TW202003567A - 針對lag-3之單一結構域抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申請案提供抗LAG-3構築體，其包含特異性識別LAG-3之單一結構域抗體(sdAb)。亦提供製備及使用該等構築體之方法。

Description

針對LAG-3之單一結構域抗體及其用途
[相關申請案之交叉參考] 本申請案主張2018年3月30日提出申請之國際專利申請案第PCT/CN2018/081356號之優先權權益，該國際專利申請案之揭示內容係以全文引用的方式併入。
[以ASCII文本檔案提交序列表] 關於ASCII文本檔案之以下提交內容係以全文引用的方式併入本文中：電腦可讀形式(CRF)之序列表(檔案名稱：761422001442SEQLIST.txt，記錄日期：2019年3月19日，大小：514 KB)。
本發明係關於包含特異性識別LAG-3之單一結構域抗體(sdAb)之構築體及其製備及使用方法。
包含503個胺基酸之淋巴球活化蛋白3 (LAG-3)屬於Ig超家族且含有4個細胞外Ig樣結構域，其指定為D1至D4。LAG3與CD4密切相關。LAG-3係在經活化T細胞、NK細胞、B細胞及漿細胞樣樹突細胞上表現之細胞表面蛋白，且在該等淋巴球亞群之功能中起作用，該作用係重要的但尚未完全理解。LAG-3蛋白負向調控T細胞之細胞增殖、活化及穩態。LAG-3亦有助於維持CD8+ T細胞處於致耐受性狀態。認為LAG-3與其主要配位體II類MHC之間的相互作用在調節樹突細胞功能方面起作用。近期臨床前研究已表明LAG-3在CD8 T細胞耗竭中之作用，且正在癌症患者之許多臨床試驗中評估使用LAG-3阻斷抗體或LAG-3-Ig融合蛋白阻斷LAG-3/II類MHC相互作用。
程式性細胞死亡受體1 (PD-1)係另一對T細胞功能具有重要負調控之抑制性免疫檢查點分子。當PD-1結合至調控T細胞受體(TCR)信號傳導之程式性細胞死亡配位體1 (PD-L1)及/或程式性細胞死亡配位體2 (PD-L2)時，PD-1信號傳導會減弱T細胞反應。已證明使用靶向PD-1或PD-L1之抗體阻斷PD-1/PD-L1軸促進腫瘤特異性T細胞免疫，對癌症患者具有顯著臨床益處。然而，由於在PD-1/PD-L1阻斷後之抗性或復發，業內仍存在巨大未滿足之臨床需求。
本文中所提及之所有出版物、專利、專利申請案及公開之專利申請案之揭示內容特此以全文引用的方式併入本文中。
本發明係關於包含特異性識別LAG-3之sdAb之抗LAG-3構築體 (下文中稱為「抗LAG-3 sdAb」)，諸如抗LAG-3 sdAb、抗LAG-3 HCAb (例如，抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白，其包含與人類免疫球蛋白G (IgG)之結晶片段(Fc)融合之抗LAG-3 sdAb)及多特異性(諸如雙特異性)抗原結合蛋白(其包含與(例如)其他sdAb、全長四鏈抗體或其抗原結合片段(例如，Fab或scFv)融合之抗LAG-3 sdAb)；及其製備及使用方法。
本申請案之一個態樣提供經分離之抗LAG-3構築體，其包含特異性識別LAG-3之單一結構域抗體(sdAb)，其中該sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，該經分離之抗LAG-3構築體包含特異性識別LAG-3之sdAb，其中該sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個胺基酸取代之其變異體。
在根據任一上文所述經分離之抗LAG-3構築體之一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb包含以下中之任一者： (1) 包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (2) 包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 192之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (3) 包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 193之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (4) 包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (5) 包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 119之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 195之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (6) 包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 196之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (7) 包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 197之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (8) 包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 198之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (9) 包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 206之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (10) 包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 213之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (11) 包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 222之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (12) 包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 224之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；或 (13) 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 225之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體。
在根據任一上文所述經分離之抗LAG-3構築體之一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb包含含有SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 191之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb包含含有SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 192之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb包含含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 193之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb包含含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 194之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb包含含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 119之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 195之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb包含含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 196之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb包含含有SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 197之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb包含含有SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 198之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb包含含有SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 206之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb包含含有SEQ ID NO: 61之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 213之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb包含含有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 146之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 222之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb包含含有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 148之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 224之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb包含含有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 149之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 225之胺基酸序列之CDR3。
在一些實施例中，提供經分離之抗LAG-3構築體，其包含特異性識別LAG-3之sdAb，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 274-311中任一者之CDR1、CDR2及CDR3。
在根據任一上文所述經分離之抗LAG-3構築體之一些實施例中，該sdAb包含含有以下之VH H結構域：(1) 包含SEQ ID NO: 1-38中任一者之胺基酸序列之FR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；(2) 包含SEQ ID NO: 77-114中任一者之胺基酸序列之FR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；(3) 包含SEQ ID NO: 153-190中任一者之胺基酸序列之FR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及/或(4) 包含SEQ ID NO: 229-266中任一者之胺基酸序列之FR4或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體。
在根據任一上文所述經分離之抗LAG-3構築體之一些實施例中，該sdAb包含VH H結構域，該VH H結構域包含與SEQ ID NO: 274-311中之任一者具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，該sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域或在VH H結構域中包含最多約3個胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，該sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。
在根據任一上文所述經分離之抗LAG-3構築體之一些實施例中，該sdAb與LAG-3之間結合之KD為約10-7 M至約10-12 M。在一些實施例中，該sdAb與LAG-3之間結合之KD為約10-9 M至約10-11 M。
在根據任一上文所述經分離之抗LAG-3構築體之一些實施例中，該sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在根據任一上文所述經分離之抗LAG-3構築體之一些實施例中，經分離之抗LAG-3構築體係僅重鏈抗體(HCAb)，其包含與Fc片段融合之特異性識別LAG-3之sdAb。在一些實施例中，HCAb為單體或二聚體。在一些實施例中，Fc片段係人類IgG1 (hIgG1) Fc、無效應物(惰性) hIgG1 Fc、hIgG4 Fc或hIgG4 Fc (S228P)。在一些實施例中，該sdAb經由肽連接體與Fc片段融合。在一些實施例中，該肽連接體包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，HCAb包含SEQ ID NO: 312-349中任一者之胺基酸序列。
在根據任一上文所述經分離之抗LAG-3構築體之一些實施例中，抗LAG-3構築體包含：(a) 第一抗原結合部分，其包含特異性識別LAG-3之sdAb；及(b) 第二抗原結合部分，其特異性識別第二抗原決定基。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含全長抗體、Fab、Fab′、(Fab′)2 、Fv、單鏈Fv (scFv)、scFv-scFv、微小抗體、雙鏈抗體(diabody)或第二sdAb。在一些實施例中，抗LAG-3構築體係多特異性的(諸如雙特異性的)。在一些實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分經由肽連接體彼此融合。在一些實施例中，該肽連接體包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb之N末端或C末端與肽序列融合。在一些實施例中，該肽序列包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體。在一些實施例中，全長抗體之Fc片段係人類IgG1 (hIgG1) Fc、無效應物hIgG1 Fc、hIgG4 Fc或hIgG4 Fc (S228P)。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb之N末端與全長抗體重鏈之C末端融合。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb之C末端與全長抗體重鏈之N末端融合。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb之N末端與全長抗體輕鏈之C末端融合。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之sdAb之C末端與全長抗體輕鏈之N末端融合。在一些實施例中，第二抗原結合部分特異性識別選自由以下組成之群之免疫檢查點分子：PD-1、4-1BB、PD-L1、TIM-3、TIGIT、CTLA-4、VISTA、B7-1、B7-H3、CD47、OX40及GITR。在一些實施例中，第二抗原結合部分特異性識別PD-1。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含含有SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之重鏈之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3及含有SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之輕鏈之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含含有SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之重鏈之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3及含有SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之輕鏈之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，第二抗原結合部分係全長抗體，其包含含有SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之重鏈及含有SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，第二抗原結合部分係全長抗體，其包含含有SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之重鏈及含有SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之輕鏈。
進一步提供經分離之抗LAG-3構築體，其與任一上文所述經分離之抗LAG-3構築體競爭性地特異性結合至LAG-3。
進一步提供醫藥組合物，其包含任一上文所述經分離之抗LAG-3構築體及醫藥學上可接受之載劑。
本申請案之另一態樣提供治療患有LAG-3有關疾病之個體之方法，其包括向該個體投與有效量之任一上文所述醫藥組合物。在一些實施例中，LAG-3有關疾病係癌症。在一些實施例中，癌症係結腸癌。在一些實施例中，個體係人類。
進一步提供編碼任一上文所述經分離之抗LAG-3構築體之經分離核酸、包含該經分離核酸之載體或包含該經分離核酸或該載體之經分離宿主細胞。在一些實施例中，提供產生任一上文所述經分離之抗LAG-3構築體之方法，其包括在有效表現所編碼之抗LAG-3構築體之條件下培養包含任一上文所述經分離核酸或載體之宿主細胞或培養任一上文所述經分離宿主細胞；及自宿主細胞獲得所表現之抗LAG-3構築體。
亦提供包含任一本文所述抗LAG-3構築體之組合物、套組及製品。
本發明提供特異性識別LAG-3之新穎單一結構域抗體(sdAb) (即，抗LAG-3 sdAb)，及包含該等抗LAG-3 sdAb之構築體。本文所述之抗LAG3 sdAb具有強結合親和力且能夠與非人類哺乳動物(諸如食蟹猴)之LAG-3交叉反應。本文所述之抗LAG3構築體可用於治療LAG-3有關疾病，諸如癌症。
因此，本申請案之一個態樣提供經分離之抗LAG-3構築體，其包含特異性識別LAG-3之sdAb。該經分離之抗LAG-3構築體可係(例如)抗LAG-3 sdAb (例如，駱駝科動物或人類化的)、包含複數個融合在一起之抗LAG-3 sdAb之多肽、包含與Fc片段(例如，人類IgG1 Fc、無效應物IgG1 Fc、IgG2 Fc或IgG4 Fc)融合之抗LAG-3 sdAb之抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白或包含與全長抗體(諸如抗PD-1抗體)或其抗原結合片段融合之抗LAG-3 sdAb之多特異性抗原結合蛋白(「MABP」)。抗LAG-3構築體可係單特異性或多特異性的(諸如雙特異性的)、單價或多價的(諸如二價)。
亦提供包含本文所述之抗LAG-3構築體之組合物(諸如醫藥組合物)、套組及製品、其製備方法及使用本文所述之抗LAG-3構築體治療LAG-3有關疾病(諸如癌症)之方法。I. 定義
術語「抗原決定基」意指能夠特異性結合至抗體之蛋白質決定子。抗原決定基通常係由分子之化學活性表面定群(諸如胺基酸或糖側鏈)組成，且通常具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。構形及非構形抗原決定基之不同之處在於，在變性溶劑存在下喪失與前者而非後者之結合。
如本文所用，「治療(treatment或treating)」係用於獲得有益或期望結果(包括臨床結果)之方法。出於本發明之目的，有益或期望臨床結果包括(但不限於)以下中之一或多者：緩和因疾病產生之一或多種症狀、減輕疾病之程度、穩定疾病(例如，預防或延遲疾病惡化)、預防或延遲疾病擴散(例如，轉移)、預防或延遲疾病復發、延遲或減緩疾病進展、改善疾病狀態、提供疾病之緩解(部分或全部)、減少治療疾病所需之一或多種其他藥劑之劑量、延遲疾病進展、提高生活品質及/或延長存活。「治療」亦涵蓋減小癌症之病理學結果。本發明之方法涵蓋治療之該等態樣中之任一或多者。
術語「預防(prevent)」及諸如「預防(prevented、preventing)」等類似詞語指示用於預防、抑制或降低疾病或病狀(例如，癌症)之復發可能性之方法。其亦係指延遲疾病或病狀之復發或延遲疾病或病狀之症狀之復發。如本文所用，「預防」及類似詞語亦包括在疾病或病狀復發之前降低該疾病或病狀之強度、效應、症狀及/或負擔。
如本文所用，「延遲」癌症之發展意指推遲、阻礙、減緩、減慢、穩定及/或延緩疾病之發展。此延遲可具有不同時長，此取決於所治療之疾病及/或個體之病史。「延遲」癌症發展之方法係在與不使用該方法相比時，在給定時間框內降低疾病發展之機率及/或在給定時間框內降低疾病程度之方法。此等比較通常係基於使用統計學上顯著數目之個體之臨床研究。癌症發展可使用標準方法偵測，該等標準方法包括(但不限於)電腦軸向斷層攝影(CAT掃描)、磁共振成像(MRI)、腹部超音波、凝血測試、動脈攝影術或生檢。發展亦可指最初不可偵測之癌症進展，且包括出現、復發及發作。
本文所用之術語「有效量」係指足以治療指定病症、病狀或疾病、諸如改善、緩解、減輕及/或延遲其症狀中之一或多者之劑或劑組合之量。關於癌症，有效量包含足以引起腫瘤縮小及/或減小腫瘤生長速率(諸如阻抑腫瘤生長)或預防或延遲其他不期望細胞增殖之量。在一些實施例中，有效量係足以延遲發展之量。在一些實施例中，有效量係足以預防或延遲復發之量。有效量可以一或多次投與來投與。藥物或組合物之有效量可：(i) 減少癌細胞數目；(ii) 減小腫瘤大小；(iii) 抑制、減慢、減緩至一定程度且較佳地停止癌細胞浸潤至周邊器官中；(iv) 抑制(亦即減緩至一定程度且較佳地停止)腫瘤轉移；(v) 抑制腫瘤生長；(vi) 預防或延遲腫瘤發生及/或復發；及/或(vii) 將與癌症相關症狀中之一或多者減輕至一定程度。
如本文所用，「個體」或「受試者」係指哺乳動物，包括(但不限於)人類、牛、馬、貓、犬、囓齒類動物或靈長類動物。在一些實施例中，個體係人類。
術語「抗體」係以其最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、全長抗體及其抗原結合片段，只要其展現期望之抗原結合活性即可。術語「抗體」包括習用4鏈抗體、單一結構域抗體及其抗原結合片段。
基礎4鏈抗體單元係由兩條相同輕(L)鏈及兩條相同重(H)鏈構成之異四聚體糖蛋白。IgM抗體係由5個基礎異四聚體單元以及稱為J鏈之額外多肽組成，且含有10個抗原結合位點，而IgA抗體包含2至5個基礎4鏈單元，該等單元可聚合以與J鏈組合形成多價裝配物。在IgG之情形下，4鏈單元通常為約150,000道耳頓(Dalton)。每一L鏈藉由一個共價二硫鍵連接至H鏈，而端視H鏈同型而定，兩條H鏈藉由一或多個二硫鍵彼此連接。每一H鏈及L鏈亦具有規則地間隔開之鏈內二硫橋。每一H鏈在N末端處具有可變結構域(VH )、之後對於α及γ鏈中之每一者係三個恆定結構域(CH )且對於μ及ε同型係四個CH 結構域。每一L鏈在N末端處具有可變結構域(VL )，之後在其另一端具有恆定結構域。VL 與VH 對齊，且CL 與重鏈之第一恆定結構域(CH 1)對齊。據信，特定胺基酸殘基在輕鏈可變結構域與重鏈可變結構域之間形成界面。VH 與VL 配對一起形成單一抗原結合位點。關於不同類別抗體之結構及性質，參見(例如)Basic and Clinical Immunology ， 第8版，Daniel P. Sties, Abba I. Terr及Tristram G. Parsolw (編輯), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994，第71頁及第6章。基於其恆定結構域之胺基酸序列，可將來自任何脊椎動物物種之L鏈分配為兩種明顯不同類型(稱為κ及λ)中之一者。端視其重鏈(CH )恆定結構域之胺基酸序列，可將免疫球蛋白分配為不同類別或同型。存在五類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其重鏈分別命名為α、δ、ε、γ及μ。基於CH序列及功能之相對較小差異將γ及α類別進一步劃分成亞類，例如人類表現以下亞類：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
術語「僅重鏈抗體」或「HCAb」係指包含重鏈，但缺少通常見於4鏈抗體中之輕鏈之功能性抗體。已知駱駝科動物(諸如駱駝、駱馬或羊駝)產生HCAb。
術語「單一結構域抗體」或「sdAb」係指具有三個互補決定區(CDR)之單一抗原結合多肽。單獨之sdAb能夠在不與相應含CDR之多肽配對之情形下結合至抗原。在一些情形下，單一結構域抗體係自駱駝科動物HCAb改造，且其重鏈可變結構域在本文中稱為「VH H」(重鏈抗體之重鏈之可變結構域)。駱駝科動物sdAb係已知最小抗原結合抗體片段中之一者(例如，參見Hamers-Casterman等人，Nature 363:446-8 (1993)；Greenberg等人，Nature 374:168-73 (1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人，Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013))。基礎VH H自N末端至C末端具有以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分別係指框架區1至4，且其中CDR1至CDR3係指互補決定區1至3。
「經分離」抗體(或構築體)係已自其產生環境之組分(例如，天然或重組)鑑別、分離及/或回收之抗體。較佳地，經分離多肽不與來自其產生環境之所有其他組分締合。其產生環境之污染性組分(諸如源自重組轉染細胞之組分)係通常將干擾抗體之研究、診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。在較佳實施例中，將多肽純化：(1) 至如藉由(例如) Lowry方法所測定大於95重量%之抗體，且在一些實施例中，至大於99重量%；(2) 至藉由使用旋杯式測序儀足以獲得至少15個N末端或內部胺基酸序列殘基之程度；或(3) 至藉由SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie Blue)或較佳銀染色之均質性。由於抗體天然環境之至少一種組分不會存在，故經分離抗體(或構築體)包括在重組細胞內之原位抗體。然而，經分離多肽、抗體或構築體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
抗體之「可變區」或「可變結構域」係指抗體之重鏈或輕鏈之胺基末端結構域。重鏈及輕鏈之可變結構域可分別稱為「VH 」及「VL 」。該等結構域通常係抗體之最可變部分(相對於相同類別之其他抗體)且含有抗原結合位點。來自駱駝科動物物種之僅重鏈抗體具有單一重鏈可變區，其稱為「VH H」。因此，VH H係VH 之特殊類型。
術語「可變」係指抗體之間可變結構域之某些區段的序列差異極大之事實。V結構域介導抗原結合且界定特定抗體對其特定抗原之特異性。然而，可變性在整個可變結構域跨度中並非均勻分佈。而是，其在重鏈可變結構域及輕鏈可變結構域二者中均集中於三個稱為互補決定區(CDR)或高度變異區(HVR)之區段中。可變結構域之更高度保守之部分稱為框架區(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變結構域各自包含四個FR區(主要採用β摺疊構形)，它們由三個CDR連結，該等CDR形成環而連結β摺疊結構且在一些情形下形成β摺疊結構之一部分。每一鏈中之CDR藉由FR區保持緊密靠近在一起，且與來自另一鏈之CDR一起促進形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Immunological Interest ，第5版，National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991))。恆定結構域並不直接參與抗體與抗原之結合，但展現各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體之群體獲得之抗體，亦即，除可以少量存在之可能天然突變及/或轉譯後修飾(例如，異構化、醯胺化)以外，構成該群體之個別抗體均相同。單株抗體具有高度特異性，其針對單一抗原位點。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相比，每一單株抗體係針對抗原上之單一決定子。除其特異性以外，單株抗體之優勢在於其係藉由融合瘤培養物合成，不受其他免疫球蛋白之污染。修飾詞「單株」指示抗體之特徵在於自實質上同源之抗體群體獲得，且不應解釋為需要藉由任一特定方法來產生該抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術來製得，包括(例如)融合瘤方法(例如，Kohler及Milstein.，Nature, 256:495-97 (1975)；Hongo等人，Hybridoma , 14 (3): 253-260 (1995)；Harlow等人，Antibodies : A Laboratory Manual , (Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T -Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981))、重組DNA方法(例如，參見美國專利第4,816,567號)、噬菌體展示技術(例如，參見Clackson等人，Nature, 352: 624-628 (1991)；Marks等人，J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Sidhu等人，J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等人，J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及Lee等人，J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)及用於在動物中產生具有一部分或所有編碼人類免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因座或基因之人類或人類樣抗體之技術(例如，參見WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)；Jakobovits等人，Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol. 7:33 (1993)；美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；及第5,661,016號；Marks等人，Bio/Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg等人，Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison,Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)；Neuberger，Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)；及Lonberg及Huszar，Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)。
術語「全長抗體」、「完整抗體」或「全抗體」可互換使用以指與抗體片段相對之呈其實質上完整形式之抗體。具體而言，全長4鏈抗體包括具有重鏈及輕鏈且包括Fc區之彼等抗體。全長僅重鏈抗體包括重鏈可變結構域(諸如VH H)及Fc區。恆定結構域可為天然序列恆定結構域(例如，人類天然序列恆定結構域)或其胺基酸序列變異體。在一些情形下，完整抗體可具有一或多種效應功能。
「抗體片段」或「抗原結合片段」包含完整抗體之一部分，較佳地完整抗體之抗原結合區及/或可變區。抗體片段之實例包括(但不限於) Fab, Fab′, F(ab′)2 及Fv片段；雙鏈抗體；直鏈抗體(參見美國專利第5,641,870號，實例2；Zapata等人，Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995))；單鏈抗體(scFv)分子；單一結構域抗體(諸如VH H)及自抗體片段形成之多特異性抗體。抗體之木瓜酶消化產生兩個相同抗原結合片段(稱為「Fab」片段)及殘餘「Fc」片段，「Fab」片段之命名反映容易結晶之能力。Fab片段係由整個L鏈以及H鏈之可變區結構域(VH )及一條重鏈之第一恆定結構域(CH 1)組成。每一Fab片段關於抗原結合均係單價的，亦即其具有單一抗原結合位點。抗體之胃蛋白酶處理產生單一大F(ab')2 片段，該片段大致對應於兩個經二硫鍵連接之具有不同抗原結合活性之Fab片段，且仍然能夠交聯抗原。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於在CH 1結構域之羧基末端處具有幾個額外殘基，該等殘基包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab'-SH係本文針對其中恆定結構域之一或多個半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之Fab'之命名。F(ab')2 抗體片段最初係作為在其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對產生。亦已知抗體片段之其他化學偶合。
術語「恆定結構域」係指相對於免疫球蛋白之另一部分(亦即可變結構域，其含有抗原結合位點)具有更加保守之胺基酸序列之免疫球蛋白分子之部分。恆定結構域含有重鏈之CH 1、CH 2及CH 3結構域(統稱CH )及輕鏈之CHL (或CL )結構域。
基於其恆定結構域之胺基酸序列，可將來自任何哺乳動物物種之抗體(免疫球蛋白)之「輕鏈」分配為兩種明顯不同類型(稱為卡帕(「κ」)及拉姆達(「λ」))中之一者。
「Fv」係含有完全抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此片段由一個重鏈可變區結構域與一個輕鏈可變區結構域呈緊密非共價締合形式之二聚體組成。自該兩個結構域之摺疊產生6個高度變異環(自H鏈及L鏈各自產生3個環)，該等高度變異環貢獻用於抗原結合之胺基酸殘基且賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變結構域(或Fv之一半，其僅包含三個對抗原具有特異性之CDR)亦具有識別且結合抗原之能力，但其親和力低於完整結合位點。
亦縮寫為「sFv」或「scFv」之「單鏈Fv」係包含連結成單一多肽鏈之VH 及VL 抗體結構域之抗體片段。較佳地，scFv多肽進一步包含在VH 與VL 結構域之間的多肽連接體，其使scFv能夠形成所期望之抗原結合結構。關於scFv之綜述，參見Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies ，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag, New York，第269-315頁(1994)。
術語「雙鏈抗體」係指藉由以下方式製備之小抗體片段：用VH 與VL 結構域之間的短連接體(約5-10個殘基)構築sFv片段(參見前述段落)，使得達成V結構域之鏈間而非鏈內配對，藉此產生二價片段，亦即具有兩個抗原結合位點之片段。雙特異性雙鏈抗體係兩個「交叉」sFv片段之異二聚體，其中兩種抗體之VH 及VL 結構域存在於不同多肽鏈上。雙鏈抗體更詳細地闡述於(例如) EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)中。
具體而言，本文之單株抗體包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類之抗體中的相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類之抗體中的相應序列一致或同源；以及此等抗體之片段，只要其展現期望生物學活性即可(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。「人類化抗體」係作為「嵌合抗體」之亞群使用。
非人類(例如，駱馬或駱駝科動物)抗體之「人類化」形式係含有最少量源自非人類免疫球蛋白之序列之嵌合抗體。在一些實施例中，人類化抗體係人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之CDR (下文定義)之殘基係由來自非人類物種(諸如小鼠、大鼠、兔、駱駝、駱馬、羊駝或非人類靈長類動物)之CDR (供體抗體)之具有期望特異性、親和力及/或能力之殘基替換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之框架(「FR」)殘基由相應的非人類殘基替換。此外，人類化抗體可包含接受者抗體或供體抗體中不存在之殘基。可進行該等修飾以進一步改善抗體效能，諸如結合親和力。一般而言，人類化抗體將包含實質上全部之至少一個且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部之高度變異環對應於非人類免疫球蛋白序列之彼等高度變異環，且全部或實質上全部之FR區係人類免疫球蛋白序列之彼等FR區，但該等FR區可包括一或多種改良抗體效能(諸如結合親和力、異構化、免疫原性等)之個別FR殘基取代。FR中之該等胺基酸取代之數量通常在H鏈中不超過6，且在L鏈中不超過3。人類化抗體視情況將亦包含免疫球蛋白恆定區(Fc) (通常為人類免疫球蛋白恆定區)之至少一部分。關於其他細節，參見(例如) Jones等人，Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329 (1988)；及Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。亦參見(例如) Vaswani及Hamilton，Ann.Allergy, Asthma & Immunol .1:105-115 (1998)；Harris，Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及Gross，Curr. Op. Biotech . 5:428-433 (1994)；及美國專利第6,982,321號及第7,087,409號。
「人類抗體」係具有對應於由人類所產生抗體之胺基酸序列之胺基酸序列及/或使用用於製備如本文所揭示之人類抗體之任一技術製備之抗體。此人類抗體之定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術(包括噬菌體展示文庫)來產生。Hoogenboom及Winter，J. Mol. Biol. , 227:381 (1991)；Marks等人，J. Mol. Biol. , 222:581 (1991)。闡述於以下文獻中之方法亦可用於製備人類單株抗體：Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy , Alan R. Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，J. Immunol. , 147(1):86-95 (1991)。亦參見van Dijk及van de Winkel，Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001)。人類抗體可藉由向基因轉殖動物投與抗原來製備，該等動物已經修飾從而因應抗原攻擊產生此等抗體，但其內源性基因座已失能，例如，經免疫xenomice (關於XENOMOUSETM 技術，參見(例如)美國專利第6,075,181號及第6,150,584號)。關於經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體，亦參見(例如) Li等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)。
術語「高度變異區」、「HVR」或「HV」在本文中使用時係指抗體可變結構域之在序列上高度變異及/或形成結構上界定環之區。通常，單一結構域抗體包含三個HVR (或CDR)：HVR1 (或CDR1)、HVR2 (或CDR2)及HVR3 (或CDR3)。HVR3 (或CDR3)展示該三個HVR之大部分多樣性，且據信在賦予抗體良好特異性方面具有獨特作用。例如，參見Hamers-Casterman等人，Nature 363:446-448 (1993)；Sheriff等人，Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)。
術語「互補決定區」或「CDR」用於指如由Kabat系統所定義之高度變異區。參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)。
本文使用且涵蓋許多HVR之描述。Kabat互補決定區(CDR)係基於序列可變性且最常用(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。而Chothia係指結構環之位置(Chothia及Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。AbM HVR代表Kabat HVR與Chothia結構環之間的折衷，且用於Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體中。「contact」HVR係基於對可獲得之複雜晶體結構之分析。來自該等HVR中之每一者之殘基係如下表1中所註明。表 1. HVR 描述。
Figure 108111097-A0304-0001
HVR可包含如下「經延伸HVR」：VL 中之24-36或24-34 (L1)、46-56或50-56 (L2)及89-97或89-96 (L3)以及VH 中之26-35 (H1)、50-65或49-65 (H2)及93-102、94-102或95-102 (H3)。對於該等定義中之每一者，根據Kabat等人(上文文獻)對可變結構域殘基進行編號。
單一結構域抗體(諸如VH H)之胺基酸殘基係根據由Kabat等人(「Sequence of proteins of immunological interest」, US Public Health Services, NIH Bethesda, Md.，公開案第91號)所給出之針對VH 結構域之通用編號進行編號，如在Riechmann及Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000年6月23日; 240 (1-2): 185-195之文章中適於來自駱駝科動物之VH H結構域。根據此編號，VH H之FR1包含在位置1-30處之胺基酸殘基，VH H之CDR1包含在位置31-35處之胺基酸殘基，VH H之FR2包含在位置36-49處之胺基酸，VH H之CDR2包含在位置50-65處之胺基酸殘基，VH H之FR3包含在位置66-94處之胺基酸殘基，VH H之CDR3包含在位置95-102處之胺基酸殘基，且VH H之FR4包含在位置103-113處之胺基酸殘基。就此而言，應注意，如此項技術中對於VH 結構域及VH H結構域所熟知，每一CDR中之胺基酸殘基之總數量可有所變化且可不對應於由Kabat編號所指示之胺基酸殘基之總數量(亦即，根據Kabat編號之一或多個位置在實際序列中可未被佔據，或實際序列可含有多於Kabat編號所容許數量之胺基酸殘基)。
表述「如Kabat中之可變結構域殘基編號」或「如Kabat中之胺基酸位置編號」及其變化形式係指用於Kabat等人(上文文獻)中之所彙編抗體之重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域之編號系統。使用此編號系統，實際直鏈胺基酸序列可含有較少或額外之對應於可變結構域之FR或HVR之縮短或插入之胺基酸。舉例而言，重鏈可變結構域可包括在H2之殘基52後之單一胺基酸插入(根據Kabat之殘基52a)及重鏈FR殘基82後之插入殘基(例如，根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。可藉由將抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定給定抗體殘基之Kabat編號。
除非本文中另有指示，否則免疫球蛋白重鏈中之殘基編號係如Kabat等人，上文文獻中EU索引之編號。「如Kabat中之EU索引」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。
「框架」或「FR」殘基係除如本文所定義之HVR殘基以外之彼等可變結構域殘基。
「人類一致性框架」或「接受體人類框架」係代表在人類免疫球蛋白VL 或VH 框架序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL 或VH 序列之選擇係來自可變結構域序列之亞組。通常，序列之亞組係如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)中之亞組。 實例包括，對於VL 而言，亞組可為如Kabat等人，上文文獻中之亞組κI、κII、κIII或κIV。 另外，對於VH 而言，亞組可為如Kabat等人中之亞組I、亞組II或亞組III。或者，人類一致性框架可源自上文，其中特定殘基、諸如當人類框架殘基係基於其與供體框架之同源性(藉由將供體框架序列與各種人類框架序列之集合體進行比對)來選擇時。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類一致性框架之接受體人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有先前存在之胺基酸序列變化。在一些實施例中，先前存在之胺基酸變化之數目為10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。
「親和力成熟」抗體係在其一或多個CDR中具有一或多個改變之抗體，與不具有彼等改變之親代抗體相比，該(等)改變使得該抗體對抗原之親和力有所改良。在一些實施例中，親和力成熟抗體對靶標抗原具有奈莫耳級或甚至皮莫耳級親和力。親和力成熟抗體係藉由此項技術中已知之程序來產生。舉例而言，Marks等人，Bio/Technology 10:779-783 (1992)闡述藉由VH 及VL 結構域改組之親和力成熟。CDR及/或框架殘基之隨機誘變於由例如下列所闡述：Barbas等人，Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)；Schier等人，Gene 169:147-155 (1995)；Yelton等人，J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)；Jackson等人，J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)；及Hawkins等人，J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)。
如本文所用，術語「特異性結合」、「特異性識別」或「對……具有特異性」係指可量測且可再現之相互作用，諸如靶標與抗原結合蛋白(諸如sdAb)之間的結合，其決定在異源性分子群體(包括生物分子)存在下靶標之存在。舉例而言，特異性結合靶標(其可為抗原決定基)之抗原結合蛋白(諸如sdAb)係與其結合其他靶標相比以更大親和力、親合力更容易地及/或以更長持續時間結合此靶標之抗原結合蛋白(諸如sdAb)。在一些實施例中，如藉由(例如)放射性免疫分析(RIA)所量測，抗原結合蛋白(諸如sdAb)與無關靶標之結合程度小於該抗原結合蛋白(諸如sdAb)與靶標之結合之約10%。在一些實施例中，特異性結合靶標之抗原結合蛋白(諸如sdAb)之解離常數(KD )為≤10-5 M、≤10-6 M、≤10-7 M、≤10-8 M、≤10-9 M、≤10-10 M、≤10-11 M或≤10-12 M。在一些實施例中，抗原結合蛋白特異性結合蛋白質上在來自不同物種之蛋白質間保守之抗原決定基。在一些實施例中，特異性結合可包括(但不要求)排他性結合。抗體或抗原結合結構域之結合特異性可藉由此項技術中已知之方法以實驗方式測定。此等方法包含(但不限於)西方墨點法(Western blot)、ELISA測試、RIA測試、ECL測試、IRMA測試、EIA測試、BIACORETM 測試及肽掃描。
術語「特異性」係指抗原結合蛋白(諸如sdAb)選擇性識別抗原之特定抗原決定基。舉例而言，天然抗體係單特異性的。如本文所用之術語「多特異性」表示抗原結合蛋白具有多抗原決定基特異性(亦即，能夠特異性結合至一種生物分子上之兩種、三種或更多種不同抗原決定基或能夠特異性結合至兩種、三種或更多種不同生物分子上之抗原決定基)。如本文所用之「雙特異性」表示抗原結合蛋白具有兩種不同抗原結合特異性。除非另有指示，否則由所列示雙特異性抗體結合之抗原之順序係任意的。亦即，舉例而言，術語「抗LAG-3/PD-1」、「抗PD-1/LAG-3」、「LAG-3×PD-1」及「PD-1×LAG-3」可互換使用以指特異性結合至LAG-3及PD-1二者之雙特異性抗體。如本文所用之術語「單特異性」表示具有一或多個結合位點之抗原結合蛋白，該等結合位點中之每一者結合相同抗原之相同抗原決定基。
如本文所用之術語「價」表示在抗原結合蛋白中存在指定數目之結合位點。舉例而言，天然抗體或全長抗體具有兩個結合位點且係二價的。因此，術語「三價」、「四價」、「五價」及「六價」表示在抗原結合蛋白中分別存在兩個結合位點、三個結合位點、四個結合位點、五個結合位點及六個結合位點。
「抗體效應功能」係指可歸因於抗體Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異體Fc區)之彼等生物學活性，且隨抗體同型而有所變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體)之下調；及B細胞活化。「降低或最小化」之抗體效應功能意指抗體效應功能自野生型或未經修飾之抗體降低至少50% (或者60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%)。抗體效應功能之測定可由熟習此項技術者容易地測定且量測。在較佳實施例中，補體結合、補體依賴性細胞毒性及抗體依賴性細胞毒性之抗體效應功能受影響。在一些實施例中，經由恆定區中消除糖基化之突變(例如，「無效應物突變」)消除效應功能。在一個態樣中，無效應物突變係CH 2區中之N297A或DANA突變(D265A+N297A)。Shields等人，J. Biol. Chem. 276 (9): 6591-6604 (2001)。或者，導致效應功能降低或消除之其他突變包括：K322A及L234A/L235A (LALA)。或者，效應功能可經由產生技術來降低或消除，諸如在不糖基化(例如，大腸桿菌(E. coli ))或在導致經改變之糖基化模式(在促進效應功能方面無效或較不有效)之宿主細胞中表現(例如，Shinkawa等人，J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473 (2003)。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或ADCC係指以下細胞毒性形式：其中結合至存在於某些細胞毒性細胞(例如，天然殺手(NK)細胞、嗜中性球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)之經分泌Ig使該等細胞毒性效應細胞能夠特異性地結合至帶抗原之靶細胞且隨後利用細胞毒素殺傷該靶細胞。抗體「武裝」細胞毒性細胞且係藉由此機制殺傷靶細胞所需的。介導ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核球則表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之Fc表現彙總於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)之第464頁上之表2中。為評價所關注分子之ADCC活性，可實施諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中所闡述之活體外ADCC分析。用於此等分析之可用效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。或者或另外，可在活體內，例如在Clynes等人，PNAS USA 95:652-656 (1998)中所揭示之動物模型中評價所關注分子之ADCC活性。
術語「Fc區」或「片段可結晶區」在本文中用於界定免疫球蛋白重鏈之C末端區域，其包括天然序列Fc區及變異體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可有所變化，但通常將人類IgG重鏈Fc區界定為自位置Cys226處之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基末端。Fc區之C末端離胺酸(根據EU編號系統之殘基447)可在(例如)抗體之產生或純化期間或藉由重組改造編碼抗體重鏈之核酸去除。因此，完整抗體之組成可包含去除全部K447殘基之抗體群體、未去除K447殘基之抗體群體及具有含有及不含K447殘基之抗體混合物之抗體群體。用於本文所述抗體中之適宜天然序列Fc區包括人類IgG1、IgG2 (IgG2A、IgG2B)、IgG3及IgG4。
「Fc受體」或「FcR」闡述結合抗體之Fc區之受體。較佳FcR係天然序列人類FcR。此外，較佳FcR係結合IgG抗體之FcR (γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類之受體，其包括該等受體之等位基因變異體及選擇性剪接形式，FcγRII受體包括FcγRIIA (「活化性受體」)及FcγRIIB (「抑制性受體」)，兩者具有主要在其細胞質結構域上有所不同之類似胺基酸序列。活化性受體FcγRIIA在其細胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基序(ITAM)。抑制性受體FcγRIIB在其細胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基序(ITIM)。(參見M. Daëron，Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))。FcR綜述於Ravetch及Kinet，Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)；Capel等人，Immunomethods 4: 25-34 (1994)；及de Haas等人，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)中。本文之術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括欲在將來鑑別之彼等FcR。
術語「Fc受體」或「FcR」亦包括新生受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒。Guyer等人，J. Immunol. 117: 587 (1976)及Kim等人，J. Immunol. 24: 249 (1994)。已知量測與FcRn之結合之方法(例如，參見Ghetie及Ward，Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997)；Ghetie等人，Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997)；Hinton等人，J. Biol. Chem. 279 (8): 6213-6 (2004)；WO 2004/92219 (Hinton等人)。可在(例如)表現人類FcRn之基因轉殖小鼠或經轉染人類細胞株中或在投與具有變異體Fc區之多肽之靈長類動物中分析人類FcRn高親和力結合多肽與FcRn之活體內結合及血清半衰期。WO 2004/42072 (Presta)闡述改良或減少與FcR結合之抗體變異體。亦參見(例如)Shields等人，J. Biol. Chem . 9(2): 6591-6604 (2001)。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體存在下靶細胞之溶解。經典補體路徑之活化係藉由補體系統之第一組分(C1q)與抗體(適當亞類)之結合來起始，該等抗體結合至其同族抗原。為評價補體活化，可實施例如如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)中所闡述之CDC分析。具有經改變Fc區胺基酸序列及增加或減小之C1q結合能力之抗體變異體闡述於美國專利第6,194,551B1號及第WO99/51642號中。彼等專利公開案之內容係以引用的方式明確併入本文中。亦參見Idusogie等人，J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)。
「結合親和力」通常係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和強度。除非另有指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對成員之間的1:1相互作用之固有結合親和力。結合親和力可由Kd 、Koff 、Kon 或Ka 指示。如本文所用，術語「Koff 」意欲指如自動力學選擇設定所測定之抗體(或抗原結合結構域)自抗體/抗原複合物之解離速率常數，其以s-1 為單位表示。如本文所用，術語「Kon 」意欲指抗體(或抗原結合結構域)與抗原締合以形成抗體/抗原複合物之締合速率常數，其以M-1 s-1 為單位表示。如本文所用，術語平衡解離常數「KD 」或「Kd 」係指特定抗體-抗原相互作用之解離常數，且描述佔據平衡時抗體分子溶液中所存在之所有抗體結合結構域之一半所需的抗原濃度且等於Koff /Kon ，其以M為單位表示。Kd 之量測預先假定所有結合劑均係在溶液中。在抗體繫鏈至細胞壁之情形下，例如在酵母表現系統中，相應平衡速率常數表示為EC50，其給出Kd 之良好近似值。親和力常數Ka 係解離常數Kd 之倒數，其以M-1 為單位表示。解離常數(KD 或Kd )用作顯示抗體對抗原之親和力之指標。舉例而言，藉由Scatchard方法使用標記有多種標記劑之抗體，以及藉由使用為非處方量測套組之BIACORETM X (由Amersham Biosciences製造)或類似套組，根據套組附帶之使用者手冊及實驗操作方法可容易地進行分析。可使用該等方法導出之KD 值係以M (Mol)為單位表示。特異性結合至靶標之抗體或其抗原結合片段之解離常數(Kd )可為(例如) ≤10-5 M、≤10-6 M、≤10-7 M、≤10-8 M、≤10-9 M、≤10-10 M、≤10-11 M或≤10-12 M。
半最大抑制濃度(IC50 )係物質(諸如抗體)抑制特定生物或生物化學功能之有效性之量度。其指示將給定生物學過程抑制一半需要多少特定藥物或其他物質(抑制劑，諸如抗體)。該等值通常表示為莫耳濃度。促效劑藥物或其他物質(諸如抗體)之IC50 與「EC50 」相當。EC50 亦代表在活體內獲得50%之最大效應所需之血漿濃度。如本文所用，「IC50 」用於指示在活體外中和50%之抗原生物活性所需抗體之有效濃度。IC50 或EC50 可藉由諸如以下之生物分析來量測：藉由FACS分析之對配位體結合之抑制(競爭結合分析)、基於細胞之細胞介素釋放分析或放大的發光鄰近均相分析(AlphaLISA)。
關於肽、多肽或抗體序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」及「同源性」係定義為在比對序列且引入空位(若需要)以達成最大序列一致性百分比後，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分之情況下，候選序列中與特定肽或多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基之百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN™ (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於衡量比對之適當參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何演算法。
編碼本文所述之構築體、抗體或其抗原結合片段之「經分離」核酸分子係自其產生環境中通常與其締合之至少一種污染性核酸分子鑑別且分離之核酸分子。較佳地，經分離核酸不與與產生環境相關之所有組分締合。編碼本文所述之多肽及抗體之經分離核酸分子之形式不為其在自然界中所發現之形式或設置。因此，經分離核酸分子有別於天然存在於細胞中之編碼本文所述多肽及抗體之核酸。經分離核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但該核酸分子係存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同之染色體位置處。
術語「控制序列」係指在特定宿主生物體內表現可操作地連接之編碼序列所需之DNA序列。適用於原核生物之控制序列(例如)包括啟動子、視情況操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞可利用啟動子、多聚腺苷酸化信號及增強子。
當核酸置於與另一核酸序列之功能性關係時，該核酸為「可操作地連接的」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則該前序列或分泌前導序列之DNA可操作地連接至該多肽之DNA；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子可操作地連接至該序列；或若核糖體結合位點之定位有助於轉譯，則該核糖體結合位點可操作地連接至編碼序列。通常，「可操作地連接」意味著所連接之DNA序列係鄰接序列，且在分泌前導序列之情形下係鄰接序列且位於閱讀相中。然而，增強子並非必須鄰接。連接係藉由在便捷限制位點處接合來完成。若不存在此等位點，則根據習用實踐使用合成寡核苷酸銜接子或連接體。
如本文所用之術語「載體」係指能夠增殖與其連接之另一核酸之核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入於引入其之宿主細胞基因體中之載體。某些載體能夠引導與其可操作地連接之核酸之表現。此等載體在本文中稱為「表現載體」。
如本文所用之術語「轉染」或「轉型」或「轉導」係指將外源性核酸轉移或引入至宿主細胞中之過程。「轉染」或「轉型」或「轉導」之細胞係經外源性核酸轉染、轉型或轉導之細胞。該細胞包括原代個體細胞及其子代。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指其中已引入外源性核酸之細胞，包括此等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型株」及「經轉型細胞」，其包括原代經轉型細胞及源自其之子代(不考慮傳代次數)。子代之核酸含量與親代細胞可不完全相同，而是可含有突變。本文包括經篩選或選擇用於原始經轉型細胞中之具有相同功能或生物學活性之突變體子代。
術語「醫藥調配物」或「醫藥組合物」係指如下製劑：其所呈之形式允許活性成分之生物學活性有效，且不含對將投與該調配物之受試者具有不可接受毒性之其他組分。此等調配物係無菌的。「無菌」調配物係無菌的或不含所有活的微生物及其孢子。
應理解，本文所述之本發明實施例包括「由實施例組成」及/或「基本上由實施例組成」。
在本文中提及「約」一值或參數包括(且描述)關於該值或參數本身之變化。舉例而言，提及「約X」之說明包括「X」之說明。
如本文所用，提及「並非」一值或參數通常意指且闡述「不同於」一值或參數。舉例而言，方法不用於治療X類型之癌症意指該方法用於治療不同於X類型之癌症。
本文所用之術語「約X-Y」具有與「約X至約Y」相同之含義。
除非上下文另外明確指示，否則如本文及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a、an)」及「該」包括複數個指示物。II. 抗 LAG-3 構築體
本申請案之一個態樣提供經分離之抗LAG-3構築體，其包含特異性識別LAG-3之單一結構域抗體(sdAb) (亦即，「抗LAG-3 sdAb」)。在一些實施例中，該抗LAG-3構築體係抗LAG-3 sdAb、融合蛋白或其抗原結合片段，其特異性結合至LAG-3且拮抗LAG-3結合II類MHC分子及/或介導T細胞耗竭之能力。(I) 抗 LAG-3 單一結構域抗體
本文所述之經分離抗LAG-3構築體包含抗LAG-3 sdAb。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb特異性識別人類LAG-3。例示性人類LAG-3之完整胺基酸序列包含SEQ ID NO: 350之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb特異性識別人類LAG-3內之抗原決定基。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb特異性識別人類LAG-3之細胞外結構域。例示性人類LAG-3之細胞外結構域之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 351之胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類靈長類動物(諸如食蟹猴)之LAG-3交叉反應。
在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3蛋白之至少一種種間變異體交叉反應。在一些實施例中，舉例而言，LAG-3蛋白(或其片段)係人類LAG-3，且LAG-3蛋白(或其片段)之種間變異體係其食蟹猴變異體。抗LAG-3 sdAb或其構築體之交叉反應性可促進抗LAG-3構築體之臨床開發，例如藉由在動物研究中容許更準確且具反應性之投藥。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3，且胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。因此，在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體，其中該等胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
本文所述之CDR序列提供於表11中。該等CDR可以任一組合來組合以產生多種抗LAG-3 sdAb。熟習此項技術者將容易地瞭解，包含源自本文所述抗體之CDR或可變結構域序列、但其中該等CDR或可變結構域序列係使用除Kabat系統以外之算法預測之抗體構築體係在本發明之範圍內。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 191之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 191之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 192之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 192之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 192之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 193之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 193之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 193之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 194之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 194之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 194之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 119之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 195之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 119之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 195之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 119之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 195之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 196之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 196之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 196之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 197之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 197之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 197之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 198之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 198之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 198之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 206之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 206之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 206之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 61之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 213之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 61之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 213之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 61之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 137之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 213之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 146之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 222之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 146之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 222之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 146之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 222之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 148之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 224之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 148之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 224之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 72之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 148之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 224之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 149之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 225之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 149之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 225之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 149之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 225之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列、SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列及SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 39、115及191之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 40、116及192之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 41、117及193之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 42、118及194之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 43、119及195之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 44、120及196之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 45、121及197之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 46、122及198之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 54、130及206之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 61、137、213之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 70、146及222之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 72、148及224之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 73、149及225之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 53、129及205之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 60、136及212之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 69、145及221之序列。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 71、147及223之序列。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 274之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 275之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 276之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 277之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 278之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 279之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 280之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 281之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 282之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 289之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 296之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 305之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 307之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 308之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 288之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 295之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 304之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 306之胺基酸序列之一個、兩個或三個CDR。在一些實施例中，提供包含VH H之抗LAG-3 sdAb，該VH H包含SEQ ID NO: 274-306中任一者之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
本文所述之抗LAG-3 sdAb可包含FR區之任何適宜序列。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 1-38中任一者之胺基酸序列之FR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個、3個或更多個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 77-114中任一者之胺基酸序列之FR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個、3個或更多個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 153-190中任一者之胺基酸序列之FR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個、3個或更多個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 229-266中任一者之胺基酸序列之FR4或其包含最多約3個(諸如約1個、2個、3個或更多個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含表11之任一抗LAG-3 sdAb之FR1、FR2、FR3及FR4。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域或其與SEQ ID NO: 289-324中之任一者具有至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之變異體。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域或在VH H結構域中包含最多約10個(諸如約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域或在CDR1及/或CDR2及/或CDR3中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域或在FR1及/或FR2及/或FR3及/或FR4中包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域或在CDR及FR二者中包含胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，提供包含VH H結構域之抗LAG-3 sdAb，該VH H結構域包含SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 288之胺基酸序列之VH H結構域或其與SEQ ID NO: 288具有至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之變異體。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含一或多種選自由以下組成之群之胺基酸取代：(1) 在胺基酸位置11處(例如，S或L)；(2) 在胺基酸位置14處(例如，A或P)；(3) 在胺基酸位置44處(例如，E或G)；(4) 在胺基酸位置45處(例如，R或L)；(5) 在胺基酸位置49處(例如，A或S)；(6) 在胺基酸位置71處 (例如，K或R)；(7) 在胺基酸位置74處(例如，A或S)；(8) 在胺基酸位置83處(例如，D或N)；(9) 在胺基酸位置86處(例如，R或K)；(10) 在胺基酸位置87處(例如，A或P)；(11) 在胺基酸位置92處(例如，M或V)；(12) 在胺基酸位置119處(例如，Q或L)；其中該等胺基酸位置係基於SEQ ID NO: 288。
在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 295之胺基酸序列之VH H結構域或其與SEQ ID NO: 295具有至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之變異體。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含一或多種選自由以下組成之群之胺基酸取代：(1) 在胺基酸位置1處(例如，Q或E)；(2) 在胺基酸位置5處(例如，A或V)；(3) 在胺基酸位置11處(例如，S或L)；(4) 在胺基酸位置14處(例如，A或P)；(5) 在胺基酸位置44處(例如，E或G)；(6) 在胺基酸位置45處(例如，R或L)；(7) 在胺基酸位置71處(例如，K或R)；(8) 在胺基酸位置74處(例如，A或S)；(9) 在胺基酸位置86處(例如，R或K)；(10) 在胺基酸位置87處(例如，A或P)；(11) 在胺基酸位置92處(例如，M或V)；或(12) 在胺基酸位置117處(例如，Q或L)；其中該等胺基酸位置係基於SEQ ID NO: 295。
在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 304之胺基酸序列之VH H結構域或其與SEQ ID NO: 304具有至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之變異體。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含一或多種選自由以下組成之群之胺基酸取代：(1) 在胺基酸位置1處(例如，Q或E)；(2) 在胺基酸位置3處(例如，Q或H)；(3) 在胺基酸位置5處(例如，M或V)；(4) 在胺基酸位置11處(例如，S或L)；(5) 在胺基酸位置14處(例如，V或P)；(6) 在胺基酸位置44處(例如，E或G)；(7) 在胺基酸位置45處(例如，R或L)；(8) 在胺基酸位置49處(例如，A或S)；(8) 在胺基酸位置71處(例如，K或R)；(9) 在胺基酸位置74處(例如，A或S)；(10) 在胺基酸位置86處(例如，R或K)；(11) 在胺基酸位置87處(例如，A或P)；(12) 在胺基酸位置92處(例如，M或V)；(13) 在胺基酸位置94處(例如，F或Y)；或(14) 在胺基酸位置117處(例如，Q、L或I)；其中該等胺基酸位置係基於SEQ ID NO: 304。
在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 306之胺基酸序列之VH H結構域或其與SEQ ID NO: 306具有至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之變異體。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含一或多種選自由以下組成之群之胺基酸取代：(1) 在胺基酸位置5處(例如，A或V)；(2) 在胺基酸位置11處(例如，S或L)；(3) 在胺基酸位置14處(例如，A或P)；(4) 在胺基酸位置44處(例如，E或G)；(5) 在胺基酸位置45處(例如，R或L)；(6) 在胺基酸位置49處(例如，A或S)；(7) 在胺基酸位置71處(例如，K或R)；(8) 在胺基酸位置74處(例如，A或S)；(9) 在胺基酸位置86處(例如，R或S)；(10) 在胺基酸位置87處(例如，A或P)；(11) 在胺基酸位置92處(例如，M或V)；或(12) 在胺基酸位置121處(例如，Q或L)；其中該等胺基酸位置係基於SEQ ID NO: 306。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb或包含抗LAG-3 sdAb之抗LAG-3構築體，其與任一本文所述抗LAG-3 sdAb競爭性地特異性結合至LAG-3。在一些實施例中，競爭性結合可使用ELISA分析來測定。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb (或包含抗LAG-3 sdAb之抗LAG-3構築體)，其與包含SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之抗LAG-3 sdAb競爭性地特異性結合至LAG-3。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb (或包含抗LAG-3 sdAb之抗LAG-3構築體)，其與包含以下之抗LAG-3 sdAb競爭性地特異性結合至LAG-3：包含SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，提供抗LAG-3 sdAb (或包含抗LAG-3 sdAb之抗LAG-3構築體)，其與表11之任一抗LAG-3 sdAb競爭性地特異性結合至LAG-3。在一些實施例中，競爭性抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M (諸如約10-8 M至約10-12 M或約10-9 M至約10-11 M)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。在一些實施例中，競爭性抗LAG-3 sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。 單一結構域抗體
在一些實施例中，抗LAG-3構築體係單一結構域抗體。例示性sdAb包括(但不限於)來自僅重鏈抗體之重鏈可變結構域(例如，駱駝科(Camelidae )中之VH H (重鏈抗體之重鏈可變結構域)或軟骨魚類中之VNAR (鯊魚新抗原受體之可變結構域))、天然不含輕鏈之結合分子、源自習用4鏈抗體之單一結構域(諸如VH 或VL )、人類化僅重鏈抗體、由表現人類重鏈區段之基因轉殖小鼠或大鼠產生之人類單一結構域抗體及除源自抗體之彼等結構域及單一結構域支架以外之經改造之結構域及單一結構域支架。sdAb可源自任何物種，包括(但不限於)小鼠、大鼠、人類、駱駝、駱馬、七鰓鰻、魚、鯊魚、山羊、兔及牛。本文所涵蓋之sdAb亦包括來自除駱駝科及鯊魚以外之物種之天然sdAb分子。
在一些實施例中，sdAb源自稱為不含輕鏈之重鏈抗體(在本文中亦稱為「僅重鏈抗體」或「HCAb」)之天然單一結構域抗原結合分子。此等單一結構域分子揭示於(例如) WO 94/04678及Hamers-Casterman, C.等人(1993)Nature 363:446-448中。出於清晰之原因，源自天然不含輕鏈之重鏈分子之可變結構域在本文中稱為VH H以使其與四鏈免疫球蛋白之習用VH 區分。此一VH H分子可源自駱駝科物種中產生之抗體，例如駱駝、駱馬、瘦駝、單峰駱駝、羊駝及原駝。除駱駝科以外之其他物種亦可產生天然不含輕鏈之重鏈分子，且此等VH H係在本申請案之範圍內。
在一些實施例中，sdAb源自軟骨魚類中所發現之免疫球蛋白之可變區。舉例而言，sdAb可源自在鯊魚血清中發現之稱為新穎抗原受體(NAR)之免疫球蛋白同型。產生源自NAR可變區之單一結構域分子(「IgNAR」)之方法闡述於WO 03/014161及Streltsov (2005)Protein Sci. 14:2901-2909中。
在一些實施例中，sdAb係重組、CDR移植、人類化、駱駝化、去免疫化及/或活體外產生的(例如，藉由噬菌體展示選擇)。在一些實施例中，框架區之胺基酸序列可藉由框架區中特定胺基酸殘基之「駱駝化」來改變。駱駝化係指藉由用在重鏈抗體之VH H結構域中之一或多個相應位置處出現之胺基酸殘基中之一或多者替換或取代來自習用4鏈抗體之(天然)VH 結構域之胺基酸序列中之一或多個胺基酸殘基。此駱駝化可以本身已知之方式來實施，熟習此項技術者例如基於本文中之進一步闡述將明瞭該方式。此「駱駝化」取代較佳在形成及/或存在於VH -VL 界面之胺基酸位置處及/或在如本文所定義之所謂的駱駝科標誌殘基處插入(例如，參見WO 94/04678，Davies及Riechmann FEBS Letters 339: 285-290, 1994；Davies及Riechmann Protein Engineering 9 (6): 531-537, 1996；Riechmann J. Mol. Biol. 259: 957-969, 1996；及Riechmann及Muyldermans J. Immunol. Meth. 231: 25-38, 1999)。
在一些實施例中，sdAb係由表現人類重鏈區段之基因轉殖小鼠或大鼠產生之人類sdAb。例如，參見US20090307787A1、美國專利第8,754,287號、US20150289489A1、US20100122358A1及WO2004049794。在一些實施例中，sdAb係親和力成熟的。
在一些實施例中，針對特定抗原或靶標之天然VH H結構域可自駱駝科動物VH H序列之(原初或免疫)文庫獲得。此等方法可涉及或可不涉及使用該抗原或靶標或其至少一部分、片段、抗原性決定子或抗原決定基，使用一或多種本身已知之篩選技術篩選此一文庫。此等文庫及技術例如闡述於WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020及WO 03/035694中。或者，可使用源自(原初或免疫) VH H文庫之經改良的合成或半合成文庫，諸如藉由諸如如(例如) WO 00/43507中所闡述之隨機誘變及/或CDR改組等技術自(原初或免疫) VH H文庫獲得之VH H文庫。
在一些實施例中，sdAb係自習用4鏈抗體產生。例如，參見EP 0 368 684、Ward等人(Nature 1989年10月12日; 341 (6242): 544-6)、Holt等人，Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490、WO 06/030220及WO 06/003388。
由於sdAb之獨特性質，因此使用VH H結構域作為單一抗原結合蛋白或作為抗原結合結構域(亦即作為較大蛋白質或多肽之一部分)提供多種優於習用VH 及VL 、scFv及習用抗體片段(諸如Fab或(Fab’)2 )之顯著優點：1) 僅需要單一結構域以高親和力結合抗原，從而使得既不需要具有第二結構域，亦不需要確保該兩個結構域以正確空間構象及構形存在(例如不需要在摺疊期間將重鏈及輕鏈配對，不需要使用諸如對於scFv之經特別設計之連接體)；2) VH H結構域及其他sdAb可自單一基因表現且不需要轉譯後摺疊或修飾；3) VH H結構域及其他sdAb可容易地改造成多價及/或多特異性形式(諸如本申請案中所闡述之彼等形式)；4) VH H結構域及其他sdAb高度可溶且不具有聚集之趨勢(正如Ward等人，Nature. 1989年10月12日;341(6242):544-6)所闡述之小鼠源「dAb」；5) VH H結構域及其他sdAb針對熱、pH、蛋白酶及其他變性劑或條件高度穩定；6) VH H結構域及其他sdAb易於製備且花費相對較少(即使在較大之生產規模上)，諸如使用微生物醱酵，此乃因不需要使用哺乳動物表現系統(產生(例如)習用抗體片段所需)；7) 與習用4鏈抗體及其抗原結合片段相比，VH H結構域及其他sdAb相對較小(大約15 kDa，或較習用IgG小10倍)，因此對諸如實體腫瘤及其他緻密組織具有(更)高之組織滲透能力；及8) VH H結構域及其他sdAb可展現所謂的「空腔結合性質」(由於與習用VH 結構域相比其延伸之CDR3環)，且因此可及習用4鏈抗體及其抗原結合片段不可及之靶標及抗原決定基，例如，已顯示VH H結構域及其他sdAb可抑制酶(例如，參見WO1997049805；Transue等人，Proteins. 1998年9月1日;32(4):515-22；Lauwereys等人，EMBO J. 1998年7月1日;17(13):3512-20)。 LAG-3
包含503個胺基酸之淋巴球活化蛋白3 (LAG-3)屬於Ig超家族且含有4個細胞外Ig樣結構域(命名為D1至D4)。LAG-3係在經活化T細胞、NK細胞、B細胞及漿細胞樣樹突細胞上表現之細胞表面蛋白，且在該等淋巴球亞群之功能中起作用，該作用係重要的但尚未完全理解。
術語「淋巴球活化蛋白3」、「LAG-3」、「LAG-3抗原」及「LAG-3抗原決定基」可互換使用，且包括人類LAG-3之變異體、同種型、物種同系物及與LAG-3具有至少一個共同抗原決定基之類似物。
人類LAG-3之例示性胺基酸序列以Genbank登錄號P18627揭示。在一些實施例中，人類LAG-3可在胺基酸序列上與Genbank登錄號P18627之人類LAG-3至少約90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，人類LAG-3序列與Genbank登錄號P18627之人類LAG-3具有不超過約10個胺基酸之差異。在一些實施例中，人類LAG-3可展示與Genbank登錄號P18627之人類LAG-3不超過5個、4個、3個、2個或1個胺基酸之差異。在一些實施例中，人類LAG-3序列可因(例如)具有保守突變或具有非保守區中之突變而與Genbank登錄號P18627之人類LAG-3不同，且LAG-3具有與Genbank登錄號P18627之人類LAG-3實質上相同之生物學功能。
在一些實施例中，本文所述之抗LAG-3 sdAb特異性識別與Genbank登錄號P18627之人類LAG-3具有至少約90%胺基酸序列一致性之LAG-3多肽。在一些實施例中，本文所述之抗LAG-3 sdAb特異性識別包含SEQ ID NO: 350或351之胺基酸序列之LAG-3多肽。
在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb可與來自除人類以外之物種之LAG-3或在結構上與人類LAG-3有關之其他蛋白質(例如，人類LAG-3同系物)交叉反應。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb對人類LAG-3具有完全特異性且不展現物種或其他類型之交叉反應性。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb特異性識別人類LAG-3之可溶同種型。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb特異性識別人類LAG-3之膜結合同種型(例如，SEQ ID NO: 350)。
在一些實施例中，本文所述之抗LAG-3 sdAb特異性識別LAG-3之細胞外結構域(ECD)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb特異性識別LAG-3 ECD之N末端部分。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb特異性識別LAG-3 ECD之C末端部分。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb特異性識別LAG-3 ECD之中間部分。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb特異性識別之LAG-3之ECD在胺基酸序列上與Genbank登錄號P18627之人類LAG-3之ECD至少約95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb特異性識別之LAG-3之ECD在胺基酸序列上與Genbank登錄號P18627之人類LAG-3之ECD 100%一致。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb特異性識別包含SEQ ID NO: 351之胺基酸序列之LAG-3多肽。 抗體親和力
抗體或抗原結合結構域之結合特異性可藉由此項技術中已知之方法以實驗方式測定。此等方法包含(但不限於)西方墨點法、ELISA測試、RIA測試、ECL測試、IRMA測試、EIA測試、BIACORETM 測試及肽掃描。
在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M、約10-7 M至約10-8 M、約10-8 M至約10-9 M、約10-9 M至約10-10 M、約10-10 M至約10-11 M、約10-11 M至約10-12 M、約10-7 M至約10-12 M、約10-8 M至約10-12 M、約10-9 M至約10-12 M、約10-10 M至約10-12 M、約10-7 M至約10-11 M、約10-8 M至約10-11 M、約10-9 M至約10-11 M、約10-7 M至約10-10 M、約10-8 M至約10-10 M或約10-7 M至約10-9 M。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之Kd 強於約10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M或10-12 M中之任一者。在一些實施例中，LAG-3係人類LAG-3。在一些實施例中，LAG-3係食蟹猴LAG-3。在一些實施例中，LAG-3係LAG-3之細胞外結構域。
在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之Kon 為約103 M-1 s-1 至約108 M-1 s-1 、約103 M-1 s-1 至約104 M-1 s-1 、約104 M-1 s-1 至約105 M-1 s-1 、約105 M-1 s-1 至約106 M-1 s-1 、約106 M-1 s-1 至約107 M-1 s-1 或約107 M-1 s-1 至約108 M-1 s-1 。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之Kon 為約103 M-1 s-1 至約105 M-1 s-1 、約104 M-1 s-1 至約106 M-1 s-1 、約105 M-1 s-1 至約107 M-1 s-1 、約106 M-1 s-1 至約108 M-1 s-1 、約104 M-1 s-1 至約107 M-1 s-1 或約105 M-1 s-1 至約108 M-1 s-1 。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之Kon 不超過約103 M-1 s-1 、104 M-1 s-1 、105 M-1 s-1 、106 M-1 s-1 、107 M-1 s-1 或108 M-1 s-1 中之任一者。
在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之Koff 為約1 s-1 至約10-6 s-1 、約1 s-1 至約10-2 s-1 、約10-2 s-1 至約10-3 s-1 、約10-3 s-1 至約10-4 s-1 、約10-4 s-1 至約10-5 s-1 、約10-5 s-1 至約10-6 s-1 、約1 s-1 至約10-5 s-1 、約10-2 s-1 至約10-6 s-1 、約10-3 s-1 至約10-6 s-1 、約10-4 s-1 至約10-6 s-1 、約10-2 s-1 至約10-5 s-1 或約10-3 s-1 至約10-5 s-1 。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之Koff 為至少約1 s-1 、10-2 s-1 、10-3 s-1 、10-4 s-1 、10-5 s-1 或10-6 s-1 中之任一者。
在一些實施例中，在放大的發光鄰近均相分析(AlphaLISA)中，抗LAG-3 sdAb之EC50 小於10 nM。在一些實施例中，在藉由FACS分析之對配位體結合之抑制(競爭結合分析)或基於細胞之細胞介素釋放分析中，抗LAG-3 sdAb之EC50 小於500 nM。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb之EC50 小於1 nM (諸如約0.001 nM至約0.01 nM、約0.01 nM至約0.1 nM、約0.1 nM至約1 nM等)、約1 nM至約10 nM、約1 nM至約5 nM、約5 nM至約10 nM、約10 nM至約50 nM、約50 nM至約100 nM、約100 nM至約200 nM、約200 nM至約300 nM、約300 nM至約400 nM或約400 nM至約500 nM。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與LAG-3之間結合之EC50 不超過約0.1 nM、1 nM、5 nM、10 nM、50 nM、10 nM、100 nM、200 nM或500 nM中之任一者。 嵌合或人類化抗體
在一些實施例中，本文所提供之抗LAG-3 sdAb係嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於(例如)美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6851-6855 (1984))中。在一些實施例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，源自駱駝科動物物種(諸如駱馬)之可變區)及人類恆定區。在一些實施例中，嵌合抗體係其中類別或亞類已自親代抗體之類別或亞類發生變化之「類別切換」抗體。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在一些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，使非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親代非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包含一或多個可變結構域，其中HVR、例如CDR (或其部分)源自非人類抗體，且FR (或其部分)源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，HVR殘基所源自之抗體)之相應殘基取代以(例如)恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法綜述於(例如) Almagro及Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)中，且進一步闡述於(例如) Riechmann等人，Nature 332:323-329 (1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；美國專利第5, 821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36:25-34 (2005) (描述SDR (a-CDR)移植)；Padlan，Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (描述「表面重整」)；Dall’Acqua等人，Methods 36:43-60 (2005) (描述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36:61-68 (2005)及Klimka等人，Br. J. Cancer , 83:252-260 (2000) (描述FR改組之「引導選擇」方法)中。
可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(例如，參見Sims等人，J. Immunol. 151:2296 (1993))；源自輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之人類抗體共有序列之框架區(例如，參見Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 89:4285 (1992)；及Presta等人，J. Immunol. , 151:2623 (1993))；人類成熟(體細胞突變)框架區或人類生殖系框架區(例如，參見Almagro及Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))；及源自篩選FR文庫之框架區(例如，參見Baca等人，J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及Rosok等人，J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996))。
在一些實施例中，在不減少結構域對抗原之天然親和力且同時降低其對於異源物種之免疫原性之情形下修飾抗LAG-3 sdAb，諸如人類化。舉例而言，可確定駱馬抗體之抗體可變結構域(VH H)之胺基酸殘基，且用如在人類共有序列中所發現之其人類對應體替換例如框架區中之駱駝科動物胺基酸中之一或多者，而該多肽不失去其典型特徵，亦即人類化不顯著影響所得多肽之抗原結合能力。駱駝科動物單一結構域抗體之人類化需要在單一多肽鏈中引入且誘變有限量之胺基酸。此與scFv、Fab'、(Fab')2 及IgG之人類化相反，後者需要在兩條鏈(輕鏈及重鏈)中引入胺基酸變化且保留兩條鏈之組裝。
包含VH H結構域之sdAb可經人類化以具有人類樣序列。在一些實施例中，本文所用VH H結構域之FR區包含與人類VH框架區至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或更大胺基酸序列同源性中之任一者。一類例示性人類化VH H結構域之特徵在於，根據Kabat編號，VH H在位置45處攜帶來自由以下組成之群之胺基酸：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺或麩醯胺酸(例如L45)，且在位置103處攜帶色胺酸。因此，屬於此類別之多肽顯示較高之與人類VH框架區胺基酸序列之同源性，且該等多肽可直接投與人類而不預期自其產生不期望之免疫反應，且不具有進一步人類化之負擔。
另一類例示性人類化駱駝科動物單一結構域抗體已闡述於WO 03/035694中，且含有通常在人類來源或來自其他物種之習用抗體中發現之疏水性FR2殘基，但藉由位置103上之帶電精胺酸殘基補償此親水性損失，該帶電精胺酸殘基取代來自雙鏈抗體之VH 中所存在之保守色胺酸殘基。因此，屬於該兩種類別之肽顯示較高之與人類VH 框架區之胺基酸序列同源性，且該等肽可直接投與人類而不預期自其產生不期望之免疫反應，且不具有進一步人類化之負擔。 人類抗體
在一些實施例中，本文所提供之抗LAG-3 sdAb係人類抗體(稱為人類結構域抗體或人類DAb)。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術來產生。人類抗體大致闡述於van Dijk及van de Winkel，Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)、Lonberg，Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)及Chen，Mol. Immunol. 47(4):912-21 (2010)中。能夠產生完全人類單一結構域抗體(或DAb)之基因轉殖小鼠或大鼠為此項技術中所已知。例如，參見US20090307787A1、美國專利第8,754,287號、US20150289489A1、US20100122358A1及WO2004049794。
可藉由向基因轉殖動物投與免疫原來製備人類抗體(例如，人類DAb)，該基因轉殖動物已經改良以因應抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體。此等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，該等基因座可替代內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此等基因轉殖小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已不活化。關於自基因轉殖動物獲得人類抗體之方法之綜述，參見Lonberg，Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。亦參見(例如)描述XENOMOUSETM 技術之美國專利第6,075,181號及第6,150,584號；描述HUMAB® 技術之美國專利第5,770,429號；描述K-M MOUSE® 技術之美國專利第7,041,870號及描述VELOCIMOUSE® 技術之美國專利申請公開案第US 2007/0061900號)。可(例如)藉由與不同人類恆定區進行組合來進一步修飾來自由此等動物產生之完整抗體之人類可變區。
人類抗體(例如，人類DAb)亦可藉由基於融合瘤之方法製得。已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株(例如，參見KozborJ. Immunol. , 133: 3001 (1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications ，第51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及Boerner等人，J. Immunol. , 147: 86 (1991))。經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦闡述於Li等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 103:3557-3562 (2006)中。其他方法包括(例如)美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni，Xiandai Mianyixue , 26(4):265-268 (2006) (描述人類-人類融合瘤)中所闡述之彼等方法。人類融合瘤技術(三源融合瘤技術)亦闡述於Vollmers及Brandlein，Histology and Histopathology , 20(3):927-937 (2005)及Vollmers及Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology , 27(3):185-91 (2005)中。
亦可藉由分離選自人類源噬菌體展示文庫之Fv純系可變結構域序列來產生人類抗體(例如，人類DAb)。接著可將此等可變結構域序列與期望之人類恆定結構域組合。自抗體文庫選擇人類抗體之技術闡述於下文中。
獲得針對特定抗原或靶標之VH H序列之一種技術涉及適宜地對能夠表現重鏈抗體之基因轉殖哺乳動物進行免疫(亦即以產生針對該抗原或靶標之免疫反應及/或重鏈抗體)，自該基因轉殖哺乳動物獲得適宜生物樣品(諸如血液樣品、血清樣品或B細胞樣品)，該生物樣品含有該等VH H序列(編碼該等VH H序列之核酸序列)，且接著自該樣品開始，使用本身已知之任何適宜技術(諸如任一本文所述方法或融合瘤技術)產生針對該抗原或靶標之VH H序列。舉例而言，出於此目的，可使用表現重鏈抗體之小鼠及WO 02/085945、WO 04/049794及WO 06/008548及Janssens等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006年10月10日; 103(41):15130-5中所闡述之其他方法及技術。舉例而言，此等表現重鏈抗體之小鼠可表現具有任何適宜(單一)可變結構域之重鏈抗體，諸如來自天然來源之(單一)可變結構域(例如人類(單一)可變結構域、駱駝科動物(單一)可變結構域或鯊魚(單一)可變結構域)，以及例如合成或半合成(單一)可變結構域。 文庫源抗體
本申請案之抗體可藉由篩選組合文庫中具有一或多種期望活性之抗體來分離。舉例而言，此項技術中已知用於產生噬菌體展示文庫及篩選此等文庫中具有期望結合特性之抗體之多種方法。此等方法綜述於(例如) Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien等人編輯，Human Press, Totowa, NJ, 2001)中，且進一步闡述於(例如) McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature 352: 624-628 (1991)；Marks等人，J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo編輯，Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu等人，J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等人，J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及Lee等人，J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)中。已闡述用於構築單一結構域抗體文庫之方法，例如參見美國專利第7371849號。
在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈式反應(PCR)來單獨選殖VH 及VL 基因之譜且將其隨機重組於噬菌體文庫中，然後可如Winter等人，Ann. Rev. Immunol. , 12: 433-455 (1994)中所闡述自該文庫篩選抗原結合噬菌體。可藉由PCR類似地選殖VH H基因譜，隨機重組於噬菌體文庫中，且篩選抗原結合噬菌體。噬菌體通常以scFv片段或Fab片段之形式展示抗體片段。來自經免疫來源之文庫無需構築融合瘤即可提供針對免疫原之高親和力抗體。或者，如Griffiths等人，EMBO J, 12: 725-734 (1993)中所闡述在不進行任何免疫之情況下可選殖天然譜(例如，自人類)以提供針對多種非自體抗原以及自體抗原之抗體之單一來源。最終，亦可如Hoogenboom及Winter，J. Mol. Biol. , 227: 381-388 (1992)中所闡述藉由以下方式以合成方式製得天然文庫：選殖來自幹細胞之未重排V-基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高度可變CDR3區並在活體外完成重排。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括(例如)：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段視為本文中之人類抗體或人類抗體片段。 生物學活性
本文所述之抗LAG-3 sdAb之生物學活性可藉由量測其半最大有效濃度(EC50 ，其為抗體與其靶標結合之有效性之量度)或半最大抑制濃度(IC50 ，其為抗體抑制特定生物或生物化學功能(諸如抑制LAG-3與II類MHC分子之間的結合)之有效性之量度)來測定。舉例而言，在此EC50 可用於指示在細胞表面上結合50% LAG-3所需抗LAG-3 sdAb之有效濃度，IC50 可用於指示在活體外中和50%之LAG-3生物活性所需抗LAG-3 sdAb之有效濃度。EC50 亦代表在活體內獲得50%之最大效應所需之血漿濃度。EC50 或IC50 可藉由此項技術中已知之分析來量測，例如諸如以下之生物分析：FACS結合分析、藉由FACS分析之對配位體結合之抑制(競爭結合分析)、基於細胞之細胞介素釋放分析或放大的發光鄰近均相分析(AlphaLISA)。
舉例而言，可使用流式細胞術研究配位體結合之阻斷(亦參見實例1)。可將表現人類LAG-3之CHO細胞自貼壁培養瓶解離且與不同濃度之測試用抗LAG-3 sdAb及恆定濃度之經標記II類MHC蛋白混合。可採用抗LAG-3抗體陽性對照，諸如BMS-986016 (Bristol-Myers Squibb)。使混合物在室溫下平衡30分鐘，用FACS緩衝液(含有1% BSA之PBS)洗滌三次。接著，添加特異性識別恆定濃度之經標記II類MHC之抗體且在室溫下培育15分鐘。將細胞用FACS緩衝液洗滌且藉由流式細胞術進行分析。可利用Prism (GraphPad Software, San Diego, CA)使用非線性回歸分析數據以計算IC50 。來自競爭分析之結果可展示抗LAG-3 sdAb抑制II類MHC與LAG-3之間的相互作用之能力。
抗LAG-3 sdAb之生物學活性可使用LAG-3阻斷分析經由螢光素酶報導基因來測試(亦參見實例4)。使用Promega LAG-3阻斷報導基因分析套組(Promega，目錄號CS194819)，根據供應商之方案來實施LAG-3阻斷報導基因分析。簡言之，可將解凍使用之MHC-II APC細胞(包括TCR活化抗原)平鋪隔夜，且接著與抗LAG-3抗體或抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白之連續稀釋液一起培育，之後添加解凍使用之LAG-3效應細胞。在37℃及5% CO2 下誘導6小時後，可添加BIO-GLO™螢光素酶分析試劑，且可測定發光。結果可展示抗LAG-3 sdAb抑制II類MHC與LAG-3之間的相互作用之能力。
在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb阻斷或拮抗由LAG-3受體轉導之信號。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb可結合至LAG-3上之抗原決定基以抑制LAG-3與II類MHC分子相互作用。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb可將LAG-3與II類MHC分子之結合降低至少以下中之任一者：約5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%或99.9%。(II) 融合構築體
本申請案進一步提供抗LAG-3融合構築體，其包含任一本文所述抗LAG-3 sdAb及第二多肽(諸如第二抗體或其抗原結合片段)或免疫球蛋白之Fc片段。在一些實施例中，抗LAG-3構築體除抗LAG-3 sdAb以外，亦包含兩種或更多種多肽。該(等)額外多肽可改變或可不改變或以其他方式影響抗LAG-3 sdAb之生物學性質，且可向抗LAG-3 sdAb添加或可不添加其他功能。在一些實施例中，第二多肽賦予抗LAG-3 sdAb一或多種期望性質或功能。
在一些實施例中，抗LAG-3構築體包含特異性識別第二抗原決定基之第二抗體或其抗原結合片段(諸如sdAb、scFv、Fab、全長抗體等)。在一些實施例中，第二抗原決定基係來自LAG-3。在一些實施例中，第二抗原決定基不係來自LAG-3。在一些實施例中，第二抗體與本文所述之抗LAG-3 sdAb特異性識別LAG-3上之相同抗原決定基。在一些實施例中，第二抗體與本文所述之抗LAG-3 sdAb特異性識別LAG-3上之不同抗原決定基。
在一些實施例中，提供包含複數(諸如2、3、4或更多)個本文所述之抗LAG-3 sdAb之抗LAG-3構築體。在一些實施例中，該複數個抗LAG-3 sdAb經由連接體(諸如肽連接體)彼此融合。該複數個抗LAG-3 sdAb可相同或不同。
在一些實施例中，與單獨之抗LAG-3 sdAb相比，抗LAG-3構築體包含增強半衰期、溶解性及/或吸收、降低免疫原性或毒性、消除或減弱不期望之副作用、賦予抗LAG-3構築體其他有利性質及/或減少抗LAG-3構築體之其他不期望性質之第二多肽。此等多肽之一些非限制性實例包括血清蛋白質，諸如人類血清白蛋白(HSA；參見(例如) WO 00/27435)或半抗原性分子(例如由循環抗體識別之半抗原，參見(例如) WO 98/22141)。已證明將免疫球蛋白之片段(諸如VH 結構域)連接至血清白蛋白或其片段可延長抗體半衰期(參見(例如) WO 00/27435及WO 01/077137)。因此，在一些實施例中，抗LAG-3構築體包含視情況經由適宜連接體(諸如肽連接體)與血清白蛋白或其片段融合之抗LAG-3 sdAb。在一些實施例中，血清白蛋白至少包含結構域III (參見PCT/EP2007/002817)。抗LAG-3 sdAb-HSA融合蛋白可為任一適宜形式，諸如(sdAb)n -HSA (n為至少1之整數)、sdAb-HSA-sdAb等。 抗 LAG-3 僅重鏈抗體 (HCAb)
在一些實施例中，抗LAG-3構築體係包含本文所述之抗LAG-3 sdAb之僅重鏈抗體(HCAb)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb與一或多個CH 2及/或CH 3結構域(例如，Fc片段)融合。在一些實施例中，CH 2及/或CH 3結構域源自人類免疫球蛋白。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb經由肽連接體與CH 2及/或CH 3結構域融合。CH 2及/或CH 3結構域可延長活體內抗LAG-3構築體之半衰期。
因此，在一些實施例中，提供經分離之抗LAG-3 HCAb，其包含與免疫球蛋白(諸如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)之Fc片段融合之本文所述之抗LAG-3 sdAb。在一些實施例中，抗LAG-3 HCAb包含IgG (諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)之Fc片段。在一些實施例中，Fc片段係人類Fc，諸如人類IgG1 (hIgG1) Fc、hIgG2 Fc或hIgG4 Fc。在一些實施例中，Fc片段係無效應物的，具有降低、最小化或消除之抗體效應功能，諸如ADCC、CDC及/或ADCP (抗體依賴性細胞吞噬作用)。在一些實施例中，無效應物Fc在CH 2區中包含N297A或DANA突變(D265A+N297A)。在一些實施例中，無效應物Fc包含K322A及L234A/L235A (LALA)突變。在一些實施例中，Fc片段係無效應物IgG1 Fc，諸如無效應物hIgG1 Fc。在一些實施例中，Fc片段係人類IgG4 Fc (S228P)。在一些實施例中，抗LAG-3 HCAb係單體的。在一些實施例中，抗LAG-3 HCAb係二聚體的。在一些實施例中，抗LAG-3 HCAb係多特異性及多價的(諸如雙特異性及二價)，例如包含兩種或更多種不同的本文所述之抗LAG-3 sdAb。在一些實施例中，抗LAG-3 HCAb係單特異性及多價的(例如，二價)，例如包含相同抗LAG-3 sdAb之兩個或更多個拷貝。
在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb及Fc片段經由肽連接體彼此融合。在一些實施例中，該肽連接體係人類IgG1鉸鏈(SEQ ID NO: 352)。在一些實施例中，該肽連接體係突變之人類IgG1鉸鏈(SEQ ID NO: 353)。在一些實施例中，該肽連接體係人類IgG4鉸鏈。在一些實施例中，該肽連接體係hIgG2鉸鏈。
因此，在一些實施例中，提供包含特異性識別LAG-3之sdAb之經分離抗LAG-3 HCAb，其中該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體，且其中該抗LAG-3 sdAb與免疫球蛋白之Fc片段融合。在一些實施例中，提供包含特異性識別LAG-3之sdAb之抗LAG-3 HCAb，其中該sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3，且其中該抗LAG-3 sdAb與免疫球蛋白之Fc片段融合。在一些實施例中，提供包含特異性識別LAG-3之sdAb之經分離抗LAG-3 HCAb，其中該sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域或其與SEQ ID NO: 274-311中之任一者具有至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之變異體，且其中該抗LAG-3 sdAb與免疫球蛋白之Fc片段融合。在一些實施例中，提供包含特異性識別LAG-3之sdAb之經分離抗LAG-3 HCAb，其中該sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域，且其中該抗LAG-3 sdAb與免疫球蛋白之Fc片段融合。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb經由肽連接體與Fc片段融合。在一些實施例中，抗LAG-3 HCAb係單體的。在一些實施例中，Fc片段係人類IgG1 Fc、無效應物人類IgG1 Fc、hIgG2 Fc、人類IgG4 Fc或hIgG4 Fc (S228P)。
在一些實施例中，提供包含兩種特異性識別LAG-3之sdAb之經分離抗LAG-3 HCAb，其中每一抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體，且其中每一抗LAG-3 sdAb之C末端與免疫球蛋白之Fc片段之N末端融合。在一些實施例中，提供包含兩種特異性識別LAG-3之sdAb之經分離抗LAG-3 HCAb，其中每一抗LAG-3 sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3，且其中每一抗LAG-3 sdAb之C末端與免疫球蛋白之Fc片段之N末端融合。在一些實施例中，該兩種抗LAG-3 sdAb係相同的。在一些實施例中，該兩種抗LAG-3 sdAb係不同的。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb經由肽連接體與Fc片段融合。在一些實施例中，Fc片段係人類IgG1 Fc、無效應物人類IgG1 Fc、hIgG2 Fc、人類IgG4 Fc或hIgG4 Fc (S228P)。
在一些實施例中，提供經分離之抗LAG-3 HCAb，其包含SEQ ID NO: 312-349中任一者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO: 312-349中之任一者具有至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之變異體。在一些實施例中，提供多肽，其包含SEQ ID NO: 312-349中任一者之胺基酸序列。
亦提供經分離之抗LAG-3 HCAb，其與本文所述之經分離之抗LAG-3 HCAb、抗LAG-3 sdAb或抗LAG-3構築體中之任一者競爭性地特異性結合至LAG-3。 多價及 / 或多特異性構築體
本申請案提供多價及多特異性之抗LAG-3構築體。多特異性抗LAG-3構築體在本文中亦稱為「抗LAG-3多特異性抗原結合蛋白(MABP)」。在一些實施例中，抗LAG-3構築體係雙特異性的，其在本文中亦稱為「抗LAG-3雙特異性抗原結合蛋白(BABP)」。
在一些實施例中，提供經分離之抗LAG-3構築體(例如，MABP或BABP)，其包含：(a) 第一抗原結合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體，及(b) 第二抗原結合部分，其特異性結合第二抗原決定基(例如，免疫檢查點分子，諸如PD-1)，其中該第一抗原結合部分與該第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，提供經分離之抗LAG-3構築體(例如，MABP或BABP)，其包含：(a) 第一抗原結合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3，及(b) 第二抗原結合部分，其特異性結合第二抗原決定基(例如，免疫檢查點分子，諸如PD-1)，其中該第一抗原結合部分與該第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，第二抗原結合部分特異性識別免疫檢查點分子，諸如PD-1、4-1BB、PD-L1、TIM-3、TIGIT、CTLA-4、VISTA、B7-1、B7-H3、CD47、OX40或GITR。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含含有VH 之重鏈及含有VL 之輕鏈。在一些實施例中，第一抗原結合部分在重鏈之N末端、輕鏈之N末端、Fc區之N末端、重鏈之C末端或輕鏈之C末端與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含Fab或scFv。在一些實施例中，第一抗原結合部分在Fab或scFv之C末端與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含全長4鏈抗體。在一些實施例中，第一抗原結合部分經由肽連接體與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，該肽連接體長不超過約30個(諸如不超過約25個、20個或15個中之任一者)胺基酸。在一些實施例中，該肽連接體包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb之N末端或C末端與肽序列融合。在一些實施例中，該肽序列包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合片段包含Fc區，諸如IgG1 Fc、無效應物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc (S228P)。
在一些實施例中，抗LAG-3構築體係抗LAG-3 MABP，其包含特異性識別免疫檢查點分子之第二抗原結合部分。如本文所用，術語「免疫檢查點分子」係指免疫系統中通常用於維持自身耐受性或調節生理免疫反應之持續時間及幅度以使附帶組織損害最小化之分子。免疫檢查點抑制劑可藉由刺激刺激性檢查點分子之活性或抑制路徑中抑制性檢查點分子之活性來抑制免疫系統檢查點。刺激性檢查點分子係刺激或正調控免疫系統之分子，諸如蛋白質。抑制性檢查點分子係抑制或負調控免疫系統之分子，諸如蛋白質。免疫系統檢查點分子包括(但不限於)細胞毒性T-淋巴球抗原4 (CTLA-4)、程式性細胞死亡1蛋白(PD-1)、程式性細胞死亡1配位體1 (PD-L1)、程式性細胞死亡1配位體2 (PD-L2)、淋巴球活化基因3 (LAG3)、B7-1、B7-H3、T細胞膜蛋白3 (TIM3)、B淋巴球及T淋巴球弱化因子(BTLA)、具有Ig及ITIM結構域之T細胞免疫受體(TIGIT)、含有V-結構域免疫球蛋白(Ig)之T細胞活化阻抑物(VISTA)、腫瘤壞死因子受體超家族成員4 (TNFRSF4，亦稱為CD134或OX40)、腫瘤壞死因子受體超家族成員9 (TNFRSF9，亦稱為4-1BB或CD137)、分化簇47 (CD47或IAP)及糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子受體(GITR)。針對免疫檢查點分子之任一已知抗體均可用於抗LAG-3 MABP中。
在一些實施例中，提供經分離之抗LAG-3構築體(例如，MABP或BABP)，其包含：(a) 第一抗原結合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體，及(b) 第二抗原結合部分，其特異性結合免疫檢查點分子(例如，PD-1)，其中該第一抗原結合部分與該第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，提供經分離之抗LAG-3構築體(例如，MABP或BABP)，其包含：(a) 第一抗原結合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3，及(b) 第二抗原結合部分，其特異性結合免疫檢查點分子(例如，PD-1)，其中該第一抗原結合部分與該第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含含有VH 之重鏈及含有VL 之輕鏈。在一些實施例中，第一抗原結合部分在重鏈之N末端、輕鏈之N末端、Fc區之N末端、重鏈之C末端或輕鏈之C末端與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含Fab或scFv。在一些實施例中，第一抗原結合部分在Fab或scFv之C末端與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含全長4鏈抗體。在一些實施例中，第一抗原結合部分與第二抗原結合部分化學融合。在一些實施例中，第一抗原結合部分經由肽連接體與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，該肽連接體長不超過約30個(諸如不超過約25個、20個或15個中之任一者)胺基酸。在一些實施例中，該肽連接體包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb之N末端或C末端與肽序列融合。在一些實施例中，該肽序列包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合片段包含Fc區，諸如IgG1 Fc、無效應物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc (S228P)。
在一些實施例中，經分離之抗LAG-3構築體包含與第二抗體或其抗原結合片段融合之本文所述之抗LAG-3 sdAb。在一些實施例中，抗LAG-3構築體包含兩種或更多種與抗LAG-3 sdAb融合之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，第二抗體特異性識別除LAG-3以外之抗原或LAG-3上之第二抗原決定基。在一些實施例中，第二抗體係全長抗體、Fab、Fab’、(Fab’)2 、Fv、scFv、scFv-scFv、微小抗體、雙鏈抗體或sdAb。在一些實施例中，第二抗體包含重鏈可變結構域(VH )及輕鏈可變結構域(VL )。
在一些實施例中，抗LAG-3構築體係單特異性的。在一些實施例中，抗LAG-3構築體係多特異性的(諸如雙特異性的)。多特異性分子係對至少兩種不同抗原決定基具有結合特異性之分子(例如，對兩種抗原決定基具有結合特異性之雙特異性抗體)。亦涵蓋具有兩種以上化合價及/或特異性之多特異性分子。舉例而言，可製備三特異性抗體。Tutt等人，J. Immunol. 147: 60 (1991)。
在一些實施例中，抗LAG-3構築體係單價的。在一些實施例中，抗LAG-3構築體係多價的(例如，二價)及單特異性的。在一些實施例中，抗LAG-3構築體包含本文所述之抗LAG-3 sdAb及與該抗LAG-3 sdAb特異性識別相同LAG-3抗原決定基之第二抗體(諸如全長抗體、sdAb或包含VH 及VL 之抗原結合片段)。在一些實施例中，第二抗體包含與抗LAG-3 sdAb相同之CDR及/或相同之VH H。舉例而言，抗LAG-3構築體可包含兩種或更多種本文所述之抗LAG-3 sdAb，其中該兩種或更多種抗LAG-3 sdAb係相同的。在一些實施例中，該兩種或更多種抗LAG-3 sdAb經由肽連接體彼此融合。與本文所述之單一抗LAG-3 sdAb之親合力相比，包含兩種或更多種抗LAG-3 sdAb之單特異性或多特異性抗LAG-3構築體可具有增加之親合力。
在一些實施例中，抗LAG-3構築體係多價及多特異性的(例如，雙特異性的)。在一些實施例中，抗LAG-3構築體包含本文所述之抗LAG-3 sdAb及特異性識別除LAG-3以外之第二抗原或與抗LAG-3 sdAb所識別之不同LAG-3抗原決定基之第二抗體(諸如全長抗體、sdAb或包含VH 及VL 之抗原結合片段)。
製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello，Nature 305: 537 (1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J. 10: 3655 (1991))及「隆凸於孔洞中(knob-in-hole)」改造(例如，參見美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下方式來製備：改造用於製備抗體Fc-異源二聚分子之靜電牽引效應(WO 2009/089004A1)；使兩個或更多個抗體或片段交聯(例如，參見美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science , 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(例如，參見Kostelny等人，J. Immunol. , 148(5):1547-1553 (1992))；使用用於製備雙特異性抗體片段之「雙鏈抗體」技術(例如，參見Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv (scFv)二聚體(例如，參見Gruber等人，J. Immunol. , 152:5368 (1994))；及製備三特異性抗體(例如，如Tutt等人，J. Immunol. 147: 60 (1991)中所闡述)；及產生包含串聯單一結構域抗體之多肽(例如，參見美國專利申請案第20110028695號；及Conrath等人，J. Biol. Chem., 2001; 276(10):7346-50)。本文亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點之經改造抗體，包括「章魚抗體(Octopus antibody)」(例如，參見US 2006/0025576A1)。
在一些實施例中，提供經分離之抗LAG-3構築體，其包含與全長抗體或包含VH 及VL 之其抗原結合片段融合之本文所述之抗LAG-3 sdAb。該全長抗體或抗原結合片段識別除LAG-3以外之抗原或來自LAG-3之與抗LAG-3 sdAb所識別之抗原決定基不同之抗原決定基，藉此賦予擴大之靶向能力。由於sdAb之大小較小，因此在一些實施例中，與全長抗體或抗原結合片段組分之彼等分子量及藥物動力學性質相比，本文所述之抗LAG-3 MABP (例如，抗LAG-3 BABP)可具有類似之分子量及藥物動力學性質。舉例而言，可藉由將一或多種抗LAG-3 sdAb與具有經證實之臨床功效及安全性之單株抗體融合來設計抗LAG-3 MABP，以提供增加之臨床益處及合意之藥物動力學性質，而不阻礙多特異性構築體之可表現性。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb藉由肽連接體與全長抗體或抗原結合片段融合。
可採用本文所述之抗LAG-3 MABP (例如，抗LAG-3 BABP)靶向除LAG-3以外之多種疾病有關抗原決定基或抗原組合，諸如LAG-3與免疫檢查點分子、細胞表面抗原(諸如腫瘤抗原)或促發炎分子之組合，藉此提供可用於治療多種疾病及病狀(諸如癌症)之劑。抗LAG-3 MABP (例如，抗LAG-3 BABP)可具有任何形式，諸如PCT/CN2017/093644中所揭示之彼等形式，該文獻係以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一些實施例中，提供經分離之抗LAG-3構築體(例如，MABP或BABP)，其包含：(a) 第一抗原結合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體，及(b) 第二抗原結合部分，其包含VH 及VL ，其中該VH 及該VL 一起形成特異性結合第二抗原決定基(例如，免疫檢查點分子，諸如PD-1)之抗原結合位點，其中該第一抗原結合部分與該第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，提供經分離之抗LAG-3構築體(例如，MABP或BABP)，其包含：(a) 第一抗原結合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3，及(b) 第二抗原結合部分，其包含VH 及VL ，其中該VH 及該VL 一起形成特異性結合第二抗原決定基(例如，免疫檢查點分子，諸如PD-1)之抗原結合位點，其中該第一抗原結合部分與該第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，第二抗原決定基係來自免疫檢查點分子，諸如PD-1、4-1BB、PD-L1、TIM-3、TIGIT、CTLA-4、VISTA、B7-1、B7-H3、CD47、OX40或GITR。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含含有VH 之重鏈及含有VL 之輕鏈。在一些實施例中，第一抗原結合部分在重鏈之N末端、輕鏈之N末端、Fc區之N末端、重鏈之C末端或輕鏈之C末端與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含Fab或scFv。在一些實施例中，第一抗原結合部分在Fab或scFv之C末端與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含全長4鏈抗體。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含抗PD-1全長抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該抗PD-1全長抗體或其抗原結合片段(例如，Fab、scFv)包含：(i) VH ，其包含SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL ，其包含SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；或(ii) VH ，其包含SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL ，其包含SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，該抗PD-1全長抗體包含：(i) 包含SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之輕鏈；或(ii) 包含SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體係派姆單抗或PD1-BM-min。在一些實施例中，第一抗原結合部分與第二抗原結合部分化學融合。在一些實施例中，第一抗原結合部分經由肽連接體與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，該肽連接體長不超過約30個(諸如不超過約25個、20個或15個中之任一者)胺基酸。在一些實施例中，該肽連接體包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb之N末端或C末端與肽序列融合。在一些實施例中，該肽序列包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合片段包含Fc區，諸如IgG1 Fc、無效應物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc (S228P)。
在一些實施例中，經分離之抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含可特異性結合至少兩種不同抗原決定基之至少兩個抗原結合部分。該至少兩個抗原結合部分中之一些可係相同的，只要MABP具有針對兩種不同抗原決定基之結合位點即可。抗LAG-3 MABP (例如，BABP)可係對稱的或不對稱的。舉例而言，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)可包含1至8個拷貝之包含本文所述抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分及1或2個拷貝之包含VH 及VL 之第二抗原結合部分。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含兩個不同抗原結合部分，其各自包含一起形成不同抗原結合位點之VH 結構域及VL 結構域。舉例而言，第二抗原結合部分可係雙特異性抗體。在一些實施例中，第二抗原結合部分係單特異性全長抗體或其抗原結合片段，諸如Fab或scFv。
在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或更多個不同抗原結合部分中之任一者，其各自包含本文所述之抗LAG-3 sdAb。在一些實施例中，兩種相同之抗LAG-3 sdAb彼此融合，其進一步與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，兩種不同之抗LAG-3 sdAb彼此融合，其進一步與第二抗原結合部分融合。
經分離之抗LAG-3 MABP (例如，BABP)可具有任何適宜數量之針對LAG-3及/或第二抗原決定基(例如，PD-1)之化合價及任何適宜數量之特異性。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)針對LAG-3為二價、三價、四價、五價、六價或更高價。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)針對第二抗原決定基(例如，PD-1)為二價、三價、四價、五價、六價或更高價。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP係雙特異性的(例如，PD-1×LAG-3 BABP)。例示性BABP繪示於圖7至圖16中。在一些實施例中，MABP係三特異性的。在一些實施例中，MABP係四特異性的。在一些實施例中，MABP具有四種以上之特異性。
在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含：(a) 一或多個拷貝(諸如2個)之第一抗原結合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，及(b) 單拷貝之第二抗原結合部分，其包含VH 及VL ，其中該VH 及該VL 一起形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1)之抗原結合位點，其中該第一抗原結合部分之每一拷貝與該第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，提供抗LAG-3 MABP (例如，BABP)，其包含：(a) 複數(諸如2、3、4、5、6、7、8或更多)個相同或不同的抗LAG-3 sdAb，及(b) 複數(諸如2、3、4、5、6或更多)個包含VH 及VL 之第二抗原結合部分，其中該VH 及該VL 一起形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1)之抗原結合位點，且其中該等抗LAG-3 sdAb彼此融合及/或與該第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，提供抗LAG-3 MABP (例如，BABP)，其包含：(a) 複數(諸如2、3或4)個相同或不同的抗LAG-3 sdAb，及(b) 兩個拷貝之第二抗原結合部分，其各自包含VH 及a VL ，其中該VH 及該VL 一起形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1)之抗原結合位點，且其中該等抗LAG-3 sdAb彼此融合及/或與該第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，該等抗LAG-3 sdAb中之一或多者各自進一步與另一相同或不同的抗LAG-3 sdAb融合。
在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含：(a) 單拷貝之第一抗原結合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，及(b) 兩個拷貝之第二抗原結合部分，其各自包含VH 及VL ，其中該VH 及該VL 一起形成特異性結合第二抗原決定基之抗原結合位點，其中該第一抗原結合部分與該第二抗原結合部分之兩個拷貝中之一者融合。在一些實施例中，抗PD-1 MABP (例如，BABP)包含：(a) 兩個拷貝之第一抗原結合部分，其各自包含抗LAG-3 sdAb，(b) 兩個拷貝之第二抗原結合部分，其各自包含VH 及VL ，其中該VH 及該VL 一起形成特異性結合第二抗原決定基之抗原結合位點，其中該第一抗原結合部分之一個拷貝與該第二抗原結合部分之每一拷貝融合。在一些實施例中，該等抗LAG-3 sdAb中之一或多者各自進一步與另一相同或不同的抗LAG-3 sdAb融合。
在一些實施例中，抗LAG-3構築體包含與第二抗體融合之本文所述之抗LAG-3 sdAb，其中該第二抗體係由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體(諸如特異性識別PD-1之全長抗體)。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb及全長抗體經由連接體(諸如肽連接體)彼此融合。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb之N末端或C末端與肽序列融合。
因此，在一些實施例中，提供經分離之抗LAG-3構築體，其包含抗LAG-3 sdAb及由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體(諸如特異性識別PD-1之全長抗體)，其中該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供經分離之抗LAG-3構築體，其包含抗LAG-3 sdAb及由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體(諸如特異性識別PD-1之全長抗體)，其中該抗LAG-3 sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，全長抗體之Fc片段係hIgG1 Fc、無效應物hIgG1 Fc、hIgG2 Fc、hIgG4 Fc或hIgG4 Fc (S228P)。在一些實施例中，該全長抗體係刺激性免疫檢查點分子之活化劑。在一些實施例中，該全長抗體係免疫檢查點抑制劑，諸如TIGIT、TIM-3、CTLA-4或PD-1之抑制劑。在一些實施例中，該全長抗體係派姆單抗、PD1-BM-min或納武單抗(nivolumab)。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb及該全長抗體經由肽連接體彼此融合。在一些實施例中，該肽連接體包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb之N末端或C末端與肽序列融合。在一些實施例中，該肽序列包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。
多特異性抗LAG3構築體可具有任一適宜形式。例示性雙特異性抗LAG3構築體示於圖7至圖16中。
在一些實施例中，抗LAG-3構築體包含兩個抗LAG-3 sdAb。在一些實施例中，每一抗LAG-3 sdAb之N末端與全長抗體重鏈之C末端融合(如圖8所例示)。在一些實施例中，每一抗LAG-3 sdAb之C末端與全長抗體重鏈之N末端融合(如圖7所例示)。在一些實施例中，每一抗LAG-3 sdAb之N末端與全長抗體輕鏈之C末端融合(如圖10所例示)。在一些實施例中，每一抗LAG-3 sdAb之C末端與全長抗體輕鏈之N末端融合(如圖9所例示)。在一些實施例中，每一抗LAG-3 sdAb之C末端與全長抗體CH 2結構域之N末端融合，且每一抗LAG-3 sdAb之N末端與全長抗體CH 1結構域之C末端融合(如圖13所例示)。在一些實施例中，每一抗LAG-3 sdAb之N末端與scFv之C末端融合，且每一抗LAG-3 sdAb之C末端與Fc區之CH 2結構域之N末端融合(如圖14所例示)。
在一些實施例中，抗LAG-3構築體包含四個抗LAG-3 sdAb。在一些實施例中，第一抗LAG-3 sdAb之C末端與全長抗體重鏈之N末端融合，且第二抗LAG-3 sdAb之C末端與全長抗體輕鏈之N末端融合(如圖11所例示)。在一些實施例中，第一抗LAG-3 sdAb之C末端與全長抗體重鏈之N末端融合，且第二抗LAG-3 sdAb之C末端與該第一抗LAG-3 sdAb之N末端融合(如圖12所例示)。在一些實施例中，第一抗LAG-3 sdAb之N末端與Fab之CH 1結構域之C末端融合，且該第一抗LAG-3 sdAb之C末端與第二CH 1結構域之N末端融合；且第二抗LAG-3 sdAb之N末端與Fab之CL 結構域之C末端融合，且該第二抗LAG-3 sdAb之C末端與第二CL 結構域之N末端融合(如圖15所例示)。在一些實施例中，第一抗LAG-3 sdAb之N末端與scFv之C末端融合，且該第一抗LAG-3 sdAb之C末端與CH 1結構域之N末端融合；且第二抗LAG-3 sdAb之C末端與第二CL 結構域之N末端融合(如圖16所例示)。a) 融合多肽
抗LAG-3 MABP (例如，BABP)之包含本文所述抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分與包含VH 及VL 之第二抗原結合部分彼此融合(亦即，共價連接)。因此，本申請案之抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含一或多種融合多肽。每一融合多肽可包含含有本文所述抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分及來自第二抗原結合部分之多肽。
包含本文所述抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分及包含VH 及VL 之第二抗原結合部分可藉由單一化學鍵(諸如肽鍵)或經由肽連接體直接連接。包含抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分可在第二抗原結合部分之任一(包括每一)多肽之N末端或C末端處融合，或可在第二抗原結合部分之任一(包括每一)多肽之內部位置處融合，諸如在第二抗原結合部分之重鏈中Fc區之N末端處。融合多肽可以重組方式或以化學方式獲得。在一些實施例中，包含抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分之C末端經由化學鍵(諸如肽鍵)或肽連接體與第二抗原結合部分之任一(包括每一)多肽之N末端融合。在一些實施例中，包含抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分之N末端經由化學鍵(諸如肽鍵)或肽連接體與第二抗原結合部分之任一(包括每一)多肽之C末端融合。在一些實施例中，包含抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分經由不為涉及胺基酸主鏈化學基團之肽鍵之化學鍵與第二抗原結合部分融合。
在一些實施例中，第二抗原結合部分包含含有VH 及VL 之單鏈抗體片段。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含scFv。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含融合多肽，該融合多肽在N末端至C末端方向上包含：包含本文所述抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分、視情況存在之肽連接體、VH 結構域及VL 結構域。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含融合多肽，該融合多肽在N末端至C末端方向上包含：包含本文所述抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分、視情況存在之肽連接體、VL 結構域及VH 結構域。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含融合多肽，該融合多肽在N末端至C末端方向上包含：VH 結構域、VL 結構域、視情況存在之肽連接體及包含本文所述抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含融合多肽，該融合多肽在N末端至C末端方向上包含：VL 結構域、VH 結構域、視情況存在之肽連接體及包含本文所述抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分。
在一些實施例中，第二抗原結合部分包含含有VH 結構域之重鏈及含有VL 結構域之輕鏈。在一些實施例中，該重鏈進一步包含一或多個重鏈恆定結構域，諸如CH 1、CH 2、CH 3、及CH 4及/或抗體鉸鏈區(HR)。在一些實施例中，該輕鏈進一步包含輕鏈恆定結構域(CL )，諸如λ CL 結構域或κ CL 結構域。在一些實施例中，包含本文所述抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分之N末端與該重鏈之C末端融合。在一些實施例中，包含抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分之C末端與該重鏈之N末端融合。在一些實施例中，包含抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分之N末端與該輕鏈之C末端融合。在一些實施例中，包含抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分之C末端與該輕鏈之N末端融合。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含第一多肽，該第一多肽自N末端至C末端包含：重鏈、視情況存在之肽連接體及包含抗LAG-3 sdAb及視情況存在之肽序列之第一抗原結合部分；及第二多肽，該第二多肽包含輕鏈。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含第一多肽，該第一多肽自N末端至C末端包含：包含視情況存在之肽序列及抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分、視情況存在之肽連接體及重鏈；及第二多肽，該第二多肽包含輕鏈。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含第一多肽，該第一多肽自N末端至C末端包含：輕鏈、視情況存在之肽連接體及包含抗LAG-3 sdAb及視情況存在之肽序列之第一抗原結合部分；及第二多肽，該第二多肽包含重鏈。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含第一多肽，該第一多肽自N末端至C末端包含：包含視情況存在之肽序列及抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分、視情況存在之肽連接體及輕鏈；及第二多肽，該第二多肽包含重鏈。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含本文所述之兩個相同之第一多肽及兩個相同之第二多肽。
在一些實施例中，第二抗原結合部分包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體。在一些實施例中，該全長抗體係由兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈組成之全長單株抗體。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含兩個相同之第一多肽，該兩個相同之第一多肽自N末端至C末端各自包含重鏈、視情況存在之肽連接體、包含抗LAG-3 sdAb及視情況存在之肽序列之第一抗原結合部分；及兩個相同之第二多肽，該兩個相同之第二多肽各自包含輕鏈(例如圖8)。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含兩個相同之第一多肽，該兩個相同之第一多肽自N末端至C末端各自包含：包含視情況存在之肽序列及抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分、視情況存在之肽連接體及重鏈；及兩個相同之第二多肽，該兩個相同之第二多肽各自包含輕鏈(例如圖7)。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含兩個相同之第一多肽，該兩個相同之第一多肽自N末端至C末端各自包含：輕鏈、視情況存在之肽連接體及包含抗LAG-3 sdAb及視情況存在之肽序列之第一抗原結合部分；及兩個相同之第二多肽，該兩個相同之第二多肽各自包含重鏈(例如圖10)。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含兩個相同之第一多肽，該兩個相同之第一多肽自N末端至C末端各自包含：包含視情況存在之肽序列及抗LAG-3 sdAb之第一抗原結合部分、視情況存在之肽連接體及輕鏈；及兩個相同之第二多肽，該兩個相同之第二多肽包含重鏈(例如圖9)。
在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含：(a) 由第一及第二重鏈以及第一及第二輕鏈組成之全長抗體，其中該全長抗體特異性識別第一抗原決定基(例如，PD-1)；(b) 第一抗LAG-3 sdAb；(c) 第二抗LAG-3 sdAb；(d) 第三抗LAG-3 sdAb；及(e) 第四抗LAG-3 sdAb；其中該第一抗LAG-3 sdAb之C末端與該第一輕鏈之N末端融合，其中該第二抗LAG-3 sdAb之C末端與該第二輕鏈之N末端融合，其中該第三抗LAG-3 sdAb之C末端與該第一重鏈之N末端融合，且其中該第四抗LAG-3 sdAb之C末端與該第二重鏈之N末端融合。在一些實施例中，該四種抗LAG-3 sdAb係不同的。在一些實施例中，該四種抗LAG-3 sdAb係相同的。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含兩個相同之第一多肽，該兩個相同之第一多肽自N末端至C末端各自包含：視情況存在之肽序列、第三或第四抗LAG-3 sdAb、視情況存在之肽連接體及重鏈；及兩個相同之第二多肽，該兩個相同之第二多肽各自包含視情況存在之肽序列、第一或第二抗LAG-3 sdAb、視情況存在之肽連接體及輕鏈。例如，參見圖11。
在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含：(a) 由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體，其中該全長抗體特異性識別第一抗原決定基(例如，PD-1)；(b) 第一抗LAG-3 sdAb；(c) 第二抗LAG-3 sdAb；(d) 第三抗LAG-3 sdAb；及(e) 第四抗LAG-3 sdAb；其中該第一抗LAG-3 sdAb之C末端與該第二抗LAG-3 sdAb之N末端融合，且該第二抗LAG-3 sdAb之C末端與一條重鏈之N末端融合，且其中該第三抗LAG-3 sdAb之C末端與該第四抗LAG-3 sdAb之N末端融合，且該第四抗LAG-3 sdAb之C末端與另一條重鏈之N末端融合。在一些實施例中，該四種抗LAG-3 sdAb係不同的。在一些實施例中，該四種抗LAG-3 sdAb係相同的。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含兩個相同之第一多肽，該兩個相同之第一多肽自N末端至C末端各自包含：視情況存在之肽序列、第一或第三抗LAG-3 sdAb、視情況存在之肽連接體、第二或第四抗LAG-3 sdAb、視情況存在之肽連接體及重鏈；及兩個相同之第二多肽，該兩個相同之第二多肽各自包含輕鏈。例如，參見圖12。
在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含：(a) 由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體，其中該全長抗體特異性識別第一抗原決定基(例如，PD-1)；(b) 第一抗LAG-3 sdAb；及(c) 第二抗LAG-3 sdAb，其中該第一或該第二抗LAG-3 sdAb之N末端與該重鏈之CH 1區之C末端融合，且該第一或該第二抗LAG-3 sdAb之C末端與該重鏈之CH 2區之N末端融合。在一些實施例中，該兩種抗LAG-3 sdAb係相同的。在一些實施例中，該兩種抗LAG-3 sdAb係不同的。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含兩個相同之第一多肽，該兩個相同之第一多肽自N末端至C末端各自包含：VH -CH 1-視情況存在之肽連接體-抗LAG-3 sdAb-CH 2-CH 3；及兩個相同之第二多肽，該兩個相同之第二多肽各自包含輕鏈。例如，參見圖13。
在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含：(a) 第一scFv，其特異性識別第一抗原決定基(例如，PD-1)；(b) 第二scFv，其特異性識別第二抗原決定基(例如，PD-1)；(c) Fc區；(d) 第一抗LAG-3 sdAb；及(e) 第二抗LAG-3 sdAb，其中每一抗LAG-3 sdAb之N末端與scFv之C末端融合且該抗LAG-3 sdAb之C末端與該Fc區之N末端融合。在一些實施例中，該兩種抗LAG-3 sdAb係相同的。在一些實施例中，該兩種抗LAG-3 sdAb係不同的。在一些實施例中，該兩種scFv係相同的。在一些實施例中，該兩種scFv係不同的。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含兩個相同之多肽，該兩個相同之多肽自N末端至C末端各自包含：scFv-視情況存在之肽連接體-抗LAG-3 sdAb-CH2 -CH3 ，諸如VH -VL -視情況存在之肽連接體-抗LAG-3 sdAb-CH2 -CH3 或VL -VH -視情況存在之肽連接體-抗LAG-3 sdAb-CH2 -CH3 。例如，參見圖14。
在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含：(a) 第一Fab，其特異性識別第一抗原決定基(例如，PD-1)；(b) 第二Fab，其特異性識別第二抗原決定基(例如，PD-1)；(c) Fc區；(d) 第一Fab樣結構域，其包含第一抗LAG-3 sdAb及第二抗LAG-3 sdAb；(e) 第二Fab樣結構域，其包含第三抗LAG-3 sdAb及第四抗LAG-3 sdAb，其中每一Fab樣結構域之N末端與Fab之C末端融合且該Fab樣結構域之兩個C末端中之一者與該Fc區之N末端融合。在一些實施例中，該四種抗LAG-3 sdAb係相同的。在一些實施例中，該四種抗LAG-3 sdAb係不同的。在一些實施例中，該兩種Fab係相同的。在一些實施例中，該兩種Fab係不同的。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含兩個相同之第一多肽，該兩個相同之第一多肽自N末端至C末端各自包含：VH -CH 1-視情況存在之肽連接體-抗LAG-3 sdAb-CH 1-CH 2-CH 3；及兩個相同之第二多肽，該兩個相同之第二多肽自N末端至C末端各自包含：VL -CL -視情況存在之肽連接體-抗LAG-3 sdAb-CL 。例如，參見圖15。
在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含：(a) 第一scFv，其特異性識別第一抗原決定基(例如，PD-1)；(b) 第二scFv，其特異性識別第二抗原決定基(例如，PD-1)；(c) Fc區；(d) 第一Fab樣結構域，其包含第一抗LAG-3 sdAb及第二抗LAG-3 sdAb；(e) 第二Fab樣結構域，其包含第三抗LAG-3 sdAb及第四抗LAG-3 sdAb，其中每一Fab樣結構域之兩個N末端中之一者與scFv之C末端融合且該Fab樣結構域之兩個C末端中之一者與該Fc區之N末端融合。在一些實施例中，該四種抗LAG-3 sdAb係相同的。在一些實施例中，該四種抗LAG-3 sdAb係不同的。在一些實施例中，該兩種scFv係相同的。在一些實施例中，該兩種scFv係不同的。在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含兩個相同之第一多肽，該兩個相同之第一多肽自N末端至C末端各自包含：scFv-視情況存在之肽連接體-抗LAG-3 sdAb-CH 1-CH 2-CH 3；及兩個相同之第二多肽，該兩個相同之第二多肽自N末端至C末端各自包含：抗LAG-3 sdAb-CL 。在一些實施例中，該scFv自N末端至C末端包含：VH -VL 或VL -VH 。例如，參見圖16。
本文所述之抗LAG-3 MABP (例如，BABP)可包含一或多個位於第一抗原結合部分與第二抗原結合部分之間的肽連接體。在一些實施例中，第二抗原結合部分之重鏈多肽與第一抗原結合部分之間的肽連接體與第二抗原結合部分之輕鏈多肽與第一抗原結合部分之間的肽連接體相同。在一些實施例中，第二抗原結合部分之重鏈多肽與第一抗原結合部分之間的肽連接體不同於第二抗原結合部分之輕鏈多肽與第一抗原結合部分之間的肽連接體。在一些實施例中，第一抗原結合部分與第二抗原結合部分在無肽連接體佈置於其間之情形下彼此直接融合。兩種或更多種抗LAG-3 sdAb之間的肽連接體可與抗LAG-3 sdAb與第二抗原結合部分之間的肽連接體相同或不同。在下文「肽連接體」部分中所闡述之上文中任一肽連接體均可用於任一本文所述抗LAG-3 MABP (例如，BABP)中。b) 包含 VH 及 VL 之第二抗原結合部分
抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含至少一個包含VH 及VL 之第二抗原結合部分。此抗原結合部分可係由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長習用抗體或源自其之抗原結合片段(例如，Fab、scFv)。
在一些實施例中，第二抗原結合部分係包含含有VH 結構域之重鏈及含有VL 結構域之輕鏈之抗原結合片段。本文所涵蓋之例示性抗原結合片段包括(但不限於) Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段；雙鏈抗體；直鏈抗體；單鏈抗體分子(諸如scFv)；及自抗體片段形成之多特異性抗體。
在一些實施例中，第二抗原結合部分包含Fc區，諸如人類Fc區。在一些實施例中，Fc區源自IgG分子，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類中之任一者。在一些實施例中，Fc區能夠調介抗體效應功能，諸如ADCC及/或CDC。舉例而言，具有野生型Fc序列之亞類IgG1、IgG2及IgG3之抗體通常顯示包括CIq及C3結合之補體活化，而IgG4不活化補體系統且不結合CIq及/或C3。在一些實施例中，Fc區包含降低Fc區與Fc受體之結合親和力之修飾。在一些實施例中，Fc區係IgG1 Fc。在一些實施例中，IgG1 Fc在位置233-236中包含一或多個突變，諸如L234A及/或L235A。在一些實施例中，Fc區係無效應物IgG1 Fc。在一些實施例中，Fc區係IgG4 Fc。在一些實施例中，IgG4 Fc包含位置327、330及/或331中之突變。例如，參見Armour KL等人，Eur J. Immunol. 1999; 29: 2613；及Shields RL等人，J. Biol. Chem. 2001; 276: 6591。在一些實施例中，Fc區包含P329G突變。在一些實施例中，Fc區係IgG4 Fc (S228P)。在一些實施例中，Fc區包含SEQ ID NO: 363-365中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，Fc區包含促進兩條不相同重鏈之異二聚化之修飾。對於具有不對稱設計之本文所述抗LAG-3 MABP (例如，BABP)，此等經修飾之Fc區可尤為受關注。在一些實施例中，該修飾係隆凸於孔洞中修飾，包含位於該等重鏈或重鏈融合多肽中之一者中之隆凸修飾及位於該兩條重鏈或重鏈融合多肽之另一者中之孔洞修飾。在一個實施例中，Fc區包含CH3結構域中兩條重鏈之間界面內之修飾，其中i) 在一條重鏈之CH3結構域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基替換，藉此在一條重鏈之CH3結構域中之界面內產生凸起(「隆凸」)，該隆凸可定位於另一條重鏈之CH3結構域中界面內之空腔(「孔洞」)中，且ii) 在另一條重鏈之CH3結構域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基替換，藉此在第二CH3結構域中之界面內產生空腔(「孔洞」)，第一CH3結構域中界面內之凸起(「隆凸」)可定位於該孔洞中。隆凸於孔洞中修飾之實例已闡述於(例如) US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431及Zhu等人，1997,Protein Science 6:781-788中。本文亦涵蓋促進異二聚化之對Fc區之其他修飾。舉例而言，可將靜電牽引效應工程化至Fc區中以提供Fc-異二聚體分子(例如，參見US4676980及Brennan等人，Science , 229: 81 (1985))。在一些實施例中，Fc區包含抑制Fab臂交換之修飾。舉例而言，IgG4 Fc中之S228P突變防止Fab臂交換。
在一些實施例中，第二抗原結合部分包含κ輕鏈恆定區。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含λ輕鏈恆定區。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含重鏈恆定區。
在一些實施例中，第二抗原結合部分係由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之單株抗體(在本文中亦稱為「4鏈抗體」)。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之多特異性(例如，雙特異性)全長抗體。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含人類IgG1亞類、無效應物hIgG1亞類或人類IgG1亞類中具有突變L234A及L235A之全長抗體。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含人類IgG2亞類之全長抗體。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含人類IgG3亞類之全長抗體。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含人類IgG4亞類或人類IgG4亞類中具有額外突變S228P之全長抗體。
此項技術中已知之任一全長4鏈抗體或源自其之抗原結合片段可用作本文所述抗LAG-3 MABP (例如BABP)之第二抗原結合部分。具有經證實之臨床功效、安全性及藥物動力學特徵之抗體或抗體片段尤為受關注。在一些實施例中，對此項技術中已知之抗體或抗體片段進行進一步改造(諸如人類化或誘變)以選擇具有適宜親和力之變異體，之後與第一抗原結合部分融合以提供抗LAG-3 MABP (例如，BABP)。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含此項技術中已知之單株抗體或抗體片段之VH 及VL 結構域及經修飾之重鏈恆定區及/或輕鏈恆定區。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含此項技術中已知之單株抗體及經修飾之Fc區，諸如具有S228P突變之IgG4 Fc或無效應物IgG1 Fc。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含人類、人類化或嵌合全長抗體或抗體片段。c) 例示性抗 LAG-3 MABP
在一些實施例中，抗LAG-3構築體係抗LAG-3 MABP，其包含特異性識別PD-1之第二抗原結合部分。在一些實施例中，該第二抗原結合部分包含抗PD-1 sdAb。在一些實施例中，該第二抗原結合部分包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗PD-1抗體。
PD-1係CD28受體家族之抑制性成員，CD28受體家族亦包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。PD-1含有近膜端免疫受體酪胺酸抑制基序(ITIM)及遠膜端基於酪胺酸之開關基序(ITSM) (Thomas, M.L. (1995) J Exp Med 181:1953-6；Vivier, E及Daeron, M (1997) Immunol Today 18:286-91)。儘管在結構上類似於CTLA-4，但PD-1缺少對於B7-1及B7-2結合至關重要之MYPPPY基序。
PD-1調控T細胞活化及耐受性，且因此拮抗性抗PD-1抗體可用於克服耐受性。PD-1已被定義為B7-4之受體。B7-4在結合至免疫細胞上之抑制性受體時可抑制免疫細胞活化。PD-1/PD-L1路徑之接合引起T細胞效應功能之抑制、細胞介素分泌及增殖(Turnis等人，OncoImmunology 1(7):1172-1174, 2012)。高水準之PD-1與耗盡或長期刺激之T細胞相關。此外，增加之PD-1表現與癌症患者之降低存活有關。下調PD-1、B7-4及免疫細胞中B7-4與PD-1抑制性信號之間的相互作用之劑可使得免疫反應增強。
在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體，其包含與抗PD-1 sdAb融合之本文所述之抗LAG-3 sdAb。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb經由連接體(諸如肽連接體)與該抗PD-1 sdAb融合。在一些實施例中，該抗LAG-3構築體包含複數(諸如2、3、4或更多)個抗LAG-3 sdAb，其可相同或不同。在一些實施例中，該抗LAG-3構築體包含複數(諸如2、3、4或更多)個抗PD-1 sdAb，其可相同或不同。該抗PD-1 sdAb可源自任何已知之抗PD-1 sdAb，諸如PCT/CN2018/071729中所揭示之彼等抗PD-1 sdAb，其內容係以全文引用的方式併入本文中。該抗LAG-3構築體可為任一適宜形式，例如自N末端至C末端為：(抗LAG-3 sdAb)-L1 -(抗PD-1 sdAb)或(抗PD-1 sdAb)-L1 -(抗LAG-3 sdAb)，其中L1 係化學鍵或連接體，諸如肽連接體。
可用於製備本文所述之多特異性抗LAG_3構築體之例示性4鏈抗PD-1抗體包括(但不限於)派姆單抗(例如，KEYTRUDA® )、納武單抗(例如，OPDIVO® )、PD1-BM-min，包括其生物類似物、其衍生物及具有相同序列之抗體。
在一些實施例中，第二抗原結合部分包含抗PD-1全長抗體或其抗原結合片段(例如，Fab、scFv)。在一些實施例中，該抗PD-1全長抗體或其抗原結合片段(例如，Fab、scFv)包含：(i) VH ，其包含SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL ，其包含SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；或(ii) VH ，其包含SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL ，其包含SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，該抗PD-1全長抗體包含：(i) 包含SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之輕鏈；或(ii) 包含SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，該抗PD-1全長抗體係派姆單抗(例如，KEYTRUDA® )或PD1-BM-min。
在一些實施例中，抗LAG-3 MABP (例如，BABP)包含(a) 第一抗原結合部分，其包含本文所述之抗LAG-3 sdAb，及(b) 第二抗原結合部分，其包含VH 及VL ，其中該VH 及該VL 一起形成特異性結合PD-1之抗原結合位點，其中該第一抗原結合部分與該第二抗原結合部分彼此融合(下文中稱為「LAG-3×PD-1 MABP」或「LAG-3×PD-1 BABP」)。例示性抗LAG-3/PD-1 BABP示於圖7至圖14及表7中。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 BABP，其包含：(a) 第一多肽，其自N末端至C末端包含：抗LAG-3 sdAb-VH -CH 1-CH 2-CH 3；及(b) 第二多肽，其自N末端至C末端包含：VL -CL ，其中VH 及VL 形成特異性結合第二抗原決定基(例如，免疫檢查點分子，諸如PD-1)之抗原結合位點，且其中該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 288、295、304或306中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，VH 及VL 形成特異性結合PD-1之抗原結合位點。在一些實施例中，VH 及VL 結構域源自派姆單抗或PD1-BM-min。在一些實施例中，VH 包含SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，且VL 包含SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，VH 包含SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，且VL 包含SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，CH 3及抗LAG-3 sdAb經由肽連接體彼此融合，諸如包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列之肽連接體。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb之N末端與肽序列融合。在一些實施例中，該肽序列包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，CH 2及CH 3結構域源自IgG1 Fc、無效應物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc (S228P)。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 BABP，其包含：(a) 第一多肽，其自N末端至C末端包含：VH -CH 1-CH 2-CH 3-抗LAG-3 sdAb；及(b) 第二多肽，其自N末端至C末端包含：VL -CL ，其中VH 及VL 形成特異性結合第二抗原決定基(例如，免疫檢查點分子，諸如PD-1)之抗原結合位點，且其中該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 288、295、304或306中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，VH 及VL 形成特異性結合PD-1之抗原結合位點。在一些實施例中，VH 及VL 結構域源自派姆單抗或PD1-BM-min。在一些實施例中，VH 包含SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，且VL 包含SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，VH 包含SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，且VL 包含SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，CH 3及抗LAG-3 sdAb經由肽連接體彼此融合，諸如包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列之肽連接體。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb之C末端與肽序列融合。在一些實施例中，該肽序列包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，CH 2及CH 3結構域源自IgG1 Fc、無效應物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc (S228P)。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 BABP，其包含：(a) 第一多肽，其自N末端至C末端包含：VH -CH 1-CH 2-CH 3；及(b) 第二多肽，其自N末端至C末端包含：抗LAG-3 sdAb-VL -CL ，其中VH 及VL 形成特異性結合第二抗原決定基(例如，免疫檢查點分子，諸如PD-1)之抗原結合位點，且其中該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 288、295、304或306中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，VH 及VL 形成特異性結合PD-1之抗原結合位點。在一些實施例中，VH 及VL 結構域源自派姆單抗或PD1-BM-min。在一些實施例中，VH 包含SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，且VL 包含SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，VH 包含SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，且VL 包含SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，CH 3及抗LAG-3 sdAb經由肽連接體彼此融合，諸如包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列之肽連接體。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb之N末端與肽序列融合。在一些實施例中，該肽序列包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，CH 2及CH 3結構域源自IgG1 Fc、無效應物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc (S228P)。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 BABP，其包含：(a) 第一多肽，其自N末端至C末端包含：VH -CH 1-CH 2-CH 3；及(b) 第二多肽，其自N末端至C末端包含：VL -CL -抗LAG-3 sdAb，其中VH 及VL 形成特異性結合第二抗原決定基(例如，免疫檢查點分子，諸如PD-1)之抗原結合位點，且其中該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 288、295、304或306中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，VH 及VL 形成特異性結合PD-1之抗原結合位點。在一些實施例中，VH 及VL 結構域源自派姆單抗或PD1-BM-min。在一些實施例中，VH 包含SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，且VL 包含SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，VH 包含SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，且VL 包含SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，CH 3及抗LAG-3 sdAb經由肽連接體彼此融合，諸如包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列之肽連接體。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb之C末端與肽序列融合。在一些實施例中，該肽序列包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，CH 2及CH 3結構域源自IgG1 Fc、無效應物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc (S228P)。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 BABP，其包含：(a) 第一多肽，其自N末端至C末端包含：VH -CH 1-抗LAG-3 sdAb-CH 2-CH 3；及(b) 第二多肽，其自N末端至C末端包含：VL -CL ，其中VH 及VL 形成特異性結合第二抗原決定基(例如，免疫檢查點分子，諸如PD-1)之抗原結合位點，且其中該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 288、295、304或306中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，VH 及VL 形成特異性結合PD-1之抗原結合位點。在一些實施例中，VH 及VL 結構域源自派姆單抗或PD1-BM-min。在一些實施例中，VH 包含SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，且VL 包含SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，VH 包含SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，且VL 包含SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，CH 3及抗LAG-3 sdAb經由肽連接體彼此融合，諸如包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列之肽連接體。在一些實施例中，CH 2及CH 3結構域源自IgG1 Fc、無效應物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc (S228P)。
在一些實施例中，提供抗LAG-3 BABP，其包含多肽，該多肽自N末端至C末端包含：VL -VH -抗LAG-3 sdAb-CH 2-CH 3，其中該VL 及該VH 一起形成特異性結合第二抗原決定基(例如，免疫檢查點分子，諸如PD-1)之scFv，且其中該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 288、295、304或306中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，VH 及VL 形成特異性結合PD-1之抗原結合位點。在一些實施例中，VH 及VL 結構域源自派姆單抗或PD1-BM-min。在一些實施例中，VH 包含SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，且VL 包含SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，VH 包含SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，且VL 包含SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，CH 3及抗LAG-3 sdAb經由肽連接體彼此融合，諸如包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列之肽連接體。在一些實施例中，CH 2及CH 3結構域源自IgG1 Fc、無效應物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc (S228P)。
在一些實施例中，抗LAG-3構築體包含第一多肽之兩個相同拷貝及第二多肽之兩個相同拷貝。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 358之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 359之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 360之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 361之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 362之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 363之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 364之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 365之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 375之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 376之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 377之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 378之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 379之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 380之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 381之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 382之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 383之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 384之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 385之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 386之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 387之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 388之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 389之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 390之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 391之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 392之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 393之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 394之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 395之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 396之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 397之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 398之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 399之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 400之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 401之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 402之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 403之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 404之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 405之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 406之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 407之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 408之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 409之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 410之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 411之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 412之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 413之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 414之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 415之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 416之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 417之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 418之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 419之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 420之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 421之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 422之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 423之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 424之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 425之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 426之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 427之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 428之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 429之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 430之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 431之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 432之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 433之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 434之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 435之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 436之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 437之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 438之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 439之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 440之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 441之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 442之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 443之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 444之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，BABP)，其包含含有SEQ ID NO: 445之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 446之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，提供多肽，其包含SEQ ID NO: 358-365及375-446中任一者之胺基酸序列。 肽連接體
抗LAG3構築體中之各個結構域及組分(諸如抗LAG-3 sdAb、Fc片段、第一抗原結合部分及第二抗原結合部分)可經由適宜連接體(諸如肽連接體)彼此融合。抗LAG-3構築體中所用一或多個肽連接體之長度、柔性程度及/或其他性質可對性質具有一些影響，該等性質包括(但不限於)對一或多種特定抗原或抗原決定基之親和力、特異性或親合力。舉例而言，可選擇較長之肽連接體以確保兩個毗鄰結構域不在空間上相互干擾。在一些實施例中，肽連接體包含柔性殘基(諸如甘胺酸及絲胺酸)，從而使得毗鄰結構域相對於彼此自由移動。舉例而言，甘胺酸-絲胺酸雙聯體可係適宜肽連接體。
肽連接體可具有任何適宜長度。在一些實施例中，肽連接體長至少約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、75個、100個或更多個胺基酸中之任一者。在一些實施例中，肽連接體長不超過約100個、75個、50個、40個、35個、30個、25個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個或更少個胺基酸中之任一者。在一些實施例中，肽連接體之長度為以下中之任一者：約1個胺基酸至約10個胺基酸、約1個胺基酸至約20個胺基酸、約1個胺基酸至約30個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約10個胺基酸至約25個胺基酸、約5個胺基酸至約30個胺基酸、長約10個胺基酸至約30個胺基酸、約30個胺基酸至約50個胺基酸、約50個胺基酸至約100個胺基酸或約1個胺基酸至約100個胺基酸。
肽連接體可具有天然序列或非天然序列。舉例而言，源自僅重鏈抗體鉸鏈區之序列可用作連接體。例如，參見WO1996/34103。在一些實施例中，肽連接體係人類IgG1鉸鏈(SEQ ID NO: 352)。在一些實施例中，肽連接體係突變之人類IgG1鉸鏈(SEQ ID NO: 353)。在一些實施例中，肽連接體係人類IgG4鉸鏈。在一些實施例中，肽連接體係hIgG2鉸鏈。在一些實施例中，肽連接體係柔性連接體。例示性柔性連接體包括甘胺酸聚合物(G)n (SEQ ID NO: 368)、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括(例如)(GS)n (SEQ ID NO: 369)、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 370)、(GGGS)n (SEQ ID NO: 371)及(GGGGS)n (SEQ ID NO: 372)，其中n為至少1之整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物及此項技術中已知之其他柔性連接體。在一些實施例中，肽連接體包含SEQ ID NO: 366 (GGGGSGGGS)或367 (GGGGSGGGGSGGGGS)之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb之N末端或C末端可與肽序列融合，該肽序列可具有本文針對肽連接體所述之序列特徵中之任一者。(III) 抗體變異體
在一些實施例中，涵蓋本文所提供之抗LAG-3構築體之胺基酸序列變異體(例如，抗LAG-3 sdAb、抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、抗LAG-3 MABP/BABP)。舉例而言，可期望改良抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入至編碼該抗體之核酸序列中或藉由肽合成來製備。此等修飾包括(例如)抗體之胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入及取代之任一組合以達成最終構築體，條件係最終構築體具有期望特性，例如抗原結合。 a) 取代、插入、缺失及變異體
在一些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於取代誘變之所關注位點包括HVR (或CDR)及FR。保守取代示於表2中之「較佳取代」標題下。更多實質性變化提供於表2之「例示性取代」標題下，且如下文參考胺基酸側鏈類別所進一步闡述。可將胺基酸取代引入至所關注抗體中且針對期望活性對產物進行篩選，該期望活性係(例如)保留/改良抗原結合、降低免疫原性或改良ADCC或CDC。表 2. 胺基酸取代
Figure 108111097-A0304-0002
可根據常見側鏈性質將胺基酸分組：(1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3) 酸性：Asp、Glu；(4) 鹼性：His、Lys、Arg；(5) 影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；及(6) 芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將需要將該等類別中之一者之成員交換為另一類別。
一類取代變異體涉及取代親代抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高度變異區殘基。通常，選擇用於進一步研究之一或多種所得變異體相對於親代抗體將在某些生物學性質(例如，增強之親和力、降低之免疫原性)中具有修飾(例如，改良)及/或實質上將保留親代抗體之某些生物性質。例示性取代變異體係親和力成熟抗體，其可使用(例如)基於噬菌體展示之親和力成熟技術(諸如本文所述之彼等技術)便捷地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且將變異體抗體展示於噬菌體上並篩選特定生物學活性(例如結合親和力)。
可對HVR作出改變(例如，取代)以(例如)改良抗體親和力。此等改變可在HVR 「熱點」(亦即，由在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變之密碼子編碼的殘基) (例如，參見Chowdhury，Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008))及/或SDR (a-CDR)中進行，其中測試所得變異體VH或VL之結合親和力。藉由二級文庫之構築及再選擇之親和力成熟已闡述於(例如) Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien等人編輯，Human Press, Totowa, NJ, (2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法中之任一者(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變)向選擇用於成熟之可變基因中引入多樣性。接著建立二級文庫。接著篩選該文庫以鑑別具有期望親和力之任一抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR定向方法，其中將若干個HVR殘基(例如，一次4至6個殘基)隨機化。可(例如)使用丙胺酸掃描誘變或建模特定鑑別參與抗原結合之HVR殘基。特定而言，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在一些實施例中，取代、插入或缺失可發生於一或多個HVR內，只要此等改變不會實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可對HVR作出不會實質上降低結合親和力之保守改變(例如，如本文所提供之保守取代)。此等改變可位於HVR「熱點」或CDR以外。在上文所提供變異體VH H序列之一些實施例中，每一HVR未經改變，或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
用於鑑別抗體中可靶向誘變之殘基或區的有用方法稱為如Cunningham及Wells (1989)Science , 244:1081-1085所闡述之「丙胺酸掃描誘變」。在此方法中，已鑑別殘基或目標殘基組(例如，帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)，且由中性或帶負電胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)替換以確定是否影響抗體與抗原之相互作用。可在對初始取代展示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，抗原-抗體複合物之晶體結構用以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。作為取代候選物，可靶向或消除此等接觸殘基及相鄰殘基。可篩選變異體以確定其是否含有期望性質。
胺基酸序列插入包括胺基末端及/或羧基末端融合物(長度在一個殘基至含有上百或更多個殘基之多肽範圍內)以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N末端或C末端與酶(例如用於ADEPT)或延長抗體血清半衰期之多肽之融合物。 b) 糖基化變異體
在一些實施例中，改變本文所提供之經分離之抗LAG-3構築體以增加或降低構築體糖基化之程度。可藉由改變胺基酸序列從而使得產生或移除一或多個糖基化位點來便捷地完成抗體中糖基化位點之增加或缺失。
倘若抗LAG-3構築體包含Fc區(例如，抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、LAG-3× PD-1 MABP)，則可改變其所連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含具支鏈、二分枝寡醣，其通常藉由N鍵聯連接至Fc區之CH 2結構域之Asn297。例如，參見Wright等人，TIBTECH 15:26-32 (1997)。該寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸以及連接至二分枝寡醣結構之「主幹」中的GlcNAc之岩藻糖。在一些實施例中，可修飾本申請案之抗LAG-3構築體中之寡醣以產生具有某些改良性質之抗體變異體。
在一些實施例中，提供具有缺少連接(直接或間接)至Fc區之岩藻糖的碳水化合物結構之抗LAG-3構築體抗體變異體。舉例而言，此抗體中岩藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。如(例如)WO 2008/077546中所闡述，岩藻糖之量係藉由計算如藉由MALDI-TOF質譜法所量測之糖鏈內Asn297處之岩藻糖相對於連接至Asn 297之所有糖結構(例如複合、雜合及高甘露糖結構)之總和的平均量來測定。Asn297係指位於Fc區中約位置297處之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，因抗體中之微小序列變化，故Asn297亦可位於位置297上游或下游之約± 3個胺基酸處，亦即，介於位置294與位置300之間。此等岩藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。例如，參見美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta, L.)；第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。與「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺乏」抗體變異體有關之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞株之實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta, L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其在實例11中)及剔除細胞株，諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8 剔除CHO細胞(例如，參見Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y.等人，Biotechnol. Bioeng ., 94(4):680-688 (2006)；及WO2003/085107)。
進一步提供具有二等分寡醣之抗LAG-3構築體變異體，例如在其中連接至抗體Fc區之二分枝寡醣由GlcNAc二等分。此等抗體變異體可具有降低之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。此等抗體變異體之實例闡述於(例如) WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546 (Umana等人)中。亦提供在連接至Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。此等抗體變異體可具有改良之CDC功能。此等抗體變異體闡述於(例如) WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及WO 1999/22764 (Raju, S.)中。 c) Fc 區變異體
在一些實施例中，可將一或多種胺基酸修飾引入至本文所提供之抗LAG-3構築體(例如，抗LAG-3 HCAb或抗LAG-3 MABP)之Fc區中，藉此產生Fc區變異體。該Fc區變異體可包含人類Fc區序列(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，該序列在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)。
在一些實施例中，本申請案涵蓋具有一些但非全部效應功能之抗PD-1構築體(例如，抗LAG-3 HCAb或抗LAG-3 MABP)變異體，此使得其成為其中抗LAG-3構築體活體內半衰期係重要的但某些效應功能(諸如補體及ADCC)係不必要或有害的之應用之合意候選物。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/缺失。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcgR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。介導ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR於造血細胞上之表現彙總於Ravetch及Kinet，Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)之第464頁上之表2中。評價所關注分子之ADCC活性之活體外分析之非限制性實例闡述於美國專利第5,500,362號(例如，參見Hellstrom, I.等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見Bruggemann, M.等人，J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))中。或者，可採用非放射性分析方法(例如，參見用於流式細胞術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI)。用於此等分析之可用效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。或者或另外，可在活體內評價所關注分子之ADCC活性，例如在諸如Clynes等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中所揭示之動物模型中。亦可實施C1q結合分析以確認抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。例如，參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評價補體活化，可實施CDC分析(例如，參見Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S.等人，Blood 101:1045-1052 (2003)；及Cragg, M.S.及M.J. Glennie，Blood 103:2738-2743 (2004))。亦可使用此項技術中已知之方法來實施FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(例如，參見Petkova, S.B.等人，Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))。
具有降低效應功能之抗體包括具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者的取代之彼等抗體(美國專利第6,737,056號)。此等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變體，包括在殘基265及297處取代為丙胺酸之所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
闡述具有經改良或減小之與FcR結合之某些抗體變異體。(例如，參見美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312及Shields等人，J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001))。
在一些實施例中，抗LAG-3構築體變異體包含具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代之Fc區，例如在Fc區之位置298、333及/或334處(殘基之EU編號)之取代。
在一些實施例中，在Fc區中作出改變，從而改變(亦即，改良或減小) C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人，J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)中所闡述。
在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體(例如，抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，抗LAG-3 HCAb或抗LAG-3 MABP)變異體，其包含含有一或多個延長半衰期及/或改良與新生Fc受體(FcRn)之結合的胺基酸取代之變異體Fc區。具有延長之半衰期及改良之與新生Fc受體(FcRn) (其負責將母體IgG轉移至胎兒中) (Guyer等人，J. Immunol . 117:587 (1976)及Kim等人，J. Immunol . 24:249 (1994))之結合之抗體闡述於US2005/0014934A1 (Hinton等人)中。彼等抗體包含具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。此等Fc變異體包括在Fc區殘基之一或多者處具有取代之彼等變異體，例如取代Fc區殘基434 (美國專利第7,371,826號)。
亦參見Duncan及Winter，Nature 322:738-40 (1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及關於Fc區變異體之其他實例之WO 94/29351。
涵蓋包含任一本文所述Fc變異體或其組合之抗LAG-3構築體(例如，抗LAG-3 HCAb或抗LAG-3 MABP)。 d) 半胱胺酸改造之抗體變異體
在一些實施例中，可期望產生半胱胺酸改造之抗LAG-3構築體，例如「thioMAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在具體實施例中，經取代殘基係在抗體之可及位點處出現。如本文所進一步闡述，藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團藉此位於抗體之可及位點處且可用於使抗體結合至其他部分(諸如藥物部分或連接體-藥物部分)以產生免疫結合物。在一些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：重鏈之A118 (EU編號)；及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。可如(例如)美國專利第7,521,541號中所闡述來產生半胱胺酸改造之抗LAG-3構築體。 e) 抗體衍生物
在一些實施例中，本文所提供之抗LAG-3構築體可經進一步修飾以包含此項技術中已知且容易獲得之其他非蛋白質性部分。適於衍生抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三氧雜環己烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中具有穩定性而在製造方面具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為具支鏈或無支鏈。連接至抗體之聚合物之數目可有所變化，且若連接一個以上之聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)以下之考慮因素來確定：欲改良抗體之特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於界定條件下之療法等。
在一些實施例中，提供抗LAG-3構築體及非蛋白質性部分之結合物，其可藉由曝露於輻射來選擇性加熱。在一些實施例中，非蛋白質性部分係碳奈米管(Kam等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)如下波長：其並不危害正常細胞，但將非蛋白質性部分加熱至可殺傷抗體-非蛋白質性部分附近細胞之溫度。
在一些實施例中，本文所提供之抗LAG-3構築體(例如，抗LAG-3 HCAb或抗LAG-3 MABP)可經進一步修飾以包含一或多種具生物活性之蛋白質、多肽或其片段。如本文可互換使用之「生物活性」或「具生物活性」意指體內顯示進行特定功能之生物學活性。舉例而言，其可意指與諸如蛋白質、DNA等特定生物分子組合，且接著促進或抑制此生物分子之活性。在一些實施例中，生物活性蛋白質或其片段包括作為活性原料藥投與患者以用於預防或治療疾病或病狀之蛋白質及多肽，以及用於診斷性目的之蛋白質及多肽(諸如用於診斷性測試或活體外分析中之酶)，以及投與患者以預防疾病之蛋白質及多肽(諸如疫苗)。在一些實施例中，生物活性蛋白質或其片段具有免疫刺激/免疫調節、膜轉運或酶活性。在一些實施例中，具生物活性之蛋白質、多肽或其片段係酶、激素、生長因子、細胞介素或其混合物。在一些實施例中，具生物活性之蛋白質、多肽或片段可特異性識別目標肽(諸如抗原或其他蛋白質)。
在一些實施例中，可包含在本文所述之抗LAG-3構築體內之生物活性蛋白質或其片段係蛋白質結合蛋白。在一些實施例中，可包含在本文所述之抗LAG-3構築體內之生物活性蛋白質或其片段係抗體模擬物，其係小的包含類似於抗體之抗原結合結構域之經改造蛋白(Geering及Fussenegger，Trends Biotechnol., 33(2):65-79, 2015)。該等分子源自現有人類支架蛋白質且包含單一多肽。可包含在本文所述之抗LAG-3構築體內之例示性抗體模擬物可係(但不限於)經設計之錨蛋白重複蛋白(DARPin；其包含3-5個側接有N末端及C末端帽結構域之完全合成錨蛋白重複序列)、親合力多聚體(高親合性多聚體(avimer)；包含多個A結構域之高親和力蛋白質，每一結構域對靶標具有低親和力)或抗運載蛋白(Anticalin)(基於脂質運載蛋白之支架，具有四個可及環，每一者之序列可隨機化)。在一些實施例中，可包含在本文所述之抗LAG-3構築體內之生物活性蛋白質或其片段係犰狳重複蛋白(例如，β-連環蛋白、α-輸入蛋白、斑珠蛋白、腺瘤性結腸息肉病蛋白(APC))，其包含犰狳重複單元(長約40個殘基之特徵性重複胺基酸序列)。每一犰狳重複係由一對形成髮夾結構之α螺旋構成。多個重複拷貝形成稱為α螺管之結構。犰狳重複蛋白能夠結合不同類型之肽，其依賴於肽主鏈之恆定結合方式而不需要特定保守側鏈或與肽之游離N末端或C末端之相互作用。按殘基識別肽殘基之可能性與重複蛋白之固有模組性之組合使得犰狳重複蛋白成為用於設計針對肽結合之通用支架之有希望候選物。
在一些實施例中，可包含在本文所述之抗LAG-3構築體內之具生物活性之蛋白質或其片段係配位體，諸如與特定細胞受體相互作用之淋巴介質及細胞因子。淋巴介質係低分子量蛋白質，當抗原或凝集素刺激T細胞生長時，T細胞分泌該等淋巴介質。III. 醫藥組合物
本申請案進一步提供醫藥組合物，其包含任一本文所述抗LAG-3構築體(例如，抗LAG-3 sdAb、抗LAG-3 HCAb或抗LAG-3 MABP)及視情況醫藥學上可接受之載劑。醫藥組合物可藉由將具有期望純度之本文所述抗LAG-3構築體與視情況存在之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol, A.編輯(1980))，其呈凍乾調配物或水溶液之形式。
醫藥組合物較佳係穩定的，其中本文之抗LAG-3構築體在儲存時基本上保留其物理及化學穩定性及完整性。用於量測蛋白質穩定性之各種分析技術在此項技術中可獲得且綜述於Peptide and Protein Drug Delivery , 247-301, Vincent Lee編輯，Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)及Jones, A.Adv. Drug Delivery Rev . 10: 29-90 (1993)中。穩定性可在選定之溫度下在選定之時間段內量測。對於快速篩選，可將調配物在40℃下保持2週至1個月，此時量測穩定性。倘若調配物在2℃-8℃下儲存，則調配物通常應在30℃或40℃下穩定達至少1個月，及/或在2℃-8℃下穩定達至少2年。倘若調配物在30℃下儲存，則調配物通常應在30℃下穩定達至少2年，及/或在40℃下穩定達至少6個月。舉例而言，儲存期間之聚集程度可用作蛋白質穩定性之指標。在一些實施例中，本文所述抗LAG-3構築體之穩定調配物可包含少於約10% (較佳少於約5%)之作為聚集體存在於調配物中之抗LAG-3構築體。
可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒，且包括緩衝劑、抗氧化劑(包括抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E、偏亞硫酸氫鈉)、防腐劑、等滲劑(例如氯化鈉)、穩定劑、金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；螯合劑(諸如EDTA)及/或非離子表面活性劑。
生理學上可接受之載劑之實例包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苄醇；對羥苯甲酸烷基酯，諸如對羥苯甲酸甲基酯或對羥苯甲酸丙基酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN™、聚乙二醇(PEG)及PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。
緩衝劑用於將pH控制在使治療有效性最佳化之範圍內，尤其若穩定性依賴於pH。緩衝劑較佳以約50 mM至約250 mM範圍內之濃度存在。本申請案中所用之適宜緩衝劑包括有機及無機酸二者及其鹽。舉例而言，檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽。另外，緩衝劑可包含組胺酸及三甲胺鹽，諸如Tris。
添加防腐劑以減慢微生物生長，且其通常以0.2%-1.0% (w/v)範圍存在。添加防腐劑可(例如)促進多用途(多劑量)調配物之產生。本申請案中所用之適宜防腐劑包括十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六羥季銨；苯紮鹵銨(benzalkonium halide)(例如，苯紮氯銨、苯紮溴銨、苯紮碘銨)、苄索氯銨；硫柳汞、苯酚、丁醇或苄醇；對羥苯甲酸烷基酯，諸如對羥苯甲酸甲基酯或對羥苯甲酸丙基酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇、3-戊醇及間甲酚。
張力劑有時稱為「穩定劑」，其存在以調整或維持組合物中液體之張力。在與較大帶電荷生物分子(諸如蛋白質及抗體)一起使用時，張力劑通常稱為「穩定劑」，此乃因其可與胺基酸側鏈之帶電荷基團相互作用，藉此減小分子間及分子內相互作用之可能性。計及其他成分之相對量，張力劑可以介於0.1重量%至25重量%之間的任一量存在、較佳以1%至5%存在。較佳張力劑包括多元糖醇，較佳地三元或更高元糖醇，諸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇及甘露醇。
其他賦形劑包括可用作以下物質中之一或多者之劑：(1) 增積劑，(2) 增溶劑，(3) 穩定劑及(4) 防止變性或容器壁黏著之劑。此等賦形劑包括：多元糖醇(上文所列舉)；胺基酸，諸如丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇，諸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環多醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫還原劑，諸如脲、麩胱甘肽、類脂酸、巰基乙酸鈉、硫甘油、α-一硫代甘油及硫代硫酸鈉；低分子量蛋白質，諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其他免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯基吡咯啶酮；單醣(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；二醣(例如，乳糖、麥芽糖、蔗糖)；三醣，諸如棉子糖；及多醣，諸如糊精或聚葡萄糖。
存在非離子表面活性劑或清潔劑(亦稱為「潤濕劑」)以有助於使治療劑溶解以及保護治療性蛋白質免受攪動誘導之聚集，此亦允許調配物暴露於剪切表面應力而不會引起活性治療性蛋白質或抗體之變性。非離子表面活性劑係以約0.05 mg/ml至約1.0 mg/ml、較佳約0.07 mg/ml至約0.2 mg/ml之範圍存在。
適宜非離子表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、PLURONIC® 多元醇、TRITON® 、聚氧乙烯去水山梨醇單醚(TWEEN®-20、TWEEN®-80等)、聚桂醇400、聚烴氧40硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50及60、甘油單硬脂酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素及羧甲基纖維素。可使用之陰離子清潔劑包括月桂基硫酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉及二辛基磺酸鈉。陽離子清潔劑包括苯紮氯銨或苄索氯銨。
為使醫藥組合物用於活體內投與，其必須係無菌的。可藉由經由無菌過濾膜過濾使醫藥組合物無菌。本文之醫藥組合物通常置於具有無菌輸液埠之容器中，例如具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子之靜脈內溶液袋或小瓶。
投與途徑係根據已知且公認之方法，諸如藉由單次或多次推注或經較長時間段輸注以適宜方式來實施，例如藉由皮下、靜脈內、腹膜內、肌內、動脈內、病灶內或關節內途徑之注射或輸注、局部投與、吸入或藉由持續釋放或延長釋放方式。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適宜實例包括含有拮抗劑之固體疏水聚合物之半透性基質，其中該等基質呈成形物件之形式(例如膜或微膠囊)。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(甲基丙烯酸-2-羥基乙基酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與L-麩胺酸乙酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOT™ (由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)構成之可注射微球體))及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
本文之醫藥組合物亦可視需要含有一種以上用於所治療特定適應症之活性化合物，較佳為具有彼此不會產生不利影響之補充活性之彼等成分。或者或另外，該組合物可包含細胞毒性劑、化學治療劑、細胞介素、免疫抑制劑或生長抑制劑。此等分子適於以對預期目的有效之量以組合形式存在。
活性成分亦可分別裝入藉由(例如)凝聚技術或界面聚合製備之微膠囊(例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或粗滴乳液中。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences 第18版中。
在一些實施例中，醫藥組合物含於一次性使用小瓶中，諸如一次性使用密封小瓶。在一些實施例中，醫藥組合物含於多次使用之小瓶中。在一些實施例中，醫藥組合物以散裝含於容器中。在一些實施例中，冷凍保存醫藥組合物。IV. 治療 LAG-3 有關疾病之方法
抗LAG-3構築體(例如，抗LAG-3 sdAb、抗LAG-3 HCAb或抗LAG-3 MABP)及其組合物(諸如醫藥組合物)可用於多種應用，諸如用於診斷、分子分析及療法。
本發明之一個態樣提供治療有需要之個體之LAG-3有關疾病或病狀之方法，其包括向該個體投與有效量之包含任一本文所述抗LAG-3構築體之醫藥組合物。在一些實施例中，該LAG-3有關疾病係癌症。在一些實施例中，該LAG-3有關疾病係免疫有關疾病。在一些實施例中，免疫有關疾病係與T細胞功能障礙病症相關。在一些實施例中，T細胞功能障礙病症之特徵在於T細胞無因變性或分泌細胞介素、增殖或執行細胞溶解活性之能力降低。在一些實施例中，T細胞功能障礙病症之特徵在於T細胞耗竭。在一些實施例中，T細胞係CD4+及CD8+ T細胞。在一些實施例中，使用本文所述之抗LAG-3構築體來增加、增強或刺激有需要之受試者之免疫反應或功能。在一些實施例中，該LAG-3有關疾病(例如，癌症、免疫有關疾病)對免疫檢查點分子單一阻斷具有部分抗性(例如，對抗PD-1抗體單一療法治療具有部分抗性)。
在一些實施例中，提供治療個體之LAG-3有關疾病之方法，其包括向該個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含含有抗LAG-3 sdAb之經分離抗LAG-3構築體及醫藥學上可接受之載劑，其中該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供治療個體之LAG-3有關疾病之方法，其包括向該個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含含有抗LAG-3 sdAb之經分離抗LAG-3構築體及醫藥學上可接受之載劑，其中該抗LAG-3 sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 288、295、304或306中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。
在一些實施例中，提供治療個體之癌症(例如，結腸癌)之方法，其包括向該個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含含有抗LAG-3 sdAb之經分離抗LAG-3構築體及醫藥學上可接受之載劑，其中該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供治療個體之癌症(例如，結腸癌)之方法，其包括向該個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含含有抗LAG-3 sdAb之經分離抗LAG-3構築體及醫藥學上可接受之載劑，其中該抗LAG-3 sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 288、295、304或306中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。
在一些實施例中，提供治療個體之LAG-3有關疾病(例如癌症，諸如結腸癌)之方法，其包括向該個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含含有特異性識別LAG-3之sdAb之經分離抗LAG-3 HCAb及醫藥學上可接受之載劑，其中該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體，其中該抗LAG-3 sdAb與免疫球蛋白之Fc片段融合。在一些實施例中，提供治療個體之LAG-3有關疾病(例如癌症，諸如結腸癌)之方法，其包括向該個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含含有抗LAG-3 sdAb之經分離抗LAG-3構築體及醫藥學上可接受之載劑，其中該抗LAG-3 sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；或(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 288、295、304或306中任一者之胺基酸序列之VH H結構域。在一些實施例中，抗LAG-3 sdAb經由肽連接體與Fc片段融合。在一些實施例中，抗LAG-3 HCAb係單體的。在一些實施例中，抗LAG-3 HCAb係二聚體的。在一些實施例中，Fc片段係人類IgG1 Fc、無效應物人類IgG1 Fc、hIgG2 Fc、人類IgG4 Fc或hIgG4 Fc (S228P)。
在一些實施例中，提供治療個體之LAG-3有關疾病(例如癌症，諸如結腸癌)之方法，其包括向該個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含經分離之抗LAG-3構築體(例如，MABP或BABP)及醫藥學上可接受之載劑，該經分離之抗LAG-3構築體包含：(a) 第一抗原結合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個(諸如約1個、2個或3個中之任一者)胺基酸取代之變異體，及(b) 第二抗原結合部分，其特異性結合第二抗原決定基(例如免疫檢查點抑制劑，諸如PD-1)，其中該第一抗原結合部分與該第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，提供治療個體之LAG-3有關疾病(例如癌症，諸如結腸癌)之方法，其包括向該個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含經分離之抗LAG-3構築體(例如，MABP或BABP)及醫藥學上可接受之載劑，該經分離之抗LAG-3構築體包含：(a) 第一抗原結合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，該抗LAG-3 sdAb包含：(1) 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列之CDR3；(2) 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列之CDR3；(3) 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列之CDR3；(4) 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 223之胺基酸序列之CDR3；(5) 包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 119之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 195之胺基酸序列之CDR3，及(b) 第二抗原結合部分，其特異性結合第二抗原決定基(例如免疫檢查點抑制劑，諸如PD-1)，其中該第一抗原結合部分與該第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，第二抗原決定基係來自免疫檢查點分子，諸如PD-1、4-1BB、PD-L1、TIM-3、TIGIT、CTLA-4、VISTA、B7-1、B7-H3、CD47、OX40或GITR。在一些實施例中，第一抗原結合部分在重鏈之N末端、輕鏈之N末端、Fc區之N末端、重鏈之C末端或輕鏈之C末端與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含Fab或scFv。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長4鏈抗體。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含抗PD-1全長抗體(例如，派姆單抗或PD1-BM-min)或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體或其抗原結合片段(例如，Fab、scFv)包含VH ，其包含SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3；及VL ，其包含SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，VH 包含SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，且VL 包含SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體包含含有SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之重鏈及含有SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體包含含有SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之重鏈及含有SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，第一抗原結合部分與第二抗原結合部分經由肽連接體融合。在一些實施例中，第二抗原結合片段包含Fc區，諸如IgG1 Fc、無效應物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc (S228P)。在一些實施例中，抗LAG-3構築體包含含有SEQ ID NO: 358之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 359之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，抗LAG-3構築體包含含有SEQ ID NO: 362之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 363之胺基酸序列之第二多肽。在一些實施例中，抗LAG-3構築體包含含有SEQ ID NO: 381之胺基酸序列之第一多肽及含有SEQ ID NO: 382之胺基酸序列之第二多肽。
在一些實施例中，治療癌症之方法具有以下生物學活性中之一或多者：(1) 殺傷癌細胞(包括旁觀者殺滅)；(2) 抑制癌細胞之增殖；(3) 誘導腫瘤中之免疫反應；(4) 降低腫瘤大小；(5) 緩和患有癌症之個體之一或多種症狀；(6) 抑制腫瘤轉移；(7) 延長存活；(8) 延長癌症進展時間；及(9) 預防、抑制或降低癌症復發之可能性。在一些實施例中，本文所述醫藥組合物介導之殺傷癌細胞之方法可達成至少約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多中任一者之腫瘤細胞死亡率。在一些實施例中，本文所述醫藥組合物介導之降低腫瘤大小之方法可將腫瘤大小降低至少約10% (包括(例如)至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中之任一者)。在一些實施例中，本文所述醫藥組合物介導之抑制腫瘤轉移之方法可將轉移抑制至少約10% (包括(例如)至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中之任一者)。在一些實施例中，本文所述醫藥組合物介導之延長個體(諸如人類)存活之方法可將個體存活延長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24個月中之任一者。在一些實施例中，本文所述醫藥組合物介導之延長癌症進展時間之方法可將癌症進展時間延長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12週中之任一者。在一些實施例中，治療免疫有關疾病之方法可增加、增強或刺激受試者之免疫反應或功能。在一些實施例中，藉由活化受試者中之效應細胞(例如T細胞，例如CD8+及/或CD4+ T細胞)、擴大(增加)效應細胞群體及/或殺傷靶細胞(例如，靶標腫瘤細胞)可增加、增強及/或刺激免疫反應或功能。在一些實施例中，相對於在投與包含本文所述之抗LAG-3構築體之醫藥組合物之前，個體中之CD4及/或CD8 T細胞具有增加或增強之引發、活化、增殖、細胞介素釋放及/或細胞溶解活性。
本文所述之方法適於治療多種癌症，包括實體癌症及液體癌症二者。該等方法適用於所有階段之癌症，包括早期階段癌症、非轉移性癌症、原發性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、轉移性癌症或緩解中之癌症。本文所述之方法可用作第一療法、第二療法、第三療法或與此項技術中已知之其他類型之癌症療法(諸如手術、輻射、化學療法、免疫療法、激素療法或其組合)之組合療法。在一些實施例中，該方法用於治療先前已經治療之個體。在一些實施例中，癌症對於先前療法係難治的。在一些實施例中，該方法用於治療先前未經治療之個體。在一些實施例中，癌症對免疫檢查點抑制劑單一療法具有部分抗性(例如，對抗PD-1抗體單一療法治療具有部分抗性)。
本申請案之醫藥組合物之劑量及期望藥物濃度可端視於所設想之具體用途有所變化。適當劑量或投與途徑之確定在普通技術者之技能內。動物實驗為確定用於人類療法之有效劑量提供可靠指導。有效劑量之物種間推算可遵循Mordenti, J.及Chappell, W.「The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics」，Toxicokinetics and New Drug Development , Yacobi等人編輯，Pergamon Press, New York 1989，第42-46頁規定之原則實施。
當使用活體內投與本文所述之抗LAG-3構築體(諸如抗LAG-3 sdAb、抗LAG-3 HCAb、抗LAG-3 MABP)時，正常劑量量可端視於投與途徑自約10 ng/kg直至約100 mg/kg哺乳動物體重變化。以下係在本申請案之範圍內：不同調配物將對不同治療及不同病症有效，且意欲治療特定器官或組織之投與可需要以不同於投與另一器官或組織之方式遞送。此外，劑量可藉由一或多次分開投與或藉由連續輸注來投與。對於經若干天或更久之重複投與而言，端視病狀而定，持續治療直至疾病症狀出現期望阻抑為止。然而，可使用其他劑量方案。藉由習用技術及分析可容易地監測此療法之進度。
在一些實施例中，單次投與醫藥組合物(例如推注注射)。在一些實施例中，多次(諸如2、3、4、5、6或更多次中之任一者)投與醫藥組合物。若進行多次投與，則其可藉由相同或不同途徑實施且可在相同部位或在替代部位進行。可每天一次至每年一次投與醫藥組合物。投與之間的間隔可係約24 h至1年中之任一者。間隔亦可係無規律的(例如在腫瘤進展後)。在一些實施例中，投藥時間表中無中斷。熟習醫藥技術者藉由監測患者之疾病之徵象且相應地調整治療可容易地確定特定患者之最佳劑量及治療方案。
本申請案之醫藥組合物(包括(但不限於)復溶調配物及液體調配物)係根據已知方法向需要治療之個體、較佳人類投與，該等已知方法諸如以推注方式或藉由經一段時期連續輸注靜脈內投與、藉由肌內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、靜脈內(i.v.)、關節內、滑膜內、鞘內、經口、經局部或吸入途徑。復溶調配物可藉由將凍乾之本文所述抗LAG-3構築體溶解於稀釋劑中而使得蛋白質遍及分散來製備。適用於本申請案中之例示性醫藥學上可接受(安全且對於投與人類無毒)之稀釋劑包括(但不限於)無菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)、或右旋糖溶液或鹽及/或緩衝劑之水溶液。
在一些實施例中，醫藥組合物藉由皮下(亦即在皮膚下)投與投與個體。出於此等目的，醫藥組合物可使用注射器來注射。然而，可獲得用於投與醫藥組合物之其他裝置，諸如注射裝置；注射筆；自動注射裝置；無針裝置；及皮下貼劑遞送系統。在一些實施例中，醫藥組合物以靜脈內方式投與個體。在一些實施例中，醫藥組合物藉由輸注(諸如靜脈內輸注)投與個體。用於免疫療法之輸注技術為此項技術中所已知(例如，參見Rosenberg等人，New Eng. J. of Med. 319: 1676 (1988))。V. 製備方法
本文所述之抗LAG-3構築體(諸如抗LAG-3 sdAb、抗LAG-3 HCAb、抗LAG-3 MABP)可使用此項技術中已知或如本文所述之任何方法來製備。亦參見實例1至實例3。在一些實施例中，提供產生抗LAG-3構築體之方法，其包括：(a) 在有效表現所編碼之抗LAG-3構築體之條件下培養宿主細胞，該宿主細胞包含編碼本文所述抗LAG-3構築體之經分離核酸或載體；及(b) 自該宿主細胞獲得所表現之抗LAG-3構築體。在一些實施例中，步驟(a)之方法進一步包括產生包含編碼本文所述抗LAG-3構築體之經分離核酸或載體之宿主細胞。
已闡述製備sdAb之方法。例如，參見Els Pardon等人，Nature Protocol , 2014; 9(3): 674。sdAb (諸如VH H)可使用此項技術中已知之方法來獲得，諸如藉由對駱駝科動物物種(諸如駱駝或駱馬)進行免疫且自其獲得融合瘤，或藉由使用此項技術中已知之分子生物學技術選殖單一結構域抗體文庫且隨後藉由利用未經選擇文庫之個別純系進行ELISA或藉由使用噬菌體展示來選擇。
為重組產生sdAb，將編碼單一結構域抗體之核酸分離且插入至可複製載體中用於進一步選殖(擴增DNA)或用於表現。使用習用程序容易地分離且定序編碼單一結構域抗體之DNA (例如，藉由使用能夠特異性結合至編碼抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)。可獲得許多載體。載體之選擇部分地取決於欲使用之宿主細胞。通常，較佳宿主細胞為原核或真核(通常哺乳動物)來源。在一些實施例中，編碼本文所述抗LAG-3構築體之經分離核酸包含SEQ ID NO: 267-273中任一者之核酸序列。1. 原核細胞中之重組產生 a) 載體構築
編碼本申請案之抗體之多核酸序列可使用標準重組技術獲得。可自抗體產生細胞(諸如融合瘤細胞)分離且定序期望多核酸序列。或者，可使用核苷酸合成器或PCR技術來合成多核苷酸。一旦獲得，則將編碼多肽之序列插入至能夠在原核宿主中複製且表現異源多核苷酸之重組載體中。此項技術中可獲得且已知之許多載體可用於本發明之目的。適當載體之選擇將主要取決於欲插入至載體中之核酸之大小及欲經載體轉型之特定宿主細胞。每一載體含有各種組件，此取決於其功能(異源多核苷酸之擴增或表現或二者)及其與其所駐留之特定宿主細胞之相容性。載體組件通常包括(但不限於)：複製起點、選擇標記物基因、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸插入物及轉錄終止序列。
一般而言，含有源自與宿主細胞相容之物種之複製子及控制序列之質體載體係與該等宿主結合使用。載體通常攜帶複製位點以及能夠提供經轉型細胞中之表型選擇之標記序列。舉例而言，通常使用pBR322 (一種源自大腸桿菌物種之質體)來使大腸桿菌轉型。pBR322含有編碼胺苄青黴素(Amp)及四環素(Tet)抗性之基因且因此提供易於鑑別經轉型細胞之方式。pBR322、其衍生物或其他微生物質體或噬菌體亦可含有或經修飾以含有可由微生物生物體使用用於表現內源性蛋白質之啟動子。用於表現特定抗體之pBR322衍生物之實例詳細闡述於Carter等人，美國專利第5,648,237號中。
另外，含有與宿主微生物相容之複製子及控制序列之噬菌體載體可作為轉型載體與該等宿主結合使用。舉例而言，可利用諸如GEM™-11等噬菌體來製備重組載體，該重組載體可用於使易感宿主細胞(諸如大腸桿菌LE392)轉型。
本申請案之表現載體可包含兩個或更多個啟動子-順反子對，其編碼多肽組分中之每一者。啟動子係位於順反子上游(5′)且調節其表現之非轉譯調節序列。原核啟動子通常屬於兩種類別，亦即誘導型及組成型。誘導型啟動子係在其控制下因應培養條件之變化(例如存在或不存在營養素或溫度變化)起始增加順反子之轉錄水準之啟動子。
由多種潛在宿主細胞識別之大量啟動子眾所周知。可將所選擇之啟動子可操作地連接至編碼輕鏈或重鏈之順反子DNA，其係藉由經由限制酶消化去除來自源DNA之啟動子且將經分離之啟動子序列插入至本申請案之載體中來實施。天然啟動子序列及許多異源啟動子二者均可用於引導靶基因之擴增及/或表現。在一些實施例中，利用異源啟動子，此乃因與天然靶多肽啟動子相比，其通常允許所表現靶基因轉錄更多且產率更高。
適於與原核宿主一起使用之啟動子包括PhoA啟動子、-半乳糖苷酶(galactamase)及乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統及雜合啟動子(諸如tac或trc啟動子)。然而，在細菌中具有功能之其他啟動子(諸如其他已知細菌或噬菌體啟動子)亦係適宜的。其核酸序列已公開，從而使得熟習此項技術者能夠使用供應任何所需限制位點之連接體或銜接子將其可操作地接合至編碼靶輕鏈及重鏈之順反子(Siebenlist等人(1980)Cell 20: 269)。
在一個態樣中，重組載體內之每一順反子包含分泌信號序列組件，其引導所表現多肽跨膜之遷移。一般而言，信號序列可係載體組件，或其可係插入至載體中之靶多肽DNA之一部分。出於本發明之目的所選擇之信號序列應係由宿主細胞識別且加工(亦即由信號肽酶裂解)之信號序列。對於不識別且處理異源多肽之天然信號序列之原核宿主細胞而言，可用選自由(例如)鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp或熱穩定腸毒素II (STII)前導序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA及MBP組成之群之原核信號序列取代該信號序列。在本申請案之一些實施例中，在表現系統之兩個順反子中所使用之信號序列係STII信號序列或其變異體。
在一些實施例中，本申請案之抗LAG-3構築體之產生可在宿主細胞之細胞質中發生，且因此不需要在每一順反子內存在分泌信號序列。在一些實施例中，多肽組分(諸如視情況與第一抗原結合部分融合之編碼第二抗原結合部分之VH 結構域之多肽及視情況與第一抗原結合部分融合之編碼第二抗原結合部分之VL 結構域之多肽)係在細胞質內表現、摺疊且組裝以形成功能性抗體。某些宿主菌株(例如，大腸桿菌trxB− 菌株)提供有利於二硫鍵形成之細胞質條件，藉此允許所表現蛋白質亞單元之適當摺疊及組裝。Proba及Pluckthun，Gene, 159:203 (1995)。
本發明提供其中可調節所表現多肽組分之定量比以使所分泌及適當組裝之本申請案抗體之產率最大化之表現系統。此調節係至少部分地藉由同時調節多肽組分之轉譯強度來完成。用於調節轉譯強度之一種技術揭示於Simmons等人，美國專利第5,840,523號中。其利用順反子內轉譯起始區(TIR)之變異體。對於給定TIR而言，可產生具有一系列轉譯強度之一系列胺基酸或核酸序列變異體，藉此提供調整此因子之便捷方式以獲得特定鏈之期望表現水準。TIR變異體可藉由習用誘變技術來產生，該等習用誘變技術造成可改變胺基酸序列之密碼子變化，但核酸序列中之沈默變化較佳。TIR中之改變可包括(例如) Shine-Dalgarno序列之數量或間隔之改變以及信號序列中之改變。產生突變信號序列之一種方法係在編碼序列之開始處產生「密碼子庫」，其不改變信號序列之胺基酸序列(亦即，變化係沈默的)。此可藉由改變每一密碼子之第三核苷酸位置來完成；另外，一些胺基酸(諸如白胺酸、絲胺酸及精胺酸)具有多個第一及第二位置，此會增加製備該庫之複雜性。此誘變方法詳細闡述於Yansura等人(1992)METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158中。
較佳地，產生一組其中每一順反子具有一系列TIR強度之載體。此有限組提供在各種TIR強度組合下，每一鏈之表現水準以及期望蛋白質產物之產率之比較。TIR強度可如Simmons等人，美國專利第5,840,523號中所詳細闡述，藉由量化報導基因之表現水準來測定。基於轉譯強度比較，選擇期望之個別TIR以組合於本申請案之表現載體構築體中。 b) 原核宿主細胞
適於表現本申請案之抗體之原核宿主細胞包括古細菌(Archaebacteria)及真細菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏(Gram)陰性或革蘭氏陽性生物體。可用細菌之實例包括大腸桿菌屬(Escherichia )(例如，大腸桿菌)、桿菌屬(Bacilli )(例如，枯草桿菌(B. subtilis ))、腸內細菌(Enterobacteria)、假單胞菌屬(Pseudomonas )物種(例如，銅綠假單胞菌(P. aeruginosa ))、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium )、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans )、克雷伯氏菌屬(Klebsiella )、變形桿菌屬(Proteus )、志賀桿菌屬(Shigella )、根瘤菌屬(Rhizobia )、透明顫菌屬(Vitreoscilla )或副球菌屬(Paracoccus )。在一些實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。在一些實施例中，使用大腸桿菌細胞作為本發明之宿主。大腸桿菌菌株之實例包括菌株W3110 (Bachmann，Cellular and Molecular Biology ，第2卷(Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987)，第1190-1219頁；ATCC保藏號27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE) degP41 kanR 之菌株33D3 (美國專利第5,639,635號)。其他菌株及其衍生物(諸如大腸桿菌294 (ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌1776 (ATCC 31,537)及大腸桿菌RV308 (ATCC 31,608))亦係適宜的。該等實例係為說明性而非為限制性。用於構築具有界定基因型之以上所提及細菌中任一者之衍生物之方法為此項技術中所已知且闡述於(例如) Bass等人，Proteins, 8:309-314 (1990)中。考慮到複製子在細菌細胞中之可複製性，通常需要選擇適當細菌。舉例而言，當使用諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410等眾所周知之質體以提供複製子時，可適宜地使用大腸桿菌、沙雷氏菌屬(Serratia )或沙門桿菌屬(Salmonella )物種作為宿主。
通常，宿主細胞應分泌最少量之蛋白水解酶，且可期望地將其他蛋白酶抑制劑併入細胞培養物中。 c) 蛋白質產生
利用上述表現載體使宿主細胞轉型且在經適當修改之習用營養培養基中培養以誘導啟動子、選擇轉型株或擴增編碼期望序列之基因。轉型意指將DNA引入至原核宿主中，從而使得DNA可作為染色體外元件或作為染色體整合體複製。端視於所用之宿主細胞，使用對於此等細胞適當之標準技術來進行轉型。對於含有大量細胞壁障壁之細菌細胞，通常使用採用氯化鈣之鈣處理。另一轉型方法採用聚乙二醇/DMSO。使用之另一技術為電穿孔。
利用上述表現載體使宿主細胞轉型且在經適當修改之習用營養培養基中培養以誘導啟動子、選擇轉型株或擴增編碼期望序列之基因。轉型意指將DNA引入至原核宿主中，從而使得DNA可作為染色體外元件或作為染色體整合體複製。端視於所用之宿主細胞，使用對於此等細胞適當之標準技術來進行轉型。對於含有大量細胞壁障壁之細菌細胞，通常使用採用氯化鈣之鈣處理。另一轉型方法採用聚乙二醇/DMSO。使用之另一技術為電穿孔。
用於產生本申請案之抗體之原核細胞係在此項技術中已知且適於培養所選擇宿主細胞之培養基中生長。適宜培養基之實例包括luria培養液(LB)加上必要之營養補充劑。在一些實施例中，培養基亦含有基於表現載體之構築所選擇之選擇劑，以選擇性地允許含有表現載體之原核細胞生長。舉例而言，將胺苄青黴素添加至培養基以用於使表現胺苄青黴素抗性基因之細胞生長。
亦可包括適當濃度之除碳、氮及無機磷酸鹽源以外之任何必要補充劑，其係單獨或作為與另一補充劑或培養基之混合物(諸如複合氮源)引入。視情況，培養基可含有一或多種選自由以下組成之群之還原劑：麩胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、巰基乙酸鹽、二硫赤藻糖醇及二硫蘇糖醇。原核宿主細胞係在適宜溫度下培養。舉例而言，對於大腸桿菌生長，較佳溫度係在約20℃至約39℃範圍內，更佳為約25℃至約37℃，甚至更佳為約30℃。培養基之pH可為在約5至約9範圍內之任一pH，此主要取決於宿主生物體。對於大腸桿菌而言，pH較佳為約6.8至約7.4，且更佳為約7.0。
若本申請案之表現載體中使用誘導型啟動子，則在適於使該啟動子活化之條件下誘導蛋白質表現。在本申請案之一個態樣中，使用PhoA啟動子來控制多肽轉錄。因此，將經轉型宿主細胞於磷酸鹽限制培養基中進行培養以用於誘導。較佳地，該磷酸鹽限制培養基係C.R.A.P培養基(例如，參見Simmons等人，J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147)。如此項技術中所已知，根據所採用之載體構築體，可使用多種其他誘導物。
所表現之本申請案之抗LAG-3構築體分泌至宿主細胞周質中且自宿主細胞周質回收。蛋白質回收通常涉及破壞微生物，通常藉由諸如滲透壓衝擊、音波處理或溶解等方式。一旦細胞被破壞，則可藉由離心或過濾去除細胞碎片或完整細胞。蛋白質可藉由(例如)親和樹脂層析進行進一步純化。或者，可將蛋白質轉運至培養基中且在其中分離。可自培養物去除細胞且產生培養物上清液，該培養物上清液經過濾並濃縮以進行進一步蛋白質純化。所表現之多肽可使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及西方墨點分析等通常已知之方法來進一步分離且鑑別。
或者，藉由醱酵製程進行大量蛋白質生產。各種大規模饋料批式醱酵程序可用於產生重組蛋白質。大規模醱酵具有至少1000公升容量、較佳地約1,000公升至100,000公升容量。該等醱酵罐使用攪拌器葉輪來分配氧及營養物、尤其葡萄糖(較佳之碳源/能源)。小規模醱酵通常係指在體積容量不超過大約100公升且可在約1公升至約100公升範圍內之醱酵罐中之醱酵。
在醱酵製程期間，誘導蛋白質表現通常係在細胞已在適宜條件下生長至期望密度(例如，OD550 為約180-220)後起始，在此階段細胞處於早期穩定期。如此項技術中已知及上文所述，根據所採用之載體構築體，可使用多種誘導物。細胞可在誘導之前生長較短時期。通常將細胞誘導約12-50小時，但可使用更長或更短之誘導時間。
為改良本申請案抗體之產量及品質，可修改各種醱酵條件。舉例而言，為改良所分泌多肽之適當組裝及摺疊，可使用過表現諸如Dsb蛋白質(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及或DsbG)或FkpA (具有伴護蛋白活性之肽基脯胺醯基順反異構酶)等伴護蛋白之其他載體來共轉型宿主原核細胞。已證實該等伴護蛋白促進細菌宿主細胞中所產生之異源蛋白質之適當摺疊及溶解性。Chen等人(1999)J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等人，美國專利第6,083,715號；Georgiou等人，美國專利第6,027,888號；Bothmann及Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等人(2001)Mol. Microbiol. 39:199-210。
為使所表現異源蛋白質(尤其蛋白水解敏感之彼等蛋白質)之蛋白分解最小化，可將某些缺乏蛋白水解酶之宿主菌株用於本發明。舉例而言，可修飾宿主細胞菌株以在編碼已知細菌蛋白酶(諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合)之基因中產生一或多個基因突變。一些大腸桿菌蛋白酶缺陷菌株可獲得且闡述於(例如) Joly等人(1998)，上文文獻；Georgiou等人，美國專利第5,264,365號；Georgiou等人，美國專利第5,508,192號；Hara等人，Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)中。
缺乏蛋白水解酶且經過表現一或多種伴護蛋白之質體轉型之大腸桿菌菌株可用作編碼本申請案抗體之表現系統中之宿主細胞。 d) 蛋白質純化
本文所產生之抗LAG-3構築體經進一步純化以獲得實質上均質之製備物以供進一步的分析及使用。可採用此項技術中已知之標準蛋白質純化方法。以下程序係適宜純化程序之實例：免疫親和管柱或離子交換管柱上之分級分離、乙醇沈澱、反相HPLC、二氧化矽上或陽離子交換樹脂(諸如DEAE)上之層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沈澱及使用(例如) Sephadex G-75之凝膠過濾。
在一些實施例中，固定在固相上之蛋白質A用於本申請案包含Fc區之抗體之免疫親和純化。蛋白質A係來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas )之41 kD細胞壁蛋白，其以高親和力結合至抗體之Fc區。Lindmark等人(1983)J. Immunol. Meth. 62:1-13。固定有蛋白質A之固相較佳係包含玻璃或二氧化矽表面之管柱，更佳係可控孔徑玻璃管柱或矽酸管柱。在一些應用中，管柱經試劑(諸如甘油)塗覆，以試圖防止污染物之非特異性黏附。接著洗滌固相以去除非特異性地結合至該固相之污染物。最後，藉由溶析自固相回收所關注抗體。2. 在真核細胞中之重組產生
對於真核表現，載體組件通常包括(但不限於)以下中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多種標記物基因及增強子元件、啟動子及轉錄終止序列。 a) 信號序列組件
用於真核宿主中之載體亦可係插入物，其編碼信號序列或在成熟蛋白質或多肽之N末端具有特異性裂解位點之其他多肽。所選擇之異源信號序列較佳係由宿主細胞識別且加工(亦即，由信號肽酶裂解)之異源信號序列。在哺乳動物細胞表現中，可獲得哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例如單純疱疹gD信號。
將此前體區之DNA與編碼本申請案抗體之DNA在閱讀框內接合。 b) 複製起點
通常，哺乳動物表現載體不需要複製起點組件(通常可使用SV40起點，此僅係由於其含有早期啟動子)。 c) 選擇基因組件
表現及選殖載體可含有選擇基因，其亦稱為可選標記物。典型選擇基因編碼如下蛋白質：(a) 賦予對抗生素或其他毒素(例如，胺苄青黴素、新黴素(neomycin)、胺甲蝶呤或四環素)之抗性，(b) 補足營養缺陷型不足，或(c) 供給無法自複合培養基獲得之關鍵營養物，例如編碼桿菌之D-丙胺酸消旋酶之基因。
選擇方案之一個實例利用藥物來阻滯宿主細胞之生長。經異源基因成功轉型之彼等細胞產生賦予抗藥性之蛋白質，且因此可在該選擇方案中存活。此佔優選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸(mycophenolic acid)及潮黴素(hygromycin)。
哺乳動物細胞之適宜可選標記物之另一實例係使得能夠鑑別有能力吸收編碼本申請案抗體之核酸的細胞之彼等可選標記物，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及金屬硫蛋白-II (較佳地靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷去胺酶、鳥胺酸去羧酶等。
舉例而言，首先藉由在含有胺甲蝶呤(Mtx) (亦即DHFR之競爭性拮抗劑)之培養基中培養所有轉型株來鑑別經DHFR選擇基因轉型之細胞。當採用野生型DHFR時，適當宿主細胞係缺乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株(例如，ATCC CRL-9096)。
或者，經編碼多肽之DNA序列、野生型DHFR蛋白及另一可選標記物(諸如胺基糖苷3′-磷酸轉移酶(APH))轉型或共轉型之宿主細胞(特定而言含有內源性DHFR之野生型宿主)可藉由在含有針對該可選標記物之選擇劑(諸如胺基糖苷抗生素，例如康黴素(kanamycin)、新黴素或G418)之培養基中使細胞生長來進行選擇。參見美國專利第4,965,199號。 d) 啟動子組件
表現及選殖載體通常含有由宿主生物體識別且可操作地連接至編碼期望多肽序列之核酸之啟動子。事實上，所有真核基因均具有富AT區，其位於轉錄起始位點上游大約25至30個鹼基處。在許多基因之轉錄起始點上游70個至80個鹼基處發現之另一序列係CNCAAT區，其中N可係任一核苷酸。在大多數真核基因之3′端處為AATAAA序列，其可係向編碼序列之3′端添加聚A尾之信號。所有該等序列均可插入至真核表現載體中。
適合與原核宿主一起使用之其他啟動子包括phoA啟動子、-內醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶啟動子、色胺酸(trp)啟動子系統及雜合啟動子(諸如tac啟動子)。然而，其他已知之細菌啟動子亦係適宜的。用於細菌系統中之啟動子亦將含有可操作地連接至編碼抗體之DNA之Shine-Dalgarno (S.D.)序列。
在哺乳動物宿主細胞中自載體之多肽轉錄係受(例如)以下啟動子控制：自病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2型)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及最佳猿猴病毒40 (Simian Virus 40) (SV40))基因體獲得之啟動子、自異源哺乳動物啟動子(例如，肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)獲得之啟動子、自熱休克啟動子獲得之啟動子，條件係此等啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子係便捷地以SV40限制性片段形式獲得，其亦含有SV40病毒複製起點。人類巨細胞病毒之立即早期啟動子係便捷地以HindIII E限制性片段形式獲得。使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表現DNA之系統揭示於美國專利第4,419,446號中。此系統之修改形式闡述於美國專利第4,601,978號中。亦參見Reyes等人，Nature 297:598-601 (1982)，其係關於在來自單純疱疹病毒之胸苷激酶啟動子控制下在小鼠細胞中表現人類干擾素cDNA。或者，可使用勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)長末端重複序列作為啟動子。 e) 增強子元件組件
藉由將增強子序列插入至載體中通常可增加高等真核生物對編碼本申請案抗體之DNA之轉錄。現已知多種增強子序列係來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎兒蛋白及胰島素)。然而，通常將使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括位於複製起點(100-270 bp)後側上之SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、位於複製起點後側上之多瘤病毒增強子及腺病毒增強子。關於使真核啟動子活化之增強元件，亦參見Yaniv,Nature 297:17-18 (1982)。增強子可在多肽編碼序列之5′或3′位置處剪接進入載體中，但較佳係位於啟動子之5′位點。 f) 轉錄終止組件
用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類細胞或來自其他多細胞性生物體之有核細胞)中之表現載體亦將含有終止轉錄及穩定mRNA所需之序列。此等序列通常可自真核生物或病毒DNA或cDNA之5′及(偶爾) 3′非轉譯區獲得。該等區含有在編碼多肽之mRNA的非轉譯部分中轉錄為多聚腺苷酸化片段之核苷酸區段。一種可用轉錄終止組件係牛生長激素多聚腺苷酸化區。參見WO94/11026及其中所揭示之表現載體。 g) 宿主細胞之選擇及轉型
用於在本文載體中選殖或表現DNA之適宜宿主細胞包括本文所述之高等真核生物細胞，包括脊椎動物宿主細胞。脊椎動物細胞在培養(組織培養)中之繁殖已成為常規程序。可用哺乳動物宿主細胞株之實例係由SV40轉型之猴腎CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎株(亞選殖用於在懸浮培養中生長之293或293細胞，Graham等人，J. Gen Virol. 36:59 (1977))；幼小倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO，Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；小鼠賽特利細胞(sertoli cell)(TM4，Mather,Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1細胞(Mather等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝細胞瘤株(Hep G2)。
利用上述用於抗體產生之表現或選殖載體使宿主細胞轉型，且在經適當修改之習用營養培養基中培養以誘導啟動子、選擇轉型株或擴增編碼期望序列之基因。 h) 培養宿主細胞
用於產生本申請案抗體之宿主細胞可在多種培養基中培養。諸如Ham's F10 (Sigma)、最小必需培養基((MEM)，(Sigma))、RPMI-1640 (Sigma)及達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基((Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM), Sigma)等市售培養基適於培養宿主細胞。另外，可使用以下文獻中所闡述之任一培養基作為宿主細胞之培養基：Ham等人，Meth. Enz. 58:44 (1979)；Barnes等人，Anal. Biochem. 102:255 (1980)；美國專利第4,767,704號；第4,657,866號；第4,927,762號；第4,560,655號；或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利再審案30,985。該等培養基中之任一者可視需要補充有激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCIN™藥物)、微量元素(定義為通常以微莫耳濃度範圍內之最終濃度存在之無機化合物)及葡萄糖或等效能源。亦可包括將為熟習此項技術者已知之適當濃度之任何其他所需補充劑。諸如溫度、pH及諸如此類等培養條件係先前與經選擇用於表現之宿主細胞一起使用之彼等培養條件，且將為普通技術人員所明瞭。 i) 蛋白質純化
當使用重組技術時，抗體可在細胞內、在周質空間中產生，或直接分泌至培養基中。若抗體係在細胞內產生，則作為第一步驟，例如藉由離心或超濾去除微粒碎片(亦即宿主細胞或溶解片段)。Carter等人，Bio/Technology 10:163-167 (1992)闡述用於分離分泌至大腸桿菌周質空間中之抗體之程序。簡言之，經約30 min使細胞糊在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲基磺醯氟(PMSF)存在下解凍。可藉由離心去除細胞碎片。倘若抗體分泌至培養基中，則通常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自此等表現系統之上清液。可在前述任一步驟中納入蛋白酶抑制劑(諸如PMSF)以抑制蛋白分解且可納入抗生素以防止外來污染物生長。
自細胞製備之蛋白質組合物可使用(例如)羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析來純化，其中親和層析係較佳純化技術。蛋白質A作為親和配位體之適宜性取決於存在於抗體中之任一免疫球蛋白Fc結構域之種類及同型。蛋白質A可用於純化基於人類免疫球蛋白含有1、2或4條重鏈之抗體(Lindmark等人，J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。推薦蛋白質G用於所有小鼠同型及人類3 (Guss等人，EMBO J. 5:15671575 (1986))。親和配位體所附接之基質最常為瓊脂糖，但可使用其他基質。機械穩定基質(諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯)容許達成較使用瓊脂糖可達成者更快之流速及更短之加工時間。倘若抗體包含CH 3結構域，則Bakerbond ABXTMresin (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)可用於純化。端視欲回收之抗體，亦可使用其他蛋白質純化技術，諸如在離子交換管柱上分級分離、乙醇沈澱、反相HPLC、矽膠上層析、肝素SEPHAROSE™上層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)上層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。
在任何初步純化步驟後，可使用pH介於約2.5-4.5之間的溶析緩衝液使包含所關注抗體及污染物之混合物經受低pH疏水相互作用層析，其較佳係在低鹽濃度(例如，約0 M-0.25 M鹽)下實施。3. 多株抗體
多株抗體通常係在動物中藉由多次皮下(s.c.)或腹膜內(i.p.)注射相關抗原及佐劑來產生。有用地，可使用雙官能基劑或衍生劑(例如，馬來醯亞胺基苯甲醯基磺基琥珀醯亞胺酯(經由半胱胺酸殘基結合)、N-羥基琥珀醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2 或R1 N═C═NR，其中R及R1 獨立地係低碳數烷基)使相關抗原與在欲免疫物種體內具有免疫原性之蛋白質(例如，鑰孔帽貝血藍蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)結合。可採用佐劑之實例包括弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)及MPL-TDM佐劑(單磷醯基脂質A、合成海藻糖二棒桿黴菌酸酯(trehalose dicorynomycolate))。熟習此項技術者無需過多實驗即可選擇免疫方案。
藉由以下方式對動物實施針對抗原、免疫原性結合物或衍生物之免疫：將(例如) 100 μg或5 μg蛋白質或結合物(分別用於兔或小鼠)與3體積之弗氏完全佐劑組合且在多個部位皮內注射該溶液。1個月後，藉由在多個部位皮下注射用佔初始量1/5至1/10之於弗氏完全佐劑中之肽或結合物對動物加強免疫。7天至14天後，抽取動物之血液且對血清進行抗體效價分析。對動物加強免疫直至效價達到穩定狀態。結合物亦可在重組細胞培養物中作為蛋白融合物來製得。此外，諸如明礬等聚集劑適於增強免疫反應。關於駱駝中之免疫，亦參見實例1。4. 單株抗體
單株抗體係自實質上同源之抗體群體獲得，亦即，除可少量存在之可能天然突變及/或轉譯後修飾(例如，異構化、醯胺化)外，構成該群體之個別抗體均相同。因此，修飾語「單株」指示抗體之特徵並非分立抗體之混合物。舉例而言，單株抗體可使用最早由Kohler等人，Nature, 256:495 (1975)所闡述之融合瘤方法來製得或可藉由重組DNA方法(美國專利第4,816,567號)來製得。在融合瘤方法中，如上文所闡述對小鼠或其他適當宿主動物(諸如倉鼠或駱馬)實施免疫以誘發產生或能夠產生將與免疫所用蛋白質特異性結合之抗體的淋巴球。或者，可在活體外對淋巴球實施免疫。接著，使用適宜融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴球與骨髓瘤細胞融合，以形成融合瘤細胞(Goding，Monoclonal Antibodies : Principles and Practice ，第59-103頁(Academic Press, 1986)。關於駱駝中之免疫，亦參見實例1。
免疫劑通常將包括抗原性蛋白或其融合變異體。通常，若期望人類來源之細胞，則使用外周血淋巴球(「PBL」)，或若期望非人類哺乳動物來源之細胞，則使用脾細胞或淋巴結細胞。接著，使用適宜融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴球與永生化細胞株融合，以形成融合瘤細胞。Goding，Monoclonal Antibodies: Principles and Practice , Academic Press (1986)，第 59-103頁。
永生化細胞株通常為經轉型之哺乳動物細胞，特定而言為囓齒類動物、牛或人類來源之骨髓瘤細胞。通常，採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞株。將由此製備之融合瘤細胞接種於適宜培養基中且使之於其中生長，該培養基較佳含有一或多種抑制未融合親代骨髓瘤細胞生長或存活之物質。舉例而言，若親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(HAT培養基)，它們係可防止HGPRT缺陷型細胞生長之物質。
較佳之永生化骨髓瘤細胞係有效融合、支持所選抗體產生細胞穩定大量產生抗體且對培養基(諸如HAT培養基)敏感之彼等細胞。在該等細胞中，較佳者係鼠類骨髓瘤株，諸如源自MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤之彼等骨髓瘤株(可自沙克研究院細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center), San Diego, Calif. USA獲得)，以及SP-2細胞(及其衍生物，例如X63-Ag8-653) (可自美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection), Manassas, Va. USA獲得)。亦已闡述將人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株用於產生人類單株抗體(Kozbor，J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications ，第51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
對其中生長融合瘤細胞之培養基分析針對抗原之單株抗體之產生。較佳地，融合瘤細胞所產生單株抗體之結合特異性係藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析(諸如放射性免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA))來測定。
可對其中培養融合瘤細胞之培養基分析針對期望抗原之單株抗體之存在。較佳地，單株抗體之結合親和力及特異性可藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析(諸如放射性免疫分析(RIA)或酶聯分析(ELISA))來測定。此等技術及分析為此項技術中所已知。舉例而言，結合親和力可藉由Munson等人，Anal.Biochem. , 107:220 (1980)之Scatchard分析來測定。
在鑑別產生具有期望特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞後，可藉由有限稀釋程序對純系進行亞選殖且藉由標準方法使其生長(Goding，上文文獻)。用於此目的之適宜培養基包括(例如) D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，可使融合瘤細胞作為哺乳動物內之腫瘤在活體內生長。
適宜地藉由諸如蛋白質A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析等習用免疫球蛋白純化程序將亞純系分泌之單株抗體自培養基、腹水或血清中分離。
單株抗體亦可藉由重組DNA方法製得，諸如美國專利第4,816,567號中所述及如上文所述之彼等方法。編碼單株抗體之DNA可使用習用程序容易地分離且定序(例如，藉由使用能夠特異性結合至編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈的基因之寡核苷酸探針)。融合瘤細胞用作此DNA之較佳來源。一旦分離，則可將DNA置於表現載體中，接著將該等表現載體轉染至原本不產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以在此等重組宿主細胞中合成單株抗體。關於編碼抗體之DNA在細菌中重組表現之綜述文章包括Skerra等人，Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)及Pliickthun，Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)。
在另一實施例中，抗體可自使用McCafferty等人，Nature , 348:552-554 (1990)中所述之技術產生的抗體噬菌體文庫分離。Clackson等人，Nature , 352:624-628 (1991)及Marks等人，J. Mol. Biol. , 222:581-597 (1991)闡述使用噬菌體庫分別分離鼠類及人類抗體。後續出版物闡述藉由鏈改組(Marks等人，Bio/Technology , 10:779-783 (1992))以及作為用於構築極大噬菌體文庫之策略之組合感染及活體內重組(Waterhouse等人，Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993))來產生高親和力(nM範圍)人類抗體。因此，該等技術係對用於分離單株抗體之傳統單株抗體融合瘤技術之可行替代方案。
亦可(例如)藉由以下方式來修飾DNA：用人類重鏈及輕鏈恆定結構域之編碼序列取代同源鼠類序列(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc. Natl Acad. Sci. USA , 81:6851 (1984))，或將非免疫球蛋白多肽之編碼序列之全部或一部分共價連接至免疫球蛋白編碼序列。通常，此等非免疫球蛋白多肽取代抗體之恆定結構域，或其取代抗體之一個抗原組合位點之可變結構域以產生嵌合二價抗體，該嵌合二價抗體包含一個對抗原具有特異性之抗原組合位點及另一對不同抗原具有特異性之抗原組合位點。
本文所述之單株抗體可係單價的，其製備為此項技術中所熟知。舉例而言，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈及經修飾重鏈之重組表現。重鏈通常在Fc區中之任一點處截短以防止重鏈交聯。或者，可使相關半胱胺酸殘基由另一胺基酸殘基取代或使其缺失以防止交聯。活體外方法亦適於製備單價抗體。消化抗體以產生其片段、特定而言Fab片段可使用此項技術中已知之常規技術來完成。
亦可使用合成蛋白質化學中之已知方法(包括涉及交聯劑之彼等方法)在活體外製備嵌合或雜合抗體。舉例而言，可使用二硫鍵交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築免疫毒素。用於此目的之適宜試劑之實例包括亞胺基硫醇酯及4-巰基丁醯亞胺酸甲基酯。
關於單株sdAb產生，亦參見實例1。5. 人類化抗體
非人類(例如，鼠類)抗體之人類化形式係嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2 或抗體之其他抗原結合子序列)，其含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列。人類化抗體包括人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之CDR之殘基由來自諸如小鼠、大鼠、兔、駱駝科動物或駱馬等非人類物種(供體抗體)之CDR且具有期望特異性、親和力及能力之殘基替換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv框架殘基由相應非人類殘基替換。人類化抗體亦可包含在接受者抗體及導入之CDR或框架序列中均未發現之殘基。一般而言，人類化抗體可包含實質上全部之至少一個、且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部之CDR區對應於非人類免疫球蛋白之彼等CDR區，且全部或實質上全部之FR區係人類免疫球蛋白共有序列之彼等FR區。在一些實施例中，人類化抗體將包含免疫球蛋白恆定區(Fc) (通常為人類免疫球蛋白恆定區)之至少一部分。例如，參見Jones等人，Nature, 321: 522-525 (1986)；Riechmann等人，Nature, 332: 323-329 (1988)；Presta，Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)。
用於使非人類抗體人類化之方法為此項技術中所熟知。通常，人類化抗體具有自非人類來源引入至其中之一或多個胺基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基通常稱為「導入」殘基，其通常取自「導入」可變結構域。人類化可遵循Winter及合作者之方法(Jones等人，Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等人，Science 239:1534-1536 (1988))或經由用囓齒類動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列來基本上實施。因此，此等「人類化」抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上少於一個完整人類可變結構域已由來自非人類物種之相應序列所取代。實際上，人類化抗體通常為人類抗體，其中一些CDR殘基及可能一些FR殘基由來自囓齒類動物抗體中類似位點之殘基所取代。
欲用於製備人類化抗體之人類可變結構域(輕鏈可變結構域及重鏈可變結構域二者)之選擇對於降低抗原性極為重要。根據所謂的「最佳擬合」方法，針對已知人類可變結構域序列之整個文庫來篩選囓齒類動物抗體之可變結構域之序列。然後接受最接近囓齒類動物序列之人類序列作為人類化抗體之人類框架(FR)。Sims等人，J. Immunol. , 151:2296 (1993)；Chothia等人，J. Mol. Biol. , 196:901 (1987)。另一方法使用源自輕鏈或重鏈之特定亞組之所有人類抗體之共有序列的特定框架。相同框架可用於若干種不同人類化抗體。Carter等人，Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等人，J. Immunol. 151:2623 (1993)。
此外重要的是，人類化抗體應保留對抗原之高親和力及其他有利之生物學性質。為達成此目標，根據較佳方法，藉由使用親代及人類化序列之三維模型分析親代序列及各種概念性人類化產物之製程來製備人類化抗體。三維免疫球蛋白模型通常可獲得且為熟習此項技術者所熟悉。可使用電腦程式，該等電腦程式說明且展示所選候選免疫球蛋白序列之可能的三維構形結構。觀察該等展示內容容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能行使中之可能作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結合之能力的殘基。以此方式，可自接受者序列及導入序列選擇FR殘基且合併使得達成期望抗體特性，諸如對一或多種靶抗原之親和力增加。一般而言，CDR殘基直接且最為實質性地參與影響抗原結合。
在一些實施例中，sdAb經修飾(諸如人類化)，而不減小結構域對抗原之天然親和力且同時降低其對異源物種之免疫原性。舉例而言，可確定駱馬抗體之抗體可變結構域(VH H)之胺基酸殘基，且將例如框架區中之駱駝科動物胺基酸中之一或多者用如在人類共有序列中所發現之其人類對應體替換，而該多肽不失去其典型特徵，亦即人類化不顯著影響所得多肽之抗原結合能力。駱駝科sdAb之人類化需要在單一多肽鏈中引入有限量之胺基酸且使其誘變。此與scFv、Fab'、(Fab')2 及IgG之人類化相反，後者需要在兩條鏈(輕鏈及重鏈)中引入胺基酸變化且保留兩條鏈之組裝。6. 人類抗體
作為人類化之替代方式，可產生人類抗體。舉例而言，目前可產生基因轉殖動物(例如小鼠)，該等基因轉殖動物在免疫後能夠在不產生內源性免疫球蛋白之情況下產生完整人類抗體譜。舉例而言，已闡述在嵌合及生殖系突變小鼠中抗體重鏈接合區(JH )基因之同型接合缺失導致內源性抗體產生之完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此等生殖系突變小鼠中可在受到抗原攻擊後產生人類抗體。例如，參見Jakobovits等人，PNAS USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等人，Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol., 7:33 (1993)；美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,591,669號、第5,545,807號；及WO 97/17852。能夠產生完全人類sdAb之基因轉殖小鼠或大鼠為此項技術中所已知。例如，參見US20090307787A1、美國專利第8,754,287號、US20150289489A1、US20100122358A1及WO2004049794。
或者，可使用噬菌體展示技術在活體外自來自未經免疫供體之免疫球蛋白可變(V)結構域基因譜產生人類抗體及抗體片段。McCafferty等人，Nature 348:552-553 (1990)；Hoogenboom及Winter，J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)。根據此技術，將抗體V結構域基因框內選殖至絲狀噬菌體(諸如M13或fd)之主要或次要外殼蛋白基因中，且在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。由於絲狀顆粒含有噬菌體基因體之單鏈DNA拷貝，故基於抗體功能性質之選擇亦導致對編碼展現彼等性質之抗體之基因的選擇。因此，噬菌體模擬B細胞之一些性質。噬菌體展示可以多種形式來實施，且綜述於(例如) Johnson, Kevin S及Chiswell, David J. ，Curr. Opin Struct. Biol. 3:564-571 (1993)中。可使用若干V基因區段來源進行噬菌體展示。Clackson等人，Nature 352:624-628 (1991)自源自經免疫小鼠脾之V基因之小型隨機組合文庫分離出抗噁唑酮抗體之多樣陣列。可構築來自未經免疫之人類供體之V基因譜，且可遵循Marks等人，J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)或Griffith等人，EMBO J. 12:725-734 (1993)所闡述之技術基本上分離出針對抗原多樣陣列(包括自體抗原)之抗體。亦參見美國專利第5,565,332號及第5,573,905號。
Cole等人及Boerner等人之技術亦可用於製備人類單株抗體(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss，第77頁(1985)及Boerner等人，J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991))。類似地，人類抗體可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入至其中內源性免疫球蛋白基因已部分或完全不活化之基因轉殖動物(例如小鼠)中來製得。在攻擊時，觀察到人類抗體產生，其在所有方面(包括基因重排、組裝及抗體譜)均非常類似於在人類中可見之情形。此方法闡述於(例如)美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；及第5,661,016號，及Marks等人，Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)；Lonberg等人，Nature, 368: 856-859 (1994)；Morrison，Nature, 368: 812-813 (1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)；Neuberger，Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)；Lonberg及Huszar，Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)中。舉例而言，在一些實施例中，人類抗體(例如，人類DAb)可藉由對人類HCAb小鼠進行免疫來產生。舉例而言，HCAb (例如，sdAb-Fc融合蛋白)可藉由對其中內源性鼠類抗體表現已消除且已引入人類轉殖基因之基因轉殖小鼠進行免疫來產生。HCAb小鼠揭示於US8,883,150、US8,921,524、US8,921,522、US8,507,748、US8,502,014、US2014/0356908、US2014/0033335、US2014/0037616、US2014/0356908、US2013/0344057、US2013/0323235、US2011/0118444及US2009/0307787中，所有該等參考文獻均係以引用的方式併入本文中，其揭示之全部均係關於僅重鏈抗體及其在基因轉殖小鼠中之產生。對HCAb小鼠進行免疫，且將所得引發之脾細胞與鼠類骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤。接著可藉由用人類序列替換鼠類CH2及CH3區以使所得HCAb為完全人類的。
最後，人類抗體亦可由活體外活化之B細胞(參見美國專利5,567,610及5,229,275)或藉由使用此項技術中已知之各種技術，包括噬菌體展示文庫(Hoogenboom及Winter，J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等人，J. Mol. Biol., 222:581 (1991)來產生。VI. 製品及套組
進一步提供套組及製品，其包含以下中之任一者：經分離之抗LAG-3構築體(諸如抗LAG-3 sdAb、抗LAG-3 HCAb、抗LAG-3 MABP)、編碼其之經分離核酸或載體或包含編碼本文所述抗LAG-3構築體之經分離核酸或載體之經分離宿主細胞。在一些實施例中，提供套組，其包含任一本文所述醫藥組合物且較佳提供其使用說明書。
本申請案之套組係呈適宜包裝。適宜包裝包括(但不限於)小瓶、瓶、廣口瓶、軟質包裝(例如，密封Mylar或塑膠袋)及諸如此類。套組可視情況提供諸如緩衝劑之額外組分及解釋性資訊。由此，本申請案亦提供製品，其包括小瓶(諸如密封小瓶)、瓶、廣口瓶、軟質包裝及諸如此類。
該製品可包含容器及位於該容器上或隨該容器附帶之標籤或包裝插頁。適宜容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器等。容器可由諸如玻璃或塑膠等多種材料來形成。通常，容器容納有效用於治療本文所述疾病或病症(諸如癌症)之組合物，且可具有無菌輸液埠(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子之小瓶)。標籤或包裝插頁指示組合物用於治療個體之特定病狀。標籤或包裝插頁將進一步包含用於向個體投與組合物之說明書。標籤可指示復溶及/或使用之指導。容納醫藥組合物之容器可為多次使用之小瓶，其容許復溶調配物之重複投與(例如，投與2-6次)。包裝插頁係指通常包括於治療產品之商業包裝內之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、禁忌及/或關於此等治療產品之使用警告之資訊。另外，製品可進一步包含第二容器，該第二容器包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。製品可進一步包括自商業及使用者角度合意之其他物料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
套組或製品可包括醫藥組合物之多個單位劑量及使用說明書，其以足以在藥房(例如，醫院藥房及從事複方之藥房)中儲存及使用之量包裝。 實例
下文實例僅意欲例示本發明且因此不應視為以任何方式限制本發明。以下實例及詳細說明係以說明方式而非限制方式提供。實例 1 ：抗 LAG-3 sdAb 之產生 免疫
利用重組LAG-3-His及LAG-3-Fc (Acrobiosystems及R&D Systems)蛋白及表現人類LAG-3之CHO-K1細胞(CHO-huLAG-3細胞)對駱駝進行免疫，所有均係根據目前之動物福利規定。為進行免疫，將抗原調配為與CFA (弗氏完全佐劑；初次免疫)或IFA (弗氏不完全佐劑；加強免疫)之乳液。抗原係在頸部以皮下方式投與。每一動物以兩週間隔接受5次100 μg LAG-3-His於CFA乳液中之注射及隨後的5次LAG-3-Fc於IFA乳液中之注射。隨後，實施CHO-huLAG-3細胞之兩次加強免疫及LAG-3蛋白之兩次加強免疫。在免疫時間表期間之各個時間點，自動物收集10 mL血液樣品且製備血清。在基於ELISA之分析中，利用固定之LAG-3-Fc蛋白或Fc蛋白作為對照，使用血清樣品驗證抗原特異性體液性免疫反應之誘導(圖1及圖2)。儘管偵測到針對Fc蛋白之抗體，但所觀察到之與LAG-3-Fc之抗體結合甚至更強，從而顯示針對LAG-3蛋白之反應之充分引發。特定而言，偵測到針對LAG-3蛋白之重鏈免疫球蛋白(HCAb)。最後一次免疫5天後，自每一動物收集300 mL血液樣品。使用FICOLL® -Paque梯度(Amersham Biosciences)，自此300 mL血液樣品分離作為駱駝HCAb之遺傳來源之外周血淋巴球(PBL)，產生1×109 個PBL。 文庫構築
使用自PBL提取之RNA作為RT-PCR之起始材料以擴增sdAb編碼基因片段。將該等片段選殖至內部噬粒載體中。該載體框內編碼C末端His標籤與sdAb編碼序列。文庫大小為大約6×108 bp。根據標準方案製備文庫噬菌體，經過濾器滅菌，且在4℃下儲存以供進一步使用。 選擇及高通量篩選
使用固體淘選以及基於細胞之淘選對上文文庫實施選擇。對兩種條件僅實施單輪選擇。分析每一選擇輸出物之富集因子(相對於對照，溶析液中存在之噬菌體數)，以及LAG-3陽性純系之多樣性及百分比(ELISA)。基於該等參數，擇選最佳選擇用於進一步分析。為此，將每一選擇之輸出物作為集合體重新選殖至可溶性表現載體中以進行高通量篩選。該載體框內編碼C末端His標籤與sdAb編碼序列。挑取群落且於96深孔板(於1 mL體積中)中生長；藉由向該等群落添加IPTG及0.1% Triton來誘導sdAb表現及釋放至上清液中。
分析上清液中之內容物結合至LAG-3蛋白(藉由ELISA)及表現LAG-3之CHO-K1穩定細胞株(藉由FACS)之能力。對陽性結合物進行定序且選擇獨特之純系用於進一步表徵。
使獨特純系於2XYT培養基中生長；藉由向該等純系添加IPTG來誘導sdAb表現及釋放至上清液中。分析含有獨特結合物之上清液抑制MHC II與LAG-3之間的相互作用之能力。為此，使表現MHC II之A375黑色素瘤細胞與含有sdAb之上清液及生物素化之LAG-3-Fc一起培育，之後與螢光團標記之鏈黴抗生物素蛋白一起培育。與無抗LAG-3 sdAb阻斷之樣品相比，平均螢光強度(MFI)之變化代表對MHC II/LAG-3相互作用之抑制。
選擇所有潛在抑制劑藉由表面電漿子共振(SPR)在BIACORETM T200儀器上進行KD 分析。解離期用於計算每一個別sdAb之koff 值。實例 2 ：非人類化抗 LAG-3 sdAb-Fc 融合蛋白之製備及活體外評估 sdAb-Fc融合蛋白之產生
藉由使抗LAG-3 sdAb與人類IgG4 Fc區融合來產生抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白構築體。此處提及之IgG4 Fc攜帶S228P突變以防止臂交換。製備構築體之大量製備物(maxiprep)用於CHO-K1細胞瞬時表現及純化。藉由層析經由含有蛋白質A瓊脂糖樹脂之管柱純化所表現之抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白。藉由SEC-HPLC測定蛋白質純度。Bristol-Myers Squibb所產生之抗LAG-3單株抗體BMS-986016係根據公開專利中之序列(參見WO/2015/116539，SEQ ID NO: 17及18；在本申請案中以SEQ ID NO: 354及355併入本文中)在人類IgG4主鏈上產生。 藉由表面電漿子共振(SPR)之靶蛋白結合及跨物種反應測試
利用BIACORETM T200儀器藉由SPR測定每一抗LAG-3抗體(sdAb-Fc融合蛋白或mAb形式)之親和力常數(KD )。簡言之，經由捕獲抗體(Jackson ImmunoResearch目錄號115-005-071)將抗LAG-3抗體以適當密度固定在感測器晶片上。以不少於5個不同濃度注射人類或食蟹猴LAG-3蛋白(Acrobiosystem，分別772-6BGF2-D5及2187-71HF1-DZ)。使用BIACORETM T200評估軟體獲得解離速率常數(koff )及締合速率常數(kon )之數據，且自koff 對kon 之比率計算親和力常數(KD )。若干種例示性抗LAG-3抗體之動力學數據彙總於表2中。表 2. 非人類化抗 LAG-3 sdAb-Fc 融合蛋白針對 LAG-3 之親和力測定
Figure 108111097-A0304-0003
 抗原決定基分箱測試
在OCTET® RED96儀器(ForteBio)上實施抗原決定基分箱測試。所有量測均係在30℃下實施。使用胺偶合方法將所關注sdAb-Fc融合蛋白固定至生物感測器上。將人類LAG-3蛋白稀釋於PBST緩衝液(1× PBS，pH 7.4及0.05% Tween-20)中，用作分析物1。人類LAG-3 (與分析物1中之濃度相同)及第二LAG-3結合實體(其可係第二sdAb-Fc融合蛋白或基準抗體BMS-986016)之混合物用作分析物2。首先將塗覆之生物感測器浸入至分析物1中，且在再生及平衡後浸入至分析物2中。比較分析物1之感測圖(亦即，單獨之人類LAG-3之曲線)及分析物2之感測圖(亦即，人類LAG-3 +第二LAG-3結合實體之曲線)以確定所關注sdAb-Fc融合蛋白之結合競爭。分箱結果示於圖3中。所測試之4種非人類化sdAb-Fc融合蛋白均不與BMS-986016競爭結合至人類LAG-3蛋白，而該4種sdAb-Fc融合蛋白彼此競爭，此指示sdAb與LAG-3上之新抗原決定基結合，該新抗原決定基與基準抗體BMS-986016所靶向者不同。 藉由FACS分析之CHO-huLAG-3細胞結合及對配位體結合之抑制
為測定細胞結合EC50 ，收穫表現人類或食蟹猴LAG-3之CHO-K1細胞，且使其與梯度濃度之抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白一起培育，之後與針對人類Fc之經螢光團標記之二級抗體一起培育。對於阻斷分析，使梯度濃度之抗LAG-3 sdAb-Fc蛋白及固定濃度之生物素化LAG-3-Fc蛋白與表現MHC II之A375黑色素瘤細胞一起共培育。利用經螢光團標記之鏈黴抗生物素蛋白偵測LAG-3-Fc與A375細胞之結合。接著利用流式細胞術分析樣品。結合及阻斷曲線分別示於圖4及圖5中。抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白之結合及阻斷能力之EC50彙總於表3中。與陽性對照BMS-986016相比，抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白具有類似之與CHO細胞上表現之人類LAG-3之結合能力。在細胞阻斷分析中，儘管所有抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白之阻斷曲線之EC50均高於BMS-986016之阻斷曲線之EC50，但值得注意的是，其阻斷曲線之跨度大於BMS-986016之跨度，此指示sdAb-Fc融合蛋白針對其特異性抗原決定基之結合可較BMS-986016更具競爭性地阻斷LAG-3與MHC II之相互作用。表 3. 非人類化抗 LAG-3 sdAb-Fc 融合蛋白針對 LAG-3 之結合數據及阻斷配位體結合數據
Figure 108111097-A0304-0004
 實例 3 ：抗 LAG-3 sdAb-Fc 融合蛋白之人類化、產生及表徵 抗LAG-3 sdAb之人類化
將sdAb AS20592、AS20594、AS20601及AS20846之蛋白質序列與共享最高同源性程度之5個最接近之人類生殖系序列進行比對。分別選擇最佳人類生殖系序列作為人類接受體。接著構築同源性模型。根據該模型分析數據，對抗原結合或抗體支架形成潛在關鍵之殘基保持不變，而選擇其餘部分用於轉化成人類對應體。最初產生一組四至六個序列最佳化之變異體(階段1)。分析該等變異體之多種參數，且將所獲得之結果用於設計第二組sdAb (階段2)。人類化sdAb在其名稱中以「VH」指示。 人類化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白之產生
在人類化變異體中，根據親和力及小規模生產水準選擇AS20592VH10、AS20594VH10、AS20601VH4及AS20846VH12用於生產及表徵。藉由使人類化抗LAG-3 sdAb與人類IgG4 Fc區融合來產生人類化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白構築體。製備構築體之大量製備物用於HEK293細胞瞬時表現及純化。藉由層析經由含有蛋白質A瓊脂糖樹脂之管柱純化所表現之人類化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白。藉由SEC-HPLC測定蛋白質純度。表現結果彙總於表4中。表 4. 人類化抗 LAG-3 sdAb-Fc 融合蛋白之表現
Figure 108111097-A0304-0005
 藉由表面電漿子共振(SPR)之靶蛋白結合及跨物種反應測試
利用BIACORETM T200儀器藉由SPR測定每一抗LAG-3抗體(sdAb-Fc融合蛋白或mAb形式)之親和力常數(KD )。簡言之，為量測針對人類LAG-3之親和力，經由捕獲抗體(Jackson ImmunoResearch目錄號115-005-071)將抗LAG-3抗體以適當密度固定在感測器晶片上。以不少於5個不同濃度注射人類LAG-3蛋白(Acrobiosystem，772-6BGF2-D5)。為量測針對食蟹猴LAG-3之親和力，將食蟹猴LAG-3蛋白(Acrobiosystem，2187-71HF1-DZ)以適當密度固定在感測器晶片上，且以不少於5個不同濃度注射抗LAG-3抗體。使用BIACORETM T200評估軟體獲得解離速率常數(koff )及締合速率常數(kon )之數據，且自koff 對kon 之比率計算親和力常數(KD )。若干種例示性抗LAG-3抗體之動力學數據彙總於表5中。表 5. 人類化抗 LAG-3 sdAb-Fc 融合蛋白之親和力測定
Figure 108111097-A0304-0006
 LAG-3阻斷報導基因分析
使用Promega LAG-3阻斷報導基因分析套組(Promega，目錄號CS194819)，根據供應商之方案來實施LAG-3阻斷報導基因分析。簡言之，將解凍使用之MHC-II APC細胞(包括TCR活化抗原)平鋪隔夜，且接著與抗LAG-3抗體或抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白之連續稀釋液一起培育，之後添加解凍使用之LAG-3效應細胞。在37℃及5% CO2 下誘導6小時後，添加BIO-GLO™螢光素酶分析試劑，且測定發光。利用GraphPad Prism 6軟體實施四參數邏輯曲線分析。數據曲線示於圖6中且彙總於表6中。在LAG-3阻斷報導基因分析中，AS20592VH10-Fc、AS20601VH4-Fc及AS20846VH12-Fc具有與BMS-986016相當或優於BMS-986016之功能。值得注意的是，sdAb-Fc融合蛋白之信號跨度(其指示抑制水準)均大於基準抗體BMS-986016之信號跨度，此與先前所闡述之配位體阻斷測試中之發現一致。表 6. 人類化抗 LAG-3 sdAb-Fc 融合蛋白之 LAG-3 阻斷報導基因分析
Figure 108111097-A0304-0007
 實例 4 ： PD-1×LAG-3 BABP 之產生及表徵 PD-1×LAG-3 BABP之構築
此實例闡述PD-1×LAG-3 BABP之構築。
BABP可藉由以下方式來構築：使抗LAG-3 sdAb融合至全長抗體或在C末端含有Fc區之源自該全長抗體之scFv或Fab區，諸如抗PD-1抗體，例如KEYTRUDA® (派姆單抗)、OPDIVO® (納武單抗)或PD1-BM-min。抗LAG-3 sdAb可經由連接體(諸如9-胺基酸Gly/Ser連接體(9GS連接體)、人類IgG1 (hIgG1)鉸鏈或突變之hIgG1鉸鏈)或在無連接體之情形下連結至全長抗體(或在C末端具有Fc區之源自該全長抗體之scFv或Fab區)。另外，短肽序列可融合至抗LAG-3 sdAb之N末端(參見圖7、圖9、圖11及圖12)或C末端(參見圖 8及圖10)。BABP可具有圖7至圖16中所例示構形中之任一者。舉例而言，抗LAG-3 sdAb可經由N末端或C末端與以下融合：重鏈中之至少一者、輕鏈中之至少一者或重鏈及輕鏈二者(參見圖7至圖10)。
如下表7中所示，產生例示性BABP。抗LAG-3 sdAb (AS20592VH10、AS20594VH10、AS20601VH4或AS20846VH12)經由突變之人類IgG1 (hIgG1)鉸鏈作為連接體或在無連接體之情形下融合至全長抗PD-1抗體(派姆單抗或PD1-BM-min)之重鏈之N末端、重鏈之C末端、輕鏈之N末端或輕鏈之C末端。在一些BABP構築體中，另一短肽添加至sdAb之N末端。表 7. 例示性 PD-1×LAG-3 構築體
Figure 108111097-A0304-0008
抗LAG-3 sdAb AS20592、AS20594、AS20601及AS20846各自經由突變之人類IgG1 (hIgG1)鉸鏈作為連接體融合至稱為PD1-BM-min之抗PD-1抗體之重鏈N末端，以分別產生PD-1×LAG-3概念驗證(POC) BABP BLP-1、BLP-2、BLP-3及BLP-4。PD-1×LAG-3 POC BABP之例示性結構示於圖7中。
人類化抗LAG-3 sdAb AS20592VH10、AS20594VH10、AS20601VH4及AS20846VH12各自經由突變之人類IgG1 (hIgG1)鉸鏈作為連接體或在無連接體之情形下融合至PD1-BM-min之重鏈之N末端、重鏈之C末端、輕鏈之N末端或輕鏈之C末端以產生PD-1×LAG-3 BABP。 PD-1×LAG-3 BABP之親和力測定
如上文實例3中所闡述評價例示性PD-1×LAG-3 BABP與人類PD-1或人類LAG-3之親和力。結果彙總於表8中。表 8. PD-1×LAG-3 BABP 之親和力測定
Figure 108111097-A0304-0009
 靶細胞結合及配位體抑制
如上文實例3中所闡述評價例示性PD-1×LAG-3 BABP與CHO細胞上所表現之PD-1或LAG-3之結合親和力及對配位體結合至細胞(亦即PD-L1結合至CHO-PD-1細胞或LAG-3-Fc結合至表現MHC II之A375黑色素瘤細胞)之阻斷。結果彙總於表9中。表 9. PD-1×LAG-3 BABP 之結合及阻斷數據
Figure 108111097-A0304-0010
 活體外功能分析
藉由基於PD-1細胞之報導基因分析(圖17A)及LAG-3阻斷報導基因分析(Promega，圖17B)來分析例示性PD-1×LAG-3 BABP之活體外活性。結果彙總於表10中。表 10. PD-1×LAG-3 BABP 之活體外功能分析
Figure 108111097-A0304-0011
 活體內抗腫瘤功效
在具有人類PD-1及人類LAG-3雙敲入之C57BL/6小鼠中所確立之同基因MC38結腸癌模型中評估BLP-4之活體內抗腫瘤活性。動物在腫瘤大小達到大約120 mm3 時開始接受利用BLP-4、PD-BM-min、AS20846-Fc或PD1-BM-min與AS20846-Fc之組合之治療。使用IgG4作為陰性對照。儘管PD-1阻斷在此模型中有效，但在測試劑量下，單獨之PD1-BM-min未能延遲7隻小鼠中之2隻中之腫瘤生長。相比之下，利用BLP-4以及PD1-BM-min與AS20846-Fc融合蛋白之組合之治療在全部7隻小鼠中均誘導腫瘤消退，此顯示優於單獨之PD-1阻斷之功效(圖18A及圖18B)。 序列表表 11. 抗 LAG-3 sdAb SEQ ID NO
Figure 108111097-A0304-0012
 SEQ ID NO: 267 (AS20410 sdAb核酸序列) CAGGTGCAACTGGCGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCATGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGTTTCTGAATATACCTTCAGTAGTGATTCTATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTGATAGTGATGGTAGCACAAGCTACGCAGGCTCCGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAAAGACAACGCCGAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGACAAGCCCTCTGTGGCTGCTATCCAGGCTCGACCCAGCTGACTTTGAATACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 268 (AS20592 sdAb核酸序列) GAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACATCATCAGTAGCTACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTGATAGTGATGGTGGCACAAGCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAACGCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGATTTTTGTTGGGTAGATGAGGATCGCCACCTCTATGAGTATAACTCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 269 (AS20594 sdAb核酸序列) CAGGTGCAGCTGGCGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACCATCAGTAGCTACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTGATAGTGATGGTAGCACAAGCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAACGCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGATTTTTGTTGGGTGGACGACTTCTATGAGTATAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 270 (AS20601 sdAb核酸序列) GAGGTGCAACTGGCGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACCTACGGTGGCTACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAACTATTAATAGTGATGGTAGCACAAACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAACGCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGCCCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGCGCGGTGGATCTCGCCCCATGTTGGGTAGCTGGTCCCATCGAGGCCGCTGACTTTGGTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 271 (AS20846 sdAb核酸序列) CAGGTGCACCTGATGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGTTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACCGTCAGTAGCTACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTGATAGTGATGGTAGCGTAAGTTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAACGCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTTCTGTGCGGCAGATCTTTGCTGGGTGGACCAGGACCAGGGAGAATATAACACCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 272 (AS20916 sdAb核酸序列) GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCAGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTGACTTTTGATGATTATGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCTCATGTATTAGCTGGAGTGGTGGTAGCACATACTATACCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGGCAGATTTGTTCTGTCCCCCACCTGATGATACTACGGGTTGGGGTATGGACCCTCCCGAGCATAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 273 (AS21317 sdAb核酸序列) CAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTTTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACCTTGAGTAGCTACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTGATAGTGATGGTAGCACAAGCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAACGCCAAGAACACTCTGTTTCTGCAAATGAACGGCCTGAAACCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGTGCTCCACTATGCTGGGTTGATTACCCATTGCCGTCGGGCCCATACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 274 (AS20410 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) QVQLAESGGGSVHAGGSLRLSCVVSEYTFSSDSMG WFRQAPGKEREGVAAIDSDGSTSYAGSVKG RFTISKDNAENTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSPLWLLSRLDPADFEY WGQGTQVTVSS SEQ ID NO: 275 (AS20592 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYIISSYCMG WFRQAPGKEREGVAAIDSDGGTSYADSVKG RFTISKDNAKNTLYLQMDSLKPEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNS WGQGTQVTVSS SEQ ID NO: 276 (AS20594 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) QVQLAESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTISSYCMG WFRQAPGKEREGVAAIDSDGSTSYADSVKG RFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAADFCWVDDFYEYNY WGQGTQVTVSS SEQ ID NO: 277 (AS20601 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLAESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTYGGYCMG WFRQAPGKEREGVATINSDGSTNYADSVKG RFTISKDNAKNTLYLQMNSLSPEDTAMYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGY WGQGTQVTVSS SEQ ID NO: 278 (AS20846 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) QVHLMESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYTVSSYCMG WFRQAPGKEREGVAAIDSDGSVSYADSVKG RFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYFCAADLCWVDQDQGEYNT WGQGTQVTVSS SEQ ID NO: 279 (AS20916 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGLTFDDYAMG WFRQAPGKEREGVSCISWSGGSTYYTDSVKG RFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAADLFCPPPDDTTGWGMDPPEHNY WGQGTQVTVSS SEQ ID NO: 280 (AS21317 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTLSSYCMG WFRQAPGKEREGVAAIDSDGSTSYADSVKG RFTISKDNAKNTLFLQMNGLKPEDTAVYYCAPLCWVDYPLPSGPY WGQGTQVTVSS SEQ ID NO: 281 (AS20592M6 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYIISSYCMG WFRQAPGKEREGVAAIDSSGGTSYADSVKG RFTISKDNAKNTLYLQMDSLKPEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYQS WGQGTQVTVSS SEQ ID NO: 282 (AS20592VH4 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMG WFRQAPGKGLEGVSAIDSDGGTSYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDEDRHLYEYNS WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 283 (AS20592VH5 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMG WFRQAPGKGLEGVAAIDSDGGTSYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDEDRHLYEYNS WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 284 (AS20592VH6 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMG WFRQAPGKGLEGVAAIDSDGGTSYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNS WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 285 (AS20592VH7 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMG WFRQAPGKGREGVAAIDSDGGTSYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNS WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 286 (AS20592VH8 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMG WFRQAPGKEREGVAAIDSDGGTSYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNS WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 287 (AS20592VH9 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMG WFRQAPGKEREGVAAIDSDGGTSYADSVKG RFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNS WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 288 (AS20592VH10 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMG WFRQAPGKGLEGVAAIDSDGGTSYADSVKG RFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNS WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 289 (AS20592VH10M1 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMG WFRQAPGKGLEGVAAIDSSGGTSYADSVKG RFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNS WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 290 (AS20594VH5 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMG WFRQAPGKGLEGVAAIDSDGSTSYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDDFYEYNY WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 291 (AS20594VH6 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMG WFRQAPGKGLEGVAAIDSDGSTSYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDDFYEYNY WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 292 (AS20594VH7 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMG WFRQAPGKGREGVAAIDSDGSTSYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDDFYEYNY WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 293 (AS20594VH8 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMG WFRQAPGKEREGVAAIDSDGSTSYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDDFYEYNY WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 294 (AS20594VH9 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMG WFRQAPGKEREGVAAIDSDGSTSYADSVKG 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無
圖1繪示免疫前血清及在末次加強免疫後之免疫後血清對LAG3-Fc或單獨的Fc之免疫反應之評估。
圖2繪示末次加強免疫後之免疫後血清中常規抗體(IgG1)及重鏈抗體(IgG2及IgG3)對LAG3-Fc或單獨的Fc之免疫反應之評估。使用自免疫前血清分離之相應免疫球蛋白片段作為對照。
圖3繪示非人類化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白及基準抗體BMS-986016之抗原決定基分箱(binning)測試。
圖4繪示利用FACS測試之非人類化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白與表現人類LAG-3之CHO-K1細胞之結合。使用BMS-986016作為陽性對照。
圖5繪示如藉由流式細胞術所量測，非人類化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白對MHC II與人類LAG-3之間的相互作用之阻斷。使用BMS-986016作為陽性對照。
圖6繪示利用報導基因分析所量測，人類化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白對LAG-3之活體外功能性阻斷。使用BMS-986016作為陽性對照且人類IgG4同型對照作為陰性對照。
圖7繪示例示性BABP之示意性結構，其包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體及兩個相同之抗LAG-3 sdAb，其中每一抗LAG-3 sdAb之C末端經由視情況存在之肽連接體與一條重鏈之N末端融合。視情況存在之肽序列可與每一抗LAG-3 sdAb之N末端融合。該兩個抗LAG-3 sdAb中之每一者特異性結合第一抗原決定基(LAG-3)。該全長抗體具有兩個抗原結合位點，每一者特異性結合第二抗原決定基。舉例而言，該BABP可由四條多肽鏈組成，其自N末端至C末端具有如下結構：(1) VL -CL ；(2) VH H-VH -CH 1-CH 2-CH 3；(3) VH H-VH -CH 1-CH 2-CH 3；及(4) VL -CL ，其中多肽鏈(1)及(2)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第一拷貝之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第二拷貝之抗原結合位點，且每一VH H特異性結合該第一抗原決定基(LAG-3)之一個拷貝。在替代形式中，可省略每一抗LAG-3 sdAb，或用彼此融合之兩個相同或不同的抗LAG-3 sdAb替換。該單特異性全長抗體可經雙特異性全長抗體替換以進一步擴展結合特異性。
圖8繪示例示性BABP之示意性結構，其包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體及兩個相同之抗LAG-3 sdAb，其中每一抗LAG-3 sdAb之N末端經由視情況存在之肽連接體與一條重鏈之C末端融合。視情況存在之肽序列可與每一抗LAG-3 sdAb之C末端融合。該兩個抗LAG-3 sdAb中之每一者特異性結合第一抗原決定基(LAG-3)。該全長抗體具有兩個抗原結合位點，每一者特異性結合第二抗原決定基。舉例而言，該BABP可由四條多肽鏈組成，其自N末端至C末端具有如下結構：(1) VL -CL ；(2) VH -CH 1-CH 2-CH 3-VH H；(3) VH -CH 1-CH 2-CH 3-VH H；及(4) VL -CL ，其中多肽鏈(1)及(2)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第一拷貝之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第二拷貝之抗原結合位點，且每一VH H特異性結合該第一抗原決定基(LAG-3)之一個拷貝。在替代形式中，可省略每一抗LAG-3 sdAb，或用彼此融合之兩個相同或不同的抗LAG-3 sdAb替換。該單特異性全長抗體可經雙特異性全長抗體替換以進一步擴展結合特異性。
圖9繪示例示性BABP之示意性結構，其包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體及兩個相同之抗LAG-3 sdAb，其中每一抗LAG-3 sdAb之C末端經由視情況存在之肽連接體與一條輕鏈之N末端融合。視情況存在之肽序列可與每一抗LAG-3 sdAb之N末端融合。該兩個抗LAG-3 sdAb中之每一者特異性結合第一抗原決定基(LAG-3)。該全長抗體具有兩個抗原結合位點，每一者特異性結合第二抗原決定基。舉例而言，該BABP可由四條多肽鏈組成，其自N末端至C末端具有如下結構：(1) VH H-VL -CL ；(2) VH -CH 1-CH 2-CH 3；(3) VH -CH 1-CH 2-CH 3；及(4) VH H-VL -CL ，其中多肽鏈(1)及(2)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第一拷貝之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第二拷貝之抗原結合位點，且每一VH H特異性結合該第一抗原決定基(LAG-3)之一個拷貝。在替代形式中，可省略每一抗LAG-3 sdAb，或用彼此融合之兩個相同或不同的抗LAG-3 sdAb替換。該單特異性全長抗體可經雙特異性全長抗體替換以進一步擴展結合特異性。
圖10繪示例示性BABP之示意性結構，其包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體及兩個相同之抗LAG-3 sdAb，其中每一抗LAG-3 sdAb之N末端經由視情況存在之肽連接體與一條輕鏈之C末端融合。視情況存在之肽序列可與每一抗LAG-3 sdAb之C末端融合。該兩個抗LAG-3 sdAb中之每一者特異性結合第一抗原決定基。該全長抗體具有兩個抗原結合位點，每一者特異性結合第二抗原決定基。舉例而言，該BABP可由四條多肽鏈組成，其自N末端至C末端具有如下結構：(1) VL -CL -VH H；(2) VH -CH 1-CH 2-CH 3；(3) VH -CH 1-CH 2-CH 3；及(4) VL -CL -VH H，其中多肽鏈(1)及(2)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第一拷貝之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第二拷貝之抗原結合位點，且每一VH H特異性結合該第一抗原決定基(LAG-3)之一個拷貝。在替代形式中，可省略每一抗LAG-3 sdAb，或用彼此融合之兩個相同或不同的抗LAG-3 sdAb替換。該單特異性全長抗體可經雙特異性全長抗體替換以進一步擴展結合特異性。
圖11繪示例示性BABP之示意性結構，其包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體及四個相同之抗LAG-3 sdAb，其中每一抗LAG-3 sdAb之C末端經由視情況存在之肽連接體與該單特異性全長抗體之重鏈或輕鏈之N末端融合。視情況存在之肽序列可與每一抗LAG-3 sdAb之N末端融合。每一抗LAG-3 sdAb特異性結合至第一抗原決定基(LAG-3)。該全長抗體具有兩個各自特異性結合第二抗原決定基之抗原結合位點。舉例而言，該BABP可由四條多肽鏈組成，其自N末端至C末端具有如下結構：(1) VH H-VL -CL ；(2) VH H-VH -CH 1-CH 2-CH 3；(3) VH H-VH -CH 1-CH 2-CH 3；及(4) VH H-VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第一拷貝之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第二拷貝之抗原結合位點，且每一VH H特異性結合該第一抗原決定基(LAG-3)之一個拷貝。在替代形式中，可省略每一抗LAG-3 sdAb，或用彼此融合之兩個相同或不同的抗LAG-3 sdAb替換。該單特異性全長抗體可經雙特異性全長抗體替換以進一步擴展結合特異性。
圖12繪示例示性BABP之示意性結構，其包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體及四個相同之抗LAG-3 sdAb，其中與每一重鏈之N末端融合者係兩個相同之抗LAG-3 sdAb，該兩個抗LAG-3 sdAb經由視情況存在之肽連接體彼此融合，且該兩個抗LAG-3 sdAb經由視情況存在之肽連接體與每一重鏈之N末端融合。視情況存在之肽序列可與嵌合重鏈之N末端融合。每一抗LAG-3 sdAb特異性結合第一抗原決定基(LAG-3)。該全長抗體具有兩個各自特異性結合第二抗原決定基之抗原結合位點。舉例而言，該BABP可由四條多肽鏈組成，其自N末端至C末端具有如下結構：(1) VL -CL ；(2) VH H-VH H-VH -CH 1-CH 2-CH 3；(3) VH H-VH H-VH -CH 1-CH 2-CH 3；及(4) VL -CL ，其中多肽鏈(1)及(2)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第一拷貝之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第二拷貝之抗原結合位點，且每一VH H特異性結合該第一抗原決定基(LAG-3)之一個拷貝。在替代形式中，可省略每一抗LAG-3 sdAb，或用彼此融合之兩個相同或不同的抗LAG-3 sdAb替換。該單特異性全長抗體可經雙特異性全長抗體替換以進一步擴展結合特異性。
圖13繪示例示性BABP之示意性結構，其包含兩個相同之抗原結合(Fab)片段、兩個相同之抗LAG-3 sdAb及一Fc區，其中每一抗LAG-3 sdAb之N末端經由視情況存在之肽連接體與該Fab片段之CH 1區之C末端融合且每一抗LAG-3 sdAb之C末端與該Fc區之CH 2區之N末端融合。每一抗LAG-3 sdAb特異性結合第一抗原決定基(LAG-3)。每一Fab片段特異性結合第二抗原決定基。舉例而言，該BABP可由四條多肽鏈組成，其自N末端至C末端具有如下結構：(1) VL -CL ；(2) VH -CH 1-VH H-CH 2-CH 3；(3) VH -CH 1-VH H-CH 2-CH 3；及(4) VL -CL ，其中多肽鏈(1)及(2)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第一拷貝之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第二拷貝之抗原結合位點，且每一VH H特異性結合該第一抗原決定基(LAG-3)之一個拷貝。在替代形式中，可省略每一抗LAG-3 sdAb，或用彼此融合之兩個相同或不同的抗LAG-3 sdAb替換。在替代形式中，為擴展特異性，該兩個Fab片段可特異性結合不同抗原決定基，及/或該等VH H片段可特異性結合不同抗原決定基。
圖14繪示例示性BABP之示意性結構，其包含兩個相同之單鏈可變片段(scFv)、兩個相同之抗LAG-3 sdAb及一Fc區，其中每一抗LAG-3 sdAb之N末端經由視情況存在之肽連接體與scFv之C末端融合且每一抗LAG-3 sdAb之C末端與該Fc區之N末端融合。每一抗LAG-3 sdAb特異性結合第一抗原決定基(LAG-3)。每一scFv特異性結合第二抗原決定基。舉例而言，該BABP可由兩條多肽鏈組成，其自N末端至C末端各自具有如下結構：VL -VH -VH H-CH 2-CH 3，其中每一多肽鏈之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之一個拷貝之scFv結構域，且每一VH H特異性結合該第一抗原決定基(LAG-3)之一個拷貝。在替代形式中，該scFv結構域自N末端至C末端可包含：VH -VL 。在替代形式中，可省略每一抗LAG-3 sdAb，或用彼此融合之兩個相同或不同的抗LAG-3 sdAb替換。另外，為擴展特異性，該兩個scFv可特異性結合不同抗原決定基，及/或該等VH H片段可特異性結合不同抗原決定基。
圖15繪示例示性BABP之示意性結構，其包含兩個相同之Fab片段、各自包含兩個VH H片段之兩個相同之Fab樣片段及一Fc區。在每一Fab樣片段中，VH 及VL 區各自由抗LAG-3 sdAb替換。每一Fab樣片段特異性結合第一抗原決定基(LAG-3)。每一Fab片段特異性結合第二抗原決定基。舉例而言，該BABP可由四條多肽鏈組成，其自N末端至C末端具有如下結構：(1) VL -CL -VH H-CL ；(2) VH -CH 1-VH H-CH 1-CH 2-CH 3；(3) VH -CH 1-VH H-CH 1-CH 2-CH 3；及(4) VL -CL -VH H-CL ，其中多肽鏈(1)及(2)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第一拷貝之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH 及VL 形成特異性結合該第二抗原決定基之第二拷貝之抗原結合位點，且每一VH H特異性結合該第一抗原決定基(LAG-3)之一個拷貝。在替代形式中，為擴展特異性，該兩個Fab片段可特異性結合不同抗原決定基，及/或該等Fab樣片段可特異性結合不同抗原決定基(例如，來自LAG-3之不同抗原決定基)。
圖16繪示例示性BABP之示意性結構，其包含兩個相同之scFv、各自包含兩個VH H片段之兩個相同之Fab樣片段及一Fc區。在每一Fab樣片段中，VH 及VL 區各自由抗LAG-3 sdAb替換。每一Fab樣片段特異性結合第一抗原決定基(LAG-3)。每一scFv特異性結合第二抗原決定基。舉例而言，該BABP可由四條多肽鏈組成，其自N末端至C末端具有如下結構：(1) VH H-CL ；(2) VL -VH -VH H-CH 1-CH 2-CH 3；(3) VL -VH -VH H-CH 1-CH 2-CH 3；及(4) VH H-CL ，其中多肽鏈(2)及(3)之VH 及VL 各自形成特異性結合該第二抗原決定基之一個拷貝之scFv，且每一VH H特異性結合該第一抗原決定基(LAG-3)之一個拷貝。在替代形式中，scFv之C末端可與包含VH H-CL之Fab樣片段中之鏈的N末端融合；及/或scFv結構域自N末端至C末端可包含：VH -VL 。另外，為擴展特異性，該兩個scFv可特異性結合不同抗原決定基，及/或該等VH H片段可特異性結合不同抗原決定基(例如，來自LAG-3之不同抗原決定基)。
圖17A至圖17B繪示在基於PD-1細胞之報導基因分析(圖17A)中及LAG-3阻斷報導基因分析(圖17B)中PD-1×LAG-3 BABP之活體外活性。使用派姆單抗(Pembrolizumab)及PD1-BM-min作為基於PD-1細胞之報導基因分析之對照且使用BMS-986016作為LAG-3阻斷報導基因分析之對照。
圖18A至圖18B繪示與BLP-4之親代元件(亦即，PD1-BM-min及AS20846-Fc)及其組合相比，PD-1×LAG-3 BLP-4在荷MC38腫瘤之C57BL/6人類PD-1/LAG-3雙敲入小鼠中之活體內功效。圖18A顯示每一治療組中之平均腫瘤體積。圖18B顯示每一動物之腫瘤體積之蛛網圖。使用IgG4作為陰性對照。
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Claims (44)

  1. 一種經分離之抗LAG-3構築體，其包含特異性識別LAG-3之單一結構域抗體(sdAb)，其中該sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體。
  2. 如申請專利範圍第1項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該sdAb包含含有SEQ ID NO: 39-76中任一者之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 115-152中任一者之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 191-228中任一者之胺基酸序列之CDR3；或在該等CDR區中包含最多約3個胺基酸取代之其變異體。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該sdAb包含以下中之任一者： (1) 包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (2) 包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 192之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (3) 包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 193之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (4) 包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；(5) 包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 119之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 195之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (6) 包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 196之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (7) 包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 197之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (8) 包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 198之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (9) 包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 206之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (10) 包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 213之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (11) 包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 222之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體； (12) 包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 224之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；或 (13) 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之CDR1或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列之CDR2或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO: 225之胺基酸序列之CDR3或其包含最多約3個胺基酸取代之變異體。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該sdAb包含以下中之任一者： (1) 包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列之CDR3； (2) 包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 192之胺基酸序列之CDR3； (3) 包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 193之胺基酸序列之CDR3； (4) 包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列之CDR3； (5) 包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 119之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 195之胺基酸序列之CDR3； (6) 包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 196之胺基酸序列之CDR3； (7) 包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 197之胺基酸序列之CDR3； (8) 包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 198之胺基酸序列之CDR3； (9) 包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 206之胺基酸序列之CDR3； (10) 包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 213之胺基酸序列之CDR3； (11) 包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 222之胺基酸序列之CDR3； (12) 包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 224之胺基酸序列之CDR3；或 (13) 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO: 225之胺基酸序列之CDR3。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該sdAb包含含有以下之VH H結構域： (1) 包含SEQ ID NO: 1-38中任一者之胺基酸序列之FR1； (2) 包含SEQ ID NO: 77-114中任一者之胺基酸序列之FR2； (3) 包含SEQ ID NO: 153-190中任一者之胺基酸序列之FR3；及 (4) 包含SEQ ID NO: 229-266中任一者之胺基酸序列之FR4。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域或其與SEQ ID NO: 274-311中之任一者具有至少約80%序列一致性之變異體。
  7. 如申請專利範圍第6項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該sdAb包含含有SEQ ID NO: 274-311中任一者之胺基酸序列之VH H結構域或在該VH H結構域中包含最多約3個胺基酸取代之其變異體。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-7 M至約10-12 M。
  9. 如申請專利範圍第8項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該sdAb與LAG-3之間結合之KD 為約10-9 M至約10-11 M。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該sdAb與來自非人類哺乳動物之LAG-3交叉反應。
  11. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體，其中特異性識別LAG-3之該sdAb係駱駝科動物、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
  12. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該經分離之抗LAG-3構築體係僅重鏈抗體(HCAb)，其包含與Fc片段融合之特異性識別LAG-3之該sdAb。
  13. 如申請專利範圍第12項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該HCAb為單體或二聚體。
  14. 如申請專利範圍第12項或第13項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該Fc片段係人類IgG1 (hIgG1) Fc、無效應物hIgG1 Fc、hIgG4 Fc或hIgG4 Fc (S228P)。
  15. 如申請專利範圍第12項至第14項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該sdAb經由肽連接體與Fc片段融合。
  16. 如申請專利範圍第15項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該肽連接體包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。
  17. 如申請專利範圍第12項至第16項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該HCAb包含SEQ ID NO: 312-349中任一者之胺基酸序列。
  18. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體，其包含：(a) 第一抗原結合部分，其包含特異性識別LAG-3之該sdAb；及(b) 第二抗原結合部分，其特異性識別第二抗原決定基。
  19. 如申請專利範圍第18項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該第二抗原結合部分包含全長抗體、Fab、Fab’、(Fab’)2 、Fv、單鏈Fv (scFv)、scFv-scFv、微小抗體、雙鏈抗體或第二sdAb。
  20. 如申請專利範圍第18項或第19項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該抗LAG-3構築體係多特異性的。
  21. 如申請專利範圍第18項至第20項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分經由肽連接體彼此融合。
  22. 如申請專利範圍第21項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該肽連接體包含SEQ ID NO: 352-353及366-372中任一者之胺基酸序列。
  23. 如申請專利範圍第18項至第22項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該第二抗原結合部分包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體。
  24. 如申請專利範圍第23項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該全長抗體之Fc片段係人類IgG1 (hIgG1) Fc、無效應物hIgG1 Fc、hIgG4 Fc或hIgG4 Fc (S228P)。
  25. 如申請專利範圍第23項或第24項之經分離之抗LAG-3構築體，其中特異性識別LAG-3之該sdAb之N末端與該全長抗體重鏈之C末端融合。
  26. 如申請專利範圍第23項或第24項之經分離之抗LAG-3構築體，其中特異性識別LAG-3之該sdAb之C末端與該全長抗體重鏈之N末端融合。
  27. 如申請專利範圍第23項或第24項之經分離之抗LAG-3構築體，其中特異性識別LAG-3之該sdAb之N末端與該全長抗體輕鏈之C末端融合。
  28. 如申請專利範圍第23項或第24項之經分離之抗LAG-3構築體，其中特異性識別LAG-3之該sdAb之C末端與該全長抗體輕鏈之N末端融合。
  29. 如申請專利範圍第18項至第28項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該第二抗原結合部分特異性識別選自由以下組成之群之免疫檢查點分子：PD-1、4-1BB、PD-L1、TIM-3、TIGIT、CTLA-4、VISTA、B7-1、B7-H3、CD47、OX40及GITR。
  30. 如申請專利範圍第29項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該第二抗原結合部分特異性識別PD-1。
  31. 如申請專利範圍第30項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該第二抗原結合部分包含： (i) 包含SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之重鏈之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及包含SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之輕鏈之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；或 (ii) 包含SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之重鏈之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及包含SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之輕鏈之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。
  32. 如申請專利範圍第30項之經分離之抗LAG-3構築體，其中該第二抗原結合部分係包含以下之全長抗體： (i) 包含SEQ ID NO: 356之胺基酸序列之重鏈，及包含SEQ ID NO: 357之胺基酸序列之輕鏈；或 (ii) 包含SEQ ID NO: 373之胺基酸序列之重鏈，及包含SEQ ID NO: 374之胺基酸序列之輕鏈。
  33. 一種經分離之抗LAG-3構築體，其包含特異性識別LAG-3之sdAb，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 274-311中任一者之CDR1、CDR2及CDR3。
  34. 一種經分離之抗LAG-3構築體，其與如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體競爭性地特異性結合至LAG-3。
  35. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1項至第34項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體及醫藥學上可接受之載劑。
  36. 一種治療患有LAG-3有關疾病之個體之方法，其包括向該個體投與有效量之如申請專利範圍第35項之醫藥組合物。
  37. 如申請專利範圍第36項之方法，其中該LAG-3有關疾病係癌症。
  38. 如申請專利範圍第37項之方法，其中該癌症係結腸癌。
  39. 如申請專利範圍第37項或第38項之方法，其中該個體係人類。
  40. 一種經分離核酸，其編碼如申請專利範圍第1項至第34項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體。
  41. 一種載體，其包含如申請專利範圍第40項之經分離核酸。
  42. 一種經分離之宿主細胞，其包含如申請專利範圍第40項之經分離核酸或如申請專利範圍第41項之載體。
  43. 一種套組，其包含如申請專利範圍第1項至第34項中任一項之經分離之抗LAG-3構築體、如申請專利範圍第35項之醫藥組合物、如申請專利範圍第40項之經分離核酸、如申請專利範圍第41項之載體或如申請專利範圍第42項之經分離之宿主細胞。
  44. 一種產生抗LAG-3構築體之方法，其包括：(a) 在有效表現所編碼之該抗LAG-3構築體之條件下培養如申請專利範圍第42項之經分離之宿主細胞；及(b) 自該宿主細胞獲得所表現之該抗LAG-3構築體。
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