KR100991679B1 - 안정화 면역원성 ＨＢｃ 키메라 입자 - Google Patents

안정화 면역원성 ＨＢｃ 키메라 입자 Download PDF

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Abstract

본원에는 자가 어셈블리된 입자의 안정성을 증강시키고 이들 입자에 의한 핵산 결합이 실질적으로 존재하지 않도록 하기 위해 공학적으로 처리시킨, 키메라성의 카복시-말단 절단된 B형 간염 바이러스 뉴클레오캡시드(코어) 단백질(HBc)이 기재되어 있다. 이러한 키메라 단백질 분자는 HBc의 N-말단, 면역원성 루프 또는 C-말단 중의 하나 이상과 펩티드 결합된 1개 이상의 면역원성 에피토프를 포함할 수 있다. 자가 어셈블리된 입자의 안정성 증강은, 키메라 분자의 아미노-말단과 카복시-말단 중의 하나 또는 둘 다 근처에 1개 이상의 이종 시스테인 잔기가 존재하고, HBc 위치 48 및 107에서 본래의 서열 내에 존재하는 시스테인 잔기가 부재함으로써 획득된다.
재조합 B형 간염 코어(HBc) 키메라 단백질 분자, 자가 어셈블리된 입자, B형 간염 바이러스, 뉴클레오캡시드

Description

안정화 면역원성 ＨＢｃ 키메라 입자{Stabilized immunogenic HBc chimer particles}
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2002년 2월 21일자로 출원된 미국 특허원 제10/080,299호 및 2002년 2월 21일자로 출원된 미국 특허원 제10/082,014호의 부분 계속 출원으로서, 2002년 10월 21일자로 출원된 미국 특허원 제10/274,616호의 부분 계속 출원이고 2002년 12월 10일자로 출원된 미국 가특허원 제60/432,123호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 면역학 분야와 단백질 공학 분야의 공통 부분에 관한 것이고, 특히 백신에서 면역원으로서 유용하고, C-말단 및 N-말단 시스테인 잔기 중의 하나 또는 둘 다를 함유하며 HBc 위치 48 및 107에서 본래 서열 내에 존재하는 시스테인 잔기 중의 하나 또는 둘 다를 대체시킨 키메라 B형 간염 바이러스(HBV) 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질(HBc)에 관한 것이다.
헤파드나비리대(hepadnaviridae) 과는 사람에게서 B형 간염을 유발시킬 수 있는 외피 DNA-함유 동물 바이러스(HBV)이다. 이러한 헤파드나비리대 과에는 기타 포유류의 B형 간염 바이러스, 예를 들면, 우드척(woodchuck; WHV), 땅 다람쥐(GSHV), 및 오리(DHV) 및 백로(HeHV)에서 발견되는 조류 바이러스가 포함된다. 본원에서 사용된 B형 간염 바이러스(HBV)는, 이에 대한 논의가 비-포유류 바이러스의 특정 예로 지칭되지 않는다면, 조류 숙주를 감염시키는 바이러스와 비교해서 포유류를 감염시키는 헤파드나비리대 과의 구성원을 지칭한다.
포유류 B형 간염 바이러스(HBV 또는 헤파드나바이러스)의 뉴클레오캡시드 또는 코어는 바이러스 아유형에 따라서 183 또는 185개 아미노산 잔기 서열을 함유하는 반면, 오리 바이러스 캡시드는 262개 아미노산 잔기를 함유한다. 몇몇 헤파드나비리대의 B형 간염 코어 단백질 단량체는 감염된 세포에서, B형 간염 코어 단백질 입자(HBc 입자)로서 공지된 안정한 응집체로 자가 어셈블리(self-assemble)된다. 2가지의 3차원적 구조물이 HBc 입자에 대해 보고되었다. 소수 집단을 차지하는 첫 번째 것은 이량체로서 HBc 서브유니트 단백질의 90개 복사물을 함유하거나 180개의 개별적인 단량체성 단백질을 함유하고; 주 집단을 차지하는 두 번째 것은 이량체로서 HBc 서브유니트 단백질의 120개 복사물을 함유하거나 240개의 개별적인 단량체성 단백질을 함유한다. 이들 입자는 각각 T=3 또는 T=4 입자로서 지칭되는데, 여기서 "T"는 삼각 측량수(triangulation number)이다. 사람 감염성 바이러스(사람 바이러스)의 이들 HBc 입자는 직경이 각각 약 30 또는 34nm이다[참조: Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74; and Metzger et al. (1998) J. Gen. Viol., 79:587-590].
문헌[참조: Conway et al., (1997) Nature, 386:91-94]에는 극저온-전자 현 미경으로부터 결정된 바와 같이, 9Å 해상능에서의 사람 HBc 입자의 구조가 기재되어 있다. 문헌[참조: Bottcher et al. (1997), Nature, 386:88-91]에는 사람 HBc 단량체에 대한 폴리펩티드 폴딩이 기재되어 있고, 이에는 알파-나선상 영역과 이들의 연결성 루프 영역이 형성되는 아미노산 잔기에 대한 대략적인 넘버링 도식이 제공되어 있다. 문헌[참조: Zheng et al. (1992), J. Biol. Chem., 267(13):9422-9429]에는 코어 입자 형성이, 하나 이상의 시스테인이 결여된 돌연변이체 단백질에 관한 연구와 C-말단-절단된 단백질에 관한 기타 연구 결과[참조: Birnbaum et al., (1990) J. Virol. 64, 3319-3330]에 근거한 디설파이드 결합 형성이나 핵산 결합, 또는 아르기닌 풍부한 C-말단 도메인에 좌우되지 않는다고 보고되어 있다.
B형 간염 뉴클레오캡시드 또는 바이러스 코어 단백질(HBc)은 면역된 숙주 동물의 T 세포 반응을 자극하는 면역원성 수송체 잔기로서 보고된 바 있다[참조: 미국 특허 제4,818,527호, 제4,882,145호 및 제5,143,726호]. 특히 유용한 상기 수송체의 적용 특성은 해당 단백질의 아미노 말단(N-말단)으로부터 대략 잔기 위치 70 내지 90, 보다 통상적으로는 약 위치 75 내지 85로 언급되는 잔기에 존재하는 면역우성 루프의 부위에 외래 또는 이종 B 세포 에피토프를 제공할 수 있는 상기 수송체의 능력이다[참조: Clarke et al. (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.313-318].
바이러스 복제 동안, HBV 뉴클레오캡시드는 바이러스성 RNA 프리-게놈(pre-genome), 바이러스성 역전사효소(Pol) 및 말단 단백질(Pol로부터 유도됨)과 연합하여 복제 적격한 코어를 형성한다. 상기 뉴클레오캡시드와 바이러스성 RNA 프리-게 놈과의 연합은 카복실 말단(C-말단)에서의 아르기닌-풍부한 도메인에 의해 매개된다. 이종 발현 시스템, 예를 들면, 바이러스성 RNA 프리-게놈이 존재하지 않는 이. 콜리(E. coli)에서 발현되는 경우에는, 프로타민-유사 C-말단, 즉 위치 150 내지 183에서의 잔기가 이. 콜리 RNA와 결합될 수 있다[참조: Zhang et al. (1992) JBC, 267(13) 9422-29].
HBcAg는 이종 에피토프에 대한 수송체로서 제안된 바 있는 B형 간염 바이러스로부터 유도된 미립형 단백질이다. HBsAg(HBs)의 상대적 면역원성을 HBcAg(HBc)와 비교하였고, 상이한 유전적 배경에서 면역 반응을 유발시킬 수 있는 각각의 능력을 비교하였다[참조: Milich et al., Science, (1986) 234 (4782): 1398-1401]. 이들 데이터는 유전적 배경과 무관하게, HBs에 비해 보다 높은 HBc의 면역원성과, HBc에 대한 만능 반응성을 강조하고 있다.
예를 들어, HBc는 BALB/c 마우스에서 HBs 보다 300배 이상 더 면역원성이고; B10.S 마우스와 B10.M 마우스 둘 다가 HBs에 대해 비-반응인자이긴 하지만, 시험된 모든 종은 HBc에 대해 반응성이다. 이들 결과는 HBc가 백신 수송체로서 적합하다는 사실, 구체적으로 언급하면 HBs에 비해 탁월하므로, 이종 에피토프를 수송하기 위해서는 HBs와 달리 HBc를 선택해야 한다는 사실을 재차 강조하고 있다.
HBc 수송체의 또 다른 이점은 이것이 효능을 위해 강력한 아주반트(adjuvant: 보조제)를 요구할 수 없다는 사실이다. 이는 상기 입자의 높은 고유 면역원성에 기인한다. HBc-피. 베르그헤이(P. berghei) 입자의 면역원성을 비교한 결과, 사람 용도로 승인된 백반이 IFA 또는 CFA 보다 더 효과적이란 사실이 밝혀졌 다[참조: Schodel et al., J. Exp. Med., (1994) 180 (3): p. 1037-46]. 이러한 관찰 결과의 중요성은 SKB의 후보 말라리아 백신의 임상 시험에서 최근에 인지된 바와 같이, 보다 신규하고 복잡한 아주반트와 연관된 독성 문제점에 의해 고조된다[참조: Stoute et al., N. Engl. J. Med., [1997] 336 (2): p. 86-91].
백신 수송체 잔기로서 적용하는 경우에는, HBV 뉴클레오캡시드가 해당 숙주로부터 유도된 핵산과 결합하지 않는 것이 바람직하다. 문헌[참조: Birnbaum et al. (1990) J. Virol., 64:3319-3330]에는 HBV 뉴클레오캡시드의 프로타민-유사 C-말단 도메인이, 바이러스-유사 입자로 어셈블리시킬 수 있는 상기 단백질의 능력을 방해하지 않으면서 결실될 수 있다는 사실이 보고되었다. 따라서, 약 위치 144에서 절단된 단백질, 즉 위치 1에서부터 약 144까지의 HBc 서열을 함유하는 단백질은 자가-어셈블리할 수 있는 반면, 잔기 139를 벗어나는 결실물은 캡시드 어셈블리를 상실한다고 보고되었다[참조: Birnbaum et al., (1990) J. Virol., 64:3319-3330; Seifer et al., (1995) Intervirology, 38: 47-62].
문헌[참조: Zlotnick et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:9556-9561]에는 완전한 길이의 HBc 단백질과 절단된 HBc 단백질을 입자로 어셈블리하는 것에 관한 연구가 기재되어 있다. 완전한 길이의 분자에 관한 논의 이외에도, 상기 문헌의 저자는 위치 1에서부터 149까지의 HBc 서열[여기서, 위치 48, 61 및 107에서의 시스테인이 각각 알라닌으로 대체되고 특정의 시스테인 잔기가 C-말단(위치 150)에 부가된다]을 함유하는 절단된 단백질의 제조 방법에 관해 보고하였다. 이러한 C-말단 머캅탄은 전자 현미경에서의 표지화를 위해 금 원자 클러스 터(cluster)에 연결하기 위해 사용된다.
보다 최근에, 문헌[참조: Metzger et al. (1998) J. Gen. Viol., 79:587-590]에는 사람 바이러스성 서열의 위치 138의 프롤린(Pro-138 또는 P138)이 입자 형성에 요구된다고 보고되었다. 상기 저자는 또한, 카복시 말단에서 142 및 140 잔기 길이로 절단된 입자의 어셈블리 능력에도 영향을 미친다고 보고하였는데, 이러한 어셈블리 능력은 139 및 137 잔기 길이로 절단되는 경우에는 완전히 상실된다.
몇몇 그룹을 대상으로 한 연구에서는, 절단된 입자가 표준 B형 간염 코어 입자에 비해 저하된 안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌는데[참조: Galena et al. (1989) J. Virol., 63:4645-4652; Inada, et al. (1989) Virus Res., 14:27-48], 이는 정제된 제제 내에서의 입자 단편의 존재 여부와 입자 크기의 가변성으로써 명백히 알 수 있다[참조: Maassen et al., (1994) Arch. Virol., 135:131-142]. 따라서, 상기 메츠거(Metzger) 등의 보고서가 발표되기 이전의 문헌[참조: Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74]에는 자가 어셈블리에 요구되는 HBc 서열에 대한 카복시 말단 경계가 아미노산 잔기 139와 144 사이에 위치하고, 첫 번째 2개 또는 3개의 아미노 말단 잔기가 다른 서열로써 대체될 수 있지만, 4개 또는 11개 아미노 말단 잔기를 없애면, 형질전환된 이. 콜리 세포 내에서의 키메라 단백질이 완전히 소멸되는 결과가 초래된다고 보고되었다.
각종의 폴리펩티드 서열의 내부 삽입물을 보유하는 재조합적으로 생성된 하이브리드 HBc 입자(당해 분야에서는 HBc 키메라 입자 또는 HBc 키메라로서 지칭됨) 가, 이. 콜리, 비. 서브틸리스(B. subtilis), 백시니아(Vaccinia), 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 포함한 광범위한 유기체에서의 이종 발현에 의해 제조되었다[참조: 예를 들면, Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74, 및 몇 가지 조사 그룹 연구 결과를 나타내는 인용문헌].
이러한 HBc 키메라는 종종, 전자 현미경으로 분석한 경우에, 이종 에피토프가 결여된 입자와 비교해서 덜 정렬된 구조를 나타내는 것으로 여겨진다[참조: Schodel et al., (1994) J. Exp. Med., 180:1037-1046]. 몇몇 경우에는, 이종 에피토프를 C-말단적으로 절단된 HBc 입자 내로 삽입하는 것이, 하이브리드 입자를 이종 발현 후에 회수할 수 없도록 하는 극적인 탈안정화 효과를 나타낸다[참조: Schodel et al. (1994) Infect. Immunol., 62: 1669-1676]. 따라서, 많은 키메라 HBc 입자는 너무 불안정하여, 이들이 회수 불가능한 정도 또는 이들이 극히 불량한 안정성 특징을 나타내는 정도로 정제 동안 격리되기 때문에, 이들을 대상으로 하여 백신 개발하는데 있어 문제가 있다.
상기 펌펜스(Pumpens) 등의 보고서[참조: Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74]에는 상기 삽입된 폴리펩티드 서열이 N-말단, C-말단 및 상기 말단들 사이에 존재하는 입자-형성 키메라가 열거되어 있다. 상기 문헌에 보고된 삽입물 길이는 N-말단에서 24 내지 50개 잔기, 내부적으로 7 내지 43개 잔기, 및 C-말단에서 11 내지 741개 잔기이다.
최근, 문헌[참조: Kratz et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:1915-1920]에는 238-잔기 녹색 형광성 단백질(GFP)과 내부적으로 융합된 절단된 HBc 서열로 구성된 키메라 HBc 입자의 이. 콜리 발현이 기재되어 있다. 이러한 키메라는 HBc의 아미노산 잔기 79 및 80을 대체하는 한 쌍의 글리신 풍부한 가요성 링커 암(arm)에 의해 플랭킹된 상기 삽입된 GFP 서열을 함유하고 있다. 상기 입자는 숙주 동물로서 래빗(rabbit) 내의 본래의 GFP에 대한 항체를 효율적으로 유발시키는 것으로 언급된다.
미국 특허 제5,990,085호에는 (i) 잔기 78과 79 사이의 면역우성 루프와 융합되고 (ii) 카복시 말단 절단된 HBc의 잔기 144 다음에 융합된 항원성 소 인히빈(inhibin) 펩티드로부터 형성된 2가지 융합 단백질이 기재되어 있다. 발현된 융합 단백질은 숙주 동물 내에 투여되는 경우에 항-인히빈 항체의 생성을 유도시키는 것으로 언급되어 있다. 상기 특허에 보고된, 면역시킨지 30일 후의 역가는 비교적 낮은데, 루프 삽입물을 갖는 융합 단백질의 경우에는 1:3000 내지 15,000이고 잔기 144 다음의 삽입물의 경우에는 1:100 내지 125이다.
미국 특허 제6,231,864호에는 합텐에 연결되어 있는 전략적으로 변형된 B형 간염 코어 단백질의 제조 방법과 용도가 교시되어 있다. 이와 같이 변형된 코어 단백질은 합텐이 펜던트하게 연결되어 있는 화학적 반응성 아미노산 잔기를 함유하는, 1 내지 약 40개 잔기 길이의 삽입물을 함유한다.
최근에 공개된 WO 01/27281에는 HBc에 대한 면역 반응이 본래 분자의 C-말단 시스테인-함유 서열의 존재 또는 부재에 의해 각각 Th1 반응에서 Th2 반응으로 변할 수 있다는 것이 교시되어 있다. 상기 명세서는 또한, C-말단 시스테인에 의한 디설파이드 형성이 상기 입자를 안정화시키는데 도움을 줄 수 있다는 의견을 나타낸다. C-말단 시스테인의 바로 상단부에 본래 HBc 서열의 몇개 잔기가 존재한다는 것이 바람직한 것으로 언급되었지만, 반드시 요구되지는 않는다. 절단된 C-말단 HBc 서열을 대체시키기 위해 사용될 수도 있는 이러한 한 가지 대체 방안은 C-말단 시스테인과, HBc 이외의 단백질로부터의 에피토프를 규정하는 임의 서열을 포함하는 것으로 언급되었다.
PCT 공개공보 WO 01/98333에는 C-말단 시스테인 잔기는 유지시키면서, 본래 HBc의 C-말단에 존재하는 4개의 아르기닌 반복 서열(반복체) 중의 1개 이상 서열의 결실이 교시되어 있다. 상기 출원에는 또한, 이와 같이 결실된 영역을 HBc 이외의 단백질로부터의 에피토프로 대체시켜, 이와 같이 형성된 분자의 HBc 부분이 부가된 에피토프에 대한 수송체로서 작용하도록 할 수 있다는 사실이 교시되어 있다.
본 발명자들 중의 한 명의 WO 02/13765 A2 및 WO 02/14478 A2에 상응하는 PCT 공개공보에는 입자로 어셈블리되는 키메라 단백질 중에 1개 이상의 부가 시스테인 잔기를 사용함으로써, C-말단적으로 절단된 HBc 입자를 안정화시킬 수 있다고 교시되어 있다. 이러한 부가 시스테인 잔기는 상기 키메라 단백질의 C-말단에 또는 C-말단 근처에 존재하는 것으로 교시된다.
완전한 길이의 HBc 입자의 핵산 결합 능력은 없애면서도, 완전한 길이의 HBc 입자의 안정성을 보존시킬 수 있는 구조상의 특징이, 헤파드나바이러스성 뉴클레오캡시드 전달 시스템을 사용한 백신 개발에 상당히 유리할 것이다. 실제로, 외래 에피토프에 대한 수송체로서의 HBc 키메라의 용도에 관한 최근의 연구 결과[참조: Ulrich et al., Adv. Virus Res., vol. 50(1998) Academic Press pages 141-182]는, 이들 키메라를 사람 백신에 사용하기 위해서는 해결해야 할 3가지 잠재적인 문제점이 있다고 지적하고 있다. 첫 번째 잠재적인 문제점은 키메라 백신 내의 핵산이 면역 숙주에게 부주의하게 전이되는 것이다. 두 번째 잠재적인 문제점은 HBc에 대한 선재(preexisting) 면역으로부터의 간섭이다. 세 번째 잠재적인 문제점은 장기간 저장에 견딜 수 있는 본래의 키메라 입자를 재현가능한 수준으로 제조할 수 있어야 한다는 것이다.
상기 4가지 PCT 공개공보는 울리히(Ulrich) 등에 의해 보고된 잠재적 문제점을 극복하기 위해 사용될 수 있는 교시를 함유하는 것으로 여겨진다. 후술되는 바와 같이, 본 발명은 예상치 못하게 높은 항체 역가를 제공해주는 또 다른 HBc 키메라를 제공하며, 한 국면에서는 HBc 키메라 안정성의 문제점 뿐만 아니라 해당 작제물의 핵산 결합 능력의 실질적인 부재에 대한 해결책을 제공해주기도 한다. 또한, 본원에 고려된 재조합 키메라는 기존의 항-HBc 항체에 대해, 존재하는 경우 최소한의 항원성을 나타낸다.
상기 입자 불안정성 발견이 N-말단 절단된 HBc 키메라 분자와 관련이 있음에도 불구하고, 문헌[참조: Neirynck et al., (October 1999) Nature Med., 5(10): 1157-1163]에는 잔기 5에서 완전한 길이의 HBc와 융합된 인플루엔자 M2 단백질의 N-말단 24-잔기 부분을 함유하고 있는 HBc 키메라의 이. 콜리 발현에서 입자 형성이 일어났다고 보고되었다. HBc의 잔기 4는 M2 서열의 잔기 24와 동일하므로, 상기 연구가들이 잔기 1-3을 결실시켰다고 간주할 수도 있다.
앞서 논의된, 백신 적용을 위해 절단된 C-말단을 수반한 하이브리드 HBc 단백질을 사용하는 것은 이들의 완전한 길이의 대응물에 비해 몇 가지 이점을 제공해주는데, 이에는 발현 수준 증강 및 결합된 이. 콜리 RNA의 결여가 포함된다. 그러나, 이종 에피토프를 표시하기 위해 공학적으로 처리된 C-말단적으로 절단된 입자는 종종 불안정하여, 발현 후 안정한 미립형 구조물로 연합되지 못하거나 또는 정제 동안 및/또는 정제 후 비-미립형 구조물로 용이하게 해리되는 입자가 생성된다. 이러한 안정성 결여는 HBc 위치 149에 대해 C-말단적으로 절단되고 잔기 위치 70 내지 80에서 면역원성 루프 내로 삽입된 잔기를 함유하기도 하는 키메라 HBc 분자로 구성된 입자로써 나타난다.
기타 문헌에는, 야생형 헤파드나바이러스성 코어 항원에서는 HBcAg 출발 코돈의 상단부 시스테인 잔기가 입자 형성 방지에 직접적으로 관여한다고 보고되었다[참조: Schodel et al. (Jan. 15, 1993) J. Biol. Chem., 268(2): 1332-1337; Wasenauer et al. (Mar. 1993) J. Virol., 67(3): 1315-1322; and Nassal et al. (Jul. 1993) J. Virol., 67(7):4307-4315]. 3가지 그룹 모두는 야생형 HBcAg에서, 코어 유전자가 위치 -30에서 상단부 개시인자 메티오닌으로부터 해독되는 경우에 존재하는, 프리코어(pre-core) 서열의 위치 -7에서의 시스테인 잔기가 입자 형성 방지에 책임이 있으므로, 미립형 HBcAg가 분비된 비-미립형 HBeAg로 전이되는 것을 촉진시킨다고 보고되었다.
문헌[참조: Bachmann and co-workers, Jegerlehner et al., (2002) Vaccine, 20:3104-3112]에서는 문헌[Neirynck et al., 상기 참조]에 기재된 바와 실질적으로 동일한 융합 작제물을, 인플루엔자 A의 M2 단백질의 외부 23-잔기를 C-말단적으로 절단된 HBc의 루프(1-149) 내로 공학적으로 처리한 리신 잔기에 링커를 통하여 커플링시킨 본 발명자들 중의 한 명의 미국 특허 제6,231,864호에 기재된 바와 유사한 커플링 작제물과 비교하였다. 상기 접합체에서는, HBc 루프 위치 79 및 80의 잔기(프롤린 및 알라닌)를 리신 잔기의 어느 한 면 상에 2개의 글리신 잔기를 함유하는 펜타펩티드로써 대체시켰다. 상기 바흐만(Bachmann) 등의 키메라는 또한, 세린 잔기로써 대체된 위치 48 및 107에 시스테인 잔기를 갖는다. 상기 저자에 의해 보고된 면역 후 결과는, N-말단 융합 단백질에 비해 상기 커플링된 작제물에 대한 항-M2 역가가 증가하였고 생존률이 증강되었다는 것을(6/6 대 0/3) 지시해준다.
이들 키메라 단백질은 입자를 형성하고, 폴리펩티드 또는 단백질 합텐에 연결될 수 있는 것으로 언급되었다. 이. 콜리-발현된 입자는 겔 여과 및 하이드록시아파타이트 칼럼에 의해 정제하였다. 이러한 입자의 정확한 어셈블리는 에티듐 브로마이드 또는 쿠마시 블루 염색을 이용하여 아가로스 겔 전기영동 상의 단일 밴드의 존재로써 입증되는 것으로 언급되었다. 그러나, 제공된 도면을 검사한 결과, 본래의 HBc 입자와 비교해서 변형된 HBc 키메라에 대해 2개 이상의 얼룩이 나타난 것으로 여겨진다. 상기 문헌에 제시된 SDS-PAGE 겔 각각을 환원성 조건 하에 수행하여, 어셈블리된 입자 및 단량체와 비교해서 단지 치환된 키메라 단량체와 치환되지 않은 키메라 단량체 만이 가시적이도록 하였다.
다음에 논의되는 바와 같이, 본 발명은 HBc 키메라 안정성 상의 문제점 뿐만 아니라 강력하게 면역원성인 물질을 제공하면서도, 해당 작제물의 핵산 결합 능력 은 실질적으로 존재하지 않게 하는 것에 대한 한 가지 해결책을 제공해준다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 숙주 세포에 의한 발현 후 입자로 자가-어셈블리되는, 재조합적으로 공학적 처리된 헤파드나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질, 즉 B형 간염 코어(HBc) 키메라 단백질[본원에서 재조합 키메라 HBc 단백질 분자, 키메라 B형 간염 코어 단백질 분자, HBc 키메라 분자 또는 단순히 키메라로서 지칭되기도 함]로 구성된 백신 또는 접종물(inoculum)에 대한 면역원을 고려한다. 고려된 키메라 분자는 대략 잔기 위치 183에서 통상 종결되는 본래의 코어 분자에 비해 적어도 C-말단에서 절단될 수 있다.
고려된 재조합 키메라 B형 간염 코어(HBc) 단백질 분자는 길이가 약 600개 이하의 아미노산 잔기이다. 이러한 키메라는 (a) HBc 분자의 N-말단 183개 아미노산 잔기, 바람직하게는 HBc 분자의 163개 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 HBc 분자의 N-말단 156개 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 HBc 분자의 N-말단 149개 아미노산 잔기 중의 약 125개 이상의 HBc 서열을 함유하는데, 이에는 위치 48 및 107에서의 시스테인 잔기 하나 또는 둘 다를 또 다른 잔기로 대체시킨, 잔기 위치 4 내지 약 75의 HBc 서열과 잔기 위치 약 85 내지 약 140의 HBc 서열이 포함된다.
고려된 키메라 분자는 또한, b) (i) HBc 프리코어(precore) 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에서의 1 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (ii) HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 및 키메라 분자의 C- 말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 해당 분자의 C-말단을 향한 1 내지 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)] 중의 어느 하나 또는 둘 다를 함유한다.
키메라 분자는 HBc 서열 내에 약 20% 이하의 치환된 아미노산 잔기를 함유할 수 있고, 입자가 후술되는 바와 같은 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4에서 0.9 내지 약 1.7, 보다 바람직하게는 약 1.2 내지 약 1.7의 280nm 대 260nm의 흡광도 비를 나타내도록, 숙주 세포에 의한 발현시 바람직하게는 실질적으로 핵산과 결합하지 않는 입자로 자가-어셈블리된다. 상기 입자는 전형적으로, 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 중에서 37℃ 하에 1개월 동안 저장한 후, 위치 48 및 107에서 양 시스테인 잔기를 함유하는 그 밖의 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자 보다 더 안정적이며, HBc 위치 48 및 107에서 시스테인을 함유하는 입자 보다 더 높은 수율로 발현된다.
또한, 상기 키메라는 이의 N-말단, HBc 면역우성 루프 내에(즉, 잔기 위치 약 76 내지 약 85 사이) 또는 C-말단 중의 하나 이상에서 펩티드-결합된 이종 아미노산 잔기 서열을 임의로 함유할 수 있다. 이러한 N-말단 서열은 면역원성 에피토프를 포함하는 HBc 잔기 2-4 중의 하나와 펩티드-결합된 약 75개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 이종 서열을 임의로 포함한다. HBc 면역우성 루프 서열에서는, (i) HBc 위치 76 내지 85의 서열 중의 0개 내지 모든 서열이 존재하거나 대체되고; 약 40개 이하의 잔기 서열에 존재하는 접합된 합텐에 대한 화학적-반응성 링커 잔기, 항-항원 또는 면역원을 구성하고 HBc 루프에 대해 이종인 1 내지 약 245개 아미노산 잔기와 펩티드 결합될 수 있거나, (ii) 위치 76 내지 85에서의 HBc의 서열이 존재하고 결실물과 이종 잔기를 함유하지 않거나, 또는 (iii) 잔기 76 내지 85 중의 하나 이상이 부재이거나 대체된다. C-말단 서열은 HBc 위치 183, 바람직하게는 HBc 위치 165에서부터 C-말단까지의 HBc에 대해 이종인 서열, 보다 바람직하게는 위치 156에서부터 C-말단까지의 HBc에 대해 이종인 서열, 가장 바람직하게는 HBc 위치 149에서부터 C-말단까지의 HBc에 대해 이종인 서열 내에 면역원성 에피토프를 포함하는 약 100개 이하의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다.
보다 바람직하게는, 고려된 키메라가 약 380개 이하의 아미노산 잔기 길이를 갖는 재조합 HBc 단백질 분자를 포함한다. 이러한 키메라는
(a) 위치 48 및 107에서의 시스테인 잔기 중의 하나, 또는 바람직하게는 둘 다를 또 다른 잔기, 예를 들면, 세린으로 대체시킨, 잔기 위치 4 내지 약 75 및 약 85 내지 약 140의 HBc 서열을 포함하는, HBc 분자의 N-말단 163개 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 HBc 분자의 N-말단 156개 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 HBc 분자의 N-말단 149개 아미노산 잔기 중의 약 125개 이상, 바람직하게는 약 135개 이상의 HBc 서열을 함유한다. 상기 키메라는 다음 중의 하나 이상을 임의로 포함한다: (i) 키메라의 N-말단, HBc 면역우성 루프 내에 또는 C-말단(여기서, C-말단 서열은 위치 163, 바람직하게는 위치 156에서부터 본래의 HBc C-말단까지의 HBc 서열 이외의 것이다) 중의 하나 이상에서 약 75개 이하 잔기의 펩티드-결합된 면역원성 서열을 임의로 포함하거나, 또는 (ii) HBc 위치 76 내지 85의 서열 잔기들 중의 제로(0) 내지 모든 잔기가 존재하거나 대체되고; 바람직하게는 1 내지 약 40개 아미노산 잔기의 서열에 존재하는 접합된 합텐에 대한 화학적-반응성 링커 잔기, 항-항원 또는 면역원을 구성하고 HBc에 대해 이종인 0 내지 약 75, 바람직하게는 1 내지 약 45개 아미노산 잔기와 펩티드 결합된다
부가적으로, 고려된 키메라 분자는 (b) (i) HBc 프리코어 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에 존재하거나[N-말단 시스테인 잔기(들)], (ii) HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 및 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 해당 분자의 C-말단을 향해 존재하거나[C-말단 시스테인 잔기(들)], 또는 위치 (i)과 (ii) 둘 다에 존재하는 1 내지 3개의 시스테인 잔기를 함유한다.
이러한 고려된 키메라 분자는
(c) HBc 서열 내에 약 20% 이하의 치환된 아미노산 잔기를 함유하고,
(d) 숙주 세포에 의한 발현 상에서, 후술되는 바와 같이 수집, 정제 및 해리시 0.9 내지 약 1.7, 보다 바람직하게는 약 1.2 내지 약 1.7의 280nm 대 260nm의 흡광도 비를 나타내는 입자로 자가-어셈블리된다.
이와 같이 자가-어셈블리된 입자는 전형적으로, 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 중에서 37℃ 하에 1개월 동안 저장한 후, 위치 48 및 107에서 두개의 시스테인 잔기를 함유하는것을 제외하고 그 밖에는 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자 보다 더 안정적이다. 따라서, 잔기 위치 48 및 107에 하나의 시스테인, 또는 바람직하게는 둘 다의 시스테인이 부재인 것이, N- 또는 C-말단 시스테인 또는 이들 둘 다가 존재함으로써 상기 입자를 안정화시키는 경우 보다 입자의 저장 안정성을 증강시킬 수 있다. 이들 시스테인 잔기들 중의 하나 또는 둘 다를 대체시키는 것이 키메라 분자 입자의 발현을 증강시킬 수도 있다.
또 다른 양태는 약 135 내지 약 365개 아미노산 잔기 길이를 갖고; 도메인 I, II, III 및 IV로 명명되는, N-말단으로부터 4개의 펩티드-연결된 아미노산 잔기 서열 도메인을 함유하는 재조합 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 단백질 키메라 분자를 고려한다.
상기 키메라 분자의 도메인 I은 약 72 내지 약 150개 아미노산 잔기를 포함하고, 이의 서열에는
(i) 적어도 HBc의 위치 4 내지 위치 75의 잔기 서열,
(ii) 위치 48에서의 시스테인 잔기에 대한 또 다른 잔기(예: 세린)의 치환(대체),
(iii) HBc 프리코어 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에 존재하는 0 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)], 및
(iv) HBc 잔기 2-4 중의 하나와 펩티드 결합된 약 75개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 임의의 면역원성 에피토프 서열
이 포함된다.
상기 키메라 분자의 도메인 II는 도메인 I의 HBc 잔기 약 75와 펩티드 결합된 약 85개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는데, 여기서
(i) HBc 위치 약 76 내지 약 85의 서열 중의 제로(0) 내지 모든 잔기가 존재하거나 대체되고; 접합된 합텐에 대한 화학적-반응성 링커 잔기 또는 항-항원을 구 성하는 1 내지 약 40개 아미노산 잔기 서열, 또는 면역원을 구성하고, HBc 루프에 대해 이종인 1 내지 약 75개 아미노산 잔기와 펩티드 결합되거나, 또는
(ii) 위치 약 76 내지 약 85에서의 HBc 서열이 존재하고 결실물 또는 부가된 이종 잔기는 존재하지 않는다.
키메라 도메인 III은 도메인 II의 잔기 약 85와 펩티드-결합된 위치 약 86에서부터 위치 약 135까지의 HBc 서열인데, 또 다른 잔기가 위치 107의 시스테인 잔기를 대체한다.
키메라 분자 도메인 IV는
(i) 도메인 III의 위치 135의 잔기와 펩티드-결합된 위치 약 136에서부터 약 163까지, 바람직하게는 약 156까지, 가장 바람직하게는 약 149까지의 HBc 아미노산 잔기 서열의 5 내지 30개 잔기,
(ii) 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 0 내지 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)], 및
(iii) 위치 163, 바람직하게는 위치 156, 보다 바람직하게는 위치 149에서부터 C-말단까지의 HBc에 존재하는 서열 이외의 서열 중의 0 내지 약 75개 아미노산 잔기
를 포함한다. 키메라 분자의 HBc 위치 150에서부터 C-말단까지의 키메라 분자 서열은 아르기닌, 리신 잔기 또는 이들 둘 다 잔기의 혼합물을 약 10개 미만 함유한다.
이러한 바람직한 키메라 분자는 (i) 아미노산 잔기의 약 10% 이하가 해당 키메라의 HBc 서열에서 치환되는 아미노산 잔기 서열을 갖고, (ii) 도메인 I 및 IV의 언급된 0 내지 3개의 시스테인 잔기 중에 존재하는 1개 이상의 시스테인 잔기를 가지며, (iii) 숙주 세포에 의한 발현시 입자로 자가-어셈블리된다. 이와 같이 하여 형성된 입자는 바람직하게는, 실질적으로 핵산과 결합하지 않으며, 바람직하게는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 중에서 37℃ 하에 1개월 동안 저장한 후, 위치 48 및 107에서 두개의 시스테인 잔기를 함유하지만 그 밖에는 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자 보다 더 안정적이다.
일반적으로 보면, 위치 48 및 107에 통상 존재하는 HBc 시스테인 잔기는, 고려된 모든 키메라 분자에서 세린 등의 기타 잔기로 대체시키고, 고려된 모든 키메라 분자는 HBc 서열에 본래 존재하지 않는 1개 이상의 N- 또는 C-말단 시스테인 잔기를 함유한다. 따라서, 몇몇 양태에서는, 도메인 I의 HBc 서열이 위치 4 내지 위치 75의 잔기 단독 + 적어도 N-말단 시스테인 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 기타 양태에서는, 고려된 키메라 분자가 N-말단 시스테인 잔기를 함유할 뿐만 아니라, 단독으로 존재하는, 즉 HBc 서열에 부가되거나 또 다른 아미노산 잔기 서열 내에 존재하는, 상기 언급된 바와 같은 도메인 IV 내의 1개의 시스테인 잔기를 함유하는 것이 바람직하다. 기타 양태에서는, 바람직한 키메라 분자가 단지 하나 이상의 C-말단 시스테인 잔기 만을 함유하고, 도메인 I이 도 1의 서열과 같은 본래의 HBc 서열에 존재하지 않는 시스테인 잔기 뿐만 아니라 위치 48에서의 HBc 시스테인 잔기를 함유하지 않는다. HBc 시스테인 잔기는 도 1의 HBc 서열 각각의 위치 약 61에 존재한다.
고려된 백신 또는 접종물은, 전형적으로 물을 함유하기도 하는 약제학적으로 허용되는 희석제 조성물에 용해 또는 분산된, 앞서 언급되고 자가-어셈블리된 키메라 분자 입자의 면역 반응 유도량을 포함한다. 도메인 I, II 및 IV 중의 하나 이상에서 고려된 키메라 분자 내에 존재하는 특히 바람직한 비-HBc 에피토프는 말라리아 CS 단백질로부터의 면역원성 서열; 인플루엔자 A M2 단백질의 아미노-말단 24 잔기로부터의 서열; B형 간염 표면 단백질(HBs)의 preS1 또는 preS2 영역으로부터의 서열; 또는 토른톤(Thornton) 등의 미국 특허 제5,124,726호(및 이의 모 특허 제4,882,145호)에 기재된 바와 같은 HBc로부터의 부가의 T 세포-자극성 서열, 예를 들면, 위치 약 85 내지 약 100의 서열 또는 보다 협소한 범위의 위치 약 93 내지 약 100의 서열이다. 특히 바람직한 링커 잔기는 리신 잔기이다.
본 발명은 몇 가지 이익과 이점을 지닌다.
본 발명의 특별한 이익은, 바람직한 키메라 입자 면역원이 전형적으로, 핵산을 실질적으로 함유하지 않으면서도, 위치 48 및/또는 107에서 대체된 시스테인 잔기를 포함하는 것을 제외하고는 그 밖에는 동일한 HBc 키메라 입자 보다 더 큰 제조시의 안정성을 나타낸다는 것이다.
본 발명의 이점은 위치 48 및 107에서 시스테인 이외의 잔기를 함유하는 키메라로부터 형성된 입자가, 위치 48 및 107에서 시스테인을 함유하는 키메라 단백질로부터 어셈블리된 입자 보다 더 신속하게 디설파이드-함유 입자를 형성한다는 것이다.
본 발명의 또 다른 이익은 널리 공지된 세포 배양 기술을 사용하여 재조합 면역원을 용이하게 제조한다는 것이다.
본 발명의 또 다른 이점은 널리 공지된 재조합 기술을 사용하여 면역원을 용이하게 제조한다는 점이다.
본 발명의 추가의 이익은 입자의 발현이, 위치 48 및 107에서 두개의 시스테인을 포함하는 유사한 키메라 분자와 비교해서 증강된다는 것이다.
본 발명의 추가의 이점은 발현된 입자가, 위치 48 및 107에서 시스테인을 함유하는 입자 보다 더 용이하게, 품질 보장 목적을 위해 성상 확인된다는 점이다.
추가의 이익과 이점은 다음 기재 내용으로부터 당업자에게는 명백할 것이다.
다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성한다.
도 1A 및 도 1B의 2개 패널로서 제시된 도 1은 6개 바이러스로부터의 포유류 HBc 단백질에 대해 공개된 6개 서열을 정렬한 것이다. 제1(서열번호 1), 사람 바이러스성 서열은 ayw 아유형의 서열이고, 이는 문헌[참조: Galibert et al. (1983) Nature, 281: 646-650]에 공개되었고; adw 아유형의 제2 사람 바이러스성 서열(서열번호 2)는 문헌[참조: Ono et al.(1983) Nucleic Acids Res., 11(6): 1747-1757]에 공개되었고; 제3 사람 바이러스성 서열(서열번호 3)은 adw2 아유형의 서열이며, 이는 문헌[참조: Valenzuela et al., Animal Virus Genetics, Field et al. eds., Academic Press, New York (1980) pages 57-70]에 공개되었고; 제4 사람 바이러스성 서열(서열번호 4)은 adyw 아유형의 서열이고, 이는 문헌[참조: Pasek et al. (1979) Nature, 282: 575-579]에 공개되었고; 제5 서열(서열번호 5)은 우드척 바이 러스 아유형의 서열이고, 이는 문헌[참조: Galibert et al. (1982) J. Virol., 41: 51-65]에 공개되었으며; 제6 포유류 서열(서열번호 6)은 땅 다람쥐의 서열이고, 이는 문헌[참조: Seeger et al. (1984) J. Virol., 51: 367-375]에 공개되었다.
도 2는 재조합 HBc 키메라를 제조하기 위해 본원에 사용된 플라스미드 벡터 pKK223-3N을 제조하는데 있어서 시판용 플라스미드 벡터 pKK223-3에 대해 만들어진 변형을 도시한 것이다. 이와 같이 변형된 서열(서열번호 7)은 시판용 벡터의 서열(서열번호 8) 아래에 제시된다. 부가된 NcoI 부위의 염기가 소문자로 제시되고, 부가된 염기는 이중으로 밑줄쳐져 있는 반면, 결실된 염기는 대시(-)로서 제시된다. 이러한 서열 절편에 존재하는 2개의 제한 부위(NcoI 및 HindIII)가 지시된다.
도 3A, 3B 및 3C로서 3개의 패널로 제시된 도 3은 말라리아성 B 세포 에피토프, 예를 들면, (NANP)4(서열번호 9)를, 시스테인 잔기 48을 세린 잔기로 대체시킨[도 3A, HBc 1-78(48S)] 공학적으로 처리된 HBc 유전자의 위치 78과 79 사이의 EcoRI 부위 및 SacI 부위 내로 클로닝시켜, SacI 부위는 보존시키면서 EcoRI 부위를 파괴시키는 바람직한 클로닝 전략을 도식적으로 제시하고 있다. 도 3B는 세린 잔기로써 대체된 잔기 위치 107에서의 시스테인을 수반한 HBc 잔기 79-149를 암호화하는, 공학적으로 처리되고 절단된 HBc 유전자의 C-말단에서 EcoRI 부위와 HindIII 부위 내로 클로닝된, 정지 코돈 및 Pf/CS-UTC로서 지칭된 것과 같은 T 세포 에피토프(서열번호 10)를 암호화하는 DNA가 제시되어 있다[HBc 79-149(107S) + PF/CS-UTC]. 증폭된 서열의 잔기 위치 79 분해에서 시작하여 HBc-암호화 서열에 인접한 5'-말단 SacI 제한 부위를 갖는 프라이머를 사용하여 도 3B의 작제물을 PCR 증폭시키고, 도 3A의 작제물을 SacI과 반응시킨 다음, 적당한 부분을 연결시켜, 피. 팔시파룸(P. falciparum)에 대한 백신에 대한 면역원의 B 세포- 및 T 세포-함유 에피토프를 암호화하는 단일 유전자 작제물을 형성시키는 과정이 도 3C에 제시되어 있다.
도 4A 내지 4H로서 8개 패널로 도시된 도 4는 각각, 0일째(4A, 4C, 4E 및 4G) 및 37℃에서 항온 배양한지 14일 후(4B, 4D, 4F 및 4H), HBc149; HBc149(C48S/C107S); HBc149+C 및 HBc149(C48S/C107S) + C로 명명된 4가지 입자에 대한 분석적 크기 배제 크로마토그래피 용출 프로필이다. 어셈블리된 입자는 7ml에서 용출되는 반면, 후속 피크에서는 보다 낮은 차수 구조물이 용출된다. 샘플을 20mM 인산나트륨(pH 6.8) 및 0.02% 나트륨 아지드에서 수행하고, 280nm에서의 흡광도가 세포좌표 상에 밀리흡광 단위(mAu)로 제시되어 있고, 용적(ml)이 가로좌표 상에 제시되어 있다.
미국 특허 제6,231,864호로부터 취한 도 5는 (I) 설포-석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산 1-카복실레이트(설포-SMCC)를 사용하여 합텐을 키메라 B형 간염 코어 단백질(sm-HBc) 입자에 펜던트하게 연결하기 위한 활성화 수송체를 형성한 다음, (II) 설프하이드릴-종결화(시스테인-종결화) 합텐을 상기 활성화 수송체에 연결하여 접합체 입자를 형성하는 2가지 반응 순서를 도시한 반응식(반응식 1)을 예시한다. 상기 sm-HBc 입자는 단일 펜던트 아미노 그룹을 갖는 박스(명확하게 도시하기 위함)로서 도시되는 반면, 설프하이드릴-종결화 합텐은 SH 그룹으로 종결된 라인으로 도시된다.
정의
HBc 키메라와 연계해서 사용된 숫자는 아미노산 잔기 서열에 대한 부가물 또는 결실물이 존재하는지의 여부와는 상관없이, 하나 이상의 잔기를 해당 서열에 부가시키거나 이러한 서열로부터 결실시킨 서열번호 1의 HBc ayw 아미노산 잔기 서열 내의 위치를 지시한다. 따라서, HBc149는 키메라가 잔기 149에서 종결된다는 것을 지시해주는 반면, HBc149 + C150은 동일한 키메라가 서열번호 1의 서열번호를 기준으로 하여 HBc 위치 150에서 시스테인 잔기를 함유한다는 것을 지시해준다.
용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합될 수 있는, 면역글로불린으로 불리우는 글리코실화 단백질 계열의 구성원인 분자를 지칭한다.
용어 "항원"은 항체 또는 수용체에 의해 결합되는 실재물(entity)을 명명하고, 또한 항체 생성을 유도시키는 실재물을 명명하기 위해 역사적으로 사용되어 왔다. 보다 최근의 활용은 항원의 의미를 항체 또는 수용체에 의해 결합된 실재물로 제한하고 있는 반면, 항체 생성을 유도시키거나 수용체와 결합하는 실재물에 대해서는 "면역원"이란 용어가 사용되고 있다. 본원에 논의된 실재물이 면역원성이면서 항원성인 경우에는, 이의 목적하는 활용도에 따라서 면역원 또는 항원으로 지칭된다.
"항원 결정기"는 항체 결합 부위 또는 T 세포 수용체에 의해 면역학적으로 결합되는, 항원의 실제적인 구조 부분을 지칭한다. 상기 용어는 또한, "에피토프"와 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 항원 결정기는 항체 생성 또는 T 세포 활성 화를 자극하는 구조물이고, 이러한 구조물의 존재는 항체에 의해 결합되거나 T 세포 활성화를 유도시키는 구조물을 결정함으로써 확인할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "접합체"는 아미노산 잔기 측쇄를 통해서 처럼, 수송체 단백질에 작동적으로 연결된 합텐을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "보존적 치환"은 하나의 아미노산 잔기를 생물학적으로 유사한 또 다른 잔기로 대체시킨 것을 의미한다. 보존적 치환의 예에는 하나의 소수성 잔기를 또 다른 소수성 잔기, 예를 들면, 이소루이신, 발린, 루이신 또는 메티오닌으로 치환하는 것, 또는 하나의 극성 잔기를 또 다른 잔기로 치환하는 것, 예를 들면, 아르기닌과 리신 간의 치환, 글루탐산과 아스파르트산 간의 치환, 또는 글루타민과 아스파라긴 간의 치환 등이 포함된다. 또한, 이와 같이 고려된 "보존적 치환"에는 도 1에 제시된 바와 같은 하나의 포유류 HBc 서열로부터의 잔기를 사용하여, 또 다른 포유류 HBc 서열 중의 동일한 위치에서의 잔기를 대체시키는 것이 포함된다.
펩티드 서열과 관련해서 사용된 바와 같은 이의 각종 문법적 형태의 용어 "상응하는"은 기재된 펩티드 서열에, 아미노 말단과 카복시 말단 중의 어느 하나 또는 둘 다에 3개 이하의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실되고, 해당 폴리펩티드 서열을 따라 특정한 아미노산 잔기 내에 보존적 치환물 만을 함유하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "도메인"은 문헌[참조: Galibert et al., (1979) Nature, 281:646-650(서열번호 1)]에 보고된 바와 같은 HBcAg 아유형 ayw의 위치 번호에 기준한 잔기 위치 넘버링으로써 확인되는 재조합 HBc 키메라 분자의 일정 부분을 의미한다. 적어도 키메라 도메인 I, II 및 III의 폴리펩티드 부분은, 천연 HBcAg의 상응하는 서열과 유사한 3차 형태로 존재하는 것으로 여겨진다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "융합 단백질"은 각각의 카복시 말단 아미노산 잔기와 아미노 말단 아미노산 잔기 간의 펩티드 결합에 의해 함께 말단-대-말단(헤드-대-테일)으로 작동적으로 연결되는, 천연에서는 함께 연결된 것이 통상적으로 발견되지 않는 둘 이상의 아미노산 잔기 서열을 함유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명의 융합 단백질은, 아미노산 잔기 서열 면에서 이러한 융합 단백질의 폴리펩티드 부분에 상응하는 폴리펩티드와 면역반응되는 항체 생성을 유도시키는 HBc 키메라 분자이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "B형 간염"은 이의 가장 광범위한 맥락에서, 앞서 논의된 바와 같은 포유류 헤파드나비리대 과의 모든 구성원을 지칭한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 본 명세서 전반에 걸쳐 상호 교환적으로 사용되며, 이는 인접한 아미노산의 알파-아미노 그룹과 카복시 그룹 간의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 선형 시리즈의 아미노산 잔기를 지칭한다. 폴리펩티드는 중성(전하를 띠지 않음) 형태 또는 염 형태의 각종 길이일 수 있다. 아미노산 잔기 서열이 산성 및 염기성 그룹을 함유한다는 사실과, 펩티드에 의해 나타낸 특별한 이온화 상태가, 이러한 펩티드가 용액 중에 존재하는 경우에는 주변 매질의 pH 값, 또는 상기 펩티드가 고체 형태인 경우에는 이를 수득하는 매질의 pH 값에 의존적이란 사실은 당해 분야에 널리 인지되어 있다. 따라서, "폴리펩티드" 또는 이의 등가 명칭은 참조된 적당한 아미노산 잔기 서열을 포함한다. 펩티드 또는 폴리펩티드는 본원에서 항상 좌측에서 우측으로, 아미노 말단(N-말단)에서부터 카복시 말단(C-말단)까지의 방향으로 제시된다.
용어 "잔기"는 아미노산 잔기와 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 동정된 모든 아미노산 잔기는 천연 상태 또는 L-배위이다. 표준 폴리펩티드 명명법에 따라서[참조: J. Biol. Chem., 243:3557-59(1969)], 아미노산 잔기에 대한 약어가 다음 표에 제시된 바와 같다:
해당 표
1문자 3문자 아미노산
Y Tyr L-티로신
G Gly 글라이신
F Phe L-페닐알라닌
M Met L-메티오닌
A Ala L-알라닌
S Ser L-세린
I Ile L-이소루이신
L Leu L-루이신
T Thr L-트레오닌
V Val L-발린
P Pro L-프롤린
K Lys L-리신
H His L-히스티딘
Q Gln L-글루타민
E Glu L-글루탐산
Z Glx L-글루탐산 또는 L-글루타민
W Trp L-트립토판
R Arg L-아르기닌
D Asp L-아스파르트산
N Asn L-아스파라긴
B Asx L-아스파르트산 또는 L-아스파라긴
C Cys L-시스테인
본 발명은 면역원성 HBc 단백질; 이러한 단백질로 구성된 안정화 면역원성 입자; 및 상기 안정화 입자로 구성된 백신 또는 접종물을 고려한다. 고려된 키메라 분자는 바람직하게는, 이의 C-말단이 도 1의 본래의 ayw 아유형에 대해 잔기 위치 183에 통상 존재하는 본래의 코어 분자를 기준으로 하여 적어도 C-말단에서 절단된다. 고려된 키메라 분자를 함유하는 입자는, 잔기 위치 48 및 107에서 본래의 HBc 단백질에 존재하는 시스테인 잔기들 중의 하나 또는 둘 다를 대체시킴으로써(도 1) 안정화시키고, C-말단과 N-말단 중의 하나 또는 둘 다에 위치하거나 또는 이들 근처에 위치하는 부가된 시스테인 잔기가 존재함으로써 안정화시킨다. 이러한 입자는 바람직하게는, 후술되는 바와 같이 실질적으로 핵산과 결합하지 않는다.
보다 특히, 고려된 키메라 분자는 약 600개 이하, 보다 바람직하게는 약 380개 이하, 가장 바람직하게는 약 200개 이하의 펩티드-결합된 α-아미노산 잔기 길이를 갖는다. 이러한 고려된 키메라 분자는 HBc의 N-말단 183개 아미노산 잔기, 바람직하게는 N-말단 163개 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 N-말단 156개 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 N-말단 149개 아미노산 잔기 중의 약 125개 이상, 보다 바람직하게는 약 135개 이상을 함유한다. 존재하는 HBc 서열은, 위치 48 및 107에서의 시스테인 잔기들 중의 하나 또는 바람직하게는 둘 다를 또 다른 잔기로 대체시킨 잔기 위치 4 내지 약 75의 HBc 서열과 약 85 내지 약 140의 HBc 서열을 포함한다.
고려된 키메라 분자는 또한, (a) HBc 프리코어 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에서 1 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (b) HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 및 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 해당 분자의 C-말단을 향한 1 내지 약 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)] 중의 어느 하나 또는 둘 다를 함유한다. 이러한 키메라 분자는 (i) HBc 서열 내에 약 20% 이하의 치환된 아미노산 잔기를 함유하고, (ii) 숙주 세포에 의한 발현시 바람직하게는 실질적으로 핵산과 결합하지 않는 입자로 자가-어셈블리된다.
이와 같이 형성된 입자는 후술되는 바와 같이 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4에서 0.9 내지 약 1.7의 280nm 대 260nm의 흡광도 비를 나타내며, 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4에서, 보다 바람직하게는 약 1.2 내지 약 1.7의 280nm 대 260nm의 흡광도 비를 나타냄으로써 핵산 결합이 실질적으로 일어나지 않았다는 것을 입증한다. 상기 형성된 입자는 전형적으로, 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 중에서 37℃ 하에 1개월 동안 저장한 후, 위치 48 및 107에서 양 시스테인 잔기를 함유하는 그 밖의 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자 보다 [분리 후] 바람직하게는 더 안정적이다. 또한, 상기 키메라는 이러한 키메라의 N-말단, HBc 면역우성 루프 내에(즉, 잔기 위치 약 76 내지 약 85 사이; HBc 루프 또는 간단히 루프) 또는 C-말단 중의 하나 이상에서 펩티드-결합된 이종 아미노산 잔기 서열을 임의로 함유한다. 해당 분자의 N-말단에 존재하는 이종 서열은 약 75개 이하의 아미노산 잔기 길이를 가질 수 있는 반면, 분자의 C-말단에 존재하는 이종 서열은 약 100개 이하의 아미노산 잔기 길이를 가질 수 있다. 분자의 N-말단 또는 C-말단 중의 어느 하나에 존재하는 경우, 이종 서열은 통상적으로, B 세포 또는 T 세포 면역원성 에피토프, 또는 둘 다를 함유하고, 바람직하게는 약 75개 이하의 아미노산 잔기를 함유한다. HBc 루프 내에 존재하는 이종 서열은 다음에 논의되는 바와 같은 약 245개 이하의 아미노산 잔기 서열을 함유할 수 있다.
HBc 면역우성 루프 서열에서는, (i) HBc 위치 약 76 내지 약 85의 서열 중의 제로(0) 내지 모든 잔기가 존재하거나 대체되고; 약 40개 이하의 잔기 서열에 존재하는 접합된 합텐에 대한 화학적-반응성 링커 잔기, 항-항원 또는 에피토프 함유 면역원을 구성하고 HBc 루프에 대해 이종인 1 내지 약 245개 아미노산 잔기와 펩티드 결합될 수 있거나, (ii) 위치 약 76 내지 약 85에서의 HBc의 서열이 존재하고 결실물과 이종 잔기를 함유하지 않거나, 또는 (iii) 잔기 76 내지 86 중의 하나 이상이 부재하거나 대체된다.
따라서, 접합된 합텐에 대한 링커 잔기를 포함하는 약 40개 이하 잔기의 이종 아미노산 잔기 서열은 항-항원성 잔기 또는 서열과 같이, HBc 루프 내에 존재할 수 있다. 이러한 항-항원성 잔기 또는 서열, 또는 접합된 합텐에 대한 화학적-반응성 링커 잔기를 함유하는 잔기 또는 서열은 각각, 바람직하게는 1 내지 약 40개 아미노산 잔기를 함유하고, 보다 바람직하게는 1 내지 약 5개 아미노산을 함유하며, 가장 바람직하게는 단일 잔기를 함유한다. HBc 루프 내에 존재하는 이종 에피토프-함유 면역원 서열은 바람직하게는 약 75개 이하 잔기, 보다 바람직하게는 약 50개 이하 잔기, 가장 바람직하게는 약 25개 이하 잔기를 함유하지만, 앞서 인지된 바와 같이 약 245개 이하 잔기를 포함할 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항-항원"은 특정 서열의 항원성, 즉 해당 서열이 항체에 의해 결합될 수 있는 능력을 붕괴시키는 잔기 또는 서열을 의미한다. 따라서, 항-항원은 면역원성 루프 내에 존재할 수 있고, 존재하는 경우, 이러한 잔기 또는 서열은 루프에 대한 항체의 결합을 붕괴시킨다. 이들 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있지만, 공급원[the Institute of Immunology Co. , Ltd., Tokyo, Japan]으로부터 시판중인 3105로 명명된 바와 같은 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 HBc 면역원성 루프의 상단에 있는 아미노산 잔기와 결합하는 것으로 인지된다. 접합된 합텐에 대한 화학적 반응성 링커 잔기는 루프에 대한 항체 결합을 붕괴시키는데 있어서 항-항원으로서 기능할 수 있다. 그러나, 편의상, 본원에서는 항-항원 잔기 또는 서열이, 화학적 반응성 잔기(예를 들면, 리신 또는 시스테인)이 결여되고 항-항원으로서 기능하는 잔기 또는 서열로서 간주될 것이다.
또 다른 양태에서는, HBc 위치 76 및 82의 루이신 및 아르기닌 잔기가 둘 다 시스테인 잔기로써 대체되고, HBc 위치 약 76 내지 약 85의 서열에 잔존하는 잔기 0 내지 모두가 존재하고, 이것이 약 40개 이하의 아미노산 잔기 서열에 존재하는 접합된 합텐에 대한 화학적-반응성 링커 잔기, 항-항원 서열 또는 이종 면역원을 구성하는 1 내지 약 245개 아미노산 잔기 중의 임의로 존재하는 서열과 펩티드 결합된다.
고려된 면역원성 입자는 재조합 B형 간염 코어(HBc) 키메라 단백질 분자로 구성되는데, 이러한 키메라 단백질 분자는 길이가 약 600개 이하의 아미노산 잔기이다. 이들 키메라 단백질 분자는 (a) 위치 48 및 107에서의 시스테인 잔기들 중의 하나, 및 바람직하게는 둘 다를 또 다른 잔기, 예를 들면, 세린으로 대체시킨, 잔기 위치 4 내지 약 75 및 약 85 내지 약 140의 HBc 서열을 함유하는, HBc 분자의 N-말단 183개 아미노산 잔기, 바람직하게는 N-말단 163개 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 HBc 분자의 N-말단 156개 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 HBc 분자의 N-말단 149개 아미노산 잔기의 약 125개 이상, 바람직하게는 약 135개 이상의 HBc 서열을 함유한다. 세린 이외에, HBc 위치 48 및 107에서의 시스테인에 대한 대체물로서 고려된 것에는 시스테인 이외의 모든 잔기, 특히 글루타민, 아스파라긴, 세린, 알라닌, 트레오닌 및 리신이 포함된다.
HBc 키메라 분자 서열은 (a') 키메라의 N-말단, HBc 면역우성 루프 또는 C-말단 중의 하나 이상에서 면역원성 서열을 함유하는 펩티드-결합된 이종 아미노산 서열 , (b') 1 내지 약 40개의 아미노산 잔기 길이를 갖고 접합된 합텐에 대한 화학적 반응성 링커 잔기를 함유하는 HBc 면역우성 루프 중의 이종 삽입물, 또는 (c') 전술된 바와 같은, HBc 위치 76 내지 85의 서열 잔기 0 내지 모두를 임의로 포함한다.
키메라 단백질 분자는 또한, (a') HBc 프리코어 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에서 1 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (b') HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 및 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 해당 분자의 C-말단을 향한 1 내지 약 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)] 중의 하나 또는 둘 다를 함유한다.
키메라 단백질 분자는 HBc 서열 내에 약 20% 이하의 치환된 아미노산 잔기를 함유하고, 숙주 세포에 의한 발현시 바람직하게는 실질적으로 핵산과 결합하지 않는(이는 전술된 바와 같이, 약 0.9 내지 약 1.7, 보다 바람직하게는 약 1.2 내지 약 1.7의 280nm 대 260nm의 흡광도 비를 나타낸다) 입자로 자가-어셈블리된다. 상기 입자는 전형적으로, 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 중에서 37℃ 하에 1개월 동안 저장한 후, 위치 48 및 107에서 양 시스테인 잔기를 함유하는 그 밖의 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자 보다 바람직하게는 더 안정적이다. 이러한 안정성 증강은 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 관찰된 피크 하의 면적을 비교하거나, 또는 비-환원성 SDS 겔 밴드 크기 또는 단백질 밀도를 비교함으로써 측정할 수 있다.
따라서, 키메라 단백질은 N-말단, HBc 면역원성(면역우성) 루프 또는 C-말단에서 하나 이상의 면역원성 에피토프를 표시할 수 있거나, 상기 면역원성 루프에서 B 세포 또는 T 세포 에피토프에 대한 링커를 표시할 수 있거나, 또는 위치 약 76 내지 약 85의 잔기 0 내지 모두를 가질 수 있다. 한 양태에서는, 상기 키메라 단백질이 자가-어셈블리된 입자로의 형성시 추가의 안정성 증강을 부여해줄 수 있는 하나 이상의 N-말단 시스테인 잔기(들)를 함유한다. 또 다른 양태에서는, 상기 키메라 단백질이 자가-어셈블리된 입자로의 형성시 추가의 안정성 증강을 부여해줄 수 있는 하나 이상의 C-말단 시스테인 잔기(들)를 함유한다. 고려된 키메라 단백질 분자는 N-말단과 C-말단 둘 다에 또는 이들 근처에 시스테인 잔기를 함유할 수도 있는데, 즉 키메라 단백질 분자는 전술된 바와 같이, N-말단 시스테인 잔기와 C-말단 시스테인 잔기 둘 다를 함유할 수 있다.
고려된 키메라 단백질은 HBc의 위치 150에서부터 183까지의 잔기를 함유할 수 있지만, 바람직하게는 HBc 잔기 위치 149(로부터 카복시-말단을 향해)의 하단부에 아르기닌 및/또는 리신 잔기를 충분히 함유하지 않기 때문에, 자가-어셈블리된 입자는 실질적으로 핵산 결합을 포함하지 않는다. 몇몇 양태에서는, 아르기닌-풍부 반복 서열 중의 2개를 포함하는, 위치 149에서부터 위치 약 163까지의 HBc 서열이 존재한다(도 1 참조). 기타 양태에서는, 1개의 아르기닌-풍부 서열을 함유하는, 위치 약 156까지의 HBc 서열이 존재한다. 기타 양태에서는, C-말단 HBc 서열이 HBc 위치 140과 149 사이에서 종결되고, 키메라 분자는 위치 150에서부터 C-말단까지의 도 1의 본래 HBc 서열 내에 존재하는 아르기닌 반복 서열을 함유하지 않거나, 또는 아르기닌 잔기들 중의 하나 이상 대신 리신 잔기를 함유하는 유사한 서열을 함유하지 않는다. 핵산 결합이 실질적으로 존재하지 않는다는 것은 다음에 논의되고, 이는 용이하게 결정할 수 있다.
검토의 용이성을 위해, 본원에 지칭된, 고려된 키메라 서열 및 서열 위치 번호는 서열번호 1에 제시된 아유형 ayw의 사람 B형 간염 코어 단백질의 서열 및 위치 넘버링에 기준한 것이다[참조: Galibert et al. (1979) Nature, 281:646-650]. 그러나, 당업자들에게 널리 공지되어 있는, 포유류 헤파드나바이러스 캡시드 단백질 서열들 간의 상당한 유사성과, 이러한 단백질에 의해 나타난 유사한 입자 형성 측면에서 보면, 사람 HBc 아유형 ayw에 관한 논의 역시 아유형 adw에도 적용할 수 있을 뿐만 아니라 우드척 및 땅 다람쥐 단백질에게도 적용 가능하는 것을 인지해야 한다. 이러한 상당한 유사성으로 인해, HBc 서열은 달리 언급되지 않는 한, 일반적으로 본원에서 "HBc" 서열로서 언급된다.
또 다른 양태에서는, 고려된 HBc 키메라가 약 380개 이하 잔기 길이이고, 이는
(a) 위치 48 및 107에서의 시스테인 잔기들 중의 하나, 및 바람직하게는 둘 다를 전술된 바와 같이, 또 다른 잔기, 예를 들면, 세린으로 대체시킨, 잔기 위치 4 내지 약 75 및 약 85 내지 약 140의 HBc 서열을 포함하는, HBc 분자의 N-말단 163개 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 HBc 분자의 N-말단 156개 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 HBc 분자의 N-말단 149개 아미노산 잔기의 약 125개 이상, 바람직하게는 약 135개 이상의 HBc 서열을 함유한다.
키메라 단백질 분자는 또한, (a') HBc 프리코어 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에서 1 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (b') HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 및 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 해당 분자의 C-말단을 향한 1 내지 약 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)] 중의 하나 또는 둘 다를 함유한다.
키메라 분자는 HBc 서열 내에 약 20% 이하의 치환된 아미노산 잔기를 함유하고, 숙주 세포에 의한 발현시 실질적으로 핵산과 결합하지 않는 입자로 자가-어셈블리된다. 이러한 입자는 바람직하게는, 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 중에서 37℃ 하에 1개월 동안 저장한 후, 위치 48 및 107에서 양 시스테인 잔기를 함유하는 그 밖의 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자 보다 더 안정적이다. 고려된 키메라 분자는 또한 바람직하게는, 증강된 발현 양을 나타낸다.
이러한 양태의 키메라 단백질은 전술된 바와 같이, 키메라의 N-말단, HBc 면역우성 루프 내에(즉, 잔기 위치 약 76 내지 약 85 사이) 또는 C-말단 중의 하나 이상에 펩티드-결합된 이종 아미노산 잔기 서열을 임의로 함유한다. HBc 면역원성 루프 서열 내에서는, (i) HBc 위치 약 76 내지 약 85의 서열 중의 제로(0) 내지 모든 잔기가 존재하거나 대체되고; 접합된 합텐에 대한 화학적-반응성 링커 잔기 또는 항-항원을 구성하는 약 40개 이하의 잔기 서열, 또는 면역원을 구성하고 HBc 루프에 대해 이종인 1 내지 약 245개, 바람직하게는 약 75개 이하의 아미노산 잔기와 펩티드 결합될 수 있거나, (ii) 위치 약 76 내지 약 85에서의 HBc의 서열이 존재하고 결실물과 이종 잔기를 함유하지 않거나, 또는 (iii) 위치 약 76 내지 약 85의 잔기 중의 하나 이상이 부재이거나 대체된다.
앞서 인지된 바와 같이, 고려된 키메라 분자는 (i) 도 1 및 서열번호 1에 예시된 바와 같이 HBc의 N-말단에 기준하여 약 -20 내지 약 +1의 위치에 존재하거나 또는 (ii) HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 및 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 해당 분자의 C-말단을 향해 존재하거나, 또는 위치 (i)과 (ii) 둘 다에 존재하는 1개 이상의 시스테인 잔기를 함유한다. 음성 아미노산 위치의 개념은 리더 서열, 예를 들면, HBc의 프리코어 서열과 통상 연관이 있다. 이러한 개념은 HBc의 위치 +1의 출발 메티오닌 잔기에 상응하는 키메라의 위치를 결정하기 위해, 서열번호 1의 서열과 소정의 키메라 분자 서열을 간단히 정렬할 수 있다는 점에서 본원에서 유사하게 사용된다. 아미노산 잔기 서열은 통상 좌측에서 우측으로, N-말단에서부터 C-말단까지의 방향으로 제시되기 때문에, HBc 출발 메티오닌에 의해 점유될 수 있는 위치의 좌측으로 정렬된 어떠한 키메라 분자 잔기도 음성 위치를 갖는다. 고려된 시스테인 잔기는 출발 메티오닌에 상응하는 위치에 대해 정렬된 HBc의 출발 메티오닌의 좌측까지 약 20개 잔기 위치에 존재할 수 있다.
또 다른 국면에서는, 바람직한 HBc 키메라가 약 135 내지 약 360개 L-α-아미노산 잔기 서열을 가지며, 4가지 일련의 펩티드 연결된 도메인, 즉 도메인 I, II, III 및 IV를 함유한다. 이들 4가지 도메인은 전술된 키메라 및 본래의 단백질과 동일한 방식으로 함께 연결시키는데; 즉 이들 4가지 도메인은 α-아미노산 이외의 잔기를 함유하므로 펩티드 결합을 형성할 수 없는 폴리펩티드, D-아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드, 또는 둘 이상의 폴리펩티드가 아미노산 잔기 측쇄를 통하여 작동적으로 연결되는 올리고펩티드 접합체와 비교해서, 서로 펩티드 결합된다. 따라서, 고려된 키메라 HBc 단백질은, 통상적인 재조합 기술 방법을 사용하여 발현함으로써 제조할 수 있다.
상기 키메라 분자의 도메인 I은 약 72 내지 약 160개 아미노산 잔기를 포함하고, 이의 서열에는 (i) 적어도 HBc의 위치 4 내지 위치 약 75의 잔기 서열, (ii) HBc 프리코어 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1, 바람직하게는 아미노산 위치 -14 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에 존재하는 0 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (iii) 면역원성 에피토프(면역원)를 포함하는 HBc 잔기 2-4 중의 하나와 펩티드 결합된 약 75개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 임의 서열이 포함된다. 이러한 면역원성 서열은 존재하는 경우에, 전형적으로 B 세포 면역 반응을 유도시키는데 사용되는 에피토프이다.
상기 키메라 분자의 도메인 II는 도메인 I의 HBc 잔기 약 75와 펩티드 결합된 약 60개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는데, 여기서
(i) HBc 위치 약 76 내지 약 85의 서열 중의 0 내지 모든 잔기가 존재하거나 대체되고; 접합된 합텐에 대한 화학적-반응성 링커 잔기를 포함하거나 항-항원을 구성하는 1 내지 약 40개 아미노산 잔기 서열, 또는 면역원을 구성하고, HBc에 대해 이종인 1 내지 약 50개 아미노산 잔기와 펩티드 결합되거나, 또는
(ii) 위치 76 내지 약 85에서의 HBc 서열이 존재하고 이종 잔기가 존재하지 않는다.
HBc 위치 약 76 내지 약 85의 서열 중의 0개 잔기가 상기 키메라 또는 또 다른 키메라에 존재하고, HBc에 대해 이종인 1 내지 약 50개 아미노산 잔기와 펩티드 결합되는 상황 하에서는, 이들 잔기가 부재하고 위치 약 75의 HBc 잔기는 이종 서열의 N-말단 잔기와 직접적으로 결합된다(이의 C-서열 말단 잔기는 HBc 위치 약 86에서의 잔기와 펩티드 결합된다). HBc 위치 약 76 내지 85에서의 잔기 모두가 부재하는 상황은 바람직하지 않으며, 상기 서열로부터의 4개 이상의 서열이 존재하는 것이 바람직하고, 상기 잔기 중의 10개 모두 또는 이의 대체물이 존재하는 것이 가장 바람직하다.
한 가지 바람직한 양태에서는, 위치 76 내지 85의 10개 잔기 서열(위치 76-85 서열)이 존재하지만, 면역원-함유 서열의 1 내지 약 50개 잔기, 또는 항-항원-함유 서열 또는 링커-함유 서열의 1 내지 약 40개 잔기에 의해 개입 차단된다. 또 다른 양태에서는, HBc 위치 76-85의 10량체 서열이 HBc 위치 76 및 82에서 2개의 대체 시스테인 잔기와 함께 존재하고, 이에는 앞서와 같이 50개 이하 잔기의 차단 서열이 포함된다.
도메인 III은 도메인 II의 잔기 85와 펩티드-결합된 위치 약 86에서부터 위치 약 135까지의 HBc 서열이다.
키메라 분자 도메인 IV는
(i) 도메인 III의 위치 135의 잔기와 펩티드-결합된 위치 136에서부터 약 149까지의 HBc 아미노산 잔기 서열의 5 내지 14개 잔기,
(ii) 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 0 내지 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)], 및
(iii) HBc 위치 약 150에서부터 C-말단까지의 HBc에 존재하지 않는 면역원성 서열 중의 0 내지 약 75개 아미노산 잔기
를 포함한다.
HBc 위치 약 136에서부터 약 163까지의 서열이 도메인 IV에 존재할 수 있지만, 키메라의 HBc 부분이 서열 위치 156에서 중단되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 도메인 IV가 상기 HBc 위치들이 부재하는 서열 중의 0 내지 약 50개 아미노산 잔기 서열, 보다 바람직하게는 0 내지 약 25개 잔기 서열을 함유한다. 따라서, 위치 약 163 내지 약 183의 영역 내에 존재하지 않는 HBc로부터의 추가 서열을 사용하는 것이 도메인 IV에 대해 고려된다. 이러한 서열 중의 하나가 HBc 위치 85 내지 100 또는 93 내지 100의 T 세포 에피토프이다. 도메인 IV는 또한 바람직하게는, 해당 분자의 C-말단에 또는 C-말단 근처에 1개의 시스테인 잔기를 함유한다.
키메라 분자는 (i) 아미노산 잔기의 약 10% 이하가 키메라의 HBc 서열에서 치환되고, (ii) 숙주 세포에 의한 발현시 입자로 자가-어셈블리되는 아미노산 잔기 서열을 갖는다. 이러한 입자는 핵산 분자와 실질적으로 결합하지 않으며, 바람직하게는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 중에서 37℃ 하에 1개월 동안 저장한 후, 위치 48 및 107에서 양 시스테인 잔기를 함유하는 그 밖의 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자 보다 더 안정적이다.
한 국면에서, 고려된 키메라 분자는 HBc 잔기 2-4 중의 하나와 펩티드 결합된 N-말단에서 에피토프를 포함하는 서열을 함유한다. 또 다른 국면에서, 고려된 키메라 분자는 면역우성 루프 내의 HBc 잔기 76과 85 사이에 위치한 분자 중앙 근처에 펩티드 결합된 링커 잔기-함유 서열, 면역원-함유 서열 또는 항-항원-함유 서열을 함유한다. 추가 국면에서는, 면역원-함유 서열이 HBc 잔기 136-149 중의 하나, 잔기 140-156 중의 하나, 또는 잔기 140-163 중의 하나와 펩티드 결합된 키메라 분자의 C-말단 부분에 위치한다.
기타 국면에서, 2개 또는 3개의 면역원-함유 서열이 상기 위치에 존재하거나, 또는 1개 또는 2개의 면역원-함유 서열이 에피토프에 대한 링커 잔기와 함께 존재한다. 다중 면역원은 2개 또는 3개 위치에서 동일한 것일 수 있거나, 또는 특정한 면역원의 이량체 또는 삼량체가 하나 이상의 위치에 존재할 수 있다. 이들 키메라 분자 각각은 또한, 전술된 바와 같이 N-말단 또는 C-말단 시스테인 잔기(들) 중의 하나 또는 둘 다를 함유한다. 이들 면역원, 키메라 분자 및 이들의 자가-어셈블리된 입자 몇 가지에 관한 구체적인 예가 다음에 논의된다.
한 가지 바람직한 HBc 키메라 분자는 약 130 내지 약 355개 아미노산 잔기를 함유할 수 있고, 위치 48 및 107에서의 시스테인 잔기들 중의 어느 하나 또는 둘 다에 대한 대체 잔기를 함유하고, 천연의 HBc 분자에는 존재하지 않는 하나 이상의 부가된 N- 또는 C-말단 안정화 시스테인 잔기를 함유한다. 몇몇 바람직한 양태에서는, HBc 잔기 4가 존재하는 반면, 잔기 2-4는 기타 바람직한 양태에 존재하기 때문에, 도메인 I은 HBc 잔기 4, 3 또는 2에서 시작하여 잔기 75까지 지속될 수 있는데, 즉 HBc 위치 75에서의 HBc 잔기까지 지속된다. 잔기 1은 DNA 출발 코돈의 아미노산인 메티오닌이다. 키메라가 N-말단 면역원성 서열 또는 시스테인 잔기(들)을 함유하는 경우에는, HBc의 위치 1에 통상적으로 존재하는 본래의 메티오닌이 부재하여, 단지 1개의 출발 시그널 만이 암호화 DNA 또는 RNA에 존재하도록 한다.
도메인 I은 또한, HBc 프리코어 서열 이외의 서열에서 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단으로부터 아미노산 위치 -20 내지 약 +1, 바람직하게는 아미노산 위치 -14 내지 약 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에 0 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)]를 함유할 수 있다.
도메인 II의 면역우성 루프 내에 또는 도메인 I 내에 존재할 수 있는 이종 면역원성 면역원은 바람직하게는, 약 15 내지 약 50개 잔기를 함유하지만, 약 6개 아미노산 잔기 정도로 짧은 에피토프가 유도될 수 있고, 항원에 의해 인식될 수 있으므로, 유용하고, 약 75량체 서열이 도메인 I 중의 N-말단에 존재할 수 있다.
하나 이상의 기타 잔기에 의해 개입 차단되긴 하지만, 위치 76에서부터 위치 85까지의 도메인 II의 HBc 잔기 모두가 존재하는 것이 바람직하다. 도메인 II는 바람직하게는, 발현 또는 사용을 방해하지 않는 어떠한 서열도 가질 수 있지만, 바람직하게는 위치 75 내지 85 잔기 사이 서열의 일부인 4개 이상의 서열을 함유한다. 한 양태에서는, 루프 위치 76 및 82의 잔기를 돌연변이시키고 시스테인 잔기로 대체시켜, 루프의 추가 안정화를 달성할 수 있도록 한다.
도메인 III은 잔기 85와 펩티드 결합된 HBc 잔기 86 내지 135를 함유한다.
도메인 IV는 (i) 잔기 135와 펩티드-결합된 HBc 위치 136에서부터 140까지, 또는 잔기 163까지, 바람직하게는 위치 156까지, 보다 바람직하게는 위치 149까지의 잔기 서열과, (ii) 0 내지 3개의 시스테인 잔기로 구성된 5개 이상의 잔기 서열을 함유하고, (iii) 특히 HBc 서열이 잔기 140에서 종결되는 경우에는, 약 75개 이하 잔기의 면역원성 에피토프 서열을 임의로 함유할 수 있지만, 약 25개 이하 정도로 더 짧은 서열이 보다 바람직하다.
상기 도메인 IV 면역원성 서열은 바람직하게는, 위치 약 163에서부터 HBc C-말단까지의 HBc 서열에 대해 이종이다. 도메인 IV에 존재하는 경우의 면역원성 서열은 바람직하게는 T 세포 에피토프이지만, 이는 도메인 I 및 II 중의 어느 하나 또는 다른 하나에 통상 존재하는 바와 같은 B 세포 에피토프일 수도 있다. HBc 서열, HBc의 preS1 및 preS2 영역, 및 기타 공급원으로부터의 B 세포 및 T 세포 에피토프의 예가 다음 표 A 및 B에 제공되어 있다.
도메인 IV는 또한, 0 내지 3개의 시스테인 잔기를 함유할 수 있고, 이러한 Cys 잔기는 키메라 분자의 카복시-말단(C-말단)의 약 30개 잔기 내에 존재한다. 바람직하게는, 1개의 시스테인(Cys) 잔기가 존재하고, 이러한 Cys는, T 세포 에피토프가 도메인 IV의 일부로서 존재하지 않는 한은 카복시-말단(C-말단) 잔기로서 존재하는 것이 바람직하다. 이러한 T 세포 에피토프가 존재하는 경우에는, 상기 바람직한 Cys가 HBc 키메라의 C-말단 마지막 5개 잔기 내에 존재하는 것이 바람직하다.
한 양태에서, 특히 바람직한 키메라는 2개의 면역원성 에피토프 서열을 함유한다. 이들 2개의 면역원성 에피토프 서열은 도메인 I과 II, 또는 II와 IV, 또는 I와 IV에 존재한다. 이러한 2개의 면역원성 에피토프 서열 중의 하나가 몇몇 양태에서는 바람직하게 B 세포 에피토프이다. 기타 양태에서는, 상기 2개의 면역원성 에피토프 서열 중의 하나가 T 세포 에피토프이다. 보다 바람직하게는, 2개의 면역원성 에피토프가 상이한 B 세포 및 T 세포 에피토프이다. 또한, 다수의 T 세포 에피토프가 T 세포 에피토프 위치에 존재할 수 있는 바와 같이, 다수의 B 세포 에피토프가 B 세포 에피토프 위치에 존재할 수 있다.
키메라 분자가 도메인 II 중에 면역원성 에피토프 서열을 함유하는 양태에서는, 상기 서열이 하나 이상의 B 세포 에피토프를 함유하고, 아미노산 잔기 76 내지 85 사이의 HBc 서열이 존재하지만, 면역원성 에피토프(들)에 의해 개입 차단되며, 키메라가 HBc 잔기 140-156 중의 하나와 펩티드 결합된 도메인 IV 중의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
이와 동일한 선호도는 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기가 도메인 II에 존재함으로써, 도메인 II에 하나 이상의 면역원성 에피토프를 제공해주는데, 잔기 76 내지 85가 존재하지만, 상기 이종 링커 잔기에 의해 개입 차단되고, HBc 잔기 140-156 중의 하나와 펩티드 결합된 T 세포 에피토프가 존재하는 키메라 분자에 대해서도 유지된다. 이러한 키메라 분자로부터 형성된 입자는 전형적으로, 접합된 에피토프 대 C-말단 펩티드 결합된 T 세포 에피토프의 비율 약 1:4 내지 1:1를 함유하는데, 약 1:2의 비율이 통상적이다.
상기 언급된 키메라 분자의 예시 구조에서는, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기가 도메인 II에 존재하고 T 세포 에피토프가 도메인 IV에 존재하는데, 부가의 B 세포 에피토프는 도메인 II에 전혀 존재하지 않는다. 이러한 키메라는 후술되는 바와 같은 ELISA 검정에서 항-루프 모노클로날 항체의 결합에 의해 측정된 바와 같이 최소한의 HBc 항원성을 나타내면서, T 세포 에피토프의 면역원성을 나타낸다.
고려된 바람직한 HBc 키메라 분자는 약 135 내지 약 360개 잔기 서열을 함유한다. 각각 약 15 내지 약 75개 잔기의 바람직한 길이를 갖는 1개 또는 2개의 면역원성 에피토프를 함유하고, 약 140 내지 약 156개 잔기의 바람직한 HBc 부분 길이를 함유할 수 있는 바람직한 HBc 키메라 분자는 약 170 내지 약 280개 아미노산 잔기 서열 길이를 갖는다. 1개 또는 2개의 면역원성 에피토프를 함유하는 특히 바람직한 키메라 분자는 약 190 내지 약 225개 잔기 길이를 갖는다. 부가된 면역원성 에피토프를 함유하지 않는 특히 바람직한 키메라 분자는 약 140 내지 약 156개 잔기 길이를 가질 수 있다. N-말단 및 C-말단 HBc 위치 길이가 다양하고, 면역원성 루프 내에 삽입될 수 있는 몇 가지 고려된 에피토프의 길이가 상이하다는 측면에서 보면 광범위한 키메라 분자 길이가 고려된다는 것을 인지해야 한다.
숙주 세포에 의한 발현 후, 고려된 재조합 단백질은 자가-어셈블리하여 실질적으로 핵산과 결합하지 않는 입자를 형성한다. 이와 같이 고려된 HBc 키메라 입자는 일반적으로 구형이고, 소정의 제제에 대해 크기 면에서 통상 균질하다. 따라서, 이들 키메라 입자는 유사한 외형과 크기를 갖는 본래의 HBc 입자를 닮았으므로, 감염 환자로부터 회수할 수 있다.
고려된 키메라 입자는 앞서 논의된 키메라 분자를 포함한다. 보다 광범위하게 언급하면, 상기 키메라 입자는 N-말단 163개 잔기 중의 약 125개 이상, 바람직하게는 약 135개 이상 서열을 갖는 키메라 C-말단 절단된 HBc 단백질을 포함하고, (i) N-말단, C-말단 또는 면역우성 루프 내의 하나 이상과 펩티드 결합된 면역원성 에피토프, 또는 면역우성 루프 중의 에피토프에 대한 이종 링커 잔기, 및 (ii) 전술된 바와 같이 N-말단과 C-말단 중의 하나 또는 둘 다에서의 1 내지 3개의 시스테인 잔기, 및 위치 135로부터의 5개 이상의 HBc 잔기 서열을 함유한다.
고려된 입자는 바람직하게는, 도메인 IV 중에 아르기닌 및/또는 리신 잔기를 충분히 함유하지 않기 때문에, 자가-어셈블리된 입자는 실질적으로 핵산 결합을 포함하지 않고, 다음에 논의되는 바와 같이 약 0.9 내지 약 1.7, 보다 바람직하게는 약 1.2 내지 약 1.7의 280/260 흡광도 비를 나타낸다. 따라서, 바람직한 키메라 단백질은 위치 163과 183 사이의 HBc 서열을 함유하지 않고, 보다 바람직한 키메라 단백질은 위치 156과 183 사이의 HBc 서열을 함유하지 않는다. 특히 바람직한 HBc 키메라 분자는 키메라 분자의 HBc 위치 149에서부터 C-말단까지 9개 미만의 아르기닌 및 리신 잔기, 및 이들의 혼합물을 함유한다.
고려된 입자에 의해 나타난 핵산 결합의 실질적 부재는 280 및 260nm에서 측정된 수용액 중에서의 해당 입자의 흡광도, 즉 280/260 흡광도 비를 비교함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 고려된 입자는 단백질을 발현하기 위해 사용되어 온 유기체의 세포 내에 본래 존재하는 올리고머성 및/또는 중합체성 DNA 및 RNA 종인 핵산과 실질적으로 결합하지 않는다. 이러한 핵산은 260nm에서 흡광도를 나타내고, 280nm에서는 비교적 덜한 흡광도를 나타내는 반면, 고려된 키메라와 같은 단백질은 260nm에서는 비교적 덜한 흡광도를 나타내고 280nm에서는 보다 큰 흡광도를 나타낸다.
따라서, 당해 분야에서 프로타민 영역으로서 종종 지칭되는 잔기 위치 150-183(또는 150-185)에서 아르기닌- 및 리신-풍부 서열을 함유하는 재조합적으로 발현된 완전한 길이의 HBc 입자 또는 키메라 HBc 입자는 260nm에서의 흡광도에 대한 280nm에서의 흡광도 비(280/260 흡광도 비)가 약 0.8이다. 위치 163까지의 HBc 서열을 포함하는 입자는 280/260 흡광도 비가 약 0.9 내지 약 1.0이며, 에티듐 브로마이드로 핵산에 대해 양성적으로 염색시킨다.
또 다른 한편, 자가-어셈블리된 입자가 실질적으로 핵산 결합을 함유하지 않도록 도메인 IV 중에 아르기닌 및 리신 잔기를 충분히 함유하지 않는 입자, 예를 들면, 3개 미만의 아르기닌 또는 리신 잔기, 또는 서로 인접한 이의 혼합물을 함유하는 입자 처럼, 또는 HBc 잔기 위치 약 140 내지 위치 149에서 종결되는 본래 또는 키메라 서열을 갖는 입자 처럼 천연 HBc의 아르기닌-풍부 핵산 결합 영역을 함유하지 않는 입자는 약 1.2 내지 약 1.7의 280/260 흡광도 비를 나타낸다. 보다 전형적인 280/260 흡광도 비는 약 1.4 내지 약 1.7이다. 이러한 범위는 소정의 키메라 HBc 입자의 도메인 II 및 IV에 존재하는 방향족 아미노산 잔기의 수에 상당 부분 기인된 것이다.
상기 논의된 N-말단 및/또는 C-말단 시스테인 잔기(들)가 존재하는 것이, 안정한 면역원성 입자를 형성할 수 있는 키메라 분자의 능력을 증강시켜 준다(다음에 논의됨). 또한, 위치 48 및 107 중의 하나 또는 둘 다에서 본래의 시스테인을 대체시키는 것이, N-말단 및/또는 C-말단 시스테인 잔기(들)에 의해 제공된 것 이외에, 상기 형성된 입자의 안정성을 증강시켜 준다. 따라서, 고려된 HBc 키메라 입자 면역원은 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같이 수집 및 초기 정제시, 및 비-환원성 SDS-PAGE에 의한 분석시 함께 체류하는 입자를 형성하는 경향이 있다(이에 대한 상세 내역은 다음에 논의된다).
고려된 입자는 전형적이고도 바람직하게는, 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 중에서 37℃ 하에 1개월 동안 저장한 후, 위치 48 및 107에서 양 시스테인 잔기를 함유하는 그 밖의 동일한 HBc 키메라 분자로부터 형성된 입자 보다 더 안정적이다. 증강된 안정성의 예가 다음 실시예에 보다 상세히 논의되어 있다.
고려된 바람직한 키메라 HBc 단백질의 도메인 I은 적어도 아미노산 잔기 위치 4에서부터 위치 75까지의 HBc의 아미노산 잔기 서열로 구성되고, 도메인 III은 위치 86에서부터 위치 135까지의 HBc 서열로 구성된다. 이들 도메인은 위치 48 및 107 중의 하나 또는 둘 다에서 도 1에 도시된 본래의 서열 내에 존재하는 시스테인 잔기를 또 다른 잔기로 1회 이상 대체시킨 것을 포함한다. 포유류 헤파드나바이러스 중의 어떠한 것으로부터의 서열도 도메인 I 및 III 중의 어느 하나에 대해 사용할 수 있으며, 둘 이상 바이러스로부터의 서열을 하나의 키메라에 사용할 수 있지만, 상기 인지된 위치 48 및 107에서 하나 또는 둘 다의 시스테인 잔기를 대체시키는 것은 사용된 모든 서열과 관련이 있다. 작제를 용이하게 하기 위해서는, 바람직하게는 사람 ayw 서열을 키메라 전반에 걸쳐 사용한다.
첫 번째 3개의 아미노-말단(N-말단) 잔기의 결실 보다 더 많은 것을 함유하는 도메인 I을 갖는 HBc 키메라는 이. 콜리 세포에서 HBc 키메라 단백질의 완전한 소멸을 초래하는 것으로 보고된 바 있다[참조: Pumpens et al., (1995) Intervirology, 38:63-74]. 한편, 인플루엔자 M2 단백질로부터의 면역원성 23량체 폴리펩티드를 HBc N-말단 서열에 융합시킨 최근의 연구 결과는, 이로써 생성된 융합 단백질이, 본래의 HBc 서열의 잔기 1-3을 대체시킨 경우에 입자를 형성하였다고 보고하였다[참조: Neirynck et al. (October 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163]. 따라서, 상기 분야는, 부가된 아미노산 서열이 HBc의 잔기 2-4 중의 하나와 펩티드-결합된 채로 존재하는 경우에 입자가 형성될 수 있는 반면, 부가의 서열이 전혀 존재하지 않고 잔기 1-3 보다 더 많은 것이 HBc의 N-말단으로부터 결실되는 경우에는 입자가 형성되지 않는다고 교시하고 있다.
HBc의 처음 5개의 N-말단 잔기 중의 하나와 펩티드-결합된 N-말단 에피토프 서열은 면역원성 서열을 포함하는 약 30개 이하의 잔기 서열 또는 단일 시스테인 잔기를 함유할 수 있다. 1 내지 3개의 시스테인 잔기가 상기 서열 중의 적당한 위치에 존재할 수 있지만, 전형적으로는 부가된 서열의 C-말단 근처에 존재하므로, 부가된 N-말단 시스테인 잔기(들)는 서열번호 1에 제시된 바와 같이 HBc N-말단을 기준으로 하여 약 -20 내지 약 +1의 위치, 보다 바람직하게는 약 -14 내지 약 +1의 위치에 존재한다. 이러한 서열의 예에는 후술되는 바와 같은(각각 표 A 및 B) B 세포 또는 T 세포 에피토프; 2개의 시스테인 잔기와, 약 6개 이상 잔기를 함유하는 상기 서열의 변이체를 포함하는, 상기 네이린크(Neirynck) 등의 인플루엔자 M2 단백질로부터의 23량체 폴리펩티드; 사용된 발현 시스템의 결과로서 융합 단백질에서 생성될 수 있는 바와 같은 β-갈락토시다제 등의 또 다른(이종) 단백질의 서열; 또는 또 다른 B형 간염-관련 서열, 예를 들면, PreS1 또는 PreS2 영역으로부터의 서열 또는 주요 HbsAg 면역원성 서열이 포함된다.
루프 영역인 도메인 II는 0 내지 약 255개 아미노산 잔기 서열을 함유한다. 이들 잔기 중에서, 0개(없음), 바람직하게는 4개 이상 잔기, 보다 바람직하게는 8개 이상 잔기, 가장 바람직하게는 10개 잔기가 위치 약 76에서부터 위치 약 85까지의 HBc 서열 부분으로 구성되고, 1 내지 약 245개 잔기, 바람직하게는 1 내지 약 50개 잔기가 HBc에 대해 이종(외래)이거나, 또는 HBc의 위치 약 76-85에 적어도 존재하지 않으며, 면역원성 서열, 예를 들면, B 또는 T 세포 에피토프, 항-항원성 서열, 또는 합텐에 연결시키기 위한 화학적 반응성 잔기를 함유하는 서열에 상응한다.
보다 특히, 면역우성 루프 내에 존재하는 이종 서열은 (i) B 세포 또는 T 세포 에피토프와 같은 에피토프에 대한 이종 링커 잔기, 또는 항-항원성 잔기 또는 서열을 함유하는 약 40개 이하의 잔기 서열, 또는 (ii) 바람직하게는 6 내지 약 50개, 보다 바람직하게는 약 15 내지 약 50개, 가장 바람직하게는 약 20 내지 약 30개 아미노산 잔기를 함유하는 면역원성 B 또는 T 세포 에피토프로 구성될 수 있다. 이들 하나 이상의 잔기는, 이들이 HBc 서열의 위치 약 76에서부터 약 86까지의 잔기들 중의 0개, 또는 바람직하게는 4개 이상, 보다 바람직하게는 8개 이상, 또는 이들 잔기 전부와 펩티드 결합되도록 위치시킨다. 면역원성 B 세포 에피토프 서열은 바람직하게는, HBc 서열 내로 펩티드 결합되거나, 또는 링커 잔기에 의해 상기 위치에서 결합되며, B 세포 에피토프의 사용은 다음에 예시적으로 논의된다.
바람직하게는 루프(도메인 II) 내에 존재하는 상기 바람직한 4개 이상의 HBc 잔기는 하나의 서열, 예를 들면, 잔기 82-85에 전부 존재할 수 있거나, 또는 이종 링커 잔기의 (플랭크) 중의 어느 한 면 상에서 분할될 수 있어, 잔기 76-77과 84-85가 존재하거나 잔기 76과 83-85가 존재한다. 더욱 바람직하게는, 도메인 II가 잔기 76에서부터 85까지의 HBc 서열 중의 8개 이상의 잔기를 함유한다. 가장 바람직하게는, 위치 76에서부터 85까지의 모든 10개 잔기 서열이 당해 키메라에 존재한다.
HBc 루프 서열에 부가된 1 내지 약 245개 잔기는 HBc 서열에 대해 이종일 수 있거나, 또는 위치 약 76-85에서 HBc 서열 이외의 서열인 HBc 서열의 하나 이상의 면역원성 부분에 상응할 수 있다. 따라서, 이러한 서열은 HBc 중의 삽입 위치에 대해 이종이다. 부가된 단일 이종 잔기는 전술된 바와 같이, B 세포 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 항-항원일 수 있다. 보다 긴 서열, 전형적으로는 전술된 바와 같은 6개 이상 아미노산 잔기 길이 내지 약 50개 아미노산 잔기 길이, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 약 50개의 잔기 길이가, 제한 부위에 의해 암호화된 이종 잔기를 제외하고는 B 세포 또는 T 세포 에피토프와 같은 면역원을 포함하는 서열 내에 존재한다.
키메라의 N-말단, 면역원성 루프 내에 또는 C-말단 중의 하나 이상에서 HBc 키메라 내에서의 발현에 유용하고, 고려된 키메라의 발현 후 링커 잔기에 대한 양 연결에도 유용한 펩티드 B 세포 에피토프의 예가, 해당 서열을 생성시킨 유전자에 대해 제공된 통상 명칭, 공개된 에피토프에 대한 인용 참조문헌 또는 특허, 및 서열번호와 함께, 다음 표 A에 제시되어 있다:
Figure 112005030872065-pct00001
Figure 112005030872065-pct00003
Figure 112005030872065-pct00004
Figure 112005030872065-pct00005
Figure 112005030872065-pct00006
Figure 112005030872065-pct00007
Figure 112005030872065-pct00008
* 공개된 에피토프에 대한 참조문헌이 다음 표 B에 제공된다.
서열번호 44의 인플루엔자 A M2 폴리펩티드 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8TX10X11RX13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24의 경우:
잔기 X1 내지 X8은 부재 또는 존재하고, 존재하는 경우에는, 각각 M2 단백질 서열 내에 천연적으로 존재하는, 메티오닌, 세린, 루이신, 루이신, 트레오닌 또는 프롤린, 글루탐산, 발린 및 글루탐산 잔기인데, 단 하나의 아래첨자 X 잔기가 존재하는 경우에는, 8까지 중에서 보다 높은 숫자의 아래첨자를 갖는 잔여 아래첨자 X가 또한 존재하며;
X10은 존재하고, 이는 프롤린, 루이신 또는 히스티딘이고;
X11은 존재하고, 이는 이소루이신 또는 트레오닌이고;
X13은 존재하고, 이는 아스파라긴 또는 세린이고;
X14는 존재하고, 이는 글루탐산 또는 글리신이고;
잔기 X15 및 X16은 존재 또는 부재이고, 존재하는 경우, 이는 각각 트립토판 및 글리신 또는 글루탐산이고;
잔기 X17 및 X19은 존재 또는 부재이고, 존재하는 경우, 이는 독립적으로 시스테인, 세린 또는 알라닌이고;
잔기 X18은 존재 또는 부재이고, 존재하는 경우, 이는 아르기닌 또는 리신이고;
잔기 X20 내지 X24는 존재 또는 부재이고, 존재하는 경우, 각각 M2 단백질 서열 내에 천연적으로 존재하는, 아스파라긴 또는 세린, 아스파르트산 또는 글리신, 세린, 세린 및 아스파르트산 잔기인데, 단 하나의 아래첨자 X 잔기가 존재하는 경우에는, 15 아래 중에서 보다 낮은 숫자의 아래첨자를 갖는 잔여 아래첨자 X가 또한 존재한다.
유사하게, 서열번호 39의 상기 바람직한 인플루엔자 A M2 서열에서는:
잔기 X1 내지 X8은 부재 또는 존재하고, 존재하는 경우에는, 각각 M2 단백질 서열 내에 천연적으로 존재하는, 메티오닌, 세린, 루이신, 루이신, 트레오닌, 글루탐산, 발린 및 글루탐산 잔기인데, 단 하나의 아래첨자 X 잔기가 존재하는 경우에는, 8까지 중에서 보다 높은 숫자의 아래첨자를 갖는 잔여 아래첨자 X가 또한 존재하며;
잔기 X15 및 X16은 존재 또는 부재이고, 존재하는 경우, 이는 각각 트립토판 및 글리신이고;
잔기 X17 및 X19은 존재 또는 부재이고, 존재하는 경우, 이는 독립적으로 시스테인, 세린 또는 알라닌이고;
잔기 X18은 존재 또는 부재이고, 존재하는 경우, 이는 아르기닌이고;
잔기 X20 내지 X24는 존재 또는 부재하고, 존재하는 경우, 각각 M2 단백질 서열 내에 천연적으로 존재하는, 아스파라긴, 아스파르트산, 세린, 세린 및 아스파르트산 잔기인데, 단 하나의 아래첨자 X 잔기가 존재하는 경우에는, 15 미만 숫자의 아래첨자를 갖는 잔여 아래첨자 X가 또한 존재한다.
이종 잔기 또는 서열 중의 어느 한 면 상에 존재하는 도메인 II의 잔여 잔기는 바람직하게는, HBc 위치 76 내지 위치 85의 잔기이다. 따라서, 예시 예에서 잔기 78 내지 82를 대체시킨 경우에는, 도메인 II 중의 키메라 서열이 76 내지 77이고, 이어서 제한 부위-암호화된 잔기, 면역원성(에피토프) 서열, 추가의 제한 부위-암호화된 잔기, 및 HBc 서열 84 내지 85가 위치한다. 잔기 78과 79 사이의 삽입 전략에 의해 제조된 키메라의 전형적인 예시 서열은 위치 2부터 78까지의 HBc 서열에 이어, 제한 부위-암호화된 잔기, 면역원성 서열, 추가의 제한 부위-암호화된 잔기, 및 HBc 서열 79 내지 85이다. 도메인 I 및 II를 통하여 고려된 기타 키메라 서열은 이들 예시와 후술되는 예시로부터 명백할 것이며, 일일이 열거할 필요는 없다.
상기 인지된 나이제리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) B 세포 에피토프 서열의 C-말단에서 펩티드 결합된 약 5 내지 약 9개 잔기 길이를 갖고 다수의 글리신 잔기를 함유하는 짧은 친수성 펩티드가 상기 서열을 함유하는 키메라 입자의 발현을 촉진시킬 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 서열번호 169의 서열 GSGDGEGG을 갖는 한 가지 유용한 짧은 펩티드가 문헌[참조: Karpenko et al., Amino Acids 18: 329-337]에 기재되어 있다.
앞서 인지된 바와 같이, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커는 아미노산 잔기 76 내지 85의 HBc 서열 내의 특정 위치에서 펩티드-결합된다. 이종 에피토프에 대한 경우와 같이, 잔기 76 내지 85의 HBc 서열이 바람직하게 존재하지만, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커에 의해 개입 차단된다. 이러한 키메라는 바람직하게는, 위치 4에서부터 적어도 위치 140까지의 HBc 서열과, 해당 키메라 단백질의 N-말단 또는 C-말단 근처에서의 시스테인 잔기를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 위치 2에서부터 149까지의 HBc 서열이 존재하지만, 이는 접합된 에피토프에 대한 이종 링커에 의해 잔기 76 내지 85가 차단되고, 키메라 분자는 C-말단 시스테인을 함유한다.
접합된 에피토프에 대한 이종 링커는 가장 바람직하게는 리신(K) 잔기이다. 티로신 및 시스테인 잔기가 링커로서 사용될 수 있는 바와 같이, 글루탐산 또는 아스파르트산, 티로신 및 시스테인 잔기도 링커 잔기로서 사용될 수 있다. 하나 이상의 링커, 예를 들면, 3개의 리신 서열이 존재할 수 있지만, 이러한 용도는 바람직하지 못한데, 이는 이러한 용도로부터, 접합된 합텐이 제1 키메라 중의 하나의 링커 및 제2 키메라 분자 중의 상이한 링커에 결합되는 이종 접합체가 형성될 수 있기 때문이라는 사실에 주목해야 한다. 미국 특허 제6,231,864 B1호에는 하나 이상의 연결성 잔기를 함유하지만, 안정화시키는 C-말단 시스테인 잔기가 결여된 HBc 키메라 분자가 기재되어 있다.
고려된 HBc 키메라에 존재하는 면역원성 에피토프 함유 서열이, 면역원성(에피토프) 서열을 (플랭킹시키는) 한 측면 또는 양 측면 상의 "가요성 링커 암"에 의해 HBc 서열 잔기로부터 분리될 수도 있다는 것에 또한 주목해야 한다. 이는 특히, 면역원성 서열이 약 30개 아미노산 잔기 길이 보다 큰 경우에 해당된다. 예시되는 가요성 링커 암 서열은 전형적으로, 약 4 내지 약 10개 글리신 잔기를 함유하는데, 이는 삽입된 서열이 그 밖의 벌징(bulging) 루프 서열로부터 외향적으로 "벌지"되도록 해주고 해당 작제물에 추가의 안정성을 부가해주는 것으로 사료된다. 이들 가요성 링커 암은 나이제리아 메닝기티디스 B 세포 에피토프 서열과 관련하여 앞서 논의된 것, 예를 들면, 서열번호 125의 펩티드와 유사하다. 예시되는 기타 가요성 링커 암 서열이 문헌[참조: Kratz et al. (March 1999) Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 96: 1915-1920]에 기재되어 있고, 이는 다음 아미노산 잔기 서열로써 예시된다:
GGGGSGGGGT (서열번호 170)
GGGGSGGGG (서열번호 171).
바로 아래의 서열은 삽입된 에피토프-함유 서열의 C-말단에서 활용되는 반면, 그 다음의 서열은 삽입된 면역원성 서열의 N- 및 C-말단 각각에서 사용된다:
GSGDEGG (서열번호 172)
GGGGSGGG (서열번호 173).
앞서 인지된 바와 같이, 도메인 III은 위치 86에서부터 위치 135까지의 HBc 서열로 구성된다. 결과적으로, 도메인 I 및 II에 대해 상기 논의된 예시적인 키메라의 서열은 연장될 수 있는데, 이로써 첫 번째 논의된 키메라가 위치 84에서부터 위치 140까지의 HBc 서열을 갖고, 두 번째 논의된 키메라가 위치 79에서부터 위치 140까지의 HBc 서열을 갖는다.
도메인 IV는 (i) 위치 136에서부터 위치 140까지의 HBc 서열을 포함하고, 임의로는 위치 149, 위치 156까지, 덜 바람직하게는 위치 163까지, 훨씬 덜 바람직하게는 위치 183까지의 HBc 서열을 포함하고, (ii) 0개 내지 3개 이하의 시스테인(Cys) 잔기를 함유하며, (iii) 위치 163, 보다 바람직하게는 위치 156 내지 C-말단에서 HBc에 대해 바람직하게는 이종인 면역원성 서열 내에 약 75개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 함유하는데, 단 도메인 IV는 위치 136에서부터 140까지의 HBc 서열 중의 5개 이상의 아미노산 잔기를 함유한다. 도메인 IV 면역원성 서열은 보다 바람직하게는, 약 50개 이하의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 약 25개 이하의 아미노산 잔기를 함유한다. 따라서, 도메인 IV 서열은 위치 약 163에서부터 C-말단까지의 C-말단 HBc 서열을 제외하고는, 실질적으로 어떠한 서열일 수도 있다.
도메인 IV 서열의 길이는 5개 잔기(즉, 위치 136에서부터 140까지의 잔기) 내지 총 3개 이하의 시스테인을 포함한 약 125개 이하 아미노산 잔기(HBc 위치 약 183 이하 + 면역원성 서열의 약 75개 이하의 면역원성 잔기)일 수 있는데, 이러한 길이는 고려된 키메라 단백질의 총 길이가 약 135 내지 약 580개 잔기를 갖기에 충분해야 한다. 도메인 I 또는 II 중의 하나 또는 둘 다와 펩티드 결합된 에피토프가, 이들 에피토프에 대한 바람직한 경우 처럼 각각 약 30 또는 50개 이하 잔기를 함유하는 경우에는, 도메인 IV 에피토프를 포함한, 해당 키메라 분자의 보다 바람직한 길이가 약 150 내지 약 280개 잔기이다. 2개의 면역원성 에피토프를 함유하는 특히 바람직한 키메라 분자는 길이가 약 190 내지 약 210개 잔기이다. 이로써 생성된 입자에 핵산 결합이 존재하지 않는다는 것은 앞서 논의된 바와 같은 280/260 흡광도 비를 측정함으로써 결정된다.
도메인 IV 서열은 0개 내지 3개 이하의 Cys 잔기를 포함할 수 있다. 존재하는 경우에는, 하나 이상의 Cys 잔기가 키메라 분자의 C-말단으로부터 약 30개 아미노산 잔기 이내에, 바람직하게는 키메라 단백질 분자의 C-말단의 약 5개 아미노산 잔기에 또는 잔기 이내에 존재하는 것이 바람직하다. 또한, 하나 이상의 Cys 잔기가 도메인 IV 서열 내에 존재하는 경우, 이들 Cys 잔기가 서로 인접해 있는 것이 바람직하다.
도메인 IV 서열이 T 세포 에피토프, 동일하거나 상이한 다수의 T 세포 에피토프, 또는 고려된 키메라가 면역원으로서 사용하도록 의도된 유기체에 대한 부가의 B 세포 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다. 예시되는 도메인 IV T 세포 에피토프 서열이 표 A에서와 같이, 다음 표 B에 제공되는데, 부가된 예시 C-말단 시스테인 잔기는 밑줄처져 있다(C):
Figure 112005030872065-pct00009
Figure 112005030872065-pct00010
Figure 112005030872065-pct00011
*밑줄친 C(C)는 본래의 서열로부터 유도된 것이 아니다.
인용문헌
Figure 112005030872065-pct00012
또 다른 유용한 T 세포 에피토프는 PADRE 에피토프로서 지칭된 합성 서열이다[참조: 미국 특허 제6,413,517호(Sette et al.)]. 서열 AKFVAAWTLKAAA(서열번호 233)을 갖는 한 가지 에피토프의 예가 문헌[참조: Alexander et al., (1994) Immunity, 5: 751-761]에 기재되어 있다.
잔기 위치 4에서부터 적어도 위치 140까지의 HBc의 아미노산 서열이, 고려된 키메라 분자 및 입자에 존재하는 것이 바람직하다. 위치 2에서부터 위치 149까지및 위치 약 163까지의 서열이 존재하는 것이 보다 바람직하다. B 세포 에피토프는 존재하는 경우, 잔기 76 내지 85에 존재하는 것이 바람직하다. HBc 위치 48 및 107에 통상적으로 존재하는 시스테인 잔기들 중의 하나 또는 둘 다를 또 다른 잔기로 대체(치환)시킨다. 적어도 단일 시스테인 잔기가, 앞서 인지된 바와 같은 도메인 I 중의 N-말단에 또는 N-말단 근처에 존재하거나, 또는 앞서 논의된 바와 같이 C-말단에 또는 C-말단 근처에 존재한다. 하나 이상의 T 세포 에피토프가 HBc 서열에 대한 N-말단 또는 C-말단 부가물로서 존재할 수도 있다. 고려된 재조합 HBc 키메라는 실질적으로 결합된 핵산을 함유하지 않는다. HBc 위치 48 및 107에 통상적으로 존재하는 시스테인 잔기들 중의 하나 또는 둘 다가, 이들 대체물을 함유하지 않는 유사한 입자, 즉 위치 48 및 107에서의 시스테인을 함유하는 키메라 보다 더 안정적이다.
고려된 재조합 HBc 키메라 분자가 전형적으로 존재하고, 이는 자가-어셈블리된 입자로서 사용된다. 이들 분자는 180 내지 240개 키메라 분자(90 또는 120개 이량체 쌍), 통상적으로 240개 키메라 분자로 구성되는데, 이는 디설파이드 환원제, 예를 들면, 2-머캅토에탄올의 존재 하에 단백질 분자로 분리되므로, 개개의 분자는 주로 디설파이드 결합에 의해 입자 내로 함께 결합되는 것으로 사료된다. 관찰된 안정성 증강은 위치 48 및 107에 시스테인들 중의 하나 또는 둘 다가 부재인 것에 기인된 것으로 여겨진다.
이들 입자는 HBV에 감염된 환자에게서 관찰된 입자와 유사하지만, 이는 비-감염성이다. 각종 원핵성 및 진핵성 숙주에서의 발현시, 개개의 재조합 HBc 키메라 분자는 입자로 어셈블리되는데, 이러한 입자는 숙주 세포로부터 용이하게 수거할 수 있으며, 경우에 따라 정제할 수 있다.
앞서 인지된 바와 같이, HBc 면역우성 루프는 통상적으로, 본래 단백질의 아미노-말단(N-말단)으로부터 약 위치 75 내지 약 85에 위치하는 것으로 언급된다. 도메인 II의 면역원성 에피토프-함유 서열은 상기 면역우성 루프 서열 내에 위치된다. 이러한 위치 설정으로 인해, 상기 어셈블리된 키메라 입자 내의 극도의 면역원성 위치에 면역원성 서열 또는 링커 잔기를 표시하면서도, HBc 루프 서열의 HBc 면역원성과 항원성을 실질적으로 제거시킬 수 있다.
각종 에피토프 및 스페이서의 앞서 논의된 N- 및 C-작제물, 삽입물 이외에도, 고려된 키메라 분자는 HBc 도메인 I, II, III 및 IV를 구성하고 있는 아미노산 잔기 내에 보존적 치환물을 함유할 수도 있다. 보존적 치환물은 앞서 규정된 바와 같다. 예시적 보존적 치환은 위치 2 및 3의 잔기(아스파르트산 및 이소루이신; DI)를, N-말단 시스테인 잔기를 포함한, 목적하는 N-말단 에피토프를 암호화하는 핵산을 부가하는데 사용되는 EcoRI 제한 부위에 의해 암호화되는 글루탐산 및 루이신(EL) 잔기로써 대체시킨 것으로 제시된다. 추가의 예시적 예는 위치 7 및 97에서의 리신 잔기를 아르기닌으로써 대체시킨 것이고, 위치 48 및 107에서의 시스테인을 세린 잔기로 대체시킨 것이다.
보다 드물게, "비-보존적" 변화, 예를 들면, 글리신을 트립토판으로 대체시키거나, 시스테인을 알라닌 잔기로 대체시키는 것이 고려된다. 유사한 소수의 변화에는 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 이들 둘 다가 포함될 수도 있다. 생물학적 활성 또는 입자 형성을 없애지 않으면서도, 아미노산 잔기를 치환, 삽입 또는 결실시킬 수 있는지를 결정하는데 있어서, 당해 분야에 널리 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, LASERGENE 소프트웨어(DNASTAR Inc., Madison, Wis.)를 사용하여 안내받을 수 있다.
본 발명의 키메라 분자의 HBc 부분, 즉 부가된 면역원, 항-항원, 링커, 가요성 링커 암 또는 이종 잔기(들)(이는 제한 효소 인공물이다)의 서열 또는 잔기 이외의 것을 갖는 HBc 서열을 지닌 부분은 가장 바람직하게는, 도 1에 제시되는 아유형 ayw의 아미노산 잔기 서열(서열번호 1)을 가지고, 한 말단 또는 양 말단에서의 절단으로 인해 존재하지 않는 아유형 ayw 서열의 일정 부분(들)은 덜 함유한다. 전형적으로, 상기 서열은 HBc 위치 2 내지 149 또는 위치 156의 서열이다. 도 1에 제시된 아유형 adw, adw2 및 adyw의 상응하는 아미노산 잔기 서열(서열번호 2, 3 및 4)이 다소 덜 바람직하다. 도 1의 마지막 두 서열인, 정렬된 위치 2 내지 149 또는 2 내지 156에서의 우드척 및 땅 다람쥐의 서열(서열번호 5 및 6)이 또한 덜 바람직하다. 그 밖에 언급된 바와 같이, 상이한 포유류 HBc 단백질로부터의 상이한 서열 부분을 단일 키메라에 함께 사용할 수 있다.
상기 언급된 바와 같은 본 발명의 키메라 분자의 HBc 부분이 위치 2 내지 약 183에 상응하는 포유류 HBc 분자의 서열 이외의 것을 갖는 경우에는, 서열번호 1과 비교해서 이러한 아미노산 잔기의 약 20% 이하가 위치 2 내지 183, 바람직하게는 위치 2 내지 163에서 치환된다. 상기 아미노산 잔기의 약 10% 이하, 보다 바람직하게는 서열번호 1과 비교해서 약 5% 이하, 가장바람직하게는 약 3% 이하가 위치 2 내지 163에서 치환된다.
따라서, 183 HBc 잔기의 고려된 키메라는 위치 2 내지 183에서 서열번호 1과는 상이한 약 36개 이하의 잔기, 바람직하게는 약 18개 잔기를 함유할 수 있다. 보다 바람직하게는, 약 9개 잔기가 잔기 위치 2 내지 183에서 ayw 서열(서열번호 1)과 상이하고, 가장 바람직하게는 약 5개 잔기가 상이하다. 보다 짧은 서열 상의 차이, 예를 들면, 2-149, 2-156 또는 2-163 상의 차이는 %를 기준으로 하여 전술된 바와 비례한다. 도메인 II의 면역우성 루프 내 또는 말단에서의 치환 이외에, 해당 키메라 분자의 비-나선상 부분에서의 치환이 바람직하고, 이는 입자 형성 보장을 도와주기 위해 전형적으로 잔기 2 내지 약 15 및 잔기 24 내지 약 50에서 이루어진다[참조: Koschel et al., (1999) J. Virol., 73(3):2153-2160].
HBc 서열이 위치 163를 벗어난 C-말단, 또는 N-말단에서 절단되거나 또는 면역우성 루프 내에 하나 이상의 결실물을 함유하는 경우, 치환된 잔기의 수는 이와 비례적으로 더 적은데, 이는 상기 서열의 총 길이가 163 잔기 보다 적기 때문이다. 해당 분자 내의 그 밖의 결실은 계산 목적상 보존적 치환으로 간주되기 때문에, 예를 들어, 도메인 III은 위치 135 대신 133에서 C-말단을 가질 경우, 2개의 잔기(134 및 135)가 계산 목적상 존재하는 것으로 추정된다.
키메라 제조
고려된 키메라 HBc 면역원은 전형적으로, 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조한다. 따라서, 특정한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 핵산 서열을, HBc를 암호화하는 전구체 서열에 가하고 이로부터 결실시켜 고려된 키메라를 암호화하는 핵산을 형성시킨다.
고려된 예시적 키메라 면역원은 전형적으로, N-말단 시스테인으로서 인플루엔자 A M2 서열 내에 존재하는 시스테인 잔기를 활용한다. HBc 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 시험관내 돌연변이 유발에 의해 상기 키메라 분자를 제조하기 위한 프라이머는 다음에 논의된다. 시스테인-함유 M2 폴리펩티드 에피토프가 N-말단에 존재하지 않는 경우에는, M2 폴리펩티드 또는 간단한 N-말단 출발 서열, 예를 들면, Met-Cys- 또는 Met-Gly-Cys-의 시스테인-함유 부분 만을 암호화하는 프라이머를 사용하여 시험관내 돌연변이 유발시킴으로써 N-말단 시스테인을 제공할 수 있다.
앞서 인지된 바와 같이, HBc 면역우성 루프는 본래의 단백질의 아미노-말단(N-말단)으로부터 위치 약 75 내지 85에 위치하는 것으로 통상 언급된다. 예시적 인플루엔자 A M2 B 세포 에피토프-함유 서열을 도메인 II의 면역우성 루프 서열 내로 위치시킬 수 있다. 이러한 위치 설정은 HBc 루프 서열의 HBc 면역원성과 항원성을 실질적으로 감소시키면서, 어셈블리된 키메라 입자 내의 극도로 면역원성인 위치에 인플루엔자 A M2 B 세포 에피토프를 표시시킨다.
2가지 전략 중의 한 가지 전략이 이종 에피토프 서열을 루프 서열 내에 위치시키는데 바람직하다. 첫 번째 전략은 면역우성 루프의 일정 부분을 암호화하는 DNA를 절단한 다음, 이를 B 세포 에피토프 등의 이종 에피토프를 암호화하는 DNA로 대체시키는 대체 전략으로 지칭된다. 두 번째 전략은 이종 에피토프를 루프 내의 인접한 잔기 사이에 삽입시키는 삽입 전략으로 지칭된다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용한 부위 지시된 돌연변이 유발을 한 가지 예시적인 대체 접근법에 사용하여, 면역우성 루프-암호화 DNA의 각 말단 근처에 있는 것인, 한 쌍의 상이한 제한 부위, 예를 들면, EcoRI 및 SacI를 암호화하는 키메라 HBc DNA 서열을 제공한다. 대체된 잔기의 예는 76 내지 81 잔기이다. 상기 루프 암호화 절편을 절단하고, 이종 B 세포 에피토프를 암호화하는 목적하는 서열을 상기 제한 부위에 연결하며, 이로써 생성된 DNA를 사용하여 상기 HBc 키메라를 발현시킨다. 이러한 기술의 용도 예에 대해서는 예를 들어, 문헌[Pumpens et al., (1995) Intervirology, 38:63-74]의 표 2를 참조할 수 있다.
또 다른 한편, 단일 제한 부위 또는 2개의 부위를 상기 영역 내로 도입할 수 있고, 이러한 DNA를 제한 효소(들)로 절단하여 "점착성" 또는 평활 말단을 제공할 수 있으며, 적당한 점착성 말단화 또는 평활 말단화 이종 DNA 절편을 상기 절단된 영역에 연결시킨다. HBc 내로의 이러한 유형의 서열 대체의 예가 다음 문헌에 보고된 연구에서 발견될 수 있다[참조: Schodel et al., (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 319-325; Schodel et al., Behring Inst. Mitt., 1997 (98): p. 114-119 and Schodel et al., J. Exp. Med., (1994) 180 (3): p. 1037-4]. 상기 문헌 중 후자의 2개 문헌에는 말라리아 병원체 피. 요엘리(P. yoelii) 및 피. 베르그헤이(P. berghei) 각각에 대한 백신의 제조에 관해 논의되어 있다. 면역우성 루프로부터 잔기를 완전히 제거시켜 주는 대체 전략은 본원에서는 통상적으로 사용되지 않는다.
HBc 면역원성 루프 내의 삽입 위치와 루프 잔기의 존재가 해당 면역원의 활성에 중요할 수 있다. 따라서, 공개된 PCT 국제출원 PCT/US01/25625 및 PCT/US01/41759에 예시된 바와 같이, 말라리아성 B 세포 에피토프를 HBc 잔기 위치 78과 79 사이에 위치시키는 것은, 동일한 면역원이 잔기 76 내지 81의 절단 및 대체된 영역 내에 위치시키는 것 보다 10 내지 1000배 더 면역원성인 큰 미립형(particulate) 면역원을 제공해준다. 또한, 동일한 말라리아성 면역원을 잔기 77과 78 사이에 위치시키는 것과 비교해서 78과 79 사이에 위치시키는 것이, 면역원성을 약 15배 정도 증강시키는 예상치 못한 결과를 가져다 준다.
따라서, 삽입이 일반적으로 바람직하다. 삽입 전략의 한 예시에서, 부위 지시된 돌연변이 유발을 이용하여, 서로 인접해 있고 인접한 아미노산 잔기, 예를 들면, 잔기 위치 78 및 79에서의 잔기를 암호화하는 코돈 사이에 2개의 제한 부위를 창출시킨다. 이러한 기술은 HBc 루프 내에서 이전에 인접한 잔기들 간의 4개의 아미노산 잔기(각 제한 부위에 대해 2개씩)를 암호화하는 12개 염기 쌍을 부가시킨다.
제한 효소로 절단시키고, 이종 B 세포 에피토프 서열을 암호화하는 DNA를 연결시키며 이러한 DNA를 발현시켜 HBc 키메라를 형성시키면, HBc 루프 아미노산 서열이 이의 N-말단 면 상에서, 5' 제한 부위에 의해 암호화된 2개의 잔기에 의해 개입 차단되고, 이어서 상기 이종 B 세포 에피토프에 의해 C-말단을 향하며, 3' 제한 부위에 의해 암호화된 2개 이상의 이종 비-루프 잔기가 그 다음을 따르며, 이어서 나머지 루프 서열이 이어지는 것으로 여겨진다. 이러한 동일한 전략을 문헌[참조: Neirynck et al., (October 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163]에 보고된 바와 같이 N-말단 시스테인 또는 N-말단 서열의 도메인 I 내로 삽입하는데 사용할 수 있거나 또는 하나 이상의 시스테인 잔기 또는 T 세포 에피토프의 도메인 IV 내로 삽입하는데 사용할 수 있다. 잔기 82와 83 사이의 삽입을 이용한 유사한 전략이 다음 문헌에 보고되었다[참조: Schodel et al., (1990) F. Brown et al. eds., Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 193-198].
보다 구체적으로 언급하면, C-말단 절단된 HBc 서열(HBc149)을 암호화하는 DNA 서열을 공학적으로 처리하여 잔기 78과 79 사이에 인접한 EcoRI 및 SacI 부위를 함유하도록 한다. 이러한 DNA를 양 효소로 절단하여, EcoRI 점착성 말단으로 3'-종결된 HBc 위치 1-78을 암호화하는 하나의 단편을 제공하는 반면, 다른 단편은 5' 말단 SacI 점착성 말단을 가지며 위치 79-149의 잔기를 암호화한다. 5' AATT 오버행(overhang)에 이어 목적하는 B 세포 에피토프를 암호화하는 서열 및 AGCT 3' 오버행을 갖는 합성 핵산을 연결하여, 통상적으로 EcoRI 부위는 파괴시키고 SacI 부위는 보존시키면서, 잔기 78과 79 사이에 2개의 이종 잔기[각각 GlyIle(GI) 및 GluLeu(EL)]에 의해 각 측면 상에서 플랭킹된 B 세포 에피토프를 암호화하는 HBc 키메라 서열을 제공한다.
도메인 IV 내의 시스테인 함유 서열, 예를 들면, 위치 326에서부터 위치 345까지의 피. 팔시파룸 CS 단백질 서열을 함유하고 PF/CS326-345(Pf-UTC)로서 본원에 지칭되는 말라리아성 T 세포 에피토프를 삽입하기 위한 유사한 전략을 사용할 수 있다. 여기서, EcoRI 및 HindIII 제한 부위를 아미노산 잔기 위치 149 다음의 HBc DNA 서열 내로 공학적으로 처리한다. EcoRI 및 HindIII로 분해시킨 후, 상기 AATT 5' 오버행에 이어 T 세포 에피토프 암호화 서열, 하나 이상의 정지 코돈 및 3' AGCT 오버행을 갖는 합성 DNA를 상기 분해된 서열에 연결시켜, HBc 잔기 1-149를 암호화하는 서열에 이어, 2개의 이종 잔기(GI), 이종 T 세포 에피토프, 정지 코돈 및 HindIII 부위를 형성시킨다.
SacI 제한 부위에 이어, 잔기 위치 79에서 시작하는 HBc를 암호화하는 서열을 갖는 정배향 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨 다음, SacI 및 HindIII로 분해하여, HBc 위치 79-149를 암호화하는 서열 + 2개의 부가된 잔기 및 C-말단에서의 T 세포 에피토프를 제공한다. 작제물을 SacI 및 HindIII로 분해하고, 이를 B 세포 함유 작제물과 후속 연결시키면, 도 2C에 도시되는, N-말단으로부터 HBc 위치 1-78의 서열, 2개의 부가된 잔기, B 세포 에피토프(예: 말라리아성), 2개의 부가된 잔기, HBc 위치 79-149, 2개의 부가된 잔기 및 T 세포 에피토프를 갖는 목적하는 재조합 HBc 키메라 면역원을 암호화하는 완전한 유전자가 제공된다.
유사한 기술을 사용하여, B 세포 에피토프의 접합을 위한 이종 링커 잔기를 루프 영역 서열 내에 위치시킬 수 있다. 고려된 링커 잔기에는 리신(Lys)(이것이 특히 바람직하다), 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 시스테인(Cys) 및 티로신(Tyr)이 포함된다.
서열번호 1에 제시된 아미노산 잔기 서열이 위치 77 및 78에서 Glu 및 Asp 잔기를 함유하는 것에 주목해야 한다. 그럼에도 불구하고, 부가의 이종 카복실 함유 잔기를 도입하는 것이 여전히 고려된다. 존재하는 글루탐산 및 아스파르트산의 화학적 반응성을 기타 요인에 의해 저하시킬 수 있다. 예를 들면, 당해 분야에서는, 이웃하는 프롤린, 예를 들면, 위치 79에서 발견되는 프롤린이 근접한 카복실 그룹의 화학적 반응성을 중화시킴으로써 이를 저하시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다.
첫 번째로 언급된 삽입 전략을 사용하여, 5개의 이종 잔기를 루프 서열 내에 위치시키는데; 하나의 잔기는 B 세포 에피토프를 접합시키기 위한 이종 링커 잔기가고, 2개의 잔기는 그 자체가 루프 서열 잔기에 인접해 있고 삽입된 제한 부위(제한 효소 인공물)의 발현 생성물인 상기 하나의 잔기의 어느 한 면 상에서 인접해 있다. B 세포 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를 암호화하는 HBc 루프 서열 내로 단일 코돈을 부가하기 위해 부위 지시된 돌연변이 유발을 이용할 수도 있다는 것에 주목해야 한다.
B 세포 또는 T 세포 에피토프를 플랭킹하는 어느 한 측면 상에서의 2개의 이종 잔기의 바람직한 용도는 편의 사항이라는 것에 주목해야 한다. 그 결과로서, 삽입된 서열의 어느 한 면 또는 양면 상에서 HBc 서열의 일부가 아닌 0 내지 3개 이상의 부가된 잔기를 사용할 수도 있다. 상기 삽입물 및 HBc 핵산의 한 말단 또는 양 말단을 적당한 뉴클레아제(예: S1 뉴클레아제)로 "츄잉 백(chewed back)"하여 함께 연결될 수 있는 평활 말단을 제공할 수 있다. 삽입된 B 세포 또는 T 세포 에피토프의 일부가 아닐 뿐만 아니라 HBc 서열의 일부도 아닌 부가된 이종 잔기는, 후술되는 몇몇 작제물에서 잔기 GluLeu가 AspIle를 대체하는 경우처럼, 이들 잔기가 이미 존재하는 잔기를 보존적 대체하지 않는 한은, 언급된 도메인에 존재하는 잔기 수로 계산되지 않는다.
니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)의 59 잔기 리불로스 비스-포스페이트 카복실라제-옥시게나제 시그널 펩티드를 암호화하는 177개 염기 쌍 DNA를 합성하기 위해 미국 특허 제5,656,472호에 예시 및 논의된 바와 같은 널리 공지된 합성 방법을 사용하여, 목적하는 재조합 HBc 키메라 핵산의 전부 또는 일부를 합성할 수도 있다는 것에 주목해야 한다. 예를 들면, 도메인 III 및 IV에 연결시킬 수 있는 "점착성" 말단 또는 평활 말단을 갖는 도메인 I 및 II를 합성하여, B 세포 에피토프의 0개 부가 잔기 내지 N-말단 면을 함유하고 C-말단 면 상에 또는 도메인 II/III 연결부 또는 몇몇 기타 목적하는 위치에 0 내지 3개의 부가 잔기를 함유하는 고려된 HBc 키메라를 발현하는 작제물을 제공할 수도 있다.
대안적 삽입 기술이 다음 문헌에 보고되었다[참조: Clarke et al. (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 313-318]. 여기서는, 유전 암호 축중의 이점을 고려하여, 상기 연구자들은 잔기 위치 80 및 81에 존재하는 본래의 잔기를 암호화한 상기 위치 잔기에 상응하는 단일 제한 부위를 공학적으로 처리하였다. 이로써, 이들의 발현된 HBc 키메라는 제한 부위-암호화된 잔기를 전혀 함유하고 있지 않으며, 삽입된 서열에 바로 인접한 HBc 루프의 잔기를 함유하고 있다.
앞서 기재된 HBc 키메라 분자를 암호화하는 핵산 서열(절편) 또는 이러한 암호화 서열의 상보체가 또한 본원에서 고려된다. 이러한 핵산 절편은 몇몇 바람직한 양태에서 분리 및 정제된 형태로 존재한다.
살아 있는 유기체에서, 특정 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 잔기 서열은 유전 암호를 통하여, 해당 단백질을 암호화하는 유전자의 데옥시리보핵산(DNA) 서열과 직접적인 관계가 있다. 따라서, 널리 공지된 유전 암호 축중을 통하여, 동일한 키메라 아미노산 잔기 서열을 암호화하지만, 두 서열이 고도로 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 것이 아니라 적당히 엄격한 조건 하에 하이브리드화되기에 충분한 수준으로 전술된 유전자 서열과 상이한 부가의 DNA 및 상응하는 RNA 서열(핵산)을 목적하는 바에 따라 제조할 수 있다.
고도로 엄격한 조건은 6XSSC에서 약 50 내지 55℃ 하에 하이브리드화하고 1-3XSSC에서 68℃ 하에 최종 세척하는 것을 포함하는 것으로 규정될 수 있다. 적당히 엄격한 조건은 0.2 내지 0.3M NaCl에서 약 50 내지 약 65℃ 하에 하이브리드화한 다음, 0.2XSSC, 0.1% SDS(나트륨 도데실 설페이트)에서 약 50 내지 약 55℃ 하에 세척하는 것을 포함한다.
(1) 그 자체 또는 이의 상보체가, 잔기 위치 4에서부터 136까지의 HBc 부분(존재하는 경우)이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 것인 키메라 분자를 암호화하고; (2) 적어도 적당히 엄격한 조건(상기 논의됨) 하에서 서열번호 234, 235, 236, 237, 238 또는 239의 DNA 서열과 하이브리드화되며; (3) 이의 HBc 서열이 서열번호 234, 235, 236, 237, 238 및 239의 DNA 서열과 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 동일률을 나타내는 핵산(DNA 서열 또는 RNA 서열)이 DNA 변이체 서열로서 규정된다. 널리 공지된 바와 같이, 고려된 핵산 서열과 같은 핵산 서열은 본원에 논의된 바와 같은 적당한 발현 시스템에서 적당한 프로모터에 작동적으로 연결시킬 때 발현된다.
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고려된 키메라 분자를 암호화하는 유사체 또는 유사한 핵산(DNA 또는 RNA) 서열이 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 키메라 유사체 핵산 서열 또는 이의 상보성 핵산 서열은, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 제시된 잔기 위치 4에서부터 잔기 위치 140까지의 HBc 서열 부분과 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 HBc 아미노산 잔기 서열을 암호화한다. 이러한 DNA 또는 RNA는 본원에서, 서열번호 234, 235, 236, 237, 238 및 239의 핵산 서열과 "유사하거나" 또는 이의 "유사체"로서 지칭되고, 적당히 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 서열번호 234, 235, 236, 237, 238 및 239의 핵산 서열 또는 이의 상보체와 하이브리드화된다. 적합한 형질감염 및 발현시, 유사한 서열을 암호화하는 핵산이 또한 고려된 키메라를 생성시킨다.
특별한 코돈을 특별한 아미노산 잔기를 암호화시키는데 사용하는데 있어서 상이한 숙주가 종종 선호된다. 이러한 코돈 선호도는 널리 공지되어 있고, 목적하는 키메라 서열을 암호화하는 DNA 서열을, 예를 들어, 시험관내 돌연변이 유발을 이용하여 변형시켜, 해당 효소를 발현시켜야 하는 특정한 숙주에 숙주-선호된 코돈을 활용한다. 또한, 유전 암호 축중을 사용하여, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 DNA 또는 이의 상보체와의 실질적인 동일성을 피하면서, 서열번호 234, 235, 236, 237, 238 및 239의 서열의 HBc 부분을 암호화할 수 있다. 따라서, 유용한 유사한 DNA 서열은 적당히 엄격한 조건 하에서 서열번호 234, 235, 236, 237, 238 및 239의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보체와 하이브리드화할 필요는 없지만, 이는 여전히 고려된 키메라 분자를 제공해줄 수 있다.
적합한 숙주 유기체에서 해당 유전자의 발현을 유도시키기에 적합한 프로모터, 및 상기 언급된 바와 같은 고려된 키메라를 암호화하는 유전자를 규정하는 외인성 핵산 절편(예: DNA 절편 또는 서열)에 작동적으로 연결된 벡터를 포함하는 재조합 핵산 분자(예: DNA 분자)가 또한 본 발명에서 고려된다. 보다 특히, 특정 키메라, 또는 서열번호 234, 235, 236, 237, 238 및 239의 키메라 유전자와 90% 이상의 동일률을 나타내고 적당히 엄격한 조건 하에서 하이브리드화되는 DNA 변이체의 HBc 부분에 대한 유전자를 규정하는 DNA 절편에 작동적으로 연결된 숙주 유기체 세포에서 해당 키메라의 발현을 유도시키기 위한 프로모터를 함유하는 벡터를 포함하는 재조합 DNA 분자가 고려된다.
서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 서열의 HBc 부분과 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 동일률을 나타내는 HBc 키메라 부분의 아미노산 잔기 서열을 암호화하는 유사체 핵산 서열인 DNA 절편에 작동적으로 연결된 숙주 유기체 세포에서 해당 키메라의 발현을 유도시키기 위한 프로모터를 함유하는 벡터를 포함하는 재조합 DNA 분자가 추가로 고려된다. 상기 재조합 DNA 분자는 숙주 세포에서의 적합한 형질감염 및 발현시, 고려된 키메라 분자를 제공해준다.
땅 다람쥐의 30개 아미노산 잔기 N-말단 서열이 기타 어떠한 HBc 서열과도 정렬되지 않는 다는 것을 인지해야 한다. 이러한 서열 및 이의 암호화 핵산 서열 및 이의 상보체는 상기 동일률에 포함되지 않을 뿐만 아니라 하이브리드화 결정 방법에 사용된 30-잔기 서열 또는 이의 상보체를 암호화하는 핵산 부분도 포함되지 않는다. 유사하게, HBc N- 및 C-말단 중의 어느 하나 또는 둘 다에서 절단되는 서열이 동일률 산정에 포함되지 않을 뿐만 아니라 면역우성 루프 잔기가 이종 에피토프의 삽입을 위해 제거된 서열도 포함되지 않는다. 따라서, 키메라 분자 내에 존재하는 HBc 서열 잔기 또는 HBc-암호화 염기 만이 동일률 산정에 포함되고 이러한 산정에서 정렬된 핵산 또는 아미노산 잔기 서열에 비유된다.
본원에 기재된 유전자에 대한 암호화 서열이 서열번호 234, 235, 236, 237, 238 및 239에 예시되기 때문에, 분리된 핵산 절편, 바람직하게는 DNA 서열, 이의 변이체 및 유사체는 당해 분야에 널리 공지되어 있고 문헌[참조: Current Protocols In Molecular Biology, Ausabel et al. eds., John Wiley & Sons (New York: 1987) p. 8.1.1-8.1.6]에 논의된 바와 같이, 특정 유전자에 대한 개시 ATG 코돈으로 시작하고 각 유전자에 대한 정지 코돈에서 종결시키거나 이러한 코돈 바로 하단에서 종결시키는 시험관내 돌연변이 유발에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 목적하는 제한 부위를 개시 코돈에서 또는 이러한 개시 코돈의 상단, 및 정지 코돈의 하단에서 공학적으로 처리하여, 기타 유전자를 제조, 절단 및 분리할 수 있다.
당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, 요구되는 핵산, 예시적으로 DNA 서열이 존재하는 한은(출발 및 정지 시그널 포함), 부가의 염기 쌍이 해당 절편의 어느 한 말단에 존재하고, 이러한 절편이 해당 단백질을 발현시키는데 여전히 활용될 수 있다. 물론, 이는 발현을 억제시키거나, 발현시키고자 하는 효소를 소모시키는 추가의 생성물을 발현시키거나, 상기 목적하는 효소에 의해 생성된 원하는 반응 생성물을 소모시키는 생성물을 발현시키거나 또는 상기 DNA 절편의 유전자의 발현을 간섭하는, 작동적으로 연결된 DNA 서열의 절편이 존재하지 않는다고 가정한 것이다.
따라서, 상기 DNA 절편에 이러한 차단성 DNA 서열이 존재하지 않는 한, 본 발명의 DNA 절편은 길이가 약 500 내지 약 15,000 염기 쌍일 수 있다. 복제 및 발현에 요구되는 최소 DNA 서열 전부가 경우에 따라 존재한다면, 재조합 DNA 분자, 특히 발현 벡터의 최대 크기는 대부분, 숙주 세포가 수용할 수 있는 벡터 크기에 의해 편의상 좌우된다, 최소 벡터 크기가 널리 공지되어 있다. 이러한 긴 DNA 절편은 바람직하지 않지만, 사용될 수는 있다.
전술된 키메라를 암호화하는 DNA 절편은 화학적 기술, 예를 들면, 문헌[참조: Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc., 103: 3185]의 포스포트리에스테르 방법에 의해 합성할 수 있다. 물론, 암호화 서열을 화학적으로 합성함으로써, 목적하는 어떠한 변형물도, 본래의 아미노산 잔기 서열을 암호화하는 것을 적당한 염기로 치환함으로써 간단히 제조할 수 있다. 그러나, 전술된 서열을 포함한 DNA 절편이 바람직하다.
고려된 HBc 키메라는 형질전환된 수 많은 숙주 시스템, 전형적으로 숙주 세포에서 생성(발현)될 수 있긴 하지만, 비세포성의 시험관내 시스템에서의 발현도 고려된다. 이들 숙주 세포성 시스템에는 미생물, 예를 들면, 재조합 박테리오파아지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨 세균; 효모 발현 벡터로 형질전환시킨 효모; 바이러스 발현 벡터(예: 바쿨로바이러스)로 감염시킨 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(예: 콜리플라워 모자이크 바이러스; 담배 모자이크 바이러스) 또는 세균성 발현 벡터(예: Ti 플라스미드)로 형질전환시킨 식물 세포 시스템; 또는 적당하게 형질전환시킨 동물 세포 시스템, 예를 들면, CHO, VERO 또는 COS 세포가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 이용된 숙주 세포에 의해 제한되지 않는다.
HBc 키메라를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 절편은 바람직하게는, 이러한 유전자를 함유하는 재조합 DNA 분자(플라스미드 벡터)로부터 수득한다. HBc 키메라의 단백질 내로의 키메라 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터가 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
발현 벡터는 프로모터를 포함한 발현 제어 요소를 함유한다. 키메라 암호화 유전자가 상기 발현 벡터에 작동적으로 연결되어, 프로모터 서열이 상기 키메라 암호화 유전자의 RNA 폴리머라제 결합과 발현을 지시할 수 있게 해준다. 폴리펩티드 암호화 유전자를 발현하는데 있어서 유용한 것은 문헌[참조: Poszkowski et al. (1989) EMBO J., 3: 2719 and Odell et al. (1985) Nature, 313: 810]에 기재된 바와 같이 유도성, 바이러스성, 합성, 항상성 프로모터 뿐만 아니라 문헌[참조: Chua et al. (1989) Science, 244: 174-181]에 제시된 바와 같이 시간상 조절된, 공간상 조절된 및 시공간상 조절된 프로모터이다.
이. 콜리 등의 원핵성 세포에 사용하는데 바람직한 한 가지 프로모터는 외부적으로 공급된 날리딕산에 의해 유도 가능한 Rec 7 프로모터이다. 보다 바람직한 프로모터는 외부적으로 공급된 이소프로필-β-D-티오갈락토-피라노시드(IPTG)에 의해 유도 가능한 플라스미드 벡터 JHEX25(공급원: Promega Corp., Madison WI)에 존재한다. 더욱 더 바람직한 프로모터인 tac 프로모터는 플라스미드 벡터 pKK223-3에 존재하고, 이는 또한, 외부적으로 공급된 IPTG에 의해 유도 가능하다. 상기 pKK223-3 플라스미드는 유도를 위해 약 25 내지 약 100μM IPTG를 사용하여, XL-1, TB1, BL21 및 BLR 등의 수 많은 이. 콜리 균주에서 성공적으로 발현될 수 있다. 놀랍게도, 약 25 내지 약 50μM IPTG 농도가 2L 진탕 플라스크 및 발효기에서 최적의 결과를 제공해주는 것으로 밝혀졌다.
몇몇 살모넬라(Salmonella) 균주, 예를 들면, 에스. 티피(S. typhi) 및 에스. 티피무륨(S. typhimurium) 및 에스. 티피무륨-이. 콜리 하이브리드를 사용하여, 면역원으로서 사용하기 위한 입자의 공급원으로서 및 약독화된 완전 세포 생백신 및 생접종물으로서 선행 HBc 키메라 입자를 포함한 면역원성의 형질전환된 유전자를 발현하였으며, 이러한 발현 및 백신 접종 시스템이 본원에서 사용될 수 있다[참조: 미국 특허 제6,024,961호; 제5,888,799호; 제5,387,744호; 제5,297,441호; Ulrich et al., (1998) Adv. Virus Res., 50: 141-182; Tacket et al., (Aug 1997) Infect. Immun., 65 (8): 3381-3385; Schodel et al., (Feb 1997) Behring Inst. Mitt., 98: 114-119; Nardelli- Haefliger et al., (Dec 1996) Infect. Immun., 64 (12): 5219-5224; Londono et al., (Apr 1996) Vaccine, 14 (6): 545-552, 및 이들에서의 인용문헌].
진핵성 세포와 적합한 발현 벡터, 예를 들면, 효모 세포와 적합한 발현 벡터, 또는 고등 식물 또는 포유류 세포와 적합한 발현 벡터가 또한 본원에서 고려된다. 이러한 발현 벡터는 또한, 본 발명의 재조합 DNA 분자를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 효모, 예를 들면, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에 사용하기 위한 벡터는 널리 공지된 바와 같이 에피솜성 또는 통합성일 수 있다. 진핵성 세포 발현 벡터는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 일부가 시판되고 있다. 통상적으로, 이러한 벡터는 목적하는 DNA 절편와 프로모터 서열을 삽입하기 위한 하나 이상의 편리한 제한 부위를 함유하고 있다. 임의로, 이러한 벡터는 진핵성 세포에서 사용하는데 특이적인 선별성 마커를 함유한다. 에스. 세레비지애에 사용하기 위한 프로모터의 예에는 에스. 세레비지애 포스포글리세르산 키나제(PGK) 프로모터 및 광범위 프로모터 GAL 10 및 GAL 1이 포함되는 반면, 알코올 옥시다제 유전자(AOX1)가 피치아 파스토리스에 대한 유용한 프로모터이다.
예를 들면, 메탄올자화성 효모인 피. 파스토리스(P. pastoris)에서 키메라를 생성하기 위해서는, 목적하는 키메라를 암호화하는 유전자를, 피치아 내에서의 구조 유전자의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 놓아둔다. 이로써 생성된 발현-적격한 형태의 이들 유전자를 피치아 세포 내로 도입한다.
보다 구체적으로 언급하면, 문헌[참조: Cregg et al. (1987) Biotechnology, 5: 479-485 ; (1987) Molecular and Cellular Biology, 12: 3376-3385]에 기재된 형질전환 및 발현 시스템을 사용할 수 있다. 키메라 V12.Pf3.1에 대한 유전자를 알코올 옥시다제 유전자(AOX1) 프로모터로부터의 하단 및 동일한 AOX1 유전자의 전사 종결인자 서열로부터의 상단에 놓아둔다. 이어서, 상기 유전자 및 이의 플랭킹 조절 영역을, 피. 파스토리스 HIS4 유전자와 피. 파스토리스 ARS 서열(자율 복제 서열) 모두를 수반하는 플라스미드 내로 도입하여, 피. 파스토리스 세포에서의 플라스미드 복제를 가능케한다[참조: Cregg et al. (1987) Molecular and Cellular Biology, 12: 3376-3385].
상기 벡터는 또한, 이. 콜리 세포에서의 해당 플라스미드의 성장을 허용해 주는데 적당한 플라스미드(예: pBR322) 부분을 함유한다. 이로써 생성된, 키메라 유전자 뿐만 아니라 상기 언급된 각종 부가의 요소를 수반하는 플라스미드를, 피. 파스토리스의 his4 돌연변이체, 즉 기능상 히스티디놀 데하이드로게나제 유전자가 결여된 세포주 내로 예시적으로 형질전환시킨다.
히스티딘이 결여된 배지 상에서 형질전환체 콜로니를 선별한 후, 문헌[참조: Cregg et al. (1987) Molecular and Cellular Biology, 12: 3376-3385]에 기재된 바와 같이, 히스티딘이 결여되긴 하지만 메탄올을 함유하는 배지 상에서 세포를 성장시켜, AOX1 프로모터를 유도시킨다. 이와 같이 유도된 AOX1 프로모터는 키메라 단백질의 발현과 피. 파스토리스 내에서의 키메라 입자의 생성을 유발시킨다.
고려된 키메라 유전자는, 문헌[참조: Cregg et al. (1987) Molecular and Cellular Biology, 12: 3376-3385]에 기재된 바와 같이, ARS 서열의 사용을 요구하지 않는 통합 형질전환에 의해 도입될 수도 있다.
포유류 세포에서 재조합 DNA 발현시킴으로써 키메라 입자를 생성하는 것은, 상기 키메라 유전자를 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현시킬 수 있는 재조합 DNA 벡터를 사용하여 예시적으로 수행된다. 이는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratories (1989)]에 보다 상세히 기재되는 과정을 수행하여 달성한다.
한 가지 예시적 예에서는, 원숭이 바이러스(SV40)-이용 발현 벡터인 pKSV-10(Pharmacia Fine Chemicals, Piscatway, NJ)를 대상으로 하여, NcoI 및 HindIII의 제한 엔도뉴클레아제로 분해시킨다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 목적하는 HBc 키메라를 암호화하는 NcoI/HindIII 서열 단편을 발현 플라스미드에 연결시키면, pSV-Pf로 명명된 환형 재조합 발현 플라스미드가 형성된다.
발현 플라스미드 pSV-Pf는 본래의 이. 콜리 앰피실린 내성 유전자를 함유한다. 따라서, pSV-Pf로 형질전환될 때, 이. 콜리 RR101(Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD)은 해당 플라스미드를 함유하는 세균에 대한 앰피실린 내성을 기준으로 하여 선별할 수 있다. 이어서, 플라스미드 함유 세균을 클로닝하고, 이 클론을 대상으로 하여, 삽입된 암호화 유전자가 발현 벡터 내로 적당히 배향되었는지에 대해 후속 스크리닝한다.
목적하는 HBc 키메라를 암호화하는 유전자를 함유하는 상기 수득된 플라스미드 pSV-Pf는, 이러한 플라스미드를 함유하는 이. 콜리를 배양함으로써 증식시킨다. 이 플라스미드 DNA를 상기 삼브룩(Sambrook) 등의 문헌에 기재된 바와 같이 이. 콜리 배양물로부터 분리한다.
키메라의 발현은, 문헌[참조: Graham et al. (1973) Virol., 52: 456]의 인산칼슘 매개된 형질감염 방법, 또는 유사한 기술을 사용하여, pSV-Pf를 포유류 세포주, 예를 들면, CHO 세포 내로 도입함으로써 달성시킨다.
pSV-Pf를 배양물 중의 CHO 세포 내로 도입하는데 있어서 최대 효율을 보장하기 위해, 문헌[참조: Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet., 1: 327]에 기재된 바와 같이, 제2 플라스미드 pSV2NEO(ATCC #37149) 및 세포독성 약물 G418 (GIBCO Laboratories, Grand Island, N. Y.)의 존재 하에 형질감염을 수행한다. G418에 대해 내성인 CHO 세포를 배양하고, 양 플라스미드 pSV2NEO 및 pSV-Pf를 획득하며, 이를 CHO/pSV-Pf 세포로 명명하였다. pSV-Pf 발현 벡터의 유전적 설계를 통하여, 상기 생성된 CHO/pSV-Pf 세포에서 특정 키메라를 발현시키고, 이들 세포의 세포질에서 탐지한 다음 이들로부터 정제할 수 있다. 이로써 생성된, 세포성 단백질을 함유하는 조성물을 본원에 논의되는 바와 같이 칼럼 상에서 분리시킨다.
발현 벡터의 선택과, 궁극적으로 키메라 암호화 유전자가 작동적으로 연결되는 프로모터의 선택은 목적하는 기능상 특성, 예를 들면, 단백질 발현 국재 및 시기, 및 형질전환시키고자 하는 숙주에 의해 직접적으로 좌우된다. 재조합 DNA 분자 작제 분야에 내재된 널리 공지된 제한 요인이 있다. 그러나, 본 발명을 실시하는데 유용한 벡터는 복제를 지시할 수 있고, 바람직하게는 DNA 절편에 포함된 키메라 유전자(이것이 상기 절편에 작동적으로 연결된다)의 발현(발현 벡터 경우)을 지시할 수 있다.
한 가지 바람직한 양태에서는, 당해 키메라를 발현하는 숙주가 원핵생물인 이. 콜리이고, 바람직한 벡터가 원핵성 레플리콘, 즉 형질전환된 원핵성 숙주 세포에서 염색체외적으로 재조합 DNA 분자의 자율 복제 및 유지를 지시할 수 있는 능력을 지닌 DNA 서열을 포함한다. 이러한 레플리콘이 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
원핵성 레플리콘을 포함하는 벡터는 또한, 이를 이용하여 형질전환된 숙주 세포(예: 이. 콜리)에서 고려된 HBc 키메라 유전자의 발현을 지시할 수 있는 원핵성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 세균성 숙주와 적합한 프로모터 서열이 전형적으로, 고려된 DNA 절편의 삽입을 위한 하나 이상의 편리한 제한 부위를 함유하는 플라스미드 벡터에 제공된다. 이러한 벡터 플라스미드의 전형적인 예가 pUC8, pUC9 및 pBR329(공급원: Biorad Laboratories, Richmond, CA), 및 pPL 및 pKK223-3 (공급원: Pharmacia, Piscataway, NJ)이다.
고등 식물 및 포유류로부터의 세포에서 유전자를 발현하는데 유용한 전형적인 벡터는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이에는 문헌[참조: Rogers et al. (1987) Meth. in Enzymol., 153: 253-277]에 기재된 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 종양 유도성(Ti) 플라스미드로부터 유도된 식물 벡터; 및 상기 포유류 발현 벡터 pKSV-10, 및 pCI-neo (Promega Corp., #E1841, Madison, WI)가 포함된다. 그러나, 문헌[참조: Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 58-24]에 기재된 pCaMVCN 전이 제어 벡터를 포함한 몇몇 기타 발현 벡터 시스템이 식물에서 작용하는 것으로 공지되어 있다. 플라스미드 pCaMVCN(공급원: Pharmacia, Piscataway, NJ)에는 콜리플라워 모자이크 바이러스 CaMV 35S 프로모터가 포함된다.
상기 식물 발현 시스템은 전형적으로, 삽입된 형질전환된 유전자의 계통적 또는 항상성 발현을 제공해준다. 계통적 발현은, 대부분의 식물 또는 모든 식물을 고려된 키메라 분자 또는 생성된 입자에 대한 공급원으로서 사용하는 경우 또는 식물의 상당 부분이 경구용 백신을 제공하기 위해 사용되는 경우에 유용할 수 있다. 그러나, 키메라 분자 또는 입자를 식물 저장 기관, 예를 들면, 뿌리, 씨앗 또는 열매(이로부터 상기 입자가 보다 용이하게 분리 또는 섭취될 수 있다)에서 발현시키는 것이 보다 효율적일 수 있다.
저장 기관 발현을 달성하는 한 가지 방식은 하나 이상의 예비선별되거나 예정된 비-광합성 식물 기관에 이의 제어된 유전자를 발현시키는 특정 프로모터를 사용하는 것이다. 다른 기관에서는 거의 또는 전혀 발현되지 않으면서 하나 이상의 예비선별된 저장 기관에서 발현되는 것(예를 들면, 잎 또는 줄기에 대한 뿌리, 씨앗 또는 열매)이 본원에서는 증강된 발현 또는 우선적 발현으로 지칭된다. 5:1 이상 비율로, 또 다른 기관과 비교해서 하나 이상의 예비선별된 기관에서의 발현을 지시하는 것으로 예시되는 프로모터는 본원에서 기관-증강된 프로모터로서 규정된다. 실질적으로 단지 1개의 저장 기관에서만 발현되고 다른 저장 기관에서는 실질적으로 전혀 발현되지 않는 것은 본원에서 기관-특이적 발현으로서 지칭되는데, 즉 한 저장 기관에서의 발현 생성물 대 또 다른 저장 기관에서의 발현 생성물의 비가 약 100:1 이상인 것은 기관 특이성을 지시해준다. 따라서, 저장 기관 특이적 프로모터는 저장 기관-증강된 프로모터 부류의 구성원이다.
식물 저장 기관의 예에는 당근, 타로토란 또는 카사바, 감자 괴경의 뿌리, 및 열매, 예를 들면, 레드 구아바, 시계풀 열매, 망고, 파파야, 토마토, 아보카도, 체리, 탄제린, 만다린, 야자, 메론(예: 칸타로프 및 수박) 및 기타 신선한 열매, 예를 들면, 스쿼시, 오이, 망고, 살구, 복숭아의 알맹이 뿐만 아니라 옥수수, 대두, 벼, 평지씨 등의 씨앗이 포함된다.
CaMV 35S 프로모터는 통상 항상성 프로모터로 간주된다. 그러나, 최근의 조사 결과, CaMV 35S 프로모터의 21-bp 영역이 또 다른 이종의 통상 그린 조직(green tissue) 프로모터인 rbcS-3A 프로모터에 작동적으로 연결되는 경우에, 이로써 생성된 키메라 프로모터가 뿌리-증강된 프로모터로 될 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 이러한 21-bp 서열이 미국 특허 제5,023,179호에 기재되어 있다. 미국 특허 제5,023,179호의 21-bp 삽입물을 함유하는 키메라 rbcS-3A 프로모터가 본원에 유용한 뿌리-증강된 프로모터이다.
상기 21-bp 절편을 포함하는 유사한 뿌리-증강된 프로모터는 CAMV 35S 프로모터 자체의 -90 내지 +8 영역이다. 미국 특허 제5,110,732호에는 상기 절단된 CaMV 35S 프로모터가, 뿌리, 및 뿌리가 될 운명의 조직인 씨앗 근생에서의 발현 증강을 제공해준다고 기재되어 있다. 이러한 프로모터가 또한 본원에서도 유용하다.
또 다른 유용한 뿌리-증강된 프로모터는 PCT/GB92/00416(1991. 9. 19.자로 공개된 WO 91/13922)에 기재된 평지씨(Brassica napus L.) 유전자의 -1616 내지 -1 프로모터이다. 상기 프로모터를 함유하는 플라스미드 pRlambdaS4 및 박테리오파아지 람다.베타.1을 수반하는 이. 콜리 DH5.알파.가 1990년 3월 8일자로 기탁기관[the National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, GB]에 기탁되었으며, 이는 수탁 번호 NCIMB40265 및 NCIMB40266이다. 이러한 프로모터의 유용한 부분은, 상기 플라스미드를 HaeIII로 절단함으로써 1.0kb 단편으로서 수득할 수 있다.
바람직한 뿌리-증강된 프로모터는 문헌[참조: DiRita and Gelvin (1987) Mol. Gen. Genet, 207: 233-241]에 기재된 플라스미드 pKan2에 존재하는 만노파인 신타제(mas) 프로모터이다. 이러한 프로모터는 이의 플라스미드 pKan2로부터 XbaI-XbalI 단편으로서 제거 가능하다.
바람직한 만노파인 신타제 뿌리-증강된 프로모터는 위치 -138까지의 코어 만노파인 신타제(mas) 프로모터 영역과 -318에서부터 -213까지의 만노파인 신타제 활성인자로 구성되고, 이는 집합적으로 AmasPmas로서 지칭된다. 이러한 프로모터는 담배 뿌리에서의 생성을, 잎 발현 수준과 비교해서 약 10 내지 약 100배 정도 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
또 다른 뿌리 특이적 프로모터는 측생(lateral) 뿌리 개시 동안 발현되고 문헌[참조: Keller et al. (1989) Genes Dev., 3: 1639-1646]에 보고된, 하이드록시프롤린-풍부한 글리코프레프로테인 유전자인 HRGPnt3을 수반하는 약 500bp의 5' 플랭킹 서열이다. 또 다른 바람직한 뿌리-특이적 프로모터는 문헌[참조: Yamamoto et al. (1991) Plant Cell, 3: 371-381]에 보고된 담배 뿌리-특이적 유전자 ToRBF의 약 -636 내지 -1의 5' 플랭킹 영역에 존재한다. 상기 저자에 의하면, 발현을 조절하는 시스-작용성 요소가 전사 개시 부위로부터 약 -636 내지 약 -299의 5' 영역에 보다 특정하게 위치하고 있다. 야마모토(Yamamoto) 등은 잎, 어린가지 분열조직 또는 줄기에서가 아니라 뿌리에서 상기 ToRBF 유전자로부터의 정상 상태 mRNA 생성을 보고하였다.
또 다른 유용한 저장 기관 특이적 프로모터는 토마토(Lycopersicon esculentum)의 열매-숙성 유전자 E8의 5' 및 3' 플랭킹 영역이다. 이들 영역 및 이들의 cDNA 서열이 문헌[참조: Deikman et al. (1988) EMBO J., 7 (11): 3315-3320 and (1992) Plant Physio., 100: 2013-2017]에 예시 및 논의되어 있다.
3개 영역이 상기 유전자의 5' 플랭킹 서열의 2181bp에 국재하고, 폴리(A) 부가 부위에 대해 3'의 522bp 서열이 상기 E8 유전자의 발현을 제어하는 것으로 보인다. -2181에서부터 -1088까지의 하나의 영역이, 미숙성 열매 내에서의 E8 유전자 전사를 에틸렌에 의해 활성화시키는데 요구되고, 이는 숙성 동안 전사를 유발시킨다. 2개의 추가의 영역, 즉 -1088 내지 -863 및 -409 내지 -263은 미숙성 열매에서 에틸렌 반응성을 부여할 수는 없지만, 숙성 동안 E8 유전자를 발현시키기에는 충분하다.
옥수수에서, 이의 제어된 효소를 내배유에서는 고수준으로 발현하고, 뿌리에서는 상당히 저하된 수준으로 발현하며 그린 조직 또는 화분에서는 전혀 발현하지 않는 옥수수 슈크로스 신타제-1(Sh) 프로모터가, 특정하게는 줄기와 뿌리에 풍부한 담배 인피부 세포에서 키메라 리포터 유전자인 β-글루쿠로니다제(GUS)를 발현하는 것으로 보고되었다[참조: Yang et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 87: 4144-4148]. 따라서, 이러한 프로모터는 식물 기관, 예를 들면, 멜론(예: 칸타루프)와 같은 신선한 열매, 또는 내배유를 함유하는 씨앗 및 고수준의 인피유 세포를 갖는 뿌리에 유용하다.
조직 특이적 프로모터의 또 다른 예는 씨앗 조직에 특이적인 레시틴 프로모터이다. 대두유 씨앗 중의 레시틴 단백질은 씨앗 성숙 동안에만 발현되는 단일 유전자(Le1)에 의해 암호화되고, 이는 전체 씨앗 mRNA의 약 2 내지 약 5%를 차지한다. 상기 레시틴 유전자 및 씨앗 특이적 프로모터가 완전히 성상 확인되었으며, 이를 사용하여 형질전환성 담배 식물에서의 씨앗 특이적 발현을 지시하였다[참조: Vodkin et al. (1983) Cell, 34: 1023 and Lindstrom et al. (1990) Developmental Genetics, 11: 160].
특히 바람직한 괴경 특이적 발현 프로모터는 감자 파타틴(patatin) 유전자의 5' 플랭킹 영역이다. 이러한 프로모터의 용도가 문헌[참조: Twell et al. (1987) Plant Mol. Biol., 9: 365-375]에 기재되어 있다. 상기 프로모터는 박테리오파아지 LPOTI의 약 406bp 단편으로 존재한다. 이러한 LPOTI 프로모터는 4개의 기타 파타틴 프로모터와 90% 이상의 상동률을 나타내고 파타틴 프로모터 PGT5와 모든 400개 염기에 걸쳐 약 95%의 상동률을 나타내는 영역을 갖는다. 이들 프로모터 각각이 본원에서 유용하다[참조: Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol., 12: 41- 50].
추가의 기관 증강된 및 기관 특이적 프로모터가 문헌[참조: Benfey et al. (1988) Science, 244: 174-181]에 기재되어 있다.
활용된 각각의 프로모터 서열은 세포 내의 키메라 분자 또는 입자의 양에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 영향을 받지 않는"이란, 해당 프로모터가, 형질전환된 세포 또는 형질전환성 식물에 축적된 키메라 분자 또는 입자에 의해 피드백 제어(억제)를 지시하도록 반응성이지 않다는 것을 의미한다.
아그로박테리움 투메파시엔스를 사용한 식물 세포의 형질감염은 전형적으로, 쌍떡잎 식물 상에서 가장 잘 수행된다. 외떡잎 식물은 통상적으로, 소위 원형질체의 직접적인 유전자 전이에 의해 대부분 용이하게 형질환된다. 직접적인 유전자 전이는 통상적으로, 전기천공, 폴리에틸렌글리콜 매개된 전이, 또는 필요한 DNA를 수반하는 마이크로포사체에 의해 세포에 충격을 가함으로써 수행한다. 이들 형질감염 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으므로, 본원에서 추가로 논의될 필요가 없다. 형질감염된 세포와 원형질체로부터 완전 식물을 재생시키는 방법이 또한, 식물 조직으로부터 목적하는 단백질을 수득하기 위한 기술로서 당해 분야에 널리 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제5,618,988호 및 제5,679,880호, 및 이에 인용된 인용문헌].
아그로박테리움 형질전환, 전기천공 또는 기타 방법을 사용하여 형성된 형질전환성 식물은 전형적으로, 하나의 염색체 상에 단일 유전자를 함유한다. 이러한 형질전환성 식물은 부가된 유전자에 대해 이형접합성인 것으로 지칭될 수 있다. 그러나, "이형접합성"이란 용어를 사용한다는 것은 통상적으로, 한 쌍의 염색체의 제2 염색체의 동일한 유전자좌에 상보성 유전자가 존재한다는 것을 의미하고, 이와 같이 하나의 부가된 유전자를 함유하는 식물에서는 상기 유전자가 존재하지 않다는 것을 의미하므로, 이러한 식물에 대한 보다 정확한 명칭은 독립적인 분리체인 것으로 여겨지는데, 이는 부가된 외인성 키메라 분자 암호화 유전자가 유사분열 및 감수분열 동안 독립적으로 분리되기 때문이다. 고려된 HBc 키메라 분자를 암호화하는 단일 구조 유전자를 유도시키는 기관 증강된 프로모터를 함유하는 형질전환성 식물, 즉 독립적인 분리체가 바람직한 형질전환성 식물이다.
보다 바람직한 것은 부가된 구조 유전자에 대해 동형접합성인 형질전환성 식물, 즉 염색체 쌍의 각 염색체 상의 동일한 유전자좌에 한 유전자씩 2개의 부가된 유전자를 함유하는 형질전환성 식물이다. 동형접합성 형질전환성 식물은, 단일 부가된 유전자를 함유하는 독립적인 분리체 형질전환성 식물을 성적 교배(자가생식)시키고, 이로써 생성된 씨앗 일부를 발아시킨 다음, 이로써 생성된, 증강된 키메라 입자 축적을 위해 생성된 식물을 대조군(본래의 비-형질전환성) 또는 독립적인 분리체 형질전환성 식물과 비교하여 분석함으로써 수득할 수 있다. 동형접합성 형질전환성 식물은 본래의 비-형질전환성 식물과 독립적인 분리체 형질전환성 식물 모두와 비교해서 증강된 키메라 입자 축적을 나타낸다.
2개의 상이한 형질전환성 식물을 교배시켜 2가지 독립적으로 분리되는 부가된 외인성(이종) 유전자를 함유하는 자손을 생성할 수 있다는 것은 인식해야 한다. 적당한 자손을 자가생식시켜, 키메라 HBc 분자를 암호화하는 양 부가된 외인성 유전자에 대해 동형접합성인 식물을 생성시킬 수 있다. 모 식물에 대한 역교잡(back-crossing) 및 비-형질전환성 식물과의 이계교잡이 또한 고려된다.
따라서, 본 발명의 형질전환성 식물은 고려된 키메라 HBc 분자를 암호화하는 이종 구조 유전자를 갖는다. 바람직한 형질전환성 식물은 부가된 이종 키메라 HBc 구조 유전자에 대한 독립적인 분리체이고, 이러한 유전자를 이의 자손에게 유전시킬 수 있다. 보다 바람직한 형질전환성 식물은 상기 이종 유전자에 대해 동형접합성이고, 성적 교배시 이러한 유전자를 이의 자손 모두에게 유전시킨다.
키메라 HBc 분자를 암호화하는 유전자는 천연상 식물에 존재하지 않기 때문에, 고려된 형질전환성 식물은, 양 식물을 동일한 조건 하에 성장시킬 경우, 동일한 유형 또는 계통의 비-형질전환된 식물 보다 더 많은 양으로 키메라 HBc 분자 입자를 축적시킨다.
"동일한 유형" 또는 "동일한 계통"이란 표현은 본원에서, 형질전환되지 않은 식물과 동일한 교잡 또는 클론의 식물을 의미한다. 광범위하게 동계 교배된 식물을 사용한 경우와 같이, 특정 교잡의 자매 세포 간의 대립유전자성 변이가 적을 경우에는, 자매 세포들 간의 비교를 이용하거나 또는 몇 가지 자매 세포를 사용하여 수득된 평균치를 사용할 수 있다. 그 밖에도, 클론이 상기 비교에 바람직하다.
형질전환성 식물로부터의 씨앗을 온실 필드, 창턱 등에서 성장시키고, 이로써 생성된 성적으로 성숙한 형질전환성 식물을 자가-화분시켜 순수한 육종(true breeding) 식물을 생성시킨다. 이들 식물로부터의 자손이 순수한 유전적 주가 되는데, 이는 환경적인 조건 범위 하에서 바람직하게는 필드에서의 키메라 HBc 분자 입자 축적에 대해 평가한 것이다.
키메라 HBc 분자 입자 축적에 대해 동형접합성인 형질전환성 식물을 기타 목적하는 특징을 지닌 모 식물과 교잡시킨다. 키메라 HBc 분자 입자 축적에 대해 이형접합성이거나 독립적으로 분리 가능한 자손을 한 부모 또는 다른 부모와 역교잡시켜, 키메라 HBc 분자 입자 축적과 기타 목적하는 특징을 나타내는 형질전환성 식물을 수득한다. 이러한 자손과 부모와의 역교잡을 1회 이상 반복하여, 수 많은 바람직한 특징을 보유하고 있는 형질전환성 식물을 수득할 수 있어야 한다.
곤충 세포 시스템을 사용하여 HBc 키메라를 발현시킬 수도 있다. 예를 들면, 이러한 한 시스템에서는, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드론형성 바이러스(AcNPV) 또는 바쿨로바이러스를 벡터로서 사용하여, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아(Trichoplusia) 유충에서 외래 유전자를 발현시킨다.
키메라를 암호화하는 서열을 상기 바이러스의 비-필수 영역, 예를 들면, 폴리헤드린 유전자 내로 클로닝시키고, 이를 폴리헤드린 프로모터의 제어 하에 놓아둔다. 키메라 서열의 성공적인 삽입으로 인해, 상기 폴리헤드린 유전자가 불활성이 되고, 코트 단백질이 결여된 재조합 바이러스가 생성된다. 이어서, 이러한 재조합 바이러스를 사용하여, 예를 들면, 에스. 프루기페르다(S. Frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아 유충을 감염시키면, 여기서 HBc 키메라를 발현시킬 수 있다[참조: E. Engelhard et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 3224-3227; and V. Luckow, Insect Cell Expression Technology, pp. 183-218, in Protein Engineering: Principles and Practice, J. L. Cleland et al. eds., Wiley-Liss, Inc, 1996]. 오토그라파 칼리포르니카 핵 폴리헤드론형성 바이러스(AcNPV)의 폴리헤드린 프로모터의 제어 하에 놓여진 이종 유전자가 종종, 감염 후기 단계 동안 높은 수준으로 발현된다.
이러한 키메라 유전자를 함유하는 재조합 바쿨로바이러스는, Bac-To-Bac™ 바쿨로바이러스 발현 시스템(Life Technologies)으로서 시판되고 있는, 바쿨로바이러스 셔틀 벡터 시스템[참조: Luckow et al. (1993) J. Virol., 67: 4566-4579]을 사용하여 작제한다. 재조합 바이러스의 스톡을 제조하고, 재조합 단백질의 발현을 표준 프로토콜에 의해 모니터한다[참조: O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York, 1992; and King et al., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman & Hall, London, 1992].
DNA를 상보성 부착 말단 또는 평활 말단을 통하여 벡터에 작동적으로 연결시키기 위한 각종 방법이 개발되었다. 예를 들면, 상보성 단독중합체 트랙을, 벡터 DNA 내로 삽입시키고자 하는 DNA 절편에 부가할 수 있다. 이어서, 상기 벡터와 DNA 절편을 상기 상보성 단독중합체성 테일 사이의 수소 결합에 의해 연결시켜 재조합 DNA 분자를 형성시킨다.
또 다른 한편, 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 합성 링커를 사용하여, DNA 절편을 전술된 바와 같이 발현 벡터에 연결시킬 수 있다. 평활-말단화 DNA 절편을, 평활-말단화 DNA 분자의 연결을 촉매할 수 있는 효소, 예를 들면, 박테리오파아지 T4 DNA 리가제의 존재 하에 과량의 합성 링커 분자와 함께 항온 배양함으로써, 상기 합성 링커를 평활-말단화 DNA 절편에 부착시킨다. 따라서, 이러한 반응 생성물은 이들의 말단에 합성 링커 서열을 수반하는 DNA 절편이다. 이어서, 이들 DNA 절편을 적당한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 상기 합성 링커와 적합성인 말단을 생성시키는 효소를 사용하여 절단시킨 발현 벡터 내로 연결시킨다. 각종의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 합성 링커는 수 많은 공급원으로부터 시판중이다[New England BioLabs, Beverly, MA 포함].
목적하는 DNA 절편은 또한, 정배향 및 역배향 프로모터가, 해당 유전자를 벡터 내로 삽입시킬 수 있도록 증폭 후 절단될 수 있는 목적하는 제한 부위을 함유하는 PCR 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 또 다른 한편, PCR 생성물을, 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, T-오버행을 함유하는 벡터(Promega Corp., A3600, Madison, WI) 내로 직접적으로 클로닝시킬 수 있다.
발현된 키메라 단백질은, 숙주 세포가 단일 세포든 아니면 다세포 숙주 내의 세포든지 간에 이러한 숙주 세포 내에서 입자로 자가 어셈블리된다. 상기 입자 함유 세포를 표준 과정을 이용하여 수거하고, 이 세포를 프렌치 압력 세포, 리소자임, 초음파기, 비드 비터 또는 미세유동화기(Microfluidics International Corp., Newton MA)를 사용하여 용해시킨다. 상기 용해물을 정화시킨 후, 입자를 45% 황산암모늄으로 침전시키고, 20mM 인산나트륨(pH 6.8)에 재현탁시키며, 동일한 완충액에 대해 투석시킨다. 이와 같이 투석시킨 물질을 간단히 원심분리시킴으로써 정화시키고, 상등액을 대상으로 하여, 세파로즈® CL-4B를 사용하여 겔 여과 크로마토그래피한다. 입자 함유 분획을 동정하고, 이를 대상으로 하여, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피하며, 황산암모늄으로 재침전시키고, 재현탁시키며, 투석시킨 다음, 멸균 여과시키고 -70℃에서 저장한다.
HBc 키메라 접합체
B 세포 또는 T 세포 반응이 요망되는 어떠한 합텐(면역원)도, 고려된 HBc 키메라 또는 키메라 입자, 예를 들면, 이종 링커 잔기, 예를 들면, 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산, 도메인 II의 루프 영역 내의 시스테인 또는 티로신 및 도메인 I 내의 N-말단 근처에 부가 시스테인 잔기를 함유하는 키메라 입자에 연결시켜 HBc 키메라 접합체를 형성할 수 있다. 관심있는 합텐은 전형적으로, B 세포 면역원이다. 이러한 합텐은 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물(삭카라이드, 즉 올리고- 또는 폴리삭카라이드), 또는 비-폴리펩티드, 비-탄수화물 화학물질, 예를 들면, 2,4-디니트로벤젠 또는 약물, 예를 들면, 코카인 또는 니코틴일 수 있다. 예시적 삭카라이드 화합물에는 NTHi 또는 엠. 카트.(M. cat.)의 리포올리고삭카라이드(LOS)가 포함된다[참조: Sun et. al. (2000) Vaccine 2000, 18 (13): 1264-1272; and Jiao et. al. (2002) Infect. Immun., 70 (11): 5982-5989]. LOS는 소수성 지질 A 부분과 친수성 코어 올리고삭카라이드 부분으로 이루어지고, 그람-음성 세균의 외막 내의 주요 성분들 중의 하나이다. 탈독소화 LOS(dLOS) 분자는 탈-O-아실화 또는 탈-N-아실화되거나 또는 둘 다이며, 문헌[참조: Hochstein (1990) in Clinical application of the Limulus amoebocyte lysate test, R. B. Prior, ed. CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, pages 38-49]에 기재된 바와 같은 리물루스(Limulus) 변형유주 세포(amoebocyte) 용해물(LAL) 검정에서 출발 LOS와 비교해서 약 100배 내지 약 10,000배 감소된 내독성을 나타낸다.
수송체 단백질을 폴리삭카라이드에 커플링시키기 위한 수 많은 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 알데히드 그룹을 올리고삭카라이드 또는 비교적 작은 폴리삭카라이드의 환원성 말단[참조: Anderson (1983) Infect. Immun., 39: 233-238; Jennings, et al. (1981) J. Immunol., 127: 1011-1018; Poren et al. (1985) Mol. Immunol., 22: 907-919] 또는 종결 말단[참조: Anderson et al. (1986) J. Immunol., 137: 1181-1186 ; Beuvery et al. [(1986)] Dev. Bio. Scand., 65: 197-204] 상에서 제조할 수 있는데, 이를 환원적 아민 반응을 통하여 수송체 단백질에 연결시킬 수 있다. 또한, 인접한 하이드록실을 퍼요오데이트 이온에 의해 산화시킨 다음, 이로써 생성된 알데히드를 시아노보로하이드라이드를 사용하여 환원적 아민화시키는 것이, 키메라의 면역원성 루프에 부가된 부가의 ε-아민-공급성 리신 잔기를 갖는 HBc 키메라 분자에 대해 특히 유용하다.
큰 폴리삭카라이드는, 폴리삭카라이드 쇄를 따라 몇몇 작용성 그룹을 무작위 활성화시키거나[참조: Chu et al. (1983) Infect. Immun., 40: 245-256; Gordon, U. S. Patent No. 4,619,828 (1986); Marburg, U. S. Patent No. 4,882,317 (1989)] 또는 말단 활성화시킴으로써[참조: Anderson et al. (1986) J. Immunol., 137: 1181-1186], 접합시킬 수 있다. 폴리삭카라이드 쇄를 따라 몇몇 작용성 그룹을 무작위 활성화시킴으로써, 이러한 폴리삭카라이드 쇄를 따라 이루어진 무작위 연결물로 인해 고도로 가교 결합되는 접합체가 유발될 수 있다. 폴리삭카라이드 대 수송체 단백질의 최적의 비는 특정한 폴리삭카라이드, 수송체 단백질 및 사용된 접합체에 좌우된다.
삭카라이드를 수송체 단백질에 접합시키는 방법에 관한 상세한 고찰이 다음 문헌에서 발견될 수 있다[참조: Dick et al., in Contributions to Microbiology and Immunology, Vol. 10, Cruse et al., eds., (S. Karger: 1989), pp. 48-114; Jennings et al., in Neoglycoconjugates: Preparation and Applications, Lee et al., eds., (Academic Press: 1994), pp. 325- 371; Aplin et al., (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 10: 259-306; and Stowell et al. (1980) Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 37: 225-281].
탄수화물 자체는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 문헌[참조: Witte et al. (1997) J. Am. Chem. Soc., 119: 2114-2118]에 기재된 바와 같은 효소적 당단백질 합성법에 의해 합성할 수 있다.
합성 및 반합성, 및 천연의 몇 가지 올리고삭카라이드가, 본 발명의 HBc 접합체를 제조하는데 사용될 것으로 고려된 합텐인 올리고삭카라이드의 예로서 다음 문단에 논의된다.
해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) 유형 b(Hib)를 치료하기 위한 백신을 제조하는데 적합한 올리고삭카라이드 합텐은, D-리보스-D-리비톨-포스페이트(하기 I), D-리비톨-포스페이트-D-리보스(하기 II), 또는 포스페이트-D-리보스-D-리비톨(하기 III) 2 내지 20개 반복 단위로 만들어진다[참조: Eduard C. Beuvery et al., EP-0 276 516-B1]:
Figure 112005030872065-pct00015
I
Figure 112005030872065-pct00016
II
Figure 112005030872065-pct00017
III
미국 특허 제4,220,717호에는 또한, 해모필루스 인플루엔자 유형 b에 대한 폴리리보실 리비톨 포스페이트(PRP) 합텐이 기재되어 있다.
문헌[참조: Peterson et al. (1998) Infect. Immun., 66 (8): 3848-3855]에는 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae)로부터의 보호를 제공해주는 트리삭카라이드 합텐인 αKdo(2 8)αKdo(2 4)αKdo가 기재되어 있다. 클라미디아 뉴모니애는 인두염에서부터 신생아 폐렴까지 범위의 사람 호흡기 감염의 원인균이다. Kdo는 3-데옥시-D-만노-옥트-2-울로손산이다.
문헌[참조: Andersson et al., EP-0 126 043-A1]에는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)에 의해 유발된 세균성 감염을 치료, 예방 또는 진단하는데 사용될 수 있는 삭카라이드가 기재되어 있다. 한 가지 유용한 부류의 삭카라이드는 디삭카라이드 GlcNAcβ1 3Gal로부터 유도된 것이다. 문헌[참조: Andersson et al. 상기 참조]에는 또한, 네오락토테트라오실세라미드가 유용하다고 기재되어 있으며, 이는 Galβ1 4GlcNAcβ1 3Galβ1 4Glc-Cer이다.
문헌[참조: McKenney et al. (1999) Science, 284: 1523- 1527]에는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 보호를 제공해주는 폴리삭카라이드인 폴리-N-석시닐 β1 6GlcN(PNSG)가 기재되어 있다. 에스. 아우레우스(S. aureus)는 심내막염, 골수염, 패혈성 관절염, 폐렴 및 농양을 포함한, 집단-획득 감염의 가장 흔한 원인균이다.
유럽 특허 제0 157 899-B1호에는 본 발명에 유용한 뉴모코쿠스성 폴리삭카라이드의 분리 방법이 기재되어 있다. 다음 표에는 본 발명에서 합텐으로서 유용한 협막상 폴리삭카라이드를 생성시키는 뉴모코쿠스성 배양 유형이 열거되어 있다:
폴리삭카라이드 합텐 공급원
Figure 112005030872065-pct00018
모락셀라(브란하멜라(Branhamella)) 카타르할리스(Moraxella catarrhalis)는 어린이에게서의 중이염과 정맥동염, 및 성인에게서의 하부 기도 감염의 원인균으로 보고되어 있다. 상기 세균의 리포올리고삭카라이드 표면 항원(LOS)의 지질 A 부분을 3-데옥시-D-만노-옥툴로손산-글루코사민 연결체에서 절단한다. 이러한 절단 생성물을 순한 알칼리 또는 하이드라진으로 처리하여, 아미드-연결된 지방산은 보존시키면서 에스테르-연결된 지방산을 제거하여, 엠. 카타르할리스(M. catarrhalis)로부터 탈독소화 리포폴리삭카라이드(dLOS)를 생성시킨다. 이러한 dLOS는, 이것이 단백질 수송체에 부착될 때까지는 면역원성이 아니다[참조: Xin-Xing Gu et al. (1998) Infect. Immun., 66 (5): 1891-1897].
그룹 B 스트렙토코커시(GBS)는 사람에게서 패혈증, 수막염, 및 관련된 신경학적 장애의 원인균이다. 협막상 폴리삭카라이드 특이적 항체가 감염으로부터 사람 영아를 보호하는 것으로 공지되어 있다[참조: Jennings et al., U. S. Patent No. 5,795,580]. GBS 협막상 폴리삭카라이드 유형 II의 반복 단위는 다음과 같다: 4)-β-D-GlcpNAC-(1 3)-[β-D-Galp (1 6)]-β-D-Galp (1 4)-β-D-Glcp- (1 3)-β-D-Glcp-(1 2)- [α-D-NeupNAC] (2 3)]-β-D-Galp-(1 (여기서, 괄호친 부분은 괄호치지 않은 서브유니트 바로 다음에 연결된 분지이다). GBS 협막상 폴리삭카라이드 유형 V의 반복 단위는 다음과 같다: 4) - [α-D-NeupNAC-(2 3)-β-D-Galp-(1 4)-β-D-GlcpNAc-(1 6)]-α-D-Glcp-(1 4)-[β-D-Glcp-(1 3)]-β-D-Galp-(l 4)-β-D-Glcp- (l.
문헌[참조: European patent application No. EU-0 641 568-A1, Brade]에는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 뉴모니애(pneumoniae) 및 시타시(Psittaci)로부터 래더형 결합성 패턴 항원을 수득하는 방법이 기재되어 있다.
문헌[참조: Slovin et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 96 (10): 5710-5715]에는 전립선 암에 대해 사용된 백신 제조에서 수송체로서의, KLH에 연결된 합성 올리고삭카라이드인 글로보(globo) H의 용도가 보고되어 있다. 유사하게, 문헌[참조: Helling et al., (July 1995) Cancer Res., 55 : 2783-2788]에는 흑색종 환자를 치료하기 위한 백신에서의 KLH-연결된 GM2의 용도가 보고되어 있다. 후자 백신은 GM2의 세라미드 이중 결합을 오존 절단시키고, 알데히드 그룹을 도입한 다음, KLH 상으로 환원적 알킬화함으로써 제조하였다. 고려된 키메라 입자를 사용하여, 유사한 과정을 활용할 수 있다.
기타 종양 세포 뿐만 아니라 정상 세포, 예를 들면, 흑색종, 신경아세포종 및 건강한 뇌 세포의 표면 상에 존재하는 글로보시드 및 간글리오시드 등의 스핑고지질의 올리고삭카라이드성 부분이 본원에서 유사하게 합텐으로서 사용될 수 있다. 글로보시드 글로보 H의 올리고삭카라이드 부분은 구조 Fucα-(1 2)-Galβ(1 3)-GalNAcβ(1 3)-Galα-(1 4)-Galβ(1 4)Glc를 갖는 반면, 간글리오시드 GM2, GM1 및 GD1a의 삭카라이드 부분은 다음 구조를 각각 갖는다: GalNAcβ- (l 4)- [NeuAcα- (2 3)]- Galβ- (1 4)-Glc; Galβ- (l 3)-GalNAcβ- (l 4)- [NeuAcα- (2 3)]-Galβ(1 4)-Glc; 및 NeuAc-(2 3)-Galβ-(1 3)- GalNAcβ(1 4)-[NeuAcα-(2 3)]-Galβ(1 4)-Glc.
미국 특허 제4,356,170호에는 환원시킨 다음 산화시켜, 상당한 가교 결합을 수반하거나 수반하지 않으면서 파상풍 독소 또는 디프테리아 독소 등의 수송체 단백질의 자유 아민 그룹 상으로 환원적 아민화시킬 수 있는 말단 알데히드 그룹을 갖는 화합물을 형성시키는, 유용한 폴리삭카라이드의 제조 방법이 기재되어 있다. 유용한 세균성 폴리삭카라이드의 예에는 β-용혈성 스트렙토코쿠스, 해모필루스 인플루엔자, 메닌고코쿠스, 뉴모코커스 및 이. 콜리가 포함된다. 입자를 환원적으로 아민화시키는 것 말고, ε-아미노 C2-C8 알킬카복실산에 의해 제공된 바와 같은 링커 암을 폴리삭카라이드 상으로 환원적으로 아민화시킨 다음, 수용성 카보디이미드를 사용하여 해당 입자에 연결시킨다.
따라서, 용어 "합텐"은 통상적으로 사용되는 것 보다 다소 더 광범위하게 본원에서 사용되는데, 이에는 그 자체로는 면역 반응을 유도시키지 못하는 소분자 뿐만 아니라 종종 그 자체로도 면역 반응을 유도시킬 수 있는 단백질과 같은 보다 큰 분자가 포함된다. 이로써 형성된 HBc 키메라 입자 접합체는 후술되는 바와 같이, 접종물 또는 백신으로서 유용하다. 이러한 키메라 단백질이 발현 후 자가 어셈블리되고 접합체가 발현 후에 형성되기 때문에, 접합체 형성은 전형적으로, 자유 단백질 분자와 비교해서 상기 어셈블리된 입자를 사용하여 수행한다.
개개의 합텐(면역원)을 특정 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 잔기 측쇄를 통하여, 이러한 단백질 또는 폴리펩티드에 작동적으로 연결시켜 펜던트하게 연결된 면역원성 접합체, 예를 들면, 측쇄 폴리펩티드 중합체를 형성시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 방법에는 각종 측쇄 상의 한 가지 이상 유형의 작용성 그룹을 통하여 연결시켜, 합텐과 펜던트하게 연결[공유적으로 연결됨(커플링됨)]되지만 하나 이상의 측쇄에 의해 분리되는 입자 내에 수송체 단백질 폴리펩티드 주쇄(본원에서는, HBc 키메라)를 발생시키는 방법이 포함된다.
상기 작용성 그룹 각각을 사용하여 수송체 단백질을 합텐에 연결시키는 방법이 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Erlanger, (1980) Method of Enzymology, 70: 85; Aurameas et al., (1978) Scand. J. Immunol., Vol. 8, Suppl. 7,7-23 and U. S. Patent No. 4,493,795 to Nestor et al]. 또한, 문헌[참조: Rodwell et al. (1985) Biotech., 3: 889-894]에 기재된 바와 같은 부위-지시된 커플링 반응을 수행하여, 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성이 실질적으로 감소되지 않도록 할 수 있다.
더우기, 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, HBc 단백질과 폴리펩티드 합텐 둘 다를 이들의 본래의 형태로 사용할 수 있거나 또는 이들의 작용성 그룹 내용을, 리신 잔기를 석시닐화하거나 시스테인-티오락톤과 반응시킴으로써 변형시킬 수 있다. 아미노 작용성 그룹을 2-이미노티올란, 3-(3-디티오피리딜)-프로피오네이트의 N-하이드록시석신이미드 에스테르, 또는 당해 분야에 공지된 기타 시약과 반응시킴으로써, 설프하이드릴 그룹을 수송체 단백질 또는 접합체 내로 혼입시킬 수도 있다.
당해 HBc 키메라 또는 합텐을 또한 변형시켜 스페이서 암, 예를 들면, 헥사메틸렌 디아민 또는 또 다른 이작용성 분자를 혼입시킴으로써 펜던트 연결을 촉진시킬 수 있다. 이러한 과정이 다음에 논의되어 있다.
폴리펩티드 합텐을 공유 결합시키는 방법은 매우 다양하고, 이는 면역학 분야 업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,818,527호에 따르면, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르((ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA) 또는 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-l-카복실레이트(SMCC, Pierce Chemical Co., Rockford, IL)를 적당한 HBc 키메라와 반응시켜 활성화된 수송체를 형성한다. 이어서, 이러한 활성화된 수송체를 합텐, 예를 들면, 설프하이드릴-말단화 합텐, 또는 말단 시스테인을 함유하거나 부가의 아미노- 또는 카복시-말단 시스테인 잔기가 부가된 폴리펩티드와 반응시켜 공유적으로 결합된 HBc 키메라 접합체를 형성시킨다. 대체 예로서, 폴리펩티드 합텐의 아미노 그룹을 먼저, N-석신이미딜 3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(SPDP, Pharmacia, Piscataway, NJ)와 반응시키고, 이러한 티올 함유 폴리펩티드를 환원 후 상기 활성화된 수송체와 반응시킨다. 물론, 황 함유 잔기와 이중 결합 함유 미카엘(Michael) 수용체를 역전시킬 수 있다. 이들 반응은 공급업자의 문헌과 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Kitagawa, et al. (1976) J. Biochem., 79: 233 and in Lachmann et al., in 1986 Synthetic Peptides as Antigens, (Ciba Foundation Symposium 119), pp. 25-40 (Wiley, Chichester: 1986](또한, 도 5 참조).
미국 특허 제4,767,842호에는 본원에 유용한, 수송체와 폴리펩티드 간의 공유 부착에 관한 몇 가지 방식이 교시되어 있다. 한 방법에서는, 톨릴렌 디이소시아네이트를 0℃에서 디옥산-완충제 용매 중에서 해당 수송체와 반응시켜 활성화된 수송체를 형성시킨다. 이어서, 폴리펩티드 합텐을 혼합시키고, 이를 상기 활성화 수송체와 반응시켜 공유 결합된 HBc 키메라 접합체를 형성시킨다.
HBc 키메라 또는 합텐 내의 티올과 그 자체 간의 디설파이드 연결을 창출시키는 것으로 전술된, 하나의 작용성 그룹 말단에 디설파이드 연결을 형성하고 다른 작용성 그룹 말단에 아미드 연결을 형성하는 수 많은 이종-이작용성 제제[N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP) 포함]가 특히 유용하다. 시약의 예에는 폴리펩티드 합텐 중의 시스테인 잔기, 및 커플링 파트너 상의 아민, 예를 들면, 리신의 ε-아민 또는 수송체 단백질 중의 기타 자유 아미노 그룹이 포함된다. 이러한 각종의 디설파이드/아미드 형성 시약이 공지되어 있다[참조: Immun. Rev. (1982) 62: 185].
기타 이작용성 커플링 제제는 디설파이드 연쇄가 아닌 티오에테르를 형성한다. 수 많은 이들 티오에테르 형성 제제가 시판중이며, 이에는 6-말레이미도카프로산, 2-브로모아세트산, 2-요오도아세트산, 4-(말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실산 등의 반응성 에스테르가 포함된다. 카복실 그룹은, 이를 석신이미드 또는 1-하이드록시-2-니트로-4-설폰산, 나트륨 염과 조합함으로써 활성화시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 특히 바람직한 커플링 제제는 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC)(공급원: Pierce Chemical Co., Rockford, IL)이다. 또 다른 이종-이작용성 가교 결합제는 N-[γ-말레이미도부티록시]석신이미드 에스테르(GMBS) 및 이의 설포네이트 염(설포-GMBS), 및 공급원[Pierce Chemical Co.]으로부터 입수 가능한 유사한 화합물이다. 전술한 목록은 제한적이지 않으며, 이러한 화합물의 변형물을 사용할 수 있다는 것은 명백하다. 도 5는 SMCC를 사용하여 HBc 활성화 수송체를 형성시키는 과정(I)과, 이러한 활성화 수송체를 설프하이드릴-말단화 합텐과 후속 반응시키는 과정(II)을 도식적으로 나타낸 것이다(반응식 1).
폴리펩티드 합텐은 당해 분야에 널리 공지된 수 많은 방식으로 수득할 수 있다. 통상의 펩티드 합성 기술을 용이하게 활용할 수 있다. 예를 들면, 보다 긴 펩티드를 생성시키는 재조합 및 PCR-이용 기술이 유용하다. 목적하는 서열이 통상적으로 비교적 짧기 때문에, 고형 상 화학적 합성법이 유용하다.
폴리펩티드 합텐의 예가 전술된 표 A 및 B에 제시되어 있다. 이들 폴리펩티드 각각을 이의 N-말단 아미노 그룹을 통하여 활용하거나, 또는 상기 표에는 제시되지 않은 부가의 N-말단 시스테인을 사용함으로써 활용할 수 있다.
관련 화학을 이용하여, 소위 "화학적 화합물"을 수송체 단백질에 커플링시킨다. 전형적으로, 커플링에 적당한 작용성 그룹을 화학적 화합물로 지정한다. 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)에 대한 항체 보호를 유도시키는 화학적 합텐의 예가 6-O-포스포콜린 하이드록시헥사노에이트이다[참조: Fischer et al. (1995) J. Immunol., 154: 3373-3382]. 하기 표는 화학적 합텐의 추가의 예를 제공해준다.
유용한 합텐에 관한 추가의 내역은 앞서 언급되고, 현재 공개된 미국 특허원 제09/930,915호 및 기타 특허원을 참조할 수 있다.
접종물 및 백신
본 발명의 또 다른 양태에서는, HBc 키메라 입자 또는 합텐과의 HBc 키메라 입자 접합체를 사람 환자 또는 적합한 동물 숙주, 예를 들면, 침팬지, 마우스, 랫트, 말, 양 등에서 접종물 또는 백신의 면역원으로서 사용된다. 접종물은 B 세포 또는 T 세포 반응(자극)을 유도시킬 수 있는데, 예를 들면, 면역원성 에피토프 또는 합텐과 면역반응되는 항체 생성 또는 T 세포 활성화를 유도시킬 수 있는 반면, 백신은 B 세포 또는 T 세포 반응 중의 어느 한 반응 또는 반응 둘 다를 통하여 면역원을 유도시킨 실체에 대한 보호를 제공해준다.
T 세포 활성화는 각종 기술에 의해 측정할 수 있다. 통상의 실시에서는, 숙주 동물에 고려된 HBc 키메라 입자 백신 또는 접종물을 접종한 후, 말초 단핵성 혈액 세포(PMBC)를 수집한다. 이어서, 이러한 PMBC를 약 3 내지 5일 동안 T 세포 면역원의 존재 하에 시험관내에서 배양한다. 이어서, 이와 같이 배양된 PMBC를 대상으로 하여, 사이토킨, 예를 들면, IL-2, GM-CSF 또는 IFN-γ의 분비 또는 증식에 대해 검정한다. T 세포 활성화에 대한 검정은 당해 분야에 널리 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제5,478,726호 및 이에 인용된 인용문헌].
예시로서 항체 형성을 이용하여, 고려된 접종물 또는 백신은, 전형적으로 물을 함유하기도 하는 약제학적으로 허용되는 희석제 조성물에 용해 또는 분산되는 HBc 키메라 입자 또는 HBc 키메라 입자 접합체의 면역원성 유효량을 포함한다. 면역시킬 필요가 있거나 항체를 유도시키고자 하는 숙주 동물, 예를 들면, 포유류(예: 마우스, 개, 염소, 양, 말, 소, 몽키, 아페 또는 사람) 또는 조류(예: 치킨, 칠면조, 오리 또는 거위)에게 투여하는 경우, 접종물은 유전적으로 연결되거나 접합된(펜던트하게 연결된) 합텐과 면역반응되는 항체를 유도시킨다. 이들 항체는 또한 바람직하게는, B 세포 면역원의 단백질 또는 삭카라이드와 결합된다.
각 면역에 활용된 재조합 HBc 키메라 면역원의 양은 면역원성 유효량으로서 지칭되고, 이는 특히, 다음에 논의되는 바와 같이, 재조합 HBc 키메라 면역원, 면역시킨 포유류, 및 백신 내의 아주반트의 존재 여부에 따라서 광범위할 수 있다. 특정 백신 및 접종물에 대한 면역원성 유효량은 전술된 보호 또는 항체 활성을 각각 제공해준다.
백신 또는 접종물은 전형적으로, 1회 접종당(단위 용량당) 약 1마이크로그램 내지 약 1밀리그램, 바람직하게는 약 10마이크로그램 내지 약 50마이크로그램의 재조합 HBc 키메라 면역원 농도를 함유한다. 본 발명의 백신 또는 접종물에 속하는 바와 같은 용어 "단위 용량"은 동물에 대한 일단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하는데, 각 단위는 요구되는 희석제, 즉 담체 또는 비히클과 연합하여 목적하는 면역원성 효과를 개별적으로 또는 집합적으로 가져다 주는 것으로 산정된 활성 물질의 예정량을 함유한다.
백신 또는 접종물은 전형적으로, 면역원, 바람직하게는 미립 형태의 면역원을 생리학적으로 관용되는(허용되는) 희석제 비히클, 예를 들면, 물, 인산염 완충 식염수(PBS), 아세테이트 완충 식염수(ABS), 링거액 등에 분산시켜 수성 조성물을 형성시킴으로써 회수된 재조합 HBc 키메라 면역원으로부터 제조한다. 이러한 희석제 비히클은 또한, 후술되는 바와 같은 유지성 물질, 예를 들면, 땅콩유, 스쿠알란 또는 스쿠알렌을 포함할 수 있다.
활성 성분으로서 단백질 함유 물질을 함유하는 접종물 및 백신 제제가 당해 분야에 널리 인식되어 있다. 전형적으로, 이러한 접종물 또는 백신은 비경구용의 액상 용제 또는 현탁제로서 제조하고; 주사하기에 앞서 액체 중에 용해 또는 현탁되기에 적합한 고체 형태를 제조할 수도 있다. 이러한 제제를 유화시킬 수도 있는데, 이것이 특히 바람직하다.
상기 면역원성 활성 성분을 종종, 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 적합한 부형제와 혼합한다. 적합한 부형제는, 예를 들면, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 배합물이다. 또한, 경우에 따라, 접종물 또는 백신은 미량의 보조 물질, 예를 들면, 해당 조성물의 면역원성 효능을 증강시키는 pH 완충제, 습윤제 또는 유화제를 함유할 수 있다.
고려된 백신 또는 접종물은 유리하게는 아주반트를 포함하기도 한다. 본 발명의 백신 및 접종물에 적합한 아주반트는 해당 키메라의 B 세포 에피토프에 대한 항체 반응을 증강시킬 수 있는 아주반트 뿐만 아니라 해당 키메라 내에 함유된 T 세포 에피토프에 대한 세포 매개된 반응을 증강시킬 수 있는 아주반트를 포함한다. 아주반트는 당해 분야에 널리 공지되어 있다[참조: Vaccine Design- The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M. F., and Newman, M. J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X].
아주반트의 예에는 완전 프로인트 아주반트(CFA)(이는 사람에게 사용하지 못한다), 불완전 프로인트 아주반트(IFA), 스쿠알렌, 스쿠알란 및 백반[예: Alhydorgel™(Superfos, Denmark)]이 포함되는데, 이는 당해 분야에 널리 공지된 물질이고 몇몇 공급원으로부터 시판중이다.
본 발명의 면역원과 함께 사용하기에 바람직한 아주반트에는 알루미늄 또는 칼슘 염(예를 들면, 하이드록사이드 또는 포스페이트 염)이 포함된다. 본원에서 사용하기에 특히 바람직한 아주반트는 수산화알루미늄 겔(예: Alhydrogel™)이다. 수산화알루미늄 겔의 경우, 당해 키메라 단백질을, 용량당 알루미늄 약 50 내지 약 800마이크로그램, 바람직하게는 약 400 내지 약 600마이크로그램이 존재하도록 상기 아주반트와 혼합한다. 또 다른 특히 바람직한 아주반트는 공급원(Superfos Biosector, Denmark)로부터 Adju-Phos™이란 상표명으로 시판중인 인산알루미늄이다. 일차 인산알루미늄 입자는 플레이트-유사 형태이고, 직경이 약 50 내지 약 100nm인데, 상기 제품 중의 최종 입자 크기는 약 0.5 내지 약 10μ이다. 인산칼슘 나노 입자(CAP)는 Biosante, Inc(Lincolnshire, IL)에 의해 개발된 아주반트이다. 관심있는 면역원을 입자 외부에 피복시키거나, 또는 내부에 피막 형성시킬 수 있다[참조: He et al., (Nov. 2000) Clin. Diagn. Lab. Immunol., 7 (6):899-903].
본 발명의 면역원과 함께 사용하기에 특히 바람직한 또 다른 아주반트는 에멀션이다. 고려된 에멀션은 수중유 에멀션 또는 유중수 에멀션일 수 있다. 면역원성 키메라 단백질 이외에도, 이러한 에멀션은 널리 공지된 바와 같은 오일 상의 스쿠알렌, 스쿠알란, 땅콩유 등, 및 분산제를 포함한다. 비-이온성 분산제가 바람직하고, 이러한 물질에는 솔비탄 및 만니드의 모노- 및 디-C12-C24-지방산 에스테르, 예를 들면, 솔비탄 모노-스테아레이트, 솔비탄 모노-올레에이트 및 만니드 모노-올레에이트가 포함된다. 면역원 함유 에멀션을 에멀션으로서 투여한다.
바람직하게는, 이러한 에멀션은 수성 상 중의 키메라 단백질로 유화시킨, 임의로 스쿠알란과 함께, 스쿠알렌 및 만니드 모노-올레에이트를 포함하는 유중수 에멀젼(Arlacel™ A)이다. 이러한 에멀션의 널리 공지된 예에는 Montanide™ ISA-720, 및 Montanide™ ISA 703 (Seppic, Castres, France)이 포함되고, 이들 각각은 스쿠알렌과 스쿠알란 둘 다를 함유하는 것을 인지해야 하는데, 스쿠알렌이 각각에서 더 우세하지만, Montanide™ ISA 703에서는 약간 덜한 정도로 존재한다. 가장 바람직하게는, Montanide™ ISA-720을 사용하고, 7: 3 (w/w)의 오일 대 물 비가 사용된다. 기타 바람직한 수중유 에멀션 아주반트에는 WO 95/17210 및 EP 0 399 843에 기재된 것들이 포함된다.
소분자 아주반트의 사용이 또한 본원에서 고려된다. 본원에 유용한 소분자 아주반트의 한 가지 유형은 미국 특허 제4,539,205호, 제4,643,992호, 제5,011,828호 및 제5,093,318호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로 삽입됨)에 기재된 7-치환된-8-옥소- 또는 8-설포-구아노신 유도체이다. 이들 물질 중에서, 7-알릴-8-옥소구아노신(록소리빈)이 특히 바람직하다. 상기 분자는 항원-(면역원-) 특이적 반응을 유도시키는데 특히 유효한 것으로 밝혀졌다.
바람직하고 유용한 아주반트에는 모노포스포릴 지질 A(MPL); 제조업체 [Ribi Immunochem, Hamilton, Montana]에 의해 제조된 널리 공지된 아주반트인 3-데아실 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)가 포함된다. 이러한 아주반트는 세균으로부터 추출된 3가지 성분, 즉 모노포스포릴 지질(MPL) A, 트레할로스 디미콜레이트(TDM) 및 2% 스쿠알렌/트윈(Tween®) 80 에멀션 중의 세포벽 골격(CWS)(MPL+TDM+CWS)를 함유한다. 이러한 아주반트는 GB 2122204B에 교시된 방법에 의해 제조할 수 있다. 바람직한 형태의 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A는 직경이 0.2㎛ 미만인 작은 입자 크기를 갖는 에멀션 형태이다(EP 0 689 454 B1). 가장 바람직한 것은 아미노알킬 글루코사미드 4-포스페이트(AGPs)로 불리우는 MPL의 합성 모노삭카라이드 동족체, 예를 들면, RC-529{2-[(R)-3-테트라데카노일옥시-테트라데카노일-아미노]-에틸-2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일-옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라-데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-p-D-글루코피라노시드 트리에틸암모늄 염}으로 시판중인 것이다. RC-529는 공급원[Corixa Corp.]로부터 시판중인 RC-529SE로서 판매된 스쿠알렌 에멀션으로 입수 가능하고, RC-529AF로서 수성 제형으로 입수 가능하다[참조: 미국 특허 제4,987,237호 및 제6,113,918호]. 이들 아주반트는 단독으로 사용하거나 또는 하나 이상의 기타 아주반트, 예를 들면, Alhydrogel™과 조합하여 사용할 수 있다.
추가로 고려된 아주반트에는 공급원(Coley Pharmaceutical Group)으로부터 입수 가능한, CpG 뉴클레오티드 모티프를 1회 이상 함유하는(플랭킹 서열 부가됨) 합성 올리고뉴클레오티드 아주반트가 포함된다. 공급원(Aquila Biopharmaceuticals, Inc.)로부터 입수 가능한 QS21로 명명된 아주반트는 남미산 나무 퀴랄자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina) 껍질로부터 유래된 아주반트 활성을 지닌 면역학적 활성의 사포닌 분획(예: Quil™ A)이며; 이의 제조 방법은 미국 특허 제5,057,540호에 기재되어 있고; 예를 들면, 미국 특허 제5,977,081호 및 제6,080,725호에 기재된, 퀴랄자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina) 사포닌의 반합성 및 합성 유도체가 또한 유용하다. 공급원(Chiron Corp.)로부터 입수 가능한 MF59 아주반트는 미국 특허 제5,709,879호 및 제6,086,901호에 기재되어 있다.
무라밀 디펩티드 아주반트가 또한 고려되고, 이에는 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thur-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, 노르-MDP로서 지칭됨), 및 N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미티올-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 1983A, MTP-PE로서 지칭됨)이 포함된다. 소위 무라밀 디펩티드 동족체가 미국 특허 제4,767,842호에 기재되어 있다.
바람직한 아주반트 혼합물에는 3D-MPL과 QS21의 조합물(EP 0 671 948 B1), 3D-MPL과 QS21를 포함하는 수중유 에멀젼(WO 95/17210, PCT/EP98/05714), 기타 담체와 제형화시킨 3D-MPL(EP 0 689 454 B1), 콜레스테롤 함유 리포좀에서 제형화시킨 QS21(WO 96/33739), 또는 면역자극성 올리고뉴클레오티드(WO 96/02555)가 포함된다. 공급원(SKB; 지금은 Glaxo-SmithKline)으로부터 입수 가능한 SBAS2(지금은 ASO2)는 수중유 에멀션 중의 QS21 및 MPL를 함유한다. 또 다른 아주반트에는 WO 99/52549에 기재된 것, 및 폴리옥시에틸렌 에테르의 비-미립형 현탁제(UK Patent Application No. 9807805)가 포함된다.
아주반트는 아주반트 양으로 활용되는데, 이는 해당 아주반트, 포유류 및 재조합 HBc 키메라 면역원에 따라서 다양할 수 있다. 전형적인 양은 면역시킬 때마다 약 1㎍ 내지 약 1mg으로 다양할 수 있다. 당업자는 적당한 농도 또는 양을 용이하게 결정할 수 있다.
접종물 및 백신은 통상적으로, 주사함으로써 비경구, 예를 들면, 피하 또는 근육내 투여한다. 기타 투여 방식에 적합한 부가의 제형에는 좌제, 및 몇몇 경우에는, 경구용 제형이 포함된다. 문헌[참조: Neirynck et al., (October 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163]에 논의된 바와 같이, 접종을 위해 비내 분무제를 사용하는 것이 또한 고려된다. 좌제의 경우, 전통적인 결합제 및 담체에는 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드가 포함될 수 있으며; 이러한 좌제는 0.5 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 2% 범위의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구용 제형에는 통상적으로 이용된 부형제, 예를 들면, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 삭카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등이 포함된다.
접종물 또는 백신 조성물은 용제, 현탁제, 정제, 환제, 캅셀제, 지속 방출형 제형 또는 산제 형태를 취하고, 이는 활성 성분으로서, 바람직하게는 입자로서 면역학적 유효량의 HBc 키메라 또는 HBc 키메라 접합체를 함유한다. 전형적인 조성물에서는, 바람직한 HBc 키메라 또는 HBc 키메라 접합체의 면역학적 유효량은 앞서 인지된 바와 같이, 용량당 활성 성분 약 1㎍ 내지 약 1mg, 보다 바람직하게는 약 5㎍ 내지 약 50㎍이다.
백신은 전형적으로, 비경구 투여용으로 제형화시킨다. 예시되는 면역화는 피하(SC), 근육내(IM), 정맥내(IV), 복강내(IP) 또는 피내(ID) 투여로 수행한다. 그러나, 경구 및 비내 경로의 백신 접종도 고려된다.
상기 HBc 키메라 입자 및 HBc 키메라 입자 접합체는 중성 또는 염 형태로서 백신으로 제형화시킬 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는 산 부가 염(해당 단백질 또는 합텐의 자유 아미노 그룹과 형성됨)이 포함되고, 이는 무기 산, 예를 들면, 염산 또는 인산, 또는 유기 산, 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 형성된 염이다. 자유 카복실 그룹과 형성된 염은 무기 염기, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철; 및 유기 염기, 예를 들면, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도시킬 수도 있다.
또 다른 양태에서는, 고려된 HBc 키메라를 암호화하는 유전자를 적합하게 약독화된 장내 세균, 예를 들면, 에스. 티피(S. typhi), 에스. 티피무륨(S. typhimurium), 에스. 티피무륨-이. 콜리 하이브리드 또는 이. 콜리 내로 형질감염시킨 백신 또는 접종물이 고려된다. 약독화 또는 무독력 에스. 티피 및 에스. 티피무륨, 및 에스. 티피무륨-이. 콜리 하이브리드의 예가 전술된 참조문헌에 논의되어 있다. 이들 백신 및 접종물은 특히, 인플루엔자, 효모, 예를 들면, 아스퍼질루스(Aspergillus) 및 캔디다(Candida), 바이러스, 예를 들면, 폴리오, 구제역, A형 간염, 및 세균, 예를 들면, 콜레라, 살모넬라 및 이. 콜리, 및 IgG 전신 반응 이외에도 또는 이 반응 대신 점막성 IgA 반응이 요망되는 경우와 같이 코, 장기 및 생식기의 점막을 통하여 전염되는 질병 또는 감염 질병에 대항해 사용하도록 고려된다.
장내 세균을 동결 건조시키고, 무수 약제학적으로 허용되는 희석제와 혼합하며, 섭취용 정제 또는 캅셀제로 만든 다음, 통상의 고체 상 투약에서과 같이 숙주 동물에게 투여한다. 또한, 이들 세균성 백신의 수성 제제를 경구, 비내, 직장 또는 질내 투여에 의해 점막성 면역에 사용하도록 적응시킨다.
고려된 키메라 분자 입자를 함유하는 식물을 사용하여 경구 면역시키는 것은, 형질전환성 식물 조직, 예를 들면, 당근과 같은 뿌리, 또는 쌀 또는 옥수수와 같은 씨앗을 단순히 섭취함으로써 달성할 수 있다. 이러한 경우, 구강 또는 위장관 내의 물은, 면역시키기 위해 통상적으로 사용되는 수성 매질을 제공해주고, 주변 식물 조직은 약제학적으로 허용되는 희석제를 제공해준다.
당해 접종물 또는 백신은 투여 제형과 적합한 방식으로, 치료학적으로 유효하고 면역원성인 양으로 투여한다. 투여될 양은 치료받는 대상체, 대상체의 면역계가 항체를 합성하는 능력, 및 목적하는 보호 정도에 좌우된다. 투여해야 하는 활성 성분의 정확한 양은 담당의의 판단에 따르며, 각 개인에게 대해 고유하다. 그러나, 적합한 투여량 범위는 개개인 마다 수 십 마이크로그램의 활성 성분이다. 초기 투여 및 부스터(booster) 투여에 적합한 섭생 또한 다양하지만, 초기 투여한 다음 일정한 간격(주 또는 개월)으로 후속 주사 또는 기타 투여하는 유형을 띤다.
일단 면역시키면, 재조합 HBc 키메라 면역원이, 말라리아성 백신에 대한 포자소체와 같은 관심있는 항원과 결합하는 충분한 역가의 항체 생성을 유도시키기에 충분한 시간 동안 상기 포유류를 유지시킨다. 예시되는 항-포자소체 항체 생성을 위한 유지 시간은 전형적으로, 약 3 내지 약 12주간 지속되고, 이는 백신의 부스터, 또는 제2 면역화 투여를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 제1 면역시킨지 24주 내지 5년 후에, 제3 면역이 또한 고려된다. 일단 보호 수준의 항체 역가가 획득되면, 이와 같이 백신 접종된 동물이, 약 1 내지 약 5년 간격으로 투여된 주기적 부스터 면역에 의해 상기 역가 또는 역가 근사치를 유지하는 것이 바람직하다.
말라리아 백신의 경우에 항-포자소체의 생성, 또는 기타 항체의 생성은, 상기 면역시킨 동물로부터 혈장 또는 혈청 샘플을 수득하고, 이 안에서 해당 항체를 대상으로 하여, 후술되는 바와 같은 ELISA 검정 또는 당해 분야에 널리 공지된 바와 같은 웨스턴 블롯 등의 또 다른 면역 검정에 의해, 합성 주변포자소체(circumsporozoite) 면역우성 항원[예: 본원에 사용된 피. 팔시파룸 CS 단백질 펩티드(NANP)5]와 같은 적당한 항원과 결합하는 능력에 대해 검정함으로써 용이하게 확인된다.
이와 같이 유도된 항체, 예를 들면, 항-CS 항체 또는 항-인플루엔자 항체를 널리 공지된 기술을 사용하여 접종된 숙주 동물의 혈액으로부터 분리한 다음, 널리 공지된 바와 같이 수동 면역을 위해 제2 백신 내로 재구성할 수 있다는 것에 주목해야 한다. 유사한 기술이 사람의 감마-글로불린 면역에 사용된다. 예를 들면, 면역시킨 하나의 숙주 또는 수 많은 숙주로부터의 항혈청을 수성 황산암모늄(전형적으로 40 내지 50% 포화도)에서 침전시키고, 이와 같이 침전된 항체를 친화 크로마토그래피를 사용함으로써 크로마토그래피적으로 정제하는데, 여기서는 (NANP)5 또는 인플루엔자 M2 폴리펩티드가 크로마토그래피 칼럼 상에 고정화된 항원으로서 활용된다. 따라서, 예를 들면, 접종물을 말 또는 양에 사용하여, 사람과 같은 또 다른 동물에게서 수동 면역시키는데 사용하기 위한 말라리아 종에 대한 항체 생성을 유도시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 특정 동물 숙주에 특정 접종물을 접종하는 단계를 포함하여, 이러한 동물 숙주에게서 항체, 활성화 T 세포 또는 이들 둘 다를 유도시키기 위한 방법이다. 이러한 방법에 사용된 접종물은 약제학적으로 허용되는 희석제에 용해 또는 분산된, 전술된 HBc 키메라 입자 또는 HBc 키메라 입자 접합체의 면역원성 유효량을 포함한다. 이러한 동물 숙주를, 널리 공지된 기술에 의해 검정될 수 있는 바와 같이, 항체 또는 활성화 T 세포를 유도시키기에 충분한 시간 동안 유지시키는데, 이를 위해서는 전형적으로, 널리 공지된 바와 같이 수 주 내지 수 개월이 소요된다. 이러한 유지 기간 동안 다수의 상기 면역이 고려된다.
디설파이드 결합을 예측하기 위한 컴퓨터 모델링
관심있는 단백질에 관한 3차원 구조 정보가 요구되는 프로그램 SS-BOND[참조: Hazes et al., Protein Eng 2, 119-25 (1988)]을 사용하여 디설파이드 결합을 예측하였다. HBc 구조 배위를 단백질 데이터 뱅크로부터 전송받고(이는 Wynne et al.에 의해 해결된 3.3Å 구조이다), 마지막 3개 단량체의 배위는 삭제하였는데, 이러한 구조가 2개의 이량체에 대한 정보를 포함하기 때문이다.
표준 퍼스널 컴퓨터 상에서 수행하는 경우, 상기 프로그램은 디설파이드 결합을 예측할 때 고려한 3가지 파라미터들에 대한 가장 엄격한 요구 사항을 자동으로 선택한다: (1) Sγ-Sγ 결합 주변의 회전각인 χ-3각(이상치는 ±90°이고 이 각으로부터의 편차는 0°로 설정된다), (2) 결합을 형성시키는데 요구되는 최대 에너지(이상치는 10kcal/mol 미만이다), 및 (3) 소정의 결합에 대한 가능한 가장 낮은 에너지 배좌(conformation) 이상을 허용해주는 에너지 차이(권장되는 최대치는 5kcal/mol이다). 그러나, 면역우성 루프 나선(ILH) 1(아미노산 50-73)과 ILH2(아미노산 79-110) 간에 디설파이드 결합 형성을 대한 모든 적중치를 획득하기 위해서는, 이들 요구 조건들을 완화시켜야 한다. 리눅스 작동 시스템으로부터 프로그램을 수행할 경우에는, 이들 파라미터를 편집할 수 있다.
후자 2가지 파라미터를 완화시키면, 부가의 적중치가 전혀 산출되지 않았다. 그러나, χ-3각을 완화시키면, 해당 결합 주변의 30°회전을 허용해 준 경우에 5개의 가능한 키메라가 산출되었다. 29°와 72°사이에서는 부가의 적중치가 전혀 수득되지 않았으며, 최대 허용 편차는 90°이므로; 이러한 적중치는 본 연구에 포함되지 않는다. 이어서, 이와 같이 하여 제조된 출력물의 측쇄 위치를, 아미노산의 근접성을 가시적으로 검사하기 위해 프로그램 GRASP[참조: Nicholls et al., Proteins 30, 9686-97 (1991)]을 사용하여 검사하였다. 72°적중치를 제외한 모든 것이 공간상 근접한 것으로 여겨지므로, 이들 키메라를 클론으로 만들었다. ILHs 중의 어느 것에서도 수득되지 않았지만, 29°에서 수득된 적중치를 또한 포함시켰는데, 이는 이들 잔기가 실제적인 면역우성 루프 내에 존재하였기 때문이다. 아미노산 D78과 P79 간에 에피토프 삽입을 수행하면, 이러한 에피토프의 염기에서 브릿징이 발생할 것이다.
2가지 주요 HBc 면역우성 나선을 브릿징하는 SS-결합 적중치
χ-3 이탈
(최대 90°)		 ILH1 아미노산(50-73) ILH2 아미노산(79-110)
4° L55 H104
6° A58 L100
17° A69 V89
24° W62 F97
29° L76* R82*
72° V72 V85
*: 면역우성 나선이 아니라, 면역우성 루프에 위치함.
본 발명은 다음의 비-제한적 실시예로써 예시된다.
실시예 1: 시스테인 돌연변이를 수반한 키메라의 작제
A. 플라스미드 벡터 pKK223-3N, 및 시스테인 치환물
문헌[참조: Zheng et al., J Biol Chem 267, 9422-9429 (1992)]에는 HBcl83 단량체 서열 내에 존재하는 4개의 시스테인 중의 2개가 디설파이드 결합 형성에 관여하지 않았다는 사실이 보고되었다. 시스테인 48이 소정의 샘플에서 부분적으로 공유적 결합된 것으로 밝혀졌으며, 시스테인 107이 자유 티올로서 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이들 시스테인의 돌연변이는 입자 어셈블리 또는 안정성에 영향을 미치는 것으로 밝혀지지 않았으며, 어떠한 설프하이드릴 반응성도 전혀 탐지되지 않았으며, 이는 시스테인 61과 시스테인 183이 완전히 디설파이드 결합된다는 확증을 제공해준다.
시스테인 잔기 C48와 C107 둘 다를 세린 잔기로 돌연변이시켜, 도입된 시스테인을 함유하는 입자의 설프하이드릴 함량을 용이하게 정량화하였다. 이는 보존적 돌연변이인데, 이는 세린이 시스테인과 가장 화학적으로 유사한 아미노산(이들은 설프하이드릴 대 하이드록실 R 그룹을 제외하고는 동일하다)이기 때문이다. 이러한 키메라를 모든 후속 키메라에 대한 주형으로서 사용하였다. 상기 주형의 2가지 변형물을 만들었는데, 하나는 V149에서 종결된 것이고[HBc149(C48S/C107S)], 다른 하나는 C-말단에 부가의 시스테인을 수반하는 것이다[HBc149(C48S/C107S)+C].
HBc 유전자를, 공급원[Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)]으로부터 입수 가능한 pKK223-3 벡터 내로 최초로 클로닝하였다. 다중 클로닝 부위가 NcoI 부위를 포함하도록 PCR을 사용하여 변형시켰다. 공급원[MJ Research (Waltham, MA)]으로부터 입수 가능한 미니사이클러(Minicycler™)를 사용하여 모든 PCR 반응을 수행하였다. 모든 연구에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같다:
단계 1 - 94℃에서 3분간 수행;
단계 2 - 92℃에서 1분간 수행;
단계 3 - 50℃에서 1분간 수행;
단계 4 - 72℃에서 40초간 수행;
단계 5 - 단계 2까지 14회 수행;
단계 6 - 72℃에서 5분간 수행;
단계 7 - 4℃에서 10분간 수행;
단계 8 - 종결.
모든 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 인비트로젠[Invitrogen (Carlsbad, CA)]에 의해 합성하고, 이를 1μM의 농도로 사용한 반면, 대략 0.1㎍의 필수 주형을 각 반응에 사용하였다. 벤트 폴리머라제[Vent polymerase (New England BioLabs, Beverly, MA)]가 증폭용 효소이고, 부가의 염화마그네슘이 어떠한 반응에서도 필요한 것으로 밝혀지진 않았다. 참조된 모든 프라이머가 다음 표 2에 열거되어 있으며, 모든 제한 효소는 공급원[New England BioLabs]로부터 구입하였다.
각 키메라의 DNA 서열은 세퀴-넷[Sequi-Net (Fort Collins, CO)]에 해외 조달된 자동화 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다. 플라스미드 분리를 위한 퀴아젠[Qiagen (Valencia, CA)] 미디 키트를 사용하여 플라스미드 스톡을 창출시켰다. PCR을 사용하여 만든 모든 키메라의 완전한 유전자 뉴클레오티드 서열이 서열 목록에 제공되어 있다.
프라이머 서열이 다음 표 2에 제시되어 있으며, 여기서는 HBc 아미노산 잔기가 정배향 프라이머에 대한 뉴클레오티드 서열 위에 제시되고 역배향 프라이머에 대해서는 아래에 제시된다. 굵은 이탤리체 아미노산 잔기 및 염기는 치환을 지시한다. 관심있는 제한 부위는 진하게 표시한 것이다. 모든 서열은 5'에서 3'로 서술된다.
Figure 112005030872065-pct00019
Figure 112005030872065-pct00020
키메라 HBc149 및 HBcl49+C
벡터 pKK223-3(도 2)를, 프라이머 1 및 2를 사용하여 증폭시켰다. 이어서, PCR 생성물 및 모 벡터를 SphI 및 HindIII로 분해시키고, 공급원[Qiagen]으로부터의 QIAEX II 겔 추출 시스템을 사용하여 1.25% 아가로스 겔(Gibco BRL, Gaithersburg, MD로부터의 겔 장치)로부터 정제하였다(주: 이들 장치와 시약을 사용하여 모든 클로닝을 수행하였다). 분해할 경우, 480개 염기쌍의 단편을 모 벡터로부터 절단하고, 이 단편을 제거한 다음, 벡터를 458개 염기쌍의 PCR 생성물과 연결시킨다. 이러한 클론(pKK223-3N, 도 2)은 본원에서 NcoI 및 HindIII 부위에 의해 플랭킹된 삽입물을 수용할 수 있다. pKK223-3 벡터에 대한 상기와 같은 변형 결과, 다중 클로닝 부위 내의 모든 제한 부위가 결실되었고, 프라이머 2로부터의 NcoI-EcoRI-HindIII 서열 만이 tac 프로모터와 5S rRNA 영역 사이에 잔존한다.
HBV ayw 아유형 게놈(NCBI로부터 입수 가능한 서열)을 사용하여 HBc 유전자를 클로닝하였다. 프라이머 3 및 4를 사용하여, 아미노산 149 다음의 정지 코돈과 함께, 플랭킹 NcoI 및 HindIII 부위를 가하였다. 이어서, pKK223-3N 벡터와 PCR 생성물을 NcoI 및 HindIII로 분해시켰다. 상기 벡터로부터 방출된 12개 염기쌍 단편을 경사 제거하였다. 상기 벡터를 대략 450개 염기쌍 PCR 단편과 연결시켜 키메라 HBcl49를 산출하였다. HBc149+C(CV-1123)을 동일한 방식으로 제조하였는데, 단 역배향 프라이머 9(서열번호 248)를 사용하여, 발린 149와 정지 코돈 사이에 시스테인을 삽입하였다.
키메라 HBc149(C48S/C107S) 및 HBc149(C48S/C107S)+C
위치 48 및 107에서 시스테인 대 세린 돌연변이를 함유하는 2개의 키메라(C48S/C107S)를 제조하기 위해서는, 몇 가지 PCR 반응이 필수적이다. C107S 돌연변이는 먼저, 내인성 EarI 부위를 활용하여 제조하였다. 프라이머 3과 프라이머 5를 사용하여 5' 조각을 생성시키고, 이에 C107S 돌연변이를 도입하였다. 완벽한 정합(match) 프라이머 6과 4를 사용하여 3' 조각을 제조하였다. 이들 단편(각각 대략 320개 및 130개 염기쌍)을 EarI로 분해시키고 연결하였다.
이어서, 이러한 연결물을 주형으로서 사용하여 C48S 돌연변이를 도입하였다. HhaI 부위를 침묵 돌연변이로서 A54 내로 도입하여 상기 돌연변이를 가능케 하였다. 다시 PCR을 이등분으로 수행하였다. 프라이머 3과 7을 사용하여 C48S 돌연변이를 5' 조각에 도입한 반면, 3' 조각은 프라이머 8과 4를 사용하여 제조하였다. 이어서, 이들 생성물(각각 약 165 및 295개 염기쌍)을 HhaI로 분해시킨 다음 연결하였다. 이어서, 상기 연결 생성물을 프라이머 3과, V149 다음에 정지 코돈을 위치시킨 프라이머 4, 또는 V149 다음에 시스테인을 부가한 다음 정지 코돈을 부가시킨 프라이머 9를 사용하여 증폭시켰다. 대략 450개 염기쌍 생성물을 NcoI 및 HindIII로 분해시킨 다음, 상기와 같이 제조한 pKK223-3N 벡터 내에 연결시켜 키메라 HBcl49(C48S/C107S) 및 HBc149(C48S/C107S)+C를 생성하였다.
5개 디설파이드 키메라 중의 4개 패널을 C48S/C107S 키메라와 유사한 방식으로 작제하였다 - 제1 돌연변이를 이등분으로 PCR함으로써 도입한 다음, 제1 연결물을 주형으로서 사용하여 제2 돌연변이를 이등분으로 도입하였다. C-말단 시스테인을 이용하여 모든 디설파이드 키메라를 제조하고, 주형으로서 HBc149(C48S/C107S)+C를 사용하여 본래의 모든 PCR을 수행하였다.
키메라 HBc149(C48S/C107S)L55C/H104C+C
침묵 Cac8I 부위를 HBc의 잔기 E64 주변에 도입하여 L55C 돌연변이를 만들었다. 프라이머 3과 12를 사용하여 5' 절반을 증폭시켰고, 프라이머 13과 9를 사용하여 3' 절반을 증폭시켰다. 이어서, 이들 PCR 생성물을 Cac8I로 분해시킨 다음, 연결하였다. 이어서, 이러한 연결물을 이등분으로 증폭시켰다. 프라이머 3과 10을 사용하여 만든 5' 절반에 H104C 돌연변이를 도입하고, C48S/C107S 키메라를 작제하는데 있어 앞서 사용된 EarI 부위를 사용하여, 주형에 C107S 돌연변이를 유지시켰다. 3' 절반에는 완벽한 정합 프라이머 6과 9가 사용되었다. EarI로 분해시킨 후, 단편을 연결시키고 프라이머 3과 9를 사용하여 재증폭시켰다. 이 생성물을 NcoI 및 HindIII로 분해시키고, 상기와 같이 제조된 pKK223-3N 내로 클로닝하였다.
키메라 HBc149(C48S/C107S)A58C/L100C+C
A58C 돌연변이를 도입시킨 5' 절반은, 상기와 같이 도입된 Cac8I 부위를 사용하여 상기 L55C 돌연변이와 동일한 방식으로 제조하였다. 프라이머 3과 14를 사용하여 A58C 돌연변이를 만든 반면, 프라이머 13과 9로부터 제조된 동일한 3' PCR 생성물(상기 L55C/H104C 참조)을 본 연결에 사용하였다. 그러나, L100C 돌연변이를 만들기 위해서는, 내인성 Sau96I 부위를 활용하였다. 완벽한 정합 프라이머 3과 15를 사용하여 5' 절반을 만든 반면, 프라이머 16과 9를 사용하여 L100C 돌연변이를 3' 절반에 도입하였다. PCR 생성물을 Sau96I로 분해시키고 연결한 다음, 프라이머 3과 9를 사용하여 재증폭시키고, 상기와 같이 pKK223-3N 내로 클로닝하였다.
키메라 HBcl49(C48S/C107S)A69C/V89C+C
프라이머 3과 17 및 내인성 BstNI 부위를 사용하여, A69C 돌연변이를 5' PCR에 도입하였다. 3' PCR은 완벽한 정합 프라이머 18과 9를 사용하였다. 생성물을 BstNI으로 분해시킨 다음 연결하였다. 이어서, 상기 연결물을 사용하여 5' PCR 절반에 V89C 돌연변이를 창출시켰는데, 해당 유전자 내에 천연으로 발생하는 Sau96I 부위를 다시 활용하였다(프라이머 3 및 11). 3' PCR으로는, 완벽한 정합 프라이머 19과 9를 사용하여 어떠한 돌연변이도 도입시키지 않는다. 생성물을 Sau96I로 분해시키고, 연결시키며, 프라이머 3과 9를 사용하여 재증폭시킨 다음, 상기와 같이 pKK223-3 내로 클로닝하였다.
키메라 HBc149(C48S/C107S)W62C/F97C+C
L55C 및 A58C 경우와 같이, W62C 돌연변이를 Cac8I 부위로부터 만들었다. 프라이머 3과 20은 5' 절반에 상기 돌연변이를 도입시킨 반면, L55C 및 A58C 돌연변이를 만들기 위해 사용된 것과 동일한 3' PCR 생성물을 여기에 사용하였다. 생성물을 Cac8I로 분해시키고, 연결한 다음, PCR 제2 회전을 수행하였다. Sau96I 부위를 다시 활용하여, 프라이머 21과 9를 사용하여 3' F97C 돌연변이를 만든 반면, 5' 프라이머 3과 15는 완벽히 정합되었다. 상기 키메라를 제조하는데 관여한 PCRs은 이와 같은 순서로 수행되어야만 한다는 것을 인지해야 하는데, 이는 F97C 돌연변이가 만들어질 때 부가의 Cac8I 부위가 도입되기 때문이다. Sau96I로 분해시킨 후, 생성물을 연결하고, 프라이머 3과 9를 사용하여 재증폭시킨 다음, 상기와 같이 pKK223-3 내로 클로닝하였다.
키메라 HBc149(C48S/C107S)L76C/R82C+C
HBc 루프 내의 A80-S81 서열에 침묵 돌연변이를 만듦으로써, NheI 부위를 상기 루프 내로 도입하는 것이 가능해졌고 상기 키메라를 PCR 2회전 만을 수행하고도 제조할 수 있게 되었다. 프라이머 3과 22를 사용하여 L76C 돌연변이를 5' 조각에 도입하였고, 프라이머 23과 9를 사용하여 R82C 돌연변이를 3' 조각에 도입하였다. 각각 대략 245 및 222개 염기쌍인 PCR 생성물을 NheI로 분해시키고 연결하였다. 이어서, 이러한 연결물을 프라이머 3과 9를 사용하여 증폭시켜 표준 450개 염기쌍 단편을 생성시키고, 이를 NcoI 및 HindIII로 분해시킨 다음, pKK223-3N 내로 클로닝하였다.
B. 루프 삽입 벡터의 제조
5개의 시스테인-수반 공학적 처리된 키메라 중의 4개가 HBc 입자로 성공적으로 어셈블리되었다. 따라서, 이들 전부를 대상으로 하여, 외래 에피토프를 면역우성 루프 내로 수용할 수 있는 능력에 대해 검정하였다. 부가적으로, 어떠한 시스테인도 도입되지 않은 키메라를 대조군으로서 사용하여, 어셈블리하는 능력과 추후에 안정화시키는 능력을 비교하였다. 에피토프를 HBc 아미노산 아스파르트산 78과 프롤린 79 사이에 삽입하였다. 모든 에피토프가 5' 말단 상에서 Gly 및 Ile에 의해 플랭킹되고(EcoRI 제한 부위에 의해 암호화됨), 3' 말단 상에서 Glu 및 Leu에 의해 플랭킹되도록(SacI 제한 부위에 의해 암호화됨), 신규한 제한 부위 EcoRI 및 SacI를 도입하였다. 따라서, 어셈블리된 입자를 형성하지 못한 HBc149(C48S/C107S)L55C/H104C+C를 제외한 모든 시스테인 키메라를 먼저, HBc 서열의 아미노산 잔기 D78과 P79 사이에 이종 에피토프를 수용할 수 있는 벡터로 만들었다.
합성 dsDNA 단편의 면역우성 루프 영역 내로의 방향성 삽입을 수용할 수 있는, 변형된 HBc149 유전자(V2 및 V16) 또는 HBc183(V8) 유전자를, PCR을 사용하여 작제한다. [아미노산 D78과 P79 사이에 삽입물을 수용하고 V149로 절단된 플라스미드는 V2로 명명되고, V149 다음에 부가의 시스테인을 갖는 동일한 플라스미드는 V16으로 명명되며, D78과 P79 사이에 삽입물을 수용하고 C183에서 종결되는 플라스미드는 V8로 명명된다]. 상기 HBc149 및 HBc183 유전자를, 2개의 PCR 프라이머 쌍(이중 하나는 아미노 말단을 증폭시키고, 다른 하나는 카복실 말단을 증폭시킨다)을 사용하여 이등분으로 증폭시킨다. V2의 경우에는, PCR 반응 생성물이 249 bp 단편(N-말단) 및 243 bp 단편(C-말단)이고; V16의 경우에는, 이러한 생성물이 249 bp 단편(N-말단) 및 246 bp 단편(C-말단)이고; V8의 경우에는, 이러한 생성물이 249 bp 단편(N-말단) 및 349 bp 단편(C-말단)이다.
이와 같이 제조된 N-말단 단편을 NcoI 및 EcoRI로 분해시키고, C-말단 단편을 EcoRI 및 HindIII로 분해시킨다. 이어서, 상기 V2, V16 및 V8 단편 쌍을 공통의 EcoRI 오버행에서 함께 연결시킨다. 이어서, 이로써 생성된 NcoI-HindIII 단편을, NcoI 및 HindIII로 분해시킴으로써 제조시킨 pKK223-3N 벡터 내로 연결시킨다.
B 세포 에피토프를 V2, V16 및 V8 플라스미드 내로 삽입하기 위해, 적당한 플라스미드를 EcoRI 및 SacI 제한 효소로 분해시킨다. 이어서, 5' EcoRI 및 3' SacI 오버행을 함유하는 합성 dsDNA 단편을 삽입한다. 모든 경우에 있어, V2, V16 및 V8, 글리신-이소루이신(EcoRI) 및 글루탐산-루이신(SacI) 아미노산 쌍은 상기 삽입된 B 세포 에피토프를 플랭킹한다. 이와 같이 삽입된 제한 부위가 다음 프라이머에서 밑줄쳐져 있다:
Figure 112005030872065-pct00021
Figure 112005030872065-pct00022
Figure 112005030872065-pct00023
상기 루프에 대한 시스테인 돌연변이의 근접성 때문에, 키메라 HBc149(C48S/C107S)L76C/R82C+C에 대해 특이적인 프라이머 세트를 고안할 필요가 있는 반면, 기타 모든 키메라는 동일한 프라이머 세트를 사용하였다(다음의 표 2 및 3). EcoRI 부위를 3' 말단에 부가함으로써, 프라이머 3과 22[HBcl49(C48S/C107S)L76C/R82C+C의 경우에는 23]를 사용하여 5' 절반을 제조하였다. 프라이머 24[HBc149(C48S/C107S)L76C/R82C+C의 경우에는 25]와 9를 사용하여 3' 절반을 제조하고, EcoRI 부위와 하단 SacI 부위를 이들 단편에 부가하였다. 이어서, 모든 PCR 생성물을 EcoRI로 분해시키고, 각각의 상응하는 절반과 연결시킨 다음, 프라이머 3과 9를 사용하여 재증폭시켰다. 이어서, 이들 생성물을 NcoI 및 HindIII로 분해시킨 다음, 제조된 플라스미드 pKK223-3N 내로 클로닝하였다. 각 클론의 서열은 전술된 바와 같이 자동화 DNA 서열 분석함으로써 확인하였다.
시스테인을 전혀 도입하지 않은 등가의 벡터(V16)에서의 과거 에피토프의 성공 또는 실패에 근거하여 에피토프 선별하였다. V16에서 실패한 2개의 에피토프를 선별하였는데, 이는 알츠하이머병(Alzheimer's disease)과 관련된 β-아밀로이드 단백질로부터의 것(잔기 1-32)[참조: Morgan etal., Nature 408, 982-985 (2000)]과, 비. 안트라시스(B. anthracis)(Ba)로부터의 보호성 항원의 잔기 701-721이다[참조: Little etal., Microbiology 142, 707-715 (1996)]. 구충(hookworm) 단백질 Asp-1로부터의 에피토프(잔기 292-303)[공급원: Dr. Peter Hotez, George Washington University]는 V16에서 낮은 수준이긴 하지만, 탐지 가능한 수준의 입자 어셈블리를 생성시키며; 이러한 에피토프는 입자 생산량이 디설파이드 결합 도입에 따라 증가할 수 있는지를 평가하기 위해 포함되었다. V16에서 극히 우수한 입자 어셈블리를 나타낸 최종 에피토프는, 공학적으로 처리된 변형물에 대한 상기 키메라의 입자 어셈블리와 안정성을 비교하기 위해 포함되었다. 이러한 에피토프는 본 발명자의 실험실에서 상기 에피토프를 사용한 선행 연구에서 입자 어셈블리에 필요한 것으로 밝혀진 서열에서 2가지 변형을 수반한, 인플루엔자 A의 M2 단백질의 세포외 도메인(잔기 2-24)으로부터 유래된 것이다[참조: Zebedee et al., J Virol 62, 2762-2772 (1988); and Neirynck et al., Nat Med 5, 1157-63 (1999)]. 모든 에피토프 서열이 다음 표 3에 제시되어 있다.
올리고뉴클레오티드 서열은, 어닐링된 경우에 상기 제조된 시스테인-공학적 처리된 벡터 내로 연결될 수 있는 일본쇄 점착성 말단을 수반하는 상부 쇄와 하부 쇄로서 고안되었다. 등몰량의 올리고(각 상부 및 하부 올리고 10μM)를 가하고, 5분 동안 95℃에서 가열한 다음, 매분 1°씩 75°에 대해 온도를 하강시킴으로써, 미니사이클러(MJ Research)를 사용하여 올리고 어닐링을 수행하였다. 이어서, 어닐링된 올리고-함유 용액을 TE 완충액에서 1:20으로 희석시켰다. 이러한 과정을 프라이머 쌍 26과 27, 28과 29, 30과 31, 및 32와 33에 대해 수행하였다. EcoRI 및 SacI로 분해시킨 다음, 이로써 생성된 작은 단편으로부터 벡터를 제거 정제함으로써, 각 디설파이드 벡터를 제조하였다. 이어서, 1㎕의 각 어닐링된 올리고를 상기 제조된 벡터 내에 연결하였다. 서열 분석함으로써, 클론 서열을 다시 확인하였다.
Figure 112005030872065-pct00024
C. 키메라의 발현 및 정제
서열 확인 후, lac 리프레서를 발현하는 플라스미드인 pREP4(Qiagen)를 사용하여 키메라를 이. 콜리의 BLR 균주(Novagen, Madison, WI) 내로 공동-형질전환시킨다. 염화칼슘 제제에 의해 세포를 적격하게 만들었다[참조: Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]. 플라스미드 pKK223-3은 tac 프로모터를 수반하지만, lac 억제인자는 암호화하지 않기 때문에, 상기 단백질이 IPTG의 부가에 의해 유도될 때까지 HBc 유전자의 발현을 억제하기 위해, 이러한 단백질은 pREP4에 의해 트랜스로 제공된다. 형질전환물을 50㎍/L 앰피실린(pKK223-3은 앰피실린 내성 마커를 수반한다), 및 10㎍/L 카나마이신(pREP4는 카나마이신 내성 마커를 수반한다)이 보충된 LB 플레이트 상에 도말하여 어느 한 플라스미드의 손실을 방지하였다.
이어서, 형질전환체를 동일한 농도의 항생제를 갖는 TB 드라이 배지(Doc Frugal, San Diego, CA)의 3ml 발단 배양물(starter cultures) 내로 피킹한 다음, 밤새 성장시켰다. 이어서, 각 발단 배양물 1ml를 사용하여, 동일한 항생제를 갖는 500ml TB 드라이 배지를 접종시키고, 배양물을 0.6 내지 1.0의 OD600으로 성장시킨 다음, 25μM IPTG로 유도시켰다. 배양물을 16 내지 24시간 동안 성장시키고, 세포를 15,000 xg로 10분 동안 원심분리시킴으로써 수거하였다.
크기 배제 크로마토그래피함으로써 키메라의 어셈블리를 검정하였다. 어셈블리된 HBc는 별개의 피크(4개의 피크 프로필 중의 2번째)로서 용출되는데, 이는 입자가 더 뒤의 피크에서 어셈블리-어셈블리되지 않은 단량체를 용출시키지 못할 경우에는 존재하지 않는다. 세포 펠릿을 교반시킴으로써 50ml의 50mM Tris-HCl, pH 8.0 및 10mM EDTA(용해용 완충액)에 재현탁시켰다. 이어서, 이러한 세포 현탁액을 미세유동화기(Microfluidics, Newton, MA)를 사용하여 용해시키고, 31,000xg로 20분 동안 원심분리시켜 세포 부스러기를 펠릿화하였다. HBc 입자는 전형적으로 가용성 분획 내에 국재하기 때문에, 상등액 용적을 측정한 다음, 포화 황산암모늄을 사용하여 1:1로 희석시켜 상기 단백질을 침전시켰다. 이로써 생성된 용액을 4℃에서 15분 동안 온화하게 교반시킨 다음, 31,000xg로 20분 동안 두 번째로 원심분리시켜 황산암모늄 침전물을 펠릿화하였다.
상등액을 경사 제거하고 펠릿을 5ml의 용해용 완충액에 재현탁시킨 다음, 투석용 튜빙(분자량 컷-오프 8,000달톤)에 옮겼다. 샘플을 1L의 용해용 완충액에 대해 3시간 이상 동안 투석시키고, 0.45㎛ 주사기 필터를 통하여 여과시킨 다음, 2.5 x 100cm XK 26 칼럼 내에 패킹되고 Akta Prime FPLC(공급원: Pharmacia Biotech)에 부착된 세파로스 CL-4B 수지(공급원: Pharmacia Biotech)를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피하였다.
상기 칼럼을 20mM 인산나트륨(pH 6.8) 및 0.02% 나트륨 아지드로 예비-평형시키고, 동일한 완충액을 1.5ml/분의 유속으로 대략 800ml에 대해 상기 칼럼 내로 펌핑하면서, 6 내지 8ml 분획을 수집하였다. 칼럼 내로 이동하는 물질의 초기 협소한 제1 피크 다음의 특징적 피크에 대한 용출 프로필을 검사함으로써, 입자 생성을 평가하였다.
어셈블리된 입자가 탐지된 경우에는, 피크 분획을 모으고, 이를 2.5 x 20cm 칼럼(Kontes, Vineland, NJ) 내에 패킹된, 조악한 HYPATITE™ C 수지(Clarkson, Williamsport, PA)의 20 내지 25ml 칼럼 용적 내로 통과시켰다. HBc 입자는 전형적으로, 상기 수지에 대한 최소한의 결합을 나타내기 때문에, 상기 단백질을 상기 칼럼 상에 부하하고, 전체 용출물을 수집하였다. 이어서, 이 칼럼을 용출물의 Abs280이 0.1 미만이 될 때까지 50mM 인산나트륨(pH 6.8)로 세척하였다.
이어서, 상기 풀을 0.45㎛ 필터 내로 통과시키고, HPLC(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA로부터의 BioCad)의 용매 라인을 통하여, MonoQ™ HR 10/10 음이온 교환 칼럼(Pharmacia Biotech) 상으로 부하하였다. 상기 칼럼을 25mM Tris-HCl 및 0.02% 나트륨 아지드에서 평형시키고, 샘플이 일단 부하되면, 동일한 완충액으로 세척하였다. 입자를 25mM Tris-HCl 중의 0-3M NaCl의 선형 농도 구배로 용출시켰다. 피크 분획을 모으고, 포화 황산암모늄을 사용하여 1:1로 희석시켜 재침전시키며, 4℃에서 1시간 동안 온화하게 교반시킨 다음, 17,500xg로 30분 동안 원심분리시켰다. 이로써 생성된 펠릿을 최소 용적의 20mM 인산나트륨(pH 6.8)에 재현탁시키고, 투석용 튜빙에 옮긴 다음, 동일한 완충액에 대해 광범위하게 투석하였다. 이어서, 정제된 최종 샘플을 0.45㎛ 필터 내로 통과시키고, 4℃에서 24시간 동안 항온 배양(유지)한 후, 이를 동결시켰다. BCA 검정(Sigma, St. Louis, MO로부터 입수 가능함)에 의해 단백질 농도를 결정하였다.
D. 어셈블리된 키메라의 성상 확인
본래의 입체 형태 측면에서 입자를 검사하는 2가지 방법(분석적 크기 배제법 및 엘만스 시험법) - 한 가지 방법은 비-환원성 조건 하에 변성 입자를 검사하는 방법(비-환원성 SDS-PAGE)이고, 다른 방법은 단량체 원형 보존을 검사하는 방법(환원성 SDS-PAGE) - 을 사용하여, 정제된 단백질을 성상 확인하였다.
미립형 물질 대 비-미립형 물질을 평가하기 위해, 정제된 단백질 샘플을 분석적 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. 이러한 과정에서는, 50 내지 90㎍의 각 샘플을 슈퍼로스(Superose) 6 HR 10/30 칼럼(Pharmacia Biotech) 상에 주사하고, HPLC(BioCad) 또는 Akta 정제기(Pharmacia Biotech)에 부착시켰다. 20mM 인산나트륨(pH 6.8)을 0.5ml/min의 유속으로 상기 칼럼 내로 펌핑하였다. 피크 용출 프로필을 가시화함으로써 입자 원형 보존을 평가하였는데, 여기서는 대략 7ml의 용출 위치에서 1개의 피크가 존재하는 것이 완전히 형성된 입자이다. 더 뒤의 피크는 비-미립형 구조, 예를 들면, 이량체 및 단량체를 나타낸다.
문헌[참조: Zheng et al., J Diol Chem 267, 9422-9429 (1992)]에 기재된 바와 유사한 방법을 사용하여, 디설파이드 결합 형성을 평가하였다. 따라서, 입자를 ELISA 플레이트 웰에서 20mM 인산나트륨(pH 6.8) 및 0.1% SDS 중의 1mg/ml의 최종 농도가 되도록 희석시켰다. 이어서, 엘만스 시약(Sigma) 원액을 디메틸 설폭사이드(DMSO) 중의 200mM 농도 하에 만들었다. 이어서, 이 용액을 20mM 인산나트륨(pH 6.8)에서 1:200으로 희석시키고, 0.1mM의 최종 농도를 위해 HBc 샘플에 부가하였다. 반응을 실온에서 15분 동안 진행하였다. 상기 판을 Spectramax™(Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 상에서 412nm 하에 판독하였다. 이어서, 비색 분석을 수행하여 디설파이드 결합 형성을 결정하였는데, 여기서는 엘만스 시약과 자유 설프하이드릴과의 반응성으로 인해 황색이 나타났고, 특정 샘플 중에서의 완전한 디설파이드 결합 형성은 어떠한 색상도 나타내지 않았다.
비-환원성 및 환원성 SDS-PAGE 겔을 사용하여 입자의 최종 성상 확인을 수행하여, 디설파이드 결합 유도된 단량체 및 이량체의 가교 결합성 뿐만 아니라 단량체 원형 보존 여부를 검사하였다. NuPAGE™ 시스템[공급원: Invitrogen, Carlsbad, CA]을 사용하여 모든 SDS-PAGE 겔을 수행하였다. XCell SureLock™ 전기영동 장치에서 MES 완충액을 사용하여 NuPAGE™ 10% Bis-Tris 1.5mm x 10 웰 겔을 수행하였다. LDS NuPAGE™ 샘플 완충액을 부가하고 50℃에서 10분 동안 가열함으로써 샘플을 제조하였다. 환원된 샘플을 제조하기 위해서는, 10%의 최종 농도를 위한 가열 단계에 앞서 β-머캅토에탄올을 부가하였다.
겔을 200V에서 30 내지 40분 동안 수행한 다음, 제공된 프로토콜에 따라서 SimplyBlue SafeStain™(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 염색시켰다. 비-환원성 샘플 중에서의 가교 결합성은 단량체성 및 이량체성 표본의 부재와, 겔의 상부에 도말 표본으로서 가시적인 고분자량 단백질의 존재에 의해 정립하였다. 단량체성 원형 보존은, 공지된 표준물과 동일한 분자량(대략 17kDa)의 1개 규정 밴드의 존재에 의해 정립되었다.
각종 온도(4℃, 실온 및 37℃)에서 항온 처리된 샘플 상에서 상기 방법을 사용하고 0일, 3일, 7일 및 14일째에 분석용 샘플을 수집함으로써, 입자의 안정성을 평가하였다.
E. 면역우성 루프에서 피. 팔시파룸으로부터의 CS-반복체 에피토프 및 N-말단 시스테인으르 함유하는 키메라 입자를 발현하기 위한 벡터
2개의 발현 벡터[V2.Pfl(N-MGCELDP) 및 V2.Pfl(N-MGCDIDP)]를 제조하여, 키메라 입자를 안정화시킬 수 있는 N-말단 시스테인 잔기의 능력을 결정하였다. 벡터 V2.Pfl(N-MGCELDP)를 제조하기 위해, 올리고뉴클레오티드 HBc(MGCELDP)-NcoI-F 및 HBcl49/HindIII-R을 사용하여 벡터 V2.Pfl로부터 하이브리드 HBc 유전자를 증폭시켰다. 이로써 생성된 528bp 단편을 NcoI 및 HindIII로 절단시키고, 동일한 두 효소로 절단시킨 바 있는 pKK-223-3N 내로 삽입한다.
벡터 V2.Pfl(N-MGCDIDP)를 제조하기 위해, 올리고뉴클레오티드 HBc(MGCDIDP)-NcoI-F 및 HBcl49/HindIII-R을 사용하여 벡터 V2.Pfl로부터 하이브리드 HBc 유전자를 증폭시킨다. 이로써 생성된 528bp 단편을 NcoI 및 HindIII로 절단시키고, 동일한 두 효소로 절단시킨 바 있는 pKK-223-3N 내로 삽입한다.
Figure 112005030872065-pct00025
F. V7 클로닝 벡터의 제조
T 세포 에피토프를 HBc 키메라의 C-말단에 융합시키기 위해, 새로운 벡터를 작제하였다. 단일의 EcoRI 및 SacI 제한 부위를 발린-149와 HindIII 부위 사이에 삽입하여, 합성 dsDNA의 EcoRI-HindIII(또는 EcoRI-SacI) 제한 부위 내로의 방향성 삽입을 촉진시킨다. 다음의 PCR 프라이머 쌍을 사용하여, 아미노 말단에 NcoI 제한 부위를 갖고 카복실 말단에 EcoRI, SacI 및 HindIII 부위를 갖는 HBc 149 유전자를 증폭시켰다. 이러한 PCR 반응 생성물(479bp)를 NcoI 및 HindIII로 분해시키고, 이를 pKK223-3N 내로 클로닝시켜 V7을 형성한다.
T 세포 에피토프를 삽입하기 위해, 플라스미드(V7)를 EcoRI 및 HindIII (또는 EcoRI 및 SacI)로 분해시키고, EcoRI/HindIII(또는 EcoRI/SacI) 오버행을 갖는 합성 dsDNA 단편을 V7에 연결시킨다. 모든 V7 작제물의 경우, 본래 HBc의 마지막 아미노산(발린-149)과 상기 삽입된 T 세포 에피토프의 첫 번째 아미노산을, EcoRI 제한 부위를 형성하는 뉴클레오티드에 의해 암호화된 글리신-이소루이신 디펩티드 서열에 의해 분리시킨다. EcoRI/SacI에 삽입된 에피토프의 경우에는, 상기 SacI 부위에 의해 비롯된, T 세포 에피토프 다음, 종결 코돈 전에 부가의 글루탐산-루이신 잔기가 존재한다. 제한 부위는 제시된 프라이머에서 밑줄쳐져 있다:
Figure 112005030872065-pct00026
G. V12 발현 작제물의 제조
아미노산 78과 79 사이에 B 세포 에피토프를 함유할 뿐만 아니라 발린-149의 T 세포 에피토프 하단을 함유하는 V12 벡터를 V2 및 V7 벡터로부터 작제한다. EcoRI/HindIII에 삽입된 AT 세포 에피토프를 함유하는 V7 벡터의 카복실 말단을, 2개의 PCR 프라이머(HBc-P79/SacI-F 및 pKK223-2/4515-32R)를 사용하여 증폭시켜, SacI 및 HindIII 제한 부위로 플랭킹된, 아미노산 79-149에 상응하는 dsDNA 단편 + T 세포 에피토프를 제공한다.
상기 PCR 생성물을 SacI 및 HindIII로 절단한 다음, 이와 동일한 2개의 효소로 절단함으로써 제조시킨 목적하는 V2 벡터 내로 클로닝시킨다. PCR 프라이머는 HBc 유전자의 아미노산 149 다음에 존재하는 T 세포 에피토프에 상관없이, 모든 V7 유전자의 카복실 말단을 증폭할 수 있게 해준다.
제한 부위가 밑줄쳐져 있다.
Figure 112005030872065-pct00027
H. V2 내로 삽입된 피. 팔시파룸 CS-반복체 B 세포 에피토프
V2 및 V7 작제물의 경우, 관심있는 B 세포 에피토프(V2) 또는 T 세포 에피토프(V7)를 암호화하는 합성 dsDNA 단편을 EcoRI/SacI 제한 부위 내로 삽입한다. 관심있는 B 및 T 세포 에피토프를 암호화하는 합성 dsDNA 단편은, 상보성 일본쇄 DNA 올리고뉴클레오티드를 등몰 농도로 혼합하고, 5분 동안 95℃로 가열한 다음, -1℃/분의 비율로 실온으로 냉각시킴으로써 제조한다. 이러한 어닐링 반응을 TE 완충액에서 수행한다. 이본쇄 DNA가 상기 제시된 암호화된 에피토프 서열과 함께 다음에 제시된다. 파운드 부호 #는 정지 코돈의 존재를 지시하기 위해 몇몇 아미노산 잔기 서열에 사용된다.
Figure 112005030872065-pct00028
Figure 112005030872065-pct00029
Figure 112005030872065-pct00030
Figure 112005030872065-pct00031
Figure 112005030872065-pct00032
Figure 112005030872065-pct00033
Figure 112005030872065-pct00034
실시예 2: 인플루엔자 A M2 폴리펩티드 서열을 함유하는 키메라의 제조
A. 인플루엔자 A M2 N-말단 도메인의 V2, V7, V8, V16, V34, V47, V48, V54, 및 V55 클로닝 벡터 내로의 삽입
V2, V7, V8, V16, V34 및 V55 작제물의 경우에는, M2 에피토프(인플루엔자 A M2 단백질의 잔기 2-24; 서열번호 9)를 암호화하는 합성 dsDNA 단편을 EcoRI/SacI 제한 부위 내로 삽입하는 반면, V47, V48, 및 V54 작제물의 경우에는 동일한 것의 잔기 1-24를 NcoI/SacI 제한 부위 내로 삽입하였다. 상보적 일본쇄 DNA 올리고뉴클레오티드를 등몰 농도로 혼합하고, 5분 동안 95℃로 가열한 다음, 분당 -1℃의 비율로 실온으로 냉각시킴으로써, 합성 dsDNA 단편을 제조하였다. 이러한 어닐링 반응을 TE 완충액에서 수행하였다. 이본쇄 DNA는 상기 제시된 암호화된 에피토프 서열과 함께 다음에 제시되어 있다:
Figure 112005030872065-pct00035
B. 개개의 시스테인-돌연변이된 인플루엔자 A M2 N-말단 도메인[M2(1-24/C17S), M2(1-24/C19S)]의 V47 발현 벡터 내로의 삽입
세린으로 돌연변이된 위치 17 또는 19에 시스테인을 갖는 M2 단백질의 잔기 1-24를 암호화하는 어닐링된 DNA 단편이 다음에 제시되어 있다. 이들을 상기 파트 A에 기재된 바와 같이 V47의 NcoI/SacI 제한 부위 내로 삽입하였다.
Figure 112005030872065-pct00036
C. 시스테인-돌연변이된 인플루엔자 A M2 N-말단 도메인[M2(2-24/C17S,C19S)]의 발현 벡터 V8, V16, V47, V48, 및 V54 내로의 삽입
V8 및 V16 작제물의 경우에는, 2개의 시스테인 대 세린 돌연변이를 수반하고 M2 에피토프(인플루엔자 A M2 단백질의 잔기 2-24)를 암호화하는 합성 dsDNA 단편을 EcoRI/SacI 제한 부위 내로 삽입하는 반면, V47, V48, 및 V54 작제물의 경우에는, 동일한 것의 잔기 1-24를 NcoI/SacI 제한 부위 내로 삽입하였다. 합성 dsDNA 단편을 상기 파트 A에 기재된 바와 같이 제조하였다.
Figure 112005030872065-pct00037
D. 인플루엔자 A M2 N-말단 도메인의 부가 복사물의, 발현 벡터 V54.M2(1-24)의 N-말단 상으로의 삽입
본래의 M2 서열[M2(1-24)] 또는 돌연변이된 M2 서열[M2(1-24/C17S, C19S)]의 1개의 부가 복사물을 현존하는 M2(1-24) 서열에 N-말단적으로 클로닝하였다. 이들 클론을 작제하는데 있어서, 본래의 메티오닌을 제거하여, 부가된 복사물이 단지 하나의 개시인자 메티오닌을 공급하도록 한다. PCR을 사용하여 상기 작제물을 2개 단편으로 제조하였다. 2개의 본래의 M2 복사물을 함유하는 클론[M2(1-24)/V54.M2(2-24)]을 제조하기 위해, 주형 V54.M2(1-24)를 사용하여 먼저, M2 서열의 D24 다음에 XhoI 부위가 삽입되므로 (아미노산 루이신에 이어 글루탐산이 삽입된) N-말단 단편을 증폭시킨 다음(이로써 생성된 단편은 353bp이다), M2 서열의 S2에 대한 N-말단에 XhoI 부위를 삽입시킴으로써, 메티오닌을 제거시킨 C-말단 단편을 증폭시켰다(이로써 생성된 단편은 538bp이다). M2의 돌연변이체에 이어 본래의 복사물을 함유하는 클론[M2(1-24/C17S,C19S/V54.M2(2-24))]을 제조하기 위해, 주형 V54.M2(1-24/C17S,C19S)를 사용하여 N-말단 단편을 생성시킨 반면, C-말단 단편은 상기와 동일하였다(이로써 생성된 단편 크기 역시 동일하다).
제조된 N-말단 단편을 BamHI 및 XhoI로 분해시키고, C-말단 단편을 XhoI 및 HindIII로 분해시켰다. 이어서, 단편 쌍을 공통의 XhoI 오버행에 함께 연결시킨다. 이어서, 이로써 생성된 BamHI-HindIII 단편을, BamHI 및 XhoI로 분해시킴으로써 제조한 pKK223-3N 벡터 내로 연결하였다.
돌연변이된 M2 서열의 2개의 부가 복사물을 현존하는 M2(1-24) 서열에 N-말단적으로 클로닝하였다. 다시, 단지 1개의 개시인자 메티오닌이 유전자의 위치 1에 보존되어 작제물 M2(1-24/C17S,C19S/M2(2-24/C17S,C19S/V54.M2(2-24)이 생성되었다. 다시, 상기 클론을 2개의 PCR 단편으로 생성하였다. 주형 V54.M2(1-24/C17S, C19S)을 사용하여, 돌연변이체 M2 서열의 D24 다음에 PstI 부위가 삽입되므로, 아미노산 루이신에 이어 글루타민이 삽입된 N-말단 단편을 생성하였다(이로써 생성된 단편은 353bp이다). 상기로부터의 주형 M2(1-24/C17S,C19S/V54.M2(2-24)를 사용하여, 돌연변이체 M2 서열의 S2에 대한 N-말단에 PstI 부위를 삽입시킴으로써, 메티오닌을 제거시킨 C-말단 단편을 생성시켰다(이로써 생성된 단편은 613bp이다).
제조된 N-말단 단편을 BamHI 및 PstI로 분해시키고, C-말단 단편을 PstI 및 HindIII로 분해시켰다. 이어서, 단편 쌍을 공통의 PstI 오버행에 함께 연결시킨다. 이어서, 이로써 생성된 BamHI-HindIII 단편을, BamHI 및 XhoI로 분해시킴으로써 제조한 pKK223-3N 벡터 내로 연결하였다.
Figure 112005030872065-pct00038
Figure 112005030872065-pct00039
E. 본래의 M2-HBc의 절단된 변형물의 작제
183개 잔기의 완전한 길이의 HBc 서열을 함유하고 있는 본래의 M2-HBc 작제물[참조: Neirynck et al., (1999) Nature Med., 5 (10): 1157-1163: WO 99/07839]를 V149로 절단시키고, 전체 유전자를 pKK223-3 발현 벡터 내로 이동시켰다. 이를 달성하기 위해, 젠트(Gent) 대학에 의해 공급된 플라스미드 3453을 PCR 반응에 대한 주형으로서 사용하여 523bp의 생성물을 수득하였다.
이 생성물을 제한 효소 AflIII 및 HindIII로 분해시킨 다음, NcoI 및 HindIII으로 분해시킴으로써 제조한 pKK223-3N 벡터 내로 연결하였다.
Figure 112005030872065-pct00040
실시예 3: 부분적으로 절단된 입자를 발현하기 위한 발현 벡터의 합성
부분적으로 절단된 HBc 입자를 발현하기 위한 발현 벡터를 제조하기 위해, 단일 아미노 말단 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머(HBc149/NcoI-F)를 단일의 C-말단 프라이머와 조합하여 사용하였다. 예를 들어, HBc156(E.cR; CV-1600 입자) 발현 플라스미드를 제조하기 위해, 프라이머 HBc149/NcoI-F 및 HBc156(E.cR)-H3-R을 사용한다. 프라이머 HBc149/NcoI-F 및 HBc156C(E.cR)-H3-R을 사용하여 HBcl56(E.cR)+C (CV-1601 입자) 발현 플라스미드를 제조하였다. 사용된 모든 프라이머의 서열이 다음에 표시된다.
입자를 절단하는 것 이외에, 및 C-말단 시스테인 잔기를 혼입시키는 몇몇 경우에는, 이. 콜리에서의 발현을 위해 최적인 코돈을 또한 사용하였다. 몇 가지 아르기닌 코돈, 특히 AGA 및 AGG는 이. 콜리에 의해 드물게 사용되는 것으로 공지되어 있고, 이들은 해독시 폴리펩티드 합성의 실속(stalling)을 유발시켜 미성숙 종결을 가져다 줌으로써, 단백질을 이. 콜리에서 효율적으로 발현시키는데 있어 문제가 있는 것으로 여겨진다. HBc의 150과 183 사이의 16개 아르기닌 코돈 중에서, 7개가 드문(rare) AGA 코돈에 의해 암호화되고, 2개가 극히 드문 AGG 코돈에 의해 암호화된다. 따라서, 본 연구에서는 모든 AGA 및 AGG 코돈을, 이. 콜리에 의해 보다 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체시켰다.
드문 아르기닌 코돈을 순차적으로 대체시키기 위해서는, HBc156 유전자를 먼저 합성한 다음(CV-1600 및 CV-1601 입자), 이를 HBc163 작제물에 대한 주형으로서 사용하고(CV-1634 및 CV-1632 입자); 그 후, 이러한 HBcl63 작제물을 HBc171 작제물에 대한 주형으로서 사용하고(CV-1642 및 CV-1643 입자); 최종적으로, HBc 171 작제물을 아르기닌 코돈 최적화 HBc182 및 HBc183 작제물에 대한 주형으로서 사용하였다. 비-최적화 HBc182 작제물(CV-1575)을 대조 목적으로 또한 제조하였다. 모든 PCR 생성물을 제한 효소 NcoI 및 HindIII로 절단하고, 전술된 바와 동일한 효소로 절단시킨 발현 벡터 pKK223-3N 내로 클로닝하였다.
아미노-말단 프라이머 서열(NcoI 제한 부위가 밑줄쳐져 있다):
Figure 112005030872065-pct00041
Figure 112005030872065-pct00042
다음 표는 완전한 길이의 HBcAg(HBc183)의 C-말단의 입체 배치와, C-말단 절단물을 수반하는 모든 입자를 예시하는 정렬을 나타낸다. 서열은 모든 작제물이 공유하고 있는 서열번호 1의 HBc의 N-말단으로부터 아미노산 잔기 위치 149에 따라서 정렬된다. C-말단 시스테인 잔기가 존재하는 경우, 이는 밑줄쳐져 있다.
Figure 112005030872065-pct00043
실시예 4: 검정 과정
A. 항원성
1. 입자 ELISA
정제된 입자를 피복 완충액(50mM 중탄산나트륨, pH 9.6)에서 2㎍/ml의 농도로 희석시키고, ELISA 스트립 웰 상으로 피복시킨다(100㎕/웰). 상기 ELISA 스트립을 실온에서 밤새 항온 배양한다(약 18시간). 그 다음 날, 상기 웰을 ELISA 세척 완충액(EWB)[인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4, 0.05% Tween®-20]으로 세척하고, PBS 중의 3% BSA로 1시간 동안 차단시킨다(200㎕/웰). ELISA 스트립을 필요할 때까지 -20℃에서 무수 저장한다.
입자의 항원성을 결정하기 위해, EWB 중의 1% BSA를 사용하여 항혈청을 희석키고, 100㎕/웰을 항원-피복된 ELISA 웰에 가한다. 혈청을 1시간 동안 항온 배양하고, ELISA 세척 완충액(상기)으로 세척하고, 항-마우스(IgG)-HRP(The Binding Site, San Diego, CA; HRP = 서양고추냉이 퍼옥시다제) 접합체(100㎕/웰) 또는 기타 적당한 항체를 사용하여 1시간 동안 프로빙시킨다. ELISA 세척 완충액으로 세척한 후, TM 블루 기질(100㎕/웰)을 부가함으로써, 상기 반응을 가시화한다. 10분 후, 1N H2SO4(100㎕/웰)을 부가함으로써 상기 반응을 중지시키고, 450nm에서 설정된 ELISA 플레이트 판독기 상에서 판독한다.
2. 합성 펩티드 ELISA
20개 아미노산 잔기 합성 펩티드(NANP)5 또는 24개 아미노산 잔기 합성 펩티드 M2를 피복 완충액(50mM 중탄산나트륨, pH 9.6)에서 1㎍/ml의 농도로 희석시키고, ELISA 스트립 웰 상으로 피복시킨다(100㎕/웰). 37℃ 항온 배양기에서 밤새(약 18시간) 항온 배양함으로써, 펩티드를 상기 웰 상으로 건조시킨다. 그 다음날 아침, 상기 웰을 ELISA 세척 완충액[인산염 완충 식염수, pH 7.4, 0.05% Tween®-20]으로 세척하고, PBS 중의 3% BSA로 1시간 동안 차단시킨다(200㎕/웰). ELISA 스트립을 필요할 때까지 -20℃에서 무수 저장한다.
입자의 항체 항원성을 결정하기 위해, EWB 중의 1% BSA를 사용하여 항혈청(모노클로날 또는 폴리클로날)을 희석키고, 100㎕/웰을 펩티드-피복된 ELISA 웰에 가한다. 혈청을 1시간 동안 항온 배양하고, ELISA 세척 완충액으로 세척하고, 항-마우스(IgG)-HRP 접합체(100㎕/웰에서 상기와 같음) 또는 기타 적당한 항체를 사용하여 1시간 동안 프로빙시키며, ELISA 세척 완충액으로 다시 세척한 후, TM 블루 기질(100㎕/웰)을 부가함으로써 가시화한다. 10분 후, 1N H2SO4(100㎕/웰)을 부가함으로써 상기 반응을 중지시키고, 450nm에서 설정된 ELISA 플레이트 판독기 상에서 판독한다.
B. 입자의 면역원성
입자의 면역원성을 검정하기 위해, 선택된 아주반트 중의 10 또는 20㎍의 입자를 사용하여 마우스를 복강내 면역시킨 다음, 4주 후에, 동일한 아주반트 중의 10㎍를 사용하여 부스터시킨다. 2, 4, 6 및 8주째에 마우스로부터 채혈한다.
실시예 5: 280:260 흡광도 비 결정
정제된 입자의 280:260 흡광도 비를 결정하기 위해, 이러한 입자를 20mM 인산나트륨 완충액, pH 6.8 중에서 대략 0.2mg/ml의 농도로 희석시키고, 260nm 및 280nm 파장에서 흡광도 값을 결정하였다. 280nm에서 측정된 흡광도 값을 260nm에서 측정된 흡광도 값으로 나누어, 280:260 흡광도 비를 결정한다. 본래의 입자(HBc 183), 잔기 위치 149 다음에 절단된 HBc 입자(HBc 149), 및 그 밖의 본원에서 동정된 몇 가지 HBc 키메라를 포함한, 몇몇 샘플에 대해 수득된 비가 다음 표에 제시되어 있다. 완전한 길이의 입자 CV- 1559는 문헌[참조: Neirynck et al., (1999) Nature Med., 5 (10): 1157-1163]에 처음 보고된 입자의 제제인 반면, 완전한 길이의 입자 CV-1607는 폴리펩티드 위치 17 및 19(서열번호 9의 X17 및 X19)에서 M2 폴리펩티드 시스테인을 세린 잔기로 돌연변이시킨 유사한 입자이다.
Figure 112005030872065-pct00044
NT: 시험되지 않음. *CV-1159는 문헌[Neirynck, 1999]에 의해 기재된 IM2-HBc와 동일하다.
실시예 6: 열 안정성 프로토콜
50mM NaPO4, pH 6.8을 사용하여, 정제된 입자를 0.5-1mg/ml의 농도로 희석시키고, 4℃, 실온 또는 37℃에서 항온 배양하였다. 샘플을 각종 시점에서 취하고, SDS-PAGE 샘플 완충액(환원성)과 혼합하고 10% SDS-PAGE 겔 상에서 수행한다. SimplyBlue SafeStain(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 겔을 염색시킨 다음 분석한다.
실시예 7: 하이브리드 입자의 분석적 겔 여과 분석
정제된 하이브리드 HBc 입자의 분석적 겔 여과 분석은 25ml 슈퍼로스® 6 HR 10/30 크로마토그래피 칼럼(Amersham Pharmacia # 17-0537-01) 및 BioCAD™ SPRINT 관류 크로마토그래피 시스템을 사용하여 수행하였다. UV 탐지기는 280nm의 파장을 모니터하도록 설정된다 상기 칼럼을 0.5ml/min의 유속으로 완충액(20 mM NaP04, pH 6.8)의 3 칼럼 용적(CV; 약 75ml)으로 평형시켰다.
분석하고자 하는 입자를 20 mM NaP04, pH 6.8을 사용하여 1ml/ml의 농도가 되도록 희석시켰다. 이어서, 상기 샘플 200㎕를 200㎕ 루프 상으로 부하하고, 상기 칼럼 상으로 주사하였다. 샘플을 0.5ml/min의 유속으로 20 mM NaP04, pH 6.8을 이용하여 상기 칼럼으로부터 용출시켰다.
상기 과정을 사용하여, N-말단 시스테인 잔기를 함유하는 입자 또는 이러한 시스테인을 함유하지 않는 유사한 입자를 분석하였다. BioCAD™ 소프트웨어(PerSeptive™)을 사용하여, 280nm 추적을 통합하였다.
실시예 8: 인플루엔자 M2 작제물
최근에, 문헌[참조: Neirynck et al., (Oct 1999) Nature Med., 5(10): 1157-1163 and WO 99/07839]에는 아미노산 잔기 1-4가 결여된, 완전한 길이의 HBc 입자(HBc183)의 N-말단에 대한 M2의 24 아미노산 세포외 도메인의 융합물이 보고되었다. 본원에서 IM2HBc로서 지칭된 상기 작제물의 도시적 제시가 다음에 나타나 있으며, 여기서 24량체가 HBc의 N-말단에 연결된다.
Figure 112005030872065-pct00045
한 가지 예시적인 제조에서는, M2 에피토프를 B형 간염 코어의 면역우성 루프 내로 삽입하고, CV-1475로서 지칭된 입자를 성공적으로 발현 및 정제하였는데, 이는 이러한 삽입 및 정제에 대해 전술된 기술을 사용하여 수행한다. M2 본래의 위치 17 및 19에서의 2개의 시스테인 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킨, M2 에피토프의 돌연변이된 변형물을 또한, 상기 면역우성 루프에서 발현시키고(CV-1473 입자), 이로써 생성된 입자를 정제하였다. 이들 두 입자가 다음에 도식적으로 예시된다.
Figure 112005030872065-pct00046
Figure 112005030872065-pct00047
CV-1473 입자 작제물은 본래의 서열(CV-1475)과 비교할 때 대략 7배 정도 더 정제된 입자를 생성시켰다. 시스테인 잔기의 돌연변이가 해당 입자의 보호 효능을 변화시키는지를 결정해야 한다. 그러나, HBc의 면역우성 루프 상에 전달된 에피토프는 통상적으로, 이들이 다른 영역(N-말단 포함)과 융합되어 이로써 생성된 입자가 감소된 항-HBc 면역원성을 나타내는 경우와 비교해서 상당히 더 면역원성이다.
M2 N-말단 24량체 에피토프를 C-말단 절단된 B형 간염 코어 입자의 N-말단에 융합시킨 입자가 또한 제조되었다. 이러한 작제물(CV-1438)은 또한, N-말단 프리코어 서열(서열번호 259)을 함유한다. 하이브리드 단백질의 말단에 단일 시스테인 잔기를 함유하는 유사한 작제물(CV-1492)을 제조하였는데, 이러한 경우 상기 시스테인 잔기는 HBc 유전자의 Val-149 바로 다음에 온다. 이들 작제물이 다음에 도식적으로 제시된다.
Figure 112005030872065-pct00048
천연 HBc 개시인자 메티오닌으로부터 해독 개시를 하지 못하도록 하기 위해서는, 상기 잔기에 대한 코돈이 누락되었는지를 주지해야 한다. EcoRI (GI) 및 SacI (EL) 제한 부위로부터 비롯된 잔기가 밑줄쳐져 있다. 프리코어 서열은 밑줄쳐진 EL 잔기와 "-HBc(2-149)" 사이에 기재되어 있다.
SDS-PAGE에 의한 분석 결과, 제조시, CV-1438 단량체 작제물이 SDS-PAGE 겔 상의 부가의 분자량 대조군으로서 작용하는 CV-1492, HBc-149, CV-1475 및 CV-1473와 비교해서 불안정한 것으로 나타났다. 이러한 CV-1438 단량체의 불안정성은 해당 입자의 분석적 겔 여과를 이용해서는 명백하지 않았다.
CV-1475는 CV-1438 및 CV-1492 보다 분자량이 약간 더 작은 것으로 예상되는데, 이는 전자 2개의 작제물이 면역우성 루프 내에 직접적으로 삽입된 M2 에피토프를 함유하므로, CV-1438 및 CV-1492에 존재하는 프리코어 서열(서열번호 259)이 결여되어 있기 때문이다. 예상된 바와 같이, CV-1492는 CV-1475 및 CV-1473 보다 더 크지만; CV-1492 + C-말단 시스테인 잔기와 동일한 CV-1438은 명백한 절단으로 인해, CV-1475 및 CV-1473 보다 확실히 더 크지 않다.
HBc N-말단(도메인 I) 또는 루프(도메인 II)에 연결된 상기 논의된 바와 같은 M2 N-말단 세포외 서열을 함유하고, 또한 HBc의 루프(도메인 II) 또는 C-말단(도메인 IV)에 연결된 서열번호 11(표 A 참조)의 것과 같은 M2 단백질 C-말단 서열을 함유하는 작제물이 또한 고려된다. 이와 같이 고려된 작제물은 또한, 본원에 전술된 바와 같은 하나 이상의 안정화 C-말단 시스테인 잔기를 함유한다.
시스테인 잔기와, 최소의 M2-유래된 서열을 혼입시키기 위한 면역우성 루프 융합물을 함유하는 하이브리드 HBc 입자의 아미노-말단을 변형시키기 위해, 일련의 합성 올리고뉴클레오티드를 합성한다. V2.Pfl(N-M2(17-24/C17S)를 제조하기 위해, 올리고뉴클레오티드 M2(17-24/C17S)-NcoI-F 및 HBcl49/HindIII-R을 사용하여, 벡터 V2.Pfl로부터 하이브리드 HBc 유전자를 증폭시킨다. 이로써 생성된 546bp 단편을 NcoI 및 HindIII로 절단시키고, 동일한 두 효소로 절단시킨 바 있는 pKK-223-3N 내로 삽입하였다.
V2.Pfl[N-M2(17-24/C19S)]를 제조하기 위해, 올리고뉴클레오티드 M2(17-24/C19S)-NcoI-F 및 HBcl49/HindIII-R을 사용하여 벡터 V2.Pfl에서 하이브리드 HBc 유전자를 증폭시킨다. 이로써 생성된 540bp 단편을 NcoI 및 HindIII로 절단시키고, 동일한 두 효소로 절단시킨 바 있는 pKK-223-3N 내로 삽입하였다.
Figure 112005030872065-pct00049
실시예 9: 양 N-말단 및 C-말단 시스테인 잔기를 함유하거나 함유하지 않는 HBc 키메라 분자
잔기 149에서 이의 C-말단이 절단된 HBc의 N-말단에서 또는 근처에서 펩티드-결합된 인플루엔자 A, M2 단백질의 잔기 1-24를 함유하는, 일련의 HBc 키메라 분자-함유 입자를 제조하였다. 성분 키메라 단백질 분자는 M2 서열 또는 변이체를 포함한 상이한 N-말단 서열을 함유하였고, 몇몇은 C-말단 시스테인 잔기를 함유하였다.
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다음 표 9A 내지 9C에 열거된 정제된 모든 입자를 분석적 크기 배제 크로마토그래피함으로써 분석하여, 정제 후 미립형 구조물의 잔류 시간을 평가하였다. N-말단 시스테인 잔기를 전혀 함유하지 않는 CV-1603으로 명명된 입자는 서브-미립형 구조물로 다시 탈어셈블리 되었다는 증거를 나타내는데, 이는 상기 단백질이 1500초 범위 내에서 용출되었기 때문이다(입자는 대략 1000초에서 용출된다).
본래의 N-말단 M2 서열에서 2개의 세린 잔기가 시스테인 잔기로 돌연변이된 것을 제외하고는 CV-1603 입자와 유사한 입자 CV-1590을 유사하게 분석한 결과, 상기 작제물이 정제 후 여전히 미립형인 채로 유지된 것으로 밝혀졌는데, 용출은 약 1000초에서 일어났으며, 이는 하이브리드 입자에 대해 전형적인 수치이다(도 4). CV-1590 입자에 대한 탈어셈블리 증거는 없었다.
이의 키메라 단백질이 2개의 N-말단 시스테인 잔기를 갖기도 하는 CV-1560 입자를 분석한 결과, 이것이 어느 정도의 탈어셈블리를 나타내긴 하였지만, 정제 후 너무 미립형인 것으로 밝혀졌는데, 이는 안정화가 CV-1590 입자에 대해서 처럼 그렇게 강건하지는 않다는 것을 제시해준다. CV-1590 입자의 N-말단 입체 배치와 CV-1560 입자의 N-말단 입체 배치를 비교한 결과(다음 표 11), CV-1560 입자에서 2개의 시스테인 잔기의 상대적 위치가, 3개 아미노산 잔기의 결실(DEL)을 통하여 CV-1590 입자에 비해 3개 아미노산 잔기 만큼 이동되었다는 사실이 나타났는데, 이는 상기 시스테인 잔기가, 최적으로 가교 결합되기 위해서는 코어 유전자 출발점으로부터 최소한의 거리(간격)로 떨어지는 것이 요구될 수 있다는 것을 지시해준다.
실시예 10: M2 또는 M2 변이체 서열과 C-말단 시스테인 잔기를 갖는 입자
CV-1603 입자는 도 4에서 정제 후 신속하게 탈어셈블리되는 것으로 나타났다. CV-1605 입자를 포함하는 HBc 키메라 분자는 CV-1603 입자와 유사한데, 단 CV-1605 성분 키메라 분자는 단일 C-말단 안정화 시스테인을 갖는다. CV-1605 입자의 발현을 지시하는 플라스미드를 제조하여, C-말단 시스테인 잔기를 CV-1603 입자에 부가하는 것이 이러한 입자에 보다 큰 안정성을 부여해줄 수 있는지를 결정하였다. 정제 후, CV-1605 입자를 분석적 크기 배제 크로마토그래피하여 분석하였다.
본 연구 결과는, 입자 안정화가 CV-1603 입자에 대해서 보다는 더 완전하지만, 2개의 아미노-말단 시스테인 잔기를 함유하고 C-말단 안정화 시스테인은 전혀 함유하지 않는 CV-1590 입자와 비교해서는 불완전하다는 사실을 입증해주었다. 상당량의 CV-1605가 미립형인 채로 잔존하긴 하였지만, 광범위하게 용출된 서브-미립형 구조물의 이종 혼합물이라는 증거가 있다. 이러한 관찰 결과는, 상기 하이브리드 입자(CV-1603)의 경우에는 CV-1605 입자에서 발견된 바와 같은 C-말단 안정화가, CV-1590 입자에서 발견된 N-말단 안정화에 대한 것 보다 덜 완전하다는 사실을 제시해준다.
하이브리드 입자의 조합된 아미노-말단 시스테인 안정화와 카복실-말단 시스테인 안정화의 적합성을 연구하기 위해, CV-1604 입자의 발현을 지시하는 발현 플라스미드를 작제하였다. CV-1604 입자의 성분 키메라 분자는 본래의 M2 폴리펩티드 서열에 존재하는 2개의 아미노-말단 안정화 시스테인 잔기를 모두 함유하고 있을 뿐만 아니라(CV-1590에서와 같음) C-말단 안정화 시스테인도 함유하고 있다(CV-1605 입자에서와 같음). CV-1604 입자를 분석한 결과, 이들이 정제 후 균질한 미립형 상태를 유지한 것으로 나타났는데, 이는 2가지 안정화 방법이 상보적이고, 서로 협력하여 사용될 수 있다는 것을 지시해준다.
입자 CV-1438 및 CV-1492를 사용하여, HBc의 N-말단과 N-말단 시스테인 잔기 간의 또 다른 링커 서열을 연구하였다. 이들 입자 둘 다는 M2 융합물과 HBc의 아미노산 D4 사이에 아미노산 서열 ELLGWLWGIDI(서열번호 398)을 함유하고 있다. 아미노산 잔기 LGWLWGIDI는 프리코어의 아미노산 -6에서부터 HBc의 아미노산 13까지 유래된 것이며, 이때 본 연구에 나쁜 영향을 미칠 수도 있는, 상기 위치에서의 해독 개시가 일어나지 못하도록 HBc의 개시인자 코돈을 결실시켰다. HBc 프리코어 서열은 위치 -7에 시스테인을 포함한다.
이들 입자는, CV-1438 성분 키메라 분자가 HBc의 위치 149에서 종결된 반면, CV-1492 성분 키메라 분자는 HBc의 149에서 종결되고 서열번호 1의 HBc에 기준하여 위치 150에서 말단 시스테인을 함유하였다는 사실에서만 상이하다. 전술된 방법에 대한 대체 방안이긴 하지만 이와 유사한 방법을 사용함으로써 입자를 대략 10분에 용출시켜, 분석적 겔 여과에 의해 분석할 경우, 양 작제물이 정제 후 미립형인 것으로 밝혀졌다. 이러한 연구는, 절단된 입자의 아미노-말단 시스테인 안정화와 카복실-말단 시스테인 안정화의 적합성, 및 HBc 유전자의 출발부와 N-말단 시스테인 잔기 간의 거리 및 아미노산 서열 상의 실재적 가변성의 관용(tolerance)을 입증해주었다.
Figure 112005030872065-pct00050
Figure 112005030872065-pct00051
Figure 112005030872065-pct00052
Figure 112005030872065-pct00053
다음 표 10은 HBeAg의 N-말단의 입체 배치와, N-말단 융합물을 수반하는 입자를 예시하는 정렬을 나타낸다. 서열은 모든 작제물이 공유하고 있는 서열번호 1의 HBc의 N-말단으로부터 아미노산 잔기 위치 4에 따라서 정렬된다. N-말단 시스테인 잔기가 존재하는 경우, 이는 밑줄쳐져 있다.
Figure 112005030872065-pct00054
Figure 112005030872065-pct00055
다음 표 11은 본원에 고려된 N-말단 인플루엔자 A M2 서열 또는 변이체를 함유하는 입자에 대한 안정성을 평가한 결과를 표로 만든 것이다. 알 수 있는 바와 같이, 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단에 기준하여 위치 마이너스 14(-14)에 N-말단 시스테인 잔기를 함유하는 HBc 키메라 분자로부터 대략 N-말단 자체까지의 안정한 입자를 제조하였다.
Figure 112005030872065-pct00056
a: 48 및 107에서의 시스테인이 세린으로 변한 입자. b: 두 번째 N-말단 M2 복사물로부터 계수됨.
실시예 11: 각종 M2 함유 입자의 항원성
ELISA를 사용하여, 모노클로날 항체 14C2에 대한 각종 입자의 항원성을 검사하였다. 해당 입자가 본래의 입체 형태로 잔류된다는 것을 보장하기 위해, ELISA 판을 먼저, 폴리클로날 항체(래비트)로 피복시켜 입자를 포획한 다음, 이를 14C2 모노클로날 항체, 또는 HBc 입자의 면역우성 루프 영역에 대해 특이성을 지닌 항-HBc 모노클로날 항체의 각종 희석물로 프로빙하였다. 다음 표에 제시된 데이터는, HBc의 면역우성 루프 내에서의 M2e의 제시(presentation)가 N-말단에서의 제시(IM2HBc/CV-1559 및 CV-1604)에 비해, 14C2 모노클로날 항체에 대한 M2e 에피토프의 접근성을 상당히 변화시키지 않는다는 사실을 입증해준다. 이들 관찰 결과는 놀라운 것이 아닌데, 이는 14C2가 N-말단 결합과는 반대로, M2e의 내부 영역(M2의 아미노산 8, 10, 11 및 14)과 결합한다는 사실이 기존에 밝혀졌기 때문이다[참조: Zebedee et al., (1988) J. Virol., 62 (8): 2762-2772].
또한, CV-1569를 제외한 모든 입자는 항-HBc 모노클로날 항체 3105에 대한 항원성을 보유하였다. 3105에 의한 인지 상실은 면역우성 루프 내로 삽입된 서열을 갖는 입자에 대해 기존에 관찰된 현상이고, 이는 전형적으로, 면역 후 이들 입자에 대한 감소된 항-HBc 반응으로 해독된다. 모노클로날 항체 3105는 공급원[the Institute of Immunology, Tokyo, Japan]으로부터 구입하였다.
입자
 모노클로날 항체
14C2 3105
CV-1123 - +
IM2HBc/CV-1559 + +
CV-1604 + +
CV-1569 + -
실시예 12: 항체 아부류 및 보호
각종 M2e-HBc 작제물(10㎍/마우스) 및 각종 아주반트를 검정한 몇 가지 연구 결과가 요약되었다. 대략 절반을 복강내 투여하고, 대략 절반을 비내 투여하였다. 각 그룹(14마리 마우스)에 대해, 혈청을 모으고 항-M2e IgG 아부류 항체의 역가를 결정하였다. 그 결과는 두 번째 부스터시킨지 1주 후에 채취한 혈청으로부터의 것이다. IgG2a 역가가 104을 초과하는 마우스의 경우에는, IgG2A 역가가 104(*)이었다.
IgG2a 그룹 수 % 보호
104 8 100
< 104* 4 70-95
백신에 대한 면역 반응 크기와 영속성을 증강시킬 수 있는 능력 뿐만 아니라 이러한 면역 반응의 Thl/Th2 편재(bias)를 조정할 수 있는 능력을 알아보기 위한, 아주반트에 대한 연구는 꾸준히 증가하고 있다. 많은 실험용 아주반트가 연구되고 있긴 하지만, 미국에서 FDA에 의해 승인된 백신 중의 한 성분으로 백반(alum)이 유일한 아주반트이다. 전형적으로, 백반은 Th2 유형에 대한 면역 반응에 치우치는데, 이는 마우스에서 고수준의 IgG1 항체가 생성됨으로써 명백하게 나타난다.
백반-제형화된 M2e-HBc 입자가 상당한 IgGl 반응을 유발시키지만, Th1 지시인자인 IgG2a 및 IgG2b 항체 역시 유발된 것으로 밝혀졌다. Thl-유형 IgG 아부류의 생성을 증강시키기 위한 시도에서, 코릭사 코포레이션(Corixa Corporation)에 의해 개발된 MPL의 합성 유도체인 RC529가 보충된 Alhydrogel™-제형화 입자의 면역원성을 마우스에서 시험하였다. 이들 연구 결과는, 상기 Alhydrogel™ 제형에 RC529를 봉입시키면, 항-M2e IgG2a 역가가 상당히 증가하였는데, 이로써 항-M2e IgG2a:IgG1 비가 대략 10배 정도 증가하였다. 양 그룹에서의 모든 마우스는 치사 챌린지로부터 완전히 보호되었지만, Alhydrogel™ 단독에 비해 Alhydrogel™+ RC529로 제형화된 CV-1569로 면역시킨 마우스에서는 이환률(발병률: morbidity)이 저하(온도 강하 및 체중 감소)된다고 지시되었다.
실시예 13: 선택된 키메라의 입자 어셈블리
크기 배제 크로마토그래피 용출 프로필 분석 결과, 예측된 5개의 시스테인 돌연변이 키메라 중의 4개가 성공적으로 입자로 어셈블리된 것으로 나타났다. C48 및 C107의 세린으로의 돌연변이가 입자 어셈블리에 전혀 영향을 미치지 않았다는 것을 확인하기 위해, HBc149 및 HBc149(C48S/C107S) 뿐만 아니라 C-말단 함유 쌍인 HBc149+C와 HBc149(C48S/C107S)+C를 포함시켰다. 이들 작제물의 봉입은 입자의 안정성 비교에 필요할 뿐만 아니라 돌연변이된 입자에서의 디설파이드 결합 형성 정도를 결정하는데 필요하였다.
발현된 모든 입자를 정제한 후, 최종 수득량을 표로 만들었다. 입자 수득량은 공학적으로 처리되지 않은 HBc149에 비해 일반적으로 매우 높았는데, 이는 도입된 돌연변이가 입자 어셈블리에 큰 영향을 미치지 않았다는 것을 제안해준다. 제1 라운드의 입자를 생성하는데 있어서의 높은 성공률로 인해, 키메라 모두가 이종 루프 삽입물을 수용하도록 이들을 유사하게 변형시켰는데, 단 실패한 입자 HBc149(C48S/C107S)L55C/H104C+C는 제외된다.
Figure 112005030872065-pct00057
*: 입자는 이 단계에서 전형적으로 순도가 75% 초과이다. NA = 어셈블리되지 않음.
각각의 키메라 대략 2mg이 성상 확인에 요구되기 때문에, 대부분의 경우에는 과부하를 피하기 위해 최대 약 50AU(25mg의 반-순수 단백질)를 음이온 교환 칼럼에 적용하도록 결정하였다. 따라서, 정제된 최종 단백질 수득량은 HA 크로마토그래피 단계 후 경사 제거된 물질의 양에 기초한 예상 수득량을 나타낸다.
실시예 14: 어셈블리된 입자의 성상 확인
디설파이드 결합 형성은 시간과 온도의 함수인 것으로 밝혀졌다. 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 이의 본래 입체 형태의 각각의 공학적 처리된 입자를 분석한 결과, 4℃, 실온 및 37℃에서 수행되고 0, 3, 7 및 14일째에 분석한 2주간의 안정성 연구 전반에 걸쳐 입자 원형 보존 간에는 차이가 전혀 없는 것으로 나타났다. 간단하게, 37℃에서 0일 및 14일 간의 프로필(가장 엄격한 조건) 만을 기록하였는데, 이는 소정의 입자에 대한 모든 용출 프로필이 실질적으로 동일하기 때문이다. C-말단 시스테인이 결여된 2가지 대조군 입자인 HBc149 및 HBc149(C48S/C107S)는 이들의 미립형 구조를 전적으로 유지하지 못하였는데, 이들의 용출 프로필은 보다 낮은 차수 구조물의 별개 집단을 나타내었다.
비-환원성 SDS-PAGE 겔 내로 이동할 수 있는 입자/단백질의 능력을 결정함으로써, 입자의 가교 결합성에 관한 추가 분석을 평가하였다. 디설파이드 결합 형성은 0일째에 대조군을 포함한 대부분의 입자에서 불완전하고, 본 연구 동안 4℃에서도 불완전한 것으로 밝혀졌다. 실온에서의 항온 배양이 디설파이드 결합 형성을 증강시켰는데, 이는 보다 높은 차수의 다량체 출현 증가에 따라 단량체 및 이량체 결합 세기가 감소한 것으로부터 결정될 수 있었다.
37℃에서 항온 처리된 실질적으로 모든 입자(비-C-말단적으로 안정화된 대조군 제외)는 7일 후에 전적으로 디설파이드 결합되었다. 특히 주목할 만한 것은, C-말단적으로 안정화된 C48S/C107S 키메라가 0일째에 전적으로 디설파이드 결합된 것으로 여겨지는 반면, 이의 C48/C107 대응물은 그렇치 못하였고 본 연구 기간 동안 C48S/C107S 키메라에 의해 달성된 바와 동일한 수준의 가교 결합성에도 도달하지 못하였다는 사실이다. 부가적으로, 공학적 처리된 입자 HBc149(C48S/C107S)W62C/F97C+C는 0일째에 동일한 수준의 가교 결합성을 나타내었다.
모든 샘플의 환원성 SDS-PAGE 겔은 출발 시점부터 안정성 연구가 끝날 무렵까지 단량체의 강도에는 어떠한 상당한 변화도 일어나지 않았다는 것을 보여주는데, 이는 모든 단량체가 모든 온도 전반에 걸쳐 본래 상태로 유지되었다는 것을 보여주며, 이는 37℃ 겔에서 0일 및 14일째에 취한 샘플을 비교함으로써 예시될 수 있다. 중요하게는, 이들 관찰 결과가, 비-환원성 조건 하에 분석된 선별된 키메라에 대해, 시간에 따른 단량체 및 이량체 강도의 감소가 단량체의 분해에 기인하지 않았다는 것을 확인시켜 준다.
자유 티올의 존재량은, 디설파이드 결합 형성도를 정립시키기 위해 안정성 연구의 모든 시점에서 모든 입자에 대해 측정하였다. 자유 티올이 엘만스 시약과 반응하긴 하지만, 디설파이드 결합에 관여한 것은 그렇치 않다. 이들 연구 결과는, 자유 티올의 존재량이 시간이 지남에 따라 감소하고, 실온 및 4℃에서 항온 처리된 것과 비교해서 37℃에서 항온 처리된 샘플에 대해 촉진된다는 사실을 입증해준다. 이들 관찰 결과는 비-환원성 SDS-PAGE 겔을 사용하여 입자를 분석한 결과와 일치됨으로써, 작제물 이동 감소는 자유 티올 수준 감소와 같은 정도이다.
상기 쳉(Zheng) 등의 관찰 결과와 일관되게, 야생형 C48 및 C107을 함유하는 2개의 대조군 입자는 모든 시간과 온도에서 자유 티올의 존재를 나타내었는데, 이는 이들 시스테인 잔기가 대부분 환원된 상태로 유지된다는 것을 확인시켜 준다. 이들 시스테인을 세린으로 돌연변이시킨 상응하는 입자에서는, 자유 티올 반응성을 폐지시켰는데, 이는 C61 및 C150이 전적으로 디설파이드 결합된다는 사실을 다시 한번 입증해준다. 공학적 처리된 입자가 비-환원성 SDS-PAGE 겔 상에서 자유 단량체 및 이량체의 존재로써 입증된 바와 같이, 정제 단계 말기에 전적으로 가교 결합되지는 않았지만, 모든 입자는 37℃에서 7일째에 겨우 탐지 가능한 수준의 자유 티올을 나타내었다.
이들 데이터는 고무적이며, 추정상의 디설파이드 결합-형성성 잔기를 예측하기 위해 사용된 컴퓨터 모델링은 극히 성공적이었지만, 완전하게 예측 못하였다. 그러나, 이러한 방식으로는 루프 안정성을 예측하기가 곤란하기 때문에, 한벌의 에피토프-함유 벡터를 창출하였다.
첫째, 모든 C48S/C107S 에피토프-함유 입자는 이들의 야생형 대응물과 유사한 방식으로 행동하였는데, 이는 이들 돌연변이가 입자 어셈블리에 영향을 미치지 않았다는 것을 의미한다. 비-디설파이드 공학적 처리된 입자에서 안정한 입자로 어셈블리되지 못한 β-아밀로이드 에피토프는 또한, 모든 4개 시스테인-공학적 처리된 벡터에서도 실패하였는데, 이는 면역우성 루프를 브릿징하는 시스테인이, 단량체를 이의 목적하는 입체 형태로 유지시킬 수 없다는 것을 지시해준다. ASP-1 에피토프는 공학적 처리된 입자에서 유사하게 행동하였지만, 시스테인이 전혀 부가되지 않은 대조군 벡터는 저수준의 어셈블리된 입자를 생성하였다. 대조군 입자에서 실패한 안트락스(anthrax) 에피토프 PA는 A58C/L1OOC 벡터에서 실제적으로 저수준의 어셈블리된 입자를 생성하였지만, 다른 벡터에서는 전혀 생성하지 못하였다. 최종적으로, 대조군 벡터에서 고수준의 어셈블리된 HBc를 생성시키는 인플루엔자 에피토프는 4개의 공학적 처리된 입자 중에서 2개의 입자, 즉 L76C/R82C 키메라 및 W62C/F97C 키메라에서 적당한 수준의 어셈블리된 입자를 생성하였다. 모든 키메라의 입자 수득량에 관한 요약이 다음 표 13에 나타나 있다. 성공적으로 어셈블리된 입자는 굵게 표시된다.
Figure 112005030872065-pct00058
Figure 112005030872065-pct00059
*: 입자는 이 단계에서 전형적으로 순도가 75% 초과이다.
"HBcl49(C48S/C107S)+C"는 간단히 하기 위해 디설파이드-공학적 처리된 입자명으로부터 생략되었다.
본래의 V16.IA(M2)2C/2S 클론(키메라 CV-1569) 뿐만 아니라 어떠한 입자도 발현되지 않았지만, C48S/C107S 변형물은 유사한 발현 수준을 나타내었다. 그러나 정제된 경우에는, C48S/C107S 변형물이 1mg 미만의 물질을 산출하였는데, 이는 본래의 클론으로부터 회수한 정제된 물질의 1/10이며, 이는 이러한 유형의 키메라에 대해서는 상이한 정제 방법이 필요할 수 있다는 것을 지시해준다. 정제하는데 있어서, 해당 입자는 하이파타이트 칼럼과 견고하게 결합되는 것으로 보이며, 이 칼럼으로부터의 회수율은 부하된 것의 10% 정도일 뿐이며, 본 연구에서 만들어진 기타 입자들은 60% 이상 회수되었다.
인플루엔자 입자 세트가 가장 완전한 것이기 때문에, 이것이 안정성 연구를 의해 설정된 유일한 입자 세트이다. 정제 과정이 최적인 것으로 여겨지지는 않지만(4개 입자 중의 2개의 회수율이 극히 낮다), 상기 물질을 37℃에서 항온 배양하고(기존에 밝혀진 바와 같이, 디설파이드 결합 형성을 촉진시키기 위함), 초기 안정성 연구를 위해 사용된 바와 동일한 분석 방법을 이용하여 이들 입자를 성상 확인하였다. 본래, 본 연구는 전술된 바와 같이 2주간 수행하도록 설정되었지만, 0, 3 및 7일째에 수집된 샘플은 특정 패턴을 알아보기에 충분하였다.
입자가 0일째에 비-환원성 겔 상에서 특유의 디설파이드 결합 형성을 나타내긴 하였지만, 4개의 입자를 분석한 결과, 공학적 처리된 모든 입자에서 별개의 절단된 단량체 밴드가 나타났다. 대조군 입자 V16.IA(M2)2C/2S는 어떠한 절단도 나타내지 않았지만, 이것이 본래 상태로 유지하기 위해 할당된 유일한 것이며, 기타 모든 것(5개의 할당된 것)은 동일한 절단 패턴을 보여주었다(데이터는 제시되지 않음). 3일 동안 항온 배양한 결과, 단량체가 V16(C48S/C107S) 키메라 및 L76C/R82C 키메라에서 완전히 분해되었고, 절단된 생성물이 W62C/F97C 키메라에서 한정 증가된 것으로 나타났지만, 이들 본래의 입자는 본래 상태로 유지되었다. 그러나, 분석적 크기 배제 크로마토그래피를 통하여 본래의 입자를 분석한 결과, 정제된 V16(C48S/C107S) 키메라는 어셈블리된 입자가 아니었는데, 이는 극도로 낮은 정제 수율에 기인한 것으로 추정되며, 형성된 입자가 정제 칼럼으로부터 효율적으로 용출 제거되지 않은 것으로 여겨진다. 안정성 연구를 종결할 경우, 모든 입자의 분해 추세가 7일까지 지속되었다.
IA(M2)2C/2S 에피토프를 이용한 최근의 연구에서는, 루프에서 표시될 때, 상기 에피토프가 절단되기 쉬운 것으로 밝혀졌다. 따라서, N-말단 서열 분석 결과는 단편을 대략 반으로 나누어 절단하여, 삽입된 에피토프 내의 특정 부위에서 절단되는 것으로 나타났다. 따라서, 단순히 특정한 에피토프의 특성에 기인한 루프 안정화에 상관없이 단량체가 절단될 수 있는 것으로 사료된다. 기타 에피토프를 이용한 추가의 루프 안정화 탐구 조사가 진행중이다.
실시예 15: HBc 단백질 CV-1843 및 CV-1842 대조군
단백질 단량체당 1 또는 2가지 접합 사건을 허용해줄 수 있는 HBc 수송체를 고안 및 작제하였다. 본원에서 특별히 고려된 접합 화학은 삭카라이드, 펩티드, 지질 또는 당지질을 1차 아민에 연결시키는 것이다. 수송체 단백질 CV-1843은 단일 리신 잔기 만을 함유하고, 이러한 잔기는 HBc 면역우성 루프 중의 HBc 위치 77에 존재하는 부가된 리신이다. 리신 마이너스 돌연변이체 CV-1842를 이용한 연구 결과, 특정의 합텐(특히, 펩티드)은 N-말단에 접합시킬 수 있는 반면, 올리고삭카라이드인 디아실-LOS는 그렇케 할 수 없는 것으로 밝혀졌다. 이러한 차이는 합텐 유형의 기하 및/또는 친수성 상의 차이에 기인된 것으로 추정된다. 이와 같은 특정한 합성은 헬퍼 T-세포 에피토프의 부가를 포함하지는 않지만, 헬퍼 T 세포 에피토프를 수송체에 접합시키거나 또는 융합 단백질로서 이와 함께 발현시킬 수 있다.
따라서, CV-1843 단백질은 위치 7에서 리신 코돈 AAA를 아르기닌 코돈(CGC)로 대체시키고, 위치 97에서 리신 코돈 AAG를 아르기닌 코돈 AGG로 대체시키며 위치 48 및 107에서 시스테인 코돈(TGT)를 세린 코돈 TCT로 대체시킴으로써, HBc 코어 상에 4가지 아미노산 돌연변이를 함유한다. 리신 코돈의 한 가지 삽입은 HBc 유전자의 아미노산 L76과 E77 사이에 이루어졌다. 상기 부위-지시된 돌연변이 유발은 QuickChang™ XL 부위-지시된 돌연변이 유발용 키트[공급원: Stratagene]를 이용한 출발 플라스미드 CV-1123을 사용함으로써 완료하였다.
각각의 돌연변이 또는 삽입에 대해, 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다. 1개의 프라이머는 다른 프라이머의 상보적 쇄이다. 모든 돌연변이 유발 반응을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머는, 근접한 뉴클레오티드[돌연변이 부위에 가장 근접함]로서 G 또는 C를 수반한, 코돈의 한 면상에 16 내지 20개 뉴클레오티드의 플랭킹 서열과 함께 돌연변이 코돈이 존재하는 방식으로 고안하였다. Pfu Turbo™ DNA 폴리머라제를 돌연변이 유발성 PCR에 사용하였고, DpnI을 사용하여 모 DNA 플라스미드를 분해시켰다.
사용된 프라이머 세트가 다음에 제시되는데, 여기서 소정의 위치에서의 본래 잔기는 단일 문자 명칭으로 먼저 기록된 다음, 대체 위치 번호가 기록되고, 이어서 대체 잔기에 대한 단일 문자 명칭이 기록된다. 단일 잔기로서 본래 또는 대체 잔기를 전혀 함유하지 않는 위치 77에서 리신(K)을 삽입하기 위한 프라이머가 상기 위치에 삽입되었다.
Figure 112005030872065-pct00060
Figure 112005030872065-pct00061
CV-1843 단백질 입자를 형성하기 위한 벡터와 동일한 방식으로 CV-1842 단백질 입자 벡터를 작제하였다. CV-1842 단백질은 위치 7, 97, 48 및 107에서 CV-1843과 동일한 4개의 돌연변이를 함유한다. 그러나, CV-1842 단백질은 위치 77에 리신 삽입물을 함유하지 않는다. CV-1842 단백질 입자는 작용성 그룹으로서 리신을 사용하는 경우와 연계해서 CV-1843에 대한 대조군 입자로서 제공된다.
재조합 플라스미드를 이. 콜리 BLR에서 성장시키고, 0.5mM IPTG로 유도시키며, 밤새 성장시켰다(대략 18시간). 세포를 원심분리시킴으로써 수거하고, 미세유동화시킴으로써 용해시켰다. 가용성 물질을 황산암모늄으로 2회 침전시키고 세파로스 CL-4B 칼럼(Amersham) 상에 부하하였다. 이 칼럼으로부터 용출된 두 번째 피크를 세라믹 하이드록시아파타이트 칼럼 상에 부하하고, 용출시킨 다음, 황산알루미늄에 재침전시켰다. 상기 단백질을 물에 재현탁시키고, 분석 및 접합을 위해 50mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 내로 투석시켰다.
실시예 16: CV-1843 및 CV-1123 단백질로의 dLOS 접합
CV-1843 단백질과 CV-1123 단백질을 다음 연구에 사용하였다. 아디프산 디하이드라지드-(ADH-) 유도체화 9274 dLOS는 공급원[Dr. Xin-Xing Gu of the National Institutes of Health, Bethesda MD]으로부터 제공되었고, 이는 두 가지 방법 중 각각의 방법에 의해 각 유형의 HBc에 개별적으로 접합시켰다. 첫 번째 화학은 CV-1123 상의 산성 잔기에 직접적으로 카보디이미드 연결시키는 것이다. 두 번째 화학은 판매자의 지시에 따라서 제조된 ADH-유도체화 석신이미딜 3-[2-피리딜디티오]프로피온아미도(SPDP)-N-[γ-말레이미도부티릴옥시]석신이미드 에스테르(GMBS)를 사용하여 위치 7, 77 및 97에서 리신에 연결시키는 것이다.
따라서, ADH-유도체화 dLOS를 N-석신이미딜-3-[2-피리딜디티오]프로피오네이트(SPDP)와 반응시켜 혼합 디설파이드를 형성시키고, N-[γ-말레이미도-부티릴옥시]석신이미드 에스테르(GMBS)를 HBc 단백질의 N-말단 아민 또는 ε-아미노 리신과 반응시켜 HBc-유도체화 석신이미도 에스테르를 형성시켰다. SPDP 혼합된 디설파이드를 디티오트레이톨(DTT)와 반응시킨 다음 투석시켜 3-티오프로피온하이드라지도-dLOS 유도체를 제공하고, 이를 HBc-유도체화 석신이미도 에스테르와 반응시켜 목적하는 접합체를 형성시켰다.
상기 제조된 접합체를 사용하여, 식염수 용액을 이용하거나 백반 상으로의 상기 접합체의 예비 흡착물이 부가된 식염수를 이용하여 마우스(그룹당 5마리)를 면역시켰다. 마우스를 3회 면역시키고, 3주간 격리시켜 두며, 제시된 역가는 최종 부스터시킨지 2주 후의 것이다. 각 용량은 5㎍의 탄수화물을 함유하였다. ELISA 조건은 다음 문헌으로부터 발췌하였다[참조: Sun. et. al. (2000) Vaccine 2000 18 (13):1264-1272]. 선재 역가를 보여주는 유일한 항체 부류가 IgM이다. 작제물 모두의 경우에는 역가를 1 log 부스터하였다.
해당 백신이 백반에 흡착된 경우에는, IgG2b 역가가 상당히 더 낮았다. 이는 탄수화물의 탈아실화 또는 가수분해에 기인될 수 있다[참조: Sturgess et. al. (1999) Vaccine, 17 (9-10): 1169-1178]. IgG2a에 대해 측정 가능한 역가를 나타내는 마우스는 전혀 없었다. Th2 반응의 특징인 IgG1 유도는 HBc 상의 보다 긴 가가교결합제에 의한 면역과 함께 나타났지만, 궁극적으로는 나머지 동물과 동일한 수준으로 야기되었다. IgG3은 필적할 만한 수준이다.
실시예 17: CV-1843 및 CV-1842 단백질로부터 제조된 입자에 대한 펩티드 접합
CV-1843 및 CV-1842 단백질로부터 제조된 입자에 펩티드를 접합시켰다. 이러한 펩티드는 아미노산 서열 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (서열번호 450)을 가지며, 링커 N-[γ-말레이미도부티릴옥시]-설포석신이미드 에스테르(설포-GMBS, Pierce Chemical Co.)를 사용하여 접합시켰다. 최적화한 후, 접합 결과는 목적하는 리신에 대한 결합과, 다음에 논의되는 바와 같은 아미노-말단에 대한 결합을 보여주었다.
따라서, CV-1843 단백질로부터 제조된 입자에 대한 은-염색된 환원성 SDS-PAGE 분석 결과는, 약 22,000 달톤에서 완전하게 환원된 HBc 폴리펩티드 쇄의 단량체 밴드, 이 위에 1개의 반복체(1개의 펩티드 부가물) 밴드, 및 이러한 1개의 반복체 밴드 위에 2개의 반복체(2개의 펩티드 부가물) 밴드를 보여주었다. 대략 44,000 달톤 영역에는, 1차 밴드와 2개의 접합체 밴드가 존재하였다. CV-1842 단백질로부터 제조된 입자의 경우에는, 단량체 및 이량체 플러스 단일 폴리펩티드에 대한 밴드와 같이 단량체 및 이량체 밴드가 존재하였다. 따라서, 상기 펩티드는 CV-1843 단백질로부터 제조된 입자에 대한 N-말단과, 위치 77에서 부가된 리신 둘 다에 접합되었지만, 상기 펩티드는 리신 잔기를 함유하지 않은 CV-1842 입자로부터 제조된 입자에 대해서는 N-말단에만 접합되었다. 단량체 및 이량체는 접합 후에는 2개의 22,000 달톤 단량체로 완전하게 환원 및 분리될 수 없는 것을 지칭한다. 이들 결과는 정제된 입자가 이들과 화학적으로 접합된 펩티드를 가질 수 있다는 사실을 명백히 보여준다.
본원에 인용된 각각의 특허 및 문헌이 참조 문헌으로써 삽입된다. 문헌의 "a" 또는 "an"의 용도는 하나 이상을 포함하는 것으로 의도된다.
전술된 명세서 및 실시예는 예시적이며, 이로써 제한되지 않는다. 본 발명의 요지 및 범위 내에서의 기타 변형이 가능하고 이는 당업자에게 용이하게 이해될 수 있을 것이다.
<110> LORANTIS LTD. <120> STABILIZED IMMUNOGENIC HBc CHIMER PARTICLES <130> ICC-136.0PCT (4564-91156) <150> US 60/432,123 <151> 2002-12-10 <160> 455 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 1 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg 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virus <400> 4 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys 85 90 95 Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 5 <211> 183 <212> PRT <213> woodchuck <400> 5 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu 1 5 10 15 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cgtcgacctg cagccaagct t 51 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid pkk223 <400> 8 ttcacataag gaggaaaaaa ccatgggatc cgaagctt 38 <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> malarial B cell epitope <400> 9 Ile Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn 1 5 10 15 Pro Glu Leu <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chimera of malarial T cell epitope and hepatitis B <400> 10 Ile Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser 1 5 10 15 Pro Cys Ser Val Thr 20 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 11 Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu 1 5 10 15 <210> 12 <211> 35 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 12 Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala 1 5 10 15 Leu Glu Lys Ala Ala Ser Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val 20 25 30 Gln Gln Ala 35 <210> 13 <211> 27 <212> PRT <213> Cryptosporidium parvum <400> 13 Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu 1 5 10 15 Pro Ala Ala Gln Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala 20 25 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 14 Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ile Thr Lys 1 5 10 15 Asn <210> 15 <211> 31 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 15 Tyr Asn Gly Glu Cys Arg Tyr Asn Arg Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg 1 5 10 15 Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Val Ala Arg Thr Leu Pro 20 25 30 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 16 Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 17 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp 20 <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 18 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 19 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 19 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala 1 5 10 15 Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 20 <211> 19 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 20 Glu Gln Gln Ser Ala Val Asp Ala Asp Asp Ser His Phe Val Ser Ile 1 5 10 15 Glu Leu Glu <210> 21 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 21 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 22 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 23 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 24 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 24 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 25 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 25 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 26 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 26 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 27 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 27 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 28 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 28 Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu 1 5 10 15 Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu 20 25 30 Trp Gly Ile 35 <210> 29 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 29 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ala Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 30 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 30 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 31 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 31 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ala Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 32 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 32 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 33 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 33 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 34 <211> 46 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 34 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro 20 25 30 Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 35 40 45 <210> 35 <211> 69 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 35 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro 20 25 30 Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu 35 40 45 Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser 50 55 60 Asn Asp Ser Ser Asp 65 <210> 36 <211> 46 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 36 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala 1 5 10 15 Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro 20 25 30 Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp 35 40 45 <210> 37 <211> 69 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 37 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala 1 5 10 15 Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro 20 25 30 Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu 35 40 45 Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala Arg Ala 50 55 60 Asn Asp Ser Ser Asp 65 <210> 38 <211> 19 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 38 Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Cys Asn Asp 1 5 10 15 Ser Ser Asp <210> 39 <211> 38 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 39 Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Cys Asn Asp 1 5 10 15 Ser Ser Asp Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg 20 25 30 Cys Asn Asp Ser Ser Asp 35 <210> 40 <211> 57 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 40 Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Cys Asn Asp 1 5 10 15 Ser Ser Asp Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg 20 25 30 Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp 35 40 45 Gly Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 50 55 <210> 41 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is methionine or absent. If methionine then Xaa in positions 2 through 8 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 3 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 4 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 5 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is threonine or absent. If threonine than Xaa in positions 6 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 7 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is valine or absent. If valine then Xaa in position 8 is not absent. <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 15 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is absent or present, if present Xaa in position 17 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 15 through 16 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa at position 18 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 15 through 17 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 is absent or present, if present Xaa in position 19 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 19 is present then positions 15 through 18 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 15 through 19 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 15 through 20 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 21 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 22 are not absent. <400> 41 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 42 <211> 47 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is methionine or absent. If methionine then Xaa in positions 2 through 8 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 3 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 4 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 5 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is threonine or absent. If threonine than Xaa in positions 6 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 7 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is valine or absent. If valine then Xaa in position 8 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is glutamic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 15 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is absent or present, if present Xaa in position 17 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 15 through 16 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa at position 18 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 15 through 17 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 is absent or present, if present Xaa in position 19 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 19 is present then positions 15 through 18 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 15 through 19 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 15 through 20 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 21 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 22 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 15 through 23 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa at position 25 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 26 through 31 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa at position 26 is leucine or absent. If serine then Xaa in positions 27 through 31 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa at position 27 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 28 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa at position 28 is threonine or absent. If threonine than Xaa in positions 29 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 30 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 is valine or absent. If valine then Xaa in position 31 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 31 is glutamic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa at position 38 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 38 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa at position 40 is absent or present, if present Xaa in position 40 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 40 is present then positions 38 through 39 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa at position 41 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 38 through 40 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa at position 42 is absent or present, if present Xaa in position 42 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 42 is present then positions 38 through 41 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa at position 43 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 38 through 42 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa at position 44 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 38 through 43 are not absent. <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa at position 46 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 45 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa at position 47 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 38 through 46 are not absent. <400> 42 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 20 25 30 Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 <210> 43 <211> 70 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is methionine or absent. If methionine then Xaa in positions 2 through 8 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 3 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 4 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 5 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is threonine or absent. If threonine than Xaa in positions 6 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 7 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is valine or absent. If valine then Xaa in position 8 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is glutamic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 15 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is absent or present, if present Xaa in position 17 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 15 through 16 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa at position 18 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 15 through 17 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 is absent or present, if present Xaa in position 19 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 19 is present then positions 15 through 18 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 15 through 19 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 15 through 20 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 21 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 22 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 15 through 23 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa at position 25 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 26 through 31 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa at position 26 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 27 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa at position 27 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 28 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa at position 28 is threonine or absent. If threonine than Xaa in positions 29 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 30 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 is valine or absent. If valine then Xaa in position 31 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 31 is glutamic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa at position 38 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 38 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa at position 40 is absent or present, if present Xaa in position 40 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 40 is present then positions 38 through 39 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa at position 41 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 38 through 40 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa at position 42 is absent or present, if present Xaa in position 42 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 42 is present then positions 38 through 41 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa at position 43 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 38 through 42 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa at position 44 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 38 through 43 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> Xaa at position 45 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 44 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa at position 46 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 45 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa at position 47 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 38 through 46 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa at position 48 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 49 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa at position 49 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 50 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa at position 50 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 51 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa at position 51 is threonine or absent. If threonine than Xaa in positions 52 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa at position 52 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 53 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa at position 53 is valine or absent. If valine then Xaa in position 54 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa at position 54 is glutamic acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> Xaa at position 61 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> Xaa at position 62 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 61 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> Xaa at position 63 is absent or present, if present Xaa in position 63 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 63 is present then positions 61 through 62 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> Xaa at position 64 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 61 through 63 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> Xaa at position 65 is absent or present, if present Xaa in position 65 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 65 is present then positions 61 through 64 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> Xaa at position 66 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 61 through 65 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> Xaa at position 67 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 61 through 66 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa at position 68 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 61 through 67 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> Xaa at position 69 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 61 through 68 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Xaa at position 70 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 61 through 69 are not absent. <400> 43 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 20 25 30 Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 <210> 44 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is methionine or absent. If methionine then Xaa in position 2 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is serine or absent. If serine then Xaa in position 3 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is leucine or absent. If leucine then Xaa in position 4 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is leucine or absent. If leucine then Xaa in position 5 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 4 is threonine or proline or absent. If threonine or proline then Xaa in position 6 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in position 7 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is valine or absent. If valine then Xaa in position 8 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is glutamic acid or aspartic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa at position 11 is isoleucine or threonine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa at position 14 is glutamic acid or glycine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 16 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is absent or present, if present Xaa in position 17 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 15 through 16 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa at position 18 arginine, lysine or absent. If arginine or lysine then Xaa in positions 15 through 17 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 is absent or present, if present Xaa in position 19 is cysteine, serine or alanine. If Xaa is position 19 is present then positions 15 through 18 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is asparagine, serine, glycine or absent. If asparagine or serine or glycine then Xaa is positions 15 through 19 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa is positions 15 through 20 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is serine or absent. If serine then Xaa is positions 15 through 21 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is serine or absent. If serine then Xaa is positions 15 through 22 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa is positions 15 through 23 are not absent. <400> 44 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 45 <211> 47 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is methionine or absent. If methionine then Xaa in position 2 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is serine or absent. If serine then Xaa in position 3 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is leucine or absent. If leucine then Xaa in position 4 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is leucine or absent. If leucine then Xaa in position 5 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 4 is threonine or absent. If threonine then Xaa in position 6 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in position 7 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is valine or absent. If valine then Xaa in position 8 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is glutamic acid or aspartic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa at position 11 is isoleucine or threonine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa at position 14 is glutamic acid or glycine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 16 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is absent or present, if present Xaa in position 17 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 15 through 16 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa at position 18 arginine, lysine or absent. If arginine or lysine then Xaa in positions 15 through 17 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 is absent or present, if present Xaa in position 19 is cysteine, serine or alanine. If Xaa is position 19 is present then positions 15 through 18 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is asparagine, serine or glycine or absent. If asparagine or serine then Xaa is positions 15 through 19 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa is positions 15 through 20 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is serine or absent. If serine then Xaa is positions 15 through 21 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is serine or absent. If serine then Xaa is positions 15 through 22 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa is positions 15 through 23 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa at position 25 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 26 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa at position 26 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 27 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa at position 27 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 28 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa at position 28 is threonine, proline or absent. If threonine or proline then Xaa in positions 29 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 30 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 is valine or absent. If valine then Xaa in position 31 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 31 is glutamic acid or aspartic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa at position 33 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa at position 34 is isoleucine or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa at position 36 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa at position 37 is glumatic acid or glycine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa at position 38 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 38 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa at position 40 is absent of present, if present Xaa in position 40 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 40 is present then positions 38 through 39 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa at position 41 is arginine, lysine or absent. If arginine or lysine than Xaa in positions 38 through 40 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa at position 42 is absent or present, if present Xaa in position 42 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 42 is present then positions 38 through 41 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa at position 43 is asparagine, serine or absent. If asparagine or serine then Xaa in positions 38 through 42 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa at position 44 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa in positions 38 through 43 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> Xaa at position 45 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 44 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa at position 46 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 45 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa at position 47 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 38 through 46 are not absent. <400> 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 20 25 30 Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 <210> 46 <211> 70 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is methionine or absent. If methionine then Xaa in position 2 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is serine or absent. If serine then Xaa in position 3 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is leucine or absent. If leucine then Xaa in position 4 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is leucine or absent. If leucine then Xaa in position 5 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is threonine or absent. If threonine then Xaa in position 6 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in position 7 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is valine or absent. If valine then Xaa in position 8 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is glutamic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa at position 11 is isoleucine or threonine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa at position 14 is glutamic acid or glycine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 16 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is absent or present, if present Xaa in position 17 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 15 through 16 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa at position 18 arginine, lysine or absent. If arginine or lysine then Xaa in positions 15 through 17 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 is absent or present, if present Xaa in position 19 is cysteine, serine or alanine. If Xaa is position 19 is present then positions 15 through 18 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is asparagine, serine, glycine or absent. If asparagine or serine then Xaa is positions 15 through 19 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa is positions 15 through 20 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is serine or absent. If serine then Xaa is positions 15 through 21 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is serine or absent. If serine then Xaa is positions 15 through 22 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa is positions 15 through 23 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa at position 25 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 26 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa at position 26 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 27 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa at position 27 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 28 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa at position 28 is threonine, proline or absent. If threonine or proline then Xaa in positions 29 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 30 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 is valine or absent. If valine then Xaa in position 31 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 31 is glutamic acid or aspartic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa at position 33 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa at position 34 is isoleucine or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa at position 36 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa at position 37 is glumatic acid or glycine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa at position 38 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 38 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa at position 40 is absent of present, if present Xaa in position 40 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 40 is present then positions 38 through 39 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa at position 41 is arginine, lysine or absent. If arginine or lysine than Xaa in positions 38 through 40 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa at position 42 is absent or present, if present Xaa in position 42 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 42 is present then positions 38 through 41 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa at position 43 is asparagine, serine, glycine or absent. If asparagine or serine or glycine then Xaa in positions 38 through 42 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa at position 44 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa in positions 38 through 43 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> Xaa at position 45 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 44 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa at position 46 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 45 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa at position 47 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 38 through 46 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa at position 48 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 49 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa at position 49 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 50 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa at position 50 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 51 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa at position 51 is threonine, proline or absent. If threonine or proline then Xaa in positions 52 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa at position 52 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 53 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa at position 53 is valine or absent. If valine then Xaa in position 54 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa at position 54 is glutamic acid or aspartic acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> Xaa at position 56 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Xaa at position 57 is isoleucine or threonine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Xaa at position 59 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> Xaa at position 60 is glumatic acid or glycine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> Xaa at position 61 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> Xaa at position 62 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 61 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> Xaa at position 63 is absent of present, if present Xaa in position 63 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 63 is present then positions 61 through 62 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> Xaa at position 64 is arginine, lysine or absent. If arginine or lysine than Xaa in positions 61 through 63 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> Xaa at position 65 is absent or present, if present Xaa in position 65 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 65 is present then positions 61 through 64 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> Xaa at position 66 is asparagine, serine, glycine or absent. If asparagine or serine or glycine then Xaa in positions 61 through 65 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> Xaa at position 67 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa in positions 61 through 66 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa at position 68 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 61 through 67 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> Xaa at position 69 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 61 through 68 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Xaa at position 70 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 61 through 69 are not absent. <400> 46 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 20 25 30 Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 47 Asn Asn Ala Thr Phe Asn Tyr Thr Asn Val Asn Pro Ile Ser His Ile 1 5 10 15 Arg <210> 48 <211> 142 <212> PRT <213> Yersinia pestis <400> 48 Asp Ile Leu Lys Val Ile Val Asp Ser Met Asn His His Gly Asp Ala 1 5 10 15 Arg Ser Lys Leu Arg Glu Glu Leu Ala Glu Leu Thr Ala Glu Leu Lys 20 25 30 Ile Tyr Ser Val Ile Gln Ala Glu Ile Asn Lys His Leu Ser Ser Ser 35 40 45 Gly Thr Ile Asn Ile His Asp Lys Ser Ile Asn Leu Met Asp Lys Asn 50 55 60 Leu Tyr Gly Tyr Thr Asp Glu Glu Ile Phe Lys Ala Ser Ala Glu Tyr 65 70 75 80 Lys Ile Leu Glu Lys Met Pro Gln Thr Thr Ile Gln Val Asp Gly Ser 85 90 95 Glu Lys Lys Ile Val Ser Ile Lys Asp Phe Leu Gly Ser Glu Asn Lys 100 105 110 Arg Thr Gly Ala Leu Gly Asn Leu Lys Asn Ser Tyr Ser Tyr Asn Lys 115 120 125 Asp Asn Asn Glu Leu Ser His Phe Ala Thr Thr Cys Ser Asp 130 135 140 <210> 49 <211> 19 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 49 Cys Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly Ala Ala Gln Phe 1 5 10 15 Gly Gly Tyr <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 50 Asn Lys Leu Gly Thr Val Ser Tyr Gly Glu Glu 1 5 10 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 51 Asn Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 52 <211> 28 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 52 Leu Asp Ile Glu Lys Asp Lys Lys Lys Arg Thr Asp Glu Gln Leu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr 20 25 <210> 53 <211> 28 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 53 Leu Asp Ile Glu Lys Asn Lys Lys Lys Arg Thr Glu Ala Glu Leu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr 20 25 <210> 54 <211> 28 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 54 Ile Asp Ile Glu Lys Lys Gly Lys Ile Arg Thr Glu Ala Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Glu Leu Asn Lys Asp Tyr Pro Gly Gln Gly Tyr 20 25 <210> 55 <211> 25 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 55 Gly Val Ser Pro Lys Val Cys Lys Asp Val Thr Val Glu Gly Ser Asn 1 5 10 15 Glu Phe Ala Pro Val Gln Asn Leu Thr 20 25 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 56 Arg Ile Gln Ser Thr Trp Arg Gln Lys Thr Val Asp Leu Pro Ala Gly 1 5 10 15 Thr Lys Tyr Val 20 <210> 57 <211> 21 <212> PRT <213> Trypanosoma cruzi <400> 57 Lys Ala Ala Ile Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala 1 5 10 15 Ala Thr Ala Pro Ala 20 <210> 58 <211> 24 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 58 Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 1 5 10 15 Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro 20 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 59 Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 1 5 10 15 Asn Ala Asn Pro 20 <210> 60 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 60 Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro 1 5 10 15 Asn Ala Asn Pro 20 <210> 61 <211> 28 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 61 Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 1 5 10 15 Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro 20 25 <210> 62 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 62 Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala 1 5 10 15 Asn Pro Asn Val 20 <210> 63 <211> 22 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 63 Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala 1 5 10 15 Asn Pro Asn Val Asp Pro 20 <210> 64 <211> 24 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 64 Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala 1 5 10 15 Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala 20 <210> 65 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 65 Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 1 5 10 15 Asn Val <210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 66 Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 1 5 10 15 Asn Val Asp Pro 20 <210> 67 <211> 22 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 67 Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 1 5 10 15 Asn Val Asp Pro Asn Ala 20 <210> 68 <211> 16 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 68 Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val 1 5 10 15 <210> 69 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 69 Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val 1 5 10 15 Asp Pro <210> 70 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 70 Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val 1 5 10 15 Asp Pro Asn Ala 20 <210> 71 <211> 19 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 71 Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln 1 5 10 15 Pro Ala Gly <210> 72 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 72 Arg Ala Asp Asp Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Gly Gln Pro 1 5 10 15 Ala Gly <210> 73 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 73 Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp Gln 1 5 10 15 Pro Gly <210> 74 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 74 Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gln 1 5 10 15 Pro Gly <210> 75 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 75 Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln 1 5 10 15 Pro Gly <210> 76 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 76 Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gln 1 5 10 15 Pro Gly <210> 77 <211> 22 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 77 Ala Pro Gly Ala Asn Gln Glu Gly Gly Ala Ala Ala Pro Gly Ala Asn 1 5 10 15 Gln Glu Gly Gly Ala Ala 20 <210> 78 <211> 36 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 78 Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp Gln 1 5 10 15 Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp 20 25 30 Asp Gln Pro Gly 35 <210> 79 <211> 16 <212> PRT <213> Plasmodium berghei <400> 79 Asp Pro Pro Pro Pro Asn Pro Asn Asp Pro Pro Pro Pro Asn Pro Asn 1 5 10 15 <210> 80 <211> 24 <212> PRT <213> Plasmodium yoelii <400> 80 Gln Gly Pro Gly Ala Pro Gln Gly Pro Gly Ala Pro Gln Gly Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Gln Gly Pro Gly Ala Pro 20 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Streptococcus sobrinus <400> 81 Lys Pro Arg Pro Ile Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Asn Gln Lys 1 5 10 15 <210> 82 <211> 16 <212> PRT <213> Streptococcus sobrinus <400> 82 Ala Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Tyr Glu Lys Asp Leu 1 5 10 15 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Shigella flexneri <400> 83 Lys Asp Arg Thr Leu Ile Glu Gln Lys 1 5 <210> 84 <211> 15 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 84 Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys 1 5 10 15 <210> 85 <211> 25 <212> PRT <213> Entamoeba histolytica <400> 85 Val Glu Cys Ala Ser Thr Val Cys Gln Asn Asp Asn Ser Cys Pro Ile 1 5 10 15 Ile Ala Asp Val Glu Lys Cys Asn Gln 20 25 <210> 86 <211> 34 <212> PRT <213> Schistosoma japonicum <400> 86 Asp Leu Gln Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Gly Glu Leu Ile 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Ser Ala Glu Ser Leu Ala Ser Glu Leu Gln Arg Arg 20 25 30 Val Asp <210> 87 <211> 34 <212> PRT <213> Schistosoma mansoni <400> 87 Asp Leu Gln Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Ser Glu Leu Ile 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Ala Ala Glu Ser Leu Ala Ser Asp Leu Gln Arg Arg 20 25 30 Val Asp <210> 88 <211> 26 <212> PRT <213> Bovine Inhibin <400> 88 Ser Thr Pro Pro Leu Pro Trp Pro Trp Ser Pro Ala Ala Leu Arg Leu 1 5 10 15 Leu Gln Arg Pro Pro Glu Glu Pro Ala Ala 20 25 <210> 89 <211> 17 <212> PRT <213> Ebola virus <400> 89 Ala Thr Gln Val Glu Gln His His Arg Arg Thr Asp Asn Asp Ser Thr 1 5 10 15 Ala <210> 90 <211> 17 <212> PRT <213> Ebola virus <400> 90 His Asn Thr Pro Val Tyr Lys Leu Asp Ile Ser Glu Ala Thr Gln Val 1 5 10 15 Glu <210> 91 <211> 17 <212> PRT <213> Ebola virus <400> 91 Gly Lys Leu Gly Leu Ile Thr Asn Thr Ile Ala Gly Val Ala Val Leu 1 5 10 15 Ile <210> 92 <211> 14 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 92 Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys Asn 1 5 10 <210> 93 <211> 18 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 93 Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Asn <210> 94 <211> 18 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 94 Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Asn <210> 95 <211> 42 <212> PRT <213> Alzheimer's disease b-Amyloid <400> 95 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 96 <211> 17 <212> PRT <213> Alzheimer's disease b-Amyloid <400> 96 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu <210> 97 <211> 11 <212> PRT <213> Alzheimer's disease b-Amyloid <400> 97 Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 1 5 10 <210> 98 <211> 33 <212> PRT <213> Alzheimer's disease b-Amyloid <400> 98 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly <210> 99 <211> 32 <212> PRT <213> alzheimer's disease b-amplyoid <400> 99 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 <210> 100 <211> 13 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 100 Tyr Val Ala Val Glu Asn Gly Val Ala Lys Lys Val Ala 1 5 10 <210> 101 <211> 15 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 101 His Phe Val Gln Gln Thr Pro Lys Ser Gln Pro Thr Leu Val Pro 1 5 10 15 <210> 102 <211> 13 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 102 His Val Val Val Asn Asn Lys Val Ala Thr His Val Pro 1 5 10 <210> 103 <211> 12 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 103 Pro Leu Gln Asn Ile Gln Pro Gln Val Thr Lys Arg 1 5 10 <210> 104 <211> 21 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 104 Ala Gln Ala Ala Asn Gly Gly Ala Ala Ser Gly Gln Val Lys Val Thr 1 5 10 15 Lys Val Thr Lys Ala 20 <210> 105 <211> 10 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 105 Tyr Val Asp Glu Gln Ser Lys Tyr His Ala 1 5 10 <210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 106 His Phe Val Gln Asn Lys Gln Asn Gln Pro Pro Thr Leu Val Pro 1 5 10 15 <210> 107 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 107 Lys Pro Ser Ser Thr Asn Ala Lys Thr Gly Asn Lys Val Glu Val Thr 1 5 10 15 Lys Ala <210> 108 <211> 17 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 108 Tyr Trp Thr Thr Val Asn Thr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Thr Phe Val 1 5 10 15 Pro <210> 109 <211> 11 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 109 Tyr Val Asp Glu Lys Lys Lys Met Val His Ala 1 5 10 <210> 110 <211> 13 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 110 His Tyr Thr Arg Gln Asn Asn Ala Asp Val Phe Val Pro 1 5 10 <210> 111 <211> 14 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 111 Tyr Tyr Thr Lys Asp Thr Asn Asn Asn Leu Thr Leu Val Pro 1 5 10 <210> 112 <211> 14 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 112 Pro Pro Gln Lys Asn Gln Ser Gln Pro Val Val Thr Lys Ala 1 5 10 <210> 113 <211> 14 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 113 Pro Pro Ser Lys Gly Gln Thr Gly Asn Lys Val Thr Lys Gly 1 5 10 <210> 114 <211> 14 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 114 Pro Pro Ser Lys Ser Gln Pro Gln Val Lys Val Thr Lys Ala 1 5 10 <210> 115 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 115 Gln Pro Gln Thr Ala Asn Thr Gln Gln Gly Gly Lys Val Lys Val Thr 1 5 10 15 Lys Ala <210> 116 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 116 Gln Pro Gln Val Thr Asn Gly Val Gln Gly Asn Gln Val Lys Val Thr 1 5 10 15 Lys Ala <210> 117 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 117 Gln Pro Ser Lys Ala Gln Gly Gln Thr Asn Asn Gln Val Lys Val Thr 1 5 10 15 Lys Ala <210> 118 <211> 20 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 118 Pro Pro Ser Ser Asn Gln Gly Lys Asn Gln Ala Gln Thr Gly Asn Thr 1 5 10 15 Val Thr Lys Ala 20 <210> 119 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 119 Pro Pro Ser Lys Ser Gln Gly Lys Thr Gly Asn Gln Val Lys Val Thr 1 5 10 15 Lys Ala <210> 120 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 120 Pro Pro Ser Lys Ser Gln Gly Thr Asn Asn Asn Gln Val Lys Val Thr 1 5 10 15 Lys Ala <210> 121 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 121 Pro Pro Ser Lys Ser Gln Pro Gly Gln Val Lys Val Thr Lys Val Thr 1 5 10 15 Lys Ala <210> 122 <211> 24 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 122 Gln Leu Gln Leu Thr Glu Gln Pro Ser Ser Thr Asn Gly Gln Thr Gly 1 5 10 15 Asn Gln Val Lys Val Thr Lys Ala 20 <210> 123 <211> 24 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 123 Gln Leu Gln Leu Thr Glu Ala Pro Ser Lys Ser Gln Gly Ala Ala Ser 1 5 10 15 Asn Gln Val Lys Val Thr Lys Ala 20 <210> 124 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 124 Ser Ala Tyr Thr Pro Ala His Val Tyr Val Asp Asn Lys Val Ala Lys 1 5 10 15 His Val Ala <210> 125 <211> 21 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 125 Ser Ala Tyr Thr Pro Ala His Phe Val Gln Asn Lys Gln Asn Asn Asn 1 5 10 15 Pro Thr Leu Val Pro 20 <210> 126 <211> 12 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 126 Val Glu Gly Arg Asn Tyr Gln Leu Gln Leu Thr Glu 1 5 10 <210> 127 <211> 12 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 127 Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr Thr Pro Ala 1 5 10 <210> 128 <211> 22 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 128 Gln Leu Gln Leu Thr Glu Pro Pro Ser Lys Asn Gln Ala Gln Thr Gln 1 5 10 15 Asn Lys Val Thr Lys Ala 20 <210> 129 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 129 Gly Arg Asp Ala Phe Glu Leu Phe Leu Leu Gly Ser Gly Ser Asp Glu 1 5 10 15 <210> 130 <211> 31 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 130 Arg His Ala Asn Val Gly Arg Asp Ala Phe Glu Leu Phe Leu Leu Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ser Asp Glu Ala Lys Gly Thr Asp Pro Leu Lys Asn His 20 25 30 <210> 131 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 131 Gly Arg Asp Ala Phe Asn Leu Phe Leu Leu Gly Arg Ile Gly Asp Asp 1 5 10 15 Asp Glu <210> 132 <211> 17 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 132 Gly Arg Asn Ala Phe Glu Leu Phe Leu Ile Gly Ser Ala Thr Ser Asp 1 5 10 15 Gln <210> 133 <211> 15 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 133 Gln Val Lys Val Thr Lys Ala Lys Ser Arg Ile Arg Thr Lys Ile 1 5 10 15 <210> 134 <211> 13 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 134 Thr Leu Val Pro Ala Val Val Gly Lys Pro Gly Ser Asp 1 5 10 <210> 135 <211> 17 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 135 His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro 1 5 10 15 Arg <210> 136 <211> 15 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 136 Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu 1 5 10 15 <210> 137 <211> 18 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 137 Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser 1 5 10 15 Gln Thr <210> 138 <211> 21 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 138 Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala 1 5 10 15 Gly Val Arg Val Lys 20 <210> 139 <211> 21 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 139 Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val 1 5 10 15 Gly Val Arg Val Lys 20 <210> 140 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Ala Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu 1 5 10 <210> 141 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp 1 5 <210> 142 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu 1 5 <210> 143 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys 1 5 10 <210> 144 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr 1 5 <210> 145 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Pro Gly Thr Ile Asn Ile 1 5 <210> 146 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Phe Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 147 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val 1 5 <210> 148 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys Gly Asp Pro 1 5 10 15 Ala <210> 149 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Met Ala Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu 1 5 10 <210> 150 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 Met Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp 1 5 10 <210> 151 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 Met Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu 1 5 <210> 152 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 Met Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys 1 5 10 <210> 153 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 153 Met Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr 1 5 <210> 154 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Met Pro Gly Thr Ile Asn Ile 1 5 <210> 155 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Met Phe Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 156 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 156 Met Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val 1 5 <210> 157 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Met Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys Gly Asp 1 5 10 15 Pro Ala <210> 158 <211> 21 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 158 Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp 1 5 10 15 His Gln Leu Asp Pro 20 <210> 159 <211> 8 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 159 Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 <210> 160 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 160 Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu 1 5 10 <210> 161 <211> 26 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 161 Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg 1 5 10 15 Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly 20 25 <210> 162 <211> 14 <212> PRT <213> Hepatitis B <400> 162 Met Gln Trp Ser Thr Ala Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro 1 5 10 <210> 163 <211> 14 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 163 Met Gln Trp Ser Thr Ala Leu His Gln Ala Leu Gln Asp Pro 1 5 10 <210> 164 <211> 6 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 164 Gln Asp Pro Arg Val Arg 1 5 <210> 165 <211> 13 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 165 Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly 1 5 10 <210> 166 <211> 13 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 166 Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 1 5 10 <210> 167 <211> 24 <212> PRT <213> B. anthracis <400> 167 Ile Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp 1 5 10 15 Thr Ser Thr Asn Gly Ile Glu Leu 20 <210> 168 <211> 15 <212> PRT <213> Hookworm <400> 168 Ile Val Tyr Gln His Ser His Gly Glu Asp Arg Pro Gly Glu Leu 1 5 10 15 <210> 169 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 169 Gly Ser Gly Asp Gly Glu Gly Gly 1 5 <210> 170 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flexible linker arm <400> 170 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr 1 5 10 <210> 171 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker arm sequence <400> 171 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 172 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Flexible linker arm <400> 172 Gly Ser Gly Asp Glu Gly Gly 1 5 <210> 173 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Flexible linker arm <400> 173 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 174 <211> 16 <212> PRT <213> HIV <400> 174 Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Cys 1 5 10 15 <210> 175 <211> 17 <212> PRT <213> Corynebacterium diphtheriae <400> 175 Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly 1 5 10 15 Cys <210> 176 <211> 25 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 176 Val Glu Ile Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Lys Arg Glu Ile Asp Lys 1 5 10 15 Asn Gly Lys Val Thr Val Ser Leu Cys 20 25 <210> 177 <211> 19 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 177 Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu 1 5 10 15 Asn Asp Cys <210> 178 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 178 Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Cys 1 5 10 <210> 179 <211> 10 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 179 Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Cys 1 5 10 <210> 180 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 180 Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Cys 1 5 <210> 181 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 181 Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ser Ala Tyr Glu Arg 1 5 10 15 Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys 20 <210> 182 <211> 22 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 182 Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Lys Leu Ser Thr Arg Gly 20 <210> 183 <211> 22 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 183 Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val 1 5 10 15 Tyr Ser Leu Ile Arg Pro 20 <210> 184 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 184 Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu Leu Ile Arg Met Ile 1 5 10 15 Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn 20 <210> 185 <211> 21 <212> PRT <213> Trypanosoma cruzi <400> 185 Ser His Asn Phe Thr Leu Val Ala Ser Val Ile Ile Glu Glu Ala Pro 1 5 10 15 Ser Gly Asn Thr Cys 20 <210> 186 <211> 16 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 186 Ser Val Gln Ile Pro Lys Val Pro Tyr Pro Asn Gly Ile Val Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 187 <211> 16 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 187 Asp Phe Asn His Tyr Tyr Thr Leu Lys Thr Gly Leu Glu Ala Asp Cys 1 5 10 15 <210> 188 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 188 Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Lys Lys Ile Lys Asn Ser Ile 1 5 10 15 Ser Cys <210> 189 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 189 Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro 1 5 10 15 Cys Ser Val Thr 20 <210> 190 <211> 19 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 190 Tyr Leu Asp Lys Val Arg Ala Thr Val Gly Thr Glu Trp Thr Pro Cys 1 5 10 15 Ser Val Thr <210> 191 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium yoelii <400> 191 Glu Phe Val Lys Gln Ile Ser Ser Gln Leu Thr Glu Glu Trp Ser Gln 1 5 10 15 Cys Ser Val Thr 20 <210> 192 <211> 16 <212> PRT <213> Streptococcus sobrinus <400> 192 Lys Pro Arg Pro Ile Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Asn Gln Lys Cys 1 5 10 15 <210> 193 <211> 17 <212> PRT <213> Streptococcus sobrinus <400> 193 Ala Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Tyr Glu Lys Asp Leu 1 5 10 15 Cys <210> 194 <211> 16 <212> PRT <213> Lymphocytic choriomeningitis virus <400> 194 Arg Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly Asn Leu Thr Ala Gln Cys 1 5 10 15 <210> 195 <211> 16 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 195 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys 1 5 10 15 <210> 196 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 196 Ala Ile Trp Gln Val Glu Gln Lys Ala Ser Ile Ala Gly Thr Asp Ser 1 5 10 15 Gly Trp Cys <210> 197 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 197 Asn Tyr Lys Asn Gly Gly Phe Phe Val Gln Tyr Gly Gly Ala Tyr Lys 1 5 10 15 Arg His Cys <210> 198 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 198 His Asn Ser Gln Thr Glu Val Ala Ala Thr Leu Ala Tyr Arg Phe Gly 1 5 10 15 Asn Val Cys <210> 199 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 199 Thr Pro Arg Val Ser Tyr Ala His Gly Phe Lys Gly Leu Val Asp Asp 1 5 10 15 Ala Asp Cys <210> 200 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 200 Arg Phe Gly Asn Ala Val Pro Arg Ile Ser Tyr Ala His Gly Phe Asp 1 5 10 15 Phe Ile Cys <210> 201 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 201 Ala Phe Lys Tyr Ala Arg His Ala Asn Val Gly Arg Asn Ala Phe Glu 1 5 10 15 Leu Phe Cys <210> 202 <211> 20 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 202 Ser Gly Ala Trp Leu Lys Arg Asn Thr Gly Ile Gly Asn Tyr Thr Gln 1 5 10 15 Ile Asn Ala Cys 20 <210> 203 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 203 Ala Gly Glu Phe Gly Thr Leu Arg Ala Gly Arg Val Ala Asn Gln Cys 1 5 10 15 <210> 204 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 204 Ile Gly Asn Tyr Thr Gln Ile Asn Ala Ala Ser Val Gly Leu Arg Cys 1 5 10 15 <210> 205 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 205 Gly Arg Asn Tyr Gln Leu Gln Leu Thr Glu Gln Pro Ser Arg Thr Cys 1 5 10 15 <210> 206 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 206 Ser Gly Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Cys 1 5 10 15 <210> 207 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 207 His Ala Asn Val Gly Arg Asp Ala Phe Asn Leu Phe Leu Leu Gly Cys 1 5 10 15 <210> 208 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 208 Leu Gly Arg Ile Gly Asp Asp Asp Glu Ala Lys Gly Thr Asp Pro Cys 1 5 10 15 <210> 209 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 209 Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr Lys Cys 1 5 10 15 <210> 210 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 210 Asn Tyr Ala Phe Lys Tyr Ala Lys His Ala Asn Val Gly Arg Asp Cys 1 5 10 15 <210> 211 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 211 Ala His Gly Phe Asp Phe Ile Glu Arg Gly Lys Lys Gly Glu Asn Cys 1 5 10 15 <210> 212 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 212 Gly Val Asp Tyr Asp Phe Ser Lys Arg Thr Ser Ala Ile Val Ser Cys 1 5 10 15 <210> 213 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 213 His Asp Asp Met Pro Val Ser Val Arg Tyr Asp Ser Pro Asp Phe Cys 1 5 10 15 <210> 214 <211> 27 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 214 Arg Phe Gly Asn Ala Val Pro Arg Ile Ser Tyr Ala His Gly Phe Asp 1 5 10 15 Phe Ile Glu Arg Gly Lys Lys Gly Glu Asn Cys 20 25 <210> 215 <211> 24 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 215 Asn Tyr Ala Phe Lys Tyr Ala Lys His Ala Asn Val Gly Arg Asp Ala 1 5 10 15 Phe Asn Leu Phe Leu Leu Gly Cys 20 <210> 216 <211> 26 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 216 Ser Gly Ala Trp Leu Lys Arg Asn Thr Gly Ile Gly Asn Tyr Thr Gln 1 5 10 15 Ile Asn Ala Ala Ser Val Gly Leu Arg Cys 20 25 <210> 217 <211> 20 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 217 Ser Gly Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr 1 5 10 15 Thr Pro Ala Cys 20 <210> 218 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 218 Thr Gly Ala Asn Asn Thr Ser Thr Val Ser Asp Tyr Phe Arg Asn Arg 1 5 10 15 Ile Thr Cys <210> 219 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 219 Ile Tyr Asp Phe Lys Leu Asn Asp Lys Phe Asp Lys Phe Lys Pro Tyr 1 5 10 15 Ile Gly Cys <210> 220 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 220 Leu Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Lys Leu Asn Asp Lys Phe Lys Pro Tyr 1 5 10 15 Ile Gly Cys <210> 221 <211> 19 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 221 Asn Gly Trp Tyr Ile Asn Pro Trp Ser Glu Val Lys Phe Asp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Arg Cys <210> 222 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 222 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro 20 <210> 223 <211> 24 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 223 Arg Asp Leu Leu Asp Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser 1 5 10 15 Pro Glu His Cys Ser Pro His His 20 <210> 224 <211> 25 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 224 Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val 1 5 10 15 Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly 20 25 <210> 225 <211> 16 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 225 Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu 1 5 10 15 <210> 226 <211> 21 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 226 Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val 1 5 10 15 Ile Glu Tyr Leu Val 20 <210> 227 <211> 32 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 227 Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Val Ser Phe Gly Val 1 5 10 15 Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu 20 25 30 <210> 228 <211> 21 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 228 Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro 1 5 10 15 Asn Ala Pro Ile Leu 20 <210> 229 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 229 Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala 1 5 10 <210> 230 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 230 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu 1 5 10 <210> 231 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 231 Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn 1 5 10 <210> 232 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 232 Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu 1 5 10 15 Met Thr Leu Ala 20 <210> 233 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> PADRE eptiope <400> 233 Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 234 <211> 549 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 234 atggacatcg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60 tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa 120 gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180 tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg ttaatttgga agatccagcg 240 tctagagacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt caggcaactc 300 ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga gtatttggtg 360 tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta 420 tcaacacttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480 ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540 tctcaatgt 549 <210> 235 <211> 555 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 235 atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60 tctgacttct ttccttccgt acgagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa 120 gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc 180 tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgca agatccagca 240 tccagagatc tagtagtcaa ttatgttaat actaacatgg gtttaaagat caggcaacta 300 ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc 360 tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta 420 tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga 480 agaactccct cgcctcgcag acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct 540 cgggaatctc aatgt 555 <210> 236 <211> 555 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 236 atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60 tctgacttct ttccttccgt cagagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa 120 gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc 180 tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgga agatccagca 240 tctagggatc ttgtagtaaa ttatgttaat actaacgtgg gtttaaagat caggcaacta 300 ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc 360 tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta 420 tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga 480 agaactccct cgcctcgcag acgcagatct ccatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct 540 cgggaatctc aatgt 555 <210> 237 <211> 549 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 237 atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60 tctgacttct ttccttccgt acgagatctt ctagataccg ccgcagctct gtatcgggat 120 gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180 tgctggggag acttaatgac tctagctacc tgggtgggta ctaatttaga agatccagca 240 tctagggacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatgtgg gcctaaagtt cagacaatta 300 ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cggttctaga gtatttggtg 360 tcttttggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta 420 tcaacgcttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480 ccctcgcctc gcagacgaag atctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540 tctcaatgt 549 <210> 238 <211> 549 <212> DNA <213> Woodchuck <400> 238 atggctttgg ggcatggaca tagatcctta taaagaattt ggttcatctt atcagttgtt 60 gaattttctt cctttggact tctttcctga tcttaatgct ttggtggaca ctgctactgc 120 cttgtatgaa gaagaactaa caggtaggga acattgctct ccgcaccata cagctattag 180 acaagcttta gtatgctggg atgaattaac taaattgata gcttggatga gctctaacat 240 aacttctgaa caagtaagaa caatcattgt aaatcatgtc aatgatacct ggggacttaa 300 ggtgagacaa agtttatggt ttcatttgtc atgtctcact ttcggacaac atacagttca 360 agaattttta gtaagttttg gagtatggat caggactcca gctccatata gacctcctaa 420 tgcacccatt ctctcgactc ttccggaaca tacagtcatt aggagaagag gaggtgcaag 480 agcttctagg tcccccagaa gacgcactcc ctctcctcgc aggagaagat ctcaatcacc 540 gcgtcgcag 549 <210> 239 <211> 651 <212> DNA <213> Ground squirrel <400> 239 atgtatcttt ttcacctgtg ccttgttttt gcctgtgttc catgtcctac tgttcaagcc 60 tccaagctgt gccttggatg gctttgggac atggacatag atccctataa agaatttggt 120 tcttcttatc agttgttgaa ttttcttcct ttggactttt ttcctgatct caatgcattg 180 gtggacactg ctgctgctct ttatgaagaa gaattaacag gtagggagca ttgttctcct 240 catcatactg ctattagaca ggccttagtg tgttgggaag aattaactag attaattaca 300 tggatgagtg aaaatacaac agaagaagtt agaagaatta ttgttgatca tgtcaataat 360 acttggggac ttaaagtaag acagacttta tggtttcatt tatcatgtct tacttttgga 420 caacacacag ttcaagaatt tttggttagt tttggagtat ggattagaac tccagctcct 480 tatagaccac ctaatgcacc cattttatca actcttccgg aacatacagt cattaggaga 540 agaggaggtt caagagctgc taggtccccc cgaagacgca ctccctctcc tcgcaggaga 600 aggtctcaat caccgcgtcg cagacgctct caatctccag cttccaactg c 651 <210> 240 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 240 ggtgcatgca aggagatg 18 <210> 241 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 241 gcgaagcttc ggatcccatg gttttttcct ccttatgtga aattgttatc cgctc 55 <210> 242 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 242 ttgggccatg gacatcgacc ctta 24 <210> 243 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 243 cgcaagctta aacaacagta gtctccggaa g 31 <210> 244 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 244 gtttctcttc caaaagtgag gctagaaatg tgaaaccaca aga 43 <210> 245 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 245 ctcacttttg gaagagaaac 20 <210> 246 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 246 gagcgcagta tggtgaggtg agctatgctc aggagactc 39 <210> 247 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 247 gaggcgctca ggcaagcaat tcttt 25 <210> 248 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 248 cgcaagctta ctagcaaaca acagtagtct cggaa 35 <210> 249 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 249 gcgctcttcc aaaagtgagg ctagaaatgc aaaaccacaa gagttgcct 49 <210> 250 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 250 gcgggcccat attagtgttg caataactga ctactaggtc tc 42 <210> 251 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 251 gcggctcgcc ccagcaaaga attgcttgtc tacacgcagt atggtgaggt 50 <210> 252 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 252 ggggcgagct aatgactcta gctacct 27 <210> 253 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 253 gcggctcgcc ccagcaaaga atgcattgcc tgagcgcagt atg 43 <210> 254 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 254 ttaggcccat attagtgttg 20 <210> 255 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 255 gcggggccta aagttcaggc aatgcttgtg gtttcacatt tcta 44 <210> 256 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 256 gcgccaggtg catagagtca ttagttcccc c 31 <210> 257 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 257 ctacctgggt gggtgtt 17 <210> 258 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 258 tatgggccta aagttcagg 19 <210> 259 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 259 gcggctcgcc gcagcaaaga attgcttgtc tgagcgcagt atggtgagg 49 <210> 260 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 260 gcggggccta aagtgcaggc aactcttgtg gtt 33 <210> 261 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 261 gcggctagct ggatcttcgc aattaacac 29 <210> 262 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 262 gcggctagct gcgacctagt agtcagtt 28 <210> 263 <211> 24 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 263 ttgggccatg gacatcgacc ctta 24 <210> 264 <211> 31 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 264 gcggaattcc atcttccaaa ttaacaccca c 31 <210> 265 <211> 39 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 265 cgcgaattca aaaagagctc ccagcgtcta gagacctag 39 <210> 266 <211> 31 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 266 cgcaagctta aacaacagta gtctccggaa g 31 <210> 267 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 267 cgcaagctta ctagcaaaca acagtagtct ccggaag 37 <210> 268 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 268 ggaaagctta ctaacattga gattcccg 28 <210> 269 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 269 gcggaattcc atcttccaaa ttaacaccca c 31 <210> 270 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 270 gcggaattcc atcttcgcaa ttaacaccca 30 <210> 271 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 271 cgggaattca aaaagagctc ccagcgtcta gagacctag 39 <210> 272 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 272 gcggaattca aaaagagctc ccagctagct gcgacct 37 <210> 273 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 273 aattctggat gcggaatttc gtcatgacag cggctatgag gtgcaccatc agaaactggt 60 tttctttgcc gaagatgtcg gttctaacaa gggggcaatt atcgagct 108 <210> 274 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 274 aattgtcacg aaagaaaata ctataattaa cccttctgag aatggtgaca cctccacgaa 60 cgggatcgag ct 72 <210> 275 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 275 aattgtttat cagcattctc acggcgaaga tcgtccaggt gagct 45 <210> 276 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 276 aatttctctg ttaaccgaag tggagacgcc gattcgtaac gaatggggta gccgctctaa 60 tgatagctct gacgagct 78 <210> 277 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 277 Met Gly Cys Glu Leu Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly 1 5 10 <210> 278 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 278 gcgccatggg gtgtgagctc gacccttata aagaatttgg 40 <210> 279 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 279 Met Gly Cys Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly 1 5 10 <210> 280 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 280 gcgccatggg gtgtgacatc gacccttata aagaatttgg 40 <210> 281 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 281 cgcaagctta gagctcttga attccaacaa cagtagtctc cg 42 <210> 282 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 282 cgcgagctcc cagcgtctag agacctag 28 <210> 283 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 283 gtatcaggct gaaaatc 17 <210> 284 <211> 19 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 284 Ile Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn 1 5 10 15 Pro Glu Leu <210> 285 <211> 57 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 285 aattaacgct aatccgaacg ctaatccgaa cgctaatccg aacgctaatc cggagct 57 <210> 286 <211> 49 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 286 ccggattagc gttcggatta gcgttcggat tagcgttcgg attagcgtt 49 <210> 287 <211> 31 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 287 Ile Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn 1 5 10 15 Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu 20 25 30 <210> 288 <211> 93 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 288 aattaacgct aatccgaacg ttgacccgaa cgctaatccg aacgctaatc cgaacgctaa 60 tccgaacgtt gacccgaacg ctaatccgga gct 93 <210> 289 <211> 91 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 289 ggagctccgg attagcgttc gggtcaacgt tcggattagc gttcggatta gcgttcggat 60 tagcgttcgg gtcaacgttc ggattagcgt t 91 <210> 290 <211> 23 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 290 Ile Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn 1 5 10 15 Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu 20 <210> 291 <211> 69 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 291 aattaacgcg aatccgaacg tggatccgaa tgccaaccct aacgccaacc caaatgcgaa 60 cccagagct 69 <210> 292 <211> 61 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 292 ctgggttcgc atttgggttg gcgttagggt tggcattcgg atccacgttc ggattcgcgt 60 t 61 <210> 293 <211> 23 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 293 Ile Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp 1 5 10 15 Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu 20 <210> 294 <211> 69 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 294 aattaacgcg aatccgaatg ccaaccctaa cgccaaccca aacgtggatc cgaatgcgaa 60 cccagagct 69 <210> 295 <211> 61 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 295 ctgggttcgc attcggatcc acgtttgggt tggcgttagg gttggcattc ggattcgcgt 60 t 61 <210> 296 <211> 31 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 296 Ile Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn 1 5 10 15 Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu 20 25 30 <210> 297 <211> 93 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 297 aattaacgcg aatccgaacg tggatccaaa tgccaaccct aacgctaatc caaacgccaa 60 cccgaatgtt gaccccaatg ccaatccgga gct 93 <210> 298 <211> 85 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 298 ccggattggc attggggtca acattcgggt tggcgtttgg attagcgtta gggttggcat 60 ttggatccac gttcggattc gcgtt 85 <210> 299 <211> 23 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 299 Ile Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn 1 5 10 15 Ala Asn Pro Asn Val Glu Leu 20 <210> 300 <211> 69 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 300 aattaatccg aacgtggatc caaatgccaa ccctaacgct aatccaaacg ccaacccgaa 60 tgttgagct 69 <210> 301 <211> 61 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 301 caacattcgg gttggcgttt ggattagcgt tagggttggc atttggatcc acgttcggat 60 t 61 <210> 302 <211> 25 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 302 Ile Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn 1 5 10 15 Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Glu Leu 20 25 <210> 303 <211> 75 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 303 aattaatccg aacgtggatc caaatgccaa ccctaacgct aatccaaacg ccaacccgaa 60 tgttgaccct gagct 75 <210> 304 <211> 67 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 304 cagggtcaac attcgggttg gcgtttggat tagcgttagg gttggcattt ggatccacgt 60 tcggatt 67 <210> 305 <211> 27 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 305 Ile Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn 1 5 10 15 Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Glu Leu 20 25 <210> 306 <211> 81 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 306 aattaatccg aacgtggatc caaatgccaa ccctaacgct aatccaaacg ccaacccgaa 60 tgttgaccct aatgctgagc t 81 <210> 307 <211> 73 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 307 cagcattagg gtcaacattc gggttggcgt ttggattagc gttagggttg gcatttggat 60 ccacgttcgg att 73 <210> 308 <211> 21 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 308 Ile Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn 1 5 10 15 Pro Asn Val Glu Leu 20 <210> 309 <211> 63 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 309 aattaacgtg gatccaaatg ccaaccctaa cgctaatcca aacgccaacc cgaatgttga 60 gct 63 <210> 310 <211> 55 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 310 caacattcgg gttggcgttt ggattagcgt tagggttggc atttggatcc acgtt 55 <210> 311 <211> 23 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 311 Ile Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn 1 5 10 15 Pro Asn Val Asp Pro Glu Leu 20 <210> 312 <211> 69 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 312 aattaacgtg gatccaaatg ccaaccctaa cgctaatcca aacgccaacc cgaatgttga 60 ccctgagct 69 <210> 313 <211> 61 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 313 cagggtcaac attcgggttg gcgtttggat tagcgttagg gttggcattt ggatccacgt 60 t 61 <210> 314 <211> 25 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 314 Ile Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn 1 5 10 15 Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Glu Leu 20 25 <210> 315 <211> 75 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 315 aattaacgtg gatccaaatg ccaaccctaa cgctaatcca aacgccaacc cgaatgttga 60 ccctaatgct gagct 75 <210> 316 <211> 67 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 316 cagcattagg gtcaacattc gggttggcgt ttggattagc gttagggttg gcatttggat 60 ccacgtt 67 <210> 317 <211> 19 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 317 Ile Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn 1 5 10 15 Val Glu Leu <210> 318 <211> 57 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 318 aattgatcca aatgccaacc ctaacgctaa tccaaacgcc aacccgaatg ttgagct 57 <210> 319 <211> 49 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 319 caacattcgg gttggcgttt ggattagcgt tagggttggc atttggatc 49 <210> 320 <211> 21 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 320 Ile Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn 1 5 10 15 Val Asp Pro Glu Leu 20 <210> 321 <211> 63 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 321 aattgatcca aatgccaacc ctaacgctaa tccaaacgcc aacccgaatg ttgaccctga 60 gct 63 <210> 322 <211> 55 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 322 cagggtcaac attcgggttg gcgtttggat tagcgttagg gttggcattt ggatc 55 <210> 323 <211> 23 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 323 Ile Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn 1 5 10 15 Val Asp Pro Asn Ala Glu Leu 20 <210> 324 <211> 69 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 324 aattgatcca aatgccaacc ctaacgctaa tccaaacgcc aacccgaatg ttgaccctaa 60 tgccgagct 69 <210> 325 <211> 61 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 325 cggcattagg gtcaacattc gggttggcgt ttggattagc gttagggttg gcatttggat 60 c 61 <210> 326 <211> 21 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 326 Ile Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser 1 5 10 15 Pro Cys Ser Val Thr 20 <210> 327 <211> 69 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 327 aattgaatat ctgaacaaaa tccagaactc tctgtccacc gaatggtctc cgtgctccgt 60 tacctagta 69 <210> 328 <211> 69 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 328 agcttactag gtaacggagc acggagacaa ttcggtggac agagagttct ggattttgtt 60 cagatattc 69 <210> 329 <211> 24 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 329 Ile Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gln Pro Ala Gly Glu Leu 20 <210> 330 <211> 72 <212> DNA <213> Plasmodium vivax <400> 330 aattccggct ggtgaccgtg cagatggcca gccagcgggt gaccgcgctg caggccagcc 60 ggctggcgag ct 72 <210> 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gctcccggct gattaccggc gccgttcgc 109 <210> 344 <211> 25 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 344 Ile Ala Pro Gly Ala Asn Gln Glu Gly Gly Ala Ala Ala Pro Gly Ala 1 5 10 15 Asn Gln Glu Gly Gly Ala Ala Glu Leu 20 25 <210> 345 <211> 75 <212> DNA <213> Plasmodium vivax <400> 345 aattgcgccg ggcgccaacc aggaaggtgg ggctgcagcg ccaggagcca atcaagaagg 60 cggtgcagcg gagct 75 <210> 346 <211> 67 <212> DNA <213> Plasmodium vivax <400> 346 ccgctgcacc gccttcttga ttggctcctg gcgctgcagc cccaccttcc tggttggcgc 60 ccggcgc 67 <210> 347 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 347 Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu 20 25 <210> 348 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 348 aattagcctg ttaaccgaag tggagacgcc gatccgtaac gaatggggct gccgctgtaa 60 tgattcttcc gacgagct 78 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<220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 353 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu 20 25 <210> 354 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 354 catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt ctagatgtaa 60 cgattcaagt gatgagct 78 <210> 355 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 355 catcacttga atcgttacat ctagaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg 60 tcagcagaga 70 <210> 356 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 356 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu 20 25 <210> 357 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 357 catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt gcagatcgaa 60 cgattcaagt gatgagct 78 <210> 358 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 358 catcacttga atcgttcgat ctgcaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg 60 tcagcagaga 70 <210> 359 <211> 26 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 359 Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu 20 25 <210> 360 <211> 78 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 360 aatttctctg ttaaccgaag tggagacgcc gattcgtaac gaatggggta gccgctctaa 60 tgatagctct gacgagct 78 <210> 361 <211> 70 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 361 cgtcagagct atcattagag cggctacccc attcgttacg aatcggcgtc tccacttcgg 60 ttaacagaga 70 <210> 362 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 362 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu 20 25 <210> 363 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 363 catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt ctagatcgaa 60 cgattcaagt gatgagct 78 <210> 364 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 364 catcacttga atcgttcgat ctagaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg 60 tcagcagaga 70 <210> 365 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 365 gcgggatccg gagcttatcg a 21 <210> 366 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer containing a restirction site <400> 366 Gly Cys Gly Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Cys Thr Thr 1 5 10 15 Gly Ala Ala Thr Cys Gly Thr Thr 20 <210> 367 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction site <400> 367 gcgctcgaga gcttattgac cgaagttgaa acc 33 <210> 368 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer containing restriction site <400> 368 gcgctgcaga tcacttgaat cgtt 24 <210> 369 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction site <400> 369 gcgctgcagt ctctgctgac cgaag 25 <210> 370 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 370 cgcgacatgt ctctgctgac cg 22 <210> 371 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 371 cgcaagctta aacaacagta gtctccggaa g 31 <210> 372 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 372 gcgaagctta ctaaggggag cggcctcgtc gacgaacaac agtagtctcc gg 52 <210> 373 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 373 gcgaagctta ctaacaaggg gagcggcctc gtcgacgaac aacagtagtc tccgg 55 <210> 374 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 374 gcgaagctta ctaaggcgag ggagtgcgcc gacgagggga gcggcctcg 49 <210> 375 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 375 gcgaagctta ctaacaaggc gagggagtgc gccgacgagg ggagcggcct cg 52 <210> 376 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 376 gcgaagctta ctacggcgat tgagagcgtc gacggcgagg cgagggagt 49 <210> 377 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 377 gcgaagctta ctaacacggc gattgagagc gtcgacggcg aggcgaggga gt 52 <210> 378 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protein sequence <400> 436 Ile Leu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His 1 5 10 15 Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala 20 25 30 Ile Ile Glu Leu 35 <210> 437 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> primer protein sequence <400> 437 Ile Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp 1 5 10 15 Thr Ser Thr Asn Gly Ile Glu Leu 20 <210> 438 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> protein primer sequence <400> 438 Ile Val Tyr Gln His Ser His Gly Glu Asp Arg Pro Gly Glu Leu 1 5 10 15 <210> 439 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> protein primer sequence <400> 439 Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu 20 25 <210> 440 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 440 ccatggacat cgacccttat cgcaatttgg agctactgtg gag 43 <210> 441 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 441 ctccacagta gctccaaatt cgcgataagg gtcgatgtcc atgg 44 <210> 442 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 442 cactaatatg ggcctaaggt tcaggcaact cttgtgg 37 <210> 443 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 443 ccacaagagt tgcctgaacc ttaggcccat attagtg 37 <210> 444 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 444 gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg c 41 <210> 445 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 445 gcagtatggt gaggtgaaga atgctcagga gactctaagg c 41 <210> 446 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 446 ggcaactctt gtggtttcac atttcttgtc tcattttgga agag 44 <210> 447 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 447 ctcttccaaa agtgagagaa gaaatgtgaa accacaagag ttgcc 45 <210> 448 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 448 cctgggtggg tgttaatttg aaagaagatc cagcgtctag ag 42 <210> 449 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 449 ctctagacgc tggatcttct ttcaaattaa cacccaccca gg 42 <210> 450 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> peptide conjugate sequence <400> 450 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 451 <211> 20 <212> PRT <213> Yersinia pestis <400> 451 Gly Asp Ile Pro Tyr Leu Gly Ala Leu Phe Arg Arg Lys Ser Glu Leu 1 5 10 15 Thr Arg Arg Thr 20 <210> 452 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza <400> 452 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 453 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza <400> 453 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 454 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza <400> 454 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 455 <211> 23 <212> PRT <213> Inlfuenza <400> 455 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20

Claims (46)

  1. 길이가 600개 이하의 아미노산 잔기인 재조합 키메라 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 단백질 분자로서,
    (A) 서열번호 1의 HBc 서열의 잔기 위치 4 내지 75 및 잔기 위치 85 내지 140의 HBc 서열을 포함하는, 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단 163개 아미노산 잔기 중의 135개 내지 163개 아미노산 잔기의 HBc 서열을 함유하고,
    이때 서열번호 1의 HBc 서열의 잔기 위치 48 및 107에서의 시스테인 잔기 하나 또는 둘 다가 글루타민, 아스파라긴, 세린, 알라닌, 트레오닌 및 리신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 잔기로 대체되고, 서열번호 1의 HBc 서열의 잔기 위치 61의 시스테인은 존재하며;
    (B) 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단, 서열번호 1의 HBc 서열의 C-말단, 또는 서열번호 1의 HBc 서열의 잔기 위치 76 내지 85 사이 중의 하나 이상의 곳에 펩티드-결합된 이종 아미노산 잔기 서열을 임의로 함유하는데,
    이때 상기 N-말단 또는 C-말단에 펩티드-결합된 이종 아미노산 잔기 서열은 B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프이고, 서열번호 1의 HBc 서열의 잔기 위치 76 내지 85 사이에 위치하는 이종 아미노산 잔기 서열은 (1) B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프 또는 (2) 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판 및 발린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 화학적 비-반응성 잔기 또는 (3) 리신, 글루탐산, 아스파르트산, 티로신 및 시스테인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 화학적 반응성 링커 잔기이며,
    이때 (i) 서열번호 1의 HBc 서열의 잔기 위치 76 내지 85 사이의 0개 내지 모든 잔기가 존재하거나,
    (ii) 서열번호 1의 HBc 서열의 잔기 위치 76 및 82의 루이신 및 아르기닌 잔기가 둘다 시스테인 잔기로 대체되고, B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프에 펩티드 결합되거나, 또는
    (iii) 서열번호 1의 HBc 서열의 잔기 위치 76 내지 85에서의 HBc의 서열이 결실물 및 부가물 없이 존재하며;
    (C) (1) (a) 서열번호 1의 HBc 서열의 잔기 위치 -29 내지 +1의 잔기들을 함유하지 않으면서, 서열번호 1의 HBc 서열의 잔기 위치 -20 내지 +1에 상응하는 키메라 분자의 아미노산 위치에서의 1 내지 3개의 시스테인 잔기, 및
    (b) 서열번호 1의 HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 당해 키메라 분자의 C-말단 쪽으로, 서열번호 1의 HBc 서열의 C-말단으로부터 30개 잔기 이내에 1 내지 3개의 시스테인 잔기
    중의 하나 또는 둘 모두를 함유하고;
    (2) 서열번호 1의 HBc 서열의 잔기 위치 2 내지 15 및 잔기 위치 24 내지 50 중의 1 내지 9 곳에서 보존적 아미노산으로 치환된 아미노산 잔기를 함유하고;
    (D) 발현 후, 실질적으로 핵산과 결합하지 않는 입자로 자가-어셈블리되는,
    재조합 키메라 B형 간염 바이러스 코어 단백질 분자.
  2. 제1항에 있어서, N-말단 서열이, 서열번호 1의 HBc 서열의 잔기 위치 2-4 중의 하나와 펩티드 결합된 B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 포함하는 재조합 키메라 B형 간염 바이러스 코어 단백질 분자.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 HBc 서열의 잔기 위치 76 내지 85에서의 HBc 서열이 결실물 및 부가물 없이 존재하는 재조합 키메라 B형 간염 바이러스 코어 단백질 분자.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 HBc 서열의 잔기 위치 76 내지 85의 서열 중의 0개 내지 모든 잔기가 존재하고, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판 및 발린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 화학적 비-반응성 잔기 또는 리신, 글루탐산, 아스파르트산, 티로신 및 시스테인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 화학적 반응성 링커 잔기, 또는 B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프에 펩티드 결합되는 재조합 키메라 B형 간염 바이러스 코어 단백질 분자.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, C-말단 서열이, 서열번호 1의 HBc 서열의 C-말단 잔기에 결합된 B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 함유하는 재조합 키메라 B형 간염 바이러스 코어 단백질 분자.
  7. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 HBc 서열의 잔기 위치 76 및 82의 루이신 및 아르기닌 잔기 둘다가 시스테인 잔기로 대체되는 재조합 키메라 B형 간염 바이러스 코어 단백질 분자.
  8. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단 156개 아미노산 잔기 중의 135개 내지 156개 아미노산 잔기의 HBc 서열을 함유하는 재조합 키메라 B형 간염 바이러스 코어 단백질 분자.
  9. 제1항에 있어서, 길이가 380개 이하의 아미노산 잔기인 재조합 키메라 B형 간염 바이러스 코어 단백질 분자.
  10. 삭제
  11. 삭제
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