CN1838967B - 稳定的免疫原性HBc嵌合体颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嵌合的、羧基末端截短的乙型肝炎病毒核壳(核心)蛋白(HBc)，该HBc经工程改造后，自组装颗粒的稳定性增强了，且基本上缺乏核酸结合能力。该嵌合蛋白分子可包括一个或多个通过肽键结合在HBc的N-末端、免疫原性环或C-末端三处中的一处或几处的免疫原性表位。增强的自组装颗粒稳定性是通过使至少一个异源半胱氨酸残基靠近上述嵌合体分子的氨基末端和/或羧基末端，和使存在于天然序列中HBc 48和107号位的半胱氨酸缺失而得以获得。

Description

稳定的免疫原性HBc嵌合体颗粒
相关申请对照
本申请根据权利要求从2002年12月10日提交的序号为60/432,123的临时申请中受益，且本申请是2002年10月21日提交的序号为10/274,616的申请的部分延续，同样是2002年2月21日提交的序号为10/080,299和10/082,014的申请的部分延续。
技术领域
本发明涉及免疫学和蛋白质工程领域的交叉部分，尤其涉及可作为免疫原应用在疫苗中的嵌合乙型肝炎病毒(HBV)核壳蛋白(HBc)，该HBc含有C末端半胱氨酸残基和/或N末端半胱氨酸残基，且存在于天然序列中HBc 48和107号位的两个半胱氨酸残基或其中之一被取代了。
发明背景
嗜肝DNA病毒科是具有被膜、含DNA的动物病毒，可导致人类的乙型肝炎(HBV)。嗜肝DNA病毒科包括其它哺乳动物的乙型肝炎病毒，例如旱獭(WHV)和地松鼠(GSHV)，和出现在鸭(DHV)和灰苍鹭(HeHV)中的禽病毒。本文所说的乙型肝炎病毒(HBV)指嗜肝DNA病毒科中感染哺乳动物的一个成员，相对于感染禽类宿主的病毒，除非相关论述提及是特定的非哺乳动物病毒实例。
根据病毒亚型，哺乳动物乙型肝炎病毒(HBV或嗜肝DNA病毒)的核壳或核心含有由183或185个氨基酸残基构成的序列，而鸭病毒衣壳含有262个氨基酸残基。若干种嗜肝DNA病毒的乙型肝炎核心蛋白单体可在受感染细胞中自组装成被称为乙型肝炎核心蛋白颗粒(HBc颗粒)的稳定聚集体。业已报导了HBc颗粒的两种三维结构。第一种结构包括含有二聚体形式的90个拷贝的HBc亚基蛋白或180个独立单体蛋白的小群体，第二种结构包括含有二聚体形式的120个拷贝的HBc亚基蛋白或240个独立单体蛋白的大群体。这些颗粒分别被称为T＝3或T＝4颗粒，其中“T”为三角划分数。这些人感染性病毒(人病毒)的HBc颗粒的直径分别为大约30或34nm。Pumpens et al.(1995)Intervirology，38：63-74；和Metzger et al.(1998)J.Gen.Viol.，79：587-590。
Conway et al.，(1997)Nature，386：91-94描述了分辩率为9埃的人HBc颗粒的结构。Bottcher et al.(1997)，Nature，386：88-91描述了人HBc单体的多肽折叠，并提供了对形成了α螺旋区及其连接环区的氨基酸残基进行大致计数的方法。Zheng et al.(1992)，J.Biol.Chem.，267(13)：9422-9429根据他们对缺乏一个或多个半胱氨酸的突变体蛋白的研究和其他人利用C-末端截短的蛋白质所进行的研究[Birnbaum et al.，(1990)J.Virol.64：3319-3330]报导的是核心颗粒形成不取决于富含精氨酸的C-末端结构域、核酸的结合或二硫键的形成。
业已公开的是乙型肝炎核壳或病毒核心蛋白(HBc)是一种免疫原性载体部分，可刺激免疫宿主动物的T细胞反应。例如，参见U.S.Patent No.4,818,527、No.4,882,145和No.5,143,726。这种载体尤为有用的应用是其在免疫优势环的特定位点呈递外源或异源B细胞表位的能力，该特定位点位于从该蛋白的氨基末端(N-末端)开始计算大约70-90号位的残基位置上，更常见的是被认为位于大约75-85号位。参见Clarke et al.(1991)在F.Brown等人编辑的Vaccines91，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork中第313-318页中发表的论文。
在病毒复制期间，HBV核壳与病毒RNA前基因组、病毒逆转录酶(Pol)和末端蛋白(来源于Pol)结合，形成复制感受态核心。核壳与病毒RNA前基因组的结合是由羧基末端(C-末端)富含精氨酸的结构域介导的。当在缺乏病毒RNA前基因组的大肠杆菌等异源表达系统中表达时，鱼精蛋白样C-末端，即150-183号位的残基可结合大肠杆菌RNA。Zhang et al.(1992)JBC，267(13)：9422-9429。
HBcAg是来源于乙型肝炎病毒的颗粒蛋白，已被提议作为异源表位的载体应用。业已比较了HBsAg(HBs)和HBcAg(HBc)二者的相对免疫原性，以及二者在不同的遗传背景中诱发免疫反应的能力[Milichet al.，Science，(1986)234(4782)：1398-1401]。这些资料着重于HBc具有的比HBs高的免疫原性，以及HBc的通用反应性，而没有考虑遗传背景。
例如，在BALB/c小鼠体内，HBc的免疫原性比HBs高300倍以上；虽然B10.S和B10.M小鼠均是HBs的无反应者，但被测试的各品系均对HBc具有反应性。这些结果再次强调了HBc作为疫苗载体的适用性，具体而言，是其对HBs的优势，因此选择了HBc，而不是HBs，用于负载异源表位。
HBc载体的另一个优势在于其发挥效能时可能无需有效佐剂的事实。这是该颗粒固有的高免疫原性造成的。对HBc-贝氏疟原虫颗粒的免疫原性所作的比较显示，被批准用于人类的明矾比IFA或CFA更有效[Schodel et al.，J.Exp.Med.，(1994)180(3)：p.1037-46]。该观测结果的重要性因为最近在SKB候选疟疾疫苗的临床实验中被注意到的与更新、更复杂佐剂相关的毒性难题而得以突出[Stoute et al.，N.Engl.J.Med.，[1997]336(2)：p.86-91]。
在作为疫苗载体部分的应用中，优选的是HBV核壳不结合宿主来源的核酸。Birnbaum et al.(1990)J.Virol.，64：3319-3330指出HBV核壳的鱼精蛋白样C-末端结构域可以缺失，而不影响该蛋白组装成病毒样颗粒的能力。因此，有报导指出，被截短至大约144号位，即含有从1到大约144号位的HBc序列的蛋白质可以自组装，而发生在139号位残基之外的缺失将破坏衣壳组装[Birnbaum et al.，(1990)J.Virl.，64：3319-3330；Seifer et al.，(1995)Intervirology，38：47-62]。
Zlotnick et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，94：9556-9561研究了全长和被截短的HBc蛋白组装成颗粒的情况。除讨论全长分子外，上述作者还报导了截短蛋白的制备，该截短蛋白具有1-149号位的HBc序列，其中48、61和107号位的半胱氨酸均被丙氨酸取代，且C-末端(150号位)添加了一个半胱氨酸残基。C-末端硫醇被用于连接金原子团，以便在电子显微镜术中进行标记。
最近，Metzger et al.(1998)J.Gen.Viol.，79：587-590报导，人病毒序列138号位的脯氨酸(Pro-138或P138)是颗粒形成所必需的。这些作者还报导，羧基末端被截短至142和140个残基长度的颗粒的组装能力受到了影响，当被截短至139和137个残基长度时，组装能力完全丧失。
若干个研究小组已指出，与标准乙型肝炎核心颗粒相比，截短的颗粒表现为稳定性降低了[Galena et al.(1989)J.Virol.，63：4645-4652；Inada，et al.(1989)Virus Res.，14：27-48]，体现在颗粒尺寸的变化和纯化制剂中存在的颗粒片段[Maassen et al.，(1994)Arch.Virol.，135：131-142]。因此，在上述Metzger等人的报导之前，Pumpens et al.，(1995)，Intervirology，38：63-74已对相关文献报导进行了综述，指出自组装所必需的HBc序列的羧基末端边界位于139和144号位的氨基酸残基之间，且前2或3个氨基末端残基可被其它序列取代，但剔除4或11个氨基末端残基将导致嵌合蛋白在转化的大肠杆菌细胞中完全消失。
具有多种多肽序列的内在插入片段的重组生产的杂合HBc颗粒(在本领域中被称为HBc嵌合颗粒或HBc嵌合体)，是通过在广泛多种生物，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、牛痘、鼠伤寒沙门氏菌、酿酒酵母中的异源表达而制备的，例如，参见Pumpens et al.(1995)Intervirology，38：63-74，及其引用文献，其中指出了若干个研究小组的工作。
通过电子显微镜术分析时发现，与缺乏异源表位的颗粒相比，这种HBc嵌合体通常表现为具有较差的有序结构[Schodel et al.，(1994)J.Exp.Med.，180：1037-1046]。在某些情况中，将异源表位插入C-末端截短的HBc颗粒具有显著的失稳效应，使杂合颗粒不能在异源表达后被回收[Schodel et al.，(1994)Infect.Immunol.，62：1669-1676]。因此，许多嵌合HBc颗粒的不稳定使它们在纯化期间崩解至无法回收的程度，或者表现出非常差的稳定性特征，从而难以用于疫苗开发。
上述Pumpens等人在(1995)Intervirology，38：63-74的报导中列举了颗粒形成嵌合体，其中，所插入的多肽序列位于N-末端、C-末端和两个末端之间。该文献报导的插入片段长度为：在N-末端为24-50个残基，在内部为7-43个残基，在C-末端为11-741个残基。
最近，Kratz et al.，(1999)Proc Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，96：1915-1920描述了一种嵌合HBc颗粒的大肠杆菌表达，该颗粒包括在内部与238个残基的绿色荧光蛋白(GFP)融合的截短的HBc序列。该嵌合体含有被插入的GFP序列，其侧翼是一对取代了HBc的79和80号位氨基酸残基的富含甘氨酸的柔性接头臂。据说这种颗粒可在宿主动物兔体内有效地诱导抗天然GFP的抗体。
U.S.Patent No.5,990,085描述了由抗原性牛抑制素肽分别融合在(i)78和79号位残基之间的免疫优势环中，和(ii)羧基末端被截短的HBc的144号位残基之后所形成的两种融合蛋白。据说所表达的融合蛋白被施用给宿主动物后可诱导抗抑制素抗体的产生。据其专利报导，免疫接种后30天的效价相对较低，具有环插入片段的融合蛋白的效价为1∶3000-15,000，而插入片段位于144号位残基后的融合蛋白的效价为1∶100-125。
U.S.Patent No.6,231,864公开了一种与半抗原相连的策略性改良乙型肝炎核心蛋白的制备和用途。该改良核心蛋白含有长度为1到大约40个残基的插入片段，而该插入片段含有与半抗原悬垂连接的化学反应性氨基酸残基。
据最近公开的WO 01/27281描述，对HBc的免疫反应可分别通过天然分子中含C末端半胱氨酸序列的存在或缺乏，从Th1反应转变为Th2反应。其公开内容也认为C末端半胱氨酸形成二硫化物有助于使颗粒稳定。据说，在紧接C末端半胱氨酸上游的天然HBc序列中，若干残基的存在是优选的，但并非必需。一种可被用于取代截短的C末端HBc序列的可选序列被认为包括了C末端半胱氨酸和确定了特定表位的任选序列，该特定表位来源于除HBc以外的蛋白质。
已出版的PCT申请WO 01/98333描述了位于天然HBc C末端的一个或多个含4个精氨酸的重复的缺失，却保留了C末端半胱氨酸残基。该申请还描述，缺失区可被取代为来源于除HBc以外的蛋白质的表位，从而使所形成分子的HBc部分担当了被添加表位的载体。
据本发明的一位发明者已出版的PCT申请WO 02/13765A2和WO02/14478A2所公开的，C末端截短的HBc颗粒的稳定化可通过利用可组装成颗粒的嵌合体蛋白中一个或多个添加的半胱氨酸残基而实现。这些添加的半胱氨酸残基被描述为位于或靠近所述嵌合蛋白的C末端。
可保留全长HBc颗粒的稳定性，并同时消除全长HBc颗粒的核酸结合能力的结构特征将非常有助于利用嗜肝DNA病毒核壳送递系统进行的疫苗研制。实际上，Ulrich等人最近在对利用HBc嵌合体作为外源表位载体的综述中[Adv.Virus Res.，50：141-182(1998)Academic Press]指出，将这些嵌合体应用在人类疫苗中需要解决三个可能的问题。第一个可能是嵌合体疫苗中的核酸意外转移到已免疫的宿主中。第二个可能是已有免疫性对HBc的干扰。第三个可能涉及对完整嵌合体颗粒的可重复制备的需要，该颗粒还可经受长期保存。
上述四份已出版的PCT申请似乎包括可用于克服Ulrich等人所公开的可能问题的内容。正如下文所公开的，本发明提供了另一种可出乎意料地产生高效价抗体的HBc嵌合体，并在一个方面中，还提供了解决HBc嵌合体稳定性以及该构建体基本上缺乏核酸结合能力方面的问题的方法。此外，考虑了一种重组嵌合体，该嵌合体对已有的抗HBc抗体表现了最低的抗原性，如果有的话。
上述对颗粒不稳定性的发现涉及N末端截短的HBc嵌合体分子，尽管Neirynck et al.，(October 1999)Nature Med.，5(10)：1157-1163报导颗粒形成发生在HBc嵌合体的大肠杆菌表达过程中，其中的HBc嵌合体具有流感M2蛋白N末端含24个残基的部分，而该流感M2蛋白与全长HBc的融合位于5号位残基。应指出的是，HBc的4号位残基与M2序列的24号位残基一致，因此也可认为这些研究者缺失了1-3号位残基。
具有截短C末端的杂合HBc蛋白在疫苗应用中的上述用途使该杂合HBc蛋白具有了超越它们的全长对应物的若干优势，包括提高的表达水平和所结合大肠杆菌RNA的缺乏。不过，经工程改造后可展示异源表位的C末端截短的颗粒通常不稳定，使颗粒无法在表达后形成稳定的颗粒性结构，或者容易在纯化期间和/或之后解离成非颗粒性结构。这种稳定性的缺乏是由特定颗粒表现的，该颗粒由C末端被截短至149号HBc位的嵌合HBc分子组成，还含有被插入在免疫原性环70-80号残基位的残基。
据其他人的报导，在野生型嗜肝DNA病毒核心抗原中，HBcAg起始密码子上游的半胱氨酸残基直接参与阻止了颗粒形成[Schodel et al.(Jan.15，1993)J.Biol.Chem.，268(2)：1332-1337；Wasenaueret al.，(Mar.1993)J.Virol.，67(3)：1315-1322和Nassal et al.(Jul.1993)J.Virol.，67(7)：4307-4315]。这三个研究小组均报导，在野生型HBeAg中，位于前核心序列-7号位的半胱氨酸残基负责阻止了颗粒形成，从而有利于从颗粒性HbcAg转变为分泌型、非颗粒性HbeAg，其中的前核心序列是核心基因从-30号位的上游起始子蛋氨酸开始翻译时存在的序列。
Bachmann与合作者[Jegerlehner et al.，(2002)Vaccine，20：3104-3112]对与上文Neirynck等人所描述构建体基本一致的融合构建体和一种偶联构建体进行了比较，该偶联构建体与本发明者之一的U.S No.6,231,864所公开的构建体类似，其中流感A M2蛋白外部的23号位残基借助于接头与经过工程改造进入了C末端截短HBc(1-149)的环中的赖氨酸残基偶联。在该偶联物中，HBc 79和80号环位的残基(脯氨酸和丙氨酸)被一个五肽所取代，该五肽在赖氨酸残基两侧各含两个甘氨酸。Bachmann等人公开的嵌合体在48和107号位还具有被丝氨酸残基取代的半胱氨酸残基。作者公开的免疫接种后的结果表明，上述偶联构建体的抗M2效价和存活(6/6对比0/3)均比N末端融合蛋白高。
据说，上述嵌合体蛋白可形成颗粒，并能够与多肽或蛋白质半抗原相连。由大肠杆菌表达的该颗粒是通过凝胶过滤和羟磷灰石柱纯化的。该颗粒的正确组装被认为可通过利用溴化乙锭或考马斯蓝染色使琼脂糖凝胶电泳中出现单一条带而得以证实。不过，对所提供图象的观察似乎显示，与天然HBc颗粒相比，改良HBc嵌合体对应了至少2个条带。文献所示的各SDS-PAGE凝胶均在还原条件下进行，因此，与组装的颗粒和单体相比，只有被取代和未被取代的嵌合体单体可见。
正如下文所公开的，本发明提供了解决HBc嵌合体稳定性以及该构建体基本上缺乏核酸结合能力方面的问题的方法，同时提供了有效的免疫原性材料。
发明概述
本发明考虑了一种用于疫苗或接种物的免疫原，该免疫原由重组工程改造的嗜肝DNA病毒核壳蛋白，即乙型肝炎核心(HBc)嵌合蛋白[在此文中也被称为重组嵌合体HBc蛋白分子、嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子、HBc嵌合体分子或简单地称之为嵌合体]组成，该嵌合蛋白被宿主细胞表达后，可自组装成颗粒。与末端通常位于大约183号残基位的天然核心分子相比，考虑的嵌合体分子可至少在C末端被截短。
考虑的重组嵌合体乙型肝炎核心(HBc)蛋白分子具有长达大约600个氨基酸残基的长度。该嵌合体含有(a)一个HBc序列，该序列具有HBc分子N末端183个氨基酸残基，优选的是N-末端163个氨基酸残基，或者更优选的是N末端156个氨基酸残基，和最优选的是该HBc分子N末端149个氨基酸残基中的至少大约125个氨基酸残基，包括从4到大约75号残基位和从大约85到大约140号残基位的HBc序列，其中48和107号位的两个半胱氨酸残基或其中之一被取代为另一种残基。
考虑的嵌合体分子还包括(b)下述两种残基或其中之一，即(i)在一个不同于HBc前核心序列的序列中的1-3个位于嵌合体分子中特定氨基酸位置上的半胱氨酸残基，该特定氨基酸位置对应SEQ ID NO：1所示HBc序列N末端开始的-20到大约+1号氨基酸位置[N-末端半胱氨酸残基]，以及(ii)从HBc序列C末端残基到该分子C末端的1-3个半胱氨酸残基，且这几个残基在所述嵌合体分子C末端开始的大约30个残基内[C末端半胱氨酸残基]。
该嵌合体分子在HBc序列中可含有多达大约20％被取代的氨基酸残基，并自组装成颗粒，该颗粒被宿主细胞表达时，优选地基本上不能结合核酸，从而正如下文所论述的，该颗粒优选地在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)pH7.4中，280nm与260nm波长的吸光度比例为0.9到大约1.7，更优选的是大约1.2到大约1.7。在pH6.8、20mM磷酸钠缓冲液中37℃保存1个月后，该颗粒典型地比由除了在48和107号位均含有半胱氨酸残基之外，其它均相同的HBc嵌合体分子所形成的颗粒更稳定，并且典型地比在HBc 48和107号位均含有半胱氨酸的颗粒的表达产量高。
此外，该嵌合体可任选地在其N末端、HBc免疫优势环(即大约76到大约85号残基位之间)或C末端三处中的一处或几处含有肽键结合的异源氨基酸残基序列。N末端序列任选地包括含有多达大约75个氨基酸残基的异源序列，这些残基通过肽键结合了HBc 2-4号位中的一个残基，而该异源序列包括免疫原性表位。HBc免疫优势环序列可包括下述情况，即(i)76-85号位的HBc序列中的0到全部残基均存在或被取代，并通过肽键结合了1到大约245个氨基酸残基，这些残基异源于HBc环并构成免疫原、抗-抗原或用于偶联半抗原的化学反应性接头残基，其中的偶联半抗原存在于一个含有多达大约40个残基的序列中，或(ii)76-85号位的HBc序列存在并不具有缺失和异源残基，或(iii)76-85号位的一个或多个残基缺失或被取代。所述C末端序列可含有多达大约100个氨基酸残基，这些残基包括特定序列中的免疫原性表位，该序列与从HBc 183号位，或优选地从HBc 165号位到C末端的HBc序列异源，更优选地与从156号位到C末端的HBc序列异源，最优选地与从149号位到C末端的HBc序列异源。
更优选的是，考虑的嵌合体包括长度长达大约380个氨基酸残基的重组HBc蛋白分子。该嵌合体含有
(a)一个HBc序列，该序列含有HBc分子N末端163个氨基酸残基，或更优选的N末端156个氨基酸残基，最优选的N末端149个氨基酸残基中的至少大约125个，优选至少大约135个氨基酸残基，包括从4到大约75号残基位和从大约85到大约140号残基位的HBc序列，其中48和107号位的一个或优选的两个半胱氨酸残基被取代为另一种残基，诸如丝氨酸。嵌合体任选地包括下述一种或多种情况：(i)在该嵌合体N末端、HBc免疫优势环和C末端三处中的一处或几处含有肽键结合的免疫原性序列，该序列含有多达大约75个残基，其中C末端序列与从163号位，优选156号位到天然HBc C末端的HBc序列不同，(ii)76-85号位的序列中的0到全部残基均存在或被取代，并通过肽键结合了0到大约75个氨基酸残基，优选的是结合了1到大约45个氨基酸残基，这些残基异源于HBc并构成免疫原、抗-抗原或用于偶联半抗原的化学反应性接头残基，其中的偶联半抗原优选地存在于含有1到大约40个氨基酸残基的序列中。
此外，考虑的嵌合体分子含有(b)1-3个半胱氨酸残基，存在于(i)一个不同于HBc前核心序列的序列中，位于该嵌合体分子中的特定氨基酸位置上，该特定氨基酸位置对应在从SEQ ID NO：1所示HBc序列N末端开始的-20到大约+1号位置[N末端半胱氨酸残基]，或者位于(ii)从HBc序列C末端残基到该分子C末端，并在从所述嵌合体分子C末端开始的大约30个残基内[C末端半胱氨酸残基]，或者位于(i)和(ii)两处。
这种考虑的嵌合体分子
(c)在HBc序列中含有多达大约20％被取代的氨基酸残基，且
(d)被宿主细胞表达时可自组装成颗粒，正如下文所论述的，在收集、纯化和溶解后，该颗粒在280nm和260nm波长的吸光度比例为0.9到大约1.7，更优选的是大约1.2到大约1.7。
在pH6.8、20mM磷酸钠缓冲液中37℃保存1个月后，上述自组装颗粒典型地比由除了在48和107号位均含有半胱氨酸残基之外，其它均相同的HBc嵌合体分子所形成的颗粒更稳定。因此，缺失48和107号残基位上的1个，或更优选的2个半胱氨酸，可使通过其它方法，即使N-和/或C-末端半胱氨酸存在而得以稳定化的颗粒的保存稳定性增强。取代上述两个半胱氨酸或其中之一也可提高所述嵌合体分子颗粒的表达。
另一种实施方案考虑了一种长度为大约135到大约365个氨基酸残基的重组乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白嵌合体分子，且该嵌合体分子从N末端开始含有4个肽键连接的氨基酸残基序列结构域，这些结构域被命名为结构域I、II、III和IV。
该嵌合体分子的结构域I含有大约72到大约150个氨基酸残基，其序列包括：
(i)至少包括4-75号位残基的HBc序列，
(ii)48号位的半胱氨酸残基被替代(取代)为其它残基，诸如丝氨酸，
(iii)在一个不同于HBc前核心序列的序列中含有0-3个位于嵌合体分子中特定氨基酸位置上的半胱氨酸残基，该特定氨基酸位置对应在从SEQ ID NO：1所示HBc序列的N末端开始的-20到大约+1号氨基酸位置[N末端半胱氨酸残基]，和
(iv)含有多达大约75个氨基酸残基的任选免疫原性表位序列，这些氨基酸残基通过肽键结合了HBc 2-4号位中的一个残基。
该嵌合体分子的结构域II包括多达大约85个氨基酸残基，这些残基通过肽键结合了结构域I中大约HBc 75号位的残基，其中
(i)从大约76到大约85号位的HBc序列中的0到全部残基均存在或被取代，并通过肽键结合了1到大约75个异源于HBc环并构成免疫原的氨基酸残基，或者结合了含有1到大约40个氨基酸残基的序列，这些残基构成抗-抗原或用于偶联半抗原的化学反应性接头残基，或者
(ii)从大约76到大约85号位的HBc序列存在并不具有缺失或添加的异源残基。
嵌合体结构域III是从大约86到大约135号位的HBc序列，该序列通过肽键结合了结构域II中大约85号位的残基，其中107号位的半胱氨酸被取代为另一个残基。
嵌合体分子结构域IV包括：
(i)从大约136到大约163号位，优选地到大约156号位，最优选地到大约149号位的HBc氨基酸残基序列中的5-30个残基，这些残基通过肽键结合了结构域III中的135号位残基，
(ii)在从嵌合体分子C末端开始的大约30个残基内含有0-3个半胱氨酸残基[C末端半胱氨酸残基]，和
(iii)特定序列中的0到大约75个氨基酸残基，该序列与存在于HBc中从163号位，优选地从156号位，更优选地从149号位到C末端的序列不同。所述嵌合体分子中从HBc 150号位到该嵌合体分子C末端的序列含有少于大约10个的精氨酸、赖氨酸残基或这两种残基的混合。
该优选嵌合体分子(i)在该嵌合体的HBc序列中，具有一个氨基酸残基序列，其中多达大约10％的氨基酸残基被取代了，(ii)具有至少一个半胱氨酸残基是选自上述结构域I和IV中的0-3个半胱氨酸残基，且(iii)被宿主细胞表达时可自组装成颗粒。所形成的颗粒优选地基本上不能结合核酸，并在pH6.8、20mM磷酸钠缓冲液中37℃保存1个月后，优选地比除了48和107号位均含有半胱氨酸残基之外，其它均相同的HBc嵌合体分子所形成的颗粒更稳定。
一般而言，在所有考虑的嵌合体分子中，位于48和107号位的HBc半胱氨酸残基通常被取代为其它残基，诸如丝氨酸，且所有考虑的嵌合体分子均含有至少一个并非HBc序列天然具有的N-或C-末端半胱氨酸残基。因此，在某些实施方案中，优选的是结构域I的HBc序列仅包括4-75号位的残基，外加至少一个N末端半胱氨酸残基。在其它实施方案中，优选的是考虑的嵌合体分子不仅含有N末端半胱氨酸残基，在结构域IV中还含有一个半胱氨酸残基，如上所指出的，该半胱氨酸是单独的，即被单独添加进HBc序列或在另一个氨基酸残基序列内。在另一种实施方案中，优选的嵌合体分子仅含有一个或多个C-末端半胱氨酸残基，且结构域I不含诸如图1所示序列的天然HBc序列中不存在的半胱氨酸残基，以及48号位的HBc半胱氨酸残基。HBc半胱氨酸残基位于图1所示HBc序列中的大约61号位。
考虑的疫苗或接种物包括溶解或分散在药学可接受溶剂组合物中的免疫反应诱导量的上述自组装嵌合体分子颗粒，该药学可接受溶剂组合物典型地还包括水。在考虑的嵌合体分子中，存在于结构域I、II和IV三处中的一处或几处的尤其优选的非HBc表位是来源于疟疾CS蛋白的免疫原性序列、来源于流感A M2蛋白氨基末端24个残基的序列、来源于乙型肝炎表面蛋白(HBs)preS1或preS2区的序列，或被公开在Thornton等人的U.S.Patent No.5,124,726(及其亲本专利No.4,882,145)中的其它来源于HBc的T细胞激发序列，诸如从大约85到大约100号位的序列或从大约93到大约100号位的较窄范围的序列。尤其优选的接头残基为赖氨酸残基。
本发明具有若干好处和优势。
本发明一个特别的好处在于，优选的嵌合体颗粒免疫原典型地在制备过程中表现的稳定性比除了在48和/或107号位含有被取代的半胱氨酸残基之外，其它均相同的HBc嵌合体颗粒高，同时基本上不能结合核酸。
本发明的一项优势在于，由48和107号位含有除半胱氨酸之外的其它残基的嵌合体形成的颗粒比48和107号位均含有半胱氨酸的嵌合体蛋白所组装的颗粒能够更快速地形成含二硫化物的颗粒。
本发明的另一个好处在于所述重组免疫原是利用众所周知的细胞培养技术制备的，并且易于制备。
本发明的另一项优势在于所述免疫原易于利用众所周知的重组体技术制备。
本发明进一步的好处在于，所述颗粒与48和107号位均包括半胱氨酸的类似嵌合体分子相比，表达提高了。
本发明进一步的优势在于，表达的颗粒比48和107号位均含有半胱氨酸的颗粒更易于被表征，诸如用于质量保证用途的表征。
通过下述公开内容，本领域普通技术人员可了解其它进一步的好处和优势。
附图简述
在构成本公开内容一部分的附图中
图1通过图1A和图1B两幅图，提供了6种病毒来源哺乳动物HBc蛋白的6个公开序列的排列。第一个人病毒序列(SEQ ID NO：1)属于ayw亚型，被公开在Galibert et al.，(1983)Nature，281：646-650中；第二个人病毒序列(SEQ ID NO：2)属于adw亚型，被公开在Ono et al.(1983)Nucleic Acids Res.，11(6)：1747-1757中；第三个人病毒序列(SEQ ID NO：3)属于adw2亚型，被公开在Valenzuela et al.，Animal Virus Genetics，Field et al.eds.，Academic Press，New York(1980)第57-70页中；第四个人病毒序列(SEQ ID NO：4)属于adyw亚型，被公开在Pasek et al.(1979)Nature，282：575-579中；第五个序列(SEQ ID NO：5)属于旱獭病毒，被公开在Galibert et al.(1982)J.Virol.，41：51-65中；第六个哺乳动物序列(SEQ ID NO：6)属于地松鼠病毒，被公开在Seeger et al.，(1984)J.Virol.，51：367-375中。
图2所示为在制备此处用于获得重组体HBc嵌合体的质粒载体pKK223-3N的过程中，对商品质粒载体pKK223-3的修饰。修饰序列(SEQID NO：7)位于商业可提供载体的序列(SEQ ID NO：8)下方。添加的NcoI位点的碱基如小写字体所示，所添加的碱基如双下划线所示，而缺失碱基则如虚线所示。该图指出了存在于所示序列片段中的两个限制性位点(NcoI和HindIII)。
图3通过图3A、3B和3C三幅图示意性地显示了优选克隆方法，其中疟疾B细胞表位，诸如(NANP)4(SEQ ID NO：9)被克隆进位于工程改造HBc基因78和79号位之间的EcoRI和SacI位点中，破坏了EcoRI位点，而保留了SacI位点，其中工程改造HBc基因中48号位的半胱氨酸残基被取代为丝氨酸残基[图3A，HBc1-78(48S)]。图3B所示为编码了诸如被称为Pf/CS-UTC的T细胞表位和终止密码子(SEQID NO：10)的DNA，该T细胞表位和终止密码子被克隆进了工程改造的、截短HBc基因C末端上的EcoRI和HindIII位点中，其中工程改造的、截短HBc基因编码了79-149号位的HBc残基，且107号位的半胱氨酸残基被取代为丝氨酸残基[HBc 79-149(107S)+PF/CS-UTC]。利用具有靠近始于79号位残基的HBc编码序列的5′-末端SacI限制位点的引物，对图3B所示构建体进行PCR扩增，采用SacI消化扩增的序列，并与图3A所示构建体反应，随后如图3C所示连接合适的部分，形成一种单基因构建体，该构建体编码了含有用于抗恶性疟原虫疫苗的免疫原表位的B细胞-和T细胞。
图4为图4A-4H八幅图，是37℃温育后第0天(4A、4C、4E和4G)和第14天(4B、4D、4F和4H)，分别与被称为HBc 149、HBc149(C48S/C107S)、HBc149+C和HBc149(C48S/C107S)+C对应的分析性尺寸排阻层析洗脱图。组装颗粒在7ml洗脱体积时洗脱，而较低级结构在随后的峰中洗脱。样品被混入pH6.8、20mM的磷酸钠和0.02％叠氮化钠中，纵坐标所示为280nm波长的吸光度，单位为毫吸光度(mAu)，横坐标所示为以毫升(mL)为单位的体积。
图5选自U.S.Patent No.6,231,864，图解了一个反应式(反应式1)，所示为两个反应序列(I)利用硫代-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(硫代-SMCC)，形成了可将半抗原悬垂连接至嵌合乙型肝炎核心蛋白(sm-HBc)颗粒的活化载体，并随后(II)将巯基封端(半胱氨酸封端)的半抗原连接至该活化载体，形成偶联颗粒。sm-HBc颗粒如方框所示，具有单悬垂氨基基团(为使该图清晰)，而巯基封端的半抗原则如以SH基团为末端的直线所示。
定义
结合HBc嵌合体应用的编号指出了在SEQ ID NO：1所示HBc ayw氨基酸残基序列中的位置，在该序列的这些位置上添加或缺失了一个或多个残基，与是否存在对氨基酸残基序列的添加或缺失无关。因此，HBc149指嵌合体末端为149号残基，而HBc149+C150指相同嵌合体在相对于SEQ ID NO：1的序列编号而言的HBc 150号位含有一个半胱氨酸残基。
术语“抗体”指被称为免疫球蛋白的糖基化蛋白家族成员的分子，该分子可特异性结合抗原。
术语“抗原”曾被用于命名被抗体或受体结合的实体，还被用于命名可诱导抗体生成的实体。更普遍的用法将抗原的含义局限为被抗体或受体结合的实体，而术语“免疫原”被用于指可诱导抗体生成或与受体结合的实体。其中，本文论述的实体同时具有免疫原性和抗原性，根据其预期的用途典型地将其称为免疫原或抗原。
“抗原决定簇”指抗原的实际结构部分，可与抗体结合位点或T细胞受体发生免疫结合。该术语还可与“表位”互换使用。因此，抗原决定簇是可刺激抗体生成或T细胞活化的结构，且该结构的存在可通过测定哪个结构被抗体结合或诱导了T细胞活化而得以确定。
本文所用术语“偶联物”指通过氨基酸残基侧链被可操纵地连接至载体蛋白的半抗原。
本文所用术语“保守性取代”指一种氨基酸残基被另一种在生物学上相似的残基所取代。保守性取代的实例包括以诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的疏水性残基取代另一种残基，或者以一种极性残基取代另一种残基，如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酸与天冬氨酸之间或谷氨酰胺与天冬酰胺之间的取代等。考虑“保守性取代”时还包括其中源于一个哺乳动物HBc序列的残基，诸如图1中所示的那些氨基酸残基被用于取代另一个哺乳动物HBc序列中相同位置上的残基的情况。
相对于肽序列应用的多种语法形式的术语“相当”指所述肽序列的氨基-和/或羧基-末端添加或减少了多达大约3个氨基酸残基，并仅含保守性取代，尤其是沿所述多肽序列排列的氨基酸残基。
本文所用术语“结构域”指重组HBc嵌合分子的一部分，它是通过(i)Galibert et al.，(1979)Nature，281：646-650(SEQ ID NO：1)所报导的方法，根据HBcAg亚型ayw的位置编号进行的残基位编号而确定的。至少嵌合体结构域I、II和III的多肽部分被认为是以与天然存在的HBcAg的相应序列类似的三级形态存在的。
本文所用术语“融合蛋白”指含有至少两个被发现在自然界不能正常连接在一起的氨基酸残基序列的多肽，这两个序列是通过它们各自的羧基-和氨基-末端氨基酸残基之间的肽键，尾对尾(头对尾)地被操作性地连接在一起。本发明的融合蛋白是HBc嵌合体分子，可诱导抗体生成，该抗体可与在氨基酸残基序列中相当于所述融合蛋白的多肽部分的多肽发生免疫反应。
本文所用术语“乙型肝炎”的最广泛含义指上文所论述的哺乳动物嗜肝DNA病毒科的任何成员。
术语“多肽”和“肽”在本说明书通篇中均可互换使用，指通过相邻氨基酸的α-氨基与羧基基团之间的肽键一个接一个地连接在一起而形成的线型系列的氨基酸残基。中性(不带电)形态或盐形态的多肽可具有多种长度。本领域充分理解的是氨基酸残基序列含有酸性和碱性基团，以及当所述肽为溶液形式时，所表现的特定电离状态取决于周围介质的pH值，或者当该肽为固态时，则取决于获得该电离状态的来源，即介质的电离状态。因此，“多肽”或其等同术语被确定为包括被参照的合适氨基酸残基序列。本文所示的肽或多肽始终从左到右，方向为从氨基-末端(N-末端)到羧基-末端(C-末端)。
术语“残基”可与习语氨基酸残基互换使用。本文确定的所有氨基酸残基均为天然或L构型。与标准多肽命名一致，[J.Biol.Chem.，243：3557-59(1969)]，氨基酸残基的缩写如下对应表所示。
发明详述
本发明考虑了一种免疫原性HBc蛋白，包括该蛋白的稳定免疫原性颗粒，以及包括该稳定颗粒的疫苗或接种物。相对于C-末端通常位于图1所示天然ayw亚型的183号残基位上的天然核心分子而言，考虑的嵌合体分子优选地至少在C-末端被截短了。含有考虑嵌合体分子的颗粒是通过取代存在于天然HBc蛋白(图1)中48和107号残基位上的两个半胱氨酸残基或其中之一，和通过使添加的半胱氨酸残基位于或靠近C-和/或N-末端而得以稳定化。如下所述，这种颗粒优选地基本上不能结合核酸。
更具体而言，考虑的嵌合体分子具有长达大约600个肽键结合的α-氨基酸残基，更优选的是长达大约380个残基，最优选的是长达大约200个残基的长度。这种考虑嵌合体分子含有N-末端183个氨基酸残基，优选HBc的163个氨基酸残基，更优选的是N-末端156个氨基酸残基，最优选的是N-末端149个氨基酸残基中的至少大约125个，更优选的是至少大约135个氨基酸残基。所含的HBc序列包括从4到大约75号位残基和从大约85到大约140号位的HBc序列，其中48和107号位的一个或优选的两个半胱氨酸残基被取代为另一种残基。
考虑的嵌合体分子还包括下述两种情况或其中之一，即(a)在一个不同于HBc前核心序列的序列中含有1-3个位于该嵌合体分子中特定氨基酸位置上的半胱氨酸残基，该特定氨基酸位置对应在从SEQ IDNO：1所示HBc序列N末端开始的-20到大约+1号氨基酸位置[N末端半胱氨酸残基]，以及(b)从HBc序列C末端残基到该分子C末端含有1到大约3个半胱氨酸残基，这些残基在从该嵌合体分子C末端开始的大约30个残基内[C末端半胱氨酸残基]。该嵌合体分子(i)在HBc序列中含有多达大约20％被取代的氨基酸残基，并(ii)可自组装成颗粒，该颗粒被宿主细胞表达时，优选地基本上不能结合核酸。
如下所述，所形成的颗粒在pH7.4的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中，表现的280nm与260nm波长的吸光度比例为0.9到大约1.7，而且通过该颗粒在pH7.4的磷酸盐缓冲盐溶液中，更优选地表现出280nm与260nm波长的吸光度比例为大约1.2到大约1.7，证实了该颗粒基本上不具有核酸结合能力。所形成的颗粒典型和优选地在pH6.8、20mM磷酸钠缓冲液中37℃保存1个月后，比除了在48和107号位均含有半胱氨酸残基之外，其它均相同的HBc嵌合体分子所形成的颗粒更稳定(在分离后)。此外，该嵌合体任选地在其N-末端、HBc免疫优势环(即在大约76到大约85号位残基之间；可简称为HBc环或仅称之为环)或C-末端三处中的一处或几处含有肽键结合的异源氨基酸残基序列。位于该分子N末端的异源序列可具有长达大约75个氨基酸残基的长度，而位于该分子C-末端的异源序列可具有长达大约100个氨基酸残基的长度。当异源序列位于该分子的N-末端或C-末端时，通常含有B细胞和/或T细胞免疫原性表位，并优选地含有多达大约75个氨基酸残基。存在于HBc环中的异源序列可含有如下所述具有多达大约245个氨基酸残基的序列。
所述HBc免疫优势环序列可包括下述情况，即(i)从大约76到大约85号位的HBc序列中的0到全部残基均存在或被取代，并通过肽键结合了1到大约245个氨基酸残基，这些残基异源于HBc环并构成含表位的免疫原、抗-抗原或用于特定偶联半抗原的化学反应性接头残基，该特定偶联半抗原存在于一个含有多达大约40个残基的序列中，或(ii)从大约76到大约85号位的HBc序列存在并不含缺失和异源残基，或(iii)76-85号位中的一个或多个残基缺失或被取代。
因此，含有多达大约40个残基，包括用于偶联半抗原的接头残基在内的异源氨基酸残基序列与抗-抗原性残基或序列一样，也可存在于HBc环中。该抗-抗原性残基或序列，或含有用于偶联半抗原的化学反应性接头残基的残基或序列均优选地含有1到大约40个氨基酸残基，更优选地含有1到大约5个残基，最优选地仅含单个残基。存在于HBc环中并含有异源表位的免疫原序列优选地含有多达大约75个残基，更优选的是多达大约50个残基，最优选的是多达大约25个残基，如上所述，几乎可以包括多达大约245个残基。
本文所用术语“抗-抗原”意指破坏了特定序列的抗原性，即破坏了该序列被抗体结合的能力的残基或序列。因此，抗-抗原可存在于免疫原性环中，且当存在时，该残基或序列可破坏抗体与该环的结合。这些抗体可以是单克隆或多克隆抗体，而单克隆抗体，诸如被指定为3105的单克隆抗体可通过商业渠道获得自Institute of ImmunologyCo.，Ltd.，Tokyl，Japan。这种单克隆抗体被认为结合在了HBc免疫原性环尖端的氨基酸残基上。用于偶联半抗原的化学反应性接头残基可作为抗-抗原发挥破坏抗体与HBc免疫原性环结合的功能。不过，为方便起见，抗-抗原性残基或序列在本文中应被认为是缺乏了诸如赖氨酸或半胱氨酸的化学反应性残基，并可发挥抗-抗原功能的残基或序列。
在另一种实施方案中，HBc 76和82号位的亮氨酸和精氨酸残基均被取代为半胱氨酸残基，而从大约76到大约85号位的HBc序列中的0到全部剩余残基均存在，并通过肽键结合了一个任选存在的序列，该序列含有1到大约245个氨基酸残基，这些残基构成异源免疫原、抗-抗原性序列或用于特定偶联半抗原的化学反应性接头残基，该特定偶联半抗原存在于一个含有多达大约40个氨基酸残基的序列中。
该考虑的免疫原性颗粒可由重组乙型肝炎核心(HBc)嵌合蛋白分子组成，且该嵌合蛋白分子的长度长达大约600个氨基酸残基。这些嵌合蛋白分子(a)具有一个HBc序列，该序列含有N-末端183个氨基酸残基，优选该HBc分子的163个氨基酸残基，更优选的是N-末端156个残基，最优选的是N-末端149个残基中的至少大约125个残基，更优选的是至少大约135个残基，包括从4到大约75号残基位和从大约85到大约140号残基位的HBc序列，其中48和107号位的一个和优选的两个半胱氨酸残基被取代为其它残基，诸如丝氨酸。除丝氨酸外，考虑的对HBc 48和107号位的半胱氨酸的其它取代还包括不同于半胱氨酸的任何残基，尤其包括谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸和赖氨酸。
如上所述，该HBc嵌合体分子序列任选地包括(a′)位于该嵌合体N-末端、HBc免疫优势环和C-末端三处中的一处或几处的肽键结合的异源氨基酸序列，该序列含有免疫原性序列，或(b′)存在于HBc免疫优势环中的异源插入序列，具有1到大约40个氨基酸残基的长度，并含有用于偶联半抗原的化学反应性接头残基，或(c′)76-85号位的HBc序列中的0到全部残基。
该嵌合蛋白分子还包括下述两种情况或其中之一，即(a′)在一个不同于HBc前核心序列的序列中含有1-3个位于嵌合体分子中特定氨基酸位置上的半胱氨酸残基，该氨基酸位置对应在从SEQ ID NO：1所示HBc序列N末端开始的-20到大约+1号氨基酸位置[N-末端半胱氨酸残基]，和(b′)从HBc序列C末端残基到嵌合体分子C末端含有1到大约3个半胱氨酸残基，这些半胱氨酸残基在从该嵌合体分子C末端开始的大约30个残基内[C末端半胱氨酸残基]。
嵌合蛋白分子在HBc序列中含有多达大约20％被取代的氨基酸残基，并可自组装成颗粒，该颗粒在被宿主细胞表达时，优选地基本上不能结合核酸(如下所述，表现的280nm与260nm波长的吸光度比例为大约0.9到大约1.7，更优选的是大约1.2到大约1.7)。在pH6.8、20mM磷酸钠缓冲液中37℃保存1个月后，该颗粒典型和优选地比由除了在48和107号位均含有半胱氨酸残基之外，其它均相同的HBc嵌合体分子所形成的颗粒更稳定。该增强的稳定性可通过比较在分析性尺寸排阻层析中观测的峰面积，或通过比较非还原性SDS凝胶条带的尺寸或蛋白质密度而得以确定。
因此，嵌合蛋白可展示位于N-末端、HBc免疫原性(免疫优势)环或C-末端的一个或多个免疫原性表位，或用于该免疫原性环中的B细胞或T细胞表位的接头，或者含有从大约76到大约85号位中的0到全部残基。在一种实施方案中，该嵌合蛋白含有一个或多个可进一步赋予自组装颗粒以增强的形成稳定性的N-末端半胱氨酸残基。在另一种实施方案中，该嵌合蛋白含有一个或多个也可进一步赋予自组装颗粒以增强的形成稳定性的C-末端半胱氨酸残基。考虑的嵌合蛋白分子还可含有位于或靠近N-和C-末端的半胱氨酸残基，即如上文所定义的，嵌合蛋白分子可同时含有N-末端半胱氨酸残基和C-末端半胱氨酸残基。
考虑的嵌合蛋白可含有从HBc 150到183号位的残基，但优选地在(从)HBc 149号位残基下游(到羧基末端)基本上不含精氨酸和/或赖氨酸残基，从而使自组装颗粒基本上不能结合核酸。在某些实施方案中，从149到大约163号位，包括两个富精氨酸重复序列的HBc序列是存在的(参见图1)。在另一些实施方案中，从149到大约156号位，包括一个富精氨酸序列的HBc序列是存在的。在另一些实施方案中，C-末端HBc序列终止于HBc 140和149号位之间，且嵌合体分子不具有存在于图1所示天然HBc序列的从150号位到C-末端中的精氨酸重复序列，或者具有包含了取代一个或多个精氨酸残基的赖氨酸残基的类似序列。核酸结合能力的基本缺乏将在下文论述，是易于确定的。
为便于论述，本文考虑的嵌和体序列和涉及的序列位置编号是基于SEQ ID NO：1所示ayw亚型的人类乙型肝炎核心蛋白的序列和位置编号[Galibert et al.，(1979)Nature，281：646-650]。但应当理解的是，考虑到本领域技术人员所熟知的哺乳动物嗜肝DNA病毒核壳蛋白序列之间极高的相似度，以及这些蛋白表现的相似的颗粒形成，有关人类HBc亚型ayw的论述也可应用于亚型adw，以及旱獭和地松鼠蛋白。正因为上述的极高相似度，如无另外指明，本文通常将HBc序列描述为“HBc”序列。
在另一种实施方案中，考虑的HBc嵌合体具有长达大约380个残基的长度，并含有
(a)包括HBc分子N-末端163个氨基酸残基，更优选的是N-末端156个氨基酸残基，最优选的是N-末端149个氨基酸残基中的至少大约125个残基，更优选的是至少大约135个残基的HBc序列，包括从4到大约75号残基位和从大约85到大约140号位的HBc序列，其中48和107号位的一个和优选的两个半胱氨酸残基均被取代为另一种残基，诸如丝氨酸，如上所述。
该嵌合蛋白分子还包括下述两种情况或其中之一，即(a′)在一个不同于HBc前核心序列的序列中含有1-3个位于嵌合体分子中特定氨基酸位置上的半胱氨酸残基，该氨基酸位置对应在从SEQ ID NO：1所示HBc序列N末端开始的-20到大约+1号氨基酸位置[N-末端半胱氨酸残基]，和(b′)从HBc序列C末端残基到嵌合体分子C末端含有1到大约3个半胱氨酸残基，这些半胱氨酸残基在从该嵌合体分子C末端开始的大约30个残基内[C末端半胱氨酸残基]。
上述嵌合体分子在HBc序列中含有多达大约20％被取代的氨基酸残基，并可自组装成颗粒，该颗粒被宿主细胞表达时基本上不能结合核酸。在pH6.8、20mM磷酸钠缓冲液中37℃保存1个月后，该颗粒优选地比由除了在48和107号位均含有半胱氨酸残基之外，其它均相同的HBc嵌合体分子所形成的颗粒更稳定。考虑的嵌合体分子也优选地表现了提高一定程度的表达。
上述实施方案的嵌合蛋白任选地如上所述，在嵌合体的N-末端、HBc免疫优势环(即位于从大约76到大约85号位残基之间)或C-末端三处中的一处或几处含有肽键结合的异源氨基酸残基序列。所述HBc免疫原性环序列可包括下述情况，即(i)从大约76到大约85号位的HBc序列中的0到全部残基均存在或被取代，并通过肽键结合了1到大约245个氨基酸残基，优选的是1到大约75个氨基酸残基，这些残基异源于HBc环，并构成免疫原，或者通过肽键结合了含有多达大约40个残基的序列，这些残基则可以构成抗-抗原或用于偶联半抗原的化学反应性接头残基，或者(ii)从大约76到大约85号位的HBc序列存在并不具有缺失和异源残基，或者(iii)从大约76到大约85号位的一个或多个残基缺失或被取代。
正如上文所指出的，考虑的嵌合体分子含有至少一个位于下述一处或两处的半胱氨酸残基，即(i)相对于图1和SEQ ID NO：1所示HBc的N末端，从大约-20到大约+1号位处，或者(ii)从HBc序列C末端残基到嵌合体分子C-末端，并在从嵌合体分子C末端开始的大约30个残基内。负氨基酸位的概念通常与前导序列，诸如HBc的前核心序列有关。同样，这一概念也可应用在本文中，人们可容易地根据SEQID NO：1排列特定嵌合体分子序列，以确定该嵌合体中与HBc+1号位的起始蛋氨酸残基位置对应的位置。由于氨基酸残基序列通常从左至右显示，方向为从N-末端到C-末端，任何被排列在可由HBc起始蛋氨酸占据的位置左侧的嵌合体分子残基均具有负位。考虑的半胱氨酸残基可出现在距离HBc的起始蛋氨酸左侧大约20个残基的位置上，该HBc起始蛋氨酸则被排列在与上述起始蛋氨酸对应的位置上。
在另一个方面中，优选的HBc嵌合体具有由大约135到大约360个L-α-氨基酸残基组成的序列，并含有4个通过肽键系列连接的结构域，即结构域I、II、III和IV。与含有除α-氨基酸以外的残基并因而不能形成肽键的多肽、含有D-氨基酸残基的多肽，或所含两个或多个多肽通过氨基酸侧链被操作性地连接在一起的寡肽偶联物相比，这4个结构域是以与上述嵌合体和天然蛋白相同的方式被连接在一起，即它们通过肽键彼此相连。因此，考虑的嵌合HBc蛋白可通过利用重组体技术的常用方法进行表达而得以制备。
上述嵌合体分子的结构域I含有大约72到大约160个氨基酸残基，其序列包括：(i)至少包括从4到大约75号位的HBc残基序列，(ii)在一个不同于HBc前核心序列的序列中含有0-3个位于嵌合体分子中特定氨基酸位置上的半胱氨酸残基，该特定氨基酸位置对应在从SEQ ID NO：1所述HBc序列N末端开始的-20到大约+1号氨基酸位，优选的是-14到大约+1号氨基酸位置[N-末端半胱氨酸残基]，和(iii)含有多达大约75个氨基酸残基的任选序列，这些残基通过肽键结合了2-4号位的一个HBc残基，该序列包括免疫原性表位(免疫原)。该免疫原性序列存在时，典型地是被用于诱导B细胞免疫反应的表位。
所述嵌合体分子的结构域II含有多达大约60个氨基酸残基，这些残基通过肽键结合了结构域I中大约75号位的HBc残基，其中
(i)从大约76到大约85号位的HBc序列中的0到全部残基均存在或被取代，并通过肽键结合了1到大约50个异源于HBc并构成免疫原的氨基酸残基，或者结合了含有1到大约40个氨基酸残基的序列，这些残基构成抗-抗原或包括了用于偶联半抗原的化学反应性接头残基。
或者(ii)从大约76到大约85号位的HBc序列存在并不具有异源残基。
从大约76到大约85号位的HBc序列中的0-所有残基出现在上述嵌合体或其它嵌合体中，并通过肽键与异源于HBc的1到大约50个氨基酸残基结合的情况中，这些残基均被缺失，且大约75号位的HBc残基直接结合了异源序列的N-末端残基，该异源序列的C-末端残基则通过肽键结合了位于大约HBc 86号位的残基。大约HBc 76-85号位的所有残基均缺失的情况并非优选，优选的是存在源于该序列的至少4个残基，最优选的是存在全部10个残基或它们的取代物。
在一种优选实施方案中，含有76-85号位10个残基的序列(76-85序列)存在，但被免疫原的1到大约50个残基，或含抗-抗原或接头的序列的1到大约40个残基所间断。在另一种实施方案中，HBc76-85号位的10-聚体序列在HBc76和82号位具有两处取代半胱氨酸残基，并且包括一个含有多达50个残基并可如上所述被间断的断续序列。
结构域III是从大约86到大约135号位的HBc序列，该序列通过肽键结合了结构域II的85号位残基。
嵌合体分子结构域IV包括：
(i)从136到大约149号位的HBc氨基酸残基序列中的5-14个残基，且该序列通过肽键结合了结构域III的135号位残基；
(ii)在从所述嵌合体分子C末端开始的大约30个残基内的0-3个半胱氨酸残基[C末端半胱氨酸残基]，和
(iii)免疫原性序列中的0到大约75个氨基酸残基不存在于从大约HBc 150号位到C-末端的HBc序列中。
从大约HBc 136到大约163号位的序列可存在于结构域IV中，但优选的是嵌合体的HBc部分终止于156号序列位。优选地，结构域IV在一个不存在于上述HBc位置上的序列中含有由0到大约50个氨基酸残基构成的序列，更优选的是该序列含有0到大约25个残基。因此，不存在于从大约163到183号位的区域中，并且源于HBc的其它序列的用途是被考虑用于结构域IV。一种这样的序列是从HBc 85到100或93到100号位的T细胞表位。结构域IV也优选地在位于或靠近所述分子C末端处含有一个半胱氨酸残基。
所述嵌合体分子(i)在HBc序列中具有一个氨基酸残基序列，其中多达大约10％的氨基酸残基被取代，并(ii)可在被宿主细胞表达时自组装成颗粒。该颗粒基本上不能结合核酸，并在pH6.8、20mM磷酸钠缓冲液中37℃保存1个月后，优选地比除了48和107号位均含有半胱氨酸残基之外，其它均相同的HBc嵌合体分子所形成的颗粒更稳定。
在一个方面中，考虑的嵌合体分子含有一个序列，该序列包括在N末端通过肽键结合了2-4号位的一个HBc残基的表位。在另一个方面中，考虑的嵌合体分子具有含免疫原、抗-抗原或接头残基的序列，该序列通过肽键结合在靠近该分子中部，即位于免疫优势环中HBc 76和85号位残基之间。在进一步的方面中，含免疫原的序列位于嵌合体分子的C-末端部分，通过肽键结合了HBc 136-149号位中的一个残基，或140-156号位中的一个残基，或140-163号位中的一个残基。
在另一些方面中，上述位置存在含2或3个免疫原的序列，或者是含1或2个免疫原的序列与用于表位的接头残基一起存在。多个免疫原可同样位于2或3个位置上，或者特定免疫原的二聚体或三聚体可出现在1个或多个位置中。所述的每一种嵌合体分子还可如上所述，含有N-末端和/或C-末端半胱氨酸残基。上述免疫原、嵌合体分子及其自组装颗粒的若干特异性实例如下文所述。
一种优选的HBc嵌合体分子可含有大约130到大约355个氨基酸残基，含有用于取代48和/或107号位的半胱氨酸残基的取代残基，并且添加了至少一个并不存在于天然存在的HBc分子中的N-或C-末端稳定化半胱氨酸残基。在一些优选的实施方案中，出现了4号位HBc残基，而2-4号位残基则出现在其它优选实施方案中，因此，结构域I可始于4、3或2号位HBc残基，并延续至75号位残基，即位于HBc 75号位的HBc残基。1号位残基为蛋氨酸，是DNA起始密码子的氨基酸。嵌合体含有N-末端免疫原性序列或半胱氨酸残基时，优选的是通常位于HBc 1号位的天然蛋氨酸被缺失，从而使编码DNA或RNA中仅存一个起始信号。
结构域I还可在一个不同于HBc前核心序列的序列中含有0-3个位于所述嵌合体分子中特定氨基酸位置上的半胱氨酸残基，该特定氨基酸位置对应在从SEQ ID NO：1所示HBc序列N末端开始的-20到大约+1号位，优选的是-14到大约+1号氨基酸位置[N-末端半胱氨酸残基]。
可存在于结构域I或结构域II的免疫优势环中的异源免疫原性免疫原优选地含有大约15到大约50个残基，但短至大约6个氨基酸残基的表位也可诱导抗体和被抗体识别，并因而有用，且大约75-聚体的序列也可位于结构域I的N末端。
优选的是结构域II中从76到85号位的全部HBc残基均存在，但被一个或多个其它残基所间断。结构域II优选地含有至少4个残基，该结构域可具有任何不干扰表达或应用的序列，但这些残基均优选地属于75-85号位残基之间的序列。在一种实施方案中，76和82号环位上的残基经过突变，并被取代为半胱氨酸残基，从而可以实现对该免疫优势环的进一步稳定化。
结构域III含有86-135号位的HBc残基，这些残基通过肽键结合了85号位残基。
结构域IV具有含至少5个残基的序列，包括(i)HBc 136-140号位，或到163号位，优选地到156号位，更优选地到149号位的残基序列，该序列通过肽键结合了135号位残基，(ii)0-3个半胱氨酸残基，和(iii)任选地可具有含多达大约75个残基的免疫原性表位序列，尤其是当HBc序列终止于140号位残基时，但含有少至大约25个残基的较短序列是最优选的。
所述结构域IV免疫原性序列优选地与从大约163号位到HBc C-末端的HBc序列异源。当该免疫原性序列存在于结构域IV中时，优选地是T细胞表位，但也可以是通常存在于结构域I或II中的B细胞表位。下表A和B提供了源于HBc序列、HBs的preS1和preS2区域及其它来源的代表性B细胞和T细胞表位。
结构域IV还可含有0-3个半胱氨酸残基，这些Cys残基均存在于所述嵌合体分子羧基末端(C-末端)的大约30个残基内。优选的是存在一个半胱氨酸(Cys)残基，且该Cys优选地以羧基-末端(C-末端)残基形式存在，除非T细胞表位是作为结构域IV的一部分而存在。当该T细胞表位存在时，优选的Cys优选地在HBc嵌合体C末端的最后5个残基中。
在一种实施方案中，尤其优选的嵌合体含有两个免疫原性表位序列。这两个免疫原性表位序列存在于结构域I和II，或II和IV，或I和IV中。在某些实施方案中，这两个免疫原性表位序列之一优选地是B细胞表位。在另一些实施方案中，这两个免疫原性表位序列之一优选地是T细胞表位。更优选的是这两个免疫原性表位是不同的B细胞和T细胞表位。此外，多个B细胞表位可位于一个B细胞表位位置上，同样多个T细胞表位也可位于一个T细胞表位位置上。
在所述嵌合体分子的结构域II中含有免疫原性表位序列的实施方案中，优选的是该序列含有一个或多个B细胞表位，和76和85号位氨基酸残基之间的HBc序列存在，但被所述免疫原性序列间断，以及所述嵌合体进一步在结构域IV中包括一个或多个通过肽键结合了HBc140-156号位中的一个残基的T细胞表位。
相同优选适用于具有下述特点的嵌合体分子，即该嵌合体分子的结构域II中存在用于偶联表位的异源接头残基，从而在结构域II中提供了一个或多个免疫原性表位，还存在76和85号位残基，但被该异源接头残基所间断，以及存在一个通过肽键结合了HBc 140-156号位中的一个残基的T细胞表位。在这种嵌合体分子形成的颗粒中，偶联表位与C-末端肽键结合的T细胞表位的比例典型地为大约1∶4到1∶1，通常为大约1∶2的比例。
在上述嵌合体分子的直观结构中，用于偶联表位的异源接头残基存在于结构域II中，T细胞表位存在于结构域IV中，且结构域II中不存在额外的B细胞表位。这种嵌合体表现了T细胞表位的免疫原性，而在如下所述的ELISA实验中，通过结合抗-环单克隆抗体进行测定时，则表现了最低程度的HBc抗原性。
优选的考虑HBc嵌合体分子具有含大约135到大约360个残基的序列。可含有1或2个优选长度均为大约15到大约75个残基的免疫原性表位，且优选HBc部分的长度为大约140到大约156个残基的优选HBc嵌合体分子具有长度为大约170到大约280个氨基酸残基的序列。含有1或2个免疫原性表位的尤其优选的嵌合体分子具有大约190到大约225个残基的长度。无添加免疫原性表位的尤其优选的嵌合体分子可具有大约140到大约156个残基的长度。应当理解的是，大范围的嵌合体分子长度是根据N-和C-末端HBc部分长度的变化，以及若干可被插入免疫原性环中的预期表位的不同长度而考虑的。
考虑的重组蛋白被宿主细胞表达后，可自组装形成基本上不能结合核酸的颗粒。考虑的HBc嵌合体颗粒通常为球形，且对特定制剂而言，大小通常是均匀的。因此，这些嵌合颗粒与具有相似形态和尺寸的天然HBc颗粒相似，并可从受感染人的体内回收。
考虑的嵌合体颗粒包括上述嵌合体分子。更广泛而言，这种嵌合体颗粒包括具有特定序列的嵌合型C-末端截短的HBc蛋白，该特定序列含有N-末端163个残基中的至少大约125，优选至少大约135个残基，该嵌合体颗粒还含有(i)通过肽键结合在N-末端、C-末端或免疫优势环三处中的一处或多处的免疫原性表位，或用于所述免疫优势环中存在的表位的异源接头残基，和(ii)1-3个位于上述N-末端和/或C-末端的半胱氨酸残基，以及至少包括从135号位开始含5个HBc残基的序列。
如下所述，考虑的颗粒优选地在结构域IV中充分缺乏精氨酸和/或赖氨酸残基，从而使自组装颗粒基本上不具有核酸结合能力，并表现出大约0.9到大约1.7，更优选地为大约1.2到大约1.7的280/260吸光度比例。因此，优选的嵌合蛋白不含位于163和183号位之间的HBc序列，更优选的嵌合体蛋白不含位于156和183号位之间的HBc序列。尤其优选的HBc嵌合体分子从HBc 149号位到嵌合体分子C末端，合有少于9个的精氨酸和赖氨酸残基及它们的混合。
由考虑颗粒表现的核酸结合能力的基本缺乏可通过比较水溶液中的颗粒在280和260nm波长所测定的吸光度，即280/260吸光度比例而得以快速确定。该考虑颗粒基本上不能结合核酸，即属于最初存在于生物细胞中，被用于表达蛋白质的寡聚和/或多聚DNA和RNA种类的核酸。这种核酸表现为具有260nm波长下的吸光度和280nm波长下相对低的吸光度，而诸如考虑嵌合体的蛋白质在260nm波长下的吸收相对较低，在280nm波长下则具有较高的吸光度。
因此，在本领域有时被称为鱼精蛋白区的150-183(或150-185)号残基位上含有富精氨酸和赖氨酸序列的重组表达的全长HBc颗粒或嵌合HBc颗粒表现的280nm波长下的吸光度与260nm波长下的吸光度的比例(280/260吸光度比例)约为0.8。包括直到163号位的HBc序列的颗粒所表现的280/260比例为大约0.9到大约1.0，且溴化乙锭进行核酸染色的结果为阳性。
另一方面，在结构域IV中充分不含精氨酸和赖氨酸残基，从而使自组装颗粒基本上不具有核酸结合能力的颗粒，诸如不含天然存在的HBc中的富精氨酸核酸结合区的颗粒，正如那些含有少于3个彼此相邻的精氨酸或赖氨酸残基或它们的混合的颗粒，或那些具有末端位于大约HBc 140到149号位残基的天然或嵌合序列的颗粒，表现的280/260吸光度比例为大约1.2到大约1.7。更典型的280/260吸光度比例为大约1.4到大约1.7。该范围在很大程度上是存在于特定嵌合HBc颗粒的结构域II和IV中的芳香族氨基酸数量造成的。
上述N-末端和/或C-末端半胱氨酸残基的存在使嵌合体分子形成稳定免疫原性颗粒的能力增强了(如下所述)。此外，在N-和/或C-末端半胱氨酸残基提供了所形成颗粒稳定性的基础上，对48和/或107号位的天然半胱氨酸的取代使该稳定性增强了。因此，通过分析性尺寸排阻层析的测定，并根据非还原性SDS-PAGE的分析，发现考虑的HBc嵌合体颗粒免疫原倾向于在收集和初步纯化后形成可聚集在一起的颗粒，具体方法参见下文的论述。
考虑的颗粒典型和优选地在pH6.8、20mM磷酸钠缓冲液中37℃保存1个月后，比由除了在48和107号位均含有半胱氨酸残基之外，其它均相同的HBc嵌合体分子所形成的颗粒更稳定。下述实例更具体地论述了增强的稳定性实例。
优选考虑的嵌合HBc蛋白的结构域I构成了始于至少4号位氨基酸残基，直至75号位的HBc氨基酸残基序列，结构域III则构成了86-135号位的HBc序列。这些结构域包括至少一个取代，即存在于图1所示天然序列中48和/或107号位的半胱氨酸残基被取代为另一种残基。来源自任意哺乳动物嗜肝DNA病毒的序列均可被用于结构域I或III，来源自2种或多种病毒的序列可被应用在一种嵌合体中，但对所述48和107号位的两个半胱氨酸残基或其中之一的取代与被采用的序列有关。优选地，为便于构建，将人ayw序列应用于所有嵌合体。
据报导，具有特定结构域I的HBc嵌合体可导致大肠杆菌细胞中的HBc嵌合体蛋白完全消失，其中的特定结构域I所含的前3个氨基-末端(N-末端)残基存在一个以上的缺失。Pumpens et al.，(1995)Intervirology，38：63-74。另一方面，据最近一项涉及将流感M2蛋白来源的免疫原性23-聚体多肽融合至HBc N-末端序列的研究报导，当天然HBc序列中1-3号位残基被取代时，所获得的融合蛋白可形成颗粒。Neirynck et al.，(October 1999)Nature Med.，5(10)：1157-1163。因此，该领域描述，当所添加的氨基酸序列通过肽键结合了HBc 2-4号位中的一个残基时，颗粒可以形成，而当不存在附加序列，且HBc N末端缺失超过1-3个残基时，颗粒则不能形成。
通过肽键结合了HBc N-末端前5个残基之一的N-末端表位序列可含有单个半胱氨酸残基或由多达大约30个残基构成的序列，包括免疫原性序列。1-3个半胱氨酸残基可位于上述序列中的合适位置上，但典型地靠近所添加序列的C-末端，从而相对于SEQ ID NO：1所示的HBcN-末端，使添加的N-末端半胱氨酸残基位于从大约-20到大约+1号位的位置中，更优选地位于从大约-14到大约+1号位的位置中。典型的序列包括诸如下文所论述并例证的B细胞或T细胞表位(分别如表A和B所示)，来源于上述Neirynck等人公开的流感M2蛋白并包括2个半胱氨酸残基的23-聚体多肽及其含有至少大约6个残基的序列变体，可作为所采用表达系统的产物而以融合蛋白形式出现的其它(异源)蛋白，诸如β-半乳糖苷酶的蛋白序列，或其它乙型肝炎相关序列，诸如来源于PreS1或PreS2区的序列或主要HBsAg免疫原性序列。
结构域II，即环区域具有含0到大约255个氨基酸残基的序列。在这些残基中，有0(无)个和优选的至少4个残基，更优选的是至少8个，最优选的是10个残基构成了从大约76到大约85号位的HBc序列的几个部分，且1到大约245个残基，优选的是1到大约50个残基均异源(外源)于HBc，或者至少不位于HBc中大约76-85号位的位置上，并相当于免疫原性序列，诸如B或T细胞表位、抗-抗原性序列或含有用于连接半抗原的化学反应性残基的序列。
更具体而言，存在于免疫优势环中的异源序列构成(i)含多达大约40个残基的序列，该序列含有用于表位，诸如B细胞或T细胞表位的异源接头残基，或抗-抗原性残基或序列，或者(ii)优选地含有6到大约50个，更优选的是大约15到大约50个，最优选的是大约20到大约30个氨基酸残基的免疫原性B或T细胞表位。这些残基中的一个或多个残基的位置可使它们通过肽键结合在从大约76到85号位的HBc序列中的0或优选的至少4个残基，更优选的是至少8个残基或全部残基之间。免疫原性B细胞表位序列优选地通过肽键结合进HBc序列中，或借助于接头残基被连接在该位置上，B细胞表位的用途将在下文中通过例证而得以论述。
那些优选地存在于所述环(结构域II)中的优选至少4个HBc残基可全部存在于一个序列中，诸如82-85号位的残基序列，或者可以被分开位于异源接头残基的两侧(侧翼)，例如，作为76-77号位残基和84-85号位残基存在，或作为76号位残基和83-85号位残基存在。更优选地，结构域II含有76-85号位的HBc序列中的至少8个残基。最优选地，76-85号位的全部10个残基所构成的序列存在于所述嵌合体中。
被添加至HBc环序列中的1到大约245个残基可异源于HBc序列，或者可相当于特定HBc序列的一个或多个免疫原性部分，其中的特定HBc序列不同于大约76-85号位的HBc序列。因此，这一序列与HBc中插入序列的位置异源。单个添加的异源残基可以是用于上述B细胞表位或抗-抗原的异源接头残基。正如上文所指出的，典型地具有至少6个氨基酸残基长度到大约50个氨基酸残基长度，更优选的是大约15到大约50个残基长度的较长序列存在于一个包括诸如B细胞或T细胞表位的免疫原的序列中，由限制性位点编码的异源残基除外。
下表A列出了具有两方面用途的典型肽B细胞表位，即有助于在考虑嵌合体表达之后与接头残基的连接，和有助于在HBc嵌合体的N-末端、免疫原性环或C-末端三处中的一处或几处的表达，该表还提供了用于获得该序列的基因的常用名，和与已公开表位相关的参考文献或专利引用，以及SEQ ID NO.。
表A
B细胞表位
Figure G2003801096124D00331
Figure G2003801096124D00341
Figure G2003801096124D00351
Figure G2003801096124D00371
Figure G2003801096124D00381
*已公开表位的引用文献由下表B提供。
对SEQ ID NO：44所示的流感A M2多肽序列X1X2X3X4X5X6X7X8TX10X11RX13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24而言：
X1-X8号位的残基均缺失或存在，且当存在时，是天然存在于M2蛋白序列中的残基，分别为蛋氨酸、丝氨酸、亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸或脯氨酸、谷氨酸、缬氨酸和谷氨酸，条件是当一个下标X号位的残基存在时，其它所有具有可达8的较高下标号的下标X号位的残基也存在。
X10号位存在，并为脯氨酸、亮氨酸或组氨酸，
X11号位存在，并为异亮氨酸或苏氨酸，
X13号位存在，并为天冬酰胺或丝氨酸，
X14号位存在，并为谷氨酸或甘氨酸，
X15和X16号位的残基存在或缺失，且当存在时，分别为色氨酸和甘氨酸或谷氨酸，
X17和X19号位的残基存在或缺失，且当存在时，分别为半胱氨酸、丝氨酸或丙氨酸，
X18号位的残基存在或缺失，且当存在时，为精氨酸或赖氨酸，以及
X20-X24号位的残基存在或缺失，且当存在时，为天然存在于M2蛋白序列中的残基，即分别为天冬酰胺或丝氨酸、天冬氨酸或甘氨酸、丝氨酸、丝氨酸和天冬氨酸，条件是当一个下标X号位的残基存在时，其它所有具有低至15的较低下标号的下标X号位的残基也存在。
同样，在上述优选的如SEQ ID NO：39所示的流感A M2序列中：
X1-X8号位的残基均缺失或存在，且当存在时，是天然存在于M2蛋白序列中的残基，即分别为蛋氨酸、丝氨酸、亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、缬氨酸和谷氨酸，条件是当一个下标X号位的残基存在时，其它所有具有高至8的较高下标号的下标X号位的残基也存在。
X15和X16号位的残基存在或缺失，且当存在时，分别为色氨酸和甘氨酸，
X17和X19号位的残基存在或缺失，且当存在时，分别为半胱氨酸、丝氨酸或丙氨酸，
X18号位的残基存在或缺失，且当存在时，为精氨酸，以及
X20-X24号位的残基存在或缺失，且当存在时，为天然存在于M2蛋白序列中的残基，即分别为天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、丝氨酸和天冬氨酸，条件是当一个下标X号位的残基存在时，其它所有具有低至15的较低下标号的下标X号位的残基也存在。
结构域II中位于异源残基或序列两侧的剩余残基均优选HBc76-85号位的残基。因此，在一个例证性的实例中，78-82号位的残基已被取代，结构域II中的嵌合体序列为76-77号位，后接限制位点编码残基、免疫原性(表位)序列、其它的限制位点编码残基，以及84-85号位的HBc序列。通过在78和79号位残基之间的插入而得以制备的嵌含体的典型序列实例是2-78号位的HBc序列，后接限制位点编码残基、免疫原性序列，其它的限制位点编码残基和79-85号位的HBc序列。通过上述和下述例证，无需一一列举，便可了解其它考虑嵌合体的结构域I和II的序列。
业已发现，含有多个甘氨酸残基，并具有大约5到大约9个残基长度的短亲水肽可参与含有特定序列的嵌合颗粒的表达，其中该短亲水肽所含的大约5-9个残基通过肽键结合在该特定序列，即脑膜炎奈瑟氏球菌B细胞表位序列的C-末端。一种有用的短肽是Karpenko etal.，(2000)Amino Acids 18：329-337所公开的短肽，具有SEQ IDNO：169所示的GSGDGEGG序列。
业已指出，用于偶联表位的异源接头通过肽键结合在76和85号位氨基酸残基之间的HBc序列中的某一位置上。对免疫原性表位而言，优选存在76-85号位的HBc残基序列，但该序列被用于偶联表位的异源接头所间断。该嵌合体优选地包括4号位到至少140号位的HBc序列，外加靠近该嵌合体蛋白N-末端或C-末端的半胱氨酸残基。更优选的是，存在2-149号位的HBc序列，但在76和85号位残基之间被用于偶联表位的异源接头所间断，且该嵌合体分子含有C-末端半胱氨酸。
所述用于偶联表位的异源接头最优选赖氨酸(K)残基。谷氨酸或天冬氨酸、酪氨酸和半胱氨酸残基也可被用作接头残基，酪氨酸和半胱氨酸残基也可如此。业已指出，可存在一个以上的接头，诸如含3个赖氨酸的序列，但该用法并非优选，因为该用法将形成异源偶联物，其中被偶联的半抗原与第一个嵌合体中的一个接头结合，并与第二个嵌合分子中的不同接头结合。U.S.Patent No.6,231,864B1公开了含有一个或多个连接残基，但缺乏稳定化N-末端半胱氨酸残基的HBc嵌合体分子。
还被指出的是，存在于考虑HBc嵌合体中并含有免疫原性表位的序列也可借助位于该免疫原性(表位)序列一侧或两侧(侧翼)的“柔性接头臂”与HBc序列残基分离。这是当免疫原性序列长度超过大约30个氨基酸残基时的特定情况。代表性的柔性接头臂序列典型地含有大约4到大约10个甘氨酸残基，这些残基被认为可使插入序列从其它凸环序列向外“凸出”，并进一步地提高该构建体的稳定性。这些柔性接头臂类似于上述与脑膜炎奈瑟氏球菌B细胞表位序列，诸如SEQ IDNO：125所示肽相关的柔性接头臂。Kratz et al.(March 1999)Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，96：1915-1920公开了其它具有代表性的柔性接头臂序列，并通过下列氨基酸残基序列举例说明：
GGGGSGGGGT    SEQ ID NO：170
GGGGSGGGG     SEQ ID NO：171
直接位于下方的序列被应用在所插入的含表位序列的C-末端，而其后的序列则被应用在所插入免疫原性序列的N-或C-末端。
GSGDEGG     SEQ ID NO：172
GGGGSGGG    SEQ ID NO：173
正如之前所指出的，结构域III构成了从86到135号位的HBc序列。因此，可延长上述例证性嵌合体的结构域I和II的序列，使所述的第一种嵌合体具有84-140号位的HBc序列，而所述第二种嵌合体则具有79-140号位的HBc序列。
结构域IV含有一个序列，该序列(i)包括从大约136到140号位，任选地到149号位、156号位或较不优选的163号位，或者甚至到183号位的HBc序列，(ii)含有0到大约3个半胱氨酸(Cys)残基，并(iii)含有特定免疫原性序列中的多达大约75个氨基酸残基，该免疫原性序列优选地与从163号位，更优选地从156号位到C-末端的HBc序列异源，前提是结构域IV含有从136到140号位的HBc序列中的至少5个氨基酸残基。结构域IV免疫原性序列更优选地含有多达大约50个氨基酸残基，最优选地含有多达大约25个残基。因此，该结构域IV序列基本上可以是任意序列，但从大约163号位到C-末端的C-末端HBc序列除外。
结构域IV序列的长度可为5个残基，即136-140号位的残基，直到大约125个氨基酸残基(直到大约HBc 183号位，外加免疫原性序列的大约75个免疫原性残基)，包括共计最多3个半胱氨酸，该长度足够长，可使考虑的嵌合蛋白具有大约135到大约580个残基的总长度。当通过肽键与结构域I和/或I I结合的表位分别含有多达大约30或大约50个残基时，这对所述表位是优选的，包括结构域IV表位在内的嵌合体分子的更优选长度为大约150到大约280个残基。含有2个免疫原性表位的尤其优选的嵌合体分子具有大约190到大约210个残基的长度。所获颗粒的核酸结合能力的缺乏是通过上述方法，测定280/260吸光度比例而得以确定的。
结构域IV序列可包括0-3个Cys残基。当这些Cys残基存在时，优选的是其中的一个或多个Cys在从所述嵌合体分子C末端开始的大约30个残基内，优选地位于该嵌合蛋白分子C-末端，或在从该C-末端开始的大约5个氨基酸残基内。此外，当结构域IV序列中存在一个以上的Cys残基时，这些Cys残基彼此相邻是优选的。
优选的是结构域IV序列包括T细胞表位，用于特定生物的多个相同或不同的T细胞表位或额外的B细胞表位，而考虑的嵌合体将被用作针对该特定生物的免疫原。与表A相似，下表B提供了典型的结构域IV T细胞表位序列，以及例证性的被添加的C-末端半胱氨酸残基，如下划线(C)所示。
表B
T细胞表位
Figure G2003801096124D00431
Figure G2003801096124D00441
*加下划线的C(C)不是来自天然序列
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从4号位到至少140号位残基的HBc氨基酸序列优选地存在于考虑的嵌合体分子和颗粒中。更优选存在的是2-149号位，并直到大约163号位的序列。B细胞表位存在时，优选地位于76和85号位残基之间。通常位于HBc 48和107号位的两个半胱氨酸残基或其中之一均被取代(替代)为另一种残基。如上所述，至少一个单独的半胱氨酸残基位于或靠近结构域I的N-末端，或者位于或靠近C-末端。一个或多个T细胞表位也可以HBc序列的N-末端或C-末端添加的形式存在。考虑的重组HBc嵌合体基本上不能结合核酸。HBc 48和107号位通常存在一个或两个半胱氨酸残基的考虑嵌合体颗粒比不含这些取代的类似颗粒更稳定，即48和107号位均含有半胱氨酸的嵌合体。
考虑的重组HBc嵌合体分子典型地存在并被用作自组装颗粒。这些颗粒由180-240个嵌合体分子(90或120个二聚体对)组成，通常为240个嵌合体分子，这些嵌合体分子在二硫化物还原剂，诸如2-巯基乙醇的存在条件下分散成蛋白质分子，因此，该个体分子被认为是主要通过二硫键在颗粒中结合在一起的。所观测到的增强的稳定性被认为是缺乏了48和107号位的两个半胱氨酸或其中之一所造成的。
这些颗粒与在HBV感染患者体内发现的颗粒类似，但这些颗粒不具有传染性。在被多种真核和原核宿主表达的过程中，这些单个的重组HBc嵌合体分子可组装成颗粒，如果需要，该颗粒可方便地从宿主细胞、营养液中收获并被纯化。
正如上文所指出的，HBc免疫优势环通常被认为位于从完整蛋白的氨基末端(N-末端)开始的大约75到大约85号位。将结构域II中含免疫原性表位的序列插入上述免疫优势环序列中。该插入可基本消除HBc环序列的HBc免疫原性和抗原性，同时在已组装嵌合体颗粒中具有极高免疫原性的位置中呈递了免疫原性序列或接头残基。
除了上述N-和C-平截、多种表位和间隔基的插入之外，考虑的嵌合体分子还可含有出现在构成HBc结构域I、II、III和IV的氨基酸残基中的保守性取代。保守性取代的定义如上所述。例证性的保守性取代诸如谷氨酸和亮氨酸(EL)残基对2和3号位残基(天冬氨酸和异亮氨酸；DI)的取代，谷氨酸和亮氨酸是由被用于添加特定核酸的EcoRI限制位点所编码的，该特定核酸可编码包括N-末端半胱氨酸残基在内的预期N-末端表位。其它例证性的实例为精氨酸对7和97号位的赖氨酸残基的取代，和丝氨酸残基对48和107号位的半胱氨酸的取代。
较少被考虑的是“非保守性”改变，例如由色氨酸取代甘氨酸，或由丙氨酸残基取代半胱氨酸。类似的较小变化还可包括氨基酸缺失或插入，或同时包括这两种情况。可利用本领域熟知的计算机程序，例如LASERGENE软件(DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)指导确定哪一个氨基酸残基可以被取代、插入或缺失，并且不破坏生物学活性或颗粒形成。
本发明嵌合体分子的HBc部分，即具有特定HBc序列的部分最优选地具有图1所示亚型ayw的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：1)，在该亚型ayw序列中，因为一个或两个末端的平截而缺失的部分较少，其中上述特定HBc序列所含序列或残基不同于所添加的免疫原、抗-抗原、接头、柔性接头臂或限制酶人工产物，即异源残基的序列或残基。典型地，该序列为2-149或-156号位的HBc序列。略微较少优选的是亚型adw、adw2和adyw的对应氨基酸残基序列，也如图1所示(SEQ IDNOs：2、3和4)。较少优选的还有2-149号位或2-156号位的旱獭和地松鼠序列，这两个序列是图1所示的最后两个序列(SEQ ID NOs：5和6)。正如其它部分所指出的，可将来源于不同哺乳动物HBc蛋白的不同序列部分同时应用在一个嵌合体中。
当上述本发明嵌合体分子的HBc部分具有除哺乳动物HBc分子从2到大约183号位的序列外的其它序列时，与SEQ ID NO：1相比，2-183号位和优选的2-163号位中有多达大约20％的氨基酸残基被取代了。与SEQ ID NO：1相比，在2-163号位中优选地有多达大约10％，更优选的是多达大约5％，最优选的是多达大约3％的氨基酸残基被取代了。
因此，由183个HBc残基组成的考虑嵌合体与SEQ ID NO：1所示2-183号位的残基可存在多达大约36个残基的差异，优选大约18个残基的差异。更优选的是与ayw序列(SEQ ID NO：1)中2-183号位的残基存在大约9个残基的差异，最优选的是大约5个残基的差异。在较短序列，例如2-149、2-156或2-163中的差异与上述基于百分率的差异成比例。在除结构域II的免疫优势环内或末端之外的位置上的取代优选地在嵌合体分子的非螺旋部分进行，并典型地位于2到大约15号位残基和24到大约50号位残基之间，以确保颗粒形成。参见Koschel et al.(1999)，J.Virol.，73(3)：2153-2160。
当HBc序列被截短在C-末端超过163号位处或N-末端时，或者在免疫优势环中存在一个或多个缺失时，被取代残基的数量占较少比例，因为该序列的总长度少于163个残基。为进行计算，在该分子其它位置上的缺失被认为是保守性取代，因此，例如，如果结构域III的C-末端位于133号位，而不是135号位时，为进行计算，有两个残基(134和135号位残基)应被假定为存在。
嵌合体制备
考虑的嵌合HBc免疫原典型地通过利用已被熟知的重组DNA技术而得以制备。因此，可使编码HBc的前体序列添加和缺失编码了特定多肽序列的核酸序列，以形成编码了考虑嵌合体的核酸。
一种代表性的考虑嵌合免疫原典型地将存在于流感A M2序列中的半胱氨酸残基作为N-末端半胱氨酸。用于通过编码了HBc分子的多肽的体外突变制备这种嵌合体分子时所用的引物如下所述。当含有半胱氨酸的M2多肽表位不位于N-末端时，N-末端半胱氨酸可通过利用仅编码了M2多肽中含半胱氨酸部分或单一N-末端起始序列，诸如Met-Cys-或Met-Gly-Cys-的引物进行体外突变而得以提供。
正如之前所指出的，HBc免疫优势环通常被描述为位于从完整蛋白的氨基-末端(N-末端)开始的大约75到85号位。含有流感A M2 B细胞表位的代表性序列可被插入结构域II的免疫优势环序列中。该插入基本上削弱了HBc环序列的HBc免疫原性和抗原性，并同时在组装的嵌合体颗粒中具有极高免疫原性的位置上呈递了该流感A M2B细胞表位。
将异源表位序列插入所述环序列的两种方法中，有一种方法是优选的。第一种方法被称为取代，其中编码免疫优势环一部分的DNA被切除并取代为编码了诸如B细胞序列的异源表位的DNA。第二种方法被称为插入，其中异源表位被插入在所述环中的相邻残基之间。
利用聚合酶链反应(PCR)的定点诱变被应用在一种典型的取代方法中，提供了一个嵌合HBc DNA序列，该序列编码了一对不同的限制位点，例如EcoRI和SacI，一个位点靠近免疫优势环编码DNA的一个末端。被取代的典型残基位于76-81号位。切除所述的环编码部分，将编码了异源B细胞表位的预期序列连接进上述限制位点，所获DNA可被用于表达上述HBc嵌合体。例如，该技术的典型应用可参见Pumpens et al.，(1995)Intervirology，38：63-74中的表2。
可选地，可将单一限制位点或2个位点导入上述区域，采用限制酶切割DNA，以提供“粘性”或钝性末端，并将具有粘性或钝性末端的合适异源DNA片段连接进上述切割区域。这种进入HBc中的序列取代类型的实例可参见Schodel et al.，(1991)F.Brown et al.eds.，Vaccines 91，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.319-325；Schodel et al.，Behring Inst.Mitt.，1997(98)：p.114-119和Schodel et al.，J.Exp.Med.，(1994)180(3)：p.1037-4中的报导内容，后两份文献分别论述了抗疟疾病原体，即约氏疟原虫和贝氏疟原虫的疫苗的制备。本文通常不采用可使残基从免疫优势环中被净去除的取代方法。
HBc免疫原性环中的插入位置和环残基的存在对免疫原的活性具有重要作用。因此，正如已公开的PCT申请PCT/US01/25625和PCT/US01/41759所例证的，将疟疾B细胞表位插入HBc 78和79号位残基之间，可获得免疫原性比被插入位于76和81号位之间的已切除和已取代区域中的相同免疫原高10-1000倍的颗粒性免疫原。此外，与将疟疾免疫原插入77和78号位残基之间相比，将相同免疫原插入78和79号位残基之间可意外地将免疫原性增强大约15倍。
因此，插入通常是优选的。在一个具有例证性的插入方法实例中，利用定点诱变创造了两个彼此相邻并位于编码了相邻氨基酸残基，诸如78和79号位残基的密码子之间的限制位点。该技术添加了12个碱基对，这些碱基对编码了位于HBc环中曾经相邻的两个残基之间的4个氨基酸残基(两个残基对应一个限制位点)。
在利用上述限制酶进行裂解，将编码了异源B细胞表位序列的DNA连接，并使该DNA表达，从而形成HBc嵌合体的基础上，发现HBc环氨基酸序列在其N-末端一侧被5’限制位点编码的两个残基所间断，在朝向C-末端的方向上后接异源B细胞表位序列，接着是另外两个由3’限制位点编码的异源、非环状残基，其后是该环序列的其余部分。相同的方法可被用于将N-末端半胱氨酸或N-末端序列插入结构域I中，正如Neirynck et al.，(1999)Nature Med.，5(10)：1157-1163所报导的，或者用于将T细胞表位或一个或多个半胱氨酸残基插入结构域IV中。Schodel et al.，(1990)F.Brown et al.eds.，Vaccines90，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork，pp.193-198报导了在82和83号位残基之间应用插入的类似方法。
更具体而言，编码了C-末端截短的HBc序列(HBc149)的DNA序列经过工程改造，在78和79号位残基之间具有了相邻的EcoRI和SacI位点。采用两种酶裂解该DNA，获得一个编码了HBc1-78号位，且3′末端为EcoRI粘性末端的片段，而另一个片段则具有5’末端SacI粘性末端，并编码了79-149号位的残基。将具有5′AATT突出端及其后编码了预期B细胞表位和AGCT 3′突出端的序列的合成核酸连接，可获得一个HBc嵌合体序列，该序列编码了位于78和79号位残基之间且两侧各有两个异源残基[分别为GlyIle(GI)和GluLeu(EL)]的B细胞表位，但通常破坏了EcoRI位点，而保留了SacI位点。
可采用类似方法将含有半胱氨酸的序列插入结构域IV中，诸如含有326-345号位的恶性疟原虫CS蛋白序列，并在本文中被称为PF/CS326-345(Pf-UTC)的疟疾T细胞表位。在本发明中，通过工程改造将EcoRI和HindIII限制位点导入HBc DNA序列，并位于149号位氨基酸残基后。采用EcoRI和HindIII消化后，将具有上述AATT 5′突出端及其后的T细胞表位编码序列、一个或多个终止密码子和3′AGCT突出端的合成DNA连接进已消化的序列中，可形成编码了HBc1-149号位残基及其后的两个异源残基(GI)、异源T细胞表位、终止密码子和HindIII位点的序列。
采用具有SacI限制位点及其后编码了始于79号位残基的HBc的序列的正向引物进行PCR扩增，随后采用SacI和HindIII进行消化，获得编码了HBc 79-149号位的序列，外加位于C-末端的两个添加残基和T细胞表位。采用SacI和HindIII消化所述构建体，并随后与含有B细胞的构建体连接，可获得编码了预期重组HBc嵌合体免疫原的完整基因，该基因从N-末端开始具有1-78号位的HBc序列、两个添加的残基、B细胞表位(例如疟疾)、两个添加的残基、HBc 79-149号位、两个添加的残基和T细胞表位，如图2C所示。
可采用类似技术将用于偶联B细胞表位的异源接头残基插入在所述的环区域序列中。考虑的接头残基包括赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和酪氨酸(Tyr)，其中尤其优选赖氨酸。
业已指出，SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基序列含有位于77和78号位的Glu和Asp残基。尽管如此，还考虑导入额外的、异源并含有羧基的残基。原有谷氨酸和天冬氨酸的化学反应性可通过其它因素减弱。例如，本领域已知的是，相邻的脯氨酸，如位于79号位的脯氨酸可中和并因此减弱邻近羧基的化学反应性。
此处采用上文提及的第一种插入方法将5个异源残基插入环序列中；其中一个残基是用于偶联B细胞表位的异源接头残基，在该接头残基两侧各有相邻的两个残基，这些残基本身还与环序列残基相邻，并且是所插入限制位点的表达产物(限制酶人工产物)。业已指出，人们还可通过定点诱变在编码了用于B细胞表位的异源接头残基的HBc环序列中添加单个密码子。
业已指出，将两个异源残基优选地应用在B细胞或T细胞表位的两侧(侧翼)是易于实现的。结果是，人们还可在所插入序列的一侧或两侧添加0-3个或更多不属于HBc序列的残基。可采用合适的核酸酶(例如S1核酸酶)“消化”上述插入序列和HBc核酸的一个或两个末端，以获得可连接在一起的钝端。既不是已插入B细胞或T细胞表位的一部分，也不是HBc序列的一部分的添加异源残基不被计算在所述结构域中存在的残基数量内，除非这些残基是原有残基的保守性取代，例如下述某些构建体中GluLeu残基取代AspIle的情况。
还被指出的是，人们还可利用已被熟知的合成方法合成预期重组HBc嵌合体核酸的全部或一部分，例如，U.S.Patent No.5,656,472所论述和例证的177个碱基对DNA的合成，该DNA编码了烟草中具有59个残基的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶信号肽。例如，人们可以合成具有钝端或“粘性末端”的结构域I和II，这两个结构域可与结构域III和IV连接，获得可表达考虑的HBc嵌合体的构建体，该考虑HBc嵌合体在B细胞表位N-末端一侧含有0个添加的残基，在C-末端一侧或结构域II/III结合处或某些其它预期位点含有0-3个添加的残基。
Clarke et al.(1991)F.Brown et al.eds.，Vaccines 91，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.313-318报导了一种可选的插入技术。在本发明中，研究人员利用遗传密码的简并性，工程改造了与80和81号位残基对应的单一限制位点，该位点编码了位于这两个位点的原始残基。因此，他们表达的HBc嵌合体不含限制位点编码残基，而含有紧邻已插入序列的HBc环的残基。
本发明还考虑了编码上述HBc嵌合体分子的核酸序列(片段)或该编码序列的补体。在某些优选实施方案中，该核酸片段以分离和纯化形式存在。
在活生物中，蛋白或多肽的氨基酸残基序列通过遗传密码与编码该蛋白的基因的脱氧核糖核酸(DNA)序列直接相关。因此，通过众所周知的遗传密码简并性，可根据需要制备可编码相同嵌合体氨基酸残基序列的额外的DNAs和相应的RNA序列(核酸)，但该序列与上述基因序列充分不同，以至于这两个序列在高严格条件下不能杂交，但可在中等严格条件下杂交。
高严格条件可被定义为包括在大约50-55℃的温度下，在6XSSC中进行的杂交，和在68℃的温度下，在1-3XSSC中进行的最终洗涤。中等严格条件包括在大约50℃到大约65℃的温度下，在0.2-0.3MNaCl中进行的杂交，及其后在大约50℃到大约55℃的温度下，在0.2XSSC、0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)中进行的洗涤。
具有下述情况的核酸序列(DNA序列或RNA序列)可被定义为DNA变体序列，即(1)本身或其补体编码了一种嵌合体分子，该嵌合体分子的HBc部分中4-136号位的残基存在时，如SEQ ID NOs：1、2、3、4、5或6所示，和(2)至少可以在中等严格条件(见下文)下与SEQID NOs：234、235、236、237、238或239所示DNA序列杂交；和(3)其HBc序列与SEQ ID NOs：234、235、236、237、238和239所示DNA序列具有至少80％，更优选的是至少90％，还要更优选的是至少95％，最优选的是100％同一性。正如本文其它部分所论述的，众所周知，核酸序列，诸如考虑的核酸序列是与合适的启动子操作性连接后在合适的表达系统中表达的。
HBC AYW DNA，SEQ ID NO：234
atggacatcg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct    60
tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa    120
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tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg ttaatttgga agatccagcg    240
tctagagacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt caggcaactc    300
ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga gtatttggtg    360
tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta    420
tcaacacttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact    480
ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa    540
tctcaatgt
HBc ADW DNA，SEQ ID NO：235
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tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta    420
tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga    480
agaactccct cgcctcgcag acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct    540
cgggaatctc aatgt
HBc ADW2 DNA，SEQ ID NO：236
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cgggaatctc aatgt
HBc ADYW DNA，SEQ ID NO：237
atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct    60
tctgacttct ttccttccgt acgagatctt ctagataccg ccgcagctct gtatcgggat    120
gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt    180
tgctggggag acttaatgac tctagctacc tgggtgggta ctaatttaga agatccagca    240
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ccctcgcctc gcagacgaag atctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa    540
tctcaatgt
旱獭DNA，SEQ ID NO：238
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tgcacccatt ctctcgactc ttccggaaca tacagtcatt aggagaagag gaggtgcaag    480
agcttctagg tcccccagaa gacgcactcc ctctcctcgc aggagaagat ctcaatcacc    540
g cgtcgcag
地松鼠DNA，SEQ ID NO：239
atgtatcttt ttcacctgtg ccttgttttt gcctgtgttc catgtcctac tgttcaagcc    60
tccaagctgt gccttggatg gctttgggac atggacatag atccctataa agaatttggt    120
tcttcttatc agttgttgaa ttttcttcct ttggactttt ttcctgatct caatgcattg    180
gtggacactg ctgctgctct ttatgaagaa gaattaacag gtagggagca ttgttctcct    240
catcatactg ctattagaca ggccttagtg tgttgggaag aattaactag attaattaca    300
tggatgagtg aaaatacaac agaagaagtt agaagaatta ttgttgatca tgtcaataat    360
acttggggac ttaaagtaag acagacttta tggtttcatt tatcatgtct tacttttgga    420
caacacacag ttcaagaatt tttggttagt tttggagtat ggattagaac tccagctcct    480
tatagaccac ctaatgcacc cattttatca actcttccgg aacatacagt cattaggaga    540
agaggaggtt caagagctgc taggtccccc cgaagacgca ctccctctcc tcgcaggaga    600
aggtctcaat caccgcgtcg cagacgctct caatctccag cttccaactg c             651
编码了考虑嵌合体分子的类似物或类似的核酸(DNA或RNA)序列也是本发明的一部分。嵌合体类似物核酸序列或与其互补的核酸序列编码了一个HBc氨基酸残基序列，该序列与SEQ ID NOs：1、2、3、4、5或6所示4-140号残基位的HBc序列部分具有至少80％，更优选的是至少90％，最优选的是至少95％的同一性。该DNA或RNA在本文中被称为SEQ ID NOs：234、235、236、237、238和239所示核酸序列的“类似物”或与其“类似”，并可在中等严格杂交条件下与SEQ ID NOs：234、235、236、237、238和239所示的核酸序列或它们的补体杂交。编码了类似序列的核酸在适当转染和表达的基础上也可生成考虑的嵌合体。
不同宿主通常优先采用特定的密码子编码特定的氨基酸残基。这种密码子优先性是众所周知的，且编码了预期嵌合体序列的DNA序列可通过体外诱变而得以改变，例如，使宿主优先采用的密码子被用于将要表达酶的特定宿主。此外，还可利用遗传密码的简并性，编码SEQID NOs：234、235、236、237、238和239所示序列的HBc部分，从而避免与SEQ ID Nos：1、2、3、4、5或6所示DNA或它们的补体具有显著同一性。因此，有用的类似DNA序列无需在中等严格条件下与SEQ ID NOs：234、235、236、237、238和239所示核苷酸序列或补体杂交，仍能提供考虑的嵌合体分子。
本发明还考虑了诸如DNA分子的重组核酸分子，该重组核酸分子包括与外源核酸片段(例如DNA片段或序列)操作性连接，从而形成编码了上述考虑嵌合体的基因的载体，以及适合驱动该基因在相容宿主生物中表达的启动子。更具体而言，本发明还考虑了一种重组DNA分子，该分子包括含有可驱动所述嵌合体在宿主生物细胞中表达的启动子的载体，该载体与一个DNA片段操作性连接，形成了可用于嵌合体HBc部分的基因，或者是与特定的DNA变体连接，该DNA变体与SEQID NOs：234、235、236、237、238和239所示嵌合体基因具有至少90％同一性，并可在中等严格条件下与该基因杂交。
本发明进一步考虑了一种重组DNA分子，该重组DNA分子包括含有可驱动嵌合体在宿主生物细胞中表达的启动子的载体，该载体操作性连接了一个DNA片段，该DNA片段是一种类似物核酸序列，其编码的HBc嵌合体部分的氨基酸残基序列与SEQ ID NOs：1、2、3、4、5或6所示序列的HBc部分具有至少80％，更优选的是90％，最优选的是95％的同一性。该重组DNA分子在适当转染和被宿主细胞表达的基础上可提供考虑的嵌合体分子。
业已指出，地松鼠HBc中含有30个氨基酸残基的N-末端序列无法与其它任意HBc序列对比。该序列及其编码核酸序列以及它们的补体均不被计入在上述同一性百分比内，编码了上述含有30个残基的序列的核酸部分或其用于杂交测定的补体也不被计入在内。类似地，在HBcN-和/或C-末端被截短的序列也不被计入在同一性计算中，那些为了插入异源表位而除去了免疫优势环中的若干残基的序列也不被计入在内。因此，仅计入存在于嵌合体分子中的那些HBc编码碱基或HBc序列残基，并可在同一性百分比计算中与对照核酸或氨基酸残基序列进行比对。
由于本文所公开基因的编码序列如SEQ ID NOs：234、235、236、237、238和239所示，因此，可通过Current Protocols In Molecular Biology，Ausabel et al.eds.，John Wiley&Sons(New York：1987)p.8.1.1-8.1.6所论述并为本领域所熟知的体外诱变技术制备分离的核酸片段，优选DNA序列及其变体和类似物，该体外诱变始于基因的起始ATG密码子，并止于各基因的终止密码子或正好位于其下游。因此，可通过工程改造使预期限制位点位于起始密码子处或其上游，和位于终止密码子处或其下游，从而能够制备、切除并分离其它基因。
正如本领域所熟知的，只要存在必需的核酸，代表性的是DNA序列(包括起始和终止信号)，其它碱基对通常可以位于所述片段的任一末端，且该片段仍然可被用于表达所述蛋白质。当然，其前提是该片段中缺失了一种操作性连接的DNA序列，该序列可抑制表达，并表达了可消耗预期将被表达的酶的其它产物，表达了可消耗该预期酶所生成的有用反应产物的产物，或者以其它方式干扰了该DNA片段基因的表达。
因此，只要该DNA片段不含有上述干扰性DNA序列，本发明的DNA片段便可具有大约500到大约15,000个碱基对的长度。重组DNA分子，尤其是表达载体的最大尺寸主要是根据方便性决定的，且该载体的大小应可被宿主细胞容纳，只要在需要时存在复制和表达所需要的全部最小DNA序列即可。最小载体尺寸是众所周知的。长DNA片段不是优选的，但也可采用。
编码了上述嵌合体的DNA片段可通过化学技术合成，例如Matteucci et al.(1981)J.Am.Chem.Soc.，103：3185的磷酸三酯法。当然，通过化学合成编码序列时，简单地以合适的碱基取代编码了天然氨基酸残基序列的碱基，便可实现任何预期修饰。不过，优选的是包括上述序列的DNA片段。
考虑的HBc嵌合体可在许多转化的宿主系统，典型的是宿主细胞中生成(表达)，但本发明也考虑了在无细胞体外系统中进行的表达。这些宿主细胞系统包括，但不限于微生物，诸如经由重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；经由酵母表达载体转化的酵母；经由病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；经由病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒；烟草花叶病毒)或细菌表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或经过适当转化的动物细胞系统，诸如CHO，VERO或COS细胞。本发明不受限于所采用的宿主细胞系统。
含有编码HBc嵌合体的基因的DNA片段优选地获得自含有该基因的重组DNA分子(质粒载体)。能够引导嵌合基因表达成HBc嵌合体蛋白的载体在本发明中被称为“表达载体”。
表达载体含有包括启动子在内的表达控制元件。嵌合体编码基因与该表达载体操作性连接，可使启动子序列引导RNA聚合酶结合并表达该嵌合体编码基因。有助于表达该多肽编码基因的启动子是Poszkowski et al.(1989)EMBO J.，3：2719和Odell et al.(1985)Nature，313：810所描述的诱导型、病毒型、合成型、组成型启动子，以及Chua et al.(1989)Science，244：174-181所公开的时间调控型、空间调控型和空间时间调控型启动子。
一种适用在原核细胞，诸如大肠杆菌中的优选启动子是Rec 7启动子，该启动子可被外源提供的萘啶酮酸诱导。一种更优选的启动子存在于质粒载体JHEX25(可获得自Promega Corp.，Madison WI)中，可被外源提供的异丙基-β-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷(IPTG)诱导。还有一种更优选的启动子，即tac启动子，存在于质粒载体pKK223-3中，也可被外源提供的IPTG诱导。采用大约25到大约100μM IPTG进行诱导，可在许多大肠杆菌菌株，诸如XL-1、TB1、BL2I和BLR中成功表达pKK223-3质粒。令人惊讶的是，已发现大约25到大约50μM的IPTG浓度能够在2L摇瓶和发酵罐中提供最佳效果。
有若干沙门氏菌菌株，诸如伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂合体已被用于表达免疫原性转基因，包括将现有HBc嵌合体颗粒既作为可充当免疫原的颗粒的来源，又作为活的、减毒的全细胞疫苗和接种物，这些表达和疫苗接种系统均可应用在本发明中。参见U.S.Patent No.6,024,961；U.S.PatentNo.5,888,799；U.S.Patent No.5,387,744；U.S.PatentNo.5,297,441；Ulrich et al.，(1998)Adv.Virus Res.，50：141-182；Tacket et al.，(Aug 1997)Infect.Immun.，65(8)：3381-3385；Schodel et al.，(Feb 1997)Behring Inst.Mitt.，98：114-119；Nardelli-Haefliger et al.，(Dec 1996)Infect.Immun.，64(12)：5219-5224；Londono et al.，(Apr 1996)Vaccine，14(6)：545-552及其中的引用文献。
本发明还考虑了与真核细胞相容的表达载体，诸如与酵母细胞相容的表达载体或与高等植物或动物的细胞相容的表达载体。这些表达载体还可被用于形成本发明的重组DNA分子。适用于酵母，诸如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母的载体可以是众所周知的游离型或整合型载体。真核细胞表达载体是本领域所熟知的，并可通过若干商业渠道获得。通常，这种载体含有一个或多个便于插入预期DNA片段和启动子序列的限制位点。任选地，这些载体含有特异性应用于真核细胞的选择标记。适用于酿酒酵母的典型启动子包括酿酒酵母磷酸甘氨酸激酶(PGK)启动子和趋异启动子GAL 10和GAL 1，而醇氧化酶基因(AOX1)则是适用于巴斯德毕赤酵母的启动子。
例如，为了在甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母中生产嵌合体，可使编码了预期嵌合体的基因处于调控序列的控制之下，该调控序列可引导结构基因在毕赤酵母属中的表达。所获表达感受态形式的上述基因便被导入了毕赤酵母属细胞中。
更具体而言，可采用Cregg et al.(1987)Biotechnology，5：479-485；(1987)Molecular and Cellular Biology，12：3376-3385描述的转化和表达系统。将用于嵌合体V12.Pf 3.1的基因插入醇氧化酶基因(AOX1)启动子的下游和同一AOX1基因的转录终止序列的上游。随后，将该基因及其侧翼调控区导入具有巴斯德毕赤酵母HIS4基因和巴斯德毕赤酵母ARS序列(自主复制序列)的质粒中，可使质粒在巴斯德毕赤酵母细胞中复制[Cregg et al.(1987)Molecular andCellular Biology，12：3376-3385]。
该载体还含有诸如pBR322的质粒的合适部分，可使该质粒在大肠杆菌细胞中生长。所获具有嵌合体基因以及上述多种其它元件的质粒被例证性地转化进巴斯德毕赤酵母的his4突变体中，即缺乏功能性组氨醇脱氢酶基因的菌株的细胞。
在缺乏组氨酸的培养基上筛选了转化体菌落后，细胞可在缺乏组氨酸，但含有甲醇的培养基上生长，正如Cregg et al.(1987)Molecularand Cellular Biology，12：3376-3385所描述的，可诱导AOX1启动子。被诱导的AOX1启动子可导致嵌合体蛋白的表达，并在巴斯德毕赤酵母中生成嵌合体颗粒。
还可通过整合性转化导入考虑的嵌合体基因，该方法无需利用ARS序列，正如Cregg et al.(1987)Molecular and Cellular Biology，12：3376-3385所描述的。
通过在哺乳动物细胞中进行的重组DNA表达以生成嵌合体颗粒典型地是利用能够在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达所述嵌合体基因的重组DNA载体进行的。这是利用本领域所熟知且Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratories(1989)更具体描述过的操作方法实现的。
在一个例证性的实例中，采用了NcoI和HindIII对以猿猴病毒(SV40)为基础的表达载体pKSV-10(Pharmacia Fine Chemicals，Piscataway，NJ)进行限制性内切核酸酶消化。编码了如实例1描述方法所制备的预期HBc嵌合体的NcoI/HindIII序列片段被连接进表达质粒中，形成了被命名为pSV-Pf的环状重组表达质粒。
表达质粒pSV-Pf含有完整的大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因。因此，当采用pSV-Pf转化大肠杆菌RR101(Bethesda ResearchLaboratories，Gaithersburg，MD)时，可根据氨苄青霉素抗性筛选含有该质粒的细菌。然后克隆含质粒的细菌，并随后筛选出编码基因以正确方向插入在所述表达载体中的克隆。
通过培养含有上述质粒的大肠杆菌，可使由上所获含有编码了预期HBc嵌合体的基因的质粒pSV-Pf增殖。按照上述Sambrook等人描述的方法，可从大肠杆菌培养物中分离该质粒DNA。
嵌合体的表达是通过采用Graham et al.(1973)Virol.，52：456描述的磷酸钙介导的转染方法或类似技术，将pSV-Pf导入诸如CHO细胞的哺乳动物细胞系中实现的。
正如Southern et al.(1982)J.Mol.Appl.Genet.，1：327所描述的，为确保以最大效率将pSV-Pf导入培养中的CHO细胞，可在第二种质粒pSV2NEO(ATCC#37149)和细胞毒性药物G418(GIBCOLaboratories，Grand Island，N.Y.)存在的条件下进行转染。培养抗G418的CHO细胞，获得了质粒pSV2NEO和pSV-Pf，并将该细胞命名为CHO/pSV-Pf细胞。由于pSV-Pf表达载体的遗传学构造，嵌合体是在所获CHO/pSV-Pf细胞中表达的，并可在这些细胞的细胞质中被检测出来并被纯化。正如本文其它部分所论述的，所获含细胞蛋白的组合物是在柱上分离的。
选择哪一种表达载体，以及将嵌合体编码基因操作性最终连接在哪一种启动子上，直接取决于预期的功能特性，例如蛋白表达的位置和时机，以及待转化的宿主细胞。这些均是构建重组DNA分子领域所熟知的固有制约因素。不过，有助于实施本发明的载体可引导DNA片段中通过操作性连接而包括的嵌合体基因的复制，优选地还引导了该嵌合体基因的表达(对表达载体而言)。
在一种优选实施方案中，可表达嵌合体的宿主是原核生物大肠杆菌，而优选的载体包括原核生物复制子，即可引导重组DNA分子在经其转染的原核宿主细胞的染色体外自主复制和维持的DNA序列。该复制子是本领域所熟知的。
包括原核复制子的载体还包括可引导考虑的HBc嵌合体基因在经其转化的宿主细胞，诸如大肠杆菌中表达的原核启动子区。可与细菌宿主相容的启动子序列典型地被提供在含有一个或多个便于插入考虑DNA片段的限制位点的质粒载体中。这种载体质粒的代表性实例为可获得自Biorad Laboratories(Richmond，CA)的pUC8、pUC9和pBR329以及可获得自Pharmacia，Piscataway，NJ的pPL和pKK223-3。
有助于基因在高等植物和哺乳动物来源的细胞中表达的典型载体是本领域所熟知的，包括Rogers et al.(1987)Meth.in Enzymol.，153：253-277描述的源于根瘤农杆菌的根瘤诱导(Ti)质粒的植物载体，和上述哺乳动物表达载体pKSV-10，以及pCI-neo(Promega Corp.，#E1841，Madison，WI)。不过，若干已知可在植物中发挥作用的其它表达载体系统包括Fromm et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：58-24描述的pCaMVCN转移控制载体。质粒pCaMVCN(可获得自Pharmacia，Piscataway，NJ)包括花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子。
上述植物表达系统典型地提供了所插入转基因的系统型或组成型表达。当植物的大部分或所有部分均被用作考虑嵌合体分子或相应颗粒的来源时，或者当该植物的大部分被用于提供口服疫苗时，可采用系统表达。不过，在诸如根、种子或果实的植物储存器官中表达嵌合体分子或颗粒可能更有效，因为可以从这些器官中更方便地分离或摄取所述颗粒。
可实现储存器官表达的一种方式是利用可在一种或多种预先选择或预定的非光合植物器官中表达其所控制的基因的启动子。在一种或多种预先选择的储存器官，诸如根、种子或果实中表达，而在其它器官，诸如叶或茎中很少表达或不表达的情况在本文中被称为增强的或优先表达。在一种或多种预先选择的器官中引导的表达与在另一种器官中引导的表达的比例至少为5∶1的代表性启动子在本文中被定义为器官增强型启动子。基本上仅在一种储存器官中表达，并基本上不在其它储存器官中表达的情况被称为器官特异性表达，即在一种储存器官中的表达产物与在另一种储存器官中的表达产物的比例约为100∶1或更高，说明具有器官特异性。因此，储存器官特异性启动子是储存器官增强型启动子种类的成员。
代表性的植物储存器官包括胡萝卜、芋头或木薯的根，马铃薯块茎，和果肉，诸如红色番石榴、西番莲果实、芒果、番木瓜、番茄、鳄梨、樱桃、蜜柑、柑橘、棕榈、诸如罗马甜瓜和西瓜的甜瓜，以及其它肉质果实，诸如南瓜、黄瓜、芒果、杏、桃，以及玉米(谷物)、大豆、水稻、油用油菜的种子等。
CaMV 35S启动子通常被认为是组成型启动子。不过，最近有研究表明，当CaMV 35S启动子的一个21-bp的区域被操作性连接进另一种异源常见绿色组织启动子rbcS-3A启动子中时，可使获得的嵌合启动子成为根增强型启动子。该21-bp序列公开在U.S.PatentNo.5,023,179中。含有U.S.Patent No.5,023,179公开的21-bp插入片段的嵌合rbcS-3A启动子在本发明中是有用的根增强型启动子。
包括上述21-bp片段的类似根增强型启动子是CAMV 35S启动子本身-90至+8号位的区域。U.S.Patent No.5,110,732公开的是该截短的CaMV 35S启动子可在根和种子的根基中提供增强的表达，其中种子的根基是必将成为根的组织。该启动子也可应用在本发明中。
另一种有用的根增强型启动子是PCT/GB92/00416(1991年9月19日出版的WO 91/13922)公开的油用油菜(Brassica napus L.)基因中-1616到-1的启动子。具有质粒pRlambdaS4的大肠杆菌DH5.α和含有该启动子的噬菌体λ.β.1于1990年3月8日保藏于英国爱伯丁的国立工业和海洋微生物保藏中心，保藏号为NCIMB40265和NCIMB40266。通过采用HaeIII裂解上述质粒可获得该启动子中1.0kb片段形式的有用部分。
一种优选的根增强型启动子是存在于DiRita和Gelvin(1987)Mol.Gen.Genet，207：233-241所描述质粒pKan2中的甘露氨酸合酶(mas)启动子。该启动子可XbaI-XbalI片段形式从其质粒pKan2中除去。
优选的甘露氨酸合酶根增强型启动子由直到-138号位的核心甘露氨酸合酶(mas)启动子区和从-318至-213号位的甘露氨酸合酶激活子组成，并被统称为AmasPmas。业已发现，该启动子可使烟草根部的表达水平提高至叶片表达水平的大约10到大约100倍。
另一种根特异性启动子是大约500bp的5’侧翼序列，该序列附带有Keller et al.(1989)Genes Dev.，3：1639-1646所报导的在侧根启动期间表达的富含羟基脯氨酸的糖蛋白基因HRGPnt3。另一种优选的根特异性启动子存在于Yamamoto et al.(1991)Plant Cell，3：371-381报导的烟草根特异性基因ToRBF的大约-636到-1的5’侧翼区中。这些作者将调控表达的顺式作用元件更具体地定位在从转录起始位点开始的5’末端大约-636到大约-299的区域中。Yamamoto等人报导了ToRBF基因在根中的稳态mRNA生产，而不是在叶片、芽分生组织或茎中。
另一种有用的储存器官特异性启动子是番茄Lycopersiconesculentum的果实熟化基因E8的5′和3′侧翼区。Deikman et al.(1988)EMBO J.，7(11)：3315-3320和(1992)Plant Physiol.，100：2013-2017例证并论述了这两个区域及它们的cDNA序列。
有三个区域位于上述基因中一个2181bp的5′侧翼序列中，且从3′末端到聚腺苷酸添加位点的一个522bp的序列似乎控制了E8基因的表达。从-2181到-1088号位的区域是乙烯激活未成熟果实中的E8基因转录所必需的，并且还促成了熟化期间的转录。另外两个区域，即-1088到-863号位和-409到-263号位不能使未成熟的果实具有乙烯反应性，但足以使E8基因在熟化期间表达。
玉米蔗糖合酶-1(Sh)启动子可在玉米中以在胚乳中的高水平表达其控制的酶，而在根中的表达水平则大幅降低，并且不能在绿色组织或花粉中表达，据报导，该启动子可在茎和根所富含的烟草韧皮细胞中特异性地表达嵌合报道基因β-葡糖醛酸酶(GUS)。Yang et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，87：4144-4148。因此，该启动子可用于植物器官，诸如肉质果实，如甜瓜，例如罗马甜瓜，或含有胚乳的种子，还可用于含高水平的韧皮细胞的根。
另一种典型的组织特异性启动子是对种子组织具有特异性的凝集素启动子。大豆种子中的凝集素蛋白是由单个基因(Le1)编码的，而该基因仅在种子成熟期间表达，并占总的种子mRNA的大约2％到大约5％。凝集素基因和种子特异性启动子已得到充分表征，并被用于引导转基因烟草植物中的种子特异性表达。例如，参见Vodkin et al.(1983)Cell，34：1023和Lindstrom et al.(1990)DevelopmentalGenetics，11：160。
一种尤其优选的块茎特异性表达启动子是马铃薯patatin基因的5’侧翼区。Twell et al.(1987)Plant Mol.Biol.，9：365-375描述了该启动子的用途。该启动子存在于噬菌体LPOTI的一个大约406bp的片段中。LPOTI启动子具有若干与其它四种patatin启动子的同源性超过90％的区域，并在所有400个碱基中与patatin启动子PGT5的同源性为大约95％。上述每一种启动子均可用于本发明。还可参见Wenzler et al.(1989)Plant Mol.Biol.，12：41-50。
Benfey et al.(1988)Science，244：174-181公开了其它的器官增强型启动子和器官特异性启动子。
所采用的每一个启动子序列均基本上不受细胞中嵌合体分子或颗粒数量的影响。本文所用术语“基本上不受影响”指所述启动子对转化细胞或转基因植物中积累的嵌合体分子或颗粒的直接反馈控制(抑制作用)没有反应。
采用根瘤农杆菌转染植物细胞典型地最好在双子叶植物上进行。单子叶植物通常最易于通过所谓的原生质体直接基因转移而得以转化。直接基因转移通常是通过电穿孔、聚乙二醇介导的转移进行，或者借助携带了所需DNA的微轰击粒子轰击细胞而得以实现。这些转染方法是本领域所熟知的，无需在此进一步论述。从转染细胞和原生质体再生完整植株的方法也是众所周知的，例如从植物组织中获得预期蛋白的技术。还可参见U.S.Patent No.5,618,988和5,679,880及其引用的文献。
采用农杆菌属转化、电穿孔或其它方法形成的转基因植物典型地含有位于一个染色体上的单基因。对所添加的基因而言，该转基因植物可被称为是杂合的。不过，术语“杂合的”的应用通常意味着在一对染色体中的另一个染色体的相同位点上存在一个互补基因，而在本文所述含有一个添加基因的植物中则不存在这种基因，这种植物的更确切名称被认为是独立分离子，因为添加的外源嵌合体分子编码基因在有丝分裂和减数分裂期间是独立分离的。含有可驱动编码了考虑HBc嵌合分子的单一结构基因的器官增强型启动子的转基因植物，即独立分离子是优选的转基因植物。
更优选的是对添加的结构基因而言为纯合的转基因植物，即包括两个添加基因，且一对染色体中的每一个染色体的相同位点均存在一个基因的转基因植物。纯合的转基因植物可通过下述方法获得，即使含有单个添加基因的独立分离转基因植物性交配(自交)，使生成的一部分种子发芽，并相对于对照(天然、非转基因)或独立分离转基因植物，分析所获植物增强的嵌合体颗粒积累。与天然、非转基因植物和独立分离的转基因植物相比，纯合转基因植物表现了增强的嵌合体颗粒积累。
应当理解的是，还可让两种不同的转基因植物交配，以获得含有两个独立分离的添加的外源(异源)基因的后代。合适后代的自交可获得对编码了嵌合HBc分子的两个添加的、外源基因而言为纯合的植物。本发明还考虑了与亲本植物的回交，和与非转基因植物的异型杂交。
因此，本发明的转基因植物具有编码了考虑嵌合HBc分子的异源结构基因。优选的转基因植物对所添加的异源嵌合HBc结构基因而言是独立分离子，并可将该基因遗传给它的后代。更优选的转基因植物对所述异源基因而言是纯合的，并可在有性交配的基础上将该基因遗传给它的所有后代。
由于编码了嵌合HBc分子的基因并不自然出现在植物中，当转基因植物和非转基因植物均在相同条件下生长时，考虑的转基因植物积累的嵌合HBc分子颗粒的数量高于相同类型或植株的非转化植物中的积累量。
术语“相同类型”或“相同植株”在本文中指与未转化植物一样杂交的植物或该未转化植物的克隆。当杂交的姊妹株当中的等位基因变异较少时，正如采用广泛自交的植物情况中，可在姊妹株之间进行比较或者利用若干姊妹株进行平均。此外，优选克隆进行比较。
转基因植物来源的种子生长在田间温室、窗台等处，且相应的性成熟的转基因植物是白花授粉，可生成纯育植物。这些植物的后代成为纯育系，对该纯育系的嵌合HBc分子颗粒积累的评估优选地在田间和一系列环境条件下进行。
对嵌合HBc分子颗粒积累而言为纯合的转基因植物与具有其它预期性状的亲本植物杂交。对嵌合HBc分子颗粒积累而言为杂合的或者可独立分离的后代与一个或另一个亲本回交，可获得表现了嵌合HBc分子颗粒积累及其它预期性状的转基因植物。后代与亲本的回交可能必须重复1次以上，才可获得具有多种理想性状的转基因植物。
还可采用昆虫细胞系统表达HBc嵌合体。例如，在一种这样的系统中，采用了苜蓿营蚊夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)或杆状病毒用作载体，以在草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫体内表达外源基因。
编码了嵌合体的序列可被克隆进上述病毒的非必需区域，诸如多角体蛋白基因中，并可被置于多角体蛋白启动子的控制下。嵌合体序列的成功插入使多角体蛋白基因失活，并生成缺乏外被蛋白的重组病毒。随后，可利用该重组病毒感染，例如可表达所述HBc嵌合体的草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫。E.Engelhard et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：3224-3227；和V.Luckow，Insect CellExpression Technology，pp.183-218，in Protein Engineering： Principles and Practice，J.L.Cleland et al.eds.，Wiley-Liss，Inc，1996。被置于苜蓿营纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的多角体蛋白启动子控制之下的异源基因通常在感染晚期以高水平表达。
含有所述嵌合基因的重组杆状病毒是利用商品名为Bac-To-BacTM杆状病毒表达系统(Life Technologies)的杆状病毒穿梭载体系统构建的(Luckow et al.(1993)J.Virol.，67：4566-4579)。制备重组病毒的原种，并通过标准方法监测重组蛋白的表达(O′Reillyet al.，Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York，1992；和King et al.，The Baculovirus Expression System：A Laboratory Guide，Chapman&Hall，London，1992)。
业已开发了多种借助互补性粘性末端或钝端将DNA与载体操作性连接的方法。例如，可将互补同聚物序列段添加到将被插入载体DNA中的DNA片段上。然后，通过该互补同聚核苷酸尾序之间的氢键结合将所述载体和DNA片段连接，以形成重组DNA分子。
可选地，正如上文所指出的，可采用含有一个或多个限制性内切核酸酶位点的合成接头将所述DNA片段连接到所述表达载体上。通过在能够催化钝端DNA分子连接的酶，诸如噬菌体T4DNA连接酶存在的条件下，温育该钝端DNA片段和大量过量的合成接头分子，可使该合成接头与钝端DNA片段相连。因此，该反应的产物是末端具有合成接头序列的DNA片段。随后，采用合适的限制性核酸内切酶裂解上述DNA片段，并连接进已经由特定酶裂解的表达载体中，该特定酶可生成与上述合成接头相容的末端。含有多种限制性内切核酸酶位点的合成接头可通过多种商业渠道获得，包括New England BioLabs，Beverly，MA。
还可利用PCR技术获得预期DNA片段，其中，正向和反向引物均含有预期可在扩增之后被切割的限制位点，从而使该基因可以被插入上述载体中。可选地，正如本领域所熟知的，可将PCR产物直接克隆进含有T-突出端的载体中(Promega Corp.，A3600，Madison，WI)。
所表达的嵌合蛋白可在宿主细胞内自组装成颗粒，而无论该宿主细胞是单细胞还是多细胞宿主的细胞。利用标准操作方法收获含有颗粒的细胞，并利用弗氏压碎器、溶菌酶、超声波仪、玻珠搅拌器或微流化器(Microfluidics International Corp.，Newton MA)裂解细胞。澄清裂解物后，采用45％硫酸铵使颗粒沉淀，重新悬浮在pH6.8、20mM磷酸钠中，并采用相同的缓冲液透析。通过短暂的离心将透析物澄清，并采用CL-4B对上清液进行凝胶过滤层析。鉴定含有颗粒的组份，进行羟磷灰石层析，并在重新悬浮之前再次进行硫酸铵沉淀，随后进行透析和无菌过滤，并-70℃保存。
HBc嵌合体偶联物
需要B细胞或T细胞反应的任何半抗原(免疫原)均可与考虑的HBc嵌合体或嵌合体颗粒，诸如含有异源接头残基的嵌合体颗粒连接，从而形成HBc嵌合体偶联物，所述异源接头残基诸如结构域II的环区中的赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸、半胱氨酸或酪氨酸，以及被添加在靠近结构域I的N-末端的半胱氨酸残基。所关注的半抗原典型地是B细胞免疫原。该半抗原可为多肽、蛋白质、碳水化合物(糖类；即寡糖或多糖)或非多肽、诸如2，4-二硝基苯的非碳水化合物或诸如可卡因或尼古丁的药物。例证性的糖类化合物包括NTHi或M.cat.[Sun et.al.(2000)Vaccine 2000，18(13)：1264-1272；和Jiao et.al.(2002)Infect.Immun.，70(11)：5982-5989]的脂寡糖(LOS)。LOS由疏水脂A部分和亲水核心寡糖部分组成，并且是革兰氏阴性菌外膜中的一种主要组分。去毒LOS(dLOS)分子被脱氧酰化和/或脱氮酰化，所表现的内毒性比Hochstein(1990)在Clinical application of the Limulus amoebocyte lysate test，R.B.Prior，ed.CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL，38-49页所描述的鲎变形细胞溶解物(LAL)试验中的起始LOS降低了大约100到大约10,000倍。
本领域已知许多可使载体蛋白与多糖偶联的方法。醛基可被制备在寡糖或相对较小的多糖的还原末端[Anderson(1983)Infect.Immun.，39：233-238；Jennings et al.(1981)J.Immunol.，127：1011-1018；Poren et al.(1985)Mol.Immuno l.，22：907-919]或末端[Anderson et al.(1986)J.Immunol.，137：1181-1186；Beuvery et al.(1986)Dev.Bio.Scand.，65：197-204]，可通过还原性氨基化与所述载体蛋白连接。此外，高碘酸盐离子氧化相邻羟基后，利用氰基氢硼化物对所获的醛进行还原氨基化，尤其适用于那些在嵌合体的免疫原性环中添加有可提供ε-胺的赖氨酸残基的HBc嵌合体分子。
大的多糖可通过末端活化[Anderson et al.(1986)J.Immunol.，137：1181-1186]或对沿该多糖链的若干官能团进行的随机活化[Chuet al.(1983)Infect.Immun.，40：245-256；Gordon，U.S.PatentNo.4,619,828(1986)；Marburg，U.S.Patent No.4,882,317(1989)]而得以偶联。对沿多糖链的若干官能团的随机活化可生成一种由于沿该多糖链的随机连接而高度交联的偶联物。多糖与载体蛋白的最佳比例取决于所采用的特定多糖、载体蛋白和偶联物。
对使糖类与载体蛋白偶联的方法的具体论述可参见Dick等人在Contributions to Microbiology and Immunology，Vol.10，Cruseet al.，eds.，(S.Karger：1989)，48-114页；Jennings等人在Neoglycoconjugates：Preparation and Applications，Lee et al.，eds.，(Academic Press：1994)，325-371页；Aplin et al.，(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.，10：259-306；和Stowell et al.(1980)Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.，37：225-281。
糖类本身可通过本领域已知的方法合成，例如通过Witte et al.(1997)J.Am.Chem.Soc.，119：2114-2118所描述的酶促糖蛋白合成方法。
下文通过寡糖实例，即考虑的可用于制备本发明HBc偶联物的半抗原，论述了若干种合成、半合成和天然的寡糖。
适用于制备可治疗b型流感嗜血菌(Hib)的疫苗的寡糖半抗原由下述部分组成，即2到20个重复的D-核糖-D-核糖醇-磷酸(I，见下文)、D-核糖醇-磷酸-D-核糖(II，见下文)或磷酸-D-核糖-D-核糖醇(III，见下文)。Eduard C.Beuvery et al.，EP-0276516-B1。
U.S.Patent No.4,220,717也公开了一种用于b型流感嗜血菌的多核糖基核糖醇磷酸(PRP)半抗原。
Peterson et al.(1998)Infect.Immun.，66(8)：3848-3855公开了一种三糖半抗原αKdo(28)αKdo(24)αKdo，可提供保护以免受肺炎衣原体的侵袭。肺炎衣原体是从咽炎到致命肺炎的人类呼吸道感染的一个病因。Kdo是3-脱氧-D-甘露糖-辛-2-酮糖酸。
Andersson et al.，EP-0126043-A1公开了可被用于治疗、预防或诊断肺炎链球菌所导致的细菌感染的糖类。一类有用的糖来源于二糖GlcNAcβ1 3Gal。上述Andersson等人还报导了有用的新乳糖四苷神经酰胺，即Galβ1 4glcNAcβ1 3Galβ1 4Glc-Cer。
McKenney et al.(1999)Science，284：1523-1527公开了一种可提供保护以免受金黄色葡萄球菌感染的聚N-琥珀酰-β1 6GlcN(PNSG)。金黄色葡萄球菌是包括心内膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、肺炎和脓肿在内的社区获得性感染的常见病因。
欧洲专利No.0157899-B1公开了适用于本发明的肺炎球菌多糖的分离方法。下表所列为可生成作为半抗原适用于本发明的荚膜多糖的肺炎球菌培养物类型。
多糖半抗原来源
  Danish类型命名   U.S.命名   1978ATCC目录号
  1   1   6301
  2   2   6302
  3   3   6303
  Danish类型命名   U.S.命名   1978ATCC目录号
  4   4   6304
  5   5
  6A   6   6306
  6B   26   6326
  7F   51   10351
  8   8   6308
  9N   9   6309
  9V   68
  10A   34
  11A   43
  12F   12   6312
  14   14   6314
  15B   54
  17F   17
  18C   56   10356
  19A   57
  19F   19   6319
  20   20   6320
  22F   22
  23F   23   6323
  25   25   6325
  33F   70
据报导，黏膜炎莫拉氏菌(布兰汉氏球菌属)是儿童中耳炎和窦炎，以及成人下呼吸道感染的一个病因。该菌的脂寡糖(LOS)表面抗原的脂质A部分在3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖酸-葡糖胺键合处被裂解。采用温和的碱或酰肼对裂解产物进行处理，以除去与酯连接的脂肪酸，同时保留与酰胺连接的脂肪酸，可获得黏膜炎莫拉氏菌来源的去毒脂寡糖(dLOS)。dLOS与蛋白载体连接之前都不具有免疫原性。Xin-Xing Gu et al.(1998)Infect.Immun.，66(5)：1891-1897。
B型链球菌(GBS)是人类脓毒症、脑膜炎和相关的神经失调的病因。已知荚膜多糖特异性抗体可保护人类婴儿不受感染。Jennings etal.，U.S.Patent No.5,795,580。II型GBS荚膜多糖的重复单位是：4)-β-D-GlcpNAc-(13)-[β-D-Galp(16)]-β-D-Galp(14)-β-D-Glcp-(13)-β-D-Glcp-(12)-[α-D-NeupNAc(23)]-β-D-Galp-(1，其中括号部分是与直接位于其后的无括号亚单位相连的一个分支。V型GBS荚膜多糖的重复单位是：4)-[α-D-NeupNAc-(23)-β-D-Galp(14)-β-D-GlcpNAc-(16)]-α-D-Glcp-(14)-[β-D-Glcp-(13)]-β-D-Galp(14)-β-D-Glcp-(1。
Brade的欧洲专利申请No.EU-0641568-A1公开了从沙眼衣原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体获得梯状带型抗原的方法。
Slovin et al.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，96(10)：5710-5715报导了合成寡糖globo H与KLH连接，作为载体在制备抗前列腺癌的疫苗方面的用途。同样，Helling et al.，(July 1995)Cancer Res.，55：2783-2788报导了与KLH-连接的GM2在治疗黑素瘤患者的疫苗中的用途。后一种疫苗是通过下述方法制备的，即对GM2的神经酰胺双键进行臭氧裂解，导入醛基并还原氨基化到KLH上。可采用考虑的嵌合体颗粒进行类似的操作。
同样，鞘脂，诸如位于其它肿瘤细胞以及正常细胞，如黑素瘤、成神经细胞瘤和健康大脑细胞的表面上的红细胞糖苷脂和神经节苷脂的寡糖部分也可在本发明中被用作半抗原。红细胞糖苷脂globo H的寡糖部分具有Fucα-(12)-Galβ(13)-GalNAcβ-(13)-Galα-(14)-Galβ-(14)Glc结构，而神经节苷脂GM2、GM1和GD1a的糖部分则分别具有下列结构：GalNAcβ-(14)-[NeuAcα-(23)]-Galβ-(14)-Glc；Galβ-(13)-GalNAcβ-(14)-[NeuAcα-(23)]-Galβ-(14)-Glc；和NeuAc-(23)-Galβ-(13)-GalNAcβ-(14)-[NeuAcα-(23)]-Galβ-(14)-Glc。
U.S.Patent No.4,356,170公开了有用多糖的制备方法，即还原后进行氧化，形成具有末端醛基的化合物，该末端醛基可被还原氨基化至载体蛋白，诸如存在或缺乏显著交联的破伤风类毒素和白喉类毒素的游离胺基团上。典型的有用的细菌多糖包括β-溶血链球菌、流感嗜血菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌和大肠杆菌。将接头臂，诸如ε-氨基C2-C8烷基羧酸提供的接头臂还原胺化至上述多糖上，并随后采用水溶性碳化二亚胺将其与所述颗粒键合，要胜于使颗粒还原胺化。
因此，术语“半抗原”在本文中的含义比其常用含义更广泛一些，包括了本身不诱导免疫反应的小分子，以及通常本身可诱导免疫反应的大分子，诸如蛋白。如下所述，所形成的HBc嵌合体颗粒偶联物可被用作接种物或疫苗。由于该嵌合体蛋白在表达后可自组装，且偶联物也在表达后形成，偶联物的形成典型地是利用已组装的颗粒实现的，而不是利用游离蛋白分子。
通过蛋白或多肽的氨基酸残基侧链使单个半抗原(免疫原)与该蛋白或多肽操作性地连接，以形成悬垂连接的免疫原性偶联物，例如支链多肽聚合物的方法是本领域所熟知的。这些方法包括通过多种侧链上一个或多个类型的官能团的连接，并导致所述颗粒内的载体蛋白多肽主链(在此处指HBc嵌合体)与所述半抗原悬垂连接---共价连接(偶连)---但间隔至少一条侧链。
Erlanger，(1980)Method of Enzymology，70：85；Aurameas etal.，(1978)Scand.J.Immunol.，Vol.8，Suppl.7，7-23和Nestor等人的美国专利U.S.4,493,795描述了利用上述各官能团将载体蛋白与半抗原连接的方法。此外，还可实施Rodwell et al.(1985)Biotech.，3：889-894描述的定点偶联反应，以使上述多肽的生物学活性基本上不被削弱。
此外，正如本领域所熟知的，HBc蛋白和多肽半抗原均可以它们的天然形态被利用，或者可通过将赖氨酸残基琥珀酰化或与半胱氨酸-硫内酯反应，从而改变其官能团含量。还可通过氨基官能团与3-(3-二硫代吡啶基)-丙酸酯的N-羟基琥珀酰亚胺酯，即2-亚氨基硫醇或本领域已知的其它试剂进行的反应，将巯基整合进载体蛋白或偶联物中。
还可对HBc嵌合体或半抗原进行修饰，以整合一个间隔臂，诸如六亚甲基二胺或其它双功能分子，从而有利于悬垂连接。下文论述了一种这样的操作方法。
用于共价结合多肽半抗原的诸多方法有很大不同，是免疫学领域的技术人员所熟知的。例如，根据U.S.Patent No.4,818,527公开的方法，使m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(ICNBiochemicals，Inc.，Costa Mesa，CA)或琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)与合适的HBc嵌合体反应，以形成活化载体。随后，使该活化载体与半抗原反应，以形成共价结合的HBc嵌合体偶联物，半抗原则诸如以巯基为末端的半抗原，或含有末端半胱氨酸或已添加额外的氨基或羧基末端半胱氨酸残基的多肽。可选实例是，可首先使多肽半抗原的氨基与N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基硫代)丙酸酯(SPDP，Pharmacia，Piscataway，NJ)反应，并可在还原后，使含巯基的多肽与上述活化载体反应。当然，含硫部分与含双键的Michael受体可以被颠倒。供应商提供的文献以及Kitagawa，et al.(1976)J.Biochem.，79：233和Lachmann et al.，in 1986 Synthetic Peptides as Antigens，(Ciba Foundation Symposium 119)，pp.25-40(Wiley，Chichester：1986)均描述了上述反应。也可参见图5。
U.S.Patent No.4,767,842描述了若干种适用于本发明在载体与多肽之间建立共价连接的方法。其中一种方法是使甲苯二异氰酸酯在0℃的二恶烷缓冲溶剂中与载体反应，形成活化载体。随后，将多肽半抗原与该活化载体混合并反应，形成共价结合的HBc嵌合体偶联物。
尤其有用的是大量可在一个官能团末端形成二硫键，并在另一个末端形成酰胺键的异双功能剂，包括上述可在自身与HBc嵌合体或半抗原中的巯基之间形成二硫键的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)。典型的试剂包括多肽半抗原中的半胱氨酸残基和偶联配偶体上的胺，诸如上述载体蛋白中赖氨酸的ε-胺或其它游离氨基。已知多种这样的可形成二硫化物/酰胺的试剂。例如，参见Immun.Rev.(1982)62：185。
其它双功能偶联剂可形成硫醚，而不是二硫键。许多成硫醚剂可通过商业渠道获得，包括6-马来酰亚胺己酸、2-溴乙酸、2-碘乙酸、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸等的反应性酯。羧基可通过与琥珀酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸、钠盐结合而被活化。对本发明方法而言，尤其优选的偶联试剂是从Pierce Chemical Co.，Rockford，IL获得的琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)。另一种异双功能交联剂是N-(γ-马来酰亚胺氧化丁酰)琥珀酰亚胺酯(GMBS)及其磺酸盐(硫代-GMBS)，和可获得自PierceChemical Co.的类似化合物。上文所列化合物并非详尽，这些化合物的变型显然也可被应用。图5提供了利用SMCC形成HBc活化载体(I)，并随后使该活化载体与以巯基为末端的半抗原反应(II)的示意图(方案1)。
可采用本领域熟知的多种方法获得多肽半抗原。常用的肽合成技术可方便地应用。例如，可采用重组和以PCR为基础的技术，获得较长的肽。由于所需要的序列通常较短，可采用固相化学合成。
典型的多肽半抗原如上文表A和B所示。这些多肽均可通过自身的N-末端氨基，或者通过利用表中未显示的额外的N-末端半胱氨酸而被利用。
相关的化学方法被用于将被称为“化合物”的物质与载体蛋白偶联。典型的是将用于偶联的合适官能团设计在该化合物中。可诱导抗肺炎链球菌的抗体的典型化学半抗原是6-O-磷酸胆碱羟基己酸酯。Fischer et al.(1995)J.Immunol.，154：3373-3382。下表提供了其它典型的化学半抗原。
涉及有用半抗原的进一步说明可参见上文，和现已公开的U.S.Patent Application Serial No.09/930,915及其它亲本申请。
接种物和疫苗
在本发明的另一个实施方案中，采用了HBc嵌合体颗粒或与半抗原偶联的HBc嵌合体颗粒作为接种物或疫苗的免疫原，应用在人类患者或合适的动物宿主中，诸如黑猩猩、小鼠、大鼠、马、绵羊等。接种物可诱导B细胞或T细胞反应(刺激)，诸如生成可与免疫原性表位或半抗原发生免疫反应的抗体，或者活化T细胞，而疫苗则提供保护，以免受特定实体的侵袭，通过B细胞和/或T细胞反应可由该实体获得免疫原。
T细胞活化可通过多种技术测定。在常用方法中，采用了考虑的HBc嵌合体颗粒疫苗或接种物接种宿主动物，并随后采集外周单核血细胞(PMBC)。在T细胞免疫原存在条件下体外培养PMBC大约3-5天。然后测定所培养的PMBC的增殖或诸如IL-2、GM-CSF或IFN-γ的细胞因子的分泌。测定T细胞活化的方法是本领域所熟知的。例如，参见U.S.Patent No.5,478,726，及其引用的文献。
以抗体形成为例，考虑的接种物或疫苗包括溶解或分散在药学可接受稀释组合物中的免疫原性有效量的HBc嵌合体颗粒或HBc嵌合体颗粒偶联物，其中的稀释组合物典型地还包括水。当对需要免疫或需要在其体内诱导抗体的宿主动物，诸如哺乳动物(例如小鼠、犬、山羊、绵羊、马、牛、猴、猿或人)或禽类(例如鸡、火鸡、鸭或鹅)施用时，接种物可诱导与遗传连接的或偶联的(悬垂连接的)半抗原发生免疫反应的抗体。这些抗体优选地还可与B细胞免疫原的蛋白或糖结合。
每次免疫接种所采用的重组HBc嵌合体免疫原的量被称为免疫原性有效量，并如下所述，可存在较大变动，该变动尤其取决于重组HBc嵌合免疫原、接受免疫的患者和疫苗中存在的佐剂。如上所述，疫苗和接种物的免疫原性有效量分别提供了预防作用或抗体活性。
疫苗或接种物典型地含有浓度为每次接种大约1微克到大约1毫克(单位剂量)的重组HBc嵌合体免疫原，优选浓度是大约10微克到大约50微克/单位剂量。与本发明的疫苗或接种物相关的术语“单位剂量”指适合以单位剂量形式用于动物的物理分散单位，每个单位含有预定量的活性物质，该预定量是经过计算可单独或与所需稀释剂，即载体或媒介物一起共同产生预期免疫原性效果的量。
疫苗或接种物典型地通过将免疫原，优选颗粒形式的免疫原分散在诸如水、盐水、磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)、乙酸盐缓冲盐溶液(ABS)、林格液等的生理学可耐受的(可接受的)稀释媒介物中，形成含水组合物，从而得以从已回收的重组HBc嵌合体免疫原中制备的。稀释媒介物还可包括含油物质，诸如下述的花生油、角鲨烷或角鲨烯。
含有蛋白类物质作为活性成分的接种物和疫苗的制备也是本领域熟知的。典型地，这种接种物或疫苗是以液体溶液或悬浮液的肠胃外制剂形式制备的；也可制备成适合在注射之前溶解或悬浮在液体中的固体形式。所述制剂也可以是被尤其优选的乳化形式。
具有免疫原性的活性成分通常与药学可接受且与该活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂诸如水、盐溶液、葡萄糖、甘油、乙醇等及它们的组合。此外，如果需要，接种物或疫苗可含有少量可增强该组合物的免疫原性效果的辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂。
考虑的疫苗或接种物优选地还包括佐剂。适用于本发明疫苗和接种物的佐剂包括可增强针对所述嵌合体中B细胞表位的抗体反应的佐剂，以及可增强细胞介导的针对所述嵌合体中T细胞表位的反应的佐剂。这些佐剂是本领域所熟知的(例如，参见Vaccine Design-The Subunit and Adjuvant Approach，1995，PharmaceuticalBiotechnology，Volume 6，Eds.Powell，M.F.，和Newman，M.J.，Plenum Press，New York和London，ISBN 0-306-44867-X)。
典型的佐剂包括不用于人的完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)、角鲨烯、角鲨烷和明矾[例如，AlhydrogelTM(Superfos，Denmark)]，这些佐剂均是本领域所熟知并可通过若干商业渠道获得的。
可与本发明免疫原一起应用的优选佐剂包括铝盐或钙盐(例如，氢氧化物或磷酸盐)。尤其适用于本发明的优选佐剂是氢氧化铝凝胶，诸如AlhydrogelTM。对氢氧化铝凝胶而言，是将所述嵌合体蛋白与该佐剂混合，使每一剂量含有大约50到大约800微克铝，优选含有大约400到大约600微克铝。另一种尤其优选的佐剂是可获得自SuperfosBiosector，Denmark的商标为Adju-PhosTM的磷酸铝。初期的磷酸铝颗粒具有板状形态，直径为大约50到大约100nm，产物中的最终颗粒尺寸为大约0.5到大约10μ。磷酸钙毫微粒(CAP)是由Biosante，Inc(Lincolnshire，IL)研制的一种佐剂。所关注的免疫原可以被包被在颗粒外部，或者被密封在颗粒内部[He et al.，(Nov.2000)Clin.Diagn，Lab.Immunol.，7(6)：899-903]。
另一种尤其适合与本发明免疫原结合应用的优选佐剂是乳剂。考虑的乳剂可以是水包油乳剂或油包水乳剂。除所述免疫原性嵌合体蛋白外，这种乳剂还包括已被熟知的角鲨烯、角鲨烷、花生油等的油相，以及分散剂。优选的是非离子型分散剂，这种分散剂包括山梨聚糖和二缩甘露醇的单-和双C12-C24-脂肪酸酯，诸如山梨聚糖单硬脂酸酯、山梨聚糖单油酸酯和二缩甘露醇单油酸酯。含有免疫原的乳剂是以乳剂形式施用的。
上述乳剂优选的是油包水乳剂，包括在水相中与所述嵌合体蛋白一起乳化的角鲨烯和二缩甘露醇单油酸酯(ArlacelTMA)，并任选地包括角鲨烷。这些乳剂包括众所周知的MontanideTM ISA-720和MontanideTM ISA 703(Seppic，Castres，France)，这两种乳剂均被认为含有角鲨烯和角鲨烷，且均以角鲨烯为主，但角鲨烯在MontanideTM ISA 703中所占比重较小。最优选的是采用MontanideTMISA 720，且所采用的油-水比例为7∶3(w/w)。其它优选的水包油型乳剂佐剂包括WO 95/17210和EP 0399843公开的佐剂。
本发明还考虑了小分子佐剂的用途。适用于本发明的一类小分子佐剂是U.S.Patents No.4,539,205、No.4,643,992、No.5,011,828和No.5,093,318中描述的7-取代-8-氧-或8-硫-鸟苷衍生物，这些专利的公开内容均被引入作为参考。在这些佐剂中，7-烯丙基-8-氧化鸟苷(loxor ibine)尤其优选。其分子已被证实在诱导抗原-(免疫原)特异性反应方面尤其有效。
优选的有用佐剂包括单磷酰脂质A(MPL)，3-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)，是Ribi Immunochem，Hamilton，Montana生产的一种已被熟知的佐剂。该佐剂在2％角鲨烯/80乳剂中含有3个提取自细菌的组分：单磷酰脂质(MPL)A、二分支菌酸(TDM)和细胞壁骨架(CWS)(MPL+TDM+CWS)。该佐剂可通过GB2122204B所述方法制备。3-脱氧-酰化单磷酰脂质A的优选形式为具有直径小于0.2μm的粒度的乳剂形式(EP 0689454B1)。最优选的是MPL的合成单糖类似物，被称为氨烷基葡糖酰胺4-磷酸(AGPs)，诸如被冠名为RC-529出售的{2-[(R)-3-十四烷酰羟基-十四烷酰-氨基]-乙基-2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四烷酰基-羟基十四烷酰基]-2-[(R)-3-四-癸酰基羟基四-十四烷酰基氨基]-p-D-吡喃葡糖苷三乙基铵盐}。RC-529可应用在角鲨烯乳剂中，以RC-529SE为名出售，也可以含水配方形式，冠名为RC-529AF，可获得自Corixa Corp.(参见，U.S.Patents No.4,987,237和No.6,113,918)。这些佐剂可单独应用，或者与一种或多种其它佐剂，诸如AlhydrogelTM组合应用。
进一步考虑的佐剂包括含有CpG核苷酸基序一次或多次(外加侧翼序列)的合成寡核苷酸佐剂，可获得自Coley PharmaceuticalGroup。可获得自Aquila Biopharmaceuticals，Inc.的被命名为QS21的佐剂是一种具有免疫原性的活性皂苷组分，具有来源于南美树种Quillaja saponan Molina树皮的佐剂活性(例如QuilTM A)，其生产方法公开在U.S.Patent No.5,057,540中；Quillaja saponanMolina皂苷的半合成和合成衍生物也有用，诸如U.S.PatentsNo.5,977,081和No.6,080,725所描述的衍生物。U.S.PatentsNo.5,709,879和No.6,086,901描述了可获得自Chiron Corp.的被命名为MF59的佐剂。
本发明还考虑了胞壁酰二肽佐剂，包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thur-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺[CGP11637，被称为正-MDP]和N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-s n-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺[(CGP)1983A，被称为MTP-PE]。U.SPatent No.4,767,842描述了所谓的胞壁酰二肽类似物。
优选的佐剂混合物包括3D-MPL和QS 21的组合(EP 0671948B1)、含有3D-MPL和QS21的水包油型乳剂(WO 95/17210，PCT/EP98/05714)、与其它载体配伍的3D-MPL(EP 0689454B1)、被配制在含胆甾醇的脂质体中的QS 21(WO 96/33739)，或具有免疫刺激性的寡核苷酸(WO 96/02555)。可获得自SKB(现为Glaxo-SmithKline)的SBAS2(现为ASO2)在水包油乳剂中含有QS21和MPL。可选的佐剂包括WO 99/52549描述的佐剂，和聚氧乙烯醚的非颗粒性悬浮液(英国专利申请号9807805.8)。
佐剂是以佐剂用量应用，该佐剂用量可根据所述佐剂、哺乳动物和重组HBc嵌合体免疫原的不同而改变。典型用量可在每次接种大约1μg到大约1mg的范围内变化。本领域技术人员已知如何方便地确定合适的浓度或用量。
接种物和疫苗通常是通过注射以肠胃外方式施用，例如皮下或肌内注射。适用于其它施用模式的其它配方包括栓剂，以及某些情况下的口服配方。本发明还考虑了Neirynck et al.(1999)Nature Med.，5(10)：1157-1163论述的鼻腔喷雾剂用于接种的用途。对栓剂而言，传统粘接剂和载体可包括，例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；这些栓剂可由含0.5％-10％，优选1-2％活性成分的混合物制成。口服配方包括常用的赋形剂，例如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
接种物或疫苗组合物采用了溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释配方或粉末形式，并含有免疫原性有效量的HBc嵌合体或HBc嵌合体偶联物，该HBc嵌合体或HBc嵌合体偶联物优选地以颗粒形式作为活性成分。正如上文所指出的，在典型的组合物中，优选HBc嵌合体或HBc嵌合体偶联物颗粒的免疫原性有效量为每剂量含有大约1μg到大约1mg活性成分，更优选的是每剂量含有大约5μg到大约50μg活性成分。
疫苗典型地被配制用于肠胃外施用。典型的免疫接种是通过皮下(SC)、肌内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)或真皮内(ID)注射实现的。但本发明还考虑了口腔和鼻腔途径的疫苗接种。
所述HBc嵌合体颗粒和HBc嵌合体颗粒偶联物可被配制成中性或盐形式的疫苗。药学可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白或半抗原的游离氨基一起形成)，是与无机酸，诸如氢氯酸或磷酸，或诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸一起形成的。与游离羧基形成的盐也可衍生自诸如钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物的无机碱，和诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等有机碱。
在另一种实施方案中，本发明考虑了一种疫苗或接种物，其中，编码了考虑HBc嵌合体的基因被转染进经过适当减毒的肠道细菌中，诸如伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂合体或大肠杆菌。上文提供的引用文献中论述了典型的已减毒或无毒的伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂合体。这些疫苗和接种物被认为尤其适用于抗感染或通过鼻黏膜、肠道和呼吸道传播的疾病，诸如流感、酵母，诸如曲霉属和念珠菌属，病毒，诸如脊髓灰质炎病毒、口蹄疫病毒、甲型肝炎病毒，以及细菌，诸如霍乱菌属、沙门氏菌属和大肠杆菌，其中除了IgG系统反应外，还需要黏膜IgA反应，或者是以该IgA反应代替IgG系统反应。
上述肠道细菌可被冻干，与干的药学可接受稀释剂混合后，制成可摄取和被施用给宿主动物的片剂或胶囊，或者是以常用固相药物形式被宿主动物服用。此外，这些细菌疫苗的含水制剂适用于黏膜接种，如通过口腔、鼻腔、直肠或阴道施用。
利用了含有考虑嵌合分子颗粒的植物物质的口服免疫接种可通过简单地摄取诸如胡萝卜的根或诸如水稻或玉米的种子的转基因植物组织而得以实现。在该情况下，口腔或胃肠道中的水提供了被常用于免疫接种的含水介质，周围的植物组织则提供了药学可接受稀释剂。
上述接种物或疫苗是以与剂量配方相容的方式，以及诸如治疗有效量和免疫原性有效量的用量被施用的。施用量取决于接受治疗的对象、该对象的免疫系统合成抗体的能力，以及预期的保护程度。需施用的活性成分的准确数量取决于医师的判断，个体不同，用量也不同。不过，合适的剂量范围是对每一个体施用数十微克量级的活性成分。最初施用和加强接种的合适方案也可变化，但典型地在首次施用后的一定间隔时间(数周或数月)后再进行1次注射或以其它方式施用。
一旦接种，便可使哺乳动物维持一段时间，足以使所述重组HBc嵌合体免疫原诱导产生足够效价的抗体，该抗体结合了被关注的抗原，诸如对疟疾疫苗而言的子孢子。用于生成例证性的抗子孢子抗体的维持时间典型地持续大约3到大约12周，并可包括1次加强免疫，或第2次免疫施用该疫苗。本发明还考虑了在需要时，还可在首次免疫接种后24周到5年内进行的第3次接种。尤其考虑到，一旦达到预防性水平的抗体效价，便可通过以大约1到大约5年的间隔定期进行加强免疫接种，使已接种疫苗的哺乳动物优选地维持在抗体效价水平上或接近该抗体效价水平。
疟疾疫苗情况中的抗子孢子或其它抗体的生成可通过下述方法快速确定，即从已免疫接种的哺乳动物体内获得血浆或血清样品，通过下述ELISA或本领域熟知的诸如蛋白质印迹法的其它免疫测定方法，测定样品中抗体结合合适抗原，诸如合成环子孢子免疫优势抗原[例如本发明所采用的恶性疟原虫CS蛋白肽(NANP)5]的能力。
业已指出，可利用已被熟知的技术从已接种的宿主哺乳动物的血液中分离被诱导产生的抗体，诸如抗CS抗体或抗流感抗体，并随后将其重构成为用于被动免疫接种的第二种疫苗，该技术也已被熟知。类似技术可用于人类的γ-球蛋白免疫接种。例如，可使来自一种或多种已免疫宿主的抗血清沉淀在硫酸铵水溶液中(典型地为40-50％饱和度)，并通过层析方法纯化沉淀的抗体，例如利用亲和层析，其中，(NANP)5或流感M2多肽被作为抗原固定在层析柱上。因此，例如，可将接种物应用在马或绵羊体内，以诱导产生抗疟疾病原体的抗体，应用在诸如人的其它动物的被动免疫接种中。
本发明的另一种实施方案是在动物宿主体内诱导抗体和/或活化T细胞的方法，包括采用接种物接种所述动物宿主的步骤。该方法采用的接种物包括溶解或分散在药学可接受稀释剂中的免疫原性量的上述HBc嵌合体颗粒或HBc嵌合体颗粒偶联物。可维持动物宿主一段足以诱导抗体或活化T细胞的时间，该时间段可通过已被熟知的技术确定，典型地需要数周至数月的时间，这也是众所周知的。本发明考虑了在该维持期间进行的多种这样的免疫接种。可预测二硫键的计算机建模
二硫键预测是利用SS-BOND程序[Hazes et al.，Protein Eng 2，119-25(1988)]进行的，该程序需要与被关注蛋白质有关的三维结构信息。HBc结构坐标可从Protein Data Bank下载(即Wynne等人解决的结构)，删除了针对最后三个单体的坐标，因为该结构包括2个二聚体的信息。
当在标准个人电脑上运行时，该程序自动选择对预测二硫键时所考虑的3个参数而言最严格的条件：(1)χ-3角，是与Sγ-Sγ键有关的旋度(理想的是±90°，与该角的偏角被设定为0°)，(2)容许键形成所必需的最大能量(理想的是低于10千卡/摩尔)，和(3)对特定键而言，在最小可能的能量构型上所容许的能量差异(推荐的最大值为5千卡/摩尔)。不过，为了获得与免疫优势环螺旋(ILH)1(50-73号位氨基酸)和ILH2(79-110号位氨基酸)之间二硫键形成对应的任意命中结果，必须放宽上述条件。如果从Linux操作系统运行该程序，可对上述参数进行编辑。
放宽上述后两个参数后，未获得其它命中结果。但放宽χ-3角，且当容许该键有30°旋度时，可获得5种可能的嵌合体(见表)。最大容许偏角为90°时，在29°和72°旋度之间未获得其它命中结果；因此，该命中结果不被计入该研究中。随后，利用程序GRASP[Nicholls etal.，Proteins 30，9686-97(1991)]检验由上所获产物的侧链位置，用于表观检验氨基酸的接近度。除72°旋度时的命中结果外，所有命中结果似乎在空间上接近，因此，可克隆这些嵌合体。虽然29°不存在于任一ILH中，该研究仍然包括了29°旋度时获得的命中结果，因为这些残基位于实际的免疫优势环中。表位插入序列被插入在D78和P79氨基酸之间，所以桥连将出现在该表位的底部。
桥连两个主要HBc免疫优势螺旋的SS-BOND命中结果
*位于免疫优势环中，而不是位于免疫优势螺旋中
本发明通过下述非限制性实例得到例证。
实施例1：具有半胱氨酸突变的嵌合体的构建
A.质粒载体pKK223-3N和半胱氨酸取代
Zheng et al.，J.Biol Chem 267，9422-9429(1992)发现在HBc183单体序列中出现的4个半胱氨酸中，有2个半胱氨酸未参与二硫键结合。48号位的半胱氨酸被发现在特定样品中部分地共价结合，107号位的半胱氨酸则被发现是以游离硫醇的形式存在。这些半胱氨酸的突变被发现并不影响颗粒的组装或稳定性，并且检测不到巯基反应性，从而确证61和183号位的半胱氨酸均通过二硫键被完全结合。
C48和C107号位的半胱氨酸残基均突变为丝氨酸残基，将易于量化含有导入的半胱氨酸的颗粒中的巯基含量。这是保守性突变，因为丝氨酸是在化学上与半胱氨酸最相似的氨基酸---它们除了巯基与羟基R基团不同外，其它均相同。以该嵌合体作为所有后续嵌合体的模板。制备该模板的2种形式，其中一种的末端位于V149[HBc149(C48S/C107S)]，另一个则在C-末端具有额外的半胱氨酸[HBc149(48S/C107S)+C]。
所述HBc基因最初被克隆进可获得自Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)的pKK223-3载体中。通过PCR修饰多克隆位点，使其包括NcoI位点。所有PCR反应均利用可获得自MJ Research(Waltham，MA)的MinicyclerTM进行。所有研究的PCR反应条件如下：
第1步---94℃，3分钟
第2步---92℃，1分钟
第3步---50℃，1分钟
第4步---72℃，40秒
第5步---返回第二步重复14次
第6步---72℃，5分钟
第7步---4℃，10分钟
第8步---结束
所有寡核苷酸PCR嵌合体均由Invitrogen(Carlsbad，CA)合成，应用浓度为1μM，而各反应所必需的模板约为0.1μg。Vent聚合酶(NewEngland BioLabs，Beverly，MA)是扩增酶，且所有反应均被发现无必要加入额外的氯化镁。下表2列出了所有被提及的引物，且所有限制酶均购自New England BioLabs。
各引物的DNA序列均通过Sequi-Net(Fort Collins，CO)进行的自动DNA测序而得以验证。质粒原种是利用用于质粒分离的Qiagen(Valencia，CA)Midi Kit创建的。序列列表提供了利用PCR获得的所有嵌合体的完整基因核苷酸序列。
引物序列如下表2所示，其中HBc氨基酸残基被显示在正向引物核苷酸序列的上方，和反向引物核苷酸序列的下方。粗斜体氨基酸残基和碱基表示取代。所关注的限制位点如粗体所示。所有序列均从5′到3′书写。
表2
Figure G2003801096124D00841
嵌合体HBc149和HBc149+C
载体pKK223-3(图2)是采用引物1和2扩增的。随后采用SphI和HindIII消化PCR产物和亲代载体，并利用购自Qiagen的QIAEXII凝胶提取系统从1.25％琼脂糖凝胶(凝胶设备购自Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中纯化消化产物。(注意：所有克隆化均利用这些设备和试剂进行)。进行消化时，从亲代载体切割下一个含有480个碱基对的片段---抛弃该片段，并使载体与含有458个碱基对的PCR产物连接。此时，该克隆(pKK223-3N，图2)能够接受两侧为NcoI和HindIII位点的插入片段。对pKK223-3载体进行该修饰的结果是多克隆位点中的所有限制位点均已缺失---仅在tac启动子和5SrRNA区之间保留了引物2来源的NcoI-EcoRI-HindIII序列。
HBV ayw亚型基因组(可获得自NCBI的序列)被用于克隆HBc基因。引物3和4连同149号位氨基酸后的终止密码子一起被用于添加侧翼的NcoI和HindIII位点。随后，采用NcoI和HindIII消化pKK223-3N载体和PCR产物。将从该载体上释放的一个含有12个碱基对的片段抛弃。并使该载体与约含450个碱基对的PCR片段连接，获得嵌合体HBc149。HBc149+C(CV-1123)是以相同方法制备，但采用了反向引物9(SEQ ID NO：248)，在149号位缬氨酸和终止密码子之间插入了一个半胱氨酸。
嵌合体HBc149(C48S/C107S)和HBc149(C48S/C107S)+C
为制备这两种在48和107号位含有从半胱氨酸到丝氨酸突变(C48S/C107S)的嵌合体，必需若干次PCR反应。首先利用内源EarI位点进行C107S突变。5′段是利用引物3和引物5生成的，导入了C107S突变。3′段是利用完全配对引物6和4制备的。这些片段(分别含有大约320和130个碱基对)均是利用EarI消化并连接的。
随后，以该连接作为模板，导入C48S突变。HhaI位点以沉默突变方式被导入A54中，实现了该突变。再次分两个部分进行PCR。利用引物3和7使上述5′段导入了C48S突变，而利用引物8和4制备3′段。随后采用HhaI消化这些产物(分别含有大约165和295个碱基对)，并进行连接。随后，采用引物3和可将终止密码子置于V149后的引物4，或可在V149后添加半胱氨酸并随后添加终止密码子的引物9，扩增上述连接产物。采用NcoI和HindIII消化含有大约450个碱基对的产物，并将其连接进如上制备的pKK223-3N载体中，获得嵌合体HBc149(C48S/C107S)和HBc149(C48S/C107S)+C。
以与构建C48S/C107S嵌合体类似的方式构建一组4种各含5个二硫化物的嵌合体----第一个突变是通过进行两个部分的PCR导入的，随后采用第一个连接产物作为模板，分两个部分导入第二个突变。制备的所有二硫化物嵌合体均具有C-末端半胱氨酸，且所有原始PCR均以HBc149(C48S/C107S)+C为模板进行。
嵌合体HBc149(C48S/C107S)L55C/H104C+C
沉默Cac8I位点被导入在HBc的E64残基周围，获得L55C突变。采用引物3和12扩增5′部分，采用引物13和9扩增3′部分。随后采用Cac8I消化这些PCR产物，并进行连接。随后分两个部分扩增连接产物。利用构建C48S/C107S嵌合体时所采用的EarI位点，将利用引物3和10获得的5′部分导入H104C突变，并在模板中保留C107S突变。3′部分利用了完全配对引物6和9。采用EarI进行消化后，连接片段并利用引物3和9再次进行扩增。利用NcoI和HindIII消化扩增产物，并将其克隆进如上制备的pKK223-3N中。
嵌合体HBc149(C48S/C107S)A58C/L100C+C
采用与上述实现L55C突变相同的方式，利用导入的Cac8I位点，制备导入了A58C突变的5′部分。引物3和14被用于产生A58C突变，而由引物13和9制备的相同3′PCR产物(见上述L55C/H104C)则被应用在该连接中。不过，为获得L100C突变，利用了内源Sau96I位点。5′部分是利用完全配对引物3和15制备的，而L100C突变则是利用引物16和9被导入在3′部分中。如上所述，利用Sau96I消化PCR产物，并进行连接，随后利用引物3和9再次进行扩增，并将扩增产物克隆进pKK223-3N中。
嵌合体HBc149(C48S/C107S)A69C/V89C+C
利用引物3和17和内源Bs tNI位点，在5′PCR中导入A69C突变。3′PCR利用了完全配对引物18和9。采用BstNI消化PCR产物，并进行连接。随后，将该连接产物用于在5′PCR部分中产生V89C突变，再次利用了天然存在于所述基因(引物3和11)中的Sau96I位点。利用完全配对引物19和9，未在3′PCR中导入任何突变。如上所述，对产物进行Sau96I消化，连接后，采用引物3和9将其再次扩增，并将扩增产物克隆进pKK223-3中。
嵌合体HBc149(C48S/C107S)W62C/F97C+C
与L 55C和A58C的情况一样，W62C突变是从Cac8I位点制备而得。引物3和20在5′部分中导入了该突变，但此处还采用了可被用于产生L55C和A58C突变的相同3′PCR产物。采用Cac8I消化PCR产物，连接后，进行第二轮PCR。利用引物21和9，将Sau96I位点再次用于产生3′F97C突变，而5′引物3和15是完全配对的。应当指出的是，制备该嵌合体所涉及的PCR必须按照该次序进行，获得F97C突变时导入额外的Cac8I位点的次序也如此。如上所述，采用Sau96I进行消化后，连接消化产物，采用引物3和9再次进行扩增，并将扩增产物克隆进pKK223-3中。
嵌合体HBc149(C48S/C107S)L76C/R82C+C
在HBc环中的A80-S81序列上产生沉默突变后，便可能将NheI位点导入该环，并可能仅经过两轮PCR便获得该嵌合体。利用引物3和22使5′段导入L76C突变，利用引物23和9使3′段导入R82C突变。采用NheI消化分别含有大约245和222个碱基对的PCR产物，并进行连接。随后利用引物3和9扩增该连接产物，获得含有450个碱基对的标准片段，该片段经过NcoI和HindIII消化后，被克隆进pKK223-3N中。
B.环插入载体的制备
4种经工程改造后具有5个半胱氨酸的嵌合体可成功地组装成HBc颗粒。因此，可测定这些嵌合体接受外源表位进入免疫优势环中的能力。此外，以不含任何导入的半胱氨酸的嵌合体作为对照，以比较组装能力，和稍后比较的稳定能力。表位被插入在HBc的78号位天冬氨酸和79号位脯氨酸之间。导入新的限制位点EcoRI和SacI后，使得所有表位在5′末端时，两侧均为Gly和Ile(由EcoRI限制位点编码)，在3′末端时，则两侧为Glu和Leu(由SacI限制位点编码)。因此，除不能形成组装颗粒的HBc149(C48S/C107S)L55C/H104C+C外，所有半胱氨酸嵌合体均首先被制成可在HBc序列的D78和P79号位氨基酸残基之间接受异源表位的载体。
通过PCR构建经过修饰的HBc149(V2和V16)或HBc183(V8)基因，这两种基因能够接受合成dsDNA片段定向插入在免疫优势环区域中。(接受了插入在D78和P79之间的插入片段并被截短至V149的质粒被命名为V2，在V149后含有额外的半胱氨酸的相同质粒则被命名为V16，接受了插入在D78和P79之间的插入片段并以C183为末端的质粒被称为V8)。采用2个PCR引物对，分两个部分扩增HBc149和HBc183基因，其中一个部分是扩增氨基末端，另一个部分是扩增羧基末端。对V2而言，PCR反应的产物是分别为249bp(N-末端)和243bp(C-末端)的两个片段；对V16而言，PCR产物是分别为249bp(N-末端)和246bp(C-末端)的两个片段；对V8而言，PCR产物则分别为249bp(N-末端)和349bp(C-末端)的两个片段。
采用NcoI和EcoRI消化已获得的N-末端片段，采用EcoRI和HindIII消化C-末端片段。随后，在共有的EcoRI突出端上，将V2、V16和V8片段对连接在一起。接着将所获NcoI-HindIII片段连接进已经过NcoI和HindIII消化而获得的pKK223-3N载体中。
为将B细胞表位插V2、V16和V8质粒中，采用了EcoRI和SacI限制酶消化合适的质粒。并随后插入含有5′EcoRI和3′SacI突出端的合成dsDNA片段。在V2、V16和V8所有情况中，甘氨酸-异亮氨酸(EcoRI)和谷氨酸-亮氨酸(SacI)氨基酸对均位于所插入的B细胞表位两侧。所插入的限制位点如下列引物中的下划线部分所示。
V2
HBc149/NcoI-F
5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA           SEQ ID NO：263
HBc-D78/EcoRI-R
5′-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC    SEQ ID NO：264
HBc-P79/BcoRI-SacI-F
5′-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG
                                       SEQ ID NO：265
HBc149/HindIII-R
5′-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG    SEQ ID NO：266
V16
HBc149/NcoI-F
5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA           SEQ ID NO：263
HBc-D78/EcoRI-R
5′-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC    SEQ ID NO：264
HBc-P79/EcoRI-SacI-F
5′-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG
                                       SEQ ID NO：265
HBc149+C/HindIII-R
5′-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG
                                       SEQ ID NO：267
V8
HBc149/NcoI-F
5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA            SEQ ID NO：263
HBc-D78/EcoRI-R
5′-GCGGAATTCCATCTTCCAAA TTAACACCCAC    SEQ ID NO：264
HBc-P79/EcoRI-SacI-F
5′-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG
                                        SEQ ID NO：265
HBc183/HindIII-R
5′-GGAAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCG        SEQ ID NO：268
由于半胱氨酸突变接近环区，有必要设计一组特定用于嵌合体HBc149(C48S/C107S)L76C/R82C+C的引物，而其它的全部嵌合体则采用相同的几组引物(下表2和表3)。5′部分是利用引物3和22(在HBc149(C48S/C107S)L76C/R82C+C的情况中采用引物23)，通过在3′末端添加EcoRI位点获得的。3′部分是利用可在这些片段上添加EcoRI位点和下游Sac I位点的引物24(在HBc149(C48S/C107S)L76C/R82C+C的情况中采用引物25)和9获得的。随后，采用EcoRI消化全部PCR产物，并连接各对应部分，再次采用引物3和9进行扩增。随后采用NcoI和HindIII消化这些扩增产物，并将它们克隆进预制的质粒pKK223-3N中。如前所述，各克隆的序列是通过自动DNA测序验证的。
选择表位的基础是过去表位在无导入半胱氨酸的等效载体(V16)中的成功或失败经验。选择了2种不能存在于V16中的表位----其中一种来自阿尔茨海默病所牵涉的β-淀粉样蛋白(1-32号位残基)[Morgan et al.，Nature 408，982-985(2000)]，另一种表位则为来自炭疽芽胞杆菌(Ba)的保护性抗原的701-721号位残基[Little etal.，Microbiology 142，707-715(1996)]。来自钩虫蛋白Asp-1(292-303号位残基)的表位(由George Washington University的Dr.Peter Hotez提供)在V16中的颗粒组装量低，但尚可检测；包括该表位可评估颗粒产量是否可以随着导入的二硫键的增加而提高。为比较该嵌合体与工程改造嵌合体的颗粒组装和稳定性，可包括在V16中表现了非常好的颗粒组装的最终表位。该表位来源自流感A M2蛋白的胞外域(2-24号位残基)[Zebedee et al.，J.Virol 62，2762-2772(1988)；和Neirynck et al.，Nat Med 5，1157-63(1999)]，在我们实验室利用该表位进行的工作中，发现其序列中的2个修饰是颗粒组装所必需的。下表3提供了所有表位序列。
寡核苷酸序列被设计为顶链和底链，退火时具有单链粘性末端，可被连接进如上制备的半胱氨酸改造载体中。寡核苷酸退火是利用Minicycler(MJ Research)进行的，包括添加等摩尔量的寡核苷酸(顶链和底链寡核苷酸各10μM)，并于95℃加热5分钟，随后每分钟降低1℃直到75℃。接着在TE缓冲液中以1∶20稀释含有退火寡核苷酸的溶液。该操作适用于引物对26和27、28和29、30和31，以及32和33。各二硫化物载体是通过下述步骤制备的，即采用EcoRI和SacI消化后，从所获的小片段中纯化出载体。随后将1μl的各种退火寡核苷酸连接进预制载体中。再次通过测序确定克隆序列。
表3
C.嵌合体的表达和纯化
确定序列后，将嵌合体与可表达lac阻抑蛋白的质粒pREP4(Qiagen)一起共同转化进大肠杆菌BLR菌株(Novagen，Madison，WI)中。通过氯化钙制备使细胞处于感受态[Sambrook et al.，Molecular cloning：a laboratory manual---2nd ed.Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989]。质粒pKK223-3具有tac启动子，但并未编码lac阻抑蛋白，所以该蛋白是由pREP4反式提供的，可在添加IPTG诱导HBc基因表达之前一直抑制其表达。将转化物接种在补充有50μg/L氨苄青霉素(pKK223-3携带了氨苄青霉素抗性标记)和10μg/L卡那霉素(pREP4携带了卡那霉素抗性标记)的LB平板上，以避免丢失这两种质粒。
随后将转化体挑进TB干培养基(Doc Frugal，San Diego，CA)的3ml起子培养物中培养过夜，其中的起子培养物含有相同浓度的上述抗生素。随后将1ml的各起子培养物用于接种含有相同抗生素的500ml TB干培养基，并使培养物生长至OD600为0.6-1.0，并接着采用25μMIPTG进行诱导。培养物生长16-24小时后，通过15,000xG离心10分钟收获细胞。
嵌合体的组装是利用尺寸排阻层析确定的。已组装的HBc以一个独特的峰洗脱出来(4个峰的洗脱图中的第2个峰)，该峰在颗粒不能组装时是不存在的-----未组装的单体在稍后的峰里洗脱出来。通过搅拌，将细胞沉淀重新悬浮在50ml含有pH8.0、50mM Tris-HCl和10mMEDTA的溶液(裂解缓冲液)中。随后，采用微流化剂(Microfluidics，Newton，MA)裂解细胞悬液，并于31,000xG离心20分钟，以沉淀细胞碎片。HBc颗粒典型地存在于可溶性组分中，所以需测定上清液体积，并采用饱和硫酸铵将上清液1∶1稀释，以沉淀该蛋白。4℃下，轻微搅拌由上所获的溶液15分钟，并再次以31,000xG离心20分钟，使硫酸铵沉淀聚集。
抛弃该上清液，将沉淀重新悬浮在5ml裂解缓冲液中，接着转移至透析管(分子量截留为8,000道尔顿)中。采用1L裂解缓冲液透析样品至少3小时，通过0.45μm针筒式滤器过滤后，利用琼脂糖CL-4B树脂进行尺寸排阻层析，该树脂被填塞在2.5×100cm XK 26柱中，并与
Figure G2003801096124D00931
Prime FPLC(均获得自Pharmacia Biotech)相连。
采用pH6.8、20mM的磷酸钠和0.02％叠氮化钠预平衡层析柱，并利用泵使大约800ml的相同缓冲液以1.5ml/分钟的流速流经该柱，收集到6-8ml流分。颗粒的生成是通过检查洗脱图中位于流经层析柱的物质最初形成的第一个窄峰后的特征峰评估的。
如果检测到组装的颗粒，将该峰的流分收集，并使其流经20-25ml柱体积的粗制HYPATITETMC树脂(Clarkson，Williamsport，PA)中，该树脂被填塞在2.5×20cm柱(Kontes，Vineland，NJ)中。HBc颗粒典型地表现为与该树脂的结合程度最低，因此可将该蛋白上样在该柱上，并收集全部洗脱液。接着采用pH6.8、50mM磷酸钠洗涤该柱，直到洗脱液的Abs280小于0.1为止。
接着，使混合样品流经0.45μm滤器，并通过HPLC(BioCad fromPerSeptive Biosystems，Framingham，MA)的溶剂线路上样至MonoQTMHR 10/10阴离子交换柱(Pharmacia Biotech)。采用含有25mMTris-HCl和0.02％叠氮化钠的溶液平衡该柱，一旦加入样品，采用相同缓冲液进行洗涤。采用溶解在25mM Tris-HCl中的0-3M线性梯度的NaCl洗脱颗粒。收集各峰的流分，与饱和硫酸铵1∶1稀释，再次形成沉淀，4℃下轻微搅拌1小时，并于17,500xG离心30分钟。将所获沉淀重新悬浮在最小体积的pH6.8、20mM磷酸钠中，再转移进透析管，并采用相同缓冲液进行粗略的透析。接着使最终的纯化样品流经0.45μm滤器，并在其冻结前置于4℃温育24小时。通过BCA试验(可获得自Sigma，St.Louis，MO)测定蛋白质浓度。
D.组装嵌合体的表征
采用2种可检验天然构型的颗粒的方法表征纯化的蛋白质(分析性尺寸排阻和ELLman′s试验)，一种方法检验非还原条件(非还原SDS-PAGE)下的变性颗粒，另一种方法检验单体的完整性(还原SDS-PAGE)。
为了评估颗粒性和非颗粒性物质，需采用分析性尺寸排阻层析分析纯化的蛋白质样品。在该操作中，将50-90μg的各样品注入Superose6HR 10/30柱(Pharmacia Biotech)上，并与HPLC(BioCad)或
Figure G2003801096124D00941
提纯器(Pharmacia Biotech)相连。利用泵使pH6.8、20mM磷酸钠以0.5mL/min的流速流经该柱。颗粒完整性是通过目测洗脱峰图评估的，出现在大约7ml的洗脱位置上的峰对应的是完全形成的颗粒。较迟出现的峰代表非颗粒性结构，诸如二聚体和单体。
二硫键的形成是利用一种与Zheng et al.，J.Biol Chem 267，9422-9429(1992)所述方法类似的方法评估的。因此，在ELISA平板孔内，将颗粒稀释在含有pH6.8、20mM磷酸钠和0.1％SDS的溶液中，直至最终浓度1mg/ml。随后，在二甲基亚砜(DMSO)中获得浓度为200mM的Ellman′s试剂(Sigma)贮存液。然后，将该溶液以1∶200稀释在pH6.8、20mM磷酸钠中，并加入HBc样品中，最终浓度为0.1mM。反应均在室温下进行15分钟。在SpectramaxTM(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)设定的412nm波长下对ELISA平板读数。然后进行比色分析，确定二硫键的形成，其中Ellman′s试剂与游离巯基的反应性产生了黄色，样品中的完全二硫键结合则导致无色。
利用非还原性和还原性SDS-PAGE凝胶检验单体和二聚体由二硫键诱导的的交联，以及单体的完整性，对颗粒进行最终表征。所有SDS-PAGE凝胶均利用购自Invitrogen(Carlsbad，CA)的NuPAGETM系统进行电泳。NuPAGETM 10％Bis-Tris 1.5mm×10孔凝胶是利用MES缓冲液在XCell SureLockTM电泳设备中进行的电泳。样品是通过添加LDS NuPAGETM样品缓冲液并于50℃加热10分钟而得以制备。为制备还原样品，在加热步骤前添加β-巯基乙醇，直至最终浓度为10％。
在200V电压下进行凝胶电泳30-40分钟后，利用SimplyBlueSafeStainTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)并按照所提供的操作流程进行染色。非还原性样品中的交联是通过单体和二聚体种类的缺乏和凝胶上部以条带形式可见的高分子量蛋白质的存在而确定的。单体完整性是通过一条分子量与已知标准相同(约为17kDa)的特定条带的存在而确定的。
颗粒稳定性是利用上述方法评估的，即在不同温度(4℃、室温和37℃)下温育样品，随时间收集第0、3、7和14天的样品用于分析。
E.可表达在免疫优势环中含有N-末端半胱氨酸和P.falciparum 来源CS-重复表位的嵌合体颗粒的载体
制备两种表达载体[V2.Pf1(N-MGCELDP)和V2.Pf1(N-MGCDIDP)]，用于确定N-末端半胱氨酸残基使嵌合体颗粒稳定的能力。为制备载体V2.Pf1(N-MGCELDP)，采用寡核苷酸HBc(MGCELDP)-NcoI-F和HBc149/HindIII-R扩增载体V2.Pf1来源的杂合HBc基因。所获528bp片段经由NcoI和HindIII裂解后，被插入在已经由相同的两种酶裂解过的pKK-223-3N中。
为制备载体V2.Pf1(N-MGCDIDP)，采用寡核苷酸HBc(MGCDIDP)-NcoI-F和HBc149/HindIII-R扩增载体V2.Pf1来源的杂合HBc基因。所获528bp片段经由NcoI和HindIII裂解后，被插入在已经由相同的两种酶裂解过的pKK-223-3N中。
HBc(MGCELDP)-NcoI-F
          M  G  C  E  L  D  P  Y  K  E  F  G
            SEQ ID NO：277
5′-GCGCCATGGGGTGTGAGCTCGACCCTTATAAAGAATTTGG
            SEQ ID NO：278
HBc(MGCDIDP)-NcoI-F
          M  G  C  D  I  D  P  Y  K  E  F  G
            SEQ ID NO：279
5′-GCGCCATGGGGTGTGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGG
            SEQ ID NO：280
F.V7克隆载体的制备
为使T细胞表位能够融合到HBc嵌合体的C末端，需构建一种新载体。将单一EcoRI和SacI限制位点插入在缬氨酸-149和HindIII位点之间，以便于将合成dsDNAs定向插入在EcoRI-HindIII(或EcoRI-SacI)限制位点中。下列PCR引物对被用于扩增具有位于氨基末端的NcoI限制位点和位于羧基末端的EcoRI、SacI和HindIII位点的HBc 149基因。该PCR反应的产物(479bp)经由NcoI和HindIII消化后被克隆进pKK223-3N中，形成了V7。
为插入T细胞表位，采用EcoRI和HindIII(或EcoRI和SacI)消化质粒(V7)，并将具有EcoRI/HindIII(或EcoRI/SacI)突出端的合成dsDNA片段连接进V7中。对所有V7构建体而言，天然HBc(缬氨酸-149)的末端氨基酸与所插入T细胞表位的首个氨基酸被可形成EcoRI限制位点的核苷酸所编码的甘氨酸-异亮氨酸二肽序列分隔开。对被插入在EcoRI/SacI上的表位而言，由于SacI位点的作用，在T细胞表位之后，终止密码子之前，存在额外的谷氨酸-亮氨酸残基。限制位点如下列引物中的下划线部分所示。
HBc149/NcoI-F
5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA    SEQ ID NO：263
HBc149/SacI-EcoRI-H3-R
5′-CGCAAGCTTAGAGCTCTTGAATTCCAACAACAGTAGTCTCCG
                                         SEQ ID NO：281
G.V12表达构建体的制备
含有位于78和79号位氨基酸之间的B细胞表位以及位于缬氨酸-149下游的T细胞表位的V12载体是由V2和V7载体构建而得。含有插入在EcoRI/HindIII上的T细胞表位的V7载体的羧基末端是利用两种PCR引物(HBc-P79/SacI-F和pKK223-3/4515-32R)扩增的，这两种PCR引物可提供与79-149号位氨基酸对应的dsDNA片段，外加两侧为SacI和HindIII限制位点的T细胞表位。
该PCR产物经由SacI和HindIII切割后，被克隆进经由相同的两种酶切割后制备的预期V2载体中。该PCR引物可被用于扩增所有V7基因的羧基末端，与位于HBc基因中149号位氨基酸之后的T细胞表位无关。
限制位点如下划线所示。
HBc-P79/SacI-F 5′-CGCGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG
                                         SEQ ID NO：282
pKK223-3/4515-32R 5′-GTATCAGGCTGAAAATC
                                         SEQ  ID NO：283
H.被插入在V2中的恶性疟原虫CS-重复B细胞表位
对V2和V7构建体而言，编码了所关注的B(V2)或T细胞表位(V7)的合成dsDNA片段被插入在EcoRI/SacI限制位点中。编码了所关注的B和T细胞表位的合成dsDNA片段是通过下述方法制备的，即将等摩尔浓度的互补单链DNA寡核苷酸混合，95℃加热5分钟后，以每分钟下降1℃的速率冷却至室温。该退火反应在TE缓冲液中进行。双链DNA s如下所示，所编码的表位序列在其上方显示。井字号#被应用在某些氨基酸残基序列中，指出了终止密码子的存在。
Pf1
  I  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A
AATTAACGCTAATCCGAACGCTAATCCGAACGCTAATCCGAACGCTA
    TTGCGATTAGGCTTGCGATTAGGCTTGCGATTAGGCTTGCGAT
          N  P  E  L                        SEQ ID NO：284
          ATCCGGAGCT                        SEQ ID NO：285
          TAGGCC                            SEQ ID NO：286
Pf3
  I  N  A  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGCTAATCCGAACGTTGACCCGAACGCTAATCCGAACGCTAATCCGA
    TTGCGATTAGGCTTGCAACTGGGCTTGCGATTAGGCTTGCGATTAGGCT
N  A  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  E  L    SEQ ID NO：287
ACGCTAATCCGAACGTTGACCCGAACGCTAATCCGGAGCT    SEQ ID NO：288
TGCGATTAGGCTTGCAACTGGGCTTGCGATTAGGCCTCGAGG
                                            SEQ ID NO：289
Pf3.1
  I  N  A  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGCGAATCCGAACGTGGATCCGAATGCCAACCCTAACGCCAACCC
TTGCGCTTAGGCTTGCACCTAGGCTTACGGTTGGGATTGCGGTTGGG
            N  A  N  P  E  L                SEQ ID NO：290
          AAATGCGAACCCAGAGCT                SEQ ID NO：291
          TTTACGCTTGGGTC                    SEQ ID NO：292
Pf3.2
  I  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  V  D  P
AATTAACGCGAATCCGAATGCCAACCCTAACGCCAACCCAAACGTGGATCCGA
    TTGCGCTTAGGCTTACGGTTGGGATTGCGGTTGGGTTTGCACCTAGGCT
          N  A  N  P  E  L                  SEQ ID NO：293
          ATGCGAACCCAGAGCT                  SEQ ID NO：294
          TACGCTTGGGTC                      SEQ ID NO：295
Pf3.3
  I  N  A  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGCGAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAA
    TTGCGCTTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTT
N  A  N  P  N  V  D  P N  A  N  P  E  L     SEQ ID NO：296
ACGCCAACCCGAATGTTGACCCCAATGCCAATCCGGAGCT    SEQ ID NO：297
TGCGGTTGGGCTTACAACTGGGGTTACGGTTAGGCC        SEQ ID NO：298
Pf3.4
  I  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A
AATTAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCA
    TTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGT
          N  P  N  V  E  L                  SEQ ID NO：299
          ACCCGAATGTTGAGCT                  SEQ ID NO：300
          TGGGCTTACAAC                      SEQ ID NO：301
Pf3.5
  I  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A
AATTAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCA
    TTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGT
          N  P  N  V  D  P  E  L            SEQ ID NO：302
          ACCCGAATGTTGACCCTGAGCT            SEQ ID NO：303
          TGGGCTTACAACTGGGAC                SEQ ID NO：304
Pf3.6
  I  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A
AATTAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCA
    TTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGT
          N  P  N  V  D  P  N  A  E  L    SEQ ID NO：305
          ACCCGAATGTTGACCCTAATGCTGAGCT    SEQ ID NO：306
          TGGGCTTACAACTGGGATTACGAC        SEQ ID NO：307
Pf3.7
  I  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGA
    TTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCT
          N  V  E  L                      SEQ ID NO：308
          ATGTTGAGCT                      SEQ ID NO：309
          TACAAC                          SEQ ID NO：310
Pf3.8
I  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGA
    TTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCT
   N  V  D  P  E  L                SEQ ID NO：311
   ATGTTGACCCTGAGCT                SEQ ID NO：312
   TACAACTGGGAC                    SEQ ID NO：313
Pf3.9
  I  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGA
    TTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCT
           N  V  D  P  N  A  E  L        SEQ ID NO：314
           ATGTTGACCCTAATGCTGAGCT        SEQ ID NO：315
           TACAACTGGGATTACGAC            SEQ ID NO：316
Pf3.10
  I  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACC
    CTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGG
              N  V  E  L       SEQ ID NO：317
           CGAATGTTGAGCT       SEQ ID NO：318
           GCTTACAAC           SEQ ID NO：319
Pf3.11
  I  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  V
AATTGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGAATGTTG
    CTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCTTACAAC
           D  P  E  L          SEQ ID NO：320
           ACCCTGAGCT          SEQ ID NO：321
           TGGGAC              SEQ ID NO：322
Pf3.12
  I  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  V
AATTGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGAATGTTG
    CTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCTTACAAC
           D  P  N  A  E  L    SEQ ID NO：323
           ACCCTAATGCCGAGCT    SEQ ID NO：324
           TGGGATTACGGC        SEQ ID NO：325
Pf-UTC(PF/CS326-345)
I  E  Y  L  N  K  I  Q  N  S  L  S  T  E  W  S  P
AATTGAATATCTGAACAAAATCCAGAACTCTCTGTCCACCGAATGGTCTCCGT
    CTTATAGACTTGTTTTAGGTCTTGAGAGACAGGTGGCTTACCAGAGGCA
          C  S  V  T  #  #        SEQ ID NO：326
          GCTCCGTTACCTAGTA        SEQ ID NO：327
          CGAGGCAATGGATCATTCGA    SEQ ID NO：328
I.间日疟原虫CS-重复B细胞表位
Pv-T1A
I  P  A  G  D  R  A  D  G  Q  P  A  G  D  R  A  A
AATTCCGGCTGGTGACCGTGCAGATGGCCAGCCAGCGGGTGACCGCGCTGCAG
    GGCCGACCACTGGCACGTCTACCGGTCGGTCGCCCACTGGCGCGACGTC
          G  Q  P  A  G  E  L    SEQ ID NO：329
          GCCAGCCGGCTGGCGAGCT    SEQ ID NO：330
          CGGTCGGCCGACCGC        SEQ ID NO：331
Pv-T1B
I  D  R  A  A  G  Q  P  A  G  D  R  A  D  G  Q  P
AATTGACAGAGCAGCCGGACAACCAGCAGGCGATCGAGCAGACGGACAGCCCG
    CTGTCTCGTCGGCCTGTTGGTCGTCCGCTAGCTCGTCTGCCTGTCGGGC
          A  G  E  L             SEQ ID NO：332
          CAGGGGAGCT             SEQ ID NO：333
          GTCCCC                 SEQ ID NO：334
Pv-T2A
I  A  N  G  A  G  N  Q  P  G  A  N  G  A  G  D  Q
AATTGCGAACGGCGCCGGTAATCAGCCGGGGGCAAACGGCGCGGGTGATCAAC
    CGCTTGCCGCGGCCATTAGTCGGCCCCCGTTTGCCGCGCCCACTAGTTG
           P  G  E  L            SEQ ID NO：335
           CAGGGGAGCT            SEQ ID NO：336
           GTCCCC                SEQ ID NO：337
Pv-T2B
  I  A  N  G  A  D  N  Q  P  G  A  N  G  A  D  D  Q
AATTGCGAACGGCGCCGATAATCAGCCGGGTGCAAACGGGGCGGATGACCAAC
    CGCTTGCCGCGGCTATTAGTCGGCCCACGTTTGCCCCGCCTACTGGTTG
          P  G  E  L               SEQ ID NO：338
          CAGGCGAGCT               SEQ ID NO：339
          GTCCGC                   SEQ ID NO：340
Pv-T2C
  I  A  N  G  A  G  N  Q  P  G  A  N  G  A  G  D  Q
AATTGCGAACGGCGCCGGTAATCAGCCGGGAGCAAACGGCGCGGGGGATCAAC
    CGCTTGCCGCGGCCATTAGTCGGCCCTCGTTTGCCGCGCCCCCTAGTTG
P  G  A  N  G  A  D  N  Q  P  G  A  N  G  A  D  D
CAGGCGCCAATGGTGCAGACAACCAGCCTGGGGCGAATGGAGCCGATGACC
GTCCGCGGTTACCACGTCTGTTGGTCGGACCCCGCTTACCTCGGCTACTGG
          Q  P  G  E  L            SEQ ID NO：341
          AACCCGGCGAGCT            SEQ ID NO：342
          TTGGGCCGC                SEQ ID NO：343
PV-T3
I  A  P  G  A  N  Q  E  G  G  A  A  A  P  G  A  N
AATTGCGCCGGGCGCCAACCAGGAAGGTGGGGCTGCAGCGCCAGGAGCCAATC
    CGCGGCCCGCGGTTGGTCCTTCCACCCCGACGTCGCGGTCCTCGGTTAG
          Q  E  G  G  A  A  E L     SEQ ID NO：344
          AAGAAGGCGGTGCAGCGGAGCT    SEQ ID NO：345
          TTCTTCCGCCACGTCGCC        SEQ ID NO：346
实施例2：含有流感A M2多肽序列的嵌合体的制备
A.流感A M2N-末端结构域插入在V2、V7、V 8、V16、V34、V47、 V48、V54和V55克隆载体中
对V2、V7、V8、V16、V34和V55构建体而言，编码了M2表位的合成dsDNA片段(流感A M2蛋白的2-24号位残基；SEQ ID NO：9)被插入在EcoRI/SacI限制位点中，而对V47、V48和V54构建体而言，相同流感A M2蛋白的1-24号位残基则被插入在NcoI/SacI限制位点中。合成dsDNA片段是通过下述方法制备的，即将等摩尔浓度的互补单链DNA寡核苷酸混合，95℃加热5分钟，并以每分钟下降1℃的速率冷却至室温。该退火反应在TE缓冲液中进行。双链DNAs如下所示，所编码的表位序列在其上方显示。
V2/V7/V8/V16/V34/V55
M2(2-24)
  I  S  L  L  T  E  V  E  T  P  I  R  N  E  W  G  C  R
AATTAGCCTGTTAACCGAAGTGGAGACGCCGATCCGTAACGAATGGGGCTGCCG
    TCGGACAATTGGCTTCACCTCTGCGGCTAGGCATTGCTTACCCCGACGGC
            C  N  D  S  S  D  E  L    SEQ ID NO：347
          CTGTAATGATTCTTCCGACGAGCT    SEQ ID NO：348
          GACATTACTAAGAAGGCTGC        SEQ ID NO：349
V47/V48/V54
M2(1-24)
M  S  L  L  T  E  V  E  T  P  I  R  N  E  W  G  C  R
CATGTCTCTGCTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGA
    AGAGACGACTGGCTTCAACTTTGGGGATAGTCTTTGCTTACCCCCACGTCT
            C  N  D  S  S  D  E  L    SEQ ID NO：350
           TGTAACGATTCAAGTGATGAGCT    SEQ ID NO：351
           ACATTGCTAAGTTCACTAC        SEQ ID NO：352
B.单个半胱氨酸突变的流感A M2N-末端结构域[M2(1- 24/C17S)、M2(1-24/C19S)]插入在V47表达载体中
编码了M2蛋白的1-24号位残基，且17或19号位的半胱氨酸突变为丝氨酸的退火DNA片段如下所示。如上文A部分所述，这些片段被插入V47的NcoI/SacI限制位点中。
V47
M2(1-24/C17S)
  M  S  L  L  T  E  V  E  T  P  I  R  N  E  W  G  S  R
CATGTCTCTGCTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCAGAAACGAATGGGGGTCTAGA
    AGAGACGACTGGCTTCAACTTTGGGGATAGTCTTTGCTTACCCCCAGATCT
            C  N  D  S  S  D  E  L    SEQ ID NO：353
           TGTAACGATTCAAGTGATGAGCT    SEQ ID NO：354
           ACATTGCTAAGTTCACTAC        SEQ ID NO：355
M2(1-24/C19S)
  M  S  L  L  T  E  V  E  T  P  I  R  N  E  W  G  C  R
CATGTCTCTGCTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGA
    AGAGACGACTGGCTTCAACTTTGGGGATAGTCTTTGCTTACCCCCACGTCT
            S  N  D  S  S  D  E  L    SEQ ID NO：356
           TCGAACGATTCAAGTGATGAGCT    SEQ ID NO：357
           AGCTTGCTAAGTTCACTAC        SEQ ID NO：358
C.半胱氨酸突变的流感A M2 N-末端结构域[M2(2-24/C17S， C19S)]插入在表达载体V8、V16、V47、V48和V54中
对V8和V16构建体而言，具有两处从半胱氨酸到丝氨酸的突变并且编码了M2表位(流感A M2蛋白的2-24号位残基)的合成dsDNA片段被插入在EcoRI/SacI限制位点中，而对V47、V48和V54构建体而言，相同流感A M2蛋白的1-24号位残基则被插入在NcoI/SacI限制位点中。如上文A部分所描述方法制备合成dsDNA片段。
V8、V16
M2(2-24/C17S，C19S)
  I  S  L  L  T  E  V  E  T  P  I  R  N  E  W  G  S  R
AATTTCTCTGTTAACCGAAGTGGAGACGCCGATTCGTAACGAATGGGGTAGCCGC
    AGAGACAATTGGCTTCACCTCTGCGGCTAAGCATTGCTTACCCCATCGGCG
            S  N  D  S  S  D  E  L    SEQ ID NO：359
           TCTAATGATAGCTCTGACGAGCT    SEQ ID NO：360
           AGATTACTATCGAGACTGC        SEQ ID NO：361
M2(1-24/C17S，C19S)
  M  S  L  L  T  E  V  E  T  P  I  R  N  E  W  G  S  R
CATGTCTCTGCTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCAGAAACGAATGGGGGTCTAGA
    AGAGACGACTGGCTTCAACTTTGGGGATAGTCTTTGCTTACCCCCAGATCT
            S  N  D  S  S  D  E  L    SEQ ID NO：362
           TCGAACGATTCAAGTGATGAGCT    SEQ ID NO：363
           AGCTTGCTAAGTTCACTAC        SEQ ID NO：364
D.额外拷贝的流感A M2N-末端结构域插入在表达载体 V54.M2(1-24)的N-末端上
一个额外拷贝的天然M2序列[M2(1-24)]或突变的M2序列[M2(1-24/C17S，C19S)]被克隆到原有M2(1-24)序列的N-末端上。构建这些克隆时，除去了原始蛋氨酸，从而使所添加的拷贝仅提供了一个起始密码子蛋氨酸。通过PCR分两个片段制备上述构建体。为获得含有2个天然M2拷贝的克隆[M2(1-24)/V54.M2(2-24)]，首先采用模板V54.M2(1-24)扩增N-末端片段，在M2序列的D24之后插入了Xho I位点(因此谷氨酸在亮氨酸后)(所获片段为353bp长)，接着扩增C-末端片段，将XhoI位点N-末端插入到M2序列的S2上，从而除去了蛋氨酸(所获片段为538bp长)。为获得含有位于天然拷贝的M2之前的突变的克隆[M2(1-24/C17S，C19S/V54.M2(2-24)]，采用了模板V54.M2(1-24/C17S，C19S)以生成N-末端片段，而C-末端片段则与上述的C-末端片段一致(所获片段尺寸也一致)。
N-末端片段是采用BamHI和XhoI消化制备的，C-末端片段则是采用XhoI和HindIII消化的。随后在这两个片段共有的XhoI突出端上将它们连接在一起。接着将所获BamHI-HindIII片段连接进经由BamHI和HindIII消化制备的pKK223-3N载体中。
2个额外拷贝的突变M2序列被克隆至原有M2(1-24)序列的N-末端。同样，仅将一个起始密码子蛋氨酸保留在该基因的1号位，获得构建体M2(1-24/C17S，C19S/M2(2-24/C17S，C19S/V54.M2(2-24)。同样分2个PCR片段制备克隆。采用模板V54.M2(1-24/C17S，C19S)生成N-末端片段，在突变M2序列的D24之后插入了PstI位点(因此谷氨酰胺在亮氨酸后)(所获片段为353bp长)。采用上述M2(1-24/C17S，C19S/V54.M2(2-24)作为模板用于生成C-末端片段，将PstI位点N-末端插入到突变M2序列的S2上，从而除去了蛋氨酸(所获片段为613bp长)。
N-末端片段是采用BamHI和PstI消化制备的，C-末端片段则是采用PstI和HindIII消化的。随后在这两个片段共有的PstI突出端将它们连接在一起。接着将所获BamHI-HindIII片段连接进已经由BamHI和HindIII消化制备的pKK223-3N载体中。
M2(1-24)/V54.M2(2-24)；M2(1-24/C17S，C19S/V54.M2(2-24)
pKK-BamHI-F
5′-CGTAGAGGATCCGGAGCTTATCGACTGCACGG    SEQ ID NO：365
M2-D24/XhoI-R
5′-GCGCTCGAGATCACTTGAATCGTT            SEQ ID NO：366
M2-XhoI/S2-F
5′-GCGCTCGAGAGCTTATTGACCGAAGTTGAACC    SEQ ID NO：367
HBc149+C/HindIII-R
5′-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG
                                        SEQ ID NO：267
M2(1-24/C17S，C19S)/M2(2-24/C17S，C19S)/V54.M2(2-24)
pKK-BamHI-F
5′-CGTAGAGGATCCGGAGCTTATCGACTGCACGG    SEQ ID NO：365
M2-D24/PstI-R
5′-GCGCTGCAGATCACTTGAATCGTT            SEQ ID NO：368
M2-Ps t I/S 2-P
5′-GCGCTGCAGTCTCTGCTGACCGAAG           SEQ ID NO：369
HBc149+C/HindIII-R
5′-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG
                                       SEQ ID NO：267
E.截短形式的天然M2-HBc的构建
将含有全长HBc序列183个残基的原始M2-HBc构建体[Neiryncket al.，(1999)Nature Med.，5(10)：1157-1163：WO 99/07839]截短至V149，并将完整基因移入pKK223-3表达载体中。为实现这些操作，采用由Gent大学提供的质粒3453作为模板进行PCR反应，获得523bp长的产物。采用限制酶Af1III和HindIII消化该产物，并将其连接进已经由NcoI和HindIII消化制备的pKK223-3N载体中。
Af1III-M2-F
5′-CGCGACATGTCTCTGCTGACCG             SEQ ID NO：370
HBc-HindIII-R
5′-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG    SEQ ID NO：371
  克隆编号   克隆名称
  CV-1438   V34.M2(2-24)
  CV-1440   V2.M2(2-24)
  CV-1475   V16.M2(2-24)
  CV-1492   V52.M2(2-24)
  CV-1560   3453/149
  CV-1569   V16.M2(1-24/C17S，C19S)
  CV-1586   V8.M2(2-24)
  CV-1587   V8.M2(1-24/C17S，C19S)
  CV-1588   V7.M2(2-24)
  CV-1590   V47.M2(1-24)
  CV-1603   V47.M2(1-24/C17S，C19S)
  CV-1604   V54.M2(1-24)
  CV-1605   V54.M2(1-24/C17S，C19S)
  CV-1606   V48.M2(1-24)
  CV-1607   V48.M2(1-24/C17S，C19S)
  CV-1671   V47.M2(1-24/C17S)
  克隆编号   克隆名称
  CV-1672   V47.M2(1-24/C19S)
  CV-1816   M2(1-24)/V54.M2(2-24)
  CV-1817   M2(1-24/C17S，C19S/V54.M2(2-24)
  CV-1818   M2(1-24/C17S，C19S)/M2(2-24/C17S，C19S)/V54.M2(2-24)
实施例3：用于表达部分截短的颗粒的表达载体的合成
为制备用于表达部分截短的HBc颗粒的表达质粒，将单一氨基末端寡核苷酸PCR引物(HBc149/NcoI-F)与单一C-末端引物组合应用。例如，为制备HBc156(E.cR；CV-1600颗粒)表达质粒，采用了引物HBc149/NcoI-F和HBc156(E.cR)-H3-R。引物HBc149/NcoI-F和HBc156C(E.cR)-H3-R被用于制备HBc156(E.cR)+C(CV-1601颗粒)表达质粒。所采用的全部引物的序列均如下所示。
除了截短颗粒，某些情况下还整合了对在大肠杆菌中的表达而言最佳的密码子，即C-末端半胱氨酸残基。已知若干精氨酸密码子，尤其是AGA和AGG很少被大肠杆菌利用，这被认为是蛋白质在大肠杆菌内有效表达的障碍，因为这导致多肽在翻译期间停止了合成，并提前终止。在HBc的150和183号位之间的16个精氨酸密码子中，有7个被罕用AGA密码子编码，有2个被极罕用的AGG密码子编码。因此，在该研究中，所有AGA和AGG密码子均被大肠杆菌较常用的密码子所取代。
为实现罕用精氨酸密码子的序贯取代，首先合成HBc156基因(CV-1600和CV-1601颗粒)，并将其作为模板用于HBc163构建体(CV-1634和CV-1632颗粒)；之后，将该HBc163构建体作为模板用于HBc171构建体(CV-1642和CV-1643颗粒)；最后，以该HBc171构建体作为模板用于精氨酸密码子最优化的HBc182和HBc183构建体。也制备了非最优化的HBc182构建体(CV-1575)作为对照。所有PCR产物均经由限制酶NcoI和HindIII裂解后，被克隆进已如上所述经由相同限制酶切割的表达载体pKK223-3N中。
氨基末端引物序列(NcoI限制位点如下划线所示)：
HBc149/NcoI-F
5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA            SEQ ID NO：263
羧基末端引物序列(HindIII限制位点如下划线所示)：
HBc156(E.cR)-H3-R
5′-GCGAAGCTTACTAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGTCTCCGG
                                        SEQ ID NO：372
HBc156C(E.cR)-H3-R
5′-GCGAAGCTTACTAACAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGTCTCCGG
                                        SEQ ID NO：373
HBc163(E.cR)-H 3-R
5′-GCGAAGCTTACTAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCG
                                        SEQ ID NO：374
HBc163C(E.cR)-H3-R
5′-GCGAAGCTTACTAACAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCG
                                             SEQ ID NO：375
HBc171(E.cR)-H3-R
5′-GCGAAGCTTACTACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT
                                             SEQ ID NO：376
HBc171C(E.cR)-H3-R
5′-GCGAAGCTTACTAACACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT
                                             SEQ ID NO：377
HBc183(E.cR)-H3-R
5′-GCGAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCGAGATTGAGATCGCCGGCGACGCGGCGATT
GAGAGCGTC                                    SEQ ID NO：378
HBc182-H3-R
5′-GCGAAGCTTACTATTGAGATTCCCGAGATTGA         SEQ ID NO：379
HBc183-H3-R
5′-GGAAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCG             SEQ ID NO：380
HBc149/HindIII-R
5′-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG          SEQ ID NO：266
HBc149+C/HindIII-R
5′-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG    SEQ ID NO：267
  克隆编号   克隆名称
  CV-1600   HBc156(E.cR)
  CV-1601   HBc156(E.cR)+C
  CV-1632   HBc163(E.cR)+C
  CV-1634   HBc163(E.cR)
  CV-1642   HBc171(E.cR)
  CV-1643   HBc171(E.cR)+C
下表所示为可例证全长HBcAg(HBc183)C-末端构型的排列，和所有具有C-末端平截的颗粒。序列是根据从所有构建体共有的SEQ IDNO：1所示HBc的N-末端开始的149号位氨基酸残基排列的。C-末端半胱氨酸残基存在时，如下划线所示。
表
实施例4：测定方法
A.抗原性
1.颗粒ELISA
采用包被缓冲液(50mM碳酸氢钠，pH9.6)将纯化颗粒稀释至2μg/mL的浓度，并将其包被在ELISA条板的孔上(100μL/孔)。室温下温育该ELISA平板过夜(大约18小时)。第二天上午采用ELISA洗涤缓冲液(EWB)[磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)，pH7.4，0.05％
Figure G2003801096124D01112
-20]洗涤板孔，并采用溶解在PBS中的3％BSA封闭1小时(200μL/孔)。干燥ELISA条板，并在-20℃下保存待用。
为测定颗粒的抗原性，采用溶解在EWB中的1％BSA稀释抗血清，并以100μL/孔的用量添加到抗原包被的ELISA板孔中。温育血清1小时，采用ELISA洗涤缓冲液(同上)洗涤，并利用抗小鼠(IgG)-HRP(The Binding Site，San Diego，CA；HRP＝辣根过氧化物酶)偶联物(100μL/孔)或其它合适抗体探测1小时。采用ELISA洗涤缓冲液洗涤后，通过添加TM兰底物(100μL/孔)观察反应。10分钟后，通过添加1N H2SO4(100μL/孔)终止反应，并在设定为450nm波长的ELISA平板读数器上读数。
2.合成肽ELISA
采用包被缓冲液(50mM碳酸氢钠，pH9.6)将具有20个氨基酸残基的合成肽(NANP)5或具有24个氨基酸残基的合成肽M2稀释至1μg/mL的浓度，并将其包被到ELISA条板的孔上(100μL/孔).通过在37℃培养箱中温育过夜(大约18小时)，使肽干燥在孔上。第二天上午，采用ELISA洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐溶液，pH7.4，0.05％-20)洗涤板孔，并采用溶解在PBS中的3％BSA封闭(200μL/孔)1小时。干燥ELISA条带，并在-20℃下保存待用。
为测定颗粒的抗体抗原性，采用溶解在EWB中的1％BSA稀释(单克隆或多克隆的)抗血清，并以100μL/孔的用量添加到肽包被的ELISA板孔中。温育血清1小时，采用ELISA洗涤缓冲液洗涤，并利用抗小鼠(IgG)-HRP偶联物(同上，100μL/孔)或其它合适抗体探测1小时，再次采用ELISA洗涤缓冲液洗涤后，通过添加TM兰底物(100μL/孔)观察反应。10分钟后，通过添加1N H2SO4(100μL/孔)终止反应，并在设定为450nm波长的ELISA平板读数器上读数。
B.颗粒的免疫原性
为测定颗粒的免疫原性，采用溶解在特定佐剂中的10或20μg颗粒，通过I P对小鼠进行免疫接种，并在第4周采用溶解在相同佐剂中的10μg颗粒进行加强接种。在2、4、6和8周时从小鼠体内采血。
实施例5：280∶260吸光度比例的测定
为测定纯化颗粒的280∶260吸光度比例，采用pH6.8、20mM磷酸钠缓冲液将颗粒稀释至大约0.2mg/mL的浓度，并在260和280nm波长下测定吸光度数值。用280nm波长下的吸光度数值除以260nm波长下的吸光度数值，以确定280∶260比例。对若干样品，包括天然颗粒(HBc183)、截短至149号位残基后的HBc颗粒(HBc149)和本文其它部分所鉴定的若干HBc嵌合体测定该比例的结果如下表所示。全长颗粒CV-1559是由Neirynck et al.，(1999)Nature Med.，5(10)：1157-1163最先报导的颗粒制剂，而全长颗粒CV-1607是类似颗粒，只是其中的17和19号位(SEQ ID NO：9中的X17和X19)的M2多肽半胱氨酸突变为丝氨酸残基。
表
  颗粒编号   全长，(F)或C-末端截短的，(T)   280∶260吸光度比例
  HBc183CV-1532   F   0.84
  HBc149   T   1.59
  颗粒编号   全长，(F)或C-末端截短的，(T)   280∶260吸光度比例
  CV-1438   T   1.57
  CV-1440   T   NT
  CV-1475   T   1.04
  CV-1492   T   1.33
  ＊CV-1559   F   0.68
  CV-1560   T   1.36
  CV-1569   T   1.38
  CV-1588   T   1.16
  CV-1590   T   1.51
  CV-1603   T   1.68
  CV-1604   T   1.40
  CV-1605   T   1.26
  CV-1607   F   0.73
  CV-1600   T   1.23
  CV-1601   T   1.12
  CV-1634   T   0.92
  CV-1632   T   0.96
  CV-1642   T   0.79
  CV-1643   T   0.77
  CV-1671   T   NT
  CV-1672   T   1.27
NT，未检出，*CV-1159与Neirynck，1999描述的IM2-HBc相同。
实施例6：热稳定性方法
采用pH6.8、50mM的NaPO4将纯化颗粒稀释至0.5-1mg/mL的浓度，并于4℃、室温或37℃条件下温育。在不同时间点取样，并与SDS-PAGE样品缓冲液(还原性)混合后，上样在10％SDS-PAGE凝胶上。采用SimplyBlue SafeStain(Invitrogen，Carlsbad，CA)对凝胶染色后，进行分析。
实施例7：杂合颗粒的分析性凝胶过滤分析
采用25mL
Figure G2003801096124D01141
6 HR 10/30层析柱(Amersham Pharmacia#17-0537-01)和BioCADTM SPRINT Perfusion层析系统对纯化杂合HBc颗粒进行分析性凝胶过滤分析。设定UV检测仪以监测280nm波长。用3倍柱体积(CV；大约75mL)缓冲液(20mM NaPO4，pH6.8)以0.50mL/分钟的流速平衡该柱。
采用pH6.8、20mM NaPO4将待分析颗粒稀释至1mg/mL的浓度。随后，将200微升(μL)样品加样到200μL进样环中，并注入层析柱中。采用pH6.8、20mM NaPO4以0.50mL/分钟的流速将样品从层析柱上洗脱。
利用上述方法分析含有N-末端半胱氨酸残基的颗粒或不含这种半胱氨酸的类似颗粒。用BioCADTM软件(PerSeptiveTM)对280nm记录线进行整合。
实施例8：流感M2构建体
最近，Neirynck et al.，(1999)Nature Med.，5(10)：1157-1163和WO 99/07839报导了M2中含有24个氨基酸的胞外域与全长HBc颗粒(HBc183)N-末端的融合，该融合缺失了1-4号位氨基酸残基。在本发明中被称为IM2HBc的构建体的图示如下，其中24-聚体被连接至HBc的N-末端。
IM2HBc
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-HBc(5-183)    SEQ ID NO：389
在一种例证性的制备中，M2表位被插入在乙型肝炎核心的免疫优势环中，且被称为CV-1475的颗粒已通过利用特定技术成功地得到表达和纯化，该技术是上文论述的适用于这种插入和纯化的技术。突变形式的M2表位也被表达在免疫优势环(CV-1473颗粒)中后，将所获颗粒纯化，其中在突变形式的M2表位中，M2天然的17和19号位的两个半胱氨酸残基被取代为丙氨酸残基。这两种颗粒的图示如下。
CV-1475
HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-EL-HBc(79-149)
                                      SEQ ID NO：390
CV-1473
HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGARANDSSD-EL-HBc(79-149)-C
                                      SEQ ID NO：391
与天然序列(CV-1475)相比，CV-1473颗粒构建体可获得多大约7倍的纯化颗粒。尚待确定半胱氨酸残基的突变是否改变了该颗粒的自卫力。不过，被送递至HBc免疫优势环上的表位通常比融合到其它区域(包括N-末端)的相同表位具有更显著的免疫原性，由此所获的颗粒可表现出还原的抗-HBc免疫原性。
还制备了一种颗粒，其中M2N-末端24-聚体表位被融合到C-末端截短的乙型肝炎核心颗粒的N-末端上。构建体(CV-1438)还含有N-末端前核心序列(SEQ ID NO：259)。制备类似的构建体，其中在杂合蛋白(CV-1492)末端含有单个半胱氨酸残基，在该情况中，单个半胱氨酸残基直接位于HBc基因的Val-149后。这些构建体如下所示。
CV-1438
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149)
                                        SEQ ID NO：392
CV-1492
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149)-C
                                        SEQ ID NO：393
应当指出的是，为预防翻译从天然HBc起始密码子蛋氨酸开始，需省略该残基的密码子。由EcoRI(GI)和SacI(EL)限制位点提供的残基如下划线所示。前核心序列位于下划线EL残基和“-HBc(2-149)”之间。
通过以HBc149、CV-1475和CV-1473在SDS-PAGE凝胶中充当额外的分子量对照，进行SDS-PAGE分析证实，在制备过程中，CV-1438单体构建体不如CV-1492稳定。采用分析性凝胶过滤颗粒时，不能证实CV-1438单体的不稳定性。
两种CV-1475均被希望具有比CV-1438和CV-1492稍低的分子量，因为前两种构建体含有被直接插入在免疫优势环中的M2表位，并因而缺失了存在于CV-1438和CV-1492中的前核心序列(SEQ ID NO：259)。与预期一样，CV-1492较大于CV-1475和CV-1473；不过，与CV-1492一样保留了C-末端半胱氨酸残基的CV-1438则由于显著的裂解而明显没有CV-1475和CV-1473大。
本发明还考虑了一种构建体，该构建体含有如上所述与HBc N-末端(结构域I)或环(结构域II)相连的M2N-末端胞外序列，还含有与上述环(结构域II)相连或者位于HBc C-末端(结构域IV)的M2蛋白C-末端序列，诸如SEQ ID NO：11所示序列(参见表A)。这种考虑的构建体还含有本文其它部分论述的至少一个稳定化C-末端半胱氨酸残基。
为修饰含有免疫优势环融合的杂合HBc颗粒的氨基-末端，使其整合半胱氨酸残基，和最小的M2-衍生序列，合成了一系列的合成寡核苷酸。为获得V2.Pf1(N-M2(17-24/C17S)，将寡核苷酸M2(17-24/C17S)-NcoI-F和HBc149/HindIII-R用于扩增载体V2.Pf1来源的杂合HBc基因。所获546bp长的片段经由NcoI和HindIII裂解后，被插入在已经由相同的两种酶裂解过的pKK-223-3N中。
为获得V2.Pf1[N-M2(17-24/C19S)]，将寡核苷酸M2(17-24/C19S)-NcoI-F和HBc149/HindIII-R用于扩增载体V2.Pf1中的杂合HBc基因。所获540bp长的片段经由NcoI和HindIII裂解后，被插入在已经由相同的两种酶裂解过的pKK-223-3N中。
M2(17-24/C17S)-NcoI-F
       M  G  S  R  C  N  D  S  S  D  I  D  P  Y  K  E
GGCGCCATGGGGTCTAGATGTAACGATTCAAGTGACATCGACCCTTATAAAGA
           F G                              SEQ ID NO：394
          ATTTCG                            SEQ ID NO：395
M2(17-24/C19S)-NcoI-F
      M  G  C  N  D  S  S  D  I  D  P  Y  K  E  F  G
GCGCCATGGGGTGTAACGATTCAAGTGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGG
                                            SEQ ID NO：396
                                            SEQ ID NO：397
实施例9：具有和不具有N-和C-末端半胱氨酸残基的HBc嵌合体分子
制备一系列含HBc嵌合体分子的颗粒，含有流感A M2蛋白的1-24号位残基，这些残基通过肽键结合在C-末端已被截短至149号位残基的HBc的N-末端上，或靠近该N-末端。组件嵌合蛋白分子含有不同的N-末端序列，包括M2序列或变体，一部分嵌合蛋白分子含有C-末端半胱氨酸残基。
通过分析性尺寸排阻层析对下表9A-9C所列全部纯化颗粒进行分析，以评估颗粒性结构在纯化后的保持情况。不含N-末端半胱氨酸残基并被命名为CV-1603的颗粒显示了解装配恢复亚颗粒性结构的证据，即该蛋白在1500秒的时间范围内洗脱(颗粒在大约1000秒时洗脱)。
对颗粒CV-1590进行类似分析，该颗粒与CV-1603颗粒相似，只是天然N-末端M2序列中的2个丝氨酸残基突变为半胱氨酸残基，分析结果表明该构建体在纯化后保持了颗粒性结构，其洗脱发生在大约1000秒时，该洗脱时间是杂合颗粒所特有的(图4)。无证据表明CV-1590颗粒解装配了。
对所含嵌合体蛋白也具有2个N-末端半胱氨酸残基的CV-1560颗粒进行分析，结果表明其在纯化后也为颗粒性结构，但的确表现出一定程度的解装配，说明该稳定化较弱于CV-1590颗粒的稳定化。对CV-1590和CV-1560颗粒的N-末端构型进行比较的结果(下表11)显示，通过缺失3个氨基酸残基(DEL)，CV-1560颗粒中2个半胱氨酸残基的位置相对于CV-1590颗粒偏移了3个氨基酸残基，说明这些半胱氨酸残基可能必须与核心基因的起点保持最小距离，以确保最佳交联。
实施例10：具有M2或M2变体序列和C-末端半胱氨酸残基的颗粒
CV-1603颗粒如图4所示，可在纯化后快速解装配。构成CV-1605颗粒的HBc嵌合体分子与CV-1603颗粒的HBc嵌合体分子相似，只是CV-1605组件嵌合体分子具有单个C-末端稳定化半胱氨酸。制备一种可引导CV-1605颗粒表达的质粒，以确定CV-1603颗粒添加的C-末端半胱氨酸残基是否能够赋予该颗粒以更高的稳定性。纯化后，利用分析性尺寸排阻层析对CV-1605颗粒进行分析。
该研究的结果证实CV-1605颗粒的稳定化比CV-1603颗粒的稳定化完全，但不如含有2个氨基-末端半胱氨酸残基且不含C-末端稳定化半胱氨酸的CV-1590颗粒完全。尽管显著量的CV-1605保持了颗粒性，仍有证据显示存在亚颗粒性结构的异源混合物，该混合物的洗脱覆盖了一个大范围。这些观察结果表明，对杂合颗粒(CV-1603)而言，出现于CV-1605颗粒中的C-末端稳定化不如出现于CV-1590颗粒中的N-末端稳定化完全。
为研究杂合颗粒中氨基与羧基末端半胱氨酸稳定化组合的相容性，构建了一种表达质粒以引导CV-1604颗粒的表达。CV-1604颗粒的组件嵌合体分子同时含有存在于天然M2多肽序列中的2个氨基末端稳定化半胱氨酸残基(也存在于CV-1590中)，以及1个C-末端稳定化半胱氨酸(也存在于CV-1605颗粒中)。对CV-1604颗粒进行分析的结果显示它们在纯化后保持了均匀的颗粒状态，说明这两种稳定化方法互补，并可结合应用。
利用颗粒CV-1438和CV-1492研究了位于HBc N-末端与N-末端半胱氨酸残基之间的可选接头序列。这两种颗粒均含有位于HBc的M2融合与D4氨基酸之间的氨基酸序列ELLGWLWGIDI(SEQ ID NO：398)。氨基酸残基LGWLWGIDI来源于从前核心的-6号位氨基酸到HBc的I3氨基酸的序列，缺失了HBc的起始密码子，可避免从该位置开始并将不利于该研究的翻译。HB前核心序列包括-7号位的半胱氨酸。
这些颗粒的差异仅在于，CV-1438组件嵌合体分子的末端位于HBc149号位，而CV-1492组件嵌合体分子的末端位于HBc 149号位，并在相对于SEQ ID NO：1所示HBc序列的150号位含有末端半胱氨酸。当采用一种可选但与上文所述类似的方法，通过分析性凝胶过滤进行分析，且颗粒因此在大约10分钟时洗脱时，两种构建体均在纯化后显示为颗粒状。该研究证实了截短颗粒中氨基-与羧基-末端半胱氨酸稳定化的相容性，和对该氨基酸序列中基本变异性的耐受性，以及N-末端半胱氨酸残基与HBc基因起点之间的距离。
表9A
  构建体编号   N-末端融合   HBcN-末端起点   M2与HBc之间的残基   C-末端终点   结合的核酸   C-末端半胱氨酸稳定化
  CV-1438   M2(2-24)   D2   ELLGWLWGI   149   否   否
  CV-1492   M2(2-24)   D2   ELLGWLWGI   149   否   是(C150)
  CV-1560   M2(1-24)   D4   无   149   否   否
  CV-1590   M2(1-24)   D4   EL   149   否   否
  CV-1603   M2(1-24)(2C＞2S)   D4   EL   149   否   否
  CV-1604   M2(1-24)   D4   EL   149   否   是(C150)
  CV-1605   M2(1-24)(2C＞2S)   D4   EL   149   否   是(C150)
  CV-1606   M2(1-24)   D4   EL   183   是   是(C183)
  CV-1607   M2(1-24)(2C＞2S)   D4   EL   183   是   是(C183)
  CV-1671   M2(1-24)(C17S)   D4   EL   149   否   否
  构建体编号   N-末端融合   HBcN-末端起点   M2与HBc之间的残基   C-末端终点   结合的核酸   C-末端半胱氨酸稳定化
  CV-1672   M2(1-24)(C19S)   D4   EL   149   否   否
  CV-1816   M2(1-24)/LE/M2(2-24)   D4   EL   149   否   是(C150)
  CV-1817   M2(1-24)(2C＞2S)/LE/M2(2-24)   D4   EL   149   否   是(C150)
  CV-1818   M2(1-24)(2C＞2S)/LQ/M2(2-24)(2C＞2S)/LE/M2(2-24)   D4   EL   149   否   是(C150)
表9B
  构建体编号   环融合   5′/3′融合侧翼序列   C-末端终点   结合的核酸   C-末端半胱氨酸稳定化
  CV-1440   M2(2-24)   GI/EL   149   否   否
  CV-1475   M2(2-24)   GI/EL   149   否   是(C150)
  CV-1569   M2(2-24)(2C＞2S)   GI/EL   149   否   是(C150)
  CV-1586   M2(2-24)   GI/EL   183   是   是(C183)
  CV-1587   M2(2-24)(2C＞2S)   GI/EL   183   是   是(C183)
表9C
  构建体编号   C-末端融合   HBc C-末端终点   M2与HBc之间的残基   C-末端终点   结合的核酸   C-末端半胱氨酸稳定化
  CV-1588   M2(2-24)   V149   GI   (M2)EL   否   否
下表10所示为可例证HBeAg N-末端构型的排列，和具有N-末端融合的颗粒。序列是根据从所有构建体共有的SEQ ID NO：1所示HBc的N-末端开始的4号位氨基酸残基排列的。N-末端半胱氨酸残基存在时，如下划线所示。
表10
下表11提供了评估本发明考虑的含N-末端流感A M2序列或变体的颗粒稳定性的结果表格。可见，稳定颗粒是从特定的HBc嵌合体分子制备而得，该HBc嵌合体分子在相对于SEQ ID NO：1所示HBc序列N-末端到大约该N-末端本身的负14(-14)号位含有N-末端半胱氨酸残基。
表11
a48和107号位的半胱氨酸均被取代为丝氨酸的颗粒，b从第二个N-末端M2拷贝开始计数。
实施例11：多种含M2颗粒的抗原性
通过ELISA检验了多种颗粒对单克隆抗体14C2的抗原性。为确保颗粒保持其天然构型，首先采用多克隆抗体(兔)包被ELISA平板，以捕获颗粒，随后采用14C2单克隆抗体的不同稀释液，或具有针对HBc颗粒免疫优势环区域的特异性的抗-HBc单克隆抗体的不同稀释液进行探测。数据如下表所示，证实与位于N-末端的情况相比(IM2HBc/CV-1559和CV-1604)，位于HBc免疫优势环中的M2e没有显著改变M2e表位对14C2单克隆抗体而言的可接近性。这些结果并不令人惊讶，因为之前已有研究显示14C2结合在M2e的内部区域(M2的8、10、11和14号位氨基酸，与结合N-末端成对比)[Zebedee etal.，(1988)J.Virol.，62(8)：2762-2772]。
此外，除了CV-1569，所有颗粒均保持了对抗-HBc单克隆抗体3105的抗原性。之前，已观察到具有插入在免疫优势环中的序列的颗粒存在3105识别丧失的现象，该现象典型地可转化为减少了免疫接种后针对上述颗粒产生的抗-HBc反应。单克隆抗体3105购自Institute ofImmunology，Tokyo，Japan。
Figure G2003801096124D01231
实施例12：抗体亚类和保护
对分析了多种M2e-HBc构建体(10μg/只小鼠)和多种佐剂的研究进行汇总。大约一半小鼠是i.p.施用，大约一半小鼠是i.n.施用。对各实验组(14只小鼠)而言，混合血清并测定抗-M2eIgG亚类抗体的效价。结果来自第二次加强接种后1周时所取的血清。对IgG2a效价大于104的小鼠而言，IgG2A效价为104(*)。
  IgG2a   组数   保护率
  10<sup>4</sup>   8   100
  ＜10<sup>4*</sup>   4   70-95
对佐剂可增强针对疫苗的免疫反应的量度和持久性的能力，以及调节该免疫反应的Th1/Th2偏压的能力的研究日益增多。尽管许多实验佐剂已被研究，明矾仍然是唯一可作为美国FDA批准疫苗的组分的佐剂。明矾典型地使针对Th2型的免疫反应出现偏压，该偏压可通过小鼠体内生成的高水平IgG1抗体证实。
业已发现，由明矾配制的M2e-HBc颗粒的确引发了显著的IgG1反应；但也引发产生了可作为Th1指示剂的IgG2a和IgG2b抗体。为提高Th1-型IgG亚类的产量，在小鼠体内测试了由AlhydrogelTM-配制的颗粒的免疫原性，该颗粒还补充了Corixa Corporation研制的MPL的合成衍生物，即RC529。这些研究表明将RC529包括在AlhydrogelTM配方中，使抗-M2e IgG2a效价显著提高，抗-M2e IgG2a∶IgG1的比例提高了大约10倍。两组的全部小鼠均被完全保护，没有受到致死攻击；不过，与仅接种AlhydrogelTM的小鼠相比，在经过与AlhydrogelTM+RC529一起配制的CV-1569免疫接种的小鼠中有发病率降低的迹象。
实施例13：特选嵌合体的颗粒组装
对尺寸排阻层析洗脱图的分析表明在5种预测的半胱氨酸突变嵌合体中，有4种可成功组装成颗粒。为证实C48和C107突变为丝氨酸不影响颗粒的组装，该研究包括了HBc149和HBc149(C48S/C107S)，以及具有C-末端半胱氨酸的一对构建体，即HBc149+C和HBc149(C48S/C107S)+C。包括这些构建体也是比较颗粒稳定性，以及确定突变颗粒中二硫键结合程度所必须的。
所有被表达的颗粒均经过纯化，且最终产量如下表所示。与未工程改造的HBc149相比，这些颗粒的产量通常非常高，说明导入的突变没有显著影响颗粒的组装。由于在制备首轮颗粒时获得了较大的成功，上述所有嵌合体均经历了类似的修饰，接受了异源环插入部分，不合格的颗粒HBc149(C48S/C107S)L55C/H104C+C除外。
表12
具有半胱氨酸突变的嵌合体的纯化蛋白产量
*该阶段典型地纯度大于75％的颗粒
NA＝无组装
由测定可知，表征研究所必需的各种嵌合体均为大约2mg，所以，在大部分情况中，最多向阴离子交换柱加样大约50AU(25mg半纯化的蛋白)，以避免过载。因此，最终纯化蛋白产量表示的是基于HA层析步骤后被抛弃物质的量而预测的产量。
实施例14：组装颗粒的表征
二硫键形成被发现是时间和温度的函数。通过分析性尺寸排阻层析对各种工程改造颗粒在天然构型时的分析表明，分别在4℃、室温和37℃条件下进行2周的稳定性研究，并于第0、3、7和14天进行分析后，颗粒的完整性之间无差异。为简化，仅显示了37℃(最苛刻条件)条件下第0和14天的洗脱图，因为特定颗粒的所有洗脱图均基本上一致。缺乏C-末端半胱氨酸的两种对照颗粒，即HBc149和HBc149(C48S/C107S)没有完整保留它们的颗粒性结构，它们的洗脱图显示存在较低级结构的独特群体。
通过测定颗粒/蛋白迁移进非还原性SDS-PAGE凝胶中的能力，进一步分析颗粒的交联。在4℃条件下，包括对照颗粒在内的大部分颗粒中的二硫键结合在第0天均显示是不完全的，并在研究期间保持该不完全状态。通过单体和二聚体的强度的降低，并结合较高级多聚体外观的相应增大，可确定室温温育增强了二硫键结合，
37℃温育的所有颗粒(无C-末端稳定化的对照颗粒除外)在7天后均显著地完全被二硫键结合。尤其应当指出的事实是，C-末端稳定化C48S/C107S嵌合体在第0天似乎完全地被二硫键结合，而其C48/C107对应物则在研究期间不能实现与C48S/C107S嵌合体相同水平的交联。此外，工程改造的颗粒HBc149(C48S/C107S)W62C/F97C+C则在第0天表现了同样高水平的交联。
所有样品的还原性SDS-PAGE凝胶均显示，从稳定性研究开始到结束，单体的强度无显著变化，说明所有单体在所有温度条件下均保持完整，与比较37℃凝胶条件下第0天和第14天所取样品时例证的结果一样。重要的是，这些观察结果证实，对在非还原性条件下分析的特定嵌合体而言，单体和二聚体的强度随时间降低并非因为单体的降解。
在稳定性研究中，测定了所有时间点所有颗粒中游离巯基的存在，以确定二硫键形成的程度。尽管游离巯基可与Ellman′s试剂反应，但二硫键所包括的巯基却不行。这些研究的结果证实游离巯基的存在随时间而减少，与室温和4℃温育的那些样品相比，37℃温育的样品中的游离巯基增加了。这些观察结果与采用非还原性SDS-PAGE凝胶分析颗粒时的结果一致，构建体迁移的减量与游离巯基降低的水平相当。
与上述Zheng等人的观测结果一致的是，含有野生型C48和C107的两种对照颗粒在所有时间和温度下均显示存在游离巯基，证实这些半胱氨酸残基仍然主要处于还原状态。在所含半胱氨酸突变为丝氨酸的相应颗粒中，游离巯基的反应性被消除了，再次证明了C61和C150完全被二硫键结合的事实。尽管工程改造的颗粒在纯化末期未完全交联，正如非还原性SDS-PAGE凝胶上存在的游离单体和二聚体所证实的那样，但所有颗粒在37℃温育第7天时，所含游离巯基的水平只是勉强可以检测而已。
这些数据是令人振奋的，而且可用于预测推定形成了二硫键的残基的计算机建模已经非常成功，但不具有完全预测性。不过，以该方式难以预测环稳定性，所以构建了一套具有表位的载体。
首先应当指出的是，所有具有表位的C48S/C107S颗粒的表现方式均与它们的野生型对应物类似，说明这些突变不影响颗粒组装。在不含二硫化物的工程改造颗粒中，不能组装成稳定颗粒的β-淀粉样蛋白表位也不能存在于全部4种含半胱氨酸的工程改造载体中，说明与免疫优势环桥接的半胱氨酸不能使单体保持其预期构型。ASP-1表位在工程改造载体中的表现类似，但无添加半胱氨酸的对照载体生成了低水平的组装颗粒。不能存在于对照颗粒中的炭疽表位PA实际上的确在A58C/L100C载体中生成了低水平的组装颗粒，而不是在其它载体中。最后，可在对照载体中获得高水平的组装HBc的流感表位在4种工程改造颗粒中的2种，即L76C/R82C嵌合体和W62C/F97C嵌合体中可产生普通水平的组装载体。所有嵌合体的颗粒产量概括如下表13所示。成功组装的颗粒如粗体所示。
表13
具有表位的嵌合体*的纯化蛋白产量
Figure G2003801096124D01271
*该阶段典型地纯度大于75％的颗粒。
为简化，已从含二硫化物的工程改造颗粒名称中省略了“HBc149(C48S/C107S)+C”。
尽管C48S/C107S形式的嵌合体所表现的表达水平近似，仍然不能象原始V16.IA(M2)2C/2S克隆(嵌合体CV-1569)那样好地表达颗粒。不过，当被纯化时，C48S/C107S形式的嵌合体所产生的颗粒不到1毫克，只是从原始克隆所回收纯化颗粒的十分之一，说明该类型的嵌合体有必要采用不同的纯化方法。在纯化过程中，这些颗粒似乎紧密结合在hypatite柱上，且所加样品中仅有10％可从该柱回收，而该研究制备的其它颗粒的回收率为60％，或更高。
由于流感组的颗粒最为完整，因此是唯一一组被提供用于稳定性研究的颗粒。尽管该纯化似乎不是最佳(4个颗粒回收2个的回收率极低)，仍然于37℃温育样品(以利于二硫键结合，正如之前所发现的)，并将用于最初稳定性研究的相同分析方法应用于表征这些颗粒。最初，该研究被设计进行2周，如上所述，而第0、3和7天收集的样品便足以帮助了解相关模式。
尽管颗粒在第0天的非还原性凝胶上表现了典型的二硫键结合，对4种颗粒的分析仍表明所有工程改造颗粒均存在独特的已裂解单体条带。对照颗粒V16.IA(M2)2C/2S表现为无裂解，但它是唯一保持完整的一组颗粒----其它几种颗粒(5组)均显示出相同的裂解模式(数据未显示)。3天的温育使V16(C48S/C107S)嵌合体和L76C/R82C嵌合体中的单体完全降解，W62C/F97C嵌合体中的裂解产物显著增加，但那些天然颗粒仍保持完整。不过，通过分析性尺寸排阻层析对天然颗粒的分析显示纯化的V16(C48S/C107S)嵌合体不是组装颗粒，这可能是极低的纯化产率造成的----很可能是已形成的颗粒不能有效地从纯化柱中洗脱的缘故。所有颗粒的降解趋势均持续7天，即稳定性研究结束的时间。
在最近采用IA(M2)2C/2S表位进行的研究工作中，已发现当该表位被展示在环上时，有裂解倾向。因此，N-末端测序表明片段被大致切割为2部分，裂解位点在所插入的表位中。因此可认为单体会裂解，与简单地由于特定表位的性质所造成的环稳定化无关。对其它表位的环稳定性的进一步探索尚在进行中。
实施例15：HBc蛋白CV-1843和CV-1842对照
设计并构建HBc载体，使每个蛋白质单体经历1或2次偶联。偶联化学在此处尤其涉及将糖类、肽、脂质或糖脂类与伯胺相连。载体蛋白CV-1843仅含有单个赖氨酸残基，该残基是添加的赖氨酸，位于HBc免疫优势环中的77号HBc位。采用无赖氨酸的突变体CV-1842进行的研究表明某些半抗原(尤其是肽)可与其N-末端偶联，而寡糖、二酰基-LOS则不行。该差异可能是半抗原类型的几何学和/或亲水性方面的差异造成的。该特定合成不涉及添加辅助T细胞表位，尽管辅助T细胞表位可与所述载体偶联或以融合蛋白形式与之一起表达。
因此，CV-1843蛋白在HBc核心上的氨基酸存在4处突变，即7号位的赖氨酸密码子AAA被取代为精氨酸密码子(CGC)、97号位的赖氨酸密码子AAG被取代为精氨酸密码子AGG、48和107号位的半胱氨酸密码子(TGT)被取代为丝氨酸密码子TCT。插入的一个赖氨酸密码子位于HBc基因的氨基酸L76和E77之间。上述定点诱变是通过利用起始质粒CV-1123和Stratagene的QuickChangeTMXL定点诱变试剂盒完成的。
每次突变或插入采用了2种寡核苷酸引物。一种引物是另一种引物的互补链。所有诱变反应所用的寡核苷酸引物均通过下述方法设计，即突变密码子与其两侧的侧翼序列中的16-20个核苷酸一起存在，以G或C为邻近核苷酸[最接近该突变位点]。在诱变PCR中采用了PfuTurboTMDNA聚合酶，并采用Dpn I消化亲代DNA质粒。
所采用的引物组如下所示，其中位于特定位置上的原始残基被首先以单字母名称标示，其后是取代发生处的位置编号，接着是取代残基的单字母名称。当77号位插入单个残基时，用于将赖氨酸(K)插入该位置的引物不含原始或取代残基。
用于7号位的引物
K7R-正向
CCATGGACATCGACCCTTATCGCGAATTTGGAGCTACTGTGGAG
             SEQ ID NO：440
K7R-反向
CTCCACAGTAGCTCCAAATTCGAGATAAGGGTCGATGTCCATGG
             SEQ ID NO：441
用于97号位的引物
K97R-正向CACTAATATGGGCCTAAGGTTCAGGCAACTCTTGTGG
             SEQ ID NO：442
K97R-反向CCACAAGAGTTGCCTGAACCTTAGGCCCATATTAGTG
             SEQ ID NO：443
用于48号位的引物
C48S-正向
GCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGC
             SEQ ID NO：444
C48S-反向
GCAGTATGGTGAGGTGAAGAATGCTCAGGAGACTCTAAGGC
          SEQ ID NO：445
用于107号位的引物
C107S-正向
GGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAG
          SEQ ID NO：446
C107S反向
CTCTTCCAAAAGTGAGAGAAGAAATGTGAAACCACAAGAGTTGCC
          SEQ ID NO：447
用于将赖氨酸插入77号位的引物
K77-正向
CCTGGGTGGGTGTTAATTTGAAAGAAGATCCAGCGTCTAGAG
          SEQ ID NO：448
K77-反向
CTCTAGACGCTGGATCTTCTTTCAAATTAACACCCACCCAGG
          SEQ ID NO：449
以与构建用于形成CV-1843蛋白颗粒的载体相同的方法构建CV-1842蛋白颗粒载体。CV-1842蛋白含有与CV-1843相同的位于7、97、48和107号位的4处突变。不过，CV-1842蛋白在77号位不含赖氨酸插入。CV-1842蛋白颗粒在以赖氨酸为官能团进行的偶联中充当了CV-1843的对照颗粒。
在大肠杆菌BLR中培养该重组质粒，采用0.5mM IPTG诱导，并培养过夜(大约18小时)。通过离心收获细胞，并通过微流化使细胞裂解。对可溶性物质进行2次硫酸铵沉淀，并加样在Sepharose CL-4B柱(Amersham)上。将从该柱洗脱的第二个峰加样在陶瓷羟磷灰石柱上，洗脱并在硫酸铵中沉淀。将所获蛋白质沉淀重新悬浮在水中，并利用50mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)对其进行透析，用于分析和偶联。
实施例16：对CV-1843和CV-1123蛋白的dLOS偶联
采用CV-1843蛋白和CV-1123蛋白进行下述研究。己二酸二酰肼-(ADH-)衍生的9274dLOS由National Institutes of Health，Bethesda MD的Dr.Xin-Xing Gu提供，并通过两种方法分别与两种类型的HBc偶联。第一种化学方法是与CV-1123上的酸性残基直接碳二亚胺连接。第二种化学方法是利用根据经销商的说明书由ADH-衍生制备的琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶二硫基]丙酸酯(SPDP)-N-[γ-马来酰亚胺基氧化丁酰]琥珀酰亚胺酯(GMBS)，与7号位的赖氨酸的连接。
这样，ADH-衍生的dLOS与N-琥珀酰亚胺基-3-[2-吡啶二硫基]丙酸酯(SPDP)反应，形成了混合的二硫化物，N-[γ-马来酰亚胺氧化丁酰]琥珀酰亚胺酯(GMBS)与HBc蛋白的N-末端氨基或ε-氨基赖氨酸反应，形成了HBc-衍生的琥珀酰亚胺酯。SPDP混合二硫化物与二硫苏糖醇(DTT)反应后，进行透析，提供了可与HBc-衍生的琥珀酰亚胺酯反应形成预期偶联物的3-硫代丙酸酰肼-dLOS衍生物。
利用盐溶液或盐水，并使上述制备的偶联物预先吸附在明矾上，将该偶联物用于免疫接种小鼠(每组5只)。对小鼠免疫接种3次，间隔为3周，所示效价为最终加强接种后2周的效价。每一剂量含有5μg糖类。ELISA条件选自[Sun.et al.(2000)Vaccine 200018(13)：1264-1272]。唯一显示预先存在效价的抗体种类为IgM。所有构建体的效价均提高了一个log。
当疫苗吸附在明矾上时，IgG2b的效价显著地较低。这可能是糖类的脱酰作用或水解造成的[Sturgess et al.，(1999)Vaccine，17(9-10)：1169-1178]。无小鼠显示对IgG2a的可测效价。Th2反应的特征，即IgG1诱导由于HBc上较长的交叉接头而随着免疫接种的进程缓慢下来，但最后终于上升至与其它动物相同的水平。IgG3水平是可比较的。
实施例17：与由CV-1843和CV-1842蛋白制备而得的颗粒的肽偶联
使肽与由CV-1843和CV-1842蛋白制备而得的颗粒偶联。该肽具有氨基酸序列SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO：450)，并且是利用接头N-[γ-马来酰亚胺基氧化丁酰]-硫代琥珀酰亚胺酯(硫代-GMBS，Pierce Chemical Co.)偶联的。最优化后，该偶联的结果显示了与预期赖氨酸的结合，以及如下所述与氨基-末端的结合。
因此，对从CV-1843蛋白制备而得的颗粒进行银染色还原性SDSPAGE的分析显示了位于大约22,000道尔顿处的完全还原的HBc多肽链的单体条带，还显示了位于该条带之上的一个单一重复(添加了一个肽)条带，和位于该单一重复条带之上的一个双重重复(添加了两个肽)条带。在大约44,000道尔顿的范围内，还存在一条基础条带和两条偶联物条带。对由CV-1842蛋白制备而得的颗粒而言，出现的单体和二聚体条带与加有单个多肽的单体和二聚体的条带一样。因此，该肽可与由CV-1843蛋白制备而得的颗粒的77号位所添加的赖氨酸和N-末端偶联，但该肽仅可与由不含赖氨酸残基的CV-1842蛋白制备而得的颗粒的N-末端偶联。单体和二聚体指在偶联后不能完全还原和不能分离成2个22,000道尔顿单体的物质。这些结果清楚地表明该纯化颗粒能够包括可与其化学偶联的肽。
本文引用的所有专利和文献均被引入作为参考。冠词“一个”或“一种”的用法指包括一个或多个。
上述说明书和实例具有例证性，不具有限制性。在本发明的精神和范畴内还有其它变动也是可能的，并且易于被本领域技术人员理解。
序列表
<110>ASHLEY，BIRKETT J.
Lyons，Katelynne J.
Jay，HaronJ.
<120>稳定的免疫原性HBc嵌合体颗粒
<130>ICC-136.0(4564-88881)
<140>US 10/732,862
<141>2003-12-10
<150>US 60/432,123
<151>2002-12-10
<150>US 10/274,616
<151>2002-10-21
<150>US 10/080,299
<151>2002-02-21
<150>US 10/082,014
<151>2002-02-22
<160>455
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>1
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>2
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>2
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>3
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>3
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Pro Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>4
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>4
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>5
<211>183
<212>PRT
<213>旱獭
<400>5
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu
1               5                   10                  15
Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu
    50                  55                  60
Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln
65                  70                  75                  80
Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln
            100                 105                 110
His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser
145                 150                 155                 160
Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro
                165                 170                 175
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Cys
            180
<210>6
<211>217
<212>PRT
<213>地松鼠
<400>6
Met Tyr Leu Phe His Leu Cys Leu Val Phe Ala Cys Val Pro Cys Pro
1               5                   10                  15
Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp
            20                  25                  30
Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu Asn Phe
        35                  40                  45
Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp Thr Ala
    50                  55                  60
Ala Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys Ser Pro
65                  70                  75                  80
His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Glu Glu Leu Thr
                85                  90                  95
Arg Leu Ile Thr Trp Met Ser Glu Asn Thr Thr Glu Glu Val Arg Arg
            100                 105                 110
Ile Ile Val Asp His Val Asn Asn Thr Trp Gly Leu Lys Val Arg Gln
        115                 120                 125
Thr Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gly His Thr Val
    130                 135                 140
Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Ala Pro
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr
                165                 170                 175
Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ala Arg Ser Pro Arg Arg
            180                 185                 190
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
        195                 200                 205
Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Asn Cys
    210                 215
<210>7
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的质粒pKK223
<400>7
ttcacacagg aaacagaatt cccggggatc cgtcgacctg cagccaagct t    51
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pKK223
<400>8
ttcacataag gaggaaaaaa ccatgggatc cgaagctt    38
<210>9
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>疟疾B细胞表位
<400>9
Ile Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu
<210>10
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>疟疾T细胞表位与乙型肝炎的嵌合体
<400>10
Ile Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser
1               5                   10                  15
Pro Cys Ser Val Thr
            20
<210>11
<211>15
<212>PRT
<213>肺炎链球菌
<400>11
Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu
1               5                   10                  15
<210>12
<211>35
<212>PRT
<213>肺炎链球菌
<400>12
Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala
1               5                   10                  15
Leu Glu Lys Ala Ala Ser Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val
            20                  25                  30
Gln Gln Ala
        35
<210>13
<211>27
<212>PRT
<213>微小隐孢子虫
<400>13
Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu
1               5                   10                  15
Pro Ala Ala Gln Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala
            20                  25
<210>14
<211>17
<212>PRT
<213>人类免疫缺陷病毒
<400>14
Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ile Thr Lys
1               5                   10                  15
Asn
<210>15
<211>31
<212>PRT
<213>口蹄疫病毒
<400>15
Tyr Asn Gly Glu Cys Arg Tyr Asn Arg Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg
1               5                   10                  15
Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Val Ala Arg Thr Leu Pro
            20                  25                  30
<210>16
<211>10
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>16
Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys
1               5                   10
<210>17
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>17
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp
            20
<210>18
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>18
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>19
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>19
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
1               5                   10                  15
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>20
<211>19
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>20
Glu Gln Gln Ser Ala Val Asp Ala Asp Asp Ser His Phe Val Ser Ile
1               5                   10                  15
Glu Leu Glu
<210>21
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>21
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>22
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>22
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>23
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>23
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>24
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>24
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
20
<210>25
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>25
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>26
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>26
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>27
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>27
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
                20
<210>28
<211>35
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>28
Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
1               5                   10                  15
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu
            20                  25                  30
Trp Gly Ile
        35
<210>29
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>29
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ala Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>30
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>30
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>31
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>31
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ala Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>32
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>32
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>33
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>33
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>34
<211>46
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>34
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
            20                  25                  30
IIe Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
        35                  40                  45
<210>35
<211>69
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>35
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
            20                  25                  30
Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu
        35                  40                  45
Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser
    50                  55                  60
Asn Asp Ser Ser Asp
65
<210>36
<211>46
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>36
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
1               5                   10                  15
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
            20                  25                  30
Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
        35                  40                  45
<210>37
<211>69
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>37
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
1               5                   10                  15
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
            20                  25                  30
Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu
        35                  40                  45
Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala Arg Ala
    50                  55                  60
Asn Asp Ser Ser Asp
65
<210>38
<211>19
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>38
Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Cys Asn Asp
1               5                   10                  15
Ser Ser Asp
<210>39
<211>38
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>39
Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Cys Asn Asp
1               5                   10                  15
Ser Ser Asp Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg
            20                  25                  30
Cys Asn Asp Ser Ser Asp
        35
<210>40
<211>57
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>40
Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Cys Asn Asp
1               5                   10                  15
Ser Ser Asp Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg
            20                  25                  30
Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp
        35                  40                  45
Gly Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
    50                  55
<210>41
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>1号位的Xaa为蛋氨酸或缺失。如果是蛋氨酸，则2-8号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>2号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则3-8号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>3号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则4-8号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>4号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则5-8号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>5号位的Xaa为苏氨酸或缺失。如果是苏氨酸，则6-8号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>6号位的Xaa为谷氨酸或缺失。如果是谷氨酸，则7-8号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>7号位的Xaa为缬氨酸或缺失。如果是缬氨酸，则8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>15号位的Xaa为色氨酸或缺失
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>16号位的Xaa为甘氨酸或缺失。如果是甘氨酸，则15号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>17号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则17号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果17号位的Xaa存在，则15-16号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>18号位的Xaa为精氨酸或缺失。如果是精氨酸，则15-17号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>19号位的Xaa缺失或存在。如果存在，则19号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果19号位的Xaa存在，则15-18号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>20号位的Xaa为天冬酰胺或缺失。如果是天冬酰胺，则15-19号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>21号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则15-20号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>22号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则15-21号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>23号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则15-22号位中的Xaa也存在。
<400>41
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20
<210>42
<211>47
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>1号位的Xaa为蛋氨酸或缺失。如果是蛋氨酸，则2-8号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>2号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则3-8号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>3号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则4-8号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>4号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则5-8号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>5号位的Xaa为苏氨酸或缺失。如果是苏氨酸，则6-8号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>6号位的Xaa为谷氨酸或缺失。如果是谷氨酸，则7-8号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>7号位的Xaa为缬氨酸或缺失。如果是缬氨酸，则8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>8号位的Xaa为谷氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>15号位的Xaa为色氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>16号位的Xaa为甘氨酸或缺失。如果是甘氨酸，则15号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>17号位的Xaa缺失或存在。如果存在，则17号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果17号位的Xaa存在，则15-16号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>18号位的Xaa为精氨酸或缺失。如果是精氨酸，则15-17号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>19号位的Xaa缺失或存在。如果存在，则19号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果19号位的Xaa存在，则15-18号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>20号位的Xaa为天冬酰胺或缺失。如果是天冬酰胺，则15-19号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>21号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则15-20号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>22号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则15-21号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>23号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则15-22号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>24号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则15-23号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>25号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则26-31号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>26号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则27-31号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>27号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则28-31号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>28号位的Xaa为苏氨酸或缺失。如果是苏氨酸，则29-31号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>29号位的Xaa为谷氨酸或缺失。如果是谷氨酸，则30-31号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>30号位的Xaa为缬氨酸或缺失。如果是缬氨酸，则31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>31号位的Xaa为谷氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(38)..(38)
<223>38号位的Xaa为色氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(39)..(39)
<223>39号位的Xaa为甘氨酸或缺失。如果是甘氨酸，则38号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(40)..(40)
<223>40号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则40号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果40号位的Xaa存在，则38-39号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>41号位的Xaa为精氨酸或缺失。如果是精氨酸，则38-40号位中的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>42号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则42号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果42号位的Xaa存在，则38-41号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(43)..(43)
<223>43号位的Xaa为天冬酰胺或缺失。如果是天冬酰胺，则38-42号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(44)..(44)
<223>44号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则38-43号位的Xaa也存在。
<220>
<221>misc_feature
<222>(45)..(45)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(46)..(46)
<223>46号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则38-45号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(47)..(47)
<223>47号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则38-46号位的Xaa也存在。
<400>42
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
            20                  25                  30
Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
<210>43
<211>70
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>1号位的Xaa为蛋氨酸或缺失。如果是蛋氨酸，则2-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>2号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则3-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>3号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则4-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>4号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则5-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>5号位的Xaa为苏氨酸或缺失。如果是苏氨酸，则6-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>6号位的Xaa为谷氨酸或缺失。如果是谷氨酸，则7-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>7号位的Xaa为缬氨酸或缺失。如果是缬氨酸，则8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>8号位的Xaa为谷氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>15号位的Xaa为色氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>16号位的Xaa为甘氨酸或缺失。如果是甘氨酸，则15号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>17号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则17号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果17号位的Xaa存在，则15-16号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>18号位的Xaa为精氨酸或缺失。如果是精氨酸，则15-17号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>19号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则19号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果19号位的Xaa存在，则15-18号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>20号位的Xaa为天冬酰胺或缺失。如果是天冬酰胺，则15-19号位的Xaa也存在，
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>21号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则15-20号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>22号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则15-21号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>23号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则15-22号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>24号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则15-23号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>25号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则26-31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>26号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则27-31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>27号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则28-31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>28号位的Xaa为苏氨酸或缺失。如果是苏氨酸，则29-31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>29号位的Xaa为谷氨酸或缺失。如果是谷氨酸，则30-31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>30号位的Xaa为缬氨酸或缺失。如果是缬氨酸，则31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>31号位的Xaa为谷氨酸或缺失
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(38)..(38)
<223>38号位的Xaa为色氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(39)..(39)
<223>39号位的Xaa为甘氨酸或缺失。如果是甘氨酸，则38号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(40)..(40)
<223>40号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则40号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果40号位的Xaa存在，则38-39号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>41号位的Xaa为精氨酸或缺失。如果是精氨酸，则38-40号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>42号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则42号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果42号位的Xaa存在，则38-41号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(43)..(43)
<223>43号位的Xaa为天冬酰胺或缺失。如果是天冬酰胺，则38-42号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(44)..(44)
<223>44号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则38-43号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(45)..(45)
<223>45号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则38-44号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(46)..(46)
<223>46号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则38-45号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(47)..(47)
<223>47号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则38-46号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(48)..(48)
<223>48号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则49-54号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(49)..(49)
<223>49号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则50-54号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(50)..(50)
<223>50号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则51-54号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(51)..(51)
<223>51号位的Xaa为苏氨酸或缺失。如果是苏氨酸，则52-54号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(52)..(52)
<223>52号位的Xaa为谷氨酸或缺失。如果是谷氨酸，则53-54号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(53)..(53)
<223>53号位的Xaa为缬氨酸或缺失。如果是缬氨酸，则54号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(54)..(54)
<223>54号位的Xaa为谷氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(61)..(61)
<223>61号位的Xaa为色氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(62)..(62)
<223>62号位的Xaa为甘氨酸或缺失。如果是甘氨酸，则61号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(63)..(63)
<223>63号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则63号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果63号位的Xaa存在，则61-62号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(64)..(64)
<223>64号位的Xaa为精氨酸或缺失。如果是精氨酸，则61-63号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(65)..(65)
<223>65号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则65号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果65号位的Xaa存在，则61-64号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(66)..(66)
<223>66号位的Xaa为天冬酰胺或缺失。如果是天冬酰胺，则61-65号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(67)..(67)
<223>67号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则61-66号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(68)..(68)
<223>68号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则61-67号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(69)..(69)
<223>69号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则61-68号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(70)..(70)
<223>70号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则61-69号位的Xaa也存在。
<400>43
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
            20                  25                  30
Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65                  70
<210>44
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>1号位的Xaa为蛋氨酸或缺失。如果是蛋氨酸，则2-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>2号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则3-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>3号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则4-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>4号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则5-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>4号位的Xaa为苏氨酸或脯氨酸或缺失。如果是苏氨酸或脯氨酸，则6-8号位的Xaa
也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>6号位的Xaa为谷氨酸或缺失。如果是谷氨酸，则7-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>7号位的Xaa为缬氨酸或缺失。如果是缬氨酸，则8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>8号位的Xaa为谷氨酸或天冬氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>10号位的Xaa为脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>11号位的Xaa为异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>13号位的Xaa为天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>14号位的Xaa为谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>15号位的Xaa为色氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>16号位的Xaa为甘氨酸、谷氨酸或缺失。如果是甘氨酸或谷氨酸，则16号位的Xaa
也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>17号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则17号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果17号位的Xaa存在，则15-16号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>18号位的Xaa为精氨酸、赖氨酸或缺失。如果是精氨酸或赖氨酸，则15-17号位的
Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>19号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则19号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果19号位的Xaa存在，则15-18号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>20号位的Xaa为天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸或缺失。如果是天冬酰胺或丝氨酸或甘
氨酸，则15-19号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>21号位的Xaa为天冬氨酸、甘氨酸或缺失。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则15-20号
位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>22号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则15-21号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>23号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则15-22号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>24号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则15-23号位的Xaa也存在。
<400>44
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20
<210>45
<211>47
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>1号位的Xaa为蛋氨酸或缺失。如果是蛋氨酸，则2-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>2号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则3-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>3号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则4-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>4号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则5-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>4号位的Xaa为苏氨酸或缺失。如果是苏氨酸，则6-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>6号位的Xaa为谷氨酸或缺失。如果是谷氨酸，则7-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>7号位的Xaa为缬氨酸或缺失。如果是缬氨酸，则8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>8号位的Xaa为谷氨酸或天冬氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>10号位的Xaa为脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>11号位的Xaa为异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>13号位的Xaa为天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>14号位的Xaa为谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>15号位的Xaa为色氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>16号位的Xaa为甘氨酸、谷氨酸或缺失。如果是甘氨酸或谷氨酸，则16号位的Xaa
也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>17号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则17号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果17号位的Xaa存在，则15-16号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>18号位的Xaa为精氨酸、赖氨酸或缺失。如果是精氨酸或赖氨酸，则15-17号位的
Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>19号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则19号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果19号位的Xaa存在，则15-18号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>20号位的Xaa为天冬酰胺、丝氨酸或甘氨酸或缺失。如果是天冬酰胺或丝氨酸，则
15-19号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>21号位的Xaa为天冬氨酸、甘氨酸或缺失。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则15-20号
位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>22号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则15-21号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>23号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则15-22号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>24号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则15-23号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>25号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则26-31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>26号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则27-31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>27号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则28-31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>28号位的Xaa为苏氨酸、脯氨酸或缺失。如果是苏氨酸或脯氨酸，则29-31号位的
Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>29号位的Xaa为谷氨酸或缺失。如果是谷氨酸，则30-31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>30号位的Xaa为缬氨酸或缺失。如果是缬氨酸，则31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>31号位的Xaa为谷氨酸或天冬氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(33)..(33)
<223>33号位的Xaa为脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(34)
<223>34号位的Xaa为异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(36)..(36)
<223>36号位的Xaa为天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(37)..(37)
<223>37号位的Xaa为谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(38)..(38)
<223>38号位的Xaa为色氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(39)..(39)
<223>39号位的Xaa为甘氨酸、谷氨酸或缺失。如果是甘氨酸或谷氨酸，则38号位的Xaa
也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(40)..(40)
<223>40号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则40号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果40号位的Xaa存在，则38-39号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>41号位的Xaa为精氨酸、赖氨酸或缺失。如果是精氨酸或赖氨酸，则38-40号位的
Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>42号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则42号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果42号位的Xaa存在，则38-41号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(43)..(43)
<223>43号位的Xaa为天冬酰胺、丝氨酸或缺失。如果是天冬酰胺或丝氨酸，则38-42号
位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(44)..(44)
<223>44号位的Xaa为天冬氨酸、甘氨酸或缺失。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则38-43号
位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(45)..(45)
<223>45号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则38-44号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(46)..(46)
<223>46号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则38-45号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(47)..(47)
<223>47号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则38-46号位的Xaa也存在。
<400>45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
            20                  25                  30
Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
<210>46
<211>70
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>1号位的Xaa为蛋氨酸或缺失。如果是蛋氨酸，则2-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>2号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则3-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>3号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则4-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>4号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则5-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>5号位的Xaa为苏氨酸或缺失。如果是苏氨酸，则6-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>6号位的Xaa为谷氨酸或缺失。如果是谷氨酸，则7-8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>7号位的Xaa为缬氨酸或缺失。如果是缬氨酸，则8号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>8号位的Xaa为谷氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>10号位的Xaa为脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>11号位的Xaa为异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>13号位的Xaa为天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>14号位的Xaa为谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>15号位的Xaa为色氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>16号位的Xaa为甘氨酸、谷氨酸或缺失。如果是甘氨酸或谷氨酸，则16号位的Xaa
也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>17号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则17号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果17号位的Xaa存在，则15-16号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>18号位的Xaa为精氨酸、赖氨酸或缺失。如果是精氨酸或赖氨酸，则15-17号位的
Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>19号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则19号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果19号位的Xaa存在，则15-18号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>20号位的Xaa为天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸或缺失。如果是天冬酰胺或丝氨酸，则
15-19号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>21号位的Xaa为天冬氨酸、甘氨酸或缺失。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则15-20号
位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>22号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则15-21号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>23号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则15-22号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>24号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则15-23号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>25号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则26-31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>26号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则27-31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>27号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则28-31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>28号位的Xaa为苏氨酸、脯氨酸或缺失。如果是苏氨酸或脯氨酸，则29-31号位的
Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>29号位的Xaa为谷氨酸或缺失。如果是谷氨酸，则30-31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>30号位的Xaa为缬氨酸或缺失。如果是缬氨酸，则31号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>31号位的Xaa为谷氨酸或天冬氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE    
<222>(33)..(33)
<223>33号位的Xaa为脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(34)
<223>34号位的Xaa为异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(36)..(36)
<223>36号位的Xaa为天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(37)..(37)
<223>37号位的Xaa为谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(38)..(38)
<223>38号位的Xaa为色氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(39)..(39)
<223>39号位的Xaa为甘氨酸、谷氨酸或缺失。如果是甘氨酸或谷氨酸，则38号位的Xaa
也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(40)..(40)
<223>40号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则40号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果40号位的Xaa存在，则38-39号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>41号位的Xaa为精氨酸、赖氨酸或缺失。如果是精氨酸或赖氨酸，则38-40号位的
Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>42号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则42号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果42号位的Xaa存在，则38-41号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(43)..(43)
<223>43号位的Xaa为天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸或缺失。如果是天冬酰胺或丝氨酸或甘
氨酸，则38-42号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(44)..(44)
<223>44号位的Xaa为天冬氨酸、甘氨酸或缺失。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则38-43号
位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(45)..(45)
<223>45号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则38-44号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(46)..(46)
<223>46号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则38-45号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(47)..(47)
<223>47号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则38-46号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(48)..(48)
<223>48号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则49-54号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(49)..(49)
<223>49号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则50-54号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(50)..(50)
<223>50号位的Xaa为亮氨酸或缺失。如果是亮氨酸，则51-54号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(51)..(51)
<223>51号位的Xaa为苏氨酸、脯氨酸或缺失。如果是苏氨酸或脯氨酸，则52-54号位的
Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(52)..(52)
<223>52号位的Xaa为谷氨酸或缺失。如果是谷氨酸，则53-54号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(53)..(53)
<223>53号位的Xaa为缬氨酸或缺失。如果是缬氨酸，则54号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(54)..(54)
<223>54号位的Xaa为谷氨酸或天冬氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(56)..(56)
<223>56号位的Xaa为脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(57)..(57)
<223>57号位的Xaa为异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(59)..(59)
<223>59号位的Xaa为天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(60)..(60)
<223>60号位的Xaa为谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(61)..(61)
<223>61号位的Xaa为色氨酸或缺失。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(62)..(62)
<223>62号位的Xaa为甘氨酸、谷氨酸或缺失。如果是甘氨酸或谷氨酸，则61号位的Xaa
也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(63)..(63)
<223>63号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则63号位的Xaa为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果63号位的Xaa存在，则61-62号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(64)..(64)
<223>64号位的Xaa为精氨酸、赖氨酸或缺失。如果是精氨酸或赖氨酸，则61-63号位的
Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(65)..(65)
<223>65号位的Xaa缺失或存在，如果存在，则65号位的Xea为半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果65号位的Xaa存在，则61-64号位也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(66)..(66)
<223>66号位的Xaa为天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸或缺失。如果是天冬酰胺或丝氨酸或甘
氨酸，则61-65号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(67)..(67)
<223>67号位的Xaa为天冬氨酸、甘氨酸或缺失。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则61-66号
位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(68)..(68)
<223>68号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则61-67号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(69)..(69)
<223>69号位的Xaa为丝氨酸或缺失。如果是丝氨酸，则61-68号位的Xaa也存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(70)..(70)
<223>70号位的Xaa为天冬氨酸或缺失。如果是天冬氨酸，则61-69号位的Xaa也存在。
<400>46
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
            20                  25                  30
Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65                  70
<210>47
<211>17
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>47
Asn Asn Ala Thr Phe Asn Tyr Thr Asn Val Asn Pro Ile Ser His Ile
1               5                   10                  15
Arg
<210>48
<211>142
<212>PRT
<213>鼠疫耶尔森氏菌
<400>48
Asp Ile Leu Lys Val Ile Val Asp Ser Met Asn His His Gly Asp Ala
1               5                   10                  15
Arg Ser Lys Leu Arg Glu Glu Leu Ala Glu Leu Thr Ala Glu Leu Lys
            20                  25                  30
Ile Tyr Ser Val Ile Gln Ala Glu Ile Asn Lys His Leu Ser Ser Ser
        35                  40                  45
Gly Thr Ile Asn Ile His Asp Lys Ser Ile Asn Leu Met Asp Lys Asn
    50                  55                  60
Leu Tyr Gly Tyr Thr Asp Glu Glu Ile Phe Lys Ala Ser Ala Glu Tyr
65                  70                  75                  80
Lys Ile Leu Glu Lys Met Pro Gln Thr Thr Ile Gln Val Asp Gly Ser
                85                  90                  95
Glu Lys Lys Ile Val Ser Ile Lys Asp Phe Leu Gly Ser Glu Asn Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Gly Ala Leu Gly Asn Leu Lys Asn Ser Tyr Ser Tyr Asn Lys
        115                 120                 125
Asp Asn Asn Glu Leu Ser His Phe Ala Thr Thr Cys Ser Asp
    130                 135                 140
<210>49
<211>19
<212>PRT
<213>流感嗜血菌
<400>49
Cys Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly Ala Ala Gln Phe
1               5                   10                  15
Gly Gly Tyr
<210>50
<211>11
<212>PRT
<213>流感嗜血菌
<400>50
Asn Lys Leu Gly Thr Val Ser Tyr Gly Glu Glu
1               5                   10
<210>51
<211>16
<212>PRT
<213>流感嗜血菌
<400>51
Asn Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala Tyr
1               5                   10                  15
<210>52
<211>28
<212>PRT
<213>黏膜莫拉氏菌
<400>52
Leu Asp Ile Glu Lys Asp Lys Lys Lys Arg Thr Asp Glu Gln Leu Gln
1               5                   10                  15
Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr
            20                  25
<210>53
<211>28
<212>PRT
<213>黏膜莫拉氏菌
<400>53
Leu Asp Ile Glu Lys Asn Lys Lys Lys Arg Thr Glu Ala Glu Leu Gln
1               5                   10                  15
Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr
            20                  25
<210>54
<211>28
<212>PRT
<213>黏膜莫拉氏菌
<400>54
Ile Asp Ile Glu Lys Lys Gly Lys Ile Arg Thr Glu Ala Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ala Glu Leu Asn Lys Asp Tyr Pro Gly Gln Gly Tyr
            20                  25
<210>55
<211>25
<212>PRT
<213>牙龈卟啉单胞菌
<400>55
Gly Val Ser Pro Lys Val Cys Lys Asp Val Thr Val Glu Gly Ser Asn
1               5                   10                  15
Glu Phe Ala Pro Val Gln Asn Leu Thr
            20                  25
<210>56
<211>20
<212>PRT
<213>牙龈卟啉单胞菌
<400>56
Arg Ile Gln Ser Thr Trp Arg Gln Lys Thr Val Asp Leu Pro Ala Gly
1               5                   10                  15
Thr Lys Tyr Val
            20
<210>57
<211>21
<212>PRT
<213>克鲁氏锥虫
<400>57
Lys Ala Ala Ile Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala
1               5                   10                  15
Ala Thr Ala Pro Ala
            20
<210>58
<211>24
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>58
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro
            20
<210>59
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>59
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Ala Asn Pro
            20
<210>60
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>60
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro
1               5                   10                  15
Asn Ala Asn Pro
            20
<210>61
<211>28
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>61
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
AsnAla Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro
           20                  25
<210>62
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>62
Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala
1               5                   10                  15
Asn Pro Asn Val
            20
<210>63
<211>22
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>63
Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala
1               5                   10                  15
Asn Pro Asn Val Asp Pro
               20
<210>64
<211>24
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>64
Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala
1               5                   10                  15
Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala
            20
<210>65
<211>18
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>65
Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Val
<210>66
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>66
Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Val Asp Pro
            20
<210>67
<211>22
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>67
Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Val Asp Pro Asn Ala
            20
<210>68
<211>16
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>68
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1               5                   10                  15
<210>69
<211>18
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>69
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1               5                   10                  15
Asp Pro
<210>70
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>70
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1               5                   10                  15
Asp Pro Asn Ala
            20
<210>71
<211>19
<212>PRT
<213>间日疟原虫
<400>71
Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln
1               5                   10                  15
Pro Ala Gly
<210>72
<211>18
<212>PRT
<213>间日疟原虫
<400>72
Arg Ala Asp Asp Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Gly Gln Pro
1               5                   10                  15
Ala Gly
<210>73
<211>18
<212>PRT
<213>间日疟原虫
<400>73
Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly
<210>74
<211>18
<212>PRT
<213>间日疟原虫
<400>74
Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly
<210>75
<211>18
<212>PRT
<213>间日疟原虫
<400>75
Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly
<210>76
<211>18
<212>PRT
<213>间日疟原虫
<400>76
Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly
<210>77
<211>22
<212>PRT
<213>间日疟原虫
<400>77
Ala Pro Gly Ala Asn Gln Glu Gly Gly Ala Ala Ala Pro Gly Ala Asn
1               5                   10                  15
Gln Glu Gly Gly Ala Ala
            20
<210>78
<211>36
<212>PRT
<213>间日疟原虫
<400>78
Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp
            20                   25                  30
Asp Gln Pro Gly
35
<210>79
<211>16
<212>PRT
<213>贝氏疟原虫
<400>79
Asp Pro Pro Pro Pro Asn Pro Asn Asp Pro Pro Pro Pro Asn Pro Asn
1               5                   10                  15
<210>80
<211>24
<212>PRT
<213>约氏疟原虫
<400>80
Gln Gly Pro Gly Ala Pro Gln Gly Pro Gly Ala Pro Gln Gly Pro Gly
1               5                   10                  15
Ala Pro Gln Gly Pro Gly Ala Pro
            20
<210>81
<211>15
<212>PRT
<213>表兄链球菌
<400>81
Lys Pro Arg Pro Ile Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Asn Gln Lys
1               5                   10                  15
<210>82
<211>16
<212>PRT
<213>表兄链球菌
<400>82
Ala Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Tyr Glu Lys Asp Leu
1               5                   10                  15
<210>83
<211>9
<212>PRT
<213>弗氏志贺氏菌
<400>83
Lys Asp Arg Thr Leu Ile Glu Gln Lys
1               5
<210>84
<211>15
<212>PRT
<213>呼吸道合胞病毒
<400>84
Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys
1               5                   10                  15
<210>85
<211>25
<212>PRT
<213>痢疾内变形虫
<400>85
Val Glu Cys Ala Ser Thr Val Cys Gln Asn Asp Asn Ser Cys Pro Ile
1               5                   10                  15
Ile Ala Asp Val Glu Lys Cys Asn Gln
            20                  25
<210>86
<211>34
<212>PRT
<213>日本血吸虫
<400>86
Asp Leu Gln Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Gly Glu Leu Ile
1               5                   10                  15
Arg Arg Ala Lys Sar Ala Glu Ser Leu Ala Ser Glu Leu Gln Arg Arg
            20                   25                  30
Val Asp
<210>87
<211>34
<212>PRT
<213>曼氏血吸虫
<400>87
Asp Leu Gln Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Ser Glu Leu Ile
1               5                   10                  15
Arg Arg Ala Lys Ala Ala Glu Ser Leu Ala Ser Asp Leu Gln Arg Arg
            20                  25                  30
Val Asp
<210>88
<211>26
<212>PRT
<213>牛抑制素
<400>88
Ser Thr Pro Pro Leu Pro Trp Pro Trp Ser Pro Ala Ala Leu Arg Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Arg Pro Pro Glu Glu Pro Ala Ala
            20                  25
<210>89
<211>17
<212>PRT
<213>埃博拉病毒
<400>89
Ala Thr Gln Val Glu Gln His His Arg Arg Thr Asp Asn Asp Ser Thr
1               5                   10                  15
Ala
<210>90
<211>17
<212>PRT
<213>埃博拉病毒
<400>90
His Asn Thr Pro Val Tyr Lys Leu Asp Ile Ser Glu Ala Thr Gln Val
1               5                   10                  15
Glu
<210>91
<211>17
<212>PRT
<213>埃博拉病毒
<400>91
Gly Lys Leu Gly Leu Ile Thr Asn Thr Ile Ala Gly Val Ala Val Leu
1               5                   10                  15
Ile
<210>92
<211>14
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>92
Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys Asn
1               5                   10
<210>93
<211>18
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>93
Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly
1               5                   10                  15
Cys Asn
<210>94
<211>18
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>94
Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly
1               5                   10                  15
Cys Asn
<210>95
<211>42
<212>PRT
<213>阿尔茨海默病β-淀粉样蛋白
<400>95
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
            20                  25                  30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
        35                  40
<210>96
<211>17
<212>PRT
<213>阿尔茨海默病β-淀粉样蛋白
<400>96
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu
<210>97
<211>11
<212>PRT
<213>阿尔茨海默病β-淀粉样蛋白
<400>97
Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
1               5                   10
<210>98
<211>33
<212>PRT
<213>阿尔茨海默病3-淀粉样蛋白
<400>98
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
            20                  25                  30
Gly
<210>99
<211>32
<212>PRT
<213>阿尔茨海默病β-淀粉样蛋白
<400>99
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
          20                  25                  30
<210>100
<211>13
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>100
Tyr Val Ala Val Glu Asn Gly Val Ala Lys Lys Val Ala
1               5                   10
<210>101
<211>15
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>101
His Phe Val Gln Gln Thr Pro Lys Ser Gln Pro Thr Leu Val Pro
1               5                   10                  15
<210>102
<211>13
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>102
His Val Val Val Asn Asn Lys Val Ala Thr His Val Pro
1               5                   10
<210>103
<211>12
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>103
Pro Leu Gln Asn Ile Gln Pro Gln Val Thr Lys Arg
1               5                   10
<210>104
<211>21
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>104
Ala Gln Ala Ala Asn Gly Gly Ala Ala Ser Gly Gln Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Lys Ala
            20
<210>105
<211>10
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>105
Tyr Val Asp Glu Gln Ser Lys Tyr His Ala
1               5                   10
<210>106
<211>15
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>106
His Phe Val Gln Asn Lys Gln Asn Gln Pro Pro Thr Leu Val Pro
1               5                   10                  15
<210>107
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>107
Lys Pro Ser Ser Thr Asn Ala Lys Thr Gly Asn Lys Val Glu Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>108
<211>17
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>108
Tyr Trp Thr Thr Val Asn Thr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Thr Phe Val
1               5                   10                  15
Pro
<210>109
<211>11
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>109
Tyr Val Asp Glu Lys Lys Lys Met Val His Ala
1               5                   10
<210>110
<211>13
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>110
His Tyr Thr Arg Gln Asn Asn Ala Asp Val Phe Val Pro
1               5                   10
<210>111
<211>14
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>111
Tyr Tyr Thr Lys Asp Thr Asn Asn Asn Leu Thr Leu Val Pro
1               5                   10
<210>112
<211>14
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>112
Pro Pro Gln Lys Asn Gln Ser Gln Pro Val Val Thr Lys Ala
1               5                   10
<210>113
<211>14
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>113
Pro Pro Ser Lys Gly Gln Thr Gly Asn Lys Val Thr Lys Gly
1               5                   10
<210>114
<211>14
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>114
Pro Pro Ser Lys Ser Gln Pro Gln Val Lys Val Thr Lys Ala
1               5                   10
<210>115
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>115
Gln Pro Gln Thr Ala Asn Thr Gln Gln Gly Gly Lys Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>116
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>116
Gln Pro Gln Val Thr Asn Gly Val Gln Gly Asn Gln Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>117
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>117
Gln Pro Ser Lys Ala Gln Gly Gln Thr Asn Asn Gln Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>118
<211>20
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>118
Pro Pro Ser Ser Asn Gln Gly Lys Asn Gln Ala Gln Thr Gly Asn Thr
1               5                   10                  15
Val Thr Lys Ala
            20
<210>119
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>119
Pro Pro Ser Lys Ser Gln Gly Lys Thr Gly Asn Gln Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>120
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>120
Pro Pro Ser Lys Ser Gln Gly Thr Asn Asn Asn Gln Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>121
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>121
Pro Pro Ser Lys Ser Gln Pro Gly Gln Val Lys Val Thr Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>122
<211>24
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>122
Gln Leu Gln Leu Thr Glu Gln Pro Ser Ser Thr Asn Gly Gln Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Gln Val Lys Val Thr Lys Ala
            20
<210>123
<211>24
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>123
Gln Leu Gln Leu Thr Glu Ala Pro Ser Lys Ser Gln Gly Ala Ala Ser
1               5                   10                  15
Asn Gln Val Lys Val Thr Lys Ala
            20
<210>124
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>124
Ser Ala Tyr Thr Pro Ala His Val Tyr Val Asp Asn Lys Val Ala Lys
1               5                   10                  15
His Val Ala
<210>125
<211>21
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>125
Ser Ala Tyr Thr Pro Ala His Phe Val Gln Asn Lys Gln Asn Asn Asn
1               5                   10                  15
Pro Thr Leu Val Pro
            20
<210>126
<211>12
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>126
Val Glu Gly Arg Asn Tyr Gln Leu Gln Leu Thr Glu
1               5                   10
<210>127
<211>12
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>127
Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr Thr Pro Ala
1               5                   10
<210>128
<211>22
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>128
Gln Leu Gln Leu Thr Glu Pro Pro Ser Lys Asn Gln Ala Gln Thr Gln
1               5                   10                  15
Asn Lys Val Thr Lys Ala
            20
<210>129
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>129
Gly Arg Asp Ala Phe Glu Leu Phe Leu Leu Gly Ser Gly Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
<210>130
<211>31
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>130
Arg His Ala Asn Val Gly Arg Asp Ala Phe Glu Leu Phe Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Ser Gly Ser Asp Glu Ala Lys Gly Thr Asp Pro Leu Lys Asn His
            20                  25                  30
<210>131
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>131
Gly Arg Asp Ala Phe Asn Leu Phe Leu Leu Gly Arg Ile Gly Asp Asp
1               5                   10                  15
Asp Glu
<210>132
<211>17
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>132
Gly Arg Asn Ala Phe Glu Leu Phe Leu Ile Gly Ser Ala Thr Ser Asp
1               5                   10                  15
Gln
<210>133
<211>15
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>133
Gln Val Lys Val Thr Lys Ala Lys Ser Arg Ile Arg Thr Lys Ile
1               5                   10                  15
<210>134
<211>13
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>134
Thr Leu Val Pro Ala Val Val Gly Lys Pro Gly Ser Asp
1               5                   10
<210>135
<211>17
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>135
His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro
1               5                   10                  15
Arg
<210>136
<211>15
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>136
Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu
1               5                   10                  15
<210>137
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>137
Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val Asp Leu Gly G1y Ser Asp Ser Phe Ser
1               5                   10                  15
Gln Thr
<210>138
<211>21
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>138
Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala
1               5                   10                  15
Gly Val Arg Val Lys
            20
<210>139
<211>21
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>139
Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val
1               5                   10                  15
Gly Val Arg Val Lys
            20
<210>140
<211>13
<212>PRT
<213>智人
<400>140
Ala Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu
1               5                   10
<210>141
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>141
Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp
1               5
<210>142
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>142
Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu
1               5
<210>143
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>143
Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys
1               5                   10
<210>144
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>144
Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr
1               5
<210>145
<211>6
<212>PRT
<213>智人
<400>145
Pro Gly Thr Ile Asn Ile
1               5
<210>146
<211>5
<212>PRT
<213>智人
<400>146
Phe Thr Pro Pro Thr
1           5
<210>147
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>147
Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val
1               5
<210>148
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>148
Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys Gly Asp Pro
1               5                   10                  15
Ala
<210>149
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>149
Met Ala Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu
1               5                   10
<210>150
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>150
Met Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp
1               5                  10
<210>151
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>151
Met Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu
1               5
<210>152
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>152
Met Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys
1               5                   10
<210>153
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>153
Met Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr
1               5
<210>154
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<400>154
Met Pro Gly Thr Ile Asn Ile
1               5
<210>155
<211>6
<212>PRT
<213>智人
<400>155
Met Phe Thr Pro Pro Thr
1               5
<210>156
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>156
Met Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val
1               5
<210>157
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>157
Met Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys Gly Asp
1               5                   10                  15
Pro Ala
<210>158
<211>21
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>158
Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1               5                   10                  15
His Gln Leu Asp Pro
            20
<210>159
<211>8
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>159
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1               5
<210>160
<211>10
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>160
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu
1               5                   10
<210>161
<211>26
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>161
Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg
1               5                   10                  15
Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly
            20                  25
<210>162
<211>14
<212>PRT
<213>乙型肝炎(病毒)
<400>162
Met Gln Trp Ser Thr Ala Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro
1               5                   10
<210>163
<211>14
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>163
Met Gln Trp Ser Thr Ala Leu His Gln Ala Leu Gln Asp Pro
1               5                   10
<210>164
<211>6
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>164
Gln Asp Pro Arg Val Arg
1               5
<210>165
<211>13
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>165
Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly
1               5                   10
<210>166
<211>13
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>166
Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly
1               5                   10
<210>167
<211>24
<212>PRT
<213>炭疽杆菌
<400>167
Ile Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp
1               5                   10                  15
Thr Ser Thr Asn Gly Ile Glu Leu
            20
<210>168
<211>15
<212>PRT
<213>钩虫
<400>168
Ile Val Tyr Gln His Ser His Gly Glu Asp Arg Pro Gly Glu Leu
1               5                   10                  15
<210>169
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头肽
<400>169
Gly Ser Gly Asp Gly Glu Gly Gly
1               5
<210>170
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>柔性接头臂
<400>170
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr
1               5                   10
<210>171
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>柔性接头臂序列
<400>171
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>172
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>柔性接头臂
<400>172
Gly Ser Gly Asp Glu Gly Gly
1               5
<210>173
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>柔性接头臂
<400>173
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1               5
<210>174
<211>16
<212>PRT
<213>HIV
<400>174
Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Cys
1               5                   10                  15
<210>175
<211>17
<212>PRT
<213>白喉棒杆菌
<400>175
Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Cys
<210>176
<211>25
<212>PRT
<213>布氏疏螺旋体
<400>176
Val Glu Ile Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Lys Arg Glu Ile Asp Lys
1               5                   10                  15
Asn Gly Lys Val Thr Val Ser Leu Cys
            20                  25
<210>177
<211>19
<212>PRT
<213>布氏疏螺旋体
<400>177
Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu
1               5                   10                  15
Asn Asp Cys
<210>178
<211>11
<212>PRT    
<213>甲型流感病毒
<400>178
Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Cys
1               5                   10
<210>179
<211>10
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>179
Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Cys
1               5                   10
<210>180
<211>9
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>180
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Cys
1               5
<210>181
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>181
Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ser Ala Tyr Glu Arg
1               5                   10                  15
Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys
            20
<210>182
<211>22
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>182
Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val Ser Pro Arg Gly
1               5                   10                  15
Lys Leu Ser Thr Arg Gly
             20
<210>183
<211>22
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>183
Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val
1               5                   10                  15
Tyr Ser Leu Ile Arg Pro
            20
<210>184
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>184
Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu Leu Ile Arg Met Ile
1               5                   10                  15
Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn
            20
<210>185
<211>21
<212>PRT
<213>克鲁氏椎虫
<400>185
Ser His Asn Phe Thr Leu Val Ala Ser Val Ile Ile Glu Glu Ala Pro
1               5                   10                  15
Ser Gly Asn Thr Cys
            20
<210>186
<211>16
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>186
Ser Val Gln Ile Pro Lys Val Pro Tyr Pro Asn Gly Ile Val Tyr Cys
1               5                   10                  15
<210>187
<211>16
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>187
Asp Phe Asn His Tyr Tyr Thr Leu Lys Thr Gly Leu Glu Ala Asp Cys
1               5                   10                  15
<210>188
<211>18
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>188
Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Lys Lys Ile Lys Asn Ser Ile
1               5                   10                  15
Ser Cys
<210>189
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>189
Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro
1               5                   10                  15
Cys Ser Val Thr
            20
<210>190
<211>19
<212>PRT
<213>间日疟原虫
<400>190
Tyr Leu Asp Lys Val Arg Ala Thr Val Gly Thr Glu Trp Thr Pro Cys
1               5                   10                  15
Ser Val Thr
<210>191
<211>20
<212>PRT
<213>约氏疟原虫
<400>191
Glu Phe Val Lys Gln Ile Ser Ser Gln Leu Thr Glu Glu Trp Ser Gln
1               5                   10                  15
Cys Ser Val Thr
            20
<210>192
<211>16
<212>PRT
<213>表兄链球菌
<400>192
Lys Pro Arg Pro Ile Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Asn Gln Lys Cys
1               5                   10                  15
<210>193
<211>17
<212>PRT
<213>表兄链球菌
<400>193
Ala Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Tyr Glu Lys Asp Leu
1               5                   10                  15
Cys
<210>194
<211>16
<212>PRT
<213>淋巴脉络丛脑膜炎病毒
<400>194
Arg Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly Asn Leu Thr Ala Gln Cys
1               5                   10                  15
<210>195
<211>16
<212>PRT
<213>破伤风梭菌
<400>195
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys
1               5                   10                  15
<210>196
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>196
Ala Ile Trp Gln Val Glu Gln Lys Ala Ser Ile Ala Gly Thr Asp Ser
1               5                   10                  15
Gly Trp Cys
<210>197
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>197
Asn Tyr Lys Asn Gly Gly Phe Phe Val Gln Tyr Gly Gly Ala Tyr Lys
1               5                   10                  15
Arg His Cys
<210>198
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>198
His Asn Ser Gln Thr Glu Val Ala Ala Thr Leu Ala Tyr Arg Phe Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Cys
<210>199
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>199
Thr Pro Arg Val Ser Tyr Ala His Gly Phe Lys Gly Leu Val Asp Asp
1               5                   10                  15
Ala Asp Cys
<210>200
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>200
Arg Phe Gly Asn Ala Val Pro Arg Ile Ser Tyr Ala His Gly Phe Asp
1               5                   10                  15
Phe Ile Cys
<210>201
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>201
Ala Phe Lys Tyr Ala Arg His Ala Asn Val Gly Arg Asn Ala Phe Glu
1               5                   10                  15
Leu Phe Cys
<210>202
<211>20
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>202
Ser Gly Ala Trp Leu Lys Arg Asn Thr Gly Ile Gly Asn Tyr Thr Gln
1               5                   10                  15
Ile Asn Ala Cys
20
<210>203
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>203
Ala Gly Glu Phe Gly Thr Leu Arg Ala Gly Arg Val Ala Asn Gln Cys
1               5                   10                  15
<210>204
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>204
Ile Gly Asn Tyr Thr Gln Ile Asn Ala Ala Ser Val Gly Leu Arg Cys
1               5                   10                  15
<210>205
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>205
Gly Arg Asn Tyr Gln Leu Gln Leu Thr Glu Gln Pro Ser Arg Thr Cys
1               5                   10                  15
<210>206
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>206
Ser Gly Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Cys
1               5                   10                  15
<210>207
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>207
His Ala Asn Val Gly Arg Asp Ala Phe Asn Leu Phe Leu Leu Gly Cys
1               5                   10                  15
<210>208
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>208
Leu Gly Arg Ile Gly Asp Asp Asp Glu Ala Lys Gly Thr Asp Pro Cys
1               5                   10                  15
<210>209
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>209
Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr Lys Cys
1               5                   10                  15
<210>210
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>210
Asn Tyr Ala Phe Lys Tyr Ala Lys His Ala Asn Val Gly Arg Asp Cys
1               5                   10                  15
<210>211
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>211
Ala His Gly Phe Asp Phe Ile Glu Arg Gly Lys Lys Gly Glu Asn Cys
1               5                   10                  15
<210>212
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>212
Gly Val Asp Tyr Asp Phe Ser Lys Arg Thr Ser Ala Ile Val Ser Cys
1               5                   10                  15
<210>213
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>213
His Asp Asp Met Pro Val Ser Val Arg Tyr Asp Ser Pro Asp Phe Cys
1               5                   10                  15
<210>214
<211>27
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>214
Arg Phe Gly Asn Ala Val Pro Arg Ile Ser Tyr Ala His Gly Phe Asp
1               5                   10                  15
Phe Ile Glu Arg Gly Lys Lys Gly Glu Asn Cys
            20                  25
<210>215
<211>24
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>215
Asn Tyr Ala Phe Lys Tyr Ala Lys His Ala Asn Val Gly Arg Asp Ala
1               5                   10                  15
Phe Asn Leu Phe Leu Leu Gly Cys
            20
<210>216
<211>26
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>216
Ser Gly Ala Trp Leu Lys Arg Asn Thr Gly Ile Gly Asn Tyr Thr Gln
1               5                   10                  15
Ile Asn Ala Ala Ser Val Gly Leu Arg Cys
            20                  25
<210>217
<211>20
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>217
Ser Gly Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr
1               5                   10                  15
Thr Pro Ala Cys
            20
<210>218
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>218
Thr Gly Ala Asn Asn Thr Ser Thr Val Ser Asp Tyr Phe Arg Asn Arg
1               5                   10                  15
Ile Thr Cys
<210>219
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>219
Ile Tyr Asp Phe Lys Leu Asn Asp Lys Phe Asp Lys Phe Lys Pro Tyr
1               5                   10                  15
Ile Gly Cys
<210>220
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>220
Leu Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Lys Leu Asn Asp Lys Phe Lys Pro Tyr
1               5                   10                  15
Ile Gly Cys
<210>221
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>221
Asn Gly Trp Tyr Ile Asn Pro Trp Ser Glu Val Lys Phe Asp Leu Asn
1               5                   10                  15
Ser Arg Cys
<210>222
<211>20
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>222
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro
            20
<210>223
<211>24
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>223
Arg Asp Leu Leu Asp Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser
1               5                   10                  15
Pro Glu His Cys Ser Pro His His
            20
<210>224
<211>25
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>224
Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val
1               5                   10                  15
Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly
            20                  25
<210>225
<211>16
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>225
Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu
1               5                   10                  15
<210>226
<211>21
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>226
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
1               5                   10                  15
Ile Glu Tyr Leu Val
            20
<210>227
<211>32
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>227
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Val Ser Phe Gly Val
1               5                   10                  15
Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
            20                  25                  30
<210>228
<211>21
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>228
Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro
1               5                   10                  15
Asn Ala Pro Ile Leu
            20
<210>229
<211>12
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>229
Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
1               5                   10
<210>230
<211>12
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>230
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
1               5                    10
<210>231
<211>12
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>231
Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn
1               5                   10
<210>232
<211>20
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>232
Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu
1               5                   10                  15
Met Thr Leu Ala
            20
<210>233
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PADRE表位
<400>233
Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1               5                   10
<210>234
<211>549
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>234
atggacatcg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct  60
tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa  120
gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt  180
tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg ttaatttgga agatccagcg  240
tctagagacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt caggcaactc  300
ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga gtatttggtg  360
tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta  420
tcaacacttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact  480
ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa  540
tctcaatgt                                                          549
<210>235
<211>555
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>235
atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct  60
tctgacttct ttccttccgt acgagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa  120
gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc  180
tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgca agatccagca  240
tccagagatc tagtagtcaa ttatgttaat actaacatgg gtttaaagat caggcaacta  300
ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc  360
tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta  420
tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga  480
agaactccct cgcctcgcag acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct  540
cgggaatctc aatgt                                                   555
<210>236
<211>555
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>236
atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct  60
tctgacttct ttccttccgt cagagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa  120
gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc  180
tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgga agatccagca  240
tctagggatc ttgtagtaaa ttatgttaat actaacgtgg gtttaaagat caggcaacta  300
ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc  360
tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta  420
tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga  480
agaactccct cgcctcgcag acgcagatct ccatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct  540
cgggaatctc aatgt                                                   555
<210>237
<211>549
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>237
atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct  60
tctgacttct ttccttccgt acgagatctt ctagataccg ccgcagctct gtatcgggat  120
gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt  180
tgctggggag acttaatgac tctagctacc tgggtgggta ctaatttaga agatccagca  240
tctagggacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatgtgg gcctaaagtt cagacaatta  300
ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cggttctaga gtatttggtg  360
tcttttggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta  420
tcaacgcttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact  480
ccctcgcctc gcagacgaag atctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa  540
tctcaatgt                                                          549
<210>238
<211>549
<212>DNA
<213>旱獭
<400>238
atggctttgg ggcatggaca tagatcctta taaagaattt ggttcatctt atcagttgtt  60
gaattttctt cctttggact tctttcctga tcttaatgct ttggtggaca ctgctactgc  120
cttgtatgaa gaagaactaa caggtaggga acattgctct ccgcaccata cagctattag  180
acaagcttta gtatgctggg atgaattaac taaattgata gcttggatga gctctaacat  240
aacttctgaa caagtaagaa caatcattgt aaatcatgtc aatgatacct ggggacttaa  300
ggtgagacaa agtttatggt ttcatttgtc atgtctcact ttcggacaac atacagttca  360
agaattttta gtaagttttg gagtatggat caggactcca gctccatata gacctcctaa  420
tgcacccatt ctctcgactc ttccggaaca tacagtcatt aggagaagag gaggtgcaag  480
agcttctagg tcccccagaa gacgcactcc ctctcctcgc aggagaagat ctcaatcacc    540
gcgtcgcag                                                            549
<210>239
<211>651
<212>DNA
<213>地松鼠
<400>239
atgtatcttt ttcacctgtg ccttgttttt gcctgtgttc catgtcctac tgttcaagcc    60
tccaagctgt gccttggatg gctttgggac atggacatag atccctataa agaatttggt    120
tcttcttatc agttgttgaa ttttcttcct ttggactttt ttcctgatct caatgcattg    180
gtggacactg ctgctgctct ttatgaagaa gaattaacag gtagggagca ttgttctcct    240
catcatactg ctattagaca ggccttagtg tgttgggaag aattaactag attaattaca    300
tggatgagtg aaaatacaac agaagaagtt agaagaatta ttgttgatca tgtcaataat    360
acttggggac ttaaagtaag acagacttta tggtttcatt tatcatgtct tacttttgga    420
caacacacag ttcaagaatt tttggttagt tttggagtat ggattagaac tccagctcct    480
tatagaccac ctaatgcacc cattttatca actcttccgg aacatacagt cattaggaga    540
agaggaggtt caagagctgc taggtccccc cgaagacgca ctccctctcc tcgcaggaga    600
aggtctcaat caccgcgtcg cagacgctct caatctccag cttccaactg c             651
<210>240
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>240
ggtgcatgca aggagatg                                                 18
<210>241
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>241
gcgaagcttc ggatcccatg gttttttcct ccttatgtga aattgttatc cgctc      55
<210>242
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>242
ttgggccatg gacatcgacc ctta                                        24
<210>243
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>243
cgcaagctta aacaacagta gtctccggaa g                                31
<210>244
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>244
gtttctcttc caaaagtgag gctagaaatg tgaaaccaca aga                   43
<210>245
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>245
ctcacttttg gaagagaaac                                             20
<210>246
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>246
gagcgcagta tggtgaggtg agctatgctc aggagactc                        39
<210>247
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>247
gaggcgctca ggcaagcaat tcttt                                       25
<210>248
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>248
cgcaagctta ctagcaaaca acagtagtct cggaa                            35
<210>249
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>249
gcgctcttcc aaaagtgagg ctagaaatgc aaaaccacaa gagttgcct              49
<210>250
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>250
gcgggcccat attagtgttg caataactga ctactaggtc tc                     42
<210>251
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>251
gcggctcgcc ccagcaaaga attgcttgtc tacacgcagt atggtgaggt             50
<210>252
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>252
ggggcgagct aatgactcta gctacct                                      27
<210>253
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>253
gcggctcgcc ccagcaaaga atgcattgcc tgagcgcagt atg                    43
<210>254
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>254
ttaggcccat attagtgttg                                              20
<210>255
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>255
gcggggccta aagttcaggc aatgcttgtg gtttcacatt tcta                   44
<210>256
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>256
gcgccaggtg catagagtca ttagttcccc c                                 31
<210>257
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>257
ctacctgggt gggtgtt                                                 17
<210>258
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>258
tatgggccta aagttcagg                                               19
<210>259
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>259
gcggctcgcc gcagcaaaga attgcttgtc tgagcgcagt atggtgagg              49
<210>260
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>260
gcggggccta aagtgcaggc aactcttgtg gtt                               33
<210>261
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>261
gcggctagct ggatcttcgc aattaacac                                    29
<210>262
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>262
gcggctagct gcgacctagt agtcagtt                                     28
<210>263
<211>24
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>263
ttgggccatg gacatcgacc ctta                                         24
<210>264
<211>31
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>254
gcggaattcc atcttccaaa ttaacaccca c                                 31
<210>265
<211>39
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>265
cgcgaattca aaaagagctc ccagcgtcta gagacctag                         39
<210>266
<211>31
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>266
cgcaagctta aacaacagta gtctccggaa g                                 31
<210>267
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>267
cgcaagctta ctagcaaaca acagtagtct ccggaag                           37
<210>268
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>268
ggaaagctta ctaacattga gattcccg                                     28
<210>269
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>269
gcggaattcc atcttccaaa ttaacaccca c                                 31
<210>270
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>270
gcggaattcc atcttcgcaa ttaacaccca                                   30
<210>271
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>271
cgggaattca aaaagagctc ccagcgtcta gagacctag                         39
<210>272
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>272
gcggaattca aaaagagctc ccagctagct gcgacct                           37
<210>273
<211>108
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>273
aattctggat gcggaatttc gtcatgacag cggctatgag gtgcaccatc agaaactggt  60
tttctttgcc gaagatgtcg gttctaacaa gggggcaatt atcgagct               108
<210>274
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>274
aattgtcacg aaagaaaata ctataattaa cccttctgag aatggtgaca cctccacgaa    60
cgggatcgag ct                                                        72
<210>275
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>275
aattgtttat cagcattctc acggcgaaga tcgtccaggt gagct                    45
<210>276
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>276
aatttctctg ttaaccgaag tggagacgcc gattcgtaac gaatggggta gccgctctaa    60
tgatagctct gacgagct                                                  78
<210>277
<211>12
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>277
Met Gly Cys Glu Leu Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly
1               5                   10
<210>278
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>278
gcgccatggg gtgtgagctc gacccttata aagaatttgg                        40
<210>279
<211>12
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>279
Met Gly Cys Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly
1               5                   10
<210>280
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>280
gcgccatggg gtgtgacatc gaccct tata aagaat ttgg                      40
<210>281
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>281
cgcaagctta gagctcttga attccaacaa cagtagtctc cg                     42
<210>282
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>282
cgcgagctcc cagcgtctag agacctag                                     28
<210>283
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>283
gtatcaggct gaaaatc                                                 17
<210>284
<211>19
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>284
Ile Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu
<210>285
<211>57
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>285
aattaacgct aatccgaacg ctaatccgaa cgctaatccg aacgctaatc cggagct     57
<210>286
<211>49
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>286
ccggattagc gttcggatta gcgttcggat tagcgttcgg attagcgtt              49
<210>287
<211>31
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>287
Ile Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu
            20                  25                  30
<210>288
<211>93
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>288
aattaacgct aatccgaacg ttgacccgaa cgctaatccg aacgctaatc cgaacgctaa  60
tccgaacgtt gacccgaacg ctaatccgga gct                               93
<210>289
<211>91
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>289
ggagctccgg attagcgttc gggtcaacgt tcggattagc gttcggatta gcgttcggat  60
tagcgttcgg gtcaacgttc ggattagcgt t                                 91
<210>290
<211>23
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>290
Ile Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu
            20
<210>291
<211>69
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>291
aattaacgcg aatccgaacg tggatccgaa tgccaaccct aacgccaacc caaatgcgaa    60
cccagagct                                                            69
<210>292
<211>61
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>292
ctgggttcgc atttgggttg gcgttagggt tggcattcgg atccacgttc ggattcgcgt    60
t                                                                    61
<210>293
<211>23
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>293
Ile Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp
1               5                   10                  15
Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu
            20
<210>294
<211>69
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>294
aattaacgcg aatccgaatg ccaaccctaa cgccaaccca aacgtggatc cgaatgcgaa    60
cccagagct                                                            69
<210>295
<211>61
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>295
ctgggttcgc attcggatcc acgtttgggt tggcgttagg gttggcattc ggattcgcgt    60
t                                                                    61
<210>296
<211>31
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>296
Ile Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu
            20                  25                  30
<210>297
<211>93
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>297
aattaacgcg aatccgaacg tggatccaaa tgccaaccct aacgctaatc caaacgccaa    60
cccgaatgtt gaccccaatg ccaatccgga gct                                 93
<210>298
<211>85
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>298
ccggattggc attggggtca acattcgggt tggcgtttgg attagcgtta gggttggcat    60
ttggatccac gttcggattc gcgtt                                          85
<210>299
<211>23
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>299
Ile Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn
1               5                   10                  15
Ala Asn Pro Asn Val Glu Leu
            20
<210>300
<211>69
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>300
aattaatccg aacgtggatc caaatgccaa ccctaacgct aatccaaacg ccaacccgaa    60
tgttgagct                                                            69
<210>301
<211>61
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>301
caacattcgg gttggcgttt ggattagcgt tagggttggc atttggatcc acgttcggat    60
t                                                                    61
<210>302
<211>25
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>302
Ile Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn
1               5                   10                  15
Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Glu Leu
            20                  25
<210>303
<211>75
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>303
aattaatccg aacgtggatc caaatgccaa ccctaacgct aatccaaacg ccaacccgaa    60
tgttgaccct gagct                                                     75
<210>304
<211>67
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>304
cagggtcaac attcgggttg gcgtttggat tagcgttagg gttggcattt ggatccacgt    60
tcggatt                                                              67
<210>305
<211>27
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>305
Ile Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn
1               5                   10                  15
Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Glu Leu
            20                  25
<210>306
<211>81
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>306
aattaatccg aacgtggatc caaatgccaa ccctaacgct aatccaaacg ccaacccgaa    60
tgttgaccct aatgctgagc t                                              81
<210>307
<211>73
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>307
cagcattagg gtcaacattc gggttggcgt ttggattagc gttagggttg gcatttggat    60
ccacgttcgg att                                                       73
<210>308
<211>21
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>308
Ile Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Val Glu Leu
            20
<210>309
<211>63
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>309
aattaacgtg gatccaaatg ccaaccctaa cgctaatcca aacgccaacc cgaatgttga    60
gct    63
<210>310
<211>55
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>310
caacattcgg gttggcgttt ggattagcgt tagggttggc atttggatcc acgtt         55
<210>311
<211>23
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>311
Ile Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Val Asp Pro Glu Leu
            20
<210>312
<211>69
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>312
aattaacgtg gatccaaatg ccaaccctaa cgctaatcca aacgccaacc cgaatgttga    60
ccctgagct                                                            69
<210>313
<211>61
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>313
cagggtcaac attcgggttg gcgtttggat tagcgttagg gttggcattt ggatccacgt    60
t                                                                    61
<210>314
<211>25
<212>PRT    
<213>恶性疟原虫
<400>314
Ile Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Glu Leu
            20                  25
<210>315
<211>75
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>315
aattaacgtg gatccaaatg ccaaccctaa cgctaatcca aacgccaacc cgaatgttga    60
ccctaatgct gagct                                                     75
<210>316
<211>67
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>316
cagcattagg gtcaacattc gggttggcgt ttggattagc gttagggttg gcatttggat    60
ccacgtt                                                              67
<210>317
<211>19
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>317
Ile Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn
1               5                   10                  15
Val Glu Leu
<210>318
<211>57
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>318
aattgatcca aatgccaacc ctaacgctaa tccaaacgcc aacccgaatg ttgagct    57
<210>319
<211>49
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>319
caacattcgg gttggcgttt ggattagcgt tagggttggc atttggatc             49
<210>320
<211>21
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>320
Ile Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn
1               5                   10                  15
Val Asp Pro Glu Leu
            20
<210>321
<211>63
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>321
aattgatcca aatgccaacc ctaacgctaa tccaaacgcc aacccgaatg ttgaccctga    60
gct    63
<210>322
<211>55
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>322
cagggtcaac attcgggttg gcgtttggat tagcgttagg gttggcattt ggatc         55
<210>323
<211>23
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>323
Ile Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn
1               5                   10                  15
Val Asp Pro Asn Ala Glu Leu
            20
<210>324
<211>69
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>324
aattgatcca aatgccaacc ctaacgctaa tccaaacgcc aacccgaatg ttgaccctaa    60
tgccgagct                                                            69
<210>325
<211>61
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>325
cggcattagg gtcaacattc gggttggcgt ttggattagc gttagggttg gcatttggat    60
c                                                                    61
<210>326
<211>21
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>326
Ile Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Set
1               5                   10                  15
Pro Cys Ser Val Thr
            20
<210>327
<211>69
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>327
aattgaatat ctgaacaaaa tccagaactc tctgtccacc gaatggtctc cgtgctccgt    60
tacctagta                                                            69
<210>328
<211>69
<212>DNA
<213>恶性疟原虫
<400>328
agcttactag gtaacggagc acggagacaa ttcggtggac agagagttct ggattttgtt    60
cagatattc                                                            69
<210>329
<211>24
<212>PRT
<213>间日疟原虫
<400>329
Ile Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala
1               5                   10                  15
Ala Gly Gln Pro Ala Gly Glu Leu
            20
<210>330
<211>72
<212>DNA
<213>间日疟原虫
<400>330
aattccggct ggtgaccgtg cagatggcca gccagcgggt gaccgcgctg caggccagcc    60
ggctggcgag ct                                                        72
<210>331
<211>64
<212>DNA
<213>间日疟原虫
<400>331
cgccagccgg ctggcctgca gcgcggtcac ccgctggctg gccatctgca cggtcaccag    60
ccgg                                                                 64
<210>332
<211>21
<212>PRT
<213>间日疟原虫
<400>332
Ile Asp Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln
1               5                   10                  15
Pro Ala Gly Glu Leu
            20
<210>333
<211>63
<212>DNA
<213>间日疟原虫
<400>333
aattgacaga gcagccggac aaccagcagg cgatcgagca gacggacagc ccgcagggga    60
gct                                                                  63
<210>334
<211>55
<212>DNA
<213>间日疟原虫
<400>334
cccctgcggg ctgtccgtct gctcgatcgc ctgctggttg tccggctgct ctgtc         55
<210>335
<211>21
<212>PRT
<213>间日疟原虫
<400>335
Ile Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp
1               5                   10                  15
Gln Pro Gly Glu Leu
            20
<210>336
<211>63
<212>DNA
<213>间日疟原虫
<400>336
aattgcgaac ggcgccggta atcagccggg ggcaaacggc gcgggtgatc aaccagggga    60
gct                                                                  63
<210>337
<211>55
<212>DNA
<213>间日疟原虫
<400>337
cccctggttg atcacccgcg ccgtttgccc ccggctgatt accggcgccg ttcgc         55
<210>338
<211>21
<212>PRT
<213>间日疟原虫
<400>338
Ile Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp
1               5                   10                  15
Gln Pro Gly Glu Leu
            20
<210>339
<211>63
<212>DNA
<213>间日疟原虫
<400>339
aattgcgaac ggcgccgata atcagccggg tgcaaacggg gcggatgacc aaccaggcga    60
gct                                                                  63
<210>340
<211>55
<212>DNA
<213>间日疟原虫
<400>340
cgcctggttg gtcatccgcc ccgtttgcac ccggctgatt atcggcgccg ttcgc         55
<210>341
<211>39
<212>PRT
<213>间日疟原虫
<400>341
Ile Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp
1               5                   10                  15
Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala
            20                  25                  30
Asp Asp Gln Pro Gly Glu Leu
        35
<210>342
<211>117
<212>DNA
<213>间日疟原虫
<400>342
aattgcgaac ggcgccggta atcagccggg agcaaacggc gcgggggatc aaccaggcgc    60
caatggtgca gacaaccagc ctggggcgaa tggagccgat gaccaacccg gcgagct       117
<210>343
<211>109
<212>DNA
<213>间日疟原虫
<400>343
cgccgggttg gtcatcggct ccattcgccc caggctggtt gtctgcacca ttggcgcctg    60
gttgatcccc cgcgccgttt gctcccggct gat taccggc gccgttcgc               109
<210>344
<211>25
<212>PRT
<213>间日疟原虫
<400>344
Ile Ala Pro Gly Ala Asn Gln Glu Gly Gly Ala Ala Ala Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Asn Gln Glu Gly Gly Ala Ala Glu Leu
            20                  25
<210>345
<211>75
<212>DNA
<213>间日疟原虫
<400>345
aattgcgccg ggcgccaacc aggaaggtgg ggctgcagcg ccaggagcca atcaagaagg    60
cggtgcagcg gagct                                                     75
<210>346
<211>67
<212>DNA
<213>间日疟原虫
<400>346
ccgctgcacc gccttcttga ttggctcctg gcgctgcagc cccaccttcc tggttggcgc    60
ccggcgc                                                              67
<210>347
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>347
Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu
            20                  25
<210>348
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>348
aattagcctg ttaaccgaag tggagacgcc gatccgtaac gaatggggct gccgctgtaa    60
tgattcttcc gacgagct                                                  78
<210>349
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>349
cgtcggaaga atcattacag cggcagcccc attcgttacg gatcggcgtc tccacttcgg    60
ttaacaggct                                                           70
<210>350
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>350
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu
            20                  25
<210>351
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>351
catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt gcagatgtaa    60
cgattcaagt gatgagct                                                78
<210>352
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>352
catcacttga atcgttacat ctgcaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg  60
tcagcagaga                                                         70
<210>353
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>353
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu
            20                  25
<210>354
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>354
catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt ctagatgtaa  60
cgattcaagt gatgagct                                                78
<210>355
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>355
catcacttga atcgttacat ctagaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg    60
tcagcagaga                                                           70
<210>356
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>356
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu
            20                  25
<210>357
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>357
catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt gcagatcgaa    60
cgattcaagt gatgagct                                                  78
<210>358
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>358
catcacttga atcgttcgat ctgcaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg   60
tcagcagaga                                                          70
<210>359
<211>26
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>359
Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu
            20                  25
<210>360
<211>78
<212>DNA
<213>甲型流感病毒
<400>360
aatttctctg ttaaccgaag tggagacgcc gattcgtaac gaatggggta gccgctctaa   60
tgatagctct gacgagct                                                 78
<210>361
<211>70
<212>DNA
<213>甲型流感病毒
<400>361
cgtcagagct atcattagag cggctacccc attcgttacg aatcggcgtc tccacttcgg   60
ttaacagaga                                                         70
<210>362
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>362
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu
            20                  25
<210>363
<211>78
<212>DNA    
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>363
catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt ctagatcgaa  60
cgattcaagt gatgagct                                                78
<210>364
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>364
catcacttga atcgttcgat ctagaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg  60
tcagcagaga                                                         70
<210>365
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>365
gcgggatccg gagcttatcg a                                            21
<210>366
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制位点的扩增引物
<400>366
Gly Cys Gly Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Cys Thr Thr
1               5                  10                  15
Gly Ala Ala Thr Cys Gly Thr Thr
            20
<210>367
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制位点的扩增引物
<400>367
gcgctcgaga gcttattgac cgaagttgaa acc                               33
<210>368
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制位点的扩增引物
<400>368
gcgctgcaga tcacttgaat cgtt                                         24
<210>369
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制位点的扩增引物
<400>369
gcgctgcagt ctctgctgac cgaag                                        25
<210>370
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>370
cgcgacatgt ctctgctgac cg                                           22
<210>371
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>371
cgcaagctta aacaacagta gtctccggaa g                                 31
<210>372
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>372
gcgaagctta ctaaggggag cggcctcgtc gacgaacaac agtagtctcc gg          52
<210>373
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>373
gcgaagctta ctaacaaggg gagcggcctc gtcgacgaac aacagtagtc tccgg       55
<210>374
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>374
gcgaagctta ctaaggcgag ggagtgcgcc gacgagggga gcggcctcg              49
<210>375
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>375
gcgaagctta ctaacaaggc gagggagtgc gccgacgagg ggagcggcct cg          52
<210>376
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>376
gcgaagctta ctacggcgat tgagagcgtc gacggcgagg cgagggagt              49
<210>377
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>377
gcgaagctta ctaacacggc gattgagagc gtcgacggcg aggcgaggga gt            52
<210>378
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>378
gcgaagctta ctaacattga gattcccgag attgagatcg ccggcgacgc ggcgattgag    60
agcgtc                                                               66
<210>379
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>379
gcgaagctta ctattgagat tcccgagatt ga                                  32
<210>380
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>380
ggaaagctta ctaacattga gattcccg    28
<210>381
<211>35
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>381
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu
            20                  25                  30
Ser Gln Cys
        35
<210>382
<211>34
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>382
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu
            20                  25                  30
Ser Gln
<210>383
<211>24
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>383
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Cys
            20
<210>384
<211>23
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>384
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro
            20
<210>385
<211>16
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>385
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Cys
1               5                   10                  15
<210>386
<211>15
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>386
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
1               5                   10                  15
<210>387
<211>9
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>387
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Cys
1               5
<210>388
<211>8
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>388
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro
1               5
<210>389
<211>203
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>389
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr
            20                  25                  30
Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg
        35                  40                  45
Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser
    50                  55                  60
Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu
65                  70                  75                  80
Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn
            100                 105                 110
Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu
        115                 120                 125
Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val
    130                 135                 140
Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
145                 150                 155                 160
Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro
                165                 170                 175
Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
        195                 200
<210>390
<211>176
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>流感-乙型肝炎嵌合体
<400>390
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile
65                  70                  75                  80
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
                85                  90                  95
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val
            100                 105                 110
Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu
        115                 120                 125
Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu
    130                 135                 140
Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg
145                 150                 155                 160
Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
                165                 170                 175
<210>391
<211>177
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>流感-乙型肝炎突变嵌合体
<400>391
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile
65                  70                  75                  80
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val
           100                 105                 110
Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu
        115                 120                 125
Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu
    130                 135                 140
Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg
145                 150                 155                 160
Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
                165                 170                 175
Cys
<210>392
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>392
Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
1               5                   10                  15
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu
            20                  25                  30
Trp Gly Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu
        35                  40                  45
Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu
    50                  55                  60
Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu
65                  70                  75                  80
His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp
                85                  90                  95
Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp
            100                 105                 110
Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly
        115                 120                 125
Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe
    130                 135                 140
Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr
                165                 170                 175
Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
            180
<210>393
<211>184
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>393
Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
1               5                   10                  15
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu
            20                  25                  30
Trp Gly Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu
        35                  40                  45
Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu
    50                  55                  60
Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu
65                  70                  75                  80
His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp
                85                  90                  95
Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp
            100                 105                 110
Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly
        115                 120                 125
Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe
    130                 135                 140
Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr
                165                 170                 175
Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Cys
            180
<210>394
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>394
Met Gly Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu
1               5                   10                  15
Phe Gly
<210>395
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>395
ggcgccatgg ggtctagatg taacgattca agtgacatcg acccttataa agaatttcg    59
<210>396
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>396
Met Gly Cys Asn Asp Ser Ser Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly
1               5                   10                  15
<210>397
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>397
gcgccatggg gtgtaacgat tcaagtgaca tcgaccctta taaagaattt gg    52
<210>398
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Hbc前核心可选接头
<400>398
Glu Leu Leu Gly Trp Leu Trp Gly Ile Asp Ile
1               5                   10
<210>399
<211>14
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>399
Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile Asp
1               5                   10
<210>400
<211>38
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>400
Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
1               5                   10                  15
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu
            20                  25                  30
Trp Gly Ile Asp Ile Asp
        35
<210>401
<211>24
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>401
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>402
<211>27
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>402
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp
            20                  25
<210>403
<211>27
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>403
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp
            20                  25
<210>404
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>乙型肝炎病毒与甲型流感病毒的嵌合体
<400>404
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp
            20                  25
<210>405
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>乙型肝炎与甲型流感病毒的嵌合体
<400>405
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp
            20                  25
<210>406
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>乙型肝炎与甲型流感病毒的嵌合体
<400>406
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Leu Glu Ser Leu Leu Thr Glu Val
            20                  25                  30
Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser
        35                  40                  45
Asp Glu Leu Asp
    50
<210>407
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>乙型肝炎与甲型流感病毒的嵌合体
<400>407
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Leu Glu Ser Leu Leu Thr Glu Val
            20                  25                  30
Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser
        35                  40                  45
Asp Glu Leu Asp
    50
<210>408
<211>77
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>乙型肝炎与甲型流感病毒的嵌合体
<400>408
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Leu Gln Ser Leu Leu Thr Glu Val
            20                  25                  30
Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser
        35                  40                  45
Asp Leu Glu Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
    50                  55                  60
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp
65                  70                  75
<210>409
<211>6
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>409
Met Leu Glu Pro Phe Gln
1               5
<210>410
<211>6
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>410
Met Leu Glu Pro Leu Gln
1               5
<210>411
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>引物蛋白序列
<400>411
Met Asp Ile Asp Pro Tyr
1               5
<210>412
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物
<400>412
Val Val Thr Thr Glu Pro Leu
1               5
<210>413
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>引物蛋白序列
<400>413
Thr Glu Arg Gly Phe Thr Leu Ser Ser Ile His Phe Trp Leu Leu
1               5                   10                  15
<210>414
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物
<400>414
Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr
1               5
<210>415
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物
<400>415
Leu Ala Thr His His Pro Ser Ser His Glu Pro Ser Glu
1               5                   10
<210>416
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质
<400>416
Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu
1               5
<210>417
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质序列
<400>417
Cys Val Val Thr Thr Glu Pro
1               5
<210>418
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质
<400>418
Arg Gly Phe Thr Leu Ser Ser Ile Cys Phe Trp Leu Leu Gln Arg
1               5                   10                  15
<210>419
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物
<400>419
Gly Met Asn Thr Asn Cys Tyr Ser Val Val Leu Asp
1               5                   10
<210>420
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物
<400>420
Glu Gly Trp Cys Leu Ile Ala Gln Arg Cys Ala Thr His His Pro
1               5                   10                  15
<210>421
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物
<400>421
Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr
1               5
<210>422
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物
<400>422
Glu Gly Trp Cys Leu Ile Cys Gln Arg Leu Ala Thr His
1               5                   10
<210>423
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物
<400>423
Leu Gly Met Asn Thr Asn
1               5
<210>424
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物
<400>424
Gly Leu Lys Phe Arg Gln Cys Leu Trp Phe His Ile Ser
1               5                   10
<210>425
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物
<400>425
Trp Thr Cys Leu Thr Met Leu Glu Gly
1               5
<210>426
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>引物蛋白序列
<400>426
Ala Thr Trp Val Gly Val
1               5
<210>427
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>引物蛋白序列
<400>427
Met Gly Leu Lys Phe Arg
1               5
<210>428
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>引物蛋白序列
<400>428
Glu Gly Cys Cys Leu Ile Ala Gln Arg Leu Ala Thr His His Pro
1               5                   10                  15
<210>429
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物序列
<400>429
Gly Leu Lys Cys Arg Gln Leu Leu Trp Phe Ser Ala Pro Asp
1               5                   10
<210>430
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物序列
<400>430
Ser Ala Pro Asp Asp Glu Cys Asn Val Gly
1               5                   10
<210>431
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物序列
<400>431
Ala Ser Cys Asp Leu Val Val Ser
1               5
<210>432
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物序列
<400>432
Ile Gly Asp Glu Leu Asn Val Gly Val
1               5
<210>433
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物序列
<400>433
Ile Gly Asp Glu Cys Asn Val Gly Val
1               5
<210>434
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物序列
<400>434
Gly Ile Gln Lys Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu
1               5                   10
<210>435
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物序列
<400>435
Gly Ile Gln Lys Glu Leu Pro Ala Ser Cys Asp Leu
1               5                   10
<210>436
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>引物蛋白序列
<400>436
Ile Leu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His
1               5                   10                  15
Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala
            20                  25                  30
Ile Ile Glu Leu
        35
<210>437
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>引物蛋白序列
<400>437
Ile Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp
1               5                   10                  15
Thr Ser Thr Asn Gly Ile Glu Leu
            20
<210>438
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物序列
<400>438
Ile Val Tyr Gln His Ser His Gly Glu Asp Arg Pro Gly Glu Leu
1               5                   10                  15
<210>439
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白质引物序列
<400>439
Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu
            20                  25
<210>440
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>440
ccatggacat cgacccttat cgcaatttgg agctactgtg gag                    43
<210>441
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>441
ctccacagta gctccaaatt cgcgataagg gtcgatgtcc atgg                   44
<210>442
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>442
cactaatatg ggcctaaggt tcaggcaact cttgtgg                           37
<210>443
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>443
ccacaagagt tgcctgaacc ttaggcccat attagtg                           37
<210>444
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>444
gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg c                      41
<210>445
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>445
gcagtatggt gaggtgaaga atgctcagga gactctaagg c                      41
<210>446
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>446
ggcaactctt gtggtttcac atttcttgtc tcattttgga agag                   44
<210>447
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>447
ctcttccaaa agtgagagaa gaaatgtgaa accacaagag ttgcc                  45
<210>448
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>448
cctgggtggg tgttaatttg aaagaagatc cagcgtctag ag 42
<210>449
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>449
ctctagacgc tggatcttct ttcaaattaa cacccaccca gg 42
<210>450
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽偶联物序列
<400>450
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>451
<211>20
<212>PRT
<213>鼠疫耶尔森氏菌
<400>451
Gly Asp Ile Pro Tyr Leu Gly Ala Leu PheArg Arg Lys Ser Glu Leu
1               5                   10                  15
Thr Arg Arg Thr
            20
<210>452
<211>24
<212>PRT
<213>流感
<400>452
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>453
<211>23
<212>PRT
<213>流感
<400>453
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>454
<211>24
<212>PRT
<213>流感
<400>454
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>455
<211>23
<212>PRT
<213>流感
<400>455
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20

Claims (80)

1.一种长度长达大约600个氨基酸残基的重组嵌合体乙型肝炎核心(HBc)蛋白分子，该分子
(a)含有一个HBc序列，该序列具有HBc分子N-末端183个氨基酸残基中的至少大约125个氨基酸残基，该序列包括从4号位到大约75号位和从大约85号位到大约140号位残基的HBc序列，其中48和107号位的两个半胱氨酸或其中之一被取代为另一种残基；
(b)任选地在该嵌合体的N-末端、大约76到大约85号位残基(在HBc免疫优势环中)之间或C-末端三处中的一处或几处含有肽键结合的异源氨基酸残基序列，其中(i)所述HBc免疫优势环中一个序列的0到所有残基均存在或被取代，并通过肽键结合了所述异源氨基酸残基序列的1到大约245个氨基酸残基，这些残基构成免疫原，或者通过肽键结合了含有多达大约40个残基的序列，这些残基则构成抗-抗原或用于偶联半抗原的化学反应性接头残基，或者(ii)76-85号位的HBc序列存在并不具有缺失和异源残基，或者(iii)76-85号位残基中的一个或多个残基缺失或被取代，
(c)含有下述两种残基或其中的一种，即(i)在一个不同于HBc前核心序列的序列中的1-3个位于嵌合体分子中一种氨基酸位置上的半胱氨酸残基，所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO：1所示HBc序列的N-末端开始的-20到大约+1号氨基酸位置[N-末端半胱氨酸残基]，和(ii)从HBc序列C-末端残基到该分子C-末端的1-3个半胱氨酸残基，且这些半胱氨酸残基在该嵌合体分子C-末端开始的大约30个残基内[C-末端半胱氨酸残基]；
该嵌合体分子(i)在HBc序列中含有多达大约20％被取代的氨基酸残基，(ii)可自组装成颗粒，该颗粒在表达后基本上不结合核酸。
2.权利要求1的重组嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子，其中N-末端序列包括含有多达大约75个氨基酸残基的异源序列，这些残基通过肽键结合了2-4号位HBc残基中的一个，该异源序列包括免疫原性表位。
3.权利要求1的重组嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子，其中从大约76到大约85号位的HBc序列存在，并且不具有缺失和异源残基。
4.权利要求1的重组嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子，其中在76-85号位的HBc序列中的0到全部残基均存在，并通过肽键结合了1到大约245个异源于HBc并构成异源表位的氨基酸残基。
5.权利要求1的重组嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子，其中76-85号位的一个或多个残基不存在或被取代。
6.权利要求1的重组嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子，其中C-末端序列含有多达大约100个氨基酸残基，这些残基包括存在于与HBc异源的序列中并键合了所述HBc序列C-末端残基的免疫原性表位。
7.权利要求1的重组嵌合体乙型肝炎核心(HBc)蛋白分子，其中位于76和82号位的HBc残基均被取代为半胱氨酸残基。
8.权利要求1的重组嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子，该分子含有一个HBc序列，该序列具有HBc分子N-末端163个氨基酸残基中的至少大约125个氨基酸残基。
9.权利要求1的重组嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子，该分子具有长达大约380个氨基酸残基的长度。
10.权利要求1的重组嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子，该分子含有HBc N-末端163个氨基酸残基中的至少大约135个氨基酸残基。
11.一种长度长达大约380个氨基酸残基的重组嵌合体乙型肝炎核心(HBc)蛋白分子，该分子
(a)含有一个HBc序列，该序列具有HBc分子N-末端163个氨基酸残基中的至少大约125个氨基酸残基，该序列包括从4号位到大约75号位和从大约85号位到大约140号位残基的HBc序列，其中48和107号位的两个半胱氨酸或其中之一被取代为另一种残基；
(b)任选地包括下述两种情况或其中之一：(i)在该嵌合体的N-末端、HBc免疫优势环和C-末端三处中的一处或几处具有肽键结合的异源序列，该序列含有多达大约75个残基，其中C-末端序列不同于从163号位到天然HBc C-末端的HBc序列，(ii)从大约76到大约85号位的序列中的0到全部残基均存在或被取代，并通过肽键与上述含有多达大约75个构成免疫原的氨基酸残基的异源序列结合，或者通过肽键与含有1到大约40个氨基酸残基的序列结合，这些残基构成抗-抗原或用于偶联半抗原的化学反应性接头残基，或者从大约76到大约85号位的HBc序列存在并不具有缺失和异源残基，或者从大约76到大约85号位的一个或多个残基不存在或被取代；
(c)含有1-3个半胱氨酸残基，存在于(i)一个不同于HBc前核心序列的序列中，位于该嵌合体分子的一种氨基酸位置上，该位置对应于SEQ ID NO：1所示HBc序列N-末端开始的-20到大约+1号氨基酸位置[N-末端半胱氨酸残基]，或者位于(ii)从HBc序列C-末端残基到所述分子C-末端，并且在从该嵌合体分子C-末端开始的大约30个残基内[C-末端半胱氨酸残基]，或者同时位于(i)和(ii)两处位置上；
(d)在HBc序列中含有多达大约20％被取代的氨基酸残基，和
(e)表达后自组装成颗粒，在收集、纯化和溶解后，表现的280nm与260nm波长的吸光度比例为0.9到大约1.7。
12.权利要求11的重组嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子，含有1-3个C-末端半胱氨酸残基。
13.权利要求11的重组嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子，含有HBc N-末端163个氨基酸残基中的至少大约135个氨基酸残基。
14.权利要求13的重组嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子，含有一个HBc序列，该序列具有HBc分子N-末端156个氨基酸残基中的至少大约135个氨基酸残基。
15.权利要求11的重组嵌合体乙型肝炎核心(HBc)蛋白分子，其中位于76和82号位的HBc残基均被取代为半胱氨酸残基。
16.权利要求11的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中所述含有多达大约75个残基的肽键结合序列是存在的。
17.权利要求16的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中所述含有多达大约75个残基的肽键结合序列键合在该嵌合体的N-末端。
18.权利要求16的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中所述含有多达大约75个残基的肽键结合序列键合在该嵌合体的HBc免疫优势环中。
19.权利要求16的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中所述含有多达大约75个残基的肽键结合序列键合在该嵌合体的C-末端。
20.权利要求16的重组HBc嵌合体蛋白分子，该分子具有第二个含有多达大约75个残基，并通过肽键结合在该嵌合体的N-末端、HBc免疫优势环或C-末端的序列，其键合位置不同于第一个所指的含有多达大约75个残基的序列的键合位置。
21.权利要求20的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中所述第一个所指的含有多达大约75个残基的序列含有B细胞表位。
22.权利要求21的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中所述第二个所指的含有多达大约75个残基的序列含有T细胞表位。
23.权利要求11的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中位于48和107号位的两个半胱氨酸残基均被取代为另一种残基。
24.权利要求23的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中取代各半胱氨酸的取代残基选自谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸和赖氨酸。
25.一种重组乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白嵌合体分子，具有大约135到大约365个氨基酸残基的长度，并且从N-末端开始含有4个肽键连接的氨基酸残基序列结构域，这4个结构域被命名为结构域I、II、III和IV，其中
结构域I包括大约72到大约150个氨基酸残基，其序列包括：
(i)至少由HBc 4-75号位的残基构成的序列，
(ii)48号位的半胱氨酸残基被取代为另一种残基，
(iii)在一个不同于HBc前核心序列的序列中含有0-3个位于该嵌合体分子的一种氨基酸位置上的半胱氨酸残基，该位置对应从SEQ IDNO：1所示HBc序列N-末端开始的-20到大约+1号氨基酸位置[N-末端半胱氨酸残基]，和
(iv)一个任选的免疫原性表位序列，含有多达大约75个氨基酸残基，这些残基通过肽键结合了HBc 2-4号位中的一个残基；
结构域II含有多这大约85个氨基酸残基，这些残基通过肽键结合了结构域I中75号位的HBc残基，其中
(i)76-85号位的HBc序列中的0到全部残基均存在或被取代，并通过肽键结合了1到大约75个异源于HBc环并构成免疫原的氨基酸残基，或者通过肽键结合了含有1到大约40个氨基酸残基的序列，这些残基构成抗-抗原或用于偶联半抗原的化学反应性接头残基，或者
(ii)76-85号位的HBc序列存在并不具有缺失或添加的异源残基；
结构域III包括从86到135号位的HBc序列，该序列通过肽键结合了结构域II中的85号位残基，其中107号位的半胱氨酸被取代为另一种残基；
结构域IV包括：
(i)从136到大约165号位的HBc氨基酸残基序列中的5到大约30个残基，这些残基通过肽键结合了结构域III的135号位残基，
(ii)从该嵌合体分子C-末端开始的大约30个残基内的0-3个半胱氨酸残基[C-末端半胱氨酸残基]，
(iii)一个序列中的0到大约75个氨基酸残基，该序列与存在于从165号位到C-末端的HBc中的序列不同，并且
从HBc 150号位到该嵌合体分子C-末端的嵌合体分子序列含有少于大约10个的精氨酸、赖氨酸残基或这两种残基的混合；
所述嵌合体分子(i)在该嵌合体的HBc序列中具有一个氨基酸残基序列，其中多达大约10％的氨基酸残基被取代，(ii)具有至少一个半胱氨酸残基是选自上述结构域I和IV中的0-3个半胱氨酸残基，并(iii)在被宿主细胞表达时自组装成颗粒，其中所形成的颗粒基本上不能结合核酸，并且在pH6.8的20mM磷酸钠缓冲液中，37℃保存一个月时间后，比由除了在48和107号位均含有半胱氨酸残基之外，其它均相同的HBc嵌合体分子形成的颗粒更稳定。
26.权利要求25的重组嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子，该分子含有1-3个C-末端半胱氨酸残基。
27.权利要求25的重组嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子，该分子含有HBc N-末端156个氨基酸残基中的至少大约135个氨基酸残基。
28.权利要求27的重组嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子，该分子含有一个HBc序列，该序列具有HBc分子N-末端149个氨基酸残基中的至少大约135个氨基酸残基。
29.权利要求25的重组嵌合体乙型肝炎核心蛋白分子，其中76和82号位的HBc残基均被取代为半胱氨酸残基。
30.权利要求25的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中含有多达大约75个残基的肽键结合序列是存在的。
31.权利要求30的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中所述含有多达大约75个残基的肽键结合序列键合在该嵌合体的N-末端。
32.权利要求30的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中所述含有多达大约75个残基的肽键结合序列键合在该嵌合体的HBc免疫优势环中。
33.权利要求30的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中所述含有多达大约75个残基的肽键结合序列键合在该嵌合体的C-末端。
34.权利要求30的重组HBc嵌合体蛋白分子，该分子具有第二个含有多达大约75个残基，并通过肽键结合在该嵌合体的N-末端、HBc免疫优势环或C-末端的序列，其键合位置不同于第一个所指的含有多达大约75个残基的序列的键合位置。
35.权利要求34的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中所述第一个所指的含有多达大约75个残基的序列含有B细胞表位。
36.权利要求35的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中所述B细胞表位通过肽键结合在位于76和85号位氨基酸残基之间的HBc序列中的一个位置上，且76-85号位的HBc序列中的至少5个残基是存在的。
37.权利要求36的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中76和85号位氨基酸残基之间的HBc序列存在，但被所述B细胞表位间断。
38.权利要求35的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中所述第二个所指的含有多达大约75个残基的序列含有T细胞表位。
39.权利要求38的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中所述T细胞免疫原性表位通过肽键结合了C-末端HBc氨基酸残基。
40.权利要求39的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中至少一个所述C-末端半胱氨酸残基是存在的。
41.权利要求25的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中该嵌合体含有从4号位到至少140号位的不间断HBc氨基酸残基序列，外加位于HBc嵌合体蛋白分子C-末端的半胱氨酸残基。
42.权利要求41的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中该嵌合体含有从4号位到149号位的不间断HBc氨基酸残基序列。
43.权利要求25的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中该嵌合体含有用于偶联表位的异源接头残基，该偶联表位存在于HBc免疫优势环中。
44.权利要求43的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中所述用于偶联表位的异源接头残基通过肽键结合在位于76和85号位氨基酸残基之间的HBc序列中的一个位置上，且76-85号位的HBc序列中的至少4个残基是存在的。
45.权利要求44的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中位于76和85号位氨基酸残基之间的HBc序列存在，但被所述用于偶联表位的异源接头残基间断。
46.权利要求25的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中取代48和107号位各半胱氨酸的残基分别选自谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸和赖氨酸。
47.包括免疫原性有效量的溶解或分散在药学可接受稀释剂中的免疫原性颗粒的接种物，其中所述免疫原性颗粒包括多个重组嵌合体乙型肝炎核心(HBc)蛋白分子，其中所述重组嵌合体HBc蛋白分子的长度长达大约600个氨基酸残基，所述重组嵌合体HBc蛋白分子
(a)含有一个HBc序列，该序列具有HBc分子N-末端183个氨基酸残基中的至少大约125个氨基酸残基，该序列包括从4号位到大约75号位和从大约85号位到大约140号位残基的HBc序列，其中48和107号位的两个半胱氨酸或其中之一被取代为另一种残基；
(b)在该嵌合体的N-末端、在HBc免疫优势环中大约76到大约85号位残基之间或C-末端三处中的一处或几处含有肽键结合的异源氨基酸残基序列，其中
(i)所述HBc免疫优势环中一个序列的0到所有残基均存在或被取代，并且所述异源氨基酸残基序列包括
构成免疫原的1到大约245个氨基酸残基，
或构成抗-抗原的1到大约40个残基的序列
或用于偶联半抗原的化学反应性接头残基；或者
(ii)76-85号位残基中的一个或多个残基缺失或被取代，
(c)含有下述两种残基或其中的一种，即
(i)在一个不同于HBc前核心序列的序列中的1-3个位于嵌合体分子中一种氨基酸位置上的半胱氨酸残基，所述氨基酸位置对应于SEQID NO：1所示HBc序列的N-末端开始的-20到大约+1号氨基酸位置[N-末端半胱氨酸残基]，和
(ii)从HBc序列C-末端残基到该分子C-末端的1-3个半胱氨酸残基，且这些半胱氨酸残基在该嵌合体分子C-末端开始的大约30个残基内[C-末端半胱氨酸残基]；
该嵌合体分子
(i)与SEQ ID NO：1-6的1-149号位的序列相比，在HBc序列中含有多达大约5％被保守取代的氨基酸残基，并且
(ii)可自组装成颗粒，该颗粒在表达后，280nm与260nm波长的吸光度比例为大约0.9到大约1.7，用50mM NaPO4，pH6.8以1mg/mL保存时比缺乏所述C-末端或N-末端半胱氨酸残基或嵌合分子中的C-末端或N-末端半胱氨酸残基被另一种残基取代，而其它方面相同的HBc嵌合体形成的颗粒更稳定。
48.权利要求47的接种物，其中所述重组嵌合体HBc蛋白分子的N-末端序列包括含有多达大约75个氨基酸残基的异源序列，这些残基通过肽键结合了2-4号位HBc残基中的一个，该异源序列包括免疫原性表位。
49.权利要求47的接种物，其中所述重组嵌合体HBc蛋白分子在76-85号位的HBc序列中含有0到全部残基，并通过肽键结合了1到大约245个异源于HBc并构成异源表位的氨基酸残基。
50.权利要求47的接种物，其中所述重组嵌合体HBc蛋白分子76-85号位的一个或多个残基缺失或被取代。
51.权利要求47的接种物，其中所述重组嵌合体HBc蛋白分子C-末端序列含有多达大约100个氨基酸残基，这些残基包括存在于与HBc异源的序列中并键合了所述HBc序列C-末端残基的免疫原性表位。
52.权利要求47的接种物，所述重组嵌合体HBc蛋白分子含有一个HBc序列，该序列具有HBc分子N-末端163个氨基酸残基中的至少大约125个氨基酸残基的HBc序列。
53.权利要求47的接种物，所述重组嵌合体HBc蛋白分子具有长达大约380个氨基酸残基的长度。
54.包括免疫原性有效量的溶解或分散在药学可接受稀释剂中的免疫原性颗粒的接种物，其中所述免疫原性颗粒包括多个重组嵌合体乙型肝炎核心(HBc)蛋白分子，其中所述重组嵌合体HBc蛋白分子的长度长达大约380个氨基酸残基，所述重组嵌合体HBc蛋白分子(a)含有一个HBc序列，该序列具有HBc分子N-末端163个氨基酸残基中的至少大约125个氨基酸残基，该序列包括从4号位到大约75号位和从大约85号位到大约140号位残基的HBc序列，其中48和107号位的两个半胱氨酸或其中之一被取代为另一种残基；
(b)任选地包括下述两种情况或其中之一：
(i)在该嵌合体的N-末端、HBc免疫优势环和C-末端三处中的一处或几处具有通过肽键结合的异源序列，该序列含有多达大约75个残基，
(ii)从大约76到大约85号位的序列中的0到全部残基均存在或被取代，其中
(iia)所述多达大约75个氨基酸残基的异源序列通过肽键与大约76到大约85号位之间的序列结合，或
(iib)构成抗-抗原的含有1到大约40个氨基酸残基的序列通过肽键与大约76到大约85号位之间的序列结合，或
(iic)用于偶联半抗原的化学反应性接头残基通过肽键与大约76到大约85位之间的序列结合，或
(iid)从大约76到大约85号位的一个或多个残基缺失或被取代；
(c)含有1-3个半胱氨酸残基，存在于
(i)一个不同于HBc前核心序列的序列中，位于该嵌合体分子的一种氨基酸位置上，该位置对应于SEQ ID NO：1所示HBc序列N-末端开始的-20到大约+1号氨基酸位置[N-末端半胱氨酸残基]，或者位于
(ii)从HBc序列C-末端残基到所述分子C-末端，并且在从该嵌合体分子C-末端开始的大约30个残基内[C-末端半胱氨酸残基]，
或者同时位于(i)和(ii)两处位置上；
(d)与SEQ ID NO：1-6的1-149号位的序列相比，在HBc序列中含有多达大约5％被保守取代的氨基酸残基，并且
(e)可自组装成颗粒，该颗粒在表达后，280nm与260nm波长的吸光度比例为大约0.9到大约1.7，用50mM NaPO4，pH6.8以1mg/mL保存时比缺乏所述C-末端或N-末端半胱氨酸残基或嵌合分子中的C-末端或N-末端半胱氨酸残基被另一种残基取代，而其它方面相同的HBc嵌合体形成的颗粒更稳定。55.权利要求54的接种物，其中所述重组嵌合体HBc蛋白分子含有HBc分子N-末端163个氨基酸残基中的至少大约135个氨基酸残基。
56.权利要求54的接种物，其中所述重组嵌合体HBc蛋白分子含有HBc分子N-末端156个氨基酸残基中的至少大约135个氨基酸残基。
57.权利要求54的接种物，其中含有多达大约75个残基的肽键结合序列是存在的。
58.权利要求57的接种物，其中所述含有多达大约75个残基的肽键结合序列键合在该嵌合体的N-末端。
59.权利要求57的接种物，其中所述含有多达大约75个残基的肽键结合序列键合在该嵌合体的HBc免疫优势环中。
60.权利要求57的接种物，其中所述含有多达大约75个残基的肽键结合序列键合在该嵌合体的C-末端。
61.权利要求57的接种物，包含第二个含有多达大约75个残基，并通过肽键结合在该嵌合体的N-末端、HBc免疫优势环或C-末端的序列，其键合位置不同于第一个所指的含有多达大约75个残基的序列的键合位置。
62.权利要求61的接种物，其中所述第一个所指的含有多达大约75个残基的序列含有B细胞表位。
63.权利要求61的接种物，其中所述第一个所指的含有多达大约75个残基的序列含有T细胞表位。
64.权利要求62的接种物，其中所述B细胞表位通过肽键结合在位于76和85号位氨基酸残基之间的HBc序列中的一个位置上，且76-85号位的HBc序列中的至少5个残基是存在的。
65.权利要求64的接种物，其中76和85号位氨基酸残基之间的HBc序列存在，但被所述B细胞表位间断。
66.权利要求62的接种物，其中所述第二个所指的含有多达大约75个残基的序列含有T细胞表位，所述T细胞表位通过肽键与C-末端HBc氨基酸残基结合。
67.权利要求57的接种物，其中第48和107位的半胱氨酸残基均被另一种残基取代。
68.权利要求57的接种物，其适于肠胃外施用。
69.权利要求57的接种物，其适于粘膜施用。
70.权利要求57的接种物，其中所述重组嵌合体HBc蛋白分子颗粒存在于伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂合体的减毒的菌株中。
71.权利要求57的接种物，其中所述重组嵌合体HBc蛋白分子颗粒存在于植物组织中。
72.权利要求57的接种物，其进一步包含佐剂。
73.权利要求72的接种物，其中所述佐剂是明矾。
74.权利要求72的接种物，其中所述佐剂是选自胞壁酰二肽、7-取代-8-氧-或8-硫-鸟苷衍生物、单磷酰脂质A、铝或钙盐的小分子。
75.权利要求72的接种物，其中所述佐剂是用所述免疫原性颗粒和所述药学可接受稀释剂乳化的。
76.权利要求75的接种物，其中所述乳剂是具有水相和油相的油包水乳剂。
77.权利要求75的接种物，其中所述乳剂是具有水相和油相的水包油乳剂。
78.权利要求77的接种物，其中所述乳剂的油相包括角鲨烯或角鲨烷。
79.权利要求75的接种物，其中所述乳剂的水相和油相是用乳化剂乳化的，所述乳化剂是山梨聚糖或二缩甘露醇C12-C24脂肪酸酯。
80.权利要求79的接种物，其中所述乳化剂是二缩甘露醇C12-C24脂肪酸酯。
81.权利要求80的接种物，其中所述二缩甘露醇C12-C24脂肪酸酯的所述C12-C24脂肪酸是油酸。
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