BR112012000826B1

BR112012000826B1 - Método para a preparação de vesículas

Info

Publication number: BR112012000826B1
Application number: BR112012000826-9A
Authority: BR
Inventors: David E. Anderson; Andrei Ogrel
Original assignee: Variation Biotechnologies Inc
Priority date: 2009-07-06
Filing date: 2010-07-06
Publication date: 2022-07-26
Also published as: EP2451950B1; MX2012000372A; EP2451950B9; WO2011005769A9; IL247238B; ES2573427T9; CA2767392C; ES2573427T3; EP2451950A4; JP2012532200A; US20120156240A1; JP5854559B2; IL247238A0; WO2011005769A1; CA2767392A1; AU2010270722B2; CN107029229A; CN107029229B; CN102482666A; IL217375A

Abstract

MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE VESÍCULAS. A presente divulgação fornece métodos para a preparação de vesículas. Em algumas modalidades, os métodos envolvem o fornecimento de uma mistura fundida de lipídios formadores de vesículas e então pela adição da mistura fundida em uma solução aquosa compreendendo um antígeno de modo que vesículas contendo antígeno sejam formadas. Em outras modalidades, os métodos envolvem o fornecimento de um produto lipídico liofilizado e reidratação do produto lipídico liofilizado com uma solução aquosa compreendendo um antígeno de modo que as vesículas contendo antígeno sejam formadas. O produto lipídico liofilizado é preparado por fusão dos lipídios formadores de vesículas a fim de produzir uma mistura lipídica fundida e então pela liofilização da mistura lipídica fundida. A presente divulgação também fornece formulações de vesícula contendo antígeno preparadas utilizando esses métodos. A presente divulgação proporciona também kits que incluem um produto lipídico liofilizado em um primeiro recipiente e uma solução aquosa compreendendo um antígeno em um segundo recipiente.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica a prioridade segundo o Código Federal norte-americano, título 35, seção 119(e), para o pedido provisório norte-americano de n° 61/223, 196, depositado em 06 de julho de 2009 e para o pedido provisório norte-americano de n° 61/256, 912, depositado em 30 de outubro de 2009, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.

Antecedentes

[002] As vesículas foram primeiro descritas na década de 1960 como um modelo de membranas celulares (ver Bangham et al., J. Mol. Biol. 13:238-252, 1965). As vesículas encontraram uma série de aplicações na entrega de fármacos de moléculas pequenas, adjuvância de vacina, transferência de genes e diagnóstico por imagem (por exemplo, ver Liposome Technology, 3 a Edição, Editado por Gregory Gregoriadis, Informa HealthCare, 2006 e Liposomes: A Practical Approach (The Practical Approach Series, 264), 2 a Edição, editado por Vladimir Torchilin e Volkmar Weissig, Oxford University Press, EUA, 2003).

[003] Um número de métodos para a preparação de vesículas foram descritos (por exemplo, ver as referências citadas acima e Walde e Ichikawa, Biomol. Eng., 18:143-177, 2001). No entanto, permanence ainda a necessidade na técnica de métodos que possam ser utilizados para aprisionar as substâncias dentro de vesículas.

[004] Um método que foi descritos na técnica é o chamado método de fusão de 3- etapas. Os lipídios formadores de vesículas são inicialmente fundidos à temperaturas elevadas (por exemplo, 120°C). Uma emulsão é criada em uma segunda etapa através da adição de um tampão aquoso (por exemplo, tampão de bicarbonato) aos lipídios fundidos. Finalmente, a substância a ser aprisionada é homogeneizada com os componentes da emulsão a uma temperatura reduzida (por exemplo, 50°C) antes da liofilização. Alternativamente, as vesículas da emulsão são liofilizadas e então reconstituídas na presença da substância a ser aprisionada.

[005] Embora os métodos tais como esse possam muito bem ser adequados para o aprisionamento de substâncias passíveis de resistir a temperaturas elevadas e/ou pequenas moléculas capazes de se difundir rapidamente em vesículas vazias, nós descobrimos que eles não são adequados para o aprisionamento dos tipos de antígenos (por exemplo, polipeptídios, vírus, etc.), que são comumente utilizados nas vacinas. Em particular, verificou-se que esses métodos produzem eficiências de aprisionamento baixas e podem reduzir drasticamente a atividade do antígeno subjacente (por exemplo, conforme medido por respostas imunológicas). Existe, portanto, uma necessidade na técnica de métodos de preparação de vesículas que sejam capazes de aprisionar antígenos, enquanto minimizas o impacto sobre a atividade do antígeno.

Sumário

[006] Em um aspecto, a presente divulgação fornece métodos para a preparação de vesículas que incluem etapas de fornecimento de uma mistura fundida de lipídios formadores de vesículas e, então, adicionando a mistura fundida a uma solução aquosa compreendendo um antígeno de modo a formar as vesículas contendo o antígeno.

[007] Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece métodos para a preparação de vesículas que incluem as etapas de fornecimento de um produto lipídico liofilizado e reidratação do produto lipídico liofilizado com uma solução aquosa compreendendo um antígeno de modo a formar as vesículas contendo antígeno. O produto lipídico liofilizado é preparado por fusão dos lipídios formadores de vesículas a fim de produzir uma mistura lipídica fundida e então pela liofilização da mistura lipídica fundida.

[008] Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece formulações de vesículas contendo antígeno preparadas utilizando esses métodos. Em algumas modalidades, as formulações de vesículas contendo antígeno exibem níveis de aprisionamento de antígeno que são mais elevados do que aqueles obtidos utilizando os métodos do estado da técnica. Em algumas modalidades, as formulações de vesículas contendo antígeno exibem níveis de atividade de antígeno que são mais elevados do que aqueles obtidos utilizando os métodos do estado da técnica.

[009] Ainda em outro aspecto, a presente divulgação proporciona kits que incluem um produto lipídico liofilizado em um primeiro recipiente e uma solução aquosa compreendendo um antígeno em um segundo recipiente. Em algumas modalidades, o kit também inclui instruções para misturar os teores dos dois recipientes, a fim de produzir formulações de vesículas contendo antígenos.

Breve Descrição dos Desenhos

[0010] A Figura 1 compara os tamanhos médios de partícula para duas formulações de vesículas que foram preparadas utilizando o método de fusão de 3 etapas do Exemplo 1 e o método de fusão invertida de 2 etapas do Exemplo 2. As formulações foram liofilizadas e, em seguida, reidratadas na presença de tampão contendo 2 μg de antígeno de hepatite A inativado. O tamanho da vesícula, que é um bom marcador de estabilidade, foi medido utilizando um mastersizer imediatamente após hidratação e 2, 4 e 6 horas depois.

[0011] A Figura 2 mostra a resposta imunológica causada por vesículas contendo o antígeno da hepatite A. As vesículas vazias foram preparadas utilizando o método de fusão de 3 etapas do Exemplo 1 e o método de fusão invertida de 2 etapas do Exemplo 2. As formulações foram liofilizadas e, em seguida, reidratadas na presença de tampão contendo 2 μg de antígeno de hepatite A inativado. Os camundongos foram imunizados por via oral 3 vezes nos dias 0, 14 e 28, e os soros foram testados quanto à reatividade 14 dias após a última vacinação. Cada símbolo representa o título final de soro de um animal individual.

[0012] A Figura 3 mostra que o teor de sal biliar em vesículas afeta a maturação de células dendríticas imaturas conforme evidenciado por citometria de fluxo. A maturação de células dendríticas imaturas foi medida por citometria de fluxo utilizando anticorpos anti-MHC II e anticorpos anti-CD86. AS DCs maduras foram definidas como duplo positivo para ambos os anticorpos. As células dendríticas imaturas foram tratadas com vesículas lipídicas de tensoativo não iônico (NISVs) preparadas conforme as etapas 1 e 2 do Exemplo 2 (sem a adição subsequente de antígeno) e com ou sem duas razões molares diferentes de ácido biliar para total de lipídios (0,1 e 0,5). Como um controle positivo as células dendríticas imaturas foram tratadas com TNF-α sozinho.

[0013] A Figura 4 compara o espectro de 31P RMN de vesículas exemplares preparadas pelos métodos do Exemplo 1 e 2 sem a adição de qualquer antígeno. Todos os espectros foram colhidos a 25°C.

Definições

[0014] Ao longo da presente divulgação, os diversos termos são utilizados e definidos nos parágrafos a seguir.

[0015] Tal como aqui utilizado, o "antígeno" refere-se a uma substância que contém um ou mais epítopos (linear, conformacional ou ambos) que podem ser reconhecidos por um anticorpo. Em certas modalidades, um antígeno pode ser um vírus, um polipeptídio, um polinucleotídeo, um polissacarídeo, etc. O termo “antígeno” indica tanto os antígenos de subunidade, (isto é, os antígenos que são separados e distintos de um organismo inteiro com o qual o antígeno é associado na natureza), bem com bactérias, vírus, fungos, parasitas mortos, atenuados ou inativados, ou outros micróbios. Em certas modalidades, um antígeno pode ser um "imunógeno".

[0016] Tal como aqui utilizado, o "aprisionamento" refere-se a qualquer tipo de associação física entre uma substância e uma vesícula, por exemplo, encapsulação, adesão (à parede interna ou externa da vesícula) ou incorporação na parede, com ou sem a extrusão da substância. O termo é utilizado de forma intercambiável com os termos "carregando" e "contendo".

[0017] Tal como aqui utilizado, o termo "resposta imunológica" refere-se a uma resposta eliciada em um animal. Uma resposta imunológica pode se referir à imunidade celular, imunidade humoral ou podem envolver ambas. Uma resposta imunológica também pode ser limitada a uma parte do sistema imunológico. Por exemplo, em certas modalidades, uma formulação imunogênica pode induzir uma resposta de IFNY aumentada. Em certas modalidades, uma formulação imunogênica pode induzir uma resposta mucosa de IgA (por exemplo, como medido em lavagens nasal e/ou retal). Em certas modalidades, uma formulação imunogênica pode induzir uma resposta mucosa de IgA (por exemplo, como medido em lavagens nasal e/ou retal).

[0018] Tal como aqui utilizado, o termo "imunogênico" significa a capacidade de produzir uma resposta imunológica em um animal hospedeiro contra uma entidade não hospedeira (por exemplo, um vírus da hepatite A ou um vírus da hepatite B). Em certas modalidades, essa resposta imunológica constitui a base da imunidade protetora provocada por uma vacina contra um organismo infeccioso específico (por exemplo, um vírus da hepatite A ou um vírus da hepatite B). Um "imunógeno" é uma substância imunogênica (por exemplo, uma molécula).

[0019] Tal como aqui utilizado, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade suficiente para mostrar um benefício significativo em um paciente em tratamento. A quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação imunogênica pode variar dependendo de fatores tais como o desfecho biológico desejado, a natureza da formulação, a via de administração, a saúde, tamanho, e/ou idade do paciente em tratamento, etc.

[0020] Tal como aqui utilizado, o termo "polipeptídio" refere-se a uma proteína (isto é, uma fita de pelo menos dois aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas). Em algumas modalidades, os polipeptídios podem incluir outras porções que não aminoácidos (por exemplo, podem ser glicoproteínas, proteoglicanos, lipoproteínas, etc.) e/ou podem ser de outro modo processados ou modificados. Os técnicos no assunto apreciarão que uma "proteína" pode ser uma cadeia polipeptídica completa tal como a produzida por uma célula (com ou sem uma sequência de sinais), ou pode ser uma porção dessa. Os técnicos no assunto verificarão que uma proteína pode às vezes incluir mais do que uma cadeia polipeptídica, por exemplo, ligada por uma ou mais ligações dissulfito ou associada por outros meios. Os polipeptídeos podem conter L-aminoácidos, D-aminoácidos, ou ambos e podem conter qualquer variedade de modificações de aminoácidos ou análogos conhecidos na técnica. As modificações úteis incluem, por exemplo, acetilação do terminal, amidação, etc. Em algumas modalidades, os polipeptídios podem compreender aminoácidos naturais e aminoácidos não naturais, aminoácidos sintéticos, e suas combinações.

[0021] Conforme aqui utilizado, o termo "polissacarídeo" refere-se a um polímero de açúcares. O polímero pode incluem açúcares naturais (por exemplo, arabinose, lixose, ribose, xilose, ribulose, xilulose, alose, altrose, galactose, glicose, gulose, idose, manose, talose, frutose, psicose, sorbose, tagatose, manoeptulose, sedoheptulose, octolose, e sialose) e/ou açúcares modificados (por exemplo, 2'-fluororibose, 2'- desoxirribose, e hexose). Os polissacarídeos exemplares incluem glicogênio, amido, dextrano, celulose, etc.

[0022] Tal como aqui utilizado, o "polinucleotídeo" refere-se a um polímero de nucleotídeos. O polímero pode incluir nucleosídeos naturais (isto é, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina, e desoxicitidina), análogos de nucleosídeos (por exemplo, 2-aminoadenosina, 2- tiothmidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3 - metil adenosina, 5-metilcitidina, C5-bromouridina, C5- fluorouridina, C5-iodouridina, C5-propinil-uridina, C5- propinil-citidina, C5-metilcitidina, 7-deazaadenosina, 7- deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina , O (6)- metilguanina, 4-acetilcitidina, 5 - (carboxihidroximetil)- uridina, dihidrouridina, metilpseudouridina, 1-metil- adenosina, 1-metil guanosina, N6-metil-adenosina, e 2 tiocitidina-), bases quimicamente modificadas, bases biologicamente modificadas (por exemplo, bases metiladas), bases intercaladas, açúcares modificados (por exemplo, 2'- fluororibose, ribose, 2'-desoxirribose, 2'-O-metilcitidina, arabinose, e hexose), ou grupos fosfato modificados (por exemplo, ligações fosforotioatos e 5 '-N-fosforamidita).

[0023] Tal como aqui utilizado, o termo " terapêutico de molécula pequena" refere-se a uma molécula terapêutica não polimérica que pode conter vários ligações carbono- carbono e têm um peso molecular de menos de cerca de 1500 Da (por exemplo, inferior a cerca de 1000 Da, inferior a cerca de 500 Da ou inferior a cerca de 200 Da). Um terapêutico de molécula pequena pode ser sintetizado em um laboratório (por exemplo, por síntese combinatória, utilizando um microrganismo modificado, etc.) ou pode ser encontrado na natureza (por exemplo, um produto natural). Em geral, um terapêutico de molécula pequena pode alterar, inibir, ativar ou de outro modo afetar um evento biológico. Por exemplo, o terapêutico de moléculas pequenas pode incluir, entre outros, substâncias anti-AIDS, substâncias anticancerosas, antibióticos, substâncias anti-diabéticas, imunossupressores, substâncias anti-virais, inibidores enzimáticos, neurotoxinas, opióides, hipnóticos, anti- histamínicos, lubrificantes, tranquilizantes, anti- convulsivos, relaxantes musculares e substâncias anti-Parkinson, anti-espasmódicos e contratantes musculares, tais como bloqueadores de canal, mióticos e anti- colinérgicos, compostos anti-glaucoma, compostos anti- parasitas e/ou anti-protozoários, moduladores de interações célula-matriz extracelular incluindo os inibidores de crescimento celular e moléculas anti-adesão, agentes vasodilatadores, inibidores de DNA, RNA ou síntese de proteínas, anti-hipertensivos, analgésicos, antipiréticos, agentes anti-inflamatórios esteróides e não esteróides, fatores anti- angiogênicos, fatores anti-secretores, anticoagulantes e/ou agentes antitrombóticos, anestésicos locais, oftálmicos, prostaglandinas, antidepressivos, substâncias anti-psicóticas, anti-eméticos, e agentes de imagem. Uma lista mais completa de moléculas pequenas exemplares adequadas para a utilização nos métodos da presente divulgação pode ser encontrada em Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications, Edited de Axel Kleemann e Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999; Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals, editado por Susan Budavari et al., CRC Press, 1996, e United States Pharmacopeia-25/National formulary- 20, publicado pela United States Pharmacopeial Convention (Convenção Farmacopéica dos Estados Unidos), Inc., 2001. De preferência, embora não necessariamente, a molécula pequena é uma que já tenha sido considerada segura e eficaz para a utilização pela agência governamental apropriada ou corpo. Por exemplo, os fármacos para uso humano listados pela FDA no título 21 do Código Federal norte-americano seção 330.5, 331 até 361, e 440 até 460 e fármacos para uso veterinário listados pela FDA no título 21 do Código Federal Norte- americano, Seção 500 até 589, são todos considerados aceitáveis para a utilização em conformidade com os métodos da presente divulgação.

[0024] Conforme aqui utilizado, o termo "tratar" (ou "tartando", "tratado", "tratamento", etc.)

[0025] refere-se à administração de uma formulação a um paciente que sofre de uma doença, um sintoma de um alívio, melhora ou afetação da doença, um sintoma ou sintomas da doença, ou a predisposição para a doença Em certas modalidades, o termo "tratando" refere-se à vacinação de um paciente. Descrição Detalhada de Algumas Modalidades. Métodos para o Preparo de Vesículas

[0026] A presente divulgação fornece métodos para a preparação de vesículas. As vesículas têm, geralmente, um compartimento aquoso fechado por uma ou mais bicamadas que incluem lipídios, opcionalmente com outras moléculas. Por exemplo, conforme discutido em mais detalhe abaixo, em algumas modalidades, as vesículas da presente divulgação compreendem moléculas potenciadoras de transporte (por exemplo, sais biliares), que facilitam o transporte de lipídios através das membranas mucosas.

[0027] Em um aspecto, a presente divulgação fornece métodos para a preparação de vesículas que incluem etapas de fornecimento de uma mistura fundida de lipídios formadores de vesículas e, então, adicionando a mistura fundida a uma solução aquosa compreendendo um antígeno de modo a formar as vesículas contendo o antígeno. Em algumas modalidades, a solução aquosa compreendendo um antígeno é controlada por temperatura. Em algumas modalidades, a solução aquosa compreendendo um antígeno é mantida a uma temperatura inferior a cerca de 50°C durante a etapa de adição (por exemplo, menos de cerca de 40°C, menos de cerca de 30°C, etc.). Em algumas modalidades, a solução aquosa compreendendo um antígeno é mantida a uma temperatura entre cerca de 25°C e cerca de 50°C. Em algumas modalidades, a solução aquosa compreendendo um antígeno é mantida à temperatura ambiente.

[0028] Deve-se entender que uma mistura fundida de lipídios formadores de vesícula pode ser obtida de qualquer forma, por exemplo, os lipídios são fundidos a fim de formar uma mistura fundida. Em algumas modalidades, os lipídios são fundidos a uma faixa de temperatura entre 120°C e 150°C (por exemplo, entre 120°C e 125°C, entre 120°C e 130°C, entre 120°C e 140°C, entre 130°C e 140°C, entre 135°C e 145°C, ou entre 140°C e 145°C). Em algumas modalidades, os lipídios são fundidos a cerca de 120°C. Em algumas modalidades, os lipídios são fundidos a cerca de 125°C. Em algumas modalidades, os lipídios são fundidos a cerca de 130°C. Em algumas modalidades, os lipídios são fundidos a cerca de 135°C. Em algumas modalidades, os lipídios são fundidos a cerca de 140°C. Em algumas modalidades, os lipídios são fundidos a cerca de 145°C. Em algumas modalidades, os lipídios são fundidos a cerca de 150°C.

[0029] Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece métodos para a preparação de vesículas que incluem as etapas de fornecimento de um produto lipídico liofilizado e reidratação do produto lipídico liofilizado com uma solução aquosa compreendendo um antígeno de modo a formar as vesículas contendo antígeno. O produto lipídico liofilizado é preparado por fusão dos lipídios formadores de vesículas a fim de produzir uma mistura lipídica fundida e então pela liofilização da mistura lipídica fundida.

[0030] Sem pretensão de vínculo a qualquer teoria, pensa-se que, adicionando uma solução aquosa de antígenos ao produto lipídico liofilizado, as vesículas são formadas na presença do antígeno. Isso pode explicar as altas eficácias de aprisionamento observadas. Além disso, os métodos da presente divulgação evitam a exposição do antígeno a solventes orgânicos e temperaturas elevadas. Sem pretensão de vínculo a qualquer teoria, isso pode explicar a atividade elevada (isto é, antigenicidade e/ou imunogenicidade) dos antígenos aprisionados nas formulações resultantes.

Lipídios formadores de Vesícula

[0031] Os lipídios são moléculas orgânicas que são geralmente insolúveis em água mas solúveis em solventes orgânicos não polares (por exemplo, éter, clorofórmio, acetona, benzeno, etc.) Os ácidos graxos são uma classe de lipídios que incluem uma porção de ácido ligada a uma cadeia de hidrocarboneto saturada ou insaturada. Os exemplos específicos incluem o ácido láurico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido palmitoleico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido araquidónico, etc. Os sais de metais alcalinos de ácidos graxos são, normalmente, mais solúveis em água do que os ácidos em si. Os ácidos graxos e seus sais que incluem cadeias de hidrocarbonetos com oito ou mais átomos de carbono, muitas vezes exibem propriedades anfifílicas, devido à presença tanto de regiões hidrofílicas (cabeça) e hidrofóbicas (final) na mesma molécula. Os lipídios não-iônicos que incluem grupos polares cabeça podem também exibir propriedades anfifílicas (isto é, tensoativas). Os triésteres de ácidos graxos com glicerol (1,2,3 trihidroxipropano) compõem uma outra classe de lipídios conhecida como triglicerídeos que são comumente encontrados em gorduras animais e óleos vegetais. Os ésteres de ácidos graxos com álcoois monohídricos de cadeia longa formam uma outra classe de lipídios que são encontrados em ceras. Os fosfolipídios são ainda uma outra classe de lipídios. Eles se assemelham a triglicerídeos ao ser porção éster fosfato do ácido fosfatídico resultante pode ser ainda esterificada com etanolamina, colina ou a serina no fosfolipídio em si. Deve-se entender que os métodos podem ser utilizados com qualquer lipídio que seja capaz de formar vesículas, incluindo qualquer um dos lipídios que são descritos na técnica anterior (por exemplo, em Liposome Technology, 3° Edition, editado por Gregory Gregoriadis, Informa HealthCare, 2006 e Liposomes: A Practical Approach (The Practical Approach Series, 264), 2 a Edição, editado por Vladimir Torchilin e Volkmar Weissig, Oxford University Press, EUA, 2003).

[0032] Em algumas modalidades, o lipídio formador de vesículas é um fosfolipídio. Qualquer fosfolipídio de ocorrência natural ou sintético pode ser utilizado. Sem limitação, os exemplos de fosfolipídios específicos são L- α-(distearoil) lecitina, L-α-(diapalmitoil) lecitina, ácido L-a-fosfatídico, ácido L-a-(dilauroil)-fosfatídico, ácido L-α (dimiristoil) fosfatídico, ácido L-α(dioleoil) fosfatídico, ácido DL-α (dipalmitoil) fosfatídico, ácido L- α (distearoil) fosfatídico, e os vários tipos de L-α- fosfatidilcolinas preparados a partir de cérebro, fígado, gema de ovo, coração, soja, e similares, ou sinteticamente, e sais desses.

[0033] Em algumas modalidades, o lipídio formador de vesículas é um tensoativo não-iônico. As vesículas de tensoativo não iônicos são aqui referidas como "NISVs". Sem limitação, os exemplos adequados de tensoativos não iônicos incluem tensoativos ligados por éster com base em glicerol. Tais ésteres de glicerol podem compreender um dois grupos acila alifáticos superiores, por exemplo, contendo pelo menos dez átomos de carbono em cada porção acila. Os tensoativos com base em tais ésteres de glicerol podem compreender mais do que uma unidade de glicerol, por exemplo, até 5 unidades de glicerol. Os monoésteres de glicerol podem ser utilizados, por exemplo, aqueles contendo uma porção de C12-C20alcanoíla ou alcenoíla, por exemplo caproíla, lauroíla, miristoíla, palmitoíla, estearoíla ou oleílica. Um tensoativo não iônico exemplar é 1 - glicerol monopalmitoíla.

[0034] Em algumas modalidades, os tensoativos ligados por éster podem também ser utilizados como o tensoativo não-iônico. Por exemplo, os tensoativos ligados por éter com base em glicerol ou um glicol tendo um glicol alifático inferior de até 4 átomos de carbono, tais como etileno glicol, são adequados. Os tensoativos com base em tais glicóis podem compreender mais do que uma unidade de glicol, por exemplo, até 5 unidades de glicol (por exemplo, diglicolacetil éter e/ou polioxietileno-3-lauril éter). Os monoéteres de glicol ou glicerol podem ser utilizados, incluindo aqueles que contêm uma porção alcanil C12-C20 ou alquenila, por exemplo capril, lauril, miristil, cetil, estearil ou oleíla. Os produtos de condensação de óxido de etileno que podem ser utilizados incluem os descritos na Publicação PCT N ° Os exemplos de tensoativos ligados por éter incluem 1-monocetil glicerol éter e diglicocetil éter.

Outros componentes

[0035] Em algumas modalidades, as vesículas podem conter outros componentes lipídicos e não-lipídicos, desde que esses não evitem a formação de vesículas. Deve-se entender que esses componentes podem ser co-misturados com os lipídios formadores de vesículas e/ou podem ser co- misturados com o (s) antígeno (s). Em algumas modalidades, descobrimos que pode ser vantajoso a co-mistura desses componentes com os lipídios formadores de vesículas.

[0036] Em algumas modalidades, as vesículas podem incluir uma molécula potenciadora de transporte que facilita o transporte de lipídios através das membranas mucosas. Tal como descrito na patente Norte-americana n° 5,876,721, uma variedade de moléculas podem ser utilizadas como potenciadores de transporte. Por exemplo, os derivados de colesterol nos quais o átomo de carbono C23 da cadeia lateral transporta um ácido carboxílico, e/ou os seus derivados, podem ser utilizados como potenciadores de transporte. Tais derivados incluem, entre outros, os “ácidos biliares”, ácido cólico e ácido quenodesoxicólico, seus produtos de conjugação com glicina ou taurina, tais como ácido glicocólico e taurocólico, ácido desoxicólico, os derivados incluindo e ursodesoxicólico, e sais de cada um desses ácidos. As NISVs que ainda incluem um ácido biliar ou sal são aqui referidas como "bilossomos". Em algumas modalidades, os potenciadores de transporte incluem aminoácidos aciloxilados, tais como acilcarnitinas e sais dessas. Por exemplo, a acilcarnitina contendo porções C6-20 alcanoil ou alcenoil, tais como palmitoilcarnitina, pode ser utilizada como potenciadores de transporte. Tal como aqui utilizado, o termo aminoácido aciloxilado se destina a cobrir aminoácidos primários, secundários e terciários assim como aminoácidos α, β e y. As acilcarnitinas são exemplos de aminoácidos y aciloxilados. Deve-se entender que as vesículas podem compreender mais do que um tipo de potenciador de transporte, por exemplo, um ou mais sais biliares diferentes e uma ou mais acilcarnitinas. O (s) potenciador (es) de transporte, se presente (s), compreendem normalmente entre 40 e 400% por cento em peso do lipídio formador de vesículas (por exemplo, entre 60 e 100%, em peso, ou entre 70 e 90% em peso). Em algumas modalidades, o potenciador de transporte, se presente, compreenderá entre 1 e 40% por cento em peso do lipídio formador de vesículas (por exemplo, entre 1 e 20% em peso, entre 1 e 25% em peso, entre 1 e 30% em peso, entre 1 e 35% em peso, entre 2 e 25% em peso, entre 2 e 30%, em peso, ou entre 2 e 35% em peso).

[0037] Em certas modalidades, as vesículas podem não conter uma molécula potenciadora de transporte. Em algumas modalidades, as vesículas podem não conter um “ácido biliar”, tal como ácido cólico e ácido quenodesoxicólico, seus produtos de conjugação com glicina ou taurina, tais como ácido glicocólico e taurocólico, ácido desoxicólico, os derivados incluindo e ursodesoxicólico, e sais de cada um desses ácidos. Em algumas modalidades, as vesículas podem carecer de aminoácidos aciloxilados, tais como acilcarnitinas e sais desses, e palmitoilcarnitinas.

[0038] Em algumas modalidades, as vesículas podem incluir um tensoativo iônico, por exemplo, para fazer com que as vesículas assumam uma carga negativa. Por exemplo, isso pode ajudar a estabilizar as vesículas e proporcionar a dispersão eficaz. Sem limitação, os materiais ácidos tais como ácidos alcanóico e alquenóico superiores (por exemplo, ácido palmítico, ácido oleico) ou outros compostos que contenham grupos ácidos, incluindo fosfatos tais como dialquil fosfatos (por exemplo, dicetilfosfato, ou ácido fosfatídico ou fosfatidilserina) e monoésteres de sulfato, tais como sulfatos de alquila superiores (por exemplo, cetilssulfato), podem todos ser utilizados para esse fim. O tensoativo iônico, se presente, compreende normalmente, entre 1 e 30% em peso do lipídio formador de vesículas. Por exemplo, entre 2 e 20%, em peso, ou entre 5 e 15% em peso. Em algumas modalidades, o tensoativo iônico, se presente, compreende entre 1 e 50% em peso do lipídio formador de vesículas (por exemplo, entre 1 e 35% em peso, entre 5 e 40% em peso, entre 10 e 40% em peso, entre 15 e 40% em peso, entre 20 e 40% em peso, ou entre 20 e 35% em peso).

[0039] Em algumas modalidades, as vesículas podem incluir um material hidrofóbico apropriado de maior massa molecular que facilita a formação de bicamadas (tal como um esteróide, por exemplo, um esterol, tal como o colesterol). Em algumas modalidades, a presença do esteróide pode auxiliar na formação da bicamada na qual as propriedades físicas da vesícula dependem. O esteróide, se presente, compreende normalmente, entre 20 e 120% em peso do lipídio formador de vesículas. Por exemplo, entre 25 e 90%, em peso, ou entre 35 e 75% em peso. Em algumas modalidades, o esteróide, se presente, compreenderá entre 25 e 95% em peso, entre 25 e 105% em peso, entre 35 e 95% em peso, ou entre 35 e 105% em peso do lipídio formador de vesículas.

[0040] Em algumas modalidades, um lioprotetor podem ser incluído em qualquer solução ou mistura antes da liofilização. Os lioprotetores exemplares incluem sacarose, trealose, polietileno glicol (PEG), tampão dimetil- succinato (DMS), albumina de soro bovino (BSA),

[0041] Em algumas modalidades, as vesículas da presente divulgação são bilossomos que ainda incluem um tensoativo iônico ou um esteróide. Em algumas modalidades, os bilossomas pode incluir tanto tensoatico iônico quanto um esteróide.

[0042] Em algumas modalidades, as vesículas da presente divulgação são vesículas não-iônicas (NISVs) que carecem de uma molécula potenciadora de transporte e que além disso inclui um tensoativo iônico ou um esteróide. Em algumas modalidades, as vesículas podem não conter um “ácido biliar”, tal como ácido cólico e ácido quenodesoxicólico, seus produtos de conjugação com glicina ou taurina, tais como ácido glicocólico e taurocólico, ácido desoxicólico, os derivados incluindo e ursodesoxicólico, e sais de cada um desses ácidos. Em algumas modalidades, as vesículas podem carecer de aminoácidos aciloxilados, tais como acilcarnitinas e sais desses, e palmitoilcarnitinas. Em algumas modalidades, as NISVs podem carecer de uma molécula potenciadoraa de transporte (por exemplo, qualquer uma das moléculas acima mencionadas) e incluem tanto um tensoativo iônico quanto um esteróide.

Liofilização

[0043] Conforme discutido acima e abaixo, em algumas modalidades, os métodos da presente divulgação incluem uma etapa de liofilização (seja de uma mistura lipídica fundida ou de uma formulação de vesículas contendo antígeno). A liofilização é um método estabelecido utilizado para melhorar a estabilidade a longo prazo de produtos. Considera-se que a melhoria da estabilidade física e química é deva ser realizada a fim de evitar a degradação e a hidrólise. A liofilização envolve o congelamento da preparação em questão e, em seguida, redução da pressão circundante (e, opcionalmente, o aquecimento da preparação) a fim de permitir que o (s) solvente (s) congelado (s) sublime (m) diretamente da fase sólida para gás (ou seja, a secagem da fase). Em certas modalidades, a fase de secagem é dividida em fases de secagem primárias e secundárias.

[0044] A fase de congelação pode ser realizada colocando a preparação em um recipiente (por exemplo, um balão, tubo Eppendorf, etc.) e, opcionalmente, rotacionando o recipiente em um banho que é arrefecido por refrigeração mecânica (por exemplo, utilizando gelo seco e metanol, nitrogênio líquido , etc.) Em algumas modalidades, a etapa de congelamento envolve a preparação do resfriamento (arrefecimento) a uma temperatura que está abaixo do ponto eutético da preparação. Uma vez que o ponto eutético ocorre à temperatura mais baixa em que a fase sólida e líquida da preparação possa coexistir, a manutenção do material a uma temperatura abaixo desse ponto assegura essa sublimação em vez de evaporação

[0045] A fase de secagem (ou a fase de secagem primária quando duas fases de secagem são utilizadas) envolve a redução da pressão e, opcionalmente, o aquecimento da preparação a um ponto em que o (s) solvente (s) pode (m) sublimar. Essa fase de secagem normalmente remove a maioria do (s) solvente (s) da preparação. Será verificado que as fases de secagem e congelamento não são necessariamente fases distintas, mas podem ser combinadas de qualquer maneira. Por exemplo, em certas modalidades, as fases de congelamento e secagem podem sobrepor-se.

[0046] Uma fase de secagem secundária pode, opcionalmente, ser utilizada para remover solvente (s) residual (is) que foi (foram) adsorvido (s) durante a fase de congelação. Sem intenção de vínculo com qualquer teoria, essa fase envolve o aumento da temperatura a fim de quebrar quaisquer interações físico-químicas que se formaram entre as moléculas de solvente e a preparação congelada. Uma vez completa a fase de secagem, o vácuo pode ser rompido com um gás inerte (por exemplo, nitrogênio ou hélio) antes de o produto liofilizado ser opcionalmente selado.

Reidratação

[0047] Conforme discutido acima, em algumas modalidades, os métodos da presente divulgação incluem uma etapa de reidratação de um produto liofilizado lipídico para formar vesículas contendo antígeno. Isso é conseguido através da mistura do produto lipídico liofilizado com uma solução aquosa compreendendo um antígeno. Em algumas modalidades, isso envolve a adição da solução aquosa com o produto lipídico liofilizado.

[0048] Em algumas modalidades, as vesículas contendo antígeno contêm pelo menos cerca de 10% do antígeno adicionado na etapa de reidratação. Em algumas modalidades, as vesículas contendo antígeno contêm pelo menos cerca de 20% do antígeno adicionado na etapa de reidratação. Em algumas modalidades, as vesículas contendo antígeno contêm pelo menos cerca de 30% do antígeno adicionado na etapa de reidratação. Em algumas modalidades, as vesículas contendo antígeno contêm pelo menos cerca de 40% do antígeno adicionado na etapa de reidratação. Em algumas modalidades, as vesículas contendo antígeno contêm pelo menos cerca de 50% do antígeno adicionado na etapa de reidratação. Em algumas modalidades, as vesículas contendo antígeno contêm pelo menos cerca de 60% do antígeno adicionado na etapa de reidratação. Em algumas modalidades, as vesículas contendo antígeno contêm pelo menos cerca de 70% do antígeno adicionado na etapa de reidratação. Em algumas modalidades, as vesículas contendo antígeno contêm pelo menos cerca de 80% do antígeno adicionado na etapa de reidratação. Em algumas modalidades, o antígeno-

[0049] Em algumas modalidades, a solução aquosa inclui um tampão. O tampão utilizado normalmente dependerá da natureza do antígeno ou antígenos na solução aquosa. Por exemplo, sem limitação, um tampão de PCB, um tampão de Na2HPO4/NaH2PO4, um tampão de PBS, um tampão de bicina, um tampão de Tris, um tampão HEPES, um tampão de MOPS, etc, podem ser utilizados. O tampão de PCB é produzido por mistura de propionato de sódio, cacodilato de sódio, e cloreto de bis-Tris propano nas razões molares 2:1:2. A variação da quantidade de HCl agregado permite tamponar em uma faixa de pH de 4-9. Em algumas modalidades, um tampão de carbonato pode ser utilizado.

[0050] Em algumas modalidades, uma formulação de vesículas contendo antígeno preparada por qualquer um dos métodos acima referidos pode ser liofilizada para uso futuro e subsequentemente reidratada (por exemplo, com água estéril ou um tampão aquoso), antes do uso. Em algumas modalidades, um adjuvante pode ser adicionado durante essa etapa de reidratação (por exemplo, pela inclusão em água estéril ou tampão aquoso). Em algumas modalidades, uma formulação de vesículas contendo antígeno podem ser armazenadas a -80°C antes da liofilização. Em algumas modalidades, uma formulação liofilizada pode ser armazenada a uma faixa de temperaturas entre -20°C e 10°C (por exemplo, entre -5°C e 10°C, entre 0°C e 5°C ou entre 2°C e 8°C).

Tamanho da vesícula e processamento

[0051] Será verificado que uma formulação de vesícula inclui, normalmente, uma mistura de vesículas com uma faixa de tamanhos. Deve-se entender que os valores de diâmetro listados abaixo correspondem ao diâmetro mais frequente dentro da mistura. Em algumas modalidades, > 90% das vesículas em uma formulação terão um diâmetro que se situa dentro de 50% do valor mais frequente (por exemplo, 1000 ± 500 nm). Em algumas modalidades, a distribuição pode ser mais restrita, por exemplo,> 90% das vesículas em uma formulação pode ter um diâmetro que se situa dentro de 40, 30, 20, 10 ou 5% do valor mais frequente. Em algumas modalidades, a sonicação ou ultra-sonicação podem ser utilizadas para facilitar a formação de vesículas e/ou a alterar o tamanho de partícula da vesícula. Em algumas modalidades, a diálise, a filtração e/ou centrifugação podem ser utilizadas para ajustar a distribuição do tamanho das vesículas.

[0052] Em geral, as vesículas produzidas em conformidade com os métodos da presente divulgação podem ser de qualquer tamanho. Em algumas modaliaddes, as formulações podem incluir vesículas com um diâmetro na faixa de cerca de 150 nm a cerca de μm, por exemplo, cerca de 800 nm a cerca de 1,5 μm. Em certas modalidades, as vesículas podem ter um diâmetro que é maior do que 10 μm, por exemplo, cerca de 15 μm até cerca de 25 μm. Em certas modalidades, as vesículas podem ter um diâmetro na faixa de cerca de 2 μm até cerca de 10 μm, por exemplo, cerca de 1 μm até cerca de 4 μm. Em certas modalidades, as vesículas podem ter um diâmetro que é inferior a 150 nm, por exemplo, cerca de 50 nm a cerca de 100 nm.

Antígenos

[0053] Em geral, deve-se entender que qualquer antígeno ou antígenos podem ser aprisionados usando um método da presente divulgação. Conforme discutido anteriormente, o antígeno ou antígenos podem ser associados a vesículas de qualquer maneira. Em algumas modalidades, o antígeno ou antígenos podem estar presentes no núcleo aquoso das vesículas. No entanto, dependendo da sua hidrofobicidade, um antígeno pode também ser parcialmente ou completamente associado a uma bicamada. Em geral, deve-se compreender que em algumas modalidades, uma formulação de vesículas pode incluir quantidades de um ou mais antígenos que não estão associados com vesículas.

[0054] Em algumas modalidades, os métodos da presente divulgação podem ser utilizados para aprisionar um ou mais dos antígenos incluídos em uma vacina. A Tabela 1 é uma lista não limitativa de vacinas adequadas. Tabela 1

[0055] Nas seções seguintes, discutiremos alguns antígenos exemplares que poderiam ser utilizados.

Hepatite A

[0056] A hepatite A é uma doença grave do fígado causada pelo vírus da hepatite A (HAV). O vírus é encontrado nas fezes de pessoas com hepatite A. Conforme mostrado na Tabela 1, diversas vacinas de hepatite A inativadas são atualmente licenciadas. Por exemplo, a Havrix ® é fabricada pela GlaxoSmithKline Biologicals. A patente norte-americana n° 6,180,110 descreve a cepa HAV atenuada (HAV 4380) utilizada em Havrix ®, que foi originalmente derivada da cepa HM175 da HAV (patente norte- americana n° 4,894,228). A Havrix ® contém uma suspensão estéril de HAV inativada com formalina. A atividade antigênica viral é referenciada a um padrão, utilizando um ensaio ELISA e expressa em termos de unidades de ELISA (U). Cada dose para adultos de 1 ml de vacina consiste em 1440 U de antígeno viral, adsorvido em 0,5 mg de alumínio como o hidróxido de alumínio (alum). A Havrix ® (como com todas as outras vacinas licenciadas de hepatite A) é fornecida como uma suspensão estéril para a administração intramuscular (IM). Embora uma dose de Havrix ® ofereça proteção pelo menos a curto prazo, uma segunda dose de reforço após seis a doze meses é atualmente recomendada a fim de garantir a proteção a longo prazo.

[0057] Outro exemplo de uma vacina inativada da hepatite A, AIMMUGEN ® tem sido licenciada e comercializada no Japão desde 1994 por Kaketsuken. AIMMUGEN ® contém uma suspensão estéril de HAV inativada com formaldeído. A dose recomendada para adultos é de 0,5 μg IM em 0, 1 e 6 meses.

[0058] Tal como aqui utilizado, a expressão "antígeno de HAV" refere-se a qualquer antígeno capaz de estimular anticorpos neutralizantes para HAV em humanos. O antígeno de HAV pode compreender partículas virais vivas atenuados ou partículas virais atenuadas inativadas ou podem ser, por exemplo um capsídeo de HAV ou proteína viral de HAV, que pode convenientemente ser obtida por tecnologia de DNA recombinante.

[0059] Em um aspecto, a presente divulgação fornece métodos para a preparação de formulações imunogênicas que incluem vírus da hepatite A atenuado ou inativado (também denominado "antígeno viral da hepatite A" ou "antígeno viral" aqui). Será verificado que os métodos podem ser utilizados para o preparo de um vírus inativado da hepatite A. Em geral, esses métodos envolverão a propagação de um vírus da hepatite A em uma célula hospedeira, lização da célula hospedeira para libertar o vírus, isolamento e, em seguida, inativação do antígeno viral. Após a remoção do meio de cultura celular, as células são lisadas para formar uma suspensão. Essa suspensão é purificada por meio de ultrafiltração e procedimentos de cromatografia de permeação em gel. O lisado purificado é então tratado com formalina a fim de assegurar a inativação viral (por exemplo, veja Andre et al., Prog. Med. Virol. 37:72-95, 1990).

[0060] Na preparação de AIMMUGEN ®, a cepa KRM0003 do vírus da hepatite A (estabelecida a partir de um HAV do tipo selvagem, que tinha sido isolado a partir das fezes de um paciente com hepatite A) é propagada em células GL37 (uma cepa de células estabelecida para a produção de vacinas a partir de uma cepa de células parente de rim de macaco verde Africano). As células GL37 são inoculadas com cepa KRM0003 de HAV e antígeno viral é colhida, extensivamente purificada e inativada com formaldeído.

[0061] Outro exemplo de um vírus inativado da hepatite A que é disponibilizado comercialmente, mas não é uma vacina licenciada é o antígeno da hepatite A (HAV-ag) da Meridian Life Sciences. Assim como Havrix ® o Meridian HAV- ag também deriva da cepa HM175 da hepatite A do vírus mas é propagada em células FRhK-4 (rim de reso fetal). Após a remoção do meio de cultura celular, as células são lisadas para formar uma suspensão e a suspensão é parcialmente purificada por centrifugação de gradiente e inativada através de tratamento com formalina.

[0062] Será verificado que qualquer cepa de vírus da hepatite A pode ser utilizada, por exemplo, sem limitação, qualquer uma das seguintes cepas que foram descritas na técnica (e outras variantes não-humanas): Vírus da hepatite A humana Hu/Arizona/HAS-15/1979 Vírus da hepatite A humana Hu/Austrália/HM 175/1976 Vírus da Hepatite A humana Hu/Costa Rica/CR326/1960 Vírus da Hepatite A humana Hu/França/CF-53/1979 Vírus da Hepatite A humana Hu/Geórgia/GA76/l 976 Vírus da Hepatite A humana Hu/Alemanha/ GBM/1976 Vírus da Hepatite A humana Hu/Japão/HAJ85-1/1985 Vírus da Hepatite A humana Hu/Los Angeles/LA/1975 Vírus da Hepatite A humana Hu/África do Norte/MBB/1978 Vírus da Hepatite A humana Hu/Noruega/NOR-21/1998 Vírus da Hepatite A humana Hu/Serra Leoa/SLF88/1988 Vírus da Hepatite A humana MSM1 Vírus da Hepatite A humana Shanghai/LCDC- 1/1984

[0063] Além disso, enquanto a formalina e o formaldeído são comumente usados \para inativar vacinas de hepatite A licenciada, deve-se entender que outras técnicas poderiam ser utilizadas, por exemplo, o tratamento com cloro, a exposição a temperaturas elevadas (o antígeno viral é inativado acima de 85°C/185°F), etc.

[0064] Em certas modalidades, pode revelar-se vantajoso adicionar etapas adicionais ao método tradicional para a preparação de um vírus inativado da hepatite A. Por exemplo, a patente norte-americana n° 6,991,929 descreve a inclusão de uma etapa de tratamento de protease (por exemplo, tripsina) após a propagação do vírus. Essa etapa foi verificada por melhorar a remoção de material da célula hospedeira e produzir uma preparação viral mais pura.

[0065] Embora todas as vacinas de hepatite A licenciadas atualmente incluam antígenos virais inativados, as vacinas alternativas que incluem o antígeno viral atenuado também têm foram descritas na literatura. Em certas modalidades, uma formulação imunogênica pode compreender tal antígeno viral atenuado. Como bem se sabe na técnica, a vantagem de uma vacina atenuada reside no potencial para a imunogenicidade superior que resulta da sua capacidade de replicação in vivo sem provocar uma infecção completa.

[0066] Um método que tem sido utilizado na técnica para o preparo de vírus da hepatite A atenuados é a adaptação viral que envolve a passagem em série de uma cepa viral através de culturas de múltiplas células. Com o tempo, os mutados de cepa e as cepas atenuadas podem então ser identificadas. Em certas modalidades, o vírus pode ser transmitido através de culturas de células diferentes. Por exemplo, os pesquisadores geraram vírus atenuados da hepatite A passando a cepa CR326 dezesseis vezes nas culturas de células do pulmão diploide humano (SCVM) (ver Provost et al J. Med.. Virol. 20:165 - 175, 2005). Uma cepa pouco mais virulenta foi obtida pelo uso da mesma cepa quinze vezes nas culturas de células do rim de macaco reso fetal (FRhK6) mais oito vezes em culturas de células SCVM. Uma vacina alternativa de hepatite A atenuada foi preparada dessa forma a partir da cepa H2 também foi descrita (ver a patente europeia N ° 0413637 e Mao et al., Vaccine 15:944947, 1997).

[0067] Em certas modalidades, pode se revelar vantajosa a realização de uma ou mais etapas de cultura de células a uma temperatura reduzida. Por exemplo, a Patente Europeia n°. 0413637 descreve a inclusão de uma ou mais etapas de inoculação na qual a temperatura é reduzida (por exemplo, a 32-34°C em vez de 35-36°C).

[0068] A patente norte-americana n° 6,180,110 descreve um vírus de hepatite A atenuado (HAV 4380) que cresce em células MRC-5. Os pesquisadores identificaram mutações em HAV 4380, que pareceram estar associadas às atenuações por comparação do seu genoma com o genoma de uma cepa mais virulenta. Isto permitiu a concepção de cepas HAV mutantes com características ideais para uma vacina de hepatite A atenuada candidata. Será verificado que essa abordagem pode ser aplicada a qualquer vírus de hepatite A atenuada conhecido e utilizada para manipular geneticamente as variantes sem a necessidade de adaptação viral.

Hepatite B

[0069] O vírus da hepatite B (HBV) provoca tanto infecções agudas quanto crônicas. O amplo espectro clínico de infecção de HBV varia a partir da hepatite sub clínica à aguda sintomática; de um estado transportador de antígeno de superfície de hepatite B inativo (HBsAg) à cirrose do fígado e as suas complicações durante a fase crônica (Fattovich, J. Hepatol. 39:S50-58, 2003). O HBVé transmitido por exposição parenteral ou mucosa a fluidos corporais de HBsAg positivos geralmente de pessoas infectadas pelo VHB (Hilleman, Vaccine 21:4626-4649, 2003).

[0070] Atualmente, existem duas vacinas comerciais utilizadas para prevenir a infecção por HBV, ambas são fabricadas usando a tecnologia recombinante. Por exemplo, Engerix-B ™ é uma vacina contra a hepatite B de DNA recombinante não-infecciosa desenvolvida pela GlaxoSmithKline Biologicals. Ela contém o antígeno de superfície purificado de HBV obtido através da cultura de células geneticamente modificadas de Saccharomyces cervisiae que transportam o gene do antígeno de superfície do HBV.

[0071] Tal como aqui utilizado, a expressão "antígeno de superfície da Hepatite B" ou "HBsAg" refere-se a qualquer antigénio HBsAg ou fragmento desse apresentando a antigenicidade do antígeno de superfície HBV em seres humanos.

[0072] A Engerix-B ™ e outras vacinas contra a hepatite B licenciadas, as quais são administradas parentericamente, têm sido bem sucedidas na indução de uma resposta imune sistêmica ao HBV. No entanto, os anticorpos produzidos como parte da resposta imunológica sistêmica são incapazes de fornecer proteção ao nível da mucosa, que é o local de entrada principal para a maioria dos agentes infecciosos, incluindo HBV. Permanece, portanto, uma necessidade na técnica de uma vacina de entrega oral da hepatite B.

[0073] Em um aspecto, a presente divulgação fornece métodos para a preparação de formulações que incluem um antígeno de superfície do vírus da hepatite B ou um fragmento desse apresentando a antigenicidade de HBsAg. Todas as vacinas da hepatite B conhecidas incluem um HBsAg recombinante. Deve-se entender que qualquer uma dessas vacinas da hepatite B licenciadas pode ser utilizada como uma fonte de antígeno em um método da presente divulgação a fim de produzir uma formulação imunogênica.

[0074] Em geral, qualquer método pode ser usado para preparar o antígeno de superfície da hepatite B. A preparação de HBsAg é bem documentada (por exemplo, ver Harford et al., Develop. Biol. Standard 54: 125, 1983 e Gregg et al., Biotechnology 5:479, 1987, entre outros).. Em geral, os métodos de tecnologia de DNA recombinante podem ser utilizados, e que envolvem a cultura de células geneticamente modificadas, que transportam o gene do antígeno de superfície do HBV. O antígeno de superfície expresso é então purificado e normalmente formulado como uma suspensão do antígeno de superfície adsorvido em hidróxido de alumínio (por exemplo, ver Valenzuela et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1-5, 1983 e McAleer et al., Nature 307:178-180, 1984).

Influenza

[0075] A influenza é uma doença infecciosa comum do sistema respiratório associada à família de vírus Orthomyxoviridae. A Influenza A e B são os dois tipos de vírus da gripe que causam doença humana epidêmica. Os vírus influenza A são ainda classificados em subtipos, com base em dois antígenos de superfície: a hemaglutinina (HA) e neuraminidase (N). Os vírus influenza B não são categorizados em subtipos. A vacinação é reconhecida como a maneira mais eficaz de prevenir ou atenuar a gripe para pessoas com risco elevado de doença grave de infecção por influenza e complicações relacionadas. A inoculação de antígeno preparado a partir de vírus da gripe inativado estimula a produção de anticorpos específicos. A proteção é geralmente proporcionada apenas contra essas cepas de vírus a partir das quais a vacina é preparada ou cepas estreitamente relacionadas.

[0076] Vacinas contra a influenza, de todos os tipos, são geralmente as vacinas trivalentes. Elas geralmente contêm antígenos derivados de duas cepas de vírus da influenza A e uma cepa da influenza B. As cepas de vírus influenza a serem incorporados nas vacinas contra a influenza em cada temporada são determinadas pela Organização Mundial de Saúde (OMS) em colaboração com as autoridades nacionais de saúde e fabricantes de vacinas. Será verificado que qualquer cepa do vírus da influenza pode ser utilizada de acordo com a presente divulgação, e que as cepas de vírus de influenza diferirão de ano para ano, com base nas recomendações da OMS.

[0077] Vacinas monovalentes, que podem ser úteis, por exemplo, em uma situação de pandemia, são também abrangidas. Uma vacina monovalente contra a pandemia de gripe provavelmente conterá o antígeno da influenza a partir de uma cepa A única. Em algumas modalidades, os antígenos da influenza são derivados a partir de cepas de infleunza pandêmica. Por exemplo, em algumas modalidades, os antígenos da influenza são antígenos virais da influenza A (H1N1 de origem suína).

[0078] Predominantemente três tipos de vacinas inativadas são utilizadas em todo o mundo para proteger contra a influenza: vacinas de vírus inteiras, vacinas de vírus divididas que contêm componentes interno e externo do vírus e vacinas de subunidades compostas por apenas componentes externos do vírus (hemaglutinina e neuraminidase). Sem interesse em vinculação com qualquer teoria, pensa-se que o maior grau de pureza de vacinas de subunidade deve fazê-las menos reatogênicas e melhor toleradas. Por outro lado as vacinas de vírus inteiro e vacinas de vírus divididos são pensados conter mais epítopos e assim serem mais imunogênicas.

[0079] Em algumas modalidades, os antígenos da influenza são baseados em vacinas de subunidades. Geralmente, as vacinas de subunidades contêm apenas as partes do vírus da influenza que são necessários para a vacinação eficaz (por exemplo, eliciar uma resposta imunitária protetora). Em algumas modalidades, os antígenos da gripe de subunidade são preparados a partir de partículas de vírus (por exemplo, a purificação dos componentes particulares do vírus). Em algumas modalidades, os antígenos da influenza de subunidade são preparados por métodos recombinantes (por exemplo, expressão em cultura de células). Por exemplo, Patente norte-americana n°. 5,858,368 descreve métodos de preparação de uma vacina contra a influenza recombinante usando tecnologia de DNA recombinante. A vacina da influenza resultante trivalente baseia-se em uma mistura de antígenos de hemaglutinina recombinantes clonados a partir de vírus da influenza com potencial epidêmico. Os antígenos de hemaglutinina recombinantes são glicoproteínas de comprimento completo, não clivadas, produzidas a partir de vetores de expressão de baculovírus em células de inseto em cultura e purificada sob condições não desnaturantes. Em algumas modalidades, os antígenos da influenza de subunidade são gerados por métodos sintéticos (por exemplo, a síntese peptídica). As vacinas de subunidades podem conter antígenos de superfície purificados, antígenos hemaglutinina e antígenos neuraminidase preparados a partir de cepas selecionadas determinadas pela OMS. Sem visar ligação com qualquer teoria, pensa-se que os antígenos de superfície, antígenos de hemaglutinina e antígenos neuramidase desempenham um papel significativo em eliciar a produção de anticorpos neutralizantes de vírus com a vacinação.

[0080] Em algumas modalidades, os antígenos da gripe são antígenos do vírus divididos. As vacinas preparadas usando antígenos do vírus dividido contêm tipicamente uma maior concentração de porções mais imunogênicas do vírus (por exemplo, a hemaglutinina e neuramidase), enquanto reduzem a concentração de proteínas virais menos imunogénicas, bem proteínas como não-virais presentes a partir de ovos (utilizadas para produção de vírus) ou agentes estranhos (por exemplo, vírus da leucose aviária, outros microrganismos e detritos celulares). Geralmente, antígenos do vírus divididos são preparados por um processo físico, que envolve romper a partícula de vírus, geralmente com um solvente orgânico ou um detergente (por exemplo, Triton X-100), e separar ou purificar as proteínas virais em graus diferentes, tal como por centrifugação ao longo de um gradiente de sacarose ou passagem de fluido alantóico através de uma coluna cromatográfica. Em algumas modalidades, os rompimentos e separação de partículas de vírus são seguidos por diálise ou ultrafiltração. Antígenos do vírus dividido geralmente contêm a maior parte ou toda a proteínas estruturais do vírus, embora não necessariamente nas mesmas proporções à medida que ocorrem no vírus inteiro. Os métodos de separação de vírus, bem como agentes de separação adequados são conhecidos na técnica (ver, por exemplo a publicação de patente Norte-americana n° 20090155309). Em algumas modalidades, a concentração de antígeno final (por exemplo, da hemaglutinina e/ou antigénios neuramidase) de antígeno virai separado é normalizados usando métodos conhecidos na arte (por exemplo, ELISA).

[0081] Em algumas modalidades, os antígenos da influenza são antígenos do vírus inteiros. Pensa-se que em indivíduos não condicionados, as vacinas preparadas com antígenos do vírus inteiros podem ser mais imunogênicas e induzir uma resposta mais elevadas de anticorpo protetor a uma dose mais baixa de antígeno que outras formulações (por exemplo, subunidade, ou antígenos do vírus dividido). No entanto, as vacinas da influenza, que incluem antígenos do vírus inteiros podem produzir mais efeitos colaterais que outras formulações.

[0082] Antígenos virais da influenza presentes em formulações imunogênicas aqui descritos. Em certas modalidades, uma formulação imunogênica pode compreender antígeno viral inativado. Será verificado que os métodos podem ser utilizados para o preparo de um vírus inativado da hepatite A. WO 09/029.695 descreve métodos exemplares para a produção de uma vacina de vírus inteiro inativado. Em geral, esses métodos envolverão a propagação de um vírus da influenza em uma célula hospedeira, lização opcional da célula hospedeira para libertar o vírus, isolamento e, em seguida, inativação do antígeno viral. O tratamento químico do vírus (por exemplo, formaldeído, formalina, entre outros) é comumente utilizado para inativar o vírus para a formulação de vacina. No entanto, deve-se entender que outras técnicas podem ser utilizadas, por exemplo, o tratamento com cloro, exposição a altas temperaturas, etc. Nestes tratamentos o revestimento exterior do vírion é tipicamente deixada intacta enquanto a função replicativa é prejudicada. Vacinas virais não replicantes contêm de preferência mais antígeno que vacinas vivas que são capazes de replicar no hospedeiro.

[0083] Em certas modalidades, uma formulação imunogênica pode compreender tal antígeno viral atenuado. Como bem se sabe na técnica, a vantagem de uma vacina preparada com um antígeno viral atenuado reside no potencial para a imunogenicidade superior que resulta da sua capacidade de replicação in vivo sem provocar uma infecção completa. Vacinas de vírus vivos que são preparadas a partir de cepas atenuadas de preferência carecem de patogenicidade, mas ainda são capazes de replicar no hospedeiro. Um método que tem sido utilizado na técnica para o preparo de antígenos virais atenuados é a adaptação viral que envolve a passagem em série de uma cepa viral através de culturas de múltiplas células. Com o tempo, os mutados de cepa e as cepas atenuadas podem então ser identificadas. Em certas modalidades, o vírus pode ser transmitido através de culturas de células diferentes. Em certas modalidades, pode se revelar vantajosa a realização de uma ou mais etapas de cultura de células a uma temperatura reduzida.

[0084] Várias vacinas contra a influenza são atualmente licenciadas (ver Tabela 1). Por exemplo, Fluzone ®, que é uma vacina contra a influenza inativada por célula dividida, é desenvolvida e fabricada pela Sanofi Pasteur, Inc. e pode ser utilizada de acordo com a presente divulgação. Fluzone ® contém uma suspensão estéril preparada a partir de vírus da influenza propagados em ovos de galinha embrionados. Os fluidos contendo os vírus são colhidos e inativados com formaldeído. O vírus da influenza é concentrado e purificado em uma solução linear gradiente de densidade de sacarose usando uma centrífuga de fluxo contínuo. O vírus é então interrompido quimicamente utilizando um tensoativo não iónico, octoxinol-9, (Triton ® X-100) produzindo um antígeno viral dividido. O vírus dividido é então adicionalmente purificado por meios químicos e suspenso em solução de cloreto de sódio isotônica tamponada com fosfato de sódio. A vacina Fluzone ® é então normalizada de acordo com os requisitos para a temporada de influenza e é formulada para conter 45 μg de hemaglutinina (HA) por dose de 0,5 mL, na razão recomendada de 15 μg de HA cada, representativa das três cepas de protótipo (por exemplo, 2007 - 2008 A vacina preparada com cepas A/Solomon Islands/3/2006 (H1N1), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) e B/Malaysia/2506/2004). A vacina Fluzone ® é formulada para injeção intramuscular.

[0085] Outro exemplo de uma vacina licenciada contra a influenza que pode ser utilizada de acordo com a presente divulgação é Vaxigrip ®, que é uma vacina contra a influenza inativada por célula dividida também desenvolvida e fabricado pela Sanofi Pasteur, Inc. A Vaxigrip ® é preparada de uma maneira semelhante ao processo descrito acima para Fluzone ® e é similarmente formulada para injeção intramuscular.

[0086] Ainda em outro exemplo de uma vacina licenciada contra a influenza que pode ser utilizada de acordo com a presente divulgação é a FluMist ®. A FluMist ® é uma vacina trivalente atenuada viva para a administração por pulverização intranasal. As cepas de vírus da influenza na FluMist ® possuem três mutações genéticas que levam ao crescimento termo-restrito e um fenótipo atenuado. O efeito cumulativo das propriedades antigênicas e os vírus da influenza geneticamente modificados é que eles são capazes de replicar na nasofaringe e induzir imunidade protetora. A fim de produzir a FluMist ®, os ovos isentos de agentes patogênicos específicos (SPF) são inoculados com cada uma das cepas virais adequadas e incubados para permitir a replicação do vírus da vacina. O fluido alantôico desses ovos é colhido, reunido e, em seguida, clarificado por filtração. O vírus é concentrado por ultracentrifugação e diluído com tampão de estabilização a fim se obter a sacarose final e concentrações de fosfato de potássio. As colheitas virais são então esterilizadas por filtração a fim de produzir massas monovalentes. As massas monovalentes a partir das três cepas são subsequentemente misturadas e diluídas conforme necessário a fim de alcançar a potência desejada com a estabilização de tampões para produzir a vacina trivalente a granel. A vacina a granel é então preenchida diretamente em pulverizadores individuais para a administração nasal. Cada pulverizador Flumist® refrigerado pré-carregado contém uma dose única de 0,2 mL. Cada dose de 0,2 mL contém 106,5-7,5 FFU de combinados de vírus de influenza atenuados de cada uma das três cepas virais adequadas.

[0087] Como descrito acima, as várias vacinas de influenza estão atualmente licenciadas. Deve-se entender que qualquer uma ou uma combinação dessas vacinas de influenza licenciadas podem ser combinadas com uma vesícula conforme aqui descrito a fim de produzir uma formulação imunogênica. Para uma formulação imunogênica ativa. Em algumas modalidades, as vacinas de influenza licenciadas são primeiro purificadas (por exemplo, para remover o adjuvante alum ou outros reagentes na vacina). Em algumas modalidades, as vacinas de influenza licenciadas não são purificadas antes da formulação com uma vesícula conforme aqui descrito.

[0088] Pedido de Patente PCT n°. PCT/US09/47911 descreve alguns outros antígenos da influenza exemplares que podem ser utilizados nos métodos e formulações da presente divulgação. Exemplos de antígenos da influenza também foram descritos nas patentes norte-americanas n 7,527,800; 7,537,768; 7,514,086; 7,510,719; 7,494,659; 7,468,259; 7,399,840; 7,361,352; 7,316,813; 7,262,045; 7,244,435; 7,192,595; 7,052,701; 6,861,244; 6,743,900; 6,740,325; 6,635,246; 6,605,457; 6,534,065; 6,372,223; 6,344,354; 6,287,570; 6,136,606; 5,962,298; 5,948,410; e 5,919,480.

Outros vírus

[0089] O vírus da hepatite C (HCV) é agora reconhecido como sendo a causa primária da hepatite não A não B associada à transfusão (NANB). O HCV é um vírus de RNA de sentido positivo de cadeia simples com semelhanças com flavivírus e pestivírus (Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2057, 1991 e Weiner et al., Virology 180: 842, 1990). As patentes norte-americanas n 7,348,011; 6,831,169; 6,538,123 e 6,235,888 descrevem todos os antígenos exemplares de HCV que podem ser empregados em uma vacina.

[0090] O retrovírus da imunodeficiência humana (HIV) é responsável pela AIDS (síndrome da imunodeficiência adquirida), uma doença na qual o sistema imunológico do corpo decompõe deixando-o vulnerável a infecções oportunistas. As patentes norte-americanas n 7,067,134; 7,063,849; 6,787,351; 6,706,859; 6,692,955; 6,653,130; 6,649,410; 6,541,003; 6,503,753; 6,500,623; 6,383,806; 6,090,392; 5,861,243; 5,817,318; e 4,983,387exemplares todos descrevem antígenos do HIV que poderiam ser empregados em uma vacina. Vários antígenos de HIV são também revelados na publicação de patente Norte-americana n. 20090117141 e 20090081254.

[0091] Em certas modalidades, uma formulação imunogênica que é preparada de acordo com os métodos da presente divulgação pode compreender um antígeno que é termolábil. Tal como aqui utilizado, os termos "antígeno termolábil" referem-se a um antígeno que perde a integridade antigênica quando exposto a certas temperaturas elevadas. Em algumas modalidades, a exposição de um antigénio termolábil a temperaturas elevadas destrói mais de 20% do em um ensaio de integridade antigênica (por exemplo, um ELISA), em comparação ao antígeno não- manipulado. Em certas modalidades, um antígeno termolábil perde a integridade antigênica a temperaturas acima de 30°C (por exemplo, acima de 35°C, acima de 40°C, acima de 45°C, ou acima de 50°C). Em algumas modalidades, o armazenamento de um antígeno termolábil a ao menos uma dessas temperaturas elevadas por mais de 3 minutos (por exemplo, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos ou mais) destrói mais de 20% da integridade antigênica do antígeno (por exemplo, mais de 30 %, mais de 40%, ou mais de 50%) de acordo com medição em um ensaio de integridade antigênica (por exemplo, um ELISA), em comparação ao antígeno não- manipulado. Conforme discutido acima, os métodos da presente divulgação são particularmente benéficos para antígenos termolábeis, porque eles podem utilizar uma menor temperatura de solução de antígeno, permitindo uma melhor conservação da integridade antigênico.

[0092] Deve-se entender que a presente divulgação não se limita aos antígenos e que, em geral, os métodos podem ser utilizados para aprisionar qualquer substância, antigênica ou não antigênica. Portanto, em algumas modalidades, os métodos da presente divulgação podem ser utilizados para aprisionar um ou mais polipeptídios, polinucleotídeo ou polissacáridos que podem ou não ser antigênico. As classes específicas de substâncias incluem, entre outras, os adjuvantes, enzimas, receptores, neurotransmissores, hormônios, citocinas, modificadores de resposta de células, tais como fatores de crescimento e fatores quimiotácticos, anticorpos, haptenos, toxinas, interferons, ribozimas, agentes anti-sentido, plasmídeos, DNA e RNA. Em algumas modalidades o polipeptídio pode ser um anticorpo ou fragmento de anticorpo, exemplo, um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, essas substâncias são termolábeis de modo que convertem em produtos de degradação, nas condições indicadas acima, no contexto de antígenos.

Adjuvantes

[0093] Em certas modalidades, os métodos da presente divulgação podem ainda incluir uma etapa de adição de um ou mais adjuvantes a uma formulação de vesícula. Como é bem conhecido na técnica, os adjuvantes são agentes que melhoram as respostas imunológicas. Os adjuvantes são bem conhecidos na técnica (por exemplo, ver " Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach", Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell and Newman, Plenum Press, Nova York e Londres, 1995). Em algumas modalidades, um adjuvante pode ser adicionado uma vez preparada a formulação de vesícula (com antígeno aprisionado). Em algumas modalidades, um adjuvante pode ser adicionado durante o processo de preparação das formulações de vesículas (por exemplo, juntamente com lipídios formadores de vesículas ou outros componentes de vesículas, juntamente com o antígeno ou em uma etapa específica).

[0094] Em certas modalidades, um adjuvante é adicionado antes da adição de um antígeno. Em algumas modalidades, o adjuvante é co-fundido com os lipídios formadores de vesículas. Em algumas modalidades, o adjuvante de TLR-4 (descrito abaixo) é co-fundido com os lipídios formadores de vesículas. Em certas modalidades, um adjuvante é adicionado após a adição de um antígeno. Em algumas modalidades, o adjuvante é adicionado juntamente com um lioprotetor após a adição de um antígeno. Em algumas modalidades, o adjuvante de TLR-3 (descrito abaixo) é adicionado juntamente com um lioprotetor após a adição de um antígeno. Em algumas modalidades, o lioprotetor é a sacarose.

[0095] Os adjuvantes exemplares incluem o adjuvante completo de Freund (CFA), adjuvante incompleto de Freund (IFA), esqualeno, esqualano e alúmen (hidróxido de alumínio), que são materiais bem conhecidos na técnica, e são disponibilizados comercialmente por várias fontes. Em certas modalidades, os sais de alumínio ou de cálcio (por exemplo, sais de hidróxido ou fosfato) podem ser utilizados como adjuvantes. O alúmen (hidróxido de alumínio) tem sido utilizado em muitas vacinas existentes. Normalmente, cerca de 40 a cerca de 700 μg de alumínio são incluídos por dose, quando administrada por via IM. Por exemplo, Havrix ® inclui 500 μg de alumínio por dose.

[0096] Em várias modalidades, emulsões óleo-em água ou emulsões água-em óleo podem também ser utilizadas como adjuvantes. Por exemplo, a fase de óleo pode incluir esqualeno ou esqualano e um tensoativo. Em várias modalidades, os tensoativos não-iônicos, tais como os ésteres de mono- e di-C12-C24-ácido graxo de sorbitano e manido podem ser utilizados. A fase de óleo compreende de preferência cerca de 0,2 a cerca de 15% em peso da formulação imunogênica (por exemplo, cerca de 0,2 a 1%). A publicação PCT n° WO 95/17210 descreve emulsões exemplares.

[0097] O adjuvante designado QS21 é uma fração de saponina imunologicamente ativa que possui atividade adjuvante derivada da casca da árvore da América do Sul Quillaja Saponaria Molina, e os métodos da sua produção são revelados na patente norte-americana n° 5,057,540. Os semi derivados sintéticos e sintéticos de saponinas Quillaja saponaria Molina são também úteis, tais como os descritos nas patentes norte-americanas n 5,977,081 e 6,080,725.

[0098] As TLRs são uma família de proteínas homólogas ao receptor de Drosophila Toll, que reconhecem padrões moleculares associados a agentes patogênicos e, assim, ajudam o corpo em distinguir entre as auto-moléculas e não auto-moléculas. As substâncias comuns em patógenos virais são reconhecidos por TLRs como padrões moleculares associados ao patógeno. Por exemplo, TLR-3 reconhece padrões em RNA de fita dupla, a TLR-4 reconhece padrões em lipopolissacarídeos enquanto a TLR-7/8 reconhece padrões contendo adenosina em RNA e DNA viral e bacteriano. Quando um TLR é desencadeado por tal reconhecimento de padrão, uma série de eventos de sinalização ocorre conduzindo à inflamação e à ativação de respostas imunológicas inatas e adaptativas. Um certo número de ligantes sintéticos contendo os padrões moleculares reconhecidos por vários TLRs estão sendo desenvolvidos como adjuvantes e podem ser incluídos em uma formulação imunogênica tal como aqui descrito.

[0099] Por exemplo, o ácido poliboinosínico: polirribocitidílico ou poli (I:C) (disponibilizados pela InvivoGen de San Diego, CA) é um análogo sintético de RNA de fita dupla (um padrão molecular associado a uma infecção viral) e um adjuvante exemplar que é um agonista para TLR-3 (por exemplo, ver Field et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58:1004 (1967) e Levy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62:357 (1969)). Em algumas modalidades, o poli (I:C) pode ser combinado com outros agentes a fim de melhorar a estabilidade (por exemplo, reduzindo a degradação através da atividade de RNases). Por exemplo, as patentes norte- americanas n 3,952,097; 4,024,241 e 4,349,538 descrevem complexos poli (I:C) com poli-L-lisina. A adição de poli- arginina em poli (I:C) também mostrou reduzir a degradação através da atividade de RNases. Poli (IC:LC) é uma sintético, poli (I:C) de fita dupla estabilizado com poli- L-lisina carboximetil celulose. A patente Norte-americana n° 20090041809 descreve ácidos nucleicos de fita dupla com um ou mais do um nucleosídeo de ácido nucleico bloqueado (LNA) que pode atuar como agonistas de TLR-3. Os técnicos no assunto serão capazes de identificar outros adjuvantes agonistas de TLR-3 adequados.

[00100] Os derivados de lipídio A atenuados (ALD), tais como lipídio monofosforil A (MPL) e lipídio 3-deacil monofosforil A (3D-MPL) ,são adjuvantes exemplares que são agonistas para TLR-4. Os ALDs são moléculas semelhantes ao lipídio A que foram alteradas ou construídas de modo que a molécula exiba um efeito menor ou diferente dos efeitos adversos do lipídio A. Esses efeitos adversos incluem pirogenicidade, a reatividade de Shwarzman e toxicidade local conforme avaliado no ensaio de dose letal de 50% de pinto embrionário (CELD50). MPL e 3D-MPL são descritos nas patentes norte-americanas n 4,436,727 e 4,912,094, respectivamente. MPL foi originalmente derivado de lipídio A, um componente de lipopolissacarídeos enterobactériais (LPS), um modulador do sistema imunológico potente mas altamente tóxico. 3D-MPL difere de MPL no fato de que o resíduo acila que é ligado por éster à glucosamina de extremidade reduzida na posição 3 foi removido seletivamente. Será verificado que o MPL e 3D-MPL pode incluir uma mistura de um número de padrões de substituição de ácidos graxos, isto é, heptaacila, hexaacila, pentaacila, etc., com diferentes comprimentos de cadeia de ácido graxo. Assim, as várias formas de MPL e 3D-MPL, incluindo suas misturas, são englobadas pela presente divulgação.

[00101] Em algumas modalidades esses ALDs podem ser combinados com trehalosedimcolato (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS), por exemplo, em uma emulsão de 2% de esqualeno/Tween ™ 80 (por exemplo, ver a patente GB No. 2.122.204). MPL é disponibilizado pela Avanti Polar Lipids, Inc., de Alabaster, AL como PHAD (dissacarídeo hexaacil fosforilado). Os técnicos no assunto serão capazes de identificar outros adjuvantes agonistas de TLR-4 adequados. Por exemplo, outros lipopolissacarídeos foram descritos na Publicação PCT N ° WO 98/01139; patente norte-americana n° 6,005,099 e Patente EP No. 729473. II. Formulações de vesícula

[00102] Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece formulações de vesículas contendo antígeno preparadas utilizando esses métodos. Em algumas modalidades, as formulações de vesículas contendo antígeno exibem níveis de aprisionamento de antígeno que são mais elevados do que aqueles obtidos utilizando os métodos do estado da técnica. Em algumas modalidades, as formulações de vesículas contendo antígeno exibem níveis de atividade de antígeno (ou seja, antigenicidade e/ou imunogenicidade) que são mais elevados do que aqueles obtidos utilizando os métodos do estado da técnica.

[00103] As formulações de vesículas imunogênicas são úteis para tratar muitas doenças em seres humanos, incluindo adultos e crianças. Em geral, no entanto elas podem ser utilizadas com qualquer animal. Em certas modalidades, os métodos presentes podem ser utilizados para aplicações veterinárias, aplicações, por exemplo, canina e felina. Se desejado, os métodos presentes podem também ser utilizados com os animais de criação, tais como ovinos, aves, bovinos, porcinos e equinos.

[00104] As formulações imunogênicas de vesículas aqui descritas serão geralmente administradas em quantidades tais e por um tempo conforme a necessidade ou suficiente para induzir uma resposta imunológica. Os regimes de dosagem podem consistir em uma única dose ou numa pluralidade de doses durante um período de tempo. A quantidade exata de antígeno a ser administrado pode variar de paciente para paciente e pode depender de vários fatores. Assim, será verificado que, em geral, a dose exata utilizada será tal como determinado pelo médico prescritor e dependerá não só do peso do paciente e da via de administração, mas também da frequência da dosagem, da idade do paciente e da gravidade dos sintomas e/ou o risco de infecção. Em certas modalidades, a dose de antígeno em uma formulação imunogênica pode variar de cerca de 5 μg a cerca de 5 mg, por exemplo, desde cerca de 100 μg a cerca de 750 μg. Doses mais baixas de antígeno podem ser suficientes quando se utiliza a administração sublingual ou bucal, ou na presença de adjuvante. Doses mais elevadas podem ser mais úteis quando administradas por via oral, especialmente na ausência de adjuvantes.

[00105] Em geral, as formulações podem ser administradas a um paciente por qualquer via. Em particular, os resultados nos exemplos demonstram que as formulações imunogênicas aqui descritas podem induzir uma resposta protetora, mesmo quando administradss por via oral. Será verificado que a via oral é particularmente desejável, tendo em conta as vantagens de entrega oral sobre qualquer forma de injeção (isto é, a conformidade, a distribuição de massa, etc.) Também será apreciado que os resultados são inesperados à luz do fato de que a maioria das vacinas (incluindo todas as vacinas de hepatite A conhecidas) foram até agora administradas por via parenteral.

[00106] Assim, em certas modalidades, as formulações imunogênicas podem ser administradas por via oral (incluindo bucal, sublingual e por lavagem gástrica ou outros meios de alimentação artificiais). Tal entrega oral pode ser realizada utilizando formulações sólidas ou líquidas, por exemplo, sob a forma de comprimidos, cápsulas, multi-partículas, géis, filmes, óvulos, elixires, soluções, suspensões, etc. Em certas modalidades, quando se utiliza uma formulação líquida, a formulação pode ser administrada em conjunção com uma formulação básica (por exemplo, uma solução de bicarbonato) a fim de neutralizar o pH do estômago. Em certas modalidades, a formulação básica pode ser administrada antes e/ou após a formulação imunogênica. Em certas modalidades, a formulação básica pode ser combinada com a formulação imunogênica antes da administração ou retirada ao mesmo tempo em que a formulação imunogênica.

[00107] Embora a administração oral seja de particular interesse, será apreciado que, em certas modalidades, uma formulação imunogênica pode também ser formulada para a entrega parenteral, por exemplo, por injeção. Em tais modalidades, a administração pode ser, por exemplo, intravenosa, intramuscular, intradérmica, ou subcutânea, ou através de infusão ou técnicas de injeção sem agulha. Para a administração parentérica tal, as formulações imunogênicas podem ser preparadas e mantidas em formulações liofilizadas convencionais e reconstituídas antes da administração com uma solução salina farmaceuticamente aceitável, tal como uma solução salina de 0,9%. O pH da formulação injetável pode ser ajustado, como é conhecido na técnica, com um ácido farmaceuticamente aceitável, tal como ácido metanossulfônico. Outros veículos e solventes aceitáveis passíveis de emprego incluem a solução de Ringer e U.S.P. Além disso, os óleos fixos estéreis são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para este fim, os ácidos graxos tais como ácido oleico são utilizados na preparação de injetáveis. As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ou por incorporação de agentes esterilizantes na forma de formulações sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio estéril injetável antes da utilização.

[00108] As formulações imunogênicas podem também ser administradas por via intranasal ou por inalação e são convenientemente administradas sob a forma de um inalador de pó seco ou uma apresentação de spray de aerossol a partir de um recipiente pressurizado, bomba, spray, atomizador ou nebulizador, com ou sem o uso de um propulsor adequado , por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, hidrofluoroalcano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para distribuir uma quantidade medida. O recipiente pressurizado, bomba, spray, atomizador ou nebulizador pode conter uma solução ou suspensão do anticorpo, por exemplo, utilizando uma mistura de etanol e do propulsor como solvente, que pode adicionalmente conter um lubrificante, por exemplo, sorbitantrioleato. As cápsulas e cartuchos (feitos, por exemplo, de gelatina) para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados para conter uma mistura em pó da formulação imunogênica e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido.

[00109] As formulações para a administração retal são preferivelmente supositórios que podem ser preparados por mistura da formulação imunogênica com excipientes não irritantes adequados ou transportadores tais como manteiga de cacau, polietilenoglicol ou uma cera de supositório que são sólidos à temperatura ambiente mas líquidos à temperatura corporal e, por conseguinte, derretem no reto e liberam os anticorpos. Os enemas de retenção e cateteres retais podem também ser utilizados como é conhecido na técnica. Os transportadores potenciadores de viscosidade, tais como hidroxipropil celulose são também determinados transportadores da divulgação para a administração retal, uma vez que facilitam a retenção da formulação dentro do reto. Geralmente, o volume de transportador que é adicionado à formulação é selecionado a fim de maximizar a retenção da formulação. Em particular, o volume não deve ser tão grande de modo a comprometer a retenção da formulação administrada na vávula retal.

Formulações exemplares

[00110] Em algumas modalidades, a presente divulgação proporciona formulações imunogênicas que incluem um antígeno, um adjuvante agonista de TLR-3 e uma vesícula que compreende um tensoativo não iônico e um potenciador de transporte que facilita o transporte de moléculas através das membranas mucosas. Em algumas modalidades, essas formulações podem ser administradas por via oral. Em algumas modalidades do adjuvante de agonista de TLR-3 compreende poli (I:C). Em algumas modalidades do adjuvante de agonista de TLR-3 compreende poli (IC:LC). Em algumas modalidades, o potenciador de transporte é um ácido biliar, um derivado desse ou um sal de qualquer desses (por exemplo, desoxicolato de sódio). Em algumas modalidades, o tensoativo não iônico é um éster de glicerol (por exemplo, 1-monopalmitoíla glicerol). Em algumas modalidades, a vesícula compreende ainda um anfifilo iônico (por exemplo, dicetilfosfato). Em algumas modalidades, a vesícula compreende ainda um esteroide (por exemplo, colesterol). Em algumas modalidades, as vesículas compreendem 1- monopalmitoíla glicerol, dicetilfosfato, colesterol, e desoxicolato de sódio.

[00111] Em algumas modalidades, a presente divulgação proporciona formulações imunogênicas que incluem um antígeno, um adjuvante agonista de TLR-3 e uma vesícula que compreende um tensoativo não. Em algumas modalidades, essas formulações podem ser administradas por via parenteral (por exemplo, por injeção intramuscular). Em algumas modalidades do adjuvante de agonista de TLR-3 compreende poli (I:C). Em algumas modalidades do adjuvante de agonista de TLR-3 compreende poli (IC:LC). Em algumas modalidades, o tensoativo não iônico é um éster de glicerol (por exemplo, 1-monopalmitoíla glicerol). Em algumas modalidades, a vesícula compreende ainda um anfifilo iônico (por exemplo, dicetilfosfato). Em algumas modalidades, a vesícula compreende ainda um esteroide (por exemplo, colesterol). Em algumas modalidades, as vesículas compreendem 1- monopalmitoíla glicerol, dicetilfosfato, colesterol. Em certas modalidades, as vesículas podem não conter uma molécula potenciadora de transporte. Em algumas modalidades, as vesículas podem não conter um “ácido biliar”, tal como ácido cólico e ácido quenodesoxicólico, seus produtos de conjugação com glicina ou taurina, tais como ácido glicocólico e taurocólico, ácido desoxicólico, os derivados incluindo e ursodesoxicólico, e sais de cada um desses ácidos. Em algumas modalidades, as vesículas podem carecer de aminoácidos aciloxilados, tais como acilcarnitinas e sais desses, e palmitoilcarnitinas.

[00112] Em algumas modalidades, a presente divulgação proporciona formulações imunogênicas que incluem um antígeno, um adjuvante agonista de TLR-4 e uma vesícula que compreende um tensoativo não iônico e um potenciador de transporte que facilita o transporte de moléculas tipo lipídios através das membranas mucosas. Em algumas modalidades, essas formulações podem ser administradas por via oral. Em algumas modalidades, o adjuvante agonista de TLR-4 compreende monofosforil lipídio A ou 3-deacil monofosforil lipídio A. Em algumas modalidades, o potenciador de transporte é um ácido biliar, um derivado desse ou um sal de qualquer desses (por exemplo, desoxicolato de sódio). Em algumas modalidades, o tensoativo não iônico é um éster de glicerol (por exemplo, 1-monopalmitoíla glicerol). Em algumas modalidades, a vesícula compreende ainda um anfifilo iônico (por exemplo, dicetilfosfato). Em algumas modalidades, a vesícula compreende ainda um esteroide (por exemplo, colesterol). Em algumas modalidades, as vesículas compreendem 1- monopalmitoíla glicerol, dicetilfosfato, colesterol, e desoxicolato de sódio.

[00113] Em algumas modalidades, a presente divulgação proporciona formulações imunogênicas que incluem um antígeno, um adjuvante agonista de TLR-4 e uma vesícula que compreende um tensoativo não. Em algumas modalidades, essas formulações podem ser administradas por via parenteral (por exemplo, por injeção intramuscular). Em algumas modalidades do adjuvante agonista de TLR-4 compreende monofosforil lipídio A ou 3-deacil monofosforil lipídio A. Em algumas modalidades, o tensoativo não iônico é um éster de glicerol (por exemplo, 1-monopalmitoíla glicerol). Em algumas modalidades, a vesícula compreende ainda um anfifilo iônico (por exemplo, dicetilfosfato). Em algumas modalidades, a vesícula compreende ainda um esteroide (por exemplo, colesterol). Em algumas modalidades, as vesículas compreendem 1-monopalmitoíla glicerol, dicetilfosfato, colesterol. Em certas modalidades, as vesículas podem não conter uma molécula potenciadora de transporte. Em algumas modalidades, as vesículas podem não conter um “ácido biliar”, tal como ácido cólico e ácido quenodesoxicólico, seus produtos de conjugação com glicina ou taurina, tais como ácido glicocólico e taurocólico, ácido desoxicólico, os derivados incluindo e ursodesoxicólico, e sais de cada um desses ácidos. Em algumas modalidades, as vesículas podem carecer de aminoácidos aciloxilados, tais como acilcarnitinas e sais desses, e palmitoilcarnitinas.

[00114] Em certas modalidades, as formulações da presente divulgação compreendem vesículas que exibem uma estrutura lamelar (por exemplo, uma estrutura de bicamada). Em algumas modalidades, as formulações da presente divulgação são substancialmente desprovidas de estruturas não lamelares (por exemplo, micelas).

[00115] Será verificado que as características físicas (por exemplo, a estrutura lamelar) das vesículas presentes em formulações descritas aqui podem ser medidas por quaisquer métodos conhecidos. Por exemplo, em algumas modalidades, as características físicas das vesículas podem ser medidas por 31P RMN a 25°C. Em algumas modalidades, um pico anisotrópico, com um campo máximo elevado, em torno - 2,5 ppm com uma anisotropia de mudança química de aproximadamente 15 a 20 ppm é indicativo da presença de uma estrutura lamelar. Em algumas modalidades, um pico isotrópico observado em espectros de 31P RMN centrados a cerca de 2,5 ppm é indicativo da presença da divulgação não-lamelar é substancialmente desprovida de um pico isotrópico em torno de 2,5 ppm. Em algumas modalidades, se um pico isotrópico de cerca de 2,5 ppm estiver presente, então ele possui uma intensidade (altura do pico) que é menor do que a intensidade (altura do pico) de um pico anisotrópico com uma anisotropia de mudança química de aproximadamente 15 a 20 ppm e um campo máximo elevado de cerca de -2,5 ppm. Em algumas modalidades, se um pico isotrópico de cerca de 2,5 ppm estiver presente, então ele possui uma intensidade (altura do pico) que é inferior a 50% de intensidade (altura do pico) de um pico anisotrópico com uma anisotropia de mudança química de aproximadamente 15 a 20 ppm e um campo máximo elevado de cerca de -2,5 ppm (por exemplo, menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5%, menos de 2% ou menos de 1%).

[00116] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece qualquer uma das formulações acima referidas em uma forma liofilizada.

III. Kits

[00117] Ainda em outro aspecto, a presente divulgação proporciona kits que incluem um produto lipídico liofilizado em um primeiro recipiente e uma solução aquosa compreendendo um antígeno (e opcionalmente um adjuvante) em um segundo recipiente. Em algumas modalidades, o kit também inclui instruções para misturar os teores dos dois recipientes, a fim de produzir formulações de vesículas contendo antígenos.

[00118] Conforme discutido acima, o produto lipídico liofilizado é o que foi preparado por fusão dos lipídios formadores de vesículas a fim de produzir uma mistura lipídica fundida e então pela liofilização da mistura lipídica fundida a fim de produzir o produto lipídico liofilizado.

[00119] Em ainda outro aspecto, a presente divulgação fornece kits que incluem qualquer formulação de vesícula contendo antígeno liofilizado da presente divulgação em um primeiro recipiente e uma solução aquosa (contendo opcionalmente um adjuvante) num segundo recipiente. Em algumas modalidades, o kit também inclui instruções para misturar os teores dos dois recipientes, a fim de reidratar a formulação de vesículas contendo antígenos.

[00120] Em algumas modalidades, o kit pode incluir componentes adicionais, tais como uma seringa para injetar a formulação de vesícula contendo antígeno em um paciente.

Exemplos

[00121] Os exemplos a seguir descrevem alguns modos exemplares de fabricação e execução de certas formulações que são aqui descritas. Deve-se entender que estes exemplos são para fins ilustrativos apenas e não se destinam a limitar o escopo das formulações e métodos aqui descritos.

Exemplo 1: Método de fusão de três etapas para a preparação de vesículas

[00122] Este exemplo descreve um método de fusão de três etapas que foi utilizado para preparar algumas das vesículas que são descritas nos exemplos posteriores.

[00123] Na etapa 1, uma razão molar de 5:4:1 dos lipídios a seguir: 1-monopalmitoíla glicerol (MPG, 270 mg), colesterol (CHO, 255 mg) e dicetil fosfato (DCP, 90 mg) foram colocados em um béquer de vidro de fundo plano de 50 ml, assegurando nenhum do pó colado ao lado do béquer de vidro . A mistura lipídica foi então fundida em um banho de óleo aquecido a 120°C durante 10 minutos, com agitação ocasional no béquer de vidro coberto com folha de alumínio.

[00124] Enquanto mantinha a temperatura da mistura lipídica fundida a 120°C, uma emulsão foi criada na etapa 2 por adição de 10,9 ml de 25 mM de tampão de bicarbonato, pH 7,6 (pré-aquecido a 50°C). A emulsão foi imediatamente homogeneizada durante 2 minutos a 50°C (a homogeneização a 8000 rpm em 50°C banho de água). Durante a homogeneização, 1,1 ml de 100 mM de desoxicolato de sódio (um "sal biliar") em 25 mM de solução tampão de bicarbonato, pH 9,7 (pré- aquecida a 50°C) foi adicionado e a homogeneização continuou durante 8 minutos a 50°C.

[00125] Na etapa 3, o antígeno (por exemplo, o antígeno HAV ou o antígeno HBV de superfície) em uma solução de PBS de pH de aproximadamente 7,2 foi adicionado à mistura lipídica fundida aquecida contendo o sal de bílis.

[00126] Em uma variação desse método de 3 etapas, a mistura lipídica fundida preparada com sal biliar na etapa 2 foi arrefecida a 30°C, incubada em um incubador /agitador (220 rpm) durante 2 horas, congelada a -80°, liofilizada e, em seguida reconstituída com a solução de antígeno em 100 mM de fosfato tampão pH 8,5 antes da utilização.

Exemplo 2: Método de fusão invertida de duas etapas para a preparação de vesículas

[00127] Este exemplo descreve um método de fusão invertida de duas etapas que foi utilizado para preparar algumas das vesículas que são descritas nos exemplos posteriores.

[00128] Na etapa 1, a mesma razão molar de 5:4:1 de lipídios (MPG: CHO: DCP) foi utilizada, no entanto, neste método, uma razão de 0,1-0,5 molar de ácido desoxicólico (um "ácido biliar") foi também incluído e co-fundido com os lipídios em um banho de óleo aquecido a 135°C durante 10 minutos. No método do Exemplo 1, uma solução aquosa de sal biliar só foi adicionada na etapa 2, após a conversão dos lipídios fundidos em uma emulsão.

[00129] Nessa fase, uma solução mãe de antígeno (por exemplo, 4 ml de 25 p,g / solução de antígeno HAV diluída com 6 ml de tampão PBS, pH 7,11 ou 1,25 ml de 1,0 mg/ml de solução de superfície de antígeno HBV diluída com 8,75 ml de tampão PBS, pH 7,2) foi pré-incubada durante 5 minutos em um banho de água aquecida (25°C a 50°C). Na etapa 2, a solução-mãe antigênica resultante foi homogeneizada (a 8.000 rpm), a mistura lipídica fundida foi adicionada e a homogeneização continuou durante mais 10 minutos. O homogenato resultante foi agitado durante 2 horas a 220 rpm e 30°C. 10 ml de uma solução de sacarose de 400 mM em tampão de PBS foram adicionados ao homogenato agitado e o homogenato foi adicionalmente agitado em vórtex durante 30 segundos. Essa mistura foi congelada a -80°C, liofilizada e depois reconstituída em 100 mM de tampão fosfato pH 8,5 antes da utilização.

[00130] Em uma variação desse método de 2 etapas, a solução lipídio co-fundido / ácido biliar preparada na etapa 1 foi arrefecida a 30°C, incubada em um incubador /agitador (220 rpm) durante 2 horas, congelada a -80°, liofilizada e, em seguida reconstituída com a solução de antígeno em 100 mM de fosfato tampão pH 8,5 antes da utilização.

Exemplo 3: Análise da integridade do antígeno da hepatite B

[00131] As soluções antigênicas de superfície de HBV foram homogeneizadas a 8.000 rpm a temperaturas de 4°C, 25°C e 50°C. A Tabela 2 abaixo compara o percentual de antígeno resultante medido por ELISA em relação ao antígeno sem manipulação medido diretamente através de ELISA. Como mostrado, a exposição de HBsAg a 50°C envolvida no método de fusão de 3 etapas do Exemplo 1 destruiu mais de 50% da integridade antigênica do antígeno. O uso do método de fusão invertida de 2 etapas da presente divulgação permite que a temperatura do tampão contendo antígeno utilize uma menor temperatura de solução de antígeno, permite uma melhor preservação da antigenicidade da proteína de subunidade. Tabela 2

Exemplo 4: Análise do aprisionamento do antígeno da hepatite B

[00132] Este exemplo descreve experimentos que foram realizados a fim de medir os níveis de aprisionamento de antígeno de superfície da hepatite B. Os níveis de aprisionamento foram medidos usando um ensaio de ninidrina. O ensaio de ninidrina é um método colorimétrico de determinação da concentração de um polipeptídio em uma amostra. As substâncias contendo grupos amino reagem com o reagente ninidrina para proporcionar um complexo azul- púrpura.

[00133] O antígeno de superfície da hepatite B foi aprisionado em vesículas usando os métodos do Exemplo 1 e 2.Duas razões diferentes de ácido biliar (0,10 e 0,50) foram testadas utilizando o método do Exemplo 2. Os antígenos de superfície da hepatite B aprisionados foram hidrolisados \a partir das vesículas, neutralizados, misturados com reagente ninidrina e, em seguida, incubados a 110°C. A solução foi então deixada arrefecer e a sua absorbância foi medida a 595 nm. Existe uma relação linear entre a absorbância a este comprimento de onda e a quantidade de polipeptídio presente na amostra original. A Tabela 3 mostra que os níveis elevados de aprisionamento de antígeno (neste caso o antígeno de superfície de HBV) foram obtidos usando o método de fusão invertida de 2 etapas do Exemplo 2. A Tabela 3 também sugere que a eficiência de aprisionamento pode ser afetada pelo teor de ácido biliar. Tabela 3

Exemplo 5: Caracterização físico-química da estabilidade das vesículas após a reidratação

[00134] Este exemplo descreve experimentos que foram realizados a fim de medir a estabilidade das vesículas por espalhamento de luz dinâmico. Nós determinamos o tamanho de partícula e a distribuição de tamanho usando um instrumento Malvern Instrument Zetasizer Nano ZS (ZEN3600) utilizando leituras triplicadas e um tempo de equilíbrio de 2 minutos. 20 μl da amostra de vesícula foram adicionados a 980 μl de tampão pH 7,6 de bicarbonato, agitados em vórtex e, em seguida adicionados a uma cuvete de poliestireno (Sarstedt 67,754). A análise estatística foi realizada utilizando Minitab vl4 com um teste t de 2 amostras a de 95% de nível de confiança. Os resultados obtidos a partir da análise de nano tamanho são mostrados na Figura 1. Vesículas preparadas como descrito nos Exemplos 1 e 2 foram medidas utilizando um Mastersizer imediatamente após a reidratação, na presença de tampão contendo 2 μg de antígeno HAV e 2, 4 e 6 horas após a reidratação. Como mostrado na Figura 1, as vesículas preparadas pelo método de fusão invertida de 2 etapas do Exemplo 2 foram mais estáveis (como avaliado por uma estabilidade do tamanho) ao longo do tempo do que as vesículas preparadas pelo método de fusão de 3 etapas do Exemplo 1. A estabilidade da vesícula após hidratação é um fator potencialmente importante para as formulações de vesículas que serão administradas a um paciente.

Exemplo 6: resposta do anticorpo ao antígeno da hepatite A na imunização de camundongos

[00135] Este Exemplo descreve o ensaio in vivo de certas formulações imunogênicas em camundongos. As vesículas foram preparadas conforme descrito nos Exemplos 1 e 2 e, em seguida, reidratadas na presença de tampão contendo 2 μg de antígeno HAV. Camundongos fêmeas BALB (n = 4) foram vacinados três vezes por gavagem oral com essas vesículas contendo antígeno nos dias 0, 14, e 28 (equivalente a 2 μg de antígeno HAV /dose).

[00136] As amostras de soro foram subsequentemente colhidas para avaliar os títulos de hepatite A-IgG específicos induzidos pela vacinação oral. As amostras de soro colhidas 14 dias após a última imunização foram testadas por ELISA contra o antígeno de HAV inativado. Conforme mostrado na Figura 2, a vacinação oral de ratos com vesículas preparadas método de fusão invertida de 2 etapas do Exemplo 2 induziu significativamente respostas de IgG (soro) mais sistémicas contra o antígeno da hepatite A do que as vesículas preparadas pelo método de fusão de 3 etapas do Exemplo 1. Cada símbolo representa um título final de soro de um animal individual. Estes dados demonstram que a hidratação das vesículas vazias preparadas usando o método de fusão de 2 etapas com antígeno de HAV resulta em melhor imunogenicidade quando comparada à hidratação de vesículas preparadas utilizando o método de fusão de 3 etapas.

[00137] Um certo número de pesquisadores demonstrou que as vacinas de hepatite A e vacinas contra a hepatite B licenciadas atualmente dadas por injeção intramuscular (IM) induzem formulações neutralizantes são capazes de induzir anticorpos IgG sistemicamente (amostras de soro) e anticorpos IgA na mucosa (amostras de lavagem nasal). Uma vez que a infecção por hepatite A e hepatite B ocorre através de superfícies mucosas, uma resposta de IgA (a marca registrada de uma resposta imune da mucosa) pode ser mais eficaz do que uma resposta de IgG sistêmica. Nós apenas esperaríamos respostas de IgG sistêmicas se as formulações imunogênicas da hepatite A ou da hepatite B fossem administradas por vias parentéricas padrão (por exemplo, por injeção IM).

Exemplo 7: Teor de sais biliares de vesículas afeta a maturação de células dendríticas imaturas

[00138] É agora normalmente aceitado que as células dendríticas (DC) são células antigênicas importantes que desempenham um papel no estabelecimento de se um antígeno (por exemplo antígeno HAV) induz tolerância ou uma resposta imunológica protetora no intestino (Alpan et al., J. Immunol. 166 (8): 4843-4852, 2001). A ativação de DCs, geralmente por estímulos inflamatórios, promove a expressão de moléculas co-estimulatórias e apresentação de antígenos, de uma forma que permita a imprimadura produtiva das células T.

[00139] Resumidamente, os progenitores DC derivados da medula óssea foram isolados a partir camundongos BALB/c e cultivados na presença de interleucina 4 (IL-4) e de factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos (GM- CSF), que leva à diferenciação para o fenótipo DC imaturo ( 5 dias). Posterior tratamento com fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) diferencia ainda DCs imaturas em células dendríticas maduras. As células dendríticas imaturas foram incubadas com vesículas lipídicas de tensoativo não iônico (NISVs) preparadas conforme as etapas 1 e 2 do Exemplo 2 (sem a adição subsequente de antígeno) e com ou sem duas razões molares diferentes de ácido biliar para total de lipídios (0,1 e 0,5). Como um controle positivo as células dendríticas imaturas foram tratadas com TNF-α sozinho. A maturação de células dendríticas imaturas foi medida por citometria de fluxo utilizando anticorpos anti-MHC II e anticorpos anti-CD86. AS DCs maduras foram definidas como duplo positivo para ambos os anticorpos. Como mostrado na Figura 3, as NISVs sem ácido biliar não afetaram significativamente a maturação de DCs imaturas enquanto as NISVs com ácido biliar aumentaram a maturação de DCs. Os resultados também sugerem que esta maturação aumentada pode ser afetada pelo teor de ácido biliar.

Exemplo 8: Caracterização de vesículas por 31P RMN

[00140] Este exemplo descreve a caracterização por 31P RMN de certas vesículas exemplares que foram preparadas de acordo com os métodos da presente divulgação.

[00141] Vesículas foram preparadas como descrito nos Exemplos 1 e 2 sem a adição de qualquer antígeno. As vesículas liofilizadas foram reconstituídas em tampão de bicarbonato de sódio (NaHCCh). A concentração lipídica final foi de 50 mg/ml. 4 ml das vesículas em suspensão foram transferidos para um tubo de RMN de 10 mm e algumas gotas de D2O foram adicionados.

[00142] O espectro de 31P RMN de vesículas preparadas utilizando o método de fusão invertida de 2 etapas é mostrado na Figura 4A. A forma de linha assimétrica, com um ombro de baixo campo e um pico de alto campo e um desvio químico de anisotropia cerca de 20 ppm corresponde a DCP organizada em uma estrutura típica lamelar.

[00143] O espectro de 31P RMN de vesículas preparadas utilizando o método de fusão de 3 etapas é mostrado na Figura 4B. Um pico isotrópico, sobreposto sobre a linha ampla e centrado em cerca de 2,5 ppm foi observado nas amostras preparadas por este método. O pico isotrópico, provavelmente, pode ser atribuído à presença das estruturas não-lamelares tais como micelas, fase hexagonal, ou vesículas de tamanho muito pequeno (de tamanho nano).

Exemplo 9: Método de fusão invertida de duas etapas para a preparação de vesículas

[00144] Este exemplo descreve um método de fusão invertida exemplar de duas etapas que pode ser utilizado para preparar vesículas. Uma razão molar de 5:4:1 de lipídios (5,575 g de MPG, 5,218 g de CHO, e 1,845 g de DCP) são colocados em um béquer de vidro de fundo chato de 250 mL, assegurando que nenhum do pó venha a aderir na lateral do béquer de vidro. Em certas modalidades, quando bilossomos são feitos, o ácido biliar é adicionado nessa etapa, por exemplo, uma razão molar de 0,5 de ácido desoxicólico (0,662 g de ácido desoxicólico).

[00145] Usando uma garra para segurar o béquer contendo lipídios e ácidos biliares, o béquer é revestido com folha de alumínio e os lipídios são permitidos derreter em um banho de óleo aquecido a 140°C a 145°C, com agitação ocasional no béquer.

[00146] Nesta fase, a solução mãe antigênica é preparada por mistura de antígeno e de tampão fosfato concentrado (5,174 g de Na2HPO4 e 1,179 g de NaH2PO4 em 15 ml de água estéril WFI). A solução-mãe antigênica é homogeneizada a 8000 rpm em um vaso esterilizado SS de 1L. Os lipídios fundidos (com ou sem ácido biliar) são rapidamente transferidos para o vaso SS através de um funil de vidro esterilizado, prosseguindo com a homogeneização da solução. A mistura é homogeneizada durante 10 minutos a 8000 rpm. A suspensão resultante é transferida para um frasco de 1 L estéril e agitada durante 1-2 horas a 220 rpm e 30° a 35°C.

[00147] Em certas modalidades, a suspensão resultante é dividida em dois volumes iguais (225 ml cada) e o adjuvante poli(IC:LC) é adicionado coforme a seguir.

[00148] Para o primeiro grupo, poli (IC:LC) em 400 mM de solução de sacarose é preparado por mistura de 22,5 ml de uma suspensão poli (IC:LC) (45 mg de poli (IC:LC) a 2 mg/ml) e 202,5 \ bml de solução de sacarose 400 mM em tampão fosfato 100 mM. A suspensão resultante é adicionada ao primeiro volume 225ml da suspensão antigênica/vesícula e agitada durante 5 minutos a 220 rpm e 30° a 35°C.

[00149] Para o primeiro grupo, poli (IC:LC) em 400 mM de solução de sacarose é preparado por mistura de 7,5 ml de uma suspensão poli (IC:LC) (45 mg de poli (IC:LC) a 2 mg/ml) e 217,5 de bml de solução de sacarose 400 mM em tampão fosfato 100 mM. A suspensão resultante é adicionada ao primeiro volume de 225ml da suspensão antigênica/vesícula e agitada durante 5 minutos a 220 rpm e 30° a 35°C.

[00150] As amostras podem então ser congeladas a -80°C durante a noite. Em certas modalidades, as amostras são subsequentemente liofilizadas e armazenadas a 4°C.

Exemplo 10: Método de fusão invertida de duas etapas para a preparação de vesículas

[00151] Este exemplo descreve outro método de fusão invertida exemplar de duas etapas que pode ser utilizado para preparar vesículas. Uma razão molar de 5:4:1 de lipídios (496 g de 1-monopalmitoíla glicerol (MPG) , 496 g de colesterol (CHO), e 164 g de dicetil fosfato (DCP) são colocados em um béquer de vidro de fundo chato, assegurando que nenhum do pó venha a aderir na lateral do béquer de vidro. Um agonista de TLR-4 é co-fundido juntamente com os lipídios (por exemplo, 12 mg de PHAD™ (dissacarídeo de hexaacil da Avanti Polar Lipids)). O béquer é apertado e coberto com folha de alumínio e os lipídios são fundidos em um banho de óleo aquecido a 120-125°C, com agitação ocasional no béquer.

[00152] Nesta fase, a solução mãe antigênica é preparada por mistura de antígeno e de tampão fosfato concentrado (5,980 g de Na2HPO4 e 1,363 g de NaH2PO4 em 20 ml de água estéri). A solução-mãe antigênica é homogeneizada a 8000 rpm a 30-35°C, e os lipídios fundidos com agonista de TLR-4 são rapidamente transferidos para o copo durante a homogeneização da solução. A mistura é homogeneizada durante 10 minutos a 8000 rpm à 30-35°C. A suspensão de lipídio-antígeno resultante é agitada durante 1-2 horas a 220 ± 10 rpm a 30-35°C.

[00153] Em algumas modalidades, a solução de sacarose em água pode ser adicionada à solução de vesícula/antígeno e agitada durante 5 minutos a 220 ± 10 rpm a 30-35°C.

[00154] As amostras podem então ser congeladas a -80°C durante a noite. Em certas modalidades, as amostras são subsequentemente liofilizadas e armazenadas a 4°C.

Incorporação por referência

[00155] Os teores de qualquer referência aqui referida são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

Outras modalidades

[00156] Pretende-se que o relatório descritivo e os exemplos sejam considerados apenas como exemplo. Outras modalidades serão evidentes para os técnicos no assunto a partir de uma consideração da especificação ou prática dos métodos, formulações e kits aqui revelados.

[00157] Em particular, enquanto que a discussão anterior teve por foco o aprisionamento de antígenos, deve- se entender que, em geral, os métodos podem ser utilizados para aprisionar qualquer substância, se antigênica ou não- antigênica. Portanto, em algumas modalidades, os métodos da presente divulgação podem ser utilizados para aprisionar um ou mais polipeptídios, polinucleotídeo ou polissacáridos que podem ou não ser antigênico. As classes específicas de substâncias incluem, entre outras, os adjuvantes, enzimas, receptores, neurotransmissores, hormônios, citocinas, modificadores de resposta de células, tais como fatores de crescimento e fatores quimiotácticos, anticorpos, haptenos, toxinas, interferons, ribozimas, agentes anti-sentido, plasmídeos, DNA e RNA. Em algumas modalidades o polipeptídio pode ser um anticorpo ou fragmento de anticorpo, exemplo, um anticorpo humanizado. Tabela 4 fornece uma lista não limitativa de substâncias exemplares que podem ser aprisionadas utilizando os métodos da presente divulgação. Tabela d

[00158] Além disso, embora os métodos da presente divulgação sejam pensados como de particular aplicação a substâncias termolábeis que são sensíveis à sua química e/ou ambiente físico (por exemplo, substâncias biológicas, tais como micróbios, polipeptídios, polinucleotídeos, polissacarídeos, etc.), deve-se entender que em algumas modalidades, os métodos podem também ser utilizados para reter substâncias mais estáveis, incluindo terapêuticos tradicionais de moléculas pequenas.

Claims

1. Método caracterizado por compreender: fornecer uma mistura fundida de lipídios formadores de vesículas; e adicionar a mistura fundida a uma solução aquosa compreendendo um antígeno de modo que as vesículas contendo antígeno sejam formadas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato dos lipídios formadores de vesículas serem fosfolipídios, ou tensoativos não iônicos.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato da mistura de lipídios formadores de vesículas compreender ainda: um tensoativo iônico; ou um esteroide.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da mistura de lipídios formadores de vesículas serem uma mistura de 1-monopalmitoíla glicerol, colesterol e dicetilfosfato.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato da solução aquosa compreendendo um antígeno ser controlada por temperatura.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato da solução aquosa compreendendo um antígeno ser mantida a uma temperatura inferior a 50 °C durante a etapa de adição da mistura fundida a uma solução aquosa compreendendo o antígeno.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato da solução aquosa compreendendo um antígeno ser mantida a uma temperatura inferior a 40°C durante a etapa de adição da mistura fundida a uma solução aquosa compreendendo o antígeno.

8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato da solução aquosa compreendendo um antígeno ser mantida a uma temperatura inferior a 30°C durante a etapa de adição da mistura fundida a uma solução aquosa compreendendo o antígeno.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato da mistura lipídica fundida compreender ainda um potenciador de transporte que facilita o transporte de lipídios através das membranas mucosas.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato da mistura lipídica fundida carecer de um potenciador de transporte que facilita o transporte de lipídios através das membranas mucosas.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato da solução aquosa compreender ainda um lioprotetor.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato do lioprotetor ser sacarose.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato do antígeno ser um vírus

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato do vírus ser um vírus atenuado ou um vírus inativado.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato do antígeno ser selecionado do grupo que consiste em um polipeptídeo, um polinucleotídeo e um polissacarídeo.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato do antígeno ser termolábil.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado por compreender ainda uma etapa de adição de um adjuvante após as vesículas contendo antígeno serem formadas.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato do adjuvante ser um agonista TLR-3.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato do agonista TLR-3 ser adicionado com um lioprotetor.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato da mistura fundida compreender ainda um adjuvante.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato do adjuvante ser um agonista TLR-4.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado por compreender ainda uma etapa de liofilização das vesículas contendo antígeno.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por compreender ainda uma etapa de reidratação das vesículas contendo antígenos após eles terem sido liofilizados.