KR102159317B1 - 개의 TP53 유전자 표적 CRISPR/Cas9 벡터 시스템 및 이를 이용한 TP53 넉아웃 세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 시스템을 활용하여 개 모델에서 대표적인 종양 억제 유전자인 TP53 유전자를 특이적으로 표적하는 기술과 이를 적용하여 구축한 TP53 넉아웃 (knock-out) 개 세포주 및 이를 종양 연구에 활용하는 기술에 관한 것이다. 본 발명의 가이드 RNA (gRNA)는 개의 TP53 유전자만을 특이적으로 표적할 수 있는바, 이러한 특정 gRNA를 CRISPR/Cas9 시스템에 도입하는 경우 오프-타겟 효과(off-target effect) 없이 개의 TP53 유전자를 특이적으로 넉아웃(knock-out) 시킬 수 있다. 따라서, 개의 TP53 유전자를 특이적으로 표적하는 gRNA가 적용된 CRISPR/Cas9 시스템은 TP53 신호체계 불활성화와 관련된 다양한 종양 관련 연구를 위한 개 세포 모델과 동물모델을 제작하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 개 TP53 유전자-특이적 CRISPR/Cas9 시스템으로 구축한 TP53 넉아웃 세포는 개의 종양과 관련된 다양한 종양유전자의 종양 생성 및 악성화 기전연구를 위한 연구 모델과 이와 관련한 항암제 테스트 모델로 활용할 수 있다.

Description

개의 TP53 유전자 표적 CRISPR/Cas9 벡터 시스템 및 이를 이용한 TP53 넉아웃 세포{Canine TP53-targeting CRISPR/Cas9 vector system and TP53 knock-out cell using the vector system}
본 발명은 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 시스템을 활용하여 개 모델에서 대표적인 종양 억제 유전자인 TP53 유전자를 특이적으로 표적하는 기술과 이를 적용하여 구축한 TP53 넉아웃 (knock-out) 개 세포주 및 이를 종양 연구에 활용하는 기술에 관한 것이다.
최근 박테리아인 스트렙토코커스 피요젠스(Streptococcus pyogenes)의 바이러스 등에 대한 RNA-매개 면역시스템을 진핵생물에 사용 가능하도록 개발된 것이 CRISPR/Cas9 시스템이다. 이는 최근 가장 각광받는 제3 세대 유전체 편집 기술(gene editing technique)로 형질전환 세포나 동물을 생산해내는데 가장 널리 사용되고 있는 기술이다. 이 기술은 20개의 염기쌍으로 이루어진 가이드 RNA(guide RNA, 이하 간략하게 ‘gRNA’로 약칭함) 서열을 설계하여 DNA 절단 효소 부위를 가지고 있는 Cas9(CRISPR associated protein 9)과 함께 세포에 도입하면 표적 유전체 부위에 DNA 절단을 유도하는 기술이다. 이 기술을 통해 특정 유전자를 제거(넉아웃; knockout)하거나 연구자가 의도하고자 하는 서열을 유전자 절단 부위에 삽입(넉인; knockin)하도록 유도할 수 있다.
이 기술은 gRNA의 20개 염기쌍과 상보적인 유전체 서열을 인식하는 것이지만, 일부 다른 서열에 비특이적으로 작동하는 오프-타겟 효과(off-target effect)가 가장 큰 걸림돌이 되고 있다. 따라서 CRISPR/Cas9 기술을 제작할 실험 모델에 정확하게 적용하기 위해서는 특이적인 gRNA를 설계·선별하고 이를 실험적으로 증명하는 것이 가장 중요하다.
한편, TP53(tumor protein 53) 유전자는 세포에 문제가 생길 수 있는 다양한 스트레스나 외부 자극에 의해 세포의 성장 조절 및 세포 노화, 세포사멸을 조절하는 중요한 인자인 p53을 암호화하고 있는 유전자이다. 이러한 기능으로 TP53 유전자는 유전체의 안정성 유지에 크게 기여한다. TP53은 많은 연구 결과 등을 통해 가장 중요한 암 억제 유전자(tumor suppressor gene)로 인식되고 있다. 모든 인간 암 환자의 약 1/3 정도가 TP53 유전자에 직접적인 돌연변이가 관찰된다고 알려져 있다. 뇌종양의 경우, TP53 유전자 차체에 돌연변이가 나타난 경우는 35%로 나타나지만 실제 TP53이 기능하는 종양 억제 신호체계가 불활성화 된 비율을 보면 약 86%로 매우 높은 것을 보면 상당수 많은 종양에서 p53의 기능이 불활성화 되어 있음을 알 수 있다. 따라서 종양유발 신호체계(oncogenic signialing)의 활성화와 함께 TP53 관련 종양 억제 신호체계의 불활성화는 종양연구에서 빼놓을 수 없는 연구 대상이다.
최근 반려견을 키우는 애견인들의 수가 증가하고 반려견의 건강에 대한 인식이 증가하고 있다. 특히, 종양은 개의 3 대 사망원인 중 하나로 효과적인 치료법이 없는 경우가 상당히 많다. 때문에 반려견의 수명 연장을 위해 종양 치료법 개발에 대한 연구가 지속적으로 이루어져야 한다. 개과 동물은 인간과 가까운 포유동물이자 수의학적 임상 데이터가 가장 잘 갖추어진 동물이다. 개과 동물에서 발생하는 많은 종양의 유전적 변이 및 병리학적 특성은 인간의 종양과도 상당히 유사하다는 결과도 보고되었다. 따라서 개과 동물에서 나온 연구 결과 및 치료법이 인간에도 적용될 수 있어, 개는 효과적인 치료법 및 항암제 개발에 시너지 효과를 줄 수 있는 좋은 연구 모델이 될 수 있다. 하지만 개과 동물의 종양을 연구하기 위한 모델 및 시스템이 상대적으로 잘 개발되지 않고 있다.
따라서 인간의 종양 연구 시스템처럼 개과 동물에 대한 종양 연구 모델 및 시스템 역시 긍정적으로 개발이 이루어질 필요성이 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 개 모델에서 대표적인 종양 억제 유전자인 TP53을 표적하기 위한 gRNA를 설계하였으며, 특정 gRNA를 CRISPR/Cas9 시스템에 도입하는 경우 오프-타겟 효과(off-target effect) 없이 TP53 유전자를 특이적으로 넉아웃(knock-out) 시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 이러한 재조합 벡터로 형질전환된 세포주의 경우 종양 연구 모델 세포주로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제10-1961667호
따라서 본 발명의 목적은 개의 TP53 유전자를 효과적으로 타겟팅할 수 있는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 벡터가 도입되어 개의 TP53 유전자가 넉아웃(knock-out)된 형질전환 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 형질전환 세포주의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 형질전환 세포주를 이용하여 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 형질전환 세포주가 이식되어 종양이 형성된, 인간을 제외한 종양형성 동물모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 종양형성 동물모델의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 동물모델을 이용하여 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 가이드 RNA(guide RNA); 및 Cas 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 개의 TP53 유전자 타겟팅용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Cas 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 Cas9 단백질일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Cas 단백질은 유전체 서열 중 NGG 트리뉴클레오타이드(trinucledotide) 서열과 도입한 가이드 RNA서열의 상보적인 서열을인식할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 벡터는 형광단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된, 형질전환 세포주를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포주는 종양유전자 과발현 벡터가 추가로 도입된 세포주일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 종양유전자는 RAS 유전자일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포주는 개의 종양형성 세포 모델일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 개 유래 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 형질전환 세포주 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포는 개 유래의 접합체(zygote), 섬유아세포, 신경계 세포, 피부세포, 성체줄기세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포주에 항암제 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질을 처리한 세포주를 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 종양형성이 개선되거나 치료되는 경우 이를 항암제로 판단하는 단계를 포함하는, 종양형성 개선 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포주가 이식되어 종양이 형성된, 인간을 제외한 종양형성 동물모델을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 동물모델은 개의 TP53 유전자가 넉아웃된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포주를 동물의 피하에 이식하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 종양형성 동물모델 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 동물모델에 항암제 후보물질을 투여하는 단계; 및 상기 후보물질을 투여한 동물모델을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 종양형성이 개선되거나 치료되는 경우 이를 항암제로 판단하는 단계를 포함하는, 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 가이드 RNA (gRNA)는 개의 TP53 유전자만을 특이적으로 표적할 수 있는바, 이러한 특정 gRNA를 CRISPR/Cas9 시스템에 도입하는 경우 오프-타겟 효과(off-target effect) 없이 개의 TP53 유전자를 특이적으로 넉아웃(knock-out) 시킬 수 있다. 따라서, 개의 TP53 유전자를 특이적으로 표적하는 gRNA가 적용된 CRISPR/Cas9 시스템은 TP53 신호체계 불활성화와 관련된 다양한 종양 관련 연구를 위한 개 세포 모델과 동물모델을 제작하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 개 TP53 유전자-특이적 CRISPR/Cas9 시스템으로 구축한 TP53 넉아웃 세포는 개의 종양과 관련된 다양한 종양유전자의 종양 생성 및 악성화 기전연구를 위한 연구 모델과 이와 관련한 항암제 테스트 모델로 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 CRISPR/Cas9 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 2는 개의 TP53 유전자를 특이적으로 인식하는 가이드 RNA 서열을 선별하는 과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 개 TP53 유전자 타겟용 가이드 RNA를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 CRISPR/Cas9 벡터 시스템이 세포에 일시적으로 도입되었는지 여부를 형광을 통해 관찰한 사진이다.
도 5는 본 발명의 TP53 gRNA #30, #39, #51 각각이 도입된 CRISPR/Cas9 벡터 시스템을 이용 개의 섬유아세포에 형질전환시킨 다음, 12 계대 (passage) 배양 후 세포군집의 형태를 보여주는 대표적인 이미지 사진이다.
도 6은 본 발명의 TP53 gRNA #30이 도입된 CRISPR/Cas9 벡터 시스템을 이용 개의 섬유아세포에 형질전환시킨 다음, 12 계대 배양 후 정상세포와 형태학적으로 가장 유사한 세포주 세 개(colonies #2, #10, and #11)를 선택하고, 이의 유전체 시퀀싱을 통해 TP53 유전자 서열에 일부 서열이 삽입 또는 결실되어 있음을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 TP53 gRNA #39가 도입된 CRISPR/Cas9 벡터 시스템을 이용 개의 섬유아세포에 전환시킨 다음, 12 계대 배양 후 정상세포와 형태학적으로 가장 유사한 세포주 세 개(colonies #3, #5, and #6)를 선택하고, 이의 유전체 시퀀싱을 통해 TP53 유전자 서열에 일부 서열이 삽입 또는 결실되어 있음을 확인한 결과이다.
도 8은 BLAST 알고리즘을 통해 본 발명의 TP53 gRNA #30 및 #39의 잠재적인 오프 타겟 유전자를 선별한 결과이다.
도 9는 본 발명의 벡터로 형질전환된 세포에서 TP53 gRNA #30 및 #39 각각의 온 타겟(on-target) 및 오프 타겟(off-target) 후보군 유전자를 대상으로 하여 Surveyor assay를 통해 인델(Indel) 돌연변이를 확인한 결과이다. TP53KO#30은 TP53 gRNA #30이 도입된 CRISPR/Cas9 벡터 시스템으로 만든 세포주를 의미하며, TP53KO#39가 도입된 TP53 gRNA #39의 CRISPR/Cas9 벡터 시스템으로 만든 세포주를 의미한다.
도 10은 본 발명의 벡터로 형질전환된 각각의 세포주(TP53KO#30, TP53KO#39)에서 EGFP를 발현 여부를 FACS (fluorescence activating cell sorting) 장비로 관찰한 결과이다.
도 11은 본 발명의 벡터로 형질전환된 세포주(TP53KO#30, TP53KO#39) 각각의 상대적인 세포증식률을 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 벡터로 형질전환된 세포주(TP53KO#30, TP53KO#39) 각각의 14 계대 배양에 따른 누적증식곡선을 나타낸 그래프이다.
도 13에서 좌측 맨 위 사진은 본 발명의 벡터로 형질전환된 세포주(TP53KO#30, TP53KO#39) 각각의 14 계대 배양 후 세포 형태를 나타내는 대표적인 이미지를 나타낸 것이다. 도 13에서 좌측 맨 아래 사진은 본 발명의 벡터로 형질전환된 세포주(TP53KO#30, TP53KO#39) 각각의 14 계대 배양 후 세포노화(cellular senescence) 정도를 확인하기 위해 베타-갈락토시다아제로 염색된 세포를 확인한 이미지이며, 우측 그래프는 베타-갈락토시다아제 염색 결과를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 14는 본 발명의 벡터로 형질전환된 세포주(TP53KO#30, TP53KO#39) 각각에 테모졸로미드를 48시간 처리 후, p53의 증가 여부와 p53에 의해 조절되는 p21의 증가여부를 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 15는 인간의 돌연변이 유전자 HRASV12 유전자[12번째 글라이신(Glycine) 잔기가 발린(Valine) 잔기로 치환된 돌연변이 인간 HRAS 유전자]가 포함된 렌티바이러스 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 벡터로 형질전환된 세포주(TP53KO#30, TP53KO#39) 각각에 HRASV12 종양유전자를 도입한 후 HRASV12 종양유전자의 과발현 여부; 및 ERK1/2와 AKT의 인산화 정도를 웨스턴블랏 기법을 통해 확인한 결과이다.
도 17은 본 발명의 벡터로 형질전환된 세포주(TP53KO#30, TP53KO#39) 각각에 HRASV12 종양유전자를 도입한 후 세포 형태의 변화를 확인한 이미지이다.
도 18은 본 발명의 벡터로 형질전환된 세포주(TP53KO#30, TP53KO#39) 각각에 HRASV12 종양유전자를 도입한 후 부착비의존성(anchorage-independence)을 검증하기 위하여 soft agar assay 실험을 수행한 결과이다.
도 19는 본 발명의 벡터로 형질전환된 세포주(TP53KO#30, TP53KO#39) 각각에 HRASV12 종양유전자를 도입한 후 상대적인 세포증식률을 나타낸 그래프이다.
도 20은 본 발명의 벡터로 형질전환된 세포주(TP53KO#30) 및 상기 세포주에 HRASV12를 도입하여 종양유전자를 과발현한 세포주 각각을 면역결핍생쥐의 피하조직에 주입하여 종양 형성 여부를 실험한 결과이다.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 가이드 RNA(guide RNA); 및 Cas 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 개의 TP53 유전자 타겟팅용 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "재조합 벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "유전자 타겟팅용 재조합 벡터"는 게놈의 특정 유전자 위치로 목적하는 유전자를 제거 또는 넉아웃(knock-out)시킬 수 있는 재조합 벡터를 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "가이드 RNA(guide RNA)"란 표적 DNA에 특이적인 RNA로, Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA를 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "Cas 단백질"은 CRISPR/Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, 가이드 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 (nickase)를 형성한다.
Cas 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터 (national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Cas 단백질을 암호화하는 CRISPR-연관 (CRISPR-associated, cas) 유전자는 종종 CRISPR-반복 스페이서 배열(CRISPR repeat-spacer array)과 관련된다. 40개 이상의 서로 다른 Cas 단백질 패밀리가 기재되어 왔다. 이러한 단백질 패밀리 중, Cas1은 서로 다른 CRISPR/Cas 시스템 중에서 아주 흔한 (ubiquitous) 것으로 보인다. CRISPR-Cas 시스템은 세 종류가 있다. 이들 중에서, Cas9 단백질 및 crRNA 및 tracrRNA을 수반하는 타입 Ⅱ CRISPR/Cas 시스템이 대표적이며, 잘 알려져 있다. cas 유전자 및 반복 구조 (repeat structure)의 특정 조합은 8개의 CRISPR 하위 유형 (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern, 및 Mtube)을 정의하는데 사용되어 왔다.
Cas 단백질은 단백질 전달 도메인 (protein transduction domain)과 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌(poly-arginine) 도메인 또는 HIV로부터 유래한 TAT 단백질일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, Cas 단백질은 가이드 RNA와 복합체를 형성할 때 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 활성을 갖는다면, 어떠한 Cas 단백질일 수 있다.
바람직하게, Cas 단백질은 Cas9 단백질일 수 있다.
상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 sp. (Streptococcus sp.), 바람직하게는 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogens)와 같은 유기체로부터 분리된 것 또는 재조합 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
스트렙토코커스 피요젠스로부터 유래한 Cas9 단백질은 NGG 트리뉴클레오타이드(trinucleotide)를 인식할 수 있다.
본 발명의 Cas 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진 Cas9 단백질일 수 있으며, 또한, 상기 Cas9 단백질에 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin) 단백질의 핵위치신호 (NLS, Nuclear localization signal, KRPAATKKAGQAKKKK) 서열과 FLAG 서열(DYKDDDDK)이 태깅(tagging)된 형태일 수 있으나, 이는 예시일 뿐, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어, "CRISPR/Cas9 시스템"이란 미생물의 면역체계로 알려진 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템을 이용해 원하는 유전자 염기서열을 절단하도록 고안된 것으로서, 고정적 구성요소로서 Cas9 단백질을 포함하고, 가변적 구성요소로서 타겟 유전자에 특이적인 가이드 RNA를 포함한다. 이때 타겟 유전자의 조건은 23 bp 길이이고 두 개의 구아닌 염기(GG)로 끝나기만 하면 된다. 가이드 RNA가 타겟 유전자를 인식하면 가이드 RNA에 Cas9 단백질이 결합하여 뉴클레아제로 작용하여 타겟 유전자의 하류 약 3 bp에 위치한 두 개의 구아닌 염기(GG)를 인식하여 절단함으로써 DNA 이중가닥 손상(DNA double strand break, DSB)을 유발한다.
본 발명의 개의 TP53 유전자 타겟팅용 재조합 벡터는, CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 것으로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 가이드 RNA(guide RNA); 및 Cas9 단백질을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 개(Canis lupus familiaris)의 TP53 (tumor protein p53) 유전자(NCBI GenBank Gene ID: 403869)의 특정 서열을 표적으로 하며, 자세하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 가이드 RNA이다.
상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA는 개의 TP53 유전자의 3번 엑손(exon)의 특정 서열을 타겟으로 할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선별마커(selection marker)를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "선별마커"란 세포로 유전자 타겟팅 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있고, 양성 선별마커와 음성 선별마커가 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "양성 선별 마커"는 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 당해 특정 마커를 발현하는 세포만 생존하도록 하여 양성 선택을 가능하게 하는 마커를 의미하며, "양성 선별 마커 유전자"는 상기 양성 선별 마커를 암호화하는 유전자를 의미하는데, 예를 들어, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(이하, 'neo'라 약칭함)는 항생제 네오마이신이 첨가된 배지에서 진핵세포가 생존할 수 있도록 하는 항생제 내성을 부여함으로써, 진핵세포에 있어서 안정적 형질감염 세포를 선별하는데 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "음성 선별 마커 유전자"는 무작위적 삽입(random insertion)이 일어난 세포를 선별하여 제거하는 음성 선택을 가능하게 하는 마커 유전자로서, 당해 유전자를 발현하는 세포만을 선별적으로 사멸시킴으로써, 무작위적 삽입에 의한 형질도입을 방지하는 역할을 수행한다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 U6, CaMV 35S, SV40, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.
본 발명의 재조합 벡터는 형광단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 2A 펩타이드(2A peptide) 서열의 한 종류인 E2A 서열에 의해 형광단백질 유전자와 Cas9 유전자가 하나의 폴리시스트론 mRNA(polycistronic mRNA) 로 전사되어 두 개의 단백질을 동시에 생산할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 이는 예시일 뿐, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 개의 TP53 유전자 타겟팅용 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포주를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "세포주"는 세포를 분리해서 순수 배양하여 계대배양해 나갈때 세포계의 각 개체를 말하며, 이때 세포주는 유전적 형질에 의해 다른 세포주와 구별될 수 있으며, 계대배양에도 원 세포의 형질이 유지되는 것을 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 플라스미드 또는 비플라스미드성 나출(naked DNA)에 의한 진핵세포의 형질전환을 세포의 종양화의 의미로서의 형질전환과 구분하기 위해, '형질감염(transfection)'이라고 부르기도 하는데, 본 명세서에서는 동일한 의미로 사용된다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 벡터가 도입된 개(Canis lupus familiaris) 유래의 세포주 일 수 있으며, 도입되는 개 유래 세포의 종류는 특별히 그 종류를 제안하는 것은 아니나, 예를 들어, 개 유래의 접합체(zygote), 섬유아세포, 신경계 세포, 피부세포, 성체줄기세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 세포주는 종양유전자 과발현 벡터가 추가로 도입될 수 있다.
상기 종양유전자로는 RAS 유전자를 예시할 수 있으나, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 종양유전자 과발현 벡터는 서열번호 29의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이는 예시일 뿐, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 개의 TP53 유전자 타겟팅용 재조합 벡터를 개 유래 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 형질전환 세포주 제조방법을 제공한다.
본 발명의 벡터가 도입될 수 있는 세포의 종류로는, 개로부터 유래한 세포이면 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니나, 예를 들어, 개 유래의 접합체(zygote), 섬유아세포, 신경계 세포, 피부세포, 성체줄기세포일 수 있다.
본 발명의 상기 세포주는 ‘개의 종양연구 모델 세포’ 또는 ‘개의 종양형성을 유도하는 세포 모델’로 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 세포주는, 개의 TP53 유전자가 넉아웃된 세포로서, 개의 종양과 관련된 다양한 종양유전자에 의한 종양 생성 및 악성화 기전연구를 위한 연구 모델과 이와 관련한 항암제 테스트 모델로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 개의 TP53 유전자 타겟팅용 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포주에 항암제 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질을 처리한 형질전환 세포주를 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 종양형성이 개선되거나 치료되는 경우 이를 항암제로 판단하는 단계를 포함하는, 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 항암제 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 종양형성 개선 또는 치료제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 추출물 또는 천연물, 화합물 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 개의 TP53 유전자 타겟팅용 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포주가 이식되어 종양이 형성된, 인간을 제외한 종양형성 동물모델을 제공한다.
본 발명의 종양형성 동물모델은 개의 TP53 유전자가 넉아웃됨에 따라, TP53 신호체계 불활성화와 관련된 다양한 종양 관련 연구를 위한 동물모델로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 개의 TP53 유전자 타겟팅용 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포주를 동물의 피하에 이식하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 종양형성 동물모델 제조방법을 제공한다.
상기 동물은 인간을 제외한 포유동물로서, 원숭이, 랫트, 마우스, 토끼, 개, 영장류 등일 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 쥐과(Muridae) 또는 개과(Canidae) 동물일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 종양형성 동물모델에 항암제 후보물질을 투여하는 단계; 및 상기 후보물질을 투여한 동물모델을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 종양형성이 개선되거나 치료되는 경우 이를 항암제로 판단하는 단계를 포함하는, 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 항암제 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 종양형성 개선 또는 치료제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 추출물 또는 천연물, 화합물 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
1. 재료 및 방법
세포 확보 및 배양
카니스 루푸스 파밀리아리스(Canis lupus familiaris) 개 태아 섬유아세포는 유산된 개 태아의 귀 조직에서 확보하였다. 귀 조직을 잘라 70% 에탄올로 멸균을 한 뒤 Dulbecco’s phosphate-buffered saline로 씻어낸 다음 수술용 칼로 잘게 잘라 0.25% 트립신으로 2시간 동안 반응을 시킨다. 이후 10% 소태아혈청(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 2% antibiotic-antimycotic (Life Technologies)이 보충된 DMEM(Life Technologies)을 넣어 Trypsin 효소를 불활성화 한다. 이렇게 처리되어 떨어져 나온 단일 세포들은 100-mm 세포 배양접시에서 10% 소태아혈청(Life Technologies), 1% 글루타맥스(Life Technologies), 1% MEM non-essential amino acids (Life Technologies), 1% antibiotic-antimycotic(Life Technologies) 및 0.1% 2-메르캅토에탄올(Life Technologies)이 보충된 DMEM(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 배양액으로 37℃, 5% CO2 인큐베이터(Astec, Fukuoka, Japan)에서 유지배양 하였다.
테모졸로미드 ( Temozolomide ) 처리
테모졸로미드(Temozolomide, TMZ; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 처리 실험을 위해, 세포들을 트립신-EDTA 이용하여 수확하고, 계수하고 그리고 100mm 배양 플레이트 당 1×106 세포의 밀도로 재접종하였다. 12 시간 후, 100 nM의 테오졸로미드를 각 웰에 첨가하였다.
가이드 RNA 디자인
개 TP53 위치 타겟팅 gRNAs 디자인을 위하여, 유전자의 모든 엑손 영역에서 NGG-프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 갖는 177개 후보군을 Feng Zhang laboratory’s Target finder program (https://zlab.bio/guide-design-resources)을 이용하여 동정하였다. 프로그램의 자동적인 오프-타겟(off-target) 스크리닝 시스템은 개 종에서 이용가능하지 않으므로, 본 실험에서는 하기의 단계를 통해 결과를 좁혔다. 첫째, 일부 TP53이 만들어져 기능하는 것을 방지하기 위해 앞부분인 엑손 1번에서 3번내에 서열을 표적하는 61개의 후보 gRNA를 선별하였다. 다음으로, 오프-타겟(off-target) 변형을 피하기 위하여 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 다른 게놈 영역(gRNAs ≤ 최대 점수 30.2), 특히 코딩 서열에 비해 낮은 결합 가능성을 갖는 후보를 동정하였다. 상기 과정을 통해 TP53에 대한 19개의 gRNA를 선별하였고, 이후 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정한 최대 점수에 따라 가장 낮은 비특이적 결합력을 기준으로 최종 3개의 gRNA를 선별하였다. 최종 선별된 3개의 gRNA는 각각 ‘TP53 gRNA #30’, ‘TP53 gRNA #39’, ‘TP53 gRNA #51’로 명명하였다.
최종 선별된 3개의 gRNA
gRNA 염기서열
TP53 gRNA #30 5 '- TAGGTGCCAGGGTAGGTCTT(서열번호 1) CGG-3'
TP53 gRNA #39 5 '- TCCCAGAGAGCGTCGTGAAC(서열번호 2) TGG-3'
TP53 gRNA #51 5 '- GTTTGGGGTTCCTGCATTCC(서열번호 3) GGG-3'
재조합 벡터 구축
개 TP53 유전자를 표적으로하는 CRISPR/Cas9 플라스미드 벡터를 제작하기 위하여, lentiCRISPRv2 (# 52961, Addgene, Cambridge, MA, USA)로부터 U6-stuffer-hSpCas9 서열을 Kpn1 (Klenow fragment로 무딘) 및 BamHI로 절단하였다. 이 단편을 pcDNA3.1 (+) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)의 Nru1 및 BamH1 부위에 삽입하였다. pEGFP-N2 (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, USA)로부터 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 서열을 EcoR1 및 Not1로 절단하고, 합성된 E2A 펩타이드 서열을 pcDNA3.1-CRISPR 플라스미드에 삽입하였다. 마지막으로, 선별된 3개의 gRNA 서열을 합성하고, 스터퍼 서열 (stuffer sequence)에 인접한 2개의 BsmB1 부위에 삽입하였다.
상기 과정을 통해 구축된 본 발명의 CRISPR/Cas9 벡터는 각각 ‘pcDNA3.1-neo-U6-dogTP53 gRNA#30-EF1-Cas9-2A-EGFP’, ‘pcDNA3.1-neo-U6-dogTP53 gRNA#39-EF1-Cas9-2A-EGFP’, ‘pcDNA3.1-neo-U6-dogTP53 gRNA#51-EF1-Cas9-2A-EGFP’로 명명하였으며, 서열번호 4 내지 6의 염기서열을 갖는다.
개 TP53 유전자 넉아웃 섬유아세포 제조
개 TP53 유전자를 표적으로 하는 CRISPR/Cas9 벡터를 Polyexpress™ (Excellgene, Rockville, MD, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 K9 fetus 1 세포로 일시적으로 형질감염시켰다. 이어서, 세포를 배양하고, 형질감염되지 않은 세포가 노화 표현형을 나타낼 때까지 배양 플레이트로 옮겼다. 마지막으로 정상적인 세포 형태와 연장된 수명을 가진 세포 콜로니를 분리되어 독립적으로 유지되었다.
반고체상 분석법(Semi-solid agar culture assay)
10% FBS를 함유하는 DMEM 중 0.72% 한천의 1.5mL 하부층을 6-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 실온 (19-21℃)에서 고형화시켰다. 반고체상 분석법에 의해 시험된 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM 중 0.28% 한천의 플레이팅층(1.5 mL)에 현탁시키고 웰에 첨가하였다. 한천을 실온에서 응고시키고 가습 된 CO2 배양기에서 37℃로 배양하였다. 한천이 건조되지 않도록 10% FBS를 함유한 DMEM 500 ㎕를 2-3 일마다 각 웰에 첨가하였다.
세포 성장 카운팅 (Cell growth counting)
세포 증식 분석을 위해 1.5×104 K9 fetus 1 대조군 세포와 TP53 넉아웃 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 10% FBS 존재 하에서 6 일간 배양하였다. 세포를 여러 번 트립신처리법을 통해 수확하고 트립신 블루로 염색하였다. 생존 세포는 혈구계 및 도립현미경을 사용하여 계수하였다. 세포의 수는 3반복의 독립적인 실험을 통해 평균값으로 계산되었다.
웨스턴 블랏팅 (Western blotting)
웨스턴 블랏 분석을 위해, 전체 세포 추출물을 1mM β-글리세로포스페이트, 2.5mM 피로인산나트륨, 1mM NaF, 1mM NaCl, 1mM NaCl, 1mM Na3VO4, 및 프로테아제 저해제 칵테일 (Roche, Basel, Switzerland)을 포함하는 RIPA(radioimmunoprecipitation assay) lysis buffer에서 준비하였다. 단백질 수준은 제조자의 지시에 따라 Bradford 분석 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 정량화하였다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 표준 프로토콜에 따라 폴리비닐리덴 디플로라이드 멤브레인(Pall Corporation, Port Washington, NY, USA)에 옮겼다. 멤브레인은 TBST 내 3% 소혈청알부민에서 HRAS(Merck Millipore, Billerica, MA, USA), TP53, p21, SV40 T 항원, 및 β-액틴(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)에 대한 항체로 이뮤노블랏팅 되었다. 일차 항체 반응 후, 막을 세척하고 호스라디쉬 퍼옥시다아제-결합된 goat anti-mouse 또는 anti-rabbit IgG 2차 항체(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 붙였다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용하였다.
개 TP53 타겟 시퀀싱
제조자의 지시에 따라 Wizard Genomic DNA Extraction Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 개 섬유아세포에서 게놈 DNA를 추출하였다. 다음으로, 각 세포주의 TP53의 엑손 3을 Takara Ex taq (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) 및 하기 표 2의 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다. PCR 반응 조건은 먼저 95℃에서 60초간 변성시키고; 95℃에서 30초, 58℃에서 40초, 72℃에서 60초간 반응을 30주기 반복한 후; 72℃에서 10분간 추가로 신장시켰다. 제조사의 지시에 따라 각각의 생성물을 pGEM T-easy 벡터(Promega)에 연결하고, ABI BigDye® terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 서열을 결정하였다.
개 TP53 유전자 PCR 증폭용 프라이머 세트
유전자 프라이머 서열 서열번호
TP53 포워드 5‘-CTGGTAAGGACTGGGTGTGG-3’ 7
리버스 5‘-GCCACTGACCGTCCAAGTAA-3’ 8
인 비보( In vivo ) 종양 형성 에세이
피하 이종 이식 모델을 만들기 위해, 인산염 완충 식염수에 있는 각 세포주별 2×106 세포를 50% Matrigel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)과 혼합하고 5-6 주령의 BALB/c nu/nu 마우스 (구입처: ㈜오리엔트바이오, 성남, 경기도, 대한민국)에 피하 이식하였다. 각 종양의 크기는 다음 공식을 사용하여 계산하였다.
종양 부피(mm3) = 종양의 가장 긴 직경(mm)×종양의 최단 직경(mm)2 /2.
염색체 분석
정상적인 개 섬유아세포 및 개 TP53 넉아웃 섬유아세포는 GenDix, Inc. (Seoul, Korea)에 의해 상업적으로 핵형을 결정하였다. 두 섬유아세포의 핵형 검사 결과는 염색체 영상 처리 시스템 인 ChIPS-Karyo 프로그램을 사용하여 분석하였다. 분석 데이터 및 모든 용어는 국제 세포 학회 (Human Cytogenomic Nomenclature) 2016 (ISCN 2016)에 의해 표현되었다.
Surveyor assay
각 gRNA의 잠재적인 오프 타겟(off-target) 유전자는 BLAST 알고리즘을 사용하여 예측하였고, surveyor assay를 위한 최종 타겟 유전자는 각 TP53 gRNA (≥10 of 20) 및 NGG PAM 서열의 존재와 일치하는 뉴클레오타이드 수에 따라 선별하였다.
제작자의 지시에 따라 Wizard Genomic DNA Extraction Kit (Promega)를 사용하여 개 섬유아세포 및 개 TP53 넉아웃 세포로부터 게놈 DNA를 추출하였다. surveyor assay는 Guide-it ™ Mutation Detection Kit (Clontech Laboratories, Inc.)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행되었다. 증폭 단계 동안, 추출된 개 게놈 DNA 100 ng을 사용하여 PCR을 수행하였다. 프라이머 서열은 하기 표 4에서 자세히 나타내었으며, PCR 반응 조건은 먼저 94℃에서 10분간 변성시키고; 95℃에서 30 초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초간 반응을 35주기 반복한 후; 72℃에서 10 분간 추가로 신장시켰다.
Surveyor assay를 위해 사용된 프라이머 세트
유전자 프라이머 서열 서열번호
TP53 포워드 5‘-TGACCCTTGACTCTGGTCTC-3‘ 9
리버스 5‘-TCGGGGTCTATTCCAGAAGC-3‘ 10
ATP8B2 포워드 5‘-AATCACTCTCACCACGGTCG-3‘ 11
리버스 5‘-CACCGTCACTCCTTGAGAGG-3‘ 12
TFE3 포워드 5‘-CTGAGATTCAGCCTGGTTCC-3’ 13
리버스 5‘-GAACACCTTGCAACCCCTAA-3‘ 14
TC3 포워드 5‘-GTACGGCTTCACTCCCGAT-3‘ 15
리버스 5‘-CCGTCCTGTAAGACAGGCAT-3‘ 16
C2CD2 포워드 5‘-TGCAGGAGGCATTTTAAGGA-3‘ 17
리버스 5‘-TCACGGGATGCTCTTTAGTT-3‘ 28
ARHGAP15 포워드 5‘-TGTGGCAACAGAGCCAATA-3‘ 19
리버스 5‘-TTTCAATGACACTGCGTTGC-3‘ 20
OVOL2 포워드 5‘-AGTAGCAGCCCATCTTCACT-3‘ 21
리버스 5‘-CATCCGAAGAGTTGGAGCTT-3‘ 22
NEURL1 포워드 5’-AGGGACAGCCTCAGTGTAG-3‘ 23
리버스 5‘-AGCTAGACTCCCCTCCTTCA-3‘ 24
APC 포워드 5’-ACCTATACCACAGAGCGCC-3‘ 25
리버스 5‘-ATGCCTGAGGTTTACTGGGT-3’ 26
통계 분석
모든 실험은 3 번 이상 반복하였다. 모든 데이터는 one-way ANOVA (분산분석)으로 분석되었으며 뒤이어 SPSS 소프트웨어 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하는 Duncan의 테스트에 의해 분석되었다. 값은 평균±표준편차로 나타내었으며, P 값이 0.05 미만인 경우 통계학적으로 유의한 것으로 평가하였다.
2. 결과
개 TP53 유전자-특이적 CRISPR / Cas9 시스템 제작
개의 TP53 유전자에 특이적인 gRNA를 선별하기 위해 다음 과정을 수행하였다. CRISPR/Cas9이 표적 유전체 서열을 인식하기 위해 필수적인 NGG PAM (Protospacer adjacent motif) 서열이 있는 곳을 개의 TP53 유전자의 엑손(exon)에서 찾아 총 177개의 후보 gRNA를 확보하였다. 일부 TP53이 만들어져 기능하는 것을 방지하기 위해 앞부분인 엑손 1번에서 3번내에 서열을 표적하는 61개의 후보 gRNA를 추려내었다. 유전체 내의 다른 서열이 표적되는 것을 방지하기 위해 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하여 서열 분석을 하여 오프-타겟 효과를 적게 나타날 수 있는 후보 gRNA 19개 서열을 확보하였다. 이 중 가장 오프-타겟 효과를 적게 가질 수 있는 gRNA를 서열 분석을 추가로 추려내어 개의 TP53의 엑손 3번을 표적하는 3개의 gRNA 서열(TP53 gRNA #30, #39, #51)을 확보하였으며, CRISPR/Cas9 벡터 시스템에 도입하였다(도 2 및 3 참조). CRISPR/Cas9 시스템은 잠재적인 오프-타겟 효과를 가져올 수 있어서 전기천공법(electroporation)을 통해 세포에 각 벡터 시스템을 일시적으로 도입하고자 하였다.
구축한 CRISPR/Cas9 벡터 시스템은 Cas9 유전자 뒤에 2A 펩타이드 서열에 의해 초록형광 유전자가 발현이 되는 시스템이기 때문에, 세포에 벡터 시스템이 일시적으로 도입되었는지 판단 여부는 형광을 통해 관찰하였다. 그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 형광 발현 여부를 통해 제작한 세 개의 TP53-특이적 CRISPR/Cas9 벡터 시스템이 성공적으로 개 섬유아세포에 도입된 것을 확인하였다.
구축한 개 TP53 유전자-표적 CRISPR / Cas9 벡터 시스템의 특이성 검증
본 발명에서 구축한 ‘개 TP53 유전자-표적 CRISPR/Cas9 벡터 시스템’의 특이성을 검증하기 위하여, 세포분석을 실시하였다.
일반적으로 포유류의 성체세포는 오랜 기간 체외 배양 시 세포수명이 다 되어 자연스럽게 더 이상 성장하지 않는 세포노화 현상이 나타난다. 하지만, TP53 유전자가 없는 세포의 경우, 세포 수명을 극복하여 세포 노화가 진행되지 않고 지속적으로 자라는 불멸화(cell immortalization) 상태가 된다고 보고되었다. 따라서, 본 실험에서 TP53유전자가 완전히 제거된 개 섬유아세포를 확보하기 위해 장기간 배양하여 지속적으로 자라는 세포를 확보하고자 하였다. 12 계대(passage) 후 세포 군집(colony)를 형성한 단일 클론들을 확보하여 각각의 세포주로 확립하였다. 이 후 세포의 형태학적 분석, 표적 유전체 서열 분석을 통해 도입한 개 TP53 유전자-표적 CRISPR/Cas9 시스템이 제대로 TP53을 넉아웃 하였는지 분석하였다.
그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 정상 개 섬유아세포는 약 8~9 계대(passage) 배양하면 세포노화가 관찰되는데, TP53 gRNA #30과 #39의 CRISPR/Cas9 벡터 시스템을 도입한 일부 세포 군집들이 노화되지 않고 지속적으로 자라는 경향을 보였다. TP53 gRNA #51의 경우에는 거의 모든 세포들이 노화되었으며, 일부 지속적으로 자라는 세포군집이 관찰되었으나 정상과는 다른 세포 형태를 보였다. 이는 TP53 gRNA #51의 오프-타겟 효과로 다른 유전자들에 돌연변이를 유도하여 생긴 결과로 예상하였다. 따라서, 본 결과를 통해 TP53 gRNA #30과 #39의 CRISPR/Cas9 벡터 시스템이 효과적으로 TP53을 표적하였음을 예상하였다.
또한, 정상세포와 형태학적으로 가장 유사한 세포주 세 개씩 선택하여 유전체 시퀀싱 기법을 수행하였다. 그 결과 도 6 및 7에서 나타낸 바와 같이, TP53 gRNA #30과 #39의 CRISPR/Cas9 벡터 시스템에 의해 표적되는 TP53 유전자 서열에 일부 서열이 삽입 또는 결실이 되어 있음을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명의 재조합 벡터가 도입된 세포에서 TP53 유전자가 넉아웃 되었음을 검증하였다.
추가적으로, 비특이적으로 표적될 가능성 있는 유사 서열 유전체를 분석하여 개 TP53 유전자에만 특이적인 CRISPR/Cas9 시스템을 선별하였다. 각 gRNA의 잠재적인 오프 타겟(off-target) 유전자는 BLAST 알고리즘을 사용하여 예측하였고, surveyor assay를 위한 최종 타겟 유전자는 각 TP53 gRNA (≥10 of 20) 및 NGG PAM 서열의 존재와 일치하는 뉴클레오타이드 수에 따라 선별하였다.
그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, TP53 gRNA #30에 잠재적인 오프 타겟 유전자로 ARHGAP15, APC, NEURL1 및 OVOL2가 선별되었으며, TP53 gRNA #39에 잠재적인 오프 타겟 유전자로 ATP8B2, C2CD2, TC3 및 TFE3가 선별되었다.
Surveyor assay는 유전체 내에 정상과 다른 돌연변이가 있음을 확인하는 실험으로, 이 실험을 통해 표적되는 TP53 유전자 서열과 비특이적으로 표적될 가능성이 있는 유전자 서열 내에 돌연변이가 발생했는지 검증하였다.
그 결과 도 9에서 나타낸 바와 같이, TP53 gRNA #30의 CRISPR/Cas9 벡터 시스템은 TP53에만 돌연변이를 유도하였으나, 반면에 TP53 gRNA #39의 CRISPR/Cas9 벡터 시스템은 TP53 이외에도 TFE3 유전자에도 돌연변이가 발생함을 관찰하여 비특이적인 기능이 있음을 확인하였다. 이를 통해 TP53 gRNA #30의 CRISPR/Cas9 벡터 시스템이 표적하고자 하는 TP53 유전자 서열에만 효과적으로 돌연변이를 유도함을 보여주었다.
개 TP53 유전자-표적 CRISPR / Cas9 벡터 시스템으로 제작한 TP53 넉아웃 개 섬유아세포 특성 검증
수많은 연구 결과를 통해 TP53 유전자는 세포에 문제가 생길 수 있는 다양한 스트레스나 외부 자극에 의해 세포의 성장 조절 및 세포 노화, 세포사멸을 조절하는 것으로 잘 알려져 있다. 세포의 TP53 유전자가 넉아웃 되었을 경우, 기본적으로 나타나는 형질에는 세포 성장 속도 증가, 세포 불멸화, 및 유전자 독성(genotoxic stress) 노출에서의 저항성과 같은 다양한 형질이 관찰됨이 보고되었다.
본 실험에서는 구축한 TP53 넉아웃 개 세포가 이와 같은 특성을 가지고 있는지 검증하고자 하였다. 첫 번째로 시간에 따라 분열되는 세포의 수를 측정하여 증식(proliferation) 속도와 세포 수명을 극복한 불멸화 현상이 보이는지 검증하였다. 14 계대 후 각각의 세포가 노화되었는지 여부를 판단하기 위해 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase) 염색을 수행하였다. 또한 DNA에 손상을 주는 약물인 테모졸로미드(Temozolomide) 처리 후, p53의 양과 p53에 의해 조절되는 p21의 양을 웨스턴블랏(western blotting) 기법으로 측정하여, p53의 기능이 완전히 상실되었는지에 대한 검증을 수행하였다. 한편, TP53 gRNA #30의 CRISPR/Cas9 벡터 시스템으로 만든 세포주를 ‘TP53KO#30’, TP53 gRNA #39의 CRISPR/Cas9 벡터 시스템으로 만든 세포주를 ‘TP53KO#39’로 각각 명명하였다.
그 결과는 도 10 내지 도 14에서 자세히 나타내었다.
TP53KO#30 및 TP53KO#39 세포주에서 EGFP를 발현 여부를 FACS (fluorescence activating cell sorting) 장비로 관찰한 결과, 구축한 세포에서 초록 형광이 발현되지 않아 본 발명의 CRISPR/Cas9 벡터가 숙주 게놈에 통합되지 않음을 확인하였다(도 10 참조).
TP53KO#30과 TP53KO#39 세포주 모두 정상세포에 비해 세포 증식 속도가 증가하는 것을 확인하였으며(도 11 참조), 정상세포는 시간이 지날수록 증식속도가 저하되어 10 계대 전 후로 거의 자라지 않는 상태로 돌입하는데 반해, TP53KO#30과 TP53KO#39 세포 모두 일정한 속도로 증식하는 것을 확인하였다(도 12 참조).
또한, 14 계대 후 각 세포의 형태를 살펴본 결과, 정상세포는 노화된 세포 형태를 보이는데 반해, TP53KO#30과 TP53KO#39 세포는 노화된 형태를 보이지 않았다(도 13 좌측 맨 위 사진 참조). 상기 세포를 대상으로 세포노화 표지 기법인 베타-갈락토시다아제 염색을 수행한 결과, 정상세포는 세포 노화로 파란색으로 염색된 세포가 관찰되는 반면, TP53KO#30과 TP53KO#39 세포에서는 베타-갈락토시다아제 양성인 세포는 거의 발견되지 않는 것을 확인하였다(도 13 좌측 맨 아래 사진 참조). 베타-갈락토시다아제 염색 결과를 정량적으로 분석한 결과, 58%의 세포가 베타-갈락토시다아제 염색 양성을 보이는 정상세포에 비해 TP53KO#30과 TP53KO#39는 각각 2%와 3%로 나타나 오랜 배양기간에도 노화현상이 거의 나타나지 않았음을 확인하였다(도 13 우측 그래프 참조).
한편, 테모졸로미드를 48시간 처리 후, p53의 증가 여부와 p53에 의해 조절되는 p21의 증가여부를 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인한 결과, 정상 세포와는 달리 TP53KO#30과 TP53KO#39 세포에서 p53과 p21이 전혀 관찰이 되지 않는 것을 확인하였다(도 14 참조). 이러한 결과를 통해, 구축한 TP53KO#30과 TP53KO#39 세포는 정상적으로 TP53 유전자가 넉아웃되었으며, 그에 따라 p53의 기능이 상실되었음을 증명하였다.
개 TP53 유전자-표적 CRISPR / Cas9 벡터 시스템으로 제작한 TP53 넉아웃 개 섬유아세포의 종양 연구에서의 활용도 검증
실제 환자에서 나타나는 것처럼 현재까지 개발된 많은 형질전환 설치류 동물 및 세포 종양 모델은 종양억제 신호체계의 불활성화와 종양유전자 신호체계의 활성화를 동시에 유도해 종양 형성을 유도한다. 본 실험에서는 개 TP53 유전자-표적 CRISPR/Cas9 벡터 시스템으로 제작한 TP53 넉아웃 세포가 이러한 종양형성 메커니즘을 연구할 수 있는 적합한 세포 모델인지 검증하고자 하였다.
일반적으로 정상 포유동물 세포는 종양 억제 유전자의 불활성화와 종양 유전자의 활성화가 동반되었을 때 종양세포화가 잘 나타난다고 알려져 있다. 따라서 TP53 넉아웃 세포에 종양 유전자를 추가 도입하여 종양세포화가 나타나는지 관찰하고자 하였다. 이를 위해, 가장 많이 연구에 이용되는 종양 유전자인 인간의 돌연변이 유전자 HRASV12 유전자[12번째 글라이신(Glycine) 잔기가 발린(Valine) 잔기로 치환된 돌연변이 인간 HRAS 유전자: 서열번호 28로 표시되는 염기서열]가 포함된 렌티바이러스 벡터를 제작하여 세포에 감염시켰다. 본 발명의 돌연변이 인간 HRAS 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터맵은 도 15에서 자세히 나타내었으며, 상기 벡터의 전체 유전자 염기서열은 서열번호 29로 나타내었다.
HRASV12 과발현 여부 및 하부신호 활성화 여부는 웨스턴블랏 기법을 통해 확인하였다. 먼저, 시험관(in vitro) 수준에서 종양세포화를 검증하기 위해 세포 형태의 변화 및 세포 성장능을 관찰하고 종양세포의 특성인 부착비의존성(anchorage-independence)을 검증하는 실험 기법인 soft agar assay 실험을 수행하였다. 최종적으로 CRISRP/Cas9 벡터 시스템의 오프-타겟 효과 및 종양세포의 성격을 보이지 않았던 TP53KO#30를 이용해 체내(in vivo) 수준에서 종양세포화가 되는지 검증하였다. 이를 위해 각각 200만개의 TP53KO#30 세포와 HRASV12를 과발현한 TP53KO#30 각각의 세포를 면역결핍생쥐의 피하조직에 주입하여 종양 형성 여부를 비교하였다.
그 결과 도 16에서 나타낸 바와 같이, TP53KO#30과 TP53KO#39 세포에 HRASV12 종양유전자를 도입한 경우, 두 세포주 모두에서 HRASV12 종양유전자가 과발현되며, 이와 더불어 ERK1/2와 AKT의 인산화가 증대되는 것으로 나타나, MAPK 신호와 PI3K/AKT 신호가 활성화되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, TP53KO#30과 TP53KO#39 세포에 HRASV12 유전자를 통해 개의 종양신호체계를 활성화할 수 있음을 확인하였다.
각 세포들의 자라는 형태를 관찰한 결과, TP53KO#30 세포는 정상세포와 유사한 형태로 자라는데 반해, TP53KO#39 및 HRASV12를 과발현한 TP53KO#30와 TP53KO#39 세포 모두 종양세포와 유사한 형태로 자라는 것을 확인하였다(도 17 참조). 참고로, 종양세포는 정상세포와 달리 일반적으로 배양배지에서 여러 층으로 겹쳐서 지속적으로 자라는 양상을 보이는 특징을 갖는다.
부착비의존성을 검증하는 soft agar assay 실험 결과에서도 TP53KO#30 세포만이 부착비의존성을 보이지 않았으며 나머지 세 세포들은 모두 부착비의존적 성장을 할 수 있다는 것을 보여주었다(도 18 참조).
TP53KO#30와 TP53KO#39 세포의 성장능은 HRASV12에 의해 촉진되는 경향은 보이지 않았다(도 19 참조).
한편, TP53KO#30 세포와 HRASV12를 과발현한 TP53KO#30 각각의 세포를 면역결핍생쥐의 피하조직에 주입하여 종양 형성 여부를 실험한 결과, TP53KO#30세포를 주입한 경우 모두 종양형성이 나타나지 않는 반면, HRASV12를 과발현한 TP53KO#30 세포에서는 종양형성을 보여주었다(도 20 좌측 사진 참조). TP53KO#30 세포는 종양을 전혀 만들지 못해 크기를 측정할 수 없었으며, HRASV12를 과발현 한 TP53KO#30 세포는 주입 후 28일차에 평균 1,266mm3 크기의 종양을 발달할 수 있음을 확인하였다(도 20 우측 그래프 참조). TP53KO#30세포는 6회의 실험군 모두 종양이 형성되지 않았고, HRASV12를 과발현 한 TP53KO#30 세포는 6회의 실험군 모두 종양이 발달되었음을 확인하였다(도 20 우측 표 참조).
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 개 TP53 유전자-표적 CRISPR/Cas9 벡터 시스템으로 제작한 TP53 넉아웃 개 섬유아세포의 경우 종양연구 모델 세포로써 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> Canine TP53 gene knock-out vector and Neoplastic model cell using the same <130> NPDC-78239 <160> 29 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TP53 gRNA #30 polynucleotide sequence <400> 1 taggtgccag ggtaggtctt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TP53 gRNA #39 polynucleotide sequence <400> 2 tcccagagag cgtcgtgaac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TP53 gRNA #51 polynucleotide sequence <400> 3 gtttggggtt cctgcattcc 20 <210> 4 <211> 10314 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucelotide seqence of pcDNA3.1-neo-U6-dogTP53 gRNA#30-EF1-Cas9-2A-EGFP <400> 4 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg 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Val Glu Gln His Lys His 1250 1255 1260 Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val 1265 1270 1275 1280 Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys 1285 1290 1295 His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu 1300 1305 1310 Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp 1315 1320 1325 Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp 1330 1335 1340 Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile 1345 1350 1355 1360 Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1365 <210> 28 <211> 570 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRASV12 gene polynucleotide sequence <400> 28 atgacggaat ataagctggt ggtggtgggc gccgtcggtg tgggcaagag tgcgctgacc 60 atccagctga tccagaacca ttttgtggac gaatacgacc ccactataga ggattcctac 120 cggaagcagg tggtcattga tggggagacg tgcctgttgg acatcctgga taccgccggc 180 caggaggagt acagcgccat gcgggaccag tacatgcgca ccggggaggg cttcctgtgt 240 gtgtttgcca tcaacaacac caagtctttt gaggacatcc accagtacag ggagcagatc 300 aaacgggtga aggactcgga tgacgtgccc atggtgctgg tggggaacaa gtgtgacctg 360 gctgcacgca ctgtggaatc tcggcaggct caggacctcg cccgaagcta cggcatcccc 420 tacatcgaga cctcggccaa gacccggcag ggagtggagg atgccttcta cacgttggtg 480 cgtgagatcc ggcagcacaa gctgcggaag ctgaaccctc ctgatgagag tggccccggc 540 tgcatgagct gcaagtgtgt gctctcctga 570 <210> 29 <211> 8149 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucelotide seqence of pCDH-CMV-HRasV12-EF1-puro <400> 29 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1800 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1860 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1920 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1980 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2040 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2100 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2160 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2220 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2280 agagctagcg aattcgaatt taaatcggat cccagtgtgg tggtacagct tggggggcca 2340 gggccggggc cgagcgatga cggaatataa gctggtggtg gtgggcgccg tcggtgtggg 2400 caagagtgcg ctgaccatcc agctgatcca gaaccatttt gtggacgaat acgaccccac 2460 tatagaggat tcctaccgga agcaggtggt cattgatggg gagacgtgcc tgttggacat 2520 cctggatacc gccggccagg aggagtacag cgccatgcgg gaccagtaca tgcgcaccgg 2580 ggagggcttc ctgtgtgtgt ttgccatcaa caacaccaag tcttttgagg acatccacca 2640 gtacagggag cagatcaaac gggtgaagga ctcggatgac gtgcccatgg tgctggtggg 2700 gaacaagtgt gacctggctg cacgcactgt ggaatctcgg caggctcagg acctcgcccg 2760 aagctacggc atcccctaca tcgagacctc ggccaagacc cggcagggag tggaggatgc 2820 cttctacacg ttggtgcgtg agatccggca gcacaagctg cggaagctga accctcctga 2880 tgagagtggc cccggctgca tgagctgcaa gtgtgtgctc tcctgacgca gcacaagctc 2940 aggacatgga ggtgccggat gcaggaagga ggtgcagacg gaaggaggag gaaggaagga 3000 cggaagcaag gaaggaagga agggctgctg gagcccagtc accccccaag ctgtaggaat 3060 tcgccagcac agtggtcgag gccgcgaagg atctgcgatc gctccggtgc ccgtcagtgg 3120 gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacg 3180 ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc 3240 ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 3300 tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag ctgaagcttc gaggggctcg catctctcct 3360 tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc ggttgagtcg cgttctgccg 3420 cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct aggtaagttt aaagctcagg 3480 tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac ctagactcag ccggctctcc 3540 acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg tttcgttttc tgttctgcgc 3600 cgttacagat ccaagctgtg accggcgcct acgctagatg accgagtaca agcccacggt 3660 gcgcctcgcc acccgcgacg acgtccccag ggccgtacgc accctcgccg ccgcgttcgc 3720 cgactacccc gccacgcgcc acaccgtcga tccggaccgc cacatcgagc gggtcaccga 3780 gctgcaagaa ctcttcctca cgcgcgtcgg gctcgacatc ggcaaggtgt gggtcgcgga 3840 cgacggcgcc gcggtggcgg tctggaccac gccggagagc gtcgaagcgg gggcggtgtt 3900 cgccgagatc ggcccgcgca tggccgagtt gagcggttcc cggctggccg cgcagcaaca 3960 gatggaaggc ctcctggcgc cgcaccggcc caaggagccc gcgtggttcc tggccaccgt 4020 cggcgtctcg cccgaccacc agggcaaggg tctgggcagc gccgtcgtgc tccccggagt 4080 ggaggcggcc gagcgcgccg gggtgcccgc cttcctggag acctccgcgc cccgcaacct 4140 ccccttctac gagcggctcg gcttcaccgt caccgccgac gtcgaggtgc ccgaaggacc 4200 gcgcacctgg tgcatgaccc gcaagcccgg tgcctgagtc gacaatcaac ctctggatta 4260 caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg 4320 atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc 4380 ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca 4440 acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac 4500 cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact 4560 catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc 4620 cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccacctg 4680 gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc 4740 ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac 4800 gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcctggtacc tttaagacca atgacttaca 4860 aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc 4920 actcccaacg aaaataagat ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg ttagaccaga 4980 tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct 5040 tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat 5100 ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tagtagttca tgtcatctta 5160 ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg aacttgttta 5220 ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 5280 ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 5340 ggctctagct atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg 5400 actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa 5460 gtagtgagga ggcttttttg gaggcctaga cttttgcaga gacggcccaa attcgtaatc 5520 atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 5580 agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 5640 tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 5700 aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 5760 cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 5820 ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 5880 ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 5940 cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 6000 actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 6060 cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 6120 tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 6180 gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 6240 caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 6300 agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 6360 tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 6420 tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 6480 gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 6540 gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 6600 aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 6660 atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 6720 gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 6780 acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 6840 ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 6900 tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 6960 ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 7020 ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 7080 atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 7140 taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 7200 catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 7260 atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 7320 acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 7380 aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 7440 ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 7500 cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 7560 atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 7620 ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 7680 ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt 7740 tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 7800 ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 7860 gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag 7920 agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 7980 gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc 8040 gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 8100 agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gccaagctg 8149

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 가이드 RNA(guide RNA); 및 Cas 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 개의 TP53 유전자 타겟팅용 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Cas 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 Cas9 단백질인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 Cas 단백질은 NGG 트리뉴클레오타이드(trinucledotide)와 도입한 가이드 RNA 서열에 상보적인 염기서열을 인식하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 벡터는 형광단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제1항의 재조합 벡터가 도입된, 형질전환 세포주.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 세포주는 종양유전자 과발현 벡터가 추가로 도입된, 형질전환 세포주.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 종양유전자는 RAS 유전자인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포주.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 세포주는 개의 종양형성 세포 모델인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포주.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 개 유래 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 형질전환 세포주 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 세포는 개 유래의 접합체(zygote), 섬유아세포, 신경계 세포, 피부세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포주 제조방법.
  11. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 세포주에 항암제 후보물질을 처리하는 단계; 및
    상기 후보물질을 처리한 세포주를 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 종양형성이 개선되거나 치료되는 경우 이를 항암제로 판단하는 단계를 포함하는, 항암제의 스크리닝 방법.
  12. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 세포주가 이식되어 종양이 형성된, 인간을 제외한 종양형성 동물모델.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 동물모델은 개의 TP53 유전자가 넉아웃된 것을 특징으로 하는, 인간을 제외한 종양형성 동물모델.
  14. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 세포주를 동물의 피하에 이식하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 종양형성 동물모델 제조방법.
  15. 제12항의 동물모델에 항암제 후보물질을 투여하는 단계; 및
    상기 후보물질을 투여한 동물모델을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 종양형성이 개선되거나 치료되는 경우 이를 항암제로 판단하는 단계를 포함하는, 항암제의 스크리닝 방법.
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