CN116848237A - 病毒样颗粒及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有高亲和力蛋白质附着系统的病毒样颗粒(VLP)，该系统允许与任何选择的功能性分子进行可互换的修饰。本发明还涉及生产VLP的方法，包括快速单细胞方法，以及VLP在研究、诊断和作为疫苗用于预防/治疗疾病中的用途。

Description

病毒样颗粒及其生产方法
技术领域
本发明涉及具有高亲和力蛋白质附着系统的病毒样颗粒(VLP)，该系统允许与任何选择的功能性分子进行可互换的修饰。本发明还涉及生产VLP的方法，包括快速单细胞方法，以及VLP在研究、诊断和作为疫苗用于疾病预防/治疗中的用途。
背景技术
病毒样颗粒(VLP)是与病毒非常相似但不含病毒遗传物质的分子。它们由病毒结构蛋白如病毒衣壳蛋白形成，当单独表达时，病毒衣壳蛋白自组装成颗粒。大多数病毒样颗粒看起来像中空的“纳米足球”，其中足球的整个表面由单个自组装蛋白质的许多拷贝组成。就生产目的而言，这意味着生产一个单一的蛋白质就足以产生一个大的纳米足球型VLP结构。
这已在医学上得到利用。VLP最常见的用途是作为疫苗。这背后的基本机制是，哺乳动物已经进化出免疫感应机制，将病毒衣壳上发现的高度重复模式识别为入侵者。这些模式仍然存在于VLP中，VLP包含重复的、高密度的病毒表面蛋白展示，但是去除了有害的病毒基因组。这是VLP用作针对引起宫颈癌的人乳头瘤病毒(HPV)的疫苗的形式。目前市面上有这种类型的HPV疫苗可供选择，如GlaxoSmithKline的Cervarix和Merck&Co生产的Gardasil和Gardasil-9。
用作疫苗的VLP的进一步开发包括将其他因子(agent)与VLP外壳结合。在这种情况下，VLP外壳作为“表位”向免疫系统呈递额外的因子。在一些情况下，形成VLP外壳的病毒衣壳蛋白可以被修饰以通过基因融合直接并入用于展示的表位。然而，这种方法通常导致VLP组装受损，大蛋白通常导致VLP不稳定。此外，如果该因子不是基于蛋白质的，则不能使用这种方法。目前正在开发的COVID19疫苗使用这种形式的VLP，其中来自冠状病毒的刺突蛋白直接融合到病毒衣壳蛋白，形成来自无关病毒的VLP外壳。
另一种选择是组装VLP，然后使用附着手段将该因子固定到VLP外壳上。这种使用额外附着手段的VLP可以被称为“复合VLP”。复合VLP可通过诸如化学交联、反应性非天然氨基酸或使用结合蛋白(如SpyTag/SpyCatcher系统)的方法来制造，以将所需因子共价附着到形成外壳的病毒衣壳蛋白上。
后一种方法允许将其他非蛋白表位附着到VLP上，但是需要复杂的生产过程，并且还不能用于任何因子。一些所需的蛋白质太大，以至于不能使用现有的附着手段附着到VLP外壳上，并且一些复杂的表位包括具有许多必须单独连接在一起的组分的多聚体，这必须通过额外的化学交联来实现。
目前用作附着手段的结合蛋白，例如在SpyTag/SpyCatcher系统中，具有进一步的问题，即蛋白之间的结合虽然很强，但不会立即发生，而是需要时间使反应物融合，并且会导致VLP-外壳聚集，这取决于哪种因子附着到外壳上。
对于人类或兽医临床应用中使用的VLP，监管机构将VLP归类为“生物”活性药物中间体(ADI)。“生物”药物是在活细胞中生产的，然后根据监管机构批准的过程进行纯化。用于生产的每种细胞系(无论是细菌/植物/酵母/昆虫/哺乳动物)都经过详细表征，以保证ADI的长期稳定性，并作为所谓的“主细胞库”(MCB)在高度指定的条件下储存。如果VLP需要两种(或甚至更多种)蛋白质来组装，例如当蛋白质用于将表位附着到VLP外壳时，那么目前药物的每种蛋白质组分需要一种MCB，并且两者都需要单独的纯化过程，每种都需要单独的表征程序，因为两者都被归类为“关键药物中间体”。此外，每种关键药物中间体以及最终ADI都需要单独的质量控制放行，这增加了生产成本。
除了这些复杂性之外，对于每个表位，必须从头开始建立表位的生产。从财务上来说，最有效的生产细胞类型是细菌(具体来说：大肠杆菌)。然而，当在大肠杆菌中生产时，许多蛋白质并不呈现它们的天然形状，而是必须作为纯化过程的一部分从变性状态重新折叠成它们的正确形式，这导致总产率的巨大下降并显著增加了过程的复杂性。
由于所有这些特征，试图将诸如表位之类的因子附着到病毒衣壳蛋白上的复合VLP型药物的生产过程复杂且昂贵。这限制了对VLP应用的广泛探索，使其局限于那些廉价的大规模生产可以使其更具竞争力的领域。
理想的是提供具有模块化能力的复合VLP，以展示几乎任何所需的因子，包括非蛋白质、在大肠杆菌内难以折叠的那些蛋白质以及复杂且大的那些蛋白质，如多聚体。还希望通过更简单的方法生产这种复合VLP，该方法只需要使用一种细胞系，并且其中VLP外壳和待展示的因子可以在细胞系内自组装。
本发明的一个或多个方面旨在解决一个或多个上述问题。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种病毒样颗粒(VLP)，其包含：
-一个或多个乙型肝炎衣壳蛋白
-一个或多个结合蛋白对，每个结合蛋白对包含第一结合蛋白和第二结合蛋白，其中结合蛋白对包含细菌毒素及其抑制剂
-一个或多个功能性分子
其中每个乙型肝炎衣壳蛋白附着于第一结合蛋白，其中每个功能性分子附着于第二结合蛋白，并且其中第一和第二结合蛋白彼此结合。
在一个实施方案中，所述一个或多个第一结合蛋白可以包含化学修饰。
在一个实施方案中，化学修饰可以附着于第二功能性分子。
在一个实施方案中，第一和第二功能性分子可以不同。在一个实施方案中，第一功能性分子可以选自抗原或抗原结合蛋白，如抗体。在一个实施方案中，第二功能性分子可以是荧光标记。
在一个实施方案中，如果功能性分子之一是抗原结合蛋白，那么VLP可以进一步包含第三结合蛋白，其中抗原结合蛋白附着于第三结合蛋白，并且第三结合蛋白进而附着于第二结合蛋白。在一个实施方案中，第三结合蛋白是蛋白G。因此，合适地，功能性分子可以直接或间接附着于第二结合蛋白。合适地，功能性分子可以通过第三结合白间接附着于第二结合蛋白。
根据本发明的第二方面，提供了一种病毒样颗粒(VLP)，其包含：
-一个或多个病毒衣壳蛋白
-一个或多个结合蛋白，其包含化学修饰，其中每个结合蛋白是细菌毒素抑制剂；
-一个或多个功能性分子
其中每个病毒衣壳蛋白附着于结合蛋白，并且其中每个化学修饰附着于功能性分子。
在一个实施方案中，功能性分子是非蛋白质分子，合适地是非蛋白质抗原或荧光分子。
在一个实施方案中，VLP可以进一步包含第二结合蛋白，其中第二结合蛋白与第一结合蛋白结合。在一个实施方案中，第二结合蛋白可以附着于第二功能性分子。
在一个实施方案中，第二结合蛋白可以是细菌毒素。合适地，是与细菌毒素抑制剂结合的细菌毒素。
在一个实施方案中，第一和第二功能性分子可以不同。在一个实施方案中，第一功能性分子可以是荧光标记。在一个实施方案中，第二功能性分子可以选自抗原或抗原结合蛋白，如抗体。
在一个实施方案中，如果功能性分子之一是抗原结合蛋白，那么VLP进一步包含第三结合蛋白，其中抗原结合蛋白附着于第三结合蛋白，并且第三结合蛋白进而附着于第二结合蛋白。在一个实施方案中，第三结合蛋白是蛋白G。因此，合适地，第二功能性分子可以直接或间接附着于第二结合蛋白。合适地，第二功能性分子可以通过第三结合蛋白间接附着于第二结合蛋白。
根据本发明的第三方面，提供了一种衣壳融合蛋白，其包含与结合蛋白融合的病毒衣壳蛋白，其中结合蛋白是细菌毒素抑制剂。
在一个实施方案中，病毒衣壳蛋白是乙型肝炎病毒衣壳蛋白。
在一个实施方案中，衣壳融合蛋白包含SEQ ID NO:12、13、14或15。
在一个实施方案中，结合蛋白包含化学修饰。
根据本发明的第四方面，提供了一种功能性融合蛋白，其包含与结合蛋白融合的功能性分子，其中结合蛋白是细菌毒素。
在一个实施方案中，功能性融合蛋白包含SEQ ID NO:16、17、18、19、21或46。
根据本发明的替代的第四方面，提供了一种功能性融合蛋白，其包含与另一结合蛋白融合的第一结合蛋白，其中第一结合蛋白是细菌毒素，并且另一结合蛋白能够捕获功能性分子，所述功能性分子为抗原结合蛋白。
在一个实施方案中，另一结合蛋白能够与功能性分子结合。合适地，在这样的实施方案中，功能性分子是抗原结合蛋白，如抗体。合适地，另一结合蛋白是本文别处所述的第三结合蛋白。在一个实施方案中，另一结合蛋白是蛋白G。
在一个实施方案中，功能性融合蛋白包含SEQ ID NO:20。
根据本发明的第五方面，提供了编码第三方面的衣壳融合蛋白或第四方面的功能性融合蛋白的一种或多种核酸。
在一个实施方案中，所述核酸编码衣壳融合蛋白并包含选自SEQ ID NO:22、23、24或25的序列。
在一个实施方案中，所述核酸编码功能性融合蛋白并包含选自SEQ ID NO:26、27、28、29、30、32、41或45的序列。
根据本发明的第六方面，提供了包含第五方面的一种或多种核酸的一种或多种载体。
在一个实施方案中，所述载体可以包含选自SEQ ID NO:1-11、47或48的序列。
根据本发明的第七方面，提供了包含第五方面的一种或多种核酸或第六方面的载体的宿主细胞。
根据本发明的第八方面，提供了包含一种或多种载体的宿主细胞，所述一种或多种载体包含编码附着于第一结合蛋白的乙型肝炎衣壳蛋白的第一核酸；和编码附着于第二结合蛋白的功能性分子的第二核酸；其中第一和第二结合蛋白能够彼此结合。
根据本发明的第九方面，提供了包含一种或多种载体的宿主细胞，所述一种或多种载体包含编码附着于第一结合蛋白的病毒衣壳蛋白的第一核酸；和编码功能性分子的第二核酸；其中功能性分子能够通过第一结合蛋白的化学修饰与第一结合蛋白结合。
根据本发明的第十方面，提供了一种在单一宿主细胞中生产病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：
(a)提供包含一种或多种载体的宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)第一核酸，其编码附着于第一结合蛋白的病毒衣壳蛋白；和
(ii)(a)第二核酸，其编码任选地附着于第二结合蛋白的功能性分子；和/
或
(b)第三核酸，其编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白；
(b)在分别表达来自第一、第二和/或第三核酸的蛋白质的条件下培养宿主细胞；
(c)从蛋白质形成病毒样颗粒。
在一个实施方案中，病毒衣壳蛋白是乙型肝炎衣壳蛋白。在一个实施方案中，第一结合蛋白是细菌毒素抑制剂。在一个实施方案中，第二结合蛋白是细菌毒素。
在一个实施方案中，步骤(b)进一步包括在使得蛋白质彼此结合的条件下培养。
在一些实施方案中，在培养步骤中，第一结合蛋白可以被化学修饰。因此，合适地，所述条件是使得第一结合蛋白被化学修饰。
在其他实施方案中，所述方法进一步包括回收蛋白质，随后化学修饰第一结合蛋白的步骤。合适地，这些步骤发生在步骤(b)之后但在步骤(c)之前。
在一些实施方案中，所述一种或多种载体可以进一步包含编码第二功能性分子的另一核酸。在一些实施方案中，当第二核酸编码附着于第二结合蛋白的功能性分子时，这可能发生。合适地，在这样的实施方案中，第一结合蛋白被化学修饰。
在一些实施方案中，所述一种或多种载体可以包含选项(ii)(a)编码附着于第二结合蛋白的功能性分子的第二核酸。合适地，在这样的实施方案中，第一结合蛋白可以或可以不被化学修饰。
在一些实施方案中，所述一种或多种载体可以包含选项(ii)(b)编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白的核酸。合适地，在这样的实施方案中，一旦形成，合适地在步骤(d)之后，可将用于附着于第三结合蛋白的功能性分子加入VLP。或者，可在选项(ii)(a)的第二核酸上编码用于附着于第三结合蛋白的功能性分子，合适地，其中第二核酸可以仅编码功能性分子。
因此，在一些实施方案中，所述一种或多种载体可以包含选项(ii)(a)编码功能性分子的第二核酸，和选项(ii)(b)编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白的核酸。
合适地，在这样的实施方案中，在从每种核酸表达蛋白质的条件下培养宿主细胞。
在一个实施方案中，第一结合蛋白被化学修饰。合适地，在这样的实施方案中，所述一种或多种载体可以包含选项(ii)(a)，并且第二核酸可以仅编码功能性分子。
在一个实施方案中，步骤(c)包括与每个第二结合蛋白结合的每个第一结合蛋白。在替代的实施方案中，步骤(c)包括合适地通过化学修饰与功能性分子结合的每个第一结合蛋白。在一个实施方案中，步骤(c)包括这两个步骤。
合适地，所述方法可以进一步包括步骤(d)：向病毒样颗粒添加功能性分子，合适地通过附着于第三结合蛋白(如果存在的话)。
根据本发明的第十一方面，提供了一种生产病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：
(a)提供包含一种或多种载体的第一宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)第一核酸，其编码附着于第一结合蛋白的乙型肝炎衣壳蛋白，其中第一结合蛋白是细菌毒素抑制剂；
(b)提供包含一种或多种载体的一种或多种另外的宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)第二核酸，其编码任选地附着于第二结合蛋白的功能性分子，其中第二结合蛋白是细菌毒素；和/或
(ii)第三核酸，其编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白，其中第二结合蛋白是细菌毒素；
(c)在分别表达来自第一、第二和/或第三核酸的蛋白质的条件下培养宿主细胞；
(d)回收蛋白质；
(e)混合蛋白质形成病毒样颗粒。
在一些实施方案中，在培养步骤中，第一结合蛋白可以被化学修饰。因此，合适地，培养第一宿主细胞的条件是使得第一结合蛋白被化学修饰。
在其他实施方案中，所述方法可以包含化学修饰第一结合蛋白的步骤。合适地，这一步骤发生在步骤(b)之后但在步骤(e)之前。
在一个实施方案中，第一结合蛋白被化学修饰。合适地，在这样的实施方案中，第二核酸可以仅编码功能性分子。
在一个实施方案中，第二核酸编码附着于第二结合蛋白的功能性分子。合适地，在这样的实施方案中，第一结合蛋白可以或可以不被化学修饰。
在一些实施方案中，所述一种或多种载体可以进一步包含编码第二功能性分子的核酸。在一些实施方案中，当第二核酸编码附着于第二结合蛋白的功能性分子时，这可能发生。合适地，另一核酸可以包含在第一或另外的宿主细胞中的载体上。合适地，在这样的实施方案中，第一结合蛋白被化学修饰。
在一些实施方案中，所述一种或多种载体可以包含选项(b)(i)编码附着于第二结合蛋白的功能性分子的第二核酸，其中第二结合蛋白是细菌毒素。合适地，在这样的实施方案中，第一结合蛋白可以或可以不被化学修饰。
在一些实施方案中，所述一种或多种载体可以包含选项(b)(ii)编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白的第三核酸。合适地，在这样的实施方案中，一旦形成，合适地在步骤(e)之后，可将用于附着于第三结合蛋白的功能性分子加入VLP。或者，可在第二核酸上编码用于附着于第三结合蛋白的功能性分子。合适地，在这样的实施方案中，第二核酸可以仅编码功能性分子。
因此，在一些实施方案中，在任意宿主细胞中的所述一种或多种载体可以包含(b)(i)编码功能性分子的第二核酸，和(b)(ii)编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白的第三核酸。
合适地，第二宿主细胞可以包含一种或多种载体，其编码单独的(b)(i)的核酸或(b)(i)和(b)(ii)的核酸。
合适地，第三宿主细胞可以包含一种或多种载体，其编码(b)(ii)的核酸。
合适地，在这样的实施方案中，在从每种核酸表达蛋白质的条件下培养宿主细胞。
在一个实施方案中，步骤(e)包括与每个第二结合蛋白结合的每个第一结合蛋白。在替代的实施方案中，步骤(e)包括合适地通过化学修饰与每个功能性分子结合的每个第一结合蛋白。在一个实施方案中，步骤(e)包括这两个步骤。
在一个实施方案中，步骤(e)进一步包括在使得蛋白质彼此结合的条件下混合。
合适地，所述方法可以包括步骤(f)：向病毒样颗粒添加功能性分子，合适地通过附着于第三结合蛋白(如果存在的话)。
根据本发明的第十二方面，提供了包含第一或第二方面的病毒样颗粒的免疫原性组合物。
根据本发明的第十三方面，提供了第一或第二方面的病毒样颗粒(VLP)或第十一方面的免疫原性组合物，其用作药物。
根据本发明的第十四方面，提供了第一或第二方面的病毒样颗粒(VLP)或第十一方面的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗传染性疾病、心血管疾病、癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、神经性疾病、代谢疾病、风湿退行性疾病或成瘾。
根据本发明的第十五方面，提供了第一或第二方面的病毒样颗粒(VLP)在研究或疾病诊断中的用途。
根据本发明的第十六方面，提供了一种诊断受试者疾病的方法，其包括：
(a)提供根据第一或第二方面的病毒样颗粒，其中功能性分子是针对源自致病因子的抗原的抗体；
(b)将病毒样颗粒与来自受试者的合适样品混合；
(c)检测病毒样颗粒是否沉淀；
(d)如果VLP沉淀，则诊断疾病的存在。
有利地，本发明提供了一种新的VLP结构，该结构利用细菌毒素和抑制剂蛋白结合对的所需特性将功能性分子附着于VLP外壳上。在本发明之前，这种类型的蛋白结合对在VLP环境中的使用从未被测试过。本发明人发现，与乙型肝炎衣壳蛋白组合，细菌毒素和抑制剂蛋白结合对的使用提供了非常稳定的VLP，几乎任何功能性分子都可以附着于其上。高亲和力结合可以应用于任何功能性分子，而不必确定给定分子连接到VLP外壳的条件。此外，该系统允许甚至大且完整的蛋白质被“粘贴”到VLP外壳上，这不能以与VLP-外壳蛋白质直接融合来完成。本发明人设计了乙型肝炎衣壳蛋白和毒素/抑制剂的组合，其以特定的方向放置，使得当VLP形成时，结合蛋白相互背离并且不相互干扰，从而避免衣壳不稳定。此外，还发现乙型肝炎病毒衣壳耐受这种融合而不丧失结构。更进一步，乙型肝炎衣壳蛋白核心单元是二聚体，这允许两个乙型肝炎衣壳单体各自附着于二聚体功能性分子的单体上。当两个乙型肝炎衣壳单体在组装过程中聚到一起时，VLP可以展示二聚体功能性分子，如天然形式的某些关键细胞因子。本发明人已经成功地设法展示了二聚体功能性分子，如IL17，其在以前很难遗传融合到VLP结构中。
本发明进一步提供了一种生产VLP的新方法，其在一个宿主细胞内发生。这种方法比目前生产VLP的方法简单得多，因此成本也低。这一过程有可能极大地降低药物治疗成本，增加患者获得VLP治疗的机会。本发明人惊奇地发现，上述新的VLP结构也提供了生产上的优势，使得这种单细胞方法成为可能。本发明人发现，通过将VLP衣壳蛋白融合到毒素蛋白上，并将功能性分子融合到配偶体(partner)抑制剂蛋白上，那么一旦两种融合蛋白都在细胞中产生，由于细菌毒素和抑制剂对的高亲和力结合，VLP将在单一细胞内自组装。
此外，细菌毒素和抑制剂对的使用还提供了这样的优点，即不同的电荷分布在VLP外壳上产生均匀的负表面电荷。这阻止了在生产过程中VLP之间形成不期望的聚集体和团块。更进一步，带正电荷的结合蛋白(通常是毒素)与功能性分子的融合同时在生产过程中作为功能性分子的“分子伴侣(chaperone)”。这意味着功能性分子，如某些蛋白质，当它们自身产生时，可能是不可溶的或者甚至对宿主细胞是有毒的，在许多情况下，由于与细菌毒素融合，它们失去毒性和/或变得可溶。通过促进许多难以产生的蛋白质的产生，这进一步增加了系统的一般效用。
此外，令人惊讶的是，本发明人已经发现，可以使用化学品如DEAE或辛胺对毒素抑制剂进行化学修饰，这使得除了毒素抑制剂与毒素配偶体的结合之外，并且独立于毒素抑制剂与毒素配偶体的结合，还可以将另外的功能性分子附着于蛋白质结合对上。这种化学反应提供了修饰VLP的第二种方法，例如用小的化学品，如荧光染料，连接到辛胺上，与毒素融合蛋白的修饰并行或替代毒素融合蛋白的修饰。这进而允许VLP结构具有巨大的灵活性和多功能性，可以选择将多个功能性分子附着于一个蛋白结合对上，其可能具有不同的功能。
总之，本发明人创造了一种新的VLP系统及其生产方法，其允许快速制造化合物VLP，所述化合物VLP作为用于生物医学应用的单一释放药物呈现任何类型的功能性分子；允许产生功能性分子的VLP连接，在没有“分子伴侣”的情况下，这些功能性分子在细胞(如细菌)中是不能产生的；允许呈现复杂的功能性分子如二聚体，而不必使用额外的化学交联，也不会破坏VLP的稳定性；并且允许产生功能性灵活的稳定VLP。
上述方面的特征和实施方案将在下面的标题部分中进一步描述。任何特征或实施方案可以以任何可行的组合与任何方面相结合。
虽然下面详细讨论了本发明的各种实施方案的产生和使用，但是应该理解，本发明提供了许多可应用的发明概念，这些概念可以在各种各样的具体环境中实施。本文讨论的具体实施方案仅仅是产生和使用本发明的具体方式的说明，并不限制本发明的范围。
为了便于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语诸如“一个”、“一种”和“该”不旨在仅指单个实体，而是包括可以使用特定实例进行说明的一般类别。本文的术语用于描述本发明的具体实施方案，但是它们的使用不限制本发明，除非在权利要求中作为概述。
本文对本发明背景的讨论被包括在内以解释本发明的上下文。这并不意味着承认所提及的任何材料在任何国家在任何权利要求的优先权日之前都是公开的、已知的或者是公知常识的一部分。
除非另有说明，本发明将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分的解释。参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:ALaboratoryManual,Third Edition,(Sambrook et al,2001,Cold Spring Harbor,New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.,1984)；美国专利号4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(Harries and Higgins eds.1984)；Transcription and Translation(Hames and Higgins eds.1984)；Culture of AnimalCells(Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells and Enzymes(IRLPress,1986)；Perbal,APractical Guide to Molecular Cloning(1984)；the series,Methods in Enzymology(Abelson和Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,NewYork)，特别地，Vols.154and 155(Wu et al.eds.)and Vol.185,"Gene ExpressionTechnology"(Goeddel,ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(Miller andCalos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods in Celland Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook of Experimental Immunology,Vols.I-IV(Weir and Blackwell,eds.,1986)；和Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1986)。
术语“同一性”和“相同的”等指两个聚合分子之间的序列相似性，例如两个核酸分子之间，如两个DNA分子之间，或两个蛋白质分子之间。序列比对和序列同一性的确定可以通过，例如，使用最初由Altschul等人1990(J Mol Biol 215:403-10)描述的基本局部比对搜索工具(BLAST)，如由Tatusova和Madden 1999(FEMS Microbiol Lett 174:247-250)描述的“Blast 2序列”算法来完成。
比对序列进行比较的方法是本领域众所周知的。各种程序和比对算法描述于，例如：Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet等人(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等人(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson等人(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana等人(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174:247-50。可以在例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10中发现序列比对方法和同源性计算的详细考虑。
国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLASTTM；Altschul等人(1990))可从几个来源获得，包括国家生物技术信息中心(Bethesda，MD)和互联网，用于与几个序列分析程序结合。关于如何使用该程序确定序列同一性的说明可在互联网上BLASTTM的“帮助”部分找到。为了比较核酸序列，可以使用BlastTM(Blastn)程序的“Blast 2序列”功能，使用默认参数。当用这种方法评估时，与参考序列具有甚至更大相似性的核酸序列将显示出增加的同一性百分比。通常，序列同一性百分比是在整个序列长度上计算的。
例如，合适地，使用以下评分参数，通过Needleman-Wunsch算法找到全局最佳比对：匹配得分：+2，错配得分：-3；空位罚分：空位产生(gap open)5，空位延伸(gapextension)2。合适地，所得最佳全局比对的同一性百分比可通过比对碱基数与总比对长度的比值乘以100来计算，其中比对长度包括匹配和错配。
术语“载体”是本领域众所周知的，并且如本文所用，是指核酸分子，例如双链DNA，其可能已经插入有根据本发明的核酸序列。合适地，载体用于将插入的核酸分子转运到合适的宿主细胞中。载体通常包含所有必需的元件，所述元件使得插入的核酸分子转录，并且优选将转录物翻译成多肽。载体通常包含所有必需的元件，使得一旦载体在宿主细胞中，载体可以独立于宿主染色体DNA或与宿主染色体DNA一致地复制；可以产生载体及其插入的核酸分子的几个拷贝。
本文使用的术语“可操作地连接”或等同表达是指各种核酸元件相对于彼此的排列，使得这些元件功能性地连接并且能够以预期的方式彼此相互作用。
术语“疗法”“治疗的”或“治疗”是指减少、改善或消除疾病或病况的一种或多种体征、症状或影响。因此，如本文所用的“治疗”或“疗法”包括对哺乳动物，特别是人类中的疾病的任何治疗，包括：(a)预防易患该疾病或有患该疾病的风险但尚未被诊断为患有该疾病的受试者发生该疾病；(b)抑制该疾病，即阻止其发展；和(c)缓解该疾病，即引起该疾病的消退。
将药剂向受试者“施用”包括将药剂引入或递送给受试者以实现其预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径施用，包括口服、鼻内、眼内、眼周、胃肠外(血管内、肌内、腹膜内或皮下)或局部。施用包括自我施用和他人施用。
术语“个体”、“受试者”和“患者”可互换使用，是指患有需要治疗的疾病或病况的任何个体受试者，合适地患有需要通过本发明的治疗进行治疗的疾病或病况。出于本公开的目的，受试者可以是人或动物，例如灵长类动物，优选人，或另一种哺乳动物，如狗、猫、马、猪、山羊或牛等。
附图说明
可以参考以下附图来描述本发明，其中：
图1显示：(A)富集纯VLP的层析级分，和(B)VLP的电子显微镜图像，表明HBc VLP外壳可以与Im7结构域融合，然后可以被纯化，并且是预期尺寸的稳定VLP；
图2显示：(A)原核细胞的示例性质粒图；(B)真核细胞的示例性质粒图；(C)分别通过T7启动子和tetR启动子独立诱导VLP骨架与功能性分子(IL-33细胞因子)的示例性质粒图。
图3显示：来自3个不同克隆的在大肠杆菌中表达的候选HBc-Im7和colE7-IL13蛋白的SDS-PAGE；显示了大量的这两种蛋白质都是可溶的，表明天然蛋白质折叠。
图4显示：从以下分离和纯化的蛋白质的SDS-PAGE：(A)亲本HBc VLP的DEAE-阴离子交换层析；(B)HBc-Im7融合VLP的DEAE-阴离子交换层析，显示了HBc-Im7的洗脱曲线显著改变，类似于亲和层析中通常遇到的情况。
图5显示：从HBc-Im7融合VLP的多模式疏水/弱阴离子交换层析中分离和纯化的蛋白质的SDS-PAGE，显示了Hbc-Im7不可逆地结合到固定相。
图6显示：经受混合模式尺寸排阻色谱(截留值700kD)的DEAE部分纯化的HBc-Im7VLP的流出液级分的SDS-PAGE，表明蛋白质以完整VLP的形式洗脱，并显示两步纯化产生高纯度的VLP级分。
图7A显示：亲本HBc衣壳VLP与HBc-Im7 VLP相比的透射电子显微镜图像(比例尺：30nm)，显示了与亲本衣壳相比，HBc-Im7颗粒中电子致密边缘的尺寸显著增加。
图7B显示：亲本HBc衣壳VLP与HBc-Im7 VLP相比的边缘宽度和直径的定量比较，表明HBc-Im7 VLP具有略微增加的总直径，但是边缘的尺寸显著增加，这与在HBc衣壳蛋白的顶部上增加的Im7蛋白层一致。
图7C显示：HBc VLP和HBC-Im7 VLP的尺寸分布直方图，表明HBc VLP的均匀尺寸分布和预期尺寸，和HBcIm7 VLP的略微但统计学上显著增加的尺寸(28.3±3.3对27.3±2.5nm，p＝0.009)。
图8显示：在用HBc-Im7 VLP接种后的不同时间点，对老龄小鼠(研究开始时15个月)中血清抗Hbc-Im7抗体的存在进行的ELISA分析；
图9显示：以下的SDS-PAGE：在大肠杆菌中表达的HBc-Im7 VLP外壳(泳道1)和ColE7-IL33融合体(泳道2)的胞质溶胶级分；包含两种蛋白融合体的胞质溶胶级分(泳道3)，在经过CaptoCore700树脂上的混合模式尺寸排阻色谱后作为流出液纯化的VLP级分(泳道5-7)。
图10显示：以下的SDS-PAGE：在HEK293T细胞中作为分泌蛋白表达的ColE7-RBD-GFP融合体(泳道1)和在大肠杆菌中表达并部分纯化的HBc-Im7VLP外壳(泳道2)的细胞上清液；和VLP，其通过混合级分偶联到ColE7-RBD-GFP，随后进行混合模式尺寸排阻色谱(CaptoCore700)以除去非VLP蛋白(泳道3)。
图11显示：在用辛胺衍生的罗丹明孵育之前(左)和之后(右)，HBc-Im7 VLP(深色阴影)与亲本HBc VLP(浅色阴影)相比的荧光。
图12显示：本发明VLP的一些实施方案的卡通图：(A)第一方面的VLP，其中功能性分子是抗原；(B)第一方面的实施方案的VLP，其包括第三结合蛋白，其中功能性分子是抗体，以及(C)第二方面的VLP，其中功能性分子是非蛋白质抗原。注意，实施方案(C)也可以与实施方案(A)或(B)组合，这里没有示出，但是在别处进行了描述。
图13显示：蔗糖密度梯度超速离心后的SDS-PAGE分析，显示了与野生型VLP相比，携带整合在HBc主要免疫显性区域中的Im7的VLP的生物物理沉降特性。
图14显示：蔗糖密度梯度超速离心后的天然琼脂糖凝胶电泳(NAGE)，显示了在HBc-Im7 VLP和野生型HBc VLP中的T3和T4构型VLP的相似分布和相似的RNA含量。
图15显示：免疫斑点印迹证实，通过将Im7整合到主要免疫显性区域(MIR)，消除了与野生型乙型肝炎病毒核心抗原的交叉反应。
图16显示：野生型和HBc-Im7 VLP(通过蔗糖梯度离心纯化)的TEM和DLS分析，以确定VLP的形状和尺寸。
图17显示：野生型和HBc-Im7 VLP(通过蔗糖梯度离心纯化)的TEM分析，以确定VLP的边缘厚度。
图18显示：由经ColE7-IL33修饰的HBc-Im7组成的VLP的蔗糖密度梯度超速离心后的SDS-PAGE分析。
图19显示：IL-33修饰的HBc-Im7 VLP和野生型HBc VLP的蔗糖密度梯度超速离心级分的天然琼脂糖凝胶电泳(NAGE)。
图20显示：图A显示了HBc、HBc-Im7和HBc-Im7-IL33 VLP的TEM图像，表明携带Im7插入片段的VLP的边缘增厚。图B显示了通过TEM测定的HBc-Im7-IL33 VLP直径的条形图，以及证明IL-33修饰的VLP的尺寸增加的DLS图。
图21显示：通过检测针对IL33构象表位的抗体，免疫斑点印迹证实了附着于HBC-Im7 VLP表面的IL33的天然蛋白质折叠(以及不存在与HBc-野生型VLP的交叉反应)。
图22显示：图A至C显示了与CuMV衍生的VLP(灰色)相比，IL33修饰的HBC-Im7 VLP在用IL33修饰的HBc-Im7(黑色)接种的小鼠中的免疫原性。
图23显示：Im7具有新颖的化学性质，允许lm7修饰的VLP的一步亲和纯化。图A顶部和底部显示了在DEAE CimMultus monolith柱上洗脱的级分的SDS PAGE分析，图B显示了在Qa CimMultus monolith柱上洗脱的级分的SDS PAGE分析，图C显示了来自HBc-Im7的DEAE柱纯化的1M NaCl级分的TEM图像，以及DEAE或Q结合机制的动画。
图24显示：SDS-PAGE分析凝胶，显示了ColE7-Im7相互作用可以对修饰的VLP进行解离-重组纯化。(A)在尿素介导的VLP-衣壳分解之后或在没有预先的衣壳分解的情况下(标记为“con”)，通过IMAC亲和纯化后的SDS PAGE，显示了用尿素处理保留了HBc-Im7(灰色箭头)和ColE7-IL33(白色箭头)的结合，而未分解的VLP不能与Ni-树脂结合，因为HBc-Im7的C-末端上的组氨酸标签不可接近。(B)在CaptoCore700(Cc700)树脂上进行的改进的尺寸排阻色谱后的SDS PAGE显示，分解的VLP重新组装成大颗粒，允许不受阻碍地流过Cc700基质。HBc-Im7和ColE7-IL33的量在化学计量上相等，表明VLP被细胞因子完全修饰。
图25显示:使用大肠杆菌素E7(Colicin E7)将蛋白质融合到VLP表面同时提供了分子伴侣功能，允许在大肠杆菌中不可溶的蛋白质自身的天然蛋白质折叠。图A显示了大肠杆菌裂解物(左)和分离成胞质溶胶与不可溶的沉淀物的SDS PAGE，显示了当与ColE7融合表达时，胞质溶胶中有显著量的IL17。图B显示了通过与Im7-琼脂糖相互作用来纯化ColE7-IL17和ColE7-IL33，随后用TEV蛋白酶切割融合的大肠杆菌素E7，下图显示了融合蛋白的排列的动画。图(C)显示了使用人IL17RA蛋白与IL-17或IL-33的受体结合ELISA的结果，证实了IL17的天然折叠，其以高亲和力选择性地与其受体结合，而IL33不结合。
图26显示：单一细胞内VLP骨架和表位蛋白的独立和顺序诱导允许最初的VLP形成，随后是表位组装。图A显示了说明诱导系统的动画图；质粒含有tetR蛋白，由AmpR基因下游的核糖体结合位点驱动组成型地表达。这允许通过添加脱水四环素(aTc)来选择性诱导表位蛋白(此处显示为C7-IL17)，而VLP骨架(HBc-Im7)可以由IPTG单独诱导。图B和C显示了每种细胞因子(IL33和IL17)的三个独立克隆的SDS-PAGE凝胶，记录了异常严格的调节而没有任何泄漏，图D显示了已经用IPTG诱导的大肠杆菌中IL17的aTc诱导的时间进程的SDS-PAGE凝胶。
图27显示：Barstar可以并入HBc以形成VLP。图A显示了HBc-Barstar VLP的蔗糖密度梯度离心后的SDS-PAGE凝胶。图B显示了DLS分析，突出显示了颗粒在34nm尺寸处的峰。图C表明，当通过TEM分析时，颗粒显示出增厚的边缘。
图28显示：SDS-PAGE凝胶显示，Barnase–Barstar相互作用可以对修饰的VLP进行解离-重组纯化。通过IMAC的亲和纯化后和在CaptoCore700(Cc700)树脂上进行的改进的尺寸排阻色谱后的SDS PAGE显示在同一凝胶上。
具体实施方式
结合蛋白对
本发明涉及利用结合蛋白对来形成桥的VLP，该桥可以将目的因子(通常是抗原)附着于形成VLP外壳的病毒衣壳蛋白上。
结合蛋白对可以是共价结合或非共价结合的。
合适地，结合蛋白对是非共价结合的。合适地，结合蛋白对是准共价(quasi-covalently)结合的。合适地，结合蛋白对通过任何非共价类型的键合来结合，例如：静电相互作用、氢键、范德华相互作用或疏水相互作用。然而，在一些实施方案中，结合蛋白对不通过疏水键合来结合。
或者，结合蛋白对可以是共价结合的。合适地，结合蛋白对可以通过任何共价类型的键合来结合。
合适地，结合蛋白对包含一个净正电荷蛋白和一个净负电荷蛋白。合适地，第一结合蛋白包含净负电荷。合适地，第二结合蛋白包含净正电荷。
有利地，具有净负电荷的第一结合蛋白增加了VLP的稳定性并减少了聚集或结块。
因此，在一个实施方案中，结合蛋白对通过静电相互作用非共价结合。
合适地，在任何情况下，结合蛋白对以高亲和力结合。合适地，结合蛋白对以飞摩尔至皮摩尔范围内的Kd结合。合适地，具有以下Kd：10fM至10pM、10fM至1pM、10fM至0.1pM、10fM至0.01pM、1fM至1pM、1fM至0.1pM、1fM至0.01pM。
有利地，蛋白质之间的高亲和力结合意味着VLP更稳定。
合适地，结合蛋白对与可以用VLP治疗的受试者的蛋白质具有低同源性。合适地，结合蛋白对与人类蛋白质具有低同源性。合适地，结合蛋白对与任何人类蛋白质的三级结构具有低同源性。
有利地，与人类蛋白质的低同源性意味着结合蛋白本身不太可能刺激脱靶免疫反应。
合适地，结合蛋白对不含任何二硫键。
合适地，结合蛋白对没有糖基化。
合适地，结合蛋白对中的每一种蛋白的尺寸相对较小。合适地，结合蛋白对中的每一种蛋白包含相对较短的序列长度。合适地，结合蛋白对中的每一种蛋白包含在84-134个氨基酸之间的长度。合适地，结合蛋白对中的每一种蛋白包含少于135个氨基酸的长度。
有利地，没有二硫键、没有糖基化和小尺寸意味着结合蛋白更容易在细菌细胞如大肠杆菌中产生。
合适地，结合蛋白对包含细菌毒素及其相应的抑制剂或抗毒素。合适地，VLP的第一结合蛋白是细菌毒素抑制剂。合适地，VLP的第二结合蛋白(如果存在的话)是细菌毒素。
合适的细菌毒素和抑制剂对是：大肠杆菌素和大肠杆菌素免疫蛋白。合适地，ColE7和Im7、ColE8和Im8、ColE9和Im9、ColE2和Im2或Barnase和Barstar。合适地，细菌毒素和抑制剂对包含细菌核酸酶及其抑制剂。合适地，第一结合蛋白是抑制剂，第二结合蛋白是细菌核酸酶。合适的细菌核酸酶和抑制剂对是：ColE7/Im7和Barnase/Barstar。
在一个实施方案中，结合蛋白对是ColE7和Im7，其中第一结合蛋白是Im7，第二结合蛋白是ColE7。
在一个实施方案中，结合蛋白对是Barnase和Barstar，其中第一结合蛋白是Barstar，第二结合蛋白是Barnase。
合适地，第一或第二结合蛋白可以是野生型蛋白，或者它们可以被修饰。合适地，第一或第二结合蛋白可以被修饰以改善它们作为本发明VLP情况下的结合蛋白的功能。合适的修饰可以包括：编码蛋白质的氨基酸序列中的插入、缺失、取代、截短、反转、重复等。
合适地，通过靶向修饰来中和对用于VLP施用的宿主细胞和/或受体生物有害的毒素(第二结合蛋白)的任何特性。
合适地，第一或第二结合蛋白可以包含一个或多个氨基酸取代。合适地，氨基酸取代可以增加第一和第二结合蛋白之间的结合亲和力。合适地，氨基酸取代可以从第一和/或第二结合蛋白中除去不需要的二硫键。
合适地，第一结合蛋白可以包含一个或多个氨基酸取代。
在第一结合蛋白是Barstar的实施方案中，合适地，Barstar的氨基酸序列包含一个或多个以下取代：C40A、C82A和I87E。合适地，Barstar的氨基酸序列可以包含所有以下取代：C40A、C82A和I87E。合适地，Barstar的氨基酸序列包含：
KKAVINGEQIRSISDLHQTLKKELALPEYYGENLDALWDALTGWVEYPLVLEWRQFEQSKQLTENGAESVLQVFREAKAEGADITIELS(SEQ ID NO:36)。
在第一结合蛋白是Im7的实施方案中，合适地，Im7的氨基酸序列包含以下取代：F41L。合适地，Im7的氨基酸序列包含：ELKNSISDYTEAEFVQLLKEIEKENVAATDDVLDVLLEHFVKITEHPDGTDLIYYPSDNRDDSPEGIVKEIKEWRAANGKPGFKQ(SEQ ID NO:37)。
合适地，第二结合蛋白可以包含一个或多个氨基酸取代。合适地，第二结合蛋白的氨基酸序列中的氨基酸取代可以增加第二结合蛋白的负电荷。
在第二结合蛋白是Barnase的实施方案中，合适地，Barnase的氨基酸序列包含以下取代：E73W。合适地，Barnase的氨基酸序列包含AQVINTFDGVADYLQTYHKLPDNYITKSEAQALGWVASKGNLADVAPGKSIGGDIFSNREGKLPGKSGRTWRWADINYTSGFRNSDRILYSSDWLIYKTTDHYQTFTKIR(SEQ ID NO:38)。
在第二结合蛋白是ColE7的实施方案中，合适地，ColE7的氨基酸序列包含一个或多个以下取代：Arg538Ala、Glu542Ala和His569Ala。合适地，ColE7的氨基酸序列可以包含所有以下取代：Arg538Ala、Glu542Ala和His569Ala。合适地，ColE7的氨基酸序列包含ESKRNKPGKATGKGKPVNNKWLNNAGKDLGSPVPDRIANKLRDKEFKSFDDFRKKFWEEVSKDPELSKQFSRNNNDRMKVGKAPKTRTQDVSGKATSFALHHEKPISQNGGVYDMDNISVVTPKRAIDIHRGKS(SEQ ID NO:39)。
合适地，第一或第二结合蛋白可以被截短。
合适地，第二结合蛋白被截短。
在第二结合蛋白是ColE7的实施方案中，合适地，ColE7蛋白的全部或部分可用作第二结合蛋白。合适地，ColE7蛋白的仅一部分被用作第二结合蛋白。合适地，ColE7蛋白被截短，合适地使得它仅包含ColE7的催化结构域。合适地，第二结合蛋白包含ColE7的催化结构域。
在第二结合蛋白是Barnase的实施方案中，合适地，Barnase蛋白的全部或部分可用作第二结合蛋白。合适地，Barnase蛋白的仅一部分被用作第二结合蛋白。合适地，Barnase蛋白被截短，合适地使得它仅包含Barnase的催化结构域。合适地，第二结合蛋白包含Barnase的催化结构域。
根据本发明的第三方面，提供了一种衣壳融合蛋白，其包含与结合蛋白融合的病毒衣壳蛋白，其中结合蛋白是细菌毒素抑制剂。
合适地，病毒衣壳蛋白可以是乙型肝炎病毒衣壳蛋白(HBc)。
合适地，结合蛋白融合到病毒衣壳蛋白的免疫显性区域，如本文别处对HBc所解释的。
合适地，衣壳融合蛋白可以包含根据SEQ ID NO:12、13、14或15的序列。合适地，衣壳融合蛋白可以包含与SEQ ID NO:12、13、14或15具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。合适地，衣壳融合蛋白可以由根据SEQ ID NO:12、13、14或15的序列组成。
在一个实施方案中，衣壳融合蛋白包含与结合蛋白Im7融合的乙型肝炎病毒衣壳蛋白。在这样的实施方案中，衣壳融合蛋白可以包含根据SEQ ID NO:12、13或14的序列。合适地，衣壳融合蛋白可以包含与SEQ ID NO:12、13或14具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。合适地，衣壳融合蛋白可以由根据SEQ ID NO:12、13或14的序列组成。
在一个实施方案中，衣壳融合蛋白包含与结合蛋白Barstar融合的乙型肝炎病毒衣壳蛋白。在这样的实施方案中，衣壳融合蛋白可以包含根据SEQ ID NO:15的序列。合适地，衣壳融合蛋白可以包含与SEQ ID NO:15具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。合适地，衣壳融合蛋白可以由根据SEQ ID NO:15的序列组成。
合适地，结合蛋白可以包含化学修饰。
根据本发明的第四方面，提供了一种功能性融合蛋白，其包含与结合蛋白融合的功能性分子，其中结合蛋白是细菌毒素。
合适地，功能性融合蛋白可以包含根据SEQ ID NO:16、17、18、19、21或46的序列。合适地，功能性融合蛋白可以包含与SEQ ID NO:16、17、18、19、21或46具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。合适地，衣壳融合蛋白可以由根据SEQ ID NO:16、17、18、19、21或46的序列组成。
在一个实施方案中，功能性融合蛋白可以包含与结合蛋白ColE7融合的IL13。在这样的实施方案中，功能性融合蛋白可以包含根据SEQ ID NO:16或17的序列。合适地，功能性融合蛋白可以包含与SEQ ID NO:16或17具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。合适地，功能性融合蛋白可以由根据SEQ ID NO:16或17的序列组成。
在一个实施方案中，功能性融合蛋白可以包含与结合蛋白ColE7融合的IL33。在这样的实施方案中，功能性融合蛋白可以包含根据SEQ ID NO:18或19的序列。合适地，功能性融合蛋白可以包含与SEQ ID NO:18或19具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。合适地，功能性融合蛋白可以由根据SEQ ID NO:18或19的序列组成。
在一个实施方案中，功能性融合蛋白可以包含与结合蛋白Barnase融合的IL13。在这样的实施方案中，功能性融合蛋白可以包含根据SEQ ID NO:21的序列。合适地，功能性融合蛋白可以包含与SEQ ID NO:21具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。合适地，功能性融合蛋白可以由根据SEQ IDNO:21的序列组成。
在一个实施方案中，功能性融合蛋白可以包含与结合蛋白ColE7融合的IL17。在这样的实施方案中，功能性融合蛋白可以包含根据SEQ ID NO:46的序列。合适地，功能性融合蛋白可以包含与SEQ ID NO:46具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。合适地，功能性融合蛋白可以由根据SEQ IDNO:46的序列组成。
或者，提供了一种功能性融合蛋白，其包含与另一结合蛋白融合的第一结合蛋白，其中第一结合蛋白是细菌毒素，并且另一结合蛋白能够捕获功能性分子，所述功能性分子为抗原结合蛋白。
合适地，另一结合蛋白能够与功能性分子结合。合适地，在这样的实施方案中，功能性分子是抗原结合蛋白，如抗体。合适地，另一结合蛋白是本文别处所述的第三结合蛋白。合适地，另一结合蛋白是蛋白G。
在一个实施方案中，功能性融合蛋白包含根据SEQ ID NO:20的序列。合适地，功能性融合蛋白可以包含与SEQ ID NO:20具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。合适地，功能性融合蛋白可以由根据SEQ ID NO:20的序列组成。
合适地，每个融合蛋白包含一个或多个接头。合适地，接头位于蛋白质编码序列之间。合适地，接头位于结合蛋白的N-末端和C-末端，合适地与病毒衣壳蛋白连接。合适地，接头位于功能性分子和结合蛋白之间。合适地，接头位于结合蛋白和另一结合蛋白之间。合适地，每个接头的长度在5至50个氨基酸之间。合适地，每个接头的长度为5、10、15、20、21、25、30、35、40个氨基酸。合适地，每个接头的长度为9、10或11个氨基酸。合适地，每个接头包含以下序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:33)或GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:34)或SGGGSSGSG(SEQID NO:35)。
合适地，第一结合蛋白可以包含另外的修饰。合适地，第一结合蛋白可以包含化学修饰。合适地，Im7可以包含化学修饰。
合适地，化学修饰能够结合到功能性分子。合适地，化学修饰能够共价结合到功能性分子。在一个实例中，结合到化学修饰的功能性分子可以是荧光分子。其他合适的功能性分子在本文别处描述。
合适地，化学物质通过非共价结合附着于第一结合蛋白。合适地，化学物质通过静电和/或疏水键合附着于第一结合蛋白。
合适的化学修饰包括具有胺基的烷烃。合适地，烷烃可以具有任何链长。合适地，烷烃是低级烷烃。合适地，烷烃可以具有1至10个碳的链长。合适地，烷烃可以具有4至8个碳的链长。合适地，烷烃可以是支链的。
合适地，根据所需的应用，选择碳链的长度和胺基上支链取代的长度，以允许不可逆地或可逆地连接到蛋白质上。在一个实施方案中，化学物质不可逆地附着于第一结合蛋白。合适地，在这样赋予不可逆结合的实施方案中，烷烃具有八个碳原子和一个末端氮(辛胺)。在另一个实施方案中，化学物质可逆地附着于第一结合蛋白。合适地，在这样允许可逆结合的实施方案中，烷烃在支链结构中具有4个碳原子(二乙基乙醇胺)。
合适地，第一结合蛋白可以在一个或多个位点，合适地在一个或多个氨基酸处被化学修饰。合适地，第一结合蛋白在一个氨基酸处被化学修饰。
在一个实施方案中，第一结合蛋白经DEAE化学修饰。
在一个实施方案中，第一结合蛋白经辛胺化学修饰。
合适地，在这样的实施方案中，第一结合蛋白可以是Im7。
合适地，经DEAE的修饰允许第一结合蛋白被纯化。合适地，通过色谱法纯化。
合适地，经辛胺的修饰允许第一结合蛋白直接与功能性分子结合。
在一个实施方案中，结合蛋白的化学修饰发生在宿主细胞内。合适地，通过翻译后修饰。在另一个实施方案中，结合蛋白的化学修饰发生在宿主细胞外。合适地，通过化学反应方式。合适地，通过非酶促催化的非共价连接方式。
病毒衣壳蛋白
本发明涉及包含一个或多个病毒衣壳蛋白的VLP，所述病毒衣壳蛋白自组装成VLP外壳，然后可以使用如上所述的蛋白结合对和/或化学修饰将功能性分子附着于所述VLP外壳上。
根据第一方面，病毒衣壳蛋白是乙型肝炎病毒衣壳蛋白(HBc)。
根据第二方面，病毒衣壳蛋白可以选自任何合适的病毒衣壳蛋白，例如：乙型肝炎病毒衣壳蛋白、丙型肝炎衣壳蛋白、HPV衣壳蛋白、AAV衣壳蛋白、HIV衣壳蛋白、流感衣壳蛋白、新城疫病毒衣壳蛋白、尼帕病毒衣壳蛋白。
在任一方面的一个实施方案中，病毒衣壳蛋白是二聚体病毒衣壳蛋白。
在任一方面的一个实施方案中，病毒衣壳蛋白是乙型肝炎病毒衣壳蛋白。
合适地，每个病毒衣壳蛋白附着于第一结合蛋白。因此，合适地，每个病毒衣壳蛋白展示第一结合蛋白。
合适地，每个病毒衣壳蛋白被修饰以展示第一结合蛋白。合适地，每个病毒衣壳蛋白融合至第一结合蛋白。合适地，通过将第一结合蛋白融合至病毒衣壳蛋白，每个病毒衣壳蛋白被修饰以展示第一结合蛋白。合适地，通过将第一结合蛋白插入病毒衣壳蛋白，每个病毒衣壳蛋白被修饰以展示第一结合蛋白。合适地，将第一结合蛋白插入病毒衣壳蛋白的主要免疫显性区域。合适地，将第一结合蛋白融合至病毒衣壳蛋白的主要免疫显性区域。合适地，将第一结合蛋白插入病毒衣壳蛋白的主要免疫显性区域的氨基酸残基76和80之间。合适地，将第一结合蛋白插入病毒衣壳蛋白的主要免疫显性区域的氨基酸残基77和79之间。合适地，将第一结合蛋白插入病毒衣壳蛋白的主要免疫显性区域的氨基酸残基77和78之间。
合适地，病毒衣壳蛋白可以包含进一步修饰。合适的修饰可以包括：编码蛋白质的氨基酸序列中的插入、缺失、取代、截短、反转、重复等。合适地，病毒衣壳蛋白在主要免疫显性区域可以包含进一步修饰。合适地，这种修饰有助于第一结合蛋白插入到病毒衣壳蛋白中。合适地，病毒衣壳蛋白可以包含氨基酸缺失。合适地，病毒衣壳蛋白在主要免疫显性区域可以包含氨基酸缺失。合适地，病毒衣壳蛋白在主要免疫显性区域可以包含氨基酸缺失，其去除带负电荷的氨基酸。
在一个实施方案中，病毒衣壳蛋白是乙型肝炎衣壳蛋白并包含如下氨基酸缺失：E77和D78。合适地，HBc的氨基酸序列包含：MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNL[X]PASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV(SEQ ID NO:40)，其中[X]表示插入位置，合适地为氨基酸插入位置，合适地为编码第一结合蛋白的氨基酸序列插入位置。
在一个实施方案中，病毒衣壳蛋白是乙型肝炎衣壳蛋白，包含插入其主要免疫显性区域内的残基76和80之间的第一结合蛋白，并且还包含以下氨基酸缺失：E77和D78。
功能性分子
本发明涉及VLP，其能够通过蛋白结合对或通过对第一结合蛋白的化学修饰在其表面展示各种功能性分子。
合适地，每个结合蛋白对附着于至少一个功能性分子。合适地，每个结合蛋白对可以附着于一个以上的功能性分子。合适地，功能性分子可以是相同类型或不同类型的。例如，每个结合蛋白对可以附着于一种或多种抗原、抗原结合蛋白或荧光分子的任意组合。
合适地，每个结合蛋白对附着于一个功能性分子。合适地，在这样的实施方案中，功能性分子可以附着于根据第一方面的第二结合蛋白，或者可以附着于第三结合蛋白(如果存在的话)。
合适地，每个化学修饰附着于一个功能性分子。合适地，在这样的实施方案中，功能性分子通过根据第二方面的化学修饰附着于第一结合蛋白。合适地，在这样的实施方案中，功能性分子是非蛋白质抗原或其表位，或荧光分子。
合适地，在一些实施方案中，每个结合蛋白对可以有一个以上的功能性分子。合适地，第一功能性分子可以通过化学修饰附着于第一结合蛋白，并且合适地，第二功能性分子可以附着于第二结合蛋白，或第三结合蛋白(如果存在的话)。
或者，第一和第二功能性分子可以附着于第二结合蛋白。此外，任选地，第三功能性分子可以通过化学修饰附着于第一结合蛋白。
合适的功能性分子可以包括：
蛋白质或非蛋白质抗原；
抗原结合蛋白，如抗体或其结合片段、抗体模拟物和适体；
荧光分子。
合适的抗原可以包括抗原的全部或部分。合适地，抗原可以是抗原的亚单位或单体。合适地，功能性分子可以是抗原的表位。合适地，使用抗原作为功能性分子产生能够刺激对抗原的免疫反应的VLP。合适地，这可用作疫苗。
合适地，抗原可以是蛋白质或非蛋白质抗原。合适的非蛋白质抗原可以包括糖、脂质或碳水化合物，或免疫反应所需的小分子化学品，或需要检测的小分子化学品，如尼古丁、可卡因或其它外源毒素。
合适地，抗原可以是与打算用VLP治疗的受试者相关的自身或非自身抗原。合适地，抗原可以是人类或非人类抗原。
合适地，抗原可以源自疾病或病症的致病因子。合适地，致病因子可以是自身或非自身的。
合适地，非自身致病因子可以是感染因子。因此，合适地，抗原可以源自感染因子，如病毒、细菌、真菌、原生动物、古细菌。
合适地，抗原可以源自选自以下的病毒：腺相关病毒、基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus)、克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)、登革热病毒(Dengue virus)、埃博拉病毒(Ebolavirus)、埃可病毒(Echovirus)、脑心肌炎病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、汉坦病毒(Hantaan virus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人腺病毒、人星状病毒、人冠状病毒、人巨细胞病毒、人肠道病毒、人疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、人副流感病毒、人呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、人环曲病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、日本脑炎病毒、多瘤病毒、昆津病毒(Kunjin virus)、拉沙病毒(Lassa virus)、麻疹病毒、传染性软疣病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒(Nipah virus)、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、A类轮状病毒、B类轮状病毒、C类轮状病毒、风疹病毒、鹭山病毒(Sagiyama virus)、Salivirus A、札幌病毒(Sapporo virus)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、托斯卡纳病毒(Toscana virus)、乌库涅米病毒(Uukuniemi virus)、水痘-带状疱疹病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、水泡性口炎病毒、西部马脑炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、寨卡病毒(Zikavirus)。
合适地，抗原可以源自选自以下的细菌：以色列放线菌(Actinomyces israelii)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、汉赛巴尔通体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana)、脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)、阿氏疏螺旋体(Borreliaafzelii)、回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)、流产布鲁氏杆菌(Brucellaabortus)、犬布鲁氏杆菌(Brucella canis)、羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏杆菌(Brucella suis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、土拉热弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、圣他罗西亚钩端螺旋体(Leptospira santarosai)、韦氏钩端螺旋体(Leptospira weilii)、野口氏钩端螺旋体(Leptospira noguchii)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈氏球菌(Neisseria meningitidis)、星形诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、立克次体(Rickettsia rickettsia)、肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonella entericasubsp.enterica)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、草绿色链球菌(Streptococcusviridans)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)。
在一个实施方案中，抗原源自冠状病毒，合适地源自SARS-CoV-2。合适地，抗原是源自SARS-CoV-2的刺突蛋白的全部或部分，或是源自SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的全部或部分。
因此，在一个实施方案中，功能性分子是源自SARS-CoV-2的刺突蛋白的一部分。合适地，是受体结合结构域。
因此，在另一个实施方案中，功能性分子是源自SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的一部分。合适地，是C-末端。
合适地，自身致病因子可以是非感染因子。因此，合适地，抗原可以源自非感染因子，如炎性分子，或引起神经(例如β-淀粉样蛋白)、软骨或骨组织退行性变化的分子，或引起肿瘤疾病恶化的分子。
合适地，抗原可以是炎性分子或引起退行性变化的分子或导致肿瘤疾病的分子，其是疾病或病症的致病因子。合适地，所述分子可以在人类或非人类哺乳动物中起作用。合适地，所述分子可以在特定物种中引起疾病或病症。
合适的炎性分子可以包括趋化因子或细胞因子，或蛋白酶。合适的趋化因子或细胞因子可以包括：白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素和集落刺激因子。合适的趋化因子或细胞因子可以包括：IL1、IL2、Il3、Il4、IL5、Il6、Il7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL17、IL33、TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、促红细胞生成素和TGFβ。合适的蛋白酶可以包括ADAMTS4、ADAMTS5。合适地，抗原是白细胞介素或蛋白酶。合适地，抗原是IL13、IL17或IL33或其片段。
因此，在一个实施方案中，功能性分子是IL13、IL17或IL33。
导致神经组织退行性变化或肿瘤疾病恶化的合适分子包括：ADAMTS4/5、血管生成因子或允许肿瘤逃逸的因子，如半乳糖凝集素蛋白。
本文提及的任何抗原同样指所述抗原的表位。
用作功能性分子的合适的抗原结合蛋白(如抗体)能够结合目的抗原。合适地，使用抗原结合蛋白(如抗体)作为功能性分子产生能够结合抗原的VLP。合适地，这可用于检测抗原，或用于将VLP靶向抗原。
目的抗原可以是上面列出的任何抗原。例如，目的抗原可以来自致病因子，如病毒、细菌、真菌、原生动物或古细菌。或者，目的抗原可以来自非感染因子，例如细胞表面受体。
合适地，所述抗体能够结合来自上述病毒、细菌、真菌、原生动物、古细菌的抗原。合适的病毒可以选自，例如：腺相关病毒、基孔肯雅病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、埃可病毒、脑心肌炎病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、汉坦病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人腺病毒、人星状病毒、人冠状病毒、人巨细胞病毒、人肠道病毒、人疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、人副流感病毒、人呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、人环曲病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、日本脑炎病毒、多瘤病毒、昆津病毒、拉沙病毒、麻疹病毒、传染性软疣病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、A类轮状病毒、B类轮状病毒、C类轮状病毒、风疹病毒、鹭山病毒、Salivirus A、札幌病毒、辛德毕斯病毒、托斯卡纳病毒、乌库涅米病毒、水痘-带状疱疹病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、水泡性口炎病毒、西部马脑炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、寨卡病毒。
在一个实施方案中，功能性分子是能够结合来自冠状病毒的抗原的抗体。在一个实施方案中，抗体能够结合来自SARS-CoV-2的抗原。
合适的细菌可以选自：以色列放线菌、炭疽杆菌、蜡状芽孢杆菌、汉赛巴尔通体、五日热巴尔通体、脆弱类杆菌、百日咳博德特氏菌、伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、回归热疏螺旋体、流产布鲁氏杆菌、犬布鲁氏杆菌、羊布鲁氏杆菌、猪布鲁氏杆菌、空肠弯曲杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热嗜衣原体、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、土拉热弗朗西斯菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体、圣他罗西亚钩端螺旋体、韦氏钩端螺旋体、野口氏钩端螺旋体、单核细胞增生李斯特菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、肺炎支原体、淋病奈氏球菌、脑膜炎奈氏球菌、星形诺卡氏菌、铜绿假单胞菌、立克次体、肠道沙门氏菌肠道亚种、伤寒沙门氏菌、宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、梅毒螺旋体、解脲支原体、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌。
合适地，在这样的实施方案中，VLP可以靶向特定的病毒。合适地，靶向以结合特定的病毒。因此，合适地，VLP可以用于检测病毒的存在。关于这种用途的进一步细节在别处提供。
合适地，抗原结合蛋白(如抗体)能够结合来自细胞表面受体的抗原。合适地，细胞表面受体可以是离子通道连接的受体、G蛋白偶联受体或酶联受体。合适地，细胞表面受体选自：5-HT受体、nAch受体、锌激活离子通道、GABAA受体、Wnt家族成员受体、包含在脂筏中的协同受体、T细胞和T细胞协同受体、B细胞受体和细胞共刺激分子、甘氨酸受体、AMPA受体、红藻氨酸受体、NMDA受体、谷氨酸受体、ATP门控通道、PIP2门控通道、Erb受体、GDNF受体、NP受体、trk受体、toll样受体、GABAB受体、A、B、C、D、E或F类GBPCR。
合适地，在这样的实施方案中，VLP可以靶向特定的细胞。合适地，靶向以结合特定的细胞。合适地，VLP可以用于将荷载递送到细胞。关于这种用途的进一步细节在别处提供。
合适的抗体可以包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD抗体。合适地，抗体是IgG抗体。合适地，IgG亚类包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
合适的其他抗原结合蛋白可以包括抗体结合片段或抗体模拟物，其表现出与抗体相同的功能。合适地，它们也能够结合目的抗原。合适地，使用抗体结合片段或模拟物作为功能性分子也产生能够结合抗原的VLP。合适地，这可用于检测抗原，或用于将VLP靶向如上所述的抗原。
合适的抗体结合片段可以包括：Fab、单特异性或双特异性F(ab)2、F(ab’)2、单特异性或双特异性双抗体(diabody)、纳米抗体(nanobody)、ScFv、ScFv-Fc、F(ab)3。
合适的抗体模拟物可以包括亲和体(affibody)、affilin、affimer、affitin、alphabody、抗运载蛋白(anticalin)、avimer、DARPin、fynomer、Kunitz结构域肽、monobody、nanCLAMP。
合适地，使用荧光分子作为功能性分子产生可见的VLP。合适地，这对于标记是有用的，特别是当与能够结合抗原的第二功能性分子如抗体或其结合片段、抗体模拟物或适体组合时。
合适的荧光分子可以包括：GFP、EBFP、EBFP2、Azurite、GFPuv、T-saphhire、Cerulean、CFP、mCFP、mTurquoise2、CyPet、mKeima-red、tagCFP、AmCyan1、mTFP1、midoriishi cyan、turboGFP、tagGFP、emerald、azami green、ZsGreen1、YFP、tagYFP、EYFP、topaz、venus、mCtrine、YPet、turboYFP、ZsYellow1、Kusabira Orange、mOrange、别藻蓝蛋白、mkO、RFP、turboRFP、tdTomato、tagRFP、dsRed、mStrawberry、turboFP602、asRed2、J-red、R-藻红蛋白、B-藻红蛋白、mCherry、HcRed、Katusha、P3、多甲藻黄素-叶绿素(peridinchlorophyll)、mKate、turboFP635、mPlum、mRaspberry。
合适地，荧光分子是GFP或GFP的任何修饰形式。
在第一方面的一个实施方案中，所述或每个功能性分子是IL13、IL17、IL33、SARSCov-2刺突蛋白的受体结合结构域或SARS Cov-2核衣壳蛋白的C-末端。
在第一方面的另一个实施方案中，所述或每个功能性分子是IgG抗体或其结合片段。在一个实施方案中，抗体或其结合片段是针对SARS-CoV-2的抗体或其结合片段。
在第二方面的一个实施方案中，所述或每个功能性分子是GFP。
在另一个实施方案中，其中VLP包含通过化学修饰附着于第一结合蛋白的第一功能性分子和附着于第二结合蛋白的第二功能性分子，合适地，第一功能性分子是GFP，第二功能性分子是IgG抗体或其结合片段。
有利地，在这样的实施方案中，VLP可用于检测抗原或使VLP靶向抗原，同时可视地标记该抗原。
在第一方面的另一个实施方案中，每个第二结合蛋白可以附着于两个功能性分子，其中第一功能性分子是抗原，第二功能性分子是不同的抗原或荧光分子。在第一方面的一个实施方案中，每个第二结合蛋白附着于SARS Cov-2刺突蛋白的受体结合结构域和SARSCov-2核衣壳蛋白的C-末端。在第一方面的一个实施方案中，每个第二结合蛋白附着于SARSCov-2刺突蛋白的受体结合结构域和GFP。
病毒样颗粒(VLP)
本发明涉及VLP、其用途及其制造方法。
合适地，VLP包含合适地形成VLP外壳的一个或多个病毒衣壳蛋白。合适地，所述一个或多个病毒衣壳蛋白自组装成VLP外壳。
合适地，VLP包含附着于病毒衣壳蛋白的一个或多个结合蛋白。
合适地，VLP外壳包含一个或多个功能性分子，所述功能性分子合适地附着于结合蛋白和/或结合蛋白上存在的化学修饰。
合适地，以这种方式，本发明的VLP在其表面上稳定地展示功能性分子。
合适地，VLP可以包含多个亚单位。合适地，每个亚单位包含完整的病毒衣壳蛋白、一个或多个结合蛋白和一个或多个功能性分子。合适地，亚单位自组装成VLP。因此，合适地，VLP包含多个病毒衣壳蛋白、多个结合蛋白和多个功能性分子。因此，合适地，在第一方面的情况下，VLP包含多个乙型肝炎衣壳蛋白、多个结合蛋白对和多个功能性分子。
合适地，每个VLP亚单位包含病毒衣壳蛋白二聚体、至少两个结合蛋白和至少两个功能性分子。合适地，每个病毒衣壳单体附着于至少一个结合蛋白和至少一个功能性分子。
任选地，每个VLP亚单位可以包含一个以上的功能性分子。合适地，每个病毒衣壳单体可以附着于一个以上的功能性分子，合适地两个功能性分子。合适地，所述或每个功能性分子可以相同或不同。例如，一个VLP亚单位可以包含附着于第二结合蛋白的功能性分子，以及通过其化学修饰附着于第一结合蛋白的另外的功能性分子。
在第一方面的一个实施方案中，合适地，每个VLP亚单位包含乙型肝炎衣壳蛋白二聚体、两个结合蛋白对和两个功能性分子。合适地，每个结合蛋白对包含附着于乙型肝炎衣壳蛋白单体的第一结合蛋白，和附着于功能性分子的第二结合蛋白。
合适地，在这样的实施方案中，所述两个功能性分子可以各自包含二聚体蛋白的单体。因此，合适地，当乙型肝炎衣壳蛋白二聚体形成时，所述两个功能性分子也可以一起形成二聚体。功能性分子的一个实例是IL17。合适地，当VLP旨在展示IL17时，每个功能性分子包含IL17的单体。
在第二方面的一个实施方案中，合适地，每个VLP亚单位包含乙型肝炎衣壳蛋白二聚体、两个结合蛋白和两个功能性分子。合适地，每个结合蛋白附着于乙型肝炎衣壳蛋白单体和功能性分子。合适地，结合蛋白直接或间接附着于病毒衣壳蛋白和功能性分子。合适地，结合蛋白直接附着于病毒衣壳蛋白，并且在某些情况下直接附着于功能性分子。
合适地，在第一方面，第一结合蛋白与乙型肝炎衣壳蛋白融合。合适地，在第二方面，结合蛋白与病毒衣壳蛋白融合。
合适地，在第一方面，第二结合蛋白可以与功能性分子融合。或者，第二结合蛋白可以间接附着于功能性分子。
在一些实施方案中，第二结合蛋白可以通过第三结合白间接附着于功能性分子。合适地，这用于如下实施方案中，其中功能性分子是抗原结合分子，如抗体。合适地，第三结合蛋白是通用抗体结合蛋白。合适地，抗体结合蛋白选自蛋白G、蛋白A、蛋白AG和链霉亲和素。合适地，第二结合蛋白可以融合至第三结合蛋白，第三结合蛋白可以附着于功能性分子。在一个实施方案中，第二结合蛋白可以融合至第三结合蛋白，第三结合蛋白能够结合功能性分子。
合适地，在第二方面，结合蛋白间接附着于功能性分子。合适地，通过化学修饰。
合适地，VLP包括负表面电荷，合适地，均匀的负表面电荷。
核酸和载体
本发明涉及编码形成VLP的组成蛋白部分的核酸，以及包含所述核酸的载体，所述核酸可用于宿主细胞中以产生VLP。
合适地，本发明涉及并利用编码附着于第一结合蛋白的病毒衣壳蛋白的第一核酸。合适地，第一核酸可以编码包含与第一结合蛋白融合的病毒衣壳蛋白的融合蛋白。合适地，病毒衣壳蛋白可以是乙型肝炎衣壳蛋白。合适地，这可以被称为“衣壳融合蛋白”。
合适地，第一核酸可以包含根据SEQ ID NO:22、23、24或25的序列。合适地，第一核酸可以包含与SEQ ID NO:22、23、24或25具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。合适地，第一核酸可以由根据SEQ IDNO:22、23、24或25的序列组成。
合适地，本发明涉及并利用编码任选地附着于第二结合蛋白的功能性分子的第二核酸。合适地，第二核酸可以编码包含任选地与第二结合蛋白融合的功能性分子的融合蛋白。合适地，这可以被称为“功能性融合蛋白”。
在一个实施方案中，第二核酸仅编码功能性分子。
在一个实施方案中，第二核酸编码附着于第二结合蛋白的功能性分子。在一个实施方案中，第二核酸编码与第二结合蛋白融合的功能性分子。
合适地，第二核酸可以包含根据SEQ ID NO:26、27、28、29、41、32或45的序列。合适地，第二核酸可以包含与SEQ ID NO:26、27、28、29、41、32或45具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。合适地，第二核酸可以由根据SEQ ID NO:26、27、28、29、41、32或45的序列组成。
合适地，功能性分子是表位。合适地，选自IL-13、IL-33、IL-17或SARS-Cov2刺突蛋白受体结合结构域的表位。
在第二核酸编码与第二结合蛋白融合的IL-13表位的实施方案中，合适地，第二核酸可以包含根据SEQ ID NO:26或27的序列，或与SEQ ID NO:26或27具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。
在第二核酸编码与第二结合蛋白融合的IL-33表位的实施方案中，合适地，第二核酸可以包含根据SEQ ID NO:28或29的序列，或与SEQ ID NO:28或29具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。
在第二核酸编码与第二结合蛋白融合的SARS-CoV2刺突蛋白表位的实施方案中，合适地，第二核酸可以包含根据SEQ ID NO:41的序列，或与SEQ ID NO:41具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。
在第二核酸编码与第二结合蛋白融合的IL-17表位的实施方案中，合适地，第二核酸可以包含根据SEQ ID NO:45的序列，或与SEQ ID NO:45具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。
在第二核酸编码与第二结合蛋白融合的两个功能性分子的实施方案中，合适地，第二核酸可以包含根据SEQ ID NO:42或43的序列，或与SEQ ID NO:42或43具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。合适地，功能性分子可以包含一个或多个表位和/或荧光分子。合适地，功能性分子可以包含两个表位。合适地，功能性分子可以包含表位和荧光分子。
在第二核酸编码两个表位的实施方案中，它们可以是与第二结合蛋白融合的任何两个表位。在一个实施方案中，第二核酸编码SARS-Cov2刺突蛋白受体结合结构域和核衣壳蛋白的C-末端片段。合适地，第二核酸可以包含根据SEQ ID NO:42的序列，或与SEQ ID NO:42具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。
在第二核酸编码与第二结合蛋白融合的表位和荧光分子的实施方案中，它们可以是任何表位和任何荧光分子。在一个实施方案中，第二核酸编码SARS-Cov2刺突蛋白受体结合结构域和eGFP。合适地，第二核酸可以包含根据SEQ ID NO:43的序列，或与SEQ ID NO:43具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明涉及并利用编码第二功能性分子的另一核酸。合适地，这种另一核酸可以被称为第四核酸。在一些实施方案中，当第二核酸已经编码附着于第二结合蛋白的第一功能性分子时，这可能发生。合适地，在这样的实施方案中，第一结合蛋白被化学修饰。
在一些实施方案中，本发明涉及并利用编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白的另一核酸。合适地，这种另一核酸可以被称为第三核酸。合适地，第三结合蛋白是能够结合抗原结合蛋白(如抗体)的蛋白。合适地，第三结合蛋白可以是例如蛋白G。
合适地，第三核酸可以包含根据SEQ ID NO:30的序列。合适地，第三核酸可以包含与SEQ ID NO:30具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。合适地，第三核酸可以由根据SEQ ID NO:30的序列组成。
合适地，第一、第二和第三结合蛋白在本文别处定义。然而，合适地，第一结合蛋白可以是细菌毒素抑制剂，第二结合蛋白可以是细菌毒素。合适地，第三结合蛋白可以是抗体结合蛋白。
在一些实施方案中，本发明可以利用第一和第二核酸。
在一些实施方案中，本发明可以利用第一、第二和第三核酸。
在一些实施方案中，本发明可以利用第一、第二和第四核酸。
在一些实施方案中，本发明可以利用第一和第三核酸。
在一些实施方案中，本发明可以利用第一、第二、第三和第四核酸。
合适地，本文所述的第一、第二、第三和第四核酸可以作为一个连续的核酸序列提供，或者可以作为多个独立的核酸序列提供。提及第一、第二、第三和第四核酸时，包括多个核酸序列可用于编码与第一、第二、第三和第四核酸相同的蛋白质的实施方案。
合适地，所述核酸可以包含一个或多个表达元件，以帮助其上编码的蛋白质的表达。
合适的表达元件包括启动子、操纵子、增强子、激活子、阻遏子、5’UTR、3’UTR、内含子、IRES等。
合适地，每个核酸包含一个或多个表达元件，其确保了其上编码的蛋白质的同等表达。合适地，每个核酸包含启动子，其确保了其中编码的蛋白质的同等表达。合适地，启动子可以包含一个或多个改变由此产生的表达水平的修饰。合适地，启动子可以包含一个或多个突变。合适地，本文描述的所述或每个核酸与启动子可操作地连接。
合适的启动子可以选自：CMV-IE、EF1a、SV40、PGK1、CAG、人类β肌动蛋白、T7、TetR/TetA、T7lac、SP6、LP1、TTR、CK8、突触蛋白(Synapsin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、CaMKII、TBG和白蛋白启动子。
合适地，每个核酸可以连接到相同的启动子或不同的启动子上。
合适地，每个核酸可以连接到相同的启动子上。因此，合适地，每个核酸可以同时表达。合适地，每个核酸可以连接到T7启动子上，任选地具有一个或多个修饰，以确保由核酸编码的蛋白质的同等表达水平。
合适地，每个核酸可以连接到不同的启动子上。因此，合适地，每个核酸可以在不同时间表达。合适地，所述或每个核酸可以独立表达。合适地，可以在不同时间诱导每个核酸的表达。因此，合适地，所述或每个启动子可以是诱导型启动子。合适地，其可通过将启动子与合适的诱导物接触来诱导，诱导物的浓度可有效诱导由此产生的表达。在一个实施方案中，第一核酸序列可以与第一启动子连接，第二核酸可以与第二启动子连接。合适地，第一启动子可以是T7启动子至本文所述的修饰的T7启动子。合适地，第二启动子可以是TetR/TetA启动子。
在一个实施方案中，可操作地连接至第二核酸的T7启动子被修饰。合适地，可操作地连接至第二核酸的T7启动子被修饰，以降低附着于其上编码的第二结合蛋白的功能性分子的表达水平。合适地，T7启动子通过点突变进行修饰。合适地，T7启动子可以包含根据Konczal等人,PLoS One 2019的命名中的任何下列修饰：1C、1T、2T、5A、8G、4C或其任意组合，其中亲本序列是：agcataat(SEQ ID NO:44)。合适地，修饰的T7启动子包含根据SEQ IDNO:31的序列。在这样的实施方案中，合适地，可操作地连接至第一核酸的T7启动子未被修饰。
因此，合适地，第一核酸表达的附着于第一结合蛋白的病毒衣壳蛋白的水平与第二核酸表达的附着于第二结合蛋白的功能性分子的水平相同，或者与第三核酸的水平相同。
因此，合适地，衣壳融合蛋白以与功能性融合蛋白或功能性分子相比1:1的水平表达。
合适地，核酸可以包含在一个或多个载体上。合适地，第一、第二、第三和/或第四核酸可以包含在一个载体上。或者，第一、第二、第三和/或第四核酸可以包含在多个载体上。在一个实施方案中，第一核酸可以包含在一个载体上，第二核酸可以包含在另一个载体上。
在一个实施方案中，第一核酸包含在第一载体上，合适地，包含在SEQ ID NO:1或2的载体上。
在一个实施方案中，第二核酸包含在第二载体上，合适地，包含在SEQ ID NO:3、4、9、10或11的载体上。
或者，在一个实施方案中，第一和第二核酸可以包含在相同载体上，合适地，包含在SEQ ID NO:5、6、7、47或48的载体上。
在一个实施方案中，第一核酸和第三核酸包含在相同载体上，合适地，包含在SEQID NO:8的载体上。
合适地，所述一个或多个载体可以包含在一个或多个宿主细胞中。合适地，所述一个或多个载体可以包含在单一宿主细胞中。合适地，例如在第十方面中。或者，所述一个或多个载体可以以任意组合包含在多个宿主细胞中。合适地，例如在第十一方面中。
合适地，在第十方面的方法中，第一、第二和/或第三核酸可以分别包含在一个载体上或第一和第二载体上，或第一、第二和第三载体上。在第十方面的方法的一个实施方案中，第一和第二核酸包含在一个载体上。合适地，所述或每个载体存在于单一宿主细胞中。在第十方面的方法的一个实施方案中，第一和第二核酸包含在SEQ ID NO:5、6、7、47或48的单一载体上。在第十方面的方法的一个实施方案中，第一和第三核酸包含在SEQ ID NO:8的单一载体上。合适地，单一宿主细胞包含SEQ ID NO:5、6、7、8、47或48的单一载体。在第十方面的方法的一个实施方案中，第一、第二和/或第三核酸包含在两个不同载体上。合适地，第一核酸可以包含在选自SEQ ID NO:1或2的第一载体上。合适地，第二核酸可以包含在选自SEQ ID NO:3、4、9、10或11的第二载体上。合适地，在单一宿主细胞中可以使用第一和第二载体的任何可行组合。例如，第一载体可以包括SEQ ID NO:1，并且可以与SEQ ID NO:3、4、9、10或11的任何第二载体组合。例如，第一载体可以包括SEQ ID NO:2，并且可以与SEQ IDNO:3、4、9、10或11的任何第二载体组合。
合适地，在第十一方面的方法中，第一和第二核酸分别包含在第一和第二载体上。合适地，第三核酸可以与第二核酸一起或单独包含在第二载体上。或者，第三核酸可以包含在第三载体上。合适地，第一载体存在于第一宿主细胞中，第二和/或第三载体存在于第二宿主细胞中。或者，第三载体可以存在于第三宿主细胞中。在第十一方面的方法的一个实施方案中，合适地，第一载体是SEQ ID NO:1或2，第二载体是SEQ ID NO:3、4、9、10或11。合适地，在宿主细胞中可以使用第一和第二载体的任何可行组合。例如，第一宿主细胞可以包括SEQ ID NO:1的第一载体，并且可以与包含任意SEQ ID NO:3、4、9、10或11的第二载体的第二宿主细胞组合。例如，第一宿主细胞可以包括SEQ ID NO:2的第一载体，并且可以与包含任意SEQ ID NO:3、4、9、10或11的第二载体的第二宿主细胞组合。
合适地，所述一个或多个载体可以进一步包含第三和/或第四核酸。在一个实施方案中，所述一个或多个载体可以进一步包含编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白的第三核酸，和编码第二功能性分子的第四核酸。
合适地，另外的第三和/或第四核酸可以包含在第一或第二的宿主细胞中的载体上。合适地，另外的第三和/或第四核酸可以包含在与第一和/或第二核酸相同的载体上，或者不同的载体上。合适地，第三和/或第四核酸可以都包含在第三载体上。或者，第三和/或第四核酸可以分别包含在第三和第四载体上。合适地，第三和/或第四载体可以存在于第一或第二宿主细胞中。或者，第三和/或第四载体可以存在于第三宿主细胞中。或者，第三载体可以存在于第三宿主细胞中，第四载体可以存在于第四宿主细胞中。
任何合适的载体都可以用于选择的宿主细胞。合适的宿主细胞在下面讨论。合适地，载体选自：质粒、粘粒、噬菌体、病毒、人工染色体。合适地，所述或每个载体是质粒。
用于宿主大肠杆菌细胞的合适质粒载体可以包括，例如：pALTER-Ex1、pALTER-Ex2、pBAD/His、pBAD/Myc-His、pBAD/gIII、pCal-n、pCal-n-EK、Cal-c、pCal-Kc、pcDNA 2.1、pDUAL、pET-3a-c、pET-9a-d、pET-11a-d、pET-12a-c、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b、pET-19b、pET-20b(+)、pET-21a-d(+)、pET-22b(+)、pET-23a-d(+)、pET-24a-d(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a-c(+)、pET-29a-c(+)、pET-30a-c(+)、pET-31b(+)、pET-32a-c(+)、pET-33b(+)、pET-34b(+)、pET-35b(+)、pET-36b(+)、pET-37b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a-c(+)、pET-42a-c(+)、pET-43a-c(+)、pETBlue-1、pETBlue-2、pETBlue-3、pGEMEX-1、pGEMEX-2、pGEX-1lT、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-3X、pGEX-4T、pGEX-5X、pGEX-6P、pHAT10/11/12、pHAT20、pHAT-GFPuv、pKK223-3、pLEX、pMAL-c2X、pMAL-c2E、pMAL-c2G、pMAL-p2X、pMAL-p2E、pMAL-p2G、pProEX HT、pPROLar.A、pPROTet.E、pQE-9、pQE-16、pQE-30/31/32、pQE-40、pQE-60、pQE-70、pQE-80/81/82L、pQE-100、pRSET、pSE280、pSE380、pSE420、pThioHis、pTrc99A、pTrcHis、pTrcHis2、pTriEx-1、pTriEx-2、pTrxFus。
在一个实施方案中，使用的载体是pET-Duet。
用于宿主哺乳动物细胞的合适质粒载体可以包括：pSV和pCMV系列载体。
在一个实施方案中，使用的载体是pcDNA5D。在一个实施方案中，宿主哺乳动物细胞是HEK293细胞或CHO细胞或其衍生物。
合适地，如果使用一个以上的载体，则它是相同的载体。
合适地，载体可以包含多种其他功能性核酸序列，如一个或多个选择性标记、一个或多个复制起点、多克隆位点等。
生产VLP的方法
本发明进一步涉及生产VLP的方法。本文描述了两种不同的方法，一种是单细胞方法，另一种是发生在至少两个细胞中并且需要混合组分以形成VLP的方法。
根据本发明的第十方面，提供了一种生产VLP的单细胞方法。
根据本发明的第十一方面，提供了一种生产VLP的多细胞方法。
合适地，所述方法可以进一步包括将包含核酸的一种或多种载体转染到所述或每个宿主细胞中。合适地，在培养所述或每个宿主细胞之前。合适地，转染可以通过任何合适的方法进行，如电穿孔、显微注射、颗粒递送、化学介导的胞吞作用、磷酸钙共沉淀或脂质体介导的递送。
合适地，在表达蛋白质的条件下培养宿主细胞包括在最佳生长条件下培养宿主细胞。合适地，最佳生长条件将根据所用的宿主细胞而变化。
合适地，宿主细胞可以选自任何细菌、酵母、昆虫细胞或人类细胞。合适地，宿主细胞是细菌宿主细胞。合适地，宿主细胞选自大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、类球红细菌(Rodhobactersphaeroides)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、希瓦氏菌(Shewanella)属菌株Ac10、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、细长盐生单胞菌(Halomonas elongate)、需盐色盐杆菌(Chromohalobacter salexigens)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、耐内酰胺诺卡氏菌(Nocardia lactamdurans)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacien)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)。
在一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。合适地，大肠杆菌菌株选自BL21、lemo21、NiCo21、NEB Express、SHuffle、T7 Express、BLR、HMS174、Tuner、Origami2、Rosetta2、m15。
在一个实施方案中，大肠杆菌菌株是BL21(DE3)，其中调节二硫键形成的额外基因dsbC和erv1P被基因组整合。合适地，基因组整合在recAX基因座内。
在另一个实施方案中，宿主细胞是人类细胞，如HEK293T细胞。
合适地，最佳生长条件包括在15-25℃的温度下培养。合适地，最佳生长条件包括在与用于人类的药物的生物工艺应用相容的培养基中培养，如化学成分确定的培养基。合适地，最佳生长条件包括在通气的培养基中培养。
合适地，宿主细胞被培养到高密度。合适地，达到4-20的密度OD600。
合适地，在表达蛋白质的条件下培养宿主细胞还可以包括诱导宿主细胞表达蛋白质。合适地，诱导宿主细胞可以包括向培养基中加入诱导物，或在培养基中创造某些诱导条件，如酸/碱pH、热休克、缺氧等。合适地，诱导物或诱导条件刺激核酸的转录。合适地，诱导物或诱导条件通过刺激核酸内的诱导型表达控制序列来实现。合适地，诱导型表达控制序列可以是诱导型启动子。合适的诱导物包括用于乳糖驱动启动子的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)或用于四环素调控启动子的四环素。
合适地，一旦培养物达到上述最佳密度，诱导宿主细胞表达蛋白质。合适地，诱导宿主细胞在对数生长期表达蛋白质。
合适地，蛋白质的浓度可以通过调节诱导物的浓度或改变宿主细胞暴露的诱导条件来改变。
合适地，培养步骤需要4-24小时。
合适地，在培养2-6小时后或当OD达到6-8时，诱导宿主细胞表达蛋白质。
在本发明的另一方面，提供了包含第七、第八或第九方面的一个或多个宿主细胞和培养基的细胞培养物。合适地，多个所述细胞。
或者，所述方法可以不在一个或多个细胞中进行，而可以在无细胞体系中进行。合适地，在第十一方面的方法中，步骤(a)在宿主细胞内进行，以确保VLP外壳的适当生产。然而，合适地，步骤(b)可以发生在宿主细胞之外，在无细胞体系中。
合适地，所述方法可以进一步包括回收VLP的步骤。合适地，从宿主细胞中回收VLP。合适地，在VLP已经形成之后。
合适地，回收VLP可以包含破碎宿主细胞。或者，宿主细胞可以将VLP分泌到培养液中。合适地，破碎宿主细胞可以通过任何合适的方法进行，如匀浆、超声处理或冻融。
VLP的回收可以通过任何合适的方法进行，如过滤、下拉(pull-down)、离心或层析法。
合适地，在结合蛋白包含化学修饰的实施方案中，合适地，VLP的回收和纯化通过层析法进行。合适地，包括一系列步骤，包括混合模式(疏水相互作用和尺寸排阻)层析、阴离子交换层析和超滤。合适地，通过阴离子交换层析。合适地，当使用阴离子交换层析回收VLP时，VLP可以包括化学修饰，合适地，在这样的实施方案中，VLP的第一结合蛋白用DEAE修饰。合适地，DEAE分子可以结合到层析柱上。
合适地，在第十一方面的方法中，步骤(d)包括回收蛋白质。合适地，从宿主细胞中回收蛋白质。合适地，可以通过类似的技术回收蛋白质。合适地，回收蛋白质可以包含如上所述破碎宿主细胞。或者，宿主细胞可以将蛋白质分泌到培养液中。
合适地，VLP通过自组装形成，合适地，自动自组装。合适地，一旦组分蛋白混合，无论是按照第十方面在单一宿主细胞内混合，还是按照第十一方面在细胞外混合，它们将组装形成VLP。
关于第十方面的单细胞方法，合适地，培养宿主细胞的步骤进一步包括在使得从第一和第二核酸或从任何另外的核酸表达的蛋白质彼此结合的条件下培养。
在一些实施方案中，在培养步骤之后，第一结合蛋白可以被化学修饰。因此，合适地，所述方法可以包含回收蛋白质，随后化学修饰第一结合蛋白的步骤。合适地，这些步骤发生在步骤(b)之后但在步骤(c)之前。
在一些实施方案中，所述一种或多种载体可以进一步包含编码第二功能性分子的另一(第四)核酸。合适地，在这样的实施方案中，第一结合蛋白被化学修饰。合适地，第二功能性分子结合到化学修饰上。合适地，在这样的实施方案中，在从第一、第二和第四核酸表达蛋白质的条件下培养宿主细胞。
在一些实施方案中，所述一种或多种载体可以进一步包含编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白的第三核酸。合适地，在这样的实施方案中，在从第一和第三核酸表达蛋白质的条件下培养宿主细胞。合适地，在这样的实施方案中，第二核酸可以存在，并且可以仅编码功能性分子。合适地，在这样的实施方案中，功能性分子是抗原结合蛋白。
在一些实施方案中，可以在从第一、第二、第三和第四核酸表达蛋白质的条件下培养宿主细胞。
在一个实施方案中，第二核酸仅编码功能性分子。合适地，在这样的实施方案中，第一结合蛋白被化学修饰，或者存在第三核酸。
在一个实施方案中，第二核酸编码附着于第二结合蛋白的功能性分子。合适地，在这样的实施方案中，第一结合蛋白可以或可以不被化学修饰。
在一个实施方案中，第十方面的步骤(c)包括与每个第二结合蛋白结合的每个第一结合蛋白。在另一个实施方案中，步骤(c)包括合适地通过化学修饰与功能性分子结合的每个第一结合蛋白。在一个实施方案中，步骤(c)包括这两个步骤。
关于第十一方面的多细胞方法，合适地，在培养步骤期间，第一结合蛋白可以被化学修饰。因此，合适地，培养第一宿主细胞的条件是使得第一结合蛋白被化学修饰。合适地，第一结合蛋白的这种化学修饰可以发生在翻译后。或者，所述方法可以包含化学修饰第一结合蛋白的步骤。合适地，这一步骤发生在步骤(d)之后但在步骤(e)之前。
在一些实施方案中，所述一种或多种载体可以进一步包含编码第二功能性分子的另一(第四)核酸。合适地，第四核酸可以包含在第一或第二宿主细胞的载体上，或者可以包含在第三宿主细胞的载体上。合适地，在这样的实施方案中，第一结合蛋白被化学修饰。合适地，在这样的实施方案中，在从第一、第二和第四核酸表达蛋白质的条件下培养宿主细胞。
在一些实施方案中，所述一种或多种载体可以包含编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白的第三核酸。合适地，在这样的实施方案中，在从第一和第三核酸表达蛋白质的条件下培养宿主细胞。
合适地，在这样的实施方案中，第二核酸(如果存在的话)仅编码功能性分子。合适地，在这样的实施方案中，功能性分子是抗原结合蛋白。
在一些实施方案中，可以在从第一、第二、第三和第四核酸表达蛋白质的条件下培养宿主细胞。
在一个实施方案中，步骤(e)包括与每个第二结合蛋白结合的每个第一结合蛋白。在另一个实施方案中，步骤(e)包括合适地通过化学修饰与每个功能性分子结合的每个第一结合蛋白。在一个实施方案中，步骤(e)包括这两个步骤。
在一个实施方案中，步骤(e)进一步包括在使得蛋白质彼此结合的条件下混合。合适地，步骤(e)包括混合宿主细胞上清液或宿主细胞裂解物。合适地，将第一宿主细胞上清液或裂解物与其它宿主细胞上清液或裂解物混合。合适地，混合使得结合蛋白的比例赋予了均匀的化学计量浓度。合适地，混合使得第一宿主细胞上清液或裂解物与其它宿主细胞上清液或裂解物的比例为约1:1。合适地，混合步骤在室温下进行，合适地在18-22℃左右。合适地，混合进行15分钟至2小时，合适地20分钟至1小时，合适地25分钟至45分钟，合适地约30分钟。
在本发明的第十方面的一个实施方案中，提供了一种在单一宿主细胞中生产病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：
(a)提供包含一种或多种载体的宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)编码附着于第一结合蛋白的病毒衣壳蛋白的第一核酸；和
(ii)编码功能性分子的第二核酸；
(b)在分别表达来自第一和第二核酸的蛋白质的条件下培养宿主细胞；
(c)从蛋白质形成病毒样颗粒。
合适地，其中第一结合蛋白被化学修饰，并且功能性分子能够结合化学物质。
在本发明的第十方面的一个实施方案中，提供了一种在单一宿主细胞中生产病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：
(a)提供包含一种或多种载体的宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)编码附着于第一结合蛋白的病毒衣壳蛋白的第一核酸；和
(ii)编码附着于第二结合蛋白的功能性分子的第二核酸；
(b)在分别表达来自第一和第二核酸的蛋白质的条件下培养宿主细胞；
(c)从蛋白质形成病毒样颗粒。
在本发明的第十方面的一个实施方案中，提供了一种在单一宿主细胞中生产病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：
(a)提供包含一种或多种载体的宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)编码附着于第一结合蛋白的病毒衣壳蛋白的第一核酸；和
(ii)编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白的第三核酸；
(b)在分别表达来自第一和第三核酸的蛋白质的条件下培养宿主细胞；
(c)从蛋白质形成病毒样颗粒。
合适地，功能性分子可以与VLP(一旦其形成)混合，合适地，功能性分子能够结合第三结合蛋白。
在本发明的第十方面的一个实施方案中，提供了一种在单一宿主细胞中生产病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：
(a)提供包含一种或多种载体的宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)编码附着于第一结合蛋白的病毒衣壳蛋白的第一核酸；和
(ii)(a)编码功能性分子的第二核酸；和
(b)编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白的第三核酸；
(b)在分别表达来自第一、第二和第三核酸的蛋白质的条件下培养宿主细胞；
(c)从蛋白质形成病毒样颗粒。
合适地，其中功能性分子能够结合第三结合蛋白。
在本发明的第十一方面的一个实施方案中，提供了一种生产病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：
(a)提供包含一种或多种载体的第一宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(j)第一核酸，其编码附着于第一结合蛋白的乙型肝炎衣壳蛋白，其中第一结合蛋白是细菌毒素抑制剂；
(b)提供包含一种或多种载体的一种或多种另外的宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(iii)第二核酸，其编码功能性分子；
(c)在分别表达来自第一和第二核酸的蛋白质的条件下培养宿主细胞；
(d)回收蛋白质；
(e)混合蛋白质形成病毒样颗粒。
合适地，其中第一结合蛋白被化学修饰，并且功能性分子能够结合化学物质。
合适地，步骤(b)包括提供第二宿主细胞。
在本发明的第十一方面的一个实施方案中，提供了一种生产病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：
(a)提供包含一种或多种载体的第一宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)第一核酸，其编码附着于第一结合蛋白的乙型肝炎衣壳蛋白，其中第一结合蛋白是细菌毒素抑制剂；
(b)提供包含一种或多种载体的一种或多种另外的宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)第二核酸，其编码附着于第二结合蛋白的功能性分子，其中第二结合蛋白是细菌毒素；
(c)在分别表达来自第一和第二核酸的蛋白质的条件下培养宿主细胞；
(d)回收蛋白质；
(e)混合蛋白质形成病毒样颗粒。
合适地，步骤(b)包括提供第二宿主细胞。
在本发明的第十一方面的一个实施方案中，提供了一种生产病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：
(a)提供包含一种或多种载体的第一宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)第一核酸，其编码附着于第一结合蛋白的乙型肝炎衣壳蛋白，其中第一结合蛋白是细菌毒素抑制剂；
(b)提供包含一种或多种载体的一种或多种另外的宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)第三核酸，其编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白，其中第二结合蛋白是细菌毒素；
(c)在分别表达来自第一和第三核酸的蛋白质的条件下培养宿主细胞；
(d)回收蛋白质；
(e)混合蛋白质形成病毒样颗粒。
合适地，功能性分子可以与VLP(一旦其形成)混合，合适地，功能性分子能够结合第三结合蛋白。
合适地，步骤(b)包括提供第二宿主细胞。
在本发明的第十一方面的一个实施方案中，提供了一种生产病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：
(a)提供包含一种或多种载体的第一宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)第一核酸，其编码附着于第一结合蛋白的乙型肝炎衣壳蛋白，其中第一结合蛋白是细菌毒素抑制剂；
(b)提供包含一种或多种载体的一种或多种另外的宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)第二核酸，其编码功能性分子；和
(ii)第三核酸，其编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白，其中第二结合蛋白是细菌毒素；
(c)在分别表达来自第一、第二和第三核酸的蛋白质的条件下培养宿主细胞；
(d)回收蛋白质；
(e)混合蛋白质形成病毒样颗粒。
合适地，其中功能性分子能够结合第三结合蛋白。
合适地，步骤(b)可以包括提供包含(i)和(ii)的第二宿主细胞。或者，步骤(b)可以包括提供包含(i)的第二宿主细胞和提供包含(ii)的第三宿主细胞。
免疫原性组合物
本发明进一步涉及包含本发明VLP的免疫原性组合物。
合适地，免疫原性组合物可以是疫苗。
合适地，免疫原性组合物可以进一步包含一种或多种佐剂。合适的佐剂包括：无机盐、乳剂、微生物衍生的佐剂、碳水化合物、细胞因子、微粒或张力活性化合物(tensoactivecompound)。
合适的无机盐包括：adjumer、alhydrogel、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾、无定形羟基磷酸硫酸铝(AAHSA)、普通铝盐、磷酸钙、Rehydragel HPA或Rehydragel LV。
合适的乳剂包括：弗氏完全、弗氏不完全、montanide ISA720、montanide ISA 51、montanide不完全、Ribi、TiterMax、AF03、AS03、MF59、specol、SPT或角鲨烯。
合适的微生物衍生的佐剂包括：霍乱毒素或其突变体、霍乱毒素亚单位B、CpGDNA、LTR 192G、MPL、百日咳博德特氏菌(Bordella pertussis)组分、大肠杆菌热不稳定毒素、CTA1-DD基因融合蛋白、Etx B亚单位、脂多糖、鞭毛蛋白、棒状杆菌衍生的P40、LTK72、MPL-SE或Ty颗粒。
合适地，免疫原性组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以包括稳定剂、填充剂、防腐剂、稀释剂、营养物、抗氧化剂、抗菌剂、缓冲剂、溶剂、灭活剂、净化剂、乳化剂、表面活性剂等。
合适的赋形剂可以选自，例如：谷氨酸一钠、蔗糖、D-甘露糖、D-果糖、葡萄糖、人血清白蛋白、磷酸钾、聚维酮(plasdone)C、无水乳糖、微晶纤维素、波拉克林(polacrilin)钾、硬脂酸镁、醋酸邻苯二甲酸纤维素、乙醇、丙酮、蓖麻油、氯化钠、苄索氯铵、甲醛、抗坏血酸、水解酪蛋白、碳酸氢钠、碳酸钠、戊二醛、2-苯氧乙醇、聚山梨酯80(吐温80)、新霉素、硫酸多粘菌素B、牛血清白蛋白、硫酸新霉素、多粘菌素B、酵母蛋白、硫酸链霉素、硫氰酸铵、大米蛋白、乳糖、福尔马林、氨基酸补充剂、磷酸盐缓冲盐溶液、磷酸二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物、酵母DNA、脱氧胆酸盐、硫代磷酸酯连接的寡脱氧核苷酸、十二水合二碱盐、脱水单碱盐、L-组氨酸、硼酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、卵清蛋白、脱水山梨糖醇三油酸酯、脱水柠檬酸钠、柠檬酸一水合物、卡那霉素、钡、氢化可的松、卵蛋白、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、辛基酚聚醚-10(TRITON X-100)、α-生育酚琥珀酸氢酯、硫酸庆大霉素、磷酸钠单碱盐、磷酸钠二碱盐、十六烷基三甲基溴化铵、和β-丙内酯、硫柳汞、α-生育酚琥珀酸氢酯、水解猪明胶、精氨酸、磷酸钾二碱盐、磷酸钾单碱盐、硫酸鱼精蛋白、焦亚硫酸钠、Vero细胞蛋白、CRM197蛋白、维生素、小牛血清、尿素、琥珀酸盐缓冲液、等渗盐溶液、苯酚、M-199培养基、鸡蛋白、聚明胶肽、金霉素、葡聚糖、Dulbecco氏改良Eagle培养基、硫酸镁、硝酸铁(III)、L-胱氨酸、L-酪氨酸、山梨醇、黄原胶、水、EDTA、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、3-O-去酰基-4’单磷酰脂质A(MPL)、QS-21和胆固醇。
在一个实施方案中，赋形剂可以是精氨酸、谷氨酰胺和海藻糖。
合适地，免疫原性组合物被配制成流体，合适地为液体。合适地，选择赋形剂和添加剂，使得制剂是液体。合适地，是可注射的液体。
免疫原性
术语“免疫原性”是指VLP或包含本发明VLP的免疫原性组合物能够在受试者中引发免疫反应。合适地，在受试者中引发有效的、优选保护性的免疫反应。因此，VLP或包含本发明VLP的免疫原性组合物能够在受试者中产生抗体反应和/或在受试者中产生基于非抗体的免疫反应。合适地，这可以称为其免疫原性活性。
如实施例中所述，本发明人已经证明，包含本发明VLP的免疫原性组合物表现出与对照疫苗相当(如果没有提高的话)的免疫原性活性。然而，令人惊讶的是，本发明人发现，包含本发明VLP的疫苗引发了与对照疫苗相比更快且更持续和一致的免疫原性反应。因此，本发明的VLP显示出免疫原性活性，非常适合用作药物的治疗用途。
合适地，VLP或包含本发明VLP的免疫原性组合物的免疫原性活性可通过施用VLP或包含本发明VLP的免疫原性组合物后受试者中存在的抗体的量(即抗体产生)来确定。合适地，与VLP抗原结合的抗体的量。合适地，施用VLP或包含本发明VLP的免疫原性组合物后，受试者中存在的抗体的量，即抗体产生，在一段时间内是持续且一致的。合适地，VLP或包含本发明VLP的免疫原性组合物的免疫原性活性可通过在给定的一段时间内施用VLP或包含本发明VLP的免疫原性组合物后受试者中存在的抗体的量(即在给定的一段时间内的抗体产生)来确定。合适的时间段概述如下。抗体的量是指其滴度或浓度。合适地，血清中抗体的浓度。
合适地，VLP或包含本发明VLP的免疫原性组合物可在受试者中维持免疫原性活性至少5天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天、至少50天、至少55天、至少60天、至少65天、至少70天、至少75天、至少80天、至少85天、至少90天、至少95天或至少100天或更长。合适地，VLP或包含本发明VLP的免疫原性组合物可在受试者中维持免疫原性活性至少110天、至少120天、至少130天、至少140天、至少150天、至少160天、至少170天、至少180天、至少190天、至少200天、至少210天、至少220天、至少230天、至少240天、至少250天、至少260天、至少270天、至少280天、至少290天、至少300天或更长。
合适地，VLP或包含本发明VLP的免疫原性组合物可在受试者中维持免疫原性活性至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少12周、至少14周、至少16周、至少18周、至少20周或更长。合适地，VLP或包含本发明VLP的免疫原性组合物可在受试者中维持免疫原性活性至少30周、至少40周、至少50周、至少60周、至少70周、至少80周、至少90周、至少100周或更长。
合适地，VLP或包含本发明VLP的免疫原性组合物可在受试者中维持免疫原性活性至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年或至少10年或更长。合适地，VLP或包含本发明VLP的免疫原性组合物可在受试者中维持免疫原性活性至少10年、至少15年、至少20年、至少25年、至少30年、至少35年、至少40年、至少45年、至少50年或更长。
合适地，其中免疫原性活性可以指免疫原性抗体的产生。合适地，以免疫原性的浓度产生抗体。合适地，以免疫原性的血清浓度产生抗体。合适地，以血清中1-20μg/ml、1-18μg/ml、1-16μg/ml、1-14μg/ml、1-12μg/ml、2-18μg/ml、2-16μg/ml、2-14μg/ml、2-12μg/ml或2-10μg/ml的浓度为例。
考虑到实施例中列出的信息，技术型的读者将认识到本发明的VLP或免疫原性组合物表现出免疫原性活性，这使得它们非常适合于以本说明书中描述的方式用于治疗。
医疗用途
本发明进一步涉及VLP或包含VLP的免疫原性组合物用于疗法或预防和/或治疗疾病的用途。
在另一方面，本发明进一步提供了治疗患有疾病的受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的根据第一或第二方面的VLP或根据第十一方面的免疫原性组合物。
在另一方面，本发明进一步提供了一种制备用于治疗疾病的药物的方法，所述药物包含有效量的根据第一或第二方面的VLP或根据第十一方面的免疫原性组合物。
合适地，所述疾病可以选自：传染性疾病、癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病、代谢疾病、炎性疾病、神经性疾病或风湿退行性疾病或成瘾。
合适的传染性疾病包括：病毒、细菌、真菌或原生动物感染。
合适的病毒感染包括：COVID-19、SARS、MERS、流感、普通感冒、呼吸道合胞病毒感染、腺病毒感染、副流感病毒感染、诺如病毒感染、轮状病毒感染、星状病毒感染、麻疹、流行性腮腺炎、风疹、水痘、带状疱疹、玫瑰疹、天花、第五种病(fifth disease)、基孔肯雅病毒感染、HPV感染、甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎、疣、疱疹、传染性软疣、埃博拉、拉沙热、登革热、黄热病、马尔堡出血热、克里米亚-刚果出血热、脊髓灰质炎、病毒性脑膜炎、病毒性脑炎、狂犬病、寨卡病毒感染、西尼罗河病毒感染、HIV/AIDS、汉坦病毒感染、HPS。
合适的细菌感染包括：尿路感染、膀胱炎、脓疱病、细菌性食物中毒、弯曲杆菌病、艰难梭菌感染、细菌性蜂窝组织炎、MRSA、CRPA、VRSA、败血症、丹毒、坏死性筋膜炎、细菌性毛囊炎、淋病、衣原体、梅毒、生殖支原体、细菌性阴道病、盆腔炎、结核病、百日咳、流感嗜血杆菌病、肺炎、细菌性脑膜炎、莱姆病、霍乱、肉毒中毒、破伤风、炭疽、隐孢子虫病、白喉、大肠杆菌感染、军团病、钩端螺旋体病、李斯特杆菌病、沙门氏菌感染、志贺氏菌胃肠炎、葡萄球菌感染、链球菌感染、TSS、伤寒、耶尔森氏菌感染。
合适的癌症包括：乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、脑癌、前列腺癌、肠癌、直肠癌、骨癌、白血病、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、眼癌、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、胆囊癌、头颈癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、间皮瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、卵巢癌、食管癌、口腔癌、鼻咽癌、鼻和鼻窦癌症、皮肤癌、肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌、阴茎癌、外阴癌。
合适的自身免疫性疾病包括：哮喘、银屑病、MS、类风湿性关节炎、反应性关节炎、狼疮、炎性肠综合征/疾病、1型糖尿病、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)、脱髓鞘性多发性神经病、格雷夫斯病(Graves’disease)、桥本甲状腺炎(Hashimo’sthyroiditis)、重症肌无力、血管炎、恶性贫血、溃疡性结肠炎、抗磷脂综合征、川崎病、脱发、白癜风、硬皮病、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、克罗恩病、腹腔疾病、阿狄森氏病(Addison’s disease)、嗜睡症。
合适的心血管疾病包括：心绞痛、心脏病发作、心力衰竭、冠心病、中风、短暂性脑缺血发作、外周动脉疾病、主动脉疾病、动脉粥样硬化、高血压、脑血管疾病、肾动脉狭窄、动脉瘤、心肌病、肺心病、心律失常、节律障碍、心内膜炎、心脏肥大、心肌炎、心脏瓣膜病、先天性心脏病、风湿性心脏病。
合适的代谢疾病包括：高胆固醇血症、高甘油三酯血症、糖尿病、高脂血症、高胆红素血症、高钙血症。
合适的炎性疾病可以包括任何上述感染或自身免疫性疾病。合适的炎性疾病可以包括：关节炎、哮喘、结核病、牙周炎、慢性溃疡、鼻窦炎、肝炎、肾小球肾炎、炎性肠综合征/疾病、灌注前损伤、移植排斥、镰状细胞病、过敏、心血管疾病、银屑病、细胞因子介导的瘙痒、COPD、糖尿病、支气管炎、克罗恩病、动脉粥样硬化、皮炎、动脉炎、狼疮。
合适的神经性疾病包括：阿尔茨海默氏病、共济失调、ALS、Bells麻痹、脑肿瘤、动脉瘤、癫痫、吉兰-巴雷综合征、脑积水、脑膜炎、MS、肌营养不良、神经皮肤综合征、帕金森病、偏头痛、脑炎、重症肌无力、痴呆、癫痫发作、脊髓性肌萎缩症、运动神经元疾病、脊柱侧凸、神经病、慢性疲劳综合征、脑瘫。
合适的风湿退行性疾病包括：类风湿性关节炎、银屑病关节炎、脊椎关节病(spondylarthropathy)、骨关节炎、狼疮、系统性硬化症。
合适的成瘾包括：酒精、尼古丁、咖啡因、安非他命、阿片类药物、镇静剂、安眠药、抗焦虑药、可卡因、大麻素、致幻剂、苯环己哌啶(phenycylcidine)。
在一个实施方案中，VLP或免疫原性组合物用于预防或治疗COVID-19。合适地，在这样的实施方案中，功能性分子可以是SARS-CoV-2抗原，合适地是SARS-CoV-2刺突蛋白。或者，在这样的实施方案中，功能性分子可以是炎性细胞因子，合适地是IL-33。
在一个实施方案中，VLP或免疫原性组合物用于预防或治疗银屑病或关节炎。合适地，在这样的实施方案中，功能性分子可以是炎性细胞因子，合适地是IL17。
在一个实施方案中，VLP或免疫原性组合物用于预防或治疗哮喘或特应性皮炎。合适地，在这样的实施方案中，功能性分子可以是炎性细胞因子，合适地是IL13或IL33。
合适地，向受试者施用的有效量是预防或治疗疾病的有效量。熟练的医师可以容易地确定合适的有效量。
合适地，剂量包括有效量。VLP的合适剂量可以包括：10-100微克，合适地10-80微克，合适地20-60微克，合适地20-40微克。
合适地，VLP或免疫原性组合物可以通过任何途径施用。合适地，VLP或免疫原性组合物可以肠内或胃肠外施用。合适地，VLP或免疫原性组合物可以通过口服、直肠、阴道、舌下、注射、经皮或吸入施用。
在一个实施方案中，VLP或免疫原性组合物可以通过注射施用，合适地通过皮下注射。
在一个实施方案中，VLP或免疫原性组合物可以通过吸入施用，合适地通过鼻吸入。
受试者
本发明涉及通过使用VLP或其免疫原性组合物来预防和/或治疗受试者的疾病。
合适地，受试者可以是人或动物。因此，合适地，预防和/或治疗疾病可以在兽医领域中进行。
合适地，受试者可以是成人或儿童。合适地，受试者可以是男性或女性。在一个实施方案中，受试者是成年人。
合适地，受试者可能已经被诊断患有疾病。
或者，受试者可能疑似患有疾病。合适地，受试者可以表现出一种或多种疾病症状。
或者，受试者可能有感染疾病的风险。合适地，受试者可能具有一种或多种与疾病相关的风险因素。合适的风险因素可以包括：例如体重、吸烟、酒精或药物成瘾、年龄、性别、种族、遗传。合适的风险因素可以进一步包括疾病的遗传易感性，例如通过特定基因的表达，或通过基因中特定突变的存在。
在一个实施方案中，向已被诊断患有疾病或具有一种或多种疾病症状的受试者提供VLP或免疫原性组合物，以治疗疾病。
在一个实施方案中，向有患病风险的受试者提供VLP或免疫原性组合物，以预防疾病。
其他用途
本发明进一步涉及VLP在研究和疾病诊断中的用途。
合适地，第一或第二方面的VLP可以用于研究。合适地，VLP可以用作检测工具。合适地，VLP可以用作标记。合适地，在这样的实施方案中，VLP包含功能性分子，所述功能性分子是荧光分子。
合适地，VLP可以包含第一功能性分子，所述第一功能性分子是抗原结合分子，如抗体，和第二功能性分子，所述第二功能性分子是荧光分子。合适地，抗原结合分子可以特异性结合细胞表面受体。合适的细胞表面受体在本文其他地方讨论，然而，合适地，细胞表面受体对细胞类型是特异性的。因此，合适地，VLP能够结合并标记特定的细胞类型。
合适地，VLP可以用作载体。合适地，在这样的实施方案中，VLP可以包括荷载。合适地，荷载可以包含在VLP内，合适地包含在VLP外壳内。合适地，荷载可以是治疗性分子。因此，合适地，VLP本身可以不是治疗剂，但可以是治疗性分子的载体。合适的治疗性分子可以包括例如寡核苷酸、小分子、肽。在一个实施方案中，治疗性分子可以包含反义寡核苷酸，其可以抑制特定核酸的表达。在另一个实施方案中，治疗性分子可以包含细胞毒性化学品，其可以引发细胞死亡。
合适地，在这样的实施方案中，VLP靶向特定位点，例如靶向需要治疗性分子的特定细胞或细胞类型。合适地，这通过包含功能性分子的VLP来实现，所述功能性分子是抗原结合分子，如抗体。合适地，抗原结合分子可以特异性结合细胞表面受体。合适地，结合对靶细胞具有特异性的细胞表面受体。合适地，与细胞表面受体的结合可以刺激细胞对VLP的摄取。因此，合适地，VLP能够结合特定的细胞类型并向其递送荷载。
在本发明的另一方面，提供了一种载体VLP，其包括第一或第二方面的特征，此外还包括荷载，其中荷载包含在VLP外壳内。合适地，荷载是治疗性分子。
合适地，第一或第二方面的VLP还可以用于诊断。
合适地，VLP包含第一功能性分子，所述第一功能性分子是抗原结合分子，如抗体。合适地，抗体特异性结合源自如上所述的致病因子的抗原。合适地，源自感染因子，如病毒、细菌、真菌、原生动物或古细菌。
因此，合适地，VLP能够结合致病因子并允许对其检测。
因此，合适地，本发明的VLP可用于根据本发明第十六方面的诊断疾病的方法中。合适地，提供了一种诊断受试者疾病的方法，其包括：
(a)提供根据本发明第一或第二方面的VLP，其中功能性分子是针对源自致病因子的抗原的抗原结合分子；
(b)将VLP与来自受试者的合适样品混合；
(c)检测VLP是否沉淀；
(d)如果VLP沉淀，则诊断疾病的存在。
合适地，鉴于功能性分子是抗原结合分子，VLP进一步包含第三结合蛋白。本文别处描述了第三结合蛋白。合适地，抗原结合蛋白通过第三结合白间接附着于第二结合蛋白。
合适地，检测是通过与致病因子结合的VLP的沉淀。合适地，检测沉淀可以包括视觉确认，或者用分光计测试。
合适地，如果没有沉淀发生，就不存在疾病。
合适地，VLP也可以包含第二功能性分子，所述第二功能性分子是荧光分子。合适地，这种第二功能性分子可以附着于第一结合蛋白的化学修饰。在这样的实施方案中，合适地，检测步骤可以包括检测样品中荧光的存在。合适地，检测步骤可以包括检测样品中荧光沉淀的存在。合适地，如果出现荧光沉淀，则诊断疾病的存在。
有利地，荧光的使用使得检测样品中的沉淀更灵敏。
在一个实施方案中，诊断方法中使用的VLP包括：
-一个或多个病毒衣壳蛋白；
-包含化学修饰的一个或多个第一结合蛋白；
-附着于一个或多个第三结合蛋白的一个或多个第二结合蛋白；
-一个或多个功能性分子；
其中每个病毒衣壳蛋白附着于第一结合蛋白，其中每个第一结合蛋白附着于第二结合蛋白，并且其中每个第三结合蛋白附着于第一功能性分子，并且每个化学修饰附着于第二功能性分子。
合适地，其中附着于第三结合蛋白的第一功能性分子是抗原结合分子。合适地，其中附着于第一结合蛋白上的化学药物的第二功能性分子是荧光分子。
来自受试者的合适样品可以是血液样品、唾液样品、血清样品、痰液样品、精子样品、粘液样品、CSF样品。合适地，样品是流体样品。
合适地，诊断方法可以进一步包括将样品与VLP一起孵育的步骤。合适地，持续足以允许VLP结合样品中的任何抗原并沉淀的一段时间。合适地，持续至少1分钟，合适地至多30分钟，合适地至多25分钟，合适地至多20分钟，合适地至多15分钟。
可通过所述方法检测的合适疾病可以是上文列出的任何疾病。
合适地，诊断方法可以进一步包括(如果诊断出疾病)对受试者的治疗的步骤。合适地，对受试者的治疗可以包括向受试者施用有效量的任何已知的相关疾病的治疗。
现在将参考以下实施例描述本发明的某些实施方案：
实施例
材料和方法
所有质粒均由邓迪大学测序和克隆服务(https://www.dnaseq.co.uk)提供，该机构也进行克隆服务和序列验证。使用的质粒：Pet-28a(+)、pETDuet 1、pcDNA5D。
修饰的VLP外壳的克隆
HBc融合至Im7或Barstar的克隆策略：
Im7(GenBank登录号GenBank:KJ470776.1)和Barstar(GenBank ARW38026.1)的ORF分别在两侧用由GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:33)组成的接头延伸，在N-末端用编码乙型肝炎核心抗原的M1-Leu76(GenBank登录号Genbank:KJ470776.1)的序列延伸，并在C-末端用编码乙型肝炎核心抗原的Pro79-V145的序列延伸，随后是终止密码子。所得序列(表3：核苷酸序列)作为具有Xba1和Not1限制性位点的商业基因合成购买，并克隆到pET-Duet 1(Novagen)中。
ColE7融合至所选表位蛋白的克隆策略：
始于E444的大肠杆菌素E7(GenBank登录号Genbank:KJ470776.1)的催化结构域的ORF被修饰以包含突变：R538A、E542A(Ku,NAR,2002)、His569A(Ko,Structure,1999)，确保完全的催化失活并保留Im7结合能力。添加N-末端甲硫氨酸以及TEV蛋白酶切割位点，随后在C-末端添加甘氨酸/丝氨酸接头。该序列的侧翼分别是NdeI和BamH1限制性位点。该序列作为商业基因合成购买，并克隆到pET-Duet 1(Novagen)中，该pET-Duet 1含有编码与Im7融合的乙型肝炎衣壳的ORF(见上文)。
Barnase融合至所选表位蛋白的克隆策略：
始于残基A40(省略信号肽)的Barnase(GenBank登录号GenBank:AAA86441.1，核苷酸403-732)的催化结构域的ORF用N-末端甲硫氨酸延伸，突变为E73W以消除催化活性，用TEV蛋白酶切割位点在C-末端延伸，随后是C-末端的甘氨酸/丝氨酸接头。该序列的侧翼分别是NdeI和BamH1限制性位点。该序列作为商业基因合成购买，并克隆到pET-Duet 1(Novagen)中，该pET-Duet1含有编码与Barstar融合的乙型肝炎衣壳的ORF(见上文)。
待展示的所选表位或另一结合蛋白的克隆策略：
待展示的表位蛋白(分别为鼠IL33、人IL13或其它结合蛋白的C-末端片段；蛋白-G)的ORF使用公开可获得的软件在大肠杆菌中针对密码子使用进行优化，并分别用BamH1和XhoI限制性位点进行延伸，以允许在ColE7或Barnase的下游或ColE7的上游(对于蛋白G)进行框内克隆，如相应序列中详述的(表2：氨基酸序列)。核苷酸序列作为商业基因合成购买，并克隆到pET-Duet 1载体(Novage)中，该pET-Duet 1载体先前分别经克隆以含有ColE7或Barnase ORF，如上所述。NB:Sars-Cov2表位蛋白在哺乳动物细胞中表达，因此不需要优化这些序列。
修饰的VLP外壳和表位融合蛋白的表达
转染：
用100ng相应的质粒转化感受态BL21 DE3和P812细胞(遗传工程细胞系，衍生自BL21-DE3，含有二硫键异构酶基因，促进具有二硫键的蛋白质的表达，这种菌株是本领域已知的)，并在42℃下热休克30秒之前在冰上孵育30分钟。将100ul LB培养基加入细菌小瓶中，在37℃下进一步孵育1小时，然后涂布在琼脂平板上，培养过夜。
诱导：
在2×YT培养基(Sigma)中制备3×4ml起始培养物，并在37℃下以200rpm振荡培养过夜。将1ml每种起始培养物在2×YT中扩增至20ml的最终体积，并在37℃下培养，直到OD600达到0.6-0.8。收集未诱导的样品，以14,000rpm离心1分钟，除去上清液，向沉淀物中加入100ul 2×Laemmli缓冲液(Sigma)。用0.5mM IPTG和5mM MgCl2诱导培养物，在18℃下以200rpm震荡过夜进行VLP表达。将诱导的100ul裂解物以14,000rpm离心1分钟，弃去上清液，并将沉淀物重悬于100ml 2×Laemmli缓冲液中。
在为单独诱导VLP骨架和表位蛋白而设计的质粒中，后者通过加入40ng/ml脱水四环素在15-20℃下诱导4-16小时。
细胞破裂(分析)：
通过在4℃下以4,000rpm离心10分钟收获培养物，弃去上清液，称重沉淀物，并在裂解缓冲液(每1g培养物3ml裂解缓冲液)中以30秒的周期超声处理2分钟，暂停间隔为10秒。加入10％的Triton x 100至0.5％的最终浓度，随后进行超声处理。将50ul裂解的物质以14,000rpm离心1分钟，将上清液加入150ul 2×Laemmli缓冲液中，并将沉淀物重悬于200ml 2×Laemmli缓冲液中。将剩余的裂解的培养物以4,000rpm离心10分钟，将上清液转移到50ml聚丙烯管中并冷冻。使用在100V下运行2.5小时的12％ Bis-Tris Nu-Page SDS-PAGE(Thermofisher)凝胶分析VLP表达，随后用即时亮蓝考马斯染色1小时。
细胞破裂(准备)：
如上沉淀细胞，随后加入Hepes 50mM(pH 7.0)、200mM NaCl、蛋白酶抑制剂混合物(Pierce)，随后在没有任何去污剂的情况下高压匀浆。通过在4℃下以18000g离心30分钟来澄清所得的裂解物。
VLP纯化
离子交换层析-二乙胺(DEAE，BIA Separations/Sartorius)：
在室温下，用10倍柱体积的去离子水和10倍柱体积的20mM/50mM 50mM Tris-HClpH 7平衡DEAE柱(IBS)。用5ml注射器装载过滤的粗提取物，并收集流出液。用逐步梯度的NaCl(0.1M、0.3M、0.5M、0.7M、1M和2M)洗涤和洗脱柱结合材料。每种条件下收集3×1ml级分，并储存在冰上。用10倍柱体积的2M NaCl、10倍柱体积的含有2M NaCl和1M NaOH的缓冲液、10倍柱体积的去离子水洗涤DEAE柱，随后在4℃下储存在20％异丙醇中直到后续使用。使用Nanodrop上280nm的蛋白质吸光度和BCA定量法(Thermofisher)对获得的样品进行定量。使用在100V下运行2.5小时的12％ Bis-Tris NuPage SDS-PAGE凝胶分析纯化，随后用即时亮蓝考马斯(Abcam)染色1小时。
离子交换层析-季胺(QA，BIA Separations/Sartorius)：
在室温下，用10倍柱体积的去离子水和10倍柱体积的20mM/50mM Tris-HCl pH 7平衡QA柱(IBS)。用5ml注射器装载过滤的粗提取物，并收集流出液。用逐步梯度的NaCl(0.1M、0.3M、0.5M、0.7M、1M和2M)洗涤和洗脱柱结合材料。每种条件下收集3×1ml级分，并储存在冰上。用10倍柱体积的2M NaCl、10倍柱体积的含有2M NaCl和1M NaOH的缓冲液、10倍柱体积的去离子水清洁DEAE柱，随后在4℃下储存在20％异丙醇中直到后续使用。使用Nanodrop上280nm的蛋白质吸光度和BCA定量法(Thermofisher)对获得的样品进行定量。使用在100V下运行2.5小时的12％ Bis-Tris NuPage SDS-PAGE凝胶分析纯化，随后用即时亮蓝考马斯(Abcam)染色1小时。
离子交换层析-混合模式(PrimaS，BIA Separations/Sartorius)：
在室温下，用10倍柱体积的去离子水和10倍柱体积的20mM/50mM Tris-HCl pH 7平衡PrimaS柱(IBS)。用5ml注射器装载过滤的粗提取物，并收集流出液。用逐步梯度的NaCl(0.1M、0.3M、0.5M、0.7M、1M和2M)洗涤和洗脱柱结合材料。每种条件下收集3×1ml级分，并储存在冰上。用10倍柱体积的2M NaCl、10倍柱体积的含有2M NaCl和1M NaOH的缓冲液、10倍柱体积的去离子水清洁DEAE柱，随后在4℃下储存在20％异丙醇中直到后续使用。使用Nanodrop上280nm的蛋白质吸光度和BCA定量法(Thermofisher)对获得的样品进行定量。使用在100V下运行2.5小时的12％ Bis-Tris NuPage SDS-PAGE凝胶分析纯化，随后用即时亮蓝考马斯(Abcam)染色1小时。
混合模式尺寸排阻色谱：
用CaptoCore 700(GE Healthcare)填充自包装的0.5ml直径、10cam长的玻璃柱，并用20％ ETOH包装。在室温下，用10倍柱体积的去离子水和10倍柱体积的20mM Tris-HClpH7平衡该柱。装载来自离子交换层析的半纯化样品，并收集1ml级分。用10倍柱体积的1MNaOH的30％异丙醇溶液清洁该柱，然后用10倍柱体积的2M NaCl清洁该柱，并用20％ ETOH储液替换。使用在100V下运行2.5小时的12％ Bis-Tris NuPage SDS-PAGE凝胶分析尺寸排阻，随后用即时亮蓝考马斯(Abcam)染色1小时。
实施例1:合适VLP外壳的鉴定和优化
寻求候选VLP外壳表现出成功框内融合的先例，它是一种允许二聚表位蛋白融合的二聚VLP蛋白结构，以及适合临床应用的先例。乙型肝炎病毒衣壳(HBc)被确定为VLP的合适候选物。
然后优化HBc蛋白的氨基酸序列，以解释结合蛋白的插入，如下所示：带负电荷的氨基酸E77和D78被删除以减少主要免疫显性区域中的净负电荷，突变F97L被添加以加速蛋白质折叠，结合天然病毒中RNA的C-末端序列在残基V145之后被去除，并且正净电荷序列被添加到C-末端以通过在V145下游插入六个组氨酸残基来稳定VLP，这六个组氨酸残基不暴露于蛋白质表面。所得克隆：DU67866和DU67867。
实施例2：蛋白质结合对的优化
选择ColE7/Im7和Barnase/Barstar作为合适的蛋白结合对，其将功能性分子附着于HBc VLP外壳上。
两对都进一步优化如下，并如上所述：
ColE7：
·基于对公共库中x射线结构的回顾，选择结合Im7所必需的催化结构域的片段。始于E444的大肠杆菌素E7(GenBank登录号：KJ470776.1)的催化结构域的ORF被修饰以包含突变：R538A、E542A(Ku,NAR,2002)、His569A(Ko,Structure,1999)，确保完全的催化失活并保留Im7结合能力。
·添加N-末端甲硫氨酸以及TEV蛋白酶切割位点，随后在C-末端添加甘氨酸/丝氨酸接头。该序列的侧翼分别是NdeI和BamH1限制性位点，并克隆到pET-Duet 1(Novagen)中，该pET-Duet 1含有与Im7融合的HepB-衣壳变体的ORF(见下文)。
·Im7：Im7(GenBank登录号：KJ470776.1)的ORF分别在两侧用接头序列GGGSGGGS延伸，在N-末端用编码乙型肝炎核心抗原的M1-Leu76(GenBank登录号：KJ470776.1)的序列延伸，并在C-末端用编码Pro79-V145的序列延伸，随后是终止密码子。所得序列具有Xba1和Not1限制性位点，并克隆到pET-Duet 1中。
·在上面指定的Im7的一级序列中插入一个突变，以引发蛋白折叠速度增加20倍：F41L(Capaldi,Nat Struct Biol 2002)。
·在上文指定的Im7序列中插入另一个已知增强衣壳形成的突变：F97L(Alexander,PNAS2013)。
Barnase：
·选择一个突变，该突变将保留Barstar结合，但废除催化活性：根据(Want，Biophys J 2004)中的数据，测试了E73->Q，但发现保留残余毒性。因此，选择E73->W并插入序列中。
·始于残基A40(省略信号肽)的Barnase(GenBank登录号：AAA86441.1，核苷酸403-732)的催化结构域的ORF用N-末端甲硫氨酸延伸，突变为E73W，用TEV蛋白酶切割位点在C-末端延伸，随后是C-末端的甘氨酸/丝氨酸接头(GGGGSGGGGS SEQ ID NO:33)。该序列的侧翼分别是NdeI和BamH1限制性位点，并克隆到pET-Duet 1(Novagen)中，该pET-Duet 1含有Barstar的ORF(见下文)。
Barstar：
·对于设计：除去半胱氨酸(C40->A,C82->A)
·对于设计：插入突变以消除二聚化突变，根据文献特征选择消除半胱氨酸和排除蛋白质二聚化(Korchuganov,2004)：I87->E
·对于克隆：Barstar(GenBank ARW38026.1)的ORF分别在两侧用接头序列(GGGGSGGGGS SEQ ID NO:33)延伸，在N-末端用编码乙肝核心抗原的M1-Leu76(Genbank:KJ470776.1)的序列延伸，并在C-末端用编码Pro79–V145的序列延伸，随后是终止密码子。所得序列用Xba1和Not1限制性位点延伸，并克隆到pET-Duet 1(Novagen)中。
实施例3：相关测试表位的选择
选择合适的测试表位，当通过蛋白结合对附着于VLP外壳上时，用作功能性分子。
选择IL-33、IL-13和SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合结构域和核衣壳作为表位。选择IL-33作为相关的疫苗靶标和COVID以及哮喘中的超免疫反应的靶标。选择IL-13作为过敏反应的相关疫苗靶标。选择IL-17作为银屑病的相关疫苗。选择SARS-CoV-2-刺突受体结合结构域以证明该系统对哺乳动物细胞中表位的表达起作用，并作为Covid-19的相关靶标。
对于鼠IL-33(RefSeq NP_001158196)，选择细胞外信号传导半胱天冬酶切割的C-末端片段(从S109开始)，并在N-末端插入GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:33)接头以将该片段连接到上游ColE7片段。插入两个突变以消除与同源ST2受体的结合，从而消除任何非疫苗相关的受体介导的毒性：分别是人IL33序列中突变D149K和E165K的鼠等价物。使用公开可获得的软件对该序列进行大肠杆菌密码子优化，并分别用BamH1和XhoI限制性位点延伸所得序列，以允许在ColE7或Barnase的下游框内克隆到pET Duet 1质粒中。所得克隆：DU 70051。
对于人IL-13(RefSeq NM_002188)，插入SGGGSSGSG接头(SEQ ID NO:35)以将该序列连接到上游ColE7片段，然后进行大肠杆菌密码子优化。所得克隆：DU 70076、DU70080。
对于人IL-17(RefSeq NM_NM_002190.3)，插入SGGGSSGSG接头(SEQ ID NO:35)以将该序列连接到上游ColE7片段，然后进行大肠杆菌密码子优化。所得克隆：DU 70721。
对于SARS-CoV-2-刺突蛋白，选择并分离结构导向的受体结合结构域(RBD)片段。选择合适的哺乳动物表达载体(pcDNA5D)。将接头GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:33)插入该序列和位于N-末端的ColE7之间，产生所得克隆：DU 67808。创建了第二个克隆，其包括用于更广泛的靶疫苗接种的SARS2-核衣壳蛋白C-末端片段的额外C-末端融合，所得克隆：DU 67817。然后创建第三个克隆，其包括添加的C-末端融合的eGFP以允许监测表达，所得克隆：DU67793。
实施例4：表达质粒的设计
对于原核表达，使用质粒骨架pETDuet。添加到质粒的其他特征包括：
·VLP-构建体，其包括由IPTG诱导的T7启动子驱动的具有框内融合的第一结合蛋白(例如Im7)的HBc-衣壳
·第二结合蛋白-表位蛋白融合体(例如ColE7-IL13)，其由IPTG诱导的T7启动子驱动，或由具有较低活性的经调节的T7启动子驱动，以允许VLP和表位蛋白的同等表达
·或者，通过将独立的tetR/tetA启动子系统整合到表达质粒中，脱水四环素对表位蛋白(例如ColE7-IL33)的独立诱导能力。
·LacI，驱动VLP-构建体ColE7-表位蛋白融合体的可诱导表达
·插入的任选的TEV蛋白酶位点，用于仅表位的分离表达，以便于纯化表位蛋白作为ELISA目的的抗原
·用于生物加工应用的质粒抗性基因，如Amp或非β-内酰胺。
通用质粒设计适用于克隆：67866、67867、70076、70051、70080、70059、70126、65750、70680、70612。
对于真核表达，使用质粒骨架pcDNA5D。添加到质粒的其他特征包括：
·用于在哺乳动物细胞中强表达的CMV启动子
·用于将产物分泌到细胞培养基中的强信号肽
·与表位蛋白(如SARS-CoV-2-刺突RBD)N-末端融合的结合蛋白(如ColE7)，作为表位蛋白的分子伴侣
·任选的tet阻遏物系统
·用于纯化的任选的C-末端六组氨酸标签
·用于生物加工应用的质粒抗性基因，如AmpR或HygR或非β-内酰胺。
通用质粒设计适用于克隆：DU67808、DU67793、DU67808。
实施例5：候选蛋白质的表达
方案(上述更多细节)：接种含有克隆DU70080的大肠杆菌BL21D3的起始培养物，然后接种25ml培养物，生长至OD 0.7，然后在18℃下用1mM IPTG诱导22小时。沉淀细胞，重新悬浮于20mM Tris/HCl(pH 7.0)、100mM NaCl、蛋白酶抑制剂混合物中，用高压匀浆器破碎，取等分试样作为“裂解物”，在4℃下以18,000G旋转30分钟，取上清液作为“胞质溶胶”，将沉淀物重新悬浮在含有triton X100和尿素的缓冲液中，作为“不可溶物”。
候选蛋白质的预期尺寸：HBc-Im7:27.6kDa.Col7-IL13:28.8kDa。
SDS-PAGE显示三个克隆中两种预期尺寸的条带。HBc-Im7融合的VLP骨架在大肠杆菌中高度可溶，尽管使用相同的T7启动子，ColE7-IL13融合体具有更高的总表达。在可溶的胞质溶胶中，VLP-骨架和细胞因子的表达分布更加均匀。
实施例6：候选蛋白质的纯化
方案(上述更多细节)：如上制备含VLP的胞质溶胶级分；通过15G离心和0.2微米过滤进行澄清，在CIM-monolith柱(Sartorius)上以1ml/min的流速在具有显示NaCl逐步梯度的Tris-HCl(pH 7.0)中运行。通过SDS-PAGE在12％凝胶上分析级分。
DEAE阴离子交换层析后的SDS-PAGE显示，HBc-Im7 VLP在仅以1M NaCl洗脱的弱DEAE阴离子交换剂上显示类似亲和层析的洗脱曲线。
方案(上述更多细节)：如所示以1ml/min的流速将获得的DEAE纯化的HBc-Im7 VLP级分在pH 7.0下进行混合模式层析(PrimaS1ml柱，Sartorius)，施加逐步NaCl梯度。取级分并通过SDS-PAGE进行分析。
混合模式层析后的SDS-PAGE显示HBc-Im7融合的VLP不可逆地结合到疏水衍生的聚甲基丙烯酸酯上。
方案(上述更多细节)：替代地，将获得的DEAE纯化的HBc-Im7 VLP级分进行多模式尺寸排阻色谱(CaptoCore 700，装载到1ml柱中，直径0.5cm，流速1.5ml/min，在Tris/HCl20mM pH 7.0，300mM NaCl中)。树脂不包括截留值约为700kD的大颗粒。较小的颗粒被包含在交联琼脂糖珠内部的辛胺捕获。通过SDS-PAGE分析级分。
多模式尺寸排阻色谱后的SDS-PAGE显示HBc-Im7纯化至多模式尺寸排阻色谱的表观均一性。
实施例7：VLP的形成
方案：如上所述将HBc-Im7 VLP纯化至表观均一性，并在10mM Tris/HCl，pH 7.0，200mM NaCl中制成1.5mg/ml蛋白质含量的浓度。VLP样品沉积在碳涂层网状格栅上。此后，将样品装载到格栅上，并在室温下孵育1分钟。多余的样品从格栅中排出。样品在室温下用2％乙酸铀酰负染色1分钟。将过量的染色剂排出，并在室温下干燥格栅。使用JEOL JEM-2200FS电子显微镜进行TEM检查。为了评估VLP直径，从n＝150个VLP中获得每种制剂的测量值。对每个VLP进行两次直径和边缘测量。对于统计检验，在确定尺寸测量值的等方差和正态分布后，进行双侧独立t检验。
HBc-Im7融合的VLP形成均匀的VLP，与亲本HBc-衣壳衍生的VLP相比，显示直径增加(38.3±2对29±2nm，p<0.001)。
HBc-Im7融合的VLP显示外部电子致密边缘的厚度显著增加。可观察到的边缘厚度的增加(10.2±1.5对5.7±1.2nm，p<0.0001)与从HBc主要免疫显性区域突出的Im7结构域蛋白的额外层一致。
实施例8：VLP的免疫原性
方案：用5ug HBc-Im7 VLP(每组n＝5)鼻内接种老龄雌性C56B/6j小鼠(研究开始时15个月)，并在第21天给予单次加强接种，如图所示采集血清。用HBc-Im7作为包被抗原，通过ELISA分析数据。
数据显示，在鼻内接种后，HBc-Im7 VLP甚至在老龄小鼠中引发强烈的免疫反应。
实施例9：将表位连接至VLP
方案：将大肠杆菌中表达的VLP外壳(泳道1)和ColE7融合的IL33(泳道2)的胞质溶胶级分偶联(泳道3)，然后如上所述通过CaptoCore700树脂上的混合模式尺寸排阻色谱纯化，并收集流出液级分(泳道5-7)。数据显示SDS-PAGE分析。实现了HBc-Im7 VLP外壳与ColE7-IL33表位融合体的成功偶联。
方案：Col-E7-RBD-GFP在悬浮培养的293T细胞中表达为分泌蛋白。收集细胞上清液(泳道1)并与DEAE纯化的HBc-Im7 VLP外壳(泳道2)一起孵育。随后，如上所述，通过与CaptoCore700树脂分批孵育来纯化培养基，以去除非VLP蛋白(尺寸排阻约为700kD)，使用超滤旋转柱(Pierce，截留值100kD，泳道3)浓缩耗尽的细胞上清液。数据显示SDS-PAGE分析。实现了HBc-Im7 VLP外壳与ColE7-RBD-GFP表位融合体的成功偶联。
实施例10：VLP的非共价化学修饰
方案：罗丹明–叠氮化物通过铜催化的叠氮化物–炔烃环加成在室温下用辛炔衍生化1小时，使用TBTA和TCEP作为还原剂，在由90％ DMSO和10％ PBS组成的反应混合物中罗丹明的最终浓度为250uM。将10ul该反应混合物与90ul VLP-胞质溶胶级分通过有力的涡旋共孵育1分钟，所述VLP-胞质溶胶级分包含溶解在50mM Hepes，pH 7.0，200mM NaCl，20％甘油中的HBc-Im7-VLP(橙色)或HBc-衣壳VLP(蓝色)。随后，将100ul VLP/罗丹明混合物与100ul在50mM Hepes、20％甘油中预平衡的Captocore700填充树脂批次孵育，室温下旋转1小时，然后离心(5000g，5min)。用488nm的激发和520nm的发射测量50ul上清液(“C8-FITC后”)和50ul原始VLP级分(“C8-FITC前”)的荧光。
数据显示，通过与辛胺衍生化的罗丹明一起孵育，HBc-Im7融合的VLP，而不是亲本HBc-衣壳VLP，可以被荧光标记。
实施例11：修饰的VLP的生物物理沉降特性
方案：使用Beckman CoulterTM超清离心管，将从表达HBc或HBcIm7的大肠杆菌中新获得的胞质溶胶级分手动覆盖在60-20％(w/v)连续蔗糖梯度上。在Sorvall Surespin 630转子中，在4℃下以30,000rpm进行分离16小时。通过用21G针头在50-60％界面之间穿刺来收获蔗糖级分。如数据所示(图13)，对单个级分进行还原SDS-PAGE。
VLP是大的结构，通常可以通过在蔗糖中的密度离心从较小的蛋白质中分离出来。大颗粒(如VLP)将平衡至更高的密度，通常为40-50％的蔗糖，与单体蛋白质相反。数据证实，这正是在携带整合的Im7蛋白的HBc衍生的VLP中发现的。
图13显示了SDS-PAGE分析，显示了携带整合在HBc主要免疫显性区域中的Im7的VLP的生物物理沉降特性。VLP颗粒(黑色箭头)预计在40-50％的密度级分。修饰的VLP的行为类似于野生型VLP。
实施例12：大肠杆菌中VLP完整性的确认
方案：使用0.5x TBE缓冲液浇铸1％琼脂糖凝胶，并在60V下在室温下每条泳道50μl样品运行1小时。在4℃下即时亮蓝考马斯染色过夜。SYBRTM safe(thermo fisher)以1:10,000的稀释度使用，并在ChemiDockTM凝胶成像系统(BioRad)上成像。
蔗糖密度梯度级分进行天然琼脂糖凝胶电泳(NAGE)(图14)。这种技术评估完整VLP的迁移，与验证单体VLP蛋白定位的SDS-PAGE相反。平行运行NAGE凝胶，通过考马斯亮蓝染色分析蛋白质含量(左)或通过SYBR safe染色分析核酸含量(右)。包括HBc VLP的纯化样品作为对照(最左边的泳道)。
HBc VLP可以以两种构型存在，要么是由240个蛋白质亚单位组成的稍大的所谓T4突变体，要么是由180个亚单位组成的较小的T3突变体。这些可以在NAGE凝胶中被区分为不同的条带。在野生型VLP(上图)中，T3和T4条带清晰可见(用箭头标记)，其中较小的T3颗粒，如预期的，在密度较低的40％级分中更丰富。
相对于HBc野生型对照，含Im7的修饰的VLP(下图)显示出在凝胶内迁移的转变，这与它们更大的尺寸一致。相对T4/T3密度与野生型VLP中所见的相同：在50％蔗糖级分中近似相等的分布(灰色箭头)和在40％缓冲区中高得多的T3条带丰度(黑色箭头)。
在大肠杆菌内的VLP组装过程中，大肠杆菌来源的RNA被整合到VLP中。裂解后，加入Benzonase来消化DNA。因此，在蔗糖梯度离心后，在高密度蔗糖级分中与VLP共定位的核酸代表位于VLP内的RNA。重复凝胶的SYBR染色显示出与40％蔗糖级分中的T3 VLP条带共定位的密集条带(用白色箭头标记)。这表明位于VLP内部的RNA受到保护，不会被Benzonase消化，这证实了VLP的完整性。
实施例13：融合蛋白的整合消除了对乙型肝炎核心抗原的任何交叉反应。
方案：通过密度蔗糖梯度纯化的VLP以PBS进行透析。将图中所示的体积点在硝酸纤维素膜上。用BSA/PBST封闭膜，然后在PBST中用抗-HBcAg(Invitrogen，MA1-7607，浓度0.1μg/ml)孵育。将膜洗涤并暴露于第二抗体(驴抗山羊HRP，稀释1:10,000；Stratech，705-035-147-JIR)，然后洗涤并用Amersham ECLTM蛋白质印迹检测试剂显影。
HBc衍生的VLP计划在临床上用作疫苗。因此，重要的是它们产生的抗体不与乙型肝炎抗体交叉反应，以使得患者不被错误地识别为乙型肝炎阳性。乙型肝炎的既往感染通过针对HBcAg(丙型肝炎抗原)的血清学进行常规筛查。HBcAg识别抗体与所谓的“主要免疫显性区域”(MIR)反应，该区域在整合Im7或Barstar时被破坏。数据显示，与野生型丙型肝炎衣壳和300ng纯化HBcAg(标记为“HBc149”)发生强烈反应的商业抗体不能与所有测试量(高达5μg)的纯化HBc-Im7 VLP发生反应。这证明了融合蛋白的整合消除了对乙型肝炎核心抗原的任何交叉反应(图15)。
实施例14：HBc-Im7 VLP与野生型HBc VLP的尺寸比较
方案：TEM：将样品溶解在25mM Tris/HCl，pH 7.0或50mM Hepes，pH 7.5中，并吸附到辉光放电的碳-formvar涂覆的铜格栅上，并用1％乙酸铀酰水溶液负染色。格栅在80kV下进行检查。使用ImageJ进行尺寸测量(每种VLP类型n＝200个颗粒)。DLS：包含在蔗糖中的样品以Tris/HCl pH 7.0，150mM NaCl透析，并用Zetasizer Ultra(Malvern Panalytical)分析1ml体积。
对经蔗糖梯度离心纯化的野生型和HBc-Im7 VLP进行电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)分析，以确定形状和尺寸。
结果数据(图16)显示，野生型HBc(上图)经TEM和DLS测量的尺寸为约30nm，这与已发表的占主导地位的T4群体的VLP的结果非常一致。相比之下，具有整合的Im7的VLP(下图)通过TEM和DLS显示出大约38nm的尺寸增加。鉴于整合的Im7蛋白在VLP表面的顶部，尺寸的增加是意料之中的。这些数据显示了VLP群体的一致性。
TEM也被用来确定VLP边缘的厚度。如数据所示(图17)，携带Im7的VLP(右)的边缘明显比野生型VLP(左)的边缘厚。这通过基于ImageJ的测量来量化，并产生大约两倍厚度的修改的边缘(12.4nm对6.5nm)。这一结果与Im7蛋白在HBc表面层顶部的均匀分布相一致。
实施例15：L33修饰的VLP在蔗糖密度超速离心中的表现如预期。
方案：通过组合的HBcIm7和ColE7_IL-33胞质溶胶的SDS-PAGE进行蔗糖密度梯度分析。通过在4℃下将含有HBc-Im7和ColE7-IL33的胞质溶胶级分以1:1的比例混合1小时，将IL33偶联至HBc-Im7 VLP。偶联的胞质溶剂级分覆盖在连续的蔗糖密度梯度上。泳道：1)含有ColE7_IL-33和HBc-Im7的胞质溶胶，2)60％蔗糖，3)50％蔗糖，4)40％蔗糖，5)30％蔗糖，6)20％蔗糖，7)10％蔗糖。黑色箭头指向ColE7_IL-33(34.2kDa)，红色箭头指向HBc-Im7(27.4kDa)。
蔗糖密度梯度离心对颗粒的尺寸和密度很敏感。HBc和HBc-Im7 VLP平衡至40％和50％蔗糖区间。在用额外的表位蛋白修饰HBc-Im7 VLP后，它们的尺寸增加，预计这将使它们在蔗糖梯度中的平衡向更高的密度转换。数据显示(图18)，由经ColE7-IL33修饰的HBc-Im7组成的VLP等摩尔平衡至50-60％区间，与其尺寸增加一致。(平衡后位于试管底部的60％蔗糖级分携带50-60％的中间相。)
实施例16：IL33修饰的VLP显示了T3和T4亚群的预期比例，并保留了在野生型VLP中也看到的RNA含量
方案：使用0.5x TBE缓冲液浇铸1％琼脂糖凝胶，并在60V下在室温下每条泳道50μl样品运行1小时。在4℃下即时亮蓝考马斯染色过夜。SYBRTM safe(ThermoFisher)以1:10,000的稀释度使用，并在ChemiDockTM凝胶成像系统(BioRad)上成像。
与通过蔗糖梯度密度离心的TEM和SDS-PAGE分析检测到的IL33修饰的VLP的较大尺寸(实施例14和15)一致，通过天然琼脂糖凝胶电泳(NAGE)对蔗糖密度级分的分析也显示IL33修饰的VLP集中于更高的密度，主要在50％蔗糖级分中，仅在40％级分中有少量组分(图19左侧所示的考马斯染色的NAGE凝胶中的箭头)。
此外，NAGE表明，T4和T3 VLP群体的相对丰度保持了它们的相对比率(T3>>T4)，这也在HBc-Im7和HBc-野生型VLP中观察到。
NAGE凝胶的SYBR SAFE染色(图19的右侧)显示了分别与T3和T4条带一起迁移的独特的RNA条带，证实了VLP的完整性，使大肠杆菌来源的VLP内定位的RNA免于被Benzonase消化。
实施例17：IL33修饰的VLP显示出预期的尺寸和边缘结构。
方案：TEM方案和DLS方案如实施例14中所述。
野生型HBc、HBc-Im7以及HBc-Im7-IL33 VLP的透射电子显微镜(TEM)显示了携带Im7插入片段的VLP中增厚的边缘，如实施例5中详述的。在用大肠杆菌素E7-IL33在外侧修饰HBc-Im7 VLP后，第三个点状外部蛋白质层变得可见，尤其是在较高放大倍数下(在图20中的图A右侧的特写图像中用黑色箭头标记)，正如从添加的蛋白质层所预期的那样。
使用TEM图像(图20中的图B的左侧)和动态光散射(图20中的图B的右侧)的尺寸测量证实了IL33修饰的VLP的尺寸增加。通过TEM(48nm)和DLS(71nm)观察到的平均粒度之间的明显差异表明在TEM的样品制备过程中，柔性连接的外部IL33层在附着到碳格栅上时的蛋白质收缩假象。
实施例18：免疫斑点印迹证实附着于VLP表面的IL33的天然蛋白质折叠。
方案：通过密度蔗糖梯度纯化的VLP以PBS进行透析。将图中所示的体积点在硝酸纤维素膜上。用BSA/PBST封闭膜，然后在PBST中用抗-mIL33(Invitrogen,PA5-4007,浓度0.4μg/ml)孵育。将膜洗涤并暴露于第二抗体(驴抗山羊HRP，稀释1:10,000；Stratech，705-035-147-JIR)，然后洗涤并用Amersham ECLTM蛋白质印迹检测试剂显影。
通过识别构象表位的抗体的特异性识别，证实了结合到VLP表面的IL33的天然折叠。将数量减少的IL33修饰或未修饰的HBc-Im7 VLP点在硝酸纤维素膜上。数据(图21)显示，即使在最低量的IL33的情况下，也能通过抗体清楚地检测到，而在缺乏IL33的VLP中没有检测到信号，证实了信号的特异性。
实施例19：IL33修饰的HBcIm7 VLP是免疫原性的。
方案：向8月龄的雌性C57Bl/6j小鼠注射3μg IL33缀合的CuMV VLP(由A.Zeltins，BMC Latvia，Riga提供)或IL33修饰的HBcIm7 VLP(每组n＝5)。疫苗经无菌过滤，并在使用前通过LAL试验确认内毒素<50EU/ml。两种疫苗都是在含有20％明矾作为佐剂的PBS中配制的。注射在短期肩胛内麻醉下于皮下进行。在数据显示的日期采集外周尾静脉血液样品(图22)。
为了根据本文提出的方法测试呈递细胞因子的VLP的免疫原性潜力，将修饰的IL-33用于接种C57Bl/6j小鼠。这是通过与根据以前使用的方法制备的携带IL33的VLP进行直接的头对头比较来完成的，该方法基于细胞因子在黄瓜花叶病毒衍生的VLP表面上的化学连接(CuMV,Zeltins,npj Vaccines 2,30(2017).https://doi.org/10.1038/s41541-017-0030-8)。
由于预计两种疫苗类型原则上都具有免疫原性，因此在限制条件下进行实验，每剂使用最少量的疫苗(3μg)并使用老龄小鼠(第一剂时8个月)。
由于该疫苗的预期临床用途是替代单克隆抗体，因此在接种小鼠中观察到的IL33特异性抗体的积累并不像传统做法那样表示为稀释的“滴度”。相反，样品血清在ELISA中进行分析，该ELISA由市售的抗IL33的高亲和力单克隆抗体校准。因此，由于含有抗IL33的多克隆抗体的接种血清的反应，任何给定的测量光密度可以被指定为“相当于×μg/ml的单克隆抗IL33”的值。与报告“滴度”相比，这种类型的分析的最大优点是数据直接显示了原型疫苗的潜在功效。例如，对于临床使用的许多单克隆抗体，患者血清中的粗略浓度约为2–10μg/ml。这意味着，如果疫苗触发多克隆抗体，达到与该浓度相当的反应，则它具有临床活性的潜力。
如数据所示(图22)，在所研究的限制条件下，使用本发明制备的IL33-疫苗显示出相似的最大抗体反应(HBcIm7疫苗中的中值浓度相当于1.90μg/ml，而CuMV疫苗中的中值浓度相当于1.97μg/ml)。然而，本发明人已经表明，用HBcIm7疫苗接种的小鼠反应更早(见基线后3周和7周，如图22C所示)。此外，在基线后的至少23周内，中值滴度也保持在可能临床有效的水平(1.12μg/ml)(如图22A和22C所示)。
重要的是，如图22所示，与CuMV接种的小鼠相比，HBcIm7接种的小鼠在个体小鼠之间表现出更持续和一致的反应。在23周时，HBcIm7接种小鼠的中值滴度仍在治疗范围内，但CuMV接种小鼠的中值滴度不在治疗范围内。
由于CuMV VLP平台已被很好地建立，并经几种疫苗模型证明有效，这些结果表明，合适地，新的HBcIm7平台用作疫苗是具有免疫原性的。
实施例20：Im7具有新颖的化学性质，允许VLP的一步亲和纯化。
方案：表达HBc或HBc-Im7的大肠杆菌的胞质溶胶级分在1ml Qa或DEAE CimMultusmonolith柱上用逐步NaCl梯度进行阴离子交换层析。泳道：1-胞质溶胶，2-流出液，3、4-0.1M NaCl，5、6-0.3M NaCl，7、8-0.5M NaCl，9、10-0.7M NaCl，11、12-1M NaCl，13、14-2MNaCl。图23A、B和D显示了洗脱级分的SDS PAGE分析。黑色箭头表示VLP单体蛋白质的预期尺寸。图23C显示了来自HBc-Im7的DEAE柱纯化的1M NaCl级分的代表性TEM图像。
在VLP纯化的筛选试验中，注意到Im7修饰的VLP与弱阴离子交换剂DEAE结合非常紧密(图23A，底部凝胶)。这与野生型HBc VLP形成鲜明对比，野生型HBc VLP仅微弱地结合到相同的阴离子交换剂上(图23A，顶部凝胶)。观察到的Im7-HBc VLP的亲和力对作为化学基团的DEAE是特异的，因为发现HBc-Im7 VLP与更强的阴离子交换剂Q的结合很弱(图23B，上图)。
Im7-HBc与DEAE相互作用的高亲和力允许从粗胞质溶胶级分中一步纯化VLP。在TEM下，纯化的VLP似乎与蔗糖梯度纯化的VLP没有区别(图23C)。
就机理而言，与Q相比，DEAE包含额外的疏水基团(用灰色箭头标记，图23C)，这将该部分转化为C4碳结构。以前的报道已经记载了C4部分对许多特定酶的高亲和力相互作用(Hofstee,B.H.J.,Biochem.Biophys.Res.Comm,53,1973,1137–1144)。以此类推，有可能是相似的化学性质构成了所观察到的Im7与DEAE相互作用的基础。
这一意想不到的化学性质提供了一种通过亲和层析纯化VLP的直接和可扩展的方法，迄今为止，还没有针对任何其他类型的VLP报道过。
实施例21：ColE7-Im7相互作用可以对修饰的VLP进行解离-重组纯化。
方案：PG通过ColE7-Im7相互作用修饰到VLP表面：在4℃下将每一种的胞质溶胶级分混合30分钟。
将PG修饰的VLP衣壳分解成VLP-二聚体：将胞质溶胶1:3稀释至50mM Tris(pH8.0)最终67mM NaCl、30mM咪唑和3M尿素中。
Ni-NTA纯化：通过IMAC(Ni-NTA)层析，使用VLP蛋白上现已暴露的c-末端六组氨酸标签纯化分解的二聚体。吸附后，用8倍柱体积(CV)的含2M尿素和30mM咪唑的缓冲液洗涤柱，然后用2CV的含低尿素(0.5M)的缓冲液洗涤。
衣壳重组：用250mM imi、50mM Arg/Glut、10％glyc、20mM Tris pH 7.0和800mMNaCl洗脱样品，随后在室温下旋转1小时。
VLP分离：将Ni-洗脱液通过1ml CaptoCore700柱，该柱保留小于700kD的蛋白质，并收集0.5ml流出液级分。
大肠杆菌素E7和Im7都在3M尿素存在下保持蛋白质折叠。在这个尿素浓度下，HBcVLP分解成蛋白质二聚体(Wingfield等人,Biochemistry 1995,34,4919—4932)。HBc-Im7VLP在其C-末端序列携带六组氨酸标签，该标签主要包含在VLP内部。然而，在用尿素分解衣壳后，六组氨酸标签暴露出来，允许通过IMAC进行亲和纯化。
图24A中所示的SDS PAGE分析证实，完整的VLP不与Ni-NTA结合，除非首先用尿素分解衣壳(标有“con”的泳道)。如图所示，显示了含有HBcIm7(灰色箭头)和ColE7-IL33(白色箭头)的胞质溶胶级分，以及在不存在或存在3M尿素的情况下进行的批次纯化的洗脱级分。没有组氨酸标记的大肠杆菌素E7-IL33与HBcIm7一起从镍柱上共洗脱。这表明尽管存在3M尿素，ColE7和Im7的结合仍然持续。
一旦从镍柱上洗脱下来(在洗涤过程中逐步从缓冲液中除去尿素之后)，二聚体蛋白可以通过在高浓度NaCl中孵育而重新结合至衣壳中(Ceres和Zlotnick,Biochemistry2002,41,11525-11531)。因此，从镍柱上洗脱下来的二聚体蛋白在800mM NaCl和额外的稳定因子的存在下孵育。此后，在CaptoCore700(Cc700)树脂上对它们进行改进的尺寸排阻色谱，该色谱保留所有小于700kD的蛋白质。得到的SDS PAGE分析如图24B所示，该图显示HBc-Im7和ColE7-IL33在Cc700柱的流出液中共洗脱，验证了衣壳的重组。
实施例22：使用大肠杆菌素E7将蛋白质融合至VLP表面同时提供了分子伴侣功能，允许自身在大肠杆菌中不可溶的蛋白质的天然蛋白质折叠。
方案：表达-将携带人IL17与大肠杆菌素E7的N-末端融合体(在动画图中标记为C7)的质粒转染到携带用于二硫键形成的辅助酶(Erv1P，DsbC)的大肠杆菌BL21/DE3细胞中。在18℃下用脱水四环素(对于IL17)和IPTG(对于辅助酶)诱导16小时。细胞被裂解。通过超声处理，并加入Benzonase，然后在4℃下用0.5％ Triton X100孵育45分钟并离心，制备胞质溶胶级分。上清液被命名为胞质溶胶；含有包涵体的不溶性沉淀物用7M尿素重悬。SDS-PAGE分析(图25A)显示了三个独立的克隆，IL17用粗体箭头标记，辅助酶用小箭头标记。
纯化-人IL17或IL33的表达如(图25A)所示。将胞质溶胶与连接至琼脂糖凝胶(Sepharose)上的商业来源的Im7一起孵育。充分洗涤后，在4℃下将Im7-琼脂糖凝胶与TEV蛋白酶孵育过夜，填充到柱中，并通过重力流洗脱。所得的SDS-PAGE分析显示在图25B中，TEV消化前后的细胞因子分别用标记的箭头表示为IL17或IL33。
受体结合ELISA-(图25C)人IL17RA蛋白(SinoBiological)以0.25ug/孔包被至ELISA板上。将4ul Im7-琼脂糖凝胶纯化的IL17和2.5ul IL33分别加入到每孔200ul PBST中。第二抗体是1:1000的抗IL17/抗IL33(两者都是小鼠IgG)。以1:10000加入抗小鼠IgG-AP30分钟。对于EC50计算，使用30KD的MW，相当于没有糖基化的人IL17二聚体(在大肠杆菌中产生)。
大肠杆菌素E7不仅通过结合Im7实现细胞因子与VLP的连接，同时还作为分子伴侣，允许表达难以产生的蛋白质。人IL17本身不能在大肠杆菌中作为可溶性蛋白表达，即使添加了辅助酶(DsbC，Erv1P)，帮助含有二硫键的蛋白质(如IL17)折叠。
图25显示，当添加大肠杆菌素E7作为N-末端融合单位时(如动画中所示)，使用我们的系统存在IL17的稳健诱导，并且大约50％的诱导蛋白在胞质溶胶中可溶(图25A)。大肠杆菌素-E7部分被正确折叠，因为该蛋白质可以通过固定化的Im7-层析分离，然后用TEV蛋白酶切割(图25B，也显示了IL33)。最后，纯化的IL17是功能性的，显示出与其受体IL17RA的特异性结合，计算的kD为5.3nM(图25C)，这与公开的数据非常一致(2.3nM,Wright,JImmunol 2015,doi10.4049/jimmunol.181.4.2799)。在特异性的证实中，IL33不与IL17RA受体结合。实施例23：单一细胞内VLP骨架和表位蛋白的独立和顺序诱导允许最初的VLP形成，随后是表位组装。
表达系统被改进以实现VLP骨架和表面修饰的表位蛋白的独立和顺序诱导性。这减少了不再需要同时产生所有重组蛋白的细胞的代谢压力。为此，构建了一个质粒，其中tetR蛋白组成型表达，由AmpR基因下游的核糖体结合位点驱动(动画图，图26A)。第二，将表位蛋白置于也含有双tet操纵子的tetR/tetA启动子的下游。结果，只有在向培养基中加入脱水四环素(aTc)时，通过使tetR蛋白从tetR/tetA启动子上解离，才能诱导表位蛋白。
用不同的表位测试该系统。此处显示的是IL33和IL17的数据。将该质粒转染至BL21/DE3大肠杆菌菌株中，该菌株已被修饰成也携带两种酶DsbC和Erv1P，作为T7启动子控制下的染色体整合拷贝。这些酶分别是二硫键转移酶和二硫键异构酶，它们有助于携带二硫键的重组蛋白(如IL17)的折叠。在20℃下用IPTG诱导转染的大肠杆菌20小时(标记为“IPTG”)。与未诱导的裂解物(标记为“U”)相比，存在HBc-Im7 VLP骨架的强烈诱导，以及可见的DsbC和Erv1P的预期诱导。随后，通过更换培养基并加入aTc，随后在27℃下孵育5小时来去除IPTG。这导致IL33和IL17的强烈增加的诱导(标记为‘aTc’)。
在图26中的图B和C的SDS PAGE凝胶中显示了每种细胞因子的三个独立克隆，证明了异常严格的调节而没有任何泄漏。这允许通过细菌细胞内的表面表位进行的VLP的预先形成和随后的修饰。图26中的图D中显示的凝胶显示了已经用IPTG诱导的大肠杆菌中aTc诱导的时间进程。IL17的诱导在60分钟后显著，并在3小时内完成。
实施例24：Barstar可以并入HBc以形成VLP。
方案：如实施例11所述实施蔗糖梯度。TEM：将样品溶解在50mM Tris/HCl，pH 7.0，150mM NaCl缓冲液中，并吸附到辉光放电的碳-formvar涂覆的铜格栅上，并用1％乙酸铀酰水溶液负染色。格栅在80kV下进行检查。DLS：包含在蔗糖中的样品以Tris/HCl pH 7.0，150mM NaCl透析，并用Zetasizer Ultra(Malvern Panalytical)分析80ul体积。
类似于Im7蛋白，Barstar蛋白可以整合到HBc衣壳中以产生VLP。当在大肠杆菌中表达为框内融合时，当应用于蔗糖密度梯度离心时，形成在40％级分中迁移的大纳米颗粒(在图27的图“a”中用灰色箭头标记)。这些颗粒在DLS测量中显示出34nm尺寸的峰(图b)，并且当通过TEM分析时(图c)，显示出增厚的边缘，类似于当Im7整合至HBc VLP中时所看到的边缘(参见实施例14)。
实施例25：Barnase-Barstar相互作用可以对修饰的VLP进行解离-重组纯化。
与大肠杆菌素E7和Im7(见实施例21)完全一样，Barnase和Barstar在3M尿素存在下保持蛋白质折叠。在这个尿素浓度下，HBc VLP分解成蛋白质二聚体(Wingfield等人,Biochemistry 1995,34,4919—4932)。HBc-Barstar VLP在其C-末端序列携带六组氨酸标签，该标签主要包含在VLP内部。然而，在用尿素分解衣壳后，六组氨酸标签暴露出来，允许通过IMAC进行亲和纯化。
图28所示的SDS-PAGE分析类似于实施例21所示的分析，除了HBc-Barstar用作VLP(灰色箭头)和Barnase-IL13用作表位(白色箭头)。凝胶显示含有HBc-Barstar和Barnase-IL13两者的混合胞质溶胶级分，随后是Ni-NTA洗脱液。CaptoCore700级分代表Cc700柱的流出液，仅包含大于700kD的蛋白质。结果表明，实施例21中详述的衣壳重组是成功的。
表1：实施例中使用的质粒克隆
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序列
SEQ ID NO:1
>pETDuet-1 HcIDU67866(6107bp)
GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC
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GGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGC
GTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCC
TCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGAT
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TGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGT
TCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTC
CGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACG
TTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAA
CCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCTAGTCATGCCCCGCGCCCACC
GGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAG
CTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGC
ATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTT
CACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCG
GTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATG
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ATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTC
ATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGG
CTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTA
ATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGT
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CATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACG
GCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTG
TGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAG
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CCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCAT
TAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAA
GGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCT
CATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCG
CACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCGATCTCGATCCC
GCGAAATTAATACGACTCACTATA
SEQ ID NO:2
>pETDuet-1 HcI 6His
GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC
Catggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctcagctctgtatc
gggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaat
ttgggaggaggtggaagcggaggaggtggatctgaactgaaaaatagtattagtgattacacagaggctgagtttgttcaacttcttaaggaaattgaaaaagagaatg
ttgctgcaactgatgatgtgttagatgtgttactcgaacactttgtaaaaattactgagcatccagatggaacggatctgatttattatcctagtgataatagagacgatagc
cccgaagggattgtcaaggaaattaaagaatggcgagctgctaacggtaagccaggatttaaacagggcggaggaggtggaagcggaggaggtggatctccagc
atccagggaattagtagtcagctatgttaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactactgtggtttcacatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttcttgaatat
ttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcttacagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttCATCACCATCATC
ACCACtaataaGCGGCCGCATAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATC
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAA
GTATAAGAAGGAGATATACATATGGCAGATCTCAATTGGATATCGGCCGGCCACGCGATCGCTGACGTC
GGTACCCTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGCTGCTGCGAAATTTGAACGCCAGCACATGGACTCGTCTA
CTAGCGCAGCTTAATTAACCTAGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCC
TCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCG
CCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCA
GCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTC
AAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAA
CTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTG
GAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTAT
TCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAAT
TTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCTGGCGGCACGATGGCATGAGATTATCAAA
AAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAA
ACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCA
TCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGT
GCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGG
AAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGG
AAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTG
GTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATG
ATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGG
CCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATG
CTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCT
CTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGA
AAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCAC
TCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAA
GGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTT
CAATCATGATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAA
AATAAACAAATAGGTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCG
TAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAA
AAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAAC
TGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCA
AGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGC
GATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCT
GAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTAC
AGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCG
GCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCC
TGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT
GGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTC
TTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCC
GCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATT
TTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGAT
GCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACAC
CCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTG
TGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCT
GCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCT
CGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTT
TCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAA
CGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGG
GTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTT
CGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAA
TGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGT
TGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCAT
TCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCT
AGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGAT
CCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGG
AAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGG
CGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCT
GAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGT
TAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATGTCCGCACCAAC
GCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATC
GCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTC
GCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAG
ACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGA
TGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGA
GACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCC
AGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGC
TTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAA
TCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACG
ACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCC
ACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAG
AGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCT
CTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACG
CTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCG
CCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCAT
ACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCG
GCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGA
GGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATA
SEQ ID NO:3
>pETDuet-1 C7接头TEV IL13 70076(6167bp)
GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC
CATGGGCAGCAGCCATCACCATCATCACCACAGCCAGGATCCGAATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG
GTCGACAAGCTTGCGGCCGCATAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCAT
AATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAG
TTAAGTATAAGAAGGAGATATACATATGGAGAGTAAACGGAATAAGCCAGGGAAGGCAACAGGTAAA
GGAAAACCTGTCAATAATAAGTGGTTAAATAATGCAGGTAAAGACTTAGGTTCTCCTGTTCCAGATCGT
ATAGCTAATAAACTACGTGATAAGGAGTTTAAAAGTTTCGATGATTTTCGTAAGAAATTCTGGGAAGA
AGTGTCAAAAGATCCTGAGTTAAGTAAACAATTTAGTCGAAACAATAATGATCGAATGAAGGTTGGAA
AAGCGCCCAAGACTAGAACCCAGGATGTTTCAGGGAAGGCAACTTCATTCGCACTTCATCATGAGAA
GCCGATCAGCCAAAATGGTGGTGTCTATGATATGGATAACATCAGCGTGGTAACACCTAAACGTGCTAT
TGATATTCACCGAGGTAAAAGCGGAGGTGGCTCATCAGGATCTGGTGAAAACCTGTATTTTCAGGGAT
CcGGCCCGGTGCCTCCAAGCACTGCCCTGCGTGAGTTAATCGAAGAATTAGTCAACATTACCCAAAAC
CAGAAGGCACCGCTGTGCAACGGTTCAATGGTCTGGAGCATCAATCTGACAGCCGGTATGTATTGCGC
GGCGCTTGAAAGCCTGATTAACGTGAGTGGTTGTTCTGCCATCGAAAAAACTCAACGTATGTTGTCCG
GCTTTTGCCCACACAAGGTATCTGCCGGTCAATTCAGTTCATTGCACGTTCGTGATACAAAAATTGAG
GTAGCCCAGTTCGTGAAGGACTTACTGTTACATTTGAAAAAGTTATTCCGTGAAGGGCAATTTAACtaat
aaGGTACCCTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGCTGCTGCGAAATTTGAACGCCAGCACATGGACTCGTCT
ACTAGCGCAGCTTAATTAACCTAGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGC
CTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGC
GCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCC
AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGT
CAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAA
ACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTT
GGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCT
ATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAA
ATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCTGGCGGCACGATGGCATGAGATTATCA
AAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGT
AAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTT
CATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCA
GTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCC
GGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCG
GGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCG
TGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACA
TGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTT
GGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAG
ATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTT
GCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATT
GGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACC
CACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAG
GAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCT
TTTTCAATCATGATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAG
AAAAATAAACAAATAGGTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACC
CCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACA
AAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGT
AACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACT
TCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGT
GGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGG
GCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCT
ACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAG
CGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAG
TCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCC
TATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATG
TTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTC
GCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGG
TATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTC
TGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGA
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CTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCA
GCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCA
GCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTT
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GCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAAC
ATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTC
ATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGAT
TCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCA
TGCTAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCG
AGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTC
GGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATT
GGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGG
CCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGG
TGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATGTCCGCAC
CAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAG
CATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCC
AGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGAC
GCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGAC
CAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGT
CAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTC
ATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTAC
AGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGAT
TTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCA
ACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCT
TCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATA
AGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACT
CTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGAC
GCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCC
GCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACC
ATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGT
CGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTA
GAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATA
SEQ ID NO:4
>pETDuet-1 C7接头TEV IL33 70051(6305bp)
GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC
CATGGGCAGCAGCCATCACCATCATCACCACAGCCAGGATCCGAATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG
GTCGACAAGCTTGCGGCCGCATAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCAT
AATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAG
TTAAGTATAAGAAGGAGATATACATATGGAGAGTAAACGGAATAAGCCAGGGAAGGCAACAGGTAAA
GGAAAACCTGTCAATAATAAGTGGTTAAATAATGCAGGTAAAGACTTAGGTTCTCCTGTTCCAGATCGT
ATAGCTAATAAACTACGTGATAAGGAGTTTAAAAGTTTCGATGATTTTCGTAAGAAATTCTGGGAAGA
AGTGTCAAAAGATCCTGAGTTAAGTAAACAATTTAGTCGAAACAATAATGATCGAATGAAGGTTGGAA
AAGCGCCCAAGACTAGAACCCAGGATGTTTCAGGGAAGGCAACTTCATTCGCACTTCATCATGAGAA
GCCGATCAGCCAAAATGGTGGTGTCTATGATATGGATAACATCAGCGTGGTAACACCTAAACGTGCTAT
TGATATTCACCGAGGTAAAAGCGGAGGTGGCTCATCAGGATCtGGTGAAAACCTGTATTTTCAGGGatcc
Agcattcagggcaccagcctgctgacccagagcccggcgagcctgagcacctataacgatcagagcgtgagctttgtgctggaaaacggctgctatgtgattaacg
tggataaaagcggcaaagatcaggaacaggatcaggtgctgctgcgctattataaaagcccgtgcccggcgagccagagcggcgatggcgtggatggcaagaaa
ctgatggtgaacatgagcccgattaaagataccgatatttggctgcatgcgaacgataaagattatagcgtggaactgcagcgcggcgatgtgagcccgccagaaca
ggcgttctttgtgctgcataagaaaagcagcgattttgtgagctttgaatgcaaaaacctgccgggcacctatattggcgtgaaagataaccagctggcgctggtggaa
gagaaagatgaaagctgcaacaacattatgtttaaactgagcaaaatttaataaGGTACCCTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGCTGCTG
CGAAATTTGAACGCCAGCACATGGACTCGTCTACTAGCGCAGCTTAATTAACCTAGGCTGCTGCCACC
GCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGG
AGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGG
TGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCT
TCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGA
TTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATC
GCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCA
AACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGC
CTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTAC
AATTTCTGGCGGCACGATGGCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAA
TGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGT
GAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATA
ACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACC
GGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACT
TTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGT
TTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTC
AGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTC
CTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACT
GCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTC
ATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGC
CACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGAT
CTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTAC
TTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGC
GACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATCATGATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTG
TCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGTCATGACCAAAATCCCTT
AACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCT
TTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCC
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GTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACG
ACTCACTATA
SEQ ID NO:5
>pETDuet-1 HcI F L 6His-C7接头TEV IL13 70080(6872bp)
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gggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaat
ttgggaggaggtggaagcggaggaggtggatctgaactgaaaaatagtattagtgattacacagaggctgagtttgttcaacttcttaaggaaattgaaaaagagaatg
ttgctgcaactgatgatgtgttagatgtgttactcgaacacctagtaaaaattactgagcatccagatggaacggatctgatttattatcctagtgataatagagacgatag
ccccgaagggattgtcaaggaaattaaagaatggcgagctgctaacggtaagccaggatttaaacagggcggaggaggtggaagcggaggaggtggatctccag
catccagggaattagtagtcagctatgttaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactactgtggtttcacatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttcttgaata
tttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcttacagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttCATCACCATCATC
ACCACtaataaGCGGCCGCATAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATC
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAA
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AACCTGTCAATAATAAGTGGTTAAATAATGCAGGTAAAGACTTAGGTTCTCCTGTTCCAGATCGTATAG
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GCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAA
GCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACT
TGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGG
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CTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATT
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CCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGT
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GTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATG
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CTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCT
CTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGA
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TCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAA
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AATAAACAAATAGGTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCG
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AAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAAC
TGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCA
AGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGC
GATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCT
GAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTAC
AGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCG
GCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCC
TGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT
GGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTC
TTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCC
GCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATT
TTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGAT
GCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACAC
CCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTG
TGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCT
GCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCT
CGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTT
TCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAA
CGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGG
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TGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGT
TGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCAT
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CCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGG
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CGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCT
GAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGT
TAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATGTCCGCACCAAC
GCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATC
GCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTC
GCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAG
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TGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGA
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ACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAG
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GGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATA
SEQ ID NO:6
>pETDuet-1 HcI F L 6His-C7接头TEV IL33 70059(7010bp)
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gggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaat
ttgggaggaggtggaagcggaggaggtggatctgaactgaaaaatagtattagtgattacacagaggctgagtttgttcaacttcttaaggaaattgaaaaagagaatg
ttgctgcaactgatgatgtgttagatgtgttactcgaacacctagtaaaaattactgagcatccagatggaacggatctgatttattatcctagtgataatagagacgatag
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catccagggaattagtagtcagctatgttaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactactgtggtttcacatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttcttgaata
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GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAA
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GCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCT
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GGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATCATGATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCA
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GAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTT
TCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATC
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CTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCT
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AGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGC
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TGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCT
GGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATT
ACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGC
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CTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTC
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ATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATT
TCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATG
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TTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGG
GTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCTAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGT
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TTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACG
CGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAA
CAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCC
AGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTC
GTATCCCACTACCGAGATGTCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCA
GCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTT
TGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGT
GAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGC
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AATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAG
CTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCG
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GGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGA
CTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAA
TGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGG
TTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGG
TTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCG
CCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGT
AGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAAC
AGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGC
GAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTG
ATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACT
CACTATA
SEQ ID NO:7
>具有突变的T7的pETDuet-1 HcI F L 6His-C7接头TEV IL33 70126(7010bp)
GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC
Catggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctcagctctgtatc
gggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaat
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CACTATA
SEQ ID NO:8
>65750pETDuet1 HcI F L 6His+蛋白G接头TEV C7(7139bp)
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catccagggaattagtagtcagctatgttaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactactgtggtttcacatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttcttgaata
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AATGATCGAATGAAGGTTGGAAAAGCGCCCAAGACTAGAACCCAGGATGTTTCAGGGAAGGCAACTT
CATTCGCACTTCATCATGAGAAGCCGATCAGCCAAAATGGTGGTGTCTATGATATGGATAACATCAGCG
TGGTAACACCTAAACGTGCTATTGATATTCACCGAGGTAAAAGCGGAGGTGGCTCATCAGGATCtGGT
GAAAACCTGTATTTTCAGGGatccGGAGGTGGCTCAggaatcacaatcccacgaaatccaggatgcccaaattctgaggacaagaact
tcccccggactgtgatggtcaacctgaacatccataaccggaataccaataccaatcccaaaaggtcctcagattactacaaccgatccacctcaccttggaatctcca
ccgcaatgaggaccctgagagatatccctctgtgatctgggaggcaaagtgccgccacttgggctgcatcaacgctgatgggaacgtggactaccacatgaactctg
tccccatccagcaagagatcctggtcctgcgcagggagcctccacactgccccaactccttccggctggagaagatactggtgtccgtgggctgcacctgtgtcacc
ccgattgtccaccatgtggcctaataaGGTACCCTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGCTGCTGCGAAATTTGAACGCCAG
CACATGGACTCGTCTACTAGCGCAGCTTAATTAACCTAGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGC
ATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT
TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTG
ACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTC
GCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCA
CCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTT
TTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTC
AACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATG
AGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCTGGCGGCACGA
TGGCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAT
CTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTTtaGGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGCAg
ATGATCAATTCAAGGCCGAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCAAATAATTCGATAGCTTGT
CGTAATAATGGCGGCATACTATCAGTAGTAGGTGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGATGCTCTTGAT
CTTCCAATACGCAACCTAAAGTAAAATGCCCCACAGCGCTGAGTGCATATAATGCATTCTCTAGTGAA
AAACCTTGTTGGCATAAAAAGGCTAATTGATTTTCGAGAGTTTCATACTGTTTTTCTGTAGGCCGTGTA
CCTAAATGTACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAGTAAAGCACATCTAAAACTTTTAGCGTTATTACGTA
AAAAATCTTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTATGGTGCCTATCTAACATCTCAATG
GCTAAGGCGTCGAGCAAAGCCCGCTTATTTTTTACATGCCAATACAATGTAGGCTGCTCTACACCTAGC
TTCTGGGCGAGTTTACGGGTTGTTAAACCTTCGATTCCGACCTCATTAAGCAGCTCTAATGCGCTGTTA
ATCACTTTACTTTTATCTAATCTAGACATcattaattccTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGC
GATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGG
CTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAG
CAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCA
GTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGC
CATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACG
ATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCG
TTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTG
TCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTA
TGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTA
AAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATC
CAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGG
GTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAAT
ACTCATACTCTTCCTTTTTCAATCATGATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATA
TTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCA
CTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCT
GCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAAC
TCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGT
AGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCA
GTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAA
GGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACAC
CGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGA
CAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACG
CCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTC
AGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGG
CCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGT
GAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG
AGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTC
AGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCA
TGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATC
CGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCG
AAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCT
GTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCC
ATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGG
GTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTT
ACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCA
GGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGA
TGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAA
ACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCT
CGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGAC
AGGAGCACGATCATGCTAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCA
AGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTG
CCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAG
GCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCC
CTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAA
TCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACC
GAGATGTCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGAT
CGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCG
GACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGC
CAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGT
GACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTG
ATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAA
TGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGC
ACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTG
ATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCA
ACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTC
CGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGG
AAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACC
ACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTG
TCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGC
CGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCA
CGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTC
CCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACG
ATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAG
Seq ID No:48
>DU70612.pETDuet-1 HBc-Im7 F->L 6His–tet-可诱导型_ColE7-接头-TEV_位点_mIL33；7700bp
GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC
Catggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctcagctctgtatc
gggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaat
ttgggaggaggtggaagcggaggaggtggatctgaactgaaaaatagtattagtgattacacagaggctgagtttgttcaacttcttaaggaaattgaaaaagagaatg
ttgctgcaactgatgatgtgttagatgtgttactcgaacacctagtaaaaattactgagcatccagatggaacggatctgatttattatcctagtgataatagagacgatag
ccccgaagggattgtcaaggaaattaaagaatggcgagctgctaacggtaagccaggatttaaacagggcggaggaggtggaagcggaggaggtggatctccag
catccagggaattagtagtcagctatgttaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactactgtggtttcacatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttcttgaata
tttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcttacagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttCATCACCATCATC
ACCACtaataaGCGGCCGCTTAACCTAGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGG
GCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTTGTACACGGCCGCATAATCGgttgacactctatcattgatagagttatttt
accactccctatcagtgatagagaaAagtgaaatgaatagttcgacaaaaatctagataacgagggcaaCATATGGAGAGTAAACGGAATAAG
CCAGGGAAGGCAACAGGTAAAGGAAAACCTGTCAATAATAAGTGGTTAAATAATGCAGGTAAAGACT
TAGGTTCTCCTGTTCCAGATCGTATAGCTAATAAACTACGTGATAAGGAGTTTAAAAGTTTCGATGATT
TTCGTAAGAAATTCTGGGAAGAAGTGTCAAAAGATCCTGAGTTAAGTAAACAATTTAGTCGAAACAAT
AATGATCGAATGAAGGTTGGAAAAGCGCCCAAGACTAGAACCCAGGATGTTTCAGGGAAGGCAACTT
CATTCGCACTTCATCATGAGAAGCCGATCAGCCAAAATGGTGGTGTCTATGATATGGATAACATCAGCG
TGGTAACACCTAAACGTGCTATTGATATTCACCGAGGTAAAAGCGGAGGTGGCTCATCAGGATCtGGT
GAAAACCTGTATTTTCAGGGatccAgcattcagggcaccagcctgctgacccagagcccggcgagcctgagcacctataacgatcagagcgtg
agctttgtgctggaaaacggctgctatgtgattaacgtggataaaagcggcaaagatcaggaacaggatcaggtgctgctgcgctattataaaagcccgtgcccggc
gagccagagcggcgatggcgtggatggcaagaaactgatggtgaacatgagcccgattaaagataccgatatttggctgcatgcgaacgataaagattatagcgtg
gaactgcagcgcggcgatgtgagcccgccagaacaggcgttctttgtgctgcataagaaaagcagcgattttgtgagctttgaatgcaaaaacctgccgggcacctat
attggcgtgaaagataaccagctggcgctggtggaagagaaagatgaaagctgcaacaacattatgtttaaactgagcaaaatttaataaGGTACCCTCGA
GTCTGGTAAAGAAACCGCTGCTGCGAAATTTGAACGCCAGCACATGGACTCGTCTACTAGCGCAGCT
TAATTAACCTAGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGT
CTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGG
CGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCG
CCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAAT
CGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGG
TGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGT
TCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTT
ATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAA
TTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCTGGCGGCACGATGGCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTC
ACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTTt
aGGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGCAgATGATCAATTCAAGGCCGAATAAGAAGG
CTGGCTCTGCACCTTGGTGATCAAATAATTCGATAGCTTGTCGTAATAATGGCGGCATACTATCAGTAGT
AGGTGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGATGCTCTTGATCTTCCAATACGCAACCTAAAGTAAAATG
CCCCACAGCGCTGAGTGCATATAATGCATTCTCTAGTGAAAAACCTTGTTGGCATAAAAAGGCTAATT
GATTTTCGAGAGTTTCATACTGTTTTTCTGTAGGCCGTGTACCTAAATGTACTTTTGCTCCATCGCGATG
ACTTAGTAAAGCACATCTAAAACTTTTAGCGTTATTACGTAAAAAATCTTGCCAGCTTTCCCCTTCTAA
AGGGCAAAAGTGAGTATGGTGCCTATCTAACATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAAAGCCCGCTTAT
TTTTTACATGCCAATACAATGTAGGCTGCTCTACACCTAGCTTCTGGGCGAGTTTACGGGTTGTTAAAC
CTTCGATTCCGACCTCATTAAGCAGCTCTAATGCGCTGTTAATCACTTTACTTTTATCTAATCTAGACATc
attaattccTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGC
CTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGA
TACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGA
GCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGT
AAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCT
CGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGT
TGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTA
TCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGA
CTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCG
TCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTC
GGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCA
ACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCC
GCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATCATGATT
GAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAAT
AGGTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATC
AAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCT
ACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCA
GAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTA
GCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGT
CTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTT
CGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATG
AGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAAC
AGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGC
CACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCA
GCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTAT
CCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACG
ACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGC
ATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTA
AGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCC
GCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCG
GGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTC
ATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCT
CCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTC
ACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGAT
GCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGG
CGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGA
TGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGC
GCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGT
CGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAG
TAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCTAGTCATGCCCCG
CGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAA
TGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTG
CCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGT
TTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCA
GCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGAT
ATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATGTCCGCACCAACGCGCAGCCCGG
ACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAAC
GATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTC
CGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGA
CAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCC
CAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAA
ATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTA
ATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGC
TTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACA
ATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCC
GCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCG
CGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCA
TACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGC
TATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATG
CGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAAT
GGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGA
AACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCG
CCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCG
ATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATA
表2：本发明的VLP中使用的成分蛋白部分的氨基酸序列
/>
/>
/>
/>
接头：
GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:33)
GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:34)
SGGGSSGSG(SEQ ID NO:35)
Barstar：
KKAVINGEQIRSISDLHQTLKKELALPEYYGENLDALWDALTGWVEYPLVLEWRQFEQSKQLTENGAESVLQVFREAKAEGADITIELS(SEQ ID NO:36)Im7：
ELKNSISDYTEAEFVQLLKEIEKENVAATDDVLDVLLEHFVKITEHPDGTDLIYYPSDNRDDSPEGIVKEIKEWRAANGKPGFKQ(SEQ ID NO:37)
Barnase：
AQVINTFDGVADYLQTYHKLPDNYITKSEAQALGWVASKGNLADVAPGKSIGGDIFSNREGKLPGKSGRTWRWADINYTSGFRNSDRILYSSDWLIYKTTDHYQTFTKIR(SEQ ID NO:38)
ColE7：
ESKRNKPGKATGKGKPVNNKWLNNAGKDLGSPVPDRIANKLRDKEFKSFDDFRKKFWEEVSKDPELSKQFSRNNNDRMKVGKAPKTRTQDVSGKATSFALHHEKPISQNGGVYDMDNISVVTPKRAIDIHRGKS(SEQ ID NO:39)
HBc：
MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNL[X]PASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV(SEQ ID NO:40)
表3：编码本发明的VLP中所用部分的核酸序列
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
T7启动子亲本序列：
gcataat(SEQ ID NO:44)。
序列表
<110> 邓迪大学
<120> 病毒样颗粒及其生产方法
<130> P305966WO
<150> GB2018816.5
<151> 2020-11-30
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pETDuet-1 HcI DU67866
<400> 1
ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag 60
gagatatacc atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc 120
ttttttgcct tctgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctcagctct 180
gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca 240
agctattctg tgttggggtg agttgatgaa tttggccacc tgggtgggaa gtaatttggg 300
aggaggtgga agcggaggag gtggatctga actgaaaaat agtattagtg attacacaga 360
ggctgagttt gttcaacttc ttaaggaaat tgaaaaagag aatgttgctg caactgatga 420
tgtgttagat gtgttactcg aacactttgt aaaaattact gagcatccag atggaacgga 480
tctgatttat tatcctagtg ataatagaga cgatagcccc gaagggattg tcaaggaaat 540
taaagaatgg cgagctgcta acggtaagcc aggatttaaa cagggcggag gaggtggaag 600
cggaggaggt ggatctccag catccaggga attagtagtc agctatgtta atgttaatat 660
gggcctaaaa atcagacaac tactgtggtt tcacatttcc tgtcttactt ttggaagaga 720
aactgttctt gaatatttgg tgtcttttgg agtgtggatt cgcactcctc ctgcttacag 780
accaccaaat gcccctatct tatcaacact tccggaaact actgttgttt aataagcggc 840
cgcataatgc ttaagtcgaa cagaaagtaa tcgtattgta cacggccgca taatcgaaat 900
taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttccccatct tagtatatta 960
gttaagtata agaaggagat atacatatgg cagatctcaa ttggatatcg gccggccacg 1020
cgatcgctga cgtcggtacc ctcgagtctg gtaaagaaac cgctgctgcg aaatttgaac 1080
gccagcacat ggactcgtct actagcgcag cttaattaac ctaggctgct gccaccgctg 1140
agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga 1200
aaggaggaac tatatccgga ttggcgaatg ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 1260
ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc 1320
tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct 1380
aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa 1440
acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc 1500
tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact 1560
caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg 1620
gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt 1680
tacaatttct ggcggcacga tggcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 1740
ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 1800
agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 1860
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<211> 6167
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pETDuet-1 C7接头TEV IL13 70076
<400> 3
ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag 60
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atgaaacgag agaggatgct cacgatacgg gttactgatg atgaacatgc ccggttactg 4920
gaacgttgtg agggtaaaca actggcggta tggatgcggc gggaccagag aaaaatcact 4980
cagggtcaat gccagcgctt cgttaataca gatgtaggtg ttccacaggg tagccagcag 5040
catcctgcga tgcagatccg gaacataatg gtgcagggcg ctgacttccg cgtttccaga 5100
ctttacgaaa cacggaaacc gaagaccatt catgttgttg ctcaggtcgc agacgttttg 5160
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ccgcgttttc gcagaaacgt ggctggcctg gttcaccacg cgggaaacgg tctgataaga 6420
gacaccggca tactctgcga catcgtataa cgttactggt ttcacattca ccaccctgaa 6480
ttgactctct tccgggcgct atcatgccat accgcgaaag gttttgcgcc attcgatggt 6540
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ggttgaggcc gttgagcacc gccgccgcaa ggaatggtgc atgcaaggag atggcgccca 6660
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cacctgtggc gccggtgatg ccggccacga tgcgtccggc gtagaggatc gagatcgatc 6840
tcgatcccgc gaaattaata cgactcacta ta 6872
<210> 6
<211> 7010
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pETDuet-1 HcI F L 6His - C7接头TEV IL33 70059
<400> 6
ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag 60
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caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 3840
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tccagctcgt tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg 4920
ttaagggcgg ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc 4980
atgggggtaa tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat 5040
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gaccagagaa aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt 5160
ccacagggta gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct 5220
gacttccgcg tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct 5280
caggtcgcag acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca 5340
ttctgctaac cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg 5400
atcatgctag tcatgccccg cgcccaccgg aaggagctga ctgggttgaa ggctctcaag 5460
ggcatcggtc gagatcccgg tgcctaatga gtgagctaac ttacattaat tgcgttgcgc 5520
tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 5580
cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga 5640
gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc 5700
cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata 5760
acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc cactaccgag atgtccgcac caacgcgcag 5820
cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat 5880
cgcagtggga acgatgccct cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc 5940
actccagtcg ccttcccgtt ccgctatcgg ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg 6000
ccagccagcc agacgcagac gcgccgagac agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat 6060
ttgctggtga cccaatgcga ccagatgctc cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga 6120
gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc agagacatca agaaataacg ccggaacatt 6180
agtgcaggca gcttccacag caatggcatc ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag 6240
cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct 6300
tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc 6360
cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa 6420
cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac gcggttggga atgtaattca gctccgccat 6480
cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg 6540
ggaaacggtc tgataagaga caccggcata ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt 6600
cacattcacc accctgaatt gactctcttc cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt 6660
tttgcgccat tcgatggtgt ccgggatctc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta 6720
ggaagcagcc cagtagtagg ttgaggccgt tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat 6780
gcaaggagat ggcgcccaac agtcccccgg ccacggggcc tgccaccata cccacgccga 6840
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agaggatcga gatcgatctc gatcccgcga aattaatacg actcactata 7010
<210> 7
<211> 7010
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突变的T7的pETDuet-1 HcI F L 6His - C7接头TEV IL33 70126
<400> 7
ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag 60
gagatatacc atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc 120
ttttttgcct tctgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctcagctct 180
gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca 240
agctattctg tgttggggtg agttgatgaa tttggccacc tgggtgggaa gtaatttggg 300
aggaggtgga agcggaggag gtggatctga actgaaaaat agtattagtg attacacaga 360
ggctgagttt gttcaacttc ttaaggaaat tgaaaaagag aatgttgctg caactgatga 420
tgtgttagat gtgttactcg aacacctagt aaaaattact gagcatccag atggaacgga 480
tctgatttat tatcctagtg ataatagaga cgatagcccc gaagggattg tcaaggaaat 540
taaagaatgg cgagctgcta acggtaagcc aggatttaaa cagggcggag gaggtggaag 600
cggaggaggt ggatctccag catccaggga attagtagtc agctatgtta atgttaatat 660
gggcctaaaa atcagacaac tactgtggtt tcacatttcc tgtcttactt ttggaagaga 720
aactgttctt gaatatttgg tgtcttttgg agtgtggatt cgcactcctc ctgcttacag 780
accaccaaat gcccctatct tatcaacact tccggaaact actgttgttc atcaccatca 840
tcaccactaa taagcggccg cataatgctt aagtcgaaca gaaagtaatc gtattgtaca 900
cggccgcata atcgaaatta atacgcctca ctatagggga attgtgagcg gataacaatt 960
ccccatctta gtatattagt taagtataag aaggagatat acatatggag agtaaacgga 1020
ataagccagg gaaggcaaca ggtaaaggaa aacctgtcaa taataagtgg ttaaataatg 1080
caggtaaaga cttaggttct cctgttccag atcgtatagc taataaacta cgtgataagg 1140
agtttaaaag tttcgatgat tttcgtaaga aattctggga agaagtgtca aaagatcctg 1200
agttaagtaa acaatttagt cgaaacaata atgatcgaat gaaggttgga aaagcgccca 1260
agactagaac ccaggatgtt tcagggaagg caacttcatt cgcacttcat catgagaagc 1320
cgatcagcca aaatggtggt gtctatgata tggataacat cagcgtggta acacctaaac 1380
gtgctattga tattcaccga ggtaaaagcg gaggtggctc atcaggatct ggtgaaaacc 1440
tgtattttca gggatccagc attcagggca ccagcctgct gacccagagc ccggcgagcc 1500
tgagcaccta taacgatcag agcgtgagct ttgtgctgga aaacggctgc tatgtgatta 1560
acgtggataa aagcggcaaa gatcaggaac aggatcaggt gctgctgcgc tattataaaa 1620
gcccgtgccc ggcgagccag agcggcgatg gcgtggatgg caagaaactg atggtgaaca 1680
tgagcccgat taaagatacc gatatttggc tgcatgcgaa cgataaagat tatagcgtgg 1740
aactgcagcg cggcgatgtg agcccgccag aacaggcgtt ctttgtgctg cataagaaaa 1800
gcagcgattt tgtgagcttt gaatgcaaaa acctgccggg cacctatatt ggcgtgaaag 1860
ataaccagct ggcgctggtg gaagagaaag atgaaagctg caacaacatt atgtttaaac 1920
tgagcaaaat ttaataaggt accctcgagt ctggtaaaga aaccgctgct gcgaaatttg 1980
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ctgagcaata actagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc 2100
tgaaaggagg aactatatcc ggattggcga atgggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag 2160
cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc 2220
cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc 2280
tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa 2340
aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg 2400
ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac 2460
actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta 2520
ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac 2580
gtttacaatt tctggcggca cgatggcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 2640
cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 2700
gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 2760
tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 2820
ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 2880
ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 2940
atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 3000
cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 3060
tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 3120
aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 3180
tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 3240
ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 3300
agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 3360
gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 3420
agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 3480
accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 3540
gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatcatgatt gaagcattta 3600
tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 3660
aggtcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 3720
aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 3780
caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 3840
ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 3900
cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 3960
tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 4020
gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 4080
ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 4140
gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 4200
caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 4260
ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 4320
tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 4380
ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 4440
agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 4500
aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 4560
gcatatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac 4620
actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct 4680
gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc 4740
tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg 4800
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<223> DU67808_pcDNA3D_FRT_信号肽_ColE7_刺突_RBD_六组氨酸
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ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 4980
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 5040
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 5100
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 5160
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 5220
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 5280
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 5340
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 5400
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 5460
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 5520
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 5580
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 5640
gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 5700
aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 5760
aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 5820
cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 5880
ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 5940
cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 6000
ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 6060
ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 6120
ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 6180
gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 6240
ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 6300
ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 6360
gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 6420
ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 6480
cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 6540
ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 6600
aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 6660
gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 6720
gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tc 6752
<210> 12
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBcIm7
<400> 12
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Lys Asn Ser Ile Ser Asp Tyr Thr
85 90 95
Glu Ala Glu Phe Val Gln Leu Leu Lys Glu Ile Glu Lys Glu Asn Val
100 105 110
Ala Ala Thr Asp Asp Val Leu Asp Val Leu Leu Glu His Phe Val Lys
115 120 125
Ile Thr Glu His Pro Asp Gly Thr Asp Leu Ile Tyr Tyr Pro Ser Asp
130 135 140
Asn Arg Asp Asp Ser Pro Glu Gly Ile Val Lys Glu Ile Lys Glu Trp
145 150 155 160
Arg Ala Ala Asn Gly Lys Pro Gly Phe Lys Gln Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr
180 185 190
Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His
195 200 205
Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val
210 215 220
Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn
225 230 235 240
Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
245 250
<210> 13
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBcIm7hh
<400> 13
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Lys Asn Ser Ile Ser Asp Tyr Thr
85 90 95
Glu Ala Glu Phe Val Gln Leu Leu Lys Glu Ile Glu Lys Glu Asn Val
100 105 110
Ala Ala Thr Asp Asp Val Leu Asp Val Leu Leu Glu His Phe Val Lys
115 120 125
Ile Thr Glu His Pro Asp Gly Thr Asp Leu Ile Tyr Tyr Pro Ser Asp
130 135 140
Asn Arg Asp Asp Ser Pro Glu Gly Ile Val Lys Glu Ile Lys Glu Trp
145 150 155 160
Arg Ala Ala Asn Gly Lys Pro Gly Phe Lys Gln Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr
180 185 190
Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His
195 200 205
Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val
210 215 220
Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn
225 230 235 240
Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val His His His
245 250 255
His His His
<210> 14
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBcIm7-F/L
<400> 14
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Lys Asn Ser Ile Ser Asp Tyr Thr
85 90 95
Glu Ala Glu Phe Val Gln Leu Leu Lys Glu Ile Glu Lys Glu Asn Val
100 105 110
Ala Ala Thr Asp Asp Val Leu Asp Val Leu Leu Glu His Leu Val Lys
115 120 125
Ile Thr Glu His Pro Asp Gly Thr Asp Leu Ile Tyr Tyr Pro Ser Asp
130 135 140
Asn Arg Asp Asp Ser Pro Glu Gly Ile Val Lys Glu Ile Lys Glu Trp
145 150 155 160
Arg Ala Ala Asn Gly Lys Pro Gly Phe Lys Gln Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr
180 185 190
Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His
195 200 205
Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val
210 215 220
Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn
225 230 235 240
Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val His His His
245 250 255
His His His
<210> 15
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBcBsAAE
<400> 15
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Val Ile Asn Gly Glu Gln Ile
85 90 95
Arg Ser Ile Ser Asp Leu His Gln Thr Leu Lys Lys Glu Leu Ala Leu
100 105 110
Pro Glu Tyr Tyr Gly Glu Asn Leu Asp Ala Leu Trp Asp Ala Leu Thr
115 120 125
Gly Trp Val Glu Tyr Pro Leu Val Leu Glu Trp Arg Gln Phe Glu Gln
130 135 140
Ser Lys Gln Leu Thr Glu Asn Gly Ala Glu Ser Val Leu Gln Val Phe
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Ala Glu Gly Ala Asp Ile Thr Ile Glu Leu Ser Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Ser Arg Glu Leu
180 185 190
Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu
195 200 205
Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu
210 215 220
Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr
225 230 235 240
Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val
245 250 255
Val His His His His His His
260
<210> 16
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C7-IL13
<400> 16
Glu Ser Lys Arg Asn Lys Pro Gly Lys Ala Thr Gly Lys Gly Lys Pro
1 5 10 15
Val Asn Asn Lys Trp Leu Asn Asn Ala Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro
20 25 30
Val Pro Asp Arg Ile Ala Asn Lys Leu Arg Asp Lys Glu Phe Lys Ser
35 40 45
Phe Asp Asp Phe Arg Lys Lys Phe Trp Glu Glu Val Ser Lys Asp Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Gln Phe Ser Arg Asn Asn Asn Asp Arg Met Lys Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Pro Lys Thr Arg Thr Gln Asp Val Ser Gly Lys Ala Thr
85 90 95
Ser Phe Ala Leu His His Glu Lys Pro Ile Ser Gln Asn Gly Gly Val
100 105 110
Tyr Asp Met Asp Asn Ile Ser Val Val Thr Pro Lys Arg Ala Ile Asp
115 120 125
Ile His Arg Gly Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Pro
130 135 140
Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn
145 150 155 160
Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp
165 170 175
Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu
180 185 190
Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu
195 200 205
Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu
210 215 220
His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu
225 230 235 240
Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln Phe Asn
245 250
<210> 17
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C7-IL13-TEV
<400> 17
Glu Ser Lys Arg Asn Lys Pro Gly Lys Ala Thr Gly Lys Gly Lys Pro
1 5 10 15
Val Asn Asn Lys Trp Leu Asn Asn Ala Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro
20 25 30
Val Pro Asp Arg Ile Ala Asn Lys Leu Arg Asp Lys Glu Phe Lys Ser
35 40 45
Phe Asp Asp Phe Arg Lys Lys Phe Trp Glu Glu Val Ser Lys Asp Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Gln Phe Ser Arg Asn Asn Asn Asp Arg Met Lys Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Pro Lys Thr Arg Thr Gln Asp Val Ser Gly Lys Ala Thr
85 90 95
Ser Phe Ala Leu His His Glu Lys Pro Ile Ser Gln Asn Gly Gly Val
100 105 110
Tyr Asp Met Asp Asn Ile Ser Val Val Thr Pro Lys Arg Ala Ile Asp
115 120 125
Ile His Arg Gly Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Glu Asn
130 135 140
Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu
145 150 155 160
Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu
165 170 175
Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr
180 185 190
Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile
195 200 205
Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser
210 215 220
Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val
225 230 235 240
Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg
245 250 255
Glu Gly Gln Phe Asn
260
<210> 18
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C7-IL33
<400> 18
Glu Ser Lys Arg Asn Lys Pro Gly Lys Ala Thr Gly Lys Gly Lys Pro
1 5 10 15
Val Asn Asn Lys Trp Leu Asn Asn Ala Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro
20 25 30
Val Pro Asp Arg Ile Ala Asn Lys Leu Arg Asp Lys Glu Phe Lys Ser
35 40 45
Phe Asp Asp Phe Arg Lys Lys Phe Trp Glu Glu Val Ser Lys Asp Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Gln Phe Ser Arg Asn Asn Asn Asp Arg Met Lys Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Pro Lys Thr Arg Thr Gln Asp Val Ser Gly Lys Ala Thr
85 90 95
Ser Phe Ala Leu His His Glu Lys Pro Ile Ser Gln Asn Gly Gly Val
100 105 110
Tyr Asp Met Asp Asn Ile Ser Val Val Thr Pro Lys Arg Ala Ile Asp
115 120 125
Ile His Arg Gly Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser
130 135 140
Ile Gln Gly Thr Ser Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr
145 150 155 160
Tyr Asn Asp Gln Ser Val Ser Phe Val Leu Glu Asn Gly Cys Tyr Val
165 170 175
Ile Asn Val Asp Lys Ser Gly Lys Asp Gln Glu Gln Asp Gln Val Leu
180 185 190
Leu Arg Tyr Tyr Lys Ser Pro Cys Pro Ala Ser Gln Ser Gly Asp Gly
195 200 205
Val Asp Gly Lys Lys Leu Met Val Asn Met Ser Pro Ile Lys Asp Thr
210 215 220
Asp Ile Trp Leu His Ala Asn Asp Lys Asp Tyr Ser Val Glu Leu Gln
225 230 235 240
Arg Gly Asp Val Ser Pro Pro Glu Gln Ala Phe Phe Val Leu His Lys
245 250 255
Lys Ser Ser Asp Phe Val Ser Phe Glu Cys Lys Asn Leu Pro Gly Thr
260 265 270
Tyr Ile Gly Val Lys Asp Asn Gln Leu Ala Leu Val Glu Glu Lys Asp
275 280 285
Glu Ser Cys Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Ser Lys Ile
290 295 300
<210> 19
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C7-IL33-TEV
<400> 19
Glu Ser Lys Arg Asn Lys Pro Gly Lys Ala Thr Gly Lys Gly Lys Pro
1 5 10 15
Val Asn Asn Lys Trp Leu Asn Asn Ala Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro
20 25 30
Val Pro Asp Arg Ile Ala Asn Lys Leu Arg Asp Lys Glu Phe Lys Ser
35 40 45
Phe Asp Asp Phe Arg Lys Lys Phe Trp Glu Glu Val Ser Lys Asp Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Gln Phe Ser Arg Asn Asn Asn Asp Arg Met Lys Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Pro Lys Thr Arg Thr Gln Asp Val Ser Gly Lys Ala Thr
85 90 95
Ser Phe Ala Leu His His Glu Lys Pro Ile Ser Gln Asn Gly Gly Val
100 105 110
Tyr Asp Met Asp Asn Ile Ser Val Val Thr Pro Lys Arg Ala Ile Asp
115 120 125
Ile His Arg Gly Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Glu Asn
130 135 140
Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Ser Ile Gln Gly Thr Ser Leu Leu Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Val Ser Phe Val
165 170 175
Leu Glu Asn Gly Cys Tyr Val Ile Asn Val Asp Lys Ser Gly Lys Asp
180 185 190
Gln Glu Gln Asp Gln Val Leu Leu Arg Tyr Tyr Lys Ser Pro Cys Pro
195 200 205
Ala Ser Gln Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys Lys Leu Met Val Asn
210 215 220
Met Ser Pro Ile Lys Asp Thr Asp Ile Trp Leu His Ala Asn Asp Lys
225 230 235 240
Asp Tyr Ser Val Glu Leu Gln Arg Gly Asp Val Ser Pro Pro Glu Gln
245 250 255
Ala Phe Phe Val Leu His Lys Lys Ser Ser Asp Phe Val Ser Phe Glu
260 265 270
Cys Lys Asn Leu Pro Gly Thr Tyr Ile Gly Val Lys Asp Asn Gln Leu
275 280 285
Ala Leu Val Glu Glu Lys Asp Glu Ser Cys Asn Asn Ile Met Phe Lys
290 295 300
Leu Ser Lys Ile
305
<210> 20
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C7-PG
<400> 20
Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr
20 25 30
Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr
35 40 45
Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu
50 55 60
Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr
65 70 75 80
Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu
85 90 95
Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp
100 105 110
Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu
115 120 125
Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu
130 135 140
Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val
145 150 155 160
Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn
165 170 175
Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr
180 185 190
Val Thr Glu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Glu Ser Lys Arg Asn Lys
210 215 220
Pro Gly Lys Ala Thr Gly Lys Gly Lys Pro Val Asn Asn Lys Trp Leu
225 230 235 240
Asn Asn Ala Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro Val Pro Asp Arg Ile Ala
245 250 255
Asn Lys Leu Arg Asp Lys Glu Phe Lys Ser Phe Asp Asp Phe Arg Lys
260 265 270
Lys Phe Trp Glu Glu Val Ser Lys Asp Pro Glu Leu Ser Lys Gln Phe
275 280 285
Ser Arg Asn Asn Asn Asp Arg Met Lys Val Gly Lys Ala Pro Lys Thr
290 295 300
Arg Thr Gln Asp Val Ser Gly Lys Ala Thr Ser Phe Ala Leu His His
305 310 315 320
Glu Lys Pro Ile Ser Gln Asn Gly Gly Val Tyr Asp Met Asp Asn Ile
325 330 335
Ser Val Val Thr Pro Lys Arg Ala Ile Asp Ile His Arg Gly Lys Ser
340 345 350
<210> 21
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Bn-IL13
<400> 21
Ala Gln Val Ile Asn Thr Phe Asp Gly Val Ala Asp Tyr Leu Gln Thr
1 5 10 15
Tyr His Lys Leu Pro Asp Asn Tyr Ile Thr Lys Ser Glu Ala Gln Ala
20 25 30
Leu Gly Trp Val Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Val Ala Pro Gly
35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Asp Ile Phe Ser Asn Arg Glu Gly Lys Leu Pro
50 55 60
Gly Lys Ser Gly Arg Thr Trp Arg Trp Ala Asp Ile Asn Tyr Thr Ser
65 70 75 80
Gly Phe Arg Asn Ser Asp Arg Ile Leu Tyr Ser Ser Asp Trp Leu Ile
85 90 95
Tyr Lys Thr Thr Asp His Tyr Gln Thr Phe Thr Lys Ile Arg Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Ser Gly Ser Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Pro Val
115 120 125
Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile
130 135 140
Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser
145 150 155 160
Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile
165 170 175
Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser
180 185 190
Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His
195 200 205
Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu
210 215 220
Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln Phe Asn
225 230 235
<210> 22
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBcIm7
<400> 22
atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct 60
tctgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctcagctct gtatcgggag 120
gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg 180
tgttggggtg agttgatgaa tttggccacc tgggtgggaa gtaatttggg aggaggtgga 240
agcggaggag gtggatctga actgaaaaat agtattagtg attacacaga ggctgagttt 300
gttcaacttc ttaaggaaat tgaaaaagag aatgttgctg caactgatga tgtgttagat 360
gtgttactcg aacactttgt aaaaattact gagcatccag atggaacgga tctgatttat 420
tatcctagtg ataatagaga cgatagcccc gaagggattg tcaaggaaat taaagaatgg 480
cgagctgcta acggtaagcc aggatttaaa cagggcggag gaggtggaag cggaggaggt 540
ggatctccag catccaggga attagtagtc agctatgtta atgttaatat gggcctaaaa 600
atcagacaac tactgtggtt tcacatttcc tgtcttactt ttggaagaga aactgttctt 660
gaatatttgg tgtcttttgg agtgtggatt cgcactcctc ctgcttacag accaccaaat 720
gcccctatct tatcaacact tccggaaact actgttgtt 759
<210> 23
<211> 777
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBcIm7hh
<400> 23
atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct 60
tctgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctcagctct gtatcgggag 120
gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg 180
tgttggggtg agttgatgaa tttggccacc tgggtgggaa gtaatttggg aggaggtgga 240
agcggaggag gtggatctga actgaaaaat agtattagtg attacacaga ggctgagttt 300
gttcaacttc ttaaggaaat tgaaaaagag aatgttgctg caactgatga tgtgttagat 360
gtgttactcg aacactttgt aaaaattact gagcatccag atggaacgga tctgatttat 420
tatcctagtg ataatagaga cgatagcccc gaagggattg tcaaggaaat taaagaatgg 480
cgagctgcta acggtaagcc aggatttaaa cagggcggag gaggtggaag cggaggaggt 540
ggatctccag catccaggga attagtagtc agctatgtta atgttaatat gggcctaaaa 600
atcagacaac tactgtggtt tcacatttcc tgtcttactt ttggaagaga aactgttctt 660
gaatatttgg tgtcttttgg agtgtggatt cgcactcctc ctgcttacag accaccaaat 720
gcccctatct tatcaacact tccggaaact actgttgttc atcaccatca tcaccac 777
<210> 24
<211> 777
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBcIm7-F/L
<400> 24
atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct 60
tctgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctcagctct gtatcgggag 120
gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg 180
tgttggggtg agttgatgaa tttggccacc tgggtgggaa gtaatttggg aggaggtgga 240
agcggaggag gtggatctga actgaaaaat agtattagtg attacacaga ggctgagttt 300
gttcaacttc ttaaggaaat tgaaaaagag aatgttgctg caactgatga tgtgttagat 360
gtgttactcg aacacctagt aaaaattact gagcatccag atggaacgga tctgatttat 420
tatcctagtg ataatagaga cgatagcccc gaagggattg tcaaggaaat taaagaatgg 480
cgagctgcta acggtaagcc aggatttaaa cagggcggag gaggtggaag cggaggaggt 540
ggatctccag catccaggga attagtagtc agctatgtta atgttaatat gggcctaaaa 600
atcagacaac tactgtggtt tcacatttcc tgtcttactt ttggaagaga aactgttctt 660
gaatatttgg tgtcttttgg agtgtggatt cgcactcctc ctgcttacag accaccaaat 720
gcccctatct tatcaacact tccggaaact actgttgttc atcaccatca tcaccac 777
<210> 25
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBcBsAAE
<400> 25
atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct 60
tctgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctcagctct gtatcgggag 120
gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg 180
tgttggggtg agttgatgaa tttggccacc tgggtgggaa gtaatttggg aggaggtgga 240
agcggaggag gtggatctaa aaaagcagtc attaacgggg aacaaatcag aagtatcagc 300
gacctccacc agacattgaa aaaggagctt gcccttccgg aatactacgg tgaaaacctg 360
gacgctttat gggatgcgct gaccggatgg gtggagtacc cgctcgtttt ggaatggagg 420
cagtttgaac aaagcaagca gctgactgaa aatggcgccg agagtgtgct tcaggttttc 480
cgtgaagcga aagcggaagg cgcggacatc accatcgaac tttctggcgg aggaggtgga 540
agcggaggag gtggatctcc agcatccagg gaattagtag tcagctatgt taatgttaat 600
atgggcctaa aaatcagaca actactgtgg tttcacattt cctgtcttac ttttggaaga 660
gaaactgttc ttgaatattt ggtgtctttt ggagtgtgga ttcgcactcc tcctgcttac 720
agaccaccaa atgcccctat cttatcaaca cttccggaaa ctactgttgt tcatcaccat 780
catcaccac 789
<210> 26
<211> 764
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C7-IL13
<400> 26
tggagagtaa acggaataag ccagggaagg caacaggtaa aggaaaacct gtcaataata 60
agtggttaaa taatgcaggt aaagacttag gttctcctgt tccagatcgt atagctaata 120
aactacgtga taaggagttt aaaagtttcg atgattttcg taagaaattc tgggaagaag 180
tgtcaaaaga tcctgagtta agtaaacaat ttagtcgaaa caataatgat cgaatgaagg 240
ttggaaaagc gcccaagact agaacccagg atgtttcagg gaaggcaact tcattcgcac 300
ttcatcatga gaagccgatc agccaaaatg gtggtgtcta tgatatggat aacatcagcg 360
tggtaacacc taaacgtgct attgatattc accgaggtaa aagcggaggt ggctcatcag 420
gatctggtgg cccggtgcct ccaagcactg ccctgcgtga gttaatcgaa gaattagtca 480
acattaccca aaaccagaag gcaccgctgt gcaacggttc aatggtctgg agcatcaatc 540
tgacagccgg tatgtattgc gcggcgcttg aaagcctgat taacgtgagt ggttgttctg 600
ccatcgaaaa aactcaacgt atgttgtccg gcttttgccc acacaaggta tctgccggtc 660
aattcagttc attgcacgtt cgtgatacaa aaattgaggt agcccagttc gtgaaggact 720
tactgttaca tttgaaaaag ttattccgtg aagggcaatt taac 764
<210> 27
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C7-IL13-TEV
<400> 27
atggagagta aacggaataa gccagggaag gcaacaggta aaggaaaacc tgtcaataat 60
aagtggttaa ataatgcagg taaagactta ggttctcctg ttccagatcg tatagctaat 120
aaactacgtg ataaggagtt taaaagtttc gatgattttc gtaagaaatt ctgggaagaa 180
gtgtcaaaag atcctgagtt aagtaaacaa tttagtcgaa acaataatga tcgaatgaag 240
gttggaaaag cgcccaagac tagaacccag gatgtttcag ggaaggcaac ttcattcgca 300
cttcatcatg agaagccgat cagccaaaat ggtggtgtct atgatatgga taacatcagc 360
gtggtaacac ctaaacgtgc tattgatatt caccgaggta aaagcggagg tggctcatca 420
ggatctggtg aaaacctgta ttttcaggga tccggcccgg tgcctccaag cactgccctg 480
cgtgagttaa tcgaagaatt agtcaacatt acccaaaacc agaaggcacc gctgtgcaac 540
ggttcaatgg tctggagcat caatctgaca gccggtatgt attgcgcggc gcttgaaagc 600
ctgattaacg tgagtggttg ttctgccatc gaaaaaactc aacgtatgtt gtccggcttt 660
tgcccacaca aggtatctgc cggtcaattc agttcattgc acgttcgtga tacaaaaatt 720
gaggtagccc agttcgtgaa ggacttactg ttacatttga aaaagttatt ccgtgaaggg 780
caatttaac 789
<210> 28
<211> 788
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C7-IL33
<400> 28
tggagagtaa acggaataag ccagggaagg caacaggtaa aggaaaacct gtcaataata 60
agtggttaaa taatgcaggt aaagacttag gttctcctgt tccagatcgt atagctaata 120
aactacgtga taaggagttt aaaagtttcg atgattttcg taagaaattc tgggaagaag 180
tgtcaaaaga tcctgagtta agtaaacaat ttagtcgaaa caataatgat cgaatgaagg 240
ttggaaaagc gcccaagact agaacccagg atgtttcagg gaaggcaact tcattcgcac 300
ttcatcatga gaagccgatc agccaaaatg gtggtgtcta tgatatggat aacatcagcg 360
tggtaacacc taaacgtgct attgatattc accgaggtaa aagcggaggt ggctcatcag 420
gatctggtga aaacctgtat tttcagggat ccggcccggt gcctccaagc actgccctgc 480
gtgagttaat cgaagaatta gtcaacatta cccaaaacca gaaggcaccg ctgtgcaacg 540
gttcaatggt ctggagcatc aatctgacag ccggtatgta ttgcgcggcg cttgaaagcc 600
tgattaacgt gagtggttgt tctgccatcg aaaaaactca acgtatgttg tccggctttt 660
gcccacacaa ggtatctgcc ggtcaattca gttcattgca cgttcgtgat acaaaaattg 720
aggtagccca gttcgtgaag gacttactgt tacatttgaa aaagttattc cgtgaagggc 780
aatttaac 788
<210> 29
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C7-IL33-TEV
<400> 29
atggagagta aacggaataa gccagggaag gcaacaggta aaggaaaacc tgtcaataat 60
aagtggttaa ataatgcagg taaagactta ggttctcctg ttccagatcg tatagctaat 120
aaactacgtg ataaggagtt taaaagtttc gatgattttc gtaagaaatt ctgggaagaa 180
gtgtcaaaag atcctgagtt aagtaaacaa tttagtcgaa acaataatga tcgaatgaag 240
gttggaaaag cgcccaagac tagaacccag gatgtttcag ggaaggcaac ttcattcgca 300
cttcatcatg agaagccgat cagccaaaat ggtggtgtct atgatatgga taacatcagc 360
gtggtaacac ctaaacgtgc tattgatatt caccgaggta aaagcggagg tggctcatca 420
ggatctggtg aaaacctgta ttttcaggga tccagcattc agggcaccag cctgctgacc 480
cagagcccgg cgagcctgag cacctataac gatcagagcg tgagctttgt gctggaaaac 540
ggctgctatg tgattaacgt ggataaaagc ggcaaagatc aggaacagga tcaggtgctg 600
ctgcgctatt ataaaagccc gtgcccggcg agccagagcg gcgatggcgt ggatggcaag 660
aaactgatgg tgaacatgag cccgattaaa gataccgata tttggctgca tgcgaacgat 720
aaagattata gcgtggaact gcagcgcggc gatgtgagcc cgccagaaca ggcgttcttt 780
gtgctgcata agaaaagcag cgattttgtg agctttgaat gcaaaaacct gccgggcacc 840
tatattggcg tgaaagataa ccagctggcg ctggtggaag agaaagatga aagctgcaac 900
aacattatgt ttaaactgag caaaatt 927
<210> 30
<211> 1059
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C7-PG
<400> 30
atgacctata aactgattct gaacggcaaa acgctgaaag gtgaaaccac caccgaagca 60
gtggatgccg caaccgccga aaaagttttc aaacagtacg ccaacgataa tggcgttgat 120
ggtgaatgga cctacgatga tgcaacgaaa accttcacgg tgaccgaaaa accggaagtt 180
attgatgcca gcgaactgac gccggcagtg acgacctaca aactggttat caatggcaaa 240
accctgaaag gtgaaacgac caccgaagcc gtggatgcag ccaccgcaga aaaagtgttt 300
aaacagtacg cgaacgataa tggcgtggac ggcgaatgga cgtatgatga tgccaccaaa 360
acgtttaccg ttacggaaaa accggaagtg atcgatgcat ctgaactgac cccggcggtg 420
accacgtata aactggttat caacggtaaa acgctgaaag gcgaaaccac gaccaaagcc 480
gtggatgcag aaaccgcgga aaaagccttt aaacagtatg caaacgataa tggcgtggat 540
ggtgtttgga cctacgatga tgccacgaaa accttcacgg ttaccgaagg cggtgggagt 600
agcggaagtg ggggtggtgg atccagtggt tctggggaaa atctgtactt ccagggtgag 660
agtaaacgga ataagccagg gaaggcaaca ggtaaaggaa aacctgtcaa taataagtgg 720
ttaaataatg caggtaaaga cttaggttct cctgttccag atcgtatagc taataaacta 780
cgtgataagg agtttaaaag tttcgatgat tttcgtaaga aattctggga agaagtgtca 840
aaagatcctg agttaagtaa acaatttagt cgaaacaata atgatcgaat gaaggttgga 900
aaagcgccca agactagaac ccaggatgtt tcagggaagg caacttcatt cgcacttcat 960
catgagaagc cgatcagcca aaatggtggt gtctatgata tggataacat cagcgtggta 1020
acacctaaac gtgctattga tattcaccga ggtaaaagc 1059
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7-突变
<400> 31
taatacgact cactatagg 19
<210> 32
<211> 786
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bn-IL13
<400> 32
atggcacagg ttatcaacac gtttgacggg gttgcggatt atcttcagac atatcataag 60
ctacctgata attacattac aaaatcagaa gcacaagccc tcggctgggt ggcatcaaaa 120
gggaaccttg cagacgtcgc tccggggaaa agcatcggcg gagacatctt ctcaaacagg 180
gaaggcaaac tcccgggcaa aagcggacga acatggcgtt gggcggatat taactataca 240
tcaggcttca gaaattcaga ccggattctt tactcaagcg actggctgat ttacaaaaca 300
acggaccatt atcagacctt tacaaaaatc agaggaggtg gctcatcagg atctggtgaa 360
aacctgtatt ttcagggatc cggcccggtg cctccaagca ctgccctgcg tgagttaatc 420
gaagaattag tcaacattac ccaaaaccag aaggcaccgc tgtgcaacgg ttcaatggtc 480
tggagcatca atctgacagc cggtatgtat tgcgcggcgc ttgaaagcct gattaacgtg 540
agtggttgtt ctgccatcga aaaaactcaa cgtatgttgt ccggcttttg cccacacaag 600
gtatctgccg gtcaattcag ttcattgcac gttcgtgata caaaaattga ggtagcccag 660
ttcgtgaagg acttactgtt acatttgaaa aagttattcc gtgaagggca atttaactaa 720
taaggtaccc tcgagtctgg taaagaaacc gctgctgcga aatttgaacg ccagcacatg 780
gactcg 786
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 33
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 35
Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 36
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Barstar
<400> 36
Lys Lys Ala Val Ile Asn Gly Glu Gln Ile Arg Ser Ile Ser Asp Leu
1 5 10 15
His Gln Thr Leu Lys Lys Glu Leu Ala Leu Pro Glu Tyr Tyr Gly Glu
20 25 30
Asn Leu Asp Ala Leu Trp Asp Ala Leu Thr Gly Trp Val Glu Tyr Pro
35 40 45
Leu Val Leu Glu Trp Arg Gln Phe Glu Gln Ser Lys Gln Leu Thr Glu
50 55 60
Asn Gly Ala Glu Ser Val Leu Gln Val Phe Arg Glu Ala Lys Ala Glu
65 70 75 80
Gly Ala Asp Ile Thr Ile Glu Leu Ser
85
<210> 37
<211> 85
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Im7
<400> 37
Glu Leu Lys Asn Ser Ile Ser Asp Tyr Thr Glu Ala Glu Phe Val Gln
1 5 10 15
Leu Leu Lys Glu Ile Glu Lys Glu Asn Val Ala Ala Thr Asp Asp Val
20 25 30
Leu Asp Val Leu Leu Glu His Phe Val Lys Ile Thr Glu His Pro Asp
35 40 45
Gly Thr Asp Leu Ile Tyr Tyr Pro Ser Asp Asn Arg Asp Asp Ser Pro
50 55 60
Glu Gly Ile Val Lys Glu Ile Lys Glu Trp Arg Ala Ala Asn Gly Lys
65 70 75 80
Pro Gly Phe Lys Gln
85
<210> 38
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Barnase
<400> 38
Ala Gln Val Ile Asn Thr Phe Asp Gly Val Ala Asp Tyr Leu Gln Thr
1 5 10 15
Tyr His Lys Leu Pro Asp Asn Tyr Ile Thr Lys Ser Glu Ala Gln Ala
20 25 30
Leu Gly Trp Val Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Val Ala Pro Gly
35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Asp Ile Phe Ser Asn Arg Glu Gly Lys Leu Pro
50 55 60
Gly Lys Ser Gly Arg Thr Trp Arg Trp Ala Asp Ile Asn Tyr Thr Ser
65 70 75 80
Gly Phe Arg Asn Ser Asp Arg Ile Leu Tyr Ser Ser Asp Trp Leu Ile
85 90 95
Tyr Lys Thr Thr Asp His Tyr Gln Thr Phe Thr Lys Ile Arg
100 105 110
<210> 39
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ColE7
<400> 39
Glu Ser Lys Arg Asn Lys Pro Gly Lys Ala Thr Gly Lys Gly Lys Pro
1 5 10 15
Val Asn Asn Lys Trp Leu Asn Asn Ala Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro
20 25 30
Val Pro Asp Arg Ile Ala Asn Lys Leu Arg Asp Lys Glu Phe Lys Ser
35 40 45
Phe Asp Asp Phe Arg Lys Lys Phe Trp Glu Glu Val Ser Lys Asp Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Gln Phe Ser Arg Asn Asn Asn Asp Arg Met Lys Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Pro Lys Thr Arg Thr Gln Asp Val Ser Gly Lys Ala Thr
85 90 95
Ser Phe Ala Leu His His Glu Lys Pro Ile Ser Gln Asn Gly Gly Val
100 105 110
Tyr Asp Met Asp Asn Ile Ser Val Val Thr Pro Lys Arg Ala Ile Asp
115 120 125
Ile His Arg Gly Lys Ser
130
<210> 40
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> x表示插入位置，合适地是氨基酸插入位置，合适地是编码第一结合蛋白的氨基酸序列插入位置。
<400> 40
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Xaa Pro Ala Ser
65 70 75 80
Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile
85 90 95
Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu
100 105 110
Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro
115 120 125
Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu
130 135 140
Thr Thr Val Val
145
<210> 41
<211> 1094
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C7-RBD
<400> 41
gagagtaaac ggaataagcc agggaaggca acaggtaaag gaaaacctgt caataataag 60
tggttaaata atgcaggtaa agacttaggt tctcctgttc cagatcgtat agctaataaa 120
ctacgtgata aggagtttaa aagtttcgat gattttcgta agaaattctg ggaagaagtg 180
tcaaaagatc ctgagttaag taaacaattt agtcgaaaca ataatgatcg aatgaaggtt 240
ggaaaagcgc ccaagactag aacccaggat gtttcaggga aggcaacttc attcgcactt 300
catcatgaga agccgatcag ccaaaatggt ggtgtctatg atatggataa catcagcgtg 360
gtaacaccta aacgtgctat tgatattcac cgaggtaaaa gcggaggtgg ctcatcagga 420
tccggtagag tccaaccaac agaatctatt gttagatttc ctaatattac aaacttgtgc 480
ccttttggtg aagtttttaa cgccaccaga tttgcatctg tttatgcttg gaacaggaag 540
agaatcagca actgtgttgc tgattattct gtcctatata attccgcatc attttccact 600
tttaagtgtt atggagtgtc tcctactaaa ttaaatgatc tctgctttac taatgtctat 660
gcagattcat ttgtaattag aggtgatgaa gtcagacaaa tcgctccagg gcaaactgga 720
aagattgctg attataatta taaattacca gatgatttta caggctgcgt tatagcttgg 780
aattctaaca atcttgattc taaggttggt ggtaattata attacctgta tagattgttt 840
aggaagtcta atctcaaacc ttttgagaga gatatttcaa ctgaaatcta tcaggccggt 900
agcacacctt gtaatggtgt tgaaggtttt aattgttact ttcctttaca atcatatggt 960
ttccaaccca ctaatggtgt tggttaccaa ccatacagag tagtagtact ttcttttgaa 1020
cttctacatg caccagcaac tgtttgtgga cctaaaaagt ctactaattt ggttaaaaac 1080
aaatgtgtca attt 1094
<210> 42
<211> 1530
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C7-RBD-核衣壳
<400> 42
gagagtaaac ggaataagcc agggaaggca acaggtaaag gaaaacctgt caataataag 60
tggttaaata atgcaggtaa agacttaggt tctcctgttc cagatcgtat agctaataaa 120
ctacgtgata aggagtttaa aagtttcgat gattttcgta agaaattctg ggaagaagtg 180
tcaaaagatc ctgagttaag taaacaattt agtcgaaaca ataatgatcg aatgaaggtt 240
ggaaaagcgc ccaagactag aacccaggat gtttcaggga aggcaacttc attcgcactt 300
catcatgaga agccgatcag ccaaaatggt ggtgtctatg atatggataa catcagcgtg 360
gtaacaccta aacgtgctat tgatattcac cgaggtaaaa gcggaggtgg ctcatcagga 420
tccggtagag tccaaccaac agaatctatt gttagatttc ctaatattac aaacttgtgc 480
ccttttggtg aagtttttaa cgccaccaga tttgcatctg tttatgcttg gaacaggaag 540
agaatcagca actgtgttgc tgattattct gtcctatata attccgcatc attttccact 600
tttaagtgtt atggagtgtc tcctactaaa ttaaatgatc tctgctttac taatgtctat 660
gcagattcat ttgtaattag aggtgatgaa gtcagacaaa tcgctccagg gcaaactgga 720
aagattgctg attataatta taaattacca gatgatttta caggctgcgt tatagcttgg 780
aattctaaca atcttgattc taaggttggt ggtaattata attacctgta tagattgttt 840
aggaagtcta atctcaaacc ttttgagaga gatatttcaa ctgaaatcta tcaggccggt 900
agcacacctt gtaatggtgt tgaaggtttt aattgttact ttcctttaca atcatatggt 960
ttccaaccca ctaatggtgt tggttaccaa ccatacagag tagtagtact ttcttttgaa 1020
cttctacatg caccagcaac tgtttgtgga cctaaaaagt ctactaattt ggttaaaaac 1080
aaatgtgtca atttcggagg tggctcatca ggatcaggtg gtttacccaa taatactgcg 1140
tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa 1200
ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct 1260
accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa atgaaagacc tcagtccaag atggtatttc 1320
tactacctag gaactgggcc agaagctgga cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc 1380
atatgggttg caactgaggg agccttgaat acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat 1440
cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc 1500
ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 1530
<210> 43
<211> 1869
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C7-RBD-GFP
<400> 43
gagagtaaac ggaataagcc agggaaggca acaggtaaag gaaaacctgt caataataag 60
tggttaaata atgcaggtaa agacttaggt tctcctgttc cagatcgtat agctaataaa 120
ctacgtgata aggagtttaa aagtttcgat gattttcgta agaaattctg ggaagaagtg 180
tcaaaagatc ctgagttaag taaacaattt agtcgaaaca ataatgatcg aatgaaggtt 240
ggaaaagcgc ccaagactag aacccaggat gtttcaggga aggcaacttc attcgcactt 300
catcatgaga agccgatcag ccaaaatggt ggtgtctatg atatggataa catcagcgtg 360
gtaacaccta aacgtgctat tgatattcac cgaggtaaaa gcggaggtgg ctcatcagga 420
tccggtagag tccaaccaac agaatctatt gttagatttc ctaatattac aaacttgtgc 480
ccttttggtg aagtttttaa cgccaccaga tttgcatctg tttatgcttg gaacaggaag 540
agaatcagca actgtgttgc tgattattct gtcctatata attccgcatc attttccact 600
tttaagtgtt atggagtgtc tcctactaaa ttaaatgatc tctgctttac taatgtctat 660
gcagattcat ttgtaattag aggtgatgaa gtcagacaaa tcgctccagg gcaaactgga 720
aagattgctg attataatta taaattacca gatgatttta caggctgcgt tatagcttgg 780
aattctaaca atcttgattc taaggttggt ggtaattata attacctgta tagattgttt 840
aggaagtcta atctcaaacc ttttgagaga gatatttcaa ctgaaatcta tcaggccggt 900
agcacacctt gtaatggtgt tgaaggtttt aattgttact ttcctttaca atcatatggt 960
ttccaaccca ctaatggtgt tggttaccaa ccatacagag tagtagtact ttcttttgaa 1020
cttctacatg caccagcaac tgtttgtgga cctaaaaagt ctactaattt ggttaaaaac 1080
aaatgtgtca atttcggagg tcatcatcat caccaccacg gaggtggctc atcaggatca 1140
ggtgcggccg ctatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg 1200
gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc 1260
gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg 1320
ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc 1380
gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag 1440
cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 1500
ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 1560
atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac 1620
aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 1680
gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 1740
cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc 1800
gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag 1860
ctgtacaag 1869
<210> 44
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7启动子亲本序列
<400> 44
gcataat 7
<210> 45
<211> 867
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C7-IL17
<400> 45
atggagagta aacggaataa gccagggaag gcaacaggta aaggaaaacc tgtcaataat 60
aagtggttaa ataatgcagg taaagactta ggttctcctg ttccagatcg tatagctaat 120
aaactacgtg ataaggagtt taaaagtttc gatgattttc gtaagaaatt ctgggaagaa 180
gtgtcaaaag atcctgagtt aagtaaacaa tttagtcgaa acaataatga tcgaatgaag 240
gttggaaaag cgcccaagac tagaacccag gatgtttcag ggaaggcaac ttcattcgca 300
cttcatcatg agaagccgat cagccaaaat ggtggtgtct atgatatgga taacatcagc 360
gtggtaacac ctaaacgtgc tattgatatt caccgaggta aaagcggagg tggctcatca 420
ggatctggtg aaaacctgta ttttcaggga tccggaggtg gctcaggaat cacaatccca 480
cgaaatccag gatgcccaaa ttctgaggac aagaacttcc cccggactgt gatggtcaac 540
ctgaacatcc ataaccggaa taccaatacc aatcccaaaa ggtcctcaga ttactacaac 600
cgatccacct caccttggaa tctccaccgc aatgaggacc ctgagagata tccctctgtg 660
atctgggagg caaagtgccg ccacttgggc tgcatcaacg ctgatgggaa cgtggactac 720
cacatgaact ctgtccccat ccagcaagag atcctggtcc tgcgcaggga gcctccacac 780
tgccccaact ccttccggct ggagaagata ctggtgtccg tgggctgcac ctgtgtcacc 840
ccgattgtcc accatgtggc ctaataa 867
<210> 46
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ColE7-IL17
<400> 46
Met Glu Ser Lys Arg Asn Lys Pro Gly Lys Ala Thr Gly Lys Gly Lys
1 5 10 15
Pro Val Asn Asn Lys Trp Leu Asn Asn Ala Gly Lys Asp Leu Gly Ser
20 25 30
Pro Val Pro Asp Arg Ile Ala Asn Lys Leu Arg Asp Lys Glu Phe Lys
35 40 45
Ser Phe Asp Asp Phe Arg Lys Lys Phe Trp Glu Glu Val Ser Lys Asp
50 55 60
Pro Glu Leu Ser Lys Gln Phe Ser Arg Asn Asn Asn Asp Arg Met Lys
65 70 75 80
Val Gly Lys Ala Pro Lys Thr Arg Thr Gln Asp Val Ser Gly Lys Ala
85 90 95
Thr Ser Phe Ala Leu His His Glu Lys Pro Ile Ser Gln Asn Gly Gly
100 105 110
Val Tyr Asp Met Asp Asn Ile Ser Val Val Thr Pro Lys Arg Ala Ile
115 120 125
Asp Ile His Arg Gly Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Glu
130 135 140
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro
145 150 155 160
Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn
165 170 175
Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr
180 185 190
Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro
195 200 205
Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly
210 215 220
Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro
225 230 235 240
Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro
245 250 255
Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys
260 265 270
Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala
275 280
<210> 47
<211> 7634
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pETDuet-1 HBc-Im7 F->L 6His – tet-可诱导型_ColE7-接头-TEV_位点_hIL17A
<400> 47
gggaattgtg agcggataac aattcccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg 60
agatatacca tggacattga cccgtataaa gaatttggag cttctgtgga gttactctct 120
tttttgcctt ctgacttctt tccttctatt cgagatctcc tcgacaccgc ctcagctctg 180
tatcgggagg ccttagagtc tccggaacat tgttcacctc accatacagc actcaggcaa 240
gctattctgt gttggggtga gttgatgaat ttggccacct gggtgggaag taatttggga 300
ggaggtggaa gcggaggagg tggatctgaa ctgaaaaata gtattagtga ttacacagag 360
gctgagtttg ttcaacttct taaggaaatt gaaaaagaga atgttgctgc aactgatgat 420
gtgttagatg tgttactcga acacctagta aaaattactg agcatccaga tggaacggat 480
ctgatttatt atcctagtga taatagagac gatagccccg aagggattgt caaggaaatt 540
aaagaatggc gagctgctaa cggtaagcca ggatttaaac agggcggagg aggtggaagc 600
ggaggaggtg gatctccagc atccagggaa ttagtagtca gctatgttaa tgttaatatg 660
ggcctaaaaa tcagacaact actgtggttt cacatttcct gtcttacttt tggaagagaa 720
actgttcttg aatatttggt gtcttttgga gtgtggattc gcactcctcc tgcttacaga 780
ccaccaaatg cccctatctt atcaacactt ccggaaacta ctgttgttca tcaccatcat 840
caccactaat aagcggccgc ttaacctagg ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat 900
aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gttgtacacg gccgcataat 960
cggttgacac tctatcattg atagagttat tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa 1020
gtgaaatgaa tagttcgaca aaaatctaga taacgagggc aacatatgga gagtaaacgg 1080
aataagccag ggaaggcaac aggtaaagga aaacctgtca ataataagtg gttaaataat 1140
gcaggtaaag acttaggttc tcctgttcca gatcgtatag ctaataaact acgtgataag 1200
gagtttaaaa gtttcgatga ttttcgtaag aaattctggg aagaagtgtc aaaagatcct 1260
gagttaagta aacaatttag tcgaaacaat aatgatcgaa tgaaggttgg aaaagcgccc 1320
aagactagaa cccaggatgt ttcagggaag gcaacttcat tcgcacttca tcatgagaag 1380
ccgatcagcc aaaatggtgg tgtctatgat atggataaca tcagcgtggt aacacctaaa 1440
cgtgctattg atattcaccg aggtaaaagc ggaggtggct catcaggatc tggtgaaaac 1500
ctgtattttc agggatccgg aggtggctca ggaatcacaa tcccacgaaa tccaggatgc 1560
ccaaattctg aggacaagaa cttcccccgg actgtgatgg tcaacctgaa catccataac 1620
cggaatacca ataccaatcc caaaaggtcc tcagattact acaaccgatc cacctcacct 1680
tggaatctcc accgcaatga ggaccctgag agatatccct ctgtgatctg ggaggcaaag 1740
tgccgccact tgggctgcat caacgctgat gggaacgtgg actaccacat gaactctgtc 1800
cccatccagc aagagatcct ggtcctgcgc agggagcctc cacactgccc caactccttc 1860
cggctggaga agatactggt gtccgtgggc tgcacctgtg tcaccccgat tgtccaccat 1920
gtggcctaat aaggtaccct cgagtctggt aaagaaaccg ctgctgcgaa atttgaacgc 1980
cagcacatgg actcgtctac tagcgcagct taattaacct aggctgctgc caccgctgag 2040
caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa 2100
ggaggaacta tatccggatt ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg 2160
cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc 2220
ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa 2280
atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac 2340
ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt 2400
tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca 2460
accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt 2520
taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta 2580
caatttctgg cggcacgatg gcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 2640
aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctttagg 2700
acccactttc acatttaagt tgtttttcta atccgcagat gatcaattca aggccgaata 2760
agaaggctgg ctctgcacct tggtgatcaa ataattcgat agcttgtcgt aataatggcg 2820
gcatactatc agtagtaggt gtttcccttt cttctttagc gacttgatgc tcttgatctt 2880
ccaatacgca acctaaagta aaatgcccca cagcgctgag tgcatataat gcattctcta 2940
gtgaaaaacc ttgttggcat aaaaaggcta attgattttc gagagtttca tactgttttt 3000
ctgtaggccg tgtacctaaa tgtacttttg ctccatcgcg atgacttagt aaagcacatc 3060
taaaactttt agcgttatta cgtaaaaaat cttgccagct ttccccttct aaagggcaaa 3120
agtgagtatg gtgcctatct aacatctcaa tggctaaggc gtcgagcaaa gcccgcttat 3180
tttttacatg ccaatacaat gtaggctgct ctacacctag cttctgggcg agtttacggg 3240
ttgttaaacc ttcgattccg acctcattaa gcagctctaa tgcgctgtta atcactttac 3300
ttttatctaa tctagacatc attaattcct accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 3360
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 3420
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 3480
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 3540
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 3600
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 3660
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 3720
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 3780
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 3840
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 3900
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 3960
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 4020
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 4080
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 4140
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 4200
ttcaatcatg attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 4260
tgtatttaga aaaataaaca aataggtcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt 4320
ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct 4380
gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc 4440
ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc 4500
aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc 4560
gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc 4620
gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg 4680
aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata 4740
cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta 4800
tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc 4860
ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg 4920
atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt 4980
cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt 5040
ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 5100
gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgcctg atgcggtatt ttctccttac 5160
gcatctgtgc ggtatttcac accgcatata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat 5220
gccgcatagt taagccagta tacactccgc tatcgctacg tgactgggtc atggctgcgc 5280
cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 5340
cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 5400
caccgaaacg cgcgaggcag ctgcggtaaa gctcatcagc gtggtcgtga agcgattcac 5460
agatgtctgc ctgttcatcc gcgtccagct cgttgagttt ctccagaagc gttaatgtct 5520
ggcttctgat aaagcgggcc atgttaaggg cggttttttc ctgtttggtc actgatgcct 5580
ccgtgtaagg gggatttctg ttcatggggg taatgatacc gatgaaacga gagaggatgc 5640
tcacgatacg ggttactgat gatgaacatg cccggttact ggaacgttgt gagggtaaac 5700
aactggcggt atggatgcgg cgggaccaga gaaaaatcac tcagggtcaa tgccagcgct 5760
tcgttaatac agatgtaggt gttccacagg gtagccagca gcatcctgcg atgcagatcc 5820
ggaacataat ggtgcagggc gctgacttcc gcgtttccag actttacgaa acacggaaac 5880
cgaagaccat tcatgttgtt gctcaggtcg cagacgtttt gcagcagcag tcgcttcacg 5940
ttcgctcgcg tatcggtgat tcattctgct aaccagtaag gcaaccccgc cagcctagcc 6000
gggtcctcaa cgacaggagc acgatcatgc tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc 6060
tgactgggtt gaaggctctc aagggcatcg gtcgagatcc cggtgcctaa tgagtgagct 6120
aacttacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 6180
agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgccagg 6240
gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc aacagctgat tgcccttcac cgcctggccc 6300
tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgctg gtttgcccca gcaggcgaaa atcctgtttg 6360
atggtggtta acggcgggat ataacatgag ctgtcttcgg tatcgtcgta tcccactacc 6420
gagatgtccg caccaacgcg cagcccggac tcggtaatgg cgcgcattgc gcccagcgcc 6480
atctgatcgt tggcaaccag catcgcagtg ggaacgatgc cctcattcag catttgcatg 6540
gtttgttgaa aaccggacat ggcactccag tcgccttccc gttccgctat cggctgaatt 6600
tgattgcgag tgagatattt atgccagcca gccagacgca gacgcgccga gacagaactt 6660
aatgggcccg ctaacagcgc gatttgctgg tgacccaatg cgaccagatg ctccacgccc 6720
agtcgcgtac cgtcttcatg ggagaaaata atactgttga tgggtgtctg gtcagagaca 6780
tcaagaaata acgccggaac attagtgcag gcagcttcca cagcaatggc atcctggtca 6840
tccagcggat agttaatgat cagcccactg acgcgttgcg cgagaagatt gtgcaccgcc 6900
gctttacagg cttcgacgcc gcttcgttct accatcgaca ccaccacgct ggcacccagt 6960
tgatcggcgc gagatttaat cgccgcgaca atttgcgacg gcgcgtgcag ggccagactg 7020
gaggtggcaa cgccaatcag caacgactgt ttgcccgcca gttgttgtgc cacgcggttg 7080
ggaatgtaat tcagctccgc catcgccgct tccacttttt cccgcgtttt cgcagaaacg 7140
tggctggcct ggttcaccac gcgggaaacg gtctgataag agacaccggc atactctgcg 7200
acatcgtata acgttactgg tttcacattc accaccctga attgactctc ttccgggcgc 7260
tatcatgcca taccgcgaaa ggttttgcgc cattcgatgg tgtccgggat ctcgacgctc 7320
tcccttatgc gactcctgca ttaggaagca gcccagtagt aggttgaggc cgttgagcac 7380
cgccgccgca aggaatggtg catgcaagga gatggcgccc aacagtcccc cggccacggg 7440
gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc gctcatgagc ccgaagtggc gagcccgatc 7500
ttccccatcg gtgatgtcgg cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg cgccggtgat 7560
gccggccacg atgcgtccgg cgtagaggat cgagatcgat ctcgatcccg cgaaattaat 7620
acgactcact atag 7634
<210> 48
<211> 7700
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DU70612. pETDuet-1 HBc-Im7 F->L 6His – tet-可诱导型_ColE7-接头-TEV_位点_mIL33
<400> 48
ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag 60
gagatatacc atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc 120
ttttttgcct tctgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctcagctct 180
gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca 240
agctattctg tgttggggtg agttgatgaa tttggccacc tgggtgggaa gtaatttggg 300
aggaggtgga agcggaggag gtggatctga actgaaaaat agtattagtg attacacaga 360
ggctgagttt gttcaacttc ttaaggaaat tgaaaaagag aatgttgctg caactgatga 420
tgtgttagat gtgttactcg aacacctagt aaaaattact gagcatccag atggaacgga 480
tctgatttat tatcctagtg ataatagaga cgatagcccc gaagggattg tcaaggaaat 540
taaagaatgg cgagctgcta acggtaagcc aggatttaaa cagggcggag gaggtggaag 600
cggaggaggt ggatctccag catccaggga attagtagtc agctatgtta atgttaatat 660
gggcctaaaa atcagacaac tactgtggtt tcacatttcc tgtcttactt ttggaagaga 720
aactgttctt gaatatttgg tgtcttttgg agtgtggatt cgcactcctc ctgcttacag 780
accaccaaat gcccctatct tatcaacact tccggaaact actgttgttc atcaccatca 840
tcaccactaa taagcggccg cttaacctag gctgctgcca ccgctgagca ataactagca 900
taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgttgtacac ggccgcataa 960
tcggttgaca ctctatcatt gatagagtta ttttaccact ccctatcagt gatagagaaa 1020
agtgaaatga atagttcgac aaaaatctag ataacgaggg caacatatgg agagtaaacg 1080
gaataagcca gggaaggcaa caggtaaagg aaaacctgtc aataataagt ggttaaataa 1140
tgcaggtaaa gacttaggtt ctcctgttcc agatcgtata gctaataaac tacgtgataa 1200
ggagtttaaa agtttcgatg attttcgtaa gaaattctgg gaagaagtgt caaaagatcc 1260
tgagttaagt aaacaattta gtcgaaacaa taatgatcga atgaaggttg gaaaagcgcc 1320
caagactaga acccaggatg tttcagggaa ggcaacttca ttcgcacttc atcatgagaa 1380
gccgatcagc caaaatggtg gtgtctatga tatggataac atcagcgtgg taacacctaa 1440
acgtgctatt gatattcacc gaggtaaaag cggaggtggc tcatcaggat ctggtgaaaa 1500
cctgtatttt cagggatcca gcattcaggg caccagcctg ctgacccaga gcccggcgag 1560
cctgagcacc tataacgatc agagcgtgag ctttgtgctg gaaaacggct gctatgtgat 1620
taacgtggat aaaagcggca aagatcagga acaggatcag gtgctgctgc gctattataa 1680
aagcccgtgc ccggcgagcc agagcggcga tggcgtggat ggcaagaaac tgatggtgaa 1740
catgagcccg attaaagata ccgatatttg gctgcatgcg aacgataaag attatagcgt 1800
ggaactgcag cgcggcgatg tgagcccgcc agaacaggcg ttctttgtgc tgcataagaa 1860
aagcagcgat tttgtgagct ttgaatgcaa aaacctgccg ggcacctata ttggcgtgaa 1920
agataaccag ctggcgctgg tggaagagaa agatgaaagc tgcaacaaca ttatgtttaa 1980
actgagcaaa atttaataag gtaccctcga gtctggtaaa gaaaccgctg ctgcgaaatt 2040
tgaacgccag cacatggact cgtctactag cgcagcttaa ttaacctagg ctgctgccac 2100
cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt 2160
gctgaaagga ggaactatat ccggattggc gaatgggacg cgccctgtag cggcgcatta 2220
agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg 2280
cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 2340
gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 2400
aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 2460
cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 2520
acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 2580
tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta 2640
acgtttacaa tttctggcgg cacgatggca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 2700
tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 2760
ctttaggacc cactttcaca tttaagttgt ttttctaatc cgcagatgat caattcaagg 2820
ccgaataaga aggctggctc tgcaccttgg tgatcaaata attcgatagc ttgtcgtaat 2880
aatggcggca tactatcagt agtaggtgtt tccctttctt ctttagcgac ttgatgctct 2940
tgatcttcca atacgcaacc taaagtaaaa tgccccacag cgctgagtgc atataatgca 3000
ttctctagtg aaaaaccttg ttggcataaa aaggctaatt gattttcgag agtttcatac 3060
tgtttttctg taggccgtgt acctaaatgt acttttgctc catcgcgatg acttagtaaa 3120
gcacatctaa aacttttagc gttattacgt aaaaaatctt gccagctttc cccttctaaa 3180
gggcaaaagt gagtatggtg cctatctaac atctcaatgg ctaaggcgtc gagcaaagcc 3240
cgcttatttt ttacatgcca atacaatgta ggctgctcta cacctagctt ctgggcgagt 3300
ttacgggttg ttaaaccttc gattccgacc tcattaagca gctctaatgc gctgttaatc 3360
actttacttt tatctaatct agacatcatt aattcctacc aatgcttaat cagtgaggca 3420
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 3480
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 3540
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 3600
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 3660
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 3720
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 3780
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 3840
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 3900
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 3960
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 4020
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 4080
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 4140
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 4200
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 4260
ttcctttttc aatcatgatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 4320
atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggtcatgac caaaatccct taacgtgagt 4380
tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 4440
tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 4500
gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 4560
agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 4620
tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 4680
ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 4740
cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 4800
tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 4860
acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 4920
gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 4980
ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 5040
tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5100
attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 5160
cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc 5220
tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg tgcactctca gtacaatctg 5280
ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg 5340
gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg 5400
gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca 5460
ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct catcagcgtg gtcgtgaagc 5520
gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt tgagtttctc cagaagcgtt 5580
aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg ttttttcctg tttggtcact 5640
gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa tgataccgat gaaacgagag 5700
aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga acgttgtgag 5760
ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca gggtcaatgc 5820
cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca tcctgcgatg 5880
cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg tttccagact ttacgaaaca 5940
cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag acgttttgca gcagcagtcg 6000
cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac cagtaaggca accccgccag 6060
cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgctag tcatgccccg cgcccaccgg 6120
aaggagctga ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gagatcccgg tgcctaatga 6180
gtgagctaac ttacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 6240
tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 6300
cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc 6360
ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc 6420
ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc 6480
cactaccgag atgtccgcac caacgcgcag cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc 6540
cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat cgcagtggga acgatgccct cattcagcat 6600
ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc actccagtcg ccttcccgtt ccgctatcgg 6660
ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg ccagccagcc agacgcagac gcgccgagac 6720
agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat ttgctggtga cccaatgcga ccagatgctc 6780
cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc 6840
agagacatca agaaataacg ccggaacatt agtgcaggca gcttccacag caatggcatc 6900
ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg 6960
caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc 7020
acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc 7080
cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac 7140
gcggttggga atgtaattca gctccgccat cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc 7200
agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg ggaaacggtc tgataagaga caccggcata 7260
ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt cacattcacc accctgaatt gactctcttc 7320
cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt tttgcgccat tcgatggtgt ccgggatctc 7380
gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc cagtagtagg ttgaggccgt 7440
tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat gcaaggagat ggcgcccaac agtcccccgg 7500
ccacggggcc tgccaccata cccacgccga aacaagcgct catgagcccg aagtggcgag 7560
cccgatcttc cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca cctgtggcgc 7620
cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcga gatcgatctc gatcccgcga 7680
aattaatacg actcactata 7700

Claims (39)

1.一种病毒样颗粒(VLP)，其包含：
-一个或多个乙型肝炎衣壳蛋白
-一个或多个结合蛋白对，每个结合蛋白对包含第一结合蛋白和第二结合蛋白，其中所述结合蛋白对包含细菌毒素及其抑制剂
-一个或多个功能性分子
其中每个乙型肝炎衣壳蛋白附着于第一结合蛋白，其中每个功能性分子附着于第二结合蛋白，并且其中所述第一结合蛋白和第二结合蛋白彼此结合。
2.根据权利要求1所述的VLP，其中所述第一结合蛋白是细菌毒素抑制剂，并且所述第二结合蛋白是细菌毒素。
3.根据权利要求1或2所述的VLP，其中每个功能性分子通过第三结合蛋白间接附着于第二结合蛋白，优选地，所述第三结合蛋白是蛋白G。
4.根据权利要求1、2或3所述的VLP，其中所述第一结合蛋白包含化学修饰，任选地，其中所述化学修饰附着于第二功能性分子。
5.根据前述权利要求中任一项所述的VLP，其中每个功能性分子可以相同或不同，优选地，其中所述功能性分子选自：蛋白质或非蛋白质抗原或其表位、抗原结合蛋白或荧光分子。
6.根据权利要求3所述的VLP，其中每个功能性分子是抗原结合蛋白，优选地，其中所述抗原结合蛋白选自抗体或其结合片段、抗体模拟物和适体，优选地，其中所述抗原结合蛋白是抗体，优选地是能够结合目的抗原的抗体。
7.一种病毒样颗粒(VLP)，其包含：
-一个或多个病毒衣壳蛋白
-一个或多个第一结合蛋白，其包含化学修饰，其中每个第一结合蛋白是细菌毒素抑制剂；
-一个或多个功能性分子
其中每个病毒衣壳蛋白附着于第一结合蛋白，并且其中每个化学修饰附着于功能性分子。
8.根据权利要求7所述的VLP，其中所述病毒衣壳蛋白是乙型肝炎衣壳蛋白。
9.根据权利要求7或8所述的VLP，其进一步包含第二结合蛋白，其中所述第二结合蛋白与所述第一结合蛋白结合，任选地，其中所述第二结合蛋白附着于第二功能性分子。
10.根据权利要求9所述的VLP，其中所述第二结合蛋白是细菌毒素，优选地是与细菌毒素抑制剂结合的细菌毒素。
11.根据权利要求9或10所述的VLP，其中每个第二功能性分子通过第三结合蛋白间接附着于第二结合蛋白，优选地，所述第三结合蛋白是蛋白G。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的VLP，其中每个功能性分子可以相同或不同，优选地，其中所述功能性分子选自：蛋白质或非蛋白质抗原或其表位、抗原结合蛋白或荧光分子。
13.根据权利要求11所述的VLP，其中所述每个功能性分子是抗原结合蛋白，优选地，其中所述抗原结合蛋白选自抗体或其结合片段、抗体模拟物和适体，优选地，其中所述抗原结合蛋白是抗体，优选地是能够结合目的抗原的抗体。
14.根据前述权利要求中任一项所述的VLP，其中所述细菌毒素抑制剂选自Im7、Im8、Im9、Im2和Barstar。
15.根据权利要求1-6或10-14中任一项所述的VLP，其中所述细菌毒素是细菌核酸酶，优选地选自：ColE7、ColE8、ColE9、ColE2和Barnase。
16.根据权利要求1-6或10-15中任一项所述的VLP，其中所述细菌毒素及其抑制剂是Barnase和Barstar，优选地，其中Barstar的氨基酸序列包含一个或多个以下取代：C40A、C82A和I87E，和/或其中Barnase的氨基酸序列包含以下取代：E73W。
17.根据权利要求1-6或10-15中任一项所述的VLP，其中所述细菌毒素及其抑制剂是ColE7和Im7，优选地，其中Im7的氨基酸序列包含以下取代：F41L，和/或其中ColE7的氨基酸序列包含一个或多个以下取代：Arg538Ala、Glu542Ala和His569Ala。
18.根据权利要求1-6或8-17中任一项所述的VLP，其中所述第一结合蛋白被插入到所述乙型肝炎衣壳蛋白的主要免疫显性区域中，优选地，所述第一结合蛋白被插入到所述乙型肝炎衣壳蛋白的主要免疫显性区域的氨基酸残基76和80之间。
19.根据权利要求1-6或8-18中任一项所述的VLP，其中所述乙型肝炎衣壳蛋白包含具有以下氨基酸缺失的氨基酸序列：E77和D78。
20.根据权利要求4-19中任一项所述的VLP，其中所述化学修饰是具有胺基的烷烃，优选地具有胺基的1-10个碳的烷烃，优选地，其中所述化学修饰选自DEAE或辛胺。
21.根据权利要求5或12所述的VLP，其中所述非蛋白质抗原选自：糖、脂质、碳水化合物或小分子化学品。
22.根据权利要求5或12所述的VLP，其中所述蛋白质抗原源自感染因子，优选地，其中所述蛋白质抗原源自病毒、细菌、真菌、原生动物、古细菌，优选地，其中所述蛋白质抗原源自病毒，优选地，其中所述病毒选自：腺相关病毒、基孔肯雅病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、埃可病毒、脑心肌炎病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、汉坦病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人腺病毒、人星状病毒、人冠状病毒、人巨细胞病毒、人肠道病毒、人疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、人副流感病毒、人呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、人环曲病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、日本脑炎病毒、多瘤病毒、昆津病毒、拉沙病毒、麻疹病毒、传染性软疣病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、A类轮状病毒、B类轮状病毒、C类轮状病毒、风疹病毒、鹭山病毒、Salivirus A、札幌病毒、辛德毕斯病毒、托斯卡纳病毒、乌库涅米病毒、水痘-带状疱疹病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、水泡性口炎病毒、西部马脑炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、寨卡病毒，优选地，其中所述蛋白质抗原源自冠状病毒，优选地源自SARS-CoV-2，优选地，所述蛋白质抗原是源自SARS-CoV-2的刺突蛋白的全部或部分，或者是源自SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的全部或部分。
23.根据权利要求5或12所述的VLP，其中所述蛋白质抗原源自非感染因子，优选地，其中所述蛋白质抗原源自炎性分子、引起神经、软骨或骨组织退行性变化的分子或引起肿瘤疾病恶化的分子，优选地，其中所述蛋白质抗原是选自趋化因子、细胞因子或蛋白酶的炎性分子，优选地，其中所述蛋白质抗原选自：IL1、IL2、Il3、Il4、IL5、Il6、Il7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL17、IL33、TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、红细胞生成素和TGFβ，优选地，其中所述蛋白质抗原是IL13、IL17或IL33的全部或部分。
24.根据权利要求5或12所述的VLP，其中所述荧光分子选自：GFP、EBFP、EBFP2、Azurite、GFPuv、T-saphhire、Cerulean、CFP、mCFP、mTurquoise2、CyPet、mKeima-red、tagCFP、AmCyan1、mTFP1、midoriishi cyan、turboGFP、tagGFP、emerald、azami green、ZsGreen1、YFP、tagYFP、EYFP、topaz、venus、mCtrine、YPet、turboYFP、ZsYellow1、KusabiraOrange、mOrange、别藻蓝蛋白、mkO、RFP、turboRFP、tdTomato、tagRFP、dsRed、mStrawberry、turboFP602、asRed2、J-red、R-藻红蛋白、B-藻红蛋白、mCherry、HcRed、Katusha、P3、多甲藻黄素-叶绿素、mKate、turboFP635、mPlum、mRaspberry，优选地，其中所述荧光分子是GFP。
25.一种衣壳融合蛋白，其包含与结合蛋白融合的病毒衣壳蛋白，其中所述结合蛋白是细菌毒素抑制剂。
26.一种功能性融合蛋白，其包含与结合蛋白融合的功能性分子，其中所述结合蛋白是细菌毒素。
27.一种功能性融合蛋白，其包含与另一结合蛋白融合的第一结合蛋白，其中所述第一结合蛋白是细菌毒素，并且所述另一结合蛋白能够与功能性分子结合，所述功能性分子是抗原结合蛋白。
28.一种或多种核酸，其编码根据权利要求25所述的衣壳融合蛋白或根据权利要求26或27所述的功能性融合蛋白。
29.一种或多种载体，其包含根据权利要求28所述的一种或多种核酸。
30.一种宿主细胞，其包含根据权利要求28所述的一种或多种核酸或根据权利要求29所述的一种或多种载体。
31.一种宿主细胞，其包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含编码附着于第一结合蛋白的乙型肝炎衣壳蛋白的第一核酸；和编码附着于第二结合蛋白的功能性分子的第二核酸；其中所述第一结合蛋白和第二结合蛋白能够彼此结合。
32.一种宿主细胞，其包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含编码附着于第一结合蛋白的病毒衣壳蛋白的第一核酸；和编码功能性分子的第二核酸；其中所述功能性分子能够通过第一结合蛋白的化学修饰与第一结合蛋白结合。
33.一种在单一宿主细胞中生产病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：
(a)提供包含一种或多种载体的宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)第一核酸，其编码附着于第一结合蛋白的病毒衣壳蛋白；和
(ii)(a)第二核酸，其编码任选地附着于第二结合蛋白的功能性分子；
和/或
(b)第三核酸，其编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白；
(b)在分别表达来自第一、第二和/或第三核酸的蛋白质的条件下培养宿主细胞；
(c)从蛋白质形成病毒样颗粒。
34.一种生产病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：
(a)提供包含一种或多种载体的第一宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)第一核酸，其编码附着于第一结合蛋白的乙型肝炎衣壳蛋白，其中
所述第一结合蛋白是细菌毒素抑制剂；
(b)提供包含一种或多种载体的一种或多种另外的宿主细胞，其中所述一种或多种载体包含：
(i)第二核酸，其编码任选地附着于第二结合蛋白的功能性分子，其中
所述第二结合蛋白是细菌毒素；和/或
(ii)第三核酸，其编码附着于第三结合蛋白的第二结合蛋白，其中所述第二结合蛋白是细菌毒素；
(c)在分别表达来自第一、第二和/或第三核酸的蛋白质的条件下培养宿主细胞；
(d)回收蛋白质；
(e)混合蛋白质形成病毒样颗粒。
35.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求1-25中任一项所述的病毒样颗粒。
36.根据权利要求1-24中任一项所述的病毒样颗粒(VLP)或根据权利要求35所述的免疫原性组合物，其用作药物。
37.根据权利要求1-24中任一项所述的病毒样颗粒(VLP)或根据权利要求35所述的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗传染性疾病、心血管疾病、癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、神经性疾病、风湿退行性疾病或成瘾。
38.根据权利要求1-24中任一项所述的病毒样颗粒(VLP)在研究或疾病诊断中的用途。
39.一种诊断受试者疾病的方法，其包括：
(a)提供根据权利要求1-24中任一项所述的病毒样颗粒，其中所述功能性分子是针对源自致病因子的抗原的抗体；
(b)将所述病毒样颗粒与来自所述受试者的合适样品混合；
(c)检测所述病毒样颗粒是否沉淀；
(d)如果VLP沉淀，则诊断疾病的存在。
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