CN111886254A - 针对lag-3的单结构域抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供包含特异性识别LAG‑3的单结构域抗体(sdAb)的抗LAG‑3构建体。也提供制备和使用这些构建体的方法。

Description

针对LAG-3的单结构域抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年3月30日提交的国际专利申请第PCT/CN2018/081356号的优先权权益，所述国际专利申请的公开内容通过引用整体并入。
以ASCII文本文件进行的序列表提交
关于ASCII文本文件的以下提交内容通过引用整体并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：761422001442SEQLIST.txt，记录日期：2019年3月19日，大小：514KB)。
发明领域
本发明涉及包含特异性识别LAG-3的单结构域抗体(sdAb)的构建体及其制备和使用方法。
发明背景
包含503个氨基酸的淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)属于Ig超家族并且含有4个细胞外Ig样结构域，其指定为D1至D4。LAG3与CD4密切相关。LAG-3是在活化的T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞样树突细胞上表达的细胞表面蛋白，并且在这些淋巴细胞亚群的功能中起作用，所述作用是重要的但尚未完全理解。LAG-3蛋白负向调控T细胞的细胞增殖、活化和稳态。LAG-3也有助于维持CD8+ T细胞处于致耐受性状态。认为LAG-3与其主要配体II类MHC之间的相互作用在调节树突细胞功能方面起作用。近期临床前研究已表明LAG-3在CD8 T细胞耗竭中的作用，并且正在癌症患者的许多临床试验中评估使用LAG-3阻断抗体或LAG-3-Ig融合蛋白对LAG-3/II类MHC相互作用的阻断。
程序性细胞死亡受体1(PD-1)是另一种对T细胞功能具有重要负调控的抑制性免疫检查点分子。当PD-1结合至调控T细胞受体(TCR)信号传导的程序性细胞死亡配体1(PD-L1)和/或程序性细胞死亡配体2(PD-L2)时，PD-1信号传导会减弱T细胞反应。已证明使用靶向PD-1或PD-L1的抗体阻断PD-1/PD-L1轴可促进肿瘤特异性T细胞免疫，对癌症患者具有显著临床益处。然而，由于在PD-1/PD-L1阻断后的抗性或复发，仍存在巨大未满足的临床需求。
本文中所提及的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容特此通过引用整体并入本文。
发明内容
本发明涉及包含特异性识别LAG-3的sdAb的抗LAG-3构建体(下文中称为“抗LAG-3sdAb”)，例如抗LAG-3 sdAb、抗LAG-3 HCAb(例如，抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白，其包含与人类免疫球蛋白G(IgG)的结晶片段(Fc)融合的抗LAG-3 sdAb)和多特异性(例如双特异性)抗原结合蛋白(其包含与例如其它sdAb、全长四链抗体或其抗原结合片段(例如，Fab或scFv)融合的抗LAG-3 sdAb)；及其制备和使用方法。
本申请的一个方面提供经分离的抗LAG-3构建体，其包含特异性识别LAG-3的单结构域抗体(sdAb)，其中所述sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述经分离的抗LAG-3构建体包含特异性识别LAG-3的sdAb，其中所述sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在根据任一上文所述经分离的抗LAG-3构建体的一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb包含以下中的任一者：
(1)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(2)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(3)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(4)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(5)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(6)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(7)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(8)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(9)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(10)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(11)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(12)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；或
(13)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在根据任一上文所述经分离的抗LAG-3构建体的一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:116的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb包含以下各物：包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:197的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:148的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供经分离的抗LAG-3构建体，其包含特异性识别LAG-3的sdAb，其中所述sdAb包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3。
在根据任一上文所述经分离的抗LAG-3构建体的一些实施方案中，所述sdAb包括包含以下的VHH结构域：(1)包含SEQ ID NO:1-38中的任一者的氨基酸序列的FR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；(2)包含SEQ ID NO:77-114中的任一者的氨基酸序列的FR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；(3)包含SEQ ID NO:153-190中的任一者的氨基酸序列的FR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和/或(4)包含SEQ ID NO:229-266中的任一者的氨基酸序列的FR4或其包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在根据任一上文所述经分离的抗LAG-3构建体的一些实施方案中，所述sdAb包含VHH结构域，所述VHH结构域包含与SEQ ID NO:274-311中的任一者具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述sdAb包括包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域或所述VHH结构域的在VHH结构域中包含至多约3个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述sdAb包括包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。
在根据任一上文所述经分离的抗LAG-3构建体的一些实施方案中，所述sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M。在一些实施方案中，所述sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-9M至约10-11M。
在根据任一上文所述经分离的抗LAG-3构建体的一些实施方案中，所述sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在根据任一上文所述经分离的抗LAG-3构建体的一些实施方案中，经分离的抗LAG-3构建体是仅重链抗体(HCAb)，其包含与Fc片段融合的特异性识别LAG-3的sdAb。在一些实施方案中，HCAb是单体的或二聚的。在一些实施方案中，Fc片段是人类IgG1(hIgG1)Fc、无效应物(惰性)hIgG1 Fc、hIgG4 Fc或hIgG4 Fc(S228P)。在一些实施方案中，所述sdAb经由肽接头与Fc片段融合。在一些实施方案中，所述肽接头包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，HCAb包含SEQ ID NO:312-349中的任一者的氨基酸序列。
在根据任一上文所述经分离的抗LAG-3构建体的一些实施方案中，抗LAG-3构建体包含：(a)第一抗原结合部分，其包含特异性识别LAG-3的sdAb；和(b)第二抗原结合部分，其特异性识别第二表位。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含全长抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、单链Fv(scFv)、scFv-scFv、微小抗体、双链抗体(diabody)或第二sdAb。在一些实施方案中，抗LAG-3构建体是多特异性的(例如双特异性的)。在一些实施方案中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分经由肽接头彼此融合。在一些实施方案中，所述肽接头包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗LAG-3sdAb的N末端或C末端与肽序列融合。在一些实施方案中，所述肽序列包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含由两条重链和两条轻链组成的全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体的Fc片段是人类IgG1(hIgG1)Fc、无效应物hIgG1 Fc、hIgG4 Fc或hIgG4Fc(S228P)。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb的N末端与全长抗体重链的C末端融合。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb的C末端与全长抗体重链的N末端融合。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb的N末端与全长抗体轻链的C末端融合。在一些实施方案中，特异性识别LAG-3的sdAb的C末端与全长抗体轻链的N末端融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分特异性识别选自由以下组成的组的免疫检查点分子：PD-1、4-1BB、PD-L1、TIM-3、TIGIT、CTLA-4、VISTA、B7-1、B7-H3、CD47、OX40和GITR。在一些实施方案中，第二抗原结合部分特异性识别PD-1。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含以下各物：包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，和包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含以下各物：包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，和包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，第二抗原结合部分是全长抗体，其包括包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分是全长抗体，其包括包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的轻链。
还提供了一种经分离的抗LAG-3构建体，所述经分离的抗LAG-3构建体与任一上文所述经分离的抗LAG-3构建体竞争性地特异性结合至LAG-3。
还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含任一上文所述经分离的抗LAG-3构建体和药学上可接受的载体。
本申请的另一方面提供一种治疗患有LAG-3相关疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的任一上文所述药物组合物。在一些实施方案中，所述LAG-3相关疾病是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是结肠癌。在一些实施方案中，所述个体是人类。
还提供了编码任一上文所述经分离的抗LAG-3构建体的经分离的核酸、包含所述经分离的核酸的载体或包含所述经分离的核酸或所述载体的经分离的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了产生任一上文所述经分离的抗LAG-3构建体的方法，所述方法包括在有效表达所编码的抗LAG-3构建体的条件下培养包含任一上文所述经分离的核酸或载体的宿主细胞或培养任一上文所述经分离的宿主细胞；以及从所述宿主细胞获得所表达的抗LAG-3构建体。
还提供了包含任何一种本文所述的抗LAG-3构建体的组合物、试剂盒和制品。
附图说明
图1绘示免疫前血清和在末次加强免疫后的免疫后血清对LAG3-Fc或单独的Fc的免疫反应的评估。
图2绘示末次加强免疫后的免疫后血清中常规抗体(IgG1)和重链抗体(IgG2和IgG3)对LAG3-Fc或单独的Fc的免疫反应的评估。使用从免疫前血清分离的相应免疫球蛋白片段作为对照。
图3绘示非人源化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白和基准抗体BMS-986016的表位分箱(binning)测试。
图4绘示利用FACS测试的非人源化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白与表达人类LAG-3的CHO-K1细胞的结合。使用BMS-986016作为阳性对照。
图5绘示如通过流式细胞术所测量，非人源化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白对MHC II与人类LAG-3之间的相互作用的阻断。使用BMS-986016作为阳性对照。
图6绘示利用报告基因测定所测量，人源化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白对LAG-3的体外功能性阻断。使用BMS-986016作为阳性对照并且人类IgG4同型对照作为阴性对照。
图7绘示示例性BABP的示意性结构，其包含具有两条相同重链和两条相同轻链的单特异性全长抗体和两个相同的抗LAG-3 sdAb，其中每个抗LAG-3 sdAb的C末端经由任选的肽接头与一条重链的N末端融合。任选的肽序列可与每个抗LAG-3 sdAb的N末端融合。所述两个抗LAG-3 sdAb中的每一者特异性结合第一表位(LAG-3)。所述全长抗体具有两个抗原结合位点，每一者特异性结合第二表位。举例来说，所述BABP可由四条多肽链组成，其从N末端至C末端具有如下结构：(1)VL-CL；(2)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；和(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合所述第一表位(LAG-3)的一个拷贝。在替代形式中，每个抗LAG-3 sdAb可省略，或用彼此融合的两个相同或不同的抗LAG-3 sdAb代替。所述单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体代替以进一步扩展结合特异性。
图8绘示示例性BABP的示意性结构，其包含具有两条相同重链和两条相同轻链的单特异性全长抗体和两个相同的抗LAG-3 sdAb，其中每个抗LAG-3 sdAb的N末端经由任选的肽接头与一条重链的C末端融合。任选的肽序列可与每个抗LAG-3 sdAb的C末端融合。所述两个抗LAG-3 sdAb中的每一者特异性结合第一表位(LAG-3)。所述全长抗体具有两个抗原结合位点，每一者特异性结合第二表位。举例来说，所述BABP可由四条多肽链组成，其从N末端至C末端具有如下结构：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3-VHH；(3)VH-CH1-CH2-CH3-VHH；和(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合所述第一表位(LAG-3)的一个拷贝。在替代形式中，每个抗LAG-3 sdAb可省略，或用彼此融合的两个相同或不同的抗LAG-3 sdAb代替。所述单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体代替以进一步扩展结合特异性。
图9绘示示例性BABP的示意性结构，其包含具有两条相同重链和两条相同轻链的单特异性全长抗体和两个相同的抗LAG-3 sdAb，其中每个抗LAG-3 sdAb的C末端经由任选的肽接头与一条轻链的N末端融合。任选的肽序列可与每个抗LAG-3 sdAb的N末端融合。所述两个抗LAG-3 sdAb中的每一者特异性结合第一表位(LAG-3)。所述全长抗体具有两个抗原结合位点，每一者特异性结合第二表位。举例来说，所述BABP可由四条多肽链组成，其从N末端至C末端具有如下结构：(1)VHH-VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；和(4)VHH-VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合所述第一表位(LAG-3)的一个拷贝。在替代形式中，每个抗LAG-3 sdAb可省略，或用彼此融合的两个相同或不同的抗LAG-3 sdAb代替。所述单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体代替以进一步扩展结合特异性。
图10绘示示例性BABP的示意性结构，其包含具有两条相同重链和两条相同轻链的单特异性全长抗体和两个相同的抗LAG-3sdAb，其中每个抗LAG-3 sdAb的N末端经由任选的肽接头与一条轻链的C末端融合。任选的肽序列可与每个抗LAG-3 sdAb的C末端融合。所述两个抗LAG-3 sdAb中的每一者特异性结合第一表位。所述全长抗体具有两个抗原结合位点，每一者特异性结合第二表位。举例来说，所述BABP可由四条多肽链组成，其从N末端至C末端具有如下结构：(1)VL-CL-VHH；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；和(4)VL-CL-VHH，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合所述第一表位(LAG-3)的一个拷贝。在替代形式中，每个抗LAG-3 sdAb可省略，或用彼此融合的两个相同或不同的抗LAG-3 sdAb代替。所述单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体代替以进一步扩展结合特异性。
图11绘示示例性BABP的示意性结构，其包含具有两条相同重链和两条相同轻链的单特异性全长抗体和四个相同的抗LAG-3sdAb，其中每个抗LAG-3 sdAb的C末端经由任选的肽接头与所述单特异性全长抗体的重链或轻链的N末端融合。任选的肽序列可与每个抗LAG-3 sdAb的N末端融合。每个抗LAG-3 sdAb特异性结合至第一表位(LAG-3)。所述全长抗体具有两个各自特异性结合第二表位的抗原结合位点。举例来说，所述BABP可由四条多肽链组成，其从N末端至C末端具有如下结构：(1)VHH-VL-CL；(2)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；和(4)VHH-VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合所述第一表位(LAG-3)的一个拷贝。在替代形式中，每个抗LAG-3sdAb可省略，或用彼此融合的两个相同或不同的抗LAG-3 sdAb代替。所述单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体代替以进一步扩展结合特异性。
图12绘示示例性BABP的示意性结构，其包含具有两条相同重链和两条相同轻链的单特异性全长抗体和四个相同的抗LAG-3sdAb，其中与每条重链的N末端融合的是两个相同的抗LAG-3 sdAb，所述两个抗LAG-3 sdAb经由任选的肽接头彼此融合，并且所述两个抗LAG-3 sdAb经由任选的肽接头与每条重链的N末端融合。任选的肽序列可与嵌合重链的N末端融合。每个抗LAG-3 sdAb特异性结合第一表位(LAG-3)。所述全长抗体具有两个各自特异性结合第二表位的抗原结合位点。举例来说，所述BABP可由四条多肽链组成，其从N末端至C末端具有如下结构：(1)VL-CL；(2)VHH-VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VHH-VH-CH1-CH2-CH3；和(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合所述第一表位(LAG-3)的一个拷贝。在替代形式中，每个抗LAG-3 sdAb可省略，或用彼此融合的两个相同或不同的抗LAG-3sdAb代替。所述单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体代替以进一步扩展结合特异性。
图13绘示示例性BABP的示意性结构，其包含两个相同的抗原结合(Fab)片段、两个相同的抗LAG-3 sdAb和一个Fc区，其中每个抗LAG-3 sdAb的N末端经由任选的肽接头与所述Fab片段的CH1区的C末端融合并且每个抗LAG-3 sdAb的C末端与所述Fc区的CH2区的N末端融合。每个抗LAG-3 sdAb特异性结合第一表位(LAG-3)。每个Fab片段特异性结合第二表位。举例来说，所述BABP可由四条多肽链组成，其从N末端至C末端具有如下结构：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-VHH-CH2-CH3；(3)VH-CH1-VHH-CH2-CH3；和(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合所述第一表位(LAG-3)的一个拷贝。在替代形式中，每个抗LAG-3 sdAb可省略，或用彼此融合的两个相同或不同的抗LAG-3 sdAb代替。在替代形式中，为扩展特异性，所述两个Fab片段可特异性结合不同表位，和/或所述VHH片段可特异性结合不同表位。
图14绘示示例性BABP的示意性结构，其包含两个相同的单链可变片段(scFv)、两个相同的抗LAG-3 sdAb和一个Fc区，其中每个抗LAG-3 sdAb的N末端经由任选的肽接头与scFv的C末端融合并且每个抗LAG-3 sdAb的C末端与所述Fc区的N末端融合。每个抗LAG-3sdAb特异性结合第一表位(LAG-3)。每个scFv特异性结合第二表位。举例来说，所述BABP可由两条多肽链组成，其从N末端至C末端各自具有如下结构：VL-VH-VHH-CH2-CH3，其中每个多肽链的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的一个拷贝的scFv结构域，并且每个VHH特异性结合所述第一表位(LAG-3)的一个拷贝。在替代形式中，所述scFv结构域从N末端至C末端可包含：VH-VL。在替代形式中，每个抗LAG-3 sdAb可省略，或用彼此融合的两个相同或不同的抗LAG-3 sdAb代替。另外，为扩展特异性，所述两个scFv可特异性结合不同表位，和/或所述VHH片段可特异性结合不同表位。
图15绘示示例性BABP的示意性结构，其包含两个相同的Fab片段、各自包含两个VHH片段的两个相同的Fab样片段和一个Fc区。在每个Fab样片段中，VH和VL区各自由抗LAG-3sdAb代替。每个Fab样片段特异性结合第一表位(LAG-3)。每个Fab片段特异性结合第二表位。举例来说，所述BABP可由四条多肽链组成，其从N末端至C末端具有如下结构：(1)VL-CL-VHH-CL；(2)VH-CH1-VHH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-VHH-CH1-CH2-CH3；和(4)VL-CL-VHH-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合所述第二表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合所述第一表位(LAG-3)的一个拷贝。在替代形式中，为扩展特异性，所述两个Fab片段可特异性结合不同表位，和/或所述Fab样片段可特异性结合不同表位(例如，来自LAG-3的不同表位)。
图16绘示示例性BABP的示意性结构，其包含两个相同的scFv、各自包含两个VHH片段的两个相同的Fab样片段和一个Fc区。在每个Fab样片段中，VH和VL区各自由抗LAG-3 sdAb代替。每个Fab样片段特异性结合第一表位(LAG-3)。每个scFv特异性结合第二表位。举例来说，所述BABP可由四条多肽链组成，其从N末端至C末端具有如下结构：(1)VHH-CL；(2)VL-VH-VHH-CH1-CH2-CH3；(3)VL-VH-VHH-CH1-CH2-CH3；和(4)VHH-CL，其中多肽链(2)和(3)的VH和VL各自形成特异性结合所述第二表位的一个拷贝的scFv，并且每个VHH特异性结合所述第一表位(LAG-3)的一个拷贝。在替代形式中，scFv的C末端可与包含VHH-CL的Fab样片段中的链的N末端融合；和/或scFv结构域从N末端至C末端可包含：VH-VL。另外，为扩展特异性，所述两个scFv可特异性结合不同表位，和/或所述VHH片段可特异性结合不同表位(例如，来自LAG-3的不同表位)。
图17A至图17B绘示在基于PD-1细胞的报告基因测定(图17A)中和LAG-3阻断报告基因测定(图17B)中PD-1×LAG-3 BABP的体外活性。使用派姆单抗(Pembrolizumab)和PD1-BM-min作为基于PD-1细胞的报告基因测定的对照并且使用BMS-986016作为LAG-3阻断报告基因测定的对照。
图18A至图18B绘示与BLP-4的亲本元件(即，PD1-BM-min和AS20846-Fc)及其组合相比，PD-1×LAG-3 BLP-4在带有MC38肿瘤的C57BL/6人类PD-1/LAG-3双敲入小鼠中的体内功效。图18A显示每个治疗组中的平均肿瘤体积。图18B显示每个动物的肿瘤体积的蛛网图。使用IgG4作为阴性对照。
具体实施方式
本发明提供特异性识别LAG-3的新颖单结构域抗体(sdAb)(即，抗LAG-3 sdAb)，和包含所述抗LAG-3 sdAb的构建体。本文所述的抗LAG3 sdAb具有强结合亲和力并且能够与非人类哺乳动物(例如食蟹猴)的LAG-3交叉反应。本文所述的抗LAG3构建体可用于治疗LAG-3相关疾病，例如癌症。
因此，本申请的一个方面提供经分离的抗LAG-3构建体，其包含特异性识别LAG-3的sdAb。所述经分离的抗LAG-3构建体可以是例如抗LAG-3 sdAb(例如，骆驼科的或人源化的)，包含多个融合在一起的抗LAG-3 sdAb的多肽，包含与Fc片段(例如，人类IgG1 Fc、无效应物IgG1 Fc、IgG2 Fc或IgG4 Fc)融合的抗LAG-3 sdAb的抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白，或包含与全长抗体(例如抗PD-1抗体)或其抗原结合片段融合的抗LAG-3 sdAb的多特异性抗原结合蛋白(“MABP”)。抗LAG-3构建体可以是单特异性或多特异性的(例如双特异性的)、单价或多价的(例如二价的)。
还提供了包含本文所述的抗LAG-3构建体的组合物(例如药物组合物)、试剂盒和制品、其制备方法和使用本文所述的抗LAG-3构建体治疗LAG-3相关疾病(例如癌症)的方法。
I.定义
术语“表位”意指能够特异性结合至抗体的蛋白质决定簇。表位通常是由分子的化学活性表面组群(例如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。构象和非构象表位的不同之处在于，在变性溶剂存在下丧失与前者而非后者的结合。
如本文所用，“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益或期望结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益或期望临床结果包括(但不限于)以下中的一者或多者：缓和因疾病产生的一种或多种症状、减轻疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病恶化)、预防或延迟疾病扩散(例如，转移)、预防或延迟疾病复发、延迟或减缓疾病进展、改善疾疾患态、提供疾病的缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其它药物的剂量、延迟疾病进展、提高生活质量和/或延长存活。“治疗”也涵盖降低癌症的病理学结果。本发明的方法涵盖治疗的这些方面中的任何一者或多者。
术语“预防(prevent)”和例如“预防(prevented/preventing)”等类似词语指示用于预防、抑制或降低疾病或疾患(例如，癌症)的复发可能性的方法。它也是指延迟疾病或疾患的复发或延迟疾病或疾患的症状的复发。如本文所用，“预防”和类似词语也包括在疾病或疾患复发之前降低所述疾病或疾患的强度、效应、症状和/或负担。
如本文所用，“延迟”癌症的发展意指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定和/或推迟疾病的发展。这种延迟可具有不同时长，取决于所治疗的疾病和/或个体的病史。“延迟”癌症发展的方法是在与不使用所述方法相比时，在给定时间框内降低疾病发展的概率和/或在给定时间框内降低疾病程度的方法。这样的比较通常是基于使用统计学上显著数目的个体的临床研究。癌症发展可使用标准方法检测，这些标准方法包括(但不限于)计算机轴向断层摄影(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、腹部超声波、凝血测试、动脉摄影术或活检。发展也可指最初不可检测的癌症进展，并且包括出现、复发和发作。
本文所用的术语“有效量”是指足以治疗指定病症、疾患或疾病、例如改善、缓解、减轻和/或延迟其症状中的一者或多者的药剂或药剂组合的量。关于癌症，有效量包含足以引起肿瘤缩小和/或减小肿瘤生长速率(例如阻抑肿瘤生长)或预防或延迟其它不期望细胞增殖的量。在一些实施方案中，有效量是足以延迟发展的量。在一些实施方案中，有效量是足以预防或延迟复发的量。有效量可以一次或多次施用来施用。药物或组合物的有效量可：(i)减少癌细胞数目；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、减慢、减缓并且优选停止癌细胞浸润至周边器官中；(iv)抑制(即在一定程度上减缓并且优选停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上减轻与癌症相关的症状中的一种或多种。
如本文所用，“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括(但不限于)人类、牛、马、猫、犬、啮齿类动物或灵长类动物。在一些实施方案中，个体是人类。
术语“抗体”是以其最广泛意义使用并且涵盖各种抗体结构，包括(但不限于)单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全长抗体及其抗原结合片段，只要它们展现期望的抗原结合活性即可。术语“抗体”包括常规4链抗体、单结构域抗体及其抗原结合片段。
基础4链抗体单元是由两条相同轻(L)链和两条相同重(H)链构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基础异四聚体单元以及称为J链的额外多肽组成，并含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2至5个基础4链单元，所述单元可聚合以与J链组合形成多价装配物。在IgG的情形下，4链单元通常是约150,000道尔顿(Dalton)。每条L链通过一个共价二硫键连接至H链，而取决于H链同型，两条H链通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H链和L链也具有规则地间隔开的链内二硫桥。每条H链在N末端处具有可变结构域(VH)，之后对于α和γ链中的每一者是三个恒定结构域(CH)并且对于μ和ε同型是四个CH结构域。每条L链在N末端处具有可变结构域(VL)，之后在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。据认为，特定氨基酸残基在轻链可变结构域与重链可变结构域之间形成界面。VH与VL配对一起形成单一抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见例如Basic andClinical Immunology，第8版，Daniel P.Sties,Abba I.Terr和TristramG.Parsolw(编辑),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994，第71页和第6章。基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将来自任何脊椎动物物种的L链分配为两种明显不同类型(称为κ和λ)中的一者。取决于其重链(CH)恒定结构域的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分配为不同类别或同型。存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其重链分别命名为α、δ、ε、γ和μ。基于CH序列和功能的相对较小差异将γ和α类别进一步划分成亚类，例如人类表达以下亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“仅重链抗体”或“HCAb”是指包含重链，但缺少通常见于4链抗体中的轻链的功能性抗体。已知骆驼科动物(例如骆驼、骆马或羊驼)产生HCAb。
术语“单结构域抗体”或“sdAb”是指具有三个互补决定区(CDR)的单一抗原结合多肽。单独的sdAb能够在不与相应含CDR的多肽配对的情形下结合至抗原。在一些情形下，单结构域抗体是从骆驼科HCAb改造，并且其重链可变结构域在本文中称为“VHH”(重链抗体的重链的可变结构域)。骆驼科sdAb是已知最小抗原结合抗体片段中的一者(参见例如Hamers-Casterman等,Nature 363:446-8(1993)；Greenberg等,Nature 374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等,Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。基础VHH从N末端至C末端具有以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3是指互补决定区1至3。
“经分离”抗体(或构建体)是已从其产生环境的组分(例如，天然或重组)鉴定、分离和/或回收的抗体。优选地，经分离多肽不与来自其产生环境的所有其它组分缔合。其产生环境的污染性组分(例如源自重组转染细胞的组分)是通常将干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性溶质。在优选的实施方案中，将多肽纯化：(1)至如通过例如Lowry方法所测定大于95重量％的抗体，并且在一些实施方案中，至大于99重量％；(2)至通过使用旋杯式测序仪足以获得至少15个N末端或内部氨基酸序列残基的程度；或(3)至通过SDS-PAGE在非还原或还原条件下使用考马斯蓝(Coomassie Blue)或优选银染色的均质性。由于抗体天然环境的至少一种组分不会存在，因此经分离抗体(或构建体)包括在重组细胞内的原位抗体。然而，经分离多肽、抗体或构建体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变部分(相对于相同类别的其它抗体)并且含有抗原结合位点。来自骆驼科物种的仅重链抗体具有单一重链可变区，其称为“VHH”。因此，VHH是VH的特殊类型。
术语“可变”是指抗体之间可变结构域的某些区段的序列差异极大的事实。V结构域介导抗原结合并且界定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在整个可变结构域跨度中并非均匀分布。实际上，其在重链可变结构域和轻链可变结构域二者中均集中于三个称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)的区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(主要采用β折叠构型)，它们由三个CDR连接，这些CDR形成环，其连接β折叠结构并且在一些情形下形成β折叠结构的一部分。每个链中的CDR通过FR区保持紧密靠近在一起，并且与来自另一链的CDR一起促进形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等,Sequences of Immunological Interest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域并不直接参与抗体与抗原的结合，但展现各种效应功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同源抗体的群体获得的抗体，即，除可以少量存在的可能天然存在突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)以外，构成所述群体的个别抗体均相同。单克隆抗体具有高度特异性，其针对单一抗原位点。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性以外，单克隆抗体的优势在于它们是通过杂交瘤培养物合成，不受其它免疫球蛋白的污染。修饰词“单克隆”指示抗体的特征为从基本上同源的抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法来产生所述抗体。举例来说，待根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来制得，包括例如杂交瘤方法(例如，Kohler和Milstein.，Nature,256:495-97(1975)；Hongo等,Hybridoma,14(3):253-260(1995)；Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；Hammerling等,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)，和用于在动物中产生具有一部分或所有编码人类免疫球蛋白序列的人类免疫球蛋白基因座或基因的人类或人类样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；和第5,661,016号；Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可互换使用以指与抗体片段相对的呈其基本上完整形式的抗体。具体来说，全长4链抗体包括具有重链和轻链并且包括Fc区的那些抗体。全长仅重链抗体包括重链可变结构域(例如VHH)和Fc区。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如，人类天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情形下，完整抗体可具有一种或多种效应功能。
“抗体片段”或“抗原结合片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段的实例包括(但不限于)Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双链抗体；直链抗体(参见美国专利第5,641,870号，实施例2；Zapata等,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体(scFv)分子；单结构域抗体(例如VHH)和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残余“Fc”片段，“Fab”片段的命名反映容易结晶的能力。Fab片段由整个L链以及H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段关于抗原结合都是单价的，即其具有单一抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大F(ab')2片段，所述片段大致对应于两个经二硫键连接的具有不同抗原结合活性的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端处具有几个额外残基，这些残基包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab'-SH是本文针对其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab'的命名。F(ab')2抗体片段最初是作为在其间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对产生。也已知抗体片段的其它化学偶联。
术语“恒定结构域”是指相对于免疫球蛋白的另一部分(即可变结构域，其含有抗原结合位点)具有更加保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子的部分。恒定结构域含有重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称CH)和轻链的CHL(或CL)结构域。
基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”分配为两种明显不同类型(称为卡帕(“κ”)和拉姆达(“λ”))中的一者。
“Fv”是含有完全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由一个重链可变区结构域与一个轻链可变区结构域呈紧密非共价缔合形式的二聚体组成。从这两个结构域的折叠产生六个高变环(从H链和L链各自产生3个环)，这些高变环贡献用于抗原结合的氨基酸残基并且赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使单一可变结构域(或Fv的一半，其仅包含三个对抗原具有特异性的CDR)也具有识别并结合抗原的能力，但其亲和力低于完整结合位点。
“单链Fv”，也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成单一多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，scFv多肽还包含在VH与VL结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成所期望的抗原结合结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun,The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语“双链抗体”是指通过以下方式制备的小抗体片段：用VH与VL结构域之间的短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(参见前述段落)，使得实现V结构域的链间而非链内配对，从而产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双链抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两种抗体的VH和VL结构域存在于不同多肽链上。双链抗体更详细地阐述于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中。
本文的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；以及这些抗体的片段，只要它们展现期望生物学活性即可(美国专利第4,816,567号；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。“人源化抗体”作为“嵌合抗体”的亚群使用。
非人类(例如，骆马或骆驼科动物)抗体的“人源化”形式是含有最少量源自非人类免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体是人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的CDR(下文定义)的残基是由来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔、骆驼、骆马、羊驼或非人类灵长类动物)的CDR(供体抗体)的具有期望特异性、亲和力和/或能力的残基代替。在一些情况下，人类免疫球蛋白的框架(“FR”)残基由相应的非人类残基代替。此外，人源化抗体可包含接受者抗体或供体抗体中不存在的残基。可进行这些修饰以进一步改善抗体效能，例如结合亲和力。一般来说，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个并且通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人类免疫球蛋白序列的那些高变环，并且全部或基本上全部的FR区是人类免疫球蛋白序列的那些FR区，但所述FR区可包括一种或多种改进抗体效能(例如结合亲和力、异构化、免疫原性等)的个别FR残基取代。FR中的这些氨基酸取代的数量通常在H链中不超过6个，并且在L链中不超过3个。人源化抗体任选地也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常为人类免疫球蛋白恒定区)的至少一部分。关于其它细节，参见例如Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。也参见例如Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；和美国专利第6,982,321号和第7,087,409号。
“人类抗体”是具有对应于由人类所产生抗体的氨基酸序列的氨基酸序列和/或使用用于制备如本文所公开的人类抗体的任一技术制备的抗体。这种人类抗体的定义明确排除包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。人类抗体可使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)来产生。Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。阐述于以下文献中的方法也可用于制备人类单克隆抗体：Cole等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。也参见van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)。人类抗体可通过向转基因动物施用抗原来制备，这些动物已经修饰以响应于抗原攻击而产生这些抗体，但其内源性基因座已失能，例如，经免疫异种小鼠(关于XENOMOUSETM技术，参见例如美国专利第6,075,181号和第6,150,584号)。关于经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体，也参见例如Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在本文中使用时是指抗体可变结构域的在序列上高变和/或形成结构上限定环的区。通常，单结构域抗体包含三个HVR(或CDR)：HVR1(或CDR1)、HVR2(或CDR2)和HVR3(或CDR3)。HVR3(或CDR3)展示所述三个HVR的大部分多样性，并且被认为在赋予抗体良好特异性方面具有独特作用。参见例如Hamers-Casterman等,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
术语“互补决定区”或“CDR”用于指如由Kabat系统所定义的高变区。参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。
本文使用并涵盖许多HVR的描述。Kabat互补决定区(CDR)是基于序列可变性并且最常用(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表KabatHVR与Chothia结构环之间的折衷，并且用于Oxford Molecular的AbM抗体建模软件中。“contact”HVR是基于对可获得的复杂晶体结构的分析。来自这些HVR中的每一者的残基是如下表1中所注明。
表1.HVR描述。
Figure BDA0002675071240000261
HVR可包含如下“延伸HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一者，根据Kabat等(同上)对可变结构域残基进行编号。
单结构域抗体(例如VHH)的氨基酸残基是根据由Kabat等(“Sequence ofproteins of immunological interest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,Md.，公开第91号)所给出的针对VH结构域的通用编号进行编号，如在Riechmann和Muyldermans,J.Immunol.Methods 2000年6月23日；240(1-2):185-195的文章中适于来自骆驼科动物的VHH结构域。根据该编号，VHH的FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，VHH的CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，VHH的FR2包含在位置36-49处的氨基酸，VHH的CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，VHH的FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，VHH的CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，并且VHH的FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。就此而言，应注意，如本领域中对于VH结构域和VHH结构域所熟知，每个CDR中的氨基酸残基的总数量可能有所变化并且可能不对应于由Kabat编号所指示的氨基酸残基的总数量(即，根据Kabat编号的一个或多个位置在实际序列中可未被占据，或实际序列可含有多于Kabat编号所容许数量的氨基酸残基)。
表述“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变化形式是指用于Kabat等(同上)中的所汇编抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这种编号系统，实际直链氨基酸序列可含有较少或额外的对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或插入的氨基酸。举例来说，重链可变结构域可包括在H2的残基52后的单一氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和重链FR残基82后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可通过将抗体序列的同源区与“标准”Kabat编号序列比对来确定给定抗体残基的Kabat编号。
除非本文中另有指示，否则免疫球蛋白重链中的残基编号是如Kabat等,同上中EU索引的编号。“如Kabat中的EU索引”是指人类IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”残基是除如本文所定义的HVR残基以外的那些可变结构域残基。
“人类一致框架”或“接受体人类框架”是代表在人类免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常出现的氨基酸残基的框架。通常，人类免疫球蛋白VL或VH序列的选择是来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)中的亚组。实例包括，对于VL而言，亚组可为如Kabat等,同上中的亚组κI、κII、κIII或κIV。另外，对于VH而言，亚组可为如Kabat等中的亚组I、亚组II或亚组III。或者，人类一致框架可源自上文，其中特定残基、例如当人类框架残基是基于其与供体框架的同源性(通过将供体框架序列与各种人类框架序列的集合体进行比对)来选择时。“源自”人类免疫球蛋白框架或人类一致框架的接受体人类框架可包含其相同氨基酸序列，或其可含有先前存在的氨基酸序列变化。在一些实施方案中，先前存在的氨基酸变化的数目为10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。
“亲和力成熟”抗体是在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，与不具有那些改变的亲本抗体相比，所述改变使得所述抗体对抗原的亲和力有所改善。在一些实施方案中，亲和力成熟抗体对靶抗原具有纳摩尔级或甚至皮摩尔级亲和力。亲和力成熟抗体是通过本领域已知的程序来产生。举例来说，Marks等,Bio/Technology10:779-783(1992)描述通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变由例如下列所描述：Barbas等,Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等,Gene 169:147-155(1995)；Yelton等,J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins等,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”或“对……具有特异性”是指可测量并且可再现的相互作用，例如靶标与抗原结合蛋白(例如sdAb)之间的结合，其决定在异源分子群体(包括生物分子)存在下靶标的存在。举例来说，特异性结合靶标(其可以是表位)的抗原结合蛋白(例如sdAb)是与其结合其它靶标相比以更大亲和力、亲合力更容易地和/或以更长持续时间结合该靶标的抗原结合蛋白(例如sdAb)。在一些实施方案中，如通过例如放射性免疫测定(RIA)所测量，抗原结合蛋白(例如sdAb)与无关靶标的结合程度小于所述抗原结合蛋白(例如sdAb)与靶标的结合的约10％。在一些实施方案中，特异性结合靶标的抗原结合蛋白(例如sdAb)的解离常数(KD)为≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10- 9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M。在一些实施方案中，抗原结合蛋白特异性结合蛋白质上在来自不同物种的蛋白质间保守的表位。在一些实施方案中，特异性结合可包括(但不要求)排他性结合。抗体或抗原结合结构域的结合特异性可通过本领域已知的方法以实验方式确定。这些方法包括(但不限于)免疫印迹、ELISA测试、RIA测试、ECL测试、IRMA测试、EIA测试、BIACORETM测试和肽扫描。
术语“特异性”是指抗原结合蛋白(例如sdAb)选择性识别抗原的特定表位。举例来说，天然抗体是单特异性的。如本文所用的术语“多特异性”表示抗原结合蛋白具有多表位特异性(即，能够特异性结合至一种生物分子上的两种、三种或更多种不同表位或能够特异性结合至两种、三种或更多种不同生物分子上的表位)。如本文所用的“双特异性”表示抗原结合蛋白具有两种不同抗原结合特异性。除非另有指示，否则由所列示双特异性抗体结合的抗原的顺序是任意的。也就是说，例如，术语“抗LAG-3/PD-1”、“抗PD-1/LAG-3”、“LAG-3×PD-1”和“PD-1×LAG-3”可互换使用以指特异性结合至LAG-3和PD-1二者的双特异性抗体。如本文所用的术语“单特异性”表示具有一个或多个结合位点的抗原结合蛋白，这些结合位点中的每一者结合相同抗原的相同表位。
如本文所用的术语“价”表示在抗原结合蛋白中存在指定数目的结合位点。举例来说，天然抗体或全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”表示在抗原结合蛋白中分别存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。
“抗体效应功能”是指可归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性，并且随抗体同型而有所变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞活化。“降低或最小化”的抗体效应功能意指抗体效应功能相比于野生型或未经修饰的抗体降低至少50％(或者60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)。抗体效应功能的测定可由本领域的一般技术人员容易地测定并测量。在一个优选的实施方案中，补体结合、补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性的抗体效应功能受影响。在一些实施方案中，通过恒定区中消除糖基化的突变(例如，“无效应物突变”)消除效应功能。在一个方面，无效应物突变是CH2区中的N297A或DANA突变(D265A+N297A)。Shields等,J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(2001)。或者，导致效应功能降低或消除的其它突变包括：K322A和L234A/L235A(LALA)。或者，效应功能可通过产生技术来降低或消除，例如在未糖基化(例如，大肠杆菌(E.coli))或在导致经改变的糖基化模式(在促进效应功能方面无效或较不有效)的宿主细胞中表达(例如，Shinkawa等,J.Biol.Chem.278(5):3466-3473(2003)。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC是指以下细胞毒性形式：其中结合至存在于某些细胞毒性细胞(例如，天然杀手(NK)细胞、嗜中性白细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)的所分泌Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性地结合至带抗原的靶细胞并且随后利用细胞毒素杀伤所述靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞并且是通过这种机制杀伤靶细胞所需的。介导ADCC的原代细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞则表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的Fc表达汇总于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页上的表2中。为评价所关注分子的ADCC活性，可实施如美国专利第5,500,362号或第5,821,337号中所述的体外ADCC测定。用于这种测定的可用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀手(NK)细胞。或者或另外，可在体内，例如在Clynes等,PNASUSA95:652-656(1998)中所公开的动物模型中评价所关注分子的ADCC活性。
术语“Fc区”或“片段可结晶区”在本文中用于界定免疫球蛋白重链的C末端区域，其包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能有所变化，但通常将人类IgG重链Fc区界定为从位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可在例如抗体的产生或纯化期间或通过重组工程改造编码抗体重链的核酸去除。因此，完整抗体的组成可包含去除全部K447残基的抗体群体、未去除K447残基的抗体群体和具有含有和不含K447残基的抗体混合物的抗体群体。用于本文所述抗体中的适宜天然序列Fc区包括人类IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或“FcR”阐述结合抗体的Fc区的受体。优选FcR是天然序列人类FcR。此外，优选FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，其包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，两者具有主要在其细胞质结构域上有所不同的类似氨基酸序列。活化性受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见M.
Figure BDA0002675071240000311
Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR综述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。本文的术语“FcR”涵盖其它FcR，包括有待在将来鉴定的那些FcR。
术语“Fc受体”或“FcR”也包括新生受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿。Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994)。已知测量与FcRn的结合的方法(参见例如Ghetie和Ward，Immunol.Today 18:(12):592-8(1997)；Ghetie等,NatureBiotechnology 15(7):637-40(1997)；Hinton等,J.Biol.Chem.279(8):6213-6(2004)；WO2004/92219(Hinton等)。可在例如表达人类FcRn的转基因小鼠或经转染人类细胞系中或在施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定人类FcRn高亲和力结合多肽与FcRn的体内结合和血清半衰期。WO 2004/42072(Presta)阐述改进或减少与FcR结合的抗体变体。也参见例如Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的溶解。经典补体途径的活化是通过补体系统的第一组分(C1q)与抗体(适当亚类)的结合来起始，这些抗体结合至其同族抗原。为评价补体活化，可实施如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所阐述的CDC测定。具有经改变Fc区氨基酸序列和增加或减小的C1q结合能力的抗体变体阐述于美国专利第6,194,551B1号和第WO99/51642号中。那些专利公开的内容通过引用明确并入本文。也参见Idusogie等,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合搭配物(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和强度。除非另有指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。结合亲和力可由Kd、K解离、K缔合或Ka指示。如本文所用，术语“K解离”旨在是指如根据动力学选择设定所测定的抗体(或抗原结合结构域)从抗体/抗原复合物的解离速率常数，其以s-1为单位表示。如本文所用，术语“K缔合”旨在是指抗体(或抗原结合结构域)与抗原缔合以形成抗体/抗原复合物的缔合速率常数，其以M-1s-1为单位表示。如本文所用，术语平衡解离常数“KD”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离常数，并且描述占据平衡时抗体分子溶液中所存在的所有抗体结合结构域的一半所需的抗原浓度并且等于K解离/K缔合，其以M为单位表示。Kd的测量预先假定所有结合剂都是在溶液中。在抗体是栓系至细胞壁的情形下，例如在酵母表达系统中，相应平衡速率常数表示为EC50，其给出Kd的良好近似值。亲和力常数Ka是解离常数Kd的倒数，其以M-1为单位表示。解离常数(KD或Kd)用作显示抗体对抗原的亲和力的指标。举例来说，通过Scatchard方法使用标记有多种标记剂的抗体，以及通过使用作为非处方测量试剂盒的BIACORETM X(由Amersham Biosciences制造)或类似试剂盒，根据试剂盒附带的使用者手册和实验操作方法可容易地进行分析。可使用这些方法导出的KD值是以M(Mol)为单位表示。特异性结合至靶标的抗体或其抗原结合片段的解离常数(Kd)可为例如≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M。
半最大抑制浓度(IC50)是物质(例如抗体)抑制特定生物或生物化学功能的有效性的量度。其指示将给定生物学过程抑制一半需要多少特定药物或其它物质(抑制剂，例如抗体)。这些值通常表示为摩尔浓度。促效剂药物或其它物质(例如抗体)的IC50与“EC50”相当。EC50也代表在体内获得50％的最大效应所需的血浆浓度。如本文所用，“IC50”用于指示在体外中和50％的抗原生物活性所需抗体的有效浓度。IC50或EC50可通过例如以下的生物测定来测量：通过FACS分析的对配体结合的抑制(竞争结合测定)、基于细胞的细胞因子释放测定或放大的发光邻近均相测定(AlphaLISA)。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”被定义为在比对序列并且引入空位(如果需要的话)以实现最大序列同一性百分比后，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的，比对可以本领域技术人员所熟知的各种方式来实现，例如使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于衡量比对的适当参数，包括在所比较序列的全长范围内实现最大比对所需要的任何算法。
编码本文所述的构建体、抗体或其抗原结合片段的“经分离”核酸分子是从其产生环境中通常与其缔合的至少一种污染性核酸分子鉴定并且分离的核酸分子。优选地，经分离的核酸不与和产生环境相关的所有组分缔合。编码本文所述的多肽和抗体的经分离的核酸分子的形式不是其在自然界中所发现的形式或设置。因此，经分离的核酸分子有别于天然存在于细胞中的编码本文所述多肽和抗体的核酸。经分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但所述核酸分子是存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体内表达可操作地连接的编码序列所需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞可利用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸置于与另一核酸序列的功能性关系时，所述核酸是“可操作地连接的”。举例来说，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则所述前序列或分泌前导序列的DNA可操作地连接至所述多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子或增强子可操作地连接至所述序列；或如果核糖体结合位点的定位有助于翻译，则所述核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”意味着所连接的DNA序列是邻接序列，并且在分泌前导序列的情形下是邻接序列并且位于阅读相中。然而，增强子并非必须邻接。连接是通过在适宜限制位点处接合来完成。如果不存在这些位点，则根据常规实践使用合成寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用的术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括呈自我复制核酸结构的载体以及并入于引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够引导与其可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用的术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源性核酸转移或引入至宿主细胞中的过程。“转染”或“转化”或“转导”的细胞是经外源性核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代个体细胞及其子代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指其中已引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化株”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源自其的子代(不考虑传代次数)。子代的核酸含量与亲本细胞可以不完全相同，而是可含有突变。本文包括经筛选或选择用于原始转化细胞中的具有相同功能或生物学活性的突变体子代。
术语“药物制剂”或“药物组合物”是指如下制剂：其所呈形式允许活性成分的生物学活性有效，并且不含对将施用所述制剂的受试者具有不可接受毒性的其它组分。这些制剂是无菌的。“无菌”制剂是无菌的或者不含所有活的微生物及其孢子。
应理解，本文所述的本发明实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。
在本文中提及“约”一个值或参数包括(并且描述)关于所述值或参数本身的变化。举例来说，提及“约X”的说明包括“X”的说明。
如本文所用，提及“并非”一个值或参数通常意指并且阐述“不同于”一个值或参数。举例来说，方法不用于治疗X类型的癌症意指所述方法用于治疗不同于X类型的癌症。
本文所用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
除非上下文另外明确指示，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一”和“所述”包括多个指示物。
II.抗LAG-3构建体
本申请的一个方面提供经分离的抗LAG-3构建体，其包含特异性识别LAG-3的单结构域抗体(sdAb)(即，“抗LAG-3 sdAb”)。在一些实施方案中，所述抗LAG-3构建体是抗LAG-3sdAb、融合蛋白或其抗原结合片段，其特异性结合至LAG-3并且拮抗LAG-3结合II类MHC分子和/或介导T细胞耗竭的能力。
(I)抗LAG-3单结构域抗体
本文所述的经分离抗LAG-3构建体包含抗LAG-3 sdAb。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb特异性识别人类LAG-3。示例性人类LAG-3的完整氨基酸序列包含SEQ ID NO:350的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb特异性识别人类LAG-3内的表位。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb特异性识别人类LAG-3的细胞外结构域。示例性人类LAG-3的细胞外结构域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:351的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类灵长类动物(例如食蟹猴)的LAG-3交叉反应。
在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3蛋白的至少一种种间变体交叉反应。在一些实施方案中，例如，LAG-3蛋白(或其片段)是人类LAG-3，并且LAG-3蛋白(或其片段)的种间变体是其食蟹猴变体。抗LAG-3 sdAb或其构建体的交叉反应性可促进抗LAG-3构建体的临床开发，例如通过在动物研究中容许更准确并且具反应性的给药。
在一些实施方案中，提供一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3，并且氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。因此，在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体，其中所述氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
本文所述的CDR序列提供于表11中。所述CDR可以任何组合来组合以产生多种抗LAG-3 sdAb。本领域技术人员将容易地了解，包含源自本文所述抗体的CDR或可变结构域序列，但其中所述CDR或可变结构域序列是使用除Kabat系统以外的算法预测的抗体构建体是在本发明的范围内。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列、SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列和SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:39、115和191的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:40、116和192的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:41、117和193的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:42、118和194的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:43、119和195的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:44、120和196的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:45、121和197的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:46、122和198的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQID NO:54、130和206的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:61、137、213的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:70、146和222的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:72、148和224的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:73、149和225的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:53、129和205的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:60、136和212的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:69、145和221的序列。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3 sdAb，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:71、147和223的序列。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:274的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:281的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQID NO:282的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:289的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:296的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:305的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:307的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:308的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:288的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:295的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:304的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:306的氨基酸序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH的抗LAG-3 sdAb，所述VHH包含SEQ ID NO:274-306中的任一者的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
本文所述的抗LAG-3 sdAb可包含FR区的任何合适序列。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:1-38中的任一者的氨基酸序列的FR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个、3个或更多个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:77-114中的任一者的氨基酸序列的FR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个、3个或更多个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:153-190中的任一者的氨基酸序列的FR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个、3个或更多个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:229-266中的任一者的氨基酸序列的FR4或其包含至多约3个(例如约1个、2个、3个或更多个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包含表11的任何一种抗LAG-3 sdAb的FR1、FR2、FR3和FR4。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域或其与SEQ ID NO:289-324中的任一者具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域或其在VHH结构域中包含至多约10个(例如约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域或其在CDR1和/或CDR2和/或CDR3中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域或其在FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4中包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域或其在CDR和FR二者中包含氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种包含VHH结构域的抗LAG-3sdAb ，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:288的氨基酸序列的VHH结构域或其与SEQ ID NO:288具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包含一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸取代：(1)在氨基酸位置11处(例如，S或L)；(2)在氨基酸位置14处(例如，A或P)；(3)在氨基酸位置44处(例如，E或G)；(4)在氨基酸位置45处(例如，R或L)；(5)在氨基酸位置49处(例如，A或S)；(6)在氨基酸位置71处(例如，K或R)；(7)在氨基酸位置74处(例如，A或S)；(8)在氨基酸位置83处(例如，D或N)；(9)在氨基酸位置86处(例如，R或K)；(10)在氨基酸位置87处(例如，A或P)；(11)在氨基酸位置92处(例如，M或V)；(12)在氨基酸位置119处(例如，Q或L)；其中所述氨基酸位置是基于SEQ ID NO:288。
在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:295的氨基酸序列的VHH结构域或其与SEQ ID NO:295具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包含一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸取代：(1)在氨基酸位置1处(例如，Q或E)；(2)在氨基酸位置5处(例如，A或V)；(3)在氨基酸位置11处(例如，S或L)；(4)在氨基酸位置14处(例如，A或P)；(5)在氨基酸位置44处(例如，E或G)；(6)在氨基酸位置45处(例如，R或L)；(7)在氨基酸位置71处(例如，K或R)；(8)在氨基酸位置74处(例如，A或S)；(9)在氨基酸位置86处(例如，R或K)；(10)在氨基酸位置87处(例如，A或P)；(11)在氨基酸位置92处(例如，M或V)；或(12)在氨基酸位置117处(例如，Q或L)；其中所述氨基酸位置是基于SEQ ID NO:295。
在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:304的氨基酸序列的VHH结构域或其与SEQ ID NO:304具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包含一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸取代：(1)在氨基酸位置1处(例如，Q或E)；(2)在氨基酸位置3处(例如，Q或H)；(3)在氨基酸位置5处(例如，M或V)；(4)在氨基酸位置11处(例如，S或L)；(5)在氨基酸位置14处(例如，V或P)；(6)在氨基酸位置44处(例如，E或G)；(7)在氨基酸位置45处(例如，R或L)；(8)在氨基酸位置49处(例如，A或S)；(8)在氨基酸位置71处(例如，K或R)；(9)在氨基酸位置74处(例如，A或S)；(10)在氨基酸位置86处(例如，R或K)；(11)在氨基酸位置87处(例如，A或P)；(12)在氨基酸位置92处(例如，M或V)；(13)在氨基酸位置94处(例如，F或Y)；或(14)在氨基酸位置117处(例如，Q、L或I)；其中所述氨基酸位置是基于SEQ ID NO:304。
在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:306的氨基酸序列的VHH结构域或其与SEQ ID NO:306具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包含一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸取代：(1)在氨基酸位置5处(例如，A或V)；(2)在氨基酸位置11处(例如，S或L)；(3)在氨基酸位置14处(例如，A或P)；(4)在氨基酸位置44处(例如，E或G)；(5)在氨基酸位置45处(例如，R或L)；(6)在氨基酸位置49处(例如，A或S)；(7)在氨基酸位置71处(例如，K或R)；(8)在氨基酸位置74处(例如，A或S)；(9)在氨基酸位置86处(例如，R或S)；(10)在氨基酸位置87处(例如，A或P)；(11)在氨基酸位置92处(例如，M或V)；或(12)在氨基酸位置121处(例如，Q或L)；其中所述氨基酸位置是基于SEQ ID NO:306。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb或包含抗LAG-3 sdAb的抗LAG-3构建体，其与任何一种本文所述的抗LAG-3 sdAb竞争性地特异性结合至LAG-3。在一些实施方案中，竞争性结合可使用ELISA测定来确定。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb(或包含抗LAG-3 sdAb的抗LAG-3构建体)，其与包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的抗LAG-3 sdAb竞争性地特异性结合至LAG-3。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb(或包含抗LAG-3 sdAb的抗LAG-3构建体)，其与包含以下的抗LAG-3 sdAb竞争性地特异性结合至LAG-3：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 sdAb(或包含抗LAG-3 sdAb的抗LAG-3构建体)，其与表11的任何一种抗LAG-3 sdAb竞争性地特异性结合至LAG-3。在一些实施方案中，竞争性抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M(例如约10-8M至约10-12M，或约10-9M至约10-11M)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。在一些实施方案中，竞争性抗LAG-3 sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
单结构域抗体
在一些实施方案中，抗LAG-3构建体是单结构域抗体。示例性sdAb包括(但不限于)来自仅重链抗体的重链可变结构域(例如，骆驼科(Camelidae)中的VHH(重链抗体的重链可变结构域)或软骨鱼类中的VNAR(鲨鱼新抗原受体的可变结构域))、天然不含轻链的结合分子、源自常规4链抗体的单结构域(例如VH或VL)、人源化仅重链抗体、由表达人类重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人类单结构域抗体和除源自抗体的那些结构域和单结构域支架以外的经工程改造的结构域和单结构域支架。sdAb可源自任何物种，包括(但不限于)小鼠、大鼠、人类、骆驼、骆马、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。本文所涵盖的sdAb也包括来自除骆驼科和鲨鱼以外的物种的天然存在的sdAb分子。
在一些实施方案中，sdAb源自称为不含轻链的重链抗体(在本文中也称为“仅重链抗体”或“HCAb”)的天然存在单结构域抗原结合分子。这些单结构域分子公开于例如WO 94/04678和Hamers-Casterman,C.等(1993)Nature 363:446-448中。出于清晰的原因，源自天然不含轻链的重链分子的可变结构域在本文中称为VHH以使其与四链免疫球蛋白的常规VH区分。这样的VHH分子可源自骆驼科物种中产生的抗体，例如骆驼、骆马、瘦驼、单峰骆驼、羊驼和原驼。除骆驼科以外的其它物种也可产生天然不含轻链的重链分子，并且这样的VHH在本申请的范围内。
在一些实施方案中，sdAb源自软骨鱼类中所发现的免疫球蛋白的可变区。举例来说，sdAb可源自在鲨鱼血清中发现的称为新颖抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同型。产生源自NAR可变区的单结构域分子(“IgNAR”)的方法阐述于WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.14:2901-2909中。
在一些实施方案中，sdAb是重组、CDR移植、人源化、骆驼化、去免疫化和/或体外产生的(例如，通过噬菌体展示选择)。在一些实施方案中，框架区的氨基酸序列可通过框架区中特定氨基酸残基的“骆驼化”来改变。骆驼化是指通过用在重链抗体的VHH结构域中的一个或多个相应位置处出现的氨基酸残基中的一者或多者代替或取代来自常规4链抗体的(天然存在)VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这种骆驼化可以本身已知的方式来实施，本领域技术人员例如基于本文中的进一步阐述将了解所述方式。这种“骆驼化”取代优选在形成和/或存在于VH-VL界面的氨基酸位置处和/或在如本文所定义的所谓的骆驼科标志残基处插入(参见例如WO 94/04678，Davies和Riechmann FEBS Letters 339:285-290,1994；Davies和Riechmann Protein Engineering 9(6):531-537,1996；Riechmann J.Mol.Biol.259:957-969,1996；和Riechmann和MuyldermansJ.Immunol.Meth.231:25-38,1999)。
在一些实施方案中，sdAb是由表达人类重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人类sdAb。参见例如US20090307787A1、美国专利第8,754,287号、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。在一些实施方案中，sdAb是亲和力成熟的。
在一些实施方案中，针对特定抗原或靶标的天然存在VHH结构域可从骆驼科VHH序列的(原初或免疫)文库获得。这些方法可涉及或可不涉及使用所述抗原或靶标或其至少一部分、片段、抗原性决定簇或表位，使用一种或多种本身已知的筛选技术筛选这样的文库。这些文库和技术例如阐述于WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020和WO 03/035694中。或者，可使用源自(原初或免疫)VHH文库的经改进的合成或半合成文库，例如通过例如如例如WO 00/43507中所阐述的随机诱变和/或CDR改组等技术从(原初或免疫)VHH文库获得的VHH文库。
在一些实施方案中，sdAb是从常规4链抗体产生。参见例如EP 0 368 684；Ward等(Nature 1989年10月12日；341(6242):544-6)；Holt等,Trends Biotechnol.,2003,21(11):484-490；WO 06/030220；和WO 06/003388。
由于sdAb的独特性质，因此使用VHH结构域作为单一抗原结合蛋白或作为抗原结合结构域(即作为较大蛋白质或多肽的一部分)提供多种优于常规VH和VL、scFv和常规抗体片段(例如Fab或(Fab')2)的显著优点：1)仅需要单结构域以高亲和力结合抗原，从而使得既不需要具有第二结构域，也不需要确保所述两个结构域以正确空间构象和构型存在(例如不需要在折叠期间将重链和轻链配对，不需要使用例如对于scFv的经特别设计的接头)；2)VHH结构域和其它sdAb可从单一基因表达并且不需要翻译后折叠或修饰；3)VHH结构域和其它sdAb可容易地工程改造成多价和/或多特异性形式(例如本申请中所阐述的那些形式)；4)VHH结构域和其它sdAb高度可溶并且不具有聚集的趋势(正如Ward等,Nature.1989年10月12日；341(6242):544-6所阐述的小鼠源“dAb”；5)VHH结构域和其它sdAb针对热、pH、蛋白酶和其它变性剂或条件高度稳定；6)VHH结构域和其它sdAb易于制备并且花费相对较少(即使在较大的生产规模上)，例如使用微生物发酵，这是因为不需要使用哺乳动物表达系统(产生例如常规抗体片段所需)；7)与常规4链抗体及其抗原结合片段相比，VHH结构域和其它sdAb相对较小(大约15kDa，或较常规IgG小10倍)，因此对例如实体肿瘤和其它致密组织具有(更)高的组织渗透能力；和8)VHH结构域和其它sdAb可展现所谓的“空腔结合性质”(由于与常规VH结构域相比其延伸的CDR3环)，并且因此可和常规4链抗体及其抗原结合片段不可及的靶标和表位，例如，已显示VHH结构域和其它sdAb可抑制酶(参见例如WO1997049805；Transue等,Proteins.1998年9月1日；32(4):515-22；Lauwereys等,EMBOJ.1998年7月1日；17(13):3512-20)。
LAG-3
包含503个氨基酸的淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)属于Ig超家族并且含有4个细胞外Ig样结构域(命名为D1至D4)。LAG-3是在经活化T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞样树突细胞上表达的细胞表面蛋白，并且在这些淋巴细胞亚群的功能中起作用，所述作用是重要的但尚未完全理解。
术语“淋巴细胞活化蛋白3”、“LAG-3”、“LAG-3抗原”和“LAG-3表位”可互换使用，并且包括人类LAG-3的变体、同工型、物种同源物和与LAG-3具有至少一个共同表位的类似物。
人类LAG-3的示例性氨基酸序列以Genbank登录号P18627公开。在一些实施方案中，人类LAG-3可在氨基酸序列上与Genbank登录号P18627的人类LAG-3具有至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，人类LAG-3序列与Genbank登录号P18627的人类LAG-3具有不超过约10个氨基酸的差异。在一些实施方案中，人类LAG-3可显示与Genbank登录号P18627的人类LAG-3不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸的差异。在一些实施方案中，人类LAG-3序列可因例如具有保守突变或具有非保守区中的突变而与Genbank登录号P18627的人类LAG-3不同，并且LAG-3具有与Genbank登录号P18627的人类LAG-3基本上相同的生物学功能。
在一些实施方案中，本文所述的抗LAG-3 sdAb特异性识别与Genbank登录号P18627的人类LAG-3具有至少约90％氨基酸序列同一性的LAG-3多肽。在一些实施方案中，本文所述的抗LAG-3 sdAb特异性识别包含SEQ ID NO:350或351的氨基酸序列的LAG-3多肽。
在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb可与来自除人类以外的物种的LAG-3或在结构上与人类LAG-3有关的其它蛋白质(例如，人类LAG-3同源物)交叉反应。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb对人类LAG-3具有完全特异性并且不展现物种或其它类型的交叉反应性。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb特异性识别人类LAG-3的可溶同工型。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb特异性识别人类LAG-3的膜结合同工型(例如，SEQ ID NO:350)。
在一些实施方案中，本文所述的抗LAG-3 sdAb特异性识别LAG-3的细胞外结构域(ECD)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb特异性识别LAG-3ECD的N末端部分。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb特异性识别LAG-3ECD的C末端部分。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb特异性识别LAG-3ECD的中间部分。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb特异性识别的LAG-3的ECD在氨基酸序列上与Genbank登录号P18627的人类LAG-3的ECD具有至少约95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb特异性识别的LAG-3的ECD在氨基酸序列上与Genbank登录号P18627的人类LAG-3的ECD具有100％同一性。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb特异性识别包含SEQ ID NO:351的氨基酸序列的LAG-3多肽。
抗体亲和力
抗体或抗原结合结构域的结合特异性可通过本领域已知的方法以实验方式测定。这些方法包括(但不限于)免疫印迹、ELISA测试、RIA测试、ECL测试、IRMA测试、EIA测试、BIACORETM测试和肽扫描。
在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M、约10-7M至约10-8M、约10-8M至约10-9M、约10-9M至约10-10M、约10-10M至约10-11M、约10-11M至约10-12M、约10-7M至约10-12M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M、约10-7M至约10-11M、约10-8M至约10-11M、约10-9M至约10-11M、约10-7M至约10-10M、约10-8M至约10-10M或约10-7M至约10-9M。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的Kd强于约10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M中的任一者。在一些实施方案中，LAG-3是人类LAG-3。在一些实施方案中，LAG-3是食蟹猴LAG-3。在一些实施方案中，LAG-3是LAG-3的细胞外结构域。
在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的K缔合为约103M-1s-1至约108M- 1s-1、约103M-1s-1至约104M-1s-1、约104M-1s-1至约105M-1s-1、约105M-1s-1至约106M-1s-1、约106M- 1s-1至约107M-1s-1、或约107M-1s-1至约108M-1s-1。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的K缔合为约103M-1s-1至约105M-1s-1、约104M-1s-1至约106M-1s-1、约105M-1s-1至约107M-1s-1、约106M-1s-1至约108M-1s-1、约104M-1s-1至约107M-1s-1、或约105M-1s-1至约108M-1s-1。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的K缔合不超过约103M-1s-1、104M-1s-1、105M-1s-1、106M-1s-1、107M-1s-1或108M-1s-1中的任一者。
在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的K解离为约1s-1至约10-6s-1、约1s-1至约10-2s-1、约10-2s-1至约10-3s-1、约10-3s-1至约10-4s-1、约10-4s-1至约10-5s-1、约10-5s-1至约10-6s-1、约1s-1至约10-5s-1、约10-2s-1至约10-6s-1、约10-3s-1至约10-6s-1、约10-4s-1至约10-6s-1、约10-2s-1至约10-5s-1、或约10-3s-1至约10-5s-1。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的K解离为至少约1s-1、10-2s-1、10-3s-1、10-4s-1、10-5s-1或10-6s-1中的任一者。
在一些实施方案中，在放大的发光邻近均相测定(AlphaLISA)中，抗LAG-3 sdAb的EC50小于10nM。在一些实施方案中，在通过FACS分析的对配体结合的抑制(竞争结合测定)或基于细胞的细胞因子释放测定中，抗LAG-3 sdAb的EC50小于500nM。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb的EC50小于1nM(例如约0.001nM至约0.01nM、约0.01nM至约0.1nM、约0.1nM至约1nM等)、约1nM至约10nM、约1nM至约5nM、约5nM至约10nM、约10nM至约50nM、约50nM至约100nM、约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、或约400nM至约500nM。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与LAG-3之间结合的EC50不超过约0.1nM、1nM、5nM、10nM、50nM、10nM、100nM、200nM或500nM中的任一者。
嵌合或人源化抗体
在一些实施方案中，本文所提供的抗LAG-3 sdAb是嵌合抗体。某些嵌合抗体阐述于例如美国专利第4,816,567号；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，源自骆驼科物种(例如骆马)的可变区)和人类恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体是其中类别或亚类已从亲本抗体的类别或亚类发生变化的“类别切换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，使非人类抗体人源化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人类抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR、例如CDR(或其部分)源自非人类抗体，并且FR(或其部分)源自人类抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人类抗体(例如，HVR残基所源自的抗体)的相应残基取代以例如恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且进一步阐述于例如Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号和第7,087,409号；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重整”)；Dall'Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“引导选择”方法)中。
可用于人源化的人类框架区包括(但不限于)：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等,J.Immunol.151:2296(1993))；源自轻链或重链可变区的特定亚组的人类抗体共有序列的框架区(参见例如Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等,J.Immunol.,151:2623(1993))；人类成熟(体细胞突变)框架区或人类种系框架区(参见例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和源自筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
在一些实施方案中，在不减少结构域对抗原的天然亲和力并且同时降低其对于异源物种的免疫原性的情形下修饰(例如人源化)抗LAG-3 sdAb。举例来说，可确定骆马抗体的抗体可变结构域(VHH)的氨基酸残基，并且用如在人类共有序列中所发现的其人类对应体代替例如框架区中的骆驼科动物氨基酸中的一者或多者，而所述多肽不失去其典型特征，即人源化不显著影响所得多肽的抗原结合能力。骆驼科动物单结构域抗体的人源化需要在单一多肽链中引入并且诱变有限量的氨基酸。这与scFv、Fab'、(Fab')2和IgG的人源化相反，后者需要在两条链(轻链和重链)中引入氨基酸变化并且保留两条链的组装。
包含VHH结构域的sdAb可被人源化以具有人类样序列。在一些实施方案中，本文所用VHH结构域的FR区包含与人类VH框架区具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大氨基酸序列同源性中的任一者。一类示例性人源化VHH结构域的特征在于，根据Kabat编号，VHH在位置45处带有来自由以下组成的组的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺(例如L45)，并且在位置103处带有色氨酸。因此，属于这种类别的多肽显示较高的与人类VH框架区的氨基酸序列同源性，并且所述多肽可直接施用于人类而不预期从其产生不期望的免疫反应，并且不具有进一步人源化的负担。
另一类示例性人源化骆驼科动物单结构域抗体已阐述于WO 03/035694中，并且含有通常在人类来源或来自其它物种的常规抗体中发现的疏水性FR2残基，但通过位置103上的带电精氨酸残基补偿这种亲水性损失，所述带电精氨酸残基取代来自双链抗体的VH中所存在的保守色氨酸残基。因此，属于这两种类别的肽显示较高的与人类VH框架区的氨基酸序列同源性，并且所述肽可直接施用于人类而不预期从其产生不期望的免疫反应，并且不具有进一步人源化的负担。
人类抗体
在一些实施方案中，本文所提供的抗LAG-3 sdAb是人类抗体(称为人类结构域抗体或人类DAb)。人类抗体可使用本领域已知的各种技术来产生。人类抗体大致阐述于vanDijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)；Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)；和Chen，Mol.Immunol.47(4):912-21(2010)中。能够产生完全人类单结构域抗体(或DAb)的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的。参见例如US20090307787A1、美国专利第8,754,287号、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。
可通过向转基因动物施用免疫原来制备人类抗体(例如，人类DAb)，所述转基因动物已经修饰以响应于抗原攻击而产生完整人类抗体或具有人类可变区的完整抗体。这些动物通常含有人类免疫球蛋白基因座的全部或一部分，这些基因座可代替内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合至动物染色体中。在这些转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已不活化。关于从转基因动物获得人类抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。也参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利第6,075,181号和第6,150,584号；描述
Figure BDA0002675071240000661
技术的美国专利第5,770,429号；描述K-M
Figure BDA0002675071240000662
技术的美国专利第7,041,870号和描述
Figure BDA0002675071240000663
技术的美国专利申请公开第US 2007/0061900号)。可例如通过与不同人类恒定区进行组合来进一步修饰来自由这些动物产生的完整抗体的人类可变区。
人类抗体(例如，人类DAb)也可通过基于杂交瘤的方法制得。已阐述用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类异源骨髓瘤细胞系(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体也阐述于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。其它方法包括例如美国专利第7,189,826号(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人类IgM抗体)和Ni，Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人类-人类杂交瘤)中所阐述的那些方法。人类杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)也阐述于Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)；和Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
也可通过分离选自人类源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人类抗体(例如，人类DAb)。接着可将这些可变结构域序列与期望的人类恒定结构域组合。从抗体文库选择人类抗体的技术阐述于下文中。
用于获得针对特定抗原或靶标的VHH序列的一种技术涉及适宜地对能够表达重链抗体的转基因哺乳动物进行免疫(即以产生针对所述抗原或靶标的免疫反应和/或重链抗体)，从所述转基因哺乳动物获得合适的生物样品(例如血液样品、血清样品或B细胞样品)，所述生物样品含有所述VHH序列(编码所述VHH序列的核酸序列)，并且然后从所述样品开始，使用本身已知的任何合适技术(例如任一本文所述方法或杂交瘤技术)产生针对所述抗原或靶标的VHH序列。举例来说，出于这个目的，可使用表达重链抗体的小鼠和WO 02/085945、WO 04/049794和WO 06/008548以及Janssens等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006年10月10日；103(41):15130-5中所阐述的其它方法和技术。举例来说，这些表达重链抗体的小鼠可表达具有任何合适(单一)可变结构域的重链抗体，例如来自天然来源的(单一)可变结构域(例如人类(单一)可变结构域、骆驼科动物(单一)可变结构域或鲨鱼(单一)可变结构域)，以及例如合成或半合成(单一)可变结构域。
文库源抗体
本申请的抗体可通过筛选组合文库中具有一种或多种期望活性的抗体来分离。举例来说，本领域已知用于产生噬菌体展示文库和筛选这些文库中具有期望结合特性的抗体的多种方法。这些方法综述于例如Hoogenboom等,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等编辑，Human Press,Totowa,NJ,2001)中，并且进一步阐述于例如McCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury，Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编辑，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中。已阐述用于构建单结构域抗体文库的方法，参见例如美国专利第7371849号。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)来单独克隆VH和VL基因的谱并且将其随机重组于噬菌体文库中，然后可如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所阐述从所述文库筛选抗原结合噬菌体。可通过PCR类似地克隆VHH基因谱，随机重组于噬菌体文库中，并且筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常以scFv片段或Fab片段的形式展示抗体片段。来自经免疫来源的文库无需构建杂交瘤即可提供针对免疫原的高亲和力抗体。或者，如Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)中所阐述在不进行任何免疫的情况下可克隆天然谱(例如，来自人类)以提供针对多种非自体抗原以及自体抗原的抗体的单一来源。最终，也可如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)中所阐述通过以下方式以合成方式制得天然文库：克隆来自干细胞的未重排V-基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变CDR3区并在体外完成重排。描述人类抗体噬菌体文库的专利公开包括例如：美国专利第5,750,373号和美国专利公开第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号和第2009/0002360号。
从人类抗体文库分离的抗体或抗体片段视为本文中的人类抗体或人类抗体片段。
生物学活性
本文所述的抗LAG-3 sdAb的生物学活性可通过测量其半最大有效浓度(EC50，其为抗体与其靶标结合的有效性的量度)或半最大抑制浓度(IC50，其为抗体抑制特定生物或生物化学功能(例如抑制LAG-3与II类MHC分子之间的结合)的有效性的量度)来测定。举例来说，此处EC50可用于指示在细胞表面上结合50％LAG-3所需抗LAG-3 sdAb的有效浓度，IC50可用于指示在体外中和50％的LAG-3生物活性所需抗LAG-3 sdAb的有效浓度。EC50也代表在体内获得50％的最大效应所需的血浆浓度。EC50或IC50可通过本领域已知的测定来测量，例如诸如以下的生物测定：FACS结合分析、通过FACS分析的对配体结合的抑制(竞争结合测定)、基于细胞的细胞因子释放测定或放大的发光邻近均相测定(AlphaLISA)。
举例来说，可使用流式细胞术研究配体结合的阻断(也参见实施例1)。可将表达人类LAG-3的CHO细胞从贴壁培养瓶解离并且与不同浓度的测试用抗LAG-3 sdAb和恒定浓度的经标记II类MHC蛋白混合。可采用抗LAG-3抗体阳性对照，例如BMS-986016(Bristol-Myers Squibb)。使混合物在室温下平衡30分钟，用FACS缓冲液(含有1％BSA的PBS)洗涤三次。然后，添加特异性识别恒定浓度的经标记II类MHC的抗体并且在室温下培育15分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤并通过流式细胞术进行分析。可利用Prism(GraphPad Software,San Diego,CA)使用非线性回归分析数据以计算IC50。来自竞争测定的结果可展示抗LAG-3sdAb抑制II类MHC与LAG-3之间的相互作用的能力。
抗LAG-3 sdAb的生物学活性可使用LAG-3阻断测定经由荧光素酶报告基因来测试(也参见实施例4)。使用Promega LAG-3阻断报告基因测定试剂盒(Promega，目录号CS194819)，根据供货商的方案来实施LAG-3阻断报告基因测定。简言之，可将解冻使用的MHC-II APC细胞(包括TCR活化抗原)平铺过夜，并且然后与抗LAG-3抗体或抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白的连续稀释液一起培育，之后添加解冻使用的LAG-3效应细胞。在37℃和5％CO2下诱导6小时后，可添加BIO-GLOTM荧光素酶测定试剂，并且可测定发光。结果可展示抗LAG-3sdAb抑制II类MHC与LAG-3之间的相互作用的能力。
在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb阻断或拮抗由LAG-3受体转导的信号。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb可结合至LAG-3上的表位以抑制LAG-3与II类MHC分子相互作用。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb可将LAG-3与II类MHC分子的结合降低至少以下中的任一者：约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％或99.9％。
(II)融合构建体
本申请还提供抗LAG-3融合构建体，其包含任何一种本文所述的抗LAG-3 sdAb和第二多肽(例如第二抗体或其抗原结合片段)或免疫球蛋白的Fc片段。在一些实施方案中，抗LAG-3构建体除抗LAG-3 sdAb以外，还包含两种或更多种多肽。所述额外多肽可改变或可不改变或以其它方式影响抗LAG-3 sdAb的生物学性质，并且可向抗LAG-3 sdAb添加或可不添加其它功能。在一些实施方案中，第二多肽赋予抗LAG-3 sdAb以一种或多种期望性质或功能。
在一些实施方案中，抗LAG-3构建体包含特异性识别第二表位的第二抗体或其抗原结合片段(例如sdAb、scFv、Fab、全长抗体等)。在一些实施方案中，第二表位是来自LAG-3。在一些实施方案中，第二表位不是来自LAG-3。在一些实施方案中，第二抗体与本文所述的抗LAG-3 sdAb特异性识别LAG-3上的相同表位。在一些实施方案中，第二抗体与本文所述的抗LAG-3 sdAb特异性识别LAG-3上的不同表位。
在一些实施方案中，提供了一种包含多个(例如2个、3个、4个或更多个)本文所述的抗LAG-3 sdAb的抗LAG-3构建体。在一些实施方案中，所述多个抗LAG-3 sdAb经由接头(例如肽接头)彼此融合。所述多个抗LAG-3 sdAb可相同或不同。
在一些实施方案中，与单独的抗LAG-3 sdAb相比，抗LAG-3构建体包含增强半衰期、溶解性和/或吸收、降低免疫原性或毒性、消除或减弱不期望的副作用、赋予抗LAG-3构建体以其它有利性质和/或减少抗LAG-3构建体的其它不期望性质的第二多肽。这些多肽的一些非限制性实例包括血清蛋白质，例如人类血清白蛋白(HSA；参见例如WO 00/27435)或半抗原性分子(例如由循环抗体识别的半抗原，参见例如WO 98/22141)。已证明将免疫球蛋白的片段(例如VH结构域)连接至血清白蛋白或其片段可延长抗体半衰期(参见例如WO 00/27435和WO 01/077137)。因此，在一些实施方案中，抗LAG-3构建体包含任选地经由合适接头(例如肽接头)与血清白蛋白或其片段融合的抗LAG-3 sdAb。在一些实施方案中，血清白蛋白至少包含结构域III(参见PCT/EP2007/002817)。抗LAG-3 sdAb-HSA融合蛋白可为任何合适形式，例如(sdAb)n-HSA(n为至少1的整数)、sdAb-HSA-sdAb等。
抗LAG-3仅重链抗体(HCAb)
在一些实施方案中，抗LAG-3构建体是包含本文所述的抗LAG-3 sdAb的仅重链抗体(HCAb)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb与一个或多个CH2和/或CH3结构域(例如，Fc片段)融合。在一些实施方案中，CH2和/或CH3结构域源自人类免疫球蛋白。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb经由肽接头与CH2和/或CH3结构域融合。CH2和/或CH3结构域可延长体内抗LAG-3构建体的半衰期。
因此，在一些实施方案中，提供一种经分离的抗LAG-3 HCAb，其包含与免疫球蛋白(例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的Fc片段融合的本文所述的抗LAG-3 sdAb。在一些实施方案中，抗LAG-3 HCAb包含IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc片段。在一些实施方案中，Fc片段是人类Fc，例如人类IgG1(hIgG1)Fc、hIgG2 Fc或hIgG4 Fc。在一些实施方案中，Fc片段是无效应物的，具有降低、最小化或消除的抗体效应功能，例如ADCC、CDC和/或ADCP(抗体依赖性细胞吞噬作用)。在一些实施方案中，无效应物Fc在CH2区中包含N297A或DANA突变(D265A+N297A)。在一些实施方案中，无效应物Fc包含K322A和L234A/L235A(LALA)突变。在一些实施方案中，Fc片段是无效应物IgG1 Fc，例如无效应物hIgG1 Fc。在一些实施方案中，Fc片段是人类IgG4 Fc(S228P)。在一些实施方案中，抗LAG-3 HCAb是单体的。在一些实施方案中，抗LAG-3 HCAb是二聚的。在一些实施方案中，抗LAG-3 HCAb是多特异性和多价的(例如双特异性的和二价的)，例如包含两种或更多种不同的本文所述的抗LAG-3 sdAb。在一些实施方案中，抗LAG-3 HCAb是单特异性和多价的(例如，二价的)，例如包含相同抗LAG-3sdAb的两个或更多个拷贝。
在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb和Fc片段经由肽接头彼此融合。在一些实施方案中，所述肽接头是人类IgG1铰链(SEQ ID NO:352)。在一些实施方案中，所述肽接头是突变的人类IgG1铰链(SEQ ID NO:353)。在一些实施方案中，所述肽接头是人类IgG4铰链。在一些实施方案中，所述肽接头是hIgG2铰链。
因此，在一些实施方案中，提供了一种包含特异性识别LAG-3的sdAb的经分离抗LAG-3 HCAb，其中所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体，并且其中所述抗LAG-3 sdAb与免疫球蛋白的Fc片段融合。在一些实施方案中，提供了一种包含特异性识别LAG-3的sdAb的抗LAG-3 HCAb，其中所述sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3；或(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的CDR3，并且其中所述抗LAG-3 sdAb与免疫球蛋白的Fc片段融合。在一些实施方案中，提供了一种包含特异性识别LAG-3的sdAb的经分离的抗LAG-3 HCAb，其中所述sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域或其与SEQ ID NO:274-311中的任一者具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体，并且其中所述抗LAG-3 sdAb与免疫球蛋白的Fc片段融合。在一些实施方案中，提供了一种包含特异性识别LAG-3的sdAb的经分离的抗LAG-3 HCAb，其中所述sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域，并且其中所述抗LAG-3 sdAb与免疫球蛋白的Fc片段融合。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb经由肽接头与Fc片段融合。在一些实施方案中，抗LAG-3 HCAb是单体的。在一些实施方案中，Fc片段是人类IgG1 Fc、无效应物人类IgG1 Fc、hIgG2 Fc、人类IgG4 Fc或hIgG4 Fc(S228P)。
在一些实施方案中，提供了一种包含两种特异性识别LAG-3的sdAb的经分离的抗LAG-3 HCAb，其中每个抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体，并且其中每个抗LAG-3 sdAb的C末端与免疫球蛋白的Fc片段的N末端融合。在一些实施方案中，提供了一种包含两种特异性识别LAG-3的sdAb的经分离抗LAG-3 HCAb，其中每个抗LAG-3 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3；或(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的CDR3，并且其中每个抗LAG-3 sdAb的C末端与免疫球蛋白的Fc片段的N末端融合。在一些实施方案中，所述两种抗LAG-3 sdAb是相同的。在一些实施方案中，所述两种抗LAG-3sdAb是不同的。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb经由肽接头与Fc片段融合。在一些实施方案中，Fc片段是人类IgG1 Fc、无效应物人类IgG1 Fc、hIgG2 Fc、人类IgG4 Fc或hIgG4 Fc(S228P)。
在一些实施方案中，提供了一种经分离的抗LAG-3 HCAb，其包含SEQ ID NO:312-349中的任一者的氨基酸序列，或其与SEQ ID NO:312-349中的任一者具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:312-349中的任一者的氨基酸序列。
还提供了经分离的抗LAG-3 HCAb，其与本文所述的经分离的抗LAG-3 HCAb、抗LAG-3 sdAb或抗LAG-3构建体中的任一者竞争性地特异性结合至LAG-3。
多价和/或多特异性构建体
本申请提供多价和多特异性的抗LAG-3构建体。多特异性抗LAG-3构建体在本文中也称为“抗LAG-3多特异性抗原结合蛋白(MABP)”。在一些实施方案中，抗LAG-3构建体是双特异性的，其在本文中也称为“抗LAG-3双特异性抗原结合蛋白(BABP)”。
在一些实施方案中，提供了一种经分离的抗LAG-3构建体(例如，MABP或BABP)，其包含：(a)第一抗原结合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体，和(b)第二抗原结合部分，其特异性结合第二表位(例如，免疫检查点分子，例如PD-1)，其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，提供了一种经分离的抗LAG-3构建体(例如，MABP或BABP)，其包含：(a)第一抗原结合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3；或(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的CDR3，和(b)第二抗原结合部分，其特异性结合第二表位(例如，免疫检查点分子，例如PD-1)，其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分特异性识别免疫检查点分子，例如PD-1、4-1BB、PD-L1、TIM-3、TIGIT、CTLA-4、VISTA、B7-1、B7-H3、CD47、OX40或GITR。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包括包含VH的重链和包含VL的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合部分在重链的N末端、轻链的N末端、Fc区的N末端、重链的C末端或轻链的C末端与第二抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含Fab或scFv。在一些实施方案中，第一抗原结合部分在Fab或scFv的C末端与第二抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含全长4链抗体。在一些实施方案中，第一抗原结合部分经由肽接头与第二抗原结合部分融合。在一些实施方案中，所述肽接头长度不超过约30个(例如不超过约25个、20个或15个中的任一者)氨基酸。在一些实施方案中，所述肽接头包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb的N末端或C末端与肽序列融合。在一些实施方案中，所述肽序列包含SEQ IDNO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二抗原结合片段包含Fc区，例如IgG1 Fc、无效应物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc(S228P)。
在一些实施方案中，抗LAG-3构建体是抗LAG-3 MABP，其包含特异性识别免疫检查点分子的第二抗原结合部分。如本文所用，术语“免疫检查点分子”是指免疫系统中通常用于维持自身耐受性或调节生理免疫反应的持续时间和幅度以使附带组织损害最小化的分子。免疫检查点抑制剂可通过刺激刺激性检查点分子的活性或抑制途径中抑制性检查点分子的活性来抑制免疫系统检查点。刺激性检查点分子是刺激或正调控免疫系统的分子，例如蛋白质。抑制性检查点分子是抑制或负调控免疫系统的分子，例如蛋白质。免疫系统检查点分子包括(但不限于)细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡1蛋白(PD-1)、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)、程序性细胞死亡1配体2(PD-L2)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、B7-1、B7-H3、T细胞膜蛋白3(TIM3)、B淋巴细胞和T淋巴细胞弱化因子(BTLA)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、含有V-结构域免疫球蛋白(Ig)的T细胞活化阻抑物(VISTA)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4，也称为CD134或OX40)、肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9，也称为4-1BB或CD137)、分化簇47(CD47或IAP)和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)。针对免疫检查点分子的任一已知抗体均可用于抗LAG-3MABP中。
在一些实施方案中，提供一种经分离的抗LAG-3构建体(例如，MABP或BABP)，其包含：(a)第一抗原结合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体，和(b)第二抗原结合部分，其特异性结合免疫检查点分子(例如，PD-1)，其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，提供一种经分离的抗LAG-3构建体(例如，MABP或BABP)，其包含：(a)第一抗原结合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3；或(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的CDR3，和(b)第二抗原结合部分，其特异性结合免疫检查点分子(例如，PD-1)，其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包括包含VH的重链和包含VL的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合部分在重链的N末端、轻链的N末端、Fc区的N末端、重链的C末端或轻链的C末端与第二抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含Fab或scFv。在一些实施方案中，第一抗原结合部分在Fab或scFv的C末端与第二抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含全长4链抗体。在一些实施方案中，第一抗原结合部分与第二抗原结合部分化学融合。在一些实施方案中，第一抗原结合部分经由肽接头与第二抗原结合部分融合。在一些实施方案中，所述肽接头长度不超过约30个(例如不超过约25个、20个或15个中的任一者)氨基酸。在一些实施方案中，所述肽接头包含SEQ IDNO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb的N末端或C末端与肽序列融合。在一些实施方案中，所述肽序列包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二抗原结合片段包含Fc区，例如IgG1Fc、无效应物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc(S228P)。
在一些实施方案中，经分离的抗LAG-3构建体包含与第二抗体或其抗原结合片段融合的本文所述的抗LAG-3 sdAb。在一些实施方案中，抗LAG-3构建体包含两种或更多种与抗LAG-3 sdAb融合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第二抗体特异性识别除LAG-3以外的抗原或LAG-3上的第二表位。在一些实施方案中，第二抗体是全长抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、scFv、scFv-scFv、微小抗体、双链抗体或sdAb。在一些实施方案中，第二抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。
在一些实施方案中，抗LAG-3构建体是单特异性的。在一些实施方案中，抗LAG-3构建体是多特异性的(例如双特异性的)。多特异性分子是对至少两种不同表位具有结合特异性的分子(例如，对两种表位具有结合特异性的双特异性抗体)。也涵盖具有两种以上化合价和/或特异性的多特异性分子。举例来说，可制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。
在一些实施方案中，抗LAG-3构建体是单价的。在一些实施方案中，抗LAG-3构建体是多价的(例如，二价的)和单特异性的。在一些实施方案中，抗LAG-3构建体包含本文所述的抗LAG-3 sdAb和与所述抗LAG-3 sdAb特异性识别相同LAG-3表位的第二抗体(例如全长抗体、sdAb或包含VH和VL的抗原结合片段)。在一些实施方案中，第二抗体包含与抗LAG-3sdAb相同的CDR和/或相同的VHH。举例来说，抗LAG-3构建体可包含两种或更多种本文所述的抗LAG-3sdAb，其中所述两种或更多种抗LAG-3 sdAb是相同的。在一些实施方案中，所述两种或更多种抗LAG-3 sdAb经由肽接头彼此融合。与本文所述的单一抗LAG-3 sdAb的亲合力相比，包含两种或更多种抗LAG-3 sdAb的单特异性或多特异性抗LAG-3构建体可具有增加的亲合力。
在一些实施方案中，抗LAG-3构建体是多价的和多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗LAG-3构建体包含本文所述的抗LAG-3 sdAb和特异性识别除LAG-3以外的第二抗原或与抗LAG-3 sdAb所识别的不同LAG-3表位的第二抗体(例如全长抗体、sdAb或包含VH和VL的抗原结合片段)。
制备多特异性抗体的技术包括(但不限于)重组共表达两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein和Cuello，Nature305:537(1983))、WO 93/08829和Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))和“隆凸入孔洞(knob-in-hole)”工程改造(参见例如美国专利第5,731,168号)。多特异性抗体也可通过以下方式来制备：工程改造用于制备抗体Fc-异源二聚分子的静电牵引效应(WO 2009/089004A1)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如美国专利第4,676,980号和Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于制备双特异性抗体片段的“双链抗体”技术(参见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；和制备三特异性抗体(例如，如Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)中所阐述)；和产生包含串联单结构域抗体的多肽(参见例如美国专利申请第20110028695号；和Conrath等,J.Biol.Chem.,2001；276(10):7346-50)。本文也包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的经工程改造的抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibody)”(参见例如US 2006/0025576A1)。
在一些实施方案中，提供一种经分离的抗LAG-3构建体，其包含与全长抗体或包含VH和VL的其抗原结合片段融合的本文所述的抗LAG-3 sdAb。所述全长抗体或抗原结合片段识别除LAG-3以外的抗原或来自LAG-3的与抗LAG-3 sdAb所识别的表位不同的表位，从而赋予扩大的靶向能力。由于sdAb的小尺寸，因此在一些实施方案中，与全长抗体或抗原结合片段组分的那些分子量和药物动力学性质相比，本文所述的抗LAG-3 MABP(例如，抗LAG-3BABP)可具有类似的分子量和药物动力学性质。举例来说，可通过将一种或多种抗LAG-3sdAb与具有经证实的临床功效和安全性的单克隆抗体融合来设计抗LAG-3 MABP，以提供增加的临床益处和期望的药物动力学性质，而不阻碍多特异性构建体的可表达性。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb通过肽接头与全长抗体或抗原结合片段融合。
可采用本文所述的抗LAG-3 MABP(例如，抗LAG-3 BABP)靶向除LAG-3以外的多种疾病相关表位或抗原组合，例如LAG-3与免疫检查点分子、细胞表面抗原(例如肿瘤抗原)或促发炎分子的组合，从而提供可用于治疗多种疾病和疾患(例如癌症)的药剂。抗LAG-3MABP(例如，抗LAG-3 BABP)可具有任何形式，例如PCT/CN2017/093644中所公开的那些形式，所述文献通过引用整体并入本文。
因此，在一些实施方案中，提供了一种经分离的抗LAG-3构建体(例如，MABP或BABP)，其包含：(a)第一抗原结合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体，和(b)第二抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合第二表位(例如，免疫检查点分子，例如PD-1)的抗原结合位点，其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，提供了一种经分离的抗LAG-3构建体(例如，MABP或BABP)，其包含：(a)第一抗原结合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3；或(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的CDR3，和(b)第二抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合第二表位(例如，免疫检查点分子，例如PD-1)的抗原结合位点，其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，第二表位是来自免疫检查点分子，例如PD-1、4-1BB、PD-L1、TIM-3、TIGIT、CTLA-4、VISTA、B7-1、B7-H3、CD47、OX40或GITR。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包括包含VH的重链和包含VL的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合部分在重链的N末端、轻链的N末端、Fc区的N末端、重链的C末端或轻链的C末端与第二抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含Fab或scFv。在一些实施方案中，第一抗原结合部分在Fab或scFv的C末端与第二抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含全长4链抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗PD-1全长抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗PD-1全长抗体或其抗原结合片段(例如，Fab、scFv)包含：(i)VH，其包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，和VL，其包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；或(ii)VH，其包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，和VL，其包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1全长抗体包含：(i)包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的轻链；或(ii)包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，抗PD-1全长抗体是派姆单抗或PD1-BM-min。在一些实施方案中，第一抗原结合部分与第二抗原结合部分化学融合。在一些实施方案中，第一抗原结合部分经由肽接头与第二抗原结合部分融合。在一些实施方案中，所述肽接头长度不超过约30个(例如不超过约25个、20个或15个中的任一者)氨基酸。在一些实施方案中，所述肽接头包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb的N末端或C末端与肽序列融合。在一些实施方案中，所述肽序列包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二抗原结合片段包含Fc区，例如IgG1 Fc、无效应物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc(S228P)。
在一些实施方案中，经分离的抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含可特异性结合至少两种不同表位的至少两个抗原结合部分。所述至少两个抗原结合部分中的一些可以是相同的，只要MABP具有针对两种不同表位的结合位点即可。抗LAG-3 MABP(例如，BABP)可以是对称的或不对称的。举例来说，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)可包含1至8个拷贝的包含本文所述抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分和1或2个拷贝的包含VH和VL的第二抗原结合部分。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含两个不同抗原结合部分，其各自包含一起形成不同抗原结合位点的VH结构域和VL结构域。举例来说，第二抗原结合部分可以是双特异性抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分是单特异性全长抗体或其抗原结合片段，例如Fab或scFv。
在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个不同抗原结合部分中的任一者，其各自包含本文所述的抗LAG-3 sdAb。在一些实施方案中，两种相同的抗LAG-3 sdAb彼此融合，其进一步与第二抗原结合部分融合。在一些实施方案中，两种不同的抗LAG-3 sdAb彼此融合，其进一步与第二抗原结合部分融合。
经分离的抗LAG-3 MABP(例如，BABP)可具有任何合适数量的针对LAG-3和/或第二表位(例如，PD-1)的化合价和任何合适数量的特异性。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)针对LAG-3为二价、三价、四价、五价、六价或更高价。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)针对第二表位(例如，PD-1)为二价、三价、四价、五价、六价或更高价。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP是双特异性的(例如，PD-1×LAG-3 BABP)。示例性BABP绘示于图7至图16中。在一些实施方案中，MABP是三特异性的。在一些实施方案中，MABP是四特异性的。在一些实施方案中，MABP具有四种以上的特异性。
在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含：(a)一个或多个拷贝(例如2个)的第一抗原结合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，和(b)单拷贝的第二抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合第二表位(例如，PD-1)的抗原结合位点，其中所述第一抗原结合部分的每一拷贝与所述第二抗原结合部分融合。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 MABP(例如，BABP)，其包含：(a)多个(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个)相同或不同的抗LAG-3 sdAb，和(b)多个(例如2个、3个、4个、5个、6个或更多个)包含VH和VL的第二抗原结合部分，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合第二表位(例如，PD-1)的抗原结合位点，并且其中所述抗LAG-3 sdAb彼此融合和/或与所述第二抗原结合部分融合。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 MABP(例如，BABP)，其包含：(a)多个(例如2个、3个或4个)相同或不同的抗LAG-3 sdAb，和(b)两个拷贝的第二抗原结合部分，其各自包含VH和VL，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合第二表位(例如，PD-1)的抗原结合位点，并且其中所述抗LAG-3 sdAb彼此融合和/或与所述第二抗原结合部分融合。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb中的一者或多者各自进一步与另一相同或不同的抗LAG-3 sdAb融合。
在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含：(a)单拷贝的第一抗原结合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，和(b)两个拷贝的第二抗原结合部分，其各自包含VH和VL，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合第二表位的抗原结合位点，其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分的两个拷贝中的一者融合。在一些实施方案中，抗PD-1MABP(例如，BABP)包含：(a)两个拷贝的第一抗原结合部分，其各自包含抗LAG-3 sdAb，(b)两个拷贝的第二抗原结合部分，其各自包含VH和VL，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合第二表位的抗原结合位点，其中所述第一抗原结合部分的一个拷贝与所述第二抗原结合部分的每一拷贝融合。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb中的一者或多者各自进一步与另一相同或不同的抗LAG-3 sdAb融合。
在一些实施方案中，抗LAG-3构建体包含与第二抗体融合的本文所述的抗LAG-3sdAb，其中所述第二抗体是由两条重链和两条轻链组成的全长抗体(例如特异性识别PD-1的全长抗体)。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb和全长抗体经由接头(例如肽接头)彼此融合。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb的N末端或C末端与肽序列融合。
因此，在一些实施方案中，提供了一种经分离的抗LAG-3构建体，其包含抗LAG-3sdAb和由两条重链和两条轻链组成的全长抗体(例如特异性识别PD-1的全长抗体)，其中所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种经分离的抗LAG-3构建体，其包含抗LAG-3 sdAb和由两条重链和两条轻链组成的全长抗体(例如特异性识别PD-1的全长抗体)，其中所述抗LAG-3 sdAb包含：(1)包含SEQID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3；或(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，全长抗体的Fc片段是hIgG1 Fc、无效应物hIgG1 Fc、hIgG2 Fc、hIgG4 Fc或hIgG4 Fc(S228P)。在一些实施方案中，所述全长抗体是刺激性免疫检查点分子的活化剂。在一些实施方案中，所述全长抗体是免疫检查点抑制剂，例如TIGIT、TIM-3、CTLA-4或PD-1的抑制剂。在一些实施方案中，所述全长抗体是派姆单抗、PD1-BM-min或纳武单抗(nivolumab)。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb和所述全长抗体经由肽接头彼此融合。在一些实施方案中，所述肽接头包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb的N末端或C末端与肽序列融合。在一些实施方案中，所述肽序列包含SEQ IDNO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。
多特异性抗LAG3构建体可具有任何合适形式。示例性双特异性抗LAG3构建体示于图7至图16中。
在一些实施方案中，抗LAG-3构建体包含两个抗LAG-3 sdAb。在一些实施方案中，每个抗LAG-3 sdAb的N末端与全长抗体重链的C末端融合(如图8所示例)。在一些实施方案中，每个抗LAG-3 sdAb的C末端与全长抗体重链的N末端融合(如图7所示例)。在一些实施方案中，每个抗LAG-3 sdAb的N末端与全长抗体轻链的C末端融合(如图10所示例)。在一些实施方案中，每个抗LAG-3 sdAb的C末端与全长抗体轻链的N末端融合(如图9所示例)。在一些实施方案中，每个抗LAG-3 sdAb的C末端与全长抗体CH2结构域的N末端融合，并且每个抗LAG-3 sdAb的N末端与全长抗体CH1结构域的C末端融合(如图13所示例)。在一些实施方案中，每个抗LAG-3 sdAb的N末端与scFv的C末端融合，并且每个抗LAG-3 sdAb的C末端与Fc区的CH2结构域的N末端融合(如图14所示例)。
在一些实施方案中，抗LAG-3构建体包含四个抗LAG-3 sdAb。在一些实施方案中，第一抗LAG-3 sdAb的C末端与全长抗体重链的N末端融合，并且第二抗LAG-3 sdAb的C末端与全长抗体轻链的N末端融合(如图11所示例)。在一些实施方案中，第一抗LAG-3 sdAb的C末端与全长抗体重链的N末端融合，并且第二抗LAG-3 sdAb的C末端与所述第一抗LAG-3sdAb的N末端融合(如图12所示例)。在一些实施方案中，第一抗LAG-3 sdAb的N末端与Fab的CH1结构域的C末端融合，并且所述第一抗LAG-3 sdAb的C末端与第二CH1结构域的N末端融合；并且第二抗LAG-3 sdAb的N末端与Fab的CL结构域的C末端融合，并且所述第二抗LAG-3sdAb的C末端与第二CL结构域的N末端融合(如图15所示例)。在一些实施方案中，第一抗LAG-3 sdAb的N末端与scFv的C末端融合，并且所述第一抗LAG-3 sdAb的C末端与CH1结构域的N末端融合；并且第二抗LAG-3 sdAb的C末端与第二CL结构域的N末端融合(如图16所示例)。
a)融合多肽
抗LAG-3 MABP(例如，BABP)的包含本文所述抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分与包含VH和VL的第二抗原结合部分彼此融合(即，共价连接)。因此，本申请的抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含一种或多种融合多肽。每一融合多肽可包括包含本文所述抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分和来自第二抗原结合部分的多肽。
包含本文所述抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分和包含VH和VL的第二抗原结合部分可通过单一化学键(例如肽键)或经由肽接头直接连接。包含抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分可在第二抗原结合部分的任何一个(包括每个)多肽的N末端或C末端处融合，或者可在第二抗原结合部分的任何一个(包括每个)多肽的内部位置处融合，例如在第二抗原结合部分的重链中Fc区的N末端处。融合多肽可以重组方式或以化学方式获得。在一些实施方案中，包含抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分的C末端经由化学键(例如肽键)或肽接头与第二抗原结合部分的任何一个(包括每个)多肽的N末端融合。在一些实施方案中，包含抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分的N末端经由化学键(例如肽键)或肽接头与第二抗原结合部分的任何一个(包括每个)多肽的C末端融合。在一些实施方案中，包含抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分经由并非涉及氨基酸主链化学基团的肽键的化学键与第二抗原结合部分融合。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含以下各物：包含VH和VL的单链抗体片段。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含scFv。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含融合多肽，所述融合多肽在N末端至C末端方向上包含：包含本文所述抗LAG-3sdAb的第一抗原结合部分、任选的肽接头、VH结构域和VL结构域。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含融合多肽，所述融合多肽在N末端至C末端方向上包含：包含本文所述抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分、任选的肽接头、VL结构域和VH结构域。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含融合多肽，所述融合多肽在N末端至C末端方向上包含：VH结构域、VL结构域、任选的肽接头和包含本文所述抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含融合多肽，所述融合多肽在N末端至C末端方向上包含：VL结构域、VH结构域、任选的肽接头和包含本文所述抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分包括包含VH结构域的重链和含有VL结构域的轻链。在一些实施方案中，所述重链还包含一个或多个重链恒定结构域，例如CH1、CH2、CH3、和CH4和/或抗体铰链区(HR)。在一些实施方案中，所述轻链还包含轻链恒定结构域(CL)，例如λCL结构域或κCL结构域。在一些实施方案中，包含本文所述抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分的N末端与所述重链的C末端融合。在一些实施方案中，包含抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分的C末端与所述重链的N末端融合。在一些实施方案中，包含抗LAG-3sdAb的第一抗原结合部分的N末端与所述轻链的C末端融合。在一些实施方案中，包含抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分的C末端与所述轻链的N末端融合。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：重链、任选的肽接头和包含抗LAG-3 sdAb和任选的肽序列的第一抗原结合部分；和第二多肽，所述第二多肽包含轻链。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：包含任选的肽序列和抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分、任选的肽接头和重链；和第二多肽，所述第二多肽包含轻链。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：轻链、任选的肽接头和包含抗LAG-3 sdAb和任选的肽序列的第一抗原结合部分；和第二多肽，所述第二多肽包含重链。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：包含任选的肽序列和抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分、任选的肽接头和轻链；和第二多肽，所述第二多肽包含重链。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含本文所述的两个相同的第一多肽和两个相同的第二多肽。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含由两条重链和两条轻链组成的全长抗体。在一些实施方案中，所述全长抗体是由两条相同重链和两条相同轻链组成的全长单克隆抗体。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含两个相同的第一多肽，所述两个相同的第一多肽从N末端至C末端各自包含重链、任选的肽接头、包含抗LAG-3 sdAb和任选的肽序列的第一抗原结合部分；和两个相同的第二多肽，所述两个相同的第二多肽各自包含轻链(例如图8)。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含两个相同的第一多肽，所述两个相同的第一多肽从N末端至C末端各自包含：包含任选的肽序列和抗LAG-3sdAb的第一抗原结合部分、任选的肽接头和重链；和两个相同的第二多肽，所述两个相同的第二多肽各自包含轻链(例如图7)。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含两个相同的第一多肽，所述两个相同的第一多肽从N末端至C末端各自包含：轻链、任选的肽接头和包含抗LAG-3 sdAb和任选的肽序列的第一抗原结合部分；和两个相同的第二多肽，所述两个相同的第二多肽各自包含重链(例如图10)。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含两个相同的第一多肽，所述两个相同的第一多肽从N末端至C末端各自包含：包含任选的肽序列和抗LAG-3 sdAb的第一抗原结合部分、任选的肽接头和轻链；和两个相同的第二多肽，所述两个相同的第二多肽包含重链(例如图9)。
在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含：(a)由第一重链和第二重链以及第一轻链和第二轻链组成的全长抗体，其中所述全长抗体特异性识别第一表位(例如，PD-1)；(b)第一抗LAG-3 sdAb；(c)第二抗LAG-3 sdAb；(d)第三抗LAG-3 sdAb；和(e)第四抗LAG-3 sdAb；其中所述第一抗LAG-3 sdAb的C末端与所述第一轻链的N末端融合，其中所述第二抗LAG-3 sdAb的C末端与所述第二轻链的N末端融合，其中所述第三抗LAG-3 sdAb的C末端与所述第一重链的N末端融合，并且其中所述第四抗LAG-3 sdAb的C末端与所述第二重链的N末端融合。在一些实施方案中，所述四种抗LAG-3 sdAb是不同的。在一些实施方案中，所述四种抗LAG-3 sdAb是相同的。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含两个相同的第一多肽，所述两个相同的第一多肽从N末端至C末端各自包含：任选的肽序列、第三或第四抗LAG-3 sdAb、任选的肽接头和重链；和两个相同的第二多肽，所述两个相同的第二多肽各自包含任选的肽序列、第一或第二抗LAG-3 sdAb、任选的肽接头和轻链。参见例如图11。
在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含：(a)由两条重链和两条轻链组成的全长抗体，其中所述全长抗体特异性识别第一表位(例如，PD-1)；(b)第一抗LAG-3sdAb；(c)第二抗LAG-3 sdAb；(d)第三抗LAG-3 sdAb；和(e)第四抗LAG-3 sdAb；其中所述第一抗LAG-3 sdAb的C末端与所述第二抗LAG-3 sdAb的N末端融合，并且所述第二抗LAG-3sdAb的C末端与一条重链的N末端融合，并且其中所述第三抗LAG-3 sdAb的C末端与所述第四抗LAG-3 sdAb的N末端融合，并且所述第四抗LAG-3 sdAb的C末端与另一条重链的N末端融合。在一些实施方案中，所述四种抗LAG-3 sdAb是不同的。在一些实施方案中，所述四种抗LAG-3 sdAb是相同的。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含两个相同的第一多肽，所述两个相同的第一多肽从N末端至C末端各自包含：任选的肽序列、第一或第三抗LAG-3 sdAb、任选的肽接头、第二或第四抗LAG-3 sdAb、任选的肽接头和重链；和两个相同的第二多肽，所述两个相同的第二多肽各自包含轻链。参见例如图12。
在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含：(a)由两条重链和两条轻链组成的全长抗体，其中所述全长抗体特异性识别第一表位(例如，PD-1)；(b)第一抗LAG-3sdAb；和(c)第二抗LAG-3 sdAb，其中所述第一抗LAG-3 sdAb或所述第二抗LAG-3 sdAb的N末端与所述重链的CH1区的C末端融合，并且所述第一抗LAG-3 sdAb或所述第二抗LAG-3sdAb的C末端与所述重链的CH2区的N末端融合。在一些实施方案中，所述两种抗LAG-3 sdAb是相同的。在一些实施方案中，所述两种抗LAG-3 sdAb是不同的。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含两个相同的第一多肽，所述两个相同的第一多肽从N末端至C末端各自包含：VH-CH1-任选的肽接头-抗LAG-3 sdAb-CH2-CH3；和两个相同的第二多肽，所述两个相同的第二多肽各自包含轻链。参见例如图13。
在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含：(a)第一scFv，其特异性识别第一表位(例如，PD-1)；(b)第二scFv，其特异性识别第二表位(例如，PD-1)；(c)Fc区；(d)第一抗LAG-3 sdAb；和(e)第二抗LAG-3 sdAb，其中每个抗LAG-3 sdAb的N末端与scFv的C末端融合并且所述抗LAG-3 sdAb的C末端与所述Fc区的N末端融合。在一些实施方案中，所述两种抗LAG-3 sdAb是相同的。在一些实施方案中，所述两种抗LAG-3 sdAb是不同的。在一些实施方案中，所述两种scFv是相同的。在一些实施方案中，所述两种scFv是不同的。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含两个相同的多肽，所述两个相同的多肽从N末端至C末端各自包含：scFv-任选的肽接头-抗LAG-3 sdAb-CH2-CH3，例如VH-VL-任选的肽接头-抗LAG-3 sdAb-CH2-CH3或VL-VH-任选的肽接头-抗LAG-3 sdAb-CH2-CH3。参见例如图14。
在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含：(a)第一Fab，其特异性识别第一表位(例如，PD-1)；(b)第二Fab，其特异性识别第二表位(例如，PD-1)；(c)Fc区；(d)第一Fab样结构域，其包含第一抗LAG-3 sdAb和第二抗LAG-3 sdAb；(e)第二Fab样结构域，其包含第三抗LAG-3 sdAb和第四抗LAG-3 sdAb，其中每个Fab样结构域的N末端与Fab的C末端融合并且所述Fab样结构域的两个C末端中的一者与所述Fc区的N末端融合。在一些实施方案中，所述四种抗LAG-3 sdAb是相同的。在一些实施方案中，所述四种抗LAG-3 sdAb是不同的。在一些实施方案中，所述两种Fab是相同的。在一些实施方案中，所述两种Fab是不同的。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含两个相同的第一多肽，所述两个相同的第一多肽从N末端至C末端各自包含：VH-CH1-任选的肽接头-抗LAG-3 sdAb-CH1-CH2-CH3；和两个相同的第二多肽，所述两个相同的第二多肽从N末端至C末端各自包含：VL-CL-任选的肽接头-抗LAG-3 sdAb-CL。参见例如图15。
在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含：(a)第一scFv，其特异性识别第一表位(例如，PD-1)；(b)第二scFv，其特异性识别第二表位(例如，PD-1)；(c)Fc区；(d)第一Fab样结构域，其包含第一抗LAG-3 sdAb和第二抗LAG-3 sdAb；(e)第二Fab样结构域，其包含第三抗LAG-3 sdAb和第四抗LAG-3 sdAb，其中每个Fab样结构域的两个N末端中的一者与scFv的C末端融合并且所述Fab样结构域的两个C末端中的一者与所述Fc区的N末端融合。在一些实施方案中，所述四种抗LAG-3 sdAb是相同的。在一些实施方案中，所述四种抗LAG-3 sdAb是不同的。在一些实施方案中，所述两种scFv是相同的。在一些实施方案中，所述两种scFv是不同的。在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含两个相同的第一多肽，所述两个相同的第一多肽从N末端至C末端各自包含：scFv-任选的肽接头-抗LAG-3sdAb-CH1-CH2-CH3；和两个相同的第二多肽，所述两个相同的第二多肽从N末端至C末端各自包含：抗LAG-3 sdAb-CL。在一些实施方案中，所述scFv从N末端至C末端包含：VH-VL或VL-VH。参见例如图16。
本文所述的抗LAG-3 MABP(例如，BABP)可包含一个或多个位于第一抗原结合部分与第二抗原结合部分之间的肽接头。在一些实施方案中，第二抗原结合部分的重链多肽与第一抗原结合部分之间的肽接头与第二抗原结合部分的轻链多肽与第一抗原结合部分之间的肽接头相同。在一些实施方案中，第二抗原结合部分的重链多肽与第一抗原结合部分之间的肽接头不同于第二抗原结合部分的轻链多肽与第一抗原结合部分之间的肽接头。在一些实施方案中，第一抗原结合部分与第二抗原结合部分在无肽接头布置于其间的情形下彼此直接融合。两种或更多种抗LAG-3 sdAb之间的肽接头可与抗LAG-3 sdAb与第二抗原结合部分之间的肽接头相同或不同。在下文“肽接头”部分中所阐述的上文中任何肽接头均可用于任何本文所述的抗LAG-3 MABP(例如，BABP)中。
b)包含VH和VL的第二抗原结合部分
抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含至少一个包含VH和VL的第二抗原结合部分。这种抗原结合部分可以是由两条重链和两条轻链组成的全长常规抗体或源自其的抗原结合片段(例如，Fab、scFv)。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分是包括包含VH结构域的重链和包含VL结构域的轻链的抗原结合片段。本文所涵盖的示例性抗原结合片段包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双链抗体；直链抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含Fc区，例如人类Fc区。在一些实施方案中，Fc区源自IgG分子，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类中的任一者。在一些实施方案中，Fc区能够介导抗体效应功能，例如ADCC和/或CDC。举例来说，具有野生型Fc序列的亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常显示包括CIq和C3结合的补体活化，而IgG4不活化补体系统并且不结合CIq和/或C3。在一些实施方案中，Fc区包含降低Fc区与Fc受体的结合亲和力的修饰。在一些实施方案中，Fc区是IgG1 Fc。在一些实施方案中，IgG1 Fc在位置233-236中包含一个或多个突变，例如L234A和/或L235A。在一些实施方案中，Fc区是无效应物IgG1 Fc。在一些实施方案中，Fc区是IgG4 Fc。在一些实施方案中，IgG4 Fc包含位置327、330和/或331中的突变。参见例如Armour KL等,Eur J.Immunol.1999；29:2613；和Shields RL等,J.Biol.Chem.2001；276:6591。在一些实施方案中，Fc区包含P329G突变。在一些实施方案中，Fc区是IgG4 Fc(S228P)。在一些实施方案中，Fc区包含SEQ ID NO:363-365中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc区包含促进两条不相同重链的异二聚化的修饰。对于具有不对称设计的本文所述抗LAG-3 MABP(例如，BABP)，这些经修饰的Fc区可尤为受关注。在一些实施方案中，所述修饰是隆凸入孔洞修饰，包含位于所述重链或重链融合多肽中的一者中的隆凸修饰和位于所述两条重链或重链融合多肽的另一者中的孔洞修饰。在一个实施方案中，Fc区包含CH3结构域中两条重链之间界面内的修饰，其中i)在一条重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基代替，从而在一条重链的CH3结构域中的界面内产生凸起(“隆凸”)，所述隆凸可定位于另一条重链的CH3结构域中界面内的空腔(“孔洞”)中，并且ii)在另一条重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基代替，从而在第二CH3结构域中的界面内产生空腔(“孔洞”)，第一CH3结构域中界面内的凸起(“隆凸”)可定位于所述孔洞中。隆凸入孔洞修饰的实例已阐述于例如US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431和Zhu等,1997,Protein Science6:781-788中。本文也涵盖促进异二聚化的对Fc区的其它修饰。举例来说，可将静电牵引效应工程改造至Fc区中以提供Fc-异二聚体分子(参见例如US4676980和Brennan等,Science,229:81(1985))。在一些实施方案中，Fc区包含抑制Fab臂交换的修饰。举例来说，IgG4 Fc中的S228P突变防止Fab臂交换。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含κ轻链恒定区。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含λ轻链恒定区。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含重链恒定区。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分是由两条重链和两条轻链组成的全长抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含由两条重链和两条轻链组成的单克隆抗体(在本文中也称为“4链抗体”)。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含由两条重链和两条轻链组成的多特异性(例如，双特异性)全长抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含人类IgG1亚类、无效应物hIgG1亚类或人类IgG1亚类中具有突变L234A和L235A的全长抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含人类IgG2亚类的全长抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含人类IgG3亚类的全长抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含人类IgG4亚类或人类IgG4亚类中具有额外突变S228P的全长抗体。
本领域已知的任何全长4链抗体或源自其的抗原结合片段可用作本文所述抗LAG-3 MABP(例如BABP)的第二抗原结合部分。具有经证实的临床功效、安全性和药物动力学特征的抗体或抗体片段尤为受关注。在一些实施方案中，对本领域已知的抗体或抗体片段进行进一步工程改造(例如人源化或诱变)以选择具有合适亲和力的变体，之后与第一抗原结合部分融合以提供抗LAG-3 MABP(例如，BABP)。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含本领域已知的单克隆抗体或抗体片段的VH和VL结构域和经修饰的重链恒定区和/或轻链恒定区。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含本领域已知的单克隆抗体和经修饰的Fc区，例如具有S228P突变的IgG4 Fc或无效应物IgG1 Fc。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含人类、人源化或嵌合全长抗体或抗体片段。
c)示例性抗LAG-3MABP
在一些实施方案中，抗LAG-3构建体是抗LAG-3 MABP，其包含特异性识别PD-1的第二抗原结合部分。在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分包含抗PD-1sdAb。在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分包含由两条重链和两条轻链组成的全长抗PD-1抗体。
PD-1是CD28受体家族的抑制性成员，CD28受体家族也包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1含有膜近端免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和膜远端酪氨酸基开关基序(ITSM)(Thomas,M.L.(1995)J Exp Med 181:1953-6；Vivier,E和Daeron,M(1997)Immunol Today18:286-91)。尽管在结构上类似于CTLA-4，但PD-1缺少对于B7-1和B7-2结合至关重要的MYPPPY基序。
PD-1调控T细胞活化和耐受性，并且因此拮抗性抗PD-1抗体可用于克服耐受性。PD-1已被定义为B7-4的受体。B7-4在结合至免疫细胞上的抑制性受体时可抑制免疫细胞活化。PD-1/PD-L1途径的接合引起T细胞效应功能的抑制、细胞因子分泌和增殖(Turnis等,OncoImmunology 1(7):1172-1174,2012)。高水平的PD-1与耗尽或长期刺激的T细胞相关。此外，增加的PD-1表达与癌症患者的降低存活有关。下调PD-1、B7-4和免疫细胞中B7-4与PD-1抑制性信号之间的相互作用的药剂可使得免疫反应增强。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体，其包含与抗PD-1sdAb融合的本文所述的抗LAG-3 sdAb。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb经由接头(例如肽接头)与所述抗PD-1sdAb融合。在一些实施方案中，所述抗LAG-3构建体包含多个(例如2个、3个、4个或更多个)抗LAG-3 sdAb，其可相同或不同。在一些实施方案中，所述抗LAG-3构建体包含多个(例如2个、3个、4个或更多个)抗PD-1 sdAb，其可相同或不同。所述抗PD-1sdAb可源自任何已知的抗PD-1 sdAb，例如PCT/CN2018/071729中所公开的那些抗PD-1sdAb，其内容通过引用整体并入本文。所述抗LAG-3构建体可为任何合适形式，例如从N末端至C末端为：(抗LAG-3 sdAb)-L1-(抗PD-1sdAb)或(抗PD-1sdAb)-L1-(抗LAG-3 sdAb)，其中L1是化学键或接头，例如肽接头。
可用于制备本文所述的多特异性抗LAG_3构建体的示例性4链抗PD-1抗体包括(但不限于)派姆单抗(例如，
Figure BDA0002675071240000971
)、纳武单抗(例如，
Figure BDA0002675071240000972
)、PD1-BM-min，包括其生物类似物、其衍生物和具有相同序列的抗体。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗PD-1全长抗体或其抗原结合片段(例如，Fab、scFv)。在一些实施方案中，所述抗PD-1全长抗体或其抗原结合片段(例如，Fab、scFv)包含：(i)VH，其包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，和VL，其包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；或(ii)VH，其包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，和VL，其包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，所述抗PD-1全长抗体包含：(i)包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的轻链；或(ii)包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述抗PD-1全长抗体是派姆单抗(例如，
Figure BDA0002675071240000981
)或PD1-BM-min。
在一些实施方案中，抗LAG-3 MABP(例如，BABP)包含(a)第一抗原结合部分，其包含本文所述的抗LAG-3 sdAb，和(b)第二抗原结合部分，其包含VH和VL，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合(下文中称为“LAG-3×PD-1MABP”或“LAG-3×PD-1BABP”)。示例性抗LAG-3/PD-1BABP示于图7至图14和表7中。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 BABP，其包含：(a)第一多肽，其从N末端至C末端包含：抗LAG-3 sdAb-VH-CH1-CH2-CH3；和(b)第二多肽，其从N末端至C末端包含：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合第二表位(例如，免疫检查点分子，例如PD-1)的抗原结合位点，并且其中所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3；或(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:223的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:288、295、304或306中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点。在一些实施方案中，VH和VL结构域源自派姆单抗或PD1-BM-min。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，CH3和抗LAG-3 sdAb经由肽接头彼此融合，例如包含SEQ IDNO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列的肽接头。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb的N末端与肽序列融合。在一些实施方案中，所述肽序列包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域源自IgG1 Fc、无效应物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc(S228P)。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 BABP，其包含：(a)第一多肽，其从N末端至C末端包含：VH-CH1-CH2-CH3-抗LAG-3 sdAb；和(b)第二多肽，其从N末端至C末端包含：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合第二表位(例如，免疫检查点分子，例如PD-1)的抗原结合位点，并且其中所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3；或(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:223的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包括包含SEQ IDNO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包括包含SEQ ID NO:288、295、304或306中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点。在一些实施方案中，VH和VL结构域源自派姆单抗或PD1-BM-min。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，CH3和抗LAG-3 sdAb经由肽接头彼此融合，例如包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列的肽接头。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb的C末端与肽序列融合。在一些实施方案中，所述肽序列包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域源自IgG1 Fc、无效应物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc(S228P)。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 BABP，其包含：(a)第一多肽，其从N末端至C末端包含：VH-CH1-CH2-CH3；和(b)第二多肽，其从N末端至C末端包含：抗LAG-3 sdAb-VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合第二表位(例如，免疫检查点分子，例如PD-1)的抗原结合位点，并且其中所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3；或(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:223的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包括包含SEQ IDNO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包括包含SEQ ID NO:288、295、304或306中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点。在一些实施方案中，VH和VL结构域源自派姆单抗或PD1-BM-min。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，CH3和抗LAG-3 sdAb经由肽接头彼此融合，例如包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列的肽接头。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb的N末端与肽序列融合。在一些实施方案中，所述肽序列包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域源自IgG1 Fc、无效应物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc(S228P)。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 BABP，其包含：(a)第一多肽，其从N末端至C末端包含：VH-CH1-CH2-CH3；和(b)第二多肽，其从N末端至C末端包含：VL-CL-抗LAG-3sdAb，其中VH和VL形成特异性结合第二表位(例如，免疫检查点分子，例如PD-1)的抗原结合位点，并且其中所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3；或(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:223的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包括包含SEQ IDNO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包括包含SEQ ID NO:288、295、304或306中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点。在一些实施方案中，VH和VL结构域源自派姆单抗或PD1-BM-min。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，CH3和抗LAG-3 sdAb经由肽接头彼此融合，例如包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列的肽接头。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb的C末端与肽序列融合。在一些实施方案中，所述肽序列包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域源自IgG1 Fc、无效应物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc(S228P)。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 BABP，其包含：(a)第一多肽，其从N末端至C末端包含：VH-CH1-抗LAG-3 sdAb-CH2-CH3；和(b)第二多肽，其从N末端至C末端包含：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合第二表位(例如，免疫检查点分子，例如PD-1)的抗原结合位点，并且其中所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3；或(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQID NO:223的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包括包含SEQ IDNO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包括包含SEQ ID NO:288、295、304或306中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点。在一些实施方案中，VH和VL结构域源自派姆单抗或PD1-BM-min。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，CH3和抗LAG-3 sdAb经由肽接头彼此融合，例如包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列的肽接头。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域源自IgG1Fc、无效应物IgG1 Fc、IgG2Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc(S228P)。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3 BABP，其包含多肽，所述多肽从N末端至C末端包含：VL-VH-抗LAG-3 sdAb-CH2-CH3，其中所述VL和所述VH一起形成特异性结合第二表位(例如，免疫检查点分子，例如PD-1)的scFv，并且其中所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:221的氨基酸序列的CDR3；或(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗LAG-3sdAb包括包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，所述抗LAG-3 sdAb包括包含SEQ ID NO:288、295、304或306中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点。在一些实施方案中，VH和VL结构域源自派姆单抗或PD1-BM-min。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，CH3和抗LAG-3 sdAb经由肽接头彼此融合，例如包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列的肽接头。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域源自IgG1 Fc、无效应物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc或IgG4 Fc(S228P)。
在一些实施方案中，抗LAG-3构建体包含第一多肽的两个相同拷贝和第二多肽的两个相同拷贝。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:359的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:360的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:361的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:362的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:363的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:364的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQID NO:365的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:375的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:376的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:377的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:378的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:379的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:380的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:381的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:382的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:383的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:384的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:385的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:386的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:387的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:388的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:389的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:390的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:391的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:392的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:393的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:394的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:395的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:396的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:397的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:398的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:399的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:400的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:401的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:402的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:403的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:404的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:405的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:406的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:407的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:408的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:409的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:410的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:411的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:412的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:413的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:414的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:415的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:416的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:417的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:418的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:419的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:420的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:421的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:422的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:423的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:424的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:425的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:426的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:427的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:428的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:429的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:430的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:431的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:432的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:433的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:434的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:435的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:436的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:437的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:438的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:440的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:441的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:442的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:444的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，BABP)，其包括包含SEQ ID NO:445的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:446的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含SEQ ID NO:358-365和375-446中的任一者的氨基酸序列。
肽接头
抗LAG3构建体中的各个结构域和组分(例如抗LAG-3 sdAb、Fc片段、第一抗原结合部分和第二抗原结合部分)可经由合适接头(例如肽接头)彼此融合。抗LAG-3构建体中所用一个或多个肽接头的长度、柔性程度和/或其它性质可对性质具有一些影响，这些性质包括(但不限于)对一种或多种特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力。举例来说，可选择较长的肽接头以确保两个毗邻结构域不在空间上相互干扰。在一些实施方案中，肽接头包含柔性残基(例如甘氨酸和丝氨酸)，从而使得毗邻结构域相对于彼此自由移动。举例来说，甘氨酸-丝氨酸双联体可以是合适的肽接头。
肽接头可具有任何合适长度。在一些实施方案中，肽接头长度为至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、75个、100个或更多个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，肽接头长度不超过约100个、75个、50个、40个、35个、30个、25个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或更少个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，肽接头的长度为以下中的任一者：约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、长约10个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、或约1个氨基酸至约100个氨基酸。
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。举例来说，源自仅重链抗体铰链区的序列可用作接头。参见例如WO1996/34103。在一些实施方案中，肽接头是人类IgG1铰链(SEQ ID NO:352)。在一些实施方案中，肽接头是突变的人类IgG1铰链(SEQ ID NO:353)。在一些实施方案中，肽接头是人类IgG4铰链。在一些实施方案中，肽接头是hIgG2铰链。在一些实施方案中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n(SEQID NO:368)、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n(SEQ ID NO:369)、(GSGGS)n(SEQ IDNO:370)、(GGGS)n(SEQ ID NO:371)和(GGGGS)n(SEQ ID NO:372)，其中n为至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其它柔性接头。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:366(GGGGSGGGS)或367(GGGGSGGGGSGGGGS)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb的N末端或C末端可与肽序列融合，所述肽序列可具有本文针对肽接头所述的序列特征中的任一者。
(III)抗体变体
在一些实施方案中，涵盖本文所提供的抗LAG-3构建体的氨基酸序列变体(例如，抗LAG-3 sdAb、抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、抗LAG-3 MABP/BABP)。举例来说，可期望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学性质。抗体的氨基酸序列变体可通过将适当修饰引入至编码所述抗体的核酸序列中或通过肽合成来制备。这些修饰包括例如抗体的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可实施缺失、插入和取代的任一组合以实现最终构建体，条件是最终构建体具有期望特性，例如抗原结合。
a)取代、插入、缺失和变体
在一些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的所关注位点包括HVR(或CDR)和FR。保守取代示于表2中的“优选取代”标题下。更多实质性变化提供于表2的“示例性取代”标题下，并且如下文参考氨基酸侧链类别所进一步阐述。可将氨基酸取代引入至所关注抗体中并且针对期望活性对产物进行筛选，所述期望活性是例如保留/改进的抗原结合、降低的免疫原性或改进的ADCC或CDC。
表2.氨基酸取代
Figure BDA0002675071240001111
Figure BDA0002675071240001121
可根据常见侧链性质将氨基酸分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链定向的残基：Gly、Pro；和(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要将这些类别中的一者的成员交换为另一类别。
一类取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人类抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的一种或多种所得变体相对于亲本抗体将在某些生物学性质(例如，增强的亲和力、降低的免疫原性)中具有修饰(例如，改进)和/或基本上将保留亲本抗体的某些生物性质。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可使用例如基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(例如本文所述的那些技术)便捷地产生。简言之，使一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体展示于噬菌体上并筛选特定生物学活性(例如结合亲和力)。
可对HVR作出改变(例如，取代)以例如改进抗体亲和力。这样的改变可在HVR“热点”(即，由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基)(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行，其中测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过二级文库的构建和再选择的亲和力成熟已阐述于例如Hoogenboom等,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等编辑，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任一者(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)向选择用于成熟的可变基因中引入多样性。然后建立二级文库。然后筛选所述文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一方法涉及HVR定向方法，其中将若干个HVR残基(例如，一次4至6个残基)随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模特定地鉴定参与抗原结合的HVR残基。特定来说，通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在一些实施方案中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要这些改变不会基本上降低抗体结合抗原的能力即可。举例来说，可对HVR作出不会基本上降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文所提供的保守取代)。这些改变可位于HVR“热点”或CDR以外。在上文所提供的变体VHH序列的一些实施方案中，每个HVR未经改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
用于鉴定抗体中可靶向诱变的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在这种方法中，鉴定了残基或目标残基组(例如，带电残基，例如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并且由中性或带负电氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)代替以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置处引入其它取代。或者或另外，抗原-抗体复合物的晶体结构用以鉴定抗体与抗原之间的接触点。作为取代候选物，可靶向或消除这些接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否含有期望性质。
氨基酸序列插入包括氨基末端和/或羧基末端融合物(长度在一个残基至含有上百或更多个残基的多肽范围内)以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在一些实施方案中，改变本文所提供的经分离的抗LAG-3构建体以增加或降低构建体糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列从而使得产生或移除一个或多个糖基化位点来便捷地完成抗体中糖基化位点的增加或缺失。
倘若抗LAG-3构建体包含Fc区(例如，抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、LAG-3×PD-1MABP)，则可改变其所连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具支链、二分枝低聚糖，其通常通过N键联连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等,TIBTECH 15:26-32(1997)。所述低聚糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸以及连接至二分枝低聚糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本申请的抗LAG-3构建体中的低聚糖进行修饰以产生具有某些改进性质的抗体变体。
在一些实施方案中，提供具有缺少连接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗LAG-3构建体抗体变体。举例来说，这种抗体中岩藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。如例如WO 2008/077546中所阐述，岩藻糖的量是通过计算如通过MALDI-TOF质谱法所测量的糖链内Asn297处的岩藻糖相对于连接至Asn 297的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总和的平均量来测定。Asn297是指位于Fc区中约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，因此Asn297也可位于位置297上游或下游的约±3个氨基酸处，即，介于位置294与位置300之间。这些岩藻糖基化变体可具有改进的ADCC功能。参见例如美国专利公开第US 2003/0157108号(Presta,L.)；第US 2004/0093621号(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”抗体变体有关的公开的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka等,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请第US 2003/0157108A1号，Presta,L；和WO 2004/056312A1，Adams等,尤其在实施例11中)和敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
进一步提供具有二等分低聚糖的抗LAG-3构建体变体，例如在其中连接至抗体Fc区的二分枝低聚糖由GlcNAc二等分。这些抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改进的ADCC功能。这些抗体变体的实例阐述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利第6,602,684号(Umana等)；和US 2005/0123546(Umana等)中。还提供了在连接至Fc区的低聚糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这些抗体变体可具有改进的CDC功能。这些抗体变体阐述于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc区变体
在一些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入至本文所提供的抗LAG-3构建体(例如，抗LAG-3 HCAb或抗LAG-3 MABP)的Fc区中，从而产生Fc区变体。所述Fc区变体可包含人类Fc区序列(例如，人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，所述序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)。
在一些实施方案中，本申请涵盖具有一些但非全部效应功能的抗PD-1构建体(例如，抗LAG-3 HCAb或抗LAG-3 MABP)变体，这使得它成为其中抗LAG-3构建体体内半衰期是重要的但某些效应功能(例如补体和ADCC)是不必要或有害的的应用的理想候选物。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/缺失。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合分析以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达汇总于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表2中。评价所关注分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例阐述于美国专利第5,500,362号(参见例如Hellstrom,I.等,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox
Figure BDA0002675071240001161
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于这些测定的可用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀手(NK)细胞。或者或另外，可在体内评价所关注分子的ADCC活性，例如在例如Clynes等,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所公开的动物模型中。也可进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评价补体活化，可实施CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie，Blood 103:2738-2743(2004))。也可使用本领域已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低效应功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些抗体(美国专利第6,737,056号)。这些Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两者或更多者处具有取代的Fc突变体，包括在残基265和297处取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利第7,332,581号)。
阐述具有经改进或减小的与FcR结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利第6,737,056号；WO 2004/056312；和Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在一些实施方案中，抗LAG-3构建体变体包含具有一个或多个改进ADCC的氨基酸取代的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334处(残基的EU编号)的取代。
在一些实施方案中，在Fc区中作出改变，从而改变(即，改进或减小)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如如美国专利第6,194,551号、WO 99/51642和Idusogie等,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所阐述。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体(例如，抗PD-1sdAb-Fc融合蛋白(例如，抗LAG-3 HCAb或抗LAG-3 MABP)变体，其包含以下各物：包含一个或多个延长半衰期和/或改善与新生Fc受体(FcRn)的结合的氨基酸取代的变体Fc区。具有延长的半衰期和改善的与新生Fc受体(FcRn)(其负责将母体IgG转移至胎儿中)(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))的结合的抗体阐述于US2005/0014934A1(Hinton等)中。那些抗体包含具有一个或多个改善Fc区与FcRn的结合的取代的Fc区。这些Fc变体包括在Fc区残基的一者或多者处具有取代的那些变体，例如取代Fc区残基434(美国专利第7,371,826号)。
关于Fc区变体的其它实例，也参见Duncan和Winter，Nature322:738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；和WO 94/29351。
涵盖包含任何本文所述Fc变体或其组合的抗LAG-3构建体(例如，抗LAG-3 HCAb或抗LAG-3 MABP)。
d)半胱氨酸工程改造的抗体变体
在一些实施方案中，可期望产生半胱氨酸工程改造的抗LAG-3构建体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在具体实施方案中，被取代的残基是在抗体的可及位点处出现。如本文所进一步阐述，通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团从而位于抗体的可及位点处并且可用于使抗体结合至其它部分(例如药物部分或接头-药物部分)以产生免疫缀合物。在一些实施方案中，以下残基中的任何一者或多者可被半胱氨酸取代：重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利第7,521,541号中所阐述来产生半胱氨酸工程改造的抗LAG-3构建体。
e)抗体衍生物
在一些实施方案中，本文所提供的抗LAG-3构建体可被进一步修饰以包含本领域已知并且容易获得的其它非蛋白质性部分。适于衍生抗体的部分包括(但不限于)水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实施例包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中具有稳定性而在制造方面具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可为具支链或无支链的。连接至抗体的聚合物的数目可有所变化，并且如果连接一个以上的聚合物，则其可为相同或不同分子。一般来说，用于衍生的聚合物的数目和/或类型可基于包括(但不限于)以下的考虑因素来确定：待改进抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
在一些实施方案中，提供了一种抗LAG-3构建体和非蛋白质性部分的缀合物，其可通过暴露于辐射来选择性加热。在一些实施方案中，非蛋白质性部分是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括(但不限于)如下波长：其并不危害正常细胞，但将非蛋白质性部分加热至可杀伤抗体-非蛋白质性部分附近细胞的温度。
在一些实施方案中，本文所提供的抗LAG-3构建体(例如，抗LAG-3 HCAb或抗LAG-3MABP)可被进一步修饰以包含一种或多种具生物活性的蛋白质、多肽或其片段。如本文可互换使用的“生物活性”或“具生物活性”意指体内显示进行特定功能的生物学活性。举例来说，其可意指与例如蛋白质、DNA等特定生物分子组合，然后促进或抑制这种生物分子的活性。在一些实施方案中，生物活性蛋白质或其片段包括作为活性原料药施用于患者以用于预防或治疗疾病或疾患的蛋白质和多肽，以及用于诊断性目的的蛋白质和多肽(例如用于诊断性测试或体外测定中的酶)，以及施用于患者以预防疾病的蛋白质和多肽(例如疫苗)。在一些实施方案中，生物活性蛋白质或其片段具有免疫刺激/免疫调节、膜转运或酶活性。在一些实施方案中，具生物活性的蛋白质、多肽或其片段是酶、激素、生长因子、细胞因子或其混合物。在一些实施方案中，具生物活性的蛋白质、多肽或片段可特异性识别目标肽(例如抗原或其它蛋白质)。
在一些实施方案中，可包含在本文所述的抗LAG-3构建体内的生物活性蛋白质或其片段是蛋白质结合蛋白。在一些实施方案中，可包含在本文所述的抗LAG-3构建体内的生物活性蛋白质或其片段是抗体模拟物，它们是包含类似于抗体的抗原结合结构域的小型工程改造蛋白(Geering和Fussenegger,Trends Biotechnol.,33(2):65-79,2015)。这些分子源自现有人类支架蛋白质并且包含单一多肽。可包含在本文所述的抗LAG-3构建体内的示例性抗体模拟物可以是(但不限于)经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin；其包含3-5个侧接有N末端和C末端帽结构域的完全合成锚蛋白重复序列)、亲合力多聚体(高亲合性多聚体(avimer)；包含多个A结构域的高亲和力蛋白质，每个结构域对靶标具有低亲和力)或抗运载蛋白(Anticalin)(基于脂质运载蛋白的支架，具有四个可及环，每一者的序列可随机化)。在一些实施方案中，可包含在本文所述的抗LAG-3构建体内的生物活性蛋白质或其片段是犰狳重复蛋白(例如，β-连环蛋白、α-输入蛋白、斑珠蛋白、腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC))，其包含犰狳重复单元(长度为约40个残基的特征性重复氨基酸序列)。每个犰狳重复序列由一对形成发夹结构的α螺旋构成。多个拷贝的重复序列形成称为α螺管的结构。犰狳重复蛋白能够结合不同类型的肽，其依赖于肽主链的恒定结合方式而不需要特定保守侧链或与肽的游离N末端或C末端的相互作用。按残基识别肽残基的可能性与重复蛋白的固有模块性的组合使得犰狳重复蛋白成为用于设计针对肽结合的通用支架的有希望候选物。
在一些实施方案中，可包含在本文所述的抗LAG-3构建体内的具生物活性的蛋白质或其片段是配体，例如与特定细胞受体相互作用的淋巴因子和细胞因子。淋巴因子是低分子量蛋白质，当抗原或凝集素刺激T细胞生长时，T细胞分泌所述淋巴因子。
III.药物组合物
本申请还提供了药物组合物，所述药物组合物包含任何一种本文所述的抗LAG-3构建体(例如，抗LAG-3 sdAb、抗LAG-3 HCAb或抗LAG-3 MABP)和任选地药学上可接受的载体。药物组合物可通过将具有期望纯度的本文所述抗LAG-3构建体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编辑(1980))，其呈冻干制剂或水溶液的形式。
药物组合物优选是稳定的，其中此处抗LAG-3构建体在储存时基本上保留其物理和化学稳定性和完整性。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中可获得并且综述于Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee编辑，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中。稳定性可在选定的温度下在选定的时间段内测量。对于快速筛选，可将制剂在40℃下保持2周至1个月，此时测量稳定性。倘若制剂在2℃-8℃下储存，则制剂通常应在30℃或40℃下稳定达至少1个月，和/或在2℃-8℃下稳定达至少2年。倘若制剂在30℃下储存，则制剂通常应在30℃下稳定达至少2年，和/或在40℃下稳定达至少6个月。举例来说，储存期间的聚集程度可用作蛋白质稳定性的指标。在一些实施方案中，本文所述抗LAG-3构建体的稳定制剂可包含少于约10％(优选少于约5％)的作为聚集体存在于制剂中的抗LAG-3构建体。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，抗氧化剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、偏亚硫酸氢钠；防腐剂，等渗剂(例如氯化钠)，稳定剂，金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；螯合剂(例如EDTA)和/或非离子表面活性剂。
生理学上可接受的载体的实例包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
缓冲剂用于将pH控制在使治疗有效性优化的范围内，尤其在稳定性依赖于pH时。缓冲剂优选以约50mM至约250mM范围内的浓度存在。本申请中所用的合适缓冲剂包括有机酸和无机酸二者及其盐。举例来说，柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外，缓冲剂可包含组氨酸和三甲胺盐，例如Tris。
添加防腐剂以减慢微生物生长，并且其通常以0.2％-1.0％(w/v)范围存在。添加防腐剂可例如促进多用途(多剂量)制剂的产生。本申请中所用的合适防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎卤铵(benzalkonium halide)(例如，苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯扎碘铵)、苄索氯铵；硫柳汞、苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
张力剂有时称为“稳定剂”，其存在以调节或维持组合物中液体的张力。当与较大带电荷生物分子(例如蛋白质和抗体)一起使用时，张力剂通常称为“稳定剂”，这是因为它们可与氨基酸侧链的带电荷基团相互作用，从而减小分子间和分子内相互作用的可能性。考虑到其它成分的相对量，张力剂可以介于0.1重量％至25重量％之间的任何量存在，优选以1％至5％存在。优选的张力剂包括多元糖醇，优选三元或更高元糖醇，例如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
其它赋形剂包括可用作以下物质中的一者或多者的试剂：(1)增积剂，(2)增溶剂，(3)稳定剂和(4)防止变性或附着于容器壁的试剂。这些赋形剂包括：多元糖醇(上文所列举)；氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，例如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，例如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，例如人类血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯烷酮；单糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；二糖(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，例如棉子糖；和多糖，例如糊精或葡聚糖。
存在非离子表面活性剂或清洁剂(也称为“润湿剂”)以有助于使治疗剂溶解以及保护治疗性蛋白质免受搅动诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力而不会引起活性治疗性蛋白质或抗体的变性。非离子表面活性剂是以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml、优选约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、
Figure BDA0002675071240001231
多元醇、
Figure BDA0002675071240001232
聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(
Figure BDA0002675071240001233
-20、
Figure BDA0002675071240001234
-80等)、聚桂醇400、聚烃氧40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、甘油单硬脂酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可使用的阴离子清洁剂包括月桂基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子清洁剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为使药物组合物用于体内施用，它们必须是无菌的。可通过经由无菌过滤膜过滤使药物组合物无菌。本文的药物组合物通常置于具有无菌输液港的容器中，例如具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
施用途径是根据已知并且公认的方法，例如通过单次或多次推注或经较长时间段输注以合适方式来实施，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内或关节内途径的注射或输注、局部施用、吸入或通过持续释放或延长释放方式。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有拮抗剂的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形制品的形式(例如膜或微胶囊)。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸-2-羟基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸与L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)构成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
本文的药物组合物也可视需要含有一种以上用于所治疗特定适应症的活性化合物，优选为具有彼此不会产生不利影响的补充活性的那些成分。或者或另外，所述组合物可包含细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。这些分子适于以对预期目的有效的量以组合形式存在。
活性成分也可分别装入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、胶质药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗滴乳液中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第18版中。
在一些实施方案中，药物组合物含于一次性使用小瓶，例如一次性使用密封小瓶中。在一些实施方案中，药物组合物含于多次使用的小瓶中。在一些实施方案中，药物组合物以散装含于容器中。在一些实施方案中，将药物组合物冷冻保存。
IV.治疗LAG-3相关疾病的方法
抗LAG-3构建体(例如，抗LAG-3 sdAb、抗LAG-3 HCAb或抗LAG-3 MABP)及其组合物(例如药物组合物)可用于多种应用，例如用于诊断、分子测定和疗法。
本发明的一个方面提供了一种治疗有需要的个体的LAG-3相关疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含任何一种本文所述的抗LAG-3构建体的药物组合物。在一些实施方案中，所述LAG-3相关疾病是癌症。在一些实施方案中，所述LAG-3相关疾病是免疫相关疾病。在一些实施方案中，免疫相关疾病与T细胞功能障碍病症相关。在一些实施方案中，T细胞功能障碍病症的特征在于T细胞无反应或分泌细胞因子、增殖或执行细胞溶解活性的能力降低。在一些实施方案中，T细胞功能障碍病症的特征在于T细胞耗竭。在一些实施方案中，T细胞是CD4+和CD8+ T细胞。在一些实施方案中，使用本文所述的抗LAG-3构建体来增加、增强或刺激有需要的受试者的免疫反应或功能。在一些实施方案中，所述LAG-3相关疾病(例如，癌症、免疫相关疾病)对免疫检查点分子单一阻断具有部分抗性(例如，对抗PD-1抗体单一疗法治疗具有部分抗性)。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的LAG-3相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含以下各物：包含抗LAG-3 sdAb的经分离抗LAG-3构建体和药学上可接受的载体，其中所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的LAG-3相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含以下各物：包含抗LAG-3 sdAb的经分离抗LAG-3构建体和药学上可接受的载体，其中所述抗LAG-3 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3；或(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包括包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包括包含SEQ ID NO:288、295、304或306中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的癌症(例如，结肠癌)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括包含抗LAG-3 sdAb的经分离抗LAG-3构建体和药学上可接受的载体，其中所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ IDNO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的癌症(例如，结肠癌)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括包含抗LAG-3 sdAb的经分离抗LAG-3构建体和药学上可接受的载体，其中所述抗LAG-3 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3；或(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包括包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包括包含SEQ ID NO:288、295、304或306中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的LAG-3相关疾病(例如癌症，例如结肠癌)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括包含特异性识别LAG-3的sdAb的经分离抗LAG-3 HCAb和药学上可接受的载体，其中所述抗LAG-3sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体，其中所述抗LAG-3 sdAb与免疫球蛋白的Fc片段融合。在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的LAG-3相关疾病(例如癌症，例如结肠癌)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括包含抗LAG-3 sdAb的经分离抗LAG-3构建体和药学上可接受的载体，其中所述抗LAG-3sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR3；或(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包括包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb包括包含SEQ ID NO:288、295、304或306中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，抗LAG-3 sdAb经由肽接头与Fc片段融合。在一些实施方案中，抗LAG-3 HCAb是单体的。在一些实施方案中，抗LAG-3HCAb是二聚的。在一些实施方案中，Fc片段是人类IgG1Fc、无效应物人类IgG1 Fc、hIgG2Fc、人类IgG4 Fc或hIgG4 Fc(S228P)。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的LAG-3相关疾病(例如癌症，例如结肠癌)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含经分离的抗LAG-3构建体(例如，MABP或BABP)和药学上可接受的载体，所述经分离的抗LAG-3构建体包含：(a)第一抗原结合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸取代的变体，和(b)第二抗原结合部分，其特异性结合第二表位(例如免疫检查点抑制剂，例如PD-1)，其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的LAG-3相关疾病(例如癌症，例如结肠癌)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含经分离的抗LAG-3构建体(例如，MABP或BABP)和药学上可接受的载体，所述经分离的抗LAG-3构建体包含：(a)第一抗原结合部分，其包含抗LAG-3 sdAb，所述抗LAG-3 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:136的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQID NO:69的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ IDNO:221的氨基酸序列的CDR3；(4)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的CDR3；(5)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的CDR3，和(b)第二抗原结合部分，其特异性结合第二表位(例如免疫检查点抑制剂，例如PD-1)，其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，第二表位是来自免疫检查点分子，例如PD-1、4-1BB、PD-L1、TIM-3、TIGIT、CTLA-4、VISTA、B7-1、B7-H3、CD47、OX40或GITR。在一些实施方案中，第一抗原结合部分在重链的N末端、轻链的N末端、Fc区的N末端、重链的C末端或轻链的C末端与第二抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含Fab或scFv。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含由两条重链和两条轻链组成的全长4链抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗PD-1全长抗体(例如，派姆单抗或PD1-BM-min)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗PD-1全长抗体或其抗原结合片段(例如，Fab、scFv)包含VH，其包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和VL，其包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且VL包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗PD-1全长抗体包括包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，抗PD-1全长抗体包括包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合部分与第二抗原结合部分经由肽接头融合。在一些实施方案中，第二抗原结合片段包含Fc区，例如IgG1 Fc、无效应物IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4Fc或IgG4 Fc(S228P)。在一些实施方案中，抗LAG-3构建体包括包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:359的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，抗LAG-3构建体包括包含SEQ ID NO:362的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:363的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，抗LAG-3构建体包括包含SEQ ID NO:381的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO:382的氨基酸序列的第二多肽。
在一些实施方案中，治疗癌症的方法具有以下生物学活性中的一者或多者：(1)杀伤癌细胞(包括旁观者杀灭)；(2)抑制癌细胞的增殖；(3)诱导肿瘤中的免疫反应；(4)降低肿瘤大小；(5)缓和患有癌症的个体的一种或多种症状；(6)抑制肿瘤转移；(7)延长存活；(8)延长癌症进展时间；和(9)预防、抑制或降低癌症复发的可能性。在一些实施方案中，本文所述药物组合物介导的杀伤癌细胞的方法可实现至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多中的任一者的肿瘤细胞死亡率。在一些实施方案中，本文所述药物组合物介导的降低肿瘤大小的方法可将肿瘤大小降低至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施方案中，本文所述药物组合物介导的抑制肿瘤转移的方法可将转移抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施方案中，本文所述药物组合物介导的延长个体(例如人类)存活的方法可将个体存活延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月中的任一者。在一些实施方案中，本文所述药物组合物介导的延长癌症进展时间的方法可将癌症进展时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周中的任一者。在一些实施方案中，治疗免疫相关疾病的方法可增加、增强或刺激受试者的免疫反应或功能。在一些实施方案中，通过活化受试者中的效应细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+T细胞)、扩大(增加)效应细胞群体和/或杀伤靶细胞(例如，靶标肿瘤细胞)可增加、增强和/或刺激免疫反应或功能。在一些实施方案中，相对于在施用包含本文所述的抗LAG-3构建体的药物组合物之前，个体中的CD4和/或CD8 T细胞具有增加或增强的引发、活化、增殖、细胞因子释放和/或细胞溶解活性。
本文所述的方法适于治疗多种癌症，包括实体癌症和液体癌症二者。所述方法适用于所有阶段的癌症，包括早期阶段癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症或缓解中的癌症。本文所述的方法可用作第一疗法、第二疗法、第三疗法或与本领域已知的其它类型的癌症疗法(例如手术、辐射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合)的组合疗法。在一些实施方案中，所述方法用于治疗先前已经治疗的个体。在一些实施方案中，癌症对于先前疗法是难治的。在一些实施方案中，所述方法用于治疗先前未经治疗的个体。在一些实施方案中，癌症对免疫检查点抑制剂单一疗法具有部分抗性(例如，对抗PD-1抗体单一疗法治疗具有部分抗性)。
本申请的药物组合物的剂量和期望药物浓度可取决于所设想的具体用途有所变化。适当剂量或施用途径的确定在普通技术者的技能范围内。动物实验为确定用于人类疗法的有效剂量提供可靠指导。有效剂量的物种间推算可遵循Mordenti,J.和Chappell,W.“The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics”，Toxicokinetics and NewDrug Development,Yacobi等编辑，Pergamon Press,New York 1989，第42-46页规定的原则实施。
当使用体内施用本文所述的抗LAG-3构建体(例如抗LAG-3 sdAb、抗LAG-3 HCAb、抗LAG-3 MABP)时，正常剂量可取决于施用途径从约10ng/kg直至约100mg/kg哺乳动物体重变化。以下在本申请的范围内：不同制剂将对不同治疗和不同病症有效，并且旨在治疗特定器官或组织的施用可需要以不同于施用另一器官或组织的方式递送。此外，剂量可通过一或多次分开施用或通过连续输注来施用。对于经若干天或更久的重复施用来说，取决于疾患，持续治疗直至疾病症状出现期望阻抑为止。然而，可使用其它剂量方案。通过常规技术和测定可容易地监测这种疗法的进程。
在一些实施方案中，单次施用药物组合物(例如推注)。在一些实施方案中，多次(例如2、3、4、5、6或更多次中的任一者)施用药物组合物。如果进行多次施用，则其可通过相同或不同途径实施并且可在相同部位或在替代部位进行。可每天一次至每年一次施用药物组合物。施用之间的时间间隔可以是约24小时至1年中的任一者。时间间隔也可以是无规律的(例如在肿瘤进展后)。在一些实施方案中，给药时间表中无中断。医药领域技术人员通过监测患者的疾病征象并相应地调整治疗可容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
本申请的药物组合物(包括但不限于重构制剂和液体制剂)是根据已知方法向需要治疗的个体、优选人类施用，所述已知方法例如以推注方式或通过经一段时期连续输注静脉内施用，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、静脉内(i.v.)、关节内、滑膜内、鞘内、经口、经局部或吸入途径施用。重构制剂可通过将冻干的本文所述抗LAG-3构建体溶解于稀释剂中而使得蛋白质遍及分散来制备。适用于本申请中的示例性药学上可接受(安全并且对于施用于人类无毒)的稀释剂包括(但不限于)无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液、或盐和/或缓冲剂的水溶液。
在一些实施方案中，药物组合物通过皮下(即在皮肤下)施用而施用于个体。出于这些目的，药物组合物可使用注射器来注射。然而，可获得用于施用药物组合物的其它装置，例如注射装置；注射笔；自动注射装置；无针装置；和皮下贴剂递送系统。在一些实施方案中，药物组合物以静脉内方式施用于个体。在一些实施方案中，药物组合物通过输注(例如静脉内输注)施用于个体。用于免疫疗法的输注技术是本领域中已知的(参见例如Rosenberg等,New Eng.J.of Med.319:1676(1988))。
V.制备方法
本文所述的抗LAG-3构建体(例如抗LAG-3 sdAb、抗LAG-3 HCAb、抗LAG-3 MABP)可使用本领域已知或如本文所述的任何方法来制备。也参见实施例1至实施例3。在一些实施方案中，提供了一种产生抗LAG-3构建体的方法，所述方法包括：(a)在有效表达所编码的抗LAG-3构建体的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本文所述抗LAG-3构建体的经分离的核酸或载体；和(b)从所述宿主细胞获得所表达的抗LAG-3构建体。在一些实施方案中，步骤(a)的方法还包括产生包含编码本文所述抗LAG-3构建体的经分离的核酸或载体的宿主细胞。
已阐述制备sdAb的方法。参见例如Els Pardon等,Nature Protocol,2014；9(3):674。sdAb(例如VHH)可使用本领域已知的方法来获得，例如通过对骆驼科物种(例如骆驼或骆马)进行免疫并且从其获得杂交瘤，或通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆单结构域抗体文库并且随后通过利用未经选择文库的个别克隆进行ELISA或通过使用噬菌体展示来选择。
为重组产生sdAb，将编码单结构域抗体的核酸分离并且插入至可复制载体中用于进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合至编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离编码单结构域抗体的DNA并测序。可获得许多载体。载体的选择部分地取决于待使用的宿主细胞。通常，优选宿主细胞为原核或真核(通常哺乳动物)来源。在一些实施方案中，编码本文所述抗LAG-3构建体的经分离的核酸包含SEQ ID NO:267-273中的任一者的核酸序列。
1.原核细胞中的重组产生
a)载体构建
编码本申请的抗体的多核酸序列可使用标准重组技术获得。可从抗体产生细胞(例如杂交瘤细胞)分离期望的多核酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成器或PCR技术来合成多核苷酸。一旦获得，就将编码多肽的序列插入至能够在原核宿主中复制并且表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域中可获得并且已知的许多载体可用于本发明的目的。适当载体的选择将主要取决于待插入至载体中的核酸的大小和待被载体转化的特定宿主细胞。每个载体含有各种组件，这取决于其功能(异源多核苷酸的扩增或表达或二者)及其与它所驻留的特定宿主细胞的相容性。载体组件通常包括(但不限于)：复制起点、选择标志物基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物和转录终止序列。
一般来说，含有源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体是与这些宿主结合使用。载体通常带有复制位点以及能够提供经转化细胞中的表型选择的标记序列。举例来说，通常使用pBR322(一种源自大肠杆菌物种的质粒)来使大肠杆菌转化。pBR322含有编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因并且因此提供易于鉴定经转化细胞的方式。pBR322、其衍生物或其它微生物质粒或噬菌体也可含有或被修饰以含有可由微生物生物体使用以用于表达内源性蛋白质的启动子。用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例详细阐述于Carter等,美国专利第5,648,237号中。
另外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可作为转化载体与这些宿主结合使用。举例来说，可利用例如GEMTM-11等噬菌体来制备重组载体，所述重组载体可用于使易感宿主细胞(例如大肠杆菌LE392)转化。
本申请的表达载体可包含两个或更多个启动子-顺反子对，其编码多肽组分中的每一者。启动子是位于顺反子上游(5′)并调节其表达的非翻译调节序列。原核启动子通常属于两种类别，即诱导型和组成型。诱导型启动子是在其控制下响应于培养条件的变化(例如存在或不存在营养素或温度变化)起始增加顺反子的转录水平的启动子。
由多种潜在宿主细胞识别的大量启动子众所周知。可将所选择的启动子可操作地连接至编码轻链或重链的顺反子DNA，它是通过经由限制酶消化去除来自源DNA的启动子并且将经分离的启动子序列插入至本申请的载体中来实施。天然启动子序列和许多异源启动子二者均可用于引导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，利用异源启动子，这是因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常允许所表达靶基因转录更多并且产率更高。
适于与原核宿主一起使用的启动子包括PhoA启动子、-半乳糖苷酶(galactamase)和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子(例如tac或trc启动子)。然而，在细菌中具有功能的其它启动子(例如其它已知细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核酸序列已公开，从而使得本领域技术人员能够使用供应任何所需限制位点的接头或衔接子将其可操作地接合至编码靶轻链和重链的顺反子(Siebenlist等(1980)Cell 20:269)。
在一个方面，重组载体内的每个顺反子包含分泌信号序列组件，其引导所表达多肽跨膜的迁移。一般来说，信号序列可以是载体组件，或其可以是插入至载体中的靶多肽DNA的一部分。出于本发明的目的选择的信号序列应该是由宿主细胞识别并加工(即由信号肽酶裂解)的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞而言，可用选自由例如碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP组成的组的原核信号序列取代所述信号序列。在本申请的一些实施方案中，在表达系统的两个顺反子中所使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
在一些实施方案中，根据本申请的抗LAG-3构建体的产生可在宿主细胞的细胞质中发生，并且因此不需要在每一顺反子内存在分泌信号序列。在一些实施方案中，多肽组分(例如任选地与第一抗原结合部分融合的编码第二抗原结合部分的VH结构域的多肽和任选地与第一抗原结合部分融合的编码第二抗原结合部分的VL结构域的多肽)是在细胞质内表达、折叠并且组装以形成功能性抗体。某些宿主菌株(例如，大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而允许所表达蛋白质亚基的适当折叠和组装。Proba和Pluckthun，Gene,159:203(1995)。
本发明提供了其中可调节所表达多肽组分的定量比以使所分泌和适当组装的本申请抗体的产量最大化的表达系统。这种调节是至少部分地通过同时调节多肽组分的翻译强度来完成。用于调节翻译强度的一种技术公开于Simmons等,美国专利第5,840,523号中。它利用顺反子内翻译起始区(TIR)的变体。对于给定TIR来说，可产生具有一系列翻译强度的一系列氨基酸或核酸序列变体，从而提供调整这种因子的适宜方式以获得特定链的期望表达水平。TIR变体可通过常规诱变技术来产生，这些常规诱变技术造成可改变氨基酸序列的密码子变化，但核酸序列中的沉默变化是优选的。TIR中的改变可包括例如Shine-Dalgarno序列的数量或间隔的改变以及信号序列中的改变。产生突变信号序列的一种方法是在编码序列的开始处产生“密码子库”，其不改变信号序列的氨基酸序列(即，变化是沉默的)。这可通过改变每个密码子的第三核苷酸位置来完成；另外，一些氨基酸(例如亮氨酸、丝氨酸和精氨酸)具有多个第一位置和第二位置，这会增加制备所述库的复杂性。这种诱变方法详细阐述于Yansura等(1992)METHODS:A Companion to Methods in Enzymol.4:151-158中。
优选地，产生一组其中每个顺反子具有一系列TIR强度的载体。这种有限组提供在各种TIR强度组合下，每个链的表达水平以及期望蛋白质产物的产率的比较。TIR强度可如Simmons等,美国专利第5,840,523号中所详细阐述，通过量化报告基因的表达水平来测定。基于翻译强度比较，选择期望的个别TIR以组合于本申请的表达载体构建体中。
b)原核宿主细胞
适于表达本申请的抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，例如革兰氏(Gram)阴性或革兰氏阳性生物体。可用细菌的实例包括大肠杆菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌)、杆菌属(Bacilli)(例如，枯草杆菌(B.subtilis))、肠内细菌(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)物种(例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门杆菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺杆菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。在一些实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一些实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann，Cellular and MolecularBiology，第2卷(Washington,D.C.:American Society for Microbiology,1987)，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 AfhuA(AtonA)ptr3 lacIq lacL8 AompT A(nmpc-fepE)degP41 kanR的菌株33D3(美国专利第5,639,635号)。其它菌株及其衍生物(例如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608))也是合适的。这些实例是说明性而非限制性的。用于构建具有限定基因型的以上所提及细菌中的任一者的衍生物的方法是本领域已知的并且阐述于例如Bass等,Proteins,8:309-314(1990)中。考虑到复制子在细菌细胞中的可复制性，通常需要选择适当细菌。举例来说，当使用例如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410等众所周知的质粒以提供复制子时，可合适地使用大肠杆菌、沙雷氏菌属(Serratia)或沙门杆菌属(Salmonella)物种作为宿主。
通常，宿主细胞应分泌最少量的蛋白水解酶，并且可期望地将其它蛋白酶抑制剂并入细胞培养物中。
c)蛋白质产生
利用上述表达载体使宿主细胞转化并且在经适当修改的常规营养培养基中培养以诱导启动子、选择转化株或扩增编码期望序列的基因。转化意指将DNA引入至原核宿主中，从而使得DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合体复制。取决于所用的宿主细胞，使用对于这些细胞适当的标准技术来进行转化。对于含有大量细胞壁障壁的细菌细胞，通常使用采用氯化钙的钙处理。另一转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的另一技术是电穿孔。
利用上述表达载体使宿主细胞转化并且在经适当修改的常规营养培养基中培养以诱导启动子、选择转化株或扩增编码期望序列的基因。转化意指将DNA引入至原核宿主中，从而使得DNA可作为染色体外组件或通过染色体整合体复制。取决于所用的宿主细胞，使用对于这些细胞适当的标准技术来进行转化。对于含有大量细胞壁障壁的细菌细胞，通常使用采用氯化钙的钙处理。另一转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的另一技术是电穿孔。
用于产生本申请的抗体的原核细胞是在本领域已知并且适于培养所选择宿主细胞的培养基中生长。合适培养基的实例包括luria培养液(LB)加上必要的营养补充剂。在一些实施方案中，培养基也含有基于表达载体的构建所选择的选择剂，以选择性地允许含有表达载体的原核细胞生长。举例来说，将氨苄青霉素添加至培养基以用于使表达氨苄青霉素抗性基因的细胞生长。
也可包括适当浓度的除碳、氮和无机磷酸盐源以外的任何必要补充剂，它们单独地或作为与另一补充剂或培养基的混合物(例如复合氮源)引入。任选地，培养基可含有一种或多种选自由以下组成的组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐、二硫赤藻糖醇和二硫苏糖醇。原核宿主细胞是在合适温度下培养。举例来说，对于大肠杆菌生长，优选温度范围为约20℃至约39℃，更优选为约25℃至约37℃，甚至更优选为约30℃。培养基的pH可为在约5至约9范围内的任何pH，这主要取决于宿主生物体。对于大肠杆菌来说，pH优选为约6.8至约7.4，并且更优选为约7.0。
如果本申请的表达载体中使用诱导型启动子，则在适于使所述启动子活化的条件下诱导蛋白质表达。在本申请的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽转录。因此，将经转化宿主细胞在磷酸盐限制培养基中进行培养以用于诱导。优选地，所述磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等,J.Immunol.Methods(2002),263:133-147)。如本领域中所已知，根据所采用的载体构建体，可使用多种其它诱导物。
所表达的本申请的抗LAG-3构建体分泌至宿主细胞周质中并且从宿主细胞周质回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常通过例如渗透压冲击、声波处理或溶解等方式。一旦细胞被破坏，就可通过离心或过滤去除细胞碎片或完整细胞。蛋白质可通过例如亲和树脂色谱法进行进一步纯化。或者，可将蛋白质转运至培养基中并且在其中分离。可从培养物去除细胞并且将培养物上清液过滤并浓缩以进一步纯化所产生的蛋白质。所表达的多肽可使用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和免疫印迹测定等通常已知的方法来进一步分离并鉴定。
或者，通过发酵工艺进行大量蛋白质生产。各种大规模补料分批发酵程序可用于产生重组蛋白质。大规模发酵具有至少1000公升容量、优选约1,000公升至100,000公升容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和营养物、尤其葡萄糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常是指在体积容量不超过大约100公升并且可在约1公升至约100公升范围内的发酵罐中的发酵。
在发酵工艺期间，诱导蛋白质表达通常是在细胞已在合适条件下生长至期望密度(例如，OD550为约180-220)后起始，在该阶段细胞处于早期稳定期。如本领域已知和上文所述，根据所采用的载体构建体，可使用多种诱导物。细胞可在诱导之前生长较短时期。通常将细胞诱导约12-50小时，但可使用更长或更短的诱导时间。
为改进本申请抗体的产量和质量，可修改各种发酵条件。举例来说，为改进所分泌多肽的适当组装和折叠，可使用过表达例如Dsb蛋白质(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和或DsbG)或FkpA(具有伴侣蛋白活性的肽基脯氨酰基顺,反-异构酶)的伴侣蛋白的其它载体来共转化宿主原核细胞。已证实所述伴侣蛋白促进细菌宿主细胞中所产生的异源蛋白质的适当折叠和溶解性。Chen等(1999)J Bio Chem274:19601-19605；Georgiou等,美国专利第6,083,715号；Georgiou等,美国专利第6,027,888号；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17106-17113；Arie等(2001)Mol.Microbiol.39:199-210。
为使所表达异源蛋白质(尤其蛋白水解敏感的那些蛋白质)的蛋白分解最小化，可将某些缺乏蛋白水解酶的宿主菌株用于本发明。举例来说，可修饰宿主细胞菌株以在编码已知细菌蛋白酶(例如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合)的基因中产生一个或多个基因突变。一些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株可获得并且阐述于例如Joly等(1998)，同上；Georgiou等,美国专利第5,264,365号；Georgiou等,美国专利第5,508,192号；Hara等,Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)中。
缺乏蛋白水解酶并且被过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株可用作编码本申请抗体的表达系统中的宿主细胞。
d)蛋白质纯化
本文所产生的抗LAG-3构建体被进一步纯化以获得基本上均质的制剂以供进一步的测定和使用。可采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序是合适的纯化程序的实例：免疫亲和柱或离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上或阳离子交换树脂(例如DEAE)上的色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用例如SephadexG-75的凝胶过滤。
在一些实施方案中，固定在固相上的蛋白质A用于本申请包含Fc区的抗体的免疫亲和纯化。蛋白质A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的411(D细胞壁蛋白，其以高亲和力结合至抗体的Fc区。Lindmark等(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13。固定有蛋白质A的固相优选是包含玻璃或二氧化硅表面的柱，更优选是受控孔径玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，柱被试剂(例如甘油)涂覆，以试图防止污染物的非特异性粘附。然后洗涤固相以去除非特异性地结合至所述固相的污染物。最后，通过溶析从固相回收所关注抗体。
2.在真核细胞中的重组产生
对于真核表达，载体组件通常包括(但不限于)以下中的一者或多者：信号序列、复制起点、一种或多种标志物基因和增强子组件、启动子和转录终止序列。
a)信号序列组件
用于真核宿主中的载体也可以是插入物，其编码信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N末端具有特异性裂解位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是由宿主细胞识别并加工(即，由信号肽酶裂解)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
将这种前体区的DNA与编码本申请抗体的DNA在阅读框内接合。
b)复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组件(通常可使用SV40起点，这仅仅是由于其含有早期启动子)。
c)选择基因组件
表达和克隆载体可含有选择基因，其也称为可选择标志物。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如，氨苄青霉素、新霉素(neomycin)、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补足营养缺陷型不足，或(c)供给无法从复合培养基获得的关键营养物，例如编码杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞产生赋予抗药性的蛋白质，并且因此可在所述选择方案中存活。这种主导选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)和潮霉素(hygromycin)。
哺乳动物细胞的合适可选择标志物的另一实例是使得能够鉴定有能力吸收编码本申请抗体的核酸的细胞的那些可选择标志物，例如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和金属硫蛋白-II(优选灵长类动物金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
举例来说，首先通过在含有甲氨蝶呤(Mtx)(即DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化株来鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。当采用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如，ATCC CRL-9096)。
或者，用编码多肽的DNA序列、野生型DHFR蛋白和另一可选择标志物(例如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH))转化或共转化的宿主细胞(特定来说含有内源性DHFR的野生型宿主)可通过在含有针对所述可选择标志物的选择剂(例如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素(kanamycin)、新霉素或G418)的培养基中使细胞生长来进行选择。参见美国专利第4,965,199号。
d)启动子组件
表达和克隆载体通常含有由宿主生物体识别并且可操作地连接至编码期望多肽序列的核酸的启动子。事实上，所有真核基因均具有富AT区，其位于转录起始位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起始点上游70个至80个碱基处发现的另一序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端处为AATAAA序列，其可以是向编码序列的3′端添加聚A尾的信号。所有这些序列均可插入至真核表达载体中。
适合与原核宿主一起使用的其它启动子包括phoA启动子、-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子(例如tac启动子)。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统中的启动子也将含有可操作地连接至编码抗体的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
在哺乳动物宿主细胞中从载体的多肽转录是受例如以下启动子控制：从病毒(例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2型)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒和最优选猿猴病毒40(SV40))的基因组获得的启动子、从异源哺乳动物启动子(例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)获得的启动子、从热休克启动子获得的启动子，条件是这些启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子适宜以SV40限制性片段形式获得，其也含有SV40病毒复制起点。人类巨细胞病毒的立即早期启动子适宜以HindIII E限制性片段形式获得。使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统公开于美国专利第4,419,446号中。这种系统的修改形式阐述于美国专利第4,601,978号中。关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中表达人类干扰素cDNA，也参见Reyes等,Nature 297:598-601(1982)。或者，可使用劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)长末端重复序列作为启动子。
e)增强子元件组件
通过将增强子序列插入至载体中通常增加高等真核生物对编码本申请抗体的DNA的转录。现已知多种增强子序列是来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，通常将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括位于复制起点(100-270bp)后侧上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点后侧上的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。关于使真核启动子活化的增强元件，也参见Yaniv,Nature297:17-18(1982)。增强子可在多肽编码序列的5′或3′位置处剪接到载体中，但优选位于启动子的5′位点。
f)转录终止组件
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类细胞或来自其它多细胞生物体的有核细胞)中的表达载体也将含有终止转录和稳定mRNA所需的序列。这些序列通常可从真核生物或病毒DNA或cDNA的5′和(偶尔)3′非翻译区获得。这些区域含有在编码多肽的mRNA的非翻译部分中转录为多聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种可用转录终止组件是牛生长激素多聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中所公开的表达载体。
g)宿主细胞的选择和转化
用于在本文载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞包括本文所述的高等真核生物细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已成为常规程序。可用哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人类胚肾细胞系(亚克隆用于在悬浮培养中生长的293或293细胞，Graham等,J.GenVirol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠赛特利细胞(sertoli cell)(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人类子宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人类肝细胞瘤系(Hep G2)。
利用上述用于抗体产生的表达或克隆载体使宿主细胞转化，并且在经适当修改的常规营养培养基中培养以诱导启动子、选择转化株或扩增编码期望序列的基因。
h)培养宿主细胞
用于产生本申请抗体的宿主细胞可在多种培养基中培养。例如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM)，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)和杜尔贝科改良伊格尔培养基((Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM),Sigma)的市售培养基适于培养宿主细胞。另外，可使用以下文献中所阐述的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利第4,767,704号；第4,657,866号；第4,927,762号；第4,560,655号；或第5,122,469号；WO 90/03430；WO87/00195；或美国专利再审30,985。这些培养基中的任一者可按需要补充有激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔浓度范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。也可包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它所需补充剂。例如温度、pH等的培养条件是先前与被选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些培养条件，并且将为普通技术人员所显而易见。
i)蛋白质纯化
当使用重组技术时，抗体可在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌至培养基中。如果抗体是在细胞内产生，则作为第一步骤，例如通过离心或超滤去除微粒碎片(即宿主细胞或溶解片段)。Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992)阐述用于分离分泌至大肠杆菌周质空间中的抗体的程序。简言之，经约30分钟使细胞糊在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下解冻。可通过离心去除细胞碎片。倘若抗体分泌至培养基中，则通常首先使用市售蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这些表达系统的上清液。可在前述任何步骤中纳入蛋白酶抑制剂(例如PMSF)以抑制蛋白水解并且可纳入抗生素以防止外来污染物生长。
从细胞制备的蛋白质组合物可使用例如羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法来纯化，其中亲和色谱法是优选的纯化技术。蛋白质A作为亲和配体的合适性取决于存在于抗体中的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同型。蛋白质A可用于纯化基于人类免疫球蛋白含有1、2或4条重链的抗体(Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。推荐蛋白质G用于所有小鼠同型和人类3(Guss等,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体所附接的基质最常为琼脂糖，但可使用其它基质。机械稳定基质如受控孔径玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯容许实现较使用琼脂糖可实现者更快的流速和更短的加工时间。倘若抗体包含CH3结构域，则Bakerbond ABXTMresin(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。取决于待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，例如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱法、肝素SEPHAROSETM色谱法、阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤后，可使用pH介于约2.5-4.5之间的溶析缓冲液使包含所关注抗体和污染物的混合物经受低pH疏水相互作用色谱法，其优选在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下实施。
3.多克隆抗体
多克隆抗体通常是在动物中通过多次皮下(s.c.)或腹膜内(i.p.)注射相关抗原和佐剂来产生。有用地，可使用双官能基剂或衍生剂(例如，马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基结合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N═C═NR，其中R和R1独立地是低级烷基)使相关抗原与在待免疫物种体内具有免疫原性的蛋白质(例如，钥孔帽贝血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)结合。可采用佐剂的实例包括弗氏完全佐剂(Freund's completeadjuvant)和MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质A、合成海藻糖二棒杆霉菌酸酯(trehalosedicorynomycolate))。本领域技术人员无需过多实验即可选择免疫方案。
通过以下方式对动物实施针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物的免疫：将例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂组合并且在多个部位皮内注射所述溶液。1个月后，通过在多个部位皮下注射用占初始量1/5至1/10的于弗氏完全佐剂中的肽或缀合物对动物加强免疫。7天至14天后，抽取动物的血液并且对血清进行抗体滴度测定。对动物加强免疫直至滴度达到稳定态。缀合物也可在重组细胞培养物中作为蛋白融合物来制得。此外，例如明矾等聚集剂适于增强免疫反应。关于骆驼中的免疫，也参见实施例1。
4.单克隆抗体
单克隆抗体是从基本上同源的抗体群体获得，即，除可少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)外，构成所述群体的个别抗体均相同。因此，修饰语“单克隆”指示抗体的特征并非分立抗体的混合物。举例来说，单克隆抗体可使用最早由Kohler等,Nature,256:495(1975)所阐述的杂交瘤方法来制得或者可通过重组DNA方法(美国专利第4,816,567号)来制得。在杂交瘤方法中，如上文所阐述对小鼠或其它适当宿主动物(例如仓鼠或骆马)实施免疫以诱发产生或能够产生将与免疫所用蛋白质特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可在体外对淋巴细胞实施免疫。然后，使用合适融合剂(例如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies:Principles and Practice，第59-103页(Academic Press,1986)。关于骆驼中的免疫，也参见实施例1。
免疫剂通常将包括抗原性蛋白或其融合变体。通常，如果期望人类来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或如果期望非人类哺乳动物来源的细胞，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后，使用合适融合剂(例如聚乙二醇)使淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,AcademicPress(1986)，第59-103页。
永生化细胞系通常是经转化的哺乳动物细胞，特定来说是啮齿类动物、牛和人类来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将由此制备的杂交瘤细胞接种于合适培养基中并且在其中生长，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。举例来说，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，它们是可防止HGPRT缺陷型细胞生长的物质。
优选的永生化骨髓瘤细胞是有效融合、支持所选抗体产生细胞稳定大量产生抗体并且对培养基(例如HAT培养基)敏感的那些细胞。在这些细胞中，优选者是鼠类骨髓瘤系，例如源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些骨髓瘤系(可从沙克研究院细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center),San Diego,Calif.USA获得)，以及SP-2细胞(及其衍生物，例如X63-Ag8-653)(可从美国典型培养物保藏所(American Type CultureCollection),Manassas,Va.USA获得)。也已阐述将人类骨髓瘤和小鼠-人类异源骨髓瘤细胞系用于产生人类单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(MarcelDekker,Inc.,New York,1987))。
对其中生长杂交瘤细胞的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性是通过免疫沉淀或通过体外结合测定(例如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定。
可对其中培养杂交瘤细胞的培养基测定针对期望抗原的单克隆抗体的存在。优选地，单克隆抗体的结合亲和力和特异性可通过免疫沉淀或通过体外结合测定(例如放射性免疫测定(RIA)或酶联测定(ELISA))来测定。这些技术和测定是本领域已知的。举例来说，结合亲和力可通过Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定产生具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆并且通过标准方法使其生长(Goding，同上)。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，可使杂交瘤细胞作为哺乳动物内的肿瘤在体内生长。
合适地通过例如蛋白质A-Sepharose、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法的常规免疫球蛋白纯化程序将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中分离。
单克隆抗体也可通过重组DNA方法制得，例如美国专利第4,816,567号中所述和如上文所述的那些方法。编码单克隆抗体的DNA可使用常规程序容易地分离并测序(例如，通过使用能够特异性结合至编码鼠类抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞用作这种DNA的优选来源。一旦分离，则可将DNA置于表达载体中，然后将所述表达载体转染至原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在这些重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)和Pliickthun，Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一个实施方案中，抗体可从使用McCafferty等,Nature,348:552-554(1990)中所述的技术产生的抗体噬菌体文库分离。Clackson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)阐述使用噬菌体文库分别分离鼠类和人类抗体。后续出版物阐述通过链改组(Marks等,Bio/Technology,10:779-783(1992))以及作为用于构建极大噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等,Nucl.AcidsRes.21:2265-2266(1993))来产生高亲和力(nM范围)人类抗体。因此，这些技术是对用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
也可例如通过以下方式来修饰DNA：用人类重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠类序列(美国专利第4,816,567号；Morrison等,Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))，或将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分共价连接至免疫球蛋白编码序列。通常，这些非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或它们取代抗体的一个抗原组合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体，所述嵌合二价抗体包含一个对抗原具有特异性的抗原组合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原组合位点。
本文所述的单克隆抗体可以是单价的，其制备是本领域中熟知的。举例来说，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰重链的重组表达。重链通常在Fc区中的任何点处截短以防止重链交联。或者，可使相关半胱氨酸残基由另一氨基酸残基取代或使其缺失以防止交联。体外方法也适于制备单价抗体。消化抗体以产生其片段、特定来说Fab片段可使用本领域已知的常规技术来完成。
也可使用合成蛋白质化学中的已知方法(包括涉及交联剂的那些方法)在体外制备嵌合或杂合抗体。举例来说，可使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于这个目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇酯和4-巯基丁酰亚氨酸甲基酯。
关于单克隆sdAb产生，也参见实施例1。
5.人源化抗体
非人类(例如，鼠类)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)，其含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的CDR的残基由来自例如小鼠、大鼠、兔、骆驼科动物或骆马的非人类物种(供体抗体)的CDR并且具有期望特异性、亲和力和能力的残基代替。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架残基由相应非人类残基代替。人源化抗体也可包含在接受者抗体和导入的CDR或框架序列中均未发现的残基。一般来说，人源化抗体可包含基本上全部的至少一个、并且通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人类免疫球蛋白的那些CDR区，并且全部或基本上全部的FR区是人类免疫球蛋白共有序列的那些FR区。在一些实施方案中，人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常为人类免疫球蛋白恒定区)的至少一部分。参见例如Jones等,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature,332:323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)。
用于使非人类抗体人源化的方法是本领域中熟知的。通常，人源化抗体具有从非人类来源引入至其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为“导入”残基，其通常取自“导入”可变结构域。人源化可基本上遵循Winter和合作者的方法(Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等,Science 239:1534-1536(1988))或经由用啮齿类动物CDR或CDR序列取代人类抗体的相应序列来实施。因此，这些“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中基本上少于一个完整人类可变结构域已由来自非人类物种的相应序列所取代。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能一些FR残基被来自啮齿类动物抗体中类似位点的残基所取代的人类抗体。
待用于制备人源化抗体的人类可变结构域(轻链可变结构域和重链可变结构域二者)的选择对于降低抗原性极为重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人类可变结构域序列的整个文库来筛选啮齿类动物抗体的可变结构域的序列。然后接受最接近啮齿类动物序列的人类序列作为人源化抗体的人类框架(FR)。Sims等,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等,J.Mol.Biol.,196:901(1987)。另一方法使用源自轻链或重链的特定亚组的所有人类抗体的共有序列的特定框架。相同框架可用于若干种不同人源化抗体。Carter等,Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等,J.Immunol.151:2623(1993)。
此外重要的是，人源化抗体应保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质。为实现这个目标，根据优选方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常可获得并且是本领域技术人员所熟悉的。可使用计算机程序，这些计算机程序说明并展示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。观察这些展示内容容许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能行使中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可从接受者序列和导入序列选择FR残基并且合并使得实现期望抗体特性，例如对一种或多种靶抗原的亲和力增加。一般来说，CDR残基直接并且最为实质性地参与影响抗原结合。
在一些实施方案中，sdAb被修饰(例如人源化)，而不减小结构域对抗原的天然亲和力并且同时降低其对异源物种的免疫原性。举例来说，可确定骆马抗体的抗体可变结构域(VHH)的氨基酸残基，并且将例如框架区中的骆驼科动物氨基酸中的一者或多者用如在人类共有序列中所发现的其人类对应体代替，而所述多肽不失去其典型特征，即人源化不显著影响所得多肽的抗原结合能力。骆驼科sdAb的人源化需要在单一多肽链中引入有限量的氨基酸并使其诱变。这与scFv、Fab'、(Fab')2和IgG的人源化相反，后者需要在两条链(轻链和重链)中引入氨基酸变化并且保留两条链的组装。
6.人类抗体
作为人源化的替代方式，可产生人类抗体。举例来说，目前可产生转基因动物(例如小鼠)，所述转基因动物在免疫后能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生完整人类抗体谱。举例来说，已阐述在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链接合区(JH)基因的同型接合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人类种系免疫球蛋白基因阵列转移至这些种系突变小鼠中可在受到抗原攻击后产生人类抗体。参见例如Jakobovits等,PNAS USA,90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year inImmunol.,7:33(1993)；美国专利第5,545,806号、第5,569,825号、第5,591,669号、第5,545,807号；和WO 97/17852。能够产生完全人类sdAb的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的。参见例如US20090307787A1、美国专利第8,754,287号、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。
或者，可使用噬菌体展示技术在体外从来自未经免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因谱产生人类抗体和抗体片段。McCafferty等,Nature 348:552-553(1990)；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227:381(1991)。根据这种技术，将抗体V结构域基因框内克隆至丝状噬菌体(例如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，并且在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此基于抗体功能性质的选择也导致对编码展现那些性质的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟B细胞的一些性质。噬菌体展示可以多种形式来实施，并且综述于例如Johnson,Kevin S和Chiswell,David J.，Curr.Opin Struct.Biol.3:564-571(1993)中。可使用若干V基因区段来源进行噬菌体展示。Clackson等,Nature352:624-628(1991)从源自经免疫小鼠脾的V基因的小型随机组合文库分离出抗噁唑酮抗体的多样阵列。可构建来自未经免疫的人类供体的V基因谱，并且可基本上遵循Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等,EMBO J.12:725-734(1993)所阐述的技术分离出针对抗原多样阵列(包括自身抗原)的抗体。也参见美国专利第5,565,332号和第5,573,905号。
Cole等和Boerner等的技术也可用于制备人类单克隆抗体(Cole等,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77页(1985)和Boerner等,J.Immunol.,147(1):86-95(1991))。类似地，人类抗体可通过将人类免疫球蛋白基因座引入至其中内源性免疫球蛋白基因已部分或完全不活化的转基因动物(例如小鼠)中来制得。在攻击时，观察到人类抗体产生，其在所有方面(包括基因重排、组装和抗体谱)都非常类似于在人类中可见的情形。这种方法阐述于例如美国专利第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；和第5,661,016号，和Marks等,Bio/Tec hnology,10:779-783(1992)；Lonberg等,Nature,368:856-859(1994)；Morrison，Nature,368:812-813(1994)；Fishwild等,Nature B iotechnology,14:845-851(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology,14:826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995)中。举例来说，在一些实施方案中，人类抗体(例如，人类D Ab)可通过对人类HCAb小鼠进行免疫来产生。举例来说，HCAb(例如，sdAb-Fc融合蛋白)可通过对其中内源性鼠类抗体表达已消除并且已引入人类转基因的转基因小鼠进行免疫来产生。HCAb小鼠公开于US8,883,150、US8,921,524、US8,921,522、US8,507,748、US8,502,014、US2014/0356908、US2014/0033335、US2014/0037616、US2014/0356908、US2013/0344057、US2013/0323235、US2011/0118444和US 2009/0307787中，所有这些参考文献都通过引用并入本文，因为它们都公开关于仅重链抗体及其在转基因小鼠中的产生。对HCAb小鼠进行免疫，并且将所得引发的脾细胞与鼠类骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。然后可通过用人类序列代替鼠类CH2和CH3区以使所得HCAb是完全人类的。
最后，人类抗体也可由体外活化的B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)或通过使用本领域已知的各种技术，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.,222:581(1991)来产生。
VI.制品和试剂盒
还提供了试剂盒和制品，其包含以下中的任一者：经分离的抗LAG-3构建体(例如抗LAG-3 sdAb、抗LAG-3 HCAb、抗LAG-3 MABP)、编码其的经分离的核酸或载体、或包含编码本文所述抗LAG-3构建体的经分离的核酸或载体的经分离的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了一种试剂盒，其包含任何一种本文所述的药物组合物并且优选提供其使用说明书。
本申请的试剂盒呈合适包装。合适包装包括(但不限于)小瓶、瓶、广口瓶、软质包装(例如，密封Mylar或塑料袋)等。试剂盒可任选地提供例如缓冲剂的额外组分和解释性信息。由此，本申请还提供制品，其包括小瓶(例如密封小瓶)、瓶、广口瓶、软质包装等。
所述制品可包含容器和位于所述容器上或随所述容器附带的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由例如玻璃或塑料等多种材料来形成。通常，容器容纳有效用于治疗本文所述疾病或病症(例如癌症)的组合物，并且可具有无菌输液港(例如容器可为静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗个体的特定疾患。标签或包装插页将还包含用于向个体施用组合物的说明书。标签可指示重构和/或使用的指导。容纳药物组合物的容器可以是多次使用的小瓶，其容许重构制剂的重复施用(例如，施用2-6次)。包装插页是指通常包括在治疗产品的商业包装内的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌和/或关于这些治疗产品的使用警告的信息。另外，制品还可包含第二容器，所述第二容器包含药学上可接受的缓冲液，例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。制品还可包括从商业和使用者角度来看理想的其它物料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
试剂盒或制品可包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书，其以足以在药房(例如，医院药房和复方药房)中储存和使用的量包装。
实施例
下文实施例仅旨在示例本发明并且因此不应视为以任何方式限制本发明。以下实施例和详细说明是以说明方式而非限制方式提供。
实施例1：抗LAG-3 sdAb的产生
免疫化
利用重组LAG-3-His和LAG-3-Fc(Acrobiosystems和R&D Systems)蛋白和表达人类LAG-3的CHO-K1细胞(CHO-huLAG-3细胞)对骆驼进行免疫，所有都是根据目前的动物福利规定。为进行免疫，将抗原配制为与CFA(弗氏完全佐剂；初次免疫)或IFA(弗氏不完全佐剂；加强免疫)的乳液。抗原是在颈部以皮下方式施用。每只动物以两周时间间隔接受5次100μgLAG-3-His于CFA乳液中的注射和随后的5次LAG-3-Fc于IFA乳液中的注射。随后，实施CHO-huLAG-3细胞的两次加强免疫和LAG-3蛋白的两次加强免疫。在免疫时间表期间的各个时间点，从动物收集10mL血液样品并制备血清。在基于ELISA的测定中，利用固定的LAG-3-Fc蛋白或Fc蛋白作为对照，使用血清样品验证抗原特异性体液性免疫反应的诱导(图1和图2)。尽管检测到针对Fc蛋白的抗体，但所观察到的与LAG-3-Fc的抗体结合甚至更强，从而显示针对LAG-3蛋白的反应的充分引发。特定来说，检测到针对LAG-3蛋白的重链免疫球蛋白(HCAb)。最后一次免疫5天后，从每只动物收集300mL血液样品。使用
Figure BDA0002675071240001571
-Paque梯度(Amersham Biosciences)，从该300mL血液样品分离作为骆驼HCAb的遗传来源的外周血淋巴细胞(PBL)，产生1×109个PBL。
文库构建
使用从PBL提取的RNA作为RT-PCR的起始材料以扩增sdAb编码基因片段。将这些片段克隆至内部噬粒载体中。所述载体框内编码C末端His标签与sdAb编码序列。文库大小为大约6×108bp。根据标准方案制备文库噬菌体，经过滤器灭菌，并且在4℃下储存以供进一步使用。
选择和高通量筛选
使用固体淘选以及基于细胞的淘选对上文文库实施选择。对两种条件仅实施单轮选择。分析每个选择输出物的富集因子(相对于对照，溶析液中存在的噬菌体数)，以及LAG-3阳性克隆的多样性和百分比(ELISA)。基于这些参数，选择最佳选择用于进一步分析。为此，将每个选择的输出物作为集合体重新克隆至可溶性表达载体中以进行高通量筛选。所述载体框内编码C末端His标签与sdAb编码序列。挑取集落并且在96深孔板(1mL体积)中生长；通过向所述集落添加IPTG和0.1％Triton来诱导sdAb表达和释放至上清液中。
分析上清液中的内容物结合至LAG-3蛋白(通过ELISA)和表达LAG-3的CHO-K1稳定细胞系(通过FACS)的能力。对阳性结合物进行测序并选择独特的克隆用于进一步表征。
使独特克隆在2XYT培养基中生长；通过向所述克隆加入IPTG来诱导sdAb表达和释放至上清液中。分析含有独特结合物的上清液抑制MHC II与LAG-3之间的相互作用的能力。为此，使表达MHC II的A375黑色素瘤细胞与含有sdAb的上清液和生物素化的LAG-3-Fc一起培育，接着与荧光团标记的链霉亲和素一起培育。与无抗LAG-3sdAb阻断的样品相比，平均荧光强度(MFI)的变化代表对MHC II/LAG-3相互作用的抑制。
选择所有潜在抑制剂通过表面等离子体共振(SPR)在BIACORETM T200仪器上进行KD分析。解离期用于计算每一个别sdAb的k解离值。
实施例2：非人源化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白的制备和体外评估
sdAb-Fc融合蛋白的产生
通过使抗LAG-3 sdAb与人类IgG4 Fc区融合来产生抗LAG-3sdAb-Fc融合蛋白构建体。此处提及的IgG4 Fc带有S228P突变以防止臂交换。制备构建体的大量制备物(maxiprep)用于CHO-K1细胞瞬时表达和纯化。通过色谱法经由含有蛋白质A琼脂糖树脂的柱纯化所表达的抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白。通过SEC-HPLC测定蛋白质纯度。Bristol-Myers Squibb所产生的抗LAG-3单克隆抗体BMS-986016是根据公开专利中的序列(参见WO/2015/116539，SEQ ID NO:17和18；在本申请中以SEQ ID NO:354和355并入本文)在人类IgG4主链上产生。
通过表面等离子体共振(SPR)的靶蛋白结合和跨物种反应测试
利用BIACORETM T200仪器通过SPR测定每个抗LAG-3抗体(sdAb-Fc融合蛋白或mAb形式)的亲和常数(KD)。简言之，通过捕获抗体(Jackson ImmunoResearch目录号115-005-071)将抗LAG-3抗体以适当密度固定在传感器芯片上。以不少于5个不同浓度注射人类或食蟹猴LAG-3蛋白(Acrobiosystem，分别为772-6BGF2-D5和2187-71HF1-DZ)。使用BIACORETMT200评估软件获得解离速率常数(k解离)和缔合速率常数(k缔合)的数据，并且根据k解离与k缔合的比率计算亲和常数(KD)。若干种示例性抗LAG-3抗体的动力学数据汇总在表2中。
表2.非人源化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白针对LAG-3的亲和力测定
Figure BDA0002675071240001591
表位分箱测试
在
Figure BDA0002675071240001592
RED96仪器(ForteBio)上实施表位分箱测试。所有测量均在30℃下实施。使用胺偶联方法将所关注sdAb-Fc融合蛋白固定在生物传感器上。将人类LAG-3蛋白稀释在PBST缓冲液(1×PBS，pH 7.4和0.05％Tween-20)中，用作分析物1。人类LAG-3(与分析物1中的浓度相同)和第二LAG-3结合实体(其可以是第二sdAb-Fc融合蛋白或基准抗体BMS-986016)的混合物用作分析物2。首先将涂覆的生物传感器浸入分析物1中，并且在再生和平衡后浸入分析物2中。比较分析物1的感测图(即，单独的人类LAG-3的曲线)和分析物2的感测图(即，人类LAG-3+第二LAG-3结合实体的曲线)以确定所关注sdAb-Fc融合蛋白的结合竞争。分箱结果示于图3中。所测试的4种非人源化sdAb-Fc融合蛋白均不与BMS-986016竞争结合至人类LAG-3蛋白，而所述4种sdAb-Fc融合蛋白彼此竞争，这指示sdAb与LAG-3上的新表位结合，所述新表位与基准抗体BMS-986016所靶向者不同。
通过FACS分析的CHO-huLAG-3细胞结合和对配体结合的抑制
为测定细胞结合EC50，收获表达人类或食蟹猴LAG-3的CHO-K1细胞，并且使其与梯度浓度的抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白一起培育，接着与针对人类Fc的经荧光团标记的二级抗体一起培育。对于阻断测定，使梯度浓度的抗LAG-3 sdAb-Fc蛋白和固定浓度的生物素化LAG-3-Fc蛋白与表达MHC II的A375黑色素瘤细胞一起共培育。利用经荧光团标记的链霉亲和素检测LAG-3-Fc与A375细胞的结合。然后利用流式细胞术分析样品。结合和阻断曲线分别示于图4和图5中。抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白的结合和阻断能力的EC50汇总于表3中。与阳性对照BMS-986016相比，抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白具有类似的与CHO细胞上表达的人类LAG-3的结合能力。在细胞阻断测定中，尽管所有抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白的阻断曲线的EC50都高于BMS-986016的阻断曲线的EC50，但值得注意的是，其阻断曲线的跨度大于BMS-986016的跨度，这指示sdAb-Fc融合蛋白针对其特异性表位的结合可较BMS-986016更具竞争性地阻断LAG-3与MHC II的相互作用。
表3.非人源化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白针对LAG-3的结合数据和阻断配体结合数据
Figure BDA0002675071240001611
实施例3：抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白的人源化、产生和表征
抗LAG-3 sdAb的人源化
将sdAb AS20592、AS20594、AS20601和AS20846的蛋白质序列与共享最高同源性程度的5个最接近的人类种系序列进行比对。分别选择最佳人类种系序列作为人类接受体。接着构建同源性模型。根据模型分析数据，对抗原结合或抗体支架形成潜在关键的残基保持不变，而选择其余部分用于转化成人类对应体。最初产生一组四至六个序列优化的变体(阶段1)。分析这些变体的多种参数，并且将所获得的结果用于设计第二组sdAb(阶段2)。人源化sdAb在其名称中以“VH”指示。
人源化抗LAG-3sdAb-Fc融合蛋白的产生
在人源化变体中，根据亲和力和小规模生产水平选择AS20592VH10、AS20594VH10、AS20601VH4和AS20846VH12用于生产和表征。通过使人源化抗LAG-3 sdAb与人类IgG4 Fc区融合来产生人源化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白构建体。制备构建体的大量制备物用于HEK293细胞瞬时表达和纯化。通过色谱法经由含有蛋白质A琼脂糖树脂的柱纯化所表达的人源化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白。通过SEC-HPLC测定蛋白质纯度。表达结果汇总于表4中。
表4.人源化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白的表达
Figure BDA0002675071240001621
通过表面等离子体共振(SPR)的靶蛋白结合和跨物种反应测试
利用BIACORETM T200仪器通过SPR测定每个抗LAG-3抗体(sdAb-Fc融合蛋白或mAb形式)的亲和力常数(KD)。简言之，为测量针对人类LAG-3的亲和力，通过捕获抗体(JacksonImmunoResearch目录号115-005-071)将抗LAG-3抗体以适当密度固定在传感器芯片上。以不少于5个不同浓度注射人类LAG-3蛋白(Acrobiosystem，772-6BGF2-D5)。为测量针对食蟹猴LAG-3的亲和力，将食蟹猴LAG-3蛋白(Acrobiosystem，2187-71HF1-DZ)以适当密度固定在传感器芯片上，并且以不少于5个不同浓度注射抗LAG-3抗体。使用BIACORETM T200评估软件获得解离速率常数(k解离)和缔合速率常数(k缔合)的数据，并且根据k解离与k缔合的比率计算亲和常数(KD)。若干种示例性抗LAG-3抗体的动力学数据汇总于表5中。
表5.人源化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白的亲和力测定
Figure BDA0002675071240001622
LAG-3阻断报告基因测定
使用Promega LAG-3阻断报告基因测定试剂盒(Promega，目录号CS194819)，根据供货商的方案来实施LAG-3阻断报告基因测定。简言之，将解冻使用的MHC-II APC细胞(包括TCR活化抗原)平铺过夜，然后与抗LAG-3抗体或抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白的连续稀释液一起培育，接着添加解冻使用的LAG-3效应细胞。在37℃和5％CO2下诱导6小时后，添加BIO-GLOTM荧光素酶测定试剂，并且测定发光。利用GraphPad Prism 6软件实施四参数逻辑曲线分析。数据曲线示于图6中并且汇总于表6中。在LAG-3阻断报告基因测定中，AS20592VH10-Fc、AS20601VH4-Fc和AS20846VH12-Fc具有与BMS-986016相当或优于BMS-986016的功能。值得注意的是，sdAb-Fc融合蛋白的信号跨度(其指示抑制水平)都大于基准抗体BMS-986016的信号跨度，这与先前所阐述的配体阻断测试中的发现一致。
表6.人源化抗LAG-3 sdAb-Fc融合蛋白的LAG-3阻断报告基因测定
Figure BDA0002675071240001631
实施例4：PD-1×LAG-3 BABP的产生和表征
PD-1×LAG-3 BABP的构建
该实施例阐述PD-1×LAG-3 BABP的构建。
BABP可通过以下方式来构建：使抗LAG-3 sdAb融合至全长抗体或在C末端含有Fc区的源自所述全长抗体的scFv或Fab区，例如抗PD-1抗体，例如
Figure BDA0002675071240001632
(派姆单抗)、
Figure BDA0002675071240001633
(纳武单抗)或PD1-BM-min。抗LAG-3 sdAb可经由接头(例如9-氨基酸Gly/Ser接头(9GS接头)、人类IgG1(hIgG1)铰链或突变的hIgG1铰链)或在无接头的情形下连接至全长抗体(或在C末端具有Fc区的源自所述全长抗体的scFv或Fab区)。另外，短肽序列可融合至抗LAG-3 sdAb的N末端(参见图7、图9、图11和图12)或C末端(参见图8和图10)。BABP可具有图7至图16中所示例构型中的任一者。举例来说，抗LAG-3 sdAb可经由N末端或C末端与以下融合：重链中的至少一者、轻链中的至少一者或重链和轻链二者(参见图7至图10)。
如下表7中所示，产生示例性BABP。抗LAG-3 sdAb(AS20592VH10、AS20594VH10、AS20601VH4或AS20846VH12)经由突变的人类IgG1(hIgG1)铰链作为接头或在无接头的情形下融合至全长抗PD-1抗体(派姆单抗或PD1-BM-min)的重链的N末端、重链的C末端、轻链的N末端或轻链的C末端。在一些BABP构建体中，将另一短肽添加至sdAb的N末端。
表7.示例性PD-1×LAG-3构建体
Figure BDA0002675071240001641
Figure BDA0002675071240001651
抗LAG-3 sdAb AS20592、AS20594、AS20601和AS20846各自经由突变的人类IgG1(hIgG1)铰链作为接头融合至称为PD1-BM-min的抗PD-1抗体的重链N末端，以分别产生PD-1×LAG-3概念验证(POC)BABP BLP-1、BLP-2、BLP-3和BLP-4。PD-1×LAG-3 POC BABP的示例性结构示于图7中。
人源化抗LAG-3 sdAb AS20592VH10、AS20594VH10、AS20601VH4和AS20846VH12各自经由突变的人类IgG1(hIgG1)铰链作为接头或在无接头的情形下融合至PD1-BM-min的重链的N末端、重链的C末端、轻链的N末端或轻链的C末端以产生PD-1×LAG-3BABP。
PD-1×LAG-3 BABP的亲和力测定
如上文实施例3中所阐述评价示例性PD-1×LAG-3 BABP与人类PD-1或人类LAG-3的亲和力。结果汇总于表8中。
表8.PD-1×LAG-3 BABP的亲和力测定
Figure BDA0002675071240001661
靶细胞结合和配体抑制
如上文实施例3中所阐述评价示例性PD-1×LAG-3 BABP与CHO细胞上所表达的PD-1或LAG-3的结合亲和力和对配体结合至细胞(即PD-L1结合至CHO-PD-1细胞或LAG-3-Fc结合至表达MHC II的A375黑色素瘤细胞)的阻断。结果汇总于表9中。
表9.PD-1×LAG-3 BABP的结合和阻断数据
Figure BDA0002675071240001671
体外功能测定
通过基于PD-1细胞的报告基因测定(图17A)和LAG-3阻断报告基因测定(Promega，图17B)来分析示例性PD-1×LAG-3 BABP的体外活性。结果汇总于表10中。
表10.PD-1×LAG-3 BABP的体外功能测定
Figure BDA0002675071240001672
Figure BDA0002675071240001681
体内抗肿瘤功效
在具有人类PD-1和人类LAG-3双敲入的C57BL/6小鼠中所确立的同基因MC38结肠癌模型中评估BLP-4的体内抗肿瘤活性。动物在肿瘤大小达到大约120mm3时开始接受利用BLP-4、PD-BM-min、AS20846-Fc或者PD1-BM-min与AS20846-Fc的组合的治疗。使用IgG4作为阴性对照。尽管PD-1阻断在这种模型中有效，但在测试剂量下，单独的PD1-BM-min未能延迟7只小鼠中的2只中的肿瘤生长。相比之下，利用BLP-4以及PD1-BM-min与AS20846-Fc融合蛋白的组合的治疗在全部7只小鼠中均诱导肿瘤消退，这显示优于单独的PD-1阻断的功效(图18A和图18B)。
序列表
表11.抗LAG-3 sdAb SEQ ID NO
Figure BDA0002675071240001691
Figure BDA0002675071240001701
Figure BDA0002675071240001711
SEQ ID NO:267(AS20410 sdAb核酸序列)
CAGGTGCAACTGGCGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCATGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGTTTCTGAATATACCTTCAGTAGTGATTCTATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTGATAGTGATGGTAGCACAAGCTACGCAGGCTCCGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAAAGACAACGCCGAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGACAAGCCCTCTGTGGCTGCTATCCAGGCTCGACCCAGCTGACTTTGAATACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:268(AS20592 sdAb核酸序列)
GAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACATCATCAGTAGCTACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTGATAGTGATGGTGGCACAAGCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAACGCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGATTTTTGTTGGGTAGATGAGGATCGCCACCTCTATGAGTATAACTCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:269(AS20594 sdAb核酸序列)
CAGGTGCAGCTGGCGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACCATCAGTAGCTACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTGATAGTGATGGTAGCACAAGCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAACGCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGATTTTTGTTGGGTGGACGACTTCTATGAGTATAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:270(AS20601 sdAb核酸序列)
GAGGTGCAACTGGCGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACCTACGGTGGCTACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAACTATTAATAGTGATGGTAGCACAAACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAACGCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGCCCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGCGCGGTGGATCTCGCCCCATGTTGGGTAGCTGGTCCCATCGAGGCCGCTGACTTTGGTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:271(AS20846 sdAb核酸序列)
CAGGTGCACCTGATGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGTTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACCGTCAGTAGCTACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTGATAGTGATGGTAGCGTAAGTTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAACGCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTTCTGTGCGGCAGATCTTTGCTGGGTGGACCAGGACCAGGGAGAATATAACACCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:272(AS20916 sdAb核酸序列)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCAGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTGACTTTTGATGATTATGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCTCATGTATTAGCTGGAGTGGTGGTAGCACATACTATACCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGGCAGATTTGTTCTGTCCCCCACCTGATGATACTACGGGTTGGGGTATGGACCCTCCCGAGCATAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:273(AS21317 sdAb核酸序列)
CAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTTTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACCTTGAGTAGCTACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTGATAGTGATGGTAGCACAAGCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAACGCCAAGAACACTCTGTTTCTGCAAATGAACGGCCTGAAACCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGTGCTCCACTATGCTGGGTTGATTACCCATTGCCGTCGGGCCCATACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:274(AS20410 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
QVQLAESGGGSVHAGGSLRLSCVVSEYTFSSDSMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSTSYAGSVKGRFTISKDNAENTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSPLWLLSRLDPADFEYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:275(AS20592 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGGTSYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMDSLKPEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:276(AS20594 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
QVQLAESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:277(AS20601 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLAESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKEREGVATINSDGSTNYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLSPEDTAMYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:278(AS20846 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
QVHLMESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:279(AS20916 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGLTFDDYAMGWFRQAPGKEREGVSCISWSGGSTYYTDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAADLFCPPPDDTTGWGMDPPEHNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:280(AS21317 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTLSSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISKDNAKNTLFLQMNGLKPEDTAVYYCAPLCWVDYPLPSGPYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:281(AS20592M6 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSSGGTSYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMDSLKPEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYQSWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:282(AS20592VH4 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKGLEGVSAIDSDGGTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:283(AS20592VH5 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGGTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:284(AS20592VH6 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGGTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:285(AS20592VH7 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKGREGVAAIDSDGGTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:286(AS20592VH8 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGGTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:287(AS20592VH9 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGGTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:288(AS20592VH10 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGGTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:289(AS20592VH10M1 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSSGGTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:290(AS20594VH5 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:291(AS20594VH6 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:292(AS20594VH7 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKGREGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:293(AS20594VH8 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:294(AS20594VH9 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:295(AS20594VH10 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:296(AS20594VH10M1 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSSGSTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:297(AS20846VH4 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGLEGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:298(AS20846VH5 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGLEGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:299(AS20846VH6 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGSVSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:300(AS20846VH7 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGSVSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:301(AS20846VH8 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVAAIDSDGSVSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:302(AS20846VH9 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSVSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:303(AS20846VH10 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:304(AS20846VH12 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:305(AS20846VH12M1 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSSGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:306(AS20601VH4 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGLEGVSTINSDGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:307(AS20601VH4.M6 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGLEGVSTIASEGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:308(AS20601VH4.M7 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGLEGVSTIASSGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:309(AS20601VH11 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGREGVSTINSDGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:310(AS20601VH11.M6 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGREGVSTIASEGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:311(AS20601VH11.M7 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGREGVSTIASSGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:312(AS20410 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
QVQLAESGGGSVHAGGSLRLSCVVSEYTFSSDSMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSTSYAGSVKGRFTISKDNAENTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSPLWLLSRLDPADFEYWGQGTQVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:313(AS20592 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGGTSYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMDSLKPEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTQVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:314(AS20594 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
QVQLAESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTQVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:315(AS20601 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLAESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKEREGVATINSDGSTNYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLSPEDTAMYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTQVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:316(AS20846 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
QVHLMESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTQVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:317(AS20916 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGLTFDDYAMGWFRQAPGKEREGVSCISWSGGSTYYTDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAADLFCPPPDDTTGWGMDPPEHNYWGQGTQVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:318(AS21317 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTLSSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISKDNAKNTLFLQMNGLKPEDTAVYYCAPLCWVDYPLPSGPYWGQGTQVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:319(AS20592M6 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSSGGTSYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMDSLKPEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYQSWGQGTQVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:320(AS20592VH4 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:321(AS20592VH5 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:322(AS20592VH6 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:323(AS20592VH7 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:324(AS20592VH8 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:325(AS20592VH9 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:326(AS20592VH10 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:327(AS20592VH10M1 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:328(AS20594VH5 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:329(AS20594VH6 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:330(AS20594VH7 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:331(AS20594VH8 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:332(AS20594VH9 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:333(AS20594VH10 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:334(AS20594VH10M1 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:335(AS20846VH4 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:336(AS20846VH5 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:337(AS20846VH6 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:338(AS20846VH7 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:339(AS20846VH8 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:340(AS20846VH9 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:341(AS20846VH10 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:342(AS20846VH12 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:343(AS20846VH12M1 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSSGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:344(AS20601VH4 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
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SEQ ID NO:345(AS20601VH4.M6 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGLEGVSTIASEGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:346(AS20601VH4.M7 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGLEGVSTIASSGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:347(AS20601VH11 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGREGVSTINSDGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:348(AS20601VH11.M6 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGREGVSTIASEGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:349(AS20601VH11.M7 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGREGVSTIASSGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:350(人类LAG-3全长氨基酸序列)
VPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL
SEQ ID NO:351(人类LAG-3细胞外结构域氨基酸序列)
VPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHL
SEQ ID NO:352(人类IgG1铰链氨基酸序列)
EPKSSDKTHTCPPCP
SEQ ID NO:353(突变的人类IgG1铰链氨基酸序列)
EPKSSDKTHTSPPSP
SEQ ID NO:354(BMS-986016重链氨基酸序列)
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:355(BMS-986016轻链氨基酸序列)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:356(派姆单抗重链氨基酸序列)
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:357(派姆单抗轻链氨基酸序列)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:358(BLP-21重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPQVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:359(BLP-21轻链氨基酸序列)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:360(BLP-22重链氨基酸序列)
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:361(BLP-22轻链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:362(BLP-23重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGLEGVSTINSDGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPQVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:363(BLP-23轻链氨基酸序列)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:364(BLP-24重链氨基酸序列)
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:365(BLP-24轻链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGLEGVSTINSDGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:366(接头肽(9GS)氨基酸序列)
GGGGSGGGS
SEQ ID NO:367(接头肽氨基酸序列)
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:368(接头肽氨基酸序列，n为至少1的整数)
(G)n
SEQ ID NO:369(接头肽氨基酸序列，n为至少1的整数)
(GS)n
SEQ ID NO:370(接头肽氨基酸序列，n为至少1的整数)
(GSGGS)n
SEQ ID NO:371(接头肽氨基酸序列，n为至少1的整数)
(GGGS)n
SEQ ID NO:372(接头肽氨基酸序列，n为至少1的整数)
(GGGGS)n
SEQ ID NO:373(PD1-BM-min重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:374(PD1-BM-min轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:375(BLP-1重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGGTSYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMDSLKPEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:376(BLP-1轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:377(BLP-2重链氨基酸序列)
QVQLAESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:378(BLP-2轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:379(BLP-3重链氨基酸序列)
EVQLAESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKEREGVATINSDGSTNYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLSPEDTAMYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:380(BLP-3轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:381(BLP-4重链氨基酸序列)
QVHLMESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:382(BLP-4轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:383(BLP-5重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGGTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:384(BLP-5轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:385(BLP-6重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGGTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:386(BLP-6轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:387(BLP-7重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:388(BLP-7轻链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGGTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:389(BLP-8重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:390(BLP-8轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGGTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:391(BLP-9重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:392(BLP-9轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:393(BLP-10重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:394(BLP-10轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:395(BLP-11重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:396(BLP-11轻链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:397(BLP-12重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:398(BLP-12轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:399(BLP-13重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:400(BLP-13轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:401(BLP-14重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:402(BLP-14轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:403(BLP-15重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:404(BLP-15轻链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:405(BLP-16重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:406(BLP-16轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:407(BLP-17重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGLEGVSTINSDGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:408(BLP-17轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:409(BLP-18重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGLEGVSTINSDGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:410(BLP-18轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:411(BLP-19重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:412(BLP-19轻链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGLEGVSTINSDGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:413(BLP-20重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:414(BLP-20轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGLEGVSTINSDGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:415(BLP-25重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGGTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISP YYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:416(BLP-25轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:417(BLP-26重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:418(BLP-26轻链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGGTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:419(BLP-27重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTLVTVSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYY AMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:420(BLP-27轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:421(BLP-28重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:422(BLP-28轻链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTLVTVSSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKA SQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:423(BLP-29重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYY YAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:424(BLP-29轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:425(BLP-30重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:426(BLP-30轻链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCK ASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:427(BLP-31重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGLEGVSTINSDGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:428(BLP-31轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:429(BLP-32重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:430(BLP-32轻链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGLEGVSTINSDGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:431(BLP-33重链氨基酸序列)
EPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSD GGTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:432(BLP-33轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:433(BLP-34重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:434(BLP-34轻链氨基酸序列)
EPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSD GGTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAADFCWVDEDRHLYEYNSWGQGTLVTVSSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:435(BLP-35重链氨基酸序列)
EPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSD GSTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTLVTVSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:436(BLP-35轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:437(BLP-36重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:438(BLP-36轻链氨基酸序列)
EPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTISSYCMGWFRQAPGKGLEGVAAIDSD GSTSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADFCWVDDFYEYNYWGQGTLVTVSSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:439(BLP-37重链氨基酸序列)
EPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSD GSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:440(BLP-37轻链氨基酸序列)
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SEQ ID NO:441(BLP-38重链氨基酸序列)
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SEQ ID NO:442(BLP-38轻链氨基酸序列)
EPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSD GSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:443(BLP-39重链氨基酸序列)
EPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGLEGVSTINSD GSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:444(BLP-39轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:445(BLP-40重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:446(BLP-40轻链氨基酸序列)
EPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYGGYCMGWFRQAPGKGLEGVSTINSD GSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDLAPCWVAGPIEAADFGYWGQGTLVTVSSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVDTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
序列表
<110> 南京传奇生物科技有限公司(Nanjing Legend Biotech Co., Ltd.)
<120> 针对LAG-3的单结构域抗体及其用途
<130> 76142-20014.42
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> PCT/CN2018/081356
<151> 2018-03-30
<160> 446
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser
20 25
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Glu Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Gln Val His Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 10
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 11
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 12
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 13
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 14
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 15
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 16
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 17
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 18
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 19
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 20
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 21
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 22
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 24
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 25
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 30
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 31
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 32
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 38
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Gly Tyr Ile Ile Ser Ser Tyr Cys Met Gly
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Gly Tyr Ile Ile Ser Ser Tyr Cys Met Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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Gly Tyr
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<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 266
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 267
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tcctgtgtag tttctgaata taccttcagt agtgattcta tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcagct attgatagtg atggtagcac aagctacgca 180
ggctccgtga aggggcgatt caccatctcc aaagacaacg ccgagaacac tctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcgac aagccctctg 300
tggctgctat ccaggctcga cccagctgac tttgaatact ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 268
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 268
gaggtgcaac tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggata catcatcagt agctactgca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcagct attgatagtg atggtggcac aagctacgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc aaagacaacg ccaagaacac tctgtatctg 240
caaatggaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcggc agatttttgt 300
tgggtagatg aggatcgcca cctctatgag tataactcct ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 269
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 269
caggtgcagc tggcggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggata caccatcagt agctactgca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcagct attgatagtg atggtagcac aagctacgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc aaagacaacg ccaagaacac tctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcggc agatttttgt 300
tgggtggacg acttctatga gtataactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 270
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 270
gaggtgcaac tggcggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggata cacctacggt ggctactgca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcaact attaatagtg atggtagcac aaactacgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc aaagacaacg ccaagaacac tctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgagccc tgaggacact gccatgtact actgcgcggt ggatctcgcc 300
ccatgttggg tagctggtcc catcgaggcc gctgactttg gttactgggg ccaggggacc 360
caggtcaccg tctcctca 378
<210> 271
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 271
caggtgcacc tgatggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ttggagggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggata caccgtcagt agctactgca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcagct attgatagtg atggtagcgt aagttatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc aaagacaacg ccaagaacac tctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact tctgtgcggc agatctttgc 300
tgggtggacc aggaccaggg agaatataac acctggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 272
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 272
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg caggggggtc tctgagactc 60
tcctgtacag cctctggatt gacttttgat gattatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgaggg ggtctcatgt attagctgga gtggtggtag cacatactat 180
accgactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccatgt attactgtgc ggcagatttg 300
ttctgtcccc cacctgatga tactacgggt tggggtatgg accctcccga gcataactac 360
tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc tca 393
<210> 273
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 273
caggttcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactt 60
tcctgtgcag cctctggata caccttgagt agctactgca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcagct attgatagtg atggtagcac aagctacgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc aaagacaacg ccaagaacac tctgtttctg 240
caaatgaacg gcctgaaacc tgaggacact gcggtgtact actgtgctcc actatgctgg 300
gttgattacc cattgccgtc gggcccatac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 274
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 274
Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val His Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Glu Tyr Thr Phe Ser Ser Asp
20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Ser Pro Leu Trp Leu Leu Ser Arg Leu Asp Pro Ala Asp Phe Glu
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 275
<211> 124
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 275
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Ile Ser Ser Tyr
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Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Ile Ser Ser Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 297
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 298
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 301
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Tyr
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<220>
<223> 合成构建体
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Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Ser Val Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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<220>
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<400> 307
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Gly Gly Tyr
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Gly Gly Tyr
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 312
Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val His Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Glu Tyr Thr Phe Ser Ser Asp
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Lys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 313
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Ile Ser Ser Tyr
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Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
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Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
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Ala Asp Phe Cys Trp Val Asp Glu Asp Arg His Leu Tyr Glu Tyr Asn
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Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
165 170 175
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Lys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 314
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Ser Ser Tyr
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Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
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Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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195 200 205
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Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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260 265 270
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
275 280 285
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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340 345 350
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 315
Glu Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Gly Gly Tyr
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
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180 185 190
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195 200 205
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
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<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 316
Gln Val His Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly
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Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
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130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
165 170 175
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180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 317
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 318
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 319
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 320
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Lys
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 322
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<220>
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<400> 323
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<211> 353
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 324
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<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 326
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 328
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<220>
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<211> 351
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<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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<220>
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<220>
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<400> 349
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275 280 285
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
290 295 300
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
305 310 315 320
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
325 330 335
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Gly Lys
355
<210> 350
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 350
Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly
20 25 30
Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro
35 40 45
Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp
50 55 60
Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly
65 70 75 80
Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu
85 90 95
Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg
115 120 125
Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr
130 135 140
Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn
145 150 155 160
Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg
165 170 175
Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His
180 185 190
Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser
195 200 205
Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser
210 215 220
Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu
225 230 235 240
Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu
245 250 255
Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro
260 265 270
Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe
275 280 285
Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr
290 295 300
Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu
305 310 315 320
Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu
325 330 335
Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe
340 345 350
Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro
355 360 365
Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys
370 375 380
Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr
385 390 395 400
Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala
405 410 415
Leu Pro Ala Gly His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser
420 425 430
Leu Leu Leu Leu Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg
435 440 445
Gln Trp Arg Pro Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro
450 455 460
Pro Gln Ala Gln Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro
465 470 475 480
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln
485 490 495
Leu
<210> 351
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 351
Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly
20 25 30
Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro
35 40 45
Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp
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Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly
65 70 75 80
Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu
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Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg
115 120 125
Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr
130 135 140
Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn
145 150 155 160
Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg
165 170 175
Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His
180 185 190
Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser
195 200 205
Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser
210 215 220
Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu
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Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu
245 250 255
Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro
260 265 270
Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe
275 280 285
Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr
290 295 300
Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu
305 310 315 320
Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu
325 330 335
Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe
340 345 350
Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro
355 360 365
Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys
370 375 380
Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr
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Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala
405 410 415
Leu Pro Ala Gly His Leu
420
<210> 352
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 352
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 353
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 353
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro
1 5 10 15
<210> 354
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 354
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr
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Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys
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Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
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Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
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385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 355
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 355
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 356
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 356
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
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420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 357
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 357
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
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Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
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100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
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130 135 140
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195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 358
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 358
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Tyr
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Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asp Ser Asp Gly Ser Val Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Leu Cys Trp Val Asp Gln Asp Gln Gly Glu Tyr Asn Thr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp
115 120 125
Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser
130 135 140
Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys
145 150 155 160
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln
165 170 175
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn
180 185 190
Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr
195 200 205
Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln
210 215 220
Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe
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Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
245 250 255
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
260 265 270
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
275 280 285
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
290 295 300
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
325 330 335
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
340 345 350
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
355 360 365
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
370 375 380
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
385 390 395 400
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
405 410 415
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
420 425 430
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
450 455 460
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
465 470 475 480
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
485 490 495
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Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
580
<210> 359
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 359
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
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Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
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50 55 60
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Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
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115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 360
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 360
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
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245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
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385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 361
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 361
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asp Ser Asp Gly Ser Val Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Leu Cys Trp Val Asp Gln Asp Gln Gly Glu Tyr Asn Thr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp
115 120 125
Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala
180 185 190
Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
245 250 255
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
260 265 270
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
275 280 285
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
290 295 300
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
305 310 315 320
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
325 330 335
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
340 345 350
Gly Glu Cys
355
<210> 362
<211> 588
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 362
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Gly Gly Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Val Asp Leu Ala Pro Cys Trp Val Ala Gly Pro Ile Glu Ala Ala Asp
100 105 110
Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Gln Val Gln
130 135 140
Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
145 150 155 160
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met Tyr
165 170 175
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile
180 185 190
Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Asn Arg
195 200 205
Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr Met Glu Leu
210 215 220
Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg
225 230 235 240
Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
260 265 270
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
275 280 285
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
290 295 300
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
305 310 315 320
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
325 330 335
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
340 345 350
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
355 360 365
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
370 375 380
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
385 390 395 400
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
405 410 415
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
420 425 430
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
435 440 445
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
450 455 460
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
465 470 475 480
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
485 490 495
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
500 505 510
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
515 520 525
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
530 535 540
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
545 550 555 560
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
565 570 575
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
580 585
<210> 363
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 363
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 364
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 364
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 365
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 365
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Gly Gly Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Val Asp Leu Ala Pro Cys Trp Val Ala Gly Pro Ile Glu Ala Ala Asp
100 105 110
Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Glu Ile Val
130 135 140
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
145 150 155 160
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
180 185 190
Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
210 215 220
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Asp Leu Pro
225 230 235 240
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
245 250 255
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
260 265 270
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
275 280 285
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
290 295 300
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
305 310 315 320
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
325 330 335
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
340 345 350
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
355
<210> 366
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 366
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 367
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 367
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 368
<211> 1
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 可以至少1个重复序列存在
<400> 368
Gly
1
<210> 369
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(2)
<223> 可以至少1个重复序列存在
<400> 369
Gly Ser
1
<210> 370
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(5)
<223> 可以至少1个重复序列存在
<400> 370
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 371
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(4)
<223> 可以至少1个重复序列存在
<400> 371
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 372
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(5)
<223> 可以至少1个重复序列存在
<400> 372
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 373
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 373
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ile Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 374
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 374
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 375
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 375
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Phe Cys Trp Val Asp Glu Asp Arg His Leu Tyr Glu Tyr Asn
100 105 110
Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser
115 120 125
Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Glu Val Gln Leu Val
130 135 140
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
145 150 155 160
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr Asp Met Ala Trp Val
165 170 175
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile Ser Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr
195 200 205
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
210 215 220
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Ser Pro Tyr Tyr
225 230 235 240
Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245 250 255
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
260 265 270
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
275 280 285
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
290 295 300
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
305 310 315 320
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
325 330 335
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
340 345 350
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
355 360 365
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
370 375 380
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
385 390 395 400
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
405 410 415
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
420 425 430
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
435 440 445
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
450 455 460
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
465 470 475 480
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
485 490 495
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
500 505 510
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
515 520 525
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
530 535 540
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
545 550 555 560
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
565 570 575
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
580
<210> 376
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 376
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 377
<211> 580
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 377
Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
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Ala Asp Phe Cys Trp Val Asp Asp Phe Tyr Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly
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Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
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Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
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Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala
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Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile Ser Gly Gly Gly Ser
180 185 190
Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
210 215 220
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met
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Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
245 250 255
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
260 265 270
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
275 280 285
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
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Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
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Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
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Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
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Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
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Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
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Ser Leu Gly Lys
580
<210> 378
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 378
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 379
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Gly Gly Tyr
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<210> 380
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 380
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 381
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 381
Gln Val His Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Tyr
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Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
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Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
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Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
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Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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Leu Ser Leu Gly Lys
580
<210> 382
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 382
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Phe Pro Trp
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 383
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 383
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Ile Ser Ser Tyr
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Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
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Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
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Ala Asp Phe Cys Trp Val Asp Glu Asp Arg His Leu Tyr Glu Tyr Asn
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Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser
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Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Glu Val Gln Leu Val
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Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr Asp Met Ala Trp Val
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Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
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Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
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Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
580
<210> 384
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 384
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 385
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 385
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ile Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
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115 120 125
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
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Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
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Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Glu Pro Lys Ser
435 440 445
Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Glu Val Gln Leu Val
450 455 460
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
465 470 475 480
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Ile Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe
485 490 495
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Ser
500 505 510
Asp Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
515 520 525
Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
530 535 540
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Phe Cys Trp
545 550 555 560
Val Asp Glu Asp Arg His Leu Tyr Glu Tyr Asn Ser Trp Gly Gln Gly
565 570 575
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580
<210> 386
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 386
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Phe Pro Trp
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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<210> 387
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 387
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 388
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Ile Ser Ser Tyr
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325 330 335
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Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 389
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 390
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340 345 350
Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 391
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Ser Ser Tyr
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Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
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Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala
165 170 175
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195 200 205
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Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met
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Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
245 250 255
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
260 265 270
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
275 280 285
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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Ser Leu Gly Lys
580
<210> 392
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 392
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
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210
<210> 393
<211> 580
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 393
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
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Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
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275 280 285
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355 360 365
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485 490 495
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Ser
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515 520 525
Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
530 535 540
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Phe Cys Trp
545 550 555 560
Val Asp Asp Phe Tyr Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
565 570 575
Thr Val Ser Ser
580
<210> 394
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 394
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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165 170 175
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180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 395
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 395
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 396
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 396
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Ala Asp Phe Cys Trp Val Asp Asp Phe Tyr Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly
100 105 110
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Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys
145 150 155 160
Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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210 215 220
Gln Gln Tyr Ser Thr Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
245 250 255
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
260 265 270
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
275 280 285
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
290 295 300
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
305 310 315 320
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
325 330 335
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340 345 350
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 397
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Phe Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ile Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
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130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
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Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
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Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
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Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 398
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 398
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Phe Cys Trp Val Asp Asp Phe Tyr Glu
325 330 335
Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
340 345 350
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 399
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Tyr
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Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
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Ser Ala Ile Asp Ser Asp Gly Ser Val Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
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Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
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Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr Asp Met Ala Trp Val Arg Gln
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195 200 205
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Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
245 250 255
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
260 265 270
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
275 280 285
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
290 295 300
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
305 310 315 320
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr
325 330 335
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340 345 350
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
355 360 365
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
370 375 380
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
385 390 395 400
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
405 410 415
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
420 425 430
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
450 455 460
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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485 490 495
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
565 570 575
Leu Ser Leu Gly Lys
580
<210> 400
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 400
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
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210
<210> 401
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 401
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Phe Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ile Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
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115 120 125
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
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Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
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Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
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Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
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Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
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Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
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Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
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Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
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Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
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Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
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Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Glu Pro Lys Ser
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Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Glu Val Gln Leu Val
450 455 460
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
465 470 475 480
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe
485 490 495
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val Ser Ala Ile Asp Ser
500 505 510
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515 520 525
Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
530 535 540
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580
<210> 402
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 402
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Phe Pro Trp
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100 105 110
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130 135 140
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 403
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 403
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr
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245 250 255
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Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
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355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
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385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 404
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 404
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His
180 185 190
Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
325 330 335
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340 345 350
<210> 405
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 405
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ile Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
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Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
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340 345 350
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355 360 365
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Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
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Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 406
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 406
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Ser Pro Pro Ser Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
225 230 235 240
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
245 250 255
Thr Val Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
260 265 270
Gly Arg Glu Gly Val Ser Ala Ile Asp Ser Asp Gly Ser Val Ser Tyr
275 280 285
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys
290 295 300
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305 310 315 320
Val Tyr Phe Cys Ala Ala Asp Leu Cys Trp Val Asp Gln Asp Gln Gly
325 330 335
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340 345 350
<210> 407
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 407
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Gly Gly Tyr
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Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
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Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr Asp Met Ala
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Ser Gly Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg
195 200 205
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Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Ser Pro
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275 280 285
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
580 585
<210> 408
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 408
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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210
<210> 409
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 409
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1 5 10 15
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Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Glu Pro Lys Ser
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450 455 460
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
465 470 475 480
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Gly Gly Tyr Cys Met Gly Trp Phe
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val Asp Leu Ala Pro
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Cys Trp Val Ala Gly Pro Ile Glu Ala Ala Asp Phe Gly Tyr Trp Gly
565 570 575
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580 585
<210> 410
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 410
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
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50 55 60
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
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195 200 205
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210
<210> 411
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 411
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr
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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
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<210> 412
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 412
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355
<210> 413
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 413
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
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385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 414
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 414
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
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Ser Pro Pro Ser Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
245 250 255
Thr Tyr Gly Gly Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
260 265 270
Gly Leu Glu Gly Val Ser Thr Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Asn Tyr
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Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
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Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
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Val Tyr Tyr Cys Ala Val Asp Leu Ala Pro Cys Trp Val Ala Gly Pro
325 330 335
Ile Glu Ala Ala Asp Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
340 345 350
Val Ser Ser
355
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 415
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Ile Ser Ser Tyr
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50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr Asp Met Ala Trp
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Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile Ser
165 170 175
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195 200 205
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Ser Pro Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
245 250 255
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
260 265 270
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
275 280 285
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
290 295 300
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
305 310 315 320
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
325 330 335
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
340 345 350
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565
<210> 416
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 416
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 418
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Ile Ser Ser Tyr
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 419
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565
<210> 420
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 420
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210
<210> 421
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<223> 合成构建体
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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
370 375 380
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
385 390 395 400
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
405 410 415
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
420 425 430
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
435 440 445
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
450 455 460
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465 470 475 480
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
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500 505 510
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
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Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
530 535 540
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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565
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 424
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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<400> 425
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100 105 110
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115 120 125
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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
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355 360 365
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 427
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<210> 428
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 428
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 429
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 429
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 430
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 431
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275 280 285
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565 570 575
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
580
<210> 432
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 432
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 433
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 433
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1 5 10 15
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
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Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
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Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
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Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 434
<211> 353
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 434
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130 135 140
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145 150 155 160
Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr
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195 200 205
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260 265 270
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Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
290 295 300
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305 310 315 320
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
325 330 335
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
340 345 350
Cys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 435
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130 135 140
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Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala
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260 265 270
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
275 280 285
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305 310 315 320
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 436
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<210> 437
<211> 444
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 437
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 438
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340 345 350
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 439
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1 5 10 15
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Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
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Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ala
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Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
245 250 255
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260 265 270
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
275 280 285
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
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325 330 335
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450 455 460
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
485 490 495
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
515 520 525
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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<210> 440
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 440
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 441
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 441
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr
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100 105 110
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130 135 140
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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
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195 200 205
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245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
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275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 442
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 442
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Glu
1 5 10 15
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Tyr Cys
35 40 45
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
85 90 95
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100 105 110
Asp Leu Cys Trp Val Asp Gln Asp Gln Gly Glu Tyr Asn Thr Trp Gly
115 120 125
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165 170 175
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Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
245 250 255
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
260 265 270
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
275 280 285
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
290 295 300
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
305 310 315 320
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
325 330 335
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340 345 350
<210> 443
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 443
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Glu
1 5 10 15
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Gly Gly Tyr Cys
35 40 45
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ser
50 55 60
Thr Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
65 70 75 80
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
85 90 95
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val
100 105 110
Asp Leu Ala Pro Cys Trp Val Ala Gly Pro Ile Glu Ala Ala Asp Phe
115 120 125
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Val Gln
130 135 140
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
145 150 155 160
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr Asp Met Ala
165 170 175
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile
180 185 190
Ser Gly Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg
195 200 205
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
210 215 220
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Ser Pro
225 230 235 240
Tyr Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
245 250 255
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
260 265 270
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
275 280 285
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
290 295 300
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
305 310 315 320
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
325 330 335
Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
340 345 350
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
355 360 365
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
370 375 380
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
385 390 395 400
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
405 410 415
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
420 425 430
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
435 440 445
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
450 455 460
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
465 470 475 480
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
485 490 495
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
500 505 510
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
515 520 525
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
530 535 540
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
545 550 555 560
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
565 570 575
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
580 585
<210> 444
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 444
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 445
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 445
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ile Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 446
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 446
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Glu
1 5 10 15
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Gly Gly Tyr Cys
35 40 45
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ser
50 55 60
Thr Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
65 70 75 80
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
85 90 95
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val
100 105 110
Asp Leu Ala Pro Cys Trp Val Ala Gly Pro Ile Glu Ala Ala Asp Phe
115 120 125
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala Val Ala Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala
180 185 190
Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210 215 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Phe Pro Trp Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
245 250 255
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
260 265 270
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
275 280 285
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
290 295 300
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
305 310 315 320
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
325 330 335
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
340 345 350
Gly Glu Cys
355

Claims (44)

1.一种经分离的抗LAG-3构建体，所述经分离的抗LAG-3构建体包含特异性识别LAG-3的单结构域抗体(sdAb)，其中所述sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体。
2.如权利要求1所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述sdAb包含以下各物：包含SEQID NO:39-76中的任一者的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:115-152中的任一者的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:191-228中的任一者的氨基酸序列的CDR3；或所述CDR的在CDR区中包含至多约3个氨基酸取代的变体。
3.如权利要求1或2所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述sdAb包含以下中的任一者：
(1)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQID NO:191的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(2)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQID NO:192的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(3)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQID NO:193的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(4)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQID NO:194的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(5)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQID NO:195的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(6)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQID NO:196的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(7)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQID NO:197的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(8)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQID NO:198的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(9)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQID NO:206的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(10)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(11)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(12)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；或
(13)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR1或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的CDR2或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的CDR3或其包含至多约3个氨基酸取代的变体。
4.如权利要求1-3中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述sdAb包含以下中的任一者：
(1)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的CDR3；
(2)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的CDR3；
(3)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的CDR3；
(4)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的CDR3；
(5)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的CDR3；
(6)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的CDR3；
(7)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的CDR3；
(8)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的CDR3；
(9)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的CDR3；
(10)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的CDR3；
(11)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的CDR3；
(12)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列的CDR3；或
(13)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的CDR2；和包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的CDR3。
5.如权利要求1-4中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述sdAb包括包含以下的VHH结构域：
(1)包含SEQ ID NO:1-38中的任一者的氨基酸序列的FR1；
(2)包含SEQ ID NO:77-114中的任一者的氨基酸序列的FR2；
(3)包含SEQ ID NO:153-190中的任一者的氨基酸序列的FR3；和
(4)包含SEQ ID NO:229-266中的任一者的氨基酸序列的FR4。
6.如权利要求1-5中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述sdAb包含以下各物：包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域，或其与SEQ ID NO:274-311中的任一者具有至少约80％序列同一性的变体。
7.如权利要求6所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述sdAb包含以下各物：包含SEQID NO:274-311中的任一者的氨基酸序列的VHH结构域，或其在所述VHH结构域中包含至多约3个氨基酸取代的变体。
8.如权利要求1-7中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-7M至约10-12M。
9.如权利要求8所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述sdAb与LAG-3之间结合的KD为约10-9M至约10-11M。
10.如权利要求1-9中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述sdAb与来自非人类哺乳动物的LAG-3交叉反应。
11.如权利要求1-10中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中特异性识别LAG-3的所述sdAb是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
12.如权利要求1-11中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述经分离的抗LAG-3构建体是仅重链抗体(HCAb)，其包含与Fc片段融合的特异性识别LAG-3的所述sdAb。
13.如权利要求12所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述HCAb是单体或二聚的。
14.如权利要求12或13所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述Fc片段是人类IgG1(hIgG1)Fc、无效应物hIgG1 Fc、hIgG4 Fc或hIgG4 Fc(S228P)。
15.如权利要求12-14中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述sdAb经由肽接头与所述Fc片段融合。
16.如权利要求15所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述肽接头包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。
17.如权利要求12-16中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述HCAb包含SEQID NO:312-349中的任一者的氨基酸序列。
18.如权利要求1-11中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体，所述经分离的抗LAG-3构建体包含：(a)第一抗原结合部分，其包含特异性识别LAG-3的所述sdAb；和(b)第二抗原结合部分，其特异性识别第二表位。
19.如权利要求18所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述第二抗原结合部分包含全长抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、单链Fv(scFv)、scFv-scFv、微小抗体、双链抗体或第二sdAb。
20.如权利要求18或19所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述抗LAG-3构建体是多特异性的。
21.如权利要求18-20中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分经由肽接头彼此融合。
22.如权利要求21所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述肽接头包含SEQ ID NO:352-353和366-372中的任一者的氨基酸序列。
23.如权利要求18-22中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述第二抗原结合部分包含由两条重链和两条轻链组成的全长抗体。
24.如权利要求23所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述全长抗体的所述Fc片段是人类IgG1(hIgG1)Fc、无效应物hIgG1 Fc、hIgG4 Fc或hIgG4 Fc(S228P)。
25.如权利要求23或24所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中特异性识别LAG-3的所述sdAb的N末端与所述全长抗体的重链的C末端融合。
26.如权利要求23或24所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中特异性识别LAG-3的所述sdAb的C末端与所述全长抗体的重链的N末端融合。
27.如权利要求23或24所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中特异性识别LAG-3的所述sdAb的N末端与所述全长抗体的轻链的C末端融合。
28.如权利要求23或24所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中特异性识别LAG-3的所述sdAb的C末端与所述全长抗体的轻链的N末端融合。
29.如权利要求18-28中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述第二抗原结合部分特异性识别选自由以下组成的组的免疫检查点分子：PD-1、4-1BB、PD-L1、TIM-3、TIGIT、CTLA-4、VISTA、B7-1、B7-H3、CD47、OX40和GITR。
30.如权利要求29所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述第二抗原结合部分特异性识别PD-1。
31.如权利要求30所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述第二抗原结合部分包含：
(i)包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，和包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；或
(ii)包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，和包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
32.如权利要求30所述的经分离的抗LAG-3构建体，其中所述第二抗原结合部分是包含以下的全长抗体：
(i)包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的轻链；或
(ii)包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的轻链。
33.一种经分离的抗LAG-3构建体，所述经分离的抗LAG-3构建体包含特异性识别LAG-3的sdAb，其中所述sdAb包含SEQ ID NO:274-311中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3。
34.一种经分离的抗LAG-3构建体，所述经分离的抗LAG-3构建体与如权利要求1-33中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体竞争性地特异性结合至LAG-3。
35.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-34中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体和药学上可接受的载体。
36.一种治疗患有LAG-3相关疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求35所述的药物组合物。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述LAG-3相关疾病是癌症。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中所述个体是人类。
40.一种经分离的核酸，所述经分离的核酸编码如权利要求1-34中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体。
41.一种载体，所述载体包含如权利要求40所述的经分离的核酸。
42.一种经分离的宿主细胞，所述经分离的宿主细胞包含如权利要求40所述的经分离的核酸或如权利要求41所述的载体。
43.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1-34中任一项所述的经分离的抗LAG-3构建体、如权利要求35所述的药物组合物、如权利要求40所述的经分离的核酸、如权利要求41所述的载体或如权利要求42所述的经分离的宿主细胞。
44.一种产生抗LAG-3构建体的方法，所述方法包括：(a)在有效表达所编码的抗LAG-3构建体的条件下培养如权利要求42所述的经分离的宿主细胞；以及(b)从所述宿主细胞获得所表达的抗LAG-3构建体。
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