CN1913920B - 流感免疫原和疫苗 - Google Patents

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Abstract

公开了嵌合的、羧基末端截短的乙型肝炎核壳(HBc)蛋白，其含有用于诱导流感M2蛋白的抗体生成的免疫原。2-4个拷贝的免疫原性流感序列优选在N-末端上或N-末端附近，或在HBc免疫原性环序列中表达。HBc嵌合体优选含有流感特异性T细胞表位，并且优选经过工程化以便增强自组装颗粒的稳定性并且增强所述嵌合颗粒的产率。也公开了制备和使用所述嵌合体的方法。

Description

流感免疫原和疫苗
对相关申请的相互参考
本申请是2003年12月10日提交的申请序号10/732,862的部分继续申请，10/732,862要求2003年2月21日提交的PCT/US03/05196的优先权，PCT/US03/05196要求2002年10月21日提交的申请序号10/274,616的优先权，10/274,616是2002年2月21日提交的申请序号10/082,014的部分继续申请和2002年2月21日提交的申请序号10/080,299的部分继续申请，10/082,014和10/080,299都是2001年8月15日提交的申请序号09/930,915的部分继续申请。
技术领域
本发明涉及免疫学和蛋白质工程领域的交叉部分，并且特别涉及用于预防甲型流感病毒导致的流感感染的免疫原和疫苗。
发明背景
嗜肝DNA病毒科是具有包膜的、含有DNA的动物病毒，它能导致人的乙型肝炎(HBV)。嗜肝DNA病毒科包括其他动物的乙型肝炎病毒，例如土拨鼠(WHV)和地松鼠(GSHV)和存在于鸭(DHV)和灰苍鹭(HeHV)中的禽类病毒。本文所说的乙型肝炎病毒(HBV)表示与感染禽类宿主的病毒相比，感染哺乳动物的嗜肝DNA病毒科的成员，除非有关讨论涉及非哺乳动物病毒的特定的例子。
根据病毒的亚型，哺乳动物乙型肝炎病毒(HBV或嗜肝DNA病毒)的核壳或核心含有具有183或185个氨基酸残基的序列，而鸭病毒衣壳含有262个氨基酸残基。若干种嗜肝DNA病毒科的乙型肝炎核心蛋白单体，能在受感染的细胞中自我组装成被称为乙型肝炎核心蛋白颗粒(HBc颗粒)的稳定聚集体。业已报导了C末端截短的HBc颗粒的两种三维结构。第一种结构包括具有作为二聚体的90个拷贝的HBc亚基蛋白或180个独立的单体蛋白的次要群体，而第二种结构包括具有作为二聚体的120个拷贝的HBc亚基蛋白或240个独立的单体蛋白的主要群体.以上颗粒分别被称为T＝4或T＝3颗粒，其中，“T”是三角形的数量。所述感染人的病毒(人病毒)的HBc颗粒的直径分别为大约10或34纳米。Pumpens et al.(1995)Intervirology，38：63-74；和Metzger et al.(1998)J.Gen.Viol.，79：587-590。
Conway et al.，(1997)Nature，386：91-94披露了在9埃分辩率时由冷冻电子显微镜照片确定的人HBc颗粒的结构。Bottcher et al(1997)，Nature，386：88-91披露了人HBc单体的多肽折叠，并且提供了对形成α螺旋区及其连接环区的氨基酸残基进行大致计数的方法。Zheng et al.(1992)，J.Biol.Chem.，267(13)：9422-9429根据他们进行的缺乏一个或多个半胱氨酸的突变型蛋白的研究和其他人用C-末端截短的蛋白进行的研究[Birnbaum et al.，(1990)J.Virol.64，3319-3330]，报导了核心颗粒形成不取决于富含精氨酸的C-末端结构域、核酸的结合或二硫键的形成．Wynne at al.，(1999)Mol.Cell，3(6)：70-80报道的T＝4颗粒的3.3分辨率晶体结构证实了Conway et al.，(1997)和Bottcher et al.，(1997)报道的HBc颗粒的低分辨率结构。
业已披露了乙型肝炎核壳或病毒核心蛋白(HBc)是一种免疫原性裁体部分，它能刺激免疫的宿主动物的T细胞应答。例如，参见美国专利No.4,818,527，4,882,145和No.5,143,726。这种裁体的一种特别有用的用途是它在从该蛋白的氨基末端(N-末端)开始计算的大约70-90号残基位置上的免疫优势环呈递外源或异源B细胞表位的能力，更常见的是大约75-85号位置。Clarke et al.(1991)F.Brown et al.eds.，Vaccines 91，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.313-318。
在病毒复制期间，HBV核壳与病毒RNA前基因组、病毒逆转录酶(Pol)、和末端蛋白(源于Pol)缔舍，形成能复制的核心。核壳和病毒RNA前基因组的缔合是由羧基末端(C-末端)的富含精氨酸的结构域介导的。当在缺乏病毒RNA前基因组的大肠杆菌等异源表达系统中表达时，鱼精蛋白样C-末端，即150-183号位置上的残基能够与大肠杆菌RNA结合。Zhang et al.(1992)JBC，267(13)9422-29。
HBcAg是源于被提议作为异源表位的载体的乙型肝炎病毒的颗粒蛋白。将HBsAg(HBs)的相对免疫原性与HBcAg(HBc)进行比较，并且比较了它们各自在不同的遗传背景中激发免疫应答的能力[Milich etal.，Science，(1986)234(4782)：p.1398-1401]。这些数据强调了HBc相对于HBs更高的免疫原性，以及不考虑遗传背景，对HBc的普遍反应性。
例如，在BALB/c小鼠中，HBc的免疫原性比HBs高300倍；并且，尽管B10.S和B10.M小鼠都对HBs无反应，测试的每株都对HBc有反应。这些结果再次强调了HBc作为疫苗载体的适用性，并且具体地，强调了其比HBs优越，因此，HBc的选择替代了HBS来携带异源表位。HBc的这些方面被认为对于流感疫苗开发是重要的，因为它们解决了涉及异源限制和抗体滴度不足的问题。
HBc载体的另一个优点是它们的效能可能不需要复杂佐剂的事实。这是由于该颗粒固有的高免疫原性。HBc-贝氏疟原虫颗粒的免疫原性比较表明，批准用于人类的明矾，比IFA或CFA都更有效[Schodelet aL，J.Exp.Med.，(1994)180(3)：p.1037-46]。最近在SKB的候选疟疾疫苗的临床试验中注意到的与更新的、更复杂的佐剂相关的毒性问题强调了这一观察结果的重要性[Stouteetal.，N.Engl.J.Med.，[1997]336(2)：p.86-91].
在作为疫苗载体部分的用途中，HBV核壳优选不与源于宿主的核酸结合.Birnbaum et al.(1990)J.Virol.，64：3319-3330证实HBV核壳的鱼精蛋白样C-末端结构域可以缺失，而又不影响该蛋白组装成病毒样颗粒的能力。因此，有人报导将蛋白截短到大约144号位置，即含有从1至大约144号位置的HBc序列可以自我组装，而缺失超过139号残基会破坏衣壳组装[F.Birnbaum & M.Nassal(1990)J.Virl.，64：3319-30].
Zlotnick et al.，(1997)Pr℃.Natl.Acad.Sci.，USA，94：9556-9561研究了全长和截短的HBc蛋白组装成颗粒的情况。除了讨论全长的分子之外，以上作者还报导了截短蛋白的制备，这种蛋白含有从1到149号位置的HBc序列，其中，48、61和107号位置上的半胱氨酸分别被丙氨酸取代，并且在C-末端(150号位置)添加了一个半胱氨酸残基。C-末端的硫醇用于连接金原子团，以便在电子显微术中进行标记。
最近，Metzger et al.(1998)J.Gen.Viol.，79：587-590报导了人病毒序列的138号位置上的脯氨酸(Pro-138或P138)是颗粒形成所必需的。以上作者还报导了在羧基末端截短为142和140个残基长度的颗粒的组装能力受到了影响，当截短到长度为139和137个残基时，组装能力完全丧失。
若干个研究小组业已证实，与标准乙型肝炎核心颗粒相比，截短的颗粒具有较低的稳定性[Galena et al.(1989)J.Virol.，63：4645-4652；Inada，et al.(1989)Virus Res.，14：27-48]，体现在颗粒大小的变化和颗粒片段在纯化制剂中的存在[Maassen et al.，(1994)Arch.Virol.，135：131-142]。因此，在上述Metzger等的报导之前，Pumpens等，1995，Intervirology，38：63-74对有关文献报导进行了综述，指明自我组装所必需的HBc序列的羧基末端边界位于139和144号氨基酸残基之间，并且前两个或三个氨基末端残基可以被其他序列所取代，但是消除4个或11个氨基末端残基会导致嵌合蛋白在转化的大肠杆菌细胞中的完全消失.
重组生产的杂合HBc颗粒具有内在插入片段(在本领域中被称为HBc嵌合颗粒或HBc嵌合体)，它含有各种插入的多肽序列，这些序列是通过在多种生物中异源表达而制备的，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、牛痘，鼠伤寒沙门氏菌，啤酒糖酵母，例如，参见Pumpens et al.(1995)Intervirology，38：63-74，以及它所引用的文献，其中提到了若干个研究小组的工作。也已经在植物中产生了天然HBc颗粒(Tsudaet al.，1998)Vox Sang，74(3)：148-155.
当通过电子显微镜分析时，与缺乏异源表位的颗粒相比，所述HBc嵌合体通常表现为具有较无序的结构[Schodel et al.，(1994)J.Exp.Med.，180：1037-1046]。在某些情况下，将异源表位插入C末端截短的HBc颗粒，所述颗粒具有显著的去稳定效果，使得杂合颗粒不能在异源表达后回收[Schodel et al.(1994)Infect.Immunol.，62：1669-1676].这样，很多嵌合HBc颗粒不稳定，使得它们在纯化时分离到它们不能回收，或它们表现出非常差的稳定性特征的程度，使得它们不能用于开发疫苗。
上述Pumpens et al.(1995)Intervirology，38：63-74的报导列举了颗粒形成嵌合体，其中，所插入的多肽序列位于N-末端、C-末端以及位于两个末端之间.在该文献中所报导的插入片段的长度为：在N-末端为24-50个残基，在内部为7-43个残基，在C-末端为11-741个残基。
Kratzetal.，(1999)Pr℃.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，96：1915-1920最近披露了嵌合HBc颗粒的大肠杆菌表达，该颗粒包括内部融合在绿色荧光蛋白(GFP)的238号残基上的截短的HBc序列。读嵌合体包括插入的GFP序列，其侧翼是一对取代了HBc的79和80号氨基酸残基的富含甘氨酸的柔性接头臂。据说这种颗粒能在作为宿主动物的兔体内有效诱导抗天然GFP的抗体。
美国专利No.5,990,085披露了由抗原性牛抑制素肽融合在(i)78和79号残基之间的免疫原性环和(ii)羧基末端截短的HBc的144号残基后面所产生的两种融合蛋白.据说所表达的融合蛋白在给宿主动物施用之后能诱导抗抑制素抗体的产生.据报导，在免疫接种30天之后在患者体内的滴度相对低，插入环中的融合蛋白的滴度为1∶3000-15000，而插在144号残基后面的滴度为1∶100-125。
美国专利No.6,231,864教导了策略上修饰的与半抗原连接的乙型肝炎核心蛋白的制备和用途.修饰的核心蛋白含有长度为1-大约40个残基的插入片段，其含有与半抗原垂直连接的化学反应性氨基酸残基。
最近公开的WO 01/27281教导了对HBc的免疫应答可以分别通过存在或不存在天然分子的含有C-末端半胱氨酸的序列，从Th1应答改变为Th2应答。该公开内容也认为，通过C-末端半胱氨酸导致的二硫化物形成，能够帮助稳定颗粒.认为紧邻C-末端半胱氨酸的上游的天然HBc序列的一些残基的存在是优选的，但不是必须的。认为可以用于替代截短的C-末端HBc序列的一种这样的替代方案包括C-末端半胱氨酸和限定来自除HBc之外的其它抗原的表位的任选序列。
公开的PCT申请WO 01/98333教导了天然HBc的C-末端上存在的四个精氨酸重复的一个或多个的缺失，而保持C-末端半胱氨酸残基。该申请也教导了可以用除HBc以外的蛋白的表位替代缺失的区域，从而如此形成的分子的HBc部分能够作为添加的表位的载体。
相应于WO 02/13765A2和WO 02/14478A2的公开的PCT申请教导了可以通过在组装成颗粒的嵌合蛋白中使用一个或多个添加的半胱氨酸残基，实现C-末端截短的HBc颗粒的稳定化.根据教导，这些添加的半胱氨酸残基位于或邻近于嵌合蛋白的C-末端。
在用嗜肝DNA病毒核壳送递系统开发疫苗时，能够保留全长HBc颗粒的稳定性，同时又消除全长HBc颗粒的核酸结合能力的结构特征将是非常有利的。实际上，Ulrich等在他们的有关用HBc嵌合体作为外源表位载体的最新的综述中[Adv.Virus Res.，vol.50(1998)AcademicPress pages141-182]指出将这种嵌合体用于人类疫苗需要解决三个潜在问题。第一个潜在问题是将嵌合疫苗中的核酸意外转移到接种的宿主中。第二个潜在的问题是现有免疫对HBc的干扰。第三个可能的问题涉及对完整嵌合体颗粒的可重复制备的需要，这种颗粒还能经受长期的保存。
上述4个公开的PCT申请似乎包含了可以用于克服Ulrich等人提出的潜在问题的教导。如下文的公开，本发明提供了另一种HBc嵌合体，该嵌合体提供了出乎意料高的抗流感抗体的滴度，并且在一方面，也提供了关于HBc嵌合体稳定性和构建体基本缺乏核酸结合能力的问题。此外，考虑的重组嵌合体表现出对预先存在的抗HBc抗体的抗原性降低.
上述颗粒不稳定性的发现与N-末端截短的HBc嵌合体分子相关，但Neirynck et al.，(1999年10月)Nature Med.，5(10)：1157-1163报道了在HBc嵌合体的大肠杆菌表达时发生了颗粒形成，读嵌合体包含流感M2蛋白(M2e)的N-末端24个残基组成的部分，包括起始的甲硫氨酸，该部分在第5号残基与全长HBc融合。
Bachmann和合作者[Jegerlehner et al.，(2002)Vaccine，20：3104-3112]比较了与上文引用的Neirynck等的文献中的构建体基本相同的融合构建体与相似于公开于U.S.No.6,231,864中的构建体的偶联的构建体，该偶联的构建体中甲型流感病毒的M2蛋白的外部23个残基(在体内除去甲硫氨酸残基后)通过接头与赖氨酸残基偶联，所述赖氨酸残基工程化到C-末端截短的HBc(1-149)中的环中，所述C-末端截短的HBc中48和107号位置的半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代。他们的结果表明，偶联的构建体与N-末端融合蛋白相比，抗M2滴度增加，并且存活率增加(6/6vs.0/3)。
前面讨论的将具有截短的C末端的杂合HBc蛋白用于疫苗，相对于它们的全长对应物，提供了一些优点，包括表达水平增强和缺乏结合的大肠杆菌RNA。但是，经过工程化以展示异源表位的C-末端截短的颗粒通常是不稳定的，得到在表达后不能缔合为稳定的颗粒状结构的颗粒，或在纯化期间和/或纯化后容易解离为非颗粒状结构的颗粒.所述稳定性的缺乏由包含C-末端截短到HBc第149位并且也含有甲型流感病毒M2蛋白的上述2-24号残基的嵌合HBc分子的颗粒所展现。
其他人报道了在野生型嗜肝DNA病毒核心抗原中，HBcAg起始密码子上游的半胱氨酸残基直接参与防止颗粒形成[Schodel et al.(Jan.15，1993)J.Biol.Chem.，268(2)：1332-1337；Wasenauer et al.(Mar.1993)J.Virol.，67(3)：1315-1322；andNassal et al.(Jul.1993)J.Virol.，67(7)：4307-4315].所有三个组都报道了在野生型HBeAg中，当从-30位的起始甲硫氨酸上游开始翻译核心基因时存在的前核心序列-7位的半胱氨酸残基负责防止颗粒形成，并因此促进从颗粒状HBcAg转变为分泌的、非颗粒状的HBeAg。
基于上述三篇公开文献，可以预见到在HBc的起始甲硫氨酸之前的位置，即，在小于相对于SEQ ID NO：1的序列的N-末端而言的位置的残基位置引入一个或多个半胱氨酸残基，实际上使C-末端截短的杂合颗粒不稳定，而不是使其稳定.如下文的讨论可见，本发明提供了与这些解释相反的结果。
发明概述
本发明涉及用于诱导针对甲型流感病毒M2蛋白(M2e)的细胞外结构域的抗体的基于嗜肝DNA病毒的免疫原，以及包含分散在生理学耐受的稀释剂中的免疫原的接种物和疫苗.下文中，名称“M2”和“M2e”可互换使用。涉及的免疫原是包含重组乙型肝炎病毒核心(HBc)嵌合蛋白分子的自组装颗粒.这些分子均具有大约150-大约375个氨基酸残基的长度，包括SEQ ID NO：9的6-大约24个残基的序列，并且包括4个肽连接的氨基酸残基序列结构域，从N-末端开始命名为结构域I、II、III和IV。
第一个结构域，即结构域I，包含大约75-大约160个氨基酸。读结构域的序列至少包括HBc的第4位到大约75位的残基的序列。在嵌合体分子中相对于SEQ ID NO：1的HBc的N-末端的大约1--55，优选1--30，更优选1--20的位置上也存在1-3个半胱氨酸残基[N-半胱氨酸残基]。N-半胱氨酸残基存在于除HBc的前核心序列的序列之外的序列中.结构域I的半胱氨酸残基也存在于SEQ ID NO：9的甲型流感M2多肽X1X2X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21-X22X23X24，如SEQ ID NO：10的优选多肽X1X2X3X4X5X6X7X8-TPIRNE-X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24的大约6-大约24个残基的2-4个序列中，所述多肽与HBc序列的N-末端的大约15个残基通过肽键连接，或通过肽键连接在HBc序列的N-末端的大约15个残基内，其带有脚标的X残基是下文所定义，以及HBc残基1-4中的一个或多个。
第二个结构域，即结构域II，包含与结构域I的大约75号残基通过肽键连接的大约0-大约60个氨基酸残基，其中(i)HBc的76-85位的序列中的0-所有10个残基通过肽键连接于(ii)构成上述SEQ IDNO：9的甲型流感M2多肽的一个或多个重复序列的大约6-大约48个残基组成的任选序列。
第三个结构域，即结构城III，是通过肽键连接于大约85号残基的大约86位到大约135位的HBc序列。
第四个结构域，即结构域IV，包含(i)通过肽键连接于结构域III的大约135位残基的大约136-140位残基加上从141-149位的HBc氨基酸残基序列的最多9个残基，(ii)0-3个半胱氨酸残基，(iii)少于4个精氨酸或赖氨酸残基，或彼此邻接的其混合物，和(iv)与HBc的164位到C-末端异源的序列，优选与HBc的156位到C-末端异源的序列中的最多约100个氨基酸残基。
涉及的嵌合体分子(i)HBc序列中包含不超过10％的保守取代的氨基酸残基，(ii)自组装为基本不与宿主细胞上表达的核酸结合的颗粒，这些颗粒比由缺乏所述N-末端半胱氨酸残基或嵌合体分子中存在的N-末端半胱氨酸被其它残基替代的其它方面相同的HBc嵌合体形成的颗粒在形成时更稳定.
结构城I的HBc序列优选包括单独的第4位-第75位的残基，至少加上N-末端半胱氨酸残基.更优选的是涉及的免疫原单独在结构域IV内，或在与HBc的164位到C-末端的序列异源的氨基酸残基序列中包含1个半胱氨酸残基。特别优选的是读异源序列包含甲型流感的T细胞表位.
另一种实施方案包括接种物或疫苗，它包括溶解或分散在可以药用的稀释组合物中的上述HBc嵌合颗粒，该组合物通常还含有水.在以免疫原性有效量给诸如哺乳动物或禽类的动物施用时，接种物诱导与嵌合颗粒特异性免疫反应的抗体。由此诱导的抗体还能够与M2蛋白的N-末端部分特异性免疫反应(与它结合)。
本发明具有若干益处和优点。
本发明的一个具体的益处是将其用作疫苗，提供了抗甲型流感的卓越的抗体滴度。
本发明的一个优点是在批准用于人类的佐剂的辅助下产生了非常高的抗体滴度。
本发明的另一个益处是采用公知的细胞培养技术生长转化的宿主细胞，可以容易并且大量制备重组免疫原。
本发明的另一个优点是用公知的重组技术很容易制备免疫原.
本发明的另一个益处是优选的免疫原与其它HBc嵌合体相比，在更高的温度下表现出更强的稳定性。
本发明的另一个优点是涉及的免疫原基本不含核酸.
通过以下说明，本领域技术人员可以了解其他益处和优点。
附图说明
在构成本说明书一部分的附图中：
图1用图1A和图1B两幅图表示来自六种病毒的哺乳动物HBc蛋白的六种公开的序列的比对.第一种(SEQ ID NO：1)人病毒序列是ayw亚型的，并且公开于Galibert et al.(1983)Nature，281：646-650中；adw亚型的第二种人病毒序列(SEQ ID NO：2)是由Ono et al.(1983)Nucleic Acids Res.，11(6)：1747-1757公开的；第三种人病毒序列(SEQID NO：3)是adw2亚型，并且由Valenzuela et al.，Animal Virus Genetics，Field et al.eds.，Academic Press，New Y或k(1980)57-70页公开的；第四种人病毒序列(SEQ ID NO：4)是adyw亚型的，它是由Pasek et al.(1979)Nature，282：575-579公开的；第五种序列(SEQID NO：5)是土拨鼠病毒序列，它是由Galibert et al.(1982)J.Virol.，41：51-65公开的；而第六种哺乳动物序列(SEQ ID NO：6)是地松鼠序列，它是由Seeger et al.(1984)J.Virol.，51：367-375公开的。
图2表示在制备在本发明中用于制备重组HBc嵌合体的质粒载体pKK223-3N时对商业化质粒载体pKK223-3进行的修饰。在可商购的载体(SEQ ID NO：8)下面示出了修饰的序列(SEQ ID NO：7)。所添加的NcoI位点的碱基用小写字母表示，而所添加的碱基通过双下划线示出，而缺失的碱基用虚线表示。示出了出现在该序列片段上的两个限制位点(NcoI和HindHI)。
图3是ICC-1603颗粒的分析大小排阻层析洗脱图谱，其中在纵坐标上示出了280nm处的吸光度，以秒表示的时间示于横坐标上。
如同对图3的讨论，图4是ICC-1590颗粒的分析大小排阻层析洗脱图谱。
如同对图3的讨论，图5是ICC-1560颗粒的分析大小排阻层析洗脱图谱。
如同对图3的讨论，图6是ICC-1605颗粒的分析大小排阻层析洗脱图谱。
如同对图3的讨论，图7是ICC-1604颗粒的分析大小排阻层析洗脱图谱。
如同对图3的讨论，图8是ICC-1438颗粒的分析大小排阻层析洗脱图谱。
如同对图3的讨论，图9是ICC-1492颗粒的分析大小排阻层析洗脱图谱。
图10是在颗粒制备之后在还原条件下进行的SDS-PAGE分析的照片，表明与ICC-1492构建体(泳道3)相比，ICC-1438单体构建体在老化后不稳定(泳道2)，其中HBc-149(泳道1)，ICC-1475(泳道4)和ICC-1473(泳道5)作为额外的分子量对照。
图11有两张图片，显示了如每个柱所示，在室温(RT；图11A)和37℃(图11B)下在采用溶于颗粒储存缓冲液20mM磷酸钠，pH7.2的0、1、2、5和10mM EDTA进行的稳定性研究后，含有三个顺序连接的M2e多肽拷贝的CV-1818颗粒的SDS-PAGE分析的照片，并且说明添加EDTA(1-10mM)时不存在切割。对照(C)是就要开始使用前从冷冻储存物中回收的相同颗粒。
图12有两张图片，显示了SDS-PAGE分析的照片，证明在室温下(RT)储存、在所示的温度下热处理图11所示的对照1.5或3小时(图12A)或储存一周后(图12B)，CV-1818颗粒的单体的蛋白水解减少。
图13有两张图片，显示了一系列叠加的SEC照片，显示了在热处理后不久(图13A)和此后在室温下维持一周后(图13B)，经过热处理(3小时)的颗粒的分析。
图14是还原SDS-PAGE凝胶的照片，表示用描述的包括热步骤(泳道1)和缺乏热步骤(泳道2)的方法纯化后的CV-1906颗粒单体。
图15是颗粒的还原SDS-PAGE凝胶分析的照片，所述颗粒含有0(1123，泳道1)、1(1604，泳道2)、2(1817，泳道3和4)和3(1818，泳道5和6)个拷贝的表达的M2e，其以串联方式融合于在149位后截短，并且在150位添加了半胱氨酸残基的HBc颗粒的N-末端。
图16是表示用一种或另一种图15所示含有Me2的HBc嵌合体或图中指出的对照免疫的小鼠在用甲型流感病毒进行致死攻击后的存活率的图片。
图17是表示图16和如图中指出的用甲型流感病毒进行攻击的小鼠的体温的图片。
图18是表示上述用甲型流感病毒攻击的小鼠的体重的图片.
定义
与HBc嵌合体一起使用的编号表示在SEQ ID NO：1的HBc ayw氨基酸残基序列中的位置，在该序列的所述位置上添加或缺失了一个或多个残基，而无论是否存在所述氨基酸残基序列的添加或缺失。因此，HBc149表明该嵌合体的末端是149号残基，而HBc149+C150表示相同的嵌合体在相对于SEQ ID NO：1的序列编号的HBc150位包含一个半胱氨酸残基。
术语“抗体”表示作为被称为免疫球蛋白的糖基化蛋白家族成员的分子，它能特异性结合于抗原。
术语“抗原”曾经被用于表示由抗体或受体结合的实体，并且还被用于表示能诱导抗体产生的实体.更近一些的用法将抗原的含义局限于由抗体或受体结合的实体，而术语“免疫原”被用于表示能诱导抗体产生或与受体结合的实体。其中，本文所讨论的实体同时具有免疫原性和抗原性，根据其预期的用途通常称之为免疫原或抗原。
“抗原决定簇”表示抗原的实际结构部分，它能与抗体结合位点或T细胞受体发生免疫结合.该术语还可以与“表位”交换使用。
本文所使用的术语“缀合物(conjugate)”表示通过氨基酸残基侧链可操作地与载体蛋白连接的半抗原。
本文所使用的术语“保守取代”表示一种氨基酸残基被另一种生物学上似的残基所取代。保守取代的例子包括用诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸的疏水性残基取代另一种疏水性残基，或者用一种极性残基取代另一种极性残基，如精氨酸和赖氨酸之间的取代，谷氨酸和天冬氨酸之间或谷氨酰胺和天冬酰胺之间的取代等。
与肽序列一起使用的各种语法形式的术语“相当”表示在所描述的肽序列的氨基末端和羧基末端中的任一个末端或两个末端上添加或减少最多达3个氨基酸残基，并且仅含有保守取代，特别是沿着多肽序列的氨基酸残基。
本文所使用的术语“结构域”表示重组HBc嵌合体分子的一部分，它是通过(i)相对Galibert et al.，(1979)Nature，281：646-650(SEQID NO：246)HBcAg亚型ayw的位置编号进行的残基位置编号而确定的。所述多肽的至少嵌合体结构域I，II和III的部分被认为以类似于天然存在的HBcAg的相应序列的三级形式存在。
在本文中，术语“融合蛋白”表示包含至少两个在正常情况下不是天然连接在一起的氨基酸残基序列的多肽，这两个序列是通过其相应的羧基末端和氨基末端氨基酸残基之间的肽键末端-末端(头-尾)地操作性连接在一起.本发明的融合蛋白是HBc嵌合体分子，它能诱导抗体的产生，这种抗体能与在氨基酸残基序列中与所述融合蛋白的多肽部分相当的多肽发生免疫反应。
在本文中，术语“乙型肝炎”以其最广义的含义表示哺乳动物嗜肝DNA病毒科的任何成员，正如上文所讨论的.
术语“多肽”和“肽”在本说明书中可以交换使用，并且表示通过邻接氨基酸的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的线性系列的氨基酸残基。多肽可以是各种长度，以其中性(不带电)形式或盐形式存在。本领域公知，含有酸性和碱性基团的氨基酸残基序列，和多肽所表现的特定离子化状态，取决于周围培养基的pH值(当肽处于溶液中)或获得所述肽的培养基的pH值(如果肽是固体形式)。因此，“多肽”或其等同术语意欲包括提到的合适氨基酸残基序列.本文中通常从左到右，并且以从氨基末端(N-末端)到羧基末端(C-末端)的方向表示肽。
术语“残基”可以与术语氨基酸残基交换使用。本文所说的所有氨基酸残基具有天然的或L-构型.为了保持标准多肽命名，[J.Biol.Chem.，243：3557-59，(1969)]，在下面的对应表中示出了氨基酸残基的缩略语：
Figure S04841451420060811D000131
发明详述
本发明涉及抗甲型流感病毒的免疫原和包含读免疫原的疫苗或接种物。涉及的免疫原是包含重组乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白嵌合体分子的颗粒，这些分子均具有大约150-大约375个氨基酸残基，优选大约150-大约235个氨基酸残基的长度，包括4个通过肽键连接的氨基酸残基序列结构域，从N-末端开始命名为结构域I、II、III和IV。在嵌合体的N-末端或N-末端附近，存在1-3个半胱氨酸残基，并且，含有SEQ ID NO：9的甲型流感M2细胞外结构域(或M2e)多肽的6-大约24个残基的2-4个多肽，例如下文定义的SEQ ID NO：10的多肽，通过肽键与嵌合体分子连接(融合)。
应该注意，人、禽类和猪甲型流感病毒的M2e序列非常相似.因此，人和禽类病毒的1-9号残基是相同的，人和猪病毒的1-7和9-10号残基也是相同的。所以三种病毒共有两个半胱氨酸(17和19)位置，并且在22-24位具有相同的残基。尽管其它位置可以在M2e的其它位置上含有不同的残基，发现人类序列的残基存在于不同的分离物中，使得人序列代表了所有三种病毒的共有序列。
在涉及的免疫原性嵌合颗粒中，(a)结构域I包含大约75-大约160个氨基酸残基，其序列至少包含HBc的第4位到大约75位的残基的序列。在嵌合体分子中相对于SEQ ID NO：1的HBc的N-末端的大约1-大约-55，优选1-大约-30，更优选1-大约-20的位置上也存在1-3个半胱氨酸残基[N-半胱氨酸残基]。N-半胱氨酸残基存在于除HBc的前核心序列的序列之外的序列中。
结构域I的半胱氨酸残基也任选存在于，但优选存在于(i)上文指出的甲型流感M2多肽，如SEQ ID NO：9的X1X2X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21-X22X23X24或优选多肽，如SEQ ID NO：10的X1X2X3X4X5X6X7X8-TPIRNE-X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24的大约6-大约24个残基的2-4个序列中，所述多肽与HBc序列的N-末端的大约15个残基通过肽键连接，或通过肽键连接在HBc序列的N-末端的大约15个残基内(参见表4)和(ii)HBc残基1-4中的一个或多个.在所述甲型流感M2多肽序列中，
残基X1-X8不存在或存在，并且当存在时，是M2e蛋白序列中天然存在的残基，分别是甲硫氨酸，丝氨酸，亮氨酸，亮氨酸，苏氨酸或脯氨酸，谷氨酸，缬氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，前提是当存在一个带脚标的X残基时，也存在任何其余的脚标数更大，最大到8的带脚标的X，
X10存在，并且是脯氨酸、亮氨酸或组氨酸，
X11存在，并且是异亮氨酸或苏氨酸，
X12存在，并且是精氨酸或赖氨酸，
X13存在，并且是天冬酰胺或丝氨酸，
X14存在，并且是谷氨酸或甘氨酸，
残基X15和X16存在或不存在，当存在时分别是色氨酸和甘氨酸或谷氨酸，
残基X17和X19存在或不存在，当存在时各自独立地是半胱氨酸、丝氨酸或丙氨酸，
残基X18存在或不存在，当存在时是精氨酸或赖氨酸，并且
残基X20-X24存在或不存在，当存在时是M2蛋白序列中天然存在的残基，分别是天冬酰胺、甘氨酸或丝氨酸，天冬氨酸或甘氨酸，丝氨酸，丝氨酸，天冬氨酸，前提是当存在一个带脚标的X残基时，也存在任何其余的脚标数更小，最小到15的带脚标的X。
(b)结构域II包含通过肽键与大约75号残基连接的大约0-大约60个氨基酸残基。读序列包括(i)HBc的76-85位的序列中的0-所有10个残基，其通过肽键连接于(ii)具有大约6-大约48个残基的任选序列，其构成上述SEQ ID NO：9的甲型流感M2多肽的一个或多个具有大约6-大约24个残基的重复序列。
(c)结构域III是通过肽键连接于大约85号残基的HBc序列的大约86位到大约135位。
d)结构域IV包含(i)通过肽键连接于结构域III的大约135位残基的大约136-140位残基加上HBc氨基酸残基序列从141-156位的最多16个残基，(ii)0-3个半胱氨酸残基，(iii)少于4个精氨酸或赖氨酸残基，或彼此邻接的其混合物，和(iv)与HBc的156位到C-末端异源的序列中的最多约100个氨基酸残基。
涉及的嵌合体分子(i)HBc序列中包含最多约10％的保守取代的氨基酸残基，(ii)自组装为基本不与宿主细胞上表达的核酸结合的颗粒，这些颗粒比由缺乏所述N-末端半胱氨酸残基或嵌合体分子中存在的N-末端半胱氨酸被其它残基替代的其它方面相同的HBc嵌合体形成的颗粒在形成时更稳定。
优选的嵌合体分子包含存在于相对于图1和SEQ ID NO：1所示的HBc的N-末端的大约-50-大约-1的位置。负数氨基酸位置的概念通常与前导序列相关，如HBc的前核心序列。此处相似地使用该概念，因为可以简单将给定的嵌合体分子序列与SEQ ID NO：1的序列进行比对，以确定相当于HBc的+1位的起始甲硫氨酸残基的嵌合体中的位置。由于氨基酸残基序列通常是从左到右，并且以从N-末端到C-末端的方向表示，在HBc起始甲硫氨酸占据的位置左边的任何比对的嵌合体分子残基具有负数位置。涉及的半胱氨酸残基可以存在于比对的HBc起始甲硫氨酸残基左边大约20个残基至相当于读起始甲硫氨酸的位置。
在检验涉及的HBc嵌合体的长度时，所述重组蛋白可以具有大约150-大约325个氨基酸残基的长度.优选地，该长度是大约150-大约235个残基.更优选地，该长度是大约170-大约215个残基.这些长度差异是由于结构域I、II和IV的长度的改变，更具体是由于存在的M2多肽数目以及是否存在与HBc异源的C-末端序列。
业已报导了在结构域I中包括前3个氨基末端(N-末端)残基的一个以上缺失的HBc嵌合体，会导致HBc嵌合蛋白在大肠杆菌细胞中的完全消失。Pumpens et al.，(1995)Intervirology，38：63-74.另一方面，在一份最近的研究中，将来自流感病毒M2蛋白的免疫原性23聚体多肽与HBc N-末端序列融合，根据报导当天然HBc序列的1-4号残基被取代时，所得到的融合蛋白能形成颗粒。Neirynck et al.(October1999)Nature Med.，5(10)：1157-1163。因此，现有技术表明，当所添加的氨基酸序列可与HBc的1-5号残基中的一个通过肽键连接时，可以形成颗粒，而如果不存在额外的序列并且缺失了HBc的N-末端的超过1-3号残基，就不能形成颗粒。
通过肽键与HBc的前5个N-末端残基之一连接的N-末端序列，可能包括一个与HBc异源的最多可达大约40个残基的序列，即，前核心序列的一部分可以存在于涉及的嵌合体分子中。示例的序列包括诸如下文所公开的甲型流感B细胞或T细胞表位，上述Neirynck等所公开的源于流感病毒M2蛋白的23-聚体多肽，可以作为所使用的表达系统的结果而以融合蛋白形式存在的诸如β-半乳糖苷酶的另一种(异源)蛋白的序列。
结构域I优选具有HBc的2、3或4位-75位的残基的序列.结构域I也包含1-3，优选1个添加的半胱氨酸残基，并且也优选包含如下文所述在氨基末端通过肽键与甲型流感M2e蛋白连接的细胞外区序列的大约6-大约24个残基的2-4个序列.因此，结构域I通常至少包含HBc的第1位的甲硫氨酸的缺失，并且可以包含HBc的2、3或4位的残基的缺失。
在嵌合体分子中相对于SEQ ID NO：1的HBc的N-末端的大约1-大约-55，优选1-大约-30，更优选1-大约-20的位置上存在1-3个半胱氨酸残基[N-半胱氨酸残基].因此，采用SEQ ID NO：1的序列作为参照点，N-末端半胱氨酸残基位于嵌合体分子中相当于SEQ IDNO：1的第1位的甲硫氨酸的位置(图1)，或该位置上游最多约50个残基的位置。最优选地，N-末端半胱氨酸残基位于相对于SEQ ID NO：1的第1位的大约1-大约-14的位置。
一个或多个N-末端半胱氨酸残基存在于除HBc的前核心序列以外的序列中。如前面所指出的，HBeAg分子含有前核心序列，读序列包含半胱氨酸残基.因此，尽管N-末端半胱氨酸残基可以邻接于前核心序列，但读残基不存在于前核心序列或涉及的嵌合体分子中。
结构域I可以具有大约160个残基的长度.优选地，结构域I具有大约95-大约145个氨基酸残基的长度，并且包含2-4个，优选三个SEQ ID NO：9的甲型流感M2多肽表位序列，如SEQ ID NO：10的序列，其优选包含SEQ ID NO：9的M2多肽的C-末端的19个残基。
最近的研究表明，从第一个谷氨酸残基开始的上游N-末端残基(在上述序列的残基X5和X6之间)在制备和表达期间被迄今为止还未知的一种或多种蛋白酶切割，或者可以被切割，所述蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶[其活性可以被苯基甲磺酰氟(PMSF)抑制]或金属蛋白酶[其活性可以被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制]。因此，一些优选实施方案利用了一种或多种19聚体或更短的M2序列，其N-末端残基是SEQ ID NO：9中X6处的谷氨酸。
更优选地，发现通过将嵌合体颗粒的缓冲液加热到大约50°-大约70℃的温度，加热大约1.5-大约3小时，可以使蛋白酶的活性最低，或类似地，使活性消除。通过将颗粒维持在含有蛋白酶抑制量的EDTA(如，大约1-10mM)或相似的掩蔽剂的含水组合物中，也可以使蛋白酶的活性最低，或使活性消除.其它有用的金属蛋白酶抑制性掩蔽剂(螯合剂)的示例基团包括2，2’-吡啶基、二巯基丙醇、乙二醇-二-(2-氨基乙基)-N，N，N’N”-四乙酸(EGTA)、次氮基四乙酸(NTA)、邻-菲咯啉、水杨酸、四乙醇胺(TEA)、苯丁抑制素和phosphoramidon。可以使原本纯化的颗粒通过大小排阻或相似的柱，然后透析或进行相似的处理，从而从组合物除去掩蔽剂和蛋白酶.也可以通过相似加热含有掩蔽剂的嵌合体颗粒的含水组合物而处理蛋白酶。
当2或3个M2e序列通过肽键连接在一起并顺序连接时，存在于天然M2序列17和19位的半胱氨酸残基中的一个或两个可以不存在，考虑的N-末端半胱氨酸残基可以存在于添加的M2序列和HBc序列的N-末端之间。优选地，考虑的N-末端半胱氨酸残基存在于天然序列17和19位的一个或两个位置上。半胱氨酸可以存在于2或3个M2序列的每个序列中，存在于N-末端M2序列中(存在于大约-52--54位)，存在于3个序列的中间序列(存在于大约-30或-32)中，或存在于与HBc序列连接的序列(存在于大约-6或-8位)中。当存在2或3个M2序列时，优选的是，一个或两个半胱氨酸，优选两个半胱氨酸存在于通过肽键与HBc序列连接的M2序列中；即，与HBc序列直接键合的M2序列，或在分子的N-末端远侧的M2序列.
通过肽键与大约75号残基连接的结构域II包含大约0-大约60个氨基酸残基.该结构域包含大约76位-大约85位的HBc序列残基中的0个(无)，优选至少4个残基，更优选至少8个到所有10个.结构域II也任选包含构成前述SEQ ID NO：9的甲型流感M2多肽的一个或多个重复的大约6-大约48个残基的序列.当存在时，甲型流感M2多肽序列优选通过肽键连接于HBc78和79号残基之间，并且HBc序列的76-85位全部存在。
下文表A中列举了用于插入考虑的重组HBc嵌合体的结构域I或II，或插入这两个结构域的优选的甲型流感M2多肽序列.以甲硫氨酸残基(M)起始的序列被设计为是用于插入结构域I的N-末端的N-末端序列，而不含N-末端M残基的序列被设计用于插入结构域II。
表A
甲型流感M2蛋白B细胞表位
序列                     SEQ ID NO
SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD      11
SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD      12
SLLTEVETPIRNEWGARANDSSD      13
SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD      14
SLLTEVETPIRNEWGSRCNDSSD      15
SLLTEVETPIRNEWGCRSNDSSD      16
SLLTEVETPIRNEWGCRANDSSD      17
SLLTEVETPIRNEWGARCNDSSD      18
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD     19
MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD     20
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCND-
SSDELLGWLWGI                 21
MSLLTEVETPIRNEWGARANDSSD     22
MSLLTEVETPIRNEWGCRANDSSD     23
MSLLTEVETPIRNEWGARCNDSSD     24
MSLLTEVETPIRNEWGCRSNDSSD     25
MSLLTEVETPIRNEWGSRCNDSSD     26
SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-
TEVETPIRNEWGSRSNDSSD         27
SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-
TEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-
TEVETPIRNEWGCRCNDSSD         28
SLLTEVETPIRNEWGARANDSSDSLL-
TEVETPIRNEWGCRCNDSSD         29
SLLTEVETPIRNEWGARANDSSDSLL-
TEVETPIRNEWGARANDSSDSLL-
TEVETPIRNEWGCRCNDSSD         30
EVETPIRNEWGSRCNDSSD          31
EVETPIRNEWGSRCNDSSDEVET-
PIRNEWGSRCNDSSD                  32
EVETPIRNEWGSRCNDSSDEVET-
PIRNEWGSRCNDSSDEVE-
TPIRNEWGCRCNDSSD                 33
SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-
TEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-
TEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-
TEVETPIRNEWGCRCNDSSD             130
SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-
TEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-
TEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-
TEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLL-
TEVETPIRNEWGCRCNDSSD             131
X1X2X3X4X5X6X7X8TPIRNEX15X16X17-
X18X19X20X21X22X23X24              10
X1X2X3X4X5X6X7X8TPIRNEX15X16X17-
X18X19X20X21X22X23X24X2-X3X4X5X6X7X8TPIRNEX15X16-
X17X18X19X20X21X22X23X24           34
X1X2X3X4X5X6X7X8TPIRNEX15X16X17-
X18X19X20X21X22X23X24X2-
X3X4X5X6X7X8TPIRNEX15X16X17-
X18X19X20X21X22X23X24X2-
X3X4X5X6X7X8TPIRNEX15X16X17-
X18X19X20X21X22X23X24             35
X1X2X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-
X16X17X18X19X20X21X22X23X24        9
X1X2X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-
X16X17X18X19X20X21X22X23X24X2-
X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-
X16X17X18X19X20X21X22X23X24        36
X1X2X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-
X16X17X18X19X20X21X22X23X24X2-
X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-
X16X17X18X19X20X21X22X23X24X2-
X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-
X16X17X18X19X20X21X22X23X24      37
X1X2X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-
X16X17X18X19X20X21X22X23X24X2-
X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-
X16X17X18X19X20X21X22X23X24X2-
X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-
X16X17X18X19X20X21X22X23X24X2-
X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15-
X16X17X18X19X20X21X22X23X24    132
SLLTEVETPTRNEWGCRCNDSSD      134
SLLTEVETPTRNGWGCRCNDSSD      135
SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD      136
SLLTEVETPTKNEWECRCNDSSD      137
SLLTEVETPTKRNGWECKSDSSD      138
SLLTEVDTLTRNGWGCRCSDSSD      139
SLLTEVETLTRNGWECKCRDSSD      140
乙型流感蛋白
NNATFNYTNVNPISHIR            38
在SEQ ID NO：9的多肽中，
残基X1-X8不存在或存在，并且当存在时，是M2e蛋白序列中天然存在的残基，分别是甲硫氨酸，丝氨酸，亮氨酸，亮氨酸，苏氨酸或脯氨酸。谷氨酸，缬氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，前提是当存在一个带脚标的X残基时，也存在任何其余的脚标数更大，最大到8的带脚标的X，
X10存在，并且是脯氨酸、亮氨酸或组氨酸，
X11存在，并且是异亮氨酸或苏氨酸，
X12存在，并且是精氨酸或赖氨酸，
X13存在，并且是天冬酰胺或丝氨酸，
X14存在，并且是谷氨酸或甘氨酸，
残基X15和X16存在或不存在，当存在时分别是色氨酸和甘氨酸或谷氨酸，
残基X17和X19存在或不存在，当存在时各自独立地是半胱氨酸、丝氨酸或丙氨酸，
残基X18存在或不存在，当存在时是精氨酸或赖氨酸，并且
残基X20-X24存在或不存在，当存在时是M2蛋白序列中天然存在的残基，分别是天冬酰胺、甘氨酸或丝氨酸，天冬氨酸或甘氨酸，丝氨酸，丝氨酸，天冬氨酸，前提是当存在一个带脚标的X残基时，也存在任何其余的脚标数更小，最小到15的带脚标的X。
在SEQ ID NO：10的相似多肽中，X1-X8不存在或存在，并且当存在时，是报道的M2e蛋白序列中天然存在的残基；即，分别是甲硫氨酸，丝氨酸，亮氨酸，亮氨酸，苏氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，缬氨酸，谷氨酸，前提是当存在一个带脚标的X残基时，也存在任何其余的脚标数更大，最大到8的带脚标的X。因此，当X1存在时，X2-X8也都存在。相似地，当X3存在时，X4-X8也都存在，依此类推。另一方面，X8可以存在，而其余脚标数更小的X残基都不存在。残基X15和X16存在或不存在，当存在时分别是色氨酸和甘氨酸或谷氨酸.残基X17和X19存在或不存在，当存在时各自独立地是半胱氨酸、丝氨酸或丙氨酸.优选的是X17和X19中的至少一个是半胱氨酸，特别是当M2多肽表位存在于嵌合体分子的N-末端时。更优选的是，当存在多个M2e序列时，存在两个半胱氨酸，并且所述两个半胱氨酸存在于距离HBc序列部分的N-末端残基最近的M2序列中。残基X18存在或不存在，当存在时是精氨酸或赖氨酸。残基X20-X24存在或不存在，当存在时是报道的M2蛋白序列中天然存在的残基；即，分别是天冬酰胺、甘氨酸或丝氨酸，天冬氨酸或甘氨酸，丝氨酸，丝氨酸，天冬氨酸，前提是当存在一个带脚标的X残基时，也存在任何其余的脚标数更小，最小到15的带脚标的X。因此，例如，当存在X23时，X15-X22也都存在。
结构域III包含通过肽键在其N-末端连接于大约85号残基的HBc大约86位到大约135位的序列.
第4个结构域，即结构域IV包含(i)通过肽键连接于结构域III的大约135位残基的136-140位残基加上HBc氨基酸残基序列从141-156位的最多16个残基，(ii)0-3个半胱氨酸残基，优选一个半胱氨酸残基，(iii)少于4个精氨酸或赖氨酸残基，或彼此邻接的其混合物，和(iv)与HBc的164位或优选156位到C-末端异源的序列中的最多约100个氨基酸残基，优选最多50个氨基酸残基，更优选最多约25个残基。
优选的是，结构域IV包含通过肽键与135号残基连接的136位-149位的HBc序列，即，从第136位的残基开始，可以连续到149位的HBc序列的最多14个残基。这样，如果存在148位的残基，也存在136位-147位的残基的序列，或如果存在141位的残基，也存在136位-140位的残基的序列。
结构域IV也可以包含0-3个半胱氨酸残基，并且所述cys残基存在于嵌合体分子的羧基末端(C-末端)的大约30个残基内。优选地，存在一个半胱氨酸(Cys)残基，读Cys优选作为羧基末端(C-末端)残基存在，除非流感T细胞表位作为结构域IV的一部分存在。当存在所述T细胞表位时，优选的Cys优选存在于HBc嵌合体的C-末端最后5个残基内。
上文讨论的N-末端半胱氨酸的存在，使嵌合体分子形成稳定免疫原性颗粒的能力出乎意料地增强(讨论于下文)。因此，涉及的HBc嵌合体免疫原易于形成在收集和初始纯化后保持在一起的颗粒，这是通过分析大小排阻层析测量的，其细节讨论于下文。
涉及的颗粒在37℃下老化后比缺乏半胱氨酸残基的相似嵌合体颗粒对分解更稳定。可以用15％的SDS-PAGE凝胶和分散在样品缓冲液(还原)中的颗粒测量后一种类型的增强的稳定性.用考马斯亮蓝对凝胶染色，然后分析。认为这种类型的稳定性表现出抗水解，而通过大小排阻层析确定的稳定性是起始颗粒形成的稳定性。
额外含有一个或多个C-末端半胱氨酸残基的颗粒表现出形成中的稳定性增强，并且对老化时的分解也是稳定的，一些既含有N-末端半胱氨酸，也含有C-末端半胱氨酸的颗粒通常在任何一种测量时都显示比仅仅在N-末端或C-末端添加了半胱氨酸的颗粒更高的稳定性。
结构域IV含有少于4个精氨酸或赖氨酸残基，或其彼此邻接的混合物。精氨酸和赖氨酸存在于从天然分子的156位延伸到C-末端的HBc的C-末端区。读区有时称作分子的“富含鱼精蛋白”或“富含精氨酸”的区域，并且结合核酸。涉及的HBc嵌合体分子和颗粒基本不含结合的核酸。
通过比较在280和260nm测量的水溶液中的颗粒的吸光度，即280/260吸光度比值，可以容易确定基本无核酸结合.涉及的颗粒基本不与原始存在于生物细胞中、用于表达蛋白的作为寡聚和/或聚合的DNA和RNA物质的核酸结合.所述核酸在260nm表现出一个吸光度，以及在280nm的相对较低的吸光度，而例如所涉及的嵌合体的蛋白在260nm表现出相对较低的吸光度，在280nm具有较高的吸光度。
因此，含有位于150-183(或150-185)号残基位置的富含精氨酸的序列的重组表达的HBc颗粒或嵌合体HBc颗粒在280nm的吸光度与260nm的吸光度的比值(280∶260吸光度比值)是大约0.8，而不含天然存在的HBc的富含精氨酸的核酸结合区的颗粒，如含有少于4个精氨酸或赖氨酸或其彼此邻接的混合物的那些，或具有以HBc残基140-149位为末端的天然或嵌合序列的那些，280∶260吸光度比值是大约1.2-大约1.6。
本发明的嵌合HBc颗粒基本不结合核酸，并且，280∶260吸光度比值是大约1.2-1.7，更典型是大约1.4-大约1.6.读范围很大部分是由于存在于特定嵌合HBc颗粒的结构域II和IV中的芳族氨基酸残基的数目.该范围部分也是由于涉及的嵌合体的结构域IV中Cys的存在，其存在可以使观察到的比值减少大约0.1，其原因目前还未知.
涉及的嵌合体HBc颗粒在37℃下水性缓冲液中在大约2周-大约1个月的时间段内比有含有相同的通过肽键连接的结构域II、III和IV序列以及除不存在1-3个半胱氨酸残基[N-末端半胱氨酸残基]或存在的单个N-末端残基被诸如丙氨酸残基的另一残基取代的、其它方面相同的结构域I序列的HBc嵌合体形成的颗粒更稳定。
因此，例如，在结构域I中含有包含两个半胱氨酸残基的甲型流感M2e多肽的颗粒[如ICC-1590颗粒]比N-末端M2变体序列含有代替半胱氨酸的丝氨酸的嵌合体分子组装成的其它方面相同的颗粒[ICC-1603颗粒]更稳定.类似地，在结构域I含有上述含丝氨酸的流感B细胞表位和在C-末端含有单个半胱氨酸的颗粒[ICC-1605颗粒]比不存在半胱氨酸的其它方面相同的颗粒更稳定，但比含有两个N-末端半胱氨酸的颗粒、ICC-1590颗粒或含有N-末端和C-末端半胱氨酸的颗粒[ICC-1604颗粒]的稳定性差。
在此指出，由它们构成的颗粒和嵌合体分子也可以互换称作前缀“ICC”或前缀“CV”后面加上四个数字，或者不带前缀的四个数字。这样，上述ICC-1590颗粒也可以称作CV-1590颗粒，或仅仅称作1590颗粒。每个名称具有相同的含义。
涉及的含N-末端半胱氨酸残基的颗粒通常也以比缺乏N-末端半胱氨酸的嵌合体分子组装成的颗粒更高的产率制备。
尽管由HBc提供的T细胞辅助在接种后高度有效地增强抗体应答(即，B细胞介导的)以“携带”免疫原性序列，HBc不激活流感特异性T细胞，除非是在有限的个体中，对于所述个体，含有B细胞表位的序列也含有T细胞表位。为了帮助确保流感特异性T辅助细胞的激发，除B细胞外，优选将一种或多种流感特异性T辅助表位掺入涉及的免疫原，并且位于免疫原的结构域IV。
大量上述或另一种T细胞表位可以存在于结构域IV中，或可以存在另一种B细胞表位。在优选的实施中，结构城IV具有与HBc异源的序列中的最多大约50个残基.更优选地，该序列最多大约25个残基，并且包含T细胞表位。
由于M2由受感染的细胞足量表达，它具有作为流感特异性CTL活性的靶的潜能。细胞外结构域是抗体的可能的附着位点，其可能以类似于治疗药物金刚烷胺的方式，或通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的激活而起作用，使M2的功能固定。
实际上，已经显示了M2的细胞外结构域含有至少2个独特的人CTL表位，一个在7-15[Jameson et al.，(1998)J.Virol.，72(11)：8682-8689]，另一个在3-11[Gianfrani er al.，(2000)Hum.Immunol.，61(5)：438-352].与CTL相比，通过ADCC和/或DCD进行的抗M2e介导的流感感染细胞的裂解，可能是靶细胞裂解的优选机制，因为与CTL不同，它们不受MHC限制。因此，激发足够滴度的表现出需要的IgG亚类谱的抗M2抗体的能力和M2e特异性，应该激发跨多种群体的宽范围的保护。
抗M2的细胞外结构域的抗体具有生物学效应的能力首先由Zebedee和Lamb描述，他们证明了单克隆抗M2抗体14C2使培养中的病毒生长减慢[Zebedee et al，(1988)J Virol，62(8)：2762-2772]。在1990年，Treanor和同事证明了相同的单克隆抗体成功抑制小鼠中的甲型流感病毒复制[Treanor et al.，(1990)J.Virol.，64(3)：l375-1377]。Palladino等确定了14C2不在体内中和病毒，但确实在体外结合感染的细胞，并且抑制病毒生长；但是，它不能治愈感染[Pailadino et al.，(1995)J.Virol.，69(4)：2075-2081]。后一篇文章的作者恰当指出了14C2是IgG1亚类抗体，IgG2a和IgG2b在固定补体方面最有效；它们在与NK细胞上的FcγRIII受体结合方面也比IgG1优越。实际上，如下文所示，小鼠中Th1免疫应答的典型的高滴度IgG2a抗体似乎与保护相关.因此，可以提供通过ADCC和/或CDC进行的抗M2e介导的流感感染细胞的裂解的免疫应答是优选的应答。
在对曾经用HBc-M2颗粒免疫过的小鼠进行攻击后，重复观察到了记忆性抗M2应答，这表明M2e-HBc颗粒激发M2特异性T细胞.为了对此进行研究，进行了初步研究，以调查M2e肽是否能在体外引起来自免疫小鼠的淋巴细胞的回忆.在用来源于M2的肽HBc p85-100和重组HbcAg引起回忆后，观察到干扰素γ分泌细胞的数目显著增加，但来自HBc的p100-120则不能引起该回忆。HbcAg引起的回忆最显著，这是可以预期的，因为对于BALB/c小鼠，这是含有很多功能性T细胞表位的强效T细胞免疫原[Saito et al.，(2001)Vaccine，20(1-2)：125-133]。
与用ICC-1569颗粒免疫相比，所有抗原引起的回忆对于分离自用ICC-1604颗粒免疫的小鼠的淋巴细胞表现得更强。该结果表明，与ICC-1569颗粒相比，ICC-1604可能是更优越的T细胞免疫原。但是，重要的是，注意这些研究的M2回忆抗原是M2e(2-24)，其在第17和19位含有半胱氨酸残基，并因此仅仅对于ICC-1604颗粒是同源的，对ICC-1569颗粒则不是，因为后者含有代替了两个半胱氨酸残基的丝氨酸。
如果第17和/或19位的半胱氨酸残基是一种或多种T细胞表位的成分，则可以解释用M2e再刺激的水平对于ICC-1S69颗粒免疫的小鼠的比ICC-1604颗粒免疫的小鼠低。但是，含有半胱氨酸残基的T细胞表位的存在不能解释用来源于HBc的抗原再刺激的水平降低。
在对M2e-HBc免疫的小鼠进行病毒攻击后，在抗M2e滴度方面的记忆性应答的观察结果似乎表明M2e结构域中存在至少一种T辅助细胞表位(2-24位)。
在人体内具有广泛反应性(HLA-DR1，HLA-DR2，HLA-DRw13)[Brett et al.，(1991)J.Immunol.，147(3)：984-991]并且也在BALB/c小鼠中有功能的来源于流感核蛋白(NP206-229)的表位被考虑用作此处的T细胞表位。已经表达并纯化了具有与HBc颗粒的C-末端融合的读表位的颗粒.也考虑其它的流感Th表位，如NP341-362、NP297-318和NP182-205[Brett et al.，(1991)J.Immunol.，147(3)：984-991]；这些序列可最终在表达M2e的颗粒的C-末端顺序连接.下面提供了这些示例的序列。
 
NP位置 序列 SEQ ID NO
206-229 FWRGENGRKTRSAYERMCNILKGK 39
341-362 LRVLSFIRGTKVSPRGKLSTRG 40
297-318 SLVGIDPFKLLQNSQVYSLIRP 41
182-205 AVKGVGTMVMELIRMIKRGINDRN 42
一种所涉及的重组HBc嵌合体分子通常以自组装的颗粒形式存在并且被用于免疫原或疫苗.所述颗粒包含180-240个嵌合体分子，这些分子在存在诸如2-巯基乙醇的二硫化物还原剂和诸如SDS的变性剂的条件下分离到蛋白分子中。各个分子通过蛋白-蛋白相互作用结合在一起成为颗粒，这些相互作用通过二硫键的存在而稳定.这些颗粒与在HBV感染的患者中观察到的颗粒相似，但是这些颗粒是非传染性的.在多种原核和真核宿主中表达后，各个重组HBc嵌合体分子在宿主中组装成可以容易从宿主细胞收获的颗粒.
除了上述N-和C-截短和插入流感M2多肽表位，所涉及的嵌合体分子还可以包括构成HBc结构域I，II，II和IV的氨基酸残基的保守取代.保守取代如上文所定义。
较少见的是还涉及“非保守”改变，例如用色氨酸取代甘氨酸.类似的次要改变还可以包括氨基酸缺失或插入或包括这两者。使用本领域众所周知的计算机程序，例如LASERGENE软件(DNASTARInc.，Madison，Wis.)可以发现确定那些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而又不会破坏生物学活性的指导。
当存在时，本发明的嵌合体分子的HBc部分[具有除了添加的表位以外的HBc序列或作为限制酶人为构造物的异源残基的部分]最优选具有图1所示的亚型ayw的2-149位的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：1)。其次优选的是亚型adw、adw2和adyw的相应的氨基酸残基序列，这些序列同样在图1中示出(SEQ ID NO：2、3和4)。其次优选的是在比对的2-149位的土拨鼠和地松鼠的序列，它们是图1中的最后两个序列(SEQ ID NO：5和6).正如在其他部分所指出的，可以将来自不同哺乳动物HBc蛋白的不同序列的部分同时用在单个嵌合体上。
当存在时，当本发明的嵌合体分子的HBc部分具有除第2-156位或2-149位的哺乳动物HBc分子以外的序列时，由于进行了一个或多个保守取代，优选的是，与SEQ ID NO：1从第2-149位或2-156位相比，不超过10％，更优选不超过5％，最优选不超过3％的氨基酸残基被取代.因此，涉及的149个HBc残基的嵌合体最多可以含有大约15或16个，优选大约7或8个与SEQ ID NO：1从第2-149位不同的残基。最优选地，最多大约5个残基与ayw序列(SEQ ID NO：1)的2-149位的残基不同.当HBc序列在一个或两个末端被进一步截短时，取代的残基数目成比例地不同。为了计算的目的，在分子中其它位置的缺失也考虑是保守取代，这样，例如，如果结构域I具有在133位而不是135位的C-末端，为了计算的目的，假定存在两个残基(134和135)。
嵌合体制备
一种涉及的嵌合免疫原是使用重组DNA技术中的众所周知的技术制备的。因此，在编码HBV的前体序列上添加或缺失编码特定多肽序列的核酸序列。
涉及的嵌合免疫原通常采用存在于M2序列中的半胱氨酸残基作为N-末端半胱氨酸。下文讨论了用于通过编码HBc分子的多核苷酸的体外诱变制备所述嵌合体分子的引物.当含有半胱氨酸的M2多肽表位不存在于N-末端时，可以通过采用仅仅编码M2多肽的含半胱氨酸部分的引物或简单的N-末端起始序列，如Met-Cys-或Met-Gly-Cys-的体外诱变提供N-末端半胱氨酸。
如前面所指出的，HBc免疫优势环通常位于完整蛋白从氨基末端(N-末端)开始的大约75-85位。含有甲型流感M2B细胞表位的序列可以位于结构域II的读免疫优势环序列中.该定位基本消除了HBc免疫原性和HBc环序列的抗原性，而将甲型流感M2B细胞表位呈递于组装颗粒中非常具有免疫原性的位置。
两种公知策略之一对将甲型流感M2 B细胞序列置于环序列中需要的位置，如残基78和79之间特别有用。首先，成功率较低的策略称作替代，其中编码环的一部分的DNA被切除，并且用编码甲型流感M2 B细胞序列的DNA替代.第二个策略称作插入，其中将甲型流感M2 B细胞序列插入环中邻接的残基之间。
将使用聚合酶链反应(PCR)的定点诱变用于一种典型的替代方法中，以便提供一种嵌合HBc DNA序列，读序列编码一对不同的限制位点，例如EcoRI和SacI，靠近免疫优势环编码DNA的每个末端。典型的残基取代是在76-81号位置上进行的。将所述环编码部分切除，将每个侧翼具有合适的HBc序列残基的甲型流感M2 B细胞表位编码序列连接到限制位点上，并且将所得到的DNA用于表达HBc嵌合体。例如，有关相似技术的典型应用可以参见Pumpells et al.，(1995)Intervirology，38：63-74中的表2。
另外，可以将单个限制位点或两个限制位点编码到所述区域，用限制酶切割DNA以便提供“粘”端，将合适的粘端或平端异源DNA片段连接到所述切割区域。被替代到HBc中的这种类型序列的例子可以从以下文献中找到：Schodel et al.，(1991)F.Brown et al.eds.，Vaccines 91，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.319-325；Schodel et al.，Behring Inst.Mitt.，1997(98)：p.114-119和Schodel et al.，J.Exp.Med.，(1994)180(3)：p.1037-4，后两份文献分别讨论了抗约氏疟原虫和贝氏疟原虫的疫苗的制备。此处通常不使用导致从免疫优势环净去除残基的替代策略。
插入是优选的.在插入方法的一种说明性例子中，利用定点诱变产生两个彼此邻接的限制位点，并且位于编码邻接的氨基酸残基，如78和79位残基的密码子之间。该技术添加了12个碱基对，这些碱基对编码位于HBc环中以前邻接的残基之间的4个氨基酸残基(每个限制位点两个残基)。
当用限制酶进行切割，连接编码示例的甲型流感M2序列的DNA，并且表达读DNA，以便形成HBc嵌合体时，发现HBc环氨基酸序列在其N-末端侧被由5’限制位点编码的两个残基间断，在朝向C-末端方向上，随后是甲型流感M2 B细胞表位序列，随后是另外两个由3，非限制位点编码的异源、非环残基，然后是该环序列的其余部分.可以优选用相同策略将T细胞表位或不是T细胞表位一部分的一个或多个半胱氨酸残基插入结构域IV.在以下文献中公开了在82和83号残基之间使用插入的类似方法：Schodel et al.，(1990)F.Brown et al.eds.，Vaccines 90，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，PP.193-198。
例如，将编码C-末端截短的HBc序列的DNA序列(HBc149)进行工程化，以包含位于78和79号残基之间的邻接的EcoRI和SacI位点.用这两种酶切割该DNA，提供了一种3’末端为EcoRI粘端的编码HBc 1-78位的片段，而另一种片段具有5’末端SacI粘端，并且编码79-149位残基。连接一种具有5′AATT突出端、以及随后的编码需要的甲型流感M2B细胞表位和AGCT3＇突出端的合成核酸，从而提供了一种HBc嵌合序列，该序列编码位于78和79号残基之间的每一侧的侧翼各有两个异源残基(分别为GI和EL)的B细胞表位，同时，破坏了EcoRI位点，而保留了SacI位点。
可以将相似的策略用于插入含有C-末端半胱氨酸的序列。因此，将EcoRI和HindIII限制位点工程化到HBc DNA序列中的氨基酸残基149号位置之后.在用EcoRI和HindIII消化之后，将一种具有上述AATT5＇突出端、随后的T细胞表位编码序列、终止密码子和3＇AGCT突出端的合成DNA连接到消化过的序列上，以便形成一种编码HBc1-149号残基、随后的两个异源残基(GI)、终止密码子和HindIII位点的序列。
用一种具有SacI限制位点、随后是一个始于79号残基位置的编码HBc的序列的正向引物进行PCR扩增，然后用SacI和HindIII消化，提供了一种编码HBc79-149号位置的序列，加上两个添加的残基和C-末端的T细胞表位.用SacI消化该构建体并且连接，提供了编码需要的重组HBc嵌合免疫原的完整基因，从N-末端开始，所述免疫原具有HBc 1-78号位置的序列、两个添加的残基、含有B细胞表位的甲型流感M2序列、两个添加的残基、HBc79-149号位置，两个添加的残基、和T细胞表位.
业已发现，优选将两个异源残基用于含有B细胞或T细胞表位的异源免疫原性序列的任意一侧(侧翼)是一件方便的事情.结果，人们还可以在插入的序列的一侧或两侧使用0-3个或更多个不是HBc序列一部分的添加的残基。可以用一种合适的核酸酶(例如S1核酸酶)“消化”插入序列和HBc核酸的一端或两端，以便提供平端，这些平端可以连接在一起。既不是插入的B细胞或T细胞表位的一部分也不是HBc序列的一部分的添加的异源残基不被统计在出现在提到的结构域中的残基数量内.
还发现可以使用众所周知的合成方法合成需要的重组HBc嵌合核酸的全部或一部分，例如，在U.S.5,656,472中公开了177个碱基对DNA的合成，该DNA编码烟草的具有59个残基的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶信号肽.例如，人们可以合成具有平端或“粘端”的结构域I和II，其可以连接到结构域III和IV上，以便提供一种能表达涉及的HBc嵌合体的嵌合体，该嵌合体包括添加在B细胞表位N-末端侧的0个残基，和添加在C-末端侧或添加在结构域II/III连接处或添加在某些其他需要位置上的0-3个残基。
本发明还涉及编码上述HBc嵌合体分子或该编码序列的互补序列的核酸序列(片段)。在某些优选实施方案中，所述核酸片段是以分离的和纯化的形式存在。
在活的生物中，蛋白或多肽的氨基酸残基序列通过遗传密码直接与编码读蛋白的基因的脱氧核糖核酸(DNA)序列相关。因此，通过众所周知的遗传密码的简并性，可以根据需要制备额外的DNAs和相应的RNA序列(核酸)，读序列编码相同的嵌合体氨基酸残基序列，但是与以前讨论的基因序列有足够的差异，以至这两种序列在高严格条件下不能杂交，而在中等严格条件下能够杂交。
高严格条件可以被定义为包括在大约50-55℃的温度下在6XSSC中杂交，并且最终的洗涤是在68℃在1-3XSSC中进行。中等严格条件包括在大约50℃-大约65℃的温度下在0.2-0.3M NaCl中杂交，然后在大约50℃-大约55℃在0.2X SSC，0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)中洗涤。
这样一种核酸序列(DNA序列或RNA序列)，它(1)本身编码，或其互补序列编码一种嵌合体分子，它的HBc部分是1-136位残基(如果存在)是SEQ ID NOS：1、2、3、4、5或6的HBc部分和(2)至少能在中等严格条件(如上文所述)下与SEQ ID NO：43、44、45、46、47或48的DNA序列杂交；和(3)它的与SEQ ID NO：43、44、45、46、47或48的DNA序列具有至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少100％同一性的HBc序列被定义为DNA变体序列。正如众所周知的，诸如所涉及的核酸序列的核酸序列是在操作性连接在合适的启动子上时在合适的表达系统中表达的，正如在本文的其他部分所讨论的。
编码所涉及嵌合体分子的类似物或类似的核酸(DNA或RNA)也是本发明的一部分。嵌合体类似物核酸序列或其互补的核酸序列编码一种HBc氨基酸残基序列，该序列与SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6所示1-136号残基位置的HBc序列部分的同一性至少为80％，更优选至少90％，最优选至少95％。读DNA或RNA在本文中被称为SEQ IDNO：43、44、45、46、47或48的核酸序列“的类似物”或“与其类似”，并且能在中等严格杂交条件下与本发明的SEQ ID NO：43、44、45、46、47或48的核酸序列或其互补序列杂交。编码类似序列的核酸在进行适当转染和表达时也能产生所涉及的嵌合体。
不同的宿主通常优先使用特定的密码子编码特定的氨基酸残基。这种密码子优先性是众所周知的，并且可以通过诸如体外谤变的方法改变编码所需嵌合体序列的DNA序列，以便宿主优先使用的密码子被用于要表达的酶的特定宿主。另外，还可以使用遗传密码的简并性来编码SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的序列的HBc部分，由此避免了与SEQ ID Nos：SEQ ID NO：43、44、45、46、47或48或其互补序列的明显的同一性。因此，有用的类似DNA序列，在中等严格条件下不一定能与SEQ ID NO：43、44、45、46、47或48或互补序列的核苷酸序列杂交，但仍然能提供相关的嵌合体分子。
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HBcAYW DNA  SEQ ID No 43
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HBcADW DNA  SEQ ID No 44
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HBcADW2 DNA SEQ ID NO 45
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HBcADYW DNA  SEQ ID NO 46
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Woodchuck DNA  SEQ ID NO 47
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地松鼠DNA
本发明还涉及诸如DNA分子的重组核酸分子，它包括与外源核酸片段(例如DNA片段或序列)操作性连接的裁体，该外源核酸片段形成了编码一种如上文所述的所涉及的嵌合体的基因，以及适合驱动所述基因在相容的宿主生物中表达的启动子．更具体地讲，还涉及一种重组DNA分子，它包括一种载体，读栽体包括用于驱动所述嵌合体在宿主生物细胞中表达的启动子，读启动子与探作性与一种DNA片段连接，该DNA片段形成了编码一种嵌合体的HBc部分的基因或与序列SEQ ID NOs：43、44、45、46、47或48的嵌合基因具有至少90％的同一性，并且能在中等严格条件下与该基因杂交的DNA变体．
还涉及一种重组DNA分子，它包括一种裁体，读裁体包括用于驱动一种嵌合体在宿主生物细胞中表达的启动子，该启动子操作性连接在一种DNA片段上，读DNA片段是一种类似物核酸序列，它所编码的HBc嵌合体部分的氨基酸残基序列与SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的序列的HBc部分的同一性至少为80％，更优选90％，最优选95％。所述重组DNA分子在宿主细胞中进行适当的转染和表达时，能提供一种所涉及的嵌合体分子.
业已发现，由于地松鼠HBc的N-末端的30个氨基酸残基的序列与任何其他HBc序列都不相同，所述序列及其编码核酸序列及其互补序列不包括在上述同一性范围内，编码所述30个残基序列的核酸部分或其用于杂交测定的互补序列也不包括在内.类似地，在HBc N-和C-末端的一端或两端截短的序列在同一性计算时不包括在内，为了插入异源表位而除去了免疫优势环中的残基的序列也不包括在内。因此，仅包括存在于嵌合体分子中的编码HBc的碱基或HBc序列残基，并且与同一性百分比计算中比对的核酸或氨基酸残基序列进行比较.
本文所公开的基因的编码序列如SEQ ID NOs：43、44、45、46、47和48所示，分离的核酸片段，优选DNA序列、其变体及类似物可以通过体外诱变制备，这种技术是众所周知的，并且公开于Current Protocols In Molecular Biology，Ausabel et al.eds.，John Wiley & Sons(New York：1987)p.8.1.1-8.1.6，该编码序列始于基因的起始ATG密码子，并且止于或正好位于每一个基因的终止密码子下游.因此，可以在起始密码子部位或上游，以及在终止密码子部位或下游产生工程化需要的限制位点，以便能够制备、切除并分离其他基因。
正如本领域所公知，只要存在需要的核酸、所列举的DNA序列(包括起始信号和终止信号)，其他的碱基对通常存在于该片段的任意末端，并且读片段仍然可用于表达该蛋白.当然，其前提是在片段中缺乏操作性连接的抑制表达、表达能消耗表达所需要的酶的另一种产物、表达能消耗需要的由所述需要的酶产生的反应产物的产物、或者以其他方式干扰该DNA片段基因的表达的DNA序列。
因此，只要该DNA片段不含有所述干扰性DNA序列，本发明的DNA片段的长度就可以为大约500-大约15000碱基对.重组DNA分子，特别是表达载体的最大大小在很多程度上是根据方便性决定的，并且载体的大小能够被宿主细胞所容纳，只要在需要时存在复制和表达所需要的所有最小DNA序列。最小载体大小是众所周知的。长的DNA片段不是优选的，但是可以使用。
编码上述嵌合体的DNA片段可以通过化学技术合成，例如Matteucci et al.(1981)J.Am.Chem.Soc.，103：3185的磷酸三酯方法.当然，通过化学合成所述编码序列，通过简单地用合适的碱基取代编码天然氨基酸残基序列的碱基可以产生任何需要的修饰.不过，优选包括上述序列的DNA片段。
可以在多种转化过的宿主系统，通常是宿主细胞中生产(表达)涉及的HBc嵌合体，不过表达也可以在无细胞的体外系统中进行。所述宿主细胞系统包括，但不限于微生物，如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化过的细菌；用酵母表达载体转化过的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染过的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒；烟草花叶病毒)或用细菌表达载体(例如Ti质粒)转化过的植物细胞系统；或适当转化过的动物细胞系统，如CHO或COS细胞。本发明受所采用的宿主细胞的限制。
含有编码HBc嵌合体的基因的DNA片段优选是从含有该基因的重组DNA分子(质粒载体)获得的.能够指导嵌合基因表达成HBc嵌合体蛋白的载体在本发明中被称为“表达载体”。
表达载体含有包括启动子在内的表达控制元件.嵌合体编码基因操作性连接在表达载体上，以便所述启动子序列能指导RNA聚合酶的结合，并表达嵌合体编码基因.可用于表达多肽编码基因的有Poszkowski et al.(1989)EMBO J.，3：2719和Odell et al.(1985)Nature，313：810所公开的诱导型、病毒的、合成的、组成型的启动子，以及Chua et al.(1989)Science，244：174-181所公开的时间调控的、空间调控的和空间时间调控的启动子。
一种在诸如大肠杆菌的原核细胞中使用的优选的启动子是Rec7启动子，它可以通过外源提供的萘啶酮酸诱导。一种更优选的启动子存在于质粒载体JHEX25(可以从Promega获得)中，它可以通过外源提供的异丙基β-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷(IPTG)诱导.一种更优选的启动子tac启动子存在于质粒载体pKK223-3中，并且也可以通过外源提供的IPTG诱导.用大约25-大约100微摩尔的IPTG进行诱导，能够使pKK223-3质粒在诸如XL-1、TB1、BL21和BLR的多种大肠杆菌菌株中成功地表达。令人吃惊的是，业已发现大约25-大约50微摩尔IPTG的浓度能够在2升摇瓶和发酵罐中产生最佳结果。
涉及的嵌合体分子在其它微生物，如，诸如伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂交体的沙门氏菌，酵母，如啤酒糖酵母或巴斯德毕赤氏酵母中，在哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，通常在单子叶和双子叶植物细胞，特别是在双子叶植物储存器官，如根、种子或果实(其中需要口服疫苗或接种物)，以及通过采用Autographa californica核多角体病毒(AcNPV)或杆状病毒在昆虫细胞，如S.Frugiperda细胞或Trichoplusia的细胞中的表达业已在前面提到的专利申请和公开的WO 02/14478A2中讨论。因此，尽管涉及到这些表达方式，但在此处不再进一步讨论.
业已开发了多种方法以便通过互补粘端或平端将DNA操作性连接到载体上。例如，可以将互补的均聚物片段添加到将要插入载体DNA中的DNA片段上。然后通过所述互补均聚物的尾之间的氢键结合连接所述载体和DNA片段，以便形成重组DNA分子。
另外，正如上文所公开的，可以用含有一个或多个限制性内切核酸酶位点的合成接头将所述DNA片段连接到所述表达载体上.通过在存在能够催化平端DNA分子连接的酶，诸如噬菌体T4DNA连接酶的条件下温育所述平端DNA片段和大量过量的合成接头分子，将所述合成接头连接在平端DNA片段上。
因此，所述反应的产物是在其末端具有合成接头序列的DNA片段。然后用合适的限制性核酸内切酶切割所述DNA片段，并且连接到业已用一种能产生与所述合成接头相容的末端的酶切割过的表达载体中。含有多种限制性内切核酸酶位点的合成接头可以从多种来源购买，包括New England BioLabs，Beverly，MA.还可以通过PCR技术获得需要的DNA片段，其中，正向和反向引物含有可以在扩增之后切割的理想的限制位点，以便可以将读基因插入所述载体.或者，可以将PCR产物直接克隆到包括T-突出端的载体上(Promega Corp.，A3600，Madison，WI)，正如本领域所熟知的。
所表达的嵌合蛋白在宿主细胞内自组装成颗粒，所述宿主细胞是单细胞或多细胞宿主的细胞.用标准方法收获含有颗粒的细胞，用弗氏压碎器、溶菌酶、超声仪、珠破碎器或微流化器(MicrofluidicsInternational Corp.，Newton MA)裂解细胞.在澄清裂解物之后，用45％的硫酸铵使颗粒沉淀，重新悬浮在20mM磷酸钠，pH6.8中，并且用相同的缓冲液透析。通过短时间离心将透析过的材料澄清，并且用CL-4B对上清液进行凝胶过滤层析。鉴定含有颗粒的级份，进行羟基磷灰石层析，并且再次用硫酸铵沉淀然后再次悬浮，透析，无菌过滤，并且在-70℃下保存。
接种物和疫苗
将优选为颗粒形式的前述重组HBc嵌合体免疫原以免疫原性有效量溶解或分散于药学可接受的媒介物组合物中形成接种物或疫苗，该组合物优选是含水的。在给需要免疫或需要诱导抗体的诸如哺乳动物(例如，小鼠、犬、山羊、绵羊、马、牛、猴、猿或人)或禽类(例如，鸡、火鸡、鸭或鹅)的宿主动物施用时，接种物能诱导与免疫原中存在的甲型流感M2B细胞表位进行免疫反应的抗体.在疫苗中，也确信那些诱导的抗体在体内与病毒或病毒感染的细胞进行免疫反应(结合)，并且保护宿主免受致病流感病毒的感染.在一种动物中作为疫苗的组合物可以是另一宿主的接种物，在没有被甲型流感感染的第二宿主中诱导抗体。
用于每一次免疫的重组HBc嵌合体免疫原的量被称为免疫原性有效量，并且可以有很大的不同，特别是根据所述重组HBc嵌合免疫原、免疫的动物宿主和佐剂在所述疫苗中的存在而有所不同，正如下文所讨论的。如上文所述，免疫有效量的疫苗和接种物分别能提供保护或抗体活性。
疫苗或接种物通常含有每次接种大约1微克-大约1毫克浓度的重组HBc嵌合体免疫原(单位剂量)，优选大约10微克-大约50微克/单位剂量.在小鼠中的免疫通常含有10或20μg嵌合体颗粒.
与本发明的疫苗或接种物相关的术语“单位剂量”表示适合作为动物的单元剂量的物理学上分离的单位，每个单位含有计算出来的预定数量的活性物质，用于与需要的稀释剂，即载体或媒介物一起单独或共同产生需要的免疫效果。
与本发明的疫苗或接种物相关的术语“单位剂量”表示适合作为动物的单元剂量的物理学上分离的单位，每个单位含有计算出来的预定数量的活性物质，用于单独或与需要的稀释剂，即载体或媒介物一起共同产生需要的免疫原性作用。可以使用单个单位剂量或多个单位剂量以提供免疫原性有效量的重组HBc嵌合体免疫原颗粒。
疫苗或接种物通常是用回收的重组HBc嵌合体免疫原颗粒制备的，包括将所述颗粒分散在诸如水、盐水、磷酸缓冲的盐溶液(PBS)、乙酸缓冲的盐溶液(ABS)、或Ringer＇s溶液等的生理学可耐受的(可接受的)稀释媒介物中，以便形成含水组合物。所述稀释媒介物还可以包括含油物质，如下文所讨论的花生油、角鲨烷或角鲨烯。
免疫活性成分通常与药学可接受的并且与所述活性成分相容的赋形剂混合。例如，合适的赋形剂包括水、盐水、葡萄糖、甘油、或乙醇等及其组合。另外，如果需要，接种物或疫苗可以含有能增强该组合物的免疫效果的微量辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂。
涉及的疫苗或接种物有利地还包括佐剂.适用于本发明的疫苗和接种物的佐剂包括能增强针对所述嵌合体的B细胞表位的抗体应答的佐剂，以及能增强细胞介导的针对所述嵌合体中所含的T细胞表位的应答的佐剂.佐剂是本领域公知的(例如，参见Vaccine Design-The Subunit and Adiuvant Approach，1995，PharmaceuticalBiotechnology，Volume 6，Eds.Powell，M.F.，和Newman，M.J.，PlenumPress，New York和London，ISBN0-306-44867-X)。
示例的佐剂包括不能用于人的完全弗氏佐剂(CFA)，不完全弗氏佐剂(IFA)、角鲨烯、角鲨烷、明矾[例如，AlhydrogelTM(Superfos，Denmark)]，这些材料是本领域所公知，并且从若干来源购买。
可以与本发明的免疫原一起使用的优选佐剂包括铝盐或钙盐(例如，氢氧化物或磷酸盐).用于本发明特别优选的佐剂是诸如AlhydrogelTM的氢氧化铝凝胶。对于氢氧化铝凝胶(明矾)来说，将嵌合蛋白与该佐剂混合，以便每剂中存在大约50-大约800微克的铝，优选存在大约400-大约600微克的铝。磷酸钙纳米颗粒(CAP)是正在由Biosante，Inc(Lincolnshire，IL)开发的佐剂。感兴趣的免疫原可以包被于颗粒外，或包囊在内部[He et al.(Nov.2000)Clin.Diagn.Lab.Immunol.，7(6)：899-903]。
用于本发明免疫原的另一种特别优选的佐剂是乳液。所涉及的乳液可以是水包油乳液或油包水乳液。除了所述免疫原性嵌合蛋白之外，所述乳液包括众所周知的诸如角鲨烯、角鲨烷、或花生油之类的油相，以及分散剂。优选非离子型分散剂，并且，所述材料包括山梨聚糖和二缩甘露醇的单和二-C12-C24脂肪酸酯，如山梨聚糖单硬脂酸酯，山梨聚糖单油酸酯和二缩甘露醇单油酸酯.含有免疫原的乳液以乳液形式施用。
所述乳液优选是油包水乳液，该乳液包括在水相中与所述嵌合蛋白颗粒乳化的角鲨烯、甘油和表面活性剂，如二缩甘露醇单油酸酯(ArlacelTMA)，并任选含有角鲨烷.油相优选包含大约0.1％-大约10％的疫苗，更优选大约0.2％-大约1％。油相的替代成分包括α-生育酚、混合链甘油二酯和甘油三酯，以及山梨聚糖酯.所述乳液公知的例子包括MontanideTM ISA-720，和MontanideTM ISA 703(Seppic，Castres，France)，这两种乳液都被认为含有角鲨烯和角鲨烷，在每一种乳液中都以角鲨烯为主，但在MontanideTM ISA-703中所占比重较小。最优选的是使用MontanideTM ISA 720，并且使用7∶3(w/w)的油与水的比例．其他优选的水包油型乳液佐剂包括公开于WO 95/17210和EP 0399843中的佐剂。
本发明还可以使用小分子佐剂。可用于本发明的一种类型的小分子佐剂是公开于美国专利NO.4,539,205，No.4,643,992，No.5,011,828和No.5,093,3187中的7-取代的8-氧-或8-硫-鸟苷衍生物，以上专利内容被收作本文的参考。在上述材料中，7-烯丙基-8-氧鸟苷(loxoribine)是特别优选的。业已证实所述分子在诱导抗原-(免疫原)特异性反应方面特别有效。
优选使用的佐剂包括单磷脂酰脂质3-脱酰基单磷脂酰脂质这是由西雅图的Corixa公司(以前是RibiImmunochem，Hamilton，Montana)生产的公知的佐剂。谊佐剂包含三种从细茵提取的成分：单磷脂酰脂质A(MPL)、海藻糖二分枝茵酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)(MPL+TDM+CWS)，其溶于2％角鲨烯/
Figure S04841451420060811D000413
80乳液中．可以通过GB 2122204B中教导的方法制备该乳液。一种优选形式的3-脱氧-酰化单磷酰脂质A是乳液形式的，具有直径小于0.2微米的小粒度(EP0689454B1)。
最优选的是一种结构上与佐剂相关的化合物，称作氨基烷基葡糖酰胺磷酸酯(AGPs)，如可以从Corixa公司买到的名称为RC-529TM佐剂{2-[(R)-3-四-癸酰基氧四癸酰基氨基]-乙基-2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-四癸酰基氧四-癸酰基]-2-[(R)-3-四-癸酰基氧四癸酰基-氨基]-p-D-吡喃葡糖苷四乙铵盐}的那些。RC-529佐剂存在于商品名为RC-529SE的角鲨烯乳液中和商品名为RC-529AF的含水制剂中，可以从Corixa公司购买(参见美国专利No.6,355,257和No.6,303,347；US6113918；和美国公开No.03-0092643)。
进一步涉及的佐剂包括含有一次或多次出现的CpG核苷酸基序(加上侧翼序列)的合成寡核苷酸佐剂，可以从Coley PharmaceuticalGroup购买。可以从Aquila Biopharmaceuticals，Inc.购买的称作QS21的佐剂是源于南美树种Quillaja Saponaria Molina的树皮的具有佐剂活性的免疫学活性皂苷级份(例如QuilTMA)，在U.S.5,057,540中公开了其制备方法.也公开了QuilTMA的衍生物，如QS21(QuilTMA的一种HPLC纯化的级份衍生物，也称作QA21)，以及其它级份，如QA17。Quillaja Saponaria Molina皂苷的半合成和合成衍生物也是有用的，如描述于美国专利No.5,977,081和No.6,080,725中的那些。可以从Chiron公司购买的称作MFS9的佐剂描述于美国专利No.5,709,879和No.6,086,901.
也涉及胞壁酰二肽佐剂，包括N-乙酰-胞壁酰-L苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thur-MDP)、N-乙酰-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，被称为正-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1＇-2＇-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(CGP)1983A，被称为MTP-PE)。所谓的胞壁酰二肽类似物描述于美国专利No.4,767,842。
优选的佐剂混合物包括3D-MPL和QS21的组合(EP0671948B1)、含有3D-MPL和QS21的水包油型乳液(WO 95/17210、PCT/EP98/05714)、与其他载体一起制剂化的3D-MPL(EP0689454B1)、在含有胆甾醇的脂质体中制剂化的QS21(WO 96/33739)、或免疫刺激性寡核苷酸(WO 96/02555).也可以使用获自SKB(现在是Glaxo-SmithKline)的佐剂SBAS2(现在是ASO2)，其中含有水包油乳液中的QS21和MPL。其他佐剂包括公开于WO 99/52549中的佐剂，和聚氧乙烯醚的非颗粒悬浮液(英国专利申请号9807805.8)。
特别优选的是使用含有一种或多种toll样受体-4(TLR-4)激动剂的佐剂，如
Figure S04841451420060811D000421
佐剂或结构上相关的化合物，如RC-529TM佐剂或脂质A模拟物，所述佐剂可以单独使用，或与TLR-9激动剂一起使用，所述TLR-9激动剂如含有CpG基序的未甲基化的寡脱氧核苷酸。这些佐剂与涉及的含有免疫原性HBc的颗粒混合或与所述免疫原化学连接时，增强产生γ的CD8+、CD4+T细胞和细胞毒性淋巴细胞的生成。所述佐剂混合物中也可以存在明矾.初始的结果表明，明矾增强了有利于IgG1型抗体生成的Th2免疫应答，而RC-529型佐剂有利于Th1免疫应答，读免疫应答有利于产生IgG2a和IgG2b抗体，当T细胞免疫原存在时，RC-529型佐剂有利于T细胞应答，如同HBc颗粒包含免疫原的情况。
最优选的佐剂混合物包含稳定的油包水乳液，其中进一步含有氨基烷基葡糖胺磷酸酯，如美国专利No.6,113,918中描述的那些.在氨基烷基葡糖胺磷酸酯中，称作RC-529{(2-[(R)-3-四-癸酰基氧四癸酰基氨基]-乙基-2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-四癸酰基氧-四癸酰基]-2-[(R)-3-四-癸酰基氧四-癸酰基氨基]-p-D-吡喃葡糖苷四乙铵盐)}的分子是最优选的。优选的油包水乳液描述于WO 9956776.
以佐剂量使用佐剂，佐剂量可以根据所述佐剂、宿主动物和重组HBc嵌合体免疫原而改变.典型的用量可以在每次接种大约1微克-大约1毫克之间变化.本领域技术人员了解的是，可以方便地确定合适的浓度或用量。
接种物和疫苗通常是通过注射以肠胃外方式施用的，例如皮下注射或肌内注射.适合其他施用模式的其他制剂包括栓剂，以及在某些场合下为口服制剂或鼻喷雾.对于栓剂来说，可以包括传统粘合剂和载体，例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；所述栓剂可以用含有0.5％-10％，优选1-2％的活性成分的混合物制成。口服制剂包括常用的赋形剂，例如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁等。
接种物或疫苗组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末形式并且含有免疫原性有效量的HBc嵌合体，优选颗粒形式，作为活性成分.在一种典型组合物中，免疫有效量的优选HBc嵌合体颗粒为每剂大约1微克-大约1毫克活性成分，更优选每剂大约5微克-大约50微克，正如上文所公开的。
疫苗或接种物通常制剂化以用于肠胃外施用.典型的接种是通过皮下(SC)、肌内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)或皮内(ID)注射进行的.
HBc嵌合体颗粒和HBc嵌合体颗粒缀合物可以制剂化为中性或盐形式的疫苗.药学可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白或半抗原的游离氨基一起形成)，并且是与无机酸，如盐酸或磷酸，或诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸一起形成的.与游离羧基形成的盐还可以由诸如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁的无机碱衍生，以及由诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸和普鲁卡因等的有机碱衍生。
所述接种物或疫苗是以与剂量制剂相容的形式，以及治疗和免疫有效(抗体诱导量或保护量等)的量施用的.要施用的量取决于接受治疗的对象，所述对象免疫系统合成抗体的能力，以及需要保护的程度。需要施用的活性成分的确切量取决于执业医生的判断，并且对每一个个体来说有所不同。不过，合适的剂量范围是每个个体几百微克的数量级的活性成分.最初施用和加强接种的合适方案也是可以变化的，不过通常在首次施用之后间隔一定时间(数周或数月)再进行随后的注射或以其他方式施用。
一旦进行了免疫，就将宿主动物维持一段足以由所述重组HBc嵌合体免疫原诱导产生足够滴度的与M2蛋白结合的抗体的时间。用于产生抗M2抗体的维持时间通常持续大约3周-大约12周时间，并且可以包括第2次加强免疫施用所述疫苗。如果必要，还可以在首次免疫之后数周-5年内进行第3次接种.特别考虑的是，一旦达到了保护性抗体滴度水平，就可以以大约1-大约5年的间隔定期加强免疫，以便优选维持在读抗体滴度水平上或接近该抗体滴度水平上。
业已发现，可以用众所周知的技术从宿主的血液中分离所诱导的抗体，然后重配成用于被动免疫的第二种疫苗，这种技术同样是众所周知的.类似技术可用于人类的γ-球蛋白免疫.例如，可以在硫酸铵水溶液中(通常为40-50％的饱和度)沉淀来自一个或多个免疫宿主的抗血清，并且通过层析方法纯化沉淀的抗体，例如通过亲和层析纯化，其中，将M2多肽用作固定在层析柱上的抗原。
接种物是与疫苗基本相同的制备物，但是用于需要诱导针对流感的抗体，但不需要预防流感的宿主动物中。
尽管没有进一步的阐述，但认为本领域技术人员采用前面的说明书和下文的详细实施例，可以在最完全的程度利用本发明。因此，下面的优选特定实施方案应该解释为仅仅是说性的，不以任何方式限定公开的其它内容。
实施例1：制备含有B细胞表位的嵌合体
A.制备质粒载体pKK223-3N，即pKK223-3的一种修饰形式
通过建立一个独特的NcoI限制位点修饰质粒载体pKK223-3(Pharmacia)，以便能够以NcoI-HindIII限制片段形式插入HBc基因，然后在大肠杆菌宿主细胞中表达。为了修饰pKK223-3质粒载体，使用PCR引物pKK223-3/433-452-F和pKK223-NcoI-mod-R，并且用pKK223-3作模板制备一种新的SphI-HindIII片段。
用限制酶SphI和HindIII切割该PCR片段，以便得到467bp的片段，然后将该片段连接到pKK223-3裁体的4106bp片段上，以便有效取代原有的480 bp SphI-HindIII片段。因此，所得到的质粒(pKK223-3N；4573bp)比亲本质粒短了13bp，并且含有位于所导入的NcoI位点上游的修饰过的核苷酸序列(参见图2，其中，虚线表示缺少的碱基)。在图2中示出了质粒pKK223-3N中的限制位点，对pKK223-3亲本质粒进行的核苷酸改变通过下划线表示，如下文所示。
pKK223-3/433-452-F  GGTGCATGCAAGGAGATG    SEQ ID NO：49
pKK223-Ncol-mod-R
GCGAAGCTTCGGATCccatggTTTTTTCCTCCTTATGTGAAATTGT
TATCCGCTC
                                          SEQ ID NO：50
B.V2、V16和V8克隆载体的制备
通过PCR构建能够接受定向插入免疫优势环区的合成dsDNA片段的修饰过的HBc149(V2和V16)基因或HBc183(V8)基因。(接受D78和P79之间的插入片段并且截短到V149的的质粒命名为V2，在V149后有一个额外的半胱氨酸的相同质粒命名为V16，接受D78和P79之间的插入片段并且在C183终止的质粒称作V8)。用两个PCR引物对分两半扩增HBc149和HBc183基因，其中的一个引物对扩增氨基末端，而另一个引物对扩增羧基末端。对于V2，PCR反应产物是249bp(N-末端)和243bp(C-末端)片段；对于V16，产物是249bp(N-末端)和246bp(C-末端)片段；对于V8，产物是249bp(N-末端)和349bp(C-末端)片段。
用NcoI和EcoRI消化所制备的N-末端片段，并且用EcoRI和HindIII消化C-末端片段。然后通过共同的EcoRI突出端将V2、V16和V8片段对连接在一起。然后将所得到的NcoI-HindIII片段连接到pKK223-3N裁体中，读载体业已通过用NcoI和HindIII消化进行过制备。
为了将B细胞表位插入V2、V16和V8质粒，用EcoRI和SacI限制酶消化合适的质粒．然后插入舍有5′EcoRI和3′SacI突出端的合成的dsDNA片段。在所有情况下，即，V2、V16和V8中，在所插入的B细胞表位侧翼是甘氨酸-异亮氨酸(EcoRI)和谷氨酸-亮氨酸(SacI)氨基酸对。在下面的引物中在插入的限制位点下面加下划线。
V2
HBc149/NcoI-F
5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA                    SEQ ID NO：51
HBc-D78/EcoRI-R
5′-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC             SEQ ID NO：52
HBc-P79/EcoRI-SacI-F
5′-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG
                                                        SEQ ID NO：53
HBc149/HindIII-R
5′-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG            SEQ ID NO：54
V16
HBc149/NcoI-F
5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA                   SEQ ID NO：51
HBc-D78/EcoRI-R
5′-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC            SEQ ID NO：52
HBc-P79/EcoRI-SacI-F
5′-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG
                                                        SEQ ID NO：53
HBc149+C/HindIII-R
5′-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG
                                               SEQ ID No：55
V8
HBc149/NcoI-F
5′-GGGCCATGGACATCGACCCTTA            SEQ ID NO：51
HBc-D78/EcoRI-R
5′-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC   SEQ ID NO：52
HBc-P79/EcoRI-SacI-F
5′-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG
                                               SEQ ID NO：53
HBc183/HindIII-R
5′-GGAAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCG    SEQ ID NO：56
C.V34和V55克隆裁体的制备
通过PCR构建能够接受定向插入N-末端区，前核心序列LGWLWG 5′的合成dsDNA片段的修饰过的HBc149基因.(编码终止于V149的HBc序列的质粒命名为V34，而编码具有V149 C-末端的额外半胱氨酸的HBc序列的质粒命名为V55).用两个PCR引物对分两半扩增HBc149基因，其中的一个引物对扩增氨基末端，而另一个引物对扩增羧基末端．对于V34，PCR反应产物是293 bp(N-末端)和484bp(C.末端)片段；对于V55，采用了相同的N-末端片段，制备了490bp C-末端片段.
用NcoI和SacI消化通过PCR制备的N-末端片段，并且用SacI和HindIII消化C-末端片段.然后通过共同的SacI突出端将V34和V55片段对连接在一起.然后将所得到的NcoI-HindIII片段连接到pKIK23-3N裁体中，读裁体业已通过用NcoI和HindIII消化进行过制备.
通过前面对V2、V16和V8克隆裁体描述的相同程序完成含B细胞表位的插入。在下面的寡核苷酸引物中在限制位点下面加下划线。
V34/V45
pKK-BamHI-F
5’-GCGGATCCGGAGCTTATCGA                 SEQ ID NO：57
HBc-NcoI/EcoRI/SacI-R
5’-GCGGAGCTCTTTTTGAATTCCCATGGTTTTTTCCTCCTTAT
                                                  SEQ ID NO：58
PreC-SacI-HBc-F
5’GCGGAGCTCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATTGACATCGACCCTTATAAAG
                                                  SEQ ID NO：59
V34
HBc149/HindIII-R
5′-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG      SEQ ID NO：54
V55
HBc149+C/HindIII-R
5’-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG
                                                  SEQ ID NO：55
D.V47、V48和V54克隆载体的制备
通过PCR构建能够接受定向插入氨基酸残基I3和D4之间的N-末端区的合成dsDNA片段的修饰过的HBc149和HBc183基因。(编码终止于V149的HBc嵌合体的质粒命名为V47，编码具有位于V149C-末端的额外半胱氨酸的HBc嵌合体的质粒命名为V54，编码终止于C183的HBc嵌合体的质粒命名为V48)。对于V47、V48和V54，用PCR引物对从模板HBc149扩增氨基末端片段，包括HBc基因前的序列。得到的PCR片段具有190bp。对于V47的C-末端片段，用PCR引物对扩增HBc基因，得到一个469bp片段；对于V54，C-末端片段是475bp。对于V48的C-末端，用PCR引物对扩增HBc183基因，得到一个574bp片段。
用于此处的克隆程序与前面对克隆载体V43和V55的描述相同。
为了将异源序列插入V47、V48和V54质粒，首先用NcoI和SacI限制酶消化质粒。然后插入含有5′AflIII和3′SacI突出端的合成dsDNA片段(注意，限制酶AflIII和NcoI留下了相容突出端)。在所有情况下，即V47、V48和V54中，HBc残基D2和13都缺失，以便异源免疫原性序列直接位于残基M1后；由SacI限制位点编码的谷氨酸-亮氨酸(EL)氨基酸对位于插入的表位后。在下面的寡核苷酸引物中在限制位点下面加下划线。
V47/V48/V54
pKK(167-150)-F
5’-GCATAATTCGTGTCGCTC                               SEQ ID NO：60
HBc-I3/EcoRI-R
5’GCGGAATTCCGATGTCCATGGTTTTTTCCT           SEQ ID NO：61
HBc-EcoRI/SacI/D4-F
5’GCGGAATTCAAAAAGAGCTCGACCCTTATAAAGAATTTGGA
                                                     SEQ ID NO：62
V47
HBc149/HindIII-R
5′-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG
                                        SEQ ID NO：54
HBc149+C/HindIII-R
5’-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG
                                        SEQ ID NO：55
E.V7克隆裁体的制备
为了能够将T细胞表位融合在HBc嵌合体的C-末端，构建了一种新的载体V7。将独特的EcoRI和SacI限制位点插入149号缬氨酸和HindIII位点之间，以便将合成的dsDNAs定向插入EcoRI-HindIII(或EcoRI-SacI)限制位点。使用下面的PCR引物对扩增在氨基末端具有NcoI限制位点，并且在羧基末端具有EcoRI、SacI和HindIII位点的HBC149基因。用NcoI/HindIII消化PCR反应的产物(479bp)，并且克隆到pKK223-3N中，以便形成V7。
为了插入T细胞表位，用EcoRI/HindIII(或EcoRI-SacI)消化质粒(V7)，将具有EcoRI/HindIII(或EcoRI/SacI)突出端的合成dsDNA片段连接到V7中。对于所有V7构建体来说，天然HBc的最后一个氨基酸(149号缬氨酸)和插入的T细胞表位的第一个氨基酸由形成EcoRI限制位点的核苷酸编码的甘氨酸-异亮氨酸二肽序列隔开。对于插入EcoRI/SacI位点的表位来说，由于有SacI位点，在T细胞表位之后，在终止密码子之前还存在额外的谷氨酸-亮氨酸残基。同样在所示出的限制位点下面加下划线。
HBc149/NcoI-F
5′-TGGGCCATGGACATCGACCCTTA                   SEQ ID NO：51
HBc149/SacI-EcoRI-H3-R
5′-CGCAAGCTTAGAGCTCTTGAATTCCAACAACAGTAGTCTCCG
                                                   SEQ ID NO：63
F.合成用于表达部分截短的颗粒的表达载体
为了制备用于截短的HBc颗粒的表达质粒，将单个氨基酸末端寡核苷酸PCR引物(HBc149/NcoI-F)与独特的C-末端引物一起使用。例如，为了制备HBc156(E.cR)表达质粒，使用了引物HBc149/NcoI-F和HBc156(E.cR)-H3-R。为了制备HBc156(E.cR)+C表达质粒，使用了引物HBc149/NcoI-F和HBc156C(E.cR)-H3-R。除了截短颗粒，并且在某些情况下掺入C-末端半胱氨酸残基，也使用了对于在大肠杆菌中表达来说最优的密码子。为了顺序替代天然HBc中存在的罕见精氨酸密码子，首先合成HBc156基因，然后用作HBc163构建体的模板；然后将HBc163构建体用作HBc171构建体的模板。下文示出了所有引物的序列。用限制酶NcoI和HindIII切割所有PCR产物，克隆到表达载体pKK223-3N中，该载体已经用相同的酶进行过切割。
HBc149/NcoI-F
5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA               SEQ ID NO：51
HBc156(E.cR)-H3-R
5’-GCGAAGCTTACTAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGTCTCCGG
                                                    SEQ ID NO：64
HBc156C(E.cR)-H3-R
5’-
GCGAAGCTTACTAACAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTA
GTCTCCGG                                           SEQ ID NO：65
HBc163(E.cR)-H3-R
5’-
GCGAAGCTTACTAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGC
GGCCTCG                                  SEQ ID NO：66
HBc163c(E.cR)-H3-R
5’-
GCGAAGCTTACTAACAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGG
AGCGGCCTCG                                SEQ ID NO：67
HBc(EcR)-H3-R
5’-
 GCGAAGCTTACTAACAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGG
AGCGGCCTCG                                SEQ ID NO：68
HBc171C(E.cR)-H3-R
5’-
GCGAAGCTTACTAACACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAG
GCGAGGGAGT                                SEQ ID NO：69
  克隆编号     克隆名称        
  CV-1600      HBc156(E.cR)      
  CV-1601      HBc156(E.cR)+C    
  CV-1632      HBc163(E.cR)+C    
  CV-1634      HBc163(E.cR)      
  CV-1642      HBc171(E.cR)      
  CV-1643      HBc171(E.cR)+C    
实施例2：制备含有甲型流感M2多肽序列的嵌合体
A.将甲型流感M2 N-末端结构域插入V2、V7、V8、V16、V34、V47、V48、V54和V55克隆裁体
对于V2、V7、V8、V16、V34和V55构建体，将编码M2e-序列(甲型流感M2蛋白的2-24号残基；；SEQ ID NO：9)的合成dsDNA片段插入EcoRI/SacI限制位点，而对于V47、V48和V54构建体，将相同M2蛋白的1-24号残基插入NcoI/SacI限制位点。在等摩尔浓度下混合互补的单链DNA寡核苷酸，加热到95℃5分钟，然后以-1℃/分钟的速度冷却到室温，从而制备合成dsDNA片段．在TE缓冲液中进行退火反应。下文示出了双链DNAs，上面是编码的表位序列。
 V2/V7/V8/V16/V34/V55      
M2(2-24)
 I  S  L  L  T  E  V  E  T  P  I  R  N  E  W  G  C  R
AATTAGCCTGTTAACCGAAGTGGAGACGCCGATCCGTAACGAATGGGGCTGCCG
    TCGGACAATTGGCTTCACCTCTGCGGCTAGGCATTGCTTACCCCGACGGC
            C  N  D  S  S  D  E  L       SEQ ID NO：70
          CTGTAATGATTCTTCCGACGAGCT       SEQ ID NO：71
          GACATTACTAAGAAGGCTGC           SEQ ID NO：72
 V47/V48/V54      
M2(1-24)
  M  S  L  L  T  E  V  E  T  P  I  R  N  E  W  G  C  R
CATGTCTCTGCTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGA
    AGAGACGACTGGCTTCAACTTTGGGGATAGTCTTTGCTTACCCCCACGTCT
           C  N  D  S  S  D  E  L         SEQ ID NO：73
           TGTAACGATTCAAGTGATGAGCT        SEQ ID NO：74
           ACATTGCTAAGTTCACTAC            SEQ ID NO：75
B.将各个半胱氨酸突变的甲型流感M2 N-末端结构域[M2(1-24/C17S)、M2(1-24/C19S)]插入V47表达载体
下文示出了编码M2蛋白的1-24号残基的退火的DNA片段，所述残基中笫17或19位的半胱氨酸突变为丝氨酸。按照上文A部分所述，将它们插入V47的NcoI/SacI限制位点。
V47      
M2(1-24/Cl7S)
  M  S  L  L  T  E  V  E  T  P  I  R  N  E  W  G  S  R
CATGTCTCTGCTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCAGAAACGAATGGGGGTCTAGA
    AGAGACGACTGGCTTCAACTTTGGGGATAGTCTTTGCTTACCCCCAGATCT
           C  N  D  S  S  D  E  L        SEQ ID NO：76
           TGTAACGATTCAAGTGATGAGCT       SEQ ID NO：77
           ACATTGCTAAGTTCACTAC           SEQ ID NO：78
M2(1-24/C196)
    M  S  L  L  T  E  V  E  T  P  I  R  N  E  W  G  C  R
CATGTCTCTGCTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGA
   AGAGACGACTGGCTTCAACTTTGGGGATAGTCTTTGCTTACCCCCACGTCT
        S  N  D  S  S  D  E  L          SEQ ID NO：79
      TCGAACGATTCAAGTGATGAGCT           SEQ ID NO：80
      AGCTTGCTAAGTTCACTAC               SEQ ID NO：81
C.将半胱氨酸突变的甲型流感M2 N-末端结构域[M2(2-24/C17S，C19S)]插入表达载体V8、V16、V47、V48和V54
对于V8和V16构建体，将具有两个半胱氨酸到丝氨酸的突变，并且编码M2e免疫原性序列(甲型流感M2蛋白的1-24号残基)的合成dsDNA片段插入EcoRI/SacI限制位点，而对于V47、V48和V54构建体，将相同序列的1-24号残基插入NcoI/SacI位点。按照上文A部分的描述制备合成dsDNA。
V8，V16
M2(2-24/C17S，C19S)
  I  S  L  L  T  E  V  E  T  P  I  R  N  E  W  G  S  R
AATTTCTCTGTTAACCGAAGTGGAGACGCCGATTCGTAACGAATGGGGTAGCCGC
    AGAGACAATTGGCTTCACCTCTGCGGCTAAGCATTGCTTACCCCATCGGCG
  S  N  D  S  S  D  E  L                  SEQ ID NO：82
TCTAATGATAGCTCTGACGAGCT                   SEQ ID NO：83
AGATTACTATCGAGACTGC                       SEQ ID NO：84
M2(1-24/C17S，C19S)
  M  S  L  L  T  E  V  E  T  P  I  R  N  E  W  G  S  R
CATGTCTCTGCTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCAGAAACGAATGGGGGTCTAGA
    AGAGACGACTGGCTTCAACTTTGGGGATAGTCTTTGCTTACCCCCAGATCT
        S  N  D  S  S  D  E  L            SEQ ID NO：85
      TCGAACGATTCAAGTGATGAGCT             SEQ ID NO：86
      AGCTTGCTAAGTTCACTAC                 SEQ ID NO：87
D.将额外拷贝的甲型流感M2结构域插入表达裁体V54.M2(1-24)的N-末端的N-末端
将一个额外拷贝的天然M2序列[M2(1-24)1或突变M2序列[M2(1-24/C17S，C19S)克隆到存在的M2(1-24)序列的N-末端。在构建这些克隆时，除去了原始的甲硫氨酸，使得添加的拷贝仅仅提供一个起始甲硫氨酸。用PCR制备两个片段的构建体．为了制备舍有两个天然M2拷贝[M2(1-24)N54.M2(2-24)]的克隆，用模板V54.M2(1-24)扩增第一个N-末端片段，该片段将XhoI位点(因此，氨基酸亮氨酸，后面是谷氨酸)插入到M2序列的D24后(得到的片段是353bp)，然后是C-末端片段，它将XhoI位点插入M2序列的S2的N-末端，从而除去甲硫氨酸(得到的片段是538bp)。为了制备含有位于天然拷贝的M2[M2(1-24/C17S，C19S/V54.M2(2-24)])之前的突变的克隆，用模板V54.M2(1-24/C17S，C19S)制备N-末端片段，而C-末端片段与上文所述相同(得到的片段大小也是相同的)。
用BamHI和XhoI消化制备的N-末端片段，用XhoI和HindIII消化C-末端片段。然后在共有的XhoI突出端将片段对连接在一起。然后将得到的BamHI-HindIII片段连接到pKK223-3N载体中，该裁体是通过用BamHI和HindIII消化而制备的。
将两个额外拷贝的突变M2序列克隆到存在的M2(2-24)序列的N-末端。仍然仅仅在基因的第1号位置保留了一个起始甲硫氨酸，以产生构建体M2(1-24/C17S，C19S/M2(2-24/C17S，C19S/V54.M2(2-24)。同样，产生了两个PCR片段的克隆。用模板V54.M2(1-24，C17S，C19S)产生N-末端片段，该片段将PstI位点(因此，氨基酸亮氨酸，后面是谷氨酸)插入到突变M2序列的残基D24后(得到的片段是353bp)．用上文所述模板M2(1-24/C17S，C19S/V54.M2(2-24)产生C-末端片段，该片段将PstI位点插入突变M2序列的S2的N-末端，从而除去了甲硫氨酸(得到的片段是613bp)。
用BamHI和PstI消化制备的N-末端片段，用PstI和HindIII消化C-末端片段。然后在共有的PstI突出端将片段对连接在一起。然后将得到的BamHI-HindIII片段连接到pKK223-3N裁体中，读载体已经通过用BamHI和HindIII消化而进行了制备。
M2(1-24)/V54.M2(2-24)；M2(1-24/C17S，C19S/V54.M2(2-24)
pKK-BamHI-F
5’-CGTAGAGGATCCGGAGCTTATCGACTGCACGG    SEQ ID NO：88
M2-D24/XhoI-R
5’-GCGCTCGAGATCACTTGAATCGTT            SEQ ID NO：89
M2-XhoI/S2-F
5’-GCGCTCGAGAGCTTATTGACCGAAGTTGAAACC
                                                 SEQ ID NO：90
HBc149+C/HindIII-R
5’CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG
                                          SEQ ID NO：55
M2(1-24/C17S，C19S)/M2(2-24/C17S，C19S)/V54.M2(2-24)
pKK-BamHI-F
5’CGTAGAGGATCCGGAGCTTATCGACTGCACGG       SEQ ID NO：57
M2-D24/PstI-R
5’-GCGCTGCAGATCACTTGAATCGTT              SEQ ID NO：91
M2-PstI/S2-F
5’GCGCTGCAGTCTCTGCTGACCGAAG              SEQ ID NO：92
HBc149+C/HindIII-R
5’CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG
                                          SEQ ID NO：55
E.构建天然M2-HBc的截短形式
将含有183个残基的全长HBc序列的初始M2-HBc构建体[Neirynck et al.，(October 1999)Nature Med.，5(10)：1157-1163：WO99/07839]截短到V149，将整个基因转移到pKK223-3表达裁体中。为此，将Gent大学提供的质粒3453用作PCR反应的模板，该反应产生523bp的产物．用限制酶AflIII和HindIII消化产物，然后连接到pKK223-3N裁体中，该载体已经通过用NcoI和HindIII消化而进行了制备。
AflIII-M2-F
5’CGCGACATGTCTCTGCTGACCG                  SEQ ID NO：93
HBc149-HindIII-R
5’CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG         SEQ ID NO：54
 
克隆编号   克隆名称
CV-1438    V34.M2(2-24)
CV-1440    V2.M2(2-24)
CV-1475 V16.M2(2-24)
CV-1492 V52.M2(2-24)
CV-1560 3453/149
CV-1569 V16.M2(1-24/C17S，C19S)
CV-1586 V8.M2(2-24)
CV-1587 V8.M2(1-24/C17S，C19S)
CV-1588 V7.M2(2-24)
CV-1590 V47.M2(1-24)
CV-1603 V47.M2(1-24/C17S，C19S)
CV-1604 V54.M2(1-24)
CV-1605 V54.M2(1-24/C17S，C19S)
CV-1606 V48.M2(1-24)
CV-1607 V48.M2(1-24/C17S，C19S)
CV-1671 V47.M2(1-24/C17S)
CV-1672 V47.M2(1-24/C19S)
CV-1816 M2(1-24)/V54.M2(2-24)
CV-1817 M2(1-24/C17S，C19S/V54.M2(2-24)
CV-1818 M2(1-24/C17S，C19S)/M2(2-24/C17S，C19S)/V54.M2(2-24)
实施例3：测定程序
A.抗原性
1.颗粒ELISA
用包被缓冲液(50mM碳酸氢钠，pH9.6)将纯化的颗粒稀释到10μg/mL的浓度，并且包被到ELISA条或板的孔中(50μL/孔).在室温下将所述ELISA条温育过夜(大约18小时).第二天上午用ELISA洗涤缓冲液[磷酸缓冲的盐溶液(PBS)，pH7.4，0.05％洗涤所述孔，并且用溶解在PBS中的3％BSA封闭1小时(75μL/孔)。干燥ELISA条，并且在-20℃下保存待用。
为了测定颗粒的抗原性，用溶解在PBS中的1％BSA稀释抗血清，并且以50微升/孔的用量添加到抗原包被的ELISA孔中。温育血清1小时，用ELISA洗涤缓冲液(上文所述)洗涤，并且用抗小鼠(IgG)-HRP(The Binding Site，San Diego，CA；HRP＝辣根过氧化物酶)缀合物(50μL/孔)或其他合适的第二抗体探测30分钟。在用ELISA洗涤缓冲液洗涤之后，通过添加TM蓝底物(50μL/孔)观察所述反应.10分钟之后，通过添加1N H2SO4(100μL/孔)终止该反应，并且在设定为450nm的波长下在ELISA平板读数器上读数。
2.合成肽ELISA
用包被缓冲液(50mM碳酸氢钠，pH9.6)将具有24个氨基酸残基的合成肽M2稀释到2微克/毫升的浓度，并且包被到ELISA条的孔中(50μL/孔).通过在通风厨排风状态下温育过夜(大约18小时)，将肽干燥在所述孔上.第二天上午，用ELISA洗涤缓冲液(磷酸缓冲的盐溶液，pH7.4，0.05％
Figure S04841451420060811D000591
洗涤所述孔，并且用溶解在PBS中的3％BSA封闭(75μL/孔)1小时.干燥ELISA条，并且在-20℃下保存待用。
为了测定颗粒的抗体结合，用溶解在PBS中的1％BSA稀释抗血清(单克隆或多克隆抗血清)，并且以50μL/孔的用量添加到抗原包被的ELISA孔中.温育血清1小时，用ELISA洗涤缓冲液洗涤，并且用抗小鼠(IgG)-HRP缀合物或其他合适的第二抗体(与前面相同，用量为50μL/孔)探测30分钟，再次用ELISA洗涤缓冲液洗涤，然后通过添加TM蓝底物(50μL/孔)观察。10分钟之后，通过添加1N H2SO4(100μL/孔)终止该反应，并且在设定为450nm的波长下用ELISA平板读数器读数。
B.颗粒的免疫原性
为了测定颗粒的免疫原性，用选择的佐剂中的10微克颗粒对小鼠进行IP免疫，并且以3周的间隔用相同佐剂中的10微克颗粒进行一次或两次加强.每次免疫后2、4、6和8周时对小鼠取血。
实施例4：确定280∶260吸光度比值
为了确定纯化颗粒的280∶260吸光度比值，在20nM磷酸钠缓冲液，pH6.8中将颗粒稀释到大约0.2mg/mL的浓度，并且在260nm和280nm的波长下测定吸光度值。用在280nm波长下测定的吸光度值除以在260nm波长下测定的吸光度值，以确定280∶260比值。下面的表1中示出了用若干种样品，包括天然颗粒(HBc183)、在149号残基位置之后截短的HBc颗粒(HBc149)、以及在本文的其他部分鉴定的若干种HBc嵌合体获得的比值.全长颗粒ICC-1559是首先在Neirynck et al.，(Oct 1999)Nature Med.，5(10)：1157-1163和专利申请WO9907839中报道的颗粒制备物，而全长颗粒ICC-1607是相似的颗粒，其中M2多肽第17和19位的半胱氨酸(SEQ ID NO：9的X17和X19)突变为丝氨酸残基。
表1
 
颗粒编号 全长(F)或C-末端截短的(T) 280∶260吸光度比值
HBc183CV-1532 F 0.84
HBc149 T 1.59
CV-1438 T 1.57
CV-1440 T NT
CV-1475 T 1.04
CV-1492 T 1.33
＊CV-1559＊ F 0.68
CV-1560 T 1.36
CV-1569 T 1.38
CV-1588 T 1.16
CV-1590 T 1.51
CV-1603 T 1.68
CV-1604 T 1.40
CV-1605 T 1.26
CV-1607 F 0.73
CV-1600 T 1.23
CV-1601 T 1.12
CV-1634 T 0.92
CV-1632 T 0.96
CV-1642 T 0.79
CV-1643 T 0.77
CV-1671 T NT
CV-1672 T 1.27
NT，未检测.＊CV-1159与Neirynck，1999描述的IM2-HBc相同
实施例5：热稳定性方案
用50mM NaPO4，pH6.8将纯化的颗粒稀释到1mg/mL的浓度，并且添加最终浓度为0.02％的叠氮化钠，以便抑制细菌生长。将样品SDS-PAGE样品缓冲液(还原性)混合，并且在15％SDS-PAGE凝胶上电泳。用考马斯亮蓝对凝胶进行染色，然后分析。
实施例6：杂合颗粒的分析凝胶过滤分析
用25mL6HR 10/30层析柱(Amersham Pharmacia #17-0537-01)和BioCADTM SPRINT Perfusion层析系统对纯化的杂合HBc颗粒进行分析凝胶过滤分析.将UV检测仪设定为监测280nm的波长.用3倍柱体积(CV；大约75mL)的缓冲液(50mM NaPO4，pH6.8)以0.75mL/分钟的流速平衡读柱。
用50mM NaPO4，pH6.8将待分析的颗粒稀释到浓度为1mg/mL。然后将200微升(μL)样品加样到200μL的环上，并且注射到所述柱上.用50mM NaPO4，pH6.8以0.75mL/分钟的流速将所述样品从读柱上洗脱。
用上述程序分析若干种含有C-末端半胱氨酸残基的颗粒或不含所述半胱氨酸的类似颗粒。用BioCADTM软件(PerSeptiveTM)整合280nm轨迹，以便提供结果。
实施例7：流感M2构建体
最近，Neirynck et al.，(Oct 1999)Nature Med.，5(10)：1157-1163和WO 99/07839报道了M2的24个氨基酸的细胞外结构域与缺乏1-4号氨基酸残基的全长HBc颗粒(HBc183)的融合。这里称作IM2HBc的该构建体的示意图示于下文，其中24聚体与HBc的N-末端连接。
IM2HBc
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-HBc(5-183)
                                     SEQ ID NO：94
在一种说明性的制备物中，将M2表位插入乙型肝炎核心的免疫优势环，用前面对插入和纯化讨论的技术成功表达和纯化了称作ICC-1475的颗粒.也在免疫优势环中表达了突变形式的M2表位，其中M2天然位置17和19的两个半胱氨酸残基被丙氨酸残基取代(ICC-1473颗粒)，并且纯化得到的颗粒.下文示意地说明了这两种颗粒。
ICC-1475
HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-EL-HRc(79-149)
                                            SEQ ID NO：95
ICC-1473
HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGARANDSSD-EL-HBc(79-149)-C
                                             SEQ ID NO：96
ICC-1473颗粒构建体产生了比天然序列(ICC-1475)多大约7倍的纯化的颗粒。仍然需要确定半胱氨酸残基的突变是否改变了颗粒的保护潜能.但是，在HBc的免疫优势环上送递的表位通常比它们与其它区域(包括N-末端)融合时显著更具有免疫原性，并且得到的颗粒表现出减少的抗HBc免疫原性。
已经制备了这样的颗粒，其中M2N-末端24聚体序列与C-末端截短的乙型肝炎核心颗粒的N-末端融合.读构建体(ICC-1438)也包含N-末端前核心序列(SEQ ID NO：66)。制备了相似的构建体，其在杂合蛋白(ICC-1492)的末端含有单个半胱氨酸残基，在此情况下，位于HBc基因的Val-149后面。这些构建体示意地示于下文。
ICC-1438
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149)
                                           SEQ ID NO：97
ICC-1492
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149)-C
                                         SEQ ID NO：98
应当注意，为了防止从天然HBc起始甲硫氨酸起始翻译，对读残基的密码子进行突变，以编码异亮氨酸残基.由EcoRI(GI)和SacI(EL)限制位点贡献的残基用下划线表示.前核心序列位于加下划线的EL残基和″-HBc(2-149)″之间。
通过本文中其它地方讨论的SDS-PAGE进行分析，在图10中显示了在制备后，与ICC-1492(泳道3)相比，ICC-1438单体构建体是不稳定的(泳道2)，其中采用HBc-149(泳道1)，ICC-1475(泳道4)和ICC-1473(泳道5)作为SDS-PAGE凝胶上的额外分子量对照。采用颗粒的分析凝胶过滤时，ICC-1438单体的不稳定性不明显。
预期ICC-1475(图10，泳道4)和ICC-1473(图10，泳道5)都比ICC-1438和ICC-1492具有略低的分子量，因为前两者含有直接插入免疫优势环中的M2序列，因此缺乏ICC-1438和ICC-1498中存在的前核心序列(SEQ ID NO：66)。正如所预期的，ICC-1492比ICC-1475和ICC-1473大；但是，除C-末端残基之外与ICC-1492相同的ICC-1438，由于明显的切割，明确地不大于ICC-1475和ICC-1473。
也涉及了这样的构建体，其含有与HBc N-末端(结构域I)或环(结构域II)连接的如上文所讨论的M2 N-末端细胞外结构域，并且也含有位于HBc的C-末端(结构域IV)的半胱氨酸残基。
为了修饰含有免疫优势环融合体的杂合HBc颗粒的氨基末端以掺入半胱氨酸残基和最小的来源于M2的序列，合成了一系列的合成寡核苷酸。为了制备V2.Pf1(N-M2(17-24/C17S)，将寡核苷酸M2(17-24/C17S)-NcoI-F和HBc149/HindIII-R用于扩增来自裁体V2.Pf1的杂合HBc基因。用NcoI和HindIII切割得到的546bp片段并且插入已经用相同的两种酶切割的pKK-223-3N中。
为了制备V2.Pf1(N-M2(17-24/C19S)，将寡核苷酸M2(17-24/C19S)-NcoI-F和HBc149/HindIII-R用于扩增裁体V2.Pf1中的杂合HBc基因。用NcoI和HindIII切割得到的540bp片段并且插入已经用相同的两种酶切割的pKK-223-3N中。
M2(17-24/C178)-NcoI-F
       M  G  S  R  C  N  D  S  S  D  I  D  P  Y  K  E  F  G
GGCGCCATGGGGTCTAGATGTAACGATTCAAGTGACATCGACCCTTATAAAGAATTTCG
                                                       SEQ ID NO：99
                                                       SEQ ID NO：100
M2(17-24/C19S)-NcoI-F
       M  G  C  N  D  S  S  D  I  D  P  Y  K  E  F  G
                                                       SEQ ID NO：101
GCGCCATGGGGTGTAACGATTCAAGTGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGG
                                                       SEQ ID NO：102
实施例8：具有和不具有N-和-末端半胱氨酸残基的HBc嵌合体分子
制备了一系列含有HBc嵌合体分子的颗粒，其含有通过肽键连接在C-末端在149号残基截短的HBc的N-末端或读N-末端附近的甲型流感M2蛋白的1-24号残基.作为组成成分的嵌合体蛋白分子含有不同的N-末端序列，其包含M2序列或变体，一些包含C-末端半胱氨酸残基。
通过分析大小排阻层析，分析下文表2中列出的所有纯化颗粒，以评估在纯化后颗粒状结构的保留.不含N-末端半胱氨酸残基的称作ICC-1603的颗粒，表现出分散回到亚颗粒状结构的迹象(图3)，因为在1500秒范围洗脱蛋白(正确形成的颗粒在大约1000秒洗脱)。
颗粒ICC-1590的相似分析表明，该构建体在纯化后保持了颗粒状，在大约1000秒发生洗脱，这是杂合颗粒的典型表现(图4)，所述ICC-1590与ICC-1603 ICC-颗粒相似，但N-末端M2序列中的两个丝氨酸残基突变为半胱氨酸残基.ICC-1590没有分散的迹象.
ICC-1560颗粒的分析表明，尽管表现出了一定程度的分散(图5)，但该颗粒在纯化后也是颗粒状，表明稳定化不如ICC-1590颗粒那么强，所述ICC-1560颗粒的嵌合蛋白也具有两个N-末端半胱氨酸残基。比较ICC-1590和ICC-1560的N-末端构型(下文表2)，表明ICC-1560颗粒中两个半胱氨酸残基的相对位置通过缺失3个氨基酸残基(DEL)相对于ICC-1590颗粒移动了3个氨基酸残基，表明半胱氨酸残基可能需要距离核心基因的起始处距离最小，以进行最优化的交联.
实施例9：具有M2或M2变体序列和C-末端半胱氨酸残基的颗粒
在图3中示出了在纯化后迅速分散的ICC-1603颗粒.包含ICC-1605颗粒的HBc嵌合体分子与包含ICC-1603颗粒的那些相似，只是1605成分嵌合体分子具有单个C-末端稳定性半胱氨酸.制备了质粒以指导ICC-1605颗粒的表达，以便研究将C-末端半胱氨酸残基加入ICC-1603颗粒是否能够给颗粒赋予更强的稳定性.在纯化后，用分析大小排阻层析分析ICC-1605颗粒(图6)。
该研究的结果证明了颗粒稳定化比ICC-1603颗粒更完全，但与含有两个氨基末端半胱氨酸残基并且不含C-末端稳定性半胱氨酸的ICC-1590相比是不完全的.尽管显著量的ICC-1605保持为颗粒状，存在在宽范围洗脱的亚颗粒状结构的异质混合物的迹象。这些观察结果表明，对于该杂合颗粒(ICC-1603)，在ICC-1605颗粒中发现的C-末端稳定化没有在ICC-1590颗粒中发现的N-末端稳定化完全。
为了研究杂合颗粒的组合氨基和羧基末端半胱氨酸稳定化的相容性，构建了表达质粒以指导ICC-1604颗粒的表达。ICC-1604颗粒的成分嵌合体分子含有天然M2多肽序列中存在的两个氨基末端稳定性半胱氨酸残基(如同在ICC-1590中)和C-末端稳定性半胱氨酸(如同在ICC-1605颗粒中).ICC-1604颗粒的分析表明它们在纯化后保留了均质颗粒状态(图7)，表明两种稳定方法是互补的，并且可以彼此协同使用。
用颗粒ICC-1438和ICC-1492研究了HBc N-末端和N-末端半胱氨酸残基之间的其它接头序列.这些颗粒都含有M2融合体和HBc的氨基酸D4之间的氨基酸序列ELLGWLWGIDI(SEQ ID NO：103)。氨基酸残基LGWLWGIDI来源于前核心的-6位氨基酸到HBc的氨基酸I3，HBc的起始密码子突变为异亮氨酸，以防止从该位置起始翻译(其将破坏研究).HB前核心序列包含-7位的半胱氨酸。
这些颗粒的差异仅仅在于以下事实，即ICC-1438成分嵌合体分子终止于HBc的149位，而ICC-1492成分嵌合体分子终止于HBc的149位，并且含有相对于SEQ ID NO：1的HBc的150位的末端半胱氨酸。当采用替代的但与上文讨论的相似的方法，通过分析凝胶过滤进行分析，从而在大约10分钟时洗脱颗粒时，表明在纯化后两种构建体都是颗粒状的(图8中的ICC-1438和图10中的ICC-1492)。该研究证明了截短的颗粒的氨基和羧基末端半胱氨酸稳定化的相容性，以及氨基酸序列中的显著变化性和N-末端半胱氨酸残基和HBc基因起始处之间的距离的耐受性.来自一些研究的数据示于下文表2A、2B和2C。
表2A
 
构建体编号 N-末端融合 HBcN-末端起始 M2和HBc之间的残基 C-末端 结合的核酸 C-末端稳定性半胱氨酸
ICC-1438 M2(2-24) D2 ELLGWLWGI 149 否 否
ICC-1492 M2(2-24) D2 ELLGWLWGI 149 否 是(C150)
ICC-1560 M2(1-24) D4 无 149 否 否
ICC-1590 M2(1-24) D4 EL 149 否 否
ICC-1603 M2(1-24)(2C>2S) D4 EL 149 否 否
ICC-1604 M2(1-24) D4 EL 149 否 是(C150)
ICC-1605 M2(1-24)(2C>2S) D4 EL 149 否 是(C150)
ICC-1606 M2(1-24) D4 EL 183 是 是(C183)
ICC-1607 M2(1-24)(2C>2S) D4 EL 183 是 是(C183)
ICC-1671 M2(1-24)(C17S) D4 EL 149 否 否
ICC-1672 M2(1-24)(C19S) D4 EL 149 否 否
ICC-1816 M2(1-24)/LE/M2(2-24) D4 EL 149 否 是(C150)
ICC-1817 M2(1-24)(2C>2S)/LE/M2(2-24) D4 EL 149 否 是(C150)
 
ICC-1818 M2(1-24)(2C>2S)/LQ/M2(2-24)(2C>2S)/LE/M2(2-24) D4 EL 149 否 是(C150)
表2B
 
构建体编号 环融合 5’/3’融合侧翼序列 C-末端 结合的核酸 C-末端稳定性半胱氨酸
ICC-1440 M2(2-24) GI/EL 149 否 否
ICC-1475 M2(2-24) GI/EL 149 否 是(C150)
ICC-1569 M2(2-24)(2C>2S) GI/EL 149 否 是(C150)
ICC-1586 M2(2-24) GI/EL 183 是 是(C183)
ICC-1587 M2(2-24)(2C>2S) GI/EL 183 是 是(C183)
表2C
 
构建体编号 C-末端融合 HBc C-末端 M2和HBc之间的残基 C-末端 结合的核酸 C-末端稳定性半胱氨酸
ICC-1588 M2(2-24) V149 GI (M2)EL 否 否
下文表3显示了说明HbeAg的N-末端的构型的比对以及具有N-末端融合的颗粒.根据所有构建体都共有的从SEQ ID NO：1的HBc的N-末端开始的第4位氨基酸残基进行序列比对.当存在N-末端半胱氨酸残基时，用下划线表示。
                        表3
构建体名称　　　　　　　序列　　　　　　　SEQ ID NO
HBeAg
                           SKLCLGWLLWGMDID                        103
ICC-1438/ICC-1492
  MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGIDID                 104
ICC-1560
                  MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD               105
ICC-1590/ICC-1604/ICC-1606
             MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELD                 106
ICC-1603/ICC-1605/ICC-1607
             MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDELD                                   107
ICC-1671
             MSLLTEVETPIRNEWGSRCNDSSDELD                          108
ICC-1672
             MSLLTEVETPIRNEWGCRSNDSSDELD                          109
ICC-1816
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDLESLLTEVET-
                                        PIRNEWGCRCSSDELD 110
ICC-1817
MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDLESLLTEVETPIRN-
                       EWGCRCNDSSDELD                    111
ICC-1818
MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDLQSLLTEVETPIRN-
     EWGSRSNDSSDLESLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELD             112
下文表4提供了评估含有N-末端甲型流感M2序列或此处涉及的变体的颗粒的稳定性的结果列表．如此处所显示的，从含有位于相对于SEQ ID NO：1的HBc序列的N-末端的负14(-14)位到大约N-末端本身的半胱氨酸残基的HBc嵌合体分子制备了稳定的颗粒.
表4
*从第二个N-末端M2拷贝
实施例10：含M2的颗粒的产率和核酸结合
产率表示为从500mL培养物纯化的颗粒的毫克数.通过测量纯化颗粒的A280∶A260比值确定结合的核酸的存在.超过1.0的比值表明没有结合的核酸，小于1.0的比值表明结合的核酸的存在.Fiers和同事描述的最初的全长IM2HBc与ICC-1559相同[Neirynck et al.，(1999)Nat.Med，5(10)：1157-1163和专利申请WO9907839].
实施例11：多种含M2颗粒的抗原性
用ELISA检验多种颗粒对单克隆抗体14C2的抗原性。为了确保颗粒保持它们的天然构象，首先用多克隆抗体(兔)包被ELISA板以捕获颗粒，然后用14C2单克隆抗体或对HBc颗粒的免疫优势环区具有特异性的两种抗HBc单克隆抗体的多种稀释液对其进行探测。下文表中提供的数据，证明了相对于在N-末端的呈递，M2e在HBc的免疫优势环中的呈递不显著改变M2e表位对14C2单克隆抗体的可接近性(IM2HBc/ICC-1559和ICC-1604)。这些观察结果并不出乎意料，因为它已经证明了142C与M2e的内部区域结合(与N末端相对的M2的氨基酸8、10、11和14[Zebedee et al.，(1988)J.ViroL，62(8)：2762-2772])。
此外，除ICC-1569以外，所有颗粒都保持对抗HBc单克隆抗体3120和3105的抗原性。3105的识别丧失是以前对具有插入到免疫优势环中的序列的颗粒观察到的现象，这通常翻译为免疫后这些颗粒的抗HBc应答降低。单克隆抗体3105和3120是从日本的Tokyo Institute ofImmunology购买的。
实施例12：多种含M2颗粒的免疫原性
在小鼠中研究ICC-1604和ICC-1569颗粒的免疫原性.两种颗粒之间的抗M2e滴度差异很小，而在两种颗粒之间观察到了抗HBc滴度的差异。具有天然免疫优势环的ICC-1604颗粒，类似于IM2HBc，引发了比ICC-1569颗粒高大约100倍的抗HBc滴度.这些数据再次强调了以下事实，即通过导致HBc单克隆抗体3105的识别丧失的表位插入，破坏了HBc的免疫优势环，从而显著减少了抗HBc抗体应答.相反，两种颗粒引发了相似的抗M2抗体应答，并且与以前对IM2HBc/ICC-1559观察到的结果相似，终点滴度是大约1∶100,000.
在AlhydrogelTM上对颗粒制剂化，在第0(零)天和28天用2剂10μg制剂化的颗粒免疫几组小鼠，每组10只。在第二次注射后2周用ELISA测定法分析合并的血清中的抗HBc和抗M2e抗体应答.在ELISAs中分析来自加强后两周的10只小鼠的合并血清，用M2e(2-24)合成肽和重组HBc(ICC-1123)作为捕获抗原。
小鼠致死攻击模型中ICC-1569和ICC-1604颗粒的直接比较，发现在AlhydrogelTM上制剂化时，两种颗粒都对致死攻击剂量提供了完全的防护。因此这些结果与以下结果一致，即，两种颗粒都引发了相似的抗M2e抗体滴度。
由Ghent大学的Fiers及其合作者采用不同颗粒和佐剂的阵列进行的多个小鼠研究的数据编辑，揭示了IgG2a亚类的抗M2e滴度和保护效果之间直接可能的关联.表现出高于104的抗M2e IgG2a滴度的小鼠很容易受到保护以免受致死攻击，而表现出低于104的抗M2e IgG2a滴度的小鼠通常表现出较不完全的保护.这些数据与保护的潜在机制相关，因为它们表明，抗M2e抗体不是简单阻断M2的功能，否则保护作用将不依赖于IgG亚类偏倚.实际上，由于小鼠IgG2a(和IgG2b)是用于固定补体和结合NK细胞表达的FcγRIII受体的最有效亚类[Ravetch et al.，(1991)Annu.Rev.Immunol.，9：457-492]，所述数据表明了免疫机制涉及CDC和/或ADCC。
实施例13：抗体亚类和保护
概括了一些研究，其中测定了多种M2e-Hbc构建体(10μg/小鼠)和多种佐剂。大约一半是i.p.施用，大约一半是i.n.施用。对于每一组(14只小鼠)，合并血清，确定抗M2eIgG亚类抗体的滴度。结果来自在第二次加强后一周采集的血清。对于IgG2a滴度超过104的小鼠，IgG1滴度是104(＊)。
 
IgG2a 组数 保护百分比
≥104 8 100
<104＊ 4 70-95
越来越多地研究了佐剂增强对疫苗的免疫应答的强度和持续时间，以及调节免疫应答的Th1/Th2偏倚的能力。尽管正在研究很多实验佐剂，在美国，明矾仍然是唯一作为FDA批准的疫苗的成分的佐剂。通常，明矾使免疫应答向Th2型偏倚，这是通过小鼠中高水平IgG1抗体的产生而表现的。
已经发现用明矾制剂化的M2e-HBc颗粒确实引发了显著的IgG1应答；但是，也引发了作为Th1指示物的IgG2a和IgG2b抗体。在尝试增强Th1型IgG亚类的产生的尝试中，在小鼠中检测了补充了RC-529的AlhydrogelTM制剂化的颗粒的免疫原性，所述RC-529是一种与Corixa公司开发的
Figure S04841451420060811D000731
结构上相似的化合物.这些研究表明，在AlhydrogelTM制剂中引入RC-529，导致了抗M2e IgG2a滴度的显著增强，使抗M2e IgG2a∶IgG1比例增加了大约10倍.两组中的所有小鼠完全受到保护而免受致死攻击；但是，用AlhydrogelTM+RC-529制剂化的ICC-1569，相对于单独的AlhydrogelTM制剂化的ICC-1569，减少了发病率(体温降低和体重减轻)。
实施例14：部分截短的HBc颗粒：合成用于表达部分截短的颗粒的表达载体
为了制备用于表达部分截短的HBc颗粒的表达质粒，与独特的C-末端引物一起使用单个氨基末端寡核苷酸PCR引物(HBc149/NcoI-F)。例如，为了制备HBc156(E.Cr；ICC-1600颗粒)表达质粒，使用了引物HBc149/NcoI-F和HBc156(E.cR)-H3-R.使用引物HBc149/NcoI-F和HBc156C(E.cR)-H3-R制备HBc156(E.cR)+C(ICC-1601颗粒)表达质粒。下文示出了所有引物的序列。
除了截短颗粒，以及在某些情况下掺入C-末端半胱氨酸残基，也使用了对于在大肠杆菌中表达最优的密码子.已知一些精氨酸密码子，特别是AGA和AGG是大肠杆菌很少使用的，并且认为对于在大肠杆菌中有效表达蛋白是有问题的，因为会导致翻译过程中的多肽合成停滞，导致提前终止.在HBc的150和183之间的16个精氨酸密码子中，7个是由罕见的AGA密码子编码，2个是由非常罕见的AGG密码子编码。因此，在该研究中，所有的AGA和AGG密码子都被大肠杆菌更常用的密码子替代。
为了能够进行罕见精氨酸密码子的顺序替代，首先合成HBc156基因(ICC-1600和HBc156+C ICC-1601颗粒)，然后用作HBc163构建体(ICC-1634和HBc163+C ICC-1632颗粒)的模板；此后，将HBc163构建体用作HBc171构建体(ICC-1642和HBC171+C ICC-1643颗粒)的模板；最后，将HBc171构建体用作精氨酸密码子优化的HBc182和HBc183构建体的模板。为了对照目的，也制备了非优化的HBc182构建体(ICC-1575)。用限制酶NcoI和HindIII切割所有PCR构建体，如上文所讨论，克隆到用相同酶切割过的表达载体pKK223-3N中。
氨基末端引物序列(NcoI加下划线)：
HBc149/NcoI-F
5’-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA                 SEQ ID NO：51
羧基末端引物序列(HiNdIII限制位点加下划线)：
HBc156(E-cR)-H3-R
5’-GCGAAGCTTACTAAGGGGAGGGCCTCGACGAACAACAG
TAG TCTCCGG                                  SEQ ID NO：64
HBc156C(E.cR)-H3-R
5’-GCGAAGCTTACTAACAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAAC
AACAGTAGT-CTCCGG                            SEQ ID NO：65
HBc163(E.cR)-H3-R
5’-
GCGAAGCTTACTAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGC
GGCCTCG
                                            SEQ ID NO：66
HBc163C(E.cR)-H3-R
5’-
GCGAAGCTTACTAACAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGG
CCTCG
                                            SEQ ID NO：67
HBc171(E.cR)-H3-R
5’-
GCGAAGCTTACTACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCG
AGGGAGT
                                            SEQ ID NO：68
HBc171C(E.cR)-H3-R
5’-
GCGAAGCTTACTAACACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAG
GCGAGGGAGT
                                              SEQ ID NO：69
HBc183(E.cR)-H3-R
5’-
GCGAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCGAGATTGAGATCGCCG
GCGACGCGG-CGATTGAGAGCGTC                      SEQ ID NO：113
HBc182-H3-R
5’-GCGAAGCTTACTATTGAGATTCCCGAGATTGA
                                              SEQ ID NO：114
HBc183-H3-R
5’-GGAAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCG
                                              SEQ ID NO：115
HBc149/HindIII-R
5’-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG  SEQ ID NO：54
HBc149+C/HindIII-R
5’-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG
                                              SEQ ID NO：55
下文表5显示的比对说明了全长HBcAg(HBc183)的C-末端和所有携带C-末端截短的颗粒的构型。根据所有构建体共有的SEQ ID NO：1的HBc的N-末端开始的149位的氨基酸残基进行序列比对。当存在C-末端半胱氨酸残基时，用下划线表示。
表5
构建体名称         序列            SEQ ID NO
HBc183
    VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
                                          116
HBc182
       VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQ 117
HBc171(E.cR)+C
         VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSPC           118
HBc171(E.cR)
VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSP                   119
HBc163(E.cR)+C
           VRRRGRSPRRRRTPSPC              120
HBc163(E.cR)
           VRRRGRSPRRRTPSP                121
HBc156(E.cR)+C
            VRRRGRSPC                     122
HBc156(E.cR)
           VRRRGRSP                       123
实施例15：用具有和不具有N-末端半胱氨酸残基的HBc嵌合体形成颗粒和稳定性
制备了一系列四种嵌合体蛋白，其含有与在149位截短的乙型肝炎核心的氨基酸D4的短N-末端融合，所述嵌合体蛋白含有0个(颗粒1891)、1个(颗粒1892和1893)或2个(颗粒1890)半胱氨酸残基。纯化后，用分析大小排阻层析(SEC)评估颗粒完整性.这些N-末端融合的序列和分离的产率示于下文表6。
表6
 
嵌合体蛋白 N-末端融合＊ SEQ IDNO 产率(mg/500mL细胞培养物)
1890 MGCRCNDSS 124 6.8
1891 MGSRSNDSS 125 ZERO
1892 MGSRCNDSS 126 1.9
1893 MGCRSNDSS 127 6.7
以1.9-6.8mg/500mL细胞培养物的产率成功纯化了含有1个或多个半胱氨酸的三种嵌合体蛋白。含有相对于起始甲硫氨酸的第3和5位的两个半胱氨酸的嵌合体(颗粒1890)或含有第3位的单个半胱氨酸的颗粒(颗粒1893)以比在第5位具有单个半胱氨酸的嵌合体(颗粒1892)更高的产率纯化.既不含第3位的半胱氨酸也不含第5位的半胱氨酸的嵌合体颗粒不能作为颗粒纯化，表明读嵌合体分子不能形成稳定的颗粒。
当通过分析SEC进行分析时，所有三种蛋白都表现出大约5-8mL处的优势峰，其代表颗粒.读发现与作为颗粒的混合物和较无序结构(非颗粒状材料)存在的、缺乏N-末端半胱氨酸的嵌合体蛋白分子颗粒，如嵌合体颗粒ICC-1048相反。SEC曲线的更详细分析发现，嵌合体蛋白分子1890形成了优质的颗粒，没有检测到较无序的结构，而嵌合体1892显示少量非颗粒状材料，嵌合体1893显示了更多的非颗粒状材料。
为了检验N-末端半胱氨酸残基稳定展示异源表位的颗粒的能力，构建了与嵌合体1890含有相同N-末端构型的嵌合体蛋白分子，其具有插入氨基酸78和79之间的免疫优势环中的来自恶性疟原虫的CS重复(NANPNVDPNANPNANPNANP；SEQ ID NO：128).纯化后，将得到的嵌合体(1894)的颗粒完整性与缺乏N-末端融合的相似嵌合体蛋白(1045)的颗粒进行比较。
这些构建体的SEC分析表明，嵌合体1045表现出了颗粒和较无序的结构的峰。来自嵌合体1894的数据的相似分析显示了无法解释的颗粒形成缺乏，目前正在对其进行研究。
实施例16：具有顺序连接的N-末端M2肽的颗粒的免疫原性
在兔中测定了通常经过工程化以含有与N-末端融合的可变拷贝M2[1，1604(实施例12)；2,1817(实施例9)；或3，1818(实施例9)]的颗粒的免疫原性。按照上文和下一个实施例的讨论，在制备这些颗粒后将其冷冻，以使认为存在的蛋白酶的作用最小.通过肌内途径，采用3剂用AlhydrogelTM(500μg铝/剂)/RC-529-AF(25μg/剂)制剂化的颗粒(25μg/剂)免疫了几组兔，每组4只.在第0、28和56天免疫兔，在第0(预取血)、14、28、56和60天取血。用ELISA测试抗M2抗体的水平。
用包被了M2e(2-24/C17S，C19S)肽(2μg/mL，进行大约18小时)的微量滴定板进行ELISA，并且用3％BSA封闭。将血清以双份加入板中，开始是1∶100稀释，然后是2倍稀释，预取血除外，其进行三份分析。为了检测固定的抗体，在生色底物TM蓝之后，加入抗兔IgG HRP缀合物。采用该预取血数据，计算了每个血清稀释度下每只兔的“截止值”，方法是确定第0天时预取血血清样品的背景+3倍标准差.通过鉴定产生比特定血清稀释度的截止值高的吸光度值的最后一个血清稀释度，确定终点滴度。如果各个兔在组中是无反应者(即，滴度为0)，而其它兔产生可检测的滴度(即，>0)，则给无反应者赋予滴度值10，从而能够计算组中的几何平均滴度(GMT)。
出乎意料的是，仅仅具有单个拷贝的与N-末端融合的M2e的颗粒(1604)不能产生可检测的抗M2e应答(表11)；但是，在最初注射后14天，颗粒1817和1818产生了可检测的抗M2e免疫应答(表7)。在第70天观察到1817颗粒的峰值滴度是14,030，而在第56天观察到1818的峰值滴度是24,300。在使用1、2或3剂后，在任何用1604免疫的兔中都没有检测到抗M2e滴度。
表7
用多种含M2e的颗粒免疫的兔的GMTs
 
颗粒 第14天 第28天 第56天 第70天
1604 0 0 0 0
1817 0 1,559 6,155 14,030
1818 684 14,030 24,300 8,100
实施例17：避免内源性蛋白酶活性
持续的工作发现，似乎是金属蛋白酶的未知蛋白酶对含M2的颗粒进行了切割，因为通过在用于分离和储存颗粒的缓冲液中加入10mMEDTA，可以防止这些颗粒的蛋白水解。为了确定更低浓度的EDTA是否也是有效的，用实施例9制备和上文讨论的ICC-1818颗粒进行了稳定性研究。将这些颗粒置于含有pH7.2的20mM磷酸钠，并且也含有0、1、2、5或10mM EDTA的储存缓冲液中。图11中示出的结果明确显示1mM EDTA在防止蛋白水解方面与10mM EDTA同样有戏。实际上，低于1mM的浓度也是有效的。
出乎意料的是，不存在EDTA时，在37℃下的蛋白水解比在室温温育条件下的蛋白水解少。该观察结果提示，蛋白酶可能是高度不稳定的，因此，在相对低的温度下(40-60℃)就可以灭活.因此，开始了一项研究，以确定通过热处理是否可以破坏蛋白水解活性，同时保持颗粒的完整性。
为了评估采用热步骤灭活蛋白酶的可能性，将颗粒加热到40、50、60或70℃，持续加热1.5或3小时。用SDS-PAGE评估单体的完整性(图12A)，数据表明，所有单体在热处理后似乎是相似的。图12B中显示的凝胶明确表明在室温(RT)下一周后，未处理的颗粒被完全切割，而在40℃下热处理的颗粒表现出切割减少，在50℃下热处理的颗粒表现出极少的切割，在60或70℃温育的那些似乎与未温育的对照无法区分。
为了评估热处理对颗粒完整性的影响，用分析SEC对热处理过的颗粒进行分析.图13A示出的数据表明，在60°和70℃进行的热处理对颗粒完整性具有很小的影响，这是通过单体/二聚体峰的轻微增加而证实的，所述峰在主颗粒峰之后洗脱。在50℃和50℃以下进行的热处理对SEC洗脱曲线没有明显影响，表明颗粒承受了热步骤，没有不良影响。
RT温育1周后热处理过的颗粒的SEC分析明确显示了未进行热处理的对照的蛋白水解，这是由颗粒峰的洗脱时间增加而证明的(图13B，RT样品).这与用SDS-PAGE观察到的蛋白水解一致(图12B)，并且表明从颗粒切割M2e，导致了颗粒大小减小.热处理过的样品都表现出优势的、完整颗粒的峰，再次与SDS-PAGE发现的不存在切割的结果一致(图12)。
这些数据提示，用于灭活负责切割含M2颗粒的蛋白水解活性的热处理可以是限制蛋白水解的有效选择。初步研究表明，在55-60℃温育3小时，对于达到蛋白水解灭活同时保持颗粒完整性是最优的。此外，在制备过程方面，优选在CL-4B步骤之前进行热灭活，以便由于热步骤而释放的单体和二聚体能有效被去除.该方法的使用可以使得颗粒能在缺乏EDTA的条件下储存。
实施例18：用EDTA和热步骤纯化，得到稳定颗粒
根据上文提供的数据，用CV-1906颗粒检验了掺入EDTA和对切割M2e的蛋白酶活性进行热灭活的原型纯化过程，所述CV-1906颗粒如ICC-1818颗粒那样，含有3个N-末端M2e拷贝，其连接于HBc序列，所述HBc序列以4号残基(天冬氨酸)起始，并且其中第48和107位的半胱氨酸被丝氨酸残基替代，所述HBc序列被截短，以除去位于149位N-末端的残基，并且在第150位添加半胱氨酸残基(HBc149C48S/C107S，C150).在3个拷贝的M2e中可以存在的6个半胱氨酸中，实际上只有M2e序列中最靠近HBc序列的两个半胱氨酸存在，另外四个半胱氨酸残基被丝氨酸残基替代。
纯化过程涉及在所有缓冲液中使用10mM EDTA，直到通过热处理对蛋白酶灭活，此时在
Figure S04841451420060811D000812
CL-4B层析过程中除去EDTA.比较了含有或缺乏热灭活步骤的程序。下面详细列出了使用的过程：
·用微流化器在Tris/EDTA缓冲液中裂解
·离心
·20％硫酸铵沉淀
·离心
·将沉淀重悬于1M NaCl/10mM EDTA中
·EDTA存在下，苯基HIC(以大约300mM NaCl洗脱)
·+/-热灭活(60℃，3小时)
·不存在EDTA的条件下进行
Figure S04841451420060811D000821
CL-4B层析
·陶瓷HA层析
比较研究发现，如所预期的，未经过热步骤的CV-1906颗粒在除去EDTA后，即，在CL-4B后立即开始切割(图14，泳道2)。相反，用包括热步骤的过程纯化的CV-1906颗粒保持完整(图14，泳道1)。
实施例19：用含1、2或3个串联的M2肽的嵌合体进行的大小研究
在大肠杆菌中表达具有与HBc的N-末端融合的0、1、2或3个串联的M2e拷贝的杂合HBc-M2e颗粒，并且纯化(表8)。如前面所讨论，在制备后也对这些颗粒进行冷冻，并且在要使用时融解。用还原SDS-PAGE比较多个单体的大小(图15).M2e-HBc杂合体的相对迁移性与它们预期的分子量一致(表8)
表8
M2e-HBc杂合颗粒的详情
 
M2e拷贝数 总氨基酸数 单体的预期分子量(kDa)
1123 0 150 16.95
1604 1 173 19.57
1817 2 198 22.39
1818 3 223 25.20
实施例20：用含1、2或3个串联的M2肽的嵌合体进行的免疫原性研究
采用致死攻击模型，在BALB/小鼠中将经过基因工程化以含有与N-末端融合的可变拷贝的M2[1，1604；2，1817；或3，1818]的颗粒的免疫原性和保护效力进行比较.从Charles River(德国)获得无病原体的雌性BALB/c小鼠，并且用于在8周龄时免疫.将动物饲养在控制温度的环境中，采用12小时的亮/暗周期，随意接受食物和水。
采用以下免疫方案对所有小鼠(每组14只)腹膜内接种100μl疫苗：以三周的间隔，用AlhydrogelTM(100μg/剂)和RC-539-AF(10μg/剂)制剂化的10μg M2e-HBc颗粒进行第一次接种、第一加强和第二次加强.在制备后也对这些颗粒进行了冷冻，并且在要使用时融解，以使蛋白酶的作用最小。在每次免疫之前和免疫后两周，通过针刺腹侧尾静脉而采集血样.最后一次取血是通过心脏穿刺进行的。37℃下使血液凝集30分钟，随后两次离心，取出上清液以采集血清.通过ELISA确定M2e特异性IgG的滴度。
用1817或1818颗粒免疫的小鼠在致死攻击后表现出完全存活，而用1604颗粒免疫的小鼠表现出一定的死亡率(参见图16)。用不含M2e的颗粒(1123)或PBS免疫的小鼠表现出100％的死亡率(图16)，强调了攻击的高严苛性.用1817和1818颗粒免疫的小鼠中的保护增强，也表现在相对于1604颗粒，发病率(体重减轻和体温降低)减少，表明与仅表达1个拷贝的M2e的颗粒(1604)相比，在用表达2或3个拷贝的M2e的颗粒(1817和1818)免疫的小鼠中保护作用最强(图17和图18)。
用ELISA确定抗M2e滴度.在37℃下用50μl溶于50mM碳酸氢钠缓冲液，pH9.7的2μg/ml M2e肽溶液包被ELISA板过夜(大约18小时).采用微量滴定板(II型F96MaxiSorpTM).清洗板后，将200μl PBS+2％BSA溶液用于封闭.温育1小时后，将1/50稀释开始的不同血清样品的一系列1/3稀释液加样到包被肽的孔中.用在PBS+1％BSA+0.05％
Figure S04841451420060811D000831
中1/6000稀释的分别针对小鼠IgG1和IgG2a的辣根过氧化物酶标记的抗体(Southern BiotechnologyAssociates，Inc.)检测结合的抗体。清洗后，在RMB底物存在下，将微量滴定板温育5分钟.通过加入1M H3PO4终止反应，测量450nm处的吸光度.为了获得与M2e的特异性结合的值，从在相应稀释度的条件下获得的免疫血清的吸光度扣除从免疫前血清获得的吸光度。
ELISA数据表明，颗粒1817和1818引发的抗M2e IgG1滴度分别比1604颗粒引发的滴度高10.4和8.4倍.相似地，颗粒1817和1818引发的抗M2eIgG2a滴度分别比1604颗粒引发的滴度高5.5和7.6倍(表9).
表9
颗粒1604、1817和1818的抗M2e滴度的比较*
(IgG1和IgG2a亚类)
*测定了来自各个小鼠的血清样品。标准差示于括号中。
对于抗HBc测定，用100μL针对HBc的多克隆兔抗体(DAKO)的10μg/ml溶液包被ELISA板(II型F96MaxiSorpTM)。清洗板后，将PBS+3％BSA溶液用于封闹.清洗后，捕获HBc抗原(10μg/ml，溶于碳酸氢盐缓冲液中)1小时．清洗后，将1/1000稀释开始的不同血清样品的一系列1/3稀释液加样到孔中.用1/10,000稀释于PBS+1％BSA中的针对小鼠IgG(Sigma)的碱性磷酸酶标记的抗体检测结合的抗体。进一步清洗后，使微量滴定板与底物一起温育30分钟.测量415nm处的吸光度。
为了获得与乙型肝炎核心抗原的特异性反应性的值，从在相应稀释度的条件下获得的免疫血清的吸光度扣除从免疫前血清获得的吸光度.为了确定各个样品的IgG1抗HBc滴度，用在PBS+0.5％BSA+0.05％
Figure S04841451420060811D000842
中1/6000稀释的针对小鼠IgG1的辣根过氧化物酶标记的抗体(Southern Biotechnology Associates，Inc.)检测结合的抗体.清洗后，在RMB底物存在下，将微量滴定板温育5分钟.通过加入1MH3PO4终止反应，测量450nm处的吸光度.
ELISA数据表明，颗粒1817和1818引发的抗HBcIgG1滴度分别比1604颗粒引发的滴度高2.4和10.1倍(表10).这些数据表明，HBc颗粒表面M2e密度的增加，活跃地抑制了对HBc载体的抗体应答.因此，与1604颗粒相比，1818颗粒的抗M2e：抗HBc比值(IgG1)高75倍，1817颗粒高23倍(表10).因此，接种的宿主中抗流感M2e的免疫应答甚至比抗HBc载体颗粒的免疫应答更高，已知HBc载体颗粒是高度免疫原性的.
表10
抗M2e和抗HBc滴度的比较＊
(IgG1亚类)
 
抗M2e 抗HBc 抗M2e：抗HBc比值
1604 149,850(82,901) 4,264,650(1940769) 0.04
1817 1,564,546(605，630) 1,766,423(473443) 0.89
1818 1,261,731(654，156) 420，577(218052) 3.00
＊检测了来自各个小鼠的血清样品。
＊在括号中示出了标准差。
在此引入本文中引用的每篇专利和文章作为参考。“一个”或“一种”意欲包括一种或多种。
前面的说明书和实施例是说明性的，不应读认为是限制性的.本发明精神和范围内的其它变化也是可能的，并且容易被本领域技术人员理解。
序列表
<110>BIRKETT，ASHLEY J.
     FIERS，WALTER
<120>流感病毒免疫原和疫苗
<130>4564/93457
<140>PCT/US04/Unknown
<141>2004-12-07
<150>US 10/732,862
<151>2003-12-10
<150>PCT/US03/05196
<151>2003-02-21
<150>US 10/274,616
<151>2002-10-21
<150>US 10/082,014
<151>2002-02-21
<150>US 10/080,299
<151>2002-02-21
<150>US 09/930,915
<151>2001-08-15
<160>140
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒，人ayw亚型
<400>1
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>2
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒，人adw亚型
<400>2
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
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<210>3
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒，人adw2亚型
<400>3
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1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
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Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys
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Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
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Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Pro Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>4
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒，人adyw亚型
<400>4
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
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Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
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Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
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Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Pro Ala
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Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
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Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
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Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
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Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>5
<211>183
<212>PRT
<213>土拨鼠
<400>5
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu
1               5                   10                  15
Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu
    50                  55                  60
Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln
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Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln
            100                 105                 110
His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser
145                 150                 155                 160
Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro
                165                 170                 175
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Cys
            180
<210>6
<211>217
<212>PRT
<213>地松鼠
<400>6
Met Tyr Leu Phe His Leu Cys Leu Val Phe Ala Cys Val Pro Cys Pro
1               5                   10                  15
Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp
            20                  25                  30
Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu Asn Phe
        35                  40                  45
Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp Thr Ala
    50                  55                  60
Ala Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys Ser Pro
65                  70                  75                  80
His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Glu Glu Leu Thr
                85                  90                  95
Arg Leu Ile Thr Trp Met Ser Glu Asn Thr Thr Glu Glu Val Arg Arg
            100                 105                 110
Ile Ile Val Asp His Val Asn Asn Thr Trp Gly Leu Lys Val Arg Gln
        115                 120                 125
Thr Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gly His Thr Val
    130                 135                 140
Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Ala Pro
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr
                165                 170                 175
Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ala Arg Ser Pro Arg Arg
            180                 185                 190
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
        195                 200                 205
Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Asn Cys
    210                 215
<210>7
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的质粒pkk223
<400>7
ttcacacagg aaacagaatt cccggggatc cgtcgacctg cagccaagct t         51
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pkk223
<400>8
ttcacataag gaggaaaaaa ccatgggatc cgaagctt                        38
<210>9
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>第1位的Xaa是甲硫氨酸或不存在。如果是甲硫氨酸，则第2-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第3-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>第3位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第4-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>第4位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第5-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>第4位的Xaa是苏氨酸或脯氨酸或不存在。如果是苏氨酸或脯氨酸，则第6-8位的
Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>第6位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第7-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>第7位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>第8位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>第10位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>第11位的Xaa是异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>第12位的Xaa是精氨酸或赖氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>第13位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>第14位的Xaa是谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>第15位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>第16位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，则第16位的
Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>第17位的Xaa不存在或存在，如果存在，第17位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第17位的Xaa，则第15-16位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>第18位的Xaa是精氨酸、赖氨酸或不存在。如果是精氨酸或赖氨酸，则第15-17
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>第19位的Xaa不存在或存在，如果存在，第19位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第19位的Xaa，则第15-18位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>第20位的Xaa是天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬酰胺、丝氨酸
或甘氨酸，则第15-19位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>第21位的Xaa是天冬氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则第15
-20位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>第22位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-21位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>第23位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-22位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>第24位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第15-23位的Xaa存在。
<400>9
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20
<210>10
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>第1位的Xaa是甲硫氨酸或不存在。如果是甲硫氨酸，则第2-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第3-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>第3位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第4-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>第4位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第5-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>第5位的Xaa是苏氨酸或不存在。如果是苏氨酸，则第6-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>第6位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第7-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>第7位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>第8位的Xaa是谷氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>第15位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>第16位的Xaa是甘氨酸或不存在。如果是甘氨酸，则第15位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>第17位的Xaa不存在或存在，如果存在，第17位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第17位的Xaa，则第15-16位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>第18位的Xaa是精氨酸或不存在。如果是精氨酸，则第15-17位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>第19位的Xaa不存在或存在，如果存在，第19位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第19位的Xaa，则第15-18位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>第20位的Xaa是天冬酰胺或不存在。如果是天冬酰胺，则第15-19位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>第21位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第15-20位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>第22位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-21位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>第23位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-22位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>第24位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第15-23位的Xaa存在。
<400>10
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20
<210>11
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>11
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp
            20
<210>12
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>12
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>13
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>13
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
1               5                   10                  15
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>14
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>14
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>15
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>15
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>16
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>16
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>17
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>17
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>18
<211>23
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>18
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>19
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>19
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>20
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>20
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>21
<211>35
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>21
Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
1               5                   10                  15
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu
            20                  25                  30
Trp Gly Ile
        35
<210>22
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>22
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ala Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>23
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>23
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>24
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>24
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ala Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>25
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>25
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>26
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>26
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>27
<211>46
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>27
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
            20                  25                  30
Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
        35                  40                  45
<210>28
<211>69
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>28
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
            20                  25                  30
Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu
        35                  40                  45
Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys
    50                  55                  60
Asn Asp Ser Ser Asp
65
<210>29
<211>46
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>29
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
1               5                   10                  15
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
            20                  25                  30
Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
        35                  40                  45
<210>30
<211>69
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>30
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
1               5                   10                  15
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
            20                  25                  30
Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu
        35                  40                  45
Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys
    50                  55                  60
Asn Asp Ser Ser Asp
65
<210>31
<211>19
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>31
Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Cys Asn Asp
1               5                   10                  15
Ser Ser Asp
<210>32
<211>38
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>32
Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Cys Asn Asp
1               5                   10                  15
Ser Ser Asp Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg
            20                  25                  30
Cys Asn Asp Ser Ser Asp
        35
<210>33
<211>57
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>33
Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Cys Asn Asp
1               5                   10                  15
Ser Ser Asp Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg
            20                  25                  30
Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp
        35                  40                  45
Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
    50                  55
<210>34
<211>47
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>第1位的Xaa是甲硫氨酸或不存在。如果是甲硫氨酸，则第2-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第3-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>第3位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第4-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>第4位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第5-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>第5位的Xaa是苏氨酸或不存在。如果是苏氨酸，则第6-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>第6位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第7-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>第7位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>第8位的Xaa是谷氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>第15位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>第16位的Xaa是甘氨酸或不存在。如果是甘氨酸，则第15位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>第17位的Xaa不存在或存在，如果存在，第17位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第17位的Xaa，则第15-16位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>第18位的Xaa是精氨酸或不存在。如果是精氨酸，则第15-17位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>第19位的Xaa不存在或存在，如果存在，第19位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第19位的Xaa，则第15-18位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>第20位的Xaa是天冬酰胺或不存在。如果是天冬酰胺，则第15-19位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>第21位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第15-20位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>第22位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-21位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>第23位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-22位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>第24位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第15-23位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>第25位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第26-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>第26位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第27-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>第27位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第28-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>第28位的Xaa是苏氨酸或不存在。如果是苏氨酸，则第29-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>第29位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第30-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>第30位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(38)..(38)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(39)..(39)
<223>第39位的Xaa是甘氨酸或不存在。如果是甘氨酸，则第38位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(40)..(40)
<223>第40位的Xaa不存在或存在，如果存在，第40位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第17位的Xaa，则第38-39位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>第40位的Xaa是精氨酸或不存在。如果是精氨酸，则第38-40位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>第42位的Xaa不存在或存在，如果存在，第42位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第42位的Xaa，则第38-41位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(43)..(43)
<223>第43位的Xaa是天冬酰胺或不存在。如果是天冬酰胺，则第38-42位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(44)..(44)
<223>第44位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第38-43位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(45)..(45)
<223>第45位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第38-44位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(46)..(46)
<223>第46位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第38-45位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(47)..(47)
<223>第47位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第38-46位的Xaa存在。
<400>34
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
            20                  25                  30
Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
<210>35
<211>70
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>第1位的Xaa是甲硫氨酸或不存在。如果是甲硫氨酸，则第2-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第3-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>第3位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第4-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>第4位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第5-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>第5位的Xaa是苏氨酸或不存在。如果是苏氨酸，则第6-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>第6位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第7-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>第7位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>第8位的Xaa是谷氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>第15位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>第16位的Xaa是甘氨酸或不存在。如果是甘氨酸，则第15位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>第17位的Xaa不存在或存在，如果存在，第17位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第17位的Xaa，则第15-16位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>第18位的Xaa是精氨酸或不存在。如果是精氨酸，则第15-17位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>第19位的Xaa不存在或存在，如果存在，第19位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第19位的Xaa，则第15-18位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>第20位的Xaa是天冬酰胺或不存在。如果是天冬酰胺，则第15-19位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>第22位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-21位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>第23位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-22位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>第25位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第26-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>第31位的Xaa是谷氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(39)..(39)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(40)..(40)
<223>第40位的Xaa不存在或存在，如果存在，第40位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第40位的Xaa，则第38-39位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>第41位的Xaa是精氨酸或不存在。如果是精氨酸，则第38-40位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>第42位的Xaa不存在或存在，如果存在，第42位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第42位的Xaa，则第38-41位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(43)..(43)
<223>第43位的Xaa是天冬酰胺或不存在。如果是天冬酰胺，则第38-42位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(44)..(44)
<223>第44位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第38-43位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(45)..(45)
<223>第45位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第38-44位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(46)..(46)
<223>第46位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第38-45位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>第47位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第38-46位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>第48位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第49-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(49)..(49)
<223>第49位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第50-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(50)..(50)
<223>第50位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第51-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(51)..(51)
<223>第51位的Xaa是苏氨酸或不存在。如果是苏氨酸，则第52-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(52)..(52)
<223>第52位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第53-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(53)..(53)
<223>第53位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(54)..(54)
<223>第54位的Xaa是谷氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(61)..(61)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(62)..(62)
<223>第62位的Xaa是甘氨酸或不存在。如果是甘氨酸，则第61位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(63)..(63)
<223>第63位的Xaa不存在或存在，如果存在，第63位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第63位的Xaa，则第61-62位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(64)..(64)
<223>第64位的Xaa是精氨酸或不存在。如果是精氨酸，则第61-63位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(65)..(65)
<223>第65位的Xaa不存在或存在，如果存在，第65位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第65位的Xaa，则第61-64位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(66)..(66)
<223>第66位的Xaa是天冬酰胺或不存在。如果是天冬酰胺，则第61-65位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(67)..(67)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(69)..(69)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(70)..(70)
<223>第70位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第61-69位的Xaa存在。
<400>35
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
            20                  25                  30
Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65                  70
<210>36
<211>47
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>第1位的Xaa是甲硫氨酸或不存在。如果是甲硫氨酸，则第2-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第3-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>第3位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第4-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>第4位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第5-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>第4位的Xaa是苏氨酸或不存在。如果是苏氨酸，则第6-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>第6位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第7-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>第7位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>第8位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>第10位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>第11位的Xaa是异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>第12位的Xaa是精氨酸或赖氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>第13位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>第14位的Xaa是谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>第15位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>第16位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，则第16位的
Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>第17位的Xaa不存在或存在，如果存在，第17位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第17位的Xaa，则第15-16位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>第18位的Xaa是精氨酸、赖氨酸或不存在。如果是精氨酸或赖氨酸，则第15-17
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>第19位的Xaa不存在或存在，如果存在，第19位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第19位的Xaa，则第15-18位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>第20位的Xaa是天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬酰胺或丝氨酸，
则第15-19位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>第21位的Xaa是天冬氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则第15
-20位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>第22位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-21位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>第23位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-22位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>第24位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第15-23位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>第25位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第26-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>第26位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第27-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>第27位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第28-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>第28位的Xaa是苏氨酸、脯氨酸或不存在。如果是苏氨酸或脯氨酸，则第29-31
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>第29位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第30-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>第30位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>第31位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(33)..(33)
<223>第33位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(34)
<223>第34位的Xaa是异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(35)..(35)
<223>第35位的Xaa是精氨酸或赖氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(36)..(36)
<223>第36位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(37)..(37)
<223>第37位的Xaa是谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(38)..(38)
<223>第38位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(39)..(39)
<223>第39位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，则第38位的
Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(40)..(40)
<223>第40位的Xaa不存在或存在，如果存在，第40位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第40位的Xaa，则第38-39位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>第41位的Xaa是精氨酸、赖氨酸或不存在。如果是精氨酸或赖氨酸，则第38-40
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>第42位的Xaa不存在或存在，如果存在，第42位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第42位的Xaa，则第38-41位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(43)..(43)
<223>第43位的Xaa是天冬酰胺、丝氨酸或不存在。如果是天冬酰胺或丝氨酸，则第38
-42位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(44)..(44)
<223>第44位的Xaa是天冬氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则第38
-43位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(45)..(45)
<223>第45位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第38-44位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(46)..(46)
<223>第46位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第38-45位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(47)..(47)
<223>第47位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第38-46位的Xaa存在。
<400>36
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
<210>37
<211>70
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>第1位的Xaa是甲硫氨酸或不存在。如果是甲硫氨酸，则第2-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第3-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>第3位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第4-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>第4位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第5-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>第5位的Xaa是苏氨酸或不存在。如果是苏氨酸，则第6-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>第6位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第7-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>第7位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>第8位的Xaa是谷氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>第10位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>第11位的Xaa是异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>第12位的Xaa是精氨酸或赖氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>第13位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>第14位的Xaa是谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>第15位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>第16位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，则第16位的
Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>第17位的Xaa不存在或存在，如果存在，第17位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第17位的Xaa，则第15-16位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>第18位的Xaa是精氨酸、赖氨酸或不存在。如果是精氨酸或赖氨酸，则第15-17
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>第19位的Xaa不存在或存在，如果存在，第19位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第19位的Xaa，则第15-18位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>第20位的Xaa是天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬酰胺或丝氨酸，
则第15-19位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>第21位的Xaa是天冬氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则第15
-20位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>第22位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-21位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>第23位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-22位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>第24位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第15-23位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>第25位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第26-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>第26位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第27-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>第27位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第28-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>第28位的Xaa是苏氨酸、脯氨酸或不存在。如果是苏氨酸或脯氨酸，则第29-31
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>第29位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第30-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>第30位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>第31位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(33)..(33)
<223>第33位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(34)
<223>第34位的Xaa是异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(35)..(35)
<223>第35位的Xaa是精氨酸或赖氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(36)..(36)
<223>第36位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(37)..(37)
<223>第37位的Xaa是谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(38)..(38)
<223>第38位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(39)..(39)
<223>第39位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，则第38位的
Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(40)..(40)
<223>第40位的Xaa不存在或存在，如果存在，第40位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第40位的Xaa，则第38-39位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>第41位的Xaa是精氨酸、赖氨酸或不存在。如果是精氨酸或赖氨酸，则第38-40
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>第42位的Xaa不存在或存在，如果存在，第42位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第42位的Xaa，则第38-41位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(43)..(43)
<223>第43位的Xaa是天冬酰胺、丝氨酸或不存在。如果是天冬酰胺或丝氨酸，则第38
-42位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(44)..(44)
<223>第44位的Xaa是天冬氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则第38
-43位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(45)..(45)
<223>第45位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第38-44位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(46)..(46)
<223>第46位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第38-45位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(47)..(47)
<223>第47位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第38-46位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(48)..(48)
<223>第48位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第49-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(49)..(49)
<223>第49位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第50-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(50)..(50)
<223>第50位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第51-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(51)..(51)
<223>第51位的Xaa是苏氨酸、脯氨酸或不存在。如果是苏氨酸或脯氨酸，则第52-54
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(52)..(52)
<223>第52位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第53-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(53)..(53)
<223>第53位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(54)..(54)
<223>第54位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(56)..(56)
<223>第56位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(57)..(57)
<223>第57位的Xaa是异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(58)..(58)
<223>第58位的Xaa是精氨酸或赖氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(59)..(59)
<223>第59位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(60)..(60)
<223>第60位的Xaa是谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(61)..(61)
<223>第61位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(62)..(62)
<223>第62位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，则第61位的
Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(63)..(63)
<223>第63位的Xaa不存在或存在，如果存在，第63位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第63位的Xaa，则第6162位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(64)..(64)
<223>第64位的Xaa是精氨酸、赖氨酸或不存在。如果是精氨酸或赖氨酸，则第61-63
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(65)..(65)
<223>第65位的Xaa不存在或存在，如果存在，第65位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第65位的Xaa，则第61-64位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(66)..(66)
<223>第66位的Xaa是天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬酰胺、丝氨酸或
甘氨酸，则第61-65位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(67)..(67)
<223>第67位的Xaa是天冬氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则第61
-66位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(68)..(68)
<223>第68位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第61-67位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(69)..(69)
<223>第69位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第61-68位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(70)..(70)
<223>第70位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第61-69位的Xaa存在。
<400>37
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65                  70
<210>38
<211>17
<212>PRT
<213>乙型流感病毒
<400>38
Asn Asn Ala Thr Phe Asn Tyr Thr Asn Val Asn Pro Ile Ser His Ile
1               5                   10                  15
Arg
<210>39
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>39
Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ser Ala Tyr Glu Arg
1               5                   10                  15
Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys
            20
<210>40
<211>22
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>40
Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val Ser Pro Arg Gly
1               5                   10                  15
Lys Leu Ser Thr Arg Gly
            20
<210>41
<211>22
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>41
Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val
1               5                   10                  15
Tyr Ser Leu Ile Arg Pro
            20
<210>42
<211>24
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>42
Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu Leu Ile Arg Met Ile
1               5                   10                  15
Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn
            20
<210>43
<211>549
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>43
atggacatcg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct   60
tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa  120
gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt  180
tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg ttaatttgga agatccagcg  240
tctagagacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt caggcaactc  300
ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga gtatttggtg  360
tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta  420
tcaacacttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact  480
ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa  540
tctcaatgt                                                          549
<210>44
<211>555
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>44
atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct   60
tctgacttct ttccttccgt acgagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa  120
gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc  180
tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgca agatccagca  240
tccagagatc tagtagtcaa ttatgttaat actaacatgg gtttaaagat caggcaacta  300
ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc  360
tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta  420
tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga  480
agaactccct cgcctcgcag acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct  540
cgggaatctc aatgt                                                   555
<210>45
<211>555
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>45
atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct   60
tctgacttct ttccttccgt cagagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa  120
gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc  180
tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgga agatccagca  240
tctagggatc ttgtagtaaa ttatgttaat actaacgtgg gtttaaagat caggcaacta  300
ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc  360
tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta  420
tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga  480
agaactccct cgcctcgcag acgcagatct ccatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct  540
cgggaatctc aatgt                                                   555
<210>46
<211>549
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>46
atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct   60
tctgacttct ttccttccgt acgagatctt ctagataccg ccgcagctct gtatcgggat  120
gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt  180
tgctggggag acttaatgac tctagctacc tgggtgggta ctaatttaga agatccagca  240
tctagggacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatgtgg gcctaaagtt cagacaatta  300
ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cggttctaga gtatttggtg  360
tcttttggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta  420
tcaacgcttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact  480
ccctcgcctc gcagacgaag atctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa  540
tctcaatgt                                                          549
<210>47
<211>549
<212>DNA
<213>土拨鼠
<400>47
atggctttgg ggcatggaca tagatcctta taaagaattt ggttcatctt atcagttgtt   60
gaattttctt cctttggact tctttcctga tcttaatgct ttggtggaca ctgctactgc  120
cttgtatgaa gaagaactaa caggtaggga acattgctct ccgcaccata cagctattag  180
acaagcttta gtatgctggg atgaattaac taaattgata gcttggatga gctctaacat  240
aacttctgaa caagtaagaa caatcattgt aaatcatgtc aatgatacct ggggacttaa  300
ggtgagacaa agtttatggt ttcatttgtc atgtctcact ttcggacaac atacagttca  360
agaattttta gtaagttttg gagtatggat caggactcca gctccatata gacctcctaa  420
tgcacccatt ctctcgactc ttccggaaca tacagtcatt aggagaagag gaggtgcaag  480
agcttctagg tcccccagaa gacgcactcc ctctcctcgc aggagaagat ctcaatcacc  540
gcgtcgcag                                                          549
<210>48
<211>651
<212>DNA
<213>地松鼠
<400>48
atgtatcttt ttcacctgtg ccttgttttt gcctgtgttc catgtcctac tgttcaagcc   60
tccaagctgt gccttggatg gctttgggac atggacatag atccctataa agaatttggt  120
tcttcttatc agttgttgaa ttttcttcct ttggactttt ttcctgatct caatgcattg  180
gtggacactg ctgctgctct ttatgaagaa gaattaacag gtagggagca ttgttctcct  240
catcatactg ctattagaca ggccttagtg tgttgggaag aattaactag attaattaca  300
tggatgagtg aaaatacaac agaagaagtt agaagaatta ttgttgatca tgtcaataat  360
acttggggac ttaaagtaag acagacttta tggtttcatt tatcatgtct tacttttgga  420
caacacacag ttcaagaatt tttggttagt tttggagtat ggattagaac tccagctcct  480
tatagaccac ctaatgcacc cattttatca actcttccgg aacatacagt cattaggaga  540
agaggaggtt caagagctgc taggtccccc cgaagacgca ctccctctcc tcgcaggaga  600
aggtctcaat caccgcgtcg cagacgctct caatctccag cttccaactg c           651
<210>49
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>49
ggtgcatgca aggagatg                                                 18
<210>50
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pkk223
<400>50
gcgaagcttc ggatcccatg gttttttcct ccttatgtga aattgttatc cgctc        55
<210>51
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>51
ttgggccatg gacatcgacc ctta                                       24
<210>52
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>52
gcggaattcc atcttccaaa ttaacaccca c                               31
<210>53
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>53
cgcgaattca aaaagagctc ccagcgtcta gagacctag                       39
<210>54
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>54
cgcaagctta aacaacagta gtctccggaa g                               31
<210>55
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>55
cgcaagctta ctagcaaaca acagtagtct ccggaag                         37
<210>56
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>56
ggaaagctta ctaacattga gattcccg                                   28
<210>57
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>57
gcgggatccg gagcttatcg a                                          21
<210>58
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>58
gcggagctct ttttgaattc ccatggtttt ttcctcctta t                    41
<210>59
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>59
gcggagctcc ttgggtggct ttggggcatt gacatcgacc cttataaag            49
<210>60
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物.
<400>60
gcataattcg tgtcgctc                                              18
<210>61
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物.
<400>61
gcggaattcc gatgtccatg gttttttcct                                 30
<210>62
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物.
<400>62
gcggaattca aaaagagctc gacccttata aagaatttgg a                    41
<210>63
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>63
cgcaagctta gagctcttga attccaacaa cagtagtctc cg                   42
<210>64
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>64
gcgaagctta ctaaggggag cggcctcgtc gacgaacaac agtagtctcc gg        52
<210>65
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>65
gcgaagctta ctaacaaggg gagcggcctc gtcgacgaac aacagtagtc tccgg     55
<210>66
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>66
gcgaagctta ctaaggcgag ggagtgcgcc gacgagggga gcggcctcg            49
<210>67
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>67
gcgaagctta ctaacaaggc gagggagtgc gccgacgagg ggagcggcct cg        52
<210>68
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>68
gcgaagctta ctacggcgat tgagagcgtc gacggcgagg cgagggagt            49
<210>69
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>69
gcgaagctta ctaacacggc gattgagagc gtcgacggcg aggcgaggga gt        52
<210>70
<211>26
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>70
Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu
            20                  25
<210>71
<211>78
<212>DNA
<213>甲型流感病毒
<400>71
aattagcctg ttaaccgaag tggagacgcc gatccgtaac gaatggggct gccgctgtaa    60
tgattcttcc gacgagct                                                  78
<210>72
<211>70
<212>DNA
<213>甲型流感病毒
<400>72
cgtcggaaga atcattacag cggcagcccc attcgttacg gatcggcgtc tccacttcgg    60
ttaacaggct                                                           70
<210>73
<211>26
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>73
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu
            20                  25
<210>74
<211>78
<212>DNA
<213>甲型流感病毒
<400>74
catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt gcagatgtaa    60
cgat tcaagt gatgagct                                                 78
<210>75
<211>70
<212>DNA
<213>甲型流感病毒
<400>75
catcacttga atcgttacat ctgcaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg    60
tcagcagaga                                                           70
<210>76
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>甲型流感病毒突变体
<400>76
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu
            20                  25
<210>77
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>77
catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt ctagatgtaa    60
cgattcaagt gatgagct                                                  78
<210>78
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>78
catcacttga atcgttacat ctagaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg    60
tcagcagaga                                                           70
<210>79
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>甲型流感病毒突变体
<400>79
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu
            20                  25
<210>80
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>80
catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt gcagatcgaa    60
cgattcaagt gatgagct                                                  78
<210>81
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>81
catcacttga atcgttcgat ctgcaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg    60
tcagcagaga                                                           70
<210>82
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>甲型流感病毒突变体
<400>82
Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu
            20                  25
<210>83
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>83
aatttctctg ttaaccgaag tggagacgcc gattcgtaac gaatggggta gccgctctaa    60
tgatagctct gacgagct                                                  78
<210>84
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>84
cgtcagagct atcattagag cggctacccc attcgttacg aatcggcgtc tccacttcgg    60
ttaacagaga                                                           70
<210>85
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>甲型流感病毒突变体
<400>85
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu
            20                  25
<210>86
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>86
catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt ctagatcgaa    60
cgattcaagt gatgagct                                                  78
<210>87
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物.
<400>87
catcacttga atcgttcgat ctagaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg    60
tcagcagaga                                                           70
<210>88
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pkk-BamHI-F-2
<400>88
cgtagaggat ccggagctta tcgactgcac gg                                  32
<210>89
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>89
gcgctcgaga tcacttgaat cgtt                                           24
<210>90
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>90
gcgctcgaga gcttattgac cgaagttgaa acc                                 33
<210>91
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>91
gcgctgcaga tcacttgaat cgtt                                       24
<210>92
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>92
gcgctgcagt ctctgctgac cgaag                                      25
<210>93
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>93
cgcgacatgt ctctgctgac cg                                         22
<210>94
<211>203
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>94
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr
            20                  25                  30
Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg
        35                  40                  45
Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser
    50                  55                  60
Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu
65                  70                  75                  80
Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn
            100                 105                 110
Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu
        115                 120                 125
Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val
    130                 135                 140
Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
145                 150                 155                 160
Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro
                165                 170                 175
Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
        195                 200
<210>95
<211>176
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>95
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile
65                  70                  75                  80
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
                85                  90                  95
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val
            100                 105                 110
Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu
        115                 120                 125
Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu
    130                 135                 140
Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg
145                 150                 155                 160
Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
                165                 170                 175
<210>96
<211>177
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>96
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                  10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile
65                  70                  75                  80
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val
            100                 105                 110
Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu
        115                 120                 125
Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu
    130                 135                 140
Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg
145                 150                 155                 160
Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
                165                 170                 175
Cys
<210>97
<211>183
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>97
Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
1               5                   10                  15
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu
            20                  25                  30
Trp Gly Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu
        35                  40                  45
Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu
    50                  55                  60
Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu
65                  70                  75                  80
His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp
                85                  90                  95
Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp
            100                 105                 110
Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly
        115                 120                 125
Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe
    130                 135                 140
Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr
                165                 170                 175
Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
            180
<210>98
<211>184
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>98
Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
1               5                   10                  15
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu
            20                  25                  30
Trp Gly Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu
        35                  40                  45
Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu
    50                  55                  60
Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu
65                  70                  75                  80
His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp
                85                  90                  95
Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp
            100                 105                 110
Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly
        115                 120                 125
Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe
    130                 135                 140
Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr
                165                 170                 175
Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Cys
            180
<210>99
<211>18
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>99
Met Gly Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu
1               5                   10                  15
Phe Gly
<210>100
<211>59
<212>DNA
<213>甲型流感病毒
<400>100
ggcgccatgg ggtctagatg taacgattca agtgacatcg acccttataa agaatttcg     59
<210>101
<211>16
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>101
Met Gly Cys Asn Asp Ser Ser Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly
1               5                   10                  15
<210>102
<211>52
<212>DNA
<213>甲型流感病毒
<400>102
gcgccatggg gtgtaacgat tcaagtgaca tcgaccctta taaagaattt gg            52
<210>103
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>xxx
<400>103
Glu Leu Leu Gly Trp Leu Trp Gly Ile Asp Ile
1               5                   10
<210>104
<211>14
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>104
Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile Asp
1               5                   10
<210>105
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>甲型流感病毒和乙型肝炎的嵌合体
<400>105
Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
1               5                   10                  15
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu
            20                  25                  30
Trp Gly Ile Asp Ile Asp
        35
<210>106
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>甲型流感病毒和乙型肝炎的嵌合体
<400>106
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>107
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>甲型流感病毒和乙型肝炎的嵌合体
<400>107
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp
            20                  25
<210>108
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>乙型肝炎和甲型流感病毒的嵌合体
<400>108
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                  10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp
            20                  25
<210>109
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>甲型流感病毒和乙型肝炎的嵌合体
<400>109
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp
            20                  25
<210>110
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>乙型肝炎和甲型流感病毒的嵌合体
<400>110
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp
            20                  25
<210>111
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>乙型肝炎和甲型流感病毒的嵌合体
<400>111
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Leu Glu Ser Leu Leu Thr Glu Val
            20                  25                  30
Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser
        35                  40                  45
Asp Glu Leu Asp
    50
<210>112
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>甲型流感病毒和乙型肝炎的嵌合体
<400>112
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Leu Glu Ser Leu Leu Thr Glu Val
            20                  25                  30
Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser
        35                  40                  45
Asp Glu Leu Asp
    50
<210>113
<211>77
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>乙型肝炎和甲型流感病毒的嵌合体
<400>113
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Leu Gln Ser Leu Leu Thr Glu Val
            20                  25                  30
Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser
        35                  40                  45
Asp Leu Glu Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
    50                  55                  60
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp
65                  70                  75
<210>114
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>114
gcgaagctta ctaacattga gattcccgag attgagatcg ccggcgacgc ggcgattgag    60
agcgtc                                                               66
<210>115
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>115
gcgaagctta ctattgagat tcccgagatt ga                                  32
<210>116
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有限制性内切核酸酶位点的扩增引物
<400>116
ggaaagctta ctaacattga gattcccg                                       28
<210>117
<211>35
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>117
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu
            20                  25                  30
Ser Gln Cys
        35
<210>118
<211>34
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>118
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu
            20                  25                  30
Ser Gln
<210>119
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>乙型肝炎的突变体
<400>119
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Cys
            20
<210>120
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>乙型肝炎突变体
<400>120
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro
            20
<210>121
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>乙型肝炎突变体
<400>121
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Cys
1               5                   10                  15
<210>122
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>乙型肝炎突变体
<400>122
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
1               5                   10                  15
<210>123
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>乙型肝炎突变体
<400>123
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Cys
1               5
<210>124
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>乙型肝炎突变体
<400>124
Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro
1               5
<210>125
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合蛋白N-末端融合体
<400>125
Met Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser
1               5
<210>126
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N-末端融合蛋白
<400>126
Met Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser
1               5
<210>127
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N-末端融合蛋白
<400>127
Met Gly Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser
1               5
<210>128
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N-末端融合蛋白
<400>128
Met Gly Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser
1               5
<210>129
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫
<400>129
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                  10                  15
Asn Ala Asn Pro
            20
<210>130
<211>92
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>130
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
            20                  25                  30
Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu
        35                  40                  45
Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser
    50                  55                  60
Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg
65                  70                  75                  80
Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
                85                  90
<210>131
<211>115
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>131
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
            20                  25                  30
Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu
        35                  40                  45
Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser
    50                  55                  60
Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg
65                  70                  75                  80
Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr
                85                  90                  95
Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp
            100                 105                 110
Ser Ser Asp
        115
<210>132
<211>93
<212>PRT
<213>流感病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>第1位的Xaa是甲硫氨酸或不存在。如果是甲硫氨酸，则第2-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第3-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>第3位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第4-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>第4位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第5-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>第5位的Xaa是苏氨酸或脯氨酸或不存在。如果是苏氨酸或脯氨酸，则第6-8位的
Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>第6位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第7-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>第7位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>第8位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>第8位的Xaa是谷氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>第10位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>第11位的Xaa是异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>第12位的Xaa是精氨酸或赖氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>第13位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>第14位的Xaa是谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>第16位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，则第16位的
Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>第17位的Xaa不存在或存在，如果存在，第17位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第17位的Xaa，则第15-16位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>第18位的Xaa是精氨酸、赖氨酸或不存在。如果是精氨酸或赖氨酸，则第15-17
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>第19位的Xaa不存在或存在，如果存在，第19位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第19位的Xaa，则第15-18位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>第20位的Xaa是天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬酰胺或丝氨酸
或甘氨酸，则第15-19位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>第21位的Xaa是天冬氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则第15
-20位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>第22位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-21位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>第23位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-22位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>第24位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第15-23位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>第25位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第26-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>第26位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第27-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>第27位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第28-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>第28位的Xaa是苏氨酸、脯氨酸或不存在。如果是苏氨酸或脯氨酸，则第29-31
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>第29位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第30-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>第30位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>第31位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(33)..(33)
<223>第33位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(34)
<223>第34位的Xaa是异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(35)..(35)
<223>第35位的Xaa是精氨酸或赖氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(36)..(36)
<223>第36位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>misc_feature
<222>(37)..(37)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(38)..(38)
<223>第38位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(39)..(39)
<223>第39位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，则第38位的
Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(40)..(40)
<223>第40位的Xaa不存在或存在，如果存在，第40位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第40位的Xaa，则第38-39位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>第41位的Xaa是精氨酸、赖氨酸或不存在。如果是精氨酸或赖氨酸，则第38-40
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>第42位的Xaa不存在或存在，如果存在，第42位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第42位的Xaa，则第38-41位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(43)..(43)
<223>第43位的Xaa是天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬酰胺、丝氨酸或
甘氨酸，则第38-42位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(44)..(44)
<223>第44位的Xaa是天冬氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则第38
-43位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(45)..(45)
<223>第45位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第38-44位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(46)..(46)
<223>第46位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第38-45位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(47)..(47)
<223>第47位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第38-46位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(48)..(48)
<223>第48位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第49-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(49)..(49)
<223>第49位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第50-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(50)..(50)
<223>第50位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第51-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(51)..(51)
<223>第51位的Xaa是苏氨酸、脯氨酸或不存在。如果是苏氨酸或脯氨酸，则第52-54
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(52)..(52)
<223>第52位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第53-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(53)..(53)
<223>第53位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(54)..(54)
<223>第54位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(56)..(56)
<223>第56位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或组氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(57)..(57)
<223>第57位的Xaa是异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(58)..(58)
<223>第58位的Xaa是精氨酸或赖氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(59)..(59)
<223>第59位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(60)..(60)
<223>第60位的Xaa是谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(61)..(61)
<223>第61位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(62)..(62)
<223>第62位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，则第61位的
Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(63)..(63)
<223>第63位的Xaa不存在或存在，如果存在，第63位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第63位的Xaa，则第61-62位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(64)..(64)
<223>第64位的Xaa是精氨酸、赖氨酸或不存在。如果是精氨酸或赖氨酸，则第61-63
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(65)..(65)
<223>第65位的Xaa不存在或存在，如果存在，第65位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第65位的Xaa，则第61-64位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(66)..(66)
<223>第66位的Xaa是天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬酰胺、丝氨酸或
甘氨酸，则第61-65位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(67)..(67)
<223>第67位的Xaa是天冬氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则第61
-66位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(68)..(68)
<223>第68位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第61-67位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(69)..(69)
<223>第69位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第61-68位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(70)..(70)
<223>第70位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第61-69位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(71)..(71)
<223>第71位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第72-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(72)..(72)
<223>第72位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第73-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(73)..(73)
<223>第73位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第74-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(74)..(74)
<223>第74位的Xaa是苏氨酸、脯氨酸或不存在。如果是苏氨酸或脯氨酸，则第75-77
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(75)..(75)
<223>第75位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第76-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(76)..(76)
<223>第76位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(77)..(77)
<223>第77位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(79)..(79)
<223>第79位的Xaa是脯氨酸、亮氨酸或组氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(80)..(80)
<223>第80位的Xaa是异亮氨酸或苏氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(81)..(81)
<223>第81位的Xaa是精氨酸或赖氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(82)..(82)
<223>第82位的Xaa是天冬酰胺或赖氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(83)..(83)
<223>第83位的Xaa是谷氨酸或甘氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(84)..(84)
<223>第84位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(85)..(85)
<223>第85位的Xaa是甘氨酸、谷氨酸或不存在。如果是甘氨酸或谷氨酸，则第84位的
Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(86)..(86)
<223>第86位的Xaa不存在或存在，如果存在，第86位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第86位的Xaa，则第84-85位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(87)..(87)
<223>第87位的Xaa是精氨酸、赖氨酸或不存在。如果是精氨酸或赖氨酸，则第84-86
位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(88)..(88)
<223>第88位的Xaa不存在或存在，如果存在，第88位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第88位的Xaa，则第84-87位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(89)..(89)
<223>第89位的Xaa是天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬酰胺、丝氨酸或
甘氨酸，则第84-88位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(90)..(90)
<223>第90位的Xaa是天冬氨酸、甘氨酸或不存在。如果是天冬氨酸或甘氨酸，则第84
-89位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(91)..(91)
<223>第91位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第84-90位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(92)..(92)
<223>第92位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第84-91位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(93)..(93)
<223>第93位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第84-92位的Xaa存在。
<400>132
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa
65                  70                  75                  80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
                85                  90
<210>133
<211>93
<212>PRT
<213>流感病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>第1位的Xaa是甲硫氨酸或不存在。如果是甲硫氨酸，则第2-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第3-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>第3位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第4-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>第4位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第5-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>第5位的Xaa是苏氨酸或不存在。如果是苏氨酸，则第6-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>第6位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第7-8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>第7位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第8位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>第8位的Xaa是谷氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>第15位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>第16位的Xaa是甘氨酸或不存在。如果是甘氨酸，则第15位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>第17位的Xaa不存在或存在，如果存在，第17位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第17位的Xaa，则第15-16位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>第18位的Xaa是精氨酸或不存在。如果是精氨酸，则第15-17位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>第19位的Xaa不存在或存在，如果存在，第19位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第19位的Xaa，则第15-18位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>第20位的Xaa是天冬酰胺或不存在。如果是天冬酰胺，则第15-19位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>第21位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第15-20位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>第22位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-21位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>第23位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第15-22位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>第24位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第15-23位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>第25位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第26-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>第26位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第27-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>第27位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第28-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>第28位的Xaa是苏氨酸或不存在。如果是苏氨酸，则第29-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>第29位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第30-31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>第30位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第31位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>第31位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(32)..(32)
<223>第38位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>misc_feature
<222>(38)..(38)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(39)..(39)
<223>第39位的Xaa是甘氨酸或不存在。如果是甘氨酸，则第38位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(40)..(40)
<223>第40位的Xaa不存在或存在，如果存在，第40位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第40位的Xaa，则第38-39位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>第41位的Xaa是精氨酸或不存在。如果是精氨酸，则第38-40位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>第42位的Xaa不存在或存在，如果存在，第42位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第42位的Xaa，则第38-41位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(43)..(43)
<223>第43位的Xaa是天冬酰胺或不存在。如果是天冬酰胺，则第38-42位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(44)..(44)
<223>第44位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第38-43位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(45)..(45)
<223>第45位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第38-44位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(46)..(46)
<223>第46位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第38-45位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(47)..(47)
<223>第47位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第38-46位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(48)..(48)
<223>第48位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第49-54位的Xaa存在。
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(49)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(50)..(50)
<223>第50位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第51-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(51)..(51)
<223>第51位的Xaa是苏氨酸或不存在。如果是苏氨酸，则第52-54位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(52)..(52)
<223>第52位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第53-54位的Xaa存在。
<220>
<221>misc_feature
<222>(53)..(53)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(54)..(54)
<223>第54位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(61)..(61)
<223>第61位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(62)..(62)
<223>第62位的Xaa是甘氨酸或不存在。如果是甘氨酸，则第61位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(63)..(63)
<223>第63位的Xaa不存在或存在，如果存在，第63位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
 氨酸。如果存在第63位的Xaa，则第61-62位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(64)..(64)
<223>第64位的Xaa是精氨酸或不存在。如果是精氨酸，则第61-63位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(65)..(65)
<223>第65位的Xaa不存在或存在，如果存在，第65位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第65位的Xaa，则第61-64位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(66)..(66)
<223>第66位的Xaa是天冬酰胺或不存在。如果是天冬酰胺，则第61-65位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(67)..(67)
<223>第67位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第61-66位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(68)..(68)
<223>第68位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第61-67位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(69)..(69)
<223>第69位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第61-68位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(70)..(70)
<223>第70位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第61-69位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(71)..(71)
<223>第71位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第72-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(72)..(72)
<223>第72位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第73-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(73)..(73)
<223>第73位的Xaa是亮氨酸或不存在。如果是亮氨酸，则第74-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(74)..(74)
<223>第74位的Xaa是苏氨酸或不存在。如果是苏氨酸，则第75-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(75)..(75)
<223>第75位的Xaa是谷氨酸或不存在。如果是谷氨酸，则第76-77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(76)..(76)
<223>第76位的Xaa是缬氨酸或不存在。如果是缬氨酸，则第77位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(77)..(77)
<223>第77位的Xaa是谷氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(84)..(84)
<223>第84位的Xaa是色氨酸或不存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(85)..(85)
<223>第85位的Xaa是甘氨酸或不存在。如果是甘氨酸，则第84位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(86)..(86)
<223>第86位的Xaa不存在或存在，如果存在，第86位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第86位的Xaa，则第84-85位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(87)..(87)
<223>第87位的Xaa是精氨酸或不存在。如果是精氨酸，则第84-86位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(88)..(88)
<223>第88位的Xaa不存在或存在，如果存在，第88位的Xaa是半胱氨酸、丝氨酸或丙
氨酸。如果存在第88位的Xaa，则第84-87位存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(89)..(89)
<223>第89位的Xaa是天冬酰胺或不存在。如果是天冬酰胺，则第84-88位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(90)..(90)
<223>第90位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第84-89位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(91)..(91)
<223>第91位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第84-90位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(92)..(92)
<223>第92位的Xaa是丝氨酸或不存在。如果是丝氨酸，则第84-91位的Xaa存在。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(93)..(93)
<223>第93位的Xaa是天冬氨酸或不存在。如果是天冬氨酸，则第84-92位的Xaa存在。
<400>133
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
            20                  25                  30
Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile
65                  70                  75                  80
Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
                85                  90
<210>134
<211>23
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>134
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>135
<211>23
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>135
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>136
<211>23
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>136
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Glu Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp
            20
<210>137
<211>23
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>137
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Lys Asn Glu Trp Glu Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>138
<211>23
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>138
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu Cys
1               5                   10                  15
Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp
            20
<210>139
<211>23
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>139
Ser Leu Leu Thr Glu Val Asp Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp
            20
<210>140
<211>23
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>140
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Glu Cys
1               5                   10                  15
Lys Cys Arg Asp Ser Ser Asp
            20

Claims (19)

1.重组乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白嵌合体分子，其是表2A所示的构建体1817和1818。
2.包含权利要求1的重组乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白嵌合体分子的颗粒。
3.一种疫苗或接种物，包含溶解或分散于药学可接受稀释剂中的治疗有效量的权利要求2的免疫原性颗粒。
4.权利要求3的疫苗或接种物，其中所述重组嵌合HBc蛋白分子颗粒存在于植物组织中。
5.权利要求3的疫苗或接种物，进一步包含佐剂。
6.权利要求5的疫苗或接种物，其中所述佐剂是明矾。
7.权利要求5的疫苗或接种物，其中所述佐剂是选自胞壁酰二肽、7-取代的8-氧-或8-硫-鸟苷衍生物、单磷脂酰脂质A、铝或钙盐的小分子。
8.权利要求5的疫苗或接种物，其中所述佐剂是一种油，所述油用所述免疫原性颗粒和所述药学可接受稀释剂乳化，以形成乳液。
9.权利要求8的疫苗或接种物，其中所述乳液是具有水相和油相的油包水乳液。
10.权利要求8的疫苗或接种物，其中所述乳液是具有水相和油相的水包油乳液。
11.权利要求10的疫苗或接种物，其中所述乳液的油相包含角鲨烯。
12.权利要求8的疫苗或接种物，其中所述乳液的油相包含角鲨烷。
13.权利要求8的疫苗或接种物，其中所述乳液的水相和油相是由乳化剂乳化的，所述乳化剂是山梨聚糖或二缩甘露醇C12-C24脂肪酸酯。
14.权利要求8的疫苗或接种物，其中所述乳化剂是二缩甘露醇C12-C24脂肪酸酯。
15.权利要求14的疫苗或接种物，其中所述二缩甘露醇C12-C24脂肪酸酯的C12-C24脂肪酸是油酸。
16.编码权利要求1的重组HBc蛋白分子的核酸，或其互补序列。
17.一种重组核酸分子，包含操作性连接于限定编码权利要求1的重组HBc蛋白分子的基因或其互补序列的核酸片段和启动子。
18.用权利要求17的重组核酸分子转化的宿主细胞。
19.权利要求18的转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂交体。
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