KR102461837B1 - Cd80 세포외도메인 및 항 lag3 항체 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CD80의 세포외도메인 및 항 LAG3 항체의 scFv를 포함하는 융합단백질 이량체에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 이량체에서 CD80은 T 세포의 CTLA-4와 결합하여 T 세포의 활성을 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질 이량체에서 항 LAG3 항체의 scFv는 LAG3와 결합하여 LAG3가 MHCII와의 결합을 조절할 수 있다. 따라서, CD80 및 항 LAG3 항체의 scFv를 포함한 융합단백질 이량체가 면역세포를 효과적으로 활성화시킴을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 융합단백질 이량체는 항암제로 이용 가능하여 산업적으로 활용 가능성이 높다.

Description

CD80 세포외도메인 및 항 LAG3 항체 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도{FUSION PROTEIN COMPRISING EXTRACELLULAR DOMAIN OF CD80 AND ANTI-LAG3 ANTIBODY FRAGMENTS AND USE THEREOF}

본 발명은 CD80 세포외도메인 및 항 LAG3 항체의 scFv를 포함하는 융합단백질 이량체 및 이를 이용한 암 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.

암 면역요법(cancer immunotherapy)은 체내 면역 작용을 이용하여 암을 치료하는 방법이다. 암 면역요법은 면역계가 암 세포 표면 단백질과 같은 항원들을 표적으로 이용하여 암 세포를 공격하도록 유발할 수 있다. 특히, 면역 체크포인트 경로의 차단을 통해 항암 면역을 활성화시킬 수 있다는 점이 보고되었다. 면역 체크포인트는 종양 세포가 면역 회피를 초래하는 주요 메커니즘 중 하나이다. 따라서, 면역 체크포인트의 저해 또는 차단은 T 세포 활성화를 증가시킬 수 있고, 이에 의해 항-종양 면역을 강화할 수 있다.

한편, CD80은 B7-1로 알려져 있으며, 리간드와 결합하여 공동자극 반응(costimulatory responses) 및 공동억제 반응(coinhibitory responses)을 전달하여 면역 조절에 관여하는 막 단백질(membrane-bound proteins) 중 B7 패밀리의 하나이다. CD80은 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 단핵구(monocyte)의 표면에 발현하는 막관통 단백질이다. CD80은 CD28, CTLA-4(CD152) 및 PD-L1에 결합하는 것으로 알려져 있다. CD80, CD86, CTLA-4 및 CD28은 공동자극-공동억제 시스템에 관여한다. 예를 들어, T 세포의 활성을 조절하고, 증식, 분화 및 생존에 관여한다.

예를 들어, CD80 및 CD86이 CD28과 상호작용을 하게 되면, 공동자극 신호가 발생하여 T 세포를 활성화시킨다. 결국, CD80은 활성화된 T 세포 표면에 발현된 CTLA-4와 결합하고, CTLA-4를 상향조절하도록 자극하게 된다. 그 결과, CD80/CD28 상호작용에 의한 면역 반응 작동 전에, CD80은 T 세포의 반응을 억제하게 된다. 이러한 피드백 회로(feedback loop)는 면역 반응을 세밀하게 조절하게 한다.

한편, LAG3는 PD-1과 유사한 기전을 가진다고 알려져 있다. 따라서, LAG3는 T 세포 및 NK 세포에서 발현하는 면역관문 수용체로 CD4와 구조가 비슷하지만 D1 도메인에 30개의 추가적인 아미노산을 가지고 있어 MHC class Ⅱ와 친화성이 높다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

특허문헌 1. 한국공개특허공보 제10-2021-0117220호

비특허문헌 1. Abstract 4547: Characterization of the LAG-3 targeting antibody BI 754111 in monotherapy and in combination with the anti-PD-1 antibody BI 754091(DOI: 10.1158/1538-7445.AM2018-4547) 비특허문헌 2. LAG-3: from molecular functions to clinical applications(Maruhashi T, et al. J Immunother Cancer 2020;8:e001014. doi:10.1136/jitc-2020-001014)

이에 본 발명자들은 면역세포의 활성을 증진시키는 새로운 조합의 융합단백질을 개발하기 위해 연구한 결과, CD80 세포외도메인과 항 LAG3 항체의 단편을 포함한 융합단백질 이량체가 면역세포를 효과적으로 활성화시킴을 확인하였다. 이를 기반으로, 상기 융합단백질 이량체가 항암제로 효과가 있다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은, CD80 세포외도메인 및 항 LAG3 항체의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질 이량체 및 이의 약학적 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 CD80 세포외도메인 및 항 LAG3 항체의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체는 CD80을 포함하고 있어 CTLA-4와 결합할 수 있다. CTLA-4와 결합을 통해, T 세포를 조절할 수 있다. 또한, LAG3는 T 세포 및 NK 세포에서 발현하는 면역관문 수용체로 MHC class II와 친화성이 높다. 따라서, 상기 융합단백질 이량체의 항 LAG3 항체의 단편은 LAG3와 MHCII의 결합을 조절할 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질 이량체는 면역세포의 활성을 효과적으로 조절할 수 있어, 항암제로 활용이 가능하다.

도 1은 일 실시예인 hCD80-hIgG4 Fc-anti-LAG3 scFv 이량체(GI-105)의 구조를 도식화한 것이다.
도 2는 GI-105를 생산한 후 이를 SDS-PAGE로 확인한 그림이다.
도 3은 GI-105를 생산한 후 이를 웨스턴 블랏으로 확인한 그림이다.
도 4a는 GI-105가 CTLA-4에 미치는 작용 기전을 도식화한 것이다.
도 4b는 CTLA-4 blockade assay를 통해 GI-105가 T 세포 기능에 미치는 영향을 확인한 도면이다.
도 5a는 GI-105가 MHCII에 미치는 작용 기전을 도식화한 것이다.
도 5b는 LAG3 blockade assay를 통해 GI-105가 T 세포 기능에 미치는 영향을 확인한 도면이다.
도 6은 마우스 유래 대장암세포주 식립 마우스에서 비이클 투여군(G1), 항 LAG-3 항체 투여군(G2), CD80-Fc 투여군(G3), 항 LAG-3 항체 + CD80-Fc 병용투여군(G4) 및 GI-105 투여군(G5) 각각의 인 비보 항종양 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7a는 도 6의 비이클 투여군(G1)에 대한 각 개체들의 종양부피를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 도 6의 항 LAG-3 항체 투여군(G2)에 대한 각 개체들의 종양부피를 나타낸 그래프이다.
도 7c는 도 6의 CD80-Fc 투여군(G3)에 대한 각 개체들의 종양부피를 나타낸 그래프이다.
도 7d는 도 6의 항 LAG-3 항체 및 CD80-Fc 병용투여군(G4)에 대한 각 개체들의 종양부피를 나타낸 그래프이다.
도 7e는 도 6의 GI-105 투여군(G5)에 대한 각 개체들의 종양부피를 나타낸 그래프이다.
도 8a는 PD-L1이 과발현된 마우스 유래 대장암 세포주 식립 마우스에서 GI-105 및 항 PD-1 항체 병용 투여에 따른 종양 성장 그래프이다.
도 8b는 PD-L1이 과발현된 마우스 유래 대장암 세포주 식립 마우스에서 GI-105 및 항 PD-1 항체 병용 투여에 따른 마우스 체중 변화를 나타낸 그래프이다.

CD80 세포외도메인 및 항-LAG3 항체의 단편을 포함하는 융합단백질

본 발명의 일 측면은, CD80 단백질 또는 이의 단편 및 항 LAG3 항체의 단편을 포함하는 융합단백질을 제공한다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "CD80"은 "B7-1"로도 불리며, 수지상세포, 활성화된 B 세포 및 단핵구에 존재하는 막단백질이다. CD80은 T 세포의 활성화와 생존에 필수적인 공자극 신호를 제공한다. CD80은 T 세포 표면에 존재하는 서로 다른 두 단백질인 CD28 및 CTLA-4에 대한 리간드로 알려져 있다. CD80은 288개의 아미노산으로 구성되어 있다. 또한, 본 명세서에서 "CD80 단백질"은 전장 CD80 또는 CD80 의 기능적 일부 단편을 의미한다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "CD80의 기능적 일부 단편"이란, CD80의 전장 단백질에서 일부 아미노산 잔기가 삭제된 절편으로서 그 본연의 생물학적 활성 및 기능을 유지하는 전장 단백질의 유사체를 의미하며, 구체적으로는 T 세포의 활성화를 위한 공자극 신호를 전달할 수 있는 CD80의 최소한의 절편(fragment)을 의미한다. 예를 들어, 상기 CD80의 기능적 일부 단편은 CD80의 세포외도메인 또는 이를 포함하는 전장 CD80 단백질의 일부 절편일 수 있다. CD80의 기능적 일부 단편의 일 구체예로는 CD80의 신호서열인 N-말단으로부터 1번째 내지 34번째 아미노산의 전부 또는 일부가 제외된 것일 수 있다. 상기 일 실시예로 CD80 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 명세서에서 사용한 용어, "LAG3"는 CD223 또는 림프구 활성화 유전자 3(Lymphocyte activation gene 3)으로 불린다. 상기 단백질은 LAG3 유전자에 의해 코딩된다. LAG3는 PD-1과 유사한 기전을 가진다고 알려져 있다. 또한, LAG3는 T 세포 및 NK 세포에서 발현하는 면역관문 수용체로 CD4와 구조가 비슷하지만 D1 도메인에 30개의 추가적인 아미노산을 가지고 있어 MHC class Ⅱ와 친화성이 높다. 이러한 구조적 특성 때문에 LAG3 또한 T 세포 활성화를 억제시킨다고 알려져 있다. LAG3는 암치료에 있어서 유망한 표적으로 주목받고 있으나, 신호전달 메커니즘이 아직 명확하지 않고 항 LAG3 항체를 이용한 단독 요법으로는 항암 효능이 크지 않거나 거의 없는 것으로 보고되고 있다(Maruhashi T, et al. J Immunother Cancer 2020;8:e001014).

본 발명에서 항 LAG3 항체는 상기 LAG3에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 또한, 항체의 항원 결합 단편은 LAG3에 특이적으로 결합할 수 있는 항원결합도메인을 포함하는 한 어떠한 형태로도 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어“항원 결합 단편(antigen binding fragment)”은 면역글로불린 전체 구조 중 항원이 결합할 수 있는 폴리펩티드의 일부를 의미하며, 예를 들어 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 및 scFv를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어, "특이적으로 결합(specifically binding)" 은 "특이적으로 인식(specifically recognizing)"과 동일한 의미로서, 항원과 항체(또는 이의 단편)가 면역학적 반응을 통해 특이적으로 상호작용하는 것을 의미한다.

항 LAG3 항체는 서열번호 13의 HCDR1, 서열번호 14의 HCDR2 및 서열번호 15의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 가질 수 있다. 또한, 항 LAG3 항체는 서열번호 16의 LCDR1, 서열번호 17의 LCDR2 및 서열번호 18의 HCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 가질 수 있다. 또한, 상기 항 LAG3 항체 단편은 scFv 형태일 수 있다. 본 명세서에서 사용한 용어, scFv는 single chain variable fragment의 약자로서, 중쇄가변영역과 경쇄가변영역이 펩타이드 링커로 연결된 형태를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서 사용한 항 LAG3 항체의 scFv의 중쇄가변영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 항 LAG3 항체의 scFv의 경쇄가변영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 중쇄가변영역과 경쇄가변영역을 연결하는 펩타이드 링커의 일 실시예는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서 사용한 항 LAG3 항체의 scFv는 서열번호 6의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

이때, 상기 융합단백질은 면역글로불린 Fc 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CH1)은 포함하지 않는 단백질을 의미한다. 상기 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM일 수 있으며, 바람직하게는 IgG4일 수 있다.

또한, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인뿐만 아니라, Fc 도메인 변이체일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄 형태(glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 도메인에 비해 증가된 당쇄, 야생형 Fc 도메인에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거(deglycosylated)된 형태일 수 있다. 또한, 무당쇄(aglycosylated) Fc 도메인도 포함된다. Fc 도메인 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 조정된 숫자의 시알산(sialic acid), 퓨코실화(fucosylation), 당화(glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.

또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 도메인의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 상기 Fc 도메인의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 상기 Fc 도메인 변이체의 일 구체예로는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 융합단백질은 하기 구조식 (1)로 이루어진 것일 수 있다:

N'-X-[링커(1)]o - Z - [링커(2)]p- Y -C' (1)

상기 구조식 (1)에 있어서,

상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고;

상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며;

상기 X는 CD80 단백질 또는 이의 기능적 일부 단편이고;

상기 Y는 항 LAG3 항체의 항원 결합 단편이며;

상기 Z는 Fc 영역 단편 또는 이의 변이체이고;

상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이며;

상기 o 및 p는 각각 독립적으로, O 또는 1이다.

이때, CD80, 이의 기능적 일부 및 항 LAG3 항체의 항원 결합 단편은 상술한 바와 같다.

이때, 상기 펩타이드 링커(1)은 5 내지 80개의 연속된 아미노산, 20 내지 60개의 연속된 아미노산, 또는 25 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 30 내지 40개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 펩타이드 링커(1)은 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커(1)은 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 하나, 두 개 또는 세 개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(1)는 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커(1)이 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.

상기 펩타이드 링커(2)는 1 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 5 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(2)는 (G4S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수) 일 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 또한, 펩타이드 링커(2)는 C말단에 추가적으로 아미노산 Gly을 더 포함할 수 있다. 일 실시예로, 상기 펩타이드 링커(2)가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.

상기 융합단백질의 각각의 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 또한, 상기 융합단백질은 일 구체예로서 서열번호 10의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

구분	아미노산 서열	서열번호
mIgG signal	MEWSWVFLFFLSVTTGVHS	1
hCD80 ECD	VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDN	2
NL028 hinge linker	GSGGGGSGGGGSGGGGSA ESKYGPPCPPCP	3
F01 (hIgG4 Fc)	APEAAGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSLG	4
(G4S)2GG linker	GGGGSGGGGSGG	5
Anti-hLAG3 scFv	QVQLVQSGGDLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDHYMNWIRQAPGKCLEWVAYIDTSATYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNWGSLDYWGQGALVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS DIQMTQSPSSLSPSVGDRVTITCQASQEISIYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYITPYTFGCGTKLDIK	6
Variable heavy chain of Anti-hLAG3 scFv	QVQLVQSGGDLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDHYMNWIRQAPGKCLEWVAYIDTSATYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNWGSLDYWGQGALVTVSS	7
linker	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS	8
Variable Light chain of Anti-hLAG3 scFv	DIQMTQSPSSLSPSVGDRVTITCQASQEISIYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYITPYTFGCGTKLDIK	9
hCD80-Fc-anti-LAG3 scFv	VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDNGSGGGGSGGGGSGGGGSA ESKYGPPCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGQVQLVQSGGDLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDHYMNWIRQAPGKCLEWVAYIDTSATYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNWGSLDYWGQGALVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSPSVGDRVTITCQASQEISIYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYITPYTFGCGTKLDIK	10

구분	핵산 서열	서열번호
Gene coding hCD80-Fc-anti-LAG3 scFv with signal peptide	ATGGAATGGTCCTGGGTGTTCCTGTTCTTCCTGTCCGTGACCACCGGCGTGCACTCTGTGATCCACGTGACCAAAGAAGTGAAAGAGGTCGCCACACTGTCCTGCGGCCACAATGTGTCCGTGGAAGAACTGGCCCAGACCAGAATCTACTGGCAGAAAGAAAAGAAAATGGTGCTGACCATGATGTCCGGCGACATGAACATCTGGCCCGAGTACAAGAACCGGACCATCTTCGACATCACCAACAACCTGTCCATCGTGATCCTGGCTCTGCGGCCTTCTGATGAGGGCACCTATGAGTGCGTGGTGCTGAAGTACGAGAAGGACGCCTTCAAGCGCGAGCACCTGGCTGAAGTGACCCTGTCTGTGAAGGCCGACTTTCCCACACCTTCCATCTCCGACTTCGAGATCCCCACCTCTAACATCCGGCGGATCATCTGCTCTACCTCCGGCGGCTTTCCTGAGCCTCATCTGTCCTGGCTGGAAAACGGCGAGGAACTGAACGCCATCAACACCACCGTGTCTCAGGACCCCGAGACAGAGCTGTACGCCGTGTCCTCTAAGCTGGACTTCAATATGACCACCAACCACAGCTTCATGTGCCTGATTAAGTACGGCCACCTGAGAGTGAACCAGACCTTCAACTGGAACACCACCAAGCAAGAGCACTTCCCCGACAACGGATCTGGCGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGAAGCGGTGGCGGAGGATCTGCTGAGTCTAAGTATGGCCCTCCTTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAAGCTGCTGGCGGGCCCTCCGTGTTTCTGTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACCAGCTGATGATCTCTCGGACACCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCTCAAGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACCCTGCCTCCAAGCCAAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGACATTGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTTCTGTACTCCCGCCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAAGAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCTGTGCTGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCCCTCAGCCTGTCCCTTGGCGGAGGCGGTGGATCAGGTGGCGGAGGATCTGGCGGACAGGTTCAGTTGGTTCAGTCTGGCGGCGACCTGGTTAAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCTCCTTCTCCGACCACTACATGAACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAATGCCTGGAATGGGTCGCCTACATCGATACCTCCGCCACCTACATCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTCCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGATAACTGGGGCTCCCTGGATTATTGGGGCCAGGGCGCTCTGGTCACAGTGTCCTCTGGAGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGATCAGGCGGTGGTGGATCTGGCGGAGGCGGTTCTGACATTCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGAGCCCATCCGTGGGCGACAGAGTGACCATTACCTGCCAGGCCAGCCAAGAGATCTCCATCTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGACGCCTCCAATCTGGAAACAGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTTACCCTGACCATCTCCAGCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGACCTACATCACCCCTTACACCTTTGGCTGCGGCACCAAGCTGGACATCAAGTAATAA	11

융합단백질 이량체

본 발명의 또 다른 측면은, 상술한 융합단백질이 두 개가 결합된 융합단백질 이량체를 제공한다. 이때, 상기 융합단백질은 CD80 세포외도메인과 면역글로불린 Fc 영역을 연결하는 링커에 포함된 시스테인에 의해 결합될 수 있다. 이때, 상기 링커는 면역글로불린의 힌지 영역을 포함할 수 있다.

융합단백질의 용도

본 발명의 또 다른 측면으로, 상기 융합단백질 이량체를 포함하는 면역 증진제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면으로, 상기 융합단백질 이량체를 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "암"은 정상인 조직세포가 어떤 원인으로 무제한 증식하여 그 생체의 생활현상이나 주위의 조직상태 등에 관계없이 급속한 발육을 계속하는 질환으로 구분되며, 본 발명에서의 암은 인체의 각종 암, 예컨대 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 암일 수 있으나, 상기 종류에 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명의 목적상 방사선에 저항성을 가지는 암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학적 조성물에 포함될 수 있다.

구체적으로, 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

상기 약학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 용어 "개체"란 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 1일 0.01 ㎍/㎏ 내지 10 g/㎏ 범위, 또는 0.01 ㎎/㎏ 내지 1 g/㎏ 범위로 투여할 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상술한 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 상기 배양액으로부터 상술한 융합단백질 이량체를 수득하는 단계를 포함하는 CD80 또는 이의 단편 및 항 LAG3 항체의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체를 제조하는 방법을 제공한다.

병용 요법

본 발명의 또 다른 측면은, 상술한 융합단백질 이량체 및 PD-1 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

PD-1 억제제

본 명세서에서 사용한 용어, “PD-1”은 활성화된 T세포의 표면에 있는 단백질로 B7 protein family의 member인 PD-L1에 결합하며 T 세포의 증식과 발현을 억제하는 음성 조절 시그널링 기전을 활성화한다. 또한, 상기 PD-1은 Programmed cell death protein 1(PD-1 또는 CD279)이라고도 지칭되기도 한다. 지금까지 동정된 PD-1 서열은 PD-L1(B7-H1) 및 PD-L2(B7-DC)과 반응하여 TCR 및 CD28로 매개된 T 세포 활성, 성장 인자 및 IL-2 또는 IFN-γ와 같은 사이토카인을 억제 및 음성 신호전달을 유도한다고 보고되었다.

인간 PD-1 유전자는 288개의 아미노산 잔기의 전체 단백질을 코딩하며(NCBI accession NP_005009.2), PD-1이 세포 표면에 발현된 후 제거되는 주요 펩타이드를 포함한다. PD-1 전체 길이의 계산된 분자량은 31,647 Da이다. 하지만, 글리코실화로 인해 웨스턴 블롯팅 분석에서 관찰되는 분자량은 40 ~ 50 kD이다.

본 명세서에서 용어“억제제”는 인간 PD-1 유전자의 활성 또는 발현의 저하를 야기시키는 물질을 의미하며, 이에 의해 이들 유전자의 활성 또는 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 경우 뿐 아니라, PD-1의 발현 증가 및 이로 인한 면역세포 활성 억제가 유의하게 개선될 수 있을 정도로 이들의 활성 또는 발현을 감소시키는 물질을 의미한다.

본 명세서에서 용어“발현의 감소”는 인간 PD-1 유전자의 유전자 수준(예를 들어 DNA 또는 mRNA) 또는 이들이 인코딩하는 단백질 수준에서 그 발현량이 예를 들어 대조군에 비하여 20% 이상 감소한 상태, 보다 구체적으로는 30% 이상 감소한 상태, 보다 더 구체적으로는 40% 이상 감소한 상태를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 용어“활성의 감소”란 대조군에 비하여 이들 유전자 또는 이들이 인코딩하는 단백질의 생체내 고유한 기능이 측정 가능할 정도로 유의하게 감소하는 것을 말하며, 구체적으로는 대상체 내에서의 면역세포 활성이 유의하게 개선 또는 회복될 수 있을 정도로 그 활성이 감소하는 것을 의미한다. 활성(activity)의 감소는 단순한 기능(function)의 감소 뿐 아니라 안정성(stability)의 감소로 기인한 궁극적인 활성 저해를 포함한다.

상기 억제제는 예를 들어 당업계에 이미 뉴클레오타이드 서열 및 그 인코딩 단백질의 아미노산 서열이 공지된 인간 PD-1 유전자의 발현을 유전자 수준에서 억제하는 shRNA, siRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 타겟 유전자를 인식하는 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 시스템과; 이들의 발현을 단백질 수준에서 억제하는 항체 또는 앱타머 뿐 아니라, 이들의 활성을 억제하는 저분자 화합물, 펩타이드 및 천연물을 포함하나, 이에 제한되지 않고 유전자 및 단백질 수준에서의 가능한 모든 억제수단이 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 PD-1 억제제는 항-PD-1 항체이다.

항 PD-1 항체에 의해 PD-1과 PD-L1의 결합이 차단되면 T 세포의 증식과 기능적 활성을 자극하며(Dong et. al. 1999 Nature Med 5:1365; Freeman et. al. 2000 J Exp Med 192:1027; Tamura et. al. 2001 Blood 97:1809; Iwai et. al. 2002 PNAS 99:12293), 종양 성장과 바이러스 감염에 대한 면역반응이 강화된다고 보고 된 바 있다. 구체적으로, 상기 PD-1 억제제는 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항 PD-1 항체는 펨브롤리주맙(Keytruda)일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

I. 융합단백질 제조

실시예 1. hCD80-hIgG4 Fc-anti-LAG3 scFv를 포함하는 융합단백질의 제조

인간 CD80 단편(hCD80), 인간 IgG4의 Fc 도메인(hIgG4 Fc) 및 항 LAG3 항체의 scFv(anti-hLAG3 scFv)를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 1), 인간 CD80 단편(서열번호 2), Ig 힌지를 포함한 링커(1)(서열번호 3), 인간 IgG4의 Fc 도메인(서열번호 4), 링커(2)(서열번호 5) 및 항 LAG3 항체의 scFv(서열번호 6)를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 11)를 GenScript사의 Expression and Optimization 서비스를 이용하여 pcDNA3.4 벡터에 적재하였다. 상기 벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-S cell)에 도입한 후, 37℃, CO₂ 8%, 무혈청 ExpiCHO^TM 발현 배지(Thermo Fisher Scientific) 조건에서 14일 동안 배양하였다. 14일 후 배양액을 수거하여 친화크로마토그래피(Affinity purification column)를 이용하여 융합단백질을 정제하고 정제된 융합단백질을 "GI-105"로 명명하였다(도 1).

또한, 상기 정제된 융합단백질을 reduced(R) 또는 non-reduced(NR) 조건하에서 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 융합단백질이 이황화 결합을 통해 이량체 구조를 이루고 있음을 확인하였다(도 2 및 도 3).

나아가, 상기 정제된 융합단백질을 HPLC 분석을 이용하여 분자량 및 순도를 확인하였다.

Ⅱ. 융합단백질의 T 세포 활성화 효과 확인

실험예 1. 융합단백질이 T 세포의 기능에 미치는 영향 확인

실험예 1.1. CTLA-4 blockade assay

CD80은 T 세포 표면에 존재하는 서로 다른 두 단백질인 CD28 및 CTLA-4에 대한 리간드로 알려져 있으며 T 세포의 활성화와 생존에 필수적인 공자극 신호를 제공한다. 이에 인간 CD80 단편을 포함하고 있는 융합단백질 이량체가 T 세포의 기능에 미치는 영향을 확인하기 위해, CTLA-4 blockade bioassay system(Promega cat No. JA1400)을 이용하여 융합단백질 이량체의 T 세포 활성화 효과를 확인하였다.

상기 CTLA-4 blockade bioassay system은 CTLA-4 Effector T 세포 표면에 발현된 CTLA-4와 aAPC/Raji 세포 표면에 발현된 CD80/86과 결합하게 되면 CD28 경로-활성화된 발광이 억제되고, CTLA-4 결합 분자가 CTLA-4 Effector T 세포 표면에 발현된 CTLA-4에 결합하게 되어 aAPC/Raji 세포 표면에 발현된 CD80/86 결합이 블로킹되면 CD28 경로-활성화된 발광이 발생하는 원리를 이용하여 CTLA-4를 표적으로 하는 효능을 측정하는 방법이다(도 4a).

구체적으로, 액체질소에 냉동보관 중인 CTLA-4 Effector T 세포와 αAPC/Raji 세포를 꺼내어 37℃ 항온수조에서 2분 동안 해동시켰다. 그 후, CTLA-4 Effector T 세포를 75T 플라스크에 넣고 25 ㎖의 세포 생장 배지(90% RPMI + 10% FBS + 200 ㎍/㎖ 하이그로마이신 B), 37℃, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 또한, αAPC/Raji 세포도 75T 플라스크에 넣고 25 ㎖의 세포 생장 배지(90% RPMI + 10% FBS + 200 ㎍/㎖ 하이그로마이신 B + 500 ㎍/㎖ 항생제 G418 셀페이트 용액), 37℃, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양하였다.

48시간 배양한 CTLA-4 Effector T 세포를 수확하여 Assay buffer(90% RPMI +10% FBS)에 현탁한 후 96-웰 white cell 배양 플레이트(Corning cat no. 3917)에 각 웰당 1×10⁵ cells/25 ㎕씩 넣었다. 그 후, 다양한 농도로 이필리무맙(Ipilimumab, Yervoy; Bristol-Myers Squibb), 융합단백질 이량체 또는 Assay buffer를 각 웰당 25 ㎕씩 처리하였으며, αAPC/Raji 세포를 준비하기 전까지 커버를 씌워 상온에 보관하였다. 이때, 이필리무맙을 처리한 군을 양성대조군으로 설정하였으며, 융합단백질 이량체를 처리한 군을 실험군으로 설정하였다. Assay buffer를 처리한 군을 음성대조군으로 설정하였다.

또한, 48시간 배양한 αAPC/Raji 세포를 수확하여 Assay buffer(90% RPMI + 10% FBS)에 현탁한 후 상온에 보관 중인 96-웰 white cell 배양 플레이트에 각 웰당 5×10⁴ cells/25㎕씩 넣었다. 이후 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 16시간 동안 배양하였다. 16시간 후 상온에 10분간 둔 다음 Steady-Glo 시약을 75 ㎕씩 거품이 생기지 않게 주의하며 넣어 주었다. 백그라운드 신호를 보정하기 위하여 가장자리 바깥 웰 중 두 군데에 Steady-Glo 시약을 넣고 5분 내지 10분간 상온에서 반응시켰다. 이후 GIoMax ®Discover System (Promega, USA)을 이용하여 발광을 측정하였다.

그 결과, 융합단백질 이량체를 처리한 실험군의 발광 측정값이 양성대조군보다 높은 것을 확인하였다(도 4b). 이를 통해, 융합단백질 이량체가 T 세포 표면에 발현된 CTLA-4와 결합하여 T 세포 기능을 억제시키지 않고 오히려 활성화시키는 것을 확인하였다.

실험예 1.2. LAG3 blockade assay

LAG3은 T 세포 및 NK 세포에서 발현하는 면역관문 수용체로 CD4와 구조가 유사하지만 D1 도메인에 30개의 추가적인 아미노산을 가지고 있어 MHC class Ⅱ와 친화성이 높다. 이러한 구조적 특성 때문에 LAG3는 T 세포 활성화를 억제시킨다고 알려져 있다. 이에 항 LAG3 항체의 scFv를 포함하고 있는 융합단백질 이량체가 T 세포의 기능에 미치는 영향을 확인하기 위해, LAG3 blockade bioassay system(Promega, JA1115)을 이용하여 융합단백질 이량체의 T 세포 활성화 효과를 확인하였다.

상기 LAG3 blockade bioassay system은 LAG3 Effector T 세포 표면에 발현된 LAG3와 MHCⅡ APC 세포 표면에 발현된 MHC class Ⅱ와 결합하게 되면 TCR 경로-활성화된 발광이 억제되고, LAG3 결합 분자가 LAG3 Effector T 세포 표면에 발현된 LAG3에 결합하게 되어 MHCⅡ APC 세포 표면에 발현된 MHC class Ⅱ와의 결합이 블로킹되면 TCR 경로-활성화된 발광이 발생하는 원리를 이용하여 LAG3를 표적으로 하는 효능을 측정하는 방법이다(도 5a).

구체적으로, 액체질소에 냉동보관 중인 MHCⅡ APC 세포 1 바이알(vial)을 37℃ 온도의 항온수조에서 2분 동안 해동시켰다. 그 후, MHCⅡ APC 세포를 TCR 활성화 항원(TCR activating Ag)이 포함된 14.5 ㎖의 세포 복구 배지(90% DMEM + 10% FBS)에 넣고 잘 혼합해 주었다. MHCⅡ APC 현탁액을 96-웰 white cell 배양 플레이트(Corning cat no. 3917)에 각 웰당 100 ㎕씩 넣고 37℃ 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다.

24시간 동안 배양한 MHCⅡ APC 세포가 들어있는 96-웰 white cell 배양 플레이트를 꺼내어 배양액을 제거하였다. 그 후, 다양한 농도로 렐라틀리맙(Relatlimab, Bristol-Myers Squibb), 융합단백질 이량체 또는 Assay buffer를 각 웰당 40 ㎕씩 처리하였으며, LAG3 Effector cell이 준비되기 전까지 커버를 씌워 상온에 보관하였다. 이때, 렐라틀리맙을 처리한 군을 양성대조군으로 설정하였으며, 융합단백질 이량체를 처리한 군을 실험군으로 설정하였다. Assay buffer를 처리한 군을 음성대조군으로 설정하였다.

또한, 액체질소에 냉동보관 중인 LAG3 Effector 세포 1 바이알을 37℃의 항온수조에서 2분 동안 해동시켰다. 그 후, LAG3 Effector 세포를 7 ㎖의 Assay buffer(90% RPMI+10% FBS)에 넣고 잘 혼합해 주었다. 혼합한 현탁액을 상온에 보관 중인 96-웰 white cell 배양 플레이트에 40 ㎕씩 넣고 37℃ 5% CO₂ 조건에서 5시간 동안 배양하였다.

5시간 후 상온에 10분간 둔 다음 거품이 생기지 않게 주의하며 Bio-Glo 시약을 80 ㎕씩 넣어 주었다. 백그라운드 신호를 보정하기 위하여 가장자리 바깥 웰 중 두 군데에 Bio-Glo 시약을 넣은 후 5분 내지 10분간 상온에서 반응시켰다. 이후 GIoMax ®Discover System(Promega, USA)을 이용하여 발광을 측정하였다.

그 결과, 융합단백질 이량체를 처리한 실험군의 발광 측정값이 양성 대조군과 유사한 수준으로 높은 것을 확인하였다(도 5b). 이를 통해, 융합단백질 이량체가 T 세포 표면에 발현된 LAG3와 결합하여 T 세포 기능을 활성화시키는 것을 확인하였다.

Ⅲ. 융합단백질의 항암 효과 확인

실험예 2. 마우스 유래 대장암세포주 식립 마우스에서의 GI-105의 항암종양 효과 확인: CT26

BALB/c 마우스(암컷, 7주령, 오리엔트 바이오)에 5 x 10⁶ 개의 CT26 암세포주(ATCC, USA)를 1 ㎖의 PBS에 희석하여 개체 당 100 ㎕씩 마우스의 우측 등 부위의 피하에 동종이식하였다.

암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 50 ㎣ 내지 120 ㎣에 도달한 개체들을 선별한 후, 선별한 마우스의 종양의 크기 및 체중을 기초로 하여 균등하도록 각 군당 8마리씩 분류하였다.

그 후, 음성대조군에는 약물을 투여하지 않았으며, 실험군에는 3 mg/kg 용량의 융합단백질 이량체를 복강 내 투여하였다. 또한, 이에 상등한 몰(mole) 수의 항 LAG-3 항체(α-LAG3, 2.5 mg/kg) 또는 CD80-Fc(1.96 mg/kg)를 각각 복강 내로 단독 또는 병용투여하였다. 첫 투여 후 3주간 주 1회 총 3회의 투여를 진행하였고, 이식된 종양 크기는 모두 주 2회 측정하였다(표 3).

그룹	약물	투여용량	투여용량 (mL/kg)	투여경로	투여횟수	N수
G1	비이클(PBS)	-	5	복강	주 1회, 3주간	8
G2	α-LAG-3	2.5	5	복강	주 1회, 3주간	8
G3	CD80-Fc	1.96	5	복강	주 1회, 3주간	8
G4	α-LAG-3 + CD80-Fc	2.5+1.96	5	복강	주 1회, 3주간	8
G5	GI-105	3	5	복강	주 1회, 3주간	8

그 결과, 음성대조군에 비해 융합단백질 이량체를 투여한 실험군의 종양 크기가 현저히 감소된 것을 확인하였다. 또한, 항 LAG-3 항체 또는 CD80-Fc 단독 투여군과 비교하여도 융합단백질 이량체 투여군의 종양 크기가 유의하게 감소되었으며, 특히, 항-LAG-3 항체와 CD80-Fc 병용투여한 실험군과 비교하여도 융합단백질 이량체를 투여한 실험군의 종양 크기가 크게 감소하였음을 확인하였다(도 6).

실험예 3. PD-L1이 과발현된 마우스 유래 대장암 세포주 이식 마우스에서 GI-105 및 항 PD-1 항체 병용투여에 의한 항암 효과 확인: hPD-L1-MC38

hPD-1/hCTLA-4 이중 녹-인 마우스(C57BL/6J, 암컷, 6주령, Shanghai model organisms)에 1x10⁶ cells/100 ㎕의 인간 PD-L1이 과발현된 마우스 유래 대장암세포주(hPD-L1-MC38)를 우측 등 부위의 피하에 동종이식하였다. 이후 일정기간이 경과한 뒤 종양의 부피를 측정하여 각 군의 평균 종양의 크기가 100 mm³이 되도록 개체를 선별하였으며, 항 LAG3 항체(1E09) 투여군과 실험군으로 융합단백질 이량체(hCD80-Fc-anti-LAG3 scFv) 투여군, 키트루다(Keytruda) + 융합단백질(hCD80-Fc-anti-LAG3 scFv) 병용 투여군으로 나누어 각 약물을 주 2회 3주간 복강 내 투여하였고, 주 2회 종양의 크기 및 체중을 측정하였다.

그 결과, 항 LAG3 항체(1E09) 투여군보다 실험군(융합단백질 이량체 단독투여군; 및 키트루다 및 융합단백질 이량체 병용투여군)에서 유의한 종양 크기 감소가 나타났으며, 특히, 키트루다와 융합단백질 이량체를 병용투여한 군에서 현저한 종양크기 감소가 관찰되었다(도 8a). 한편, 양성대조군 및 실험군 모두에서 체중감소는 나타나지 않았으며, 각 군 간의 유의미한 차이도 나타나지 않았다(도 8b).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> GI Innovation, Inc. <120> FUSION PROTEIN COMPRISING EXTRACELLULAR DOMAIN OF CD80 AND ANTI-LAG3 ANTIBODY FRAGMENTS AND USE THEREOF <130> PDPB214668 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mIgG signal <400> 1 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 2 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD80 ECD <400> 2 Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys 1 5 10 15 Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp 20 25 30 Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn 35 40 45 Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn 50 55 60 Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr 65 70 75 80 Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His 85 90 95 Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser 100 105 110 Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile 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gctatcgtgg 5160 ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg 5220 gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct 5280 gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct 5340 acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa 5400 gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa 5460 ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc 5520 gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt 5580 ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct 5640 gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc 5700 gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg 5760 ggttcgcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt tcgattccac 5820 cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat 5880 cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac cccaacttgt ttattgcagc 5940 ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc 6000 actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctgtatacc 6060 gtcgacctct agctagagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 6120 ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg 6180 tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 6240 gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 6300 gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 6360 gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 6420 taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 6480 cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 6540 ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 6600 aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 6660 tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 6720 gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 6780 cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 6840 ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 6900 cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct 6960 gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 7020 cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 7080 tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 7140 ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 7200 aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 7260 atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 7320 ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 7380 tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 7440 agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 7500 taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 7560 tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 7620 cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 7680 ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 7740 tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 7800 tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 7860 cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 7920 tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 7980 gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 8040 tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 8100 atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 8160 tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 8220 8220 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of anti-hLAG <400> 13 Gly Phe Ser Phe Ser Asp His Tyr 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of anti-hLAG <400> 14 Ile Asp Thr Ser Ala Thr Tyr Ile 1 5 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of anti-hLAG <400> 15 Ala Arg Asp Asn Trp Gly Ser Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of anti-hLAG3 <400> 16 Gln Glu Ile Ser Ile Tyr 1 5 <210> 17 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 of anti-hLAG3 <400> 17 Asp Ala Ser 1 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of anti-hLAG3 <400> 18 Gln Gln Thr Tyr Ile Thr Pro Tyr Thr 1 5

Claims (17)

1. 하기 구조식 (2)로 이루어진 융합단백질:
   N'-X-[링커(1)]o - Z - [링커(2)]p- Y -C' (2)
   상기 구조식 (2)에 있어서,
   상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고;
   상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며;
   상기 X는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, CD80 단백질의 기능적 일부 단편이고;
   상기 Y는 서열번호 13의 HCDR1 영역, 서열번호 14의 HCDR2 영역 및 서열번호 15의 HCDR3 영역을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 16의 LCDR1 영역, 서열번호 17의 LCDR2 영역 및 서열번호 18의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, 항 LAG3 항체의 항원 결합 단편이며;
   상기 Z는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 Fc 영역이고;
   상기 링커(1)은 30개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커이며;
   상기 링커(2)는 12개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커이고;
   상기 o 및 p는 1이다.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 중쇄가변영역은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것인 융합단백질.
   
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 경쇄가변영역은 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 것인 융합단백질.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 중쇄가변영역과 상기 경쇄가변영역은 펩타이드 링커를 통해 결합된 것인 융합단백질.
   
10. 삭제
11. 제1항의 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체.
    
12. 제11항의 융합단백질 이량체를 포함하는 면역 증진제.
    
13. 제11항의 융합단백질 이량체를 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 조성물.
    
15. 제13항에 있어서, 상기 조성물은 PD-1 억제제를 추가적으로 포함하는 것인 조성물.
    
16. 제15항에 있어서, 상기 PD-1 억제제는 항 PD-1 항체인 것인 조성물.
    
17. 제16항에 있어서, 항 PD-1 항체는 펨브롤리주맙인 것인 조성물.

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