рекомбінантної експресії, трансгенних тварин і т. д.). Термін включає цілі імуноглобуліни, а також фрагменти і т. д., що описані вище під визначенням "антитіла". Способи одержання моноклональних антитіл відомі з рівня техніки.
Одним способом, який можна використовувати, є спосіб Копіег, с. еї аі. (1975) "Сопііпиои5
Сийигез ОЇ Ризей СеїЇ5 Зесгейпд Апііроду ОЇ Ргедеїпеа Зресійсйну, " Маїшге 256:495-497, або його модифікація. Зазвичай, моноклональні антитіла розробляють на мишах, щурах або кроликах.
Антитіла одержують шляхом імунізації тварини імуногенною кількістю клітин, клітинних екстрактів або білкових препаратів, які містять необхідний епітоп. Імуноген може являти собою без обмеження первинні клітини, культивовані клітинні лінії, злоякісні пухлинні клітини, білки, пептиди, нуклеїнові кислоти або тканину. Клітини, що застосовувані для імунізації, можна культивувати протягом деякого періоду часу (наприклад, щонайменше 24 години) перед їх застосуванням як імуногена. Клітини можна застосовувати як імуногени самі по собі або у комбінації з неденатуруючим ад'ювантом, таким як Кібі (див., наприклад, Уеппіпд5, М.М. (1995) "Кеміем/ ої Зеїесієй Адіимапі5 Озей іп Апібоду Ргодисіоп, " ІГАК У. 37(3):119-125). Зазвичай клітини слід підтримувати інтактними та переважно життєздатними при застосуванні як імуногени. Інтактні клітини можуть забезпечувати для імунізованих тварин кращу детекцію антигенів, ніж зруйновані клітини. Застосування денатуруючих або агресивних ад'ювантів, наприклад, ад'юванта Фрейнда, може зруйнувати клітини і, отже, не рекомендується. Імуноген можна вводити багаторазово з періодичними інтервалами, такими як два рази на тиждень або 10) раз на тиждень, або можна вводити таким чином, щоб зберігалася його життєздатність у тварини (наприклад, у рекомбінантній тканині). Альтернативно, існуючі моноклональні антитіла та будь-які інші еквівалентні антитіла, які є імуноспецифічними для необхідного патогенного епітопу, можна секвенувати і одержати рекомбінантно будь-якими способами, що відомими з рівня техніки. Відповідно до одного варіанта здійснення, таке антитіло секвенують, а полінуклеотидну послідовність потім клонують у вектор для експресії або розмноження.
Послідовність, що кодує антитіло, яке являє інтерес, можна зберігати у векторі в клітині-хазяїні, а потім клітку-хазяїна можна розмножити та заморозити для подальшого застосування.
Полінуклеотидну послідовність таких антитіл можна застосовувати для генетичної маніпуляції з метою створення моноспецифічних або мультиспецифічних (наприклад, біспецифічних, триспецифічних і тетраспецифічних) молекул за даним винаходом, а також антитіла з оптимізованою афінністю, химерного антитіла, гуманізованого антитіла та/або канинізованого антитіла, для покращення афінності або інших характеристик антитіла.
Термін "5сЕРу" відноситься до одноланцюгових фрагментів варіабельних доменів. Молекули 5сЕм одержують шляхом зв'язування варіабельного домену легкого та/або важкого ланцюга за допомогою короткого з'єднуючого пептиду. У роботі Віга еї аї. (1988) ("ЗіпаІїе-СНнаіп Апіідеп-
Віпаіпуд Ргоїеїіп5, " Зсіепсе 242: 423-426) описаний приклад з'єднуючих пептидів, які з'єднують містком приблизно 3,5 нм між карбоксильним кінцем одного варіабельного домену та амінокінцем іншого варіабельного домену. Були розроблені та застосовуються лінкери з іншими послідовностями (Віга еї аї. (1988) "БіпдІе-СНаїп Апіідеп-Віпаіпу Ргоїеїп5, " Зсіепсе 242: 423-426).
У свою чергу, лінкери можна модифікувати для додаткових функцій, таких як приєднання лікарських засобів або прикріплення до твердих підкладок. Одноланцюгові варіанти можна одержати або рекомбінантно, або синтетично. Для синтетичного одержання 5сЕм можна застосовувати автоматизований синтезатор. Для рекомбінантного одержання 5сЕм відповідну плазміду, що містить полінуклеотид, який кодує 5СЕм, можна ввести у відповідну клітину-хазяїна, або еукаріотичну, таку як дріжджові клітини, клітини рослини, комахи або ссавців, або прокаріотичну, таку як Е. соїї. Полінуклеотиди, що кодують 5СЕм, який являє інтерес, можна одержати звичайними маніпуляціями, такими як лігування полінуклеотидів. 5сЕм, що одержаний у результаті, можна виділити за допомогою стандартних методик очищення білка, що відомі з рівня техніки.
Даний винахід, зокрема, відноситься до гуманізованих варіантів антитіл до ГАС-3 за даним винаходом і до мультіспецифічних зв'язуючих молекул, що містять їх. Термін "гуманізоване" антитіло позначає химерну молекулу, яка зазвичай одержана за допомогою рекомбінантних методик, що має епітоп-зв'язуючий сайт імуноглобуліну від виду, що не відносяться до людини, та решту імуноглобулінової структур молекули, яка базується на структурі та/або послідовності імуноглобуліну людини. Епітоп-зв'язуючий сайт може містити або повні варіабельні домени, що злиті на константних доменах, або тільки СОК, що привиті на відповідні каркасні ділянки у варіабельних доменах. Епітоп-зв'язуючі сайти можуть бути дикого типу або модифіковані однією або декількома амінокислотними замінами. Це усуває константну ділянку як імуноген у людей, але можливість імунної відповіді на чужорідну варіабельну ділянку зберігається (І оВидіїйо, АЕ еї аІ!. (1989) "Моизе/Нитап Спітегіс Мопосіопа! Апіїроду Іп Мап: Кіпеїіс5 Апа Іттипе Кезропзе, "
Ргос. Май). Асад. сі. (О5БА) 86: 4220-4224). В іншому підході основна увага приділяється не тільки забезпеченню наявності константних ділянок людського походження, але й модифікації варіабельних ділянок, а також зміненню їх форми на як можна більше близьку до людської форми. Відомо, що варіабельні ділянки як важких, так і легких ланцюгів містять три СОБК, які варіюють в залежності від антигенів, що розглядаються, та визначають зв'язуючу здатність, фланковані чотирма каркасними ділянками (ЕК), які відносно консервативні у заданому виді та які ймовірно забезпечують каркас для СОК. При одержанні антитіл, що відмінні від людських, до конкретного антигена варіабельні ділянки можна "переформувати" або "гуманізувати" шляхом щеплення СОК, які одержані з антитіла, що відмінне від людського, на ЕК, що присутні у людському антитілі, яке підлягає модифікації. Застосування такого підходу до різних антитіл розглянуто у роботі За, К. еї аІ.«1993) "Кезпаріпуд А Нитап Апіїроду То Іппірії Те ІптегіеикКіп 6-
Берепаепі Титог СеїЇ Сгоули, " Сапсег Ке5 53:851-856. Ніесптапп, Г. еї а. (1988) "НезПпаріпд
Нитап Апііродієз тої Тпегару, " Майшге 332:323-327; Метоеуєп, М. еї аї. (1988) "Незпаріпд
Нитап Апііродієв: сзгайіпд Ап Апійузогуте Асіїмйу, " Зсіепсе 239:1534-1536; КешШеброгоцан, С. А. еїаї. (1991) "Нитапігайоп ОЇ А Моизе Мопосіопа! Апіїбоду Ву СОВ-Стайіпд: Те Ітропапсе ОЇ
Егатемжогк Кезідце5 Оп Гоор Сопіоптпаїййоп, " Ргоївіп Епдіпеегіпд 4:773-3783; Маєда, Н. еї аї. (1991) "Сопвігисіоп ОЇ Везпарей Нитап Апііродієз М/Уййп НІМ-Мецшігаїїгіпуд Асіїмйу, 7" Нитап
Апіїродієз Нубгідота 2:124-134; Соптап, 5. 0. єї а). (1991) "Везпаріпяа А ТПегарешіс СА
Апіїроду, " Ргос. Май. Асай. 5сі. (0О.5.А.) 88:4181-4185; Тетрезві, Р.В. єї аї. (1991) "Незпаріпд А (610) Нитап Мопосіопа! Апібоду То Іппірй Нитап Кезрігайогу Зупсуйа! Мігиз ІпТескйоп іп мімо, "
Віо/Гесппоіоду 9:266-271; Со, М. 5. єї аї. (1991) "Нитапілей Апіїбодіє5 Рог Апіїміга! Тпегару, "
Ргос. Майї). Асад. 5сі. (0.5.А.) 88:2869-2873; Сапег, Р. єї аї. (1992) "Нитапігайоп ОЇ Ап Апії- р1ів85пег2 Апіїбоду Рог Нитап Сапсег Тпегару, " Ргос. Маї!. Асай. 5сі. (0О.5.А.) 89:4285-4289; і Со,
М.5. еї аІ. (1992) "Спітегіс Апа Нитапіей Апіїродіеєз УМІВ Зресійсйу Бог Тпе СОЗ3З Апіїдеп, " 4.
Ітітипої. 148:1149-1154. Відповідно до деяких варіантів здійснення, гуманізовані антитіла зберігають всі послідовності СОК (наприклад, гуманізоване мишаче антитіло, яке містить всі шість СОК з мишачих антитіл). Відповідно до інших варіантів здійснення, гуманізовані антитіла мають один або декілька СОК (один, два, три, чотири, п'ять або шість), які змінені за їх амінокислотною послідовностю(-ями) відносно вихідного антитіла, які також називають одним або декількома СОК, "які є похідними від" одного або декількох СОК з вихідного антитіла (тобто є похідними від таких СОК, які одержані завдяки даним про амінокислотні послідовності таких
СОК, і т.д.). Полінуклеотидну послідовність, яка кодує варіабельний домен антитіла, можна застосовувати для створення таких похідних і покращення афінності або інших характеристик таких антитіл. Загальний принцип гуманізації антитіла передбачає збереження основної послідовності епітоп-зв'язуючої частини антитіла при заміні решти нелюдської частини антитіла на послідовность людського антитіла. Існує чотири загальних стадії гуманізації моноклонального антитіла. Ці стадії наступні: (1) визначення нуклеотидної та прогнозованої амінокислотної послідовності варіабельних доменів легких і важких ланцюгів вихідного антитіла, (2) конструювання гуманізованого антитіла або канинізованого антитіла, тобто прийняття рішення про те, яку каркасну ділянку антитіла застосовувати у процесі гуманізації або канинізації, (3) фактичні методології/методики гуманізації або канинізації та (4) трансфекція і експресія гуманізованого антитіла. Див., наприклад, патенти США МоМо 4816567, 5807715, 5866692 та 6331415.
Епітоп-зв'язуючий сайт молекул за даним винаходом може містити повний варіабельний домен, що злитий з константним доменом, або тільки ділянки (СОМ), що визначають компліментарність, такої варіабельної ділянки, які привиті до відповідних каркасних ділянок.
Епітоп-зв'язуючі сайти можуть бути дикого типу або модифіковані однією або декількома амінокислотними замінами. Це усуває константну ділянку як імуноген у людей, але можливість імунної відповіді на чужорідний варіабельний домен зберігається (ІоВидійо, А.Р. еї а/І.(1989) "Моизе/Нитап СпТітегіс Мопосіопа! Апіїроду Іп Мап: Кіпейс5 Апа Іттипе Кезропзе, " Ргос. Май.
Асад. осі. (0.5.А.) 86:4220-4224). В іншому підході основна увага приділяється не тільки забезпеченню наявності константних ділянок людського походження, але і модифікованих варіабельних доменів, а також зміненню їх форми на якомога більш близьку до людської форми. Відомо, що варіабельні домени як важких, так і легких ланцюгів містять три ділянки (СОК), що визначають компліментарність, які варіюють у залежності від антигенів, що розглядаються, та визначають зв'язуючу здатність, фланкировані чотирма каркасними ділянками (ЕК), які відносно консервативні у заданого виду і які, ймовірно, забезпечують каркас для СОК. При одержані антитіл, що відмінні від людських, до конкретного антигена варіабельні домени можна "переформувати" або "гуманізувати" шляхом щеплення СОР, які одержані з антитіла, що відмінне від людського, на ЕК, які присутні у людському антитілі, що підлягає модифікації. Застосування такого підходу до різних антитіл розглянуто у роботі Бай, К. єї а!(1993) Сапсег НКез 53:851-856. Ніесптапп, Ї. еї а). (1988) "Незпаріпд Нитап Апііродієв ог
Тпегару, " Маїшиге 332:323-327; Метоеуеп, М. еї аї. (1988) "Незпаріпд Нитап Апіїродієвв: Стайіпду
Ап Апійузолуте Асіїмпйу, " Зсіепсе 239:1534-1536; КешШеброгоцодн, С. А. єї аї. (1991) "Нитапігайоп
ОА Моийзе Мопосіопа! Апіроду Ву СОВ-Стайіпд: Те Ітропапсе ОЇ Егатемжоїк Везідцез Оп
Гоор Сопіогітайіоп, " Ргоївіп Епдіпеегіпд 4:773-3783; Маєда, Н. єї аї. (1991) "Сопвігисіоп ОЇ
Везпаред Нитап Апіїродієз УП НІМ-Мешгаїїгіпуд Асіїміу, " Нитап Апіїродієз Нубргідота 2:124- 134; Соптап, 5. 0. еї аїІ. (1991) "Кезпаріпд А Тпегарешіс СО4 Апііроду, " Ргос. Май. Асай. 5061. (0О.5.А.) 88:4181-4185; Тетреві, Р.В. еї аї. (1991) "Безпаріпд А Нитап Мопосіопа! Апіїбоду То 5о0 Іппірії Нитап Кезрігагу Зупсуйаї! Міги5 Іптесійоп іп мімо, " Віо/ГесппоЇоду 9:266-271; Со, М. 5. єї аІ. (1991) "Нитапілей Апіїродіе5 Рог Апіїмігаї Тпегару, " Ргос. Май. Асай. Зсі. (0.5.А.) 88:2869- 2873; Сапег, Р. єї аї. (1992) "Нитапігайоп ОЇ Ап Апіі-рі8в5Нпег2 Апіроду Рог Нитап Сапсег
Тпегару, " Ргос. Май. Асай. сі. (0О.5.А.) 89:4285-4289; ії Со, М.5. еї аїІ. (1992) "Спітегіс Апа
Нитапігей Апіїродіез УМИй Зресійсйцу Бог Те СОЗ33 Апіідеп, " У. Іттипої. 148:1149-1154.
Відповідно до деяких варіантів здійснення, гуманізовані антитіла зберігають всі послідовності
СОК (наприклад, гуманізоване мишаче антитіло, яке містить всі шість СОК з мишачих антитіл).
Відповідно до інших варіантів здійснення, гуманізовані антитіла мають один або декілька СО (один, два, три, чотири, п'ять або шість), які розрізняються за послідовністю відносно вихідного антитіла. (610) Був описаний ряд "гуманізованих" молекул антитіл, що містять епітоп-зв'язуючий сайт, який одержаний з імуноглобуліну, що відмінний від людського, включаючи химерні антитіла, що мають варіабельний домен гризуна або модифікований варіабельний домен гризуна й асоційовані з ним ділянки (СОК), що визначають компліментарність, злиті 3 константними доменами людини (див., наприклад, УМіптег еї аІ.«1991) "Мап-таде Апіірбодіе5, " Майиге 349:293- 299; І орцаїйо еї аї. (1989) "Моизе/Нитап СНітегіс Мопосіопа! Апіїбоду Іп Мап: Кіпеїїсв Апа
Іптітипе Кезропзе, " Ргос. Май. Асай. Зсі. (0О.5.А.) 86:4220-4224 (1989), пам еї аї. (1987) "Спагасіегігайоп ОЇ А Моизе/Нитап СпПітегіс Мопосіопа! Апіїбоду (17-1А) То А Соїоп Сапсег
Титог-Ав5осіаїей Апіїдеп, " У. Іттипої. 138:4534-4538, і Вгомуп еї аїЇ. (1987) "Титог-5ресіїіс
Сепеїїсапйу Епдіпеегеа Мигіпе/Нитап Спітегіс Мопосіопа! Апіїбоаду, " Сапсег Кев5. 47:3577-3583).
В інших джерелах описані СОК гризунів, що привиті у підтримуючу каркасну ділянку (ЕК) людини перед злиттям 3 відповідним константним доменом людського антитіла (див., наприклад, Кіесптапп, І... еї аІ.«1988) "Кезпаріпд Нитап Апііродієв Тог Тпегару, " Майиге 332:323-
З27; Метоеуеп, М. еї а. (1988) "Не5Ппаріпуд Нитап Апііродіе5: Сгайпд Ап АпіШузогуте Асіїмну, "
Зсіепсе 239:1534-1536; і допез еї а!. (1986) "Керіасіпд Те Сотріетепіату-Оеїетптіпіпа Ведіопе
Іп А Нитап Апіїбоду УМІп Тпозе гот А Моизе, " Маїиге 321:522-525). В іншому джерелі описані
СОК гризунів, що підтримувані рекомбінантно венованими каркасними ділянками гризунів. Див., наприклад, публікацію європейського патенту Мо 519596. Такі "гуманізувані" молекули сконструйовані для мінімізації небажаної імунологічної відповіді на молекули антитіл гризунів до антитіла людини, що обмежує тривалість і ефективність терапевтичних застосувань таких фрагментів у людей, що приймають такий препарат. Інші способи гуманізації антитіл, які також можна використовувати, розкриті у роботі Оацдпепу еї аІ(1991) "РоїЇутегазе Спаїіп Веасійп
Расійатюев5 Тйе СіІопіпд, СОВ-Стайіпо, Апа Рарій Ехргезвіоп ОЇ А Мигіпе Мопосіопа! Апіїбоду
Оігесієа Адаїпзї Тпе СО18 Сотропепі ОЇ І ейКосуїе Іпіедгіп5, " Мисі. Асіа5 Ке5. 19:2471-2476, і в патентах США МоМо 6180377, 6054297, 5997867 і 5866692.
ІЇ. Рецептори Есу (Есук)
Домени СН2 та СНЗ двох важких ланцюгів взаємодіють з утворенням Ес-ділянки, яка є доменом, який розпізнається клітинними рецепторами Ес, у тому числі без обмеження гамма- рецепторами Ес (ЕсукК). Термін "Ес-ділянка", що застосовуваний у контексті даного документа, застосовують для позначення С-кінцевої ділянки важкого ланцюга Ідс. Амінокислотна послідовність домену СН2-СНЗ ілюстративного ЇД01 людини являє собою (5ЕО ІЮ МО:1): 231 240 250 260 270 280
АР ПСсСсРБУ ЕГЕРРКРКОТ ІМІБЕТРЕУТ СУЛЛУПУБНЕр РЕУМКЕМА УЮ 290 300 310 320 330
СУВБУНМАКТК РЕБЕЕОСТМ5ТУ ВУУБУТТУТН опАТМОКЕїКк СКУБМКАТРА
Зо 350 зер 370 Зо
РІВЕКТІЗКАК СОРЕЕРОУУТ ІРРБВЕЕМТК МОоУВІТСІУК СЕХРБЗБІАУВ за до 410 420 430 иЕОМОСОРЕММ УКТТРРУПІБ5 ПОСОБРЕТУБКТ, тУОкВВМООос МУКОСБУМНЕ
ДАО 447
АТНМНУТОКО І5І5РОХ яка пронумерована відповідно до ЄЮ системи нумерації за Кабаї, де Х є лізином (К) або відсутній.
Амінокислотна послідовність домену СН2-СНЗ ілюстративного (3052 людини являє собою (ЗЕО ІЮ МО:г):
231 280 250 260 270 280
АРРУА-СРБУ ЕГЕРРКРКОТ ІМІБНТРЕУТ СсллДУВНЕО РЕМОЕМИ У УЮ 290 300 310 320 330
СУВУНМНАКТК РЕБЕОЕМОТЕ УМО тТУУН ОормІМОоКЕКк СКЕМОМКОТГРА зЗйО з5О Зоо Зо За
РІБЕКТІБКТК СОРКЕРОМУТ ІРРОНЕЕМТК МОоУвВІтсрУК СЕТтТРООБІВЗУВ 390 ДО 410 420 430 ивоМсОРЕММ УКТІРРМІО5 ООБЕЕГтОКІ, ТУПО ВМООС МУвОСЬУМНЕ
ДАО 447
АГНМНуТОКЬ Г5ІБРоХ о яка пронумерована відповідно до Є системи нумерації за Кабаї, де Х є лізином (К) або відсутній.
Амінокислотна послідовність домену СН2-СНЗ ілюстративного (ДЗ людини являє собою (ЗЕОІЮ МО:3): 231 ря го го ре 280
АРЕТПГОсСсРВУ ЕПЕРРКРКОТ ІМІБВКТРЕМТ сил УВнЕр РЕМОЕВЕКИНУ УЮ 290 300 310 320 330 сУВУНМАКТК РЕЕЕОУМОТЕ ВУМБУГТМІН ормІіМсквІКк СКМОМКАГРА 340 350 360 370 380
РІВЕКТІЗКТК СОРКЕРОМУТ ІРРОКВЕМТК МОоУВІтТсІУкК СЕтРОПІАУЕ 390 400 410 420 430
МЕВБОоСОРЕММ УМТТРРМІО5 ПОБЕЕГУОКІ, тТУркОвРеиноос МІВБСЬУМНЕ 440 ДА
АТНМКЕТОК5 ТвБІвРОоХ о яка пронумерована відповідно до Є системи нумерації за Кабаї, де Х є лізином (К) або вІдсУтни ВИСПОТНА послідовність домену СН2-СНЗ ілюстративного ІдД54 людини являє собою (ЗЕО ІЮ МО:4): 231 24о го 260 20 280
АРЕЕТОсСРБУ ЕГПЕРРЕРКОТ ІМІБЕТРЕМТ СУМУ УВОоВр РЕМОЕМИАИ УЮ 290 300 310 320 330 сУВУНМАКТК РЕБЕОВЕМОТУ ВУМБМІТУТН опи МОКВиКк скКУВМКкОогРБ
ЗДО ЗБ Зоо 370 380
ЗБІЕКТІБВБКАК СОРВЕРОМУТ ІРРБОВЕМТК МоУВБІтТсгУК СЕУРБОТАУВ 90 до д10 до ДЗ иВЕБМОСОРЕММ УКТТРРУТО5 ПОБЕЕТУБН, Турко МВСУ МНЕ
До ДА
АТНМНУуУТОоКО ївБІБІСХ яка пронумерована відповідно до ЄЮ системи нумерації за Кабраї, де Х є лізином (К) або відсутній.
За всім даним описом нумерація залишків у константній ділянці важкого ланцюга Ідс відповідає Б системі нумерації за КарБбаї єї а!., Хедиєпсез ої Ргоївїпв5 ої Іттипоіодісаї Іпіегеві, 57
ЕЯ. Рибріїс Неайй Зегмісе, МНІ, МО (1991) ("Кара"), що явним чином включена у даний документ за допомогою посилань. "БО система нумерації за Кава!" відноситься до нумерації БО антитіла
Ід51 людини. Амінокислоти з варіабельних доменів зрілих важких і легких ланцюгів імуноглобулінів позначені за положенням амінокислоти у ланцюзі, а СОК вказаний згідно з визначенням за Кабаї (буде зрозуміло, що СОРНІ, згідно з визначенням за СПпоїйіа, С. 8. І е5К, А.
М. (1987) "Сапопісаї! вігисіиге5 ог Ше Ппурегмагіабіе гедіоп5 ої іттиподіориїїпе, ". У. Мої. Віої. 196:901-917) починається на п'ять залишків раніше). Караї описав багаточисленні амінокислотні послідовності для антитіл, визначив амінокислотну консенсусну послідовність для кожної підгрупи та привласнив кожній амінокислоті номер залишку. Схему нумерації за Караї можна розширити на антитіла, що не включені в його збірку, шляхом вирівнювання антитіла, що розглядається, з однією з консенсусних послідовностей за Кабаї з урахуванням консервативних амінокислот. Цей спосіб присвоєння номерів залишків став стандартним у даній галузі техніки та дозволяє легко виявити амінокислоти в еквівалентних положеннях у різних антитіл, в тому числі у химерних або гуманізованих варіантів. Наприклад, амінокислота у положенні 50 легкого ланцюга антитіла людини займає еквівалентне положення амінокислоті у положенні 50 легкого ланцюга антитіла миші.
За рядом різних положень у межах константних ділянкок антитіла спостерігалися поліморфізми (наприклад, за положеннями Ес, у тому числі без обмеження положенням 270, 272, 312, 315, 356 і 358, що пронумеровані згідно з ЄЮ системою нумерації за Каба)), і, відповідно, можуть мати місце невеликі відмінності між представленою послідовністю та послідовностями, що відомими з рівня техніки. Були добре охарактеризовані поліморфні форми імуноглобулінів людини. У теперешній час відомі 18 Ст алотипи: с1т (1, 2, 3, 17) або С1т (а,
Х, Її, 27), б2т (23) або б2т (п), Зт (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) або СЗт (1, с3, 63, БО, 63, 64, 5,1, 91, с5, М, м, 95) (І еяїгапс, єї а)І., "Те Нитап Ідсаї 5!ибсіаззев: МоїІесшаг Апаїувів ої Зігисіиге, Рипсіоп Апа Кедшіайоп." Регдатоп, Охіога, рр. 43-78 (1990); І еїтапс, с. єї аї., 1979,
Нит. Сепвї.: 50, 199-211). Зокрема, передбачається, що антитіла за даним винаходом можуть включати будь-який алотип, ізоалотип або гаплотип будь-якого гена імуноглобуліну та не обмежені алотипом, ізоалотипом або гаплотипом послідовностей, що представлені у даному документі. Крім того, у деяких системах експресії С-кінцевий амінокислотний залишок (що виділений жирним вище) домену СНЗ може бути видалений посттрансляційно. Відповідно, С- кінцевий залишок домену СНЗ є необов'язковим амінокислотним залишком у зв'язуючих І АС-3 молекулах за даним винаходом. Зокрема, даний винахід відноситься до зв'язуючих ГАС-3 молекул без С-кінцевого залишку домену СНЗ. Також, зокрема, даний винахід відноситься до таких конструкцій, які містять С-кінцевий залишок лізину домену СНЗ.
Активуючі та інгібуючі сигнали трансдукуються при лігуванні Ес-ділянки з клітинним рецептором Ес (Есук). Здатність такого лігування призводити до діаметрально протилежних функцій виникає зі структурних відмінностей серед різних ізоформ рецепторів. Різні відповіді зумовлюють два різних домени у цитоплазматичних сигнальних доменах рецептора, що звуться імунорецепторними тирозинними активуючими мотивами (ІТАМ) та імунорецепторними тирозиновими інгібуючими мотивами (ІТІМ5). Залучення різних цитоплазматичних ферментів у такі структури обумовлює результат ЕсукК-опосередквуваних клітинних відповідей. До комплексів ЕсуК, що містять ІТАМ, відносяться ЕсукКіІ, ЕСуУКПА, ЕсуУКкПА, тоді як до комплексів, що містять ІТІМ, відноситься тільки ЕсукіІІВ. Людські нейтрофіли експресують ген ЕсСуУКПА.
Угруповування ЕсукПА за допомогою імунних комплексів або зшивання зі специфічними антитілами сприяє агрегації ІТАМ з рецептор-асоційованими кіназами, які полегшують фосфорилювання ІТАМ. Фосфорилювання ІТАМ виконує роль сайту докінгу для ЗукК-кінази, активація якої призводить у результаті до активації наступних субстратів (наприклад, РізК).
Клітинна активація призводить до вивільнення прозапальних медіаторів. Ген ЕсукІІВ експресується на В-лімфоцитах; його позаклітинний домен на 96 95 ідентичний ЕсСукКІА і зв'язує комплекси дО нерозрізненим чином. Наявність ІТІМ у цитоплазматичному домені ЕсукІїІВ визначає цей інгібуючий підклас ЕсукК. Нещодавно була встановлена молекулярная основа такого інгібування. При спільному лігуванні з активуючим сук, ІТІМ в ЕсуКІІВ стає фосфорильованим і притягує домен 5Н2 інозитолполіфосфат-5-фосфатази (5НІР), який гідролізує фосфоінозитолові месенджери, що вивільняються у результаті активації тирозинкінази, що містить ІТАМ, залежна від ЕсукК, у результаті запобігається приплив внутрішньоклітинного Са"". Таким чином, перехресне зшивання ЕсСукКіІІВ послаблює активуючу відповідь на лігування Есук та інгібує клітинну відповідну реакцію. Відповідно, активація В- клітин, проліферація В-клітин і секреція антитіл припиняються. (610) І. Біспецифічні антитіла, мультиспецифічні діатіла та діатіла ОАКТО
Функціональність антитіл може бути підвищена шляхом створення мультиспецифічних молекул на основі антитіл, які можуть одночасно зв'язувати два окремих і різних антигени (або різні епітопи одного і того ж антигена), та/або шляхом створення молекули на основі антитіл, що має більше високу валентність (тобто більше двох сайтів зв'язування) для одного епітопу та/або антигена.
Для одержання молекул, що мають більші функціональні можливості, ніж природні антитіла, був розроблений широкий спектр форматів рекомбінантних біспецифічних антитіл (див., наприклад, РСТ публікації УУО 2008/003116, УМО 2009/132876, УМО 2008/003103, УМО 2007/146968, УМО 2009/018386, УМО 2012/009544, УУО 2013/070565), більшість з яких передбачають застосування лінкерних пептидів або для злиття додаткового епітоп-зв'язуючого фрагмента (наприклад, 5сЕм, МІ, МН і т. д.) з остовом антитіла або в остові антитіла (ІдА, дО,
ІЧЕ, до або ІдМ), або для злиття множини епітоп-зв'язуючих фрагментів (наприклад, двох Еар- фрагментів або 5сЕм5). Альтернативні формати передбачають застосування лінкерних пептидів для злиття епітоп-зв'язуючого фрагмента (наприклад, 5сЕм, МІ, МН їі т. д.) з доменом димеризації, таким як домен СН2-СНЗ, або альтернативними поліпептидами (МО 2005/070966,
МО 2006/107786А УМО 2006/107617А, УМО 2007/046893). Зазвичай, такі підходи передбачають компроміси та баланс переваг і недоліків. Наприклад, у РСТ публікаціях МО 2013/174873, УМО 2011/133886 і МО 2010/136172 розкрито, що застосування лінкерів може викликати проблеми у терапевтичних планах, і запропоновано триспецифічне антитіло, в якому домени Сі їі СНІ переключені з їх відповідних природних положень, а домени Мі і МН зроблені різноманітними (МО 2008/027236, УМО 2010/108127) для забезпечення їм можливості зв'язуватися з більше ніж одним антигеном. Таким чином, у молекулах, що розкриті в цих документах, специфічність зв'язування принесена у жертву здатності зв'язувати додаткові види антигенів. У РСТ публікаціях УМО 2013/163427 і МО 2013/119903 розкрита модифікація домену СН2 для включення аддукту злитого білка, що містить зв'язуючий домен. У документі наголошується, що домен СНа2, ймовірно, грає лише мінімальну роль в опосередковані ефекторної функції. У РСТ публікаціях МО 2010/028797, ММО2010028796 і УМО 2010/028795 розкриті рекомбінантні антитіла,
Ес-ділянки яких були замінені додатковими доменами Мі і МН з утворенням тривалентних зв'язуючих молекул. У РСТ публікаціях УМО 2003/025018 і М/О2003012069 розкриті рекомбінантні діатіла, окремі ланцюги яких містять домени 5сЕм. У РСТ публікації УМО 2013/006544 розкриті багатовалентні молекули Раб, які синтезуються у вигляді єдиного поліпептидного ланцюга, а потім піддаються протеолізу з утворенням на виході гетеродимерних структур. Таким чином, у молекул, що розкриті у цих документах, повна або часткова здатність опосередковувати ефекторну функцію принесена у жертву здатності зв'язувати додаткові види антигенів. У РСТ публікаціях МО 2014/022540, УМО 2013/003652, МО 2012/162583, МО 2012/156430, УМО 2011/086091, МО 2008/024188, МО 2007/024715, МО 2007/075270, МО 1998/002463, МО 1992/022583 та МО 1991/003493 розкрите додавання додаткових зв'язуючих доменів або функціональних груп до антитіла або частині антитіла (наприклад, додавання діатіла до легкого ланцюга антитіла, або додавання додаткових доменів МІ ії МН до легких і важких ланцюгів антитіла, або додавання гетерологічного злитого білка, або зв'язування декількох доменів Бар один з одним у ланцюг). Таким чином, у молекул, що розкриті у цих документах, нативна структура антитіла принесена у жертву здатності зв'язувати додаткові види антигенів.
Крім того, у рівні техніки відзначалася можливість одержання діатіл, які відрізняються від таких природних антитіл здатністю зв'язувати два або більше різних видів епітопів (тобто характеризуються біспецифічністю або мультиспецифічністю на додаток до двовалентності або багатовалентності) (див., наприклад, Ноїїдег еї а/.(1993) "Оіародіев": бтаї! Вімаіепі Апа
Візресійс Апіроду Егадтепіє, " Ргос. Маї). Асай. 5сі. (0О.5.А.) 90:6444-6448; 005 2004/0058400 (Ноїїпдег єї аІ.); 005 2004/0220388 / МО 02/02781 (Мепепвз еї аї.); АЇї еї аІ. (1999) РЕВ5 І ей. 454(1-2):90-94; 1 и, 0. єї аї. (2005) "А Бшіу Нитап Весотрбіпапі Іда-І ке Візресіїс Апіїбоду То
Воїй Те Ерідепта! Стоули Расіог Весеріог Апа Те Іпзцііп-ііке Стомли Расіог Весеріог Еог
Еппапсеа Апійштог Асіїмну, " у. Віої. Спет. 280(20):19665-19672; МО 02/02781 (Мепепз вї аї.);
ОІаївеп, Т. еї аї. (2004) "СомаІєпі Оівийіде-Гіпкеа Апі-СЕА Оіароду Айомже Зйе-Зресіїіс
Сопісдайоп Апа Вадіоїабеїїпа Рог Титог Тагдеїіпуд Арріїсайоп5, " Ргоївіп Епд. ЮОев. Зеї. 17(1):21- 27; Ми, А. еї аї. (2001) "Мийітетгігайноп ОЇ А Спітетгіс Апії-СО20 Біпдіє Спаіп Гм-ЕРм Ривіоп Ргоївіп
І Медіаївд Тигоцдп Магіаріє Оотаїп Ехспаподе, " Ргоївіп Епдіпеегіпд 14(2):1025-1033; Азапо еї аї. (2004) "А біароду Рог Сапсег ІттипоїНегару Апа ї5 Рипсіопа! Епнапсетепі Ву Ривіоп ОЇ Нитап
Ес ботаїп, " Абзігасі ЗР-683, 9. Віоспет. 76(8):992; Такетига, 95. еї аї. (2000) "Сопвігисіоп ОТГ А
Ріароду (Зтаї! ВАесотріпапі Вівресіїс Апіїбоду) О5іпд А ВАеїоїдіпд Зузіет, " Ргоївіп Епод. 13(8):583-588; Ваєцепе, Р.А. єї аї. (2009) "Візресіїс Т-Сеї! Епоаадіпа Апіїродієє Рог Сапсег (610) Тпегару, " Сапсег Кез. 69(12):4941-4944).
Конструкція діатіла базується на похідному антитіла, що відоме як одноланцюговий фрагмент варіабельного домену (5СЕм). Такі молекули одержують шляхом зв'язування варіабельних доменів легкого талабо важкого ланцюга за допомогою короткого з'єднуючого пептиду. У свою чергу, лінкери можна модифікувати для додаткових функцій, таких як приєднання лікарських засобів або прикріплення до твердих підкладок. Одноланцюжні варіанти можна одержати або рекомбінантно, або синтетично. Для синтетичного одержання 5сЕм можна застосовувати автоматизований синтезатор. Для рекомбінантного одержання 5сЕм підходящу плазміду, що містить полінуклеотид, який кодує 5сСЕм, можна ввести у підходящу клітку-хазяїна, або еукаріотичну, таку як дріжджові клітини, клітини рослини, комахи або ссавців, або прокаріотичну, таку як Е. соїї. Полінуклеотиди, що кодують 5сЕм, який являє інтерес, можна одержати звичайними маніпуляціями, такими як лігування полінуклеотидів. 5СЕм, що одержаний у результаті, можна виділити за допомогою стандартних методик очищення білка, що відомі з рівня техніки.
Створення немоноспецифічних діатіл дає значну перевагу перед антитілами, включаючи без обмеження здатність спільно лігувати та спільно локалізувати клітини, які експресують різні епітопи. Таким чином, біспецифічні діатіла мають широкий спектр застосувань, у тому числі в терапії та імунодіагностиці. Біспецифічність забезпечує більшу гнучкість у конструюванні та розробці діатіла для різних задач, у забезпеченні підвищеної авідності до мультимірних антигенів, у перехресному зшиванні різних антигенів й у спрямованому націлюванні на конкретні типи клітин, виходячи з наявність обох цільових антигенів. Завдяки їх підвищеній валентності, низьким швидкостям дисоціації та швидкому виведенню з кровотоку (для діатіл невеликих розмірів, на рівні або нижче -- 50 кДа), для молекул діатіл, що відомі з рівня техніки, також було продемонстровано особливе застосування в області візуалізації пухлини (Ейгдегаїа еї аІ.(1997) "Іпргомей Титоиг Тагдейпуд Ву Оізширпіде егаріїйлеа Оіародіех Ехргеззей Іп Ріспіа равіогів, "
Ргоївїіп Епа. 1011221).
Біспецифічність діатіл призвела до їх застосування для спільного лігувания різних клітин, наприклад, перехресного зшивання цитотоксичних Т-клітин з пухлинними клітинами (Зіаег7 еї а!.(1985) "Нургіа Апіібодіе5 Сап Тагдеї 5йез Рог АнНаск Ву Т Сеїї5, " Майшге 314:628-631, і НоїПдег еї аі. (1996) "Зресіїйс Кійпа ОЇ Гутрпота СеїІє Ву Суюїохіс Т-СеЇє Медіаїєд Ву А Візресіїіс
З0 Оіароду, " Ргоївіп Епд. 9:299-305; Магуіп єї аї. (2005) "Бесотбіпапі Арргоаснез То Іда-ГікКе
Візресійс Апііїродіе5, " Асіа РІаптасої. біп. 26:649-658). Альтернативно, або додатково, біспецифічні діатіла можна застосовувати для спільного лігування рецепторів на поверхні різних клітин або на одній клітині. Спільне лігування різних клітин і/або рецепторів корисно для модулювання ефекторних функцій і/або передачі сигналів у імунної клітини. Мультиспецифічні молекули (наприклад, біспецифічні діатіла), що містять епітоп-зв'язуючі сайти, можуть бути спрямовані на поверхневу детермінанту будь-якої імунної клітини, таку як В7-НЗ (СО0276), В7-НА (МТСМ1), ВТ А (00272), 603, С08, С0р16, 0027, 60032, 0040, СОр401, 0047, 6064, 6070 (сргл3, Срво (8В7-1), 6086 (87-2), 6094 (КІ От), Сб0137 (4-188), СО1371 (4-1881), СбО226,
СТІ А-4 (СО152), галектин-9, СІТК, СІТКІ, ННГА2, ІСОЗ (С0278), ІСО5І (С0275), рецептор активацій кілерів (КІК), ГАС-3 (СбО223), ПОНТ (ТМЕ5Е14, СО0258), МНС І або ІІ класу, МКОоЗа,
Мкага, ох40 (20134), ОХ40І (С01341), РОТН, РО-1 (00279), РО-І 1 (8В7-НІ, С0274), РО-І2 (87-СО, С0273), РУВ (МЕСІ 5, 20155), 5ІВРа, ТОВ, ТІСІТ, ТІМ-3 (НАМСКЗ) і/або МІЗТА (РО-1Н), які експресуються на Т-лімфоцитах, натуральних кілерах (МК), антиген-презентуючих клітинах або інших мононуклеарних клітинах. Так, зокрема, епітоп-зв'язуючі сайти, що спрямовані на рецептор клітинної поверхні, який бере участь у регуляції імунної контрольної точки (або її ліганда), корисні для створення біспецифічних або мультиспецифічних зв'язуючих молекул, які антагонізують або блокують передачу інгібуючого сигнала молекулами імунної контрольної точки та тим самим стимулюють, підвищують або посилюють імунні відповіді у суб'єкта. До молекул, що беруть участь у регуляції імунних контрольних точок, відносяться без обмеження
В7-НЗ, В7-Н4, ВТ А, Сб040, б0401, 0047, 2070, СО80, С0р86, 0094, С0137, С01371, СО226,
СТІ А-4, галектин-9, СІТА, СІТАГ, ННІ А2, ІСО5, ІСОБІ,, КІВ, І АС-3, ГПІСНТ, МН І або ІІ класу,
Мкага, МКага, охХ40, ОХ40І, РОН, РО-1, РО-І 1, РО-І2, РУВ, 5ІВРа, ТОВ, ТІСІТ, ТІМ-3 і/або
МІ5ТА.
Тим не менш, вищезгадані переваги обходяться високою ціною. Для утворення таких немоноспецифічних діатіл необхідна успішна збірка двох або більш відмінних і різних поліпептидів (тобто для такого утворення необхідно, щоб діатіла утворювалися за допомогою гетеродимеризації поліпептидних ланцюгів різних видів). Цей факт сильно відрізняє їх від моноспецифічних діатіл, які утворюються за допомогою гомодимеризації ідентичних поліпептидних ланцюгів. Оскільки повинні бути представлені щонайменше два різнорідних 10) поліпептиди (тобто поліпептиди двох видів) для утворення немоноспецифічного діатіла, а також оскільки гомодимеризація таких поліпептидів призводить до одержання неактивних молекул (ТаКетига, 5. еї аї. (2000) "Сопвігисіоп ОЇ А Оіароду (Зтаї! Весотрбіпапі Візресійс Апііроду)
О5іпд А Кейїаїпд Зузіет, " Ргоївіп Епд. 13(8):583-588), одержання таких поліпептидів необхідно здійснювати таким чином, щоб запобігти ковалентному зв'язуванню між поліпептидами одного виду (тобто запобігти гомодимеризації) (ТаКептига, 5. еї аІ. (2000) "Сопвігисіоп ОЇ А Ріароду (Зтаї! Кесотрбіпапі Візресіїіс Апіїроду) О5іпд А Кетїдіпд 5узієт, " Ргоївіп Епод. 13(8):583-588).
Таким чином, у рівні техніки було розкрито нековалентне зв'язування таких поліпептидів (див., наприклад, Оіаїхеп еї аІ(2004) "Сомаіепі Оізиніае-Г іпкей Апіі-СЕА Біароду АПомє ЗпПе-5ресіїіс
Сопідайноп Апа Кадіоїіабеїїпд Бог Титог Тагдеїйіпд Арріїсайоп5, " Ргої. Епдг. ЮОе5. зеї. 17:21-27; Авзапо еї аї. (2004) "А бСіароду Рог Сапсег Іттипоїпегару Апа 5 ЕРипсіїопа! Еппапсетепі Ву
Еивіоп ОЇ Нитап Ес рРотаїп, " Абеігасі ЗР-683, У. Віоспет. 76(8):992; Такетига, 5. єї аї. (2000) "Сопвігосіоп ОЇ А Оіабсду (Зтаї! Ресотрбіпапі Візресіїс Апіїбоду) Овіпд А Кеїоїдіпд Зузіет, "
Ргоївіп Епо. 13(8):583-588; ГИ, 0. еї аї. (2005) "А РишПу Нитап Несотрбіпапі Іда-гіКе Візресіїіс
Апіїбоду То Воїй Те Ерідента! Стоули Расіог Ресеріог Ап Те Іпзцііп-ГіКе Стомй Расіюог
Весерюг Рог Еппапсей Апійштог Асіїміу, " у. Віої. Спет. 280(20):19665-19672).
Тим не менш, з рівня техніки відомо, що біспецифічні діатіла, що складаються з нековалентно зв'язаних поліпептидів, є нестабільними та легко дисоціюють на нефункціональні мономери (див., наприклад, І и, О. еї аІ(2005) "А Ешу Нитап НКесотрбіпапі Іда-іїКе Візресіїс
Апіїбоду То Воїй Те Ерідента! Стоули Расіог Ресеріог Ап Те Іпзцііп-ГіКе Стомй Расіюог
Кесеріог Бог Еппапсей Апійштог Асіїмну, " У. Віої. Спет. 280(20):19665-19672).
З огляду на цю проблему, у галузі техніки вдалося розробити стабільні, ковалентно зв'язані гетеродимерні немоноспецифічні діатіла, що звуться діатілами ЮАКТЯ (Оцча! Айіпйу Ке-
Тагодеїїпу Неадепів - цілеспрямовані реагенти з подвійною афінністю); див., наприклад, патентні публікації США МоМо 2013-0295121, 2010-0174053 та 2009-0060910; публікації європейських патентів МоМо ЕР 2714079, ЕР 2601216, ЕР 2376109, ЕР 2158221 і РСТ публікації УМО 2012/162068, УМО 2012/018687, МО 2010/080538, УМО 2008/157379, УМО 2006/113665 і 5іоап,
О.О. еї аї. (2015) "Тагодеїіпуд НІМ Везегуоїг іп Іп'еєсїеє4й С04 Т СеїЇє Бу ЮцаІ-Айіпійу Не-їагдеїїп9
МоїІесшез (ОАКТ5) (Шаг Віпа НІМ Епмеюре апа Кесгий Суюїохіс Т Сеїї5, " РГо5 Рашод. 11(111)ухе1005233. дої: 10.1371/Лоигпа!.рраї.1005233; А! Низзаїпі, М. еї аї. (2015) "Тагдеїпу СО123
Іп АМІ Овіпду А Т-Сеї! рігесієд Юца!І-Аніппу Ве-Тагдейпд (АКТ) Ріаногт, " Віоса 127(1):122-131;
Спіспіїї, С.А. еї аї. (2015) "А СбОЗхСО123 Вівресіїс ЮАВТ Рог Недігесіпд Нові Т СеїЇв То
МуєІодепоиз І еиКетіа: Ргесіїпіса! Асіїмйу Апа Заїеїу п Моппитап Ргітайев, " Зсі. Тгапві. Мед. 7(289):289гав2; Моотге, Р.А. еї аї. (2011) "Арріїсайоп ОЇ Оца! Айіпйу Веїагдеїпо Моїіесшев То
Аспіеме Оріїта! ВНедігесієд Т-Сеї! Кійпту ОО В-СеїЇ Гутрпота, " Віоса 117(17):4542-4551; Мегїі,
М.О. єїаї. (2010) "Тнегарешііс Сопігої ОЇ В Сеї! Асіїмайоп Міа Вестийтепі Ої Есдатта Весеріог Пр (СО32В) Іппірйогу Бипсіоп УМИп А Момеї Візресійс Апіроду Зсапноїа, " Агійгйй5 Кпеит. 62(7):1933- 1943; Чопп5оп, 5. еї аї. (2010) "Епнесюг СеїЇ Весгийтепі М/ййп Моме! Ем-Вазед ЮпцаІ-Аніпйу Ве-
Тагаеїпа Ргоїєїп І єад5 То Роїєпі Титог Суюіувів Апа іп мімо В-СеїЇ ЮОеріейоп, " 9). Мої. Віо|. 399(3):436-449; Маг/іп, 9.5. еї а). (2005) "Несотбріпапі Арргоасне5 То Іда-сіКе Вівресіїіс
Апіійбодіеє5, " Асіа Рпаптасої. Зіп. 26:649-658; Оіаївеп, Т. єї аї. (2004) "Сомаїепі Різиніае-Г іпкеа
Апі-СЕА біароду АйЙйом Зійе-Зресіїс Сопішдайоп Апа ВадіоїабеїйпЯ Бог Титог Тагаєїїпа
Арріїсайопз5, " Ргої. Епдг. Ое5. Зеї. 17:21-27; Ноїїїде"г, Р. єї а. (1993) "Оіароаієв": Зтаї! Вімаїепі
Апа Вігвресіїїс Апіроду Егадтепів5, " Ргос. Май. Асай. сі. (0О.5.А.) 90:6444-6448. Такі діатіла містять два або більше поліпептида, що ковалентно зв'язані у комплекс, і передбачають включення способами інженерії одного або декількох цистеїнових залишків у кожному з видів поліпептиду, що використовуються, які забезпечують утворення дисульфідних зв'язків і тим самим ковалентно зв'язують два поліпептидних ланцюги. Наприклад, було показано, що додавання цистеїнового залишку до С-кінця таких конструкцій дозволяє утворити дисульфідний зв'язок між поліпептидними ланцюгами, стабілізуючи гетеродимер, що одержаний у результаті, без втручання у характеристики зв'язування двовалентної молекули.
Кожний з двох поліпептидів простішого біспецифічного діатіла ОАКТФ містить три домени.
Перший поліпептид містить ("у напрямку від М-кінця до С-кінця): (ї) перший домен, який містить ділянку зв'язування варіабельного домену легкого ланцюга першого імуноглобуліну (МІ-1), (її) другий домен, який містить ділянку зв'язування варіабельного домену важкого ланцюга другого імуноглобуліну (МН), та (ії) третій домен, який містить цистеїновий залишок (або домен, що містить цистеїн) і домен, що сприяє утворенню гетеродимера, який сприяє гетеродимеризації з другим поліпептидом діатіла та ковалентно зв'язує перший та другий поліпептиди діатіла один з одним. Другий поліпептид містить (у напрямку від М-кінця до С-кінця): () перший домен, який містить ділянку зв'язування варіабельного домену легкого ланцюга другого імуноглобуліну (610) (МІ 2), (її) другий домен, який містить ділянку зв'язування варіабельного домену важкого ланцюга першого імуноглобуліну (УНІ), і (ії) третій домен, який містить цистеїновий залишок (або домен, що містить цистеїн) і комплементарний домен, що сприяє утворенню гетеродимера, який утворює комплекс з доменом, що сприяє утворенню гетеродимера, першого поліпептидного ланцюга для того, щоб сприяти гетеродимеризації з першим поліпептидним ланцюгом. Цистеїновий залишок (або домен, що містить цистеїн) третього домену другого поліпептидного ланцюга сприяє утворенню ковалентного зв'язка другого поліпептидного ланцюга з першим поліпептидним ланцюгом діатіла. Такі молекули є стабільними, високоактивними та мають здатність одночасно зв'язувати два або більше антигенів. Відповідно до одного варіанта здійснення, треті домени кожного з першого та другого поліпептидів містять цистеїновий залишок, який призначений для зв'язування поліпептидів один з одним за допомогою дисульфідного зв'язка. На Фіг. 1 представлене схематичне зображення такого діатіла, в якому використовуються домени, що сприяють утворенню гетеродимера, з Є- спіраллю/К-спіраллю та лінкер, що містить цистеїн, для ковалентного зв'язування. На Фіг. 2 та
Фіг. ЗА-3С показано, що один або обидва поліпептиди можуть додатково мати послідовність домену СН2-СНЗ, так щоб комплексоутворення між двома поліпептидами діатіла формувало
Ес-ділянку, яка здатна зв'язуватися з рецептором Ес у клітин (таких як В-лімфоцити, дендритні клітини, натуральні кілери, макрофаги, нейтрофіли, еозинофіли, базофіли та тучні клітини). Як більше докладно представлено нижче, домени СНО та/або СНЗ таких поліпептидних ланцюгів не обов'язково повинні бути ідентичними за послідовністю, та переважно вони модифіковані таким чином, щоб це сприяло комплексоутворенню між двома поліпептидними ланцюгами.
Було описана множина варіантів таких молекул (див., наприклад, патентні публікації США
МоМо 2015/0175697, 2014/0255407, 2014/0099318, 2013/0295121, 2010/0174053 та 2009/0060910; публікації європейских патентів МоМо ЕР 2714079, ЕР 2601216, ЕР 2376109, ЕР 2158221 і РСТ публікації УМО 2012/162068, УМО 2012/018687, УМО 2010/080538). Такі діатела САКТФ, що містять Ес-ділянку, можуть містити дві пари поліпептидних ланцюгів. Перший поліпептидний ланцюг містить (у напрямку від М-кінця до С-кінця): () перший домен, який містить ділянку зв'язування варіабельного домену легкого ланцюга першого імуноглобуліну (МІ1), (ії) другий домен, який містить ділянку зв'язування варіабельного домену важкого ланцюга другого імуноглобуліну (МН), та (ії) третій домен, який містить цистеїновий залишок (або домен, що містить цистеїн) і сприяє гетеродимеризації з другим поліпептидом діатіла та ковалентно зв'язує перший та другий поліпептид діатіла один з одним, і (м) домен СН2-СНЗ. Другий поліпептид містить (у напрямку від М-кінця до С-кінця): (|) перший домен, який містить ділянку зв'язування варіабельного домену легкого ланцюга другого імуноглобуліну (МІ 2), (її) другий домен, який містить ділянку зв'язування варіабельного домену важкого ланцюга першого імуноглобуліну (МНІ), і (ії) третій домен, який містить цистеїновий залишок (або домен, що містить цистеїн) і домен, що сприяє утворенню гетеродимера, який сприяє гетеродимеризації з першим поліпептидним ланцюгом. У цьому випадку два перших поліпептиди утворюють комплекс один з одним з утворенням Ес-ділянки. На Фіг. ЗА-3С представлені схематичні зображення трьох варіантів таких діатіл з використанням різних доменів, що сприяють утворенню гетеродимера.
Інші діатела ЮАКТФ, що містять Ес-ділянку, можуть містити три поліпептидні ланцюги.
Перший поліпептид таких діатіл ОАКТФ містить три домени: (Її) домен, що містить МІ, (ії) домен, що містить Мі 2, та (ії) домен, що містить послідовність СН2-СНЗ. Другий поліпептид таких діател ОАКТО містить: (ї) домен, що містить Мі 2, (ії) домен, що містить МН, і (ії) домен, який сприяє гетеродимеризації та ковалентному зв'язуванню першого поліпептидного ланцюга діатіла. Третій поліпептид таких діател ОАКТО містить послідовність СН2-СНЗ. Таким чином, перший та другий поліпептидні ланцюги таких діател ОАКТФ асоціюються один з одним з утворенням сайту зв'язування МІ 1/Л/НІ1, який здатний зв'язуватися з епітопом, а також сайту зв'язування МІ 2/Л/Н2, який здатний зв'язуватися з другим епітопом. Такі більше складні молекули ОАКТФ також мають домени, що містять цистеїн, функція яких полягає в утворенні ковалентно зв'язаного комплексу. Таким чином, перший та другий поліпептиди зв'язані один з одним за допомогою дисульфідного зв'язка за участю цистеїнових залишків у їх відповідних третіх доменах. Слід зазначити, що перший та третій поліпептидні ланцюги об'єднуються в комплекс один з одним з утворенням Ес-ділянки, яка стабілізована дисульфідним зв'язком. На
Фіг. 4А-48 представлені схематичні зображення таких діатіл, що містять три поліпептидні ланцюги.
Ще одні діатіла ЮАКТЯ, що містять Ес-ділянки, можуть містити п'ять поліпептидних ланцюгів, які можуть містити ділянки зв'язування з варіабельних доменів легкого та важкого ланцюгів від трьох або менше різних імуноглобулінів (що звуться МІ1/Л/НІ, МІ 2//Н2 та
МІЗ/Л/НЗ). Наприклад, перший поліпептидний ланцюг таких діатіл може містити: (І) домен, що (610) містить УНІ, (ії) домен, що містить СНІ, і (ії) домен, що містить послідовність СН2-СНЗ. Другий та п'ятий поліпептидні ланцюги таких діатіл можуть містити: () домен, що містить МІ, і (ії) домен, що містить СІ. Третій поліпептидний ланцюг таких діатіл може містити: (ї) домен, що містить УНІ, (її) домен, що містить СНІ, (ії) домен, що містить послідовність СН2-СНЗ, (ім) домен, що містить МІ/2, (м) домен, що містить МНЗ, та (м) домен, що сприяє утворенню гетеродимера, де домени, що сприяють утворенню гетеродимера, сприяють димеризации третього ланцюга з четвертим ланцюгом. Четвертий поліпептид таких діатіл може включати: (Її) домен, що містить Мі 3, (ії) домен, що містить МУНАа, і (ії) домен, який сприяє гетеродимеризації та ковалентному зв'язуванню третього поліпептидного ланцюга діатіла. У цьому випадку перший та третій поліпептиди утворюють комплекс один з одним з утворенням Ес-ділянки. Такі більш складні молекули ОАКТФ також мають домени, що містять цистеїн, функція яких полягає в утворенні ковалентно зв'язаного комплексу, так щоб кожний поліпептидний ланцюг був зв'язаний щонайменше з одним поліпептидним ланцюгом, що приєднується, за допомогою дисульфідного зв'язку за участю цистеїнових залишків. Переважно такі домени розташовані у порядку від М-кінця до С-кінця. На фіг. 5 представлені схематичні зображення таких діатіл, що містять п'ять поліпептидних ланцюгів.
З рівня техніки відомі альтернативні конструкції для задач, де потрібна чотирьохвалентна молекула, але не потрібна Ес, включаючи без обмеження чотирьохвалентні тандемні антитіла, що також звуться "ТападАрБ" (див., наприклад, патентні публікації США МоМе 2005-0079170, 2007- 0031436, 2010-0099853, 2011-020667 2013-0189263; публікації європейських патентів МоМо ЕР 1078004, ЕР 2371866, ЕР 2361936 і ЕР 1293514; РСТ публікації МО 1999/057150, УМО 2003/025018 ії УМО 2013/013700), які утворені у результаті гомодимеризації двох ідентичних ланцюгів, кожний з яких має домен УНІ, МІ 2, МН2 та МІ 2.
Нещодавно були описані тривалентні структури, що включають два зв'язуючих домени за типом діатіла і один домен типу, що відмінний від діатіла, та Ес-ділянку (див., наприклад, РСТ заявку РСТ/О5З15/33076 під назвою "Триспецифічні зв'язуючі молекули та способи їх застосування (Тгі-зресійс Віпаіпд МоїІесшев5 і Меїпод5 ої Озе Тпегеої)», що подана 29 травня 2015 року; та РСТ/О515/33081 під назвою "Триспецифічні зв'язуючі молекули, які специфічно зв'язуються з множиною антигенів злоякісних пухлин, і способи їх застосування (Тгі-5ресіїіс
Віпаіпд МоїІесціез Тпаї Зресіїїсану Віпа то Мийіріеє Сапсег Апіїдеп5 апа Меїйпоаз ої Обе Тпегеоб», що подана 29 травня 2015 року). Такі тривалентні молекули можна використовувати для створення моноспецифічних, біспецифічних або триспецифічних молекул. На Фіг. бА-6Е представлені схематичні зображення таких тривалентних молекул, що містять З або 4 поліпептидні ланцюги.
ІМ. Зв'язуючі ГАС-3 молекули за даним винаходом
До переважних зв'язуючих ГАС-3 молекул за даним винаходом відносяться антитіла, діатіла, ВІТЕ і т. д., і вони здатні зв'язуватися з суцільною або дискретною (наприклад, конформаціонною) частиною (епітопом) ГАС-3 людини. Зв'язуючі ГАС-3 молекули за даним винаходом будуть переважно також характеризуватися здатністю зв'язуватися з молекулами
Г АС-3 одного або декількох видів, що відмінні від людини, зокрема, приматів (і особливо таких приматів, як яванська макака). Типовий поліпептид ГАС-3 людини (послідовність в МСВІ
МР 002277.4, включаючи сигнальну послідовність 3 22 амінокислотних залишків (показану підкреслено) та зрілий білок з 503 амінокислотних залишків) має амінокислотну послідовність (ЗЕО ІО МО: 5):
МИБЕАОЕГОСТІ, ЕГОРІЙМАРУ КРІОРСАВБУР УУМАОЕСАРА ОГРОБРТІРІ,
ОороБІПКЕКАСС УТАИОНОРОБО РРАААРСОСНРІ, АРОРПРААРО 5БИСРЕРККУТ
УГБУБРОСЬК 5БОБКЕГРІОРЕМ ОГОЕКСВОКО ВЕБ МІЕРАК КБАПАСЕТУБАА
УНІГКОКАГбеС КЕСЕГПКІСОАб МТАБРРОБІВК АБОИМІГМС5 ЕБКРОКЕРАБУ
НИМ ОСК УРУКЕСРННН ГАЕБЕГЕГРО УБРМОБОоРИСС СІСТУКОСЕМ
УЗБІМУМІТУ СГЕРРТРІТУ УХАбАСВББЕУСІ РСКГРАСУСТ КБЕГПТАКИТР
РОБОРОБДІМТ СБОМОБЕТЬКІ ВПУБОАОАСТ УТСНІНГОВО ОБМАТУТІГАТ
ІТМТРЕКО5ЕсСЬЮ РОБКИ ОСЕ МІТРУБСОВЕКЕ МИББГОТРБО ББЕБОРИГЕА
ОБАОГПІВБОРМИ ОСОБУОСЕКІ ГОААМУЄЕТЕЇ, ББРОБАОБООК АРСОСАГРАСНІ,
ППЕПІПОМІе ПУ ТОАКО ЕНТИВКЕКЕОМЕР КЕЕБАГТЕОСІ НРРОАОБКІВ
ЕГЕОБЕРЕРЕР ЕРЕРЕРЕРЕР ЕРЕОЇ,
Відповідно до деяких варіантів здійснення, зв'язуючі ГАС-3 молекули за даним винаходом характеризуються будь-яким (одним або декількома) з наступних критеріїв: (1) специфічно зв'язує ГАС-3 людини як такий, що ендогенно експрессується на поверхні простимульованих Т-клітин людини; (2) специфічно зв'язує ГАС-3 людини з рівноважною константою зв'язування (Ко) 40 нМ або менше; (3) специфічно зв'язує І АС-3 людини з рівноважною константою зв'язування (Ко) 0,5 нМ або менше; (4) специфічно зв'язує ГАС-3 примата, що відмінний від людини, (наприклад, ГАС-3 яванської макаки); (5) специфічно зв'язує ГАС-3 примата, що відмінний від людини, з рівноважною константою зв'язування (Ко) 50 нМ або менше; (6) специфічно зв'язує І АО-3 примата, що відмінний від людини, з рівноважною константою зв'язування (Ко) 5 НМ або менше; (7) інгібує (тобто блокує або перешкоджає йому) зв'язування І АС-3 з МН ІІ класу; (8) стимулює імунну відповідь; (9) стимулює антиген-специфічну Т-клітинну відповідь як окремий засіб; (10) проявляє синергізм з антитілом до РО-1, стимулюючи антиген-специфічну Т-клітинну відповідь; (11) зв'язує такий же епітоп | АС-3, що й антитіло до І АС-3: | АС-3 тАБ 1 або ГГ АС-3 тАб 6, імабо (12) не конкурує з антитілом до ГАОс-3 257Е (ВМ5 986016, Медагех/ВМ5) за зв'язування з
ГАС-3 (наприклад, за результатами вимірювань за допомогою аналізу Віасоге).
Термін "антиген-специфічна Т-клітинна відповідь", що застосовується у контексті даного документа, відноситься до відповідей, що виробляються Т-клітинами, які є результатом стимуляції Т-клітини антигеном, у відношенні якого Т-клітина є специфічною. До обмежуючих прикладів відповідей, що виробляються Т-клітиною при антиген-специфічній стимуляції, відносяться проліферація та вироблення цитокінів (наприклад, вироблення ТМЕ-а, ІЕМ-у).
Здатність молекули стимулювати антиген-специфічну Т-клітинну відповідь можна визначити, наприклад, за допомогою аналізу РВМС, що описаний у даному документі, простимульованих антигеном ентеротоксину типу В ("ЗЕВ") гарпуіососсиз ашимгеицв5.
Переважні зв'язуючі (АС-3 молекули за даним винаходом мають домени МН і/або Мі. мишачих моноклональних антитіл до І Ас-3: "| А(-3 тАр 1", "| АС-3 тАБ 2", "| АС-3З тА 3", "ГдО-3 тА 4", "ГАО-3 тАб 5" і/або "САС-3 тА 6", і більше переважно мають 1, 2 або всі З
СОВНн з домену УН і/або 1, 2 або всі З СОК. з домену Мі. таких моноклональних антитіл до І АС-
З. До таких переважних зв'язуючих ГАС-3 молекул відносяться біспецифічні (або мультиспецифічні) антитіла, химерні або гуманізовані антитіла, ВіТе, діатіла та т. д. і такі зв'язуючі молекули, які мають варіантні Рс-ділянки.
Даний винахід, зокрема, відноситься до зв'язуючих ГАС-3 молекул, що містять зв'язуючий
І АС-3 домен, який має: (А) (1) три СОКН з домену МН антитіла до ІГ АС-3, І АС-3 тАБ 1, або МІ 4 ПІ АС-3 тАб 1; (2) три СОК. з домену МІ антитіла до І АС-3, І АСІ-3 тАб 1; (3) три СОКн з домену МН антитіла до ГАС-3, І АСІ-3 тАБ 1, і три СОК. з домену Мі. антитіла до Г АО-3, І АС-3 тАб 1; (4) домен МН антитіла до ІГ АС-3, І ДО-3 тАБ 1; (5) домен Мі. антитіла до І АС-3, | АС-3 тАб 1; (6) домени МН і Мі антитіла до І АО-3, І АСІ-3 тА 1; (В) (1) три СОКНн з домену МН антитіла до І АС-3, І АС-3 тАб 2; (2) три СОК. з домену МІ антитіла до І АС-3, І АСІ-3 тАб 2; (3) три СОКн з домену МН антитіла до І АС-3, | АС-3 тА 2, і три СОК. з домену Мі. антитіла до І АО-3, І АС-3 тАб 2; (4) домен МН антитіла до ІГ АС-3, І ДО-3 тА 2; (5) домен Мі. антитіла до І АС-3, | АС-3 тАб 2; (6) домени МН і Мі. антитіла до ГАО-3, І ДС-3 тА 2; (С) (1) три СОКн з домену МН антитіла до ГАС-3, І АС-3 тА 3; (2) три СОК. з домену МІ антитіла до І АС-3, І АСІ-3 тАб З; (3) три СОКн з домену МН антитіла до І АС-3, | АС-3 тА 3, і три СОК. з домену Мі. антитіла до АС-3, | АС-3 тАб З; (4) домен МН антитіла до І АС-3, І ДС-3 тА 3; (5) домен Мі. антитіла до І АС-3, | АС-3 тАб З; (6) домени МН і Мі антитіла до І АС-3, І АСІ-3 тА З; (0) (1) три СОКн з домену МН антитіла до ГАС-3, І АС-3 тАБ 4; (2) три СОК. з домену МІ антитіла до І АС-3, І АСІ-3 тАб 4; (3) три СОКн з домену МН антитіла до І АО-3, | АС-3 тА 4, і три СОК. з домену Мі. антитіла до І АО-3, І АС-3 тАб 4; (4) домен МН антитіла до ІГ АС-3, І ДО-3 тАБ 4; (5) домен Мі. антитіла до І АС-3, | АС-3 тАб 4; (6) домени МН і Мі антитіла до І АО-3, І АСІ-3 тА 4; (Е) 0) три СОКНн з домену МН антитіла до І АС-3, І АС-3 тАб 5; (2) три СОК. з домену МІ антитіла до І АС-3, І АСІ-3 тАб 5; (3) три СОКн з домену МН антитіла до І АС-3, | АС-3 тА 5, і три СОК. з домену Мі. антитіла до І дО-3, І ДС-3 тАБ 5; (4) домен МН антитіла до ІГ АС-3, І ДО-3 тАб 5; (5) домен Мі. антитіла до І АС-3, | АС-3 тАб 5; (6) домени МН і МІ антитіїла до І АС-3, І АСІ-3 тА 5; (РЕ) І) три СОКн з домену МН антитіла до І АС-3, І ДО-3 тА 6; (2) три СОК. з домену МІ антитіла до І АС-3, І АСІ-3 тАб 6; (3) три СОКн з домену МН антитіла до І Ас-3, | АС-3 тА 6, і три СОК. з домену Мі. антитіла до І дО-3, І ДСИ-3 тА 6; (4) домен МН антитіла до ІГ АС-3, І ДО-3 тА 6; (5) домен Мі. антитіла до І АС-3, | АС-3 тАб 6; (6) домени МН і Мі антитіла до І АО-3, І АСІ-3 тА 6, (С) (1) три СОК. з домену Мі антитіла до І АС-3, МІ 4 НІ АС-3 тАб 1; (2) три СОКн з домену МН антитіла до І АС-3, І АСІ-3 тА 1, і три СОК з домену Мі антитіла к
ГАС-3, МІ 4 ПІ АС-3 тА 1; або який зв'язується або конкурує за зв'язування з епітопом, який імуноспецифічно зв'язує | АО-3 тА 1, Гда-3 тАБ 2, ГГ АС-3 тАБ 3, І АС-3 тАб 4, І АС-3 тА 5 або І АС-3 тАб 6.
А. Антитіло до І АС, І АО-3 тАБ 1 1. Мишаче антитіло до антитіла людини ГГ АС-3 тАБ 1
Амінокислотна послідовність домену МН ГАОС-3 тАр 1 (ЗЕО ІЮ МО:б) показана нижче (залишки СОКН показані підкресленими).
ОтТОГМОБОРЕ ГКЕКРОЕТУКІ БСКАБСУТЕВ МУСММИУКОА РОКУТКИМСОМ
ІМТУТСЕВТУ АООБЕСКЕАКЕ 5ІСОТ5АБТАУ ГОІчІМІГЕМЕО ТАТУЕСАВЕБВ
Туру У5МОХИи сОосбтТеУТУВо
СОКні из АС-3 ть 1 (5КО І МО:8): нНуСМИ
СОЖКнІ2 из МАО-3 тА 1 (5КО І МО:9): ТІМТУТСЕВТУАПОЕЕС
СОН из МАС-3 тА 1 (5КО 10 МО:10): ЕББПУрУУЗМоУ
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує домен МН з ГАС-3 тАБ 1, являє собою 5ЕО ІЮ
МО: 7 (нуклеотиди, що кодують залишки СОКН, показані підкресленими): сацчаєсссадс гддсдсадсс гддчдассодад сІдаацдаадс сЕдчдадчадас адссаадасєс ссстдсаадд сЕЕстудаса сассессада аасєаєдааа
ЕчаассдоаЧує даадсаддсс ссаддааадчая ЄЕссааауєд дасоддчасеач аєааасассЕ асасєЕддада чЕсаасаєбає асєдаєдасї Есаачачас9
ЧЕЕЕЧССЕСС ЕСЕ дддаа сегстдссад састудсестає сгсдсадатса асарссісаа ааасдаддас асдастасає асссстусдс аададааєсс сЕСЕаєЧЧаїєє асеаєєсває ачасбєасо ду ддссааддаа сстсадссас саЯаЕстсст са
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МІ з ГАС-3 тАБ 1 (ЗЕО ІЮ МО: 11) (залишки СОКІ. показані підкресленими):
БУМУТОТРІТ 15УТІСОРАВ ІБСКеВОБІІ, НБООКТУТМИ ПІОБКРООБРЕ
КІчТУПУ5ЕТО 5СУРОКЕТОВ С5ОТРЕТЬКІ ЕУВАЕБІСУ УУСТОСТНЕР
ХТЕСОСТКТЕ ІК
СОКИ ої БАО-3 тА 1 (5КО І МО:13): кевБОоБІІНВОСКТУТМ
СОКІ2 ої ГАС-3 тль 1 (5КОО І МО:14): ТУЗЕТО5
СОЖКІЗ ої ДАО-3 тА 1 (5КО І МО:15): МПОСТНЕРУТ
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує домен МІ. з | ДО-3 тАБ 1, являє собою 5ЕО ІЮО МО: 12 (нуклеотиди, що кодують залишки СОКГ., показані підкресленими): часчеЕсдсодЧч судасссадас сссасесасе срдссудеста ссаєсудаса ассадссєсс асстстсуса адЕсаадЕса дадссЕСЕта саєачЕЧдчаєд 1 Чдааачасаєа ЕЄЄЧЧВассоод ссудссасада доассаддсса дсстссадад судсстааєст ассеЕсадЕдЕС ЕсаасєЕддчас ЕсєЧдЧчадесс стсдасадєс састддсаЧчеЕ ддадассачуда сачассссас асрдааваєс адсадачс9У аддссдадда ЕЕсдодадеє саєтаєстодсЕ аасааддчЕас асаєєтєсса
ЕасасясЕсуд даддоддадас саадстуддаа асаааа
2. Гуманізація антитіла до І АС-3 | АС-3 тА 1 для утворення "ПІ АС-3 тАб 1»
Вищеописане мишаче антитіло до І Ас-3, І АС-ЗтАб 1, було гуманізуване для демонстрації можливості гуманізації антитіла до ГАС-3 з метою зменшення його антигенності при введенні людині, що приймає такий препарат. Гуманізація давала на виході два гуманізуваних домени
МН, що позначені у даному документі як "МН-1 пі Аа-3 тАБ 1" ї "УН-2 ПІ да-3 тАБ 1", ї чотири гуманізуваних домени МІ, що позначені у даному документі як "МІ -1 НГ АС-З тАБ 1", "МІ -2
ПГАС-3 тАбБ 1", "МІ -3 ПІ да-3 тАб 1" ії "МІ -4 пі да-3 тА 1". Будь-який з гуманізованих доменів
МІ. може формувати пару з гуманізованими доменами МН. Відповідно, будь-яке антитіло, що містить один з гуманізованих доменів Мі, який з'єднаний у парі з гуманізованим доменом УН, загалом називають "пГАС-3 тАБ 1", а конкретні комбінації гуманізованих доменів МН/Л/. називають із зазначенням конкретних доменів МНЛ/І,, наприклад, гуманізоване антитіло, що містить МН-1 ПІ АС-3 тА 1 і МІ -2 ПІ АС-3 тАб 1, зокрема, називають "п АС-3 тАб 1 (1.2)».
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МН з МН-1 п АС-3 тАбБ 1 (5ЕО 1ІЮ
МО:16) (залишки СОКНн показані підкресленими):
ОУОгУОБбАЕ УККРОАБУКУ 5СКАБСІТЕТ МУСММИУВБОА РООСГЕММОИ
ІНТУТСЕВТУ АОПОБЕСКРЕУКЄ ЗМОТБАБТАТ ГОЇ551КАВО ТАМУУСАВЕВ
ТУПУУВМОУи сот УТУве
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує МН-1 ПІ дС-3 тАБ 1, являє собою 5ЕО ІЮ МО:17 (нуклеотиди, що кодують залишки СОКНн, показані підкресленими): саддеЕдсаас сддЕЕсаарс сддсдссЧад дедаваааадс сгддсдесс сдсдааадсу Єссудтааду саєссудуба сасуєссаса ааєєаєсдааеа
ЕчаассдаддЕ осдасадаса ссадуддсадч дчассдддаасд дасддадЧчЕаа аєсааєасЕє аєасадчдсда чсадчеЕасеЕсає асеЕдчасдчаєє ЕСсЯчадчадсад аьсуєсЕстссарєддаса ссадсдстад гассудсттає стоссацдаєта дЕСссесссаа досоддаддчасєс асадссЯссє ассаєсоордс ссосаачаче
ЕЄаєаєдасеЕ асєаєачсає ачаєєасооддоадасааддсасаассоагдас адечадевесс
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МН з МН-2 ПІ АС-3 тАбБ 1 (5ЕО 1ІЮ
МО:18) (залишки СОКНн, показані підкресленими): Й
ОУОГУОББАЕ УККРОСАБУКУ 5СКАБСУТЕТ МУСМНИУКОА РОоОСГЕММСМ
ІНТУТСЕ5ТУ АПОВБЕСКЕУКЄ 5МОТБАСТАУ ГОЇБОБГКАВО ТАМТЕСАБЕВ
ТУВУХеМОУМ сот УТУвО
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує МН-2 ПІ АС-3 тАБ 1, являє собою 5ЕО ІЮ МО:19 (нуклеотиди, що кодують залишки СОКНн, показані підкресленими):
саччсЧчдсаас годЧдссаасс сЯадсоассдчадЧч дрдааааачс стддсдессос счаєдааадтд Есстдсаадд саєстдддаста тасдєсєсаса ааєсаєдава
ЕдчаасоудЧдї дсдасаддса ссаддасадо часточааєдч чаєсдчдвавчЕаа аєсааєасЕєЄ аєасададсдда чадЕасеЕбає асЕдасдаєє Есаададсад асгєсадстс тссагсддаса ссадсдстад тассусєсттає стссадаєта дЕссесссаа доадсодаддас асадесаєст асстстдсдс седсаадачЕ
ЕєЯдбаєдасе асєаєадсає ачаєєасу ддодддасааддрасаассдг дас адеЕдчадеЕсесс
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МІ з МІ-1 ПГАС-3 тА 1 (5ЕО ІО
МО:20) (залишки СОК. показані підкресленими):
ПІУМТОТРІВ Г5УТРООРАв І5СК858Оо5ІІ. НВЗОСКТУТПМИ ПІОКРООБРЕ
КІТ ПУЗВЕТО 5ОУРОКЕБсСЮ С9БОТОЕТОКІ ЗБЕУВБАВЕПУСУ туСтОСТНнНЕР
ХІТЕСОСТКУВ ІК
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує МІ -1 НІ АС-3 тАБ 1, являє собою 5ЕО ІЮ МО:21 (нуклеотиди, що кодують залишки СОК. показані підкресленими): чатгаєсЧдєва гдасЕсадас ассастудса стідадедсда ссссаддеса дсссоустауде асссссута ааєсаєссса дЕсссЕсстЯ4 саєаасчаєа
Чааадасста ЕЄЄЧЧаасоду сосссодсада аассаддесса аадсссадад ачаєсдаєсо ассЕсЯЧЕєєсС адаасеЕсдас ачеЕддадесдс ссцаєссдссс стсадуддЕсс дуесєстадда стцчаєсєттас ссІсаацаєс ссаацчадсоч аддссдачда сассадЧдЕЄ стастассдтЕ аасададсас ссасЕєсссь
Баєасаєс с дсодаддсас аааачеодачЧ агтааа
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МІ з МІ/-2 ПГАС-3 тА 1 (5ЕО ІО
МО:22) (залишки СОК. показані підкресленими):
ПІУМТОТРІВ ГОУТРООРАВ ІчІ50К55ОБІІ НВООКТУГМИ ПІОБРООБРЕ
КІТ ПМЗЕТО 5ОУРОКЕОсСЮ ООБТОЕТІКІ 5БКЕУВАВОУсСУ ХУСИОСТНЕР
ХІТЕСССТКУЄ ІК
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує МІ -2 ПІ ДС-3 тАБ 1, являє собою 5ЕО ІЮ МО:23 (нуклеотиди, що кодують залишки СОК. показані підкресленими):
частаєссуєта сдасісацас ассасідіса стІдадсдеда ссссадавєса
Чдсссодстаде ассссстудсра ааєсаєссса дЕСССЕССвЯ саєачсачаєа
Ччааачасста ЕЄЄЄсСаасоод сеЕсстдсада дассаддсса аадсссадад ачдаєтдаєсо ассЕсЯєЄЕєсС адчаасЕсчас ачЕЧддадесдс ссдчаєсусосєсех сЕтсаддудєсс ддсгсвддча седаєсєсьттас сІсаадаєс ссавададс ду аддссдчадча содссЧддуадеє састасрдсє адасачадЕас ссасеєктссся
Баєасаєству дсоддаддсас аааачсдддЧдач агтсааа
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МІ з МІ/-3 ПГАС-3 тА 1 (5ЕО І
МО:24) (залишки СОК. показані підкресленими):
ПІММТОТРІВ Г5УМТРОоОРАБ ч1І5СК55О5ІІ, НьООКТУСМИ ПОКРООРРЕ
КІГ УЗЕГО 5ОУРОКЕВСеЮ СОеОТрЕТІКІ БЕМЕАВЕрУусУ УУСМТОСТНЕР
ЇТЕОССТІКУВ ІК
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує МІ -3 ПІ ДС-3 тАБ 1, являє собою 5ЕО ІЮ МО:25 (нуклеотиди, що кодують залишки СОК. показані підкресленими): частаєссуєта сдастсадасєс ассастідсса стЕдчадедсда ссессадцЧіса дсссоастадс ассссстдста ааєсаєссса чЕСССЕССвЯ саєачсааєа
Ччааачасста ЄЕЄЄЯЧаасіуу сЕсссдсада аассаддсса ассассачад ачдаєєдаєсі ассЕСсСЯЕвєєсС адаасЕСЧас аачєЕддадчедс ссуаєссаЯстс сЕсаддуєсс ддсєстодддча сеЕцаєствсас сстІсаадаєс ссаачаЧдс ду аддссдчаддда счдссудаЧЕс састассус є аасададеЕас ссасЕєсссеЕ
БГаєасаєссвуу дсоддадасас аааадсддад аггава
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МІ з МІ/-4 пПГдО-3 тА 1 (5ЕО І
МО:26) (залишки СОК. показані підкресленими):
ПІУММТОТРІВ ГБУТРООРАВ чІ5СКв55О5ПІ, НЗОАКТУСМИ ПООКРООРРЕ
КПІХІМЗЕТО 5ОУРОБЕБсСЮ с9ОТрЕТІКІ 5БЕУМЕАВЕПУСУ ХУСМИООТНЕР
ЇТЕСОСТКМУВ ІК
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує МІ -4 ПІ АСі-3 тАр 1, являє собою 5ЕО ІЮ МО:27 (нуклеотиди, що кодують залишки СОК., показані підкресленими): частаєссуєта сдасісадас ассастдіса стІдадсдеда ссесссадчаєса дессастаде арсссссудса ааєсаєссса дЕСССсСЕСсСсвЯд саєачсдчаєа сааадасста ЕЄЄдаасоуу сЕсстдсада аассаддсеса ассассадад ачдаєєдаєсо ассЕсЯдЕвєЕсС ачаасєсдчас ачеЕдчадсус ссдчассустс сЕтсадддЕсс ддсєстоодда сеЕдчдарстсстас ссесаадаєс ссаачадес 9 аддссдадда суєсоддадеЕс гастассуєє аасададдбас ссасеЕєссся
Баєасаєссу дсуддаддсас аааадсдддачЧ астааа
СОВИ з домену МІ, МІ -4 ПІ да-3 тАБб 1, містить амінокислотну заміну гліцину на аланін і має амінокислотну послідовність: КЗБЗОБІІЇНЗБАКТМІ М (5ЕО ІЮ МО:28), замінений аланін показаний підкресленим). Передбачається, що аналогічна заміна може бути включена у будь- який з описаних вище доменів СОКІ1 І ДС-3 тАБ 1.
В. Антитіло до І АС, ГГ АО-3 тАбБ 2
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МН з ГАС-3 тАБ 2 (5ЕО ІЮ МО:29) (залишки СОРВНн показані підкресленими):
ЕУОгОоОБОРЕ ГУКРОАБУКІ 5СКТІБЗСТІТЕТ ВУМІНИСКОЄ НСЕБТВБИІСУ
ІчІХхРУБСрІСУ МОКЕКМКАТІ ТУПМОООТАУ МОГЕБІТЗЕО 5АМУЕТСАВИН
ЕМУЕСОРШИВАХУ йСОСТРУТУВА
СОКнІ з МАС-3 тд 2 (ЕОМ МО:31): РУІМІН
СІЖжн2 УН з МА О-3 тА 2 (6КЕО1ЮМО:37): УХТУРУБСРІСУНОКЕКН
СОКкеЗ УН з ГАС-3 тА 2 (5КО І МО:33): ИНЕМУуЕСРИВАУ
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує домен МН з ГАО-3 тАБбБ 2, являє собою 5ЕО ІЮ МО:30 (нуклеотиди, що кодують залишки СОКНн, показані підкресленими): чаччссадс гЕІсадсадсс аддчасстдадЧч сІдЧагдаваас стддадесІс адсдаадасс ссстддсаада сессстддаса сасаєстасо дасєасааса
Басассічдсг даддсададс сагуддадацча ЧчдесеЕгдадчтіу чаєгддаєає аєєтаєссЕє асадсддЕда баєтддаєас аассадааді Есаадааса9д чддссасаєтчд асЕдсадаса арсссіссад сасадсестас агдчатстесс чсадсстдас асстддаадас сстдсадсся єстассдрдс аадаєададсас ачачаасвасеЕ ЕЄЧЯЧссссвЯ аЧЕЄсаЯЧСсСЕвас содддссаад давасуссаде састдестьст дса
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МІ з ГАС-3 тАБб 2 (5ЕО ІЮ МО:34) (залишки СОК. показані підкресленими):
РІМІТОБРАВ ГАМБІСОКАТ І5СКАВОВМО ХОСЕБЗУММИУ ООКРООРРКІ,
ТТУУУЗМПЕВ СІРАКЕО5СОО ООТГТОЕТІМІН РУБЕВЕБААТІ УСО0О5ЗЕВРІ,
ТЕСАСТКІВІ, К
СОКИ з МА СО-3 тА 2 (5КО І МО:36): КАБОКЛУОСЕБУМИ
СОКІ2 з МАС-3 тА Ь 2(5КО І МО:37): У"5МІЕ5
СОКІЗ з МАСО-3 тА Ь 2 (5КО І МО:38): ОО55ЕОРІТ
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує домен Мі. з Г АС-3 тАБ 2, являє собою 5ЕО ІЮ МО: (нуклеотиди, що кодують залишки СОК., показані підкресленими):
часаєсуєдс гєдасссавааєс сссадсеверсс ссудстдедде сестаддаса чадддссасс ассссстдса ачадассадсса аачєЕЧчЕєЧчає єаєчаєссьа ааадЕваєає ааассудудсас саасадааас саддасадсс асссааастс сЕсаєстаєс я ЄЄабаєссаа ЕСсСєадчааєсяї ддодаєсссса ссадчессад гддсадЧчеЕддд ЕсЕдддасад астссассст саасаєссає сстудсодад адчадчаєдс содсаасстає тасеЕдЕСсадс ааачєЕачЕцча адаєссаЯасьс асдЕссдаддвд стдддассаа дсгдчадстд ааа
С. Антитіло до І АС, І АО-3 тАБб З
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МН з ГАС-3 тАБ З (5ЕО ІЮ МО:39) (залишки СОКНн показані підкресленими):
ЕМКГООБОРЕ ГУМКРОАБУКІ БСКАБСУТЕТ БВУМІНИУВОВ НСОБІЕМІСУХ
ІТРУМНСОТСУ МОКЕКТКАТІ ТУОМООМТАУ МЕБВБГАБЕр БАМХУСТВИВ
ЕМУЕСРИВАХ йСОСТУТУБА
СОКнІ з МАО-3 тА З (ЗЕОІОМО 41): РуІМІН
СОКна2 з МАО-3 тА З (КО І МО:42): УХтУРУНСОТОУМОКЕКТ
СТОКкнЗ з МАО-3 тА З (5КО І МО:43): МПОЕМУуЕСРИШВАУ
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує домен МН з ГАС-3 тАб 3, являє собою 5ЕО ІЮ
МО: 40 (нуклеотиди, що кодують залишки СОКНн, показані підкресленими): чаддеЕссдаддс Есадсаціс аддасстІдадЧч сгрчуєдааас стдддадЧдссІс адедаачаста єсстусаадд сЕсстддаса сасасссаст чдасєасааса
ЕЕсассдудудєЄ даддсададс сасодасада дссеЕсдачед ччаєсдоаває аєєсаєссьє аєзаєдуєда ЄасЕдадстас аассачаадї Есаадассза чассасаєтчд астдсацдаса ассссІссаа сасадсстас агддаастес чсадсстддс аєстудаадас сстосадеЕсс астастсдтас аадаєадаас аччаастасеЕ Ебсаадсссста аЧаЕєсасЕсас сододссаадд ддастстдохє сасЕдвесЕсяе дса
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МІ з ГАС-3 тАБ З (5ЕО ІЮ МО:44) (залишки СОК. показані підкресленими):
ПІУГДТОБРЕТО ГАМІ ООКАТ ІБСКАВвОВУО Обом ООКРООРЕКІ,
ГТІХААВБМІЕВ СІРАКЕССсСЬЮСсС ОО ГОЕТІМІН РУВБЕВЕБААТУ тСООББЕОРІ,
ТЕСАСТІКІЕЇ, К
СІЖИ з МАС-3 птАЬ З (5КО І МО 46): КАБОВБУУОСОБУММ
СОКІ2 з МАО-3 тА З (5КО І МО :47): ААЗМЖІК5
СОКІЗ з ЛАО-3 тА З (5КО І МО :48): ОО5БЕОРІТ
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує домен МІ з ГАС-3 тАб 3, являє собою 5ЕО ІЮ
МО:45 (нуклеотиди, що кодують залишки СОКНн, показані підкресленими): часаєсуєрдс сцдасссваєс рссаастсст сгсчадстасує сестадацса чаддадссасс асстсстдса ачассадсса аачєЧЕЄєдає Еаєчаєчачєва аєадЕсбаєає адаастдусрасє саасадааас саддасадсес асссаавасес сеЕсаєстаєтд сеЕдсаєссаа Есгадааєст оддаєссссад ссаддатетад гадсаЧчсдадчЧ ст ддддасач астссасест саасаєссає сстагддвачд9 адчаччаєодс бдсаассстає сассуссадс ааадчєЕачеЕда ддаєссаЯасьс асачсссддсд стодудассва дсгддадссд ааа
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МН з ГАС-3 тАБ 4 (5ЕО ІЮ МО:49) (залишки СОКНн показані підкресленими):
ЕУОгНОвБОРЕ ГПУМКРОАБУКІ 5БСЕКЕТОСУТЕТ ВУМІННШУКОЄЮ НОКОГЕМІСХ
ІХТРУМСрАСуУ МОМЕКТКАТІ ТУрМОООТАХ МЕГВБІТВЕр БАМУТСАВИМ
МНУВОРШИВАУ ОО ТУВА
СОКнІ з ГАО-3 тА А (6КОІОМО:51): рІМІН
СОКн2 з МАСО-3 тА 4 (6ЕО1ОМО:52): ХТУРУІНСВАСУМОМЕКТ
СТІЖНнІі з МАСО-3 тА А (КО ІЮ МО :53): МиМНММУЕСРМВАХ
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує домен МН з ГАС-4 тАБ 4, являє собою 5ЕО ІЮ
МО:50 (нуклеотиди, що кодують залишки СОКНн, показані підкресленими): чадчаЕссадс тЕсассадіс аддасстІдачЧч стаддеЕЧдааас стддддЧесс адсуаачавта сссгдсаада сеЕсстуудаба сасссссасо дасгасааса
БасасєууЧ дчаачсададс сасддааача честсЧчачЧчтідд чассдддчаєає т агєвваєсеськя асааєдачєда ЕасЕддсЕас аассадаасе Есаадассаза чассасаєтч астдсацдаса ассссіссач сасадсесстас ахсддадсьсс чдсадсстЕдас аєстдаддасєс ЕСсСЕЧдсачссе астаствде дес аачаєаддаас аєчаасеасе Еєсаассессва ЧЕЕЄасЕєас гГдддассаад ддастстг да састдеЕстст 9ед
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МІ з ГАС-3 тА 4 (5ЕО ІЮ МО:54) (залишки СОК. показані підкресленими):
ПІМГПТОБРАБ ГБАУБІСОВБАТ чІ5СКАВОВУМО ХОБСУТУІМИХ ООКРООРРКІ,
ГІЕААВМІОЕВ СІРАБЕОСОоО ОСТОЕТІМІН РУБЕЕБААТУ УСООБ5МЕОБРІ,
ТЕСАСТКГВЇ, К
СОКИ з ГАС-3 тль 4 (5КО ІЮ МО:56): КАБОБУМОХОСУТУІМ
СОКІ2 з МГАС-3 тА 4(5КО І МО:7570) АА5МІЕ5
СОКІЗ з ГАС-3 тль 4 (5КО І МО:58): ОО5МЕПРІТ
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує домен МІ з ГАС-3 тА 4, являє собою 5ЕО ІЮ
МО:55 (нуклеотиди, що кодують залишки СОК.|, показані підкресленими): часаєЕдеЕдс Едасссвааєс сссадессеєс ЕсоЧдесвдДЕдЕ сЕСТтаддоса чадддссасс асстсссдса ачдассадсса ааачстєаЕєєдчає Єаєчсаєаава
ЕбасЕсєаєає саасіуурас саасачааас сацддасадес асссааасіс суЕсаєрсєстд сеЕдсаєссаа Есгадааєст оддаєссссад ссаддатетад гадсаЧчсдадчЧ ст ддддасач астссасест саасаєссає сстагддвачд9 адчаччаєодс бдсаассстає сассуссадс ааадєЕааєда ддаєссЯасьс асчЕссддсд стоодудассва дсгддадеву ааа
Е. Антитіло до І АС, ГГ АО-3 тАБ 5
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МН з ГАС-3 тА 5 (5ЕО ІЮ МО:59) (залишки СОКНн показані підкресленими):
ЕУОГгООБбРЕ ГУКРОСАБУКІ БСКАБСУТЕТ ВУМІНИУКОб РОКОТЕМІСУ
ІХРУБСОЕСУ МОКЕКВКАТІ ТУПМ5ВОТАУ МОГЕ5ІТ5Ер 5АУВЕТСАРИН
ВЕМІВгОРИЕВАХ йСОСТОУТУВА
СОКнІ з ГА О-3 тА 5 (6КЕОЮМО:61): РІМІН
СОЖКн2 з МА О-3 тА Ь 5 (ЗЕООЮМО:62): ХТУРУБОСОЕСУМОКЕКЬ
СОКк из з МАСО-3 тА 5(5КО І МО:653 ): ИНЕМУЕСРИВАУ
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує домен МН з ГАС-3 тАБ 5, являє собою 5ЕО ІЮ
МО:60 (нуклеотиди, що кодують залишки СОКНн, показані підкресленими): чаддсссадс сЕСсСадсацдес аддчасстдадд стад даавасєс сЕддадессьс адсдаачаєє ссстдсааад сссссддаса сасаєссасо дассасааса
Басасі дудді даадсададс сстддаааца десЕсдааєд част ддаєає аєєбєаєссЕє асачеЕсдЕєда ЄЄЕЄсадаєас аассадаадцчі Есаададсаза чдассасаєту асудгадаса аргсстссад сасадсстасєс ахтддаєсстсс чсадсстєдас аєстсдаддас ЕєстудсадеЕст Ессастудсдс аадаєдасас аччаастасеЕ ЕЄсасссстдЯ аЕЕєсасЕсас сододдссаад дчддастссаде састадсстст цдса
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МІ з ГАС-3 тАБ 5 (5ЕО ІЮ МО:64)
Зо
(залишки СОК. показані підкресленими): рРІУД,ТО5РАБ ГАМБІСОБАТ чІ5СКАБОВУО УОСЕБУМНИУ ООКРООРРЕ,
ІУУУЗМЕВ СІРАКЕОСОС БОТОЕТІМІН РУБЕББААТУ УСООББЕДРІ.
ТЕСАСТКІЕЇ К
СОЖИ з МА С-3 тАЬ 5 (5ЕО І МО:66): КАБОБМОУОСЕБУММ
СОКІ2 з МА С-3 ть 5 (5КО І МО:67): УЧЬМНІЕ5
СОКІЗ з МА С-3 тА 5 (ЕКО І МО:68): ОО55ЕПРІ,Т
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує домен МІ з ГАС-3 тАб 5, являє собою 5ЕО ІЮ
МО:65 (нуклеотиди, що кодують залишки СОК.|, показані підкресленими): часаєсдтдс гдасссааєс тссадустст ссддстудєуєЄ сЕСТтаддоадса чадддссасс асстсстдса ачадссадсса ааачєЕчЕєЧчає єаєчаєчЧчЕа ааадеЕваєає саасоддстас саасадааас саддасадсс асссаавастс сЕсаєсстатч ЕЄаЕсЕЄсСсаа ЕСЕадааєст додаєсссад ссаддеєтад гадсаЧчеддЧч ЕСЕ удддасад астісассст саасатссає сстдгддвад адчадчаєдс гдсаасстає тасудусадс ааачсадчєдча адаєссЯясьс асясссоддвд стдддассаа дстодадстад ааа ? 1. Мишаче антитіло до антитіла людини Г АС-3 тАбБ 6
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МН з ГАС-3 тА 6 (5ЕО ІЮ МО:69) (залишки СОКНн показані підкресленими):
ЕМІГООБОРЕ ГУКРОАБУКІ РСКАБСУТЕТ ВУММОМУКОВ НОСЕБТЕМІСОВ
ІНМРОМСУТІТУ МОКЕЕСКАТІ ТУКОоБОТАТ МЕБЕБІТОЕО ТАМУУСАБЕА
ПІВ вруйсОо СТУ
СОКнІ з ПАС-3 тА 6(5КО І МО:71): руУнМО
СОЖКн2 з МАО-3 тА (КО І МО :72): РІНРОМСОСУТІУНОКЕЕС
СТКкнЗ з ГАС-3 тА 6 (5КО І МО:72): ЕАПОТУЕТХЕрВУ
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує домен МН з ГАС-3 тАБ 6, являє собою 5ЕО ІЮ
МО:70 (нуклеотиди, що кодують залишки СОКНн, показані підкресленими): чадЧчєсстдс годсаасадістоавдасстдад стаді даадс стадддаетс адсудаачавта сссгдсааду сЕсстудаєба сасаєссасо аасєасааса
Ечдчассод9дЧє даадсададс сасддачада дссссдадсо дассодачдає аєєааєссвЯ асааєдадєдЕ бастаєстас аассадааці ЄєЄдададсаа чадссасастч ассурадаса адсссссад тасадсстас арддадстсс чсадсстдас асссдадчас ассдсадссо ассассдсдс аадачачаса даєстасЕєстї асЕєЄєдаста стодддсесааддсассастестсасадсссс сеЕса
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МІ з ГАС-3 тА 6 (5ЕО ІЮ МО:74) (залишки СОК. показані підкресленими):
РІУММТОБНЕКЕ М5ТО5УСОВУЄ ІТСКАВОВМВ ЗММАМУСООКР СОБРКОТТІЕВ
АВБХТКУТОУРІО КЕТО5СО5ОТО ЕТЕТІВБВБУСА АПГАУУТСОО НУБТРИТКСО
СТКГЕТЇК
СОКИ з МА О-3 тд 6 (КО МО:76): КАБОРУВВУЧА
СОКІ2 з МА О-3 тлЬ 6(5КО І МО:77): 5бАБУВУТ
СОКІЗ з МА СО-3 тд 6(5КО І МО:78): ООНуІБТРИТ
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує домен Мі з ГАС-3 тАБ 6, являє собю 5ЕО ІЮ
МО:75 (нуклеотиди, що кодують СОК, показані підкресленими): часаєтчєда гдасссадіс г сасадаєтс агцдссасає сацдссодддацда садддссадс ассасссдса ачассадеЕса ачаєчеЕЧчадчі ЕСЕЧЕЄєЯсаЧ ссгуддбаєса асадааасса дчасаасстєс стазаєсасе дасссса
Ччсаєсстасс адЕасасеЕдуд адессстддає содсессастд дсадсддаєс гддЧдчасаччає ссастссса ссаєсадчсач гоагсоцсадцасо дчсадасст Чо садессаєта ссдссадсаа саєстаєаЯва сеЕссаєсадас асссудсдада часассаадс гдддаавааєсава а 2. Гуманізація антитіла до І АС-3 | АС-3 тА 6 для утворення "пі АС-3 тА 6"
Вищеописане мишаче антитіло до ГАс-3, | Дс-ЗтАб 6, було гуманізоване для демонстрації можливості гуманізації антитіла до ГАС-3 з метою зменшення його антигенності при введенні людині, що приймає такий препарат. Гуманізація дала на виході два гуманізованих домени УН, що позначені у даному документі як "МН-1 НГ АС-3 тАр 6" і "МН-2 ПІ АС-3 тАБ 6", і два гуманізованих домени МІ, що позначені у даному документі як "МІ -1 ПІ АС-3 тА 6" і "МІ -2 пПГАС-3 тА 6". Будь-який з гуманізованих доменів МІ може формувати пару з будь-яким з гуманізованих доменів МН. Відповідно, будь-яке антитіло, що містить один з гуманізованих доменів Мі, який з'єднаний у парі з гуманізованим доменом УН, загалом називають "п АС-3 тАБ 6", а конкретні комбінації гуманізованих доменів МН/// називають із зазначенням конкретних доменів УНЛ/., наприклад, гуманізоване антитіло, що містить МН-1 пі дО-3 тАБб 6 і
МІ-2 п Аа-3 тА 6, зокрема, називають "пі АС-3 тА 6 (1.2)».
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МН з МН-1 п АС-3 тАбБ 6 (5ЕО 1ІЮ
МО:79) (залишки СОКНн показані підкресленими):
ОУОгМОоББАЕ УККРОАБУКУ 5СКАБСУТЕТ ВУММОМУКОА РОСОСТЕИМОВ
ІМРОМСУТІУ МОКЕЕСКУТМ ТТОТОТОТАтУ МЕГКО5ІВЗОО ТАМУТСАРЕА
ТЕТ вВПУйсОо СТУ
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує МН-1 ПІ дС-3 тА 6, являє собою 5ЕО ІЮ МО:80 (нуклеотиди, що кодують залишки СОКНн, показані підкресленими):
садчдіссадс гддрдсадес гддадсадссдаа додаадчааас стддсцасаад сасчдааЧчЧчвЯЧ сссвдсаауу ссадсддста сасстрсасес дасЕасааса)
ЕадассудудЕ ссдасаддсес ссаддасадуд дсссдддааєд дасодусдас аєсаассссяЯя асаасаччдсЯяєЄ садассаєсстас аассадааає єсдчачачЧчсад адсчдассасуд ассассдаса ссадсассад сассЧчсстас агсддоааст дес
ЧассссгЧудсу дадусдасдасєс ассуссуєує астасеусус садададасс чЧасвасЕєсЕ асЕєсдаста стідооддссад ддсассассс гдассуєаюс сьсс
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МН з МН-2 ПІ АС-3 тАбБ 6 (5ЕО 1ІЮ
МО:81) (залишки СОКНн показані підкресленими):
ЕМОГМЕВСОС ГУКРОСВІВІ 5СААБСЕТЕ5 ВУММОМУБОА РОКОПЕМУ5О
ІМРОМНСУТІУ МОКЕЕСКЕТІ 5БОМАКМОГуУ ГОММОГКАВЕО ТАМУТСАВЕА
ПУЕ ВПТисОо СТУ
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує МН-2 ПІ дС-3 тА 6, являє собою 5ЕО ІЮ МО:82 (нуклеотиди, що кодують залишки СОКНн, показані підкресленими): чаччдЕссадс гаЧдсоадааєс гаддсоадсоада сіддесаачс сгддсЧчдасау ссЕдадасєу адсЕдсдсво ссадсддеєЕ сассеЕксадс дасєасааса бачасрдудЕ ссдасаддсес сстгдудсаачу дсстдддааєу ддєдєссдас аєсаассссу асаасочдсЯЕ дассаєсвас аассадчаачЕ ЕсчадчааЧчссу чЧЕЕсассарс адссоадддаса асодссвадчаа садсстдвас стосачаєча асадсссдсу доссувддас ассоуссддєудеє астасводсуєс сасададдсс частасЕєсє асєєссчасва соодддссау ддсассассс гдассдсдєс стесс
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МІ з МІ/-1 пПГдО-3 тА 6 (5ЕО ІО
МО:83) (залишки СОК. показані підкресленими):
РІОМТОБРОВ ГБАБУСОКУТ ІТСВАБОВУ5 ЗУММАЙМУООКР СКАРКІГІ ТВ
АВІКУТОУРЬ КЕБСеСеСТО ЕТОТІВЄГОР ЕрЕАТУТУСОО НУБТРИТЕСС
СТЕГЕТК
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує МІ-1 ПІ дДО-3 тАБ 6, являє собою 5ЕО ІЮ МО:84 (нуклеотиди, що кодують залишки СОК., показані підкресленими): часаєссацда гдасссацад ссесссадсадс сеЕдацдсоасса дсоагсдоадсцдЧа сададсдасс ассасстудіс ачассадсса ччаєчеЕдчЕСсСс аасаєааЕач сстддстаєса дсадаадссс дудсааддсессс ссаадстдсо даєстасаас
Ччссадсвбасс аддЕасасадучу сосдсссадс ачасєсадсуд дсадсддсеес сддасассдчдасєс гссассстда ссассацсад сстдсадссс дадцЧчасЕ сс ссасстаста сідссадсадч састасадса сссссгддас стссоодсада часассаадс годаааєссва чЧ
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МІ з МІ/-2 пПГда-3 тА 6 (5ЕО ІО
МО:85) (залишки СОК. показані підкресленими):
рІММТОБРОО Г5БАБУБОВКУТ ІТСКАВЗОВУВ 5ММАЙМТУООКР СКАРКІТІ 5
АВБХВУТОУРО БЕ5БО5БООТО ЕТЕТІВБІОР ЕРІАУХУСОО НУБТРИТЕОО
СТКГЕЇК
Ілюстративний полінуклеотид, який кодує МІ -2 ПІ дДО-3 тАБ 6, являє собою 5ЕО ІЮ МО:86 (нуклеотиди, що кодують залишки СОК., показані підкресленими): часассурєдЧда гєцдасссадач ссессадсацс стдацсачсса дедгдддсцча сачачесдасс аксасссдсс ачассадсса ачдчаєдЕдЕСсСс аасаєаЧчЕач сстддтаєса дсадаадссс дасааддссс ссаадстдсо дасстасачдс
Ччссадчстасс адсасасадуд сдсдсссддає адчаєсссадсоа дсадсоддессс саддсассдас гІсассгсса ссахссадсад сстоадсацдссс дадцдасаїсд ссдессасста ссдссадсад састасадса сссссеЕддас соттсоодсада чдасассаадс гддаавааєсаа Ч
СОВІ1 з домену МІ, МІ-1 і М/-2 НІГ АС-3 тА 2, містить амінокислотну заміну лізину на аргінін і має амінокислотну послідовність: НАБОЮУ5Б5ЗМУМА (5ЕО ІО МО:87), замінений аргінін показаний підкресленим). Передбачається, що аналогічна заміна може бути включена у будь- яку з областей І АС-3 тАб 6 СОВ/И1, що описані вище.
Передбачені незначні зміни в амінокислотній послідовності доменів МН і/або Мі, що представлені у даному документі. Наприклад, С-кінцевий амінокислотний залишок будь-якого з доменів МН і/або Мі, що описані у даному документі, може бути замінений для полегшення субклонування.
М. Антитіла до ГАС-3, І АС-3 тАбБ 1, Г АС-3 тА 2, І АС-3 тА З, І АС-3 тА 4, І ДО-3 тА 5 і/або ГАО-3 тАБ 6, та їх похідні, що мають сконструйовану Ес-ділянку
У традиційній імунній функції взаємодія комплексів антитіло-антиген з клітинами імунної системи призводить у результаті до широкого спектра відповідей, починаючи від ефекторних функцій, таких як антитілозалежна цитотоксичність, дегрануляція тучних клітин і фагоцитоз, до імуномодулюючих сигналів, таких як регуляція проліферації лімфоцитів і секреції антитіл. Всі ці взаємодії ініціюються при зв'язуванні Ес-ділянки антитіл або імунних комплексів зі спеціалізованими рецепторами клітинної поверхні на гематопоетичних клітинах. Різноманітність клітинних відповідей, що запускаються антитілами та імунними комплексами, обумовлена структурною гетерогенністю трьох рецепторів Ес: ЕСсуУКІ (СОб64), ЕсуКІ! (СО32) і ЕсуУфП (СО16).
ЕсукІ (СО64), ЕсукПА (СО32А) і сук (СО16) є активуючими (тобто такими, що посилюють імунну систему) рецепторами; ЕСуКІІВ (СОЗ2В) є інгібуючим (тобто таким, що послаблює імунну систему) рецептором. Крім того, взаємодія з неонатальним рецептором с (РоКп) опосередковує рециркуляцію молекул дос з ендосоми на клітинну поверхню та вивільнення у кров. Вище представлена амінокислотна послідовність ілюстративного ЇДС1 (5ЕО ІЮ МО:1),
Іц2 (ЗЕО ІЮ МО:2), І93 (5ЕО ІЮО МО: 3) і 9054 (5ЕО ІЮ МО 4).
Модифікація Ес-ділянки зазвичай призводить до зміни фенотипу, наприклад, зміни періоду напівжиття у сироватці, зміни стабільності, зміни сприйнятливості до клітинних ферментів або зміни ефекторної функції. Може бути необхідна модифікація антитіла або іншої зв'язуючої молекули за даним винаходом у відношенні ефекторної функції, наприклад, з тим щоб підвищити ефективність такої молекули при лікуванні злоякісної пухлини. У деяких випадках необхідне зменшення або виключення ефекторної функції, наприклад, у випадку антитіл, механізм дії яких передбачає блокування або антагонізм, але не знищення клітин, що несуть цільовий антиген. Підвищена ефекторна функція, зазвичай, необхідна у відношенні небажаних клітин, таких як пухлинні та чужорідні клітини, де ЕсукК експресуються на низьких рівнях, наприклад, пухлинноспецифічні В-клітини з низькими рівнями ЕсукКіІІВ (наприклад, при неходжкінській лімфомі, СІ. ії лімфомі Беркітта). Відповідно до зазначених варіантів здійснення, молекули за даним винаходом, яким надали або змінили ефекторну функціональну активність, корисні для лікування та/або запобігання захворюванню, порушення або інфекції, при яких необхідна підвищена ефективність ефекторної функціональної активності.
Відповідно до деяких варіантів здійснення, зв'язуючі | АС-3 молекули за даним винаходом містять ЕРо-ділянку, яка має одну або декілька модифікацій (наприклад, заміни, делеції або вставки) відносно послідовності амінокислот Ес-ділянки дикого типу (наприклад, 5ЕО ІЮО МО: 1), які зменшують афінність і авідність Ес-ділянки та, відповідно, молекули за даним винаходом до одного або декількох рецепторів Есук. Відповідно до інших варіантів здійснення, молекули за даним винаходом містять Ес-ділянку, яка має одну або декілька модифікацій відносно амінокислот Ес-ділянки дикого типу, які збільшують афінність і авідність Ес-ділянки та, відповідно, молекули за даним винаходом до одного або декількох рецепторів ЕсукК. Відповідно до інших варіантів здійснення, молекули містять варіантну Ес-ділянку, причому зазначений варіант надає або опосередковує підвищену активність, а саме антитілозалежну клітинноопосредковуванну цитотоксичність (АЮСС), і/або підвищене зв'язування з ЕсукПА відносно молекули, що не містить Ес-ділянку або містить Ес-ділянку дикого типу. Відповідно до альтернативних варіантів здійснення, молекули містять варіантну Ес-ділянку, причому зазначений варіант надає або опосередковує знижену АЮОСсС-активність (або іншу ефекторну функцію) та/або підвищене зв'язування з ЕСуКІІВ відносно молекули, що не містить Ес-ділянку або містить Ес-ділянку дикого типу. Відповідно до деяких варіантів здійснення, даний винахід відноситься до зв'язуючих | АС-3 молекул, що містить варіантну Ес-ділянку, причому у такій варіантній Ес-ділянці не спостерігають зв'язування, що піддається детекції, з будь-яким Есувк відносно молекули, яка порівнюється, що містить Ес-ділянку дикого типу. Відповідно до інших варіантів здійснення, даний винахід відноситься до зв'язуючих ГАС-3 молекул, що містять варіантну Рсо-ділянку, причому таку варіантну Ес-ділянку зв'язує лише один Есук, переважно один з ЕсСуКІА, ЕсукИВ або ЕсукША. Будь-яку таку підвищену афінність і/або авідність переважно оцінюють шляхом вимірювання іп міго ступеня зв'язування з ЕсуК, що піддається детекції, або Есунк-зв'язаної активності у клітинах, які експресують низькі рівні ЕсукК, якщо активність зв'язування вихідної молекули (без модифікованої Ес-ділянки) не можна детектувати у клітинах, або у клітинах, які експресують цільові антигени рецептора, що відмінний від ЕсуК, з щільністю від 30000 до 20000 молекул/клітина, з щільністю від 20000 до 10000 молекул/клітина, з щільністю від 10000 до 5000 молекул/клітина, з щільністю від 5000 до 1000 молекул/клітина, з щільністю від 1000 до 200 молекул/клітина або з щільністю 200 молекул/клітина або менше (але щонайменше 10, 50, 100 або 150 молекул/клітина).
Зв'язуючі ГГ АО-3 молекули за даним винаходом можуть містити варіантну Ес-ділянку, що має змінені афінності у відношенні активуючого та/або інгібуючого рецептора Есу. Відповідно до одного варіанта здійснення, зв'язуюча ГАС-3 молекула містить варіантну Ес-ділянку, яка має підвищену афінність у відношенні ЕсукКіІІВ і знижену афінність у відношенні ЕСуКША і/або
ЕСУКПА відносно молекули, що порівнюється, з Ес-ділянкою дикого типу. Відповідно до іншого варіанта здійснення, зв'язуюча ГАС-3 молекула за даним винаходом містить варіантну Ес- ділянку, яка має знижену афінність у відношенні ЕСУКІІВ і підвищену афінність у відношенні
ЕсуКІША і/або ЕсукПА відносно молекули, що порівнюється, з Ес-ділянкою дикого типу.
Відповідно до ще одного варіанта здійснення, зв'язуючі ГАС-3 молекули за даним винаходом містять варіантну Ес-ділянку, яка має знижену афінність у відношенні ЕСУуКІІВ і знижену афінність у відношенні ЕсукПША і/або ЕсукПА відносно молекули, що порівнюється, з Ес- ділянкою дикого типу. Відповідно до ще одного варіанта здійснення, зв'язуючі | АС-3 молекули за даним винаходом містять варіантну Ес-ділянку, яка має незмінювану афінність у відношенні
ЕсукІІВ і знижену (або підвищену) афінність у відношенні ЕсукША і/або ЕсукІПА відносно молекули, що порівнюється, з Ес-ділянкою дикого типу.
Відповідно до деяких варіантів здійснення, зв'язуючі | АС-3 молекули за даним винаходом містять варіантну Ес-ділянку, що має змінену афінність у відношенні ЕСуУКІША і/або ЕсугПА з тим, щоб імуноглобулін мав посилену ефекторну функцію. До обмежуючих прикладів ефекторних клітинних функцій відносяться антитілозалежна клітинноопосредковувана цитотоксичність, антитілозалежний фагоцитоз, фагоцитоз, опсонизація, опсонофагоцитоз, клітинне зв'язування, розеткоутворення, зв'язування 3 С1д ії комплементзалежна клітинноопосредковувана цитотоксичність.
Відповідно до переважного варіанта здійснення, зміна афінності або ефекторної функції є щонайменше 2-кратною, переважно щонайменше 4-кратною, щонайменше 5-кратною, щонайменше б-кратною, щонайменше 7-кратною, щонайменше 8-кратною, щонайменше 9- краою, щонайменше 10-кратною, щонайменше 50-кратною або щонайменше 100-кратною відносно молекули, яка порівнюється, що містить Ес-ділянку дикого типу. Відповідно до інших варіантів здійснення даного винаходу, варіантна Ес-ділянка імуноспецифічно зв'язує один або декілька БСК з афінністю, яка щонайменше на 6595, переважно щонайменше на 70 95, щонайменше на 7595, щонайменше на 80 956, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 965, 10) щонайменше на 95 95, щонайменше на 100 95, щонайменше на 125 95, щонайменше на 150 95,
щонайменше на 175 95, щонайменше на 200 95, щонайменше на 225 95 або щонайменше на 250 95 більше, ніж у молекули, що містить Ес-ділянку дикого типу. Такі вимірювання можна здійснювати за допомогою іп мімо або іп міго аналізу, та відповідно до переважного варіанта здійснення, іп міго аналізами, такими як аналізи ІФА або на основі поверхневого плазмонного резонансу.
Відповідно до різних варіантів здійснення, зв'язуючі | АС-3 молекули за даним винаходом містять варіантну Ес-ділянку, причому зазначений варіант надає антагоністичну дію щонайменше на одну активність рецептора ЕсукК або антагоністичну дію щонайменше на одну активність рецептора ЕсуК. Відповідно до переважного варіанта здійснення, молекули містять варіант, який надає антагоністичну дію на одну або декілька активностей ЕсукКІІВ, наприклад, передачу, що опосередкована В-клітинним рецептором, сигнала, активацію В-клітин, проліферацію В-клітин, вироблення антитіл, приплив внутрішньоклітинного кальцію у В-клітин, прогресування клітинного циклу, ЕСсуКІІВ-опосередковане інгібування передачі сигнала ЕсеКІ, фосфорилювання ЕсуКІІВ, ЗНІР-рекрутінг, ЗНІР-фосфорилювання і асоціацію з ЗПС, або активність однієї або декількох наступних молекул (наприклад, МАР-кінази, УМК, р38 або АК) у шляху сигнальної трансдукції за участю ЕсуКІІВ. Відповідно до іншого варіанта здійснення, зв'язуючі ГАС-3 молекули за даним винаходом містять варіант, який надає агоністичну дію на одну або декілька активностей Есе, наприклад, активацію тучних клітин, мобілізацію кальцію, дегрануляцію, вироблення цитокінів або вивільнення серотоніну.
Відповідно до деяких варіантів здійснення, молекули містять Ес-ділянку, що містить ділянки від двох або більше ізотипів (дб (наприклад, ІДдс1, Ідс2, ІдсСЗ та Ідс4). У контексті даного документа говорять, що Ес-ділянка відноситься до певного ізотипу дос, якщо її амінокислотна послідовність є найбільше гомологичною такому ізотипу відносно інших ізотипів дос. Різні ізотипи ІдсС характеризуються різними фізичними та функціональними властивостями, включаючи період напівжиття у сироватці, зв'язування комплементу, афінності зв'язування Есук і активності ефекторних функцій (наприклад, АЮОСС, СОС і т. д.), через відмінності в амінокислотних послідовностях їх шарніра та/або Ес-ділянок, наприклад, як описано у Ріезсі і
Мерреп (1999) 9. Сііп. І аб. Апа!. 14:141-156; Снарреї єї а. (1993) 9. Віої. Спет. 33:25124-25131;
СНарреї! еї а!(1991) Ргос. Маї). Асад. сі. (0О.5.А.) 88:9036-9040; або Вгйддетапп еї а!.(1987) У.
Ехр. Мей 166:1351-1361. Такий тип варіантної Ес-ділянки можна використовувати окремо або у комбінації з амінокислотною модифікацією для впливу на Ес-опосередковану ефекторну функцію та/або активність зв'язування. У комбінації амінокислотна модифікація та шарнір/Ес- ділянка (ДС можуть проявляти подібну функціональність (наприклад, підвищену афінність у відношенні ЕсСуКІПА) і можуть діяти адитивно або, що більше переважно, синергично, модифікуючи ефекторну функціональність молекули за даним винаходом відносно молекули за даним винаходом, що містить Ес-ділянку дикого типу. Відповідно до інших варіантів здійснення, амінокислотна модифікація та Ес-ділянка (Я можуть проявляти протилежну функціональність (наприклад, відповідно підвищену та знижену афінність у відношенні ЕсуКІІА) і можуть діяти, селективно послаблюючи або зменшуючи специфічну функціональність молекули за даним винаходом відносно молекули, що не містить Ес-ділянку або містить Ес-ділянку дикого типу того ж ізотипу.
Відповідно до переважного конкретного варіанта здійснення, зв'язуючі ГАС-3 молекули за даним винаходом містять варіантну Ес-ділянку, причому зазначена варіантна Ес-ділянка містить щонайменше одну амінокислотну модифікацію відносно Ес-ділянки дикого типу, так щоб зазначена молекула мала змінену афінність у відношенні БСК, за умови, що зазначена варіантна Ес-ділянка не має заміни в положеннях, які безпосередньо контактують з ЕсукК, за результатами кристалографічного та структурного аналізу взаємодій Ес-ЕсСК, таких як описані у
Зопдептапп ей а). (2000) Маїште 406:267-73. Прикладами положень в РЕс-ділянці, які безпосередньо контактують з ЕсукК, є амінокислотні залишки 234-239 (шарнірна ділянка), амінокислотні залишки 265-269 (петля В/С), амінокислотні залишки 297-299 (петля СЕ) і амінокислотні залишки 327-332 (петля Б/б5). Відповідно до деяких варіантів здійснення, молекули за даним винаходом містять варіантні Ес-ділянки, які містять модифікацію щонайменше одного залишку, яка не створює безпосереднього контакту з ЕсукК, за результатами кристалографічного та структурного аналізу, наприклад, не знаходиться у сайті зв'язування ЕБо-Есук.
Варіантні Ес-ділянки добре відомі з рівня техніки, та відповідно до даного винаходу, можна застосовувати будь-яку відому варіантну Ес-ділянку для надання або модифікації ефекторної функції, що проявляється молекулою за даним винаходом, яка містить Ес-ділянку (або її частину), згідно з результатами функціонального аналізу, наприклад, у МК-залежному або (610) макрофагзалежному аналізі. Наприклад, варіанти Ес-ділянки, що виявлені як такі, що змінюють ефекторну функцію, розкриті у РСТ публікаціях УМО 04/063351, МО 06/088494, УМО 07/024249,
УМО 06/113665, УМО 07/021841, УМО 07/106707 ії УМО 2008/140603, та у даних молекулах можна застосовувати будь-який підходящий варіант, що розкритий в них.
Відповідно до деяких варіантів здійснення, зв'язуючі | АС-3 молекули за даним винаходом містять варіантну Ес-ділянку, що має одну або декілька амінокислотних модифікацій в одній або декількох ділянках, при цьому модифікація(-її) змінює (відносно Ес-ділянки дикого типу) співвідношення афінностей вариантної Ес-ділянки до активуючого Есук (такого як ЕСсувКІА або
ЕсукПА) відносно інгібуючого Есук (такого як ЕсуКІІВ):
Зміни у днхого тних зо варідмуного афінвості ло БеУК хви
Співвідношення афінностей піт ттнттттаптттатт пл почта пест сет потоп птн зміна ух ликого тиву до варівнтвого аднності до БУК у луючий
Особливо переважними є зв'язуюючі ГАС-3 молекули за даним винаходом, які мають варіантну Ес-ділянку (відносно Ес-ділянки дикого типу), при цьому така варіантна Ес-ділянка має співвідношення афінностей, що перевищує 1. Такі молекули особливо корисні при здійсненні терапевтичного або профілактичного лікування захворювання, порушення або інфекції або ослабленні їх симптому, коли необхідна підвищена ефективність ефекторної клітинної функції (наприклад, АОСС), що опосередкована ЕсукК, наприклад, у випадку злоякісної пухлини або інфекційного захворювання. Для порівняння, варіантна Ес-ділянка, що має співвідношення афінностей менше 1, опосередковує знижену ефективність ефекторної клітинної функції. У таблиці 1 наведені ілюстративні одиночні, подвійні, потрійні, четверні та п'ятиразові мутації за значеннями їх співвідношення афінностей, які або перевищують 1, або ні.
Таблиця 1
Ілюстративні одиночні або множинні мутації, що наведені за допомогою співвідношення афінностей
Е2431 і . 234, Е243ІЇ, К292Р Ц1235М, Б243І, вго9гР,
Е243 В2оР Е2431,, РАЛІ і М421К У3001. УЗО0І і РЗОВІ.
Е2431 і . Ї235І, 243, К292Р ЦІ1235Р, Б243ІЇ, вго9гР, рага7оє Уз00ї Е243І, К292Р і 3001. УзЗо0. УЗО0І і РЗОВІ.
Е2431 і . 2350, 2431, К292Р ц|Б243ІЇ, ВН2г92Р, УЗОБІ, дргога РОВІ. Е243І1, К292Р і М3О5І Уз00. УЗО0І і РЗОВІ р27оЕ і . Е2431, Р2А7І, 0270Е і
В292Р РЗОВІ. Е243І, К292Р і РЗ9бІ. Маяк пол
К292Р і . Е2431, 2551, 0270Е і
Мор ема узоосірзеві | рову ни
К292Р і Р2АЛІ, р27ОЕ і 2431, 0270Е, 53160 і
МЗО5І маг Кк вива
К292Р і . Е2431, 0270Е, К3921 ії 0 Праву |Воввіротовірзеву рр ни
УЗОО. ї 0270Е, 53160 їЕ243Ї, 0270Е, РЗ96І і
РЗОбІ. вива ан
РЗОбІ. і . Е243І, К292Р, УЗОО01І, ії 0270ОЕ, РЗОбІ. і 2431, К292Р, МЗО5І ії
Оа419н РЗ9бІ.
МУ284М, К2921. і Р2471, 0270Е, УЗО0І і
КкЗ7оМ Мак . К255І, О0270Е, 22925 і
К255І, 0270Е, УЗО0І і
РЗ9бІ.
Таблиця 1 (продовження) 000 по
Вва16а з Зо офвннюмеі 01
РЗОбІ. "
РгА7І. і век | 11 12020530
РЗОбІ.
ШО НЕННЯ ННЯ НОЯ
МУЗО5І 2122 2 З « о
РЗОбІ. шк дан
Відповідно до конкретного варіанта здійснення, у варіантних Ро-ділянках будь-які амінокислотні модифікації (наприклад, заміни) припадають на будь-які з положень 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328 або 330 і переважно на один або декілька з наступних залишків: А240, І240, І 241, 1243, Н244, М298, ІЗ28 або М330. Відповідно до іншого конкретного варіанта здійснення, у варіантних Ес-ділянках будь-які амінокислотні модифікації (наприклад, заміни) припадають на будь-які з положень 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 або 439 і переважно на один або декілька з наступних залишків: Н280, 0280, 280, 290, 5290, Т290, 290, М294, К295, Р296, 0298, М298, Р298, М298, ІЗО0 або 1 300.
Відповідно до переважного варіанта здійснення, у варіантних Ес-ділянках, які зв'язують Есук зі зміненою афінністю, будь-які амінокислотні модифікації (наприклад, заміни) припадають на будь-які з положень 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 216, 218, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 або 439.
Переважно, варіантна Ес-ділянка має будь-який з наступних залишків: А256, М268, 0272, 0286, 0286, 5286, А290, 5290, А298, М301, АЗ12, ЕЗ20, М320, 0320, 8320, ЕЗ22, АЗ26, 0326, ЕЗ26,
МЗ326, 5326, К330, 339, АЗ33, АЗ34, ЕЗ334, НЗ34, 1334, М334, 0334, М334, К335, 0335, АЗ59,
АЗбО або А430.
Відповідно до іншого варіанта здійснення, у варіантних Ес-ділянках, які зв'язують Есук (за допомогою його Ес-ділянки) зі зменшеною афінністю, будь-які амінокислотні модифікації (наприклад, заміни) припадають на будь-які з положень 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 або 439.
Відповідно до іншого варіанта здійснення, у варіантних Ес-ділянках, які зв'язують Есук (за допомогою його Ес-ділянки) зі збільшеною афінністю, будь-які амінокислотні модифікації (наприклад, заміни) припадають на будь-які з положень 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 або 430. Відповідно до іншого варіанта здійснення, у варіантних Ес-ділянках, які зв'язують ЕсСукІА зі збільшеною афінністю, знаходяться будь-які з наступних залишків: А255, А256, А258, А267, А268, М268,
А272, 0272, А276, А280, А283, А285, А286, 0286, 0286, 5286, А290, 5290, М301, ЕЗ20, МЗ320, 0320, 8320, ЕЗ22, АЗ26, 0326, ЕЗ26, 5326, КЗ30, АЗ31, 0335, АЗ37 або А430.
Переважні варіанти включають одну або декілька модифікацій у будь-яких положеннях: 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 296, 297, 298, 299, 302, 304, 305, 313, 323, 325, 326, 328, 330 або 332.
Особливо переважні варіанти включають одну або декілька модифікацій, що вибрані з груп
А-АЇ: в |230А,230Е,230мабо230б;.///7/777777 о (гзав гака:
111 (240А,240ї240Мабо240т;. 77777111 о |263А,263і263Мабо263т;. 77771111
Р (|264Р,264Е,264Н,264І,264А,264табо2в4Му;.СС//111с1 о (265Р,265У,265Н,265І,265І,26571,265М,265Мабо2650;.Й.С/:)и/:;/НВБ./!//////////:: в (266А,266ї,266Мабо2в6т; 77777711 271М, 271У, 271ММ або 2710; 2995, 299М, 299ММ або 299У; 325У, 325ММ або 325Р; 3281, 328Н, 328М або 328М;
З332ММ, 332Р, 3320 або 332; і
Ще більш особливі варіанти включають одну або декілька модифікацій, що вибрані з груп 1- 105: 6 (Р2а1Е/Р243О/М2бот/М2баЕ/ІЗ3аЕЇ 59 |52390/І332Е 07 Ф|Р2а1Е/Р243ВН/М2б2Е/М26б4В | 60 |52390/1332Е/АЗІЮЇ :/ 8 (Р2а1Е/Р243Н/М2б2Е/М2баВ/ІЗЗаЕЇ 61 |52390/13320М. ..:/К:.:/::/дуд::С 9 |Р2а1Е/Р2Я43ЗУ/Мобот/М2аб4В | 62 |52390/133200.....:ККХСКН/.4:С:К(0С:У |З 52390 / М2970 / ІЗЗ2Е / АЗЗОМ / Е2А15 13 (гга1в/Р243О0/М26б2т/М2б4в | 66 |52390/М2970/І332Е/КЗа6Е -:: |Рга1му/Р243Му/М2б2А/М2баА | 68 |52390/5298А/ІЗЗАЕ -/::оуои (16 |гга1у/гга3ЗуУ/Мобат/М2б4т | 69 |52390/М2641/АЗЗОС/ІЗЗАЕ
Е2гА1м / Е243У / М2621 / М264Т / 27 Ц|іЗавТ/ІЗЗаЕ 77777777 | 80 |5239Е/МоблЯ/ІЗЗаЕ, 2 3 (|м2г970/т2991/І332Е 00 | 86 |5239М/ІЗ3аМ 7771 зб (|м2г970/т2991/І332Е | 89 |52390/133200....:К.:..::/ .А:ИИи.:С С 37 |м2г970/т299М/І332Е | 90 |52390/І3320Е -::Х ЕС: С /д 43 |52390/АЗЗОМ/ІЗЗ2Е | 96 |М2ба/АЗЗОГ/ЛІЗЗЕ 9 45 |52390/АЗЗОМ/ІЗЗ2Е/КЗабТ | 98 |М2ба/ІЗЗаЕ /////:///////-/З 46 |52390/АЗЗОМ/ІЗЗ2Е/12341 | 99 |М2б4/529ВАЛІЗЗАЕ С і 53 |5аз9р/раббі/Ммае7р/ІЗЗаЕ | ОЇ
Відповідно до одного варіанта здійснення, зв'язуюча ГАС-3 молекула за даним винаходом буде містити варіантну Есо-ділянку, що має щонайменше одну модифікацію у Ес-ділянці.
Відповідно до деяких варіантів здійснення, варіантна Ес-ділянка містить щонайменше одну заміну, що вибрана з групи, що складається з /235М, Е243|, К292Р, У3001І, МЗ3О5І і РЗОбІ, причому зазначена нумерація відповідає ЕЄШО системі нумерації за Кабаї.
Відповідно до конкретного варіанта здійснення, варіантна Ес-ділянка містить: (А) щонайменше одну заміну, яка вибрана з групи, що складається з Е2431Ї, К292Р, УЗО01,
МЗО5І і РЗ396І; (В) щонайменше дві заміни, які вибрані з групи, що складається з: (1) Е243І і РЗ396І; (2) Е243І і К292Р; їі (3) К292Р і МЗ3О5І; (С) щонайменше три заміни, які вибрані з групи, що складається з: (1) 2431, К292Р і 3001; (2) Е243І, К292Р їм3051; (3) Е243І, К292Р і РЗ396І і (4) К292Р, МЗО5І і РЗ96І ; (ФС) щонайменше чотири заміни, які вибрані з групи, що складається з: (1) 243, К292Р, УЗО0І і РЗ96І. і
(2) Е243І, К292Р, МЗО5І і РЗ396І ; або (Е) щонайменше п'ять замін, які вибрані з групи, що складається 3: (1) Е243Ї, К292Р, УЗ00І, МЗО5І і РЗ396Ї і (2)1235М, Е243І, В292Р, УЗО00І і РЗ3961.
Відповідно до іншого конкретного варіанта здійснення, варіантна Ес-ділянка містить заміни 3: (А) 2431, К292Р і 3001; (В) 1235М, 2431, К292Р, УЗО0І і Р3961 ; або (С) Е243І, К292Р, 3001, УЗО5І і РЗОбІ..
Відповідно до одного варіанта здійснення, зв'язуюча ГАС-3 молекула за даним винаходом містить варіантну Ес-ділянку, яка характеризується зниженим (або практично відсутнім) зв'язуванням з ЕсукІА (СОб64), ЕсуКПА (СО32А), ЕсукІІВ (СО328), ЕсуКкША (СО16а) або ЕсукПІВ (СО16Б) (відносно зв'язування, яким характеризується Ес-ділянка ДО1 дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО:1)). Відповідно до одного варіанта здійснення, зв'язуюча ГАС-3 молекула за даним винаходом буде містити варіантну Ес-ділянку, яка характеризується зменшеним (або практично відсутнім) зв'язуванням з Есук (наприклад, ЕСсуКПА) і зменшеною (або практично відсутньою)
АрСС-ефекторною функцією. Відповідно до деяких варіантів здійснення, варіантна Ес-ділянка містить щонайменше одну заміну, яка вибрана з групи, що складається з І 234А, І 235А, 0265А,
МмМ2970 ії М29706. Відповідно до конкретного варіанта здійснення, варіантна Ес-ділянка містить заміну з І 234А, І 235А, І 234А і І 235А, 0265А, М2970О або М2970.
Відповідно до іншого варіанта здійснення, зв'язуюча | АС-3 молекула за даним винаходом містить Ес-ділянку, яка первинно характеризується зниженим (або практично відсутнім) зв'язуванням з ЕсСуКІША (СОрі'ба) та/"або зменшеною ефекторною функцією (відносно зв'язування, яким характеризується Ес-ділянка ЇдД1 дикого типу (ЗЕО ІЮ МО:1)). Відповідно до конкретного варіанта здійснення, зв'язуюча ГАС-3 молекула за даним винаходом містить Ес- ділянку ЇД2 (ЗЕО ІЮ МО: 2) або Ес-ділянку 954 (5ЕО І: МО: 4). При використанні Ес-ділянки
Ід04 даний винахід також відноситься до внесення стабілізуючої мутації, такої як заміна 5228Р у шарнірній ділянці Ідс4 (див., наприклад, 5ЕО І МО:117: ЕЗКУСОРРСРРСР, (и еї аї., (2008) "Те ЕЧесі ОГ А Роїпі Миайоп Оп Те їарійу ОЇ Іда4 Ав Мопіюгей Ву Апаїуїїса!
ОНгасепігітидайоп, 7" 9. РПапгтасешііса! Зсіепсе5 97:960-969) для зменшення випадків обміну ланцюгами. У Ес-ділянку ЇД4 можуть бути введені й інші стабілізуючі мутації, що відомі з рівня техніки (Реїегв5, Р еї аї., (2012) "Епдіпеегіпд ап Іпргомей д54 МоїІесше м/йп Кедисей бізийае
Вопа Неїегодепейу апа Іпстеазейд Бар Ротаїп Гнептаї егарбіїку, " 9. ВіоїЇ. Спет., 287:24525-24533; патентна РСТ публікація УМО 2008/145142).
Відповідно до інших варіантів здійснення, даний винахід відноситься до застосування будь- якого варіанта Ес, що відомий з рівня техніки, такого як розкриті у роботі дУеПетгів, В..). єї а!(2002) "Іпіегасіоп 5йе5з Оп Нитап Ідс-Ес Бог Есдаттак: Ситепі Модеї5, " Ітттипої. Ген. 82:57-65;
Ргезіа, І... еї аї. (2002) "Епдіпеегіпд Тпегарешіс Апіїродіе5 Рог Ітргомей Еипсійоп, " Віоспет. ос. Тгап5. 30:487-90; Ідизодіє, Е.Е. еї аї. (2001) "Епдіпеєегей Апіїрбодієз У/йН Іпстгеазей Асіїмйу То
Кесгий Сотріетепі, " У. Іттипої. 166:2571-75; ЗПівєїав, В.Г... еї а. (2001) "Нідн Везоїшіоп Марріпд
ОЇ Тне Віпаїпд 5йе Оп Нитап Ідс1 Рог Ес Сатта ВІ, Ес Сатта ВІЇ, Ес Сатта ВІЇ, Апа ГсВАп
Апа Оезідп ОГ ІдО1 Магіапів УМІВ Ітргомей Віпаїпуд То Те Ес датта К, " 9. Віої. Спет. 276:6591- 6604; Ідизодіє, Е.Е. еї а. (2000) "Марріпу ОЇ Те Ста Віпаїпоа 5іе Оп Айихап, А Спітетгіс Апіїбоду
УМ А Нитап дос Ес, " у). Іттипої. 164:4178-84; Ведау, М.Р. єї аї. (2000) "ЕЇтіпайоп ОЇ Ес
Весерюг-Оерепаепі ЕПесіог Рипсбопз5 ОГ А Моадійеа Ід04 Мопосіопа! Апібоду То Нитап СО4, ..
Ітітипої. 164:11925-1933; Хи, 0. еї а. (2000) "п Міо СпНагасівєгіганоп ої Ріме Нитапігей ОКТЗ
ЕпМесіог ЕРипсіоп Магіапі Апіїродіе5, " СеїЇ. Іттипої. 200:16-26; Аптоиг, К.І. еї аї. (1999) "ВНесотбіпапі питап Ідеї Моїіесціез ГасКкіпд Есдатта Ресеріог І Віпаіпд Апа Мопосуїе Тгіддегіпд
Асіїміціе5, " Ешиг. У. Іттипої. 29:2613-24; деМегів, В. єї а!. (1996) "Модшацоп ОЇ Ес(Ссатта)й Апа
Нитап Сотрієтепі Асіїмайоп Ву Ід23-Соге ОїЇїдозасспагіде Іпіегасіопв5, " Ітітипої. Гей. 54:101- 04; Гипа, у. єї а. (1996) "Мийіріе Іпіегасіпв ОГ Їдс м/п не Соге ОїЇїдозасснатде Сап Модшіате
Весодпійоп Ву Сотріетепі Апа Нитап Ес Сатта Весеріог І Апа Іпїшепсе Те Зупіпевзів ОЇ Мб
ОїЇїдозасспагіде Спаіпб5, " 9. Іттипої. 157:4963-4969; НиїсНіпв еї аї. (1995) "Ітргомейд
Віодівігіршіоп, Титог Тагдеїйпо, Апа Недисейд Іттиподепісйу Іп Місе М/Н А Сатта 4 Маїапі ОЇ
Сатраїн-1Н, " Ргос. Май). Асай. 5сі. (0.5.А.) 92:11980-84; деМегів, В. єї аї. (1995) "Весодпйіоп зпез Оп Нитап до Бог Ес Сатта Кесеріог5: Тпе Коїе ОЇ СіІусозуЇайоп, " Іттипої. Гей. 44:111- 17; Гипа), 9. еї а. (1995) "ОіїдозассНатіде-Ргоївїп Іпіегасіюп5 Іп Їдс Сап Модиіаїє Ресодпійоп Ву
Ес Сатта Ресеріог5, " РЕАЗЕВ У. 9:115-19; АІедге, М... еї а. (1994) "А Моп-Асіїмаїйіпд "Нитапігесй"
Апіі-СОЗ Мопосіопа! Апіїбоду Кеїаійп5 Іттипозирргеззіме Ргорегіє5 Іп Мімо, " Тгапзріапіайоп (610) 57:1537-1543; І ипа еї а. (1992) "Мийіріє Віпаіпа 5йез Оп Те СН2 Вотаїп ОС да Бог Моизе Ес батта К11," Мої. Іттипої. 29:53-59; І шипа еї аї. (1991) "Нитап Ес Сатта ВІ Апа Ес Сатта ВІЇ
Іптегасі МІП Оізійпсі Виї Омепарріпуд Зйе5з Оп Нитап дос, "У. Іттипої. 147:2657-2662; Випсап,
А.В. вї аї. (1988) "І осаїїганоп ОЇ Тне Віпаїпа 5йе Рог Тне Нитап Нідн-Аніпіпу Ес Весеріог Оп Іда, " Майшге 332:563-564; патенти США МоМо 5624821, 5885573, 6194551, 72765861 7317091; і РСТ публікації МО 00/42072 та УМО 99/58572.
Відповідно до деяких варіантів здійснення, молекули за даним винаходом додатково містять один або декілька сайтів глікозилювання, так щоб один або декілька вуглеводних фрагментів були ковалентно приєднані до молекули. Переважно, молекули за даним винаходом з одним або декількома сайтами глікозилювання та/або однією або декількома модифікаціями у Ес- ділянці надають або мають підвищену антитілоопосередковану ефекторну функцію, наприклад, підвищену АЮСс-активність у порівнянні з немодифікованим антитілом. Відповідно до деяких варіантів здійснення, даний винахід додатково відноситься до молекул, що містять одну або декілька модифікацій амінокислот, які відомі як такі, що безпосередньо або опосередковано взаємодіють з вуглеводним фрагментом Ес-ділянки, включаючи без обмеження амінокислоти у положеннях 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299 або 301.
Амінокислоти, які безпосередньо або опосередковано взаємодіють з вуглеводним фрагментом
Ес-ділянки, відомі з рівня техніки, див., наприклад, УепПегіз еї аї., 1995 Іттипоїіоду І еЧЦегв5, 44: 111-7, яка включена у даний документ за допомогою посилання у повному її обсязі.
Відповідно до іншого варіанта здійснення, даний винахід відноситься до молекул, які були модифіковані внесенням одного або декількох сайтів глікозилювання в один або декілька сайтів молекул, переважно без зміни функціональності молекул, наприклад, активності зв'язування з цільовим антигеном або Есук. Сайти глікозилювання можуть бути внесені у варіабельну та/або константну ділянку молекул за даним винаходом. "Сайти глікозилювання", що застосовувані у контексті даного документа, включають будь-яку специфічну амінокислотну послідовність в антитілі, до якої буде специфічно або ковалентно приєднаний олігосахарид (тобто вуглеводи, що містять два або більше простих цукрів, що поєднані разом). Бічні олігосахаридні ланцюги зазвичай зв'язані з остовом антитіла за допомогою або М-, або О-зв'язків. М-зв'язане глікозилювання відноситься до приєднання олігосахаридного фрагмента до бічного ланцюга аспарагінового залишку. О-зв'язане глікозилювання відноситься до приєднання олігсахаридного фрагмента до гідроксиамінокислоти, наприклад, серину, треоніну. Молекули за даним винаходом можуть містити один або декілька сайтів глікозилювання, включаючи сайти М- зв'язаного й О-зв'язаного глікозилювання. Відповідно до даного винаходу, можна застосовувати будь-який відомий з рівня техніки сайт глікозилювання для М-зв'язаного або О-пов'язаного глікозилювання. Ілюстративним сайтом М-зв'язаного глікозилювання, який є придатним відповідно до способів за даним винаходом, є амінокислотна послідовність: Азп-Х-ТПг/5ег, де Х може бути будь-якою амінокислотою, а Тпг/Зег позначає треонін або серин. Такий сайт або сайти можна внести у молекулу за даним винаходом за допомогою способів, що добре відомі у галузі техніки, до якої відноситься даний винахід (див., наприклад, Іп міго Мшиадепевів,
Весотбріпапі ОМА: А поп Соигзе, у. Ю. Маївоп, еї аІ. М.Н. Ргеетап апа Сотрапу, Мем Моїк, 1983, спаріег 8, рр. 106-116, яка включена у даний документ за допомогою посилання у повному її обсязі. Ілюстративний спосіб внесення сайту глікозилювання у молекулу за даним винаходом може передбачати модифікацію або мутацію амінокислотної послідовності молекули так, щоб одержати необхідну послідовність Аб5п-Х-ГПг/56г.
Відповідно до деяких варіантів здійснення, даний винахід відноситься до способів модифікації вуглеводного вмісту молекули за даним винаходом шляхом додавання або видалення сайту глікозилювання. Способи модифікації вуглеводного вмісту антитіл (і молекул, що містять домени антитіла, наприклад, Ес-ділянка) добре відомі з рівня техніки і охоплюються даним винаходом, див., наприклад, патент США Мо 6218149, ЕР 0 359 096 ВІ1; публікацію О5 2002/0028486, УМО 03/035835; публікацію США Мо 2003/0115614; патент США Мо 6218149; патент США Мо 6472511; всі з яких включені у даний документ у повному їх обсязі. Відповідно до інших варіантів здійснення, даний винахід відноситься до способів модифікації вуглеводного вмісту молекули за даним винаходом шляхом видалення одного або декількох ендогенних вуглеводних фрагментів молекули. Відповідно до конкретного варіанта здійснення, даний винахід відноситься до зсуву сайту глікозилювання Ес-ділянки антитіла шляхом модифікації положень, що прилягають до 297. Відповідно до конкретного варіанта здійснення, даний винахід відноситься до модифікації положення 296 так, щоб глікозилювалося положення 296, а не положення 297.
Ефекторну функцію також можна модифікувати за допомогою таких методик, як введення одного або декількох цистеїнових залишків у Ес-ділянку, тим самим забезпечуючи можливість (610) утворення міжланцюжкового дисульфідного зв'язку у цій ділянці, у результаті чого утворюється гомодимерне антитіло, яке може характеризуватися покращеною здатністю до інтерналізації та/"або підвищеним комплементзалежним цитолізом клітин і АЮСС (Сагоп, Р.С. еї аІ.(1992) "Епдіпеегеа Нитапігей Оітегіс Бопт5 ОЇ ІдсС Аге Моге ЕПесіїме Апіїродіе5, " У. Ехр. Меа. 176:1191-1195; ЗНорез, В. (1992) "А Сепеїїсау Епдіпеетеа Нитап ДС Миїапі МУйН Епнапсей
Суоунйс Асіїмйу, "7 У. Іттипої. 148(9):2918-2922. Гомодимерні антитіла з підвищеною протипухлинною активністю також можна одержати за допомогою гетеробіфункціональних зшиваючих лінкерів, як описано у роботі Мой, Е.А. еї а/.(1993) "Мопосіопа! Апіїрбоду
Нотодітеге: Еппапсей Апійштог Асіїмйу Іп Миде Місе, " Сапсег Кезеагсп 53:2560-2565.
Альтернативно, може бути сконструйовано антитіло, яке має подвійні Ес-ділянки та, таким чином, може мати підвищені комплементзалежні літичні та АОСС-характеристики (5іемепзоп,
С..Т. еї аІ(1989) "А Спітетіс Апіїроду М/Н Опа! Ес Ведіопз (різЕабнс) Ргерагед Ву Мапіршіацйопе5
АЇ Те Ідо Ніпде, " Апіі-Сапсег Огид Оезідп 3:219-230).
Період напівжиття у сироватці молекул за даним винаходом, що містять Ес-ділянки, може бути збільшений шляхом збільшення афінності зв'язування Ес-ділянки з ЕсКп. Термін "період напіжиття", що застосовуваний у контексті даного документа, означає фармакокинетичну властивість молекули, яка представляє собою міру середнього часу життя молекул після їх введення. Період напівжиття може бути виражений як час, що необхідний для усунення п'ятдесяти відсотків (50 95) відомої кількості молекули з організму суб'єкта (наприклад, пацієнта- людини або іншого ссавця) або його конкретної частини, наприклад, яка виміряна у сироватці, тобто період напівжиття у кровотоці, або в інших тканинах. Зазвичай, збільшення періоду напівжиття призводить у результаті до збільшення середнього часу утримання (МКТ) у кровотоці для молекули, що вводиться.
Відповідно до деяких варіантів здійснення, зв'язуючі | АС-3 молекули за даним винаходом містять варіантну Ес-ділянку, яка містить щонайменше одну амінокислотну модифікацію відносно Ес-ділянки дикого типу і які характеризуються збільшеним періодом напівжиття (відносно Ес-ділянки дикого типу).
Відповідно до деяких варіантів здійснення, зв'язуючі | АС-3 молекули за даним винаходом містять варіантну Ес-ділянку, яка містить амінокислотну заміну, що збільшує періодом напівжиття, за одним або декількома положеннями, які вибрані з групи, що складається з 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435 і 436, які пронумеровані відповідно до
БО системи нумерації за Кабваї. Багаточисленні конкретні мутації, що здатні збільшувати період напівжиття молекули, яка містить Ес-ділянку, відомі з рівня техніки та включають, наприклад,
М252У, 5254Т, Т256Е та їх комбінації. Наприклад, див. мутації, що описані у патентах США МоМо 6277375, 7083784, 7217797, 8088376, публікаціях США МоМо 2002/0147311, 2007/0148164 та міждународних публікаціях УМО 98/23289, УМО 2009/058492 та УМО 2010/033279, які включені у даний документ за допомогою посилання у повному їх обсязі. Молекули, що містять Ес-ділянку зі збільшеним періодом напівжиття, також включають молекули із замінами за двома або більше залишками Ес-ділянки 250, 252, 254, 256, 257, 288, 307, 308, 309, 311, 378, 428, 433, 434, 435 і 436. Зокрема, дві або більше замін вибрані з: Т2500, М252У, 5254Т, Т256Е, К2880, 73070,
МЗО8Р, АЗ78У, М4281,, М434А, НАЗК і 4361.
Відповідно до конкретного варіанта здійснення, варіантна Ес-ділянка містить заміни з: (А) 252У, 2541 і 256Е; (В) М252У із254Т; (С) М252У і Т256ЄЕ; (0) 2500 і 4281; (Є) 13070 і МАЗ4А; (Є) АЗ78М і МАЗ4А; (с) М4З4А і У4361; (Н) МЗО8Р їі М434А; або () К2880 і НАЗ5БК.
Даний винахід додатково відноситься до варіантних Ес-ділянок, що містять: (А) одну або декілька мутацій, які змінюють ефекторну функцію та/або Есук; і (В) одну або декілька мутацій, які продовжують період напівжиття у сироватці.
МІ. Біспецифічні зв'язуючі І АС-3 молекули за даним винаходом
Один варіант здійснення даного винаходу відноситься до біспецифічних зв'язуючих молекул, які здатні зв'язуватися з "першим епітопом" і "другим епітопом", причому перший епітоп являє собою епітоп (Г АС-3 людини, а другий епітоп являє собою такий же або відмінний епітоп ГАС-3 або являє собою епітоп іншої молекули, яка присутня на поверхні імунної клітини (610) (такої як Т-лімфоцит) і бере участь у регуляції імунної контрольної точки. Відповідно до деяких варіантів здійснення, другий епітоп переважно не являє собою епітоп ГАС-3. Відповідно до одного варіанта здійснення, другий епітоп являє собою епітоп В7-НЗ, В7-Н4, ВТ А, СОЗ, СО8,
Ср16, 0027, 0032, С0040, С0401, 0047, С0О64, 2070, С080, С086, 0094, 00137, СО1371,
СО226, СТІ А-4, галектину-9, СІТА, СІТАЇГ, ННІ А2, ІСОБ5, ІСОБІ,, КІВ, І дО-3, ГІСНТ, МН І або
ІЇ класу, МКОС2а, МКО2а, ОХ40, ОХ40І, РОН, РО-1, РО-І 1, РО-І2, РМЕВ, 5ІВРа, ТОВ, ТІСІТ, ТІМ-
З або МІ5ТА. Відповідно до конкретних варіантів здійснення, другий епітоп являє собою СО137,
РО-1, ОХ40, ТІСІТ або ТІМ-3. Відповідно до деяких варіантів здійснення, такі біспецифічні молекули містять більше двох епітоп-зв'язуючих сайтів. Такі біспецифічні молекули можуть, наприклад, зв'язувати два або більше різних епітопів (АС-3 та щонайменше один епітоп молекули, яка не є | Ас-3.
Даний винахід відноситься до біспецифічних антитіл, що здатні одночасно зв'язуватися з
І АО-3 та другим епітопом (наприклад, В7-НЗ, В7-Н4А, ВТІ А, 2040, СО80, 2086, СО137, СТІ А-4,
ІСО5, КІК, МНС І або ІІ класу, ОХ40, РО-1, РО-І1, ТС, ТІМ-3 і т. д.). Відповідно до деяких варіантів здійснення, біспецифічне антитіло, що здатне одночасно зв'язуватися з РО-1 і другим епітопом, одержують за допомогою будь-якого зі способів, що описані у РСТ публікаціях УУО 1998/002463, МО 2005/070966, МО 2006/107786 МО 2007/024715, МО 2007/075270, МО 2006/107617, МО 2007/046893, МО 2007/146968, МО 2008/003103, МО 2008/003116, МО 2008/027236, УМО 2008/024188, УМО 2009/132876, МО 2009/018386, МО 2010/028797,
МО2010028796, МО 2010/028795, МО 2010/108127, МО 2010/136172, МО 2011/086091, МО 2011/133886, МО 2012/009544, МО 2013/003652, МО 2013/070565, МО 2012/162583, МО 2012/156430, УМО 2013/174873 та УМО 2014/022540, кожна з яких включена у даний документ за допомогою посилання у повному її обсязі. 1. Біспецифічні діатіла, що не мають Ес-ділянок
Один варіант здійснення даного винаходу відноситься до біспецифічних одновалентних діатіл, які містять перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг, і найбільше переважно складаються з них, послідовності яких дозволяють поліпептидним ланцюгам ковалентно зв'язуватися один з одним з утворенням ковалентно зв'язаного діатіла, яке здатне одночасно зв'язуватися з першим епітопом ("епітопом 1") ії другим епітопом ("епітопом 2"), причому такі епітопи не ідентичні один одному. Таким чином, такі біспецифічні діатіла містять домени "МІ 15/«УНТІ", які здатні зв'язуватися з першим епітопом (Мі епітоп 1/МНепітоп 1), їі ДОМеНнИ "Мі25/«УНа2", які здатні зв'язуватися з другим епітопом (Мі епітопо/МНепітопг). Позначення "МІ 1" і "МНІ" позначають відповідно варіабельний домен легкого ланцюга та варіабельний домен важкого ланцюга, які пов'язують "перший" епітоп такого біспецифічного діатіла. Аналогічним чином, позначення "МІ 2" та "МН2" позначають відповідно варіабельний домен легкого ланцюга та варіабельний домен важкого ланцюга, які зв'язують "другий" епітоп такого біспецифічного діатіла. Відповідно до одного варіанта здійснення, епітоп 1 таких молекул діатіла є епітопом
І АС-3, а епітоп 2 таких молекул діатіла не є епітопом Г Ас-3 (наприклад, він являє собою епітоп з В7-НЗ, В7-Н4, ВТ А, 2040, СО80, СО86, СО137, СТІ А-4, ІСО5, КІК, МН І або ІІ класу, ОХ40,
РО-1, РО-І1, ТОВ, ТІМ-3 і т. д.).
Домен МІ першого поліпептидного ланцюга таких зв'язуючих ГАС-2 діатіл взаємодіє з доменом МН другого поліпептидного ланцюга з утворенням першого функціонального епітоп- зв'язуючого сайту, який специфічний до першого антигена (тобто або | АС-3, або антигена, який містить другий епітоп). Аналогічним чином, домен МІ. другого поліпептидного ланцюга взаємодіє з доменом МН першого поліпептидного ланцюга з утворенням другого функціонального епітоп- зв'язуючого сайту, який специфічний до другого антигена (тобто або антигену, який містить другий епітоп, або ГАС-3). Таким чином, вибір доменів МІ і МН першого та другого поліпептидних ланцюгів скоординований таким чином, щоб два поліпептидних ланцюга діатіла у сукупності містили домени МІ. і МН, що здатні зв'язуватися як з епітопом ГАс-3, так і з другим епітопом (тобто вони у сукупності містять домени Мі где -з/МНідо-з і Мі епітопг/ МНепітопг)о. Не має значення, чи позначена конкретна пара зв'язуючих доменів (тобто Мі епітоп 1/МНепітоп 1 260 Мі епітоп 2/МНепітоп 2), епітоп антигена з епітопом 1 або епітоп антигена з епітопом 2), як перший відносно другого епітоп діатіла; такі позначення мають відношення тільки до наявності та орієнтації доменів поліпептидних ланцюгів зв'язуючих молекул за даним винаходом.
Перший поліпептидний ланцюг за варіантом здійснення таких біспецифічних одновалентних діатіл містить, у напрямку від М-кінця до С-кінця, М-кінець, домен Мі. моноклонального антитіла, що здатне зв'язуватися або з першим епітопом, або з доменом Мі. моноклонального антитіла, що здатне зв'язуватися з другим епітопом (тобто або Мі гдс-з, або Мі епітопг), Перший проміжний спейсерний пептид (лінкер 1), домен МН моноклонального антитіла, що здатне зв'язуватися або з другим епітопом (якщо такий перший поліпептидний ланцюг містить Мі гдс-з), або з доменом (610) МН моноклонального антитіла, що здатне зв'язуватися з першим епітопом (якщо такий перший поліпептидний ланцюг містить Мі епітоп г), другий проміжний спейсерний пептид (лінкер 2), що необов'язково містить цістеїновий залишок домену, який сприяє утворенню гетеродимеру, та С- кінець (Фіг. 1).
Другий поліпептидний ланцюг за варіантом здійснення біспецифічних одновалентних діатіл містить, у напрямку від М-кінця до С-кінця, М-кінець, домен МІ моноклонального антитіла, що здатне зв'язуватися з ГАС-3 або доменом Мі моноклонального антитіла, що здатне зв'язуватися з другим епітопом (тобто або Мі гдсз, або Мі епітоп2, і Мі, що є доменом, який не вибраний для включення у перший поліпептидний ланцюг антитіла), проміжний лінкерний пептид (лінкер 1), домен МН моноклонального антитіла, що здатне зв'язуватися або з другим епітопом (якщо такий другий поліпептидний ланцюг містить Мі дс-з), або з доменом МН моноклонального антитіла, що здатне зв'язуватися з | АС-3 (якщо такий другий поліпептидний ланцюг містить Мі зпитоп г), другий проміжний спейсерний пептид (лінкер 2), що необов'язково містить цістеїновий залишок домену, який сприяє утворенню гетеродимеру, та С-кінець (Фіг. 1).
Найбільше переважно, довжину проміжного лінкерного пептиду (наприклад, лінкера 1), який розділяє такі домени МІ і МН) вибирають таку, щоб практично або повністю попередити зв'язування доменів МІ. ї МН поліпептидного ланцюга один з одним. Таким чином, домени МІ і
МН першого поліпептидного ланцюга практично або повністю не здатні зв'язуватися один з одним. Аналогічно, домени МІ. і МН другого поліпептидного ланцюга практично або повністю не здатні зв'язуватися один з одним. Переважний проміжний спейсерний пептид (лінкер 1) має послідовність (ЗЕО ІЮ МО:88): ОСО5ОСОО.
Довжину та склад другого проміжного лінкерного пептиду (лінкер 2) вибирають на основі вибору доменів, які сприяють утворенню гетеродимеру. Зазвичай, другий проміжний лінкерний пептид (лінкер 2) буде містити 3-20 амінокислотних залишків. Так, зокрема, якщо домени, які сприяють утворенню гетеродимеру, не містять цистеїновий залишок, то використовують другий проміжний лінкерних пептид (лінкер 2), що містить цистеїн. Другий проміжний спейсерний пептид (лінкер 2), що містить цистеїн, буде містити 1, 2, З або більше 3 цистеїнових залишків.
Переважний спейсерний пептид (лінкер 2), що містить цистеїн, має послідовність (ЗЕ ІЮ
МО:89): СсСОо(оо. Альтернативно, лінкер 2 не містить цистеїн (наприклад, 500, (0305 (З5ЕО ІЮ
МО:90), ГГ ацвкева (5ЕО ІЮ МО:С91), ООБВБОВОСКОВИСОЯ (5ЕБО ОО МО:92), А5ТКа (5ЕО ІО МО:93),
ГЕРК55З (ЗЕО ІО МО:94), АРЗ55 (ЗЕО ІО МО:95) і т. д.), і тоді, як описано нижче, застосовують домен, що містить цистеїн, який сприяє утворенню гетеродимеру. Необов'язково, застосовують як лінкер 2, що містить цистеїн, так і домен, що містить цистеїн, який сприяє утворенню гетеродимеру.
Домени, які сприяють утворенню гетеродимеру, можуть являти собою СМЕРКЗС (5ЕО ІЮ
МО:96), або МЕРК5С (ЗЕО ІЮ МО:97), або АЕРК5БС (5ЕО ІЮ МО:98) на одному поліпептидному ланцюгу та СЕМКОЕС (5ЕО ІЮ МО:99) або ЕМКОЕС (5ЕО ІЮО МО:100) на іншому поліпептидному ланцюгу (И52007/0004909).
Більше переважно, тим не менш, домени таких діатіл, які сприяють утворенню гетеродимеру, утворюються з одного, двох, трьох або чотирьох тандемно повторюваних спіральних доменів з протилежним зарядом, які містять послідовність щонайменше з шести, щонайменше з семи або щонайменше з восьми амінокислотних залишків, так щоб домен, який сприяє утворенню гетеродимеру, мав повний заряд (Арозіоіоміс, В. еї а!І(2008) "рРН-Зепвймйу ої
Ше ЕЗ/КЗ Негегодітегіс Сойеа Сої, " Віотасгоптоїесшез 9:3173-3180; Атаї, К.М. еї аї. (2001) "Неїїх-етабіїгей Ем (п5Ем) Апіїроду Егадтепів: Зирвійшіпу Ше Сопвіапі Юотаїпв ої а Рар
Егадтепі ог а Неїегодітегіс Сойеа-соїї ботаїп, " У. Моїес. Віої. 312:221-228; Ага, К.М. еї аї. (2002) "Сотрагівоп ої п Мімо Зеїесіоп апа Ваїйопа! Оезідп ої Неїегодітегіс Соїйей Соїв, " зігисіцге 10:1235-1248; Воиснег, б. єї а. (2010) "Ргоївіп Оєїесіюп Ву М/езіет Віої Міа Соїєа-СоїЇ
Іпсегасіоп5, " Апаїуйса! Віоспетівігу, 399:138-140; Сасніа, Р.9. єї аї. (2004) "Бупіпеїййс Реріїде
Массіпе ОемеІортепі: Меазитетепі ОЇ Роїусіопа! Апіроду Айіпйу Апа Сто55-Неасіїміу Овіпда А
Мем Реріїде Саріиге Апа КеїЇєазе Зузіет Рог Зи!йгпасе Ріазтоп Кезопапсе 5ресігозсору, " 9. Мої.
Весодпії. 17:540-557; Ое Стезсеп2о, С.О. єї а. (2003) "ВеаІ-Тіте Мопіюгіпу ої Ше Іпіегасійп5 ої
Тмо-5ігапдед де помо Оезідпей Сойеа-Соїїє: ЕМесі ої СБаійп Гепдій оп їШе Кіпеїїс апа
Тпепподупатіс Сопеіапів ої Віпаїіпод, " Віоспетівігу 42:1754-1763; Регтапаеє2-Ноагідиег, «5. еї аї. (2012) ""пдисед Неїегодітегігайоп Апа Ригіїїсайоп ОЇ Тмо Тагаєї Ргоївїнз Ву А БЗупінеїїс Соїйва-
СоїЇ Тад, " Ргоївіп 5сіепсе 21:511-519; Сспози, Т.5. єї а). (2009) "Епа-То-Епа Апа Епа-То-Мідае
Іптетпеїїса! Іпіегасіоп5: Мем/ Сіаззе5 ОЇ Іпіегасііїпуд Неїїх Раїг5 Іп Ргоївіп Зігисіиге5, " Асіа
СтузіаПодгарніса 065:1032-1041; Стідогуап, Сх. єї аї. (2008) "Бігисіига! Зресіїйсну Іп Соїйеа-СоїЇ
Іпіегасіоп5, " Си. Оріп. Бігис. Віої. 18:477-483; | йому5Кі, У.А. єї аї. (2002) "Оезідпіпд
Неїегодітегіс Глуо-зігапдей со-Неїїса! Соїйеа-Соїїє: Те ЕПесі5 ОЇ Нуйгорпобісйу Апа а-Неїсаї! (610) Ргореп5зйу Оп Ргоївіп ЕРоїдіпд, еїФарішу, Апа Зресійсйу, " 9. Віої. Спет. 277:37272-37279;
зівіпКгидег, 9.0. еї аї. (2012) "Тпе а'--а--а4 Мепіса! Тгіай і5 Ге55 Оі5согітіпайпуд Тпап ї(ЖїТе а'--а--а'
Мепіса! Тіїайд іп Шїе АпіїрагаїІє!Ї Сойеа-соїЇ Оітег Моїй, "У. Атег. Спет. ос. 134(5):2626-2633; зігаиззтап, В. еї аї. (2007) "КіпКіпд їе Соїйеа Соїї - Медаїїмему Спагдед Везідиез аї Ше Соїїва- сої! Іпіегасе, " У. Моїес. Віої. 366:1232-1242; Тііреї, В. еї аї. (2002) "Кіпеїїс Апаїувів ої Ше
Іптегасіоп5 рбеїмеєп Тгоропіп С апа Ше С-іегтіпа! Тгоропіп І Недиіайгу Ведіоп апа Маїїдайопої а
Мем Рерійде Оеїїмегу/Саріиге Бузіет изей ог Бигасе Ріазтоп Кезопапсе, " у. Моїес. Віо). 323:345-362; Мооїївоп, О.М. (2005) "Тпе Оевзідп ОЇ Сойеа-Сої! Бігисіиге5 Апа Аззетрбіїев5, " Адм.
Ргої. Спет. 70:79-112; 7епа, У. єї аї. (2008) "А І ідапа-Рзейдогесеріог Зувієт Вазед Оп де помо
Резідпед Реріїде5 Бог Те Сепегайоп ОЇ Адепоміга! Месіог5 Умій АКегей Тгоріхт, " у). Сепе Меа. 10:355-367).
Такі повторювані спіральні домени можуть бути точними повторами або можуть мати заміни.
Наприклад, спіральний домен домену, який сприяє утворенню гетеродимеру, першого поліпептидного ланцюга може містити послідовність з восьми амінокислотних залишків, вибраних для надання негативного заряду такому домену, який сприяє утворенню гетеродимеру, а спіральний домен домену, що сприяє утворенню гетеродимеру, другого поліпептидного ланцюга може містити послідовність з восьми амінокислотних залишків, вибраних для надання позитивного заряду такому домену, який сприяє утворенню гетеродимеру. Не має значення, яка спіраль передбачена для першого або другого поліпептидних ланцюгів за умови, що, якщо в обох поліпептидних ланцюгах представлені такі домени, які сприяють утворенню гетеродимерів, то для іншого поліпептидного ланцюга використовується спіраль з протилежним зарядом. Позитивно заряджена амінокислота може являти собою лізин, аргінін, гістидин і т. д., йабо негативно заряджена амінокислота може являти собою глутамінову кислоту, аспарагінову кислоту та т. д. Позитивно заряджена амінокислота переважно являє собою лізин, і/або негативно заряджена амінокислота переважно являє собою глутамінову кислоту. Можна використовувати тільки один домен, який сприяє утворенню гетеродимеру, (оскільки такий домен буде інгібувати гомодимеризацію та тим самим сприяти гетеродимеризації), тим не менш, переважно, щоб домени, які сприяють утворенню гетеродимеру, містили як першу, так і другу поліпептидні ланцюги діатіл за даним винаходом.
Відповідно до переважного варіанта здійснення, один з доменів, які сприяють утворенню гетеродимеру, буде містять чотири тандемних спіральних домени з "Е-спіралями" (ЗЕО ІЮ
МО:101: ЕМААІ ЕК-ЕМААГ ЕК-ЕМААГ ЕК-ЕМААГ ЕК), глутаматні залишки яких утворюють будуть формувати негативний заряд при рнН 7, у той час як інший з доменів, які сприяють утворенню гетеродимеру, буде містити чотири тандемних спіральних домени з "К-спіралями" (ЗЕО ІЮ
МО:102: КМААЇ КЕ-КМААЇ КЕ-КУААЇ КЕ-КМААЇ КЕ), лізинові залишки яких будуть утворювати позитивний заряд при рН 7. Наявність таких заряджених доменів сприяє асоціації між першим і другим поліпептидами та, відповідно, сприяє утворенню гетеродимеру. Особливо переважним є домен, який сприяє утворенню гетеродимеру, в якому один з чотирьох тандемних спіральних доменів з "Е-спіраллю" з ЗЕО ІЮ МО:101 був модифікований з включенням цистеїнового
ЕУМААСЕК-ЕМААТЕК-ЕМААТЕК- ЕУМААІВК Ззалишку - й-т тот - т- -6 (5ЕБЕО ІО МО:103). Аналогічно, особливо переважним є домен, який сприяє утворенню гетеродимеру, в якому один з чотирьох тандемних спіральних доменів з "К-спіраллю" з 5БЕО І МО: 102 був модифікований з . КУААСКЕ-КУААЇКЕ-КУААЇТКЕ-КУААТКЕ включенням цистеїнового залишку: - по - -- -- - (ЗЕО ІОЮ МО:104).
У УМО 2012/018687 розкрито, що для покращення фармакокінетичних властивостей іп мімо діатіл діатіло можна модифікувати з включенням поліпептидної частини білка, що зв'язується у сироватці, на одному або декількох кінцях діатіла. Найбільше переважно, така поліпептидна частина білка, що зв'язується у сироватці, буде вбудована у С-кінець діатіла. Альбумін є найбільше поширеним білком у плазмі та має період напівжиття у людей, що становить 19 днів.
Альбумін має декілька сайтів зв'язування малих молекул, які дозволяють йому нековалентно зв'язуватися з іншими білками та тим самим продовжувати їх період напівжиття у сироватці.
Альбумін-зв'язуючий домен З (АВОЗ) білка С з штаму 5148 5ігеріососси5 складається з 46 амінокислотних залишків, що утворюють стабільний триспіральний пучок, і має широку альбумін-зв'язуючу специфічність (Чдопап5зоп, М.О. еї аІ.(2002) "Зігисіцге, Зресіїйсйу, Апа Моде
ОГ Іпіегасіїоп Рог Васієїта! АІритіп-Віпдіпд Модиев, " у. Віої. Спет. 277(10):8114-8120. Таким чином, особливо переважна поліпептидна частина білка, що зв'язується у сироватці, для покращення фармакокінетичних властивостей іп мімо діатіла являє собою альбумін-зв'язуючий домен (АВО) з стрептококового білка б і більше переважно альбумін- зв'язуючий домен З
(АВОЗ) білка б з штаму 5148 Бігеріососсиз (5ЕО ІЮО МО: 105): І АЕАКМІ АМАЕ ЕІ ОКУОУЗОУ
УКМІЛОМАКЬ АЕСМКАПОЕ ІГААЇ Р.
Як розкрито у МО 2012/162068 (що включена у даний документ за допомогою посилання), "деімунізовані" варіанти ЗЕО ІЮ МО: 105 мають здатність послаблювати або виключати зв'язування з МНС ІІ класу. Виходячи з результатів комбінаційної мутації, наступні комбінації замін вважають переважними замінами для утворення такого деімунізованого АВО: 660/7055471А; 665/705-71А; 665/705-79А; 64А/65А/71А; 64А/65А/71А-665; 64А/65А/71А-660; 64А/65А/71А466Е; 64А/65А/79А-665; 64А/65А/79А-660; 64А/65А/79А66Е. Варіантні АВО, що мають модифікації І64А, ІЄ5БА та 079А або модифікації МбЄб65, 71705 і 079А. Варіантний деімунізований АВО, має амінокислотну послідовність:
ГАБАКУГАМВ БІрКтусСУБрУ ТКЕМОтОб6МАКкВооАНЛЕСУКАТІЮЕ ІГААГР (ЗО ях
МО:106), або амінокислотну послідовність:
ГАБАКУГАМВ ЕГОКтТСУВОУ УЕМАсаАсоММАКТ УВСУКАТІА»Е ІГААГР (ЗО І
МО:107), або амінокислотну послідовність:
ПАБАКУГПАМЕ ВЕПОКтТСУВруУ ТЕМПІ Во6МАКкелоУВСУКАГІА»7 В ІГААТР (ЗО 0
МО:108), особливо переважні, оскільки такі деімунізовані АВО характеризуються зв'язуванням, що практично дорівнює дикому типу, при цьому забезпечуючи ослаблене зв'язування з МНС Іі класу. Таким чином, перший поліпептидний ланцюг такого діатіла, що має АВО, містить третій лінкер (лінкер 3), що переважно розташований на С-кінці відносно домену з Е-спіраллю (або К- спіраллю) такого поліпептидного ланцюга з тим, щоб перебувати між доменом з Е-спіраллю (або К-спіраллю) і АВО (який переважно є деімунізованим АВО). Переважною послідовністю для такого лінкера З є БЕО ІЮО МО:90: 56505. 2. Біспецифічні діатіла, що містять Ес-ділянку
Один варіант здійснення даного винаходу відноситься до біспецифічних діатіл, що містить
Ес-ділянку, яка здатна одночасно зв'язуватися з ГАО-3 та другим епітопом (наприклад, В7-НЗ,
В7-Н4, ВТ А, Сб040, 2080, 086, СО137, СТІ А-4, ІСО5, КІК, МНС І або ІІ класса, ОХ40, РО-1,
РО-І1, ТОВ, ТІМ-3 та т. д.). Додавання домену СН2-СНЗ дО в один або обидва з поліпептидних ланцюгів діатіла, так щоб утворення комплексу між ланцюгами діатіла призводило у результаті до утворення Ес-ділянки, збільшує біологічний період напівжиття та/або змінює валентність діатіла. Включення домену СН2-СНЗ дб в обидва поліпептиди діатіла буде забезпечувати утворення дволанцюжкового біспецифічного діатіла, що містить Ес-ділянку (Фіг. 2).
Альтернативно, включення домену СН2г-СНЗ |дс тільки в один поліпептид діатіла забезпечує утворення більш складного чотирьохланцюжкового біспецифічного діатіла, що містить Ес-ділянку (Фіг. ЗА-3С). На Фіг. ЗС показане типове чотирьохланцюжкове діатіло, що має константний домен легкого ланцюга (СІ) і константний домен важкого ланцюга СНІ, тим не менш, як альтернативу можна використовувати фрагменти таких доменів, а також інші поліпептиди (див., наприклад, Фіг. ЗА та ЗВ, патентні публікації США МоМо 2013-0295121, 2010- 0174053 та 2009-0060910; публікації європейських патентів ЕР 2714079, ЕР 2601216, ЕР 2376109, ЕР 2158221 і РСТ публікації УМО 2012/162068, УМО 2012/018687, УМО 2010/080538).
Таким чином, наприклад, замість домену СНІ можна використовувати пептид з амінокислотною послідовністю ЗМЕРКЗС (5ЕО ІЮ МО:96) МЕРКЗС (5ЕО ІО МО:97) або АЕРКБ5С (5ЕО ІЮО МО:98), що одержаний з шарнірного домену до людини, а замість домену СІ. можна використовувати б
С-кінцевих амінокислот легкого каппа-ланцюга людини, ЗЕМЕСЕС (ЗЕО ІЮ МО:99) або ЕМАСЕС (ЗЕО ІЮ МО:100). Типове чотирьохланцюжкове діатело, що містить пептид, показано на Фіг. ЗА.
Як альтернатива або на додаток, можна використовувати пептид, що містить тандемні спіральні домени з протилежним зарядом, такі як спіральні домени з "Е-спіраллю" (5ЕО ІЮ МО:101:
ЕУААТЕК-ЕУААТЕК-ЕУААТЕК-ЕУААТЕК або 5КО І МО:103: ЕУААСЕК-
ЕМААТЕК-ЕУААТЕК-ЕМААТЕК); 1 домени з «К-спіраллю» (6ЕОПОМО:102: КУААТКЕ-
КУААТІКЕ-КУААЇІКЕ-КУААТКЕ або БЕОПОУМО:104: КУААСКЕ-КУААТКЕ-КУААТКЕ-
БО КУААТКЕ).
Типове чотирьохланцюжкове діатіло, що містить домен, який містить спіраль, показане на Фіг.
ЗВ.
Молекули діатіл, що містять Ес-ділянку, за даним винаходом зазвичай включають додаткові проміжні лінкерні пептиди (лінкери). Зазвичай, додаткові лінкери будуть містити 3-20 амінокислотних залишків. Додаткові або альтернативні лінкери, які можна використовувати у молекулах діатіл, що містять Ес-ділянку, за даним винаходом, включають: оО5 (5ЕБЕО ІЮ
МО:90), ГГ ацвкева (5ЕО ІЮ МО:С91), ООБВБОВОСКОВИСОЯ (5ЕБО ОО МО:92), А5ТКа (5ЕО ІО МО:93),
ОКТНТСРРСР (5ЕО ІЮ МО:109), ГЕРКЗ5 (5ЕО ІО МО:94), АРБЗ55 (5ЕО ІЮО МО:95) иАР555РМЕ (ЗБЕО І МО:110), ГЕРКБАЮОКТНТСРРСО (5БО ІЮО МО: 111), БОС і боб. Для полегшення клонування можна застосовувати 5ЕО ІЮ МО:94 замість БОС або СОС. Крім того, після амінокислотної послідовності (3050 або 5ЕО ІЮ МО:94 може відразу ж слідувати 5ЕО ІЮ МО: 109 для утворення альтернативних лінкерів: СОСОК ТНТІСРРСР (5БО ІЮО МО:112); і
ГЕРКЗБОКТНТСРРОСР; (5ЕО ІО МО:113). Молекула діатела, що містить Ес-ділянку, за даним винаходом може включати шарнірну ділянку ДО на додаток до лінкера або замість нього.
Ілюстративні шарнірні ділянки включають: варіант шарніра ЕРК5ЗСОКТНТСРРСР (5ЕО І
МО:114) з ІД01, ЕККССУЕСРРСР (5ЕО ІО МО:115) з І952, ЕБКУСРРСОСРБСР (5ЕО ІО МО:116) з
Ід54 та ЕБКУОРРСРРСР (5ЕБО ІО МО:117) з Ід054, що містить стабілізуючу заміну для зменшення обміну ланцюгами.
Як наведено на Фіг. ЗА-3С, діатіла за даним винаходом можуть містити чотири різних ланцюги. Перший і третій поліпептидні ланцюги такого діатіла містять три домени: (ї) домен, що містить МІ-1 (ії) домен, що містить МІ 2, (іїї) домен, що сприяє утворенню гетеродимеру, та (ім) домен, що містить послідовність СН2-СНЗ. Другий і четвертий поліпептидні ланцюги містять: (і) домен, що містить МІ2, (і) домен, що містить МН, їі (ії) домен, що сприяє утворенню гетеродимеру, причому домени, що сприяють утворенню гетеродимеру, сприяють димеризації першого/третього поліпептидних ланцюгів з другим/четвертим поліпептидними ланцюгами.
Домени МІ і/або МН третього та четвертого поліпептидних ланцюгів і домени МІ і/або УНН першого та другого поліпептидних ланцюгів можуть бути однаковими або розрізнятися для забезпечення чотирьохвалентного зв'язування, яке є або моноспецифічним, або біспецифічним, або тетраспецифічним. Позначення "МІ 3" та "МНЗ" позначають відповідно варіабельний домен легкого ланцюга та варіабельний домен важкого ланцюга, які зв'язують "третій" епітоп такого діатіла (епітоп 3"). Аналогічним чином, позначення "МІ 4" та "МН." позначають відповідно варіабельний домен легкого ланцюга та варіабельний домен важкого ланцюга, які зв'язують "четвертий" епітоп такого діатіла ("епітоп 4"). Загальна структура поліпептидних ланцюгів типових чотирьохланцюжкових діатіл, що містять Ес-ділянку, за даним винаходом представлена у таблиці 2:
Таблиця 2 специфічне тетраспецифічне
НРО - домен що, сприяє утворенню гетеродимеру
Відповідно до конкретного варіанта здійснення, діатіла за даним винаходом є біспецифічними, чотирьохвалентними (тобто мають чотири епітоп-зв'язуючі сайти), діатілами, що містять Ес, (Фіг. ЗА-3С), які складаються з чотирьох повних поліпептидних ланцюгів.
Біспецифічні, чотирьохвалентні діатіла, що містять Ес, за даним винаходом містять два епітоп- зв'язуючі сайти, що є імуноспецифічними до І Ас-3 (які можуть бути здатні зв'язуватися з одним і тим самим епітопом ГГ АС-3 або з різними епітопами ГГ АС-3), та два епітоп-зв'язуючі сайти, що є специфічними до другого епітопу (наприклад, В7-НЗ, В7-Н4, ВТІ А, 2040, СОр80, С086, СО0137,
СТІ А-4, ІСО5, КІР, МН І або ІІ класу, ОХ40, РО-1, РО-І1, ТОВ, ТІМ-3 і т. д.).
Відповідно до додаткового варіанта здійснення, біспецифічні діатіла, що містять Ес-ділянку, можуть містити три поліпептидні ланцюги. Перший поліпептид такого діатіла містить три домени: (|) домен, що містить МІ1, (її) домен, що містить МІ2 та (ії) домен, що містить послідовність СН2-СНЗ. Другий поліпептид таких діатіл містить: (ї) домен, що містить МІ 2 (ії)
домен, що містить Мі 1 і (ії) домен, який сприяє гетеродимеризації та ковалентному зв'язуванню першого поліпептидного ланцюга діатіла. Третій поліпептид таких діатіл містить послідовність
СН2-СНЗ. Таким чином, перший і другий поліпептидні ланцюги таких діатіл об'єднуються разом з утворенням сайту зв'язування МІ 1//Н/1, який здатний зв'язуватися з першим епітопом, а також сайту зв'язування МІ/2//Н2, який здатний зв'язуватися з другим епітопом. Перший і другий поліпептиди зв'язані один з одним за допомогою дисульфідного зв'язку за участю цистеїнових залишків в їх відповідних третіх доменах. Слід зазначити, що перший і третій поліпептидні ланцюги об'єднуються у комплекс один з одним з утворенням Ес-ділянки, яка стабілізована дисульфідним зв'язком. Такі діатіла мають підвищену активність. На фіг 4А та 4В показані структури таких діатіл. Такі біспецифічні діатела, що містять Ес-ділянку, можуть мати будь-яку з двох орієнтацій (таблиця 3):
Таблиця З
Перша орієнтація друга орієнтація
НРО - домен, що сприяє утворенню гетеродимеру
Відповідно до конкретного варіанта здійснення, діатіла за даним винаходом є біспецифічними, двовалентними (тобто мають два епітоп-зв'язуючі сайти), діатілами, що містять
Ес, (Фіг. 4А-4ЩВ), які складаються з трьох повних поліпептидних ланцюгів. Біспецифічні, двовалентні діатіла, що містять Ес, за даним винаходом містять один епітоп-зв'язуючий сайт, імуноспецифічний до ГАС-3, та один епітоп-зв'язуючий сайт, специфічний до другого епітопу (наприклад, В7-НЗ, В7-Н4, ВТ А, 2040, СОр80, 2086, СО137, СТІ А-4, ІСОБ5, КІВ, ГАа-3 МН І або ІІ класу, ОХ40, РО-11, ТОВ, ТІМ-3 та т. д.).
Відповідно до наступного варіанта здійснення, біспецифічні діатіла, що містять Ес-ділянку, можуть містити всі п'ять поліпептидних ланцюгів. Відповідно до конкретного варіанта здійснення, два із зазначених п'яти поліпептидних ланцюгів мають однакову амінокислотну послідовність. Перший поліпептидний ланцюг таких діател включає: (ії) домен, що містить УНІ, (і) домен, що містить СНІ, і (ії) домен, що містить послідовність СН2-СНЗ. Перший поліпептидний ланцюг може являти собою важкий ланцюг антитіла, який містить МУНІ і константну ділянку важкого ланцюга. Другий і п'ятий поліпептидні ланцюги таких діатіл містять: () домен, що містить МІ 1 і (її) домен, що містить СІ. Другий і/або п'ятий поліпептидні ланцюги таких діатіл можуть являти собою легкі ланцюги антитіла, які містять М 1, комплементарний
МНІ першого/третього поліпептидного ланцюга. Перший, другий і/або п'ятий поліпептидні ланцюги можна виділити з природних антитіл. Альтернативно, їх можна сконструювати рекомбінантними способами. Третій поліпептидний ланцюг таких діатіл містить: (ї) домен, що мітить МН (ії) домен, що мітить СНІ, (ії) домен, що містить послідовність СН2-СНЗ, (ім) домен, що мітить МІ 2, (м) домен, що мітить МНЗ та (мі) домен, що сприяє утворенню гетеродимеру, де
З5 домени, що сприяють утворенню гетеродимеру, сприяють димеризації третього ланцюга з четвертим ланцюгом. Четвертий поліпептид таких діатіл містить: (ї) домен, що містить МІ 3, (ії) домен, що містить МН2 та (ії) домен, який сприяє гетеродимеризації та ковалентному зв'язуванню третього поліпептидного ланцюга діатіла.
Таким чином, перший і другий, а також третій і п'ятий поліпептидні ланцюги таких діатіл об'єднаються разом з утворенням двох зв'язуючих сайтів МІ 1//НІ1, що здатні зв'язувати перший епітоп. Третій і четвертий поліпептидні ланцюги таких діатіл об'єднуються разом з утворенням сайту зв'язування МІ/2//Н2, який здатний зв'язуватися з другим епітопом, а також сайту зв'язування МІ З//НЗ, який здатний зв'язуватися з третім епітопом. Перший і третій поліпептиди зв'язані один з одним за допомогою дисульфідного зв'язку за участю цистеїнових залишків у їх відповідних константних ділянках. Слід відзначити, що перший і третій поліпептидні ланцюги об'єднуються у комплекс один з одним з утворенням Ес-ділянки. Такі діатіла мають підвищену активність. На Фіг. 5 показана структура таких діатіл. Слід розуміти, що домени МІ1Л/нН1,
МІ2/Л/Н2 та МІЗЛ/НЗ можуть бути однаковими або відрізнятися для забезпечення зв'язування, яке є моноспецифічним, біспецифічним або триспецифічним.
Тим не менш, як представлене у даному документі, такі домени переважно вибрані так, щоб зв'язувати ГАС-3 та другий епітоп (або другий і третій епітоп (наприклад, В7-НЗ, В7-Н4, ВІТА,
Сраб, Сбо080, 0086, 20137, СТІ А-4, ІСОБ5, КІВ, І АС-3 МНС І або ІІ класу, ОХ40, РО-І 1, ТОВ,
ТІМ-3 та т. д.). Другий і третій епітопи можуть бути різними епітопами однієї і тієї ж молекули антигена або можуть бути епітопами різних молекул антигена. Такі аспекти даного винаходу більш докладно розглянуті нижче.
Таким чином, домени Мі і МН поліпептидних ланцюгів вибрані таким чином, щоб утворювалися сайти зв'язування МІ/Л/Н, що специфічні до необхідних епітопів. Сайти зв'язування МІ//Н, що утворені у результаті зв'язування поліпептидних ланцюгів, можуть бути однаковими або відрізнятися для забезпечення чотирьохвалентного зв'язування, яке є моноспецифічним, біспецифічним, триспецифічним або тетраспецифічним. Зокрема, домени МІ. і МН можуть бути вибрані таким чином, щоб біспецифічне діатіло могло містити два сайти зв'язування до першого епітопу та два сайти зв'язування до другого епітопу, або три сайти зв'язування до першого епітопу та один сайт зв'язування до другого епітопу, або два сайти зв'язування до першого епітопу, один сайт зв'язування до другого епітопу та один сайт зв'язування до третього епітопу (як показано на Фіг. 5). Загальна структура поліпептидних ланцюгів типових п'ятиланцюжкових діатіл, що містять Ес-ділянку, за даним винаходом представлена у таблиці 4:
Таблиця 4
Бі сини специфічне (зх 7)
Триспецифічне (22 ланцюг |МНеУНІСНІСНасНУСооН 01010111 х1х1)
НРО - домен, що сприяє утворенню гетеродимеру
Відповідно до конкретного варіанта здійснення, діатіла за даним винаходом є біспецифічними чотирьохвалентними (тобто мають чотири епітоп-зв'язуючі сайти) діатілами, що містять Ес, які складаються з п'яти повних поліпептидних ланцюгів, що мають два сайти зв'язування до першого епітопу та два сайти зв'язування до другого епітопу. Відповідно до одного варіанта здійснення, біспецифічні чотирьохвалентні діатела, що містять Ес, за даним винаходом містять два епітоп-зв'язуючі сайти, що імуноспецифічні до ГАС-3 (які можуть бути здатні зв'язуватися з одним і тим самим епітопом І АС-3 або з різними епітопами ГАС-3), і два епітоп-зв'язуючі сайти, що специфічні до другого епітопу (наприклад, В7-НЗ, В7-Н4, ВТІ А, СО40,
Сорво,сб086, 20137, СТІ А-4, ІСО5, КІВ, ГГ АС-3 МН І або ІІ класу, ОХ40, РО-І1, ТСВ, ТІМ-3 та т. д.). Відповідно до іншого варіанта здійснення, біспецифічні чотирьохвалентні діатіла, що містять Ес, за даним винаходом містять три епітоп-зв'язуючі сайти, що імуноспецифічні до ГАс-
З (які можуть бути здатні зв'язуватися з одним і тим самим епітопом ГАС-3 або з різними епітопами ГАС-3), та один епітоп-зв'язуючий сайт, що специфічний до другого епітопу (наприклад, В7-НЗ, В7-Н4, ВТ А, 2040, С0р80, 2086, 20137, СТІ А-4, ІСОБ5, КІВ, ГАа-3 МН І або ІЇ класу, ОХ40, РО-І1, ТСВА, ТІМ-3 та т. д.). Відповідно до іншого варіанта здійснення, біспецифічні чотирьохвалентні діатіла, що містять Ес, за даним винаходом містять один епітоп- зв'язуючий сайт, що іммуноспецифічний до ГАс-3, та три епітоп-зв'язуючі сайти, що специфічні до другого епітопу (наприклад, В7-НЗ, В7-Н4, ВТІ А, 040, СО80, С086, СО137, СТІ А-4, ІСОБ,
КІВ, ГАС-3 МНЄ І або ІІ класу, ОХ40, РО-І 1, ТСВ, ТІМ-3 і т. д.). 3. Біспецифічні тривалентні зв'язуючі молекули, що містять Ес-ділянки
Ще один варіант здійснення даного винаходу відноситься до біспецифічних тривалентних зв'язуючих молекул, що містять Ес-ділянку, та здатні одночасно зв'язуватися з першим 5О0 епітопом, другим епітопом і третім епітопом, причому щонайменше один із таких епітопів не ідентичний іншому з таких епітопів. Таким чином, такі біспецифічні діатіла містять домени "МІ/15/«МНІ1", які здатні зв'язуватися з першим епітопом, домени "Мі 25/«МН2", які здатні зв'язуватися з другим епітопом, і домени "Мі 35/«УНЗ", які здатні зв'язуватися з третім епітопом.
Відповідно до одного варіанта здійснення, один або два з таких епітопів є епітопом ГАс-3, а інший (або інші) з таких епітопів не є епітопом ГАС-3 (наприклад, епітопом В7-НЗ, В7-Н4, ВТІ А,
Сраб, Сбр80, 2086, 20137, СТІ А-4, ІСО5, КІВ, І АС-3, МНС І або ІІ класу, ОХ40, РО-1, РО-І 1,
ТОВ, ТІМ-3 і т. д.). Такі біспецифічні тривалентні зв'язуючі молекули містять три епітоп-зв'язуючі сайти, два з яких є зв'язуючими доменами за типом діатіла, які забезпечують сайт зв'язування А та сайт зв'язування В, і один з яких є зв'язуючим доменом, що не відносяться за типом діатіла, який забезпечує сайт зв'язування С (див., наприклад, Фіг. бА-бЕ, і РСТ заявки Мо:
РСТ/О515/33081 і РСТ/О515/33076).
Зазвичай, тривалентні зв'язуючі молекули за даним винаходом будуть містити чотири різних поліпептидних ланцюги (див. Фіг. бА-68), тим не менш, молекули можуть містити меншу або більшу кількість поліпептидних ланцюгів, наприклад, у результаті злиття таких поліпептидних ланцюгів один з одним (наприклад, за допомогою пептидного зв'язку), або у результаті "розподілу" таких поліпептидних ланцюгів з утворенням додаткових поліпептидних ланцюгів, або у результаті зв'язування меншої кількості або додаткових поліпептидних ланцюгів за допомогою дисульфідних зв'язків. На Фіг. 68-6Е наведена ілюстрація цього аспекту даного винаходу, на якій схематично зображені такі молекули з трьома поліпептидними ланцюгами. Як представлено на Фіг. б6А-6Е, тривалентні зв'язуючі молекули за даним винаходом можуть мати альтернативні орієнтації, в яких зв'язуючі домени за типом діатіла є М-кінцевими (Фіг. бА, 6С та 60) або С-кінцевими (Фіг. 6В, 6Е та 6Е) відносно Ес-ділянки.
Відповідно до деяких варіантів здійснення, перший поліпептидний ланцюг таких тривалентних зв'язуючих молекул за даним винаходом містить: (ї) домен, що містить МІ, (ії) домен, що містить Мі 2, (ії) домен, що сприяє утворенню гетеродимеру та (ім) домен, що містить послідовність СН2-СНЗ. Домени МІ/1 ї МІ2, що розташовані на М-кінці або С-кінці відносно домену, що містить СН2-СНЗ, як представлено у таблиці 5 (Фіг. бА та 6В). Другий поліпептидний ланцюг таких варіантів здійснення містить: (ї) домен, що містить Мі 2, (ії) домен, що містить МНІ, і (її) домен, що сприяє утворенню гетеродимеру. Третій поліпептидний ланцюг за такими варіантами здійснення містить: (ї) домен, що містит УНЗ, (ії) домен, що містить СНІ, і (ії) домен, що містить послідовність СН2-СНЗ. Третій поліпептидний ланцюг може являти собою важкий ланцюг антитіла, який містить МНЗ та константну ділянку важкого ланцюга. Четвертий поліпептид за такими варіантами здійснення містить: (ії) домен, що містить МІ 3, та (ії) домен, що містить СІ. Четвертий поліпепгидний ланцюг може являти собою легкий ланцюг антитіла, який містить МЗ3, комплементарний МНЗ третього поліпептидного ланцюга. Третій або четвертий поліпептидні ланцюги можна виділити з природних антитіл. Альтернативно, їх можна сконструювати рекомбінантними, синтетичними або іншими способами.
Варіабельні домени легкого ланцюга з першого та другого поліпептидних ланцюгів відокремлені від варіабельних доменів важкого ланцюга з таких поліпептидних ланцюгів проміжним спейсерним лінкером, який має занадто коротку довжину, щоб дозволити їх доменам
МІ1/Л/НАаО (або їх МІ 2/УНІ) зв'язатися разом з утворенням епітоп-зв'язуючого сайту, що здатний зв'язуватися з першим або другим епітопом. Переважний проміжний спейсерний пептид (лінкер 1) для такої мети має послідовність (ЗЕ ІЮ МО:14): ССОо5ОСОО. Інші домени тривалентних зв'язуючих молекул можуть бути розділені одним або декількома проміжними спейсернимі пептидами, що необов'язково містять цистеїновий залишок. Ілюстративні лінкери, що придатні для створення тривалентних зв'язуючих молекул, наведені у даному описі, а також представлені у РСТ заявках РСТ/О515/33081 ії РСТ/О515/33076. Таким чином, перший і другий поліпептидні ланцюги таких тривалентних зв'язуючих молекул об'єднуються разом з утворенням сайту зв'язування МІ 1/Л/НІ1, який здатний зв'язувати перший епітоп, а також сайту зв'язування
МІ 2//Н2, який здатний зв'язуватися з другим епітопом. Третій і четвертий поліпептидні ланцюги таких тривалентних зв'язуючих молекул об'єднуються разом з утворенням сайту зв'язування
МІ.З//НЗ, який здатний зв'язуватися з третім епітопом.
Як описано далі, тривалентні зв'язуючі молекули за даним винаходом можуть містити три поліпептиди. Тривалентні зв'язуючі молекули, що містять три поліпептидні ланцюги, можуть бути одержані шляхом зв'язування доменів четвертого поліпептиду, М-кінцевого у відношенні домену, що містить МНЗ, третього поліпептиду. Альтернативно, використовують третій поліпептидний ланцюг тривалентної зв'язуючої молекули за даним винаходом, що містить наступні три домени: (ї) домен, що містить МІ 3, (ії) домен, що містить МНЗ, та (ії) домен, що 10) містить послідовність СН2-СНЗ, причому МІЗ та МНЗ відокремлені один від одного проміжним спейсерним пептидом, який має достатню довжину (щонайменше 9 або більше амінокислотних залишків), щоб дозволити об'єднання таких доменів з утворенням епітоп-зв'язуючого сайту.
Слід розуміти, що домени МІ 1/Л/НІ1, МІ 2//Н2 та МІ З/Л/НЗ таких молекул діатіл можуть бути однаковими або розрізнятися для забезпечення зв'язування, яке є моноспецифічним, біспецифічним або триспецифічним. Тим не менш, як зазначено у даному документі, такі домени переважно вибрані так, щоб зв'язувати І АС-3 і другий епітоп (або другий і третій епітоп) (переважно, такі епітопи являли собою епітопи В7-НЗ, В7-Н4, ВТІ А, 040, СО80, С086, СО0137,
СТІ А-4, ІСОБ, КІВ, І АС-3 МН І або ІІ класу, ОХ40, РО-І1, ТОВ, ТІМ-3 і т. д.).
Зокрема, домени МІ ії МН можуть бути вибрані таким чином, щоб тривалентна зв'язуюча молекула містила два сайти зв'язування до першого епітопу та один сайт зв'язування до другого епітопу, або один сайт зв'язування до першого епітопу та два сайти зв'язування до другого епітопу, або один сайт зв'язування до першого епітопу, один сайт зв'язування до другого епітопу та один сайт зв'язування до третього епітопу. Загальна структура поліпептидних ланцюгів типових тривалентних зв'язуючих молекул за даним винаходом представлена на Фіг. бА-6Е й у таблиці 5:
Таблиця 5 1-а орієнтація чотирьохланцюгів| З-їйланцюг |МН»МНЗ-СНІ-СНа-СнНУАСООН.Й 77777771. 2-а орієнтація чотирьохланцюгів| З-їйланцюг |МН»МНЗ-СНІ-СНа-СНУАСООН.ЇЛ///7777777/є/є/:/Х:еецч га орієнтація трьох ланцюгів зга орієнтація трьох ланцюгів
НРО - домен, що сприяє утворенню гетеродимеру
Один варіант здійснення даного винаходу відноситься до біспецифічних тривалентних зв'язуючих молекул, які містять два епітоп-зв'язуючі сайти до ГАС-3 та один епітоп-зв'язуючий сайт до другого епітопу, що присутній на молекулі, яка відмінна від ГАС-3 (наприклад, В7-НЗ,
В7-Н4, ВТ А, СбОр40, бОр80, 086, СО137, СТІ А-4, ІСОБ5, КІВ, І АС-3, МНС І або ІІ класу, ОХ40,
РО-І1, ТОВ, ТІМ-3 ії т. д.). Два епітоп-зв'язуючі сайти до ГАС-3 можуть зв'язувати один і той самий епітоп або різні епітопи. Інший варіант здійснення даного винаходу відноситься до біспецифічних тривалентних зв'язуючих молекул, які містять один епітоп-зв'язуючий сайт до
І АД-3 та два епітоп-зв'язуючі сайти, які зв'язують другий антиген, що присутній на молекулі, яка відмінна від ГАС-3 (наприклад, В7-НЗ, В7-Н4, ВТІ А, 2040, СО80, СО086, СО137, СТІ А-4, ІСОБ,
КІВ, ГАС-3, МНС І або ІІ класу, ОХ40, РО-І1, ТОВ, ТІМ-3 і т. д.). Два епітоп-зв'язуючі сайти до другого антигена можуть зв'язувати один і той самий епітоп або різні епітопи антигена (наприклад, однакові або різні епітопи ГАС-3). Як показано вище, такі біспецифічні тривалентні зв'язуючі молекули можуть містити три або чотири поліпептидних ланцюги.
МІ. Константні домени та Ес-ділянки
У даному документі представлені константні домени антитіла, що придатні для створення зв'язуючих ГАС-3 молекул (наприклад, антитіл, діатіл, тривалентних зв'язуючих молекул і т. д.) за даним винаходом.
Переважним доменом Сі є каппа-домен Сі дб людини. Амінокислотною послідовністю ілюстративного каппа-домену Сі. людини є (ЗЕО ІЮ МО 118):
ВТУМААРБУРІ ЕРРБОЕОЇ КЗ аТАБУМСІЇ М МЕМРАЕАКМО МУКМОМАГОБа МЗОЕЗМТЕОО
ЗКОБТУБІ 55 ТІ ТІ ЗКАОМЕ КНКУМАСЕМТ НОСІ 55РУТК 5БЕМАИаЕС
Альтернативно, ілюстративним доменом Сі є лямбда-домен Сі Ідс людини.
Амінокислотною послідовністю ілюстративного каппа-домену Сі. людини є (ЗЕО ІЮ МО:119):
ОРКААРБЗМТІ ЕРРО5БЗБЕБ ОА МКАТІ МСІІ5 ОЕГЕМРЕАМТМА МУКАОБЗРУКА аМЕТТРУКО5
ММКУААБОМІ ЗІ. ТРЕОМУКЗН АЗУЗСОМТНЕ СЗТМЕКТМУАР
ТЕС5
Як представлено у даному документі, зв'язуючі І АО-3 молекули за даним винаходом можуть містити Ес-ділянку. Ес-ділянка таких молекул за даним винаходом може відноситися до будь- якого ізотипу (наприклад, Ідс1, Ідс2, ІдСЗ3 або Ідс4). Зв'язуючі (АОС-3 молекули за даним винаходом можуть додатково містити домен СНІ і/або шарнірну ділянку. За наявності, домен
СНІ і/або шарнірна ділянка можуть відноситися до будь-якого ізотипу (наприклад, Ідс1, дог,
ІЧО3З або Ідса4), та переважно відносяться до того самого ізотипу, що й необхідна Ес-ділянка.
Ілюстративним доменом СНі є домен СН дс1. Амінокислотною послідовністю ілюстративного домену СНІ ІдДОС1 людини є (ЗЕО ІЮ МО:120):
АЗТКОРОМЕР ГАРБЗКОТООа СТААГОЯСІ МК ОМЕРЕРУТУ5 М/МЗОАІ ТОМ НТЕРАМ О55
СІ М5І 55УМТ МРБЗБЗЗІ аТОТ МІСМУМНКРЗ МТКМОКАМ
Ілюстративним доменом СНі є домен СН 1Ідс2. Амінокислотною послідовністю ілюстративного домену СНІ Ід22 людини є (5ЕО ІЮ МО 121):
АЗБТКОРОМЕР ГАРСЗА5ОТОЕ ЗТААГОСІ МК ОМЕРЕРМТУ5 М/МБЗОАІ ТИМ НТЕРАМІ О55
СІ М51 5554МТ МРЗЗМЕатТОТ УТОММОнНКкРЗ МТКМОКТУ
Ілюстративним доменом СНІ! є домен СНІ 1дс4. Амінокислотною послідовністю ілюстративного домену СНІ Ід04 людини є (5ЕО ІЮ МО 122):
АЗБТКОРОМЕР ГАРСЗА5ОТОЕ З5ТААГОЯСІ УК ОМЕРЕРМТУ5 МУМБЗОАІТ5ОаМ НТЕРАМ О55
СІ М5І 55УМТ МРБЗБЗЗІ акт УТОММОонНКкРЗ МТКМОКАМ
Однією ілюстративною шарнірною ділянкою є шарнірна ділянка /дсї людини.
Амінокислотною послідовністю ілюстративної шарнірної ділянки ді людини є (5ЕО ІО
МО:114): ЕРКОСОКТНТСРРСР.
Інша ілюстративна шарнірна ділянка являє собою шарнірну ділянку ІдсС2 людини.
Амінокислотною послідовністю ілюстративної шарнірної ділянки Ідс2 людини є (5ЕО ІО
МО:115): ЕВКССУМЕСРРОСР.
Інша ілюстративна шарнірна ділянка являє собою шарнірну ділянку Ід54 людини.
Амінокислотною послідовністю ілюстративної шарнірної ділянки Ідс4 людини є (5ЕО ІО
МО:116): ЕЗКУОРРСРЗСР. Як описано у даному документі, шарнірна ділянка 954 може містити стабілізуючу мутацію, таку як заміна 5228Р. Амінокислотною послідовністю ілюстративної стабілізованої шарнірної ділянки Ід4 є (ЗЕО ІЮ МО:117): ЕЗКУСРРСРРСР.
Ес-ділянка молекул, що містять Ес-ділянку, (наприклад, антитіл, діатіл і тривалентних молекул) за даним винаходом може являти собою або повну Ес-ділянку (наприклад, повну Ес- ділянку Ід), або тільки фрагмент Ес-ділянки. Необов'язково, Ес-ділянка молекул, що містять
Ес-ділянку, за даним винаходом не має С-кінцевий лізиновий амінокислотний залишок. Так, зокрема, Ес-ділянка молекул, що містять Ес-ділянку, за даним винаходом може бути сконструйованою варіантною Ес-ділянкою. Незважаючи на те, що Ес-ділянка біспецифічних молекул, що містять Ес-ділянку, за даним винаходом може мати здатність зв'язуватися з одним або декількома рецепторами Ес (наприклад, Есук(5)), більше переважно така варіантна Ес- ділянка буде мати змінене зв'язування з ЕсукІА (СО64), ЕсукПА (СО32А), ЕсукІІВ (СО32В),
ЕсувкША (СО16ба) або ЕсукПІВ (СО165) (відносно зв'язування, яким характеризується Ес-ділянка дикого типу) або будуть мати істотно зменшену або відсутню здатність зв'язуватися з інгібуючим(-и) рецептором(-ами). Таким чином, Ес-ділянка молекул, що містять Ес-ділянку, за даним винаходом може включати декілька або всі домени СНаО2 та/або декілька або всі домени
СНЗ повної Ес-ділянки, або може містити послідовність варіантного СНаІ2 та/або варіантного СНЗ (який може включати, наприклад, одну або декілька вставок і/або одну або декілька делецій у відношенні до доменів СН2 або СНЗ повної Ес-ділянки). Такі Рс-ділянки можуть містити поліпептидні частини, що не відносяться до Ес, або можуть містити частини неприродних повних Ес-ділянок, або можуть містити орієнтації доменів СН2 та/або СНЗ, що не зустрічаються у природі, (такі як, наприклад, два домени СНІ, або два домени СНЗ, або у напрямку від М-кінця до С-кінця, домен СНЗ, що зв'язаний з доменом СНЕІ та т. д.).
З рівня техніки відомі модифікації Ес-ділянки, які були визначені як такі, що змінюють ефекторну функцію, у тому числі модифікації, які збільшують зв'язування з активуючими рецепторами (наприклад, ЕсукПА (СО1бА) та зменшують зв'язування з інгібуючими рецепторами (наприклад, ЕСукіІІВ (СО32В) (див., наприклад, 5іамеппадеп, .В. еї аІ(2007) "Ес
Оріїтігайоп ОЇ ТНнегарешіс Апіїродіеє Еппапсез ТНеєїї АБійу То КіїЇ Титог Сеїє й Міго Апа
Сопігоїє Титог Ехрапвіоп Іп Мімо Міа І ом/-Айіпйу Асіїмайпуд Есдатта Несеріог5, " Сапсег Кев. 57(18):8882-8890). Ілюстративні варіанти Ес-ділянок ЇДО1 людини зі зменшеним зв'язуванням з
СО328 та/або збільшеним зв'язуванням з СО16А містять заміни Е243І, К292Р, УЗО00І, МЗ3О5І або
Р2961.. Такі амінокислотні заміни можуть бути присутніми у Ес-ділянці Ї901 людини у будь-якій 10) комбінації або підкомбінації. Відповідно до іншого варіанта здійснення, варіант Ес-ділянки Їдс1 людини містить заміну Е243І, К292Р їі 3001. Відповідно до іншого варіанта здійснення, варіант
Ес-ділянки ІЇД1 людини містить заміни Е243І, К292Р, УЗО00І, М305І та Р2961.
Так, зокрема, переважно, щоб домени СН2-СНЗ поліпептидних ланцюгів молекул, що містять Ес-ділянку, за даним винаходом характеризувалися зниженим (або практично відсутнім) зв'язуванням з ЕСуУКІА (2064), ЕсукКПА (СО32А), ЕсуйкІІВ (СО32В), сук ША (СО16а) або ЕсувПІВ (СО16Б) (відносно зв'язування, яким характеризується Есо-ділянка ДО1 дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО:1)). Вище описані варіантні Ес-ділянки та мутантні форми, що здатні опосередкувати таке змінене зв'язування. Відповідно до конкретних варіантів здійснення, молекули, що містять Ес- ділянку, за даним винаходом містять Ес-ділянку дО, яка характеризується зменшеною АОСС- ефекторною функцією. Відповідно до переважного варіанта здійснення, домен СН2-СНЗ першого та/або третього поліпептидних ланцюгів таких молекул включають будь-яку 1, 2 або З заміни: Г234А, 1235А, М2970 і М2970. Відповідно до іншого варіанта здійснення, варіант Ес- ділянки ЇД40 людини містить заміну М2970, заміну М2970, заміни І 234А та І1235А заміни або заміну 0265А, оскільки ці мутації усувають зв'язування ЕсК. Відповідно до альтернативного варіанта, використовують домен СН2-СНЗ, який від самого початку характеризується зниженим (або практично відсутнім) зв'язуванням з ЕсуКкША (СО1ба) та/"або зменшеною ефекторною функцією (відносно зв'язування, яким характеризується Ес-ділянка Д1 дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО:1)). Відповідно до конкретного варіанта здійснення, молекули, що містять Ес-ділянку, за даним винаходом містять Ес-ділянку Ід52 (ЗЕО ІЮ МО: 2) або Ес-ділянку ІД4 (ЗЕО ІЮ: МО: 4). У разі використання Ес-ділянки ІдД04 даний винахід також відноситься до внесення стабілізуючої мутації, такої як заміна 5228Р, що описана вище, у шарнірній ділянці (див., наприклад, ЗЕО ІЮ
МО: 117). Оскільки заміни М2970, М2970), І 234А, 1 235А та 0265А усувають ефекторну функцію, у тих обставинах, коли необхідна ефекторна функція, ці заміни переважно не будуть використовуватися.
Переважна послідовність ЇДО1 для доменів СН2 та СНЗ зв'язуючих ГАО-3 молекул за даним винаходом буде мати заміни І 234А/Л 235А (ЗЕО ІЮО МО:123):
АРЕААССОСРОУ ЕБЕРРЕРКОТ ГМІБЕТРЕМТ СУУУрРУБНЕО РЕУКЕМИУУД
СУВБУНМАКТК РЕЕВКОУМОТУ БУУБУДТУСН ОПАМОКЕУК СКУБМКАГРА
РІЕКТІБКАК СОРБЕРОМУТ ГРРОБЕЕМІТК МОУ ТСТУК СЕУРБОТАМУЕ иЕОБМООРЕММ УКТТРРУГПОВ ПОБЕВгДУеКІ Турко вБиИсОоб МУВБОСОУМНЕ
АГНМНуУТОоКе ГБГБРОоХ де Х являє собою лізин (К) або відсутній.
Так, зокрема, переважно, щоб Ес-ділянки поліпептидних ланцюгів, що містять Ес-ділянку, молекул за даним винаходом характеризувалися підвищеним періодом напівжиття у сироватці (відносно періоду напівжиття, яким характеризується відповідний Ес дикого типу). Вище описані варіантні Ес-ділянки та мутантні форми, що характеризуються тривалим періодом напівжиття у сироватці. Відповідно до переважного варіанта здійснення, домен СН2-СНЗ першого та/або третього поліпептидних ланцюгів таких молекул, що містять Ес-ділянку, включають будь-яку 1, 2 або З заміни: М252У, 52541 і Т256Е. Даний винахід додатково відноситься до молекул, що містять Ес-ділянку, за даним винаходом, які містять варіантні Ес-ділянки, що містять: (А) одну або декілька мутацій, які змінюють ефекторну функцію та/ або Есуг; і (В) одну або декілька мутацій, які продовжують період напівжиття у сироватці.
Переважна послідовність (ДО1 для доменів СН2 та СНЗ молекул, що містять Ес-ділянку, за даним винаходом будуть містити заміни І 234А/Л 235А/М252У/52541/1256Е (5ЕО ІЮ МО:124):
АРЕААССРОУМ ЕГЕРРКЕРКОТ ГПУТТВКЕРЕМТ СУМУПУБНЕО РЕУКЕМИ ТУР
СУВБУНМАКТК РЕЕКОТМОТУ БУУБУПТУСН ОПАМОКЕуУК СКУБМКАГРА
РІЕКТІБКАК СОРКЕРОМУТ ГРРОКЕЕМТІК МОМ ТСІУК СЕУРБОТАМВ яЕОМООРЕММ УКТТРРУГОВ ОСБЕЕПТеКІ ТУркКОБиОоОов МУгОСОУМНЕ
АгнМнутТОоКко г5ГО5РоХ де Х являє собою лізин (К) або відсутній.
Переважна послідовність Ід4 для доменів СН2 та СНЗ молекул, що містять Ес-ділянку, за даним винаходом будуть містити заміни М252у/525471/1256Е (5ЕО ІЮ МО:125):
АРЕЕГОСОРОУ ЕБЕРРКРКОТ ГПУІТРКЕРЕБУТ СУУУрУВОВБІр РЕУОЕМИ ТУЮ
СУБЕМНМАКТК РЕБЕОЕМОТУ КУУБУСТУСН ОБАМИ МОКЕУК СКУБМКОГРо о"ТЕКТІВБКАК СОРКЕРОМУТ ГРРООВБЕМТІТК МОУБІТСГУК СЕУРБОТАМЕ яЖЕОБМООРЕММ УКТТРРУГО5Є ОБОБЕДУОКІ ТУрКОКИОВЕС МУгОСОУМНЕ
АгНнМнІТОоКО ГБІБІСХ де Х являє собою лізин (К) або відсутній.
Для діатіл і тривалентних зв'язуючих молекул (перший і третій поліпептидні ланцюги яких не ідентичні) бажано зменшити або попередити гомодимеризацію між доменами СН2-СНЗ двох перших поліпептидних ланцюгів або між доменами СН2-СНЗ двох третіх поліпептидних ланцюгів. Домени СН2 та/або СНЗ таких поліпептидних ланцюгів не обов'язково повинні бути ідентичними за послідовністю, та переважно вони модифіковані таким чином, щоб це сприяло комплексоутворенню між двома поліпептидними ланцюгами. Наприклад, амінокислотна заміна (переважно заміна на амінокислоту, яка містить об'ємну бічну групу, що утворює "виступ", наприклад, триптофан), може бути введена у домен СН2 або СНЗ з тим, щоб стеричний вплив перешкоджав взаємодії з доменом, що аналогічно мутований, і змушував мутований домен утворювати пару з доменом, в якій методом інженерії була вбудована комплементарна або узгоджувальна мутація, тобто "западина" (наприклад, заміна на гліцин). Такі набори мутацій можуть бути вбудовані способами інженерії у будь-яку пару поліпептидів, що містять домени
СнН2г-СНЗ, які утворюють Ес-ділянку. Способи білкової інженерії для полегшення гетеродимеризації відносно гомодимеризації добре відомі з рівня техніки, зокрема, у відношенні інженерії імуноглобуліноподібних молекул, і охоплюються даним документом (див., наприклад,
Кідджмау еї аІ.(1996) "Кпорз-Іпіо-Ноїе5" Епдіпеегіпд ОЇ Апіроду СНЗ Ботаїп5 Рог Неаму Спаїіп
Неїегодітегілайоп, " Ргоївіп Епдг. 9:617-621, АїмеїЇ єї аіЇ. (1997) "Маріє Неїегодітегт5 Егот
Кетоавеїїпд Те ботаїп Іпіегтасе ОЇ А Нотодітег О5іпд А Рпаде Оі5ріау І іргагу, " У. Мої. Віої. 270: 26-35, і Хіє еї а). (2005) "А Мем Еоптаї ОЇ Вівресіїс Апіроду: Нідніу ЕнНісівепі
Негегодітегігайноп, Ехргезбзіоп Апа Титог Сеїї Гувів, " У. Іттипої. Меїйоаз 296:95-101; кожна з яких включена у даний документ за допомогою посилання у повному її обсязі). Переважно, "виступ" вбудовують способами інженерії у домени СН2-СНЗ першого поліпептидного ланцюга, а "западину" вбудовують способами інженерії у домени СН2-СНЗ третього поліпептидного ланцюга діатіл, що містять три поліпептидні ланцюги. Таким чином, "виступ" буде сприяти попередженню гомодимеризації першого поліпептидного ланцюга через його домени СН2 та/або СНЗ.
Оскільки третій поліпептидний ланцюг переважно містить заміну "западина", вона буде гетеродимеризуватися з першим поліпептидним ланцюгом, а також гетеродимеризуватися сама по собі. Ця стратегія може бути використана для діатіл і тривалентних зв'язуючих молекул, що містять три, чотири або п'ять ланцюгів, як детально описано вище, де "виступ" вбудовують способами інженерії у домени СН2-СНЗ першого поліпептидного ланцюга, а "западину" вбудовують способами інженерії у домени СН2-СНЗ третього поліпептидного ланцюга.
Переважний виступ створюють шляхом модифікації Ес-ділянки ІдсС 3 включенням модифікації Т366УУ. Переважну западину створюють шляхом модифікації Ес-ділянки ДО з включенням модифікації 73665, І 368А та У407М. Для полегшення очищення гомодимеру третього поліпептидного ланцюга, що несе западину, з кінцевої біспецифічної гетеродимерної молекули, що містить Ес-ділянку, сайт зв'язування білка А доменів СН? та СНЗ третього поліпептидного ланцюга переважно мутують шляхом заміни амінокислоти у положенні 435 (Н4З5К). Таким чином, гомодимер третього поліпептидного ланцюга, що несе западину, не буде зв'язуватися з білком А, тоді як біспецифічний гетеродимер буде зберігати свою здатність зв'язувати білок А за допомогою сайту зв'язування білка А на першому поліпептидному ланцюзі.
Відповідно до альтернативного варіанта здійснення, третій поліпептидний ланцюг, що несе западину, може включати амінокислотні заміни у положеннях 434 та 435 (МАЗ4А/М435К).
Переважна амінокислотна послідовність ІДС! для доменів СН2 та СНЗ першого поліпептидного ланцюга молекули, що містить Ес-ділянку, за даним винаходом буде мати послідовність (ЗЕО ІЮ МО:126), що "несе виступ":
АРЕААССРБУ ЕПЕРРЕРКОТ ГМІБЕТРЕМТ СУУУВУБНЕО РЕУКЕМИ ХУ
СУВБУНМАКТК РКЕВБОХУМОТУ КУМУБУТУСН ОБАМИ МОКЕУК СКУБМКАГРА
РІЕКТІБКАК СОРКЕРОМУТ ГРРОКЕЕМІК МоУвБІйЖСТУК СЕУРООТАУВ
ИЕБМООРЕММ УКТТРРУГПОБ ПОБЕКЕГПУОВКІ Турко БКиСОосСс МУгОБСОУМНЕ
АГНМНуУТОКо ІвІБРоХ де Х являє собою лізин (К) або відсутній.
Переважна амінокислотна послідовність Ід! для доменів СН2 та СНЗ другого поліпептидного ланцюга молекули, що містить Ес-ділянку, за даним винаходом, що має два поліпептидних ланцюги (або третього поліпептидного ланцюга молекули, яка містить Ес-ділянку, що має три, чотири, або п'ять поліпептидних ланцюгів), буде мати послідовність (5ЕО ІЮ
МО:127), що "несе западину":
АРЕААССРБУ ЕБЕРРЕРКОТ МІБЕТРЕМТ СУУУПЮУВБНЕО РЕУКЕМАИ У УЮ
СУВЕУНМАКТК РЕВБЕОХМОТУ КУУБУПТУСН ОБ МОКЕУК СКУБМКАГРА
РІЕКТІБКАК СОРЕБЕРОМУТ ГРРОКЕЕМТІК МОУБІЗСАУК СЕТРОПОТАМУВ яЕБМООРЕММ УКТТРЕРУМІО5 ОСБЕЕГМОКІ, тУркенкисОов МУКОСеУМНЕ
АгнМКуТОоКо ГБІвБРоХ де Х являє собою лізин (К) або відсутній.
Як можна бачити, домени СН2-СНЗ з 5ЕО ІЮ МО:126 і 5ЕО ІО МО:127 включають заміну у положенні 234 на аланін і 235 на аланін і таким чином утворюють РЕс-ділянку, яка характеризується зниженим (або практично відсутнім) зв'язуванням з ЕСсуУКІА (СО64), ЕсукПА (СО32А), ЕсуКкІІВ (СО328), ЕсукША (СО16ба) або ЕсукПвВ (СО16Б) (відносно зв'язування, яким характеризується Ес-ділянка дикого типу (5ЕО ІЮ МО:1). Даний винахід також відноситься до таких доменів СН2-СНЗ, які містять аланінові залишки у положеннях 234 та/або 235 і/або альтернативні та/або додаткові заміни, які модифікують ефекторну функцію та/або активність, що зв'язує з РУК, у Ес-ділянці. Даний винахід також відноситься до таких доменів СН2-СНЗ, які додатково містять одну або декілька амінокислотних замін, що подовжують період напівжиття.
Зокрема, даний винахід відноситься до таких доменів СН2-СНЗ, що несуть западину та несуть виступ, які додатково містять М252У/52541/1256БЕ.
Переважно, щоб перший поліпептидний ланцюг мав послідовність СН2-СНЗ, що "несе виступ", таку як послідовність ЗЕО ІЮ МО:126. Тим не менш, як буде зрозуміло, у першому поліпептидному ланцюзі може бути використаний домен СН2-СНЗ, що "несе западину", (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 127), й у цьому випадку домен СН2-СНЗ, що "несе виступ", (наприклад,
ЗЕО ІЮ МО: 126) буде використаний у другому поліпептидному ланцюзі молекули, що містить
Ес-ділянку, за даним винаходом, що має два поліпептидні ланцюги (або у третьому поліпептидному ланцюзі молекули, яка містить Ес-ділянку, що має три, чотири або п'ять поліпептидних ланцюгів).
Як докладно описано вище, даний винахід відноситься до молекул, що містять Ес-ділянку, (наприклад, антитіл і діатіл, які містить Ес-ділянку), що мають домени СН2 та СНЗ дикого типу або домени СН2 та СНЗ, які містять комбінації замін, що описані вище. Ілюстративною амінокислотною послідовністю домену СН2-СНЗ ІдСї, що охоплює такі зміни, є (5ЕО ІО
МО 28):
АРЕХ1ІХ2ОоСРВУ ЕГЕРРКРЕОТ ІхХзІХАКХ5РЕМТ СУУУБВУБВНЕВ
РЕУКЕМИХ УЮ СУВЕУНМАКТК РЕБКЕОТМСТУ вБУУБУПТУТН
ОА МОКЕТК СКУБМКАГРА РІЕКТІВБКАК СОРКЕРОМ УТ
ІГРРБКЕЕМТК МОБ хХосСАз УК СЕТУРООТАМУВ иЕОМООРЕММ
УЕТТРРУГО5 рООЕвЕгПхавКкІ ТУ ОКкОКиИСОС МУгБСОУМНЕ
АГгНХахіоїТОоКке Ге5ГеБРОХІ11 де: (а) як Ху, так і Х» являють собою І! (дикий тип) або являють собою А (знижене зв'язування з
ЕсСУК); (Б) Хз, Ха і Х5 відповідно являють собою М, З і Т (дикий тип) або являють собою У, Ті Е (подовжений період напівжиття), (с) Хв, Х7 і Хв відповідно являють собою Т, | і М (дикий тип) або являють собою М, | і (виступ) або 5, А і М (западина); (8) Хе ії Хіо відповідно являють собою М і Н (дикий тип) або являють собою М і К (без зв'язування білка А) або А і К (без зв'язування білка А); і (є) Хіт являє собою К або відсутній.
Відповідно до інших варіантів здійснення, даний винахід відноситься до зв'язуючих І Ас-3 молекул, що містять домени СН2 та/або СНЗ, які були змінені способами інженерії для полегшення гетеродимеризації відносно гомодимеризації за допомогою мутацій, що відомі з рівня техніки, таких як публікації, що розкриті у РСТ, УМО 2007/110205, МО 2011/143545, УМО 2012/058768, УМО 2013/06867, всі з яких включені у даний документ за допомогою посилання у повному їх обсязі.
МІ. Еталонні антитіла
А. Еталонне антитіло до І АО-3
Для оцінки та характеристики нових зв'язуючих І АО-3 молекул антитіл за даним винаходом використовували наступне еталонне антитіло: 25Е7 (ВМ5-986016, Медагех/вВМ5, що позначене у даному документі як "ГАОс-ЗтАБ А"). 1. 25Е7 (ТАС-3 тА А")
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МН у 25Е7 ("ГАС-ЗтАБ А") (5ЕО ІЮ
МО:129) (залишки СОКНн показані підкресленими): оУогоОМсАс ГІКРОЕТІВІ ТСАУТосВЕо ВУХУММИТКОР РОКОГЕМІСЕ
ІМННОМТМЬМ РОЗІКВКУТІ ПОТОКМОВОІ КОЕБУТААВТ АМУТУСАКОоХВ пУБУМИВОРиИ СОТ УТУБо
Нижче показана амінокислотна послідовність домену МІ у 25Е7 (| АсС-ЗтАбБ А") (5ЕО ІЮ
МО:130) (залишки СОК. показані підкресленими):
ЕІМІТОБРАТ Г5ГОБРОВЕКАТ ГОСКАБОВІВ БУГАЙТУООКР СОАРКІТІ ТО
АЗМЕКАТСІРА КЕБСОООСТО ЕТІТІБОСГЕР ЕБЕАУУТСОО В5МИРІТЕСО
СТМІВЇК
В. Еталонні антитіла до РО-1
Для оцінки та характеристики активності нових зв'язуючих | АС-3 молекул за даним винаходом у комбінації з антитілом до РО-1 можна застосовувати еталонне антитіло. Відомі антитіла, які є імуноспецифічними до РО-1 (див., наприклад, патенти Сполучених Штатів Мо 8008449, Мо 8552154; патентні РСТ публікації УМО 2012/135408, УМО 2012/145549 ії МО 2013/014668), і в їх число входять: ніволумаб (також відомий як 504, ВМ5-936558, ОМО-4538,
МОХ-1106, і представлений на ринку як ОРОЇМОФ від ВгізіоІ-Муег5 Здацірр), що позначений у даному документі як ""О-1 тАБ 1", пембролізумаб (раніше відомий як ламбролізумаб, також відомий як МК-3475, 5С2Н-900475, і представлений на ринку як КЕУТКОМБАФ від МегсК), що позначений у даному документі як ""О-1 тАбБ2г"; ЕНІ12.2Н7 (Оапа Рагбрег), що позначений у даному документі як ""ЮО-1 тАБ 3"; піділізумаб (також відомий як СТ-011, СигеТесі, ), що позначений у даному документі як "РО-1 тАбБ 4". 1. Ніволумаб ("РО-1 тАб 17)
Амінокислотна послідовність варіабельного домену важкого ланцюга РО-1 тАБ 1 має амінокислотну послідовність (5ЕО ІЮ МО:131) (залишки СОКНн показані підкресленими): оУОгУЕВССоо УМУОРОББІКІ ОСКАБСІТЕо МБОМНИУБОА РОКСГЕЙМУАМ
ІМУОО5ККУУ АО5УКОКЕТІ ЗКОМОКМТІТГЕ ГОММОГКАВО ТАУУТСАТНО руйсСОостТгМтТ М55
Амінокислотна послідовність варіабельного домену легкого ланцюга РО-1 тАБб 1 має амінокислотну послідовність (5ЕО ІЮ МО:132) (залишки СОКНн показані підкресленими):
ЕчІУМГТОБРАТ Г5ГОРОБКАТ ГО5СКАБВОВМВ БУГАЙУООКР СОАРВПІТ ТО
А5ЗМВАТСІРА БЕБСОСОСТО ЕТОТІББГЕР БОБАМТУСОО 55МИРЕТЕ СО
СТКУВІК
2. Пембролізумаб ("РО-1 тАбБ 2")
Амінокислотна послідовність варіабельного домену важкого ланцюга РО-1 тАБ 2 має амінокислотну послідовність (5ЕО ІЮ МО:133) (залишки СОКНн показані підкресленими): оУСрМОоБ5ОУє УККРОАВУКУ 5СКАБСІТЕТ МУУМУМУКОА РООСГЕММоЄ
ІНРЗМНССТМЕ МЕКЕКМЕУТІ ТТОООТТІТАТ МЕБКОТОКОО ТАУТУСАКВО
УКЕОМОВОуий сОоСТТУгУВе
Амінокислотна послідовність варіабельного домену легкого ланцюга РО-1 тАБб 2 має амінокислотну послідовність (5ЕО ІОЮ МО:134) (залишки СОКНн показані підкресленими):
ЕГІМПТОБРАТ Г5ГО5БРОВЕКАТ ГОБСКАВКОУВ Т5ОУЗУПНИХ ООКРООАРНІ,
ІТУБПАБУТЕВ СУРАБКЕОСОО ОББОБТОЕТОТІв БПЕРЕВЕАМУХ УСОНеВКОГТРІ,
ТЕСССТКУВІК
3. ЕН1Т2.2Н7 ("РО-1 тА 3")
Амінокислотна послідовність варіабельного домену важкого ланцюга РО-1 тАБ З має амінокислотну послідовність (5ЕО ІЮ МО:135) (залишки СОКНн показані підкресленими):
ОУОгоОББАВ ГАКРОАБУОМ БСКАБСУБЕТ ВВИТНМУКОВ РООСІЕМІСУ
ІУРОБТОСЕТЕУ МОКЕКОКАТІ ТАпКБеОТтТАУ МОГ5БеГТОЕО БАМУУСАКИК
О5ЗОУНАМОХ йсОостТеУТУво
Амінокислотна послідовність варіабельного домену легкого ланцюга РО-1 тАб 3 має амінокислотну послідовність (5ЕО ІЮ МО:136) (залишки СОКНн показані підкресленими):
ПІМОТОБРАВ ГТУБІСОБКБАТ ІБСКАБВБОВУВ Т5СУЗУМНИХУ ООКРООРРКІ,
ІІКЕСЗМІЕБ СІРАБЕ5СоО ООТОЕТІМІН РУБЕВОТАТУ УСОНЬМВЕІТІРУ
ТЕСССТКІЕІ Кк 4. Піділізумаб ("РО-1 тАБ 4")
Амінокислотна послідовність варіабельного домену важкого ланцюга РО-1 тАБ 4 має амінокислотну послідовність (5ЕО ІЮ МО:137) (залишки СОКНн показані підкресленими):
оУогуУСеоВБЕ ГККРОАБУКІ БСКАБСУТЕТ МУСММИУКОА РСООСТОММОМ
ІНТО5СЕВТУ АБЕЕКОБЕУКЕ СГОТБУМТАУ ГОЇТ5ІТАБО ТОМувЕСУКУб
УППАПОУйсСОоС ТІУТУве
Амінокислотна послідовність варіабельного домену легкого ланцюга РО-1 тАБб 4 має амінокислотну послідовність (5ЕО ІЮ МО:138) (залишки СОКНн показані підкресленими): вІМОТОвБРОО ГБАБУСБОКУТ ІТСВБАВКВ5УВ УМНИБООКРО КАРКІМІ ВТ
ЗзМГАВОУРОК гобоебоСТву СОПТІМОГОРЕ БЕАТУТУСООК 5З5ЕРІТЕ СОС
ТКЕТВІЇК
ЇХ. Способи одержання
Антитіло до поліпептиду ГАс-3, та інші ГАс-3-агоністи, антагоністи та модулятори, можна створювати з полінуклеотидів і/або послідовностей антитіл ГАС-3 тАбБ 1, І АС-3 тАБ 2, І ДО-3 тАб 3, Гда-3 тАБ 4, І Да-3 тАБ 5 або І АС-3 тАБ 6 за допомогою способів, що відомі з рівня техніки, наприклад, синтетично або рекомбінантно. Один із способів одержання таких пептидних агоністів, антагоністів і модуляторів передбачає хімічний синтез поліпептиду з подальшою обробкою в окислювальних умовах, що підходять для одержання нативної конформації, тобто правильних сполук за допомогою дисульфідних зв'язків. Це може бути виконано за допомогою методик, що добре відомі фахівцям у даніїй галузі техніки (див., наприклад, КеїЇеу, К. РЕ. єї а!.(1990) Іп: Сепеїйс Епаіпеегіпу Ргіпсірієх апа Меїйодв», Зеїйому, /.К. Ед., Ріеєпит Ргевз5, М.У., мої. 15.12, рр 1-19; Біемай, У.М еї а. (1984) 5оїїа Рназе Реріїде Зупіпезів, Рієтсе Спетіса! Со., Носіктога,
ІС; також див. патенти США МоМо 4105603, 3972859, 3842067 і Мо 3862925).
Поліпептиди за даним винаходом можна легко одержати за допомогою твердофазного пептидного синтезу (МеггійеЇа, В. (1986) "Бої Рпазе Зупіпеві5, " Зсівпсе 232(4748):341-347;
Ноцаніеп, В.А. (1985) "Сепега! Меїнод Рог Тне Варіа 5оїід-Рназе Зупіпевзів ОЇ І агає Митбегв ОЇ
Реріідев: Зресіїйсну ОГ Апіїдеп-Апіїрбоаду Іпіегасіоп Аї Те І емеї! ОЇ Іпаїмідча! Атіпо Асід», " Ргос.
Май. Асай. сі. (0.5.А.) 82(15):5131-5135; Сапезап, А. (2006) "Зоїїд-Рнпазе Бупіпевів п Те
Тмепіу-Рігвї Сепіцйгу, " Міпі Кем. Мед. Спет. 6(1):3-10).
Відповідно до іншої альтернативи, повністю людські антитіла, що мають один або декілька
СОМ з ГАС-3 тАб 1, І АС-3 тАбБ 2, Г АС-3 тА 3, І АС-3 тА 4, І АС-3 тА 5 або І АО-3 тАб 6, або які конкурують з ГАС-3 тАБ 1, ГАС-3 тАБ 2, І АС-3 тА 3, І АС-3 тАб 4, І ДО-3 тА 5 або
ГАС-3 тА 6 за зв'язування з ГАС-3 людини або його розчинною формою, можна одержати за допомогою комерційно доступних мишей, які були змінені способами інженерії так, щоб вони експресували конкретні білки імуноглобуліну людини. Для одержаання гуманізованих або людських антитіл також можна застосовувати трансгенних тварин, які призначені для вироблення більш бажаних (наприклад, повністю людських антитіл) або більш робасної імунної відповіді.
Прикладами такої методики є Хепотоизе "м (Ардепіх, Іпс., Фрімонт, Каліфорнія) та НиМАбБ-
Моизеф і ТС Моизе "М (обидві від Медагех, Іпс., Принстон, Нью-Джерсі).
В альтернативному варіанті антитіла можуть бути одержані рекомбінантно та експресовані за допомогою будь-якого способу, що відомий з рівня техніки. Антитіла можуть бути одержані рекомбінантно шляхом спочатку виділення антитіл, що одержані з тварин-хазяїв, одержання послідовності генів і застосування послідовності генів для рекомбінантної експресії антитіла у клітинах-хазяїнах (наприклад, клітинах СНО). Іншим способом, який може бути використаний, є експресія послідовності антитіл у рослинах (наприклад, тютюні) або у трансгенному молоці.
Були розкриті підходящі способи рекомбінантної експресії антитіл у рослинах або молоці (див., наприклад, Рееїег5 еї а/.(2001) "Ргодисцоп ОЇ Апіїбодіе5 Апа Апіїбоду Егадтепів Іп Ріапів, "
Массіпе 19:2756; І опрего, М. еї аї. (1995) "Нитап Апіїрбодіе5 Егот Тгапздепіс Місе, " Іпї. Кем.
Ітітипо! 13:65-93; та РоїоскК еї аїІ. (1999) "Ттапздепіс МІК Аз А Меїпой Рог Те Ргодисіоп ОЇ
Кесотрбіпапі Апіібодіе5, " У. Іттипої Меїйоа5 231:147-157). З рівня техніки відомі підходящі способи одержання похідних антитіл, наприклад, гуманізованих, одноланцюжкових і т. д. В іншому альтернативному варіанті антитіла можна одержати рекомбінантно за допомогою технології фагового дисплея (див., наприклад, патенти США МоМо 5565332, 5580717, 5733743, 6265150 і Уміпієг, 0. єї аї. (1994) "МакКкіпд Апіїбодіез Ву Рпаде Оізріау Тесппоїоду, " Аппи. Кем.
Іттипої. 12.433-455).
Антитіла, що являють інтерес, або білок можуть бути піддані секвенуванню з розщепленням за Едманом, яке добре відомо фахівцям у даній галузі техніки. Інформацію про пептиди, що одержана за результатами мас-спектрометрії або розщеплення за Едманом, можна застосовувати для розробки зондів або праймерів, які застосовують для клонування білка, що являє інтерес.
Альтернативним способом клонування білка, що являє інтерес, є "пенінг" за допомогою очищеного ІГАС-3 або його частин для клітин, що експресують антитіло, що являє інтерес, або білок, яке має один або декілька СО ГАС-3 тАБ 1, ГАС-3 тАБ 2, І АС-3 тА 3, ГАС-3 тАБ 4,
ГАСі-3 тАбБ 5, або | АС-3 тАр 6 або яке конкурує з ГАС-3 тАбБ 1, ГАС-3 тАбБ 2, ГАС-3 тАб 3,
ГАС-З тА 4, ГАСб-3 тАБ 5 або ГАС-3 тА б за зв'язування з ГАС-3 людини. Процедуру "пенінса" можна проводити шляхом одержання бібліотеки кКДНК з тканин або клітин, які експресують ГАС-3, надекспресії КДНК у клітинах другого типу та скринінгу трансфікованих клітин другого типу у відношенні специфічного зв'язування з І АС-3 у присутності або відсутності
ГАС-З тАБ 1, ГАС-3 тАБ 2, ГАС-3 тАБ 3, ГАС-3 тАбБ 4, | АС-3 тАб 5 або ГАО-3 тА 6.
Детальний опис способів, які застосовуються при клонуванні генів ссавців, що кодують білки клітинної поверхні, за допомогою "пенінга", можна знайти у рівні техніки (див., наприклад, Агийо,
А. еї аІ(1987) "МоїІесшаг Сіопіпд ОТГ А СО28 сОМА Ву А Нідп-ЕНісієпсу СО Сеї! Ехргезвіоп зЗузіет, " Ргос. Май). Асай. Зсі. (0О.5.А.) 84:8573-8577, і ерпап, 9. єї аї. (1999) "ЗеІесіїме Сіопіпа
ОЇ СеїЇ Бипасе Ргоїєїп5 Іпмоїмей іп Огдап Оеємеіортепі: Еріїнеїїа!І СПусоргоїєїп Ів Іпмоїмейд Іп
Могтаї! Ерйїпеїїа! Оіїегепіайоп, " Епдосгіпої. 140:5841-5854).
Вектори, що містять полінуклеотиди, які являють інтерес, можуть бути введені у клітину- хазяїна будь-яким з ряду підходящих способів, включаючи електропорацію, трансфекцію з використанням хлориду кальцію, хлориду рубідію, фосфату кальцію, ОЕАЕ -декстрану або інших речовин, бомбардування мікрочастинками, ліпофекцію та інфекцію (наприклад, де вектор є інфекційним агентом, таким як вірус коров'ячої віспи). Вибір векторів, що вводяться, або полінуклеотидів часто буде залежати від особливостей клітини-хазяїна.
Для виділення генів, що кодують антитіло, яке являє інтерес, поліпептид або білок, можна застосовувати будь-яку клітину-хазяїна, що здатна до надекспресії гетерологічних ДНК.
Необмежуючі приклади підходящих клітин-хазяїв ссавців включають без обмеження клітини
СО5, Нега і СНО. Переважно, клітини-хазяїни експресують кКДНК на рівні приблизно, що у 5 разів перевищує, більше переважно у 10 разів перевищує, ще більше переважно у 20 разів перевищує рівень відповідного ендогенного антитіла, що являє інтерес, або білка, за наявностю, у клітині-хазяїні. Скринінг клітин-хазяїнів у відношенні специфічного зв'язування з
ГАО-3 здійснюють імуноаналізом або ЕАС5. Можна виявити клітину, що надекспресує антитіло, яке являє інтерес, або білок.
Даний винахід відноситься до поліпептидів, що містять амінокислотну послідовність антитіл за даним винаходом. Поліпептиди за даним винаходом можна одержати за допомогою процедур, що відомі з рівня техніки. Поліпептиди можна одержати за допомогою протеолітичного або іншого розщеплення антитіл, за допомогою рекомбінантних способів (тобто окремими або злитими поліпептидами), як описано вище, або за допомогою хімічного синтезу.
Поліпептиди антитіл, особливо більш коротші поліпептиди розміром приблизно до 50 амінокислот, зазвичай одержують за допомогою хімічного синтезу. Способи хімічного синтезу відомі з рівня техніки і є комерційно доступними. Наприклад, антитіло до поліпептиду ГАС-3 можна одержати за допомогою автоматичного синтезатора поліпептидів, що використовує твердофазний спосіб.
Даний винахід відноситься до варіантів антитіл | АС-3 тАБ 1, ГАС-3 тАБ 2, ГГ ДОа-3 тА 3,
ГАС-3 тАБ 4, І ДО-3 тАбБ 5 або І АС-3 тА 6 і їх поліпептидним фрагментам, які зв'язуються з
ГАС-3, включаючи функціонально еквівалентні антитіла та злиті поліпептиди, які не надають значного впливу на властивості таких молекул, а також варіанти, які мають збільшену або знижену активність. Модифікація поліпептидів є звичайною практикою у даній галузі техніки та не потребує докладного опису у даному документі. Приклади модифікованих поліпептидів включають поліпептиди з консервативними замінами амінокислотних залишків, однією або декількома делеціями або додаваннями амінокислот, які не надають значного згубного впливу на функціональну активність, або із застосуванням хімічних аналогів. До амінокислотних залишків, які можуть бути консервативно замінені один з одним, відносяться без обмеження гліцин/аланін, серин/треонін, валін/ізолейцин/лейцин, аспарагін/глутамін, аспарагінова кислота/глутамінова кислота, лізин/аргінін ії фенілаланін/тирозин. До таких поліпептидів також відносяться глікозильовані та неглікозильовані поліпептиди, а також поліпептиди з іншими посттрансляційними модифікаціями, такими як, наприклад, глікозилювання різними цукрами, ацетилювання та фосфорилювання. Переважно, амінокислотні заміни будуть консервативними, (610) тобто амінокислота, що внесена у результаті заміни, буде мати таки ж хімічні властивості, що й бо вихідна амінокислота. Такі консервативні заміни відомі з рівня техніки, і їх приклади були наведені вище. Амінокислотні модифікації можуть варіювати від зміни або модифікації однієї або декількох амінокислот до повної реорганізації ділянки, такої як варіабельний домен. Зміни у варіабельному домені можуть змінювати афінність і/або специфічність зв'язування. Інші способи модифікації передбачають застосування методик зв'язування, що відомі у даній галузі, включаючи без обмеження ферментативні засоби, окислююче заміщення та хелатування.
Модифікації можна застосовувати, наприклад, для прикріплення міток для імуноаналізу, такого як прикріплення радіоактивних фрагментів для радіоіїмунологічного аналізу. Модифіковані поліпептиди одержують за допомогою процедур, що загальноприйняті у даній галузі техніки, та їх можна піддати скринінгу за допомогою стандартних аналізів, що відомі у даній галузі техніки.
Даний винахід відноситься до злитих білків, що містять один або декілька поліпептидів або антитіл ГАС-3 тАБ 1, ГАС-3 тАБ 2, І АС-3 тА 3, І АС-3 тА 4, І АО-3 тАбБ 5 або І АО-3 тАбБ 6 за даним винаходом. Відповідно до одного варіанта здійснення, даний винахід відноситься до злитого поліпептиду, який містить легсий ланцюг, важкий ланцюг або як легкий, так і важкий ланцюг. Відповідно до іншого варіанта здійснення, злитий поліпептид містить гетерологічну константну ділянку імуноглобуліну. Відповідно до іншого варіанта здійснення, злитий поліпептид містить варіабельний домен легкого ланцюга та варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, що одержано із загальнодоступної депонованої гібридоми. У контексті даного винаходу злитий білок антитіла містить один або декілька поліпептидних доменів, які специфічно зв'язуються з
І АС-3, та іншу амінокислотну послідовність, до якої він не приєднаний у нативній молекулі, наприклад, гетерологічну послідовність або гомологічну послідовність з іншої ділянки.
Х. Застосування зв'язуючих І АС-3 молекул за даним винаходом
Даний винахід відноситься до композицій, включаючи фармацевтичні композиції, що містять зв'язуючі ГАОС-3 молекули за даним винаходом (наприклад, антитіла до ІГАС-3, біспецифічні антитіла до ГАС-3 та т. д.), поліпептиди, що одержані з таких молекул, полінуклеотиди, що містять послідовності, які кодують такі молекули або поліпептиди, та інші засоби, які описані у даному документі.
Як розглянуто вище, ГАС-3 відіграє важливу роль у негативній регуляції проліферації, функції та гомеостазу Т-клітин. Зв'язуючі | АС-3 молекулиза за даним винаходом мають здатність інгібувати функцію І АС-3 та таким чином звертати опосередковане ГГ АС-3 інгібування імунної системи. Таким чином, ГАС-3 тАбБ 1, ГАС-3 тАБ 2, ГАС-3 тА 3, Г АС-3 тАб 4, І ДИ-3 тАБ 5 ії ГАО-3 тАбБ 6, їх гуманізовані похідні та молекули, що містять їх зв'язуючі ГАО-3 фрагменти (наприклад, біспецифічні діатіла та т. д.) або які конкурують за зв'язування з такими антитілами, можна застосовувати для блокування опосередкованого І Ас-3 інгібування імунної системи і тим самим для того, щоб сприяти активації імунної системи.
Біспецифічні зв'язуючі ГАС-3 молекули за даним винаходом, які зв'язуються з ГАС-3 та іншою молекулою, що бере участь у регуляції імунної контрольної точки, що присутня на поверхні клітини (наприклад, РО-1), підсилюють імунну систему шляхом блокування опосередкованого ГАС-3 інгібування імунної системи та таких молекул імунної контрольної точки. Таким чином, зв'язуючі ГАС-3 молекули за даним винаходом придатні для посилення імунної відповіді (наприклад, Т-клітинної імунної відповіді) у суб'єкта. Зокрема, зв'язуючі І Ас-3 молекули за даним винаходом можна застосовувати для лікування будь-якого захворювання або стану, що асоційований з небажано пригніченою імунною системою, у тому числі злоякісної пухлини та захворювань, які асоційовані з присутністю патогена (наприклад, бактеріальної, грибкової, вірусної інфекції або інфекції найпростішими).
Злоякісні пухлини, які можна лікувати за допомогою зв'язуючих ГАС-3 молекул за даним винаходом, включають види злоякісних пухлин, що характеризуються присутністю клітини злоякісної пухлини, що вибрана з групи, що складається з клітини: пухлини надниркової залози, злоякісної пухлини, що асоційована зі СНІДом, альвеолярної саркоми м'яких тканин, астроцитарної пухлини, злоякісної пухлини сечового міхура, злоякісної пухлини кісток, злоякісної пухлини головного та спинного мозку, метатастатичної пухлини головного мозку, злоякісної пухлини молочної залози, пухлин каротидного тільця, цервікальної злоякісної пухлини, хондросаркоми, хордоми, хромофобної нирково-клітинної карциноми, світло-клітинної карциноми, злоякісної пухлини товстої кишки, колоректальної злоякісної пухлини, шкірної доброякісної фіброзної гістіоцитоми, десмопластичної дрібнокруглоклітинної пухлини, епендімоми, пухлини Юінга, позаскелетної слизоподібної хондросаркоми, недосконалого кісткового фіброгенеза, фіброзної дисплазії кістки, злоякісної пухлини жовчного міхура або жовчовивідних шляхів, злоякісної пухлини шлунково-кишкового тракту, гестаційної трофобластичної хвороби, ембріонально-клітинної пухлини, злоякісної пухлини голови та шиї, (610) гепатоклітинна карциноми, пухлини острівців підшлункової залози, саркоми Капоші, злоякісної пухлини нирки, лейкозу, ліпоми/доброякісної ліпоматозної пухлини, ліпосаркоми/злоякісної ліпоматозної пухлини, злоякісної пухлини печінки, лімфоми, злоякісної пухлини легені, гранулобластоми, меланоми, менінгіоми, множинних ендокринних неоплазій, множинної мієломи, мієлодиспластичного синдрому, нейробластоми, нейроендокринних пухлин, злоякісної пухлини яєчника, злоякісної пухлини підшлункової залози, папілярної карциноми щитовидної залози, пухлини паращитовидних залоз, дитячої злоякісної пухлини, пухлини оболонки периферичного нерва, феохромоцитоми, пухлини гіпофіза, злоякісної пухлини передміхурової залози, увеальної меланоми заднього відділу ока, рідкісного порушення з боку кровотворної системи, ниркової метастатичної злоякісної пухлини, рабдоідної пухлини, рабдоміосаркоми, саркоми, злоякісної пухлини шкіри, саркоми м'яких тканин, плоскоклітинної злоякісної пухлини, злоякісної пухлини шлунка, синовіальної саркоми, злоякісної пухлини яєчка, тимусної карциноми, тімоми, метастатичної злоякісної пухлини щитовидної залози та злоякісної пухлини матки.
Зокрема, зв'язуючі ГГ АС-3 молекули за даним винаходом можна застосовувати для лікування колоректальної злоякісної пухлини, гепатоклітинної карциноми, гліоми, злоякісної пухлини нирки, злоякісної пухлини молочної залози, множинної мієломи, злоякісної пухлини сечового міхура, нейробластоми; саркоми, неходжкінської лімфоми, недрібноклітинної злоякісної пухлини легені, злоякісної пухлини яєчника, злоякісної пухлини підшлункової залози та злоякісної пухлини прямої кишки.
До захворювань, що асоційовані з патогеном, які можна лікувати за допомогою зв'язуючих
ГАС-3 молекул за даним винаходом, відносяться хронічні вірусні, бактеріальні, грибкові та паразитарні інфекції. До хронічних інфекцій, які можна лікувати за допомогою зв'язуючих ГАО-3 молекул за даним винаходом, відносяться вірус Епштейна -- Барра, вірус гепатиту А (НАМ), вірус гепатиту В (НВУ), вірус гепатиту С (НСУ), віруси герпесу (наприклад, НЗМ-1, НБМУ-2, ННУ- б, СМУМ), вірус імунодефіциту людини (ВІЛ), вірус везикулярного стоматиту (У5М), Васійі,
Сіїгорасіег, Споїега, ОбірпіНетіа, Епіегобасієг, Сопососсі, Неїїсобасієг руїогі, КіерзієїІа, І едіопейа,
Мепіпдососсі, мікобактерія, Рзейдотопа5, Рпешитопососсі, рикетсія, ЗаітопейПа, зЗе!їтайа, еарнуїососсі, Бігеріососсі, Теїапив, Аврегодійи5 (А. Титідає5, А.підег і т. д), Віазіотусев5 дептаїййідіє, Сапаїда (С. аїрісап5, С. Кгивзеї, С. діаргага, С. Тгорісаїі5 і т. д.), Стуріососсив пеоїогптапе, рід Мисогаіез (тисог, арзідіа, гпігорив), брогоїнгіх зсНепкії, Рагасоссідіоіде5
Бргавіїїепві5, Соссідіоїдеб5 іттіїв, Нізіоріаєта сарзшіайшт, Іеріозрігові5, Воітеїйа Бигоддонеї, гельмінтовий паразит (анкілостоматіди, стрічкові черв'яки, трематоди, плоскі черви (наприклад, зЗепізіо5зотіа), Сіагаїа Іатбіа, МіспіпеПа, Оіепїіатоеба Нгадіїї5, Ттурапозота Бгисеї, Ттурапозхота сгилі і Геізптапіа допомапі.
Зв'язуючі ГАС-3 молекули за даним винаходом можна комбінувати з імуногенним засобом, таким як протипухлинна вакцина. Такі вакцини можуть містити очищені пухлинні антигени (включаючі рекомбінантні білки, пептиди та молекули вуглеводів), аутологічні або алогенні пухлинні клітини. Був описаний ряд стратегій пухлинної вакцини (див., наприклад, Раїепа, С., еї а!., (2006) "Сапсег массіпев: ргесіїпіса! зіцаїєз апа помеї 5ігагедіеєв5, " Адм. Сапсег Кев. 95, 115-145;
Меїтап, І., еї а. (2011) "Сапсег іттипоїпегару сотез ої аде, " Маїиге 480, 480-489; 7Напо, Х. М. еї а. (2008) "Тне Апіі-Титог Іттипе Везропзе Іпдисед Ву А Сотрбіпайоп ої МАСЕ-3З/МАСЕ-п-
Регімей Реріїдев, " Опсої. Кер. 20, 245-252; Рівів, М. І. еї аї. (2002) "Сепегаїйоп ої Т-сеїЇ Іттипйну тю Ше НЕВ-2/пеи Ргоївїп Айег Асіїме Іттипігайоп мйй НЕВ-2/пеи Реріїде-Вазейд Массіпев5, " У.
Сіп. Опсої. 20:2624-2632; Мегтеї), НА. еї аї. (2012) "Роїепііайоп ої а р53-5ІЇР Массіпе Ву
Сусіорпозрнатіде Іп Омагіап Сапсег: А 5іпдівє-Апт Ріазе Ії зіцау." Іпі. У. Сапсег 131:Е670-Еб680).
Зв'язуючі ГАС-3 молекули за даним винаходом можна комбінувати з режимами хіміотерапевтичного лікування. У цих випадках може бути можливість зменшити дозу хіміотерапевтичного реагенту, що вводиться (МоКуг. М.В. еї аїІ. (1998) "Кеаїїгайоп ОЇ Те
ТНнегарешіс Роїепійа! Ої СТІ А-4 ВіосКаде Іп Ї ом-Юозе СпетоїНпегару-Тгєаіївд Тито/г-Веаїтіпа Місе, " Сапсег Кезеагсп 58: 5301-5304).
Зв'язуючі ГАС-3 молекули за даним винаходом можна комбінувати з іншими імуностимулюючими молекулами, такими як антитіла, які активують імунну реакцію у хазяїна для забезпечення підвищених рівнів активації Т-клітин. Зокрема, було продемонстровано, що антитіла до РО-1, антитіла до РО-1 1 і/або антитіла до СТІ А-4 активують імунну систему (див., наприклад, аеї Кіо, М-Ї. єї а!(2005) "Апіроду-Меадіаїєйд бідпаїйнту Тпгоцай РО-1 Совіїтиіагев Т
Сеїї Апа Епнапсез5 СО28-Оерепаепі Ргоїїегайіоп, " Еиг. у). Іттипої 35:3545-3560; Ваїте", 0. |. єї а! (2006) "Кевіогіпд Рипсійоп Іп Ехпацйзієа СО8 т Сеїї5 Юигіпу Спгопіс Міга! ІптТесійоп, " Маїиге 439, 682-687; Імаї, У. еї аї. (2002) "Іпмоїметепі ої РО-І1 Оп Титог СеїЇв іп Те Евзсаре Егот Нові
Ітітипе бБузівєт Апа Титог Іттипоїйегару бу РО-І1 ріосКаде, " Ргос. Май Асай. Зсі. ОБА 99, бо 12293-12297; Іеаси, 0. ВА., еї аї., (1996) "Епнапсетепі ОГ Апійштог Іттипійу Ву СТІ А-4
Віоскаде, " Зсіепсе 271, 1734-1736). До додаткових імуностимулюючих молекул, які можна комбінувати зі зв'язуючими ГАС-3 молекулами за даним винаходом, відносяться антитіла до молекул на поверхні дендритних клітин, які активують функцію дендритних клітин (ОС) і презентування антигена, антитіла до СО40, що здатні заміщати Т-клітинну хелперну активність і активацію антитіл на костимулюючі молекули Т-клітин, такі як РО-І1, СТІ А-4, ОХ-40 4-188 і
ЇСОЗ5 (див., наприклад, ПО еї а/.(2000) "Епесіїме Ргітіпу ОЇ Сушюохіс Т Гутрпосуїе Ргесигзог5 Ву зирсшапеоив Аатіпівігайоп ОЇ Реріїде Апіїдепв Іп Гірозоте5 Ассотрапієд Ву Апії-С040 Апа
Апіі-СТІ А-4 Апііїбодіе5, "Іттипобріоіоду 201:527-40; патентСшША Мо 5811097; УМеіпрегу еї аї. (2000) "Епдадетепі ої Ше ОХ-40 Кесеріог Іп Мімо Еппапсез Апійштог Іттипйу, " Іттипої 164:2160-2169; Меїего єї аї. (1997) "Мопосіопа! Апіїбодіез Адаїпві Те 4-188 Т-Сеї| Асіїмайоп
МоїІесціе Егадісасе Еетаріїзпей Титог5, " Майшге Меадісіпе 3: 682-685; Ншцоїї еї а. (1999У711С05 і5
Ап Іпаисіріє Т-Сеї! Со-Біітшаюг бігисішгапйу Апа ЕипсіопаПйу Кеїатейд то СО28," Майшге 397: 263- 266; і Могап, А.Е. еї аїЇ. (2013) "Те ТМЕК5 ОХ40, 4-188, апа СО040 Ав Тагдвїв Рог Сапсег
Ітітипоїйегару, " Сип Оріп ІттипоЇї. 2013 Арг; 25(2): 10.1016/).соі.2013.01.004), та/або стимулюючі химерні антигенні рецептори (САК), що містять антиген-зв'язуючий домен, спрямований до антигена захворювання, що злитий 3 одним або декількома внутрішньоклітинними сигнальними доменами з різних рецепторів костимулюючого білка (наприклад, СО28, 4-188, ІСО5, ОХ40 їі т.д.), які призначені для стимуляції Т-клітин при зв'язуванні антигена (див., наприклад, Тейатапії, 5. єї аї. (2013) "Тагоєїїпа Ої Асціє Муєїоїа ІТГешкаєтіа Ву СуюКіпе-Іпдисей КіПег Се Ведігесієй М/йН А Моме! СО123-5ресіїйс Спітенс
Апііїдеп ВРесеріюг, " Вг. У. Наетацої. 161:389-401; СІ, 5. еї а. (2014) "Епнісасу Адаіп5зі Нитап Асше
Муєїоід ГеиКетіа Ап Муевїіоабіайоп ОЇ Моптаї! Нетаїйороїевзі5 п А Моизе Моде! Овіпуд Спітетгіс
Апіїдеп Несеріогї-Моаієа Т Сеїв, " Віоса123(15): 2343-2354; Магаїго5, А. єї а. (2013) "ГТ СеїЇв
Ехргеззіпд СО123-5ресіїйс Спітегіс Апіїдеп Несеріогх Ехпірії Зресіїс Сую/уіс ЕмНесіог Рипсіопе
Апа Апіййтог ЕПесів Адаїп5ї Нитап Асціе Муеіоіа І еиКетіа, " Віоса 122:3138-3148; Ріггіюіа, І. еї аІ. (2014) "СНнітегіс Апіїдеп Ресеріоїв Адаіїпзї СОЗ33/00123 Апіїдепе ЕНісіепнНу Тагдеї Ргітагу
Асшіе Муеїйоїа І ейКетіа СеїЇ5 іп мімо, " ГеиКетіа 28(8):1596-1605).
Зв'язуючі | АОС-3 молекули за даним винаходом можна комбінувати з інгібуючими химерними антигенними рецепторами (ІСАК) для відведення цілеспрямованих імунотерапевтичних відповідей. Антиген-зв'язуючий домен іСАК, що спрямований до антигена захворювання, злитий з одним або декількома внутрішньоклітинними сигнальними доменами з різних інгібуючих рецепторів білка (наприклад, СТІ А-4, РО-1 і т. д.), які призначені для обмеження Т- клітинних відповідей при зв'язуванні антигена (див., наприклад, Редогом М.О. (2013) "РО-1- апа
СТІ А-4-Вазей Іппірйогу Спітегіс Апіїдеп Весеріогв (САН5) Оімей ОН-Тагдеї Іттипоїпегару
Кезропзев, " 5сі Тгапі Мей. 5(215):215га172).
Зокрема, антитіло до | АС-3 за даним винаходом, застосовують у комбінації з антитілом до
СО137, антитілом до ОХ40, антитілом до РО-1, антитілом до РО-І1, антитілом до ТІСІТ, антитілом до ТІМ-3 та/або вакциною проти злоякісних пухлин.
Крім їх корисності у терапії, зв'язуючі ГАС-3 молекули за даним винаходом можна помітити міткою, що детектується, та застосовувати у детекції І АС-3 у зразках або у візуалізації | АС-3 на клітинах.
ХІ. Фармацевтичні композиції
До композицій за даним винаходом відносяться безтарні лікарські композиції, що придатні для виготовлення фармацевтичних композицій (наприклад, неочищених або нестерильних композицій), і фармацевтичні композиції (тобто композиції, які придатні для введення суб'єкту або пацієнту), які можна застосовувати при одержанні стандартних лікарських форм. Такі композиції містять профілактично або терапевтично ефективну кількість зв'язуючих ІАс-З3 молекул за даним винаходом або комбінацію таких засобів і фармацевтично прийнятного носія.
Переважно, композиції за даним винаходом містять профілактично або терапевтично ефективну кількість зв'язуючих ГАС-3 молекул за даним винаходом і фармацевтично прийнятний носій. Даний винахід, зокрема, відноситься до таких фармацевтичних композицій, в яких зв'язуюча | АС-3 молекула являє собою: антитіло (| Ас-3 тАбБ 1, І ДС-3 тАбБ 2, І ДО-3 тАр
З, І да-3 тА 4, І ДОа-3 тАб 5 або І ДО-3 тАБ 6; гуманізоване антитіло І АС-3 тАБ 1; І ДО-3 тАр 2, | да-3 тАБ 3, І ДО-3 тА 4, І ДО-3 тАб 5 або І АО-3 тАБб 6; зв'язуючий І Ас-3 фрагмент будь- якого такого антитіла; або в яких зв'язуюча | АС-3 молекула являє собою біспецифічне діатіло до ГАС-3 (наприклад, ГАС-3 х РО-1 біспецифічне діатіло) Особливо охоплюються такі молекули, які містять З СОК. і З СОКн з ГАО-3 тАБ 1; або які містять З СОР. і З СОРн з І АО-3 тА 2; або які містять З СОВ; і З СОРн з І дО-3 тАБ 3, або які містять З СОВ: і З СОРНн з Г ДО-3 тА 4, або які містять З СОК. і З СОРн з І дО-3 тА 5, або які містять З СОВ: і З СОРНн з Г ДО-3 бо тАб 6.
Даний винахід також відноситься до таких фармацевтичних композицій, які додатково включають друге терапевтичне антитіло (наприклад, пухлинноспецифічне моноклональне антитіло), яке є біспецифічним до конкретного антигена злоякісної пухлини, і фармацевтично прийнятний носій.
Відповідно до конкретного варіанта здійснення, термін "фармацевтично прийнятний" означає такий, що схвалений регуляторним органом федерального уряду або уряду штату або зазначений у переліку у Фармакопеї США або іншої загальновизнаної фармакопеї для застосування на тваринах, а конкретніше, на людях. Термін "носій" відноситься до розріджувача, ад'юванту (наприклад, ад'юванту Фрейнда (повному та неповному), допоміжному засобу або середовищу, з якими вводять терапевтичний засіб. Такими фармацевтичними носіями можуть бути стерильні рідини, такі як вода і олії, у тому числі олії нафтового, тваринного, рослинного або синтетичного походження, такі як арахісова олія, соєва олія, мінеральна олія, кунжутна олія та т.п. Вода є переважним носієм при внутрішньовенному введенні фармацевтичної композиції. Сольові розчини та водні розчини декстрози та гліцерину також можна використовувати як рідкі носії особливо для ін'єкційних розчинів. У число підходящих фармацевтичних допоміжних засобів входять крохмаль, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, борошно, крейда, силікагель, стеарат натрію, моностеарат гліцерину, тальк, хлорид натрію, сухе знежирене молоко, гліцерин, пропілен, гліколь, вода, етанол та ін. За необхідності, композиція може також містити незначні кількості змочуючих або емульгуючих засобів або засобів для буферизації рН. Ці композиції можуть приймати форму розчинів, суспензій, емульсії, таблеток, пігулок, капсул, порошків, композицій з уповільненим вивільненням та ін.
Зазвичай, інгредієнти композицій за даним винаходом постачають або окремо, або у змішаному один з одним стані в одиничній лікарській формі, наприклад, у вигляді сухого ліофілізованого порошку або безводного концентрату у герметично закритій ємності, такої як ампула або саше, із зазначенням кількості активного засобу. Якщо композицію необхідно вводити шляхом інфузії, вона може бути дозованою за допомогою інфузійного флакона, що містить стерильну фармацевтичну воду або сольовий розчин. Якщо композицію вводять шляхом ін'єкції, може бути надана ампула стерильної води для ін'єкцій або сольового розчину, з тим щоб інгредієнти можна було змішати перед введенням.
Композиції за даним винаходом можуть бути складені у вигляді нейтральних або сольових форм. Фармацевтично прийнятні солі включають без обмеження солі, що утворені аніонами, такими як аніони, що походять з соляної, фосфорної, оцтової, щавлевої, винної кислот і т. д., |і солі, що утворені катіонами, такими як катіони, що походять з гідроксидів натрію, калію, амонію, кальцію, заліза, ізопропіламіну, триетиламіну, 2-етиламіноетанола, гістидину, прокаїну і т. д.
Даний винахід також відноситься до фармацевтичної упаковки або набору, які містять одну або декілька ємностей, що заповнені зв'язуючою ГАС-3 молекулою за даним винаходом (їі більше переважно антитілом ГАС-3 тАбр 1, ГАС-3 тА 2, ГАС-3 тАбБ 3, ГАС-3 тА 4, І Да-3 тА 5 або ГАс-3 тАБ 6; гуманізованим антитілом ГАС-3 тАБ 1; ГАС-3 тАБ 2, І АС-3 тА 3,
ГАС-3 тА 4, ГАС-3 тА 5 або І АО-3 тАБб 6; зв'язуючим І АС-3 фрагментом будь-якого такого антитіла; або в яких зв'язуюча ГАС-3 молекула являє собою біспецифічне діатіло до ГАс-3 (наприклад, ГАС-3 х РО-1 біспецифічне діатіло)). Особливо охоплюються такі молекули, які містять З СОК. і З СОКн з ГАО-3 тАБ 1; або які містять З СОР): і З СОРн з ГАО-3 тА 2; або які містять З СОК. і З СОКн з ГАО-3 тАБ 3, або які містять З СОР: і З СОВн з ГАО-3 тА 4, або які містять З СОК. і З СОКНн з ГАО-3 тА 5, або які містять З СОК. і З СОКн з ГАО-3 тАБ 6, окремо або з таким фармацевтично прийнятним носієм. Крім того, у фармацевтичну упаковку або набір також можуть бути включені один або декілька інших профілактичних або терапевтичних засобів, що придатні для лікування захворювання. Даний винахід також відноситься до фармацевтичної упаковки або набору, що містить одну або декілька ємностей, що заповнені одним або декількома інгредієнтами фармацевтичних композицій за даним винаходом. З такою ємністю(ємностями) необов'язково може бути асоційоване інформаційне повідомлення у формі, що наказана урядовим органом, що регулює виробництво, застосування або продаж фармацевтичних препаратів або біологічних продуктів, при цьому в інформаційному повідомленні відображено схвалення таким органом виробництва, застосування або продажу для прийому людиною.
Даний винахід відноситься до наборів, які можна застосовувати у способах, що описані вище. Набір може містити будь-яку зі зв'язуючих ГАС-3 молекул за даним винаходом. Набір може додатково містити один або декілька інших профілактичних і/або терапевтичних засобів, що придатні для лікування злоякісної пухлини, в одній або декількох ємкостях; і/або набір може 10) додатково містити одне або декілька цитотоксичних антитіл, які зв'язують один або декілька антигенів злоякісної пухлини, які асоційовані зі злоякісною пухлиною. Відповідно до деяких варіантів здійснення, інший профілактичний або терапевтичний засіб являє собою хіміотерапевтичний засіб. Відповідно до інших варіантів здійснення, профілактичний або терапевтичний засіб являє собою біологічний або гормональний терапевтичний засіб.
ХІІ. Способи введення
Композиції за даним винаходом можуть бути передбачені для лікування, профілактики та полегшення одного або декількох симптомів, що асоційовані із захворюванням, порушенням або інфекцією, шляхом введення суб'єкту ефективної кількості злитого білка або кон'югованої молекули за даним винаходом або фармацевтичної композиції, що містить злитий білок або кон'юговану молекулу за даним винаходом. Відповідно до переважного аспекту, такі композиції є практично чистими (тобто практично не містять речовин, які обмежують її дію або викликають небажані побічні ефекти). Відповідно до конкретного варіанта здійснення, суб'єктом є тварина, переважно ссавець, така як ссавець, що відмінна від примату, (наприклад, бичачі, кінські, котячі, псові, гризуни та т. д.) або примат (наприклад, мавпа, така як яванська макака, людина та т. д.).
Відповідно до переважного варіанта здійснення, суб'єктом є людина.
Відомі різні системи доставлення, і їх можна застосовувати для введення композицій за даним винаходом, наприклад, інкапсулювання у ліпосомах, мікрочастинках, мікрокапсулах, рекомбінантних клітинах, що здатні експресувати антитіло або злитий білок, ендоцитоз, що опосередкований рецепторами (див., наприклад, УМи еї аІ.(1987) "Кесеріог-Медіаївд Іп Міто
Сепе Тгапзіогтайоп Ву А Боїшбіе ОМА Сагієег Зузіет, " У. Віої. Спет. 262:4429-4432), конструювання нуклеїнової кислоти як частини ретровірусного або іншого вектора та т.д.
Способи введення молекули за даним винаходом передбачають без обмеження парентеральне введення (наприклад, внутрішньошкірне, внутрішньом'язове, внутрішньоочеревинне, внутрішньовенне та підшкірне), епідуральне та крізьслизове (наприклад, інтраназальні та пероральні шляхи). Відповідно до конкретного варіанта здійснення, зв'язуючі (| А(С-3 молекули за даним винаходом вводять внутрішньом'язово, внутрішньовенно або підшкірно. Композиції можна вводити будь-яким зручним шляхом, наприклад, за допомогою інфузії або болюсної ін'єкції, за допомогою абсорбції крізь епітеліальні або слизові оболонки (наприклад, слизову оболонку порожнини рота, слизову оболонку прямої кишки та кишечника і т. д.), і можна вводити разом з іншими біологічно активними засобами.
Введення може бути системним або локальним. Крім того, також можна використовувати легеневе введення, наприклад, із застосуванням інгалятора або небулайзера та складу з аерозолюючим засобом. Див., наприклад, патенти США МоМо 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 і 4880078; і РСТ публікації УМО 92/19244, УМО 97/32572, МО 97/44013, ММО 98/31346 і УУО 99/66903, кожна з яких включена у даний документ за допомогою посилання у повному її обсязі.
Даний винахід також відноситься до того, що зв'язуючі ГАС-3 молекули за даним винаходом упаковані у герметично закриту ємність, таку як ампула або саше, на якій зазначена кількість молекули. Відповідно до одного варіанта здійснення, такі молекули поставляють у вигляді сухого стерилізованого ліофілізованого порошку або безводного концентрату у герметично закритій ємності, та їх можна ресуспендувати, наприклад, водою або сольовим розчином до відповідної концентрації для введення суб'єкту. Переважно, зв'язуючі | АС-3 молекули за даним винаходом, поставляють у вигляді сухого стерильного ліофілізованого порошку у герметично закритій ємності.
Ліофілізовані зв'язуючі | АС-3 молекули за даним винаходом слід зберігати при температурі від 2 "С до 8 "С в їх вихідній ємності, та молекули слід вводити у межах 12 годин, переважно у межах 6 годин, у межах 5 годин, у межах З годин або у межах 1 години після ресуспендування.
Відповідно до альтернативного варіанта здійснення, такі молекули поставляють у рідкій формі у герметично закритій ємності із зазначенням кількості та концентрації молекули, злитого білка або кон'югованої молекули. Переважно, такі зв'язуючі | АС-3 молекули, якщо вони представлені у рідкій формі, поставляють у герметично закритій ємності.
Кількість композиції за даним винаходом, яка буде ефективною при лікуванні, попередженні або полегшенні одного або декількох симптомів, що асоційовані з порушенням, можна визначити за допомогою стандартних клінічних методик. Точна доза, яка буде використана у складі, також буде залежати від шляху введення та від тяжкості стану та повинна визначатися на розсуд практикуючого клініциста та з урахуванням обставин для кожного пацієнта. Ефективні дози можна екстраполювати з кривих залежностей доза-відповідь, що одержані з тест-систем іп міго або на модельних тваринах.
У контексті даного документа "ефективна кількість" фармацевтичної композиції, відповідно 10) до одного варіанта здійснення, являє собою кількість, що достатня для досягнення корисних або необхідних результатів, включаючи без обмеження клінічні результати, такі як зменшення симптомів, які викликані захворюванням, ослаблення симптому інфекції (наприклад, вірусного навантаження, лихоманки, болю, сепсису та т. д.) або симптому злоякісної пухлини (наприклад, проліферації клітин злоякісної пухлини, наявність пухлини, метастаз пухлини та т. д.), тим самим підвищуючи якість життя страждаючих захворюванням, зменшуючи дозу інших лікарських препаратів, що необхідних для лікування захворювання, підсилюючи ефект іншого лікарського препарату, наприклад, шляхом націлювання та/або інтерналізації, затримуючи прогресування захворювання та/або продовжуючи дожиття індивідуумів.
Ефективну кількість можна вводити за одне або декілька введень. У контексті даного винаходу ефективна кількість лікарського засобу, сполуки або фармацевтичної композиції являє собою кількість, що достатня для зменшення проліферації (або ефекту) вірусної присутності та для зменшення та/або уповільнення розвитку вірусного захворювання, або безпосередньо, або опосередковано. Відповідно до деяких варіантів здійснення, ефективна кількість лікарського засобу, сполуки або фармацевтичної композиції може бути або не бути досягнута у поєднанні з іншим лікарським засобом, сполукою або фармацевтичною композицією. Таким чином, "ефективну кількість" можна розглядати у контексті введення одного або декількох хіміотерапевтичних засобів, і один засіб можна розглядати як такий, який дають в ефективній кількості, якщо у поєднанні з одним або декількома іншими засобами може бути досягнутий або досягається необхідний результат. Незважаючи на те, що індивідуальні потреби розрізняються, визначення оптимальних діапазонів ефективних кількостей кожного компонента входить у компетенцію фахівців у даній галузі техніки.
Для зв'язуючих ГАС-3 молекул, що охоплюються даним винаходом (наприклад, антитіл, діатіл і т.д.), дозування, що вводиться пацієнту, переважно визначають, виходячи з маси тіла (кг) суб'єкта, який приймає таку молекулу. Для зв'язуючих І АС молекул, що охоплюються даним винаходом, дозування, що вводиться пацієнту, зазвичай становить щонайменше приблизно 0,01 мкг/кг маси тіла, щонайменше приблизно 0,05 мкг/кг маси тіла, щонайменше приблизно 0,1 мкг/кг маси тіла, щонайменше приблизно 0,2 мкг/кг маси тіла, щонайменше приблизно 0,5 мкг/кг маси тіла, щонайменше приблизно 1 мкг/кг маси тіла, щонайменше приблизно 2 мкг/кг маси тіла, щонайменше приблизно З мкг/кг маси тіла, щонайменше приблизно 5 мкг/кг маси тіла, щонайменше приблизно 10 мкг/кг маси тіла, щонайменше приблизно 20 мкг/кг маси тіла, щонайменше приблизно 30 мкг/кг маси тіла, щонайменше приблизно 50 мкг/кг маси тіла, щонайменше приблизно 100 мкг/кг маси тіла, щонайменше приблизно 250 мкг/кг маси тіла, по щонайменше приблизно 750 мкг/кг маси тіла, щонайменше приблизно 1,5 мг/кг маси тіла, щонайменше приблизно З мг/кг маси тіла, щонайменше приблизно 5 мг/кг маси тіла або щонайменше приблизно 10 мг/кг, щонайменше приблизно 30 мг/кг, щонайменше приблизно 50 мг/кг, щонайменше приблизно 75 мг/кг, щонайменше приблизно 100 мг/кг, щонайменше приблизно 125 мг/кг, щонайменше приблизно 150 мг/кг або більше маси тіла. Розраховану дозу будуть вводити, виходячи з маси тіла пацієнта на вихідному рівні лікування. Значна (210 95) зміна маси тіла від вихідного рівня або маси за плато, що встановилося, повинна призводити до перерахунку дози.
Відповідно до деяких варіантів здійснення, дозування, що вводиться пацієнту, зв'язуючих
ГАС-3 біспецифічних молекул (наприклад, діатіл і тривалентних зв'язуючих молекул), що охоплюються даним винаходом, зазвичай становить щонайменше від приблизно 0,3 нг/кг на добу до приблизно 0,9 нг/кг на добу, щонайменше від приблизно 1 нгкг на добу до приблизно З нг/кг на добу, щонайменше від приблизно З нг/кг на добу до приблизно 9 нг/кг на добу, щонайменше від приблизно 10 нг/кг на добу до приблизно 30 нг/кг на добу, щонайменше від приблизно 30 нг/кг на добу до приблизно 90 нг/кг на добу, щонайменше від приблизно 100 нг/кг на добу до приблизно 300 нг/кг на добу, щонайменше від приблизно 200 нг/кг на добу до приблизно 600 нг/кг на добу, щонайменше від приблизно 300 нг/кг на добу до приблизно 900 нг/кг на добу, щонайменше від приблизно 400 нг/кг на добу до приблизно 800 нг/кг на добу, щонайменше від приблизно 500 нг/кг в добу до приблизно 1000 нг/кг на добу, щонайменше від приблизно 600 нг/кг на добу до приблизно 1000 нг/кг на добу, щонайменше від приблизно 700 нг/кг на добу до приблизно 1000 нг/кг на добу, щонайменше від приблизно 800 нг/кг на добу до приблизно 1000 нг/кг на добу, щонайменше від приблизно 900 нг/кг на добу до приблизно 1000 нг/кг на добу або становить щонайменше приблизно 1000 нг/кг на добу. Розраховану дозу будуть вводити, виходячи з маси тіла пацієнта на вихідному рівні лікування. Значна (210 95) зміна маси тіла від вихідного рівня або маси за плато, що встановилося, повинна призводити до перерахунку дози.
Відповідно до іншого варіанта здійснення, введення пацієнту здійснюють згідно з режимом бО лікування, що передбачає одну або декілька доз такої профілактично або терапевтично ефективної кількості зв'язуючої | АС-3 молекули за даним винаходом, причому введення згідно з режимом лікування здійснюють протягом 2 діб, З діб, 4 діб, 5 діб, 6 діб або 7 діб. Відповідно до деяких варіантів здійснення, режим лікування передбачає періодичне введення доз профілактично або терапевтично ефективної кількості зв'язуючих ГАС-3 молекул за даним винаходом (наприклад, введення дози на 1-у добу, на 2-у добу, на 3-ю добу та на 4-е добу заданого тижня) та не введення доз профілактично або терапевтично ефективної кількості зв'язучої | АС-3 молекули (і, зокрема, антитіла ГАС-3 тАБ 1, І АС-3 тА 2, І АС-3 тАБ 3, І да-3 тАб 4, І дО-3 тА 5, І ДО-3 тА 6, гуманізованого антитіла І АО-3 тАБ 1, І АИ-3 тА 2, І АО-3 тАб 3, І Аа-3 тАБ 4, ГА 0-3 тА 5 або І АОС-3 тА 6, зв'язуючого І АС-3 фрагмента будь-якого такого антитіла або в якому зв'язуюча І АС-3 молекула являє собою біспецифічне І АС-3 діатіло (наприклад, ГАС-3 х РО-1 біспецифічне Ес-діатіло)). Особливо охоплюється введення (на 5-ту добу, на 6б-ту добу та на 7-му добу того же тижня) молекул, які містять З СОН. і З СОКн з І ДО-3 тА 1; або які містять З СОК. і З СОРн з І дО-3 тАБ 2; або які містять З СОВ: і З СОРНн з Г дО-3 тА 3, або які містять З СОК. і З СОРн з І дАО-3 тА 4, або які містять З СОВ: і З СОРНн з Г ДО-3 тА 5, або які містять З СОК: і З СОКн з ГАС-3 тАБ 6. Зазвичай має місце 1, 2, 3, 4, 5 або більше курсів лікування. Кожний курс може мати такий же режим або інший режим лікування.
Відповідно до іншого варіанта здійснення, дозу, що вводиться, підвищують протягом першої чверті, першої половини або перших двох третин або трьох чвертей режиму(-ів) (наприклад, протягом першого, другого або третього режиму лікування з 4 курсів) до тих пір, доки досягають добової профілактично або терапевтично ефективної кількості зв'язуючої | АС-3 молекули. У таблиці 6 наведені 5 прикладів різних режимів прийому доз, що описані вище, для типового курсу лікування діатілом.
Таблиця 6 (нг діатіла на кг маси суб'єкта на добу) 85,6,7 ні Фні Ін Ін снб пиши ши шини шшши шини шини ши 85,6,7 ні Фні Ін Ін снб пиши шини шини шини шини ши 85,6,7 ні Фні Ін Ін снб пиши ши шини шини шини шини ши о 5,6,7 ні Ї|ні//ТЇнб//Їні///(нб///
Дозування та частоту введення зв'язуючої ГАС-3 молекули за даним винаходом можна зменшити або змінити шляхом посилення поглинання та проникнення у тканину молекули за допомогою таких модифікацій, як, наприклад, ліпідизація.
Дозування зв'язуючої | АС-3 молекули за даним винаходом, що вводиться пацієнту, можна розрахувати для застосування як монотерапії. Альтернативно, молекулу можна застосовувати у комбінації з іншими терапевтичними композиціями, і дозування, що вводиться пацієнту, буде нижче, ніж при застосуванні зазначених молекул як монотерапії.
Фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити локально в область, що потребує лікування; це можна здійснити, наприклад, шляхом без обмеження локальної інфузії, шляхом ін'єкції або за допомогою імплантату, причому зазначений імплантат являє собою пористий, непористий або желатіноподібний матеріал, включаючи мембрани, такі як мембрани зікаїавііс, або волокна. Переважно, при введенні молекули за даним винаходом слід проявляти обережність у випадку застосування матеріалів, в яких молекула не абсорбується.
Композиції за даним винаходом можна доставляти у везикулі, зокрема, у ліпосомі (див.
Гапдег (1990) "Мем Метоаз ОЇ Огид Оеїїмегу, " Зсіепсе 249:1527-1533); Тгеаї єї аї., іп ГПрозотев іп Ше Тнегару ої Іптесіїои5 Оізеазе апа Сапсег, І оре2-Вегевзівїп апа РіаІег (едв.), І ів5, Мем/ МО, рр. 353-365 (1989); І оре2-Вегезівіп, іріа., рр. З 17-327).
Композиції за даним винаходом можна доставляти у системі з контрольованим вивільненням або з уповільненим вивільненням. Для одержання складів з уповільненим вивільненням, що містять одну або декілька із зв'язуючих | АС-3 молекул за даним винаходом, можна застосовувати будь-яку методику, що відома фахівцю у даній галузі техніки. Див., наприклад, патент США Мо 4526938; РСТ публікацію М/О 91/05548; РСТ публікацію УМО 96/20698; Міпуд єї а!(1996) "Іпігашштога! Вадіоіїттипоїйегарпу ОЇ А Нитап Соїоп Сапсег
Хеподгай Овіпа А Бивзіаіпед-Кеїеєазе Сеї, " Кадіомшегару 8. Опсоіоду 39:179-189, опа еї а!. (1995) "Апіїроду Меадіаїед Гипду Тагодеїййпа Ог Гопд-Сігошайпод Етиївіоп5, "РОСА дошиптаї ої Рпагтасеціїсаї
Зсіепсе а Тесппоіоду 50:372-397; Сієек еї а!. (1997) "Віодеагадабіє Роїутетгіс Сатівєт5 Гог А БЕРИ
Апііроду Рог Сагаіомазсціаг Арріїсайоп, " Рго. ІпгІ. зутр. Сопігої. Кеї. Віоасі. Магїег. 24:853-854; та ат еї аї. (1997) "Містоепсарзиціайоп ОЇ Весотбіпапі Нитапігед Мопосіопа! Апіїбоду Рог Госаї
Оеєїїмегу, " Ргос. ІпгІ. Зутр. Сопігої Кеї. Віоасі. Маїег. 24:759-760, кожна з яких включена у даний документ за допомогою посилання у повному її обсязі. Відповідно до одного варіанта здійснення, можна застосовувати помпу у системі з контрольованим вивільненням (див. Гапдег, раніше; Зейоп, (1987) "тріапіаріе Ритрв5, " СКС Стій. Кеу. Віотей. Епод. 14:201-240; Виспма!а єї а!. (1980) "Гопд-Тегпт, Сопіїпиоив Іпігамепои5 Нераїіп Аатіпівігайоп Ву Ап Ітріапіавіє Іпгивіоп
Ритр Іп Атриїагогу Раїїєпів МИ Несштепі Мепоиз Тпготрбровів, " Зигдегу 88:507-516; і зацаек єї аІ. (1989) "А Ргеїїтіпагу Та! ОЇ Те Ргодгаттабіє Ітріапіаріє Медісайоп бЗувзієт Рог Іпвиїїп
Оеїїмегу, " М. ЕпоїЇ. У. Мей. 321:574-579). Відповідно до іншого варіанта здійснення, для досягнення контрольованого вивільнення молекул можна застосовувати полімерні матеріали (див., наприклад, Меадіса! Арріїсайоп5 ої СопігоПей Кеїеєазе, Гапдег апа Уу/ізе (еаз5.), СКС Ргезв.,
Воса Наюп, Ріогіда (1974); Сопітоїей Огид Віоамайаріїйу, Огид Ргодисі Оеєзідп апа Репоптапсе, тоїеп апа Ваї! (ед5.), ММПеу, Мем/ Моїк (1984); І ему еї аї. (1985) "Іппірйоп ОГ Саїсіїісайоп ОЇ
Віоргозіпеїйс Неапй МаїЇмез5 Ву Госа! СопігоїІєд-КеІеазе Рірпозрпопаїе, " Зсіепсе 228:190-192;
Ригіпду еї аї. (1989) "СопігоПей Веїєазе ОЇ Юоратіпе Ггот А Роїутетгіс Вгаїп Іпріапі: п Мімо
Спагасіегігайоп, " Апп. Менигої. 25:351-356; Номага еї а!. (1989) "Іпігасегебга! Огид Оеєїїмегу Іп ВНаїб
М/Н Гевіоп-Іпдисей Метогу ЮОеїйсійв5, " У. Меигозигу. 7(1):105-112); патент США Мо 5679377, патент США Мо 5916597, патент США Мо 5912015, патент США Мо 5989463, патент США Мо 5128326, РСТ публікацію М/О 99/15154 та РСТ публікацію УМО 99/20253). У число прикладів полімерів, що застосовуються у складах з уповільненим вивільненням, входять без обмеження полі(2-гідроксиетилметакрилат), полі(метилметакрилат), полі(акрилова кислота), сополімери етилену та вінілацетату, поли(метакрилова кислота), полігліколіди (РІ С), поліангідриди, полі(М- вінілпіролідон), полівініловий спирт, поліакриламід, полі(етиленгліколь), полілактиди (РІА), сополімери лактиду та гліколіду (РІ СА) і складні поліортоефіри. Систему з контрольованим вивільненням можна розмістити поблизу терапевтичної мішені (наприклад, легенів), таким чином буде необхідна лише частина системної дози (див., наприклад, бСоодзоп, іп МЕВІСАЇ.
АРРІИІСАТІОМ5 ОБ СОМТКОЇЇГЕО РЕГЕАЗЕ, раніше, мої. 2, рр. 115-138 (1984)). Полімерні композиції, що придатні як імплантати з контрольованим вивільненням, можна застосовувати відповідно до Юипп ей аїЇ. (див.0.5. 5945155). Цей конкретний спосіб заснований на терапевтичному ефекті контрольованого іп 5йи вивільнення біоактивного матеріалу з полімерної системи. Імплантація зазвичай може відбуватися у будь-якому місці організму пацієнта, що потребує терапевтичного лікування. Можна застосовувати неполімерну систему безперервної доставки, при цьому як система доставки лікарського засобу в організмі суб'єкта застосовують неполімерний імплантат. При імплантації в організм органічний розчинник імплантату буде руйнуватися, диспергуватися або вимиватися з композиції у навколишню тканинну рідину, а неполімерний матеріал буде поступово коагулювати або осідати з утворенням твердої мікропористої матриці (див. 5 5888533).
Системи з контрольованим вивільненням розглянуті в огляді І апдег (1990, "Мем/ Меїтодз ОЇ
Огид Овєїїмегу, " Зсіеєпсе 249: 1527-1533). Для одержання складів з уповільненим вивільненням, що містять один або декілька терапевтичних засобів за даним винаходом, можна застосовувати будь-яку методику, що відома фахівцю у даній галузі техніки. Див., наприклад, патент США Мо 4526938; міждународні публікації УМО 91/05548 і УМО 96/20698; Міпд єї а1!.(1996) "Іпігаїштогаї
Вадіоіттипоїйегарпу ОЇ А Нитап Соїоп Сапсег Хеподгай Овіпд А Зивіаіпед-КеїІеазе сеї, "
Вадіоїегару 5 Опсоіоду 39:179-189, 5опд єї аї. (1995) "Апіроду Меадіатва І ипд Тагдеїйту ОЇ
Гопд-Сігошаєпуд ЕЄтиїбвіоп5, "РА дУошигпа! ої Рпагтасешіса! 5сіепсе 5 Тесппоїоду 50:372-397;
СіІеєекК еї аї. (1997) "Віодедгадаріє Роїутегтіс Сатієт5 Бог А БЕРСЕ Апіїроду Еог Сагаіомазсшіаг
Арріїсайоп, " Рго. ІпгІ. Зутр. СопігоЇ. Кеї. Віоасі. Маїег. 24:853-854; та їат еї аї. (1997) "Місгоепсарзшайноп ОЇ Кесотрбіпапі Нитапігей Мопосіопа! Апіїбоду Рог Госаї! Оеєїїмегу, " Ргос.
Інт!. Зутр. Сопігої! Веї. Віоасі. Маїег. 24:759-760, кожна з яких включена у даний документ за допомогою посилання у повному її обсязі.
Якщо композиція за даним винаходом являє собою нуклеїнову кислоту, що кодує зв'язуючу
ІГА(-3 молекулу за даним винаходом, нуклеїнову кислоту можна вводити іп мімо для стимуляції експресії зв'язуючої ГАС-3 молекули, що кодується нею, шляхом конструювання її як частини відповідного вектора експресії нуклеїнової кислоти та введення його таким чином, щоб він став внутрішньоклітинним, наприклад, за допомогою ретровірусного вектора (див. патент США Мо 4980286), або шляхом прямої ін'єкції або за допомогою бомбардування мікрочастинками (наприклад, генної гармати; Віоїїсїіс, биропО), або покриття ліпідами або рецепторами клітинної (610) поверхні або транспортуючими засобами, або шляхом введення його у поєднанні з гомеобоксоподібним пептидом, про який відомо, що він потрапляє всередину ядра (див., наприклад, чоїйої єї а!І.«1991) "Апіеппаредіа Нотеобох Рерііде Кедшіагез Меишга! Могрподепезвів, "
Ргос. Маїй. Асад. сі. (0.5.А.) 88:1864-1868) і т. д. В альтернативному варіанті нуклеїнову кислоту можна ввести внутрішньоклітинно та вбудувати у ДНК клітини-хазяїна для експресії шляхом гомологічної рекомбінації.
Лікування суб'єкта терапевтично або профілактично ефективною кількістю зв'язуючої І Ас-3 молекули за даним винаходом може передбачати однократне лікування або, переважно, може передбачати серію лікувань. У переважному прикладі суб'єкта лікують таким діатілом один раз на тиждень протягом приблизно 1-10 тижнів, переважно 2-8 тижнів, більше переважно приблизно 3-7 тижнів і ще більше переважно протягом приблизно 4, 5 або 6 тижнів.
Фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити раз на добу, два рази на добу або три рази на добу. В альтернативному варіанті фармацевтичні композиції можна вводити раз на тиждень, два рази на тиждень, раз на два тижні, раз на місяць, раз у шість тижнів, раз у два місяці, два рази на рік або раз на рік. Також буде зрозуміло, що ефективне дозування молекул, що застосовуються для лікування, може збільшуватися або зменшуватися у ході курсу конкретного лікування.
Приклади
Тепер, після опису у загальних рисах даного винаходу, те ж саме буде більше зрозумілим при зверненні до наведених далі прикладів, які представлені як ілюстрації та не призначені для обмеження даного винаходу, якщо не зазначено інше. Фахівцям у даній галузі техніки буде очевидно, що на практиці може бути реалізовано багато модифікацій як у відношенні матеріалів, так і у відношенні способів без відступу від обсягу даного розкриття.
Приклад 1
Характеристика моноклональних антитіл до (Г Ас-3: | ДО-3 тАБ 1, І ДО-3 тАб 2, І Аа-3 тАр
З, ТАИ-З3 тАБ 4, І АС-3 тА 5 і ГАС-3 тА 6
Шість мишачих моноклональних антитіл виділяли як такі, що здатні імуноспецифічно зв'язуватися з | АС-3 як людини, так і яванскої макаки, та давали їм позначення "ГАС-3 тАБ 17", "ГАС-3З тА 2", "| АС-З тАб 3", "| АС-З тА 4", "| АС-З тА 5" і "ГАС-3 тА 6". Було виявлено, що СОК цих антитіл відрізняються, і вони наведені вище. ГАС-3 тАБб 1 піддавали гуманізації, що давало на виході два гуманізованих домени УН, що позначені у даному документі як "У/Н-1
ПГАС-З тАБ 1" ії "МН-2 п АС-3 тАбБ 1", ії чотири гуманізованих домени Мі, що позначені у даному документі як "МІ -1 ПІ да-3 тА 1", "МІ -2 п да-3 тАбБ 1", "МІ -3 НГ АС-3 тА 1" і "МІ 4
ПГАС-З тАБ 1". Ії АО-3 тА 6 також гуманізували, що давало на виході два гуманізованих домени МН, що позначені у даному документі як "МН-1 ПІ Ас-3 тА 6" ії "МН-2 НІ АО-3 тА 6", і два гуманізованих домени Мі, що позначені у даному документі як "Мі -1 ПІ Аа-3 тА 6" і "МІ -2
ПГАС-3 тА 6". Як зазначено вище, гуманізовані варіабельні домени важких і легких ланцюгів зазначеного антитіла можна застосовувати у будь-якій комбінації, а конкретні комбінації гуманізованих варіабельних доменів зазначені за допомогою посилання на конкретні домени
МНЛІ/Ї, наприклад, гуманізоване антитіло, що містить МН-1 НІ АС-3 тАБ 1 ії МІ -2 НІ АС-3 тАБ 1, зокрема, зазначено як "п АС-3 тАбБ 1(1.2)».
Повнорозмірні гуманізовані тАБ були сконструйовані наступним чином: С-кінець гуманізованого домену Мі зливали з М-кінцем каппа-ділянки легкого ланцюга людини з одержанням легкого ланцюга, та кожний легкий ланцюг спарювали з важким ланцюгом, що містить гуманізований домен УН того ж антитіла, злитий з М -кінцем або константної ділянки
ІД991 людини, що містить заміни І 234А/ 235А(АА), або константної ділянки 904 людини, що містить заміну 5228Р.
Амінокислотна послідовність ілюстративної константної ділянки 91 людини, що містить заміни І 234А/ 235А (АА) (ЗЕО ІЮ МО:139):
АБТКОРОМЕР ГАРВБОКОТОО СТААГОСЬМК ПУЕРЕРУТУ5В ЯМОБСАГТВОоОУ
НТЕРАМГОВве су веВУМТ МРГ ОТОТ УХІСМУМНКРО МТКУрКЕМЕР
К5СОКТНТІСР РСОСРАРЕААССО РОУЕГЕРРКР КОТІМІБКТР БУТСУУУрУВ
НЕОРЕУКЕМИ УУрОУВУНМА КТКЕРКЕЕОУМ БтувУуУБУТтТ УгБнОори мок
ЕТКСКУБМКА ГПРАРІЕКТІВ КАКСОРЕЕРО МУТОРРОКЕЕ МІКМОУБІТС
ТІМКОЕТРОБОЇ АМЕШЕОБМООР ЕММУКТТРРМ ГОБОСеКВгу ВБКЕОТУрКо Ки
СОБбМУвЕвБСВУ МНЕАГНМНУТ ОоКкоГОГОРОХ де Х являє собою лізин (К) або відсутній.
У ЗЕО ІО МО:139 амінокислотні залишки 1-98 відповідають домену СНІ ІЇдсС1 (ЗЕО ІО МО: 120), амінокислотні залишки 99-113 відповідають шарнірній ділянці їдс1 (ЗЕО І МО: 114), а амінокислотні залишки 114-329 відповідають домену СН2-СНЗ Ід, що містить заміни
І 234А/ 235А (підкреслені) (ЗЕО ІЮ МО:123).
Амінокислотна послідовність ілюстративної константної ділянки ЇД4 людини, що містить заміну 5228Р (ЗЕО ІЮ МО:140):
АВБТКОРОБМЕР ГАРСВКОТОЬЕ БТААГБОСІМК ПУЕРЕРУТУЄ йМеСАГПТтТВвОоМ
НТЕРАУМТОве увів МРООБІОТКТ УТСОМУОНКРО МІКУрКеУЕо
КІСРРОРРСР АРЕЕГОСРОМ ЕБЕРРКРКОТ ГМІБЕТРЕУМТ СУУУрУВОВвр
РЕУОВЕМИХУЮ СБУВЕУНМАКТК РКЕЕОВЕМОТУ КУУБУПТМІН ОПММОКЕМК
СКУБМКОРО Б5БІВКТІБКАК СОРБЕРОМУТ ГРРООВБЕМТК МОУВБІТСТУК
СЕУРООТАУЕ МЕБМСООРЕММ УКТТРРУГПОВ ПОБЕЕГПУеВБКІ ТУрКОКИсЕС
МУгБСВУМНЕ АПНМНУТОКо ГеГоГОоХ де Х являє собою лізин (К) або відсутній.
У ЗЕО ІЮО МО:140 амінокислотні залишки 1-98 відповідають домену СНІ Ідс4 (ЗЕО ІО МО: 122), амінокислотні залишки 99-110 відповідають стабілізованій шарнірній ділянці Ідсе4, що містить заміни 5228Р (підкреслені) (ЗЕО ІО МО: 117), а амінокислотні залишки 111-326 відповідають домену СН2-СНЗ Ідс4 (5ЕО І МО 4).
Кінетику зв'язування антитіл | АС-3 тАБ 1, І АС-3 тА 2, ГГ ДИ-3 тАБ 3, І ДО-3 тАБ 4, І ДИ-3 тА 5, І дО-3 тА 6, декількох гуманізованих й еталонного антитіла І АОс-3 тАБ А досліджували з використанням аналізу Віасоге. Антитіла до | АС-3 захоплювали та інкубували з Нібх-міченим розчинним ГАС-3 людини (5ПІГ АС-3-Нів), а кінетику зв'язування визначали за допомогою аналізу
Віасоге. Розрахункові Ка, Ка і КО представлені у таблиці 7.
Таблиця 7
АСЗтАВА ЇЇ 777777777771787 1111754 | 117171717171711111711106 1
ІАС-З тАб 32
АС тАрЯа 77 777777777171711712 Ї77717117193 | щюю77777708 2
АС тАрба. | 777777777717117714 77711113 Ї7777717171717171717171711108 1
ІАС-З тАб 62
Таблиця 7 (продовження) а - захоплене на іммобілізованому Бар2 кози до мишачого Ес р - захоплене на іммобілізованому білку С с - захоплене на іммобілізованому Бар2 кози до людського Ес й - захоплене на іммобілізованому білку А е - людський ІДС1 (АА) геІдо4 (5228)
У додаткових дослідженнях досліджували кінетику зв'язування гуманізованих антитіл ПІ Ас-
З тАБ 1 (1.4) і ПГАО-3 тА 6 (1.1) й еталонного антитіла ГАС-3 тАБ А до ГАС-3 як людини, так і яванської макаки за допомогою аналізу Віасоге. У цих дослідженнях розчинний злитий білок з розчинним ГАС-3 (позаклітинним доменом ГАС-3 людини або яванської макаки, що злитий з
Іцс2а миші) захоплювали на поверхні з Рабра2 кози до Ес миші та інкубували з антитілом до ГГ Ас-
З, а кінетику зв'язування визначали за допомогою аналізу Віасоге. Криві зв'язування для ГАС-3 тА А, ПІ АС-3 тА 1 (1.4) ії ПГАС-3 тАб 6 (1.1), що зв'язуються з | АС-3 яванської макаки, показані відповідно на Фіг. 7А-7С, а розрахункові Ка, Ка і КО представлені у таблиці 8. В окремому дослідженні вивчали зв'язування біспецифічного діатела, що містить Ес-ділянку, що включає ПГАС-3 тА 6 (1.1) до ГАС-3 як людини, так і яванської макаки, з допомогою аналізу
Віасоге. У цьому дослідженні діатело, що містить ПІ АС-3 тА 6 (1.1), захоплювали на поверхні з Бар2 кози до Ес людини та інкубували зі злитим білком з розчинним ГАС-3 (позаклітинним доменом І АС-3 яванської макаки або людини, що злитий з Ніб-міткою), а кінетику зв'язування визначали за допомогою аналізу Віасоге. Розрахункові Ка, Ка і КО представлені у таблиці 8.
Таблиця 8 о вттюдюіися о в вк корму
Антитіло до І АО-3 Ка Ка КО Ка Ка піАС-ЗтАЬб()» | 9.9 | «70 | «01 | 82 | 30 | 37 а хх іммобілізований злитий білок з Їд2а миші та | АС-3 яванської макаки або людини р - іммобілізоване антитіло, що містить Ес-ділянку, що включає епітоп-зв'язуючий домен п да-3 тА 6 (1.1)
З результатів було видно, що ГАС-3 тАбБ 1 і ГАО-3 тАБр 6 характеризувалися кращою кінетикою зв'язування, ніж еталонне антитіло ГАс-3 тАБб А. Крім того, гуманізован ГАС-3 тАБ б характеризувалося кращої кінетикою перехресного зв'язування з | АС-3 яванської макаки.
Специфічність до епітопу у ГАС-3 тАБ 1, ГАС-3 тА 6 і еталонного антитіла ГАС-3 тАБ А досліджували за допомогою аналізу Віасоге. Для визначення, чи зв'язувалися антитіла з різними епітопами ГАС-3, 5пІАС-3-Ніє захоплювали антитілом миші до пента-Ніб5, що іммобілізований на чіпі-датчику СМ5 відповідно до процедури, що рекомендована виробником.
Якщо коротко, карбоксильні групи на поверхні чіп-датчика активували шляхом ін'єкції розчину, що містить 0,2 М М-етил-М-(З-диетиламінопропіл)-карбодімід і 0,05 М М-гідроксисукцинімід.
Антитіло до пента-Ні5 вводили ін'єкцією на активовану поверхню з СМ5 у 10 мМ ацетату натрію, рН 5,0, зі швидкістю потоку 5 мкл/хв. з подальшим введенням 1 М етаноламіну для дезактивації аміногруп, що залишилися. Експерименти по зв'язуванню проводили у НВЗ-ЕР буфері, який містив 10 мМ НЕРЕ5, рН 7,4, 150 мМ Масі, З мМ ЕОТА та 0,005 95 поверхнево-активної речовини Р20. Кожне антитіло (І АС-3 тАБ 1, І АС-3 тА 6 і ГАС-2 тАБ А) попередньо вводили ін'єкцією на захоплений ПГАСЗ3-Ніз протягом 180 секунд при швидкості потоку 5 мкл/хв. у концентрації 1 мкМ з подальшим рухомим буфером і ін'єкцією конкурентного антитіла у тих же умовах. Відповідь конкурентного антитіла, що одержана у результаті зв'язування, порівнювали з його відповіддю на ПІ АСЗ-Ніх, що одержана у результаті зв'язування, яка попередньо введена ін'єкцією з буфером для виявлення антитіл, що конкурують за один і той же епітоп. Регенерацію поверхні з іммобілізованим антитілом до пента-Ніх проводили шляхом імпульсної ін'єкції 10 мМ гліцину з рН 1,5. Нормативні криві одержували шляхом ін'єкції аналітів на оброблену поверхню без іммобілізованого білка. Криві зв'язування будували за допомогою програмного забезпечення ВіАема|чаїййоп м4.1 з даних сенсограми у режимі реального часу.
Результати цього експерименту показані на Фіг. ВА-80. У результатів цього експерименту видно, що біотинільоване антитіло | АСЗ тАБ А було здатне зв'язуватися з 5пІ АС-3-Нів навіть у присутності надлишкових кількостей небіотинільованих антитіл ГАЗ тАбБ 1 і ГАЗ тАБ 6. На відміну від цього, ГАЗ тАбБ 1 блокувало зв'язування І АС-3 тАБ 6. Таким чином, з результатів видно, що І дО-3 тАБ 1 і ГАО-3 тАБб 6 могли зв'язуватися з одним і тим же або епітопами І Ас-
З, що перекриваються, та конкурувати один з одним за зв'язування з І АС-3. Було виявлено, що як ГАС-3 тАб 1, так і ГАО-3 тА 6 зв'язувалися з епітопом, який відрізнявся від епітопу, що зв'язується антитілом ГАС-3 тАб А.
Для додаткової характеристики антитіл до ГАЗ у двох різних аналізах оцінювали їх здатність блокувати зв'язування між Г(АСЗ та МНС І класу. В одному аналізі досліджували здатність антитіл блокувати зв'язування злитого білка з Ес і розчинного ГАСЗ людини з МНС Ії класу, що іммобілізований на поверхні. Для цього аналізу кожний з І АС-3 тАБ 1, І АС-3 тА 2,
ГАСі-3 тАб 3, І АС-3 тАб 4 та ГАС-3 тА 5 (у кількості 0-67 нМ, 2-кратні серійні розведення) змішували зі злитим білком з Ес і розчинного ГАС-3 людини (у концентрації 5 мкг/мл) й окремо інкубували з іммобілізованим МНС І класу (1 мкг/мл). Кількість ГАС-3, що зв'язується з іммобілізованим МНС ІІ класу, оцінювали за допомогою кон'югованого з гамма-НЕКР вторинного антитіла кози до Ес людини. У додаткових експериментах (ГАС-3 тАб А пі гуманізувані антитіла
ПГАС-3 тА 1 (1.4) і п АС-3 тА 6 (1 1) (у кількості 0,0096-7,0 нМ, трикратні серійні розведення) змішували зі злитим білком з розчинним ГАС-3 людини (0,2 мкг/мл) і аналізували на зв'язування з іммобілізованим МНС ЇЇ класу, як описано вище. Результати цих експериментів показані на
Фіг. ЗА та фіг 98.
В іншому аналізі досліджували здатність антитіл до | АСЗ за даним винаходом блокувати зв'язування злитого білка з Ес і розчинного ГАЗ людини (5ПІ АС-3-Ес) з нативним МН ІІ класу на клітинній поверхні. Для цього аналізу кожне з І Ас-3 тАб 1, І ДО-3 тА 2, Г ДО-3 тА 3, І АС-
З тАбБ 4, ГАС-3 тА 5 і еталонного антитіла | АС-3 тАБ А (у концентрації 0,1-26,7 нг/мл, 2- кратні серійні розведення) змішували з біотинільованим злитим білком з Ес і розчинним ІГАС-3 людини (у концентрації 0,5 мкг/мл) і окремо інкубували з позитивними за МН ІІ класу клітинами
Дауді. Кількість ГАС-3, що зв'язується з поверхнею клітин Дауді, визначали за допомогою вторинного антитіла до стрептавідину, що кон'югованти з РЕ, за допомогою ЕГАСз-аналізу. У додаткових окремих експериментах І АС-3 тАБб 1, І ДИ-3 тА 6 і І АО-3 тАБ А; або І АО-3 тАр 1 ї гуманізовані антитіла ПГАС-3 тА 1 (1.4), НІ АС-3 тА 1 (1.2), НАС-3 тА 1 (2.2) і ПГАО-3 тА 1 (1.1) аналізували, як описано вище. Результати цих експериментів показані відповідно на
Фіг. ТОА-100.
З результатів цих аналізів інгібування (Фіг. 9А-9В і фіг. 10А-10С) видно, що всі протестовані антитіла до | АО-3 блокували зв'язування злитого білка 5ПІ АС-3-Ес з МН ІІ класу.
Приклад 2
Методологія проточної цитометрії
В експериментах по визначенню рівнів експресії інгібіторів контрольних точок: РО-1 і ГАо-3 на клітинах в експериментах, що описані нижче, використовували наступні комерційні антитіла, що відповідним чином мічені флуоресцентною міткою: кон'юговане з фікоеритрин-цианіном 7 (РЕ-Су7) антитіло до СО4 (клон 5КЗ| або кон'юговане з флуоресцеїін-ізотіоціанатом (РІТС) антитіло до СО4 |(клон КРА-Т4|, кон'юговане з фікоеритрином (РЕ) антитіло до ГАО-3 І|клон 305223НІ, кон'юговане з фікоеритрином (РЕ) антитіло до РО-1 (клон ЕНІ12.2Н7| або кон'юговане з алофікоцианіном (АР С) антитіло (еВіозсіепсе5 або Віої! едепа)) і відповідні ізотипічні контролі.
Всі антитіла застосовували у концентраціях, що рекомендовані виробником. Фарбування клітин проводили у буфері для ЕАСЗ (10 95 ЕС5 у РВ5) на льоду протягом 30 хвилин у темряві для додавання первинних антитіл. Після двох промивок клітини або фарбували відповідним вторинним реагентом на льоді протягом 30 хвилин у темряві, або відразу аналізували на проточному цитометрі. Для виключення мертвих клітин все зразки фарбували барвником життєздатних клітин: 7-аміноактиноміцін Ю (7-ААО) (ВО Віозсеіїпсез5 або ВіоЇ едепа) або дигідрохлорид 4", б-діамідіно-2-феніліндола (САРІ) (іїе Тесппоіодіе5). Всі зразки аналізували на проточному цитометрі або ГАС5 Саїїбиг, або Рогпезза (ВО Віозсіепсе5) й аналізували з використанням програмного забезпечення Ріомо (Тгеебіаг, Ашленд, Орегон).
Приклад З (610) Експресія ГАО-3 та зв'язування антитіл з простимулюваними Т-клітинами
Вивчали експресію | Ас-3 та здатність виділених антитіл до ГАС-3 специфічно зв'язувати
ІГАСбб-З она поверхні простимульованих СО3/С2028 Т-клітин. Т-клітини одержували з мононуклеарів периферичної крові (РВМСО), коротко, РВМС очищали за допомогою способу центрифугування у градієнті щільності Рісої-Радце Ріиб5 (ЗЕ НеайПсаге), відповідно до інструкцій виробника, з цільної крові, що одержана згідно з інформованою згодою від здорових донорів (Віоіодісаї Зресіаку Согрогаййоп), а потім Т-клітини очищали за допомогою набору
РупареаазФ Опісиспейд Нитап Т СеїїЇ5 Киї (те Тесппоіодієв) відповідно до інструкцій виробника.
Для стимуляції виділені Т-клітини культивували протягом 10-14 діб у присутності рекомбінантного 1-2 людини І|ЗО од./млі (Рергоїесії) і активуючих гранул для Т-клітин людини
БупабеадьФ (Ійе Тесппоодіе5) відповідно до інструкцій виробника. Експресію ГАС-3 на свіжовиділених непростимульованих СО4-- Т-клітинах і простимульованих СО4-- Т-клітинах (що взяті з культури на 11-у або 14-у добу) досліджували за допомогою проточної цитометрії, як описано вище, з використанням кон'югованих з РІТС антитіл до СО4 та кон'югованих з РЕ антитіл до І АС-3.
Результати цих досліджень показані на Фіг. 11А-11С. Експресію ГАО-3 не спостерігали на непростимульованих СО4-- Т-клітинах (Фіг. 11А). Однак у СОЗ/СО8-простимульованих СО4-- Т- клітин від двох різних донорів (0:58468 і 0:43530) спостерігали різке збільшення експресії І АО-3 (Фіг. 118 та 118).
Досліджували здатність ГАС-3 тАБ 1 (фіг 12, секції А та 0), ГАО-3 тАБ 2 (Фіг. 12, секції В та
Е), ГАС-3 тА З (Фіг. 12, секції С та РЕ), ГАС-3 тА 4 (Фіг. 13, секції А та С) і ГАС-3 тАБ 5 (Фіг. 13, секції В та 0) специфічно зв'язуватися з простимулюваними СО4- Т-клітинами.
Простимульовані Т-клітини (що одержані, як описано вище, від донора 0:58468), взяті з культури на 14-ту добу, та свіжі непростимульовані клітини (що одержані, як описано вище, від донора 0:43530) піддавали проточній цитометрії із застосуванням виділених антитіл до Гдо-3 та подальшого вторинного реагенту, що відповідним чином мічений флуоресцентною міткою, (кон'югованого з РС антитіла до до миші (НІ) (даскзоп ІттипокКезеагсі ГІ арз)) і кон'югованого з РІТС антитіла до СО4. Як показано на Фіг. 12, секціях А-Е, і Фіг. 13, секціях АЮ, кожне з досліджених антитіл до 1|А(-3 зв'язувалося тільки з простимулюваними, але не з непростимулюваними СО4-- Т-клітинами.
З результатів цих досліджень видно, що рівень ГАС-3 підвищувався на простимульованих Т- клітинах, і що антитіла до ГАС-3 за даним винаходом специфічно зв'язували тільки простимульовані Т-клітини.
Приклад 4
Функціональна активність антитіл до ГА
Ентеротоксин типу В (ЗЕВ) Зіарпуіососси5 аигеи5 являє собою суперантіген мікроорганізму, що здатний активувати більшу частину Т-клітин (5-30 95). 5ЕВ зв'язується з МНС ЇЇ поза щілиноподібної детермінанти пептиду та, відповідно, залежить від МНС ЇЇ але є нерестриктованим і ТСК-опосередкованим. ЗЕВ-стимуляція Т-клітин призводила до проліферації олігоклональних Т-клітин і продукуванню цитокінів (хоча можна було спостерігати варіабельність серед донорів). Досліджували експресію антитіл до ГАС-3 і антитіл до РО-1 окремо і у комбінації на РМВС, що про стимульовані за допомогою ЗЕВ.
РВМС, що очищені, як описано вище, культивували у КРМІ-середовищі ж 1095 інактивованого теплом ЕВ5-1 95 пеніциліну/стрептоміцину в об'ємних колбах Т-25 протягом 2-3 діб окремо або з 5ЕВ (бідта-Аїагісп) у концентрації 0,1 нг/мл (первинна стимуляція). У кінці першого раунду 5ЗЕВ-стимуляції РВМС двічі промивали РВЗ і відразу ж висівали у 96-лункові планшети для культивування тканин у концентрації 1-5х105 клітин/лунка тільки у середовище, у середовище з 5ЕВ у концентрації 0,1 нг/мл (вторинна стимуляція) та без антитіла або у середовище з 5ЕВ та з контрольним антитілом дос і культивували протягом додаткових 2-3 діб.
Через 48 годин після первинної об'ємної ЗЕВ-стимуляції клітини вивчали у відношенні експресії
РО-1 ї ГАО-3 за допомогою проточної цитометрії із застосуванням антитіл до ГАС-3, що кон'юговані з РЕ, і антитіл до СОЮЗ, що кон'юговані з РІТС; або антитіл до РО-1, що кон'юговані з
АРС, і антитіл до СОЮЗ, що кон'юговані з РІТС. На 5-у добу після вторинного культивування у 96- лунковому планшеті з 5ЕВ-стимуляцією лунки, оброблені розчином без антитіла або з контрольним антитілом, вивчали за допомогою проточної цитометрії у відношенні експресії РО- 1 ї САС-3 із застосуванням антитіла до ГАС-3, що кон'юговане з РЕ, і антитіла до РО-1, що кон'юговане з АРС.
Результати проточної цитометрії від двох типових донорів (0:34765 і О0:53724) показані на
Фіг. 14, секції А-О (0: 34765) і Фіг. 15, секції А-О (0: 53724). З цих результатів видно, що рівень
ГАС-3 та РО-1 підвищувався протягом 48 годин після ЗЕВ-стимуляції з подальшим посиленням, (610) що спостерігається на 5-ту добу після культивування з ЗЕВ-стимуляцією. У цих дослідженнях у донора 1 після 5ЕВ-стимуляції було більше ГАС-3/РО-1 подвійних позитивних клітин.
Додавання контрольного антитіла після 5ЕВ-стимуляції змінювало експресію ГАС-3 або РО-1 (пор. Фіг. 14, секції С та О і Фіг. 15, секції С та 0).
Підвищення рівня імунних білків контрольних точок ГАС-3 та РО-1 після 5ЕВ-стимуляції
РВМС обмежувало вивільнення цитокінів при повторній стимуляції. Вивчали здатність | АС-3 тАБ 1, ГАС-3 тАбБ 3, І АС-3 тАб 4, | АС-3 тАб 6, моноклонального антитіла до РО-1, що позначене як "РО-1 тА 5", й еталонних антитіл РО-1 тАБ 1 (включаючи Ес-варіант 235А/235А (АА)), РО-1 тАБ 2, ГАЗ тА А та комерційного антитіла до ГАЗ 1784 (Мо І 5-С18692, 1 5 Віо, що позначене як "СГАСЗ тАб В") посилювати вивільнення цитокінів за допомогою інгібування контрольних точок.
РВМС стимулювали за допомогою 5ЕВ, як описано вище, за винятком вторинних стимуляцій. Клітини висіювали без антитіл, з ізотиповим контрольним антитілом або з антитілами до ГАС-3 й антитілами до РО-1 окремо або у комбінації. У кінці другої стимуляції надосадову рідину збирали для вимірювання секреції цитокінів із застосуванням наборів для
ІФА Юиозеї на зразках від людини відносно ІЄМу, ТМЕа, 11-10 ї 1-4 (К 85. О 5у«(етв) відповідно до інструкцій виробника. На Фіг. 16А-16В показані профілі секреції ІЄМу (Фіг. 16А) та ТМЕа (Фіг. 168) у РВМС, простимульовані за допомогою 5ЕВ, від типового донора (0:38166), які оброблені розчином без антитіл або з одним з наступних антитіл: ізотиповим контролем, РО-1 тАбБ 1, РО-1 тА 2, ГАС-3 тАб А, І Да-3 тА В, ГГ АС-3 тАб 1, І АС-3 тА 3, І АС-3 тА 4 або І АО-3 тАб 6.
Для цього дослідження використовували антитіла у концентрації 0,009, 0,039, 0,156, 0,625, 2,5, 10 ї 40 мкг/мл. На Фіг. 17 показані профілі секреції ІЕМУ у РВМС, що простимульовані за допомогою ЗЕВ, від іншого типового донора (0:58108), які оброблені наступним: розчином без антитіла, ізотиповим контрольним антитілом; РО-1 тАБ 2 та/або ГАС-3 тАБ А; РО-1 тАБ 5 і/або
ГАС-3 тАБб 1 або РО-1 тАБ 5 і/або ГАС-3 тАБр 3. Для цього дослідження застосовували антитіла у концентрації 10 мкг/мл.
З результатів цих досліджень видно, що антитіла до РО-1 значно посилювали функцію імунної системи, про що свідчила збільшене вироблення ІЕМу (Фіг. 16А і фіг. 17) і ТМЕа (Фіг. 168) у РВМС, що простимульовані за допомогою ЗЕВ, при повторній стимуляції. До здивування також спостерігали, що ГАС-3 тАБ 1 також збільшувало вироблення цитокінів у декількох донорів до рівнів, що порівняні з антитілами до РО-1, у той час як еталонні тАБ до Г АС-3, І АС-
З тАБ А та ГАС-3 тАБ В і декілька виділених антитіл (АС-3 тА 3, | АС-4 та І АО-6) забезпечували лише невелике посилення вивільнення цитокінів. Крім того, комбінація антитіл до ГАС-3 з антитілом до РО-1 призводила до додаткового посилення вивільнення цитокінів (Фіг. 17) з РВМС, що простимульовані за допомогою 5ЕВ, при повторній стимуляції. | АС-3 тАб 1 забезпечувало найбільше посилення вивільнення цитокінів у поєднанні з антитілом до РО-1 у порівнянні з ГАО-3 тАБб З і еталонним антитілом ГАС-3 тАб А.
Приклад 5
Зв'язування з ендогенним ГГ АС-3 яванської макаки
За допомогою ЕБГАС5 вивчали здатність гуманізованого антитіла ПГАС-3 тАбр 6 (1.1) і еталонного антитіла ГАС-3 тАБ А зв'язувати ендогенний ГАС-3, що експресований на РВМС яванської макаки. Для цього дослідження РВМС виділяли з цільної крові яванської макаки- донора та культивували окремо або з ЗЕВ-стимуляцією (500 нг/мл), як фактично описано вище.
Через 6б годин після ЗЕВ-стимуляції клітини (непростимульовані та простимульовані) фарбували антитілами ПІ АС-3 тА 6 (1.1), ГАС-3 тАБб А або РО-1 тА 1 (10-кратні серійні розведення). Антитіла детектували за допомогою вторинного антитіла кози до Ес людини, що мічено АРС. Зв'язування відображено у вигляді графіка на Фіг. 18А-188 для двох яванських макак-донорів.
Стимуляцію 5ЕВ підтверджували за посиленою експресією РО-1, яка була детектована за допомогою антитіла до РО-1, РО-1 тАБб 1. З результатів цих досліджень було видно, що ПІ Ас-3 тА 6 (1.1) зв'язувалося з ендогенним І АС-3, що експресується на поверхні простимульованих
РВМС яванської макаки.
Всі публікації та патенти, що згадані у даному описі, включені у даний документ за допомогою посилання у тому ж ступені, як якби кожна окрема публікація або патентна заявка була конкретно і окремо зазначена як така, що включена за допомогою посилання у повному її обсязі. Незважаючи на те, що даний винахід був описаний у зв'язку з конкретними варіантами його здійснення, буде зрозуміло, що його можна піддати додатковим модифікаціям, і дана заявка мається на увазі як така, що охоплює будь-які варіанти, застосування або адаптації даного винаходу, згідно, у цілому, з принципам даного винаходу, та включає такі відхилення від даного розкриття, які входять у загальновідому або загальноприйняту практику у галузі техніки, 10) до якої відноситься даний винахід, і які можуть бути застосовані до основних ознак, що викладені вище у даному документі.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 МакроДЖенікс, Інк.
Ла Мотте-Мос, Росс
Шах, Калпана
Сміт, Дуглас Х.
Джонсон, Лесіл
Мур, Пол
Бонвіні, Еціо
Кеніг, Скотт «120» ЗВ'ЯЗУЮЧІ ГАС-3 МОЛЕКУЛИ ТА СПОСОБИ ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ «130» 1301.0121РСТ «1505 05 62/255,094 «1515 2015-11-13 «1505 0562/172,277 «1515 2015-06-08 «1605 140 «1705 РагепсІп уеєгвзіоп 3.5 «2105 1 зо «2115 217 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(217) «223» Ідб1і Ес Ведіоп «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (217)..(217) «223» Хаа?217 і85 пувіпе (К) ог Арзепе «4005 1
Аза Ргто сбіц Гец Гец сіу сі1у Рко бек Уаі1і Рбе їец Рпе Рго Рго Гуз 1 5 10 15
Рко Гуз Авр ТПх Ге Меєс Іїе бБег Агуд ТПтІ Рго сі Уа1і ТПкх Суз Уаї 20 25 3о
УуУаї Ма1 Авр Уа1 бек Нів с1ц Авр Рго Ссіцш Уа1! Гуз Рібе Авп Тгр Туг 35 40 45 уаї Авр с1у Уа1! сіц Уаї Нів Авп Аїа їув Трт Кгув Рго Агд бі с1ц 50 55 бо сСіп Тук Авп бек ТПтІ Тут Агуд Уа1 Уаї бБет Уа1і! Іїец ТПг Уаї1ї Ієц Нів 65 70 75 80 біп Авр Ттр Гей Авп о сіу Гпув сіц Тут пув Сув гув Уаї бБет Авп Гув 85 Зо 95
А1їа тей Рго Аїа Рго І1е сіц Гпув ТПї І1ї1е бБегт ув Аїа пув С1у сіп 100 105 110
Рго Агд бі Рго біп Уа1! Тугк ТПт Гец Рго Рго бек Агкд бі сій Меєс 115 120 125
ТПЕ гув Авп о біп Уаії бек Ггецп ТПкх Сув Гей Уаії пув с1у РПпе Тук Рго 130 135 140 ет Авр І1е Аїа Уаі сіцш Ткр бій бек Авп б1іу біп Рго біц Авп Авп 145 150 155 160
Тук Ггув ТПжІ ТПтІ Ркго Рго Уаі Ггецп Авр Бех Авр с1у бБет РПпе РПе ГІеєец зо 165 170 175
Тук бБет пув Гецп ТПї Уаії Авр пув бБет Акд Тктр біп сіп с1у Авп Уаї1ї 180 185 190
Рпе бек Сув бБет Уа1ї Месє Ніз Сі Аїа їеец Нів Авп Нів Тут ТПг с1п 195 200 205
Кпузв бБет Ггец бек Гец бет Рго б1Уу Хаа 210 215 «2105 2 «2115 216 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225» (1)..(216) «223» Ідб2 Ес Ведіоп «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (216)..(216)
«223» Хаа?216б 185 пувіпе (К) ог Арвепе «4005 2
Аза Рго Рго Уаі Аїа Сіу Рго Бек Уа1! Рпе Гей Ропе Рго Рго Гув Рго 1 5 10 15
Туз Авр ТПІ Ггецп Ме Іїе бек Агуд ТПх Рго біц Уаі1і ТПтї Сув Уа1ї Уаї 20 25 30 уа1ї1 Авр Уаї бек Нів Сі Авр Рго сі Уа1ії сіп Рібе Авп Тгр Туг Уаї1ї 35 40 45
Авр сіу Уаї біцш уа1ї Ніз Авп Аїа Гпув ТПг туз Рго Агд сб1ц Сі б1п 50 55 бо
Рпе Азп бет ТПІ Ріе Агуд Уа1ї Уаї бБет Уаі1ії гец ТПтІ Уаї Уаї Ніз сіп 65 70 75 80
Авр Тгр Гецп Авп сіу пув бі Тук Гпув Сув Гпув Уаі1! бБег Авп Гув Щ1Уу 85 90 95
Теп Рго Аїа Ркго І1е бі пув ТПхКх Іїе бек пув ТПІ Гув с1у сіп Рго зо 1600 195 110
Атд бі Рго сіп Уаі! Тут ТПтї Гец Рго Рго бБет Агд біц біц Меє ТПг 115 120 125
Тув Авп сіп Уаї бек Гей ТПх Сув Ге Уа1і! Гув о1у РПпе Тук Ркго бек 130 135 140
Авр Іїе Бек Уаі сіц Ткр сіц бБет Авп б1у біп Рго біц Авп Авп Тут 145 150 155 160
Тпув ТПг ТПг Рго Рго Мес Гец Авр бБет Авр сіу Бек РПпе РПпе Іец Туг 165 170 175
Ззек Ггпув Гей ТПх Уаі1і Авр пув бБегхт Атуд Ттр сбіп сбіп с1у Авп Уа1 РБПе 180 185 190 бек Сув бБет Уа! Меє Нів сіц АТїа Гец Ніз Авп Ніз Тугк ТПг с1іп Гув 195 200 205
Ззек Гецп бек Гей бек Рго б1у Хаа 210 215
«2105 З «2115 217 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(217) «223» ІдоЗ ЕС «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (217)..(217) «223» Хаа?217 і85 пувіпе (К) ог Арзепе «4005 З
Аза Ргто сіц Гец Гец сіу сіу Рко Бек Уаії Рпе Гец Рпе Ркго Ркго Гуз 1 5 10 15
Рго пув Авр ТПтї ТЇІецп Мес І1їе бБег Агу ТПтї Рго сіц Уа1і ТПк Сув Уаї 20 25 30
Ууаї уаї Авзр Уа! Бек Нів біцп Авзр Рго біц Уаї біп Рбе Гув Тгр Туг зо 35 40 45 уаї Авр с1у Уа1! сіц Уаї Нів Авп Аїа їув Трт Кгув Рго Агд сі б1ц 50 55 бо
Сіп Тут Авп бек ТПтІ Рібе Агуд Уа1! Уа1ї бБегт Уа1! Гец ТіПг Уаї Ієц Нівз 65 70 75 80 біп Авр Ттр Гей Авп о сіу Гпув сіц Тут пув Сув гув Уаї бБет Авп Гуз 85 Зо 95
Аїа теп Рго Аїа Ркго Іїе сбіц Пув ТПг Ії1е Бек Пув ТПг Гув с1у сіп 100 105 110
Рго Агд бі Рго біп Уа1! Тугк ТПт Гец Рго Ркго Бех Акд сі бій Меєс 115 120 125
ТПЕ гув Авп о біп Уаії бек Ггецп ТПкх Сув Гей Уаії пув с1у РПпе Тук Рго 130 135 140 зехт Авр Іїе Аїа Уа1 бій Тгтр бій бек Бек с1у сіп Рго б1п Авп Авп 145 150 155 160
Тук Авп ТПт ТПтІ Рго Рго Меєс Ггецп Авр бБегт Авр с1у бБет РПпе РПе ГІеєец 165 170 175
Тук бБет пув Гецп ТПї Уаі Авр пувз бек Агд Тгтр біп сбіп с1у Авп Те 180 185 190
Рпе бек Сув бБет Уа1ї Месє Ніз Сі Аїа їец Нів Авп Агд Ропе Тіт с1п 195 200 205 пув бек Гей бБет Пец бек Рго сіу Хаа 210 215 «2105 4 «2115 217 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(217) «223» Ідб4 Ес Ведіоп
З0 0«2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (217)..(217) «223» Хаа?217 і85 пувіпе (К) ог Арзепе
З5 «4005 4
Аза Ргто сбіц Рпе Гец сіу сіу Рко бек Уаі1і Рпбе їец Рпе Рго Рго Гуз 1 5 10 15 40
Рко Гуз Авр ТПх Ге Меєс Іїе бБег Агуд ТПтІ Рго сі Уа1і ТПкх Суз Уаї 20 25 30 45 Ууаї Маї1ї Авр Уаї бек біп біп Авр Рго сій Уаі Сбіп Рпе Авп Тгр Туг уаї Авр с1у Уа1! сіц Уаї Нів Авп Аїа їув Трт Кгув Рго Агд сі б1ц 50 зо бо
Сіп Рбе Авзп бек ТПт Тут Агд Уаї Уа1ї бек Уаі1і! їєц ТПг Уаї Ієц Нівз 65 70 75 80 біп Авр Ттр Гей Авп о сіу Гпув сіц Тут пув Сув гув Уаї бБет Авп Гуз 85 Зо 95 с1іу Гей Рго бБет бБет Іїе сіц пув ТПїІ І1е бБет гув Аїа Гув сіу сіп 100 105 110
Рго Агд бі Рго біп Уа1! Тук ТПт Гец Рго Ркго бек сбі1іп сі бій Меєс 115 120 125
ТПЕ гув Авп о біп Уаії бек Ггецп ТПхкх Сув Гей Уаї пузв с1у Робе Тук Рго 130 135 140 ет Авр І1е Аїа Уаі1і сій Ткр біц бБег Авп с1у сіп Рго біц Авп Авп 145 150 155 160
Тук Ггув ТПжІ ТПтІ Ркго Рго Уаі Ггецп Авр бБет Авр сіу бБет РПе РіПе Ієц 165 170 175
Тук бБет Акд Гецп ТПї Уаі Авр пув бек Агд Ттр біп сі сб1у Авп Уаї1ї 180 185 190
Рпе бек Сув бБет Уа1ї Месє Ніз Сіш АТїа Гец Нів Авп Нів Тут ТПтг Сс1іп 195 200 205
Зо
Кпузв бБет Гец бет Гец бет Гей С1Уу Хаа 210 215
З5 «2105 5 «2115 525 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз 40 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОВКЕ «2225 (1)..(525) «223» ТАС-3 45 «4005 (5
Меє ТЕр бі1ц Аїа сіп Рпе Гец сі1у Гей Гей Робе Гей біп Рго Іец Ттгр 1 5 10 15 50 уаї Аїа Рхто Уаі Гпув Рко Гец сСіп Рго б1іу Аїа біц Уаі1ії Рго Уаї Уаї 20 25 30 55
ТЕр Аїа сіп сі с1у Аза Рго Аїа сіп їей Рго Сув Бех Рго ТПх Ше
Рко гей біп Авр Гец бет ІТей Гей Агуд Агд Аїа сіу Уаі1 ТіПг Тгр сіп 50 55 бо
Ніз сіп Рго Авр бек бі1у Рго Рго Аїа Аза Аїа Рго с1у Нів Рго Іец 65 70 75 80
А1а Рго сС1у Рго Нів Рго А1ї1а А1їа Рго бБег бекг Тгр С1у Рго Агд Рго 85 Зо 95
Ат Атуд Тут ТБПт Уаії Ге бет Уаї сС1у Рго біу б1іу Гец Агд бБетх 01Уу 1600 105 110
Атд Гей Рго Гец сіп Рго Акд Уаі! Сіп гей Авр біц Агд б1у Акд сіп 115 120 125
Атуд б1у Авр РпПе ет Ггец Тктр Гей Агуд Рго Азїа Агуд Агуд Аза Авр А1а 130 135 140 сСіу б1ш Тугт Агд Аї1а Аїа Уа1ї Нів їец Агд Авр Агуд Аїа Ієц бек Сув 145 150 155 160
Агкд теп Агд Гей Агкд Тец сіу сбіп Аза бБег Меїсї ТПг Аїа бек Рго Рго 165 170 175 сіу бек Гей Агуд Аїа бБет Авр Тктр Уаі І1е Гей Авп Сув бБет РПе 5бег 180 185 190
Атуд Рго Авр Агуд Рго Аїа бегт Уаі1ії Нізв Тегр Рпбе Агуд Авп Агд СсС1у с1іп 195 200 205 с1у Агд Уа1ї Рго Уаії Агд Сі бетг Рго Нів Ніз Нів Гей Аїа с1ц 5бег 210 215 220
Рпе Гей Рібе Ггецп Рго біп Уаі бБет Ргто Месє Авр бек с1у Рго Тгтр Щ1У 225 230 235 240
Сув І1е Гей ТПї Тут Агуд Авр сіу Рпе Авп Уа! бБег І1е Меє Тук Авп 245 250 255
Те ТПтІ Уаї Ггец сі1у Гей бі Рго Рго ТПт Рго Гецп ТПтІ Уаї Тух Аїа 260 265 270 с1у Аїа сіу бБег Атд УМаі1ії сіу Гей Рго Сув Агкд Гей Рго Аїа сСіу Уаї
275 280 285 сіу ТПг Агуд бБет РПпе Гец ТПтІ Аїа Гуз Тгр ТПгІ Рго Рго біу б1у 1У 290 295 300
Рго Авр Гецп гец Уа1! ТПт с1у Авр Авп с1у Авр Рпе ТПт Гей Аг9д Гей 305 310 315 320
Сі Авр Уаї бек біп Аза СсСіп Аза с1іу ТП Тут Трг Сув Ніз Ії1е Нівз 325 330 335
Те сіп сій біп біп Гей Авп Аїа ТПт Уаї! ТПг Гец Аїа І1е І1е ТІПг 340 345 350
Ууа1ї ТпЕ Ркго Ппув бек РПе сіу Бек Рго сіу Бек їец сіу Ппув Гецч Гей 355 360 365
Сузв січ Уаї ТПїІ Ркго Уаі бек бі1у біп бій Агуд Рпе Уаі1і Тгр бек бек 370 375 380 теп Авр ТПтІ Ркго бБет біп Агд бек Рпе бехт С1у Рго Тгр Гей сі Аїа 385 390 395 400
Зо біп бій Аза сСіп Гец Гец бет сіп Рго Тгр біп Сув біп їец Тут сіп 405 410 415 сі1у бій Агд Гец Гец сіу Аїа Аїа Уа1і Тут Рібе ТПт біц Гец бет 5бег 420 425 430
Рго сС1у Аї1а сСіп Агд бек сС1у Агд Аза Рго СсС1у Аїа їец Рго Аї1а С1Уу 435 440 445
Ніз їец теп Гец Рпе їец І1їе їец СсСіу Уа1ї Іїєц бет Іец Ієц Іец Іец 450 455 460 уаї Тк СсС1у АТїа Ррбе СсС1у Робе Нівз Ієц Тгр Агд Агд сбіп Тгр Агд Рго 465 470 475 480
Ат Агуд Рбе бег Аїа їец бі сіп С1у Іїе Нів Рго Рго с1іп Аїа с1п 485 490 495
Ззек Гуз Ії1е бі бі еп біш сбіп бій Рго бі Рго сі Рго с1ц Рго 500 505 510 бі Рго бій Рго сій Рго біц Рго сі Рго сі Сбіп Гец 515 520 525 «2105 6 «2115 1270 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(120) «223» ІТ1АС-3 шАБ 1 УН «4005 6 сбіп Іїе сбіп Гец УМаі сіп бет сі1у Ркго бій Гей гув гув Рго с1у с1ц 1 5 10 15
ТПкх Уаї пув І1е бек Сув гув Аза бек Сб1іу Тут ТПтїІ Рпе Агд Авп Тук 20 25 30 сіу Месє Авп Ттр Уаі ув сіп Аїа Ркго сСі1у гув Уаії Ге пув Тгр Меє
Зо сіу Тер Іїе Авп ТПтІ Тут ТПт сіу сіц бет ТПт Тут Аїа Авр Авр Ріє бо 35 сі б1у Акд Рпе Аїа РПе бет ЇТГецп с1іу ТПг Бех Аза бБег ТПг Аїа Туг 65 70 75 80 теп сіп І1е Авп І1е Гей Гуз Авп бі Авр ТПтІ Аїа ТПтІ Тут РПе Сувг 40 85 30 95
Аза Атуд бі бек Гец Тут Авр Тут Тут бек Мес Авр Тут Тгтр С1у сіп 100 105 110 45 сіу ТПг бБет Уаї ТПт Уаї бек 5бег 115 120 50 «2105 7 «2115 360 «2125 ДМА «2135 Мив шизси1ив8 55 «2205 «221» щштівс Беасиге
«223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд ГАС-3 шАБ 1 УН «4005 7 садзаєссадеЕ гддсдсадесс сддасстьдад ссдаачдчаадс ссддадчадас адссаадаєс бо
ЕссЕдсаадд СЕССЕЧДЯддса сбасссесада аастаєсддаа єдчаассдддадІ даадсаддсе 120 ссаддааадд ЄЄЕсааадеєуд дасдддсвєда аєааасассої асассддада дЕсаасатаєсє 180 дсЕЧаєчасе ЕСсЧчаддчасу чЧЕССДСсССЕЄСсС ССЕЕсдддаа ссср дссад сасеєдсстає; 240
Есдсадаєса асасєссісаа ааасчаддас асддстасає ассеЕссдедс аадчадаасєссс 300 сЕСТаєчаєсє астаєєсстає ддассассдудд ддЕСааддаа ссісадссас сдссеЕсстсса
З6о «2105 8 «2115 5 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 зо «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(5) «2235» ТАС-З3 шАБ 1 УН СОВ 1 «4005 8
Авп Тут с1у Меє Авп 1 5 «2105 13 «2115 17 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(17) «2235» ТАС-3 шАБ 1 УН СОрВ2 «4005 1.15
ТЕр І1е Авп ТПтІ Тут Тік бі1у бі бек ТПт Тут Аза Авр Авр Рпе сіц 1 5 19 15 ов1у
«2105 10 «2115 11 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(11) «223» Т1АС-3 шВшАр 1 УНН СОВЗ «4005 10 біц бек Гей Тут Авр Тут Тут бБет Меє Авр Туг 1 5 19 «2105 11 «2115 112 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225» (1)..(11727) «223» Т1АС-3 шАБ 1 УТ,
Зо «4005 111
Авр уаї Уаї Маії ТПт сіп ТПт Рко Ге ТПї Гей бегт Уа! ТПтг Іїе 01Уу 1 5 19 15
Сіп Рго Аїа бек І1е бБег Сув Пув бБет бек біп бек Гей Гец Нів 5бег 20 25 30
Авр со1у Ппув ТПт Тут Ггец Авп Ткр Гей Гей біп Агуд Рго сбіу сбіп 5бег 35 40 45
Рго біц Агуд Гец Іїе Тук Гей Уаії бек біц Гей Авр бет Сі1у Уаї1ї Рго зо бо
Авр Атуд Рпе ТПт сіу бБет сіу бБет біу ТПх Авр Рпе ТПтІ Іец Гув І1е 50 65 70 75 80 зехт Агкд Уаі біш Аїа бій Авр Гей с1у Маії Тухк Тук Сув Тктр с1п щу 85 30 35
ТБЕ Нів Рібе Рго Тут ТПг Робе сС1у сСі1у сб1у ТПг пув їец бі І1е Гуз 1600 195 110
«2105 12 «2115 336 «2125 ОМА «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» щшщівс Геагитге «223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд ГАС-3 шАБ 1 ХУ, «4005 12 чаєдеЕсдеЕда єдасссадас сссасесасеЕ сєсдЕСЯОдЕеЕса ссаєєддаса ассадсстсс бо ассЕСсЕсдса адссаадсса дадссеЕсстса саєгадесдаєд дааадасавта ЕЄсдааєссва 120 гЕЕЧдеЕсасада ддссаддсса діЕсЕссадад сдсстаасст асстддеєдес сдаастодас 180
ЕсЕддадеЕсс сідасаддес сассддсадеЕ двдаєссаддада сачдчарсссас ассдааааєс 240 ачсачадчедч аддсеЕдчадча ЄЕсЯОддадее саєвтасвдсс ддасааддеас асасесссд 300 гасасчдсесо дадддддадас саадсєддаа асбаааа зо 336 «2105 13 «2115 16
З5 «2125 РЕ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(16) «2235» ТАС-3 шАБ 1 УТ, СВІ «4005 13 пуз бБет бек біп бек теп Гїец Нівз бБег Авр СсС1у Гуз ТПтх Туг Іец Авп 1 5 19 15 «2105 14 «2115 7 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(7)
«223» Т1АС-3 шАрБ 1 Уї Сов «4005 14 печ Уаї бек бій Гец Авр 5ег 1 5 «2105 15 «2115 9 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(9) «223» Т1АС-3 шАр 1 УТ СоВЗ «4005 15
Тер с1п с1у ТБтг Нівз Ре Рго Тут Тіг 1 5 «2105 16 «2115 1270 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе зо «2205 «223» 1АС-3 шАБ 1 УНІ «4005 16 сбіп Маі сбіп Гец Уаі сіп бек сі1у Аїа сі Уаї пув пув Рго с1у А1а 1 5 10 15 бек Уаї Кпув Уаї бБет Сув Кгув А1їа бек С1у Тук ТПтг Рре ТПг Авп Туг 20 25 30 сіу Месє Авп Ттр Уаі Агд сіп Аза Рго сСі1у сбіп сС1у еп біц Тгр Меє 35 40 45 сіу Тер Іїе Авп ТПтІ Тут ТПт сіу сіц бет ТПт Тут Аїа Авр Авр Ріє бо 50 сі б1у Акту Рпе Ма! Рібе бБет Ме Авр ТПї бегт Аза бет ТПтІ Аїа Туг 65 70 75 80 55 теп сіп І1е бет бБет Гей Гуз Аза бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Атуд бі бек Гец Тут Авр Тут Тут бек Мес Авр Тут Тгтр С1у сіп 1600 195 110 сіу ТПг ТПт Уаї ТПт Уаї бек 5бег 115 120 «2105 17 «2115 360 «2125 ОМА «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» Ро1уписіеосіде Епсодіпд БПІАС-3 шпшАБ 1 УНІ «4005 17 саддесдсаас гддсЕсСааєсс сддсдссддад дсдааааадс сіддсдссЕС сасдааадед бо
ЕссЕдсаадч сасєстдддса сбасдсєсаса ааєстаєдаєва єдчаассддді дсдасаддса 120 ссадддсадд дасєддааєд даєсддддеєда аєсаастасес асасаддсда дачсасетає 180 дсЕЧдЧасчаєєсє Есдаддадсад аєрєссдЕСЬсс сссасоддаса ссадсодстад бассдсетає; 240 20) сеЕсСсадчаєста ЯясссЕСсСсСаа ддсодаддас асадсЕдеЕсс асссаєєсдедс ссоасддададе 300
ЕеЕЧдваєчасеі аставадсає ддаєссассддд ддасааддсра саассодєдас адедадсссс
З6о «2105 18 «2115 120 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «2235» ПІАсС-3 шВшАр 1 УНІ «4005 18 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бехт с1у Аї1а сій Уаї пув пув Рго С1у А1а 1 5 19 15
Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут ТПтї Рпе ТПх Авп Тук 20 25 30 сіу Месє Авп Ттр Уаі Агд сіп Аїа Рго сСі1у сбіп сС1у теп біц Тгр Меє 35 40 45 сіу Тер Іїе Авп ТПтІ Тут ТПт сіу сіц бет ТПт Тут Аїа Авр Авр Ріє 50 зо бо сі б1у Акту Рпе Ма! РПе бБет Ме Авр ТПї бегт Аза бет ТПтІ Аїа Туг 65 70 75 80 їец Сіп І1їе бек Бек Ігец Пув Аїа сі Авр ТПт А1їа Уа1ї Тук Робе Сув 85 30 35
Аза Атуд бі бек Гец Тут Авр Тут Тут бек Мес Авр Тут Тгтр С1у сіп 1600 195 110 сіу ТПг ТПт Уаї ТПт Уаї бек 5бег 115 120 «2105 19 «2115 360 «2125 ОМА «213» Актітісіа1! бБедцепсе «2205 «223» Ро1уписіеосіде Епсодіпд БПІАС-3 шАБ 1 УН2
ЗО «4005 19 саддесдсаас гддсЕсСааєсс сддсдссддад десЕдаааааадс сгддсдсесЕс сасдааадчсід бо
ЕссЕдсаадч сасєстдддса сбасдсєсаса ааєстаєдаєва єдчаассддді дсдасаддса 120 ссаддадсадч дассддаасд чаєсдоддаєдда ассаасассс асасаддсда дадсасесає; 180 дсЕдЧасдаєє ссдадддсад асстдеЕсеЕєс єссаєддаса ссадсдстад гассддасетає 240 сеЕсСсадчаєста ЯясссЕСсСсСаа ддсодаддас асадседеЕсс асрссесєдеЕдс ссоасвдададе 300
Еедваєчасеі аставадсає ддаєсассдуд ддасааддсра саассдєдас адесдадсссс
З6о «2105 20 «2115 112 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» ПІАсС-3 шВшАр 1 УТ1 «4005 20
Авр Іїе Маії Меєсє ТПт сіп ТПт Рко Гец бБеїт Гей бегт Уаі! ТПг Рго 01Уу 1 5 19 15
Сіп Рго Аїа бек І1е бБег Сув Пув бБет бек біп бек Гей Гец Нів 5бег 20 25 30
Авр с1у Ппув ТПг Тут Гец Авп Тгтр Гей Гей біп Пув Рго с1у сіп бБег 35 40 45
Рго б1п Агд Гецп Іїе Тухк Пец Уа1і бек бій Гец Авр Бек сіу Уаі1ї Рго 50 зо бо
Авр Атуд Рпе бБет сіу бБет сіу бБет біу ТПх Авр Рпе ТПтІ Іец Гув І1е 65 70 75 80 зехт Агкд Уаі біш Аїа бій Авр Уаї с1у Маі Тухк Тук Сув Тктр с1п щу 85 30 35
ТБЕ Нів Рібе Рго Тут ТПг Робе сС1у сі1у б1у ТПг пув Уа1! с1п І1е Гуз 1600 195 110
З0 «2105 21 «2115 336 «2125 ОМА «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» Ро1уписіеосіде Епсодіпд БПІАС-3 шпшАр 1 1 «4005 21 чавєаєсдеєса єдасесадас ассаседсса седадсдеда ссссаддеЕса дсссдастаде бо аьрЕєсстдсра аассаєссса дЕСССсСЕССТІд саєадсдаєд дааадасста ЕЕсдаасод 120 сСЕЕСсдсада аассаддсса аадессадад адаєєдасст асссдеЕссс адаасессдас 180 ачдеЕддадеЕдс ссчарсоасес сЕСадддісс додсЕСЕдодда стдчарєссвтас єСЕссаадаєс 240
Есаачачдчедчд аддссдадда сдЕсдддЧдаєЕ састасвдеЕс ддсадддеас ссасеЕтсссь 300 тгаєасасєьєсдд дсодаддсас аааадеєддад астааа 336 «2105 22
«2115 112 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «2235» ПІАС-3 шВшАр 1 У12 «4005 щД 22
Авр І1е Уа1 Меєс ТрПг сіп ТБг Рго Тец бБетг ТІец бет Уа1 ТПг Рго СсС1Уу 1 5 19 15
Сіп Рго Аїа бек І1е бБег Сув Пув бБет бек біп бек Гей Гєц Нів 5бег
Авр со1у Ппув ТПт Тут Ггец Авп Ткр Гей Гей біп Агуд Рго сбіу сбіп 5бег 20
Рго б1п Агд Гецп Іїе Тухк Пец Уа1і! бек бій Гец Авр бек біу Уаі1ї Рго зо бо 25
Авр Атуд Рпе бБет сіу бБет сіу бБет біу ТПх Авр Рпе ТПтІ Іец Гув І1е 65 70 75 80 30 бек Агд Уаії Сі Аїа сС1ц Авр Уаї сіу Уа1ї Тук Туг Сув Тгтр сіп С1Уу 85 30 35
ТБЕ Нів Рібе Рго Тут ТПг Робе сС1у сі1у б1у ТПг пув Уа1! с1п І1е Гуз 35 1600 195 110 «2105 23 «2115 336 40 «2125 ОМА «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» Ро1уписіеосіде Епсодіпд БПІАС-3 шАБ 1 У12 45 «4005 Б23 чавєаєсдеєса єдасесадас ассаседсса седадсдеда ссссаддеЕса дсссдастаде бо 50 аЕгєсссвдста аассаєссса дісссІссвд сасадсдаєд дааадасста ЄсеЕдаастдв 120 сСЕЕСсдсада дассаддсса аадсссадад ачаєсчарсє ассЕСЯдстЕс адаасьсдас 180 ачдеЕддадеЕдс ссчарсоасес сЕСадддісс додсЕСЕдодда стдчарєссвтас єСЕссаадаєс 240
Есаачачдчедчд аддссдадда сдЕсдддЧдаєЕ састасвдеЕс ддсадддеас ссасеЕтсссь гаєасасьєсд дсодаддсас аааадеєддад асстсааа 336 «2105 24 «2115 112 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» ПІАсС-3 шВшАр 1 УЗ «4005 24
Авр Іїе Маії Меєсє ТПт сіп ТПт Рко Гец бБеїт Гей бегт Уаі! ТПг Рго 01Уу 1 5 19 15
Сіп Рго Аїа бек І1е бБег Сув Пув бБет бек біп бек Гей Гец Нів 5бег 20 25 30
Авр со1у Ппув ТПт Тут Ггец Авзп Ткр Гей Гей біп ув Рго сб1іу сбіп Ркго 35 40 45
Рго біц Агуд Гец Іїе Тук Гей Уаії бек біц Гей Авр бет Сі1у Уаї1ї Рго 50 зо бо
Авр Атуд Рпе бБет сіу бБет сіу бБет біу ТПх Авр Рпе ТПтІ Іец Гув І1е 65 70 75 80 зехт Агкд Уаі біш Аїа бій Авр Уаї с1у Маі Тухк Тук Сув Тктр с1п щу 85 30 35
ТБЕ Нів Рібе Рго Тут ТПг Робе сС1у сі1у б1у ТПг пув Уа1! с1п І1е Гуз 1600 105 110 «2105 25 «2115 336 «2125 ОМА «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» Ро1уписіеосіде Епсодіпд БПІАС-3 шпшАБ 1 У13 «4005 25 частасєсдеЕста сдасссадас ассастдсса седадедсда ссссаддсса дсссдастадвес бо аьрЕєсстдсра аассаєссса дЕССсСсСЕССТІд саєадсдаєд дааадасста ЕЕсдаасод сСЕЕСсдсада аассаддсса ассодссадад ачаєсчарсє ассЕСЯдстЕс адаасьсдас 180 ачдеЕддадеЕдс ссчарсоасес сЕСадддісс додсЕСЕдодда стдчарєссвтас єСЕссаадаєс 240
Есаададсдд аддссдадда сдусдддадЕЄ гастастудєс одоодсадддсрас ссассссссяь 300 тгаєасасєьєсдд дсодаддсас аааадеєддад астааа 336 «2105 26 «2115 112 «2125 РЕТ «213» Актітісіа1! бБедцепсе «2205 «2235» ПІАС-3 шВшАр 1 У14 «4005 226
Авр Іїе Маії Меєсє ТПт сіп ТПт Рко Гец бБеїт Гей бе Уаі! ТПг Рго с1Уу 1 5 19 15
Зо
Сіп Рго Аїа бек І1е бБег Сув Пув бБет бек біп бек Гей Гец Нів 5бег 20 25 30
Авр Аїа Гуз ТПгІ Тут Гец Авп Тгтр Гец Гец сіп Гув Рго с1у сіп Рго 35 40 45
Рго б1п Агд Гецп Іїе Тухк Пец Уа1і бек бій Гец Авр Бек сіу Уаі1ї Рго 50 зо бо
Авр Атуд Рпе бБет сіу бБет сіу бек б1іу ТПІ Авр Рпе ТПтІ Іец Гув І1е 65 70 75 80 зехт Агкд Уаі біш Аїа бій Авр Уаї с1у Маі Тухк Тук Сув Тктр с1п щу 85 30 35
ТБЕ Нів Рібе Рго Туг ТПт Рпе сС1у сі1іу б1у ТПк пув Уаї сі І1е Гуз 1600 195 110 «2105 27 «2115 336 «2125 ОМА «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе
«223» Ро1уписіеосіде Епсодіпд БПІАС-3 шпшАрБ 1 УТ4 «4005 227 чавєаєсдеєса єдасесадас ассаседсса седадсдеда ссссаддеЕса дсссдастаде бо аьрЕєсстдсра аассаєссса дЕССсССсСЕССТІд саєадсдаєд сааадасста ЕЕсдаасод 120 сСЕЕСсдсада аассаддсса ассодссадад ачаєсчарсє ассЕСЯдстЕс адаасьсдас 180 адеЕддадесдс ссдассдсеЕс стісадддеЕсс ддсЕСЕддда стчасєєстас ссеЕсаачаєсс 240
Есаачачдчедчд аддссдадда сдЕсдддЧдаєЕ састасвдеЕс ддсадддеас ссасеЕтсссь 300 тгаєасасєьєсдд дсодаддсас аааадеєддад астааа 336 «2105 28 «2115 16 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе
З0 0«2205 «2235» ПІАсС-3 шВшАр 1 14 СрВ1 «4005 28 пув бек бек Сіп бек Гей Гец Нів Бек Авр Аїа Кув ТПг Тук Іецй Авп 1 5 19 15 «2105 29 «2115 121 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..:5121) «2235» Т1АС-3 шАБ 2 УНН «4005 29 сі Маї біп Гец сіп сіп бет с1у Ркго бій гей Уаії пув Рго С1у А1а 1 5 19 15
Ззек Уаії пузв Іїе бек Сув пув ТПт бек с1у Тут ТПтї Рпе ТПх Авр Тук 20 25 30
Авп І1е Ніз Тер теп Агд Сіп бБехт Нів бі1у с1і1ц бБег їец с1ц Тгр Ії1е 35 40 45 сіу Тут Іїе Тут Рго Тут Бек с1і1у Авр І1е с1у Тут Авп біп гув РІПе 50 55 бо
Тув Авп Агуд Аза ТБПт Тецп ТпПг оУаії Авр Авп бет бБет бет ТПтІ Аїа Туг 65 70 75 80
Меє Авр Гец Агуд бет Гец ТПтІ бБет бій Авр бегт Аїа Уаі! Рпе Тут Сув 85 30 35
А1ї1а Агуд Ттр Нів Агуд Азп Туг Робе С1у Рго Тгр Рпе Аїа Тух Тгр 01У 1600 195 110 біп сб1у ТПг Ркго Уаі! ТПт Уаї бБет А1а 115 120 «2105 30 «2115 363 «2125 ОМА «2135 Мив шизси1ив8
Зо «2205 «221» щштівс Беасиге «223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд ГАС-3 шАБ 2 УН «4005 30 чаддессадс Ессадсадесс аддасстдад седдсдааас сгддддсесеЕС адесдаачаєсєе бо
ЕСсСсСтдсаада сЕєСстуудаєса сасаєєстасо дастасааса сасассддес даддсачадс 120 саєддачада дсссєЕЧдЧадсод чассодасає асєстасссєс асадеЕддеєда бассддаєсас 180 аассачаадс Есаадаасад ддссасаєсд асеєдсадаса ассссоссад сасадсстас 240 асдчдаєсеЕсс дсадсстдас аєссдаадас сседсадеЕсс єссаседедс аачаєсддсас 300 ачздаасстасс Есоддссссод ЯчЧЕЄсЧДСсСЕсас соддддссаад ддасЕСссддеЕ саседеЕСссь
З6о чса 363
«2105 31 «2115 5 «2125 РЕТ «2135 Мив шизсцп1цйв8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(5) «223» Т1АС-3 шАр 2 Ун сов 1 «4005 31
Авр Тут Авп І1е Нівз 1 5 «2105 32 «2115 17 «2125 РЕТ «2135 Мив шизсцп1цйв8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(17) «223» Т1АС-3 шАБ 2 УНН Сов «4005 32
Зо
Тук Іїе Тут Рко Тут бек С1у Авр Іїе б1іу Тут Авп біп Гув РПе Гуз 1 5 10 15
Авп «2105 33 «2115 12 «2125 РЕТ «2135 Мив шизсцп1цйв8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(12) «223» Т1АС-3 шАр 2 УНН СОВЗ «4005 33
Тер Ніз Агд Авп Тут Рібе Сіу Рго Тгр Робе Аїа Туг 1 5 10 «2105 34 «2115 111 «2125 РЕТ
«2135 Мив шизси1ив8 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..:(111) «2235» Т1АС-3 шАБ 2 МУ, «4005 34
Авр Іїе Маії Гецп ТПт сіп бек Рго Аїа бБегт Гей Аїа Уаі! бБет Гец 01Уу 1 5 19 15 біп Агуд Аза ТПг І1їе бБет Сув Гув Аїа бБег біп бек Маії Авр Тут Авр сіу бій бБет Тут Мес Авп Тер Тут сіп сбіп гув Рго біу біп Рго Ркго 20 35 40 45
Туз Гечп Гец І1е Тут Уа1ї Уа1і бек Авп Гей біц бБехт с1у Іїе Рго Аїа 50 зо бо 25
Ат Рпе бехг Сіу бБегт С1іу бек біу ТПІ Авзр Роре ТПг Ієц Авп І1е Нівз 65 70 75 80
Зо
Ро Уаі бі бі бі Авр Аїа Аїа ТПг Тут Тут Сув сіп сіп бек бек 85 30 35 бі Авр Рго Гей ТПгІ Рпе сіу Аїа с1у ТПг Гпув еп бій Гец Гуз 1600 195 110 «2105 35 «2115 333 «2125 ОМА «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» щштівс Беасиге «223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд ГАС-3 шАБ 2 ХУ, «4005 35 часасєсвєдеЕдс сдасссааєс єссадсеЕсєсе ЕєЕгддсеЕдедЕ сЕСТадддса дадддссасс бо ассЕсссдса аддссадсса аадедеЕєЧчає саєчаєдаєд ааадеЕсавєає даасеєддасас 120 саасадааас саддасадсс асссааассс сссасєсвтаєд ЕсдЯдваєссаа ЕСТаВдаассь 180 чадаєссссад ссаддеєсєсад єддсадсдда ссЕдддасад ассссасссо саасаєссає ссЕЯДсодадча адчадчасдс сбдсаасстає саседссадс ааадетадеда ддадасссдсЕс 300 асдЕссддерд срдоддассаа дсгддадссд ааа 333 «2105 36 «2115 15 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1и8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(15) «2235» ТАС-3 шАБ 2 УТ, СВІ «4005 36
Туз Аїа бБет Сіп бек Уаі Авр Тут Авр с1і1у бі бБет Тук Меє Авп 1 5 19 15 «2105 37 «2115 7
З0 «2125 РЕ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(7) «2235 ТАС-3 шАБ 2 УТ Срв2 «4005 37
Ууаї Маї Бек Авп Гец біц 5бег 1 5 «2105 38 «2115 39 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(:9) «2235» ТАС-3 шАр 2 УТ СрВЗ «4005 38 біп біп бет бБет бі Авр Ркго Гец ТПг
1 5 «2105 39 «2115 121 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(121) «223» ТАС-3 шАБ З УН «4005 39 сі Маі Агд Гец сіп сіп бек сіу Рго бій Гей Уаії пув Рго с1у А1а 1 5 10 15
Ззек Уаії пузв Іїе бек Сув пув Аїа бек с1у Тут ТПтї Рпе ТПх Авр Тук 20 25 30
Авп о І1е Ніз Тгр Уа1і! Агуд СсСіп бБехг Нів сі1іу сіп бБег їєц Сі Тер І1е сіу Тук Іїе Тук Рго Тут Авп с1іу Авр ТПт с1у Тут Авп біп гув РІПе зо 50 55 бо
Туз ТПт пув Аїа ТПї Гей ТП Уа1 Авр Авп бет бБет Авп ТПг Аїа Тук 65 70 75 80 35
Меє біц Гец Агкд бБет Гец Аїа бет бій Авр бегт Аїа Уаі1! Тут Тут Сув 85 Зо 95 40
ТПК Акуд Ткр бБет Агуд Авп Тут Рбе біу Рго Ттр Рпе Аїа Тут Ттр У 100 105 110 45 сСіп сб1у ТПх пГец Уа1 ТПг Уа1ї! бБег А1а 115 120 «2105 840 «2115 363 «2125 ДМА «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» щштівс Беасиге «223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд ГАС-3 шАБ 3 УН
«4005 40 чаддеЕссддс Ессадсадсс аддасстдад ссддсдааас суддддсесеЕсС адсдаачаєва бо
ЕСсССсСтдсаадд сЕєстудаєса сасаєссасоі дастасааса сеЕсасрдддеЕ даддсачадс 120 саєддасада дссЕєЧадчед дассддвасає ассєстасссс асааєддеєда бассддастсас 180 аассачаадс Есаадассаа ддссасаєсд асеєдсадаса ассссоссаа сасадсстас 240 асддаасесс дсадсстддс аєссдаадас ссеЕдсадессеє ассассдвас аачаєддвадс 300 ачдаасстасс Есоддссссод ЯдЧЕЄсЧдСсСЕсСас соддддссаад дчдасестддадс сасуєдесесь
З6о чса 363 «2105 141 «2115 5 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8
З0 0«2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(5) «2235 ТАС-З3 шАБ З УН СОВ 1
З5 «4005 41
Авр Тут Авп І1е Нівз 1 5 «2105 42 «2115 17 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(17) «2235 ТАС-3 шАрБ З УН СрВ2 «4005 42
Тук Іїе Тут Рко Тут Авп б1у Авр ТПх сіу Тут Авп біп Гув РПпе Гуз 1 5 10 15 тах
«2105 43 «2115 12 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(12) «223» Т1АС-3 шАрБ 3 УН СОВЗ «4005 43
ТЕр б5Бет Акд Авп Тут РПпе С1у Рго Тгр Рпе Аїа Туг 1 5 10 «2105 44 «2115 111 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(111) зо «223» Т1АС-3 шАБ З УТ, «4005 а44
Авр Іїе Маії Гецп ТПт сіп бет Рко ТПтІ бБеїт гей Аїа Уаі! бБет Іеєц 01Уу 1 5 10 15 біп Агуд Аза ТПтІ Іїе бБет Сув пув Аїа бек біп бет Уаії Авр Тут Авр 20 25 30 с1у Авр бБегт Тут Меєс Авп Тктр Тут сіп сбіп гув Рго біу біп Рго Ркго 35 40 45
Туз Гецп їГец І1е Тут Аза Аза бек Авп Гей біц бехт с1у Іїе Рго Аїа бо 50 Акту Робе бет с1і1у бек с1і1у бек Сс1у ТПг Авр Робе ТПІ Іеєцй Авп І1е Нів 65 70 75 80
Ро Уаі бі бі бі Авр Аїа Аїа ТПг Тут Тут Сув сіп сіп бек бек 55 85 30 95 біЧ Авр Рго Гей ТПтІ Рпе сіу Аїа сіу ТПїІ Гуз гей бій Ггец Гуз
1600 195 110 «2105 45 «2115 333 «2125 ОМА «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» щштівс Беасиге «223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд ГАС-3 шАБ 3 ХУ, «4005 45 часастєдеЕдс сдасссааєс єссаасеЕсєст єЕгддсЕдеЕдЕ сЕСТадддса дадддссасс бо ассЕсстсдса аддссадсса аадедеЕєЧчає саєчаєдаєд асадеЕсаєає даасеєдатсає 120 саасадааас саддасадсс асссааасіс сісаєстаєд срдсаєссаа ЕСТтадаассь 180 чадаєссссад ссаддеЕсєсад сдоадсадеддад ссЕдддасад ассссасссо саасаєссає 240 ссЕЯДдсодадча адчадчасєдс єдсаасстає саседссадс ааадетадеда ддадасссдсЕс 300 асчєссддсд седддассаа дстгддадсвєд ааа 333 «2105 46
З5 «2115 15 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(15) «2235 Т1АС-3 шАБ З УТ, СрВ1 «4005 46
Туз Аїа бБет сСіп бек Уаі Авр Тухт Авр сб1у Авр бБетї Тут Меє Авп 1 5 19 15 «2105 47 «2115 7 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ
«222» (1)..(7) «223» Т1АС-3 шАр З МІ Сов «4005 47
Аза Аїа Бек Авп Гец біц 5бег 1 5 «2105 48 «2115 9 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(9) «223» Т1АС-3 шАрБ 3 УТ СовЗ «4005 48 біп біп бет бБет бі Авр Ркго Гец ТПг 1 5 «2105 249 «2115 121 «2125 РЕТ зо «2135 Мив тивсчійв «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(121) «223» ТАС-3 шАБ 4 УН «4005 49 сі Ма! сіп Пец Нів сіп бек с1у Рго Сіш їец Уа1! Пув Рго С1у А1а 1 5 10 15
Ззек Уаії пузв Іїе бек Сув пув ТПт бек с1у Тут ТПтї Рпе ТПх Авр Тук 20 25 30
Авп о І1е Ніз Тер Уа1ї Ппув біп бБехт Нів біу Гуз бБет їец с1ц Тгр Ії1е 35 40 45 сіу Тук Іїе Тук Рго Тут Авп с1у Авр Аїа с1у Тут Авп біп Авп РІе 50 55 бо
Туз ТПт пув Аїа ТПї Гей ТБ Уа1 Авр Авп бет бБет бБетї ТПг Аїа Тук 65 70 75 80
Меє біц Гец Агкд бет Гец ТПтІ бБет бій Авр бегт Аїа Уаі1! Тут Тут Сув 85 30 35
Аза Атуд Ттр Авп о Меє Авзп Тут РпПе сСіу Рго Тгр Рпе Аза Тут Тгр 01Уу 1600 195 110 сСіп сб1у ТПх пГец Уа1 ТПг Уа1ї! бБег А1а 115 120 «2105 50 «2115 363 «2125 ОМА «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» щштівс Беасиге «223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд ГАС-3 шАБ 4 УН «4005 50 чаддсссадс сссассадес аддасстдад седдеЕдааас седдддссес адедаачата бо
ЕссЕдсаада сЕсстЕддаса сасьсесасе дастасааса гасассдддІ даадсададс 120 20) саєддааада дсссєЕЧдЧадсод чассодасає арєстасссєс асааєддеєда єдссддадстас 180 аассачаасо Есаадассаа ддссасаєсд асеєдсадаса ассссоссад сасадсстас 240 асддадсеЕсс дсадсстдас аєссдаддас ссеЕдсадессє ассассдедс аачаєддаас 300 аєчаастасеЕ єгддсссстд дЕЄЕДСЕвас єддддссаад ддасеЕстуддеЕ састдесесяь
З6о 929 363 «2105 51 «2115 5 «2125 РЕТ «2135 Мив тивсчійв «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(5) «2235 ТАС-З3 шАБ 4 УН СОВ 1 «4005 51
Авр Тут Авп І1е Нівз 1 5 «2105 -Х52 «2115 17 «2125 РЕТ «2135 Мив шизсцп1цйв8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(17) «223» Т1АС-3 шАр 4 УНН Сов «4005 щД 52
Тук Іїе Тут Рко Тут Авп б1у Авр Аза сіу Тут Авп біп Авп РПпе Гуз 1 5 10 15 тах «2105 53 «2115 12 «2125 РЕТ зо «2135 Мив тивсчійв «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(12) «223» Т1АС-3 шАр 4 УНН СОВЗ «4005 53
ТЕр Авп Ме Авп о Тук Рпе с1у Рго Тгр Рпе А1а Туг 1 5 10 «2105. 54 «2115 111 «2125 РЕТ «2135 Мив шизсцп1цйв8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(111) «223» Т1АС-3 шАБ 4 УТ, «4005 54
Авр Іїе Маії Гец ТПт сіп бет Рго Аїа Бех гей Аїа Уаі! бет Іеєц 01Уу 1 5 10 15 біп Агуд Аза ТПтІ Іїе бБет Сув пув Аїа бБет біп бБет Уаії Авр Тут Авр 20 25 30 сіу Ма1ї ТПІ Тут І1їе Авп Ткр Тут сіп сбіп гув Рго біу біп Рго Ркго 35 40 45
Туз Гец їец І1е Рпе Аїа Аїа бБегт Авп їец сіц бехт с1у Іїе Рго Аїа 50 зо бо
Акту Робе бет с1і1у бек с1і1у бек Сс1у ТПг Авр Робе ТПІ Іеєцй Авп І1е Нів 65 70 75 80
Ро Уаі бі бі біш Авр Аїа Аїа ТПтІ Тут Тук Сув сбі1іп сі1іп бек Авп 85 30 35 біЧ Авр Рго Гей ТПтІ Рпе сіу Аїа сіу ТПїІ Гуз гей бій Ггец Гуз 1600 195 110 «2105 чЩ6ео55 «2115 333 «2125 ОМА зо «2135 Мив тивсчійв «2205 «221» щштівс Беасиге «223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд ГАС-3 шАБ 4 Х1, «4005 55 часасєсєдеЕдс Едасссааєс сссадсеЕссеЕ ЕсододсЕдЕдЕ сЕСвадддса дадддссасс бо ассЕсстсдса аддссадсса аадедеЕєЧчає саєчаєсдаєд єсасеЕсаєває саастддасас 120 саасадааас саддасадсс асссааассс сссассеєсд ссдсаєссаа ЕСТтадаассь 180 чадаєссссад ссаддеЕсєсад сдоадсадеддад ссЕдддасад ассссасссо саасаєссає 240 ссЕЧдсоддадд аддаддаєдс єдсаасстає гасрдеЕсадс ааадсааєсда ддаєсссоастіс 300 асдЕссддерд срдоддассаа дсгддадссд ааа 333 «2105 ь556 «2115 15
«2125 РЕТ «2135 Мив шивси1іцв «2205 «2215» МІ5С РГЕАТОВЕ «2225 (1)..(15) «2235» ТГТАС-З3 шАБб 4 УТ СсоВІ1 «4005 Ь56
Туз Аїа бБет сСіп бек Уаі Авр Тут Авр сіу Маї ТПІ Тут Ії1е Авп 1 5 10 15 «2105 57 «2115 7 «2125 РЕТ «2135 Мив шивси1іцв «2205 «2215» МІ5С РГЕАТОВЕ «2225 (1)..(7) «2235» ТГТАС-З3 шАБбБ 4 УТ. СОВ2 «4005 Ь57
Аза Аїа бБег Авп Тїец сіц 5ег 1 5 «2105 58 «2115 39 «2125 РЕТ «2135 Мив шивси1іцв «2205 «2215 МІ5С РГЕАТОВЕ «2225 (1)..(9) «2235» ТГТАС-З3 шАБ 4 УТ. СОВЗ «4005 58 біп біп бег Авп о б1іц Авр Ркго Гец ТПг 1 5 «2105 59 «2115 121 «2125 РЕТ «2135 Мив шивси1іцв «2205 «2215» МІ5С РГЕАТОВЕ «2225 (1)..(121)
«2235» Т1АС-3 шАБ 5 УН «4005 Д БкБ59 сі Маї біп Гецш сіп біп бек с1іу Рго сій Гей Уа1! Гув Рго сіу Аїа 1 5 19 15
Ззек Уаї пув Іїе бек Сув пув Аїа бет б1у Тут ТПї Рібе ТПх Авр Тук 20 25 30
Авп о І1е Ніз Тер Уа1ї Ппув біп бБехт Рго біу Гув бБет їец сб1ц Тгр Ії1е 35 40 45 сіу Тут Іїе Тут Рго Тут Бек с1у Авр Рпе б1іу Тугт Авп біп гув РІПе 50 зо бо
Туз бБет пув Аїа ТПї Гей ТП Уа1 Авр Авп бет бБет бБетї ТПг Аїа Тук 65 70 75 80
Мес Авр Гец Агуд бБет Гей ТПтї Бек сій Авр бек Аїа Уаії РпПе Тут Сув 85 30 35
А1ї1а Агуд Ттр Нів Агуд Азп Туг Робе С1у Рго Тгр Рпе Аїа Тух Тгр 01У зо 1600 195 110 сбіп с1у ТПт Гец УМаі! ТПт Уаї бет А1а 115 120 «2105 60 «2115 363 «2125 ОМА «213» Мив штивсчійв «2205 «221» щштівс Беасиге «223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд ГАС-3 шАБ 5 УН «4005 60 чаддеіссадс Ессадсадесс аддасстдад ссддсдааас сіддадсесес адсдаачасє- бо
ЕссЕдсааадч сСЕсСсСтЕдддаса сасаєресасе дастасааса гасассдддІ даадсададс 120 ссЕддааада дсссЕЧдааєо чассодасає асєстасссєс асадеЕддеЕда ЕЕссддваєсас 180 аассачаадс Есаададсаа ддссасаєсд асеєдсадаса ассссоссад сасадсстас 240 асдчдаєсеЕсс дсадсстдас аєссдаддас сседсадесє єЕссассдедс аадчаєддсас адчаастасеЕ єгддсссстд дЕЄЕДЯДСЕвас єддддссаад ддасеЕстуддеЕ састдесесяь
З6о чса 363 «2105 6561 «2115 5 «2125 РЕТ «213» Мив штивсчійв «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(5) «2235 ТАС-З3 шАБ 5 УН СОВ 1 «4005 61
Авр Тут Авп І1е Нів 1 5 «2105 62
З0 «2115 17 «2125 РЕТ «2135 Мив шизсцп1цйв8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(17) «2235» ТАС-3 шАБ 5 УН СрВ2 «4005 62
Тук Іїе Тут Рко Тут бек Сб1у Авр Рпе біу Тут Авп біп Гув РПпе Гуз 1 5 19 15 зекг «2105 63 «2115 12 «2125 РЕТ «2135 Мив шизсцп1цйв8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(12)
«223» Т1АС-3 шАр 5 УНН СОВЗ «4005 63
ТЕр Нів Акуд Авп о Тук Рпе с1у Рго Тгр Рпе А1а Туг 1 5 10 «2105 564 «2115 111 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(111) «223» Т1АС-3 шАБ 5 УТ, «4005 64
Авр Іїе Маії Гец ТПт сіп бет Рго Аїа Бех гей Аїа Уаі! бет Іеєц 01Уу 1 5 10 15 біп Агуд Аза ТПтІ Іїе бБет Сув пув Аїа бек біп бет Уаії Авр Тут Авр 20 25 30 сі1у бі бек Тук Меє Авп Тгр Тухг сСіп сіп Пув Рго С1у Сіп Рго Рго
Туз Гечп Гец І1е Тут Уа1ї Уа1і бек Авп Гей біц бБехт с1у Іїе Рго Аїа 35 50 55 бо
Ат РобПе бехг Сіу бБегт С1іу бек біу ТПІ Авзр Роре ТПг Ієц Авп І1е Нівз 65 70 75 80 40
Ро Уаі бі бі бі Авр Аїа Аїа ТПг Тут Тут Сув сіп сіп бек бек 85 Зо 95 45 біЧ Авр Рго Гей ТПтІ Рпе сіу Аїа сіу ТПїІ Гуз гей бій Ггец Гуз 100 105 110 «2105 65 «2115 333 «2125 ДМА «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» щштівс Беасиге «223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд ГАС-3 шАБ 5 ХУ,
«4005 65 часасєсєдеЕдс Едасссааєс сссадсеЕссеЕ ЕсододсЕдЕдЕ сЕСвадддса дадддссасс бо ассЕсссдса аддссадсса аадедеЕєЧчає саєчаєдаєд ааадеЕсавєає даасеєддасас 120 саасадааас саддасадсс асссааассс сссасєссвсаєсд ЕсСЯЄЕсссаа сСстадаассь 180 чадаєссссад ссаддеЕсєсад сдоадсадеддад ссЕдддасад ассссасссо саасаєссає 240 ссЕЧдсоддадд аддаддаєдс єдсаасстає гасрдеЕсадс ааадчстадчсда ддаєсссоастіс 300 асдЕссддерд срдоддассаа дсгддадссд ааа 333 «2105 566 «2115 15 «2125 РЕТ «213» Мив штивсчійв «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ зо «2225 (1)..(15) «2235» ТАС-3 шАБ 5 УТ, СрВ1 «4005 66
Тув Аїа бБег біп бБет Маі1і Авр Тут Авр Сбіу біц бБег Тук Меє Авп 1 5 19 15 «2105 67 «2115 7 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(7) «2235 ТАС-3 шАБ 5 УТ. Срв2 «4005 67
Ууаї Маї Бек Авп Гец біц 5бег 1 5 «2105 168 «2115 39 «2125 РЕТ
«2135 Мив шизси1ив8 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(9) «223» Т1АС-3 шАр 5 УТ СоВЗ «4005 568 біп біп бет бБет бі Авр Ркго Гец ТПг 1 5 «2105 69 «2115 118 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(118) «223» ІТАС-3 шАБ 6 УН «4005 69 січ Маї Гей Гец сіп сіп бет с1і1у Ркго бій гей Уаії пув Рго С1у А1а 1 5 10 15
Зо
Ззек Уаії пув Іїе Рго Сув пув Аїа бек с1у Тут ТПтї РПпе ТПх Авр Тук 20 25 30
Авп о Меєсє Азр Ткгр Уаї Ппув біп бБехт Нів бі1у с1і1ц бБег їец с1ц Тгр Ії1е 35 40 45 сС1у Авр І1е Авп Рго Авр Авп сі1у Уаї1ї! ТПтї І1е Тут Авп сіп Гув РІе 50 55 бо січ сб1у пув Аїа ТПт Гец ТПт Уаї Авр Гуз бет бет бет ТПтІ Аїа Туг 65 70 75 80
Меє біц Гецп Агкд бет Гец ТПтІ бет бій Авр ТПтІ Аїа Уа1ї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Атуд бі Аза Авр Тут РпПе Тут РпПе Авр Тут Тгр С1у біп с1у ТПг 100 105 110
ТПг Гец ТПг Уаї бек 5бег 115
«2105 70 «2115 354 «2125 ОМА «213» Мив штивсчійв «2205 «221» щштівс Беасиге «223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд ГАС-3 шптАБ 6 УН «4005 мН70 чаддеЕсстдс гдсаасадесс сддасстдад седдсдаадс сгддддасЕЕсС адсдаачаєва бо сссрдсаадд СЕссСЕдддаса сасаєесасе дастасааса гддассдддІ даадсададс 120 саєддачада дсссЕЧдЧадсод чассодачає ассєааєсстд асааєддеЕдс бастаєстсас 180 аассачаадс Есдадддсаа ддссасассд асеєдсадаса адсссоіссад басадсстас 240 аєддадсссс дсадсстдас ассеЕдаддас астдсадсст аєєстасеєдсдс аададачоасд 300 чаєстассеЕєсс ассседасвта сеЕддддссаа ддсассассс єсасадессьс сьеса 354 20) «2105 71 «2115 5 «2125 РЕТ «2135 Мив тивсчійв «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(5) «2235» Т1АС-3 шАБ б ун Сов 1 «4005 Д Л71
Авр Тут Авп Меє Авр 1 5 «2105 «72 «2115 17 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(17) «2235» ТАС-3 шАБ 6 УН СрВ2
«4005 72
Авр Іїе Авп Рго Авр Авп сіу Уа! ТПї І1їе Тут Авп біп пув Рпе с1ц 1 5 19 15 ов1у «2105 73 «2115 9 «2125 РЕТ «213» Мив штивсчійв «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(9) «223» Т1АС-3 шАр 6 УН СОВЗ «4005 73 бі Аза Авр Тут Рпе Тут РіПе Авр Туг 1 5 «2105 174 зо «2115 107 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225» (1)..(107) «223» Т1АС-3 шАБ б УТ, «4005 774
Авр І1ї1е Уа1ї Меєсє Трт сСіп бек Нів Агд Рібе Меб бег ТПт бек Уа1 0Щ1У 1 5 10 15
Авр Атуд Уаї бБет Іїе ТПт Сув пув Аїа бБет біп Авр Уаі! бет бет Уаї 20 25 30 уаї Аїа Тгр Тут Сіп біп Пув Рго сіу Сіп бек Рго Гув Гец Ге Іїе 35 40 45
Рпе бек Аїа бек Тухк Агкуд Тут ТПт сі1у Маі Рго Авр Агд Рпе ТПг Щ1Уу 50 зо бо бек біу бБек бі1у ТПх Авр Рпе ТПтІ РпПе ТПІ Іїе бБет Бек Уаі сіп Аїа
65 70 75 80
А1ї1а Авр тїец Аїа Уаі1ії Тут Тут Сув Сіп біп Нів Тут бет Тірк Рго Тгр 85 30 35
ТПЕ Рпе сіу сіу с1у ТПжї Кпувз ге бі Іїе Гуз 1600 195 «2105 175 «2115 321 «2125 ОМА «213» Мив штивсчійв «2205 «221» щштівс Беасиге «223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд ГАС-3 птАБ б УТ, «4005 715 часасєєсдеда єдасссадсс ссасачаєєсс асдессасає садеЕєддада садддеЕсадс бо ассасссдса аддссадсса двчдаєдеЕдчадеЕ СЕСЕДЕсЧдтад сссддсаєса асадааасса 120 ччасаассес стаааєссасе дарєсєссс дсаєсстасс доасасасвда адсссстдає зо 180 сЯсЕсСастд дсадчедчаєс сдддасоадчає сссасееєеєса ссаєсадсад єДдЕдсаддсе 240 чдсачасстдд садеЕстаєса сідеЕсадсаа саєсстаєадта сеЕССсСдЕддас дЕєСЯдодесддва 300 часассаадс гддааассаа а 321 «2105 76 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Мив штивсчійв «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(11) «2235» ТАС-3 шАБ 6 УТ, СВІ «4005 76 пув Аїа бек б1п Авр Уаі1і! бегт бБет Уаі1ї! Уаї А1їа 1 5 10
«2105 177 «2115 7 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(7) «223» Т1АС-3 шАр 6 УТ Сов «4005 ЛТ177 зек А1ї1а бБект Тут Агд Тухк ТіК 1 5 «2105 78 «2115 9 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(9) «223» Т1АС-3 шАр 6 УТ СоВЗ «4005 7Л78
Зо
Сіп б1іп Ніз Тук бБетг ТіртІ Рго Тгр ТПг 1 5
З5 «2105 79 «2115 118 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе 40 «2205 «223» П1АС-3 шАБ б УН-1 «4005 79 45 Сбіп Маі сбіп Гец Уаії Сіп бек б1у Аїа сіц Уаї пув Гув Рго сіу Аїа 1 5 10 15
Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут ТПтї Рпе ТПх Авр Тук 50 20 25 30
Авп о Мес Авр ТІр Уаі Акд сіп Азїа Рго сСіу біп сб1у їец біц Тгр Меє 55 сб1у Авр Іїе Авп Рго Авр Авп сіу Уаі! ТПтІ І1е Тут Авп біп гув РІПе бо сі б1у Атуд Маії ТПт Меє ТПтІ ТІ Авр ТПї бет ТПтІ бет ТПтІ Аїа Туг 65 70 75 80
Меє біц Гец Агд бБет Гец Акд бет Авр Авр ТПтІ Аїа Уа1! Тут Тут Сув 85 30 35
Аза Атуд бі Аза Авр Тут РпПе Тут РпПе Авр Тут Тгр С1у біп с1у ТПг 1600 195 110
ТІ Гей ТПк Уаї бек 5ег 115 «2105 80 «2115 354 «2125 ОМА «213» Агтіті1сіа1! бБецдцепсе «2205 «223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд БПІАС-3 шпшАр 6 УН-1 «4005 80 саддеіссадс гддсдсадсс сддсодссдаа дсдаачааас ссддсдсаад садсдаадччЧвед бо 20)
ЕссрЕдсаадд ссадсддсса сасссесасс дастасааса гддассдддІ ссдасаддес 120 ссаддасадчд дсссддаасд часдддсдас ассаассссд асаасддсдІ дассаєстас 180 аассачааає Есдадддадсад адсдассаєбд ассассдаса ссадсассад сассдестас 240 аєддаастдс ддЕссстдсу дадсдасдас ассдссуєрдЕ астасрдсдс садададчасс 300 частассеЕсс асессдасса сеЕддддссад ддсассассс гдассаєдеЕссьсс 354 «2105 81 «2115 118 «2125 РЕТ «2135 Акгксітісіа1! бедцепсе «2205 «2235» ПІАС-3 шВшАр б УН-2 «4005 81 сі Маї сб1іп Гец Маії сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаії ув Рго б1у 1У 1 5 19 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПІ РПпе 5еїг Авр Тук 20 25 30
Авп о Мес Авр ТІр Уаі Акд сіп Аїа Рго сбіу пув біу їец бі Тгр Уаї 35 40 45 зект Авр І1їе Авп Рго Авр Авп сіу Маї ТПІ Іїе Тут Авп сіп Гпув РБГе 50 зо бо сі б1у Акуд Рпе ТПтІ І1е 5Бег Агд Авр Авп Аїа Пув Авп бБет Гец Туг 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гец Агд Аїа бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 30 35
Аза Атуд бі Аза Авр Тут РпПе Тут РпПе Авр Тут Тгр С1у біп с1у ТПг 1600 195 110
ТПг Гец ТПг Уаї бек 5бег 115 20) «2105 82 «2115 354 «2125 ОМА «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд БПІАС-3 шАр 6 УН-2 «4005 82 чаддсссадс гддЕддааєс єддсддсддада сеЕддеЕсаадс сеЕддсддсад ссудачасод бо адсеЕдсдссрд ссадсддссс сасссесадс дастасааса гддассдддІ ссдасаддес 120 ссЕддсаадчд дссгіддаасд ддсдсссдас ассаассссд асаасддсдІ дассаєстсас 180 аассачаадс Есдаддадссд дЕеЕссассаєс адссоддддаса асдссаадаа садсстедсас 240 сгдсачаєда асадссодсуд ддссдаддас ассдссдеЕдс ассассдсдс садададдес 300 частасеЕсєст асеЕєсдасвта суіддддссад ддсассассс гдассуєаєс стсс 354
«2105 83 «2115 197 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» ПІАС-3 шАр б МІ-1 «4005 83
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПт сіп бет Рко бБетї бБеїт Гей бегт Аїа бБет Уа1ї 01Уу 1 5 19 15
Авр Акуд Уа1і ТПг Іїе ТПтї Сув Агуд Аза бБегт біп Авр Уаії бек бек Уаї уаї Аїа Ттр Тут сіп сіп пув Ркго сіу гув Аза Рго пув Іїец Іец І1е 20 35 40 45
Тук бБет Аїа бет Тут Агд Тух ТПх біу Уа1 Рго бБет Ат9д Рпе Бех щу 50 зо бо 25 бек біу бБек бі1у ТПх Авр Рпе ТПтї ТІецй ТПІ Іїе бБет Бек Гей сіп Рго 65 70 75 80
Зо
Сіш Авр Рпе АТїа ТПт Тут Тук Сув сб1іп Сіп Ніз Тугк бетг Тіт Рго Тгр 85 30 35
ТПг Рпе сіу сіу сіу ТПпхїх Гув Гей Сбіц І1їе Гуз 1600 195 «2105 84 «2115 321 «2125 ОМА «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд БПІАС-3 шпшАр 6 МІ-1 «4005 84 часасссада єдасссадад ссссадсадс сеЕдадсдсса дсдЕдддсда сачадедасс бо ассасссдсЕс дддссадсса дчдасдеЕдссс адсодсдадеЕда сссддсаєса дсадаадссс 120 часааддссс ссаадссдсо дасссасадс дссадстасс додасасасадд сдсдсссадс 180 ачаєссадсуд дсадсддссс сддсассддас сссассстрда ссаєсадсад ссрдсадссс 240 чадчассссу ссасстасса седссадсад састрасадса ссссстддас сЕссддсдада ддсассаадс гсддаааєсаа 49 321 «2105 85 «2115 197 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «2235» ПІАС-3 шВАр б МІ -2 «4005 85
Авр Іїе Маії Мес ТПтІ сіп бет Рко бБетї бБеїт Гей бегт Аїа бБет Уа1ї 01Уу 1 5 19 15
Авр Атуд Маії ТПт Іїе ТПт Сув Акгуд Аїа бек біп Авр Уаі1! бет бет Уаї 20 25 30 уаї Аїа Ттр Тут сіп сіп пув Ркго сіу гув Аза Рго пув Іїец Іец І1е
Зо
Тук бБет Аїа бет Тут Агд Тух ТПх біу Уа1 Рго Авр Ат9д Рпе Бех щу зо бо 35 зек біу Бек біу ТПх Авр Рпе ТПтІ РпПе ТПтІ Іїе бБег бБетг Гей біп Рго 65 70 75 80
Сі Авр І1е АТїа Уаї Тут Тук Сув сб1іп Сіп Ніз Тугк бетг Тіт Рго Тгр 40 85 90 35
ТПЕ Рпе сіу сіу с1у ТПжї Кпувз ге бі Іїе Гуз 1600 195 45 «2105 86 «2115 321 «2125 ОМА 50 «2135 Акгксітісіа1! бедцепсе «2205 «223» Ро1уписіеобіде Епсодіпд БПІАС-3 шАр 6 МУІ-2 «4005 86 часассдєда єдасссадад ссссадсадс сідадсдсса дсдЕдддсда сачадедасс бо ассасссдсЕс дддссадсса дчдасдеЕдссс адсодсдадеЕда сссддсаєса дсадаадссс часааддссс ссаадссдсІ дасссасадс дссадстасс додасасасадд сдедсссда; 180 ачаєссадсуд дсадсддсЕс сддсассдас сссассесса ссаєсадсад ссгрдсадссс 240 чаччасаєссд ссдеЕєстасвта стідссадсад састасадса ссссстддас сеЕгсоддсоавда 300 часассаадс гддаааєссаа 4дЧ 321 «2105 87 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Актітісіа1! бБедцепсе «2205 «223» ВГАС-3 шАБ 6 УІ-1/У1-2 СОРВІ1 «4005 87
Атуд Аїа бБет сіп Авр Уаії бБет бБет Уаі1і Уаії Аза 1 5 19 20) «2105 88 «2115 8 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» ІіпКехг 1 «4005 88 сіу б1у с1у Бех с1у сі1у сі1у «1У 1 5 «2105 89 «2115 6 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» Сув КтіпКетг 2 «4005 89 сСіу С1у Сув С1у С1у ФУ 1 5
«2105 90 «2115 4 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа1! бБедцепсе «2205 «223» АВОр тіпКег «4005 90 сіу с1у о1у 5бБег 1 «2105 91 «2115 6 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» ІіпКкекг «4005 191 їеи сі1у с1у сС1у бек С1У 1 5 «2105 92
З0 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» ТіпКкег «4005 92 сіу б1у сб1у Бек сіу сіу сіу Бех с1у С1у щЩУ 1 5 10 «2105 93 «2115 5 «212» РЕ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» ІіпКкекг «4005 93
А1їа бБетк ТПхї Ггув с1У 1 5 «2105 94 «2115 6
«2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» ТІіпКег «4005 94 теп сіц Рко Ппув бет 5бег 1 5 «2105 95 «2115 5 «212» РЕ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» ІіпКег «4005 95
Аза Рко Бек бБекг 5бБекг 1 5 «2105 96 «2115 7 «2125 РЕТ «2135 Акгксітісіа1! бедцепсе «2205 «223» Негегодіштет-Ргоштобіпд Роштшаїп
З5 «4005 96 сіу Маі1 бій Рго Ппув бек Сув 1 5 «2105 97 «2115 6 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» Негегодіштет-Ргоштобіпд Роштшаїп «4005 97 уаї бій Ркго Ппув Бек Сув 1 5 «2105 18 «2115 6 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе
«223» Негегодіштет-Ргоштобіпд Роштшаїп «4005 98
Аїа біц Рго Гпув бек Сув 1 5 «2105 199 «2115 7 «212» РЕ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» Негегодіштет-Ргоштобіпд Роштшаїп «4005 99 сіу Рпе Авп Атуд о1у сіц Сув 1 5 «2105 100 «2115 6 «212» РЕ «213» Агтіті1сіа1! бБедцепсе
З0 0«2205 «223» Негегодіштет-Ргоштобіпд Роштшаїп «4005 100
Рпе Азвп Агд СсС1у сі Сув 1 5 «2105 101 «2115 28 «212» РЕ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» Е-Сої1 «4005 101
Сбіц Маі Аїа Аза Гецшц сіц Ггув сіц Уаі Аїа Аїа Гей бі Ггув сіц Уаї 1 5 10 15
Аза Аїа їец сіц гув сіц Уаі Аїа Аїа Гей біц Гуз 20 25 «2105 102 «2115 28
«2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» Кк-Сої1 «4005 102 гуз Уаі Аїа А1їа Гей Гуз бі пув Уа1і Аїа Аїа Гей Гуз сі Гпуз Уаї 1 5 10 15
Аза Аїа їецп Ггув сіц пув Уаі Аїа А1ї1а Гей Ггув б1ц 20 25 «2105 103 «2115 28 «2125 РЕТ «213» Актітісіа1! бБедцепсе «2205 «223» штодітбіей Е-Сої1 «4005 103 сбіц Маі Аїа Аїа Сув сіц Ггув сіц Уаі Аїа Аїа гей бі гув біц Уаї 1 5 10 15 зо
Аза Аїа їец сіц гув сі Уаі Аїа Аїа ей сіц Гуз 20 25 «2105 104 «2115 28 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» штодітбіей К-Сої1 «4005 104 пув Маі Аїа Аїа Сузв Гув сіц пув Уаі Аза Аїа Гецш пув сій пуз Уаї 1 5 10 15
Аза Аїа їецп Ггув сіц пув Уаі Аїа А1ї1а Гей Ггув б1ц 20 25 «2105 105 «2115 46 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205
«223» АВО «4005 105 теп Аїа сіц Аїа пуз Маії Гец Аза Авп Агуд бі Гей Авр Гуз Тут щу 1 5 10 15 уаї бБет Авр Тут Тут Гпув Авп Гец І1е Авр Авп Аїа пуз бБет Аїа с1ц 20 25 30 сіу Ма1ї їув Аїа Гец Іїе Авр сіц І1е гей Азїа Аїа Гей Рго 35 40 45 «2105 106 «2115 46 «2125 РЕТ «213» Актітісіа1! бБедцепсе «2205 «223» деїтт АВО «4005 106 теп Аїа сі Аїа гуз Уаії ге Аза Авп Агд сіц Тец Авр Гуз Тут У 1 5 10 15
Зо уаї бБет Авр Тут Тут Гпув Авп Гец І1е Авр Авп Аїа пуз бБет Аїа с1ц 20 25 30 сі1у Маї Гуз Аїа їей І1їе Авр сбіцш Іїе Гец Аза Аза Гей Рго 35 40 45 «2105 107 «2115 46 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» деїтт АВО «4005 107 теп Аїа сі Аїа гуз Уаії ге Аза Авп Агд біц Тец Авр Гуз Тух щу 1 5 19 15 уаї бБет Авр Тут Тут Гпув Авп Аї1а Аїа Авп Авп Аїа пуз ТПт Уаї с1ц 20 25 30 сіу Ма1і їув Аїа їец Ії1е Аїа сіц І1е гей Азїа Аїа Гей Рго 35 40 45
«2105 108 «2115 46 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» деїтт АВО «4005 108 теп Аїа сі Аїа гуз Уаії ге Аза Авп Агд біц Тец Авр Гуз Тух щу 1 5 10 15 уаї бБет Авр Тут Тут пув Авп Гец І1е бек Авп Аїа пувз бет Уаї с1ц 20 сіу Ма1і їув Аїа їец Ії1е Аїа сіц І1е гей Азїа Аїа Гей Рго 25 «2105 109 «2115 10 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе
З0 0«2205 «223» Ніпде тіпКкег «4005 109 35 Авр Ппув ТПх Нів ТБПг Сув Ркго Рго Сув Рго 1 5 10 «2105 110 40 «2115 8 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 45 «223» ТІіпКег «4005 110
А1а Рго Бек бек бБетг Рго Меє сій 1 5 «2105 111 «2115 15 «2125 РЕТ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205
«223» Сув КтіпКег «4005 111 їец Сіц Рко Гув бек Аїа Авр Гув ТПк Нів ТПг Сув Ркго Рго Сув 1 5 10 15 «2105 112 «2115 13 «212» РЕ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» ТІіпКег «4005 112 сСіу б1у С1у Авр Гуз ТПтІ Нів ТБт Суз Рго Рго Сув Рго 1 5 10 «2105 113 «2115 16 «212» РЕ «213» Агтіті1сіа! бБедцепсе «2205 «223» ІіпКег зо «4005 113
Пец с1ц Ркго Пув бет бек Авр Гуз ТПк Нів ТПг Сув Рго Рго Сув Рго 1 5 10 15 «2105 114 «2115 15 «212» РЕ «2135 Ното зарієпв «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(15) «223» Ідб1і Ніпде «4005 114 сі Рко пув бек Сув Авр Кув ТПг Нів ТПг Сув Рго Рго Сув Рго 1 5 10 15 «2105 115 «2115 12 «212» РЕ «2135» Ното зарієпз
«221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(12) «223» Ідб2 Ніпде «4005 115 січ Агд Ггув Сув Сув Уаі сіц Сув Ркго Рго Сув Рго 1 5 10 «2105 116 «2115 12 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(12) «223» Ідб4 Ніпде «4005 116 біц бек пув Тук сіу Рко Рко Сув Ркго бек Сув Рго 1 5 10 зо «2105 117 «2115 12 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз
«2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(12) «223» Ідб4 Ніпде (5228Р)
«4005 117 біц бек пув Тук сіу Рко Рко Сув Рго Рго Сув Рго 1 5 10
«2105 118 «2115 107 «2125 РЕТ «2135 Ното варієпв «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225» (1)..(107) «2235 ІС Карра «4005 118
Атуд ТП Маі Аза Аїа Рко бет Уаі! РпПе І1ї1е Рбе Рго Рго бБет Авр б1ц 1 5 10 15 біп Гей Гув бБет с1у ТПтІ Аїа бБет Уаії Уаї Сув Гей Гей Авп Авп РІе 20 25 30
Тут Рго Акуд Сі АТїа Гуз Ма! сіп Тер гуз УМаі1ії Авр Авп А1а Іец СсІп 35 40 45 бек б1у Авп бек біп бі бек Уа1! ТПг бі сбіп Авр бек Гув Авр бек 50 55 бо
ТПт Тут бБет Ггец бет бек ТПх Ггецп ТПх Гей бет Гув Аїа Авр Тух с1ц 65 70 75 80 пуз Ніз пув Маї Тут Аїа Сув Ссіц Уаї ТрІ Нів СсСіп сб1у Гєц бег 5бег 85 Зо 95
Рхто Уа1і ТПї Кпув бек Рпе Ап Агуд о1у сії Сув 100 105 зо «2105 119 «2115 104 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(104) «2235 ІС 1І1ашюпраа «4005 119 біп Ргто Гув Аза Аїа Ркго бет Уаі1! ТПтї Гей Рібе Рго Рго бет бет б1ц 1 5 10 15 бі Гец біп Аза Авп Гув Аїа ТПт їец Уаї Сув Гей І1е бБегт Авр РІе 20 25 30
Тук Рко с1у Аї1а Уа1і ТПх Уа1ії Аза Тгр ув Аза Авр Бек бек Рко Уаї1 35 40 45 пув Аїа сіу Маї сіп ТПк ТБг Ркго бек пув с1іп бег Авп Авп Гуз Туг 50 55 бо
А1ї1а А1їа бБег бек Тут Гец бек Гей ТПтІ Рго б1ц Сіп Тер Гуз бек Нів 65 70 75 80
Атуд бек Тут Бек Сув сСіп Уа1 ТПтг Нів сіцш сС1у Бех ТПг Уа1! сі Гув 85 90 95
ТПк УМаі Аїа Рко ТПї бі Сув бек 100 «2105 120 «2115 198 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(98) «223» Ідб1і СНІ «4005 1270
А1а бБет ТПт Гув сіу Рко бек Уа1 Рпе Рго Гец Аїа Ркго бБет бБет Гуз 1 5 10 15 бек ТПкг бБехт сСі1іу с1у ТБх Аїа А1їа їец сС1у Сув їец Уа1! цув Авр Туг 20 25 30
Рпе Рго бі Рго Уаії ТПт Уаії бБет Ткгр Авп бет с1у Аїа Ге ТПкК бек 35 40 45 сіу Маї Ніз ТП Рібе Рго Аїа Уаї їєц Сіп бет бек С1у Гец Тук бег 50 55 бо теп бБет бБет Уаії Уаі1ії ТПг Уаі1і Рго бек бек бБет Гец с1у ТПк сіп ТЕПкК 65 70 75 80
Тут І1е Сув Авп Уа1! Авп Нів Кпуз Рго бБет Авп ТПт Гуз Уа1! Авр Гуз 85 Зо 95 пузв Уаї «2105 121 «2115 198 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз
«221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(98) «223» Ідб2 СНІ «4005 121
А1їа бБет ТПт Гув сіу Рко бБет Уаі РпПе Рго гейш Аза Рго Сув бБет Агд 1 5 19 15
Зек ТПтї бек бі бек ТПх Аїа Аїа Іїецй с1у Сув Ге Уаі1і Гуз Авр Тук 20 25 30
Рпе Рго бі Рго Уаі1 ТПх Уаі1і бек Ттр Авп бБет с1у Аїа Ге ТПкК бек 35 40 45 сіу Маї Ніз ТП Рібе Рго Аїа Уаї їєц Сіп бет бек С1у Гец Тук бег 50 55 бо
Тец бек бБетг Уаії Уаі1і ТП Уа1і Рго Бек б5Бет Авп Рпе сіу ТПг Сбіп ТПг 65 70 75 80
Тут Трпхї Сув Авп Уа1! Авр Нів Кпуз Рго бБет Авп ТПт Гуз Уа1! Авр Гуз зо 85 30 95
ТПг Уаї «2105 122 «2115 198 «2125 РЕТ «2135 Ното зарієпв «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(98) «223» Ідба СНІ «4005 122
Аза бек ТПк пув Сіу Рго бек Уаі1і Рпе Ркго гей Аза Рго Сув бБетг Агд 1 5 10 15
Зек ТПтї бек бі бек ТПх Аїа Аїа Іїецй с1у Сув Ге Уаі1і Гуз Авр Тук 20 25 30
Рпе Рго бі Рго Уаі1 ТПх Уаі1і бек Ттр Авп бБет с1у Аїа Ге ТПкК бек
35 40 45 сіу Маї Ніз ТП Рібе Рго Аїа Уаї їєц Сіп бет бек С1у Гец Тук 5бег 50 55 бо теп бБет бБет Уаі1ії Уаі1ї ТПї Уаі1і Рго бек бек бБет Гец с1у ТПк Гуз ТЕПкК 65 70 75 80
Тут Трпхї Сув Авп Уа1! Авр Нів Кпуз Рго бБет Авп ТПт Гуз Уа1ї! Авр Гуз 85 Зо 95
Атда Уаї «2105 123 «2115 217 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(217) «223» Ідб1 (АА)
Зо «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (217)..(217) «223» Хаа?217 і15 а 1увіпе (К) ог ів арвепе «4005 123
Аза Ргто біц Аза Аїа сіу сіу Рко бек Уаі1і Рпбе їец Рпе Рго Рго Гуз 1 5 10 15
Рко Гуз Авр ТПх Ге Меєс Іїе бБегт Агуд ТПтІ Рго сі Уаі1і ТПкх Сув Уаї 20 25 30
Ууаї уаї Авзр Уа1! Бек Нів бі Авр Рго біцш Уаї пув Рібе Авп Тгр Туг 35 40 45
Ууаї Авр с1у Уа1 сіц Уа1! Нів Авп А1ї1а Гув ТПг Гуз Рго Агд сіц Сс1ц 50 55 бо
Сіп Тут Авп бек ТПт Тут Агд Уаї Уа1ї бек Уаі1і! їєц ТПг Уаї Ієц Нівз 65 70 75 80 біп Авр Ттр Гей Авп о сіу Гпув сіц Тут пув Сув Кпув Уаї бБет Авп Гув
85 Зо 95
А1їа тей Рго Аїа Рго І1е сіц Гпув ТПї І1ї1е бБегт ув Аїа пув С1у сіп 1600 105 110
Рго Агд бі Рго біп Уа1! Тугк ТПт Ге Рго Рго Бех Агкд бі бій Меєс 115 120 125
ТПЕ гув Авп о біп Уаії бек Ггецп ТПкх Сув Гей Уаії пув с1у РПпе Тук Рго 130 135 140 зехт Авр Іїе Аїа Уа1і сбіш Ткр бі1ц Бех Авп б1у сіп Рго бій Авп Авп 145 150 155 160
Тут Гув ТПг ТПт Рго Рго Уаі Гей Авр 5ет Авр сіу бБет РПпе РпПе Гец 165 170 175
Тук бБет пув Гецп ТПт Уаії Авр пув бБет Агуд Тктр біп сіп с1у Авп Уаї1ї 180 185 190
Рпе бек Сув бБет Уа1ї Месє Ніз Сі Аїа їеец Нів Авп Нів Тут ТПг с1п 195 200 205
Зо
Кпузв бБет Ггец бет Гец бет Рго б1Уу Хаа 210 215 «2105 124 «2115 217 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(217) «223» ІдСсС1 Ес (АА/УТЕ) «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (217)..(217) «223» Хаа?217 185 а 1увіпе (К) ог із арзепе «4005 124
Аза Ргто біц Аза Аїа сіу сіу Рко бек Уаі1і Рпбе їец Рпе Рго Рго Гуз 1 5 19 15
Рко Гуз Авр ТПх Ггецп Тух Іїе ТПг Агуд бі Рго сі Уа1і ТПкх Суз Уаї
20 25 30
Ууаї уаї Авзр Уа1! Бек Нів бі Авр Рго біцш Уаї пув Рібе Авп Тгр Туг 35 40 45 уаї Авр с1у Уа1! сіц Уаї Нів Авп Аїа їув Трт Кгув Рго Агд сі б1ц 50 55 бо
Сіп Тут Авп бек ТПт Тут Агд Уаї Уа1ї бек Уаі1і! їєц ТПг Уаї Ієц Нівз 65 70 75 80 біп Авр Ттр Гей Авп о сіу Гпув сіц Тут пув Сув гув Уаї бБет Авп Гуз 85 Зо 95
А1а Пец Рго Аїа Рго І1ї1е СсС1іц Гув ТПг І1їе бек Гуз Аї1а туз С1у сіп 100 105 110
Рго Агд бі Рго біп Уа1! Тугк ТПт Гец Рго Ркго Бех Акд сі бій Меєс 115 120 125
ТПЕ гув Авп о біп Уаії бек Ггецп ТПкх Сув Гей Уаії пув с1у РПпе Тук Рго 130 135 140
Зо зехт Авр Іїе Аїа Уа1 сбіш Тгтр бій бБег Авп с1іу сіп Ркго б11 Авп Авп 145 150 155 160
Тук Ггув ТПжІ ТПтІ Ркго Рго Уаі Ггецп Авр Бех Авр с1у бБет РПпе РПе ГІеєец 165 170 175
Тут Бек Кпув Ггец ТПтї УМа1і Авр Гпув бБет Агу Тгр сіп біп с1у Авп Уаї! 180 185 190
Рпе бек Сув бБет Уа1ї Месє Ніз Сі Аїа їеец Нів Авп Нів Тут ТПг с1п 195 200 205
Кпузв бБет Ггец бет Гец бет Рго б1Уу Хаа 210 215 «2105 125 «2115 217 «2125 РЕТ «2135 Ното зарієпв «2205
«221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(217) «223» Ідба Ес (УТЕ) «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (217)..(217) «223» Хаа?217 і15 а 1увіпе (К) ог ів арвепе «4005 125
Аза Ргто сбіц Рпе Гец сіу сіу Рко бек Уаі1і Рпбе їец Рпе Рго Рго Гуз 1 5 10 15
Рко Гуз Авр ТПх Ггецп Тух Іїе ТПг Агуд бі Рго сі Уа1і ТПкх Суз Уаї 20 УуУаї Ма1 Авр Уа1! бек сіп сС1ц Авр Рго Сіц Уа! с1іп Рбе Авп Тер Туг уаї Авр с1у Уа1! сіц Уаї Нів Авп Аїа їув Трт Кгув Рго Агд сі б1ц 25 50 55 бо
Сіп Рбе Авзп бек ТПт Тут Агд Уаї Уа1ї бек Уаі1і! їєц ТПг Уаї Ієц Нівз 65 70 75 80
Зо біп Авр Ттр Гей Авп о сіу Гпув сіц Тут пув Сув гув Уаї бБет Авп Гуз 85 Зо 95 35 с1іу Гей Рго бБет бБет Іїе сіц пув ТПїІ І1е бБегт ув Аїа пув С1у сіп 100 105 110 40 Рго Агд Сі Ркго Сіп Уаї Туг ТПх Гей Ркго Рго бетхт Сіп сб1цш сіц Меєс 115 120 125
ТПЕ гув Авп о біп Уаії бек Ггецп ТПкх Сув Гей Уаії пув с1у РПпе Тук Рго 45 130 135 140 зехт Авр Іїе Аїа Уа1 сбіш Тгтр бій бБег Авп с1іу сіп Ркго б1й Авп Авп 145 150 155 160
Тук Ггув ТПжІ ТПтІ Ркго Рго Уаі Ггецп Авр Бех Авр с1у бБет РПпе РПе ГІеєец 165 170 175
Тук бБет Акд Гецп ТПї Уаі Авр пув бек Агд Ттр біп сі сб1у Авп Уаї1ї 180 185 190
Рпе бек Сув бБет Уа1ї Месє Ніз Сі Аїа їеец Нів Авп Нів Тут ТПг с1п 195 200 205
Кпузв бБет Гец бет Гец бет Гей С1Уу Хаа 210 215 «2105 126 «2115 217 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(217) «223» Кпор Ес дотаїп «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (217)..(217) «223» Хаа?217 і15 а 1увіпе (К) ог ів арвепе «4005 126
Аза Рго біц Аза Аїа сіу сіу Рго Бек Уаії Рпе Гец Рпе Ркго Ркго Гуз 1 5 10 15
Зо
Рко Гуз Авр ТПх Ге Меєс Іїе бБег Агуд ТПтІ Рго сі Уа1і ТПкх Суз Уаї 20 25 30
Ууаї уаї Авзр Уа! Бек Нів біц Азр Рго біц Уаї пув Рібе Азп Тгр Туг 35 40 45
Ууаї Авр с1у Уа1 сіц Уа1! Нів Авп А1ї1а їГув ТПг Гуз Рго Агд Сі Сс1ц 50 55 бо
Сіп Тут Авп бек ТПтІ Тугт Агд Уаї Уаї бек Уаі1і! їєц ТПг Уаї Ієц Нівз 65 70 75 80 біп Авр Ттр Гей Авп о сіу Гпув сіц Тут пув Сув гув Уаї бБет Авп Гуз 85 Зо 95
А1їа тей Рго Аїа Рго І1е сіц Гпув ТПї І1ї1е бБегт ув Аїа пув С1у сіп 100 105 110
Рго Агд бі Рго біп Уа1! Тугк ТПт Гец Рго Ркго Бех Акд сі бій Меєс 115 120 125
ТпЕ гув Авп о біп Уаії бек Ггецп Тгр Сув Гей Уаї Ппув с1у РПпе Тук Рго 130 135 140 зехт Авр Іїе Аїа Уа1 сбіш Тгтр бій бБег Авп с1іу сіп Ркго б1й Авп Авп 145 150 155 160
Тут Гув ТПг ТПт Рго Рго Уаі Гей Авр 5ет Авр сіу бБет РПпе РпПе Гец 165 170 175
Тук бБет пув Гецп ТПї Уа1і Авр пув бек Агд Тгтр біп сіп с1у Авп Уаї1ї 180 185 190
Рпе бек Сув бБет Уа1ї Месє Ніз Сі Аїа їеец Нів Авп Нів Тут ТПг с1п 195 200 205
Кпузв бБет Ггец бет Гец бет Рго б1Уу Хаа 210 215 «2105 177 «2115 217 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз
Зо «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(217) «223» Ноїе Ес «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (217)..(217) «223» Хаа217 ів а 1увіпе (К) ої ів арзепе «4005 177
Аза Ргто біц Аза Аїа сіу сіу Рко бек Уаі1і Рпбе їец Рпе Рго Рго Гуз 1 5 10 15
Рко Гуз Авр ТПх Ге Меєс Іїе бБег Агуд ТПтІ Рго сі Уа1і ТПкх Суз Уаї 20 25 30
Ууаї уаї Авзр Уа1! Бек Нів бі Авр Рго біцш Уаї пув Рібе Авп Тгр Туг 35 40 45 уаї Авр с1у Уа1! сіц Уаї Нів Авп Аїа їув Трт Кгув Рго Агд сі б1ц 50 55 бо
Сіп Тут Авп бек ТПт Тут Агд Уаї Уа1ї бек Уа1і! їєц ТПгт Уаї Ієц Нівз 65 70 75 80 біп Авр Ттр Гей Авп о сіу Гпув сіц Тут пув Сув гув Уаї бБет Авп Гуз 85 Зо 95
А1а пец Рго Аїа Рго І1ї1е СсС1іц Гув ТПг І1їе бек тув Аї1а тув СсС1у сіп 100 105 110
Рго Агд бі Рго біп Уа1! Тугк ТПт Гец Рго Ркго Бех Акд сі бій Меєс 115 120 125
ТпЕ гув Авп о біп Уаї бек Ггецп бек Сув Аїа Уаї Гпув с1у Робе Тук Рго 130 135 140 зехт Авр Іїе Аїа Уа1 сбіш Тгтр бій бБег Авп с1іу сіп Ркго б1й Авп Авп 145 150 155 160
Тук Ггув ТПжІ ТПтІ Ркго Рго Уаії Ггец Авр бБет Авр сіу бБет РПе Ріе Ієц 165 170 175
Уаї Бек пув їец ТПї Уа1 Авр Гув бехг Агд Тер сСіп сбіп сС1у Авп Уаї 180 185 190
Рпе бек Сув бБехт Уаї Меє Нів Сіш АТїа Гец Нів Авп Агд Тут ТПг с1п 195 200 205
Кпузв бБет Ггец бет Гец бет Рго б1Уу Хаа 210 215 «2105 128 «2115 217 «2125 РЕТ «2135 Ното зарієпв «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(217) «223» Ідб1і Ес цпіуегзаї1ї «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (4)..(5) «223» Хаа4(Х1) апа Хаа5(Х2) аге роБб І (жіїа4 Суре), ог аге роОїН А (дестеавед ЕСЕ ріпаіпд)
«2215 МІ5С РГЕАТОВЕ «2225 (22)..(26) «223» Хаа22(Х3), Хаа24(Х4), апа Хаа26(Х5) аге гевресвіуеїу М, 5 апа т (шжі1д буре), от У, Т апа Е (ехгепадаедй БПа157-11 є) «2205 «2215 МІ5С РГЕАТОВЕ «222» (136)..(138) «223» Хаа136(Х6), апа Хаа138(Х7) аге геврестіуеїу Т апа г о (мі14 Буре) ок М апа Ії (КпоБ), ог аге 5 апа А (Ппоїє) «2205 «2215 МІ5С РГЕАТОВЕ «2225 (177)..(177) «223» Хаа177(Х8) ів У (ші14 буре) мупйеп Хаа136(Х6) ів Т апа Хаа138(Х7) і8в8 1; Хаа177(Х8) ів У (Кпор) мпеп Хаа136(Х6) ів М апа Хаа138(Х7) і8в8 1; Хаа177 (Х8) 185 М (пПо1г) мпеп Хаа136(Х6) ів 5:апа
Хаа138(Х7) 18 А «2205 «2215 МІ5С РГЕАТОВЕ «222» (204)..(205) «223» Хаа204(Х9) апа Хаа205(Х10) гезврессіуе1їу аге М апа Н (мії14 Буре), ох аге М апа В (по ргогеіп А ріпдіпд), ог аге А апа К (по ргобеїп А ріпаіпд)
З0 «2205 «2215 МІ5С РГЕАТОВЕ «2225 (217)..(217) «223» Хаа217(Х11) і5 К ог ів арвепеі «4005 128
Аза Ргто сбіц Хаа Хаа сіу сіу Рко бек Уаі1і Рпе їец Рпе Рго Рго Гуз 1 5 10 15
Ркто Гуз Авр ТПїх Ггецп Хаа Іїе Хаа Акд Хаа Ркго Сі Уаі1і ТПкх Сувз Уаї 20 25 30
УуУаї Ма1 Авр Уа1 бек Нів с1ц Авр Рго Ссіцш Уа1! Гуз Рібе Авп Тгр Туг 35 40 45 уаї Авр с1у Уа1! сіц Уа1 Ні Азп Аїа Гуз ТПх Кгув Рго Агд Сі б1ц 5о0 50 55 бо
Сіп Тут Авп бек ТПт Тут Агд Уаї Уа1ї бек Уаі1і! їєц ТПг Уаї Ієц Нівз 65 70 75 80 біп Авр Ттр Гец Авп о сіу пузв сіц Тут пув Сув гув Уаї бБет Авп Гуз 85 90 95
А1їа тей Рго Аїа Рго І1е сіц Гпув ТПї І1ї1е бБегт ув Аїа пув С1у сіп 100 105 110
Рго Ак бі Рго біп Уа1! Тугк ТПт Гец Рго Ркго Бех Акд сі бій Меєс 115 120 125
ТпЕ гув Авп о біп Уаї бек Ггецп Хаа Сув Хаа Уаї пув с1у РПпе Тук Рго 130 135 140 ет Авр І1е Аїа Уаі1і сій Ткр біц бБег Авп с1у сіп Рго біц Авп Авп 145 150 155 160
Тук Ггув ТПжІ ТПтІ Ркго Рго Уаі Ггецп Авр Бех Авр с1у бБет РПпе РПе ГІеєец 165 170 175
Хаа бек пув Пец ТПт УМаії Авр Гув бБет Акд Ттр с1іп сі1іп с1у Авп Уаї 180 185 190
Рпе бек Сув бБет Уа1ї Месє Ніз Сі Аїа Іїеец Нів Хаа Хаа Тут ТПг с1іп 195 200 205
Зо
Кпузв бБет Ггец бет Гец бет Рго б1Уу Хаа 210 215 «2105 129 «2115 1270 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(120) «223» Т1АС-3 шВШАр А УНН «4005 129 сбіп Маі сбіп Гец сіп сіп Тктр с1іу Аїа сС1у Гей Гец пув Рго бБет с1ц 1 5 10 15
ТпПх Гец бБет Гецп ТПї Сув Азїа Уа1 Тук сіу с1і1у бБет РПе 5еїг Авр Тук 20 25 30
Тут Тер Авп Тгтр І1е Агу біп Рго Рго сбіу Ппув с1у Гей сі ТкЕр Ше 35 40 45 сСіу б1іц І1їе Авп Нів Авп СсС1у Авп ТІ Авзп бет Авп Рго бет Ієц Гуз 50 55 бо зек Агкд Уа1і ТПх Гпгец бБет Тец Авр ТПт бБет Гув Авп сбіп РоПе бБетг Гей 65 70 75 80 пув Гец Акуд бек Ма! ТПтІ Аїа А1їа Авр ТПІ А1їа Уаї! Тут Тук Сув А1а 85 Зо 95
Рпе сСі1у Тук Бек Авр Тухк бій Тут Авп Тгр Рпе Авр Рго Тгр сС1у сіп 1600 105 110 сіу ТПг Гей Маії ТПт Уаї бек 5бег 115 120 «2105 130 «2115 107 «2125 РЕТ «213» Мив штивсчійв «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ зо «2225» (1)..(107) «223» Т1АС-3 шШАБ А УТ, «4005 130 сі Іїе Маї Гецп ТПг біп бБехт Рго Аїа ТПт Гецй бек Гей Бех Рго Щ1Уу 1 5 10 15 січ Агуд Аза ТПт Гец бет Сув Акуд Аїа бек біп бет Іїе бБет бет Туг 20 25 30 теп Аїа Ткр Тут Сіп біп ув Рго бі1у біп Аза Рго Агд Гецп їецп І1е 35 40 45
Тут Авр Аїа бБет Авп Агд Аза ТПх сіу Іїе Рго Аї1а Акд Рпе бБех ШУ бо 50 бек біу бБек бі1у ТПх Авр Рпе ТПтї ТІецй ТПІ Іїе бБет Бек Гей с1ц Рго 65 70 75 80 55 бі Авр Рпе Аїа Уаї Тут Тут Сув сіп сіп Агуд Бек Авп Тгр Рго Іей 85 Зо 95
ТПЕ Рпе сіу сіп с1у ТПІ Авп Гей бі Іїе Гуз 1600 195 «2105 131 «2115 113 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(113) «223» РО-1 шАБ 1 УН «4005 131 сбіп Маі сбіп Гец Уаі сіц бехт сі1у сі1у с1у Уаї Уаії біп Рго с1у Акгд 1 5 19 15
Ззек Ггецп Агд Ггецп Авр Сув пув Аїа бек С1у Іїе ТПтї РПпе бек Авп бек 20 25 30 сСіу Месє Ніз Тер Уаї Агд СсСіп Аза Рго сС1у Гуз сС1у гц біц Тгр Уаї 35 40 45
Аїа мМмаї Іїе Тер Тут Авр сіу Бек Гпув Акд Тухк Тут Аїа Авр бек Уаї 50 зо бо туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПх Гецп Ріе 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гец Агд Аїа бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тук Сув 85 30 35
Аза ТПІ Авп о Авр Авр Тут Тктр с1у біп б1у ТБПт гец Уаі1і ТПт Уаї 5ег 1600 195 110 зекг «2105 132 «2115 107 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225» (1)..(107)
«223» РО-1 шАБ 1 УТ, «4005 132 сі Іїе Маї Гецп ТПг біп бБехт Рго Аїа ТПт Гецй бек Гей Бех Рго Щ1Уу 1 5 10 15 січ Агуд Аза ТПт Гец бек Сув Акуд Аїа бек біп бет Уаі1! бет бет Туг 20 25 30 теп Аїа Ткр Тут Сіп біп ув Рго бі1у біп Аза Рго Агд Гецп їецп І1е 35 40 45
Тут Авр Аїа бБет Авп Агд Аза ТПх сіу Іїе Рго Аїа Ат9д Рпе Бех щу 50 55 бо бек біу бБек бі1у ТПх Авр Рпе ТПтї ТІецй ТПІ Іїе бБет Бек Гей с1ц Рго 65 70 75 80 бі Авр Рпе Аїа Уаї Тут Тут Сув сіп сіп Бек бек Авп Тгр Рго Агд 85 Зо 95
ТПЕ Рпе сіу сіп с1у ТПжї Кпуз Уаі бі Іїе Гуз зо 1600 105 «2105 133 «2115 1270
З5 «2125 РЕ «2135 Мив шизси1ив8 «4005 133 40 сСіп Ма1 с1іп Пец Уа1 сі1іп бек с1у Уа1! с1іш Уаї Гуз Пув Рго С1у А1а 1 5 10 15
Ззек Уаії пуз Уа1ії бек Сув пув Аїа бек с1у Тут ТПтї Рпе ТПх Авп Тук 45 20 25 30
Тухк Меє Тут Тктр Уаі Агд біп Аза Рго сбіу сбіп с1у Гец сі Тгр Меєс сіу б1у Іїе Авп Рго бБегт Авп сіу сіу ТПтІ Авп Рпбе Авп о біц гув РІПе 50 55 бо
Туз Авп Акуд Уаї! ТПтї Гей ТБ ТБкК Авр о бет бет ТПІ ТПІ ТПг Аїа Тук 65 70 75 80
Меє біц Гецп Гпув бБет Гец сіп Рпе Авр Авр ТПІ Аїа Уа1! Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Ату Агуд Авр о Тут Акуд Ропе Авр Меє Сіу Рібе Авр Тут Тгр С1у сіп 100 105 110 сСі1у ТБкг Трт Уа1ї! ТртІ Уа1ї! бек 5бег 115 120 «2105 134 «2115 111 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8 «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(111) «223» РО-1 шАБ 2 УТ «4005 134 січ Іїе Маії Гецп ТПг сіп бет Ркго Аїа ТПїІ Гей бегт Ггец бет Рго 01Уу 1 5 10 15
Зо січ Агуд Аза ТПт Гец бет Сув Акуд Аїа бехт гув біу Уаії бет ТПЕ 5бег 20 25 30 сСі1іу Тук бек Тук теп Нів Тгр Ту сСіп сСіп Пув Рго С1у сСіп А1а Рго 35 40 45
Ат9д Гей Ге Іїе Тут Ггец Аїа бет Тут Гей біц бек біу Уаії Рго А1а 50 55 бо
Атуд Рпе бБет сіу бБет сіу бБет с1у ТПї Авр Робе ТПтІ їец ТПтІ Іїее 5ег 65 70 75 80 бек гец біц Рго Сі Авр Рбе Аїа Уаї Тут Тут Суз с1іп Нів бБетг Агд 85 Зо 95
Авр Гей Рго Гецп ТПтІ Рпе сіу сіу с1у ТПїІ Гпув Уаії біц Іїе Гуз 100 105 110 «2105 135 «2115 121 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8
«221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(121) «223» РО-1 шАБ 3 УН «4005 135 сСіп Ма1 с1іп Пец сСіп с1іп бек с1у Аїа Ссіш їецш Аїа їув Рго С1у А1а 1 5 10 15
Ззек Уаії біп Меєс бек Сув пув Аїа бек с1у Тут Бек РПпе ТПтх бек бек
Тгр І1е Нів Тгр Уа1ї гув бі1іп Агд Рго сбіу Сіп С1іу їец с1цп Тгр Ії1е 20 сіу Тут Іїе Тут Рго Бет ТПт сіу Рпе ТПт сі Тут Авп біп гув РІПе бо 25
Туз Авр Гпув Аїа ТПї Гей ТПх Аза Авр Гуз бБет бБет бБетї ТПг Аїа Тук 65 70 75 80 30 Мес сіп Гец бег бек Гецп ТПтї Бек сій Авр бек Аїа Уаії Тут Тук Сув 85 Зо 95
А1ї1а Агуд Тгтр Агуд Авр о бет бег сіу Тут Нів Аїа Мес Авр Тух Тгтр 01У 35 1600 105 110 сбіп с1у ТПт бБет УМаі! ТПт Уаї бек 5бег 115 120 40 «2105 136 «2115 111 «2125 РЕТ 45 «213» Мив штивсчійв «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ 50 «2225 (1)..(111) «223» РО-1 шАБ 3 ХУ, «4005 136 55 Авр І1е Уаї Іїец ТБПт Сіп бек Рго Аїа бет Іецп ТПтІ Уаії Бех Іец СЩ1Уу 1 5 10 15 біп Агуд Аза ТПтІ Іїе бБет Сув Акуд Аїа бек біп бет Уаі бет ТПЕ 5бег 20 25 30 сі1іу Тук бек Тук Меє Нів Тгр Тухг сСіп сіп Пув Рго С1у Сіп Рго Рго 35 40 45
Туз Гецп Гец І1е пуз Ріпе Сіу бек Авп Гей біц бБет с1у Іїе Рго Аїа 50 зо бо
Ат РобПе бехг Сіу бБегт С1іу бек біу ТПІ Авзр Роре ТПг Ієц Авп І1е Нівз 65 70 75 80
Рго Уа1і! сб1іц сіц Сі Авр ТІ АТа Тіт Тут Тут Суз с1іп Нів бет Тгр 85 90 95 січ Іїе Рго Тут ТПт Рпе сіу сіу с1і1у ТПжї Гуз гей біц Іїе Гуз 100 105 110 «2105 137 «2115 117 «2125 РЕТ «2135 Мив шизси1ив8
Зо «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(117) «223» РО-1 шАБ 4 УН «4005 137 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бет сіу бБехт бі гей гувз пув Рго С1у А1а 1 5 10 15
Ззек Уаії пузв Іїе бек Сув пув Аїа бек с1у Тут ТПтї Рпе ТПх Авп Тук 20 25 30 сіу Месє Авп Ттр Уаі Агд сіп Аїа Рго сСі1у біп сС1у їец біп Тгр Меє 35 40 45 с1у Тгр Іїе Авп ТПг Авр бБет сіу сі бек ТПтІ Тут Аї1а біцш бій РПе 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе Уаі Рібе бек Ггецп Авр ТПт бБет Уаі Авп ТПг Аїа Тук 65 70 75 80 теп сіп І1е ТПт бет Гей ТПхї Аза бі Авр ТПт сіу Меє Тут РПе Сувг
85 Зо 95 уаї Атуд Уаї сіу Тут Авр Аїа Гей Авр Тут Тгр Сі1у біп сбіу ТПтг Іец 1600 195 110
Ууа1ї1 ТрпЕ Уаі1ї бек 5бБег 115 «2105 138 «2115 106 «2125 РЕТ «213» Мив штивсчійв «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(106) «223» РО-1 шАБ 4 У, «4005 138 сі Іїе Маї Гецп ТПг біп бБет Рго Бек бБег Гей бек Аїа Бек Уаі щу 1 5 10 15
Авр Атуд Маї ТПтІ Іїе ТПт Сув бБет А1їа Агд бет бет Уаі1і бБет Тут Меє зо 20 25 30
Ніз Тер Рбе сіп сіп пув Рго сС1у Пув Аїа Рго Гуз їец Тгр І1е Туг 35
Атуд ТПт бБегт Авп Гец Аїа бет сСіу Уаі1і Рго бБет Агд Рпе бет С1уУу 5бБег бо 40 сіу бек б1у ТПт бБет Тут Сув Гецп ТПїІ І1е Авп бег їец біп Рго с1ц 65 70 75 80 45 Авр Рпе Аїа ТПІ Тут Тут Сув біп сіп Акд бек бек Рпе Рго Гец ТІПг 85 Зо 95
Рпе сі1у біу б1у ТПК пув їецй бій І1їе Гуз 50 1600 105 «2105 139 «2115 330 55 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз
«221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (1)..(330) «223» Ідб1і епсіге сопвтапс гедіоп (АА) «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (330)..(330) «223» ХааЗ330 185 а 1увіпе (К) ог ів арвепе «4005 139
А1а бБет ТПт Гпув сіу Рко бБет Уаі Рібе Рго гец Аїа Рко бБет бет Гуз 1 5 10 15 бек ТПтї бек біу бі1у ТПх Аїа Аїа Іїецй с1у Сув Ге Уаі1і Гуз Авр Тук 20
Рпе Рго бі Рго Уаі1 ТПх Уаі1і бек Ттр Авзп бет сС1у Аїа Ге Тік бек 25 сі1іу Ма1 Нів ТБг Рре Рго А1ї1а Уа1! ІТец Сіп бек бБехт С1у їец Тут 5Бег бо теп бБет бБет Уаі1ії Уаі1ії ТПїх Уаі1і Рго бБет бБет бет Гец с1у ТПк сіп Тк 30 65 70 75 80
Тут І1е Сув Авп Уа1! Авп Нів Кпуз Рго бБет Авп ТПт Гуз Уа1! Авр Гуз 85 Зо 95 35
Атд уаї сі Рго Пув бек Сув Авр Гув ТПт Нівз ТПкг Сув Рго Рго Сув 100 105 110 40
Рго Аї1а Рго бі Аїа Аза сіу сіу Рго бБет Уаі1і! РПпе Гец Рпе Рго Рго 115 120 125 45 Кпув Ркго пув Авр ТПтІ Пец Мес І1їе бБег Аку ТПт Рго сбіц Уаі ТПкг Сув 130 135 140
Ууаї уаї Уаї Авр уа1ї бек Нів сіцш Азр Рго сіц Уаії Пуз Рібе Азп Тгр 50 145 150 155 160
Тук Уаї Авр сіу Уа1ї сіц Ууаї Ніз Авп Аза Гпув ТПт Тув Рго Агд с1ц 165 170 175 55 січ біп Тут Авп о бБет ТПтІ Тут Акуд Уаі Уаії бБет Уаії Ггец ТПт Уаї ГІец 180 185 190
Ніз с1іп Авр Тгр Гїец Авп с1іу пузв бі Тут Кпув Сув Тув Уа1ї бБет Авп 195 200 205
Туз Аїа теп Рго Аїа Рго Іїе бі пув ТПт Іїе бБет ув Аїа Гуз щУ 210 215 220 біп Рго Атуд бі Рго сіп Уа! Тут ТПтї Гей Рго Рго бБет Агкд сбіц с1ц 225 230 235 240
Меєс Тпї Гпув Авп о бСіп Уаії бек Гей ТПг Сув Гей Уа1ї Ггув с1у РПпе Туг 245 250 255
Рго Бек Авр Іїе Аїа Уа1і бій Тер сбіц 5Бег Авп с1у с1іп Рго бій Авп 260 265 270
АвпоТут Гув ТПт ТПт Рко Рко Уаії Гей Авр бет Авр біу бБет РпПпе РПе 275 280 285
Те Тут бБет пув Гей ТПїх Уа1і Авр пувз бБегхт Агуд Тгтр сбіп сіп с1у Авп 290 295 300
Зо
Ууа1ї Рре бек Сув Бек Уа1ї Месє Ніз СсС1п АТа ІТец Нів Авп Нів Туг ТЕПг 305 310 315 320
Сіп пПув Бек Гец бБег Гец бБет Рго с1Уу Хаа 325 330 «2105 140 «2115 327 «2125 РЕТ «2135» Ното зарієпз «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «2225 (1)..(327) «223» Ідб4 епсіге сопвтапс гедіоп (Р) «2205 «221» МІБ5БС ЕБАТОКЕ «222» (327)..(327) «223» Хаа327 і855 а 1увіпе (К) ог ів арвепе «4005 140
А1їа бБет ТПт Гув сіу Рко бБет Уаі РпПе Рго гейш Аза Рго Сув бБет Агд 1 5 10 15
Зек ТПтї бек бі бет ТПтІ Аїа Аїа їец с1у Сув Гецп Уа1ї Гуз Авр Тук 20 25 30
Рпе Рго бі Рго Уаі1 ТПх Уаі1і бек Ттр Авп бБет с1у Аїа Ге ТПкК бек 35 40 45 сіу Маї Нів ТіПк Рібе Рго Аїа Уаї їєц Сіп бет бек С1у Гец Тук бег 50 55 бо
Тец бек бБетг Уаії Уаі1і ТП Уа1! Рго Бек бБет бБет Гей сіу ТПїг Кпуз ТІПг 65 70 75 80
Тут Трпхї Сув Авп Уа1! Авр Нів Кпуз Рго бБет Авп ТПт Гуз Уа1! Авр Гуз 85 30 95
Атуд уаї бі бек пув Тут сіу Рко Рго Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Ркго 100 105 110 біц Рпе Гей с1у с1у Рго Бек МУМаі! РпПе Гецп РпПе Рго Рго Гув Рго Гув 115 120 125
Зо
Авр ТПІ Гец Меє Іїе бБет Акуд ТПтІ Рго бі Уаії ТПт Сув Уаї Уаї Уаї 130 135 140
Авр уаії Бек сіп біц Авр Рго бі Уа! сСіп Рпе Авп Тгр Тут Уаї Авр 145 150 155 160 сіу Ммаї сіц Уаї Нів Авп Аїа Пув ТртІ Кпув Рго Агд Сі б1іц с1п РБе 165 170 175
Авп о бБет ТПтї Тут Агуд Уа1ї Уа1! Бех Уаї їецш Трх Уаї їец Нів Ссіп Авр 180 185 190
ТЕр гец Авп с1у пузв бі Тук гув Сув пПув Уаії бБет Авп Гуз с1УуУ Гец 195 200 205
Рхко бБет бек Іїе бі пув ТПх Іїе бБег Гув Аїа ув с1у сіп Рго Агд 210 215 220
Сі Рго сіп Уа1ї! Тук ТПтї Кгецп Рго Рго бек біп сі Сі Меє ТБПк Гуз 225 230 235 240
Авп о біп Уаії бБет Гец ТПт Сув Гец Уа1і гуз біу Рпе Тут Рго бБетї Авр 245 250 255
Іїе Аїа Уа1ї Сіц Тгр біц бек Авп сіу біп Рго бій Авп Авп Тут Гуз 260 265 270
ТПЕ ТПт Рко Рко Уаії Гей Авр бек Авр сіу бБет РПе РпПе Ге Тук бек 275 280 285
Атд Гей ТПт Уаі Авр ув бБет Агкд Тгр біп біц б1іу Авп Уаі РпПе 5ег 290 295 300
Суз бек Уаї Месє Ніз Сі Аїа їеец Нів Авп Нів Тут ТПтІ с1іп Ппув бег 305 310 315 320 теп бБет Ггец бет Гей С1Уу Хаа

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Зв'язуюча ГАС-3 молекула, яка здатна зв'язуватися як з ГАС-3 людини, так і з ГАО-3 яванської макаки, причому зазначена зв'язуюча (ГАС-3 молекула містить варіабельний домен важкого ланцюга та варіабельний домен легкого ланцюга, причому: зазначений варіабельний домен важкого ланцюга містить домен СОКНІ, домен СОКНІ2 та домен СОКНУЗ, і зазначений варіабельний домен легкого ланцюга містить домен СОБІ, домен СОКІ2 та домен СОКІ 3, причому: (А) (1) домен СОКНІ, домен СОКН2 та домен СОКНЗ являють собою СОК важкого ланцюга з І АС-3 тАБ 6 МНІ і відповідно мають амінокислотні послідовності: 5ЗЕО 10 МО:71, 5ЕО ІЮ МО:72 та 5ЕО ІО МО:73; і (2) домен СОКІ1, домен СОКІ2 та домен СОКІ З являють собою СО легкого ланцюга з І Ас-3 тА 6 і відповідно мають амінокислотні послідовності: 5ЕО 10 МО:76, 5ЕО І МО:77 і 5ЕО ІЮ МО:78; або (В) (1) домен СОКНІ, домен СОКН?2 та домен СОКНЗ являють собою СОК важкого ланцюга з І дДа-3 тА 6 і відповідно мають амінокислотні послідовності: 5ЕО ІЮ МО:71, ЗЕО ІО МО:72 та ЗЕО І МО:73; і (2) домен СОКІ1, домен СОКІ2 та домен СОКІ З являють собою СО. легкого ланцюга з ПІ АС- З тАБ 6 і відповідно мають амінокислотні послідовності: 5ЕО ІЮ МО:87, 5ЕО ІЮ МО:77 і 5ЕО І МО:78.
2. Зв'язуюча І АО-3 молекула за п. 1, причому: (1) домен СОКНІ, домен СОКНАІО та домен СОКНЗ являють собою СОК важкого ланцюга з | Ас- З тА 6 і відповідно містять амінокислотні послідовності: ФЕО ІЮ МО:71, 5ЕО ІЮ МО:72 та 5ЕО ІО МО:73; і (2) домен СОКІ1, домен СОКІ2 та домен СОКІ З являють собою СО легкого ланцюга з І Ас-3 тА 6 і відповідно містять амінокислотні послідовності: 5З2Е0 10 МО:76, 5ЕО ІЮ МО:77 і 5ЕО І МО:78.
3. Зв'язуюча І АО-3 молекула за п. 1, причому: (1) домен СОКНІ, домен СОКН2 та домен СОКНЗ являють собою СОК важкого ланцюга з НІ АО-3 тА 6 і відповідно містять амінокислотні послідовності: 5ЕО 10 МО:71, ЗЕО ІЮО МО:72 та ЗЕО І МО:73; і (2) домен СОКІ1, домен СОКІ2 та домен СОКІ З являють собою СО. легкого ланцюга з ПІ АС- З тА 6 і відповідно містять амінокислотні послідовності: 52ЕО 10 МО:87, 5ЕО І МО:77 і 5ЕО 10 МО:78.
4. Зв'язуюча І АО-3 молекула за будь-яким з пп. 1-3, причому зазначена молекула являє собою антитіло.
5. Зв'язуюча ГАС-3 молекула за п. 4, причому зазначена молекула являє собою химерне антитіло або гуманізоване антитіло.
6. Зв'язуюча ГАС-3 молекула за будь-яким з пп. 1-3 або п. 5, причому зазначена молекула містить варіабельний домен важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЕС І МО:79.
7. Зв'язуюча І АО-3 молекула за будь-яким з пп. 1-3 або пп. 5-6, причому зазначена молекула містить варіабельний домен легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ЕО І МО:83 або 5ЕО ІЮО МО:85.
8. Зв'язуюча І АО-3 молекула за п. 6 або п. 7, причому зазначений варіабельний домен важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:79, а зазначений варіабельний домен легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:83.
9. Зв'язуюча І АС-3 молекула за будь-яким з пп. 1-8, причому зазначена молекула являє собою біспецифічну зв'язуючу молекулу, що здатна одночасно зв'язуватися з |! А(Сі-3 людини та з другим епітопом.
10. Зв'язуюча І АС-3 молекула за п. 9, причому зазначений другий епітоп являє собою епітоп молекули, що бере участь у регуляції імунної контрольної точки, що присутня на поверхні імунної клітини.
11. Зв'язуюча ІГАС-3 молекула за п. 9, причому зазначений другий епітоп являє собою епітоп В7-НЗ, В7-Н4, ВТ А, Сб040, б0401, 0047, 2070, СО80, С0р86, 0094, С0137, С01371, СО226, СТІ А-4, галектину-9, СІТА, СІТАГ, ННІ А2, ІСОБ5, ІСОБІ,, КІВ, І АС-3, ІП ІСНТ, МН І або ІІ класу, Мкага, МКага, ОхХ40, ОХ40І, РОН, РО-1, РО-І 1, РО-І2, РМЕА, 5ІВРа, ТОВ, ТІСІТ, ТІМ-3 або МІ5ТА.
12. Зв'язуюча | АС-3 молекула за п. 11, причому зазначений другий епітоп являє собою епітоп РО-1.
13. Зв'язуюча ГАС-3 молекула за будь-яким з пп. 9-12, причому зазначена молекула являє собою: (а) діатіло, причому зазначене діатіло являє собою ковалентно зв'язаний комплекс, який містить дві або три, або чотири різних поліпептидних ланцюги; або (р) тривалентну зв'язуючу молекулу, причому зазначена тривалентна зв'язуюча молекула являє собою ковалентно зв'язаний комплекс, який містить три, чотири або п'ять поліпептидних ланцюгів.
14. Зв'язуюча (| АО-3 молекула за п. 13, причому зазначена молекула містить Ес-ділянку.
15. Зв'язуюча | АС-3 молекула за будь-яким з пп. 2-8 або п. 14, причому зазначена Ес-ділянка являє собою варіантну Ес-ділянку, яка містить: (а) одну або декілька амінокислотних модифікацій, які зменшують афінність зазначеної варіантної Ес-ділянки у відношенні Есуг; і/або (5) одну або декілька амінокислотних модифікацій, які збільшують період напівжиття у сироватці зазначеної варіантної Ес-ділянки.
16. Зв'язуюча (| АО-3 молекула за п. 15, причому: (а) зазначені модифікації, які зменшують афінність варіантної Ес-ділянки у відношенні Есук, містять заміни: (1)1234А, 1235А або (2) І234А та І 235А; і (5) зазначені модифікації, які збільшують період напівжиття у сироватці варіантної Ес-ділянки, містять заміни: (1) М252У, М252У і 52547; (2) М252У і Т256Е; (3) М252У, 52541 і Т256Е; або (4) К2880 і НАЗБК, причому зазначена нумерація відповідає ЄЮ системі нумерації за Кабаї.
17. Фармацевтична композиція, що містить зв'язуючу ГАС-3 молекулу за будь-яким з пп. 1-16 і фармацевтично прийнятний носій.
18. Зв'язуюча ГАС-3 молекула за будь-яким з пп. 1-16, причому зазначена молекула застосовується для стимуляції Т-клітинної імунної відповіді у суб'єкта, що потребує того.
19. Зв'язуюча ГАС-3 молекула за будь-яким з пп. 1-16, причому зазначена молекула застосовується при лікуванні захворювання або стану, що асоційований з пригніченою імунною (610) системою.
20. Зв'язуюча І АС-3 молекула за п. 19, причому захворювання або стан являє собою злоякісну пухлину або інфекцію.
21. Зв'язуюча І АС-3 молекула за п. 20, причому захворювання або стан являє собою злоякісну пухлину, яка характеризується присутністю клітини злоякісної пухлини, що вибрана з групи, що складається з клітини: пухлини надниркової залози, злоякісної пухлини, що асоційована зі СНІДом, альвеолярної саркоми м'яких тканин, астроцитарної пухлини, злоякісної пухлини сечового міхура, злоякісної пухлини кісток, злоякісної пухлини головного та спинного мозку, метастатичної пухлини головного мозку, злоякісної пухлини молочної залози, пухлин каротидного тільця, цервікальної злоякісної пухлини, хондросаркоми, хордоми, хромофобної нирково-клітинної карциноми, світло-клітинної карциноми, злоякісної пухлини товстої кишки, колоректальної злоякісної пухлини, шкірної доброякісної фіброзної гістіоцитоми, десмопластичної дрібнокруглоклітинної пухлини, епендімоми, пухлини Юінга, позаскелетної слизоподібної хондросаркоми, недосконалого кісткового фіброгенеза, фіброзної дисплазії кістки, злоякісної пухлини жовчного міхура або жовчовивідних шляхів, злоякісної пухлини шлунково-кишкового тракту, гестаційної трофобластичної хвороби, ембріонально-клітинної пухлини, злоякісної пухлини голови та шиї, гепатоклітинної карциноми, пухлини острівців підшлункової залози, саркоми Капоші, злоякісної пухлини нирки, лейкозу, ліпоми/доброякісної ліпоматозної пухлини, ліпосаркоми/злоякісної ліпоматозної пухлини, злоякісної пухлини печінки, лімфоми, злоякісної пухлини легені, гранулобластоми, меланоми, менінгіоми, множинних ендокринних неоплазій, множинної мієломи, мієлодиспластичного синдрому, нейробластоми, нейроендокринних пухлин, злоякісної пухлини яєчника, злоякісної пухлини підшлункової залози, папілярної карциноми щитовидної залози, пухлини паращитовидних залоз, дитячої злоякісної пухлини, пухлини оболонки периферичного нерва, феохромоцитоми, пухлини гіпофіза, злоякісної пухлини передміхурової залози, увеальної меланоми заднього відділу ока, рідкісного порушення з боку кровотворної системи, ниркової метастатичної злоякісної пухлини, рабдоідної пухлини, рабдоміосаркоми, саркоми, злоякісної пухлини шкіри, саркоми м'яких тканин, плоскоклітинної злоякісної пухлини, злоякісної пухлини шлунка, синовіальної саркоми, злоякісної пухлини яєчка, тимусної карциноми, тимоми, метастатичної злоякісної пухлини щитовидної залози та злоякісної пухлини матки.
22. Зв'язуюча І АС-3 молекула за п. 20, причому зазначене захворювання або стан являє собою колоректальну злоякісну пухлину, гепатоклітинну карциному, гліому, злоякісну пухлину нирки, злоякісну пухлину молочної залози, множинну мієлому, злоякісну пухлину сечового міхура, нейробластому, саркому, неходжкінську лімфому, недрібноклітинну злоякісну пухлину легені, злоякісну пухлину яєчника, злоякісну пухлину підшлункової залози, злоякісну пухлину прямої кишки, гострий мієлоїдний лейкоз (АМІ), хронічний мієлогенний лейкоз (СМІ), гострий В- лімфобласний лейкоз (В-АЇЇ), хронічний лімфоцитарний лейкоз (СІ), волосатоклітинний лейкоз (НСІ), новоутворення з баластних плазмоцитоїдних дендритних клітин (ВРОСМ), неходжкінські лімфоми (МНІ), включаючи мантійноклітинну лімфому (МС) і дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому (5/3, ходжкінськоу лімфому, системний мастоцитоз або лімфому Беркітта.
23. Зв'язуюча І АС-3 молекула за будь-яким з пп. 1-16, причому зазначена молекула позначена міткою, що детектується, та застосовується у детекції ГАс-3.
МН, ЩО К-спіраль | ме (або Е-спіраль) "ШУ ц Поліпептидний ланцюг 1 00 сон «М с Зоо птніннтноя сивою Лінкер 2 мч Лінкер 1 ТАТІ нер еВ», й Попіпептидний ланцюг 2 0 сон ЗИ нн с пе Шин; ж К-спіраль ре і (або Е-спіраль) й М с : Мн, зібране діатіло МН, м ре чив соон «ДІДИ ення ше ьс сон АК чий ну но ря Я Мн, У
Фіг. 1
, . МН. Поліпептидний ланцюг 1 ! Щі печу ; сон «ЧАШІ ЧО нс УН тати снз сно Лінкер 2 М Лінкер З снЗ о нер и ОО по «оон «ПТ сш Вк Шен сни у Шк ки Ше ЩІ х Я й весні дит і ; дже Поліпептидний ланцюг 2 рай а сс Же У Мн, Зібране діатіло МН, м рев мн сн сні с - Зо соон «ІПн вт ут «тех соон ПИЙ Й, ун шк сні сні ши -К-- МН, Щи
ФІГ. 2
МН,
шен. М: В Мо. ! НЕННЯ ВЕН» у си шо скаОоН й Мне ' Га зе ноут І піні Ск с СКеекнпддтпитеднистя ве УНІ с УНІ у. ! | мн. м сон тн Ше" Ек С ак С лак
Мн. шен М с 2 Уна Ша СОН єп ето, лшстшяй ке бен возі УНІ УМ м Мн, ; мн, ми КТ сон НЯ дн як чо г МН ання ОХ слдан кв той сні й: й рр чеке. НИ яз Мао Ма ав Нв» ьо «ВИНІ : Фон се ДМ сс а е Ж сно ун ся с МН, Й УЗ МО 0 УНІ мб М
Фіг. ЗА
Домен, що сприяє й . . утворенню гетеродимера ун Поліпептидні ланцюги 214 ГАТАТАТАЧАИХ -, ОХ ом юн хи що. Лінкер Лінкар із необов'язковим й цистегновим залишком сет чн ОО ехо ченні УМ тові зап Мн Домен, що сприяє "ККе» Цистаїнові запишки з утворенню гетеродимера о п й інке ут еечетуттут " он Ви мн СОН сну Лінкер із необов'язковим ЕЙ дик й цистаїновим залишком «Шо» «ПІ о Поліпептидні ланцюги Лі З рй р ит тн нттнрнтнтнтннншшшеч Й Мн, запазолЛінкер фр . пед мивеМ в зе Чон «Ме ники ча, Біспецифічне ше Ше -- чотирьохвалентне Ро-діатіло т си най Соон Ме з'яв Є ян ун
Цих. ерйййня ЯВДуррнстк вним й Я ? Це кий ха ДПІ Я «г Ме о Мн, соон е йо Ес-домен х рома інн сестеціх; чі МАЕ. ра НІ «5 сосн «ДО ее в Мн,
Фіг. ЗВ у ж аку р о їз су ва «є 54 «Мм3 птн що Кн, ПОН НЕАНІе ХВ ПН чи сон Її. спі й Нонна й че и зн, Б, ї во а ТУ У, я - Мн, и : м де | ТОК х У НН, ші 5 ред що КО, ше. ою пт я ЯН мя Ше Шин, ЧК пах дет ва «а к- - МН, МК мк ! Мо ЙО І ММ г Ям ее я кн, с сна м ше сю воно у сн але ТЕТ і 3 ї Опель ох з - шеф Кт сні с й Ве вв, ші: це мед» ме нн жк дою до со дей Я СХ "те МА вро. щу УНА КЕ ре й мн, . св сови ДР ТТ» й КОН «кН бер є ас а. ще що що Ще 2 Фо Є С вк х АНІ я Ще
Фіг. ЗС
Поліпептидний ланцюг 1 мн, ве сою і від, «Це щ і снз К-спіраль що ее "Ух сю (або Е-спіраль) да Я і. «НН ВНЕННеиея А С ло її з АДАДЕ З УХкОХМОКККХ УН як я Й / дини Нінкер З або Лінкер 2. нн спейсерний лінкер З - Пінкер З лептидний лящ. Поліпептидний ланцюг 2 ссон «АДИД Є В ж . |: . "г й К-спіраль Лінкер2 й ши (або Е-спіраль) А що й й Ем МН, СНІ Поліпептидний ланцюг З екв ОО вс ! 4 Фон Ши ор я Лінкер З сно тв Сов ств мн, Зібране Ео-діатіло (версія 1
Т. й : мі кон ре ш-УН ща сна ; З - ху ОО сан сон ЛО сення ВВ», обо и сн сне ДЛ Є -тешт пс со тиви -- - ле рих соя ВО Сех Сех мн. ре Ши см мн.
Фіг. 4ДА
Лінкер З сна че ст с ШО» се Уа Лінкер 4 ! ' би невннм й я К-спіраль оз Й (або Е-спіраль) «Шу. Попіпептидний ланцюг 1 дак» | в Пінкер2 зажим й Лінкер 1 дали с - ТЯ сою -АЙДДІ с ше. Й 7 Поліпептидний ланцюг 2 К-спіраль 00 Лінкер2 ун ой (або Е-спіраль) ря В й п це пе У Мн, Лінкер З І Поліпептидний ланцюг З Шо о м чий панцюг З ре спрдлдтеюют СОН сна Мн, екасегв сетдтнех сна зібране Ро-діатіло (версія 2) МН, че ств с с ет нн скнртуюе СПОН сна рез Щ кал: дет Ж ско -ЯДАД с т ши ПЕ, ше ет, МН,
Фіг. 48 й м, Поліпептидний ланцюг 2 соов -о нт З най . ш 7 Чі ть «ММ МІ Поліпептидний ланцюг 1 ЦІ Ії пе а Шиян о т і Пий о СНУ ПОСН тт з. Поліпептидний ланцюг 5 що шт мі я: МВ" Пеня . -ш нн СМ, с Моль ЕН Поліпептидний ланцюг З 27 -т К-спіраль с і (або Е-спіраль) я сс соон в: УНІ ех пкженанесестцку Мн, . о й оди Чеететннкчя- ІДДДД. СОН І Поліпептидний дн з панцюг 4 ше з БО спіраль) у, і і і «яз ; Ме, - 8 Ме. я КУ и М с окт ай м, сення порок о, соон ПТН соте ДУ сн оон Де Й що ую МО ДНО ТТ ПО ун сні СНІ вх СНІ й дн где сонету нити я нкттання - ДА срон хь щ кр ун МДЕ поси КБ ве ді хН3 ех о. ща МИ. Я бе чні, З -ч б ун. ММ,
Фіг. 5 чн, КІ сон Перший поліпептидний ланцюг ; дна дал УНІ чаї ск сна ДА - ; «У «НН НН». у пн с» МИ се ЕНН, сиз Другий поліпептидний ланцюг оси Що І М Шарнір ее. Третій полІПЕПТИДНИЙ ЛАНЦЮГ оба нене че Мою зе че сю а. ще. й ча поліпептидний ланцюг за типом діатіла МЕЧ тк СайтА р» ши мч Ес зо АДДАДА-. мн т, ло нин ев НИМИ АН сени я сраки ПО ПнНс Ше / дюн о ст Коасй Я ; сн) СЕС во оця Кк ,/ бант В А пе Й / союн І бе Ще у за типом діатіна Ше пеня ча Ше М ММ,
Фіг. бА
Лінкер 4 ЧЕ, ШИ ес ПП рн ся кн, - К-спіраль сна Яінкер З ся ! «С (або Е-спіраль!) Лінкер 1 ща - ЛАД сон Лінкер 2 МнІ Перший поліпептидний ланцюг АК енх й лі Хетете МЛМ сосх інкер 1 і У о ДЛінкер2 Есяі сн -спіраль : в (або К-спіраль) се Ме дк і Ід гу оо мк хе дух. де еесв Ксвсснх Ше ах - : А бно неви Шо селу Другий поліпептидний ши: ЩІ ше панцюг Третій поліпептидний ланцюг Шарнір Зв сн ее цу ча ПІК КтЕМ кл к Ше т у Як ю ВМ шо чн нос їн. дон с з і а нт поліпептидний ланцюг , Два зв'язуючих домена за типом діатіла сннренни 0ОСНЗ
КК. сСайтА ОК не й НІ ра я ми совно ; ЕНН», саю МН, ий пн СМ шарів дея, Сайт С Уже | САДКА ра пе З Ос у ПМ есоон бсюн о с ей. мі3 Я сн і ді Оу. я сом, | ні рен, Сайт В тра Зв'язуючий домен не за типом діатіла
Фіг. 68
Два зв'язуючих домена за типом діатіла Мн, о діІбайт А ке вв: Й пла ОКХ Мк о Ом сосн сні соон -АДДААД вес з Ши ЛИН ІДД г Уно ко; Щі п т, пе /Йї АДМ небу борні «ап ИИВІНИННН:» я дб нт вай ВИ Ге і Ме с Ї тон сна мк: Щи ба Ж, А «ЩШарнртчу ст. СОН, й мн, сні кеВ ча. ИЙ Зв'язуючий домен не Ше затипомодіатіла.Ї (7 ча У у
Фіг. 8С Два зв'язуючих домена за тмпом діатіпа МН, СайтА д се ці ще ме чех ви М задля МОН срон се со ЛАДА ввести Ме ії сет йАлу з ун, со ДІ А нти ай УЙЇ ВІ лин сеншвввни: Ж й свое МН й Вайт в/ сюН пон МЕНЯ сс І СНн2 Ши с чо пл ка й Зв'язуючий домен не Ше затипом діатіла (777 Унн ЗКУ Сайт С
Фіг. 60
Два зв'язуючих домена за типом діатіла й Мене СН у байтА в сно АТ м совно с МН, Косий сн ОО срревю СНІ Сайт Є ка З се ; ї На. йо аит Ло с сон Чернів щи Де пишних нс сосон яко в з ух вени | и Ома», х УНІ ау, | уні ре. Мо вн, З Сайт В рт Зв'язуючий домен не за типом діатіла
Фіг. 6Е Два зв'язуючих домена за типом діатіла Й ; ї с 0 - СН І ра х мі сон Кме о НЕВЕаниз» Се МН, плин МУ снз ОК УНЗ байт Ї (й жи тт с ЗДА сан рве ване ше і Моря нн ши -Є ДІ РобОН е Мосс ЗД Х М мн, м Ше х мн кед КО мМатун щи ді їх І Сайт В рт Зв'язуючий домен не за типом діатіла
Фіг. бЕ
Во -5о о 50 150 250 Фіг ТА Ви 7 З, й ши ні зіва ни чн нки Що -50 0 50 155250 ДЗ
Фіг. 78 В Р Й -й піна «а 0 50 150 250 350
Фіг. 76 ко ви 0 зоо 2501 тАвА 250 т твАвА 200 5 я 0о ! - дві 200 1501 Ід тав 150 4 100 4 100 І 50 ввео | 504 стві 0 уфее нн буфер а лаві «ТТ тпАвЕ -50 4 вен -50- : , 0 200 400 500 0 200 400 600 Час с Час ге
Фіг. ЗА Фіг. 8685 и во З00- зпо- о ; " тАБА 250 Ка е здо тАві 150 5 150 Й сне Др В
100. 100 тдьі ев тАвА 5 тА кі | сн Б. дове а з тва Б прненрнння ; ; Б : ! 0 200 400 600 0 200 400 600 Час с Час с
Фіг. 80 Фіг. 80
1500000 ча я-і Я В | т 1000000 че 7 10 700 Кони. тАб (НМ) --- дос тАвІ НА ГАС-З тАВ4 - інн | ДОЗ тА -- АС-З тА -- 103 тА
Фіг. ЗА 500000 -- ГАС-АЗ тАВА 600000 що я- НАС-АЗ тАБ 1 (1.4) й - ПГАО-3 тАЬ 6 (1.1) 400000 200000 х 0 «В «й - 0 1 Івах (конц. НМ)
Фіг. 9В зоо й Ж Е 200 М ч . 300 м о ес 197 102 107 197 Коннентрація (нг/мл) - ГАС тАБА -- ГАС тА З - ГАС-З тАБІ -- САС тар 4 - ДОЗ тАвро я САС-З тАБ 5
Фіг. 10Д 1000044 є е її 7 їх | ; -- 5000 х А ч ї т е ч о й (й) 107 197 109 19! Концентрація (мкг/мл) -1АОЗТАВА оф ІА -- АВ тав (3 Незабарвлений - ГАОЗ тАЬ б
Фіг. 108
10000 У -4 е яко й а г те За - 5000 о а то о 109 4 Концентрація (мкгімл) -- пПАО-З тА 1 (1.4) - ГдОо-3 тд 1 - ІАб-ЗтАЬ1(12) ФАЗ я- НдАО-З тАЬ 1 (2.2) ) Незабарвлений -- ПАС-З тА 1 (1.1)
Фіг. 100
Фіг. 11А Непростимульований (0:58468)
Гуе. 19 па по га ШО й Е як з се С ни Кос НИВА ШЕ 1061 10 1108 ЕСЕ СЕМ НС
Ь. « остимульований ідень 11, 2:
Фіг. 1185 п 11, 0:58468 То уд ШЕЙК Іо Ач д Не я т шиї л ие ие г При і о вн с я ни я ї СД ох ше я ше шо 10 я то 0-87 45 те Те не 1 ЛА СТМ ЕН
Фіг. 11С Простимульований (день 14, 0:43530) 1 г рені: ііі - ііі інінііінііінінііінінініннйння е
1.5 . А я; Код в В, а го т шле я пек чі от КС свя Ше е- що іа Я в і ї м , я 10616 10 110 вЛАНІ:СОЯ НЄ
UAA201711642A 2015-06-08 2016-06-07 Зв'язуюча lag-3 молекула та спосіб її застосування UA123310C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562172277P 2015-06-08 2015-06-08
US201562255094P 2015-11-13 2015-11-13
PCT/US2016/036172 WO2016200782A1 (en) 2015-06-08 2016-06-07 Lag-3-binding molecules and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA123310C2 true UA123310C2 (uk) 2021-03-17

Family

ID=57504153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201711642A UA123310C2 (uk) 2015-06-08 2016-06-07 Зв'язуюча lag-3 молекула та спосіб її застосування

Country Status (22)

Country Link
US (3) US11072653B2 (uk)
EP (2) EP3302562A4 (uk)
KR (1) KR20180021786A (uk)
CN (1) CN107614013B (uk)
AU (1) AU2016274485B2 (uk)
BR (1) BR112017026330A2 (uk)
CA (1) CA2986953A1 (uk)
CL (2) CL2017003132A1 (uk)
CO (1) CO2017012553A2 (uk)
CR (1) CR20170550A (uk)
EA (1) EA201792657A1 (uk)
EC (1) ECSP17080639A (uk)
GE (1) GEP20207162B (uk)
HK (1) HK1252827A1 (uk)
IL (1) IL256179B2 (uk)
MX (2) MX2017015876A (uk)
MY (1) MY187967A (uk)
PE (1) PE20180927A1 (uk)
PH (1) PH12017502222A1 (uk)
TW (1) TWI773646B (uk)
UA (1) UA123310C2 (uk)
WO (1) WO2016200782A1 (uk)

Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3148580B1 (en) * 2014-05-29 2021-01-20 MacroGenics, Inc. Tri-specific binding molecules that specifically bind to multiple cancer antigens and methods of use thereof
JO3663B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
MA41463A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Anaptysbio Inc Anticorps dirigés contre le gène d'activation 3 des lymphocytes (lag-3)
TWI773646B (zh) * 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
SI3456346T1 (sl) 2015-07-30 2021-11-30 Macrogenics, Inc. Molekule za vezavo PD-1 in LAG-3 in postopki za uporabo le-teh
LT3356411T (lt) 2015-10-02 2021-09-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecifiniai antikūnai, specifiniai pd1 ir tim3
TWI756187B (zh) 2015-10-09 2022-03-01 美商再生元醫藥公司 抗ｌａｇ３抗體及其用途
GEP20217328B (en) 2015-12-14 2021-12-10 Macrogenics Inc Bispecific molecules having immunoreactivity with pd-1 and ctla-4, and methods of use thereof
EP3399989B1 (en) 2015-12-16 2023-08-09 Merck Sharp & Dohme LLC Anti-lag3 antibodies and antigen-binding fragments
NZ743881A (en) 2016-02-06 2023-11-24 Epimab Biotherapeutics Inc Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
MA55697A (fr) 2016-05-18 2022-02-23 Boehringer Ingelheim Int Molécules d'anticorps pour le traitement du cancer
WO2017220555A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 F-Star Beta Limited Lag -3 binding members
CN109563171B (zh) 2016-06-20 2023-09-19 F-星治疗有限公司 结合pd-l1和lag-3的结合分子
AU2017281830B2 (en) 2016-06-20 2023-04-06 Kymab Limited Anti-PD-L1 antibodies
GB201612520D0 (en) 2016-07-19 2016-08-31 F-Star Beta Ltd Binding molecules
CN110023337B (zh) 2016-10-11 2024-01-05 艾吉纳斯公司 抗lag-3抗体及其使用方法
BR112019006876A2 (pt) 2016-10-13 2019-06-25 Symphogen As anticorpos e composições anti-lag-3
AR110424A1 (es) * 2016-12-23 2019-03-27 Macrogenics Inc Moléculas de unión a adam9 y métodos de uso de las mismas
SG11201907208XA (en) 2017-02-10 2019-09-27 Regeneron Pharma Radiolabeled anti-lag3 antibodies for immuno-pet imaging
CN109475617B (zh) * 2017-02-22 2022-05-17 天境生物科技(杭州)有限公司 抗lag-3抗体及其应用
IL268836B2 (en) 2017-02-24 2024-04-01 Macrogenics Inc Bispecific molecules that bind CD137 and cancer antigens and their uses
KR20190121816A (ko) 2017-04-03 2019-10-28 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-pd-1 항체와 돌연변이 il-2 또는 il-15의 면역접합체
JP2020513009A (ja) 2017-04-05 2020-04-30 シムフォゲン・アクティーゼルスカブＳｙｍｐｈｏｇｅｎ Ａ／Ｓ Ｐｄ−１、ｔｉｍ−３、およびｌａｇ−３を標的とする併用治療
SG11201909154SA (en) 2017-04-05 2019-10-30 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3
HUE060019T2 (hu) * 2017-04-05 2023-01-28 Hoffmann La Roche Anti-LAG3 antitestek
WO2018187190A1 (en) * 2017-04-06 2018-10-11 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Precision activation of hiv-specific ctls to eliminate reactived latent t cells
RU2019138507A (ru) * 2017-05-02 2021-06-02 Мерк Шарп И Доум Корп. Составы антител против lag3 и совместные составы антител против lag3 и антител против pd-1
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
JP7301002B2 (ja) 2017-05-30 2023-06-30 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 抗ｌａｇ－３抗体または抗ｌａｇ－３抗体および抗ｐｄ－１もしくは抗ｐｄ－ｌ１抗体を含む組成物
AU2018277559A1 (en) 2017-05-30 2019-10-17 Bristol-Myers Squibb Company Compositions comprising a combination of an anti-LAG-3 antibody, a PD-1 pathway inhibitor, and an immunotherapeutic agent
CN110720039A (zh) 2017-05-30 2020-01-21 百时美施贵宝公司 Lag-3阳性肿瘤的治疗
WO2019011306A1 (en) * 2017-07-13 2019-01-17 Nanjing Leads Biolabs Co., Ltd. LAG-3 BINDING ANTIBODIES AND USES THEREOF
JP2020536495A (ja) 2017-08-30 2020-12-17 フェインズ セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｌａｇ−３抗体及びその使用
JP7384668B2 (ja) * 2017-10-05 2023-11-21 第一三共株式会社 細胞傷害性ｔ細胞枯渇用組成物
AU2018366199A1 (en) * 2017-11-08 2020-05-28 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-PD-1 sequences
JP7489316B2 (ja) 2017-12-19 2024-05-23 エフ－スター セラピューティクス リミテッド Ｐｄ－ｌｉ抗原結合部位を有するｆｃ結合断片
CN109970860A (zh) * 2017-12-27 2019-07-05 信达生物制药(苏州)有限公司 三链抗体、其制备方法及其用途
CN111699200B (zh) 2018-01-15 2023-05-26 南京传奇生物科技有限公司 针对pd-1的单域抗体和其变体
WO2019149716A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising an antigen-binding site binding to lag3
JP7346790B2 (ja) * 2018-03-30 2023-09-20 ナンジン レジェンド バイオテック カンパニー，リミテッド Ｌａｇ‐３に対する単一ドメイン抗体およびその使用
EP3788079A4 (en) * 2018-05-03 2022-12-21 Shanghai Epimab Biotherapeutics Co., Ltd. HIGH AFFINITY ANTIBODIES AGAINST PD-1 AND LAG-3 AND B-SPECIFIC BINDING PROTEINS PRODUCED FROM THEM
CN110615840A (zh) * 2018-06-19 2019-12-27 信达生物制药(苏州)有限公司 全人源的抗lag-3抗体及其应用
CA3107660A1 (en) 2018-07-26 2020-01-30 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 combination therapy for the treatment of cancer
EA202191086A1 (ru) 2018-10-19 2021-09-20 Бристоль-Мейерз Сквибб Компани Комбинированная терапия меланомы
US20220213192A1 (en) * 2019-04-26 2022-07-07 WuXi Biologics Ireland Limited Bispecific antibodies against pd-1 and lag-3
WO2020243570A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and combination therapy
WO2020243563A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures for suitability to immuno-oncology therapy
JP2022534982A (ja) 2019-05-30 2022-08-04 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 細胞局在化シグネチャーおよびその使用
US20220220204A1 (en) * 2019-06-12 2022-07-14 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Anti-pd-l1/anti-lag-3 multiple antigen binding proteins and methods of use thereof
EP4039711A4 (en) * 2019-07-23 2023-11-15 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. BISPECIFIC ANTI-CD47/ANTI-LAG-3 ANTIBODY, PREPARATION METHOD AND USE THEREOF
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
KR20220066334A (ko) 2019-09-22 2022-05-24 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Lag-3 길항제 요법에 대한 정량적 공간 프로파일링
WO2021092220A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject with a tumor suitable for a checkpoint inhibitor therapy
WO2021092221A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject with a tumor suitable for a checkpoint inhibitor therapy
US20220411499A1 (en) 2019-11-08 2022-12-29 Bristol-Myers Squibb Company LAG-3 Antagonist Therapy for Melanoma
KR20220119694A (ko) * 2019-12-23 2022-08-30 마크로제닉스, 인크. 암 치료를 위한 요법
EP4100426A1 (en) 2020-02-06 2022-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Il-10 and uses thereof
JP2023532768A (ja) 2020-07-07 2023-07-31 バイオエヌテック エスエー Ｈｐｖ陽性癌の治療用ｒｎａ
WO2022047189A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 antagonist therapy for hepatocellular carcinoma
MX2023002326A (es) 2020-08-31 2023-03-21 Bristol Myers Squibb Co Firma de localizacion celular e inmunoterapia.
AU2021364837A1 (en) 2020-10-23 2023-05-25 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 antagonist therapy for lung cancer
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
US20220233689A1 (en) 2020-12-28 2022-07-28 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumors
EP4267105A1 (en) 2020-12-28 2023-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
BR112023019847A2 (pt) 2021-03-29 2023-11-07 Juno Therapeutics Inc Métodos para dosagem e tratamento com uma combinação de uma terapia com inibidor de ponto de verificação e uma terapia com célula t car
EP4314061A1 (en) * 2021-03-31 2024-02-07 Merus N.V. Novel multispecific antibodies
WO2022240741A1 (en) 2021-05-12 2022-11-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Lag3 and gal3 inhibitory agents, xbp1, cs1, and cd138 peptides, and methods of use thereof
EP4370552A1 (en) 2021-07-13 2024-05-22 BioNTech SE Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in combination therapy for cancer
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
CN118176214A (zh) 2021-10-29 2024-06-11 百时美施贵宝公司 血液癌症的lag-3拮抗剂疗法
CN114395047B (zh) * 2021-12-07 2023-11-07 合肥天港免疫药物有限公司 双特异性抗体及其应用
WO2023147371A1 (en) 2022-01-26 2023-08-03 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for hepatocellular carcinoma
WO2023164638A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for colorectal carcinoma
WO2023168404A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor
WO2023170606A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Alentis Therapeutics Ag Use of anti-claudin-1 antibodies to increase t cell availability
WO2023178329A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024116140A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Medimmune Limited Combination therapy for treatment of cancer comprising anti-pd-l1 and anti-cd73 antibodies
WO2024126457A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Astellas Pharma Europe Bv Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and immune checkpoint inhibitors
WO2024137776A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for lung cancer

Family Cites Families (209)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5985A (en) 1848-12-26 Pianoforte-action
US320A (en) 1837-07-31 John dainty
US3862925A (en) 1973-07-05 1975-01-28 American Home Prod Preparation of somatotropin release inhibiting factor and intermediates therefor
US3842067A (en) 1973-07-27 1974-10-15 American Home Prod Synthesis of(des-asn5)-srif and intermediates
JPS5726506B2 (uk) 1974-03-08 1982-06-04
US4105603A (en) 1977-03-28 1978-08-08 The Salk Institute For Biological Studies Peptides which effect release of hormones
ATE37983T1 (de) 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
US4524390A (en) 1983-03-07 1985-06-18 Eastman Kodak Company Imaging apparatus
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
JPH0712434B2 (ja) 1987-11-27 1995-02-15 日東化学工業株式会社 リン・アンチモン含有酸化物触媒の製法
US5026822A (en) 1988-07-12 1991-06-25 Hoechst Celanese Corp. High molecular weight polyimide, method of making same and articles formed therefrom
ATE159982T1 (de) 1988-09-15 1997-11-15 Univ Columbia Antikörper mit modifiziertem kohlenhydratgehalt und verfahren zur herstellung und verwendung
US4928535A (en) 1988-10-07 1990-05-29 Oshman's Sporting Goods, Inc. Methods and apparatus for measuring ski boot binding torque
AU6290090A (en) 1989-08-29 1991-04-08 University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
AU6430190A (en) 1989-10-10 1991-05-16 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
WO1991006287A1 (en) 1989-11-06 1991-05-16 Enzytech, Inc. Protein microspheres and methods of using them
FR2656800B1 (fr) 1990-01-08 1992-05-15 Roussy Inst Gustave Nouvelles proteines produits par les lymphocytes humains, sequence d'adn codant pour ces proteines et applications pharmaceutiques et biologiques.
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
WO1991019244A1 (en) 1990-06-04 1991-12-12 3Com Corporation Method for optimizing software for any one of a plurality of variant architectures
ATE221379T1 (de) 1991-05-01 2002-08-15 Jackson H M Found Military Med Verfahren zur behandlung infektiöser respiratorischer erkrankungen
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
AU669124B2 (en) 1991-09-18 1996-05-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing humanized chimera antibody
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9225453D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
IL108501A (en) 1994-01-31 1998-10-30 Mor Research Applic Ltd Antibodies and pharmaceutical compositions containing them
KR100257466B1 (ko) 1994-05-06 2000-07-01 레지날드 쇼트버그 에스. 안토니우스-소도 Lag-3의 가용성 폴리펩타이드 절편 및 생산 방법 치료 조성물, 항-이디오타입 항체
EP0805678B1 (en) 1995-01-05 2003-10-29 THE BOARD OF REGENTS acting for and on behalf of THE UNIVERSITY OF MICHIGAN Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
DE69624824T2 (de) 1995-07-21 2003-09-11 Applied Research Systems Ars Holding N.V., Curacao Verfahren zur erkennung, identifizierung, isolierung, selektiver markierung und zielgerichteter erkennung von th1 lymphozyten mit hilfe von lag-3 protein
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US5916597A (en) 1995-08-31 1999-06-29 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition and method using solid-phase particles for sustained in vivo release of a biologically active agent
US5736152A (en) 1995-10-27 1998-04-07 Atrix Laboratories, Inc. Non-polymeric sustained release delivery system
US5942328A (en) 1996-02-29 1999-08-24 International Business Machines Corporation Low dielectric constant amorphous fluorinated carbon and method of preparation
AU2063197A (en) 1996-03-04 1997-09-22 Massachusetts Institute Of Technology Materials and methods for enhancing cellular internalization
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
ATE320488T1 (de) 1996-11-28 2006-04-15 Roussy Inst Gustave Mutanten des lag-3 proteins, ihre expression und verwendung
PT954282E (pt) 1997-01-16 2005-06-30 Massachusetts Inst Technology Preparacao de particulas para inalacao
ATE427966T1 (de) 1997-02-11 2009-04-15 Immunomedics Inc Stimulation einer immunantwort durch antikírper, welche mit dem alpha-galaktosylepitop markiert sind
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP0900841A1 (en) 1997-06-18 1999-03-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) LAG-3 splice variants
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
DE69907456T2 (de) 1998-06-24 2004-03-25 Advanced Inhalation Research, Inc., Cambridge Grosse poröse partikel ausgestossen von einem inhalator
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US7109292B2 (en) 1999-03-08 2006-09-19 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CA2399832C (en) 2000-02-11 2011-09-20 Stephen D. Gillies Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
EP1294904A1 (en) 2000-06-30 2003-03-26 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Heterodimeric fusion proteins
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EP1355919B1 (en) 2000-12-12 2010-11-24 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
JP4249013B2 (ja) 2001-07-31 2009-04-02 佑 本庶 Ｐｄ−１に対し特異性を有する物質
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
EP1293514B1 (en) 2001-09-14 2006-11-29 Affimed Therapeutics AG Multimeric single chain tandem Fv-antibodies
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
EP1456652A4 (en) 2001-11-13 2005-11-02 Dana Farber Cancer Inst Inc IMMUNOCELL ACTIVATION MODULATING SUBSTANCES AND USE METHOD THEREFOR
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
WO2003074679A2 (en) * 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
EP1571968A4 (en) 2002-04-16 2007-10-17 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF TUMORS
IL149820A0 (en) 2002-05-23 2002-11-10 Curetech Ltd Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency
US7351803B2 (en) 2002-05-30 2008-04-01 Macrogenics, Inc. CD16A binding proteins and use for the treatment of immune disorders
JP4409430B2 (ja) 2002-07-03 2010-02-03 小野薬品工業株式会社 免疫賦活組成物
US7425619B2 (en) 2002-08-14 2008-09-16 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US20070048301A1 (en) 2002-11-26 2007-03-01 Bodary-Winter Sarah C Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
JP4511943B2 (ja) 2002-12-23 2010-07-28 ワイス エルエルシー Ｐｄ−１に対する抗体およびその使用
US7355008B2 (en) 2003-01-09 2008-04-08 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7563869B2 (en) 2003-01-23 2009-07-21 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Substance specific to human PD-1
EP1897548B2 (en) 2003-02-28 2024-05-22 The Johns Hopkins University T cell regulation
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
EP1697415A1 (en) 2003-11-12 2006-09-06 Biogen Idec MA Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
CA2550551C (en) 2004-01-16 2013-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion polypeptides capable of activating receptors
KR20050082389A (ko) 2004-02-18 2005-08-23 메덱스젠 주식회사 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체를 포함하는 장기이식합병증 치료용 약제학적 조성물
US20090123413A1 (en) 2004-08-23 2009-05-14 Britta Hardy Use of bat monoclonal antibody for immunotherapy
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
AU2006232920B2 (en) 2005-04-06 2011-09-29 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
AU2006232310B9 (en) 2005-04-06 2011-07-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Improved stably tethered structures of defined compositions with multiple functions or binding specificities
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
JP5838021B2 (ja) 2005-04-15 2015-12-24 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 共有結合型ダイアボディとその使用
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
PL2439273T3 (pl) 2005-05-09 2019-08-30 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko białku programowanej śmierci komórki 1(pd-1) oraz metody leczenia nowotworów z wykorzystaniem przeciwciał anty-pd-1 samodzielnie lub w połączeniu z innymi immunoterapeutykami
KR101514463B1 (ko) 2005-06-08 2015-04-28 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 예정 세포사 1(ｐｄ-1) 경로를 억제함으로써 지속 감염 및 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물
JP2006345852A (ja) 2005-06-16 2006-12-28 Virxsys Corp 抗体複合体
AU2006267090B2 (en) 2005-07-11 2013-03-07 Provention Bio, Inc. Methods for the treatment of autoimmune disorders using immunosuppressive monoclonal antibodies with reduced toxicity
ES2526811T3 (es) 2005-08-10 2015-01-15 Macrogenics, Inc. Identificación y modificación de anticuerpos con regiones Fc variantes y métodos de uso de estos
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CA2618482C (en) 2005-08-19 2014-10-07 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
CA2607056C (en) 2005-10-19 2015-11-24 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
CN105709237A (zh) 2005-12-16 2016-06-29 Ibc 医药公司 基于免疫球蛋白的多价生物活性装配体
WO2007106707A2 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant heavy chains and methods of using same
CA2646965C (en) 2006-03-24 2016-06-21 Jonathan H. Davis Engineered heterodimeric protein domains
EP2418223A3 (en) 2006-06-12 2013-01-16 Emergent Product Development Seattle, LLC Single-chain multivalent binding proteins with effector function
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
AT503889B1 (de) 2006-07-05 2011-12-15 Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F Multivalente immunglobuline
DK2059533T3 (da) 2006-08-30 2013-02-25 Genentech Inc Multispecifikke antistoffer
WO2008140603A2 (en) 2006-12-08 2008-11-20 Macrogenics, Inc. METHODS FOR THE TREATMENT OF DISEASE USING IMMUNOGLOBULINS HAVING FC REGIONS WITH ALTERED AFFINITIES FOR FCγR ACTIVATING AND FCγR INHIBITING
EP1987839A1 (en) * 2007-04-30 2008-11-05 I.N.S.E.R.M. Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
US9244059B2 (en) * 2007-04-30 2016-01-26 Immutep Parc Club Orsay Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
CA2688275A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Stable igg4 antibodies
CA2691357C (en) 2007-06-18 2014-09-23 N.V. Organon Antibodies to human programmed death receptor pd-1
EP3424951A1 (en) 2007-06-21 2019-01-09 MacroGenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
AU2008282218A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
CN104548091A (zh) 2008-02-11 2015-04-29 治疗科技公司 用于肿瘤治疗的单克隆抗体
EP2113255A1 (en) 2008-05-02 2009-11-04 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Cytotoxic immunoglobulin
EP2282770B1 (en) 2008-06-04 2018-03-07 MacroGenics, Inc. Antibodies with altered binding to fcrn and methods of using same
JP5945096B2 (ja) 2008-07-04 2016-07-05 小野薬品工業株式会社 抗ヒトｐｄ−１抗体の癌に対する治療効果を最適化するための判定マーカーの使用
AR072999A1 (es) * 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
WO2010028795A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
WO2010028796A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Trispecific hexavalent antibodies
WO2010028797A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
CA2998281C (en) 2008-09-26 2022-08-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human anti-pd-1 antobodies and uses therefor
EP2376109B1 (en) 2008-12-19 2019-01-23 MacroGenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
JP5844159B2 (ja) 2009-02-09 2016-01-13 ユニヴェルシテ デクス−マルセイユＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｄ’Ａｉｘ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ Ｐｄ−１抗体およびｐｄ−ｌ１抗体ならびにその使用
CN102356092B (zh) 2009-03-20 2014-11-05 霍夫曼-拉罗奇有限公司 双特异性抗-her抗体
AU2010252284A1 (en) 2009-05-27 2011-11-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US8277919B2 (en) 2009-07-23 2012-10-02 VMO Systems, Inc. Reflective coating for an optical disc
JP2013512251A (ja) 2009-11-24 2013-04-11 アンプリミューン、インコーポレーテッド Ｐｄ−ｌ１／ｐｄ−ｌ２の同時阻害
GB201000467D0 (en) 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
US20110206672A1 (en) 2010-02-25 2011-08-25 Melvyn Little Antigen-Binding Molecule And Uses Thereof
ES2582001T3 (es) 2010-02-25 2016-09-08 Affimed Gmbh Molécula que se une a antígeno y usos de la misma
US8993731B2 (en) 2010-03-11 2015-03-31 Ucb Biopharma Sprl PD-1 antibody
US8876892B2 (en) 2010-04-21 2014-11-04 Medtronic, Inc. Prosthetic heart valve delivery system with spacing
WO2011133886A2 (en) 2010-04-23 2011-10-27 Genentech, Inc. Production of heteromultimeric proteins
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
WO2011159877A2 (en) 2010-06-18 2011-12-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
US20130115215A1 (en) 2010-07-14 2013-05-09 Hongxing Zhou Domain insertion immunoglobulin
ES2667100T3 (es) 2010-08-02 2018-05-09 Macrogenics, Inc. Diacuerpos covalentes y sus usos
JP6167040B2 (ja) 2010-11-05 2017-07-19 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計
KR102289394B1 (ko) 2011-03-31 2021-08-13 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 인간 프로그램화된 사멸 수용체 pd-1에 대한 항체의 안정한 제제 및 관련된 치료
WO2012145493A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Amplimmune, Inc. Antibodies and other molecules that bind b7-h1 and pd-1
US9750806B2 (en) 2011-05-17 2017-09-05 Trion Research Gmbh Vaccine preparation containing trifunctional antibodies with antigen immunogenicity enhancer properties
SG195073A1 (en) 2011-05-21 2013-12-30 Macrogenics Inc Deimmunized serum-binding domains and their use for extending serum half-life
ES2732213T3 (es) 2011-05-21 2019-11-21 Macrogenics Inc Moléculas que se unen a CD3 capaces de unirse a CD3 humano y no humano
WO2012162583A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Design and construction of novel multivalent antibodies
WO2013003647A2 (en) 2011-06-28 2013-01-03 Sea Lane Biotechnologies, Llc Multispecific stacked variable domain binding proteins
AU2012275133B2 (en) 2011-06-30 2017-08-17 Genzyme Corporation Inhibitors of T-cell activation
EP2729488A4 (en) 2011-07-06 2015-01-14 Medimmune Llc PROCESS FOR PREPARING MULTIMANT POLYPEPTIDES
US9920438B2 (en) 2011-07-07 2018-03-20 Massachusetts Institute Of Technology Methods and apparatus for ultrathin catalyst layer for photoelectrode
WO2013013700A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Affimed Therapeutics Ag Multivalent antigen-binding fv molecule
LT2734551T (lt) 2011-07-24 2018-04-10 Cure Tech Ltd. Humanizuotų imunomoduliuojančių monokloninių antikūnų variantai
US9580509B2 (en) 2011-11-07 2017-02-28 Medimmune, Llc Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof
AU2013216943B2 (en) 2012-02-10 2018-04-19 Research Corporation Technologies, Inc. Fusion proteins comprising immunoglobulin constant domain-derived scaffolds
WO2013163427A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibodies to treat hiv-1 infection
CA2873402C (en) 2012-05-15 2023-10-24 Bristol-Myers Squibb Company Cancer immunotherapy by disrupting pd-1/pd-l1 signaling
BR112014026990A2 (pt) 2012-05-24 2017-07-11 Hoffmann La Roche anticorpo , ácido nucleico , vetores , célula hospedeira , composição farmacêutica , uso de um anticorpo e método para o tratamento de um paciente com necessidade de terapia.
AR091649A1 (es) 2012-07-02 2015-02-18 Bristol Myers Squibb Co Optimizacion de anticuerpos que se fijan al gen de activacion de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
WO2014022540A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US9845356B2 (en) 2012-08-03 2017-12-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Single agent anti-PD-L1 and PD-L2 dual binding antibodies and methods of use
MX2015003416A (es) 2012-09-17 2015-10-29 Galectin Therapeutics Inc Metodo para mejorar las inmunoterapias especificas en el tratamiento contra el cancer.
ES2643887T3 (es) 2012-10-02 2017-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Combinación de anticuerpos anti-KIR y anticuerpos anti-PD-1 para tratar el cáncer
BR112015008118A2 (pt) 2012-10-12 2017-12-05 Brigham & Womens Hospital Inc reforço da resposta imune
EP2912063A1 (en) 2012-10-23 2015-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-kir and anti-ctla-4 antibodies to treat cancer
US10034939B2 (en) 2012-10-26 2018-07-31 The University Of Chicago Synergistic combination of immunologic inhibitors for the treatment of cancer
US9487587B2 (en) 2013-03-05 2016-11-08 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof
SI2970464T1 (sl) * 2013-03-15 2020-08-31 Glaxosmithkline Intellectual Propety Development Limited Anti-LAG-3 vezavni proteini
DK2992017T3 (da) 2013-05-02 2021-01-25 Anaptysbio Inc Antistoffer rettet mod programmeret død-1 (pd-1)
CN105683217B (zh) 2013-05-31 2019-12-10 索伦托治疗有限公司 与pd-1结合的抗原结合蛋白
US20160145355A1 (en) 2013-06-24 2016-05-26 Biomed Valley Discoveries, Inc. Bispecific antibodies
AR097306A1 (es) 2013-08-20 2016-03-02 Merck Sharp & Dohme Modulación de la inmunidad tumoral
EP2840091A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
WO2015036394A1 (en) 2013-09-10 2015-03-19 Medimmune Limited Antibodies against pd-1 and uses thereof
JP6623353B2 (ja) 2013-09-13 2019-12-25 ベイジーン スウィッツァーランド ゲーエムベーハー 抗ｐｄ−１抗体並びにその治療及び診断のための使用
EP3508502B1 (en) 2013-09-20 2023-04-26 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-lag-3 antibodies and anti-pd-1 antibodies to treat tumors
EP3757130A1 (en) 2013-09-26 2020-12-30 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
ES2923641T3 (es) 2013-12-30 2022-09-29 Epimab Biotherapeutics Inc Inmunoglobulina con Fabs en tándem y usos de la misma
EP3096782A4 (en) 2014-01-21 2017-07-26 Medlmmune, LLC Compositions and methods for modulating and redirecting immune responses
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
CA2937503A1 (en) 2014-01-28 2015-08-06 Bristol-Myers Squibb Company Anti-lag-3 antibodies to treat hematological malignancies
AU2015229103C9 (en) 2014-03-14 2020-11-26 Immutep S.A.S Antibody molecules to LAG-3 and uses thereof
US20150307620A1 (en) 2014-04-16 2015-10-29 University Of Connecticut Linked immunotherapeutic agonists that costimulate multiple pathways
EP3142697A1 (en) 2014-05-15 2017-03-22 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of lung cancer using a combination of an anti-pd-1 antibody and another anti-cancer agent
EP3148580B1 (en) 2014-05-29 2021-01-20 MacroGenics, Inc. Tri-specific binding molecules that specifically bind to multiple cancer antigens and methods of use thereof
WO2015195163A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 R-Pharm Overseas, Inc. Pd-l1 antagonist fully human antibody
WO2015200828A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 H. Lee Moffit Cancer Center And Research Institute, Inc. Conjugates for immunotherapy
SG10201900571YA (en) 2014-07-22 2019-02-27 Cb Therapeutics Inc Anti-pd-1 antibodies
CN105330740B (zh) 2014-07-30 2018-08-17 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗pd-1抗体及其应用
DK3177644T3 (da) 2014-08-05 2021-01-11 MabQuest SA Immunologiske reagenser, som binder til PD-1
CA2956399A1 (en) 2014-08-05 2016-02-11 Cb Therapeutics, Inc. Anti-pd-l1 antibodies
JO3663B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
GB201419084D0 (en) 2014-10-27 2014-12-10 Agency Science Tech & Res Anti-PD-1 antibodies
US10822414B2 (en) 2014-11-11 2020-11-03 Sutro Biopharma, Inc. Anti-PD-1 antibodies, compositions comprising anti-PD-1 antibodies and methods of using anti-PD-1 antibodies
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
CA2971734A1 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Enumeral Biomedical Holdings, Inc. Anti-pd-1 antibodies
CN107708732A (zh) 2015-02-06 2018-02-16 卡德门企业有限公司 免疫调节剂
EP3283107B1 (en) 2015-04-17 2020-05-27 Bristol-Myers Squibb Company Compositions comprising a combination of ipilimumab and nivolumab
TWI773646B (zh) * 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
JP2019500893A (ja) 2015-11-03 2019-01-17 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド Ｐｄ−１及びｔｉｍ−３に特異的に結合する抗体及びそれらの使用

Also Published As

Publication number Publication date
ECSP17080639A (es) 2018-02-28
MX2017015876A (es) 2018-04-20
MY187967A (en) 2021-11-03
AU2016274485B2 (en) 2022-02-17
CL2019001193A1 (es) 2019-09-27
US11858991B2 (en) 2024-01-02
EP4303235A3 (en) 2024-03-13
IL256179B1 (en) 2023-11-01
AU2016274485A1 (en) 2018-01-04
PH12017502222A1 (en) 2018-06-11
TW201702265A (zh) 2017-01-16
CN107614013A (zh) 2018-01-19
TWI773646B (zh) 2022-08-11
CN107614013B (zh) 2021-12-24
IL256179A (en) 2018-02-28
EP3302562A4 (en) 2019-03-06
EP4303235A2 (en) 2024-01-10
EP3302562A1 (en) 2018-04-11
IL256179B2 (en) 2024-03-01
US20190085075A1 (en) 2019-03-21
MX2021013681A (es) 2022-01-24
PE20180927A1 (es) 2018-06-08
US20240124582A1 (en) 2024-04-18
CL2017003132A1 (es) 2018-06-15
EA201792657A1 (ru) 2018-07-31
CR20170550A (es) 2018-04-03
HK1252827A1 (zh) 2019-06-06
BR112017026330A2 (pt) 2018-09-04
US20210206851A1 (en) 2021-07-08
CO2017012553A2 (es) 2018-02-28
CA2986953A1 (en) 2016-12-15
GEP20207162B (en) 2020-10-12
KR20180021786A (ko) 2018-03-05
WO2016200782A1 (en) 2016-12-15
US11072653B2 (en) 2021-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA123310C2 (uk) Зв'язуюча lag-3 молекула та спосіб її застосування
US11945873B2 (en) Antitumor antagonists
US11639386B2 (en) Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD19 and CD3, and uses thereof
US20210115123A1 (en) Trispecific inhibitors for cancer treatment
US20210047426A1 (en) Bi-Specific Monovalent Diabodies That are Capable of Binding CD123 and CD3, and Uses Thereof
US20200164071A1 (en) Checkpoint regulator antagonists
EP3161004B1 (en) Covalently bonded diabodies having immunoreactivity with pd-1 and lag-3, and methods of use thereof
UA127372C2 (uk) Моноспецифічне pd-1-сполучне моноклональне антитіло
JP6518199B2 (ja) Ｍｉｃａおよびｍｉｃｂタンパク質に対する抗体
WO2019174603A1 (zh) 靶向ctla-4抗体、其制备方法和用途
UA125611C2 (uk) Біспецифічні молекули, що мають імунореактивність відносно pd-1 і ctla-4, і способи їх застосування
US10851157B2 (en) Antagonists targeting the TGF-β pathway
JP2020502042A (ja) Ｍｉｃａおよびｍｉｃｂタンパク質に対する抗体
WO2023104214A1 (zh) 包含lrrc15抗原结合结构域的多特异性t细胞接合剂
WO2023242351A1 (en) Combination therapy of bispecific antibodies against ceacam5 and cd47 and bispecific antibodies against ceacam5 and cd3
TW202413419A (zh) 與ｎｋｐ４６和ｂｃｍａ變體結合之具有ｆｃ工程化的自然殺手（ｎｋ）細胞接合物
KR20240082364A (ko) 인터루킨-2 돌연변이 및 이의 융합 단백질
EA040028B1 (ru) Биспецифические моновалентные диатела, которые способны связывать cd19 и cd3, а также их применения