ES2573427T9 - Procedimientos para preparar vesículas y formulaciones producidas a partir de las mismas - Google Patents

Description

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Procedimientos para preparar vesfculas y formulaciones producidas a partir de las mismas Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad bajo 35 U.S.C. § 119(e) para la solicitud provisional de los EE. UU. con numero de serie 61/223.196, presentada el 6 de julio de 2009 y la solicitud provisional de los EE. UU. con numero de serie 61/256.912, presentada el 30 de octubre de 2009.

Antecedentes

Las vesfculas se describieron por primera vez en la decada de 1960 como un modelo de membranas celulares (vease Bangham et al., J. Mol. Biol. 13:238-252, 1965). Las vesfculas han encontrado varias aplicaciones en la administracion de farmacos con moleculas pequenas, adyuvancia de vacuna, transferencia genica y diagnostico por imagen (por ejemplo, vease Liposome Technology, 3a edicion, editado por Gregory Gregoriadis, Informa Healthcare, 2006 y Liposomes: A Practical Approach (The Practical Approach Series, 264), 2a edicion, editado por Vladimir Torchilin y Volkmar Weissig, Oxford University Press, USA, 2003).

Se han descrito varios procedimientos para preparar vesfculas (por ejemplo, veanse las referencias citadas anteriormente y Walde e Ichikawa, Biomol. Eng., 18:143-177, 2001). Sin embargo, sigue existiendo una necesidad en la tecnica de obtener procedimientos que se puedan usar para atrapar sustancias dentro de vesfculas.

Un procedimiento que se ha descrito en la tecnica es el denominado procedimiento de fundido en 3 etapas. Inicialmente, se funden los lfpidos formadores de vesfculas a temperaturas altas (por ejemplo, 120 °C). Se crea una emulsion en una segunda etapa anadiendo un tampon acuoso (por ejemplo, tampon bicarbonato) a los lfpidos fundidos. Finalmente, se homogeneiza la sustancia que se va a atrapar con los componentes de la emulsion a una temperatura reducida (por ejemplo, 50 °C) antes de la liofilizacion. De forma alternativa, se liofilizan las vesfculas de la emulsion y a continuacion se reconstituyen en presencia de la sustancia que se va a atrapar.

Aunque los procedimientos tales como este pueden ser muy adecuados para atrapar sustancias que pueden soportar temperaturas altas y/o moleculas pequenas que se pueden difundir rapidamente en vesfculas vacfas, se ha descubierto que no son adecuados para atrapar los tipos de antfgenos (por ejemplo, polipeptidos, virus, etc.) que estan implicados comunmente en las vacunas. En particular, se ha descubierto que estos procedimientos producen eficacias de atrapamiento bajas y pueden reducir drasticamente la actividad del antfgeno subyacente (por ejemplo, como se mide por respuestas inmunitarias). Por lo tanto, existe una necesidad en la tecnica de obtener procedimientos de preparacion de vesfculas que puedan atrapar antfgenos minimizando ademas el impacto sobre la actividad del antfgeno.

Mann et al, Vaccine 22: 2425-2429, 2004 divulga la preparacion de vesfculas fundiendo lfpidos a 140°, a los que se le anade desoxicolato, seguido de una formulacion con hemaglutinina de gripe.

Resumen

La presente invencion proporciona un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1.

Breve descripcion del dibujo

La figura 1 compara los tamanos de partfcula medios para dos formulaciones de vesfcula que se prepararon usando el procedimiento de fundido en 3 etapas del ejemplo 1 y el procedimiento de fundido en 2 etapas invertido del ejemplo 2. Se liofilizaron las formulaciones y a continuacion se rehidrataron en presencia de un tampon que contema 2 |jg de antfgeno de hepatitis A inactivado. Se midio el tamano de vesfcula, que es un buen marcador de estabilidad, usando un Mastersizer inmediatamente despues de la hidratacion y 2, 4 y 6 horas despues de esto.

La figura 2 muestra la respuesta inmunitaria provocada por las vesfculas que contienen el antfgeno de hepatitis A. Se prepararon vesfculas vacfas usando el procedimiento de fundido en 3 etapas del ejemplo 1 y el procedimiento de fundido en 2 etapas invertido del ejemplo 2. Se liofilizaron las formulaciones y a continuacion se rehidrataron en presencia de un tampon que contema 2 jg de antfgeno de hepatitis A inactivado. Se inmunizaron los ratones por via oral 3 veces los dfas 0, 14 y 28, y se sometieron a prueba los sueros para determinar la reactividad 14 dfas despues de la ultima vacunacion. Cada sfmbolo representa esa valoracion de punto final de suero de un animal individual.

La figura 3 muestra que el contenido de sal biliar en las vesfculas afecta a la maduracion de las celulas dendnticas inmaduras como se evidencia por citometna de flujo. Se midio la maduracion de celulas dendnticas inmaduras por citometna de flujo usando anticuerpos anti-MHC II y anti-CD86. Las CD maduras se definieron como doble positivo para ambos anticuerpos. Se trataron celulas dendnticas inmaduras con vesfculas lipfdicas de tensioactivo no ionico (VTNI) preparadas como en las etapas 1 y 2 del ejemplo 2 (sin la posterior adicion de antfgeno) y con o sin dos proporciones molares diferentes de acido biliar con respecto a lfpido total (0,1 y 0,5). Como control positivo, se trataron celulas dendnticas inmaduras con TNF-a solo.

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La figura 4 compara el espectro de RMN de 31P de vesmulas ejemplares preparadas por los procedimientos del ejemplo 1 y 2 sin la adicion de ningun antfgeno. Se obtuvieron todos los espectros a 25 °C.

Definiciones

En toda la presente divulgacion, se emplean varios terminos que se definen en los siguientes parrafos.

Como se usa en el presente documento, el termino "antigeno" se refiere a una sustancia que contiene uno o mas epftopos (lineales, conformacionales o bien ambos) que se pueden reconocer por un anticuerpo. En determinados modos de realizacion, un antigeno puede ser un virus, un polipeptido, un polinucleotido, un polisacarido, etc. El termino "antfgeno" indica tanto antigenos de subunidades, (es decir, antigenos que estan separados y diferenciados de un organismo completo con el que esta asociado el antigeno en la naturaleza), asf como bacterias, virus, hongos, parasitos u otros microbios muertos, atenuados o inactivados. En determinados modos de realizacion, un antigeno puede ser un "inmunogeno".

Como se usa en el presente documento, el termino "atrapar" se refiere a cualquier tipo de asociacion ffsica entre una sustancia y una vesmula, por ejemplo, encapsulacion, adhesion (a la pared interna o externa de la vesmula) o inclusion en la pared con o sin extrusion de la sustancia. El termino se usa de manera intercambiable con los terminos "cargar" y "contener".

Como se usa en el presente documento, los terminos "respuesta inmunitaria" se refieren a una respuesta provocada en un animal. Una respuesta inmunitaria se puede referir a inmunidad celular, inmunidad humoral o puede implicar ambas. Una respuesta inmunitaria tambien puede estar limitada a una parte del sistema inmunitario. Por ejemplo, en determinados modos de realizacion, una formulacion inmunogena puede inducir un incremento en la respuesta de IFNy. En determinados modos de realizacion, una formulacion inmunogena puede inducir una respuesta de IgA mucosa (por ejemplo, como se mide en lavados nasales y/o rectales). En determinados modos de realizacion, una formulacion inmunogena puede inducir una respuesta de IgG sistemica (por ejemplo, como se mide en el suero).

Como se usa en el presente documento, el termino "inmunogeno" quiere decir que puede producir una respuesta inmunitaria en un huesped animal frente a una entidad distinta del huesped (por ejemplo, un virus de la hepatitis A o virus de la hepatitis B). En determinados modos de realizacion, esta respuesta inmunitaria forma la base de la inmunidad protectora provocada por una vacuna frente a un organismo infeccioso espedfico (por ejemplo, un virus de la hepatitis A o un virus de la hepatitis B). Un "inmunogeno" es una sustancia inmunogena (por ejemplo, una molecula).

Como se usa en el presente documento, los terminos "cantidad terapeuticamente eficaz" se refieren a la cantidad suficiente para mostrar un beneficio significativo en un paciente que se esta tratando. La cantidad terapeuticamente eficaz de una formulacion inmunogena puede variar dependiendo de factores tales como el criterio de valoracion biologico deseado, la naturaleza de la formulacion, la via de administracion, la salud, la estatura y/o la edad del paciente que se esta tratando, etc.

Como se usa en el presente documento, el termino "polipeptido" se refiere a una protema (es decir, una cadena de al menos dos aminoacidos unidos entre sf por enlaces peptfdicos). En algunos modos de realizacion, los polipeptidos pueden incluir restos distintos de aminoacidos (por ejemplo, pueden ser glucoprotemas, los proteoglucanos, lipoprotemas, etc.) y/o se pueden procesar o modificar de otro modo. Los expertos en la tecnica apreciaran que una "protema" puede ser una cadena polipeptfdica completa como se produce por una celula (con o sin una secuencia senal), o puede ser una porcion de la misma. Los expertos en la tecnica apreciaran que una protema pueden incluir a veces mas de una cadena polipeptfdica, por ejemplo unida por uno o mas enlaces disulfuro o asociada por otros medios. Los polipeptidos pueden contener L-aminoacidos, D-aminoacidos, o ambos y pueden contener cualquiera de una variedad de modificaciones aminoaddicas o analogos conocidos en la tecnica. Las modificaciones utiles incluyen, por ejemplo, acetilacion, amidacion, etc, terminal. En algunos modos de realizacion, los polipeptidos pueden comprender aminoacidos naturales, aminoacidos no naturales, aminoacidos sinteticos y combinaciones de los mismos.

Como se usa en el presente documento, el termino "polisacarido" se refiere a un polfmero de glucidos. El polfmero puede incluir glucidos naturales (por ejemplo, arabinosa, lixosa, ribosa, xilosa, ribulosa, xilulosa, alosa, altrosa, galactosa, glucosa, gulosa, idosa, manosa, talosa, fructosa, psicosa, sorbosa, tagatosa, manoheptulosa, sedoheptulosa, octolosa y sialosa) y/o glucidos modificados (por ejemplo, 2'-fluororribosa, 2'-desoxirribosa y hexosa). Los polisacaridos ejemplares incluyen almidon, glucogeno, dextrano, celulosa, etc.

Como se usa en el presente documento, el termino "polinucleotido" se refiere a un polfmero de nucleotidos. El polfmero puede incluir nucleosidos naturales (es decir, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina), analogos de nucleosidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-iodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, 4-acetilcitidina, 5-(carboxihidroximetil)uridina, dihidrouridina, metilpseudouridina, 1-metiladenosina, 1-metilguanosina, N6-metiladenosina y 2-tiocitidina), bases qdmicamente modificadas, bases biologicamente modificadas (por ejemplo, bases metiladas), bases intercaladas, glucidos

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modificados (por ejemplo, 2-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, 2'-O-metilcitidina, arabinosa y hexosa), o grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos y enlaces 5'-N-fosforamidita).

Como se usa en el presente documento, el termino "farmaco terapeutico de moleculas pequenas" se refiere a una molecula terapeutica no polimerica que puede contener varios enlaces carbono-carbono y tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 1500 Da (por ejemplo, menos de aproximadamente 1000 Da, menos de aproximadamente 500 Da o menos de aproximadamente 200 Da). Un farmaco terapeutico de moleculas pequenas se puede sintetizar en un laboratorio (por ejemplo, por smtesis combinatoria, usando un microorganismo genomanipulado, etc.) o se puede encontrar en la naturaleza (por ejemplo, un producto natural). En general, un farmaco terapeutico de moleculas pequenas puede modificar, inhibir, activar o afectar de otro modo a un acontecimiento biologico. Por ejemplo, los farmacos terapeuticos de moleculas pequenas pueden incluir, pero no se limitan a, sustancias antisida, sustancias antineoplasicas, antibioticos, sustancias antidiabeticas, inmunodepresores, sustancias antivmcas, inhibidores enzimaticos, neurotoxinas, opioides, hipnoticos, antihistammicos, lubricantes, tranquilizantes, anticonvulsivos, relajantes musculares y sustancias antiparkinsonianas, antiespasmodicos y contractores musculares incluyendo bloqueantes de los canales, mioticos y anticolinergicos, compuestos antiglaucoma, compuestos antiparasitarios y/o antiprotozoicos, moduladores de las interacciones de la matriz extracelular celular incluyendo inhibidores del crecimiento celular y moleculas antiadhesion, agentes vasodilatadores, inhibidores de la smtesis de ADN, ARN o protemas, antihipertensivos, analgesicos, antipireticos, agentes antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, factores antiangiogenicos, factores antisecretores, anticoagulantes y/o agentes antitromboticos, anestesicos locales, oftalmicos, prostaglandinas, antidepresivos, sustancias antipsicoticas, antiemeticos y agentes para obtencion de imagenes. Se puede encontrar un listado mas completo de moleculas pequenas ejemplares adecuadas para su uso en los procedimientos de la presente divulgacion en Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications, editado por Axel Kleemann y Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999; Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals, editado por Susan Budavari et al., CRC Press, 1996, y United States Pharmacopeia-25/National formulary-20, publicada por la United States Pharmacopeial Convention, Inc., 2001. Preferentemente, aunque no necesariamente, la molecula pequena es una que ya se ha considerado segura y eficaz para su uso por el organismo o agencia gubernamental apropiada. Por ejemplo, los farmacos para uso en seres humanos enumerados por la FDA en 21 C.F.R. §§ 330,5, 331 a 361, y 440 a 460, y los farmacos para uso veterinario enumerados por la FDA en 21 C.F.R. §§ 500 a 589, se consideran todos aceptables para su uso de acuerdo con los procedimientos de la presente divulgacion.

Como se usa en el presente documento, el termino "tratar" (o "tratando”, "tratado”, "tratamiento”, etc.) se refiere a la administracion de una formulacion a un paciente que tiene una enfermedad, un smtoma de una enfermedad o una predisposicion hacia una enfermedad, con el fin de aliviar, calmar, modificar, mejorar, superar o influir en la enfermedad, un smtoma o smtomas de la enfermedad, o la predisposicion hacia la enfermedad. En determinados modos de realizacion, el termino "tratar" se refiere a la vacunacion de un paciente.

Descripcion detallada de algunos modos de realizacion

I. Procedimientos para preparar vesiculas

La presente divulgacion proporciona procedimientos para preparar vesmulas. En general, las vesmulas tienen un compartimento acuoso encerrado por una o mas bicapas que incluyen lfpidos, opcionalmente con otras moleculas. Por ejemplo, como se analiza con mas detalle a continuacion, en algunos modos de realizacion, las vesmulas de la presente divulgacion comprenden moleculas potenciadoras del transporte (por ejemplo, sales biliares) que facilitan el transporte de lfpidos a traves de las membranas mucosas.

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona procedimientos para preparar vesmulas que incluyen las etapas de proporcionar una mezcla fundida de lfpidos formadores de vesmulas y a continuacion anadir la mezcla fundida a una solucion acuosa que comprende un antfgeno de modo que se formen las vesmulas que contienen antfgeno. En algunos modos de realizacion, la solucion acuosa que comprende un antfgeno se controla por temperatura. En algunos modos de realizacion, la solucion acuosa que comprende un antfgeno se mantiene a una temperatura de menos de aproximadamente 50 °C durante la etapa de adicion (por ejemplo, menos de aproximadamente 40 °C, de menos de aproximadamente 30 °C, etc.). En algunos modos de realizacion, la solucion acuosa que comprende un antfgeno se mantiene en un intervalo de temperatura de entre aproximadamente 25 °C y aproximadamente 50 °C. En algunos modos de realizacion, la solucion acuosa que comprende un antfgeno se mantiene a temperatura ambiente.

Se debe entender que una mezcla fundida de lfpidos formadores de vesmulas se puede obtener de cualquier manera, por ejemplo, se funden los lfpidos para formar una mezcla fundida. En algunos modos de realizacion, se funden los ifpidos en un intervalo de temperatura entre 120 °C y 150 °C (por ejemplo, entre 120 °C y 125 °C, entre 120 °C y 130 °C, entre 120 °C y 140 °C, entre 130 °C y 140 °C, entre 135 °C y 145 °C, o entre 140 °C y 145 °C). En algunos modos de realizacion, se funden los lfpidos a aproximadamente 120 °C. En algunos modos de realizacion, se funden los lfpidos a aproximadamente 125 °C. En algunos modos de realizacion, se funden los lfpidos a aproximadamente 130 °C. En algunos modos de realizacion, se funden los lfpidos a aproximadamente 135 °C. En algunos modos de realizacion, se funden los lfpidos a aproximadamente 140 °C. En algunos modos de realizacion, se funden los lfpidos a aproximadamente 145 °C. En algunos modos de realizacion, se funden los lfpidos a aproximadamente 150 °C.

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En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona procedimientos para preparar vesfflulas que incluyen las etapas de proporcionar un producto lipfdico liofilizado y rehidratar el producto lip^dico liofilizado con una solucion acuosa que comprende un antigeno de modo que se formen vesfculas que contienen antigeno. El producto lip^dico liofilizado se prepara fundiendo los lfpidos formadores de vesfflulas para producir una mezcla lip^dica fundida y a continuacion liofilizar la mezcla lipfdica fundida.

Sin desear comprometerse con ninguna teona, se cree que anadiendo una solucion acuosa de antigenos al producto lip^dico liofilizado, se forman vesfculas en presencia del antigeno. Esto puede explicar las eficacias de atrapamiento altas observadas. Adicionalmente, los procedimientos de la presente divulgacion evitan exponer el antigeno a disolventes organicos y temperaturas altas. Sin desear quedar limitado por ninguna teona, esto puede explicar la actividad alta (es decir, antigenicidad y/o inmunogenicidad) de los antigenos atrapados en las formulaciones resultantes.

Lipidos formadores de vesculas

Los lfpidos son moleculas organicas que, en general, son insolubles en agua, pero solubles en sustancias organicas apolares (por ejemplo, eter, cloroformo, acetona, benceno, etc.). Los acidos grasos son una clase de lfpidos que incluyen un resto acido unido a una cadena de hidrocarburos saturada o insaturada. Los ejemplos especfficos incluyen acido laurico, acido palmftico, acido estearico, acido araqrndico, acido palmitoleico, acido oleico, acido linoleico, acido linolenico, acido araquidonico, etc. Las sales de metales alcalinos de acidos grasos son tfpicamente mas solubles en agua de los propios acidos. Los acidos grasos y sus sales que incluyen cadenas de hidrocarburos con ocho o mas carbonos a menudo presentan propiedades anfifflicas debido a la presencia de regiones tanto hidrofilas (cabeza) como hidrofobas (cola) en la misma molecula. Los lfpidos no ionicos que incluyen grupos con cabeza polar tambien pueden presentar propiedades anfifflicas (es decir, tensioactivas). Los triesteres de acidos grasos con glicerol (1,2,3-trihidroxipropano) componen otra clase de lfpidos conocidos como trigliceridos que se encuentran comunmente en grasas animales y aceites vegetales. Los esteres de acidos grasos con alcoholes monohndricos de cadena larga forman otra clase de lfpidos que se encuentran en ceras. Los fosfolfpidos tambien son otra clase de lfpidos. Se asemejan a los trigliceridos en que son derivados de ester o amida de glicerol o esfingosina con acidos grasos y acido fosforico. El resto fosfato del acido fosfatfdico resultante puede estar esterificado adicionalmente con etanolamina, colina o serina en el propio fosfolfpido. Se debe entender que se pueden usar los procedimientos con cualquier lfpido que pueda formar vesfculas incluyendo cualquiera de los lfpidos que se describen en la tecnica anterior (por ejemplo, en Liposome Technology, 3a edicion, editado por Gregory Gregoriadis, Informa Healthcare, 2006 y Liposomes: A Practical Approach (The Practical Approach Series, 264), 2a edicion, editado por Vladimir Torchilin y Volkmar Weissig, Oxford University Press, USA, 2003).

En algunos modos de realizacion, el lfpido formador de vesfculas es un fosfolfpido. Se puede usar cualquier fosfolfpido natural o sintetico. Sin limitacion, los ejemplos de fosfolfpidos especfficos son L-a-(diestearoil)lecitina, L-a-(diapalmitoil)lecitina, acido L-a-fosfatido, acido L-a-(dilauroil)-fosfatidico, acido L-a(dimiristoil)fosfatidico, acido L-a(dioleoil)fosfatfdico, DL-a(dipalmitoil)fosfatfdico, L-a(diestearoil)fosfatfdico, y los diversos tipos de L-a-fosfatidilcolinas preparados a partir de cerebro, hngado, yema de huevo, corazon, soja y similares, o de forma sintetica, y sales de los mismos.

En algunos modos de realizacion, el lfpido formador de vesfculas es un tensioactivo no ionico. Las vesfculas de tensioactivo no ionico se denominan en el presente documento "VTNI". Sin limitacion, los ejemplos de tensioactivos no ionicos adecuados incluyen tensioactivos unidos a ester a base de glicerol. Dichos esteres de glicerol pueden comprender uno de dos grupos acilo alifatico superior, por ejemplo, que contienen al menos diez atomos de carbono en cada resto acilo. Los tensioactivos a base de dichos esteres de glicerol pueden comprender mas de una unidad de glicerol, por ejemplo, hasta 5 unidades de glicerol. Se pueden usar monoesteres de glicerol, por ejemplo, los que contienen un resto alquenoflo o alcanoflo C12-C20, por ejemplo, caproflo, lauroflo, miristefflo, palmitoflo, oleflo o estearcfflo. Un tensioactivo no ionico ejemplar es 1-monopalmitoilglicerol.

En algunos modos de realizacion, tambien se pueden usar tensioactivos unidos a eter como tensioactivo no ionico. Por ejemplo, son adecuados los tensioactivos unidos a eter basados en glicerol o un glicol que tiene un glicol alifatico inferior de hasta 4 atomos de carbono, tal como etilenglicol. Los tensioactivos basados en dichos glicoles pueden comprender mas de una unidad de glicol, por ejemplo, hasta 5 unidades de (por ejemplo, eter diglicolcefflico y/o eter polioxietilen-3-launlico). Se pueden usar monoeteres de eter o glicerol, incluyendo los que contienen un resto alquenilo o alcanilo C12-C20, por ejemplo, caprilo, laurilo, miristilo, cetilo, oleflo o estearilo. Los productos de condensacion de oxido de etileno que se pueden usar incluyen los divulgados en la publicacion PCT n.° WO88/06882 (por ejemplo, tensioactivos de amina y eter alifatico superior de polioxietileno). Los tensioactivos unidos a eter ejemplares incluyen eter 1-monocefflico de glicerol y eter diglicolcefflico.

Otros componentes

En algunos modos de realizacion, las vesfculas pueden contener otros componentes lipfdicos y no lipfdicos, siempre que estos no eviten la formacion de vesfculas. Se debe entender que estos componentes se pueden mezclar conjuntamente con los lfpidos formadores de vesfculas y/o se pueden mezclar conjuntamente con el/los antfgeno(s).

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En algunos modos de realizacion, se ha descubierto que puede ser ventajoso mezclar conjuntamente estos componentes con los lfpidos formadores de vesfculas.

En algunos modos de realizacion, las vesfculas pueden incluir una molecula potenciadora del transporte que facilita el transporte de Kpidos a traves de las membranas mucosas. Como se describe en la patente de los EE. UU. N.° 5.876.721, se puede usar una variedad de moleculas como potenciadores del transporte. Por ejemplo, se pueden usar derivados de colesterol en los que el atomo de carbono C23 de la cadena lateral lleva un acido carboxflico, y/o derivados de los mismos, como potenciadores del transporte. Dichos derivados incluyen, pero no se limitan a, los "acidos biliares" acido colico y acido quenodesoxicolico, sus productos de conjugacion con glicina o taurina tal como acido glicocolico y taurocolico, derivados que incluyen acido desoxicolico y ursodesoxicolico, y sales de cada uno de estos acidos. Las VTNI que incluyen ademas un acido biliar o sal se denominan en el presente documento "bilosomas". En algunos modos de realizacion, los potenciadores del transporte incluyen aminoacidos aciloxilados, tales como acilcarnitinas y sales de los mismos. Por ejemplo, se puede usar acilcarnitina que contiene restos alquenoflo y alcanoflo C6-20, tal como palmitoilcarnitina, como potenciadores del transporte. Como se usa en el presente documento, se pretende que el termino aminoacido aciloxilado cubra aminoacidos primario, secundarios y terciarios asf como a, p y y aminoacidos. Las acilcarnitinas son ejemplos de y aminoacidos aciloxilados. Se debe entender que las vesfculas pueden comprender mas de un tipo de potenciador del transporte, por ejemplo, una o mas sales biliares diferentes y una o mas acilcarnitinas. El/Los potenciador(es) del transporte, si estan presentes, tfpicamente comprenderan entre un 40 y un 400 % por ciento en peso del lfpido formador de vesfculas (por ejemplo, entre un 60 y un 100% en peso o entre un 70 y un 90% en peso). En algunos modos de realizacion, el/los potenciador(es) del transporte, si estan presentes comprenderan entre un 1 y un 40 % por ciento en peso del lfpido formador de vesfculas (por ejemplo, entre un 1 y un 20 % en peso, entre un 1 y un 25 % en peso, entre un 1 y un 30 % en peso, entre un 1 y un 35 % en peso, entre un 2 y un 25 % en peso, entre un 2 y un 30 % en peso o entre un 2 y un 35 % en peso).

En determinados modos de realizacion, las vesfculas pueden carecer de una molecula potenciadora del transporte. En algunos modos de realizacion, las vesfculas pueden carecer de un "acido biliar" tal como acido colico y acido quenodesoxicolico, sus productos de conjugacion con glicina o taurina tales como acido glicocolico y taurocolico, derivados que incluyen acido desoxicolico y ursodesoxicolico, y sales de cada uno de estos acidos. En algunos modos de realizacion, las vesfculas pueden carecer de aminoacidos aciloxilados, tales como acilcarnitinas y sales de los mismos, y palmitoilcarnitinas.

En algunos modos de realizacion, las vesfculas pueden incluir un tensioactivo ionico, por ejemplo, para provocar que las vesfculas lleven una carga negativa. Por ejemplo, esto puede ayudar a estabilizar las vesfculas y proporcionar una dispersion eficaz. Sin limitacion, para este proposito se pueden usar materiales acidos tales como acidos alcanoicos y alquenoicos superiores (por ejemplo, acido palmttico, acido oleico) u otros compuestos que contienen grupos acidos incluyendo fosfatos tales como fosfatos de dialquilo (por ejemplo, fosfato de dicetilo, o acido fosfatfdico o fosfatidilserina) y monoesteres de sulfato tales como sulfatos de alquilo superior (por ejemplo, cetilsulfato). El/Los tensioactivo(s) ionico(s), si estan presentes, tfpicamente comprenderan, entre un 1 y un 25 % en peso del lfpido formador de vesfculas. Por ejemplo, entre un 2 y un 20 % en peso o entre un 5 y un 15 % en peso. En algunos modos de realizacion, el/los tensioactivo(s) ionico(s), si estan presentes, comprenderan entre un 1 y un 50 % en peso del lfpido formador de vesfculas (por ejemplo, entre un 1 y un 35 % en peso, entre un 5 y un 40 % en peso, entre un 10 y un 40 % en peso, entre un 15 y un 40 % en peso, entre un 20 y un 40 % en peso, o entre un 20 y un 35 % en peso).

En algunos modos de realizacion, las vesfculas pueden incluir un material hidrofobo apropiado de mayor masa molecular que facilita la formacion de bicapas (tal como un esteroide, por ejemplo, un esterol tal como colesterol). En algunos modos de realizacion, la presencia del esteroide puede ayudar a formar la bicapa de la que dependen las propiedades ffsicas de la vesfcula. El esteroide, si estan presente, tfpicamente comprendera entre un 20 y un 120 % en peso del lfpido formador de vesfculas. Por ejemplo, entre un 25 y un 90 % en peso o entre un 35 y un 75 % en peso. En algunos modos de realizacion, el esteroide, si esta presente, comprendera entre un 25 y un 95 % en peso, entre un 25 y un 105 % en peso, entre un 35 y un 95 % en peso, o entre un 35 y un 105 % en peso del lfpido formador de vesfculas.

En algunos modos de realizacion, se puede incluir un lioprotector en cualquier solucion o mezcla antes de la liofilizacion. Los lioprotectores ejemplares incluyen sacarosa, trehalosa, polietilenglicol (PEG), tampon dimetilsuccinato (DMS), seroalbumina bovina (BSA), manitol y dextrano.

En algunos modos de realizacion, las vesfculas de la presente divulgacion son bilosomas que incluyen ademas un tensioactivo ionico o un esteroide. En algunos modos de realizacion, los bilosomas pueden incluir un tensioactivo ionico y un esteroide.

En algunos modos de realizacion, las vesfculas de la presente divulgacion son vesfculas de tensioactivo no ionico (VTNI) que carecen de una molecula potenciadora del transporte y que incluyen ademas un tensioactivo ionico o un esteroide. En algunos modos de realizacion, las vesfculas pueden carecer de un "acido biliar" tal como acido colico y acido quenodesoxicolico, sus productos de conjugacion con glicina o taurina tales como acido glicocolico y taurocolico, derivados que incluyen acido desoxicolico y ursodesoxicolico, y sales de cada uno de estos acidos. En algunos modos de realizacion, las vesfculas pueden carecer de aminoacidos aciloxilados, tales como acilcarnitinas y sales de los mismos, y palmitoilcarnitinas. En algunos modos de realizacion, las VTNI pueden carecer de una molecula

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potenciadora del transporte (por ejemplo, cualquiera de las moleculas mencionadas anteriormente) e incluir un tensioactivo ionico y un esteroide.

Liofilizacion

Como se analiza anteriormente y a continuacion, en algunos modos de realizacion, los procedimientos de la presente divulgacion incluyen una etapa de liofilizacion (ya sea de una mezcla lipfdica fundida o de una formulacion de vesfculas que contienen antigeno). La liofilizacion es un procedimiento establecido para potenciar la estabilidad a largo plazo de los productos. Se cree que la potenciacion de la estabilidad ffsica y qmmica se logra evitando la degradacion y la hidrolisis. La liofilizacion implica congelar la preparacion en cuestion y a continuacion reducir la presion circundante (y opcionalmente calentar la preparacion) para permitir que el/los disolvente(s) congelado(s) sublimen directamente de la fase solida a gas (es decir, fase de secado). En determinados modos de realizacion, la fase de secado se divide en fases de secado primario y secundario.

La fase de congelacion se puede realizar colocando la preparacion en un recipiente (por ejemplo, un matraz, tubo Eppendorf, etc.) y opcionalmente girando el recipiente en un bano que se enfna por refrigeracion mecanica (por ejemplo, usando hielo seco y metanol, nitrogeno lfquido, etc.). En algunos modos de realizacion, la etapa de congelacion implica enfriar la preparacion hasta una temperatura que esta por debajo del punto eutectico de la preparacion. Puesto que el punto eutectico se produce a la temperatura mas baja a la que pueden coexistir la fase solida y lfquida de la preparacion, mantener el material a una temperatura por debajo de este punto garantiza que la sublimacion, en lugar de la evaporacion, ocurrira en pasos subsiguientes.

La fase de secado (o la fase de secado primario cuando se usan dos fases de secado) implica reducir la presion y opcionalmente calentar la preparacion hasta un punto en el que el/los disolvente(s) se pueda(n) sublimar. Esta fase de secado tipicamente retira la mayona del/de los disolvente(s) de la preparacion. Se apreciara que las fases de congelacion y de secado no son necesariamente fases distintas sino que se pueden combinar de cualquier manera. Por ejemplo, en determinados modos de realizacion, las fases de congelacion y de secado se pueden solapar.

Opcionalmente se puede usar una fase de secado secundario para retirar el/los disolvente(s) residual(es) que se adsorben durante la fase de congelacion. Sin desear comprometerse con ninguna teona, esta fase implica elevar la temperatura para romper cualquier interaccion fisicoqmmica que se haya formado entre las moleculas de disolvente y la preparacion congelada. Una vez que se completa la fase de secado, se puede romper el vado con un gas inerte (por ejemplo, nitrogeno o helio) antes de que se selle opcionalmente el producto liofilizado.

Rehidratacion

Como se analiza anteriormente, en algunos modos de realizacion, los procedimientos de la presente divulgacion incluyen una etapa de rehidratar un producto lipfdico liofilizado para formar vesfculas que contienen antfgeno. Esto se logra mezclando el producto lipfdico liofilizado con una solucion acuosa que comprende un antfgeno. En algunos modos de realizacion, esto implica anadir la solucion acuosa al producto lipfdico liofilizado.

En algunos modos de realizacion, las vesfculas que contienen antfgeno contienen al menos aproximadamente un 10 % del antfgeno anadido en la etapa de rehidratacion. En algunos modos de realizacion, las vesfculas que contienen antfgeno contienen al menos aproximadamente un 20 % del antfgeno anadido en la etapa de rehidratacion. En algunos modos de realizacion, las vesfculas que contienen antfgeno contienen al menos aproximadamente un 30 % del antfgeno anadido en la etapa de rehidratacion. En algunos modos de realizacion, las vesfculas que contienen antfgeno contienen al menos aproximadamente un 40 % del antfgeno anadido en la etapa de rehidratacion. En algunos modos de realizacion, las vesfculas que contienen antfgeno contienen al menos aproximadamente un 50 % del antfgeno anadido en la etapa de rehidratacion. En algunos modos de realizacion, las vesfculas que contienen antfgeno contienen al menos aproximadamente un 60 % del antfgeno anadido en la etapa de rehidratacion. En algunos modos de realizacion, las vesfculas que contienen antfgeno contienen al menos aproximadamente un 70 % del antfgeno anadido en la etapa de rehidratacion. En algunos modos de realizacion, las vesfculas que contienen antfgeno contienen al menos aproximadamente un 80 % del antfgeno anadido en la etapa de rehidratacion. En algunos modos de realizacion, las vesfculas que contienen antfgeno contienen al menos aproximadamente un 90 % del antfgeno anadido en la etapa de rehidratacion.

En algunos modos de realizacion, la solucion acuosa incluye un tampon. El tampon usado tfpicamente depende de la naturaleza del antfgeno o antfgenos en la solucion acuosa. Por ejemplo, sin limitacion, se puede usar un tampon PCB, un tampon Na2HPO^NaH2PO4, un tampon PBS, un tampon bicina, un tampon Tris, un tampon HEPES, un tampon MOPS, etc. El tampon PCB se produce mezclando propionato de sodio, cacodilato de sodio, y bis-Tris propano en las proporciones molares 2:1:2. Variar la cantidad de Hcl anadido permite tamponar a lo largo de un intervalo de pH de 4-9. En algunos modos de realizacion, se puede usar un tampon carbonato.

En algunos modos de realizacion, una formulacion de vesfculas que contienen antfgeno preparada por cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente se puede liofilizar para un uso futuro, y posteriormente rehidratarse (por ejemplo, con agua o un tampon acuoso) antes de su uso. En algunos modos de realizacion, se puede anadir un coadyuvante durante esta etapa de rehidratacion (por ejemplo, por inclusion en el agua esteril o tampon acuoso). En algunos modos de realizacion, una formulacion de vesfculas que contienen antfgeno se puede almacenar a -80 °C

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antes de la liofilizacion. En algunos modos de realizacion, una formulacion liofilizada se puede almacenar en un intervalo de temperaturas de entre -20 °C y 10 °C (por ejemplo, entre -5 °C y 10 °C, entre 0 °C y 5 °C o entre 2 °C y 8 °C).

Tamano de vesicula y procesamiento

Se apreciara que una formulacion de vesfcula incluira tipicamente una mezcla de vesfculas con un intervalo de tamanos. Se debe entender que los valores de diametro enumerados a continuacion corresponden al diametro mas frecuente dentro de la mezcla. En algunos modos de realizacion, > 90 % de las vesfculas en una formulacion tendran un diametro que esta dentro de un 50 % del valor mas frecuente (por ejemplo, 1000 ± 500 nm). En algunos modos de realizacion, la distribucion puede ser mas estrecha, por ejemplo, > 90 % de las vesfculas en una formulacion pueden tener un diametro que esta dentro de un 40, 30, 20, 10 o 5% del valor mas frecuente. En algunos modos de realizacion, se puede usar sonicacion o ultrasonicacion para facilitar la formacion de vesfculas y/o para modificar el tamano de particula de vesfcula. En algunos modos de realizacion, se puede usar filtracion, dialisis y/o centrifugacion para ajustar la distribucion de tamano de vesfcula.

En general, las vesfculas producidas de acuerdo con los procedimientos de la presente divulgacion pueden ser de cualquier tamano. En algunos modos de realizacion, las formulaciones pueden incluir vesfculas con un diametro en el intervalo de aproximadamente 150 nm a aproximadamente 15 pm, por ejemplo, de aproximadamente 800 nm a aproximadamente un 1,5 pm. En determinados modos de realizacion, las vesfculas pueden tener un diametro que es mayor que 10 pm, por ejemplo, de aproximadamente 15 pm a aproximadamente 25 pm. En determinados modos de realizacion, las vesfculas pueden tener un diametro en el intervalo de aproximadamente 2 pm a aproximadamente 10 pm, por ejemplo, de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 4 pm. En determinados modos de realizacion, las vesfculas pueden tener un diametro que es menor que 150 nm, por ejemplo, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 100 nm.

Antigenos

En general, se debe entender que cualquier antigeno o antigenos se pueden atrapar usando un procedimiento de la presente divulgacion. Como se analiza previamente, el antigeno o antigenos pueden estar asociados con vesfculas de cualquier manera. En algunos modos de realizacion, el antigeno o antigenos pueden estar presentes en el nucleo acuoso de las vesfculas. Sin embargo, dependiendo de su hidrofobicidad, un antigeno tambien puede estar parcial o completamente asociado con una bicapa. En general, se ha de entender asimismo que, en algunos modos de realizacion, una formulacion de vesfcula puede incluir cantidades de uno o mas antigenos que no estan asociados con vesfculas.

En algunos modos de realizacion, los procedimientos de la presente divulgacion se pueden usar para atrapar uno o mas de los antigenos incluidos en una vacuna. La tabla 1 es una lista no limitante de vacunas adecuadas.

Tabla 1

Vacuna

Enfermedad

BioThrax®

Carbunco

DTaP (Daptacel®, Infanrix®, Tripedia®)

Difteria

Td (Decavac®)

Difteria

DT, TT

Difteria

Tdap (Boostrix®, Adacel®)

Difteria

DTaP/IPV/HepB (Pediarix®)

Difteria

DTaP/Hib (TriHIBit®)

Difteria

HepA (Havrix®, Vaqta®)

Hepatitis A

HepA/HepB (Twinrix®)

Hepatitis A

HepB (Engerix-B®, Recombivax HB®)

Hepatitis B

HepB/Hib (Comvax)

Hepatitis B

DTaP/IPV/HepB (Pediarix),

Hepatitis B

HepA/HepB (Twinrix®)

Hepatitis B

Hib (ActHIB®, HibTITER®, PedvaxHIB®)

HIB

HepB/Hib (Comvax®)

HIB

DTaP/Hib (TriHIBit®)

HIB

PVH (Gardasil®)

PVH

Gripe (Fluarix®, Fluvirin®, Fluzone®, Flulaval®, FluMist®)

Gripe estacional

(continuacion)

Vacuna

Enfermedad

Gripe (Afluria®)

Gripe estacional

Gripe (Agriflu®)

Gripe estacional

Gripe (Begrivac®)

Gripe estacional

Gripe (Enzira®)

Gripe estacional

Gripe (Fluad®)

Gripe estacional

Gripe (Fluvax®)

Gripe estacional

Gripe (Fluviral, Fluviral S/F®)

Gripe estacional

Gripe (Crippol®)

Gripe estacional

Gripe (Inflexal, Inflexal S, Inflexal V®)

Gripe estacional

Gripe (Influvac®)

Gripe estacional

Gripe (Mastaflu®)

Gripe estacional

Gripe (Mutagrip®)

Gripe estacional

Gripe (Optaflu®)

Gripe estacional

Gripe (Vaxigrip®)

Gripe estacional

Gripe pandemica H1N1 (Arepanrix®)

Gripe pandemica H1N1

Gripe pandemica H1N1 (Calvapan®)

Gripe pandemica H1N1

Gripe pandemica H1N1 (Focetria®)

Gripe pandemica H1N1

Gripe pandemica H1N1 (Gripe A (H1N1) 2009 Monovalent Vaccine®)

Gripe pandemica H1N1

Gripe pandemica H1N1 (Pandemrix®)

Gripe pandemica H1N1

JE (JE-Vax®)

Encefalitis japonesa

Enfermedad de Lyme (LYMErix®)

Enfermedad de Lyme

Sarampion (Attenuvax®)

Sarampion

MMR (M-M-R II®)

Sarampion

MMRV (ProQuad®)

Sarampion

Conjugado mening. (Menactra®)

Meningococica

Polisacarico mening. (Menomune®)

Meningococica

Paperas (Mumpsvax®)

Paperas

MMR (M-M-R II®)

Paperas

MMRV (ProQuad®)

Paperas

DTaP (Daptacel®, Infanrix®, Tripedia®)

Tosferina

Tdap (Boostrix®)

Tosferina

DTaP/IPV/HepB (Pediarix®)

Tosferina

DTaP/Hib (TriHIBit®)

Tosferina

Conjugado neumo. (Prevnar®)

Neumococica

Polisacarido neumo. (Pncumovax 23®)

Neumococica

Polio (Ipol®)

Poliomelitis

DTaP/IPV/HepB (Pediarix®)

Poliomelitis

Rabia (BioRab®, Imovax Rabies®, RabAvert®)

Rabia

Rotavirus (RotaTeq®)

Rotavirus

Rubeola (Meruvax II®)

Rubeola

MMR (M-M-R II®)

Rubeola

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(continuacion)

Vacuna

Enfermedad

MMRV (ProQuad®)

Rubeola

Zoster (zostavax®)

Zoster

Vaccinia (Dryvax®)

Viruela y viruela sfmica

DTaP (Daptacel®, Infanrix®, Tripedia®)

Tetanos

Td (Decavac®)

Tetanos

DT, TT

Tetanos

Tdap (Boostrix®)

Tetanos

DTaP/IPV/HepB (Pediarix®)

Tetanos

DTaP/Hib (TriHIBit®)

Tetanos

BCG

Tuberculosis

Antitifoidea (Typhim Vi®)

Tifoidea

Antitifoidea oral (Vivotif Berna®)

Tifoidea

Varicela (Varivax®)

Varicela (Varicella)

MMRV (ProQuad®)

Varicela (Varicella)

Fiebre amarilla (YF-Vax®)

Fiebre amarilla

En las siguientes secciones se analizan algunos antigenos ejemplares que se podnan usar.

Hepatitis A

La hepatitis A es una hepatopatia grave provocada por el virus de la hepatitis A (VHA). El virus se encuentra en las heces de personas con hepatitis A. Como se muestra en la tabla 1, en la actualidad estan autorizadas varias vacunas de la hepatitis A inactivadas. Por ejemplo, Havrix® se fabrica por GlaxoSmithKline Biologicals. La patente de los EE. UU. N.° 6.180.110 describe la cepa de VHA atenuado (VHA 4380) usada en Havrix® que se derivo originalmente de la cepa HM175 del VHA (patente de los EE. UU. N.° 4.894.228). Havrix® contiene una suspension esteril de VHA inactivado con formalina. La actividad del antigeno vmco se referencia a un patron usando un ELISA y se expresa en terminos de unidades de ELISA (U). Cada dosis de adulto de 1 ml de la vacuna consiste en 1440 U de antigeno vmco, adsorbido en 0,5 mg de aluminio como hidroxido de aluminio (alum). Havrix® (al igual que con todas las demas vacunas de la hepatitis A autorizadas) se suministra como una suspension esteril para administracion intramuscular (i.m.). Aunque una dosis de Havrix® proporciona al menos proteccion a corto plazo, en la actualidad se recomienda una segunda dosis de recuerdo despues de seis a doce meses para garantizar una proteccion a largo plazo.

Otro ejemplo de una vacuna de la hepatitis A inactivada, AIMMUGEN® se ha autorizado y comercializado en Japon desde 1994 por Kaketsuken. AIMMUGEN® contiene una suspension esteril de VHA inactivado con formaldetndo. La dosis de adulto recomendada es de 0,5 |jg i.m. a los 0, 1 y 6 meses.

Como se usa en el presente documento, la expresion "antfgeno de VHA" se refiere a cualquier antfgeno que puede estimular un anticuerpo neutralizante para VHA en seres humanos. El antfgeno de VHA puede comprender partmulas de virus vivo atenuado o partmulas de virus atenuado inactivado o puede ser, por ejemplo una capside de VHA o protema vmca de VHA, que se puede obtener convenientemente por tecnologfa de ADN recombinante.

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona procedimientos para preparar formulaciones inmunogenas que incluyen un virus de la hepatitis A inactivado o atenuado (tambien denominado "antfgeno vmco de hepatitis A" o "antfgeno vmco" en el presente documento). Se apreciara que se pueden usar los procedimientos para preparar un virus de la hepatitis A inactivado. En general, estos procedimientos implicaran propagar un virus de la hepatitis A en una celula huesped, lisar la celula huesped para liberar el virus, aislar y a continuacion inactivar el antfgeno vmco. Despues de la retirada del medio de cultivo celular, se lisan las celulas para formar una suspension. Esta suspension se purifica a traves de procedimientos de ultrafiltracion y cromatograffa de permeacion en gel. A continuacion, se trata el lisado purificado con formalina para garantizar la inactivacion vmca (por ejemplo, vease Andre et al., Prog. Med. Virol. 37:72-95, 1990).

En la preparacion de AIMMUGEN®, se propaga la cepa de virus de la hepatitis A KRM0003 (establecida a partir de un VHA natural, que se ha aislado a partir de las heces de un paciente con hepatitis A) en celulas GL37 (una cepa celular establecida para la produccion de vacunas a partir de una cepa celular original de rinon de mono verde africano). Se inoculan celulas gL37 con VHA cepa KRM0003 y se recoge el antfgeno vmco, se purifica exhaustivamente y se inactiva con formaldetndo.

Otro ejemplo de un virus de la hepatitis A inactivado que esta comercialmente disponible pero no es una vacuna autorizada es el antfgeno de hepatitis A (VHA-ag) de Meridian Life Sciences. Como Havrix®, el Meridian VHA-ag tambien deriva del virus de la hepatitis A cepa HM175 pero se propaga en celulas FRhK-4 (rinon fetal de macaco de la

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India). Despues de la retirada del medio de cultivo celular, se lisan las celulas para formar una suspension y se purifica parcialmente la suspension por centrifugacion con gradiente y se inactivada por tratamiento con formalina.

Se apreciara que se puede usar cualquier cepa de virus de la hepatitis A, por ejemplo, sin limitacion cualquiera de las siguientes cepas que se han descrito en la tecnica (y otras variantes no humanas):

virus de la hepatitis A humano Hu/Arizona/HAS-15/1979

virus de la hepatitis A humano Hu/Australia/HM175/1976

virus de la hepatitis A humano Hu/China/H2/1982

virus de la hepatitis A humano Hu/Costa Rica/CR326/1960

virus de la hepatitis A humano Hu/Francia/CF-53/1979

virus de la hepatitis A humano Hu/Georgia/GA76/1976

virus de la hepatitis A humano Hu/Alemania/GBM/1976

virus de la hepatitis A humano Hu/Japon/HAJ85-1/1985

virus de la hepatitis A humano Hu/Los Angelos/LA/1975

virus de la hepatitis A humano Hu/Africa del Norte/MBB/1978

virus de la hepatitis A humano Hu/Noruega/NOR-21/1998

virus de la hepatitis A humano Hu/Sierra Leona/SLF88/1988

virus de la hepatitis A humano MSM1

virus de la hepatitis A humano Shanghai/LCDC-1/1984

Ademas, aunque la formalina y el formaldelddo se usan comunmente para inactivar las vacunas de la hepatitis A autorizadas inactivadas, se debe entender que se podnan usar otras tecnicas, por ejemplo, el tratamiento con cloro, exposicion a temperaturas altas (el antfgeno vmco se inactiva por encima de 85 °C/185°F), etc.

En determinados modos de realizacion puede resultar ventajoso anadir etapas adicionales al procedimiento tradicional para preparar un virus de la hepatitis A inactivado. Por ejemplo, la patente de los EE. UU. N.° 6.991.929 describe incluir una etapa de tratamiento de proteasa (por ejemplo, tripsina) despues de que el virus se haya propagado. Se descubrio que esta etapa mejora la retirada del material de celula huesped y proporciona una preparacion vmca mas pura.

Aunque todas las vacunas de la hepatitis A autorizadas en la actualidad incluyen antigenos vmcos inactivados, tambien se han descrito en la literatura vacunas alternativas que incluyen el antfgeno vmco atenuado. En determinados modos de realizacion, una formulacion inmunogena puede comprender un antigeno vmico atenuado de este tipo. Como es bien conocido en la tecnica, la ventaja de una vacuna atenuada radica en el potencial para una mayor inmunogenicidad lo que resulta de su capacidad para replicarse in vivo sin provocar una infeccion completa.

Un procedimiento que se ha usado en la tecnica para preparar los virus de la hepatitis A atenuados es la adaptacion vmca que implica pasar en serie una cepa vmca a traves de multiples cultivos celulares. Con el tiempo, la cepa muta y a continuacion se pueden identificar las cepas atenuadas. En determinados modos de realizacion, se puede pasar el virus a traves de diferentes cultivos celulares. Por ejemplo, los investigadores han generado virus de la hepatitis A atenuados pasando la cepa CR326 dieciseis veces en cultivos de celulas de pulmones diploides humanas (MRCS) (vease Preboste et al., J. Med. Virol. 20:165-175, 2005). Se obtuvo una cepa ligeramente mas virulenta pasando la misma cepa quince veces en cultivos de celulas de rinon fetal de macaco de la India (FRhK6) mas ocho veces en cultivos de celulas MRCS. Tambien se ha descrito una vacuna de la hepatitis A atenuada alternativa que se preparo de esta forma a partir de la cepa H2 (vease la patente europea n.° 0413637 y Mao et al., Vaccine 15:944-947, 1997).

En determinados modos de realizacion puede resultar ventajoso realizar una o mas de las etapas de cultivo celular a una temperatura reducida. Por ejemplo, la patente europea n.° 0413637 describe incluir una o mas etapas de inoculacion en las que se reduce la temperatura (por ejemplo, a 32-34 °C en lugar de 35-36 °C).

La patente de los EE. UU. N.° 6.180.110 describe un virus de la hepatitis A atenuado (VHA 4380) que crece en celulas MRC-5. Los investigadores identificaron mutaciones en VHA 4380 que paredan estar asociadas con la atenuacion, comparando su genoma con el genoma de una cepa mas virulenta. Esto les permitio disenar cepas de VHA mutantes con caractensticas optimas para una vacuna de la hepatitis A atenuada candidata. Se apreciara que este enfoque se pudo aplicar a cualquier virus de la hepatitis A atenuado conocido y se pudo usar para modificar geneticamente las variantes sin la necesidad de adaptacion vmca.

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Hepatitis B

El virus de la hepatitis B (VHB) provoca infecciones tanto agudas como cronicas. El amplio espectro clmico de la infeccion por VHB vana desde hepatitis asintomatica a sintomatica aguda; desde un estado de portador de antigeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) inactiva a cirrosis hepatica y sus complicaciones durante la fase cronica (Fattovich, J. Hepatol. 39:s50-58, 2003). El VHB se transmite en la exposicion parenteral o mucosa a fluidos corporales positivos en HBsAg generalmente de personas infectadas con VHB (Hilleman, Vaccine 21:4626-4649, 2003).

En la actualidad, existen dos vacunas comerciales usadas para prevenir la infeccion por VHB, ambas estan fabricadas usando tecnologfa recombinante. Por ejemplo, Engerix-B™ es una vacuna contra hepatitis B de ADN recombinante no infeccioso desarrollado por GlaxoSmithKline Biologicals. Contiene el antigeno de superficie purificado del VHB obtenido cultivando celulas de Saccharomyces cerevisiae modificadas geneticamente, que llevan el gen del antigeno de superficie del VHB.

Como se usa en el presente documento, la expresion "antfgeno de superficie de la hepatitis B" o "HBsAg" se refiere a cualquier antfgeno HBsAg o fragmento del mismo que presenta la antigenicidad del antfgeno de superficie del VHB en seres humanos.

Engerix-B™ y otras vacunas de la hepatitis B autorizadas, que se administran por via parenteral, han sido exitosas en inducir una respuesta inmunitaria sistemica a VHB. Sin embargo, los anticuerpos producidos como parte de la respuesta inmunitaria sistemica no pueden proporcionar proteccion en el nivel de la mucosa, que es el sitio de entrada principal para la mayona de los agentes infecciosos incluyendo el VHB. Por lo tanto, existe una necesidad en la tecnica de obtener una vacuna para la hepatitis B administrada por via oral.

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona procedimientos para preparar formulaciones inmunogenas que incluyen un antfgeno de superficie del virus de la hepatitis B o un fragmento del mismo que presenta la antigenicidad de HBsAg. Todas las vacunas de la hepatitis B conocidas incluyen un HBsAg recombinante. Se debe entender que se puede usar una cualquiera de estas vacunas de hepatitis B autorizada como una fuente de antfgeno en un procedimiento de la presente divulgacion para producir una formulacion inmunogena.

En general, se puede usar cualquier procedimiento para preparar un antfgeno de superficie de hepatitis B. La preparacion del HBsAg esta bien documentada (por ejemplo, vease Harford et al., Develop. Biol. Standard 54: 125, 1983 y Gregg et al., Biotechnology 5:479, 1987, entre otros). En general, se pueden usar procedimientos de tecnologfa de aDn recombinante que implican cultivar celulas modificadas geneticamente, que llevan el gen del antfgeno de superficie de VHB. El antfgeno de superficie expresado se purifica a continuacion y se formula normalmente como una suspension del antfgeno de superficie adsorbido en hidroxido de aluminio (por ejemplo, vease Valenzuela et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1-5, 1983 y McAleer et al., Nature 307:178-180, 1984).

Gripe

La gripe es una enfermedad infecciosa comun del sistema respiratorio asociada con la familia de virus Ortomyxoviridae. Gripe A y B son los dos tipos de virus de la gripe que provocan epidemia humana. Los virus de la gripe A se categorizan ademas en subtipos en base a dos antfgenos de superficie: hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (N). Los virus de la gripo B no se categorizan en subtipos. Se reconoce la vacunacion como la unica forma mas eficaz de evitar o atenuar la gripe para los que tienen un riesgo alto de enfermedad grave por infeccion gripal y complicaciones relacionadas. La inoculacion de antfgeno preparado a partir del virus de la gripe inactivado estimula la produccion de anticuerpos espedficos. En general, se proporciono proteccion solo frente a las cepas de virus a partir de las que se prepara la vacuna o de cepas estrechamente relacionadas.

Las vacunas antigripales, de todos los tipos, normalmente son vacunas trivalentes. En general, contienen antfgenos derivados de dos cepas del virus de la gripe A y una cepa del virus de la gripe B. Las cepas del virus de la gripe que se van a incorporar en las vacunas antigripales cada estacion se determinan por la Organizacion mundial de la salud (OMS) en colaboracion con las administraciones sanitarias nacionales y los fabricantes de vacunas. Se apreciara que se puede usar cualquier cepa del virus de la gripe de acuerdo con la presente divulgacion, y que las cepas del virus de la gripe diferiran de ano en ano en base a las recomendaciones de la OMS.

Tambien se engloban las vacunas monovalentes, que pueden ser utiles, por ejemplo, en una situacion pandemica. Una vacuna de la gripe pandemica monovalente muy probablemente contendra el antfgeno de gripe de una unica cepa A. En algunos modos de realizacion, los antfgenos de la gripe se derivan de cepas de gripe pandemica. Por ejemplo, en algunos modos de realizacion, los antfgenos de la gripe son antfgenos vmcos de la gripe A (H1N1 de origen porcino).

En todo el mundo se usan predominantemente tres tipos de vacunas inactivadas para proteger frente a la gripe: vacunas de virus completos, vacunas de virus fraccionados que contienen componentes externos e internos del virus, y vacunas de subunidades compuestas solo de los componentes externos del virus (hemaglutinina y neuraminidasa). Sin desear quedar limitado por ninguna teona, se cree que la mayor pureza de las vacunas de subunidades debe hacer que sean menos reactogenas y mejor toleradas. A la inversa, se cree que las vacunas de virus completos y virus fraccionados contienen mas epftopos y por tanto son mas inmunogenas.

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En algunos modos de realizacion, los antigenos de la gripe se basan en vacunas de subunidades. En general, las vacunas de subunidades contienen solo las partes del virus de la gripe que se necesitan para una vacunacion eficaz (por ejemplo, que provocan una respuesta inmunitaria protectora). En algunos modos de realizacion, los antigenos de la gripe de subunidades se preparan a partir de partmulas de virus (por ejemplo, purificacion de componentes particulares del virus). En algunos modos de realizacion, los antigenos de la gripe de subunidades se preparan por procedimientos recombinantes (por ejemplo, expresion en cultivo celular). Por ejemplo, la patente de los eE. UU. N.° 5.858.368 describe procedimientos de preparacion de una vacuna antigripal recombinante usando tecnologfa de ADN recombinante. La vacuna antigripal trivalente resultante se basa en una mezcla de antfgenos de hemaglutinina recombinante clonados a partir de virus de la gripe que tienen potencial epidemico. Los antfgenos de hemaglutinina recombinantes son glucoprotemas de longitud completa, no escindidas, producidas a partir de vectores de expresion de baculovirus en celulas de insecto cultivadas y purificadas en condiciones sin desnaturalizacion. En algunos modos de realizacion, los antfgenos de la gripe de subunidades se generan por procedimientos sinteticos (por ejemplo, smtesis peptfdica). Las vacunas de subunidades pueden contener antfgenos de superficie purificados, antfgenos de hemaglutinina y antfgenos de neuraminidasa preparados a partir de cepas seleccionadas determinadas por la OMS. Sin desear comprometerse con ninguna teona, se cree que los antfgenos de superficie, antfgenos de hemaglutinina y antfgenos de neuraminidasa desempenan un papel significativo en provocar la produccion de anticuerpos neutralizantes del virus tras la vacunacion.

En algunos modos de realizacion, los antfgenos de la gripe son antfgenos de virus fraccionados. Las vacunas preparadas usando antfgenos de virus fraccionados contienen tfpicamente una mayor concentracion de las porciones mas inmunogenas del virus (por ejemplo, hemaglutinina y neuraminidasa), mientras que se disminuye la concentracion de las protemas vmcas menos inmunogenas asf como de las protemas no vmcas presentes en huevos (usadas para producir el virus) o de agentes extranos en (por ejemplo, virus de la leucosis aviar, otros microorganismos y residuos celulares). En general, los antfgenos de virus fraccionados se preparan por un procedimiento ffsico que implica romper la partmula vmca, en general con un detergente o disolvente organico (por ejemplo, Triton X-100), y separar o purificar las protemas vmcas en diferentes grados, tal como por centrifugacion en un gradiente de sacarosa o paso de lfquido alantoideo en una columna cromatografica. En algunos modos de realizacion, la rotura y la separacion de partmulas vmcas se sigue por dialisis o ultrafiltracion. Los antfgenos de virus fraccionados normalmente contienen la mayona de o todas las protemas estructurales del virus aunque no necesariamente en las mismas proporciones que se producen en el virus completo. Los procedimientos de fraccionamiento vmco asf como agentes de fraccionamiento adecuados son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, la publicacion de patente de los EE. UU. N.° 20090155309). En algunos modos de realizacion, la concentracion de antfgeno final (por ejemplo, antfgenos de hemaglutinina y/o neuraminidasa) del antfgeno de virus fraccionado se estandariza usando procedimientos conocidos en la tecnica (por ejemplo, ELIsA).

En algunos modos de realizacion, los antfgenos de la gripe son antfgenos de virus completos. Se cree que en individuos no sensibilizados, las vacunas preparadas con antfgenos de virus completos pueden ser mas inmunogenas e inducir una mayor respuesta de anticuerpos protectores a una menor dosis de antfgenos que otras formulaciones (por ejemplo, antfgenos de virus fraccionados o de subunidades). Sin embargo, las vacunas antigripales que incluyen antfgenos de virus completos pueden producir mas efectos secundarios que otras formulaciones.

Los antfgenos vmcos de la gripe presentes en las formulaciones inmunogenas descritas en el presente documento pueden ser infecciosos, inactivados o atenuados.

En determinados modos de realizacion, una formulacion inmunogena puede comprender un antfgeno vmco inactivado. Se apreciara que se puede usar cualquier procedimiento para preparar un antfgeno vmco de la gripe inactivada. El documento WO 09/029695 describe procedimientos ejemplares para producir una vacuna del virus inactivado completo. En general, estos procedimientos implicaran propagar un virus de la gripe en una celula huesped, lisando opcionalmente la celula huesped para liberar el virus, aislar y a continuacion inactivar el antfgeno vmco. Se usa comunmente un tratamiento qrnmico del virus (por ejemplo, formalina, formaldehndo, entre otros) para inactivar el virus para la formulacion de vacuna. Sin embargo, se debe entender que se podnan usar otras tecnicas, por ejemplo, tratamiento con cloro, exposicion a altas temperaturas, etc. En estos tratamientos, la cubierta externa del virion tfpicamente se deja intacta mientras se altera la funcion de replicacion. Las vacunas de virus no replicantes contienen preferentemente mas antfgeno que las vacunas con virus vivos que se pueden replicar en el huesped.

En determinados modos de realizacion, una formulacion inmunogena puede comprender un antfgeno vmco atenuado. Como es bien conocido en la tecnica, una ventaja de una vacuna preparada con un antfgeno vmco atenuado radica en el potencial para la mayor inmunogenicidad lo que resulta de su capacidad para replicarse in vivo sin provocar una infeccion completa. Las vacunas de virus vivos que se preparan a partir de cepas atenuadas preferentemente carecen de patogenicidad pero todavfa se pueden replicar en el huesped. Un procedimiento que se ha usado en la tecnica para preparar antfgenos vmcos de la gripe es la adaptacion vmca que implica pasar en serie una cepa vmca a traves de multiples cultivos celulares. Con el tiempo, la cepa muta y a continuacion se pueden identificar las cepas atenuadas. En determinados modos de realizacion, se puede pasar el virus a traves de diferentes cultivos celulares. En determinados modos de realizacion puede resultar ventajoso realizar una o mas de las etapas de cultivo celular a una temperatura reducida.

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En la actualidad estan autorizadas varias vacunas antigripales (vease la tabla 1). Por ejemplo, Fluzone®, que es una vacuna antigripal inactivada con celulas fraccionadas, se desarrolla y se fabrica por Sanofi Pasteur, Inc. y se puede usar de acuerdo con la presente divulgacion. Fluzone® contiene una suspension esteril preparada a partir de virus de la gripe propagados en huevos de gallina embrionados. Los fluidos que contienen virus se recogen y se inactivan con formaldehfdo. El virus de la gripe se concentra y se purifica en una solucion de gradiente de densidad de sacarosa lineal usando una centrifugadora de flujo continuo. A continuacion, se rompe qmmicamente el virus usando un tensioactivo no ionico, octoxinol-9, (Triton® X-100) produciendo un antfgeno vmco fraccionado. Despues se purifica adicionalmente el virus fraccionado por medios qmmicos y se suspende en solucion isotonica de cloruro de sodio tamponada con fosfato de sodio. A continuacion, se estandariza la vacuna Fluzone® de acuerdo con los requisitos para la temporada gripal y se formula para que contenga 45 |jg de hemaglutinina (HA) por 0,5 ml de dosis, en la proporcion recomendada de 15 jg de HA cada una, representativa de las tres cepas prototipo (por ejemplo, 2007-2008 vacuna preparada con cepas A/Islas Salomon/3/2006 (H1N1), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) y B/Malasia/2506/2004). La vacuna Fluzone® se formula para inyeccion intramuscular.

Otro ejemplo de una vacuna antigripal autorizada que se puede usar de acuerdo con la presente divulgacion es Vaxigrip®, que es una vacuna antigripal inactivada con celulas fraccionadas tambien desarrollada y fabricada por Sanofi Pasteur, Inc. Vaxigrip® se prepara de forma similar al procedimiento indicado anteriormente para Fluzone® y se formula de forma similar para inyeccion intramuscular.

Aun otro ejemplo de una vacuna antigripal autorizada que se puede usar de acuerdo con la presente divulgacion es Flumist®. Flumist® es una vacuna trivalente con virus vivos atenuados para administracion por pulverizacion intranasal. Las cepas del virus de la gripe en Flumist® tienen tres mutaciones geneticas que dan lugar a un crecimiento restringido por temperatura y un fenotipo atenuado. El efecto acumulativo de las propiedades antigenicas y los virus de la gripe modificados geneticamente es que se pueden replicar en la nasofaringe e inducir inmunidad protectora. Para producir Flumist®, se inoculan huevos sin patogeno espedfico (SPF) con cada una de las cepas vmcas apropiadas y se incuban para permitir la replicacion vmca de la vacuna. Se recoge el lfquido alantoideo de estos, se mezcla y a continuacion se aclara por filtracion. Se concentra el virus por ultracentrifugacion y se diluye con tampon de estabilizacion para obtener las concentraciones finales de fosfato de potasio y sacarosa. A continuacion, se filtran de forma esteril los virus recogidos para producir las masas monovalentes. Posteriormente, se mezclan las masas monovalentes de las tres cepas y se diluyen segun se requiera para lograr la potencia deseada con tampones estabilizantes para producir la vacuna trivalente a granel. A continuacion se carga directamente la vacuna a granel en pulverizadores individuales para administracion nasal. Cada pulverizador de Flumist® refrigerado precargado contiene una unica dosis de 0,2 ml. Cada dosis de 0,2 ml contiene 106,5"7,5 FFU de reagrupados de virus de la gripe vivos atenuados de cada una de las tres cepas vmcas apropiadas.

Como se describe anteriormente, en la actualidad estan autorizadas varias vacunas antigripales. Se debe entender que una cualquiera o la combinacion de estas vacunas antigripales autorizadas se puede combinar con una vesfcula como se describe en el presente documento para producir una formulacion inmunogena. Por ejemplo, Fluzone® y/o Vaxigrip® comerciales se pueden combinar de esta manera para producir una formulacion inmunogena activa. En algunos modos de realizacion, en primer lugar se purifican las vacunas antigripales autorizadas (por ejemplo, para retirar coadyuvante de alumbre u otros reactivos en la vacuna). En algunos modos de realizacion, las vacunas antigripales autorizadas no se purifican antes de la formulacion con una vesmula como se describe en el presente documento.

La solicitud de patente PCT N°. PCT/US09/47911 describe algunos otros antfgenos de la gripe ejemplares que se podnan usar en los procedimientos y formulaciones de la presente divulgacion. Los antfgenos de la gripe ejemplares tambien se han descrito en las patentes de los EE. UU. N.° 7.527.800; 7.537.768; 7.514.086; 7.510.719; 7.494.659; 7.468.259; 7.399.840; 7.361.352; 7.316.813; 7.262.045; 7.244.435; 7.192.595; 7.052.701; 6.861.244; 6.743.900; 6.740.325; 6.635.246; 6.605.457; 6.534.065; 6.372.223; 6.344.354; 6.287.570; 6.136.606; 5.962.298; 5.948.410; y 5.919.480.

Otros virus

El virus de la hepatitis C (VHC) se reconoce ahora como la causa principal de hepatitis ni A, ni B (NANB) asociada a transfusion. El VHC es un virus de ARN de sentido positivo monocatenario con similitudes con los flavivirus y pestivirus (Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2057, 1991 y Weiner et al., Virology 180: 842, 1990). Las patentes de los EE. UU. N.° 7.348.011; 6.831.169; 6.538.123 y 6.235.888 describen todas antfgenos de VHC ejemplares que se pueden emplear en una vacuna.

El retrovirus de inmunodeficiencia humana (VIH) es el responsable del sida (smdrome de inmunodeficiencia adquirida), una enfermedad en la que el sistema inmunitario del organismo falla dejandolo vulnerable a infecciones oportunistas. Las patentes de los EE. UU. N.° 7.067.134; 7.063.849; 6.787.351; 6.706.859; 6.692.955; 6.653.130; 6.649.410; 6.541.003; 6.503.753; 6.500.623; 6.383.806; 6.090.392; 5.861.243; 5.817.318; y 4.983.387 describen todas antfgenos de VIH ejemplares que se pueden emplear en una vacuna. Tambien se divulgan diversos antfgenos de VIH en la publicacion de solicitud de patente de los EE. UU. N.° 20090117141 y 20090081254.

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En determinados modos de realizacion, una formulacion inmunogena que se prepara de acuerdo con los procedimientos de la presente divulgacion puede comprender un antigeno que es termolabil. Como se usa en el presente documento, los terminos "antigenos termolabiles" se refieren a un antigeno que pierde la integridad antigenica cuando se expone a determinadas temperaturas elevadas. En algunos modos de realizacion, la exposicion de un antfgeno termolabil a temperaturas elevadas destruye mas de un 20 % de la integridad antigenica del antigeno (por ejemplo, mas de un 30 %, mas de un 40 %, mas de un 50 % o mas) medida en un ensayo de integridad antigenica (por ejemplo, un ELISA) en comparacion con el antfgeno no manipulado. En determinados modos de realizacion, un antfgeno termolabil pierde la integridad antigenica a temperaturas por encima de 30 °C (por ejemplo, por encima de 35 °C, por encima de 40 °C, por encima de 45 °C, o por encima de 50 °C). En algunos modos de realizacion, el almacenamiento de un antfgeno termolabil a una de estas temperaturas elevadas durante mas de 3 minutos (por ejemplo, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos o mas) destruye mas de un 20 % de la integridad antigenica del antfgeno (por ejemplo, mas de un 30 %, mas de un 40 %, mas de un 50 % o mas) medida en un ensayo de integridad antigenica (por ejemplo, un ELISA) en comparacion con el antfgeno no manipulado. Como se analiza anteriormente, los procedimientos de la presente divulgacion son particularmente beneficiosos para los antfgenos termolabiles debido a que pueden utilizar una temperatura menor de solucion de antfgeno, lo que permite una mejor conservacion de la integridad antigenica.

Se debe entender que la presente divulgacion no se limita a los antfgenos y que, en general, los procedimientos se pueden usar para atrapar cualquier sustancia sea antigenica o no antigenica. Por lo tanto, en algunos modos de realizacion, los procedimientos de la presente divulgacion se pueden usar para atrapar uno o mas polipeptidos, polinucleotidos o polisacaridos que pueden ser o no antigenicos. Las clases espedficas de sustancias incluyen, pero no se limitan a, coadyuvantes, enzimas, receptores, neurotransmisores, hormonas, citocinas, modificadores de la respuesta celular tales como factores de crecimiento y factores quimiotacticos, anticuerpos, haptenos, toxinas, interferones, ribozimas, agentes antisentido, plasmidos, ADN y ARN. En algunos modos de realizacion, el polipeptido puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo humanizado. En algunos modos de realizacion, estas sustancias son termolabiles ya que se convierten en degradantes en las condiciones al que se hace referencia anteriormente en el contexto de los antfgenos.

Coadyuvantes

En determinados modos de realizacion, los procedimientos de la presente divulgacion pueden incluir ademas una etapa de anadir uno o mas coadyuvantes a una formulacion de vesfcula. Como es bien conocido en la tecnica, los coadyuvantes son agentes que potencian las respuestas inmunitarias. Los coadyuvantes son bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, vease "Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach", Pharmaceutical Biotechnology, Volumen 6, Eds. Powell and Newman, Plenum Press, New York and London, 1995). En algunos modos de realizacion, se puede anadir un coadyuvante una vez que se ha preparado la formulacion de vesfcula (con antfgeno atrapado). En algunos modos de realizacion, se puede anadir un coadyuvante durante el procedimiento de preparacion de las formulaciones de vesfcula (por ejemplo, junto con lfpidos formadores de vesfculas u otros componentes de vesfcula, junto con el antfgeno o con una etapa dedicada).

En determinados modos de realizacion, se anade un coadyuvante antes de que se anada el antfgeno. En algunos modos de realizacion, el coadyuvante se funde conjuntamente con lfpidos formadores de vesfculas. En algunos modos de realizacion, un coadyuvante de TLR-4 (descrito a continuacion) se funde conjuntamente con lfpidos formadores de vesfculas. En determinados modos de realizacion, se anade un coadyuvante despues de que se anada un antfgeno. En algunos modos de realizacion, se anade el coadyuvante junto con un lioprotector despues de que se anada un antfgeno. En algunos modos de realizacion, se anade un coadyuvante de TLR-3 (descrito a continuacion) junto con un lioprotector despues de que se anada un antfgeno. En algunos modos de realizacion, el lioprotector es sacarosa.

Los coadyuvantes ejemplares incluyen coadyuvante completo de Freund (CFA), coadyuvante incompleto de Freund (IFA), escualeno, escualano y alumbre (hidroxido de aluminio), que son materiales bien conocidos en la tecnica, y estan comercialmente disponibles de varias fuentes. En determinados modos de realizacion, se pueden usar sales de aluminio o calcio (por ejemplo, sales de fosfato o hidroxido) como coadyuvantes. Se ha usado alumbre (hidroxido de aluminio) en muchas vacunas existentes. Tfpicamente, se incluye de aproximadamente 40 a aproximadamente 700 |jg de aluminio por dosis cuando se administra i.m. Por ejemplo, Havrix® incluye 500 jg de aluminio por dosis.

En varios modos de realizacion, tambien se pueden usar emulsiones de aceite en agua o emulsiones de agua en aceite como coadyuvantes. Por ejemplo, la fase de aceite puede incluir escualeno o escualano y un tensioactivo. En varios modos de realizacion, se pueden usar tensioactivos no ionicos tales como los mono- y di-esteres de acidos grasos C12-C24 de sorbitano y manida. Preferentemente, la fase de aceite comprende de aproximadamente un 0,2 a aproximadamente un 15 % en peso de la formulacion inmunogena (por ejemplo, de aproximadamente un 0,2 a un 1 %). La publicacion PCT N.° WO 95/17210 describe emulsiones ejemplares.

El coadyuvante denominado QS21 es una fraccion de saponina inmunologicamente activa que tiene actividad coadyuvante derivada de la corteza del arbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina, y los procedimientos de su produccion se divulgan en la patente de los EE. UU. N.° 5.057.540. Los derivados sinteticos y semisinteticos de las saponinas de Quillaja saponaria Molina tambien son utiles, tales como las descritas en las patentes de los EE. UU. N.° 5.977.081 y 6.080.725.

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Los TLR son una familia de protemas homologas al receptor Toll de Drosophila, que reconocen patrones moleculares asociados a patogenos y, por tanto, ayudan al cuerpo a distinguir entre moleculas propias y no propias. Las sustancias comunes en patogenos vmcos se reconocen por los TLR como patrones moleculares asociados a patogenos. Por ejemplo, TLR-3 reconoce patrones en el ARN bicatenario, TLR-4 reconoce patrones en los lipopolisacaridos mientras que TLR-7/8 reconocen patrones que contienen adenosina en ARN y ADN vmcos y bacterianos. Cuando se desencadena un TLR por dicho reconocimiento de patron, se produce una serie de acontecimientos de senalizacion que da lugar a la inflamacion y la activacion de respuestas inmunitarias innata y adaptativa. Varios ligandos sinteticos que contienen los patrones moleculares reconocidos por varios TLR se estan desarrollando como coadyuvantes y se pueden incluir en una formulacion inmunogena como se describe en el presente documento.

Por ejemplo, poli(acido riboinosmico:ribocitidflico) o poli(I:C) (disponible de InvivoGen de San Diego, CA) es un analogo sintetico de ARN bicatenario (un patron molecular asociado a infeccion vmca) y un coadyuvante ejemplar que es un agonista para TLR-3 (por ejemplo, vease Field et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58:1004 (1967) y Levy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62:357 (1969)). En algunos modos de realizacion, se puede combinar poli(I: C) con otros agentes para mejorar la estabilidad (por ejemplo, reduciendo la degradacion por medio de la actividad de las ARNasas). Por ejemplo, la patente de los Ee. UU. N.° 3.952.097; 4.024.241 y 4.349.538 describen complejos de poli(I:C) con poli-L-lisina. Tambien se ha demostrado que la adicion de poli-arginina a poli(I:C) reduce la degradacion por medio de la actividad de las ARNasas. Poli (IC:LC) es un poli(I:C) bicatenario sintetico estabilizado con poli-L-lisina-carboximetilcelulosa. La publicacion de patente de los EE. UU. N.° 20090041809 describe acidos nucleicos bicatenarios con uno o mas de un nucleosido de acido nucleico bloqueado (ANB) que puede actuar como agonistas de TLR-3. Los expertos en la tecnica podran identificar otros coadyuvantes de agonistas de TLR-3 adecuados.

Los derivados de lfpidos A atenuados (DLA) tales como monofosforil lfpido A (MPL) y 3-desacil monofosforil lfpido A (3D-MPL) son coadyuvantes ejemplares que son agonistas para TLR-4. Los DLA son moleculas similares al lfpido A que se han alterado o construido de modo que la molecula presente efectos adversos menores o diferentes de los del lfpido A. Estos efectos adversos incluyen pirogenicidad, toxicidad y reactividad local de Schwarzman como se evaluo en el ensayo de dosis letal al 50 % en embrion de pollo (CELD50). MPL y 3D-MPL se describen en las patentes de los EE. UU. N.° 4.436.727 y 4.912.094, respectivamente. El MPL se derivo originalmente del lfpido A, un componente de los lipopolisacaridos enterobacterianos (LPS), un modulador del sistema inmunitario potente pero muy toxico. El 3D-MPL difiere del MPL en que el residuo acilo que esta unido con ester a la glucosamina terminal reductora en la posicion 3 se ha retirado selectivamente. Se apreciara que MPL y 3D-MPL pueden incluir una mezcla de varios patrones de sustitucion de acidos grasos, es decir, heptaacilo, hexaacilo, pentaacilo, etc., con longitud de la cadena de acidos grasos variables. Por tanto, se engloban varias formas de MPL y 3D-MPL, incluyendo mezclas de los mismos, por la presente divulgacion.

En algunos modos de realizacion, estos DLA se pueden combinar con dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), por ejemplo, en una emulsion de escualeno/Tween™ 80 al 2 % (por ejemplo, vease la patente GB N.° 2122204). MPl esta disponible de Avanti Polar Lipids, Inc. de Alabaster, aL como PhAD (disacarido de hexaacilo fosforilado). Los expertos en la tecnica podran identificar otros coadyuvantes de agonistas de TLR-4 adecuados. Por ejemplo, se han descrito otros lipopolisacaridos en la publicacion pCt N.° WO 98/01139; la patente de los EE. UU. N.° 6.005.099 y la patente EP N.° 729473.

II. Formulaciones de vesicula

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona formulaciones de vesmula que contienen antfgeno preparadas usando estos procedimientos. En algunos modos de realizacion, las formulaciones de vesmula que contienen antfgeno presentan niveles de atrapamiento de antfgeno que son mayores que los obtenibles usando los procedimientos de la tecnica anterior. En algunos modos de realizacion, las formulaciones de vesmula que contienen antfgeno presentan niveles de actividad de antfgeno (es decir, antigenicidad y/o inmunogenicidad) que son mayores que los obtenibles usando los procedimientos de la tecnica anterior.

Las formulaciones de vesmula inmunogenas son utiles para tratar muchas enfermedades en seres humanos incluyendo adultos y ninos. En general, sin embargo, se pueden usar con cualquier animal. En determinados modos de realizacion, los procedimientos en el presente documento se pueden usar para aplicaciones veterinarias, por ejemplo, aplicaciones caninas y felinas. Si se desea, los procedimientos en el presente documento tambien se pueden usar con animales de granja, tales como razas ovina, aviar, bovina, porcina y equina.

En general, las formulaciones de vesmula inmunogenas descritas en el presente documento se administraran en dichas cantidades y durante un tiempo tal que sea necesario o suficiente para inducir una respuesta inmunitaria. Los regfmenes de dosificacion pueden consistir en una unica dosis o una pluralidad de dosis durante un periodo de tiempo. La cantidad exacta de antfgeno que se va a administrar puede variar de un paciente a otro y puede depender de varios factores. Por tanto, se apreciara que, en general, la dosis precisa usada sera la determinada por el medico prescriptor y dependera no solo del peso del paciente y la via de administracion, sino tambien de la frecuencia de dosificacion, la edad del paciente y la gravedad de los smtomas y/o el riesgo de infeccion. En determinados modos de realizacion, la dosis de antfgeno en una formulacion inmunogena puede variar de aproximadamente 5 |jg a aproximadamente 5 mg, por ejemplo, de aproximadamente 100 jg a aproximadamente 750 jg. Dosis menores de antfgeno pueden ser

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suficientes cuando se usa administracion sublingual u oral, o en presencia de coadyuvante. Dosis mayores pueden ser mas utiles cuando se administran por via oral, en especial en ausencia de coadyuvantes.

En general, las formulaciones se pueden administrar a un paciente por cualquier via. En particular, los resultados en los ejemplos demuestran que las formulaciones inmunogenas descritas en el presente documento pueden inducir una respuesta protectora incluso cuando se administra por via oral. Se apreciara que la via oral es particularmente deseable en vista de las ventajas de la administracion oral sobre cualquier forma de inyeccion (es decir, cumplimiento, distribucion de masa, etc.). Tambien se apreciara que los resultados son inesperados en vista del hecho de que la mayona de las vacunas (incluyendo todas las vacunas de la hepatitis A conocidas) hasta el momento se han administrado por via parenteral.

Por tanto, en determinados modos de realizacion, las formulaciones inmunogenas se pueden administrar por via oral (incluyendo por via oral, via sublingual y por lavado gastrico u otros medios de alimentacion artificial). Dicha administracion oral se puede lograr usando formulaciones solidas o lfquidas, por ejemplo, en forma de comprimidos, capsulas, multipartfculas, geles, pelfculas, ovulos, elixires, soluciones, suspensiones, etc. En determinados modos de realizacion, cuando se usa una formulacion lfquida, la formulacion se puede administrar conjuntamente con una formulacion basica (por ejemplo, una solucion de bicarbonato) para neutralizar el pH del estomago. En determinados modos de realizacion, la formulacion basica se puede administrar antes y/o despues de la formulacion inmunogena. En determinados modos de realizacion, la formulacion basica se puede combinar con la formulacion inmunogena antes de su administracion o tomarse al mismo tiempo que la formulacion inmunogena.

Aunque la administracion oral es de especial interes, se apreciara que, en determinados modos de realizacion, una formulacion inmunogena tambien se puede formular para la administracion por via parenteral, por ejemplo, por inyeccion. En dichos modos de realizacion, la administracion puede ser, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intradermica o subcutanea, o por medio de tecnicas de infusion o inyeccion sin aguja. Por dicha administracion parenteral, las formulaciones inmunogenas se pueden preparar y mantener en formulaciones liofilizadas convencionales y reconstituirse antes de su administracion con una solucion salina farmaceuticamente aceptable, tal como una solucion salina al 0,9 %. El pH de la formulacion inyectable se puede ajustar, como es conocido en la tecnica, con un acido farmaceuticamente aceptable, tal como acido metanosulfonico. Otros vehfculos y disolventes aceptables que se pueden emplear incluyen la solucion Ringer y USP. Ademas, convencionalmente se emplean aceites fijos esteriles como disolvente o medio de suspension. Para este proposito se puede emplear cualquier aceite fijo suave incluyendo mono o digliceridos sinteticos. Ademas, se usan acidos grasos tales como acido oleico en la preparacion de sustancias inyectables. Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, por filtracion a traves de un filtro de retencion bacteriana, o incorporando agentes esterilizantes en forma de formulaciones solidas esteriles que se pueden disolver o dispersar en agua esteril u otro medio inyectable esteril antes de su uso.

Las formulaciones inmunogenas tambien se pueden administrar por via intranasal o por inhalacion y se administran convenientemente en forma de una presentacion de pulverizacion en aerosol o inhalador de polvo seco desde un recipiente presurizado, bomba, pulverizador, atomizador o nebulizador, con o sin el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, un hidrofluoroalcano, dioxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificacion se puede determinar proporcionando una valvula para administrar una cantidad dosificada. El recipiente presurizado, bomba, pulverizador, atomizador o nebulizador puede contener una solucion o suspension del anticuerpo, por ejemplo, usando una mezcla de etanol y el propulsor como disolvente, que puede contener adicionalmente un lubricante, por ejemplo, trioleato de sorbitano. Las capsulas y cartuchos (fabricados, por ejemplo, a partir de gelatina) para su uso en un inhalador o insuflador se pueden formular para contener una mezcla en polvo de la formulacion inmunogena y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidon.

Las formulaciones para administracion rectal son preferentemente supositorios que se pueden preparar mezclando la formulacion inmunogena con excipientes o vehfculos no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera de supositorio que sean solidos a temperatura ambiente pero lfquidos a temperatura corporal y, por lo tanto, se funden en la boveda rectal y liberan los anticuerpos. Tambien se pueden usar enemas de retencion y cateteres rectales como es conocido en la tecnica. Los vehfculos potenciadores de la viscosidad tales como hidroxipropilcelulosa tambien son determinados vehnculos de la divulgacion para administracion rectal ya que facilitan la retencion de la formulacion en el recto. En general, el volumen del vehfculo que se anade a la formulacion se selecciona para aumentar al maximo la retencion de la formulacion. En particular, el volumen no debe ser tan grande como para poner en peligro la retencion de la formulacion administrada en boveda rectal.

Formulaciones ejemplares

En algunos modos de realizacion, la presente divulgacion proporciona formulaciones inmunogenas que incluyen un antfgeno, un coadyuvante de agonista de TLR-3 y una vesfcula que comprende un tensioactivo no ionico y un potenciador del transporte que facilita el transporte de moleculas similares a lfpidos a traves de las membranas mucosas. En algunos modos de realizacion, estas formulaciones se pueden administrar por via oral. En algunos modos de realizacion, el coadyuvante de agonista de TLR-3 comprende poli(I:C). En algunos modos de realizacion, el coadyuvante de agonista de TLR-3 comprende poli(IC:LC). En algunos modos de realizacion, el potenciador del transporte es un acido biliar, un derivado del mismo o una sal de cualquiera de estos (por ejemplo, desoxicolato de

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sodio). En algunos modos de realizacion, el tensioactivo no ionico es un ester de glicerol (por ejemplo, 1-monopalmitoilglicerol). En algunos modos de realizacion, la vesfcula comprende ademas un anfifilo ionico (por ejemplo, dicetilfosfato). En algunos modos de realizacion, la vesfcula comprende ademas un esteroide (por ejemplo, colesterol). En algunos modos de realizacion, las vesfculas comprenden 1-monopalmitoilglicerol, dicetilfosfato, colesterol y desoxicolato de sodio.

En algunos modos de realizacion, la presente divulgacion proporciona formulaciones inmunogenas que incluyen un anffgeno, un coadyuvante de agonista de TLR-3 y una vesfcula que comprende un tensioactivo no ionico. En algunos modos de realizacion, estas formulaciones se pueden administrar por via parenteral (por ejemplo, por inyeccion intramuscular). En algunos modos de realizacion, el coadyuvante de agonista de TLR-3 comprende poli(I:C). En algunos modos de realizacion, el coadyuvante de agonista de TLR-3 comprende poli(IC:LC). En algunos modos de realizacion, el tensioactivo no ionico es un ester de glicerol (por ejemplo, 1-monopalmitoilglicerol). En algunos modos de realizacion, la vesfcula comprende ademas un anfifilo ionico (por ejemplo, dicetilfosfato). En algunos modos de realizacion, la vesfcula comprende ademas un esteroide (por ejemplo, colesterol). En algunos modos de realizacion, las vesfculas comprenden 1-monopalmitoilglicerol, dicetilfosfato y colesterol. En algunos modos de realizacion, la vesfcula puede carecer de un molecula potenciadora del transporte. En algunos modos de realizacion, la vesfcula puede carecer de un "acido biliar" tal como acido colico y acido quenodesoxicolico, sus productos de conjugacion con glicina o taurina tales como acido glicocolico y taurocolico, derivados que incluyen acido desoxicolico y ursodesoxicolico, y sales de cada uno de estos acidos. En algunos modos de realizacion, la vesfcula puede carecer de aminoacidos aciloxilados, tales como acilcarnitinas y sales de los mismos, y palmitoilcarnitinas.

En algunos modos de realizacion, la presente divulgacion proporciona formulaciones inmunogenas que incluyen un anffgeno, un coadyuvante de agonista de TLR-4 y una vesfcula que comprende un tensioactivo no ionico y un potenciador del transporte que facilita el transporte de moleculas similares a ffpidos a traves de las membranas mucosas. En algunos modos de realizacion, estas formulaciones se pueden administrar por via oral. En algunos modos de realizacion, el coadyuvante de agonista de TLR-4 comprende monofosforil ffpido A o 3-desacil monofosforil ffpido A. En algunos modos de realizacion, el potenciador del transporte es un acido biliar, un derivado del mismo o una sal de cualquiera de estos (por ejemplo, desoxicolato de sodio). En algunos modos de realizacion, el tensioactivo no ionico es un ester de glicerol (por ejemplo, 1-monopalmitoilglicerol). En algunos modos de realizacion, la vesfcula comprende ademas un anfifilo ionico (por ejemplo, dicetilfosfato). En algunos modos de realizacion, la vesfcula comprende ademas un esteroide (por ejemplo, colesterol). En algunos modos de realizacion, las vesfculas comprenden 1-monopalmitoilglicerol, dicetilfosfato, colesterol y desoxicolato de sodio.

En algunos modos de realizacion, la presente divulgacion proporciona formulaciones inmunogenas que incluyen un anffgeno, un coadyuvante de agonista de TLR-4 y una vesfcula que comprende un tensioactivo no ionico. En algunos modos de realizacion, estas formulaciones se pueden administrar por via parenteral (por ejemplo, por inyeccion intramuscular). En algunos modos de realizacion, el coadyuvante de agonista de TLR-4 comprende monofosforil ffpido A o 3-desacil monofosforil ffpido A. En algunos modos de realizacion, el tensioactivo no ionico es un ester de glicerol (por ejemplo, 1-monopalmitoilglicerol). En algunos modos de realizacion, la vesfcula comprende ademas un anfifilo ionico (por ejemplo, dicetilfosfato). En algunos modos de realizacion, la vesfcula comprende ademas un esteroide (por ejemplo, colesterol). En algunos modos de realizacion, las vesfculas comprenden 1-monopalmitoilglicerol, dicetilfosfato y colesterol. En algunos modos de realizacion, la vesfcula puede carecer de un molecula potenciadora del transporte. En algunos modos de realizacion, la vesfcula puede carecer de un "acido biliar" tal como acido colico y acido quenodesoxicolico, sus productos de conjugacion con glicina o taurina tales como acido glicocolico y taurocolico, derivados que incluyen acido desoxicolico y ursodesoxicolico, y sales de cada uno de estos acidos. En algunos modos de realizacion, la vesfcula puede carecer de aminoacidos aciloxilados, tales como acilcarnitinas y sales de los mismos, y palmitoilcarnitinas.

En determinados modos de realizacion, las formulaciones de la presente divulgacion comprenden vesfculas que presentan una estructura laminar (por ejemplo, una estructura bicapa). En algunos modos de realizacion, las formulaciones de la presente divulgacion son sustancialmente carentes de estructuras no laminares (por ejemplo, micelas).

Se apreciara que las caractensticas ffsicas (por ejemplo, estructura laminar) de las vesfculas presentes en las formulaciones descritas en el presente documento se pueden medir por cualquier procedimiento conocido. Por ejemplo, en algunos modos de realizacion, las caractensticas ffsicas de las vesfculas se pueden medir por RMN de 31P a 25 °C. En algunos modos de realizacion, un pico anisotropo con un maximo de campo alto alrededor de -2,5 ppm con una anisotropfa de desplazamiento qmmico de aproximadamente 15 a 20 ppm es indicativo de la presencia de una estructura laminar. En algunos modos de realizacion, un pico isotropo observado en los espectros de RMN de 31P centrado alrededor de 2,5 ppm es indicativo de la presencia de estructuras no laminares. En algunos modos de realizacion, los espectros de RMN de 31P de una formulacion de la presente divulgacion carece sustancialmente de un pico isotropo alrededor de 2,5 ppm. En algunos modos de realizacion, si esta presente un pico isotropo alrededor de 2,5 ppm entonces tiene una intensidad (altura de pico) que es menor que la intensidad (altura de pico) de un pico anisotropo con una anisotropfa de desplazamiento qmmico de aproximadamente 15 a 20 ppm y un maximo de campo alto alrededor de -2,5 ppm. En algunos modos de realizacion, si esta presente un pico isotropo alrededor de 2,5 ppm entonces tiene una intensidad (altura de pico) que es menor de un 50 % de la intensidad (altura de pico) de un pico anisotropo con una anisotropfa de desplazamiento qmmico de aproximadamente 15 a 20 ppm y un maximo de campo

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alto alrededor de -2,5 ppm (por ejemplo, menor de un 40 %, menor de un 30 %, menor de un 20 %, menor de un 10 %, menor de un 5 %, menor del 2 % o menor de un 1 %).

En algunos modos de realizacion, la presente divulgacion proporciona una cualquiera de las formulaciones mencionadas anteriormente en forma liofilizada.

III. Kits

Aun en otro aspecto, la presente divulgacion proporciona kits que incluyen un producto lipfdico liofilizado en un primer recipiente y una solucion acuosa que comprende un antigeno (y opcionalmente un coadyuvante) en un segundo recipiente. En algunos modos de realizacion, el kit tambien incluye instrucciones para mezclar el contenido de los dos recipientes para producir formulaciones de vesfcula que contienen antigeno.

Como se analiza anteriormente, el producto lipfdico liofilizado es uno que se preparo previamente fundiendo lfpidos formadores de vesfculas para producir una mezcla lipfdica fundida y a continuacion liofilizando la mezcla lipfdica fundida para producir el producto lipfdico liofilizado.

Aun en otro aspecto, la presente divulgacion proporciona kits que incluyen cualquier formulacion de vesfcula que contiene antigeno liofilizada de la presente divulgacion en un primer recipiente y una solucion acuosa (que contiene opcionalmente un coadyuvante) en un segundo recipiente. En algunos modos de realizacion, el kit tambien incluye instrucciones para mezclar el contenido de los dos recipientes para rehidratar la formulacion de vesfcula que contiene antigeno.

En algunos modos de realizacion, el kit puede incluir componentes adicionales tales como una jeringuilla para inyectar la formulacion de vesfcula que contiene antfgeno en un paciente.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos describen algunos de modos ejemplares de fabricar y poner en practica determinadas formulaciones que se describen en el presente documento. Se debe entender que estos ejemplos solo son con fines ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de las formulaciones y procedimientos descritos en el presente documento.

Ejemplo 1: Procedimiento de fundido en tres etapas para preparar vesiculas

Este ejemplo describe un procedimiento de fundido en tres etapas que se uso para preparar algunas de las vesfculas que se describen en los ejemplos posteriores.

En la etapa 1, se dispuso una proporcion molar a 5:4:1 de los siguientes lfpidos: 1-monopalmitoilglicerol (MPG, 270 mg), colesterol (CHO, 255 mg) y fosfato de dicetilo (DCP, 90 mg) en un vaso de precipitados de vidrio de fondo plano de 50 ml, asegurandose de que no se adhiere nada de polvo en la pared del vaso de precipitados de vidrio. A continuacion, se fundio la mezcla lipfdica en un bano de aceite calentado a 120 °C durante 10 minutos, con agitacion ocasional en el vaso de precipitados de vidrio cubierto con lamina de aluminio.

Mientras que se mantema la temperatura de la mezcla lipfdica fundida a 120 °C, se creo una emulsion en la etapa 2 anadiendo 10,9 ml de tampon bicarbonato 25 mM, pH 7,6 (precalentado a 50 °C). Se homogeneizo de inmediato la emulsion durante 2 minutos a 50 °C (homogeneizacion a 8000 rpm en bano de agua a 50 °C). Mientras aun se esta homogeneizando, se anaden 1,1 ml de una solucion de desoxicolato de sodio 100 mM (una "sal biliar") en tampon bicarbonato 25 mM, pH 9,7 (precalentado a 50 °C) y se continuo la homogeneizacion durante 8 minutos a 50 °C.

En la etapa 3, se anadio el antfgeno (por ejemplo, antfgeno de VHA o antfgeno de superficie de VHB) en una solucion de PBS de aproximadamente pH 7,2 a la mezcla lipfdica fundida calentada que contema la sal biliar.

En una variacion de este procedimiento en 3 etapas, se enfrio la mezcla lipfdica fundida preparada con sal biliar en la etapa 2 hasta 30 °C, se incubo en una incubadora/agitador (220 rpm) durante 2 horas, se congelo a -80 °C, se liofilizo y a continuacion se reconstituyo con la solucion de antfgeno en tampon fosfato 100 mM pH 8,5 antes de su uso.

Ejemplo 2: Procedimiento de fundido en dos etapas invertido para preparar vesiculas

Este ejemplo describe un procedimiento de fundido en dos etapas invertido que se uso para preparar algunas de las vesfculas que se describen en los ejemplos posteriores.

En la etapa 1, se uso la misma proporcion molar 5:4:1 de lfpidos (MPG:CHO:DCP); sin embargo, en este procedimiento, tambien se incluyo una proporcion molar 0,1-0,5 de acido desoxicolico (un "acido biliar") y se fundio conjuntamente con los lfpidos en un bano de aceite calentado a 135 °C durante 10 minutos. En el procedimiento del ejemplo 1, solo se anadio una solucion acuosa de sal biliar en la etapa 2 despues de convertir los lfpidos fundidos en una emulsion.

En esta fase, se preincubo una solucion madre de antigeno (por ejemplo, 4 ml de 25 |jg/ml de solucion de antigeno de VHA diluida con 6 ml de tampon PBS, pH 7,11 o 1,25 ml de 1,0 mg/ml de solucion de antigeno de superficie de VHB diluida con 8,75 ml de tampon PBS, pH 7,2) durante 5 minutos en un bano de agua caliente (25 °C a 50 °C). En la etapa 2, se homogeneizo la solucion madre de antigeno resultante (a 8.000 rpm), se anadio la mezcla lipfdica fundida 5 y se continuo la homogeneizacion durante otros 10 minutos. Se agito el homogeneizado resultante durante 2 horas a 220 rpm y 30 °C. Se anadieron 10 ml de una solucion de sacarosa 400 mM en tampon PBS al homogeneizado agitado y se mezclo en vortex adicionalmente el homogeneizado durante 30 segundos. Se congelo esta mezcla a -80 °C, se liofilizo y a continuacion se reconstituyo en tampon fosfato 100 mM pH 8,5 antes de su uso.

En una variacion de este procedimiento en 2 etapas, se enfrio la solucion de acido biliar / lfpido fundido conjuntamente 10 preparada en la etapa 1 hasta 30 °C, se incubo en una incubadora/agitador (220 rpm) durante 2 horas, se congelo a -80 °C, se liofilizo y a continuacion se reconstituyo con la solucion de antigeno en tampon fosfato 100 mM pH 8,5 antes de su uso.

Ejemplo 3: Analisis de la integridad del antigeno de la hepatitis B

Se homogeneizaron las soluciones de antigeno de superficie de VHB a 8.000 rpm a temperaturas de 4 °C, 25 °C y 15 50 °C. La tabla 2 a continuacion compara el porcentaje de antigeno resultante medido por ELISA con relacion al

antigeno no manipulado medido directamente por ELISA. Como se muestra, la exposicion de HBsAg a los 50 °C implicados en el procedimiento de fundido en 3 etapas del ejemplo 1 destruyo mas de un 50 % de la integridad antigenica del antigeno. El uso del procedimiento de fundido en 2 etapas invertido de la presente divulgacion permite que la temperatura del tampon que contiene antigeno se reduzca sustancialmente (por ejemplo, a 25 °C). El 20 procedimiento de fundido en 2 etapas invertido, debido a que puede utilizar una temperatura menor de solucion de antigeno, permite una mejor conservacion de la antigenicidad de la subunidad de protema.

Tabla 2

Antigeno

Temperatura de solucion de antigeno

4 °C

25 °C 50 °C

HBsAg

67 % 71 % 38 %

Ejemplo 4: Analisis del atrapamiento del antigeno de la hepatitis B

25 Este ejemplo describe experimentos que se realizaron para medir los niveles de atrapamiento de antigeno de superficie de la hepatitis B. Se midieron los niveles de atrapamiento usando un ensayo de ninhidrina. El ensayo de ninhidrina es un procedimiento colorimetrico para determinar la concentracion de un polipeptido en una muestra. Las sustancias que contienen grupos amino reaccionan con el reactivo de ninhidrina para proporcionar un complejo de color azul purpura.

30 Se atrapo el antigeno de superficie de la hepatitis B en vesfculas usando los procedimientos del ejemplo 1 y 2. Se sometieron a prueba dos proporciones diferentes de acido biliar (0,10 y 0,50) usando el procedimiento del ejemplo 2. Se hidrolizaron los antigenos de superficie de la hepatitis B atrapados de las vesfculas, se neutralizaron, se mezclaron con el reactivo de ninhidrina y a continuacion se incubaron a 110 °C. A continuacion, se dejo que se enfriara la solucion y se midio la absorbancia a 595 nm. Existe una relacion lineal entre la absorbancia a esta longitud de onda y la

35 cantidad de polipeptido presente en la muestra original. La tabla 3 muestra que se lograron niveles altos de atrapamiento de antigeno (en este caso antigeno de superficie de VHB) usando el procedimiento de 2 etapas invertido del ejemplo 2. La tabla 3 tambien sugiere que la eficacia de atrapamiento se puede ver afectada por el contenido en acido biliar.

Tabla 3

Antigeno

Procedimiento de preparacion de vesiculas

Fundido en 3 etapas Fundido en 2 etapas invertido

Sal / acido biliar

Proporcion 0,17 de sal biliar Proporcion 0,50 de acido biliar Proporcion 0,10 de acido biliar

HBsAg

42 % 56 % 40 %

Ejemplo 5: Caracterizacion fisicoquimica de la estabilidad de vesfcula despues de la rehidratacion

Este ejemplo describe experimentos que se realizaron para medir la estabilidad de vesfcula usando dispersion de luz dinamica. Se determino el tamano de particula y la distribucion de tamano usando un Malvern Zetasizer Instrument

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Nano ZS (ZEN3600) usando lecturas por triplicado y un tiempo de equilibrio de 2 minutes. Se anadieron 20 ml de muestra de vesteula a 980 ml de tampon bicarbonato pH 7,6, se agito en vortex, y despues se anadio a una cubeta de poliestireno (Sarstedt 67,754). Se realizo el analisis estadfstico usando Minitab vl4 con una prueba de la t de 2 muestras en el nivel de confianza del 95 %. Los resultados obtenidos del analisis de tamano nanometrico se muestran en la figura 1. Se midieron vesteulas preparadas como se describe en los ejemplos 1 y 2 usando un Mastersizer inmediatamente despues de la rehidratacion en presencia de tampon que contema 2 |jg de antigeno de VHA y a 2, 4 y 6 horas despues de la rehidratacion. Como se muestra en la figura 1, las vesteulas preparadas por el procedimiento de fundido en 2 etapas invertido del ejemplo 2 eran mas estables (evaluadas por estabilidad de tamano) con el tiempo que las vesteulas preparadas por el procedimiento de fundido en 3 etapas del ejemplo 1. La estabilidad de vesteula despues de la hidratacion es un factor potencialmente importante para las formulaciones de vesteula que se administraran a un paciente.

Ejemplo 6: Respuesta de anticuerpos al antigeno de la hepatitis A en la inmunizacion de ratones

Este ejemplo describe las pruebas in vivo de determinadas formulaciones inmunogenas en ratones. Se prepararon vesteulas como se describe en los ejemplos 1 y 2 y a continuacion se rehidrataron en presencia de tampon que contema 2 jg de antigeno de VHA. Se vacunaron ratones BALB/c hembra (n = 4) tres veces por sonda oral con estas vesteulas que conteman antigeno los dfas 0, 14 y 28 (equivalente a 2 jg antigeno VHA/dosis).

Posteriormente se recogieron muestras de suero para evaluar los valores de IgG espedfica de la hepatitis A inducidos por vacunacion oral. Se sometieron a prueba las muestras de suero recogidas 14 dfas despues de la ultima inmunizacion por ELISA frente a antigeno de VHA inactivado. Como se muestra en la figura 2, la vacunacion por via oral de ratones con las vesteulas preparadas por el procedimiento de fundido en 2 etapas invertido del ejemplo 2 indujo respuestas de IgG sistemicas (suero) significativamente mas altas frente al antigeno de la hepatitis A que las vesteulas preparadas por el procedimiento de fundido en 3 etapas del ejemplo 1. Cada sfmbolo representa el valor de punto final de suero de un animal individual. Estos datos demuestran que la hidratacion de vesteulas vadas preparadas usando el procedimiento de fundido en 2 etapas invertido con antigeno de VHA da como resultado una mejor inmunogenicidad en comparacion con la hidratacion de vesteulas preparadas usando el procedimiento de fundido en 3 etapas.

Varios investigadores han demostrado que las vacunas de la hepatitis A y las vacunas de la hepatitis B autorizadas actualmente administradas por inyeccion intramuscular (i.m.) inducen anticuerpos IgG neutralizantes. Se ha descubierto que las formulaciones inmunogenas de la hepatitis A administradas por via oral pueden inducir anticuerpos IgG de forma sistemica (muestras de suero) y anticuerpos IgA por via mucosa (muestras de lavado nasal). Puesto que la infeccion por hepatitis A y hepatitis B se produce por medio de superficies mucosas, un respuesta de IgA (el rasgo caracteristico de una respuesta inmunitaria mucosa) puede ser mas eficaz que una respuesta de IgG sistemica. Solo se podrian esperar respuestas de IgG sistemica si las formulaciones de hepatitis A o hepatitis B inmunogenas se fueran a administrar por vfas parenterales estandar (por ejemplo, por inyeccion i.m.).

Ejemplo 7: El contenido en sal biliar de las vesteulas afecta a la maduracion de celulas dendriticas inmaduras

Ahora se acepta que, en general, las celulas dendriticas (CD) son importantes celulas presentadoras de antigeno que desempenan un papel para establecer si un antigeno (por ejemplo, antigeno de VHA) induce tolerancia o una respuesta inmunitaria protectora en el intestino (Alpan et al., J. Immunol. 166 (8): 4843-4852, 2001). La activacion de las CD, habitualmente por estimulos inflamatorios, promueve la expresion de moleculas de coestimuladoras y la presentacion de antigenos de una manera que permite la sensibilizacion productiva de linfocitos T.

En resumen, se aislaron progenitores de CD derivadas de medula osea de ratones BALB/c indiferenciados y se cultivaron en presencia de interleucina 4 (IL-4) y factor estimulador de colonias de granulocitos-macrofagos (GM-CSF) lo que da lugar a la diferenciacion para el fenotipo de CD inmaduras (5 dfas). El tratamiento posterior con el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) diferencia ademas las CD inmaduras en celulas dendriticas madura. Se incubaron CD inmaduras con vesteulas liptelicas de tensioactivo no ionico (VTNI) preparadas como en las etapas 1 y 2 del ejemplo 2 (sin la posterior adicion de antigeno) con o sin dos proporciones molares diferentes de acido biliar con respecto a lfpido total (0,1 y 0,5). Como control positivo, se trataron CD inmaduras con TNF-a solo. Se midio la maduracion de CD inmaduras por citometria de flujo usando anticuerpos anti-MHC II y anti-CD86. Las CD maduras se definieron como doble positivo para ambos anticuerpos. Como se muestra en la figura 3, las VTNI sin acido biliar no afectaron significativamente a la maduracion de CD inmaduras mientras que las VTNI con acido biliar incrementaron la maduracion de las CD. Los resultados tambien sugieren que este incremento en la maduracion se puede ver afectado por el contenido en acido biliar.

Ejemplo 8: Caracterizacion de vesteulas por RMN de 31P

Este ejemplo describe la caracterizacion por RMN de 31P de determinadas vesteulas ejemplares que se prepararon de acuerdo con los procedimientos de la presente divulgacion.

Se prepararon vesteulas como se describe en los ejemplos 1 y 2 sin la adicion de ningun antigeno. Se reconstituyen vesteulas liofilizadas en tampon bicarbonato de sodio (NaHCOa). La concentracion lipfdica final era de 50 mg/ml. Se transfirieron 4 ml de vesteulas suspendidas en un tubo de RMN de 10 mm y se anadieron unas pocas gotas de D2O.

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El espectro de RMN de 31P de vesmulas preparadas usando el procedimiento de fundido en 2 etapas invertido se muestra en la figura 4A. La forma de lmea asimetrica, con una meseta de campo bajo y un pico de campo alto y una anisotropfa de desplazamiento qmmico de aproximadamente 20 ppm corresponde a DCP organizado en una estructura laminar tfpica.

El espectro de RMN de 31P de vesmulas preparadas usando el procedimiento de fundido en 3 etapas se muestra en la figura 4B. Se observo un pico isotropo superpuesto sobre la lmea ancha y centrado alrededor de 2,5 ppm en las muestras preparadas por este procedimiento. El pico isotropo se puede atribuir probablemente a la presencia de las estructuras no laminares tales como micelas, fase hexagonal, o vesmulas de tamano muy pequeno (nanotamano).

Ejemplo 9: Procedimiento de fundido en dos etapas invertido para preparar vesiculas

Este ejemplo describe un procedimiento de fundido en dos etapas invertido ejemplar que se puede usar para preparar vesmulas. Se dispone una proporcion molar 5:4:1 de lfpidos (5,575 g de MPG, 5,218 g de cHo, y 1,845 g de DCP) en un vaso de precipitados de vidrio de fondo plano de 250 ml, asegurandose de que no se adhiere nada de polvo en la pared del vaso de precipitados de vidrio. En determinados modos de realizacion, cuando se fabrican bilosomas, se anade acido biliar en esta etapa, por ejemplo, una proporcion molar 0,5 de acido desoxicolico (0,662 g de acido desoxicolico).

Usando una abrazadera para sujetar el vaso de precipitados que contiene lfpidos y acido biliar, se cubre el vaso de precipitados con una lamina de aluminio y se deja que los lfpidos se fundan en un bano de aceite calentado a de 140 °C a 145 °C, con agitacion ocasional en el vaso de precipitados.

En esta fase, se prepara la solucion madre de antfgeno mezclando el antfgeno y tampon fosfato concentrado (5,174 g de Na2HPO4 y 1,179 g de NaH2PO4 en 15 ml de agua esteril WFI). Se homogeneiza la solucion madre de antfgeno a 8000 rpm en un recipiente SS de 1 l esterilizado. Se transfieren rapidamente los lfpidos fundidos (con o sin acido biliar) en el recipiente SS por medio de un embudo de vidrio esterilizado mientras se continua homogeneizando la solucion. Se homogeneiza la mezcla durante 10 minutos a 8000 rpm. Se transfiere la suspension resultante en un frasco esteril de 1 l y se agitan durante 1-2 horas a 220 rpm y de 30 ° a 35 °C.

En determinados modos de realizacion, se divide la suspension resultante en dos volumenes iguales (225 ml cada uno) y se anade el poli(IC:LC) coadyuvante como sigue.

Para el primer grupo, se prepara poli(IC:LC) en solucion de sacarosa 400 mM mezclando 22,5 ml de una suspension de poli(IC:LC) (45 mg de poli(IC:LC) a 2 mg/ml) y 202,5 ml de solucion de sacarosa 400 mM en tampon fosfato 100 mM. Se anade la suspension resultante al primer volumen de 225 ml de la suspension antigeno/vesmula y se agita durante 5 minutos a 220 rpm y de 30 ° a 35 °C.

Para el segundo grupo, se prepara poli(IC:LC) en solucion de sacarosa 400 mM mezclando 7,5 ml de una suspension de poli(IC:LC) (15 mg de poli(IC:LC) a 2 mg/ml) y 217,5 ml de solucion de sacarosa 400 mM en tampon fosfato 100 mM.

Se anade la suspension resultante al segundo volumen de 225 ml de la suspension antigeno/vesmula y se agita durante 5 minutos a 220 rpm y de 30 ° a 35 °C.

A continuacion se pueden congelar las muestras a -80 °C durante la noche. En determinados modos de realizacion, posteriormente se liofilizan las muestras y se almacenan a 4 °C.

Ejemplo 10: Procedimiento de fundido en dos etapas invertido para preparar vesiculas

Este ejemplo describe otro procedimiento de fundido en dos etapas invertido ejemplar que se puede usar para preparar vesmulas. Se dispone una proporcion molar 5:4:1 de lfpidos (496 g de 1-monopalmitoil glicerol (MPG), 496 g de colesterol (CHO) y 164 g de fosfato de dicetilo (DCP)) en un vaso de precipitados de vidrio de fondo plano, asegurandose de que no se adhiere nada de polvo a la pared del vaso de precipitados de vidrio. Se funde conjuntamente un agonista de TLR-4 junto con los lfpidos (por ejemplo, 12 mg de PHAD™ (disacarido de hexaacilo fosforilado de Avanti Polar Lipids)). Se fija el vaso de precipitados y se cubre con una lamina de aluminio y se funden los lfpidos en un bano de aceite caliente a 120-125 °C con agitacion ocasional en el vaso de precipitados.

En esta fase, se prepara la solucion madre de antfgeno mezclando el antfgeno y un tampon fosfato concentrado (5,980 g de Na2HPO4y 1,363 g de NaH2PO4 en 20 ml de agua esteril). Se homogeneiza la solucion madre de antfgeno a 8.000 rpm a 30-35 °C, y se transfieren rapidamente los lfpidos fundidos con agonista de TLR-4 al vaso de precipitados se transfieren mientras se homogeneiza la solucion. Se homogeneiza la mezcla a 8.000 rpm de forma continua durante 10 minutos a 30-35 °C. Se agita la suspension de lfpido-antfgeno resultante durante 1-2 horas a 220610 rpm a 30-35 °C.

En algunos modos de realizacion, se puede anadir solucion de sacarosa en agua a la solucion de vesmula/antigeno y se agitar durante 5 minutos a 220610 rpm a 30-35 °C.

A continuacion se pueden congelar las muestras a -80 °C durante la noche. En determinados modos de realizacion, posteriormente se liofilizan las muestras y se almacenan a 4 °C.

Incorporacion por referencia

El contenido de cualquier referencia a la que se haga referencia en el presente documento se incorpora en el presente 5 documento por referencia en su totalidad.

Otros modos de realizacion

Se pretende que la memoria descriptiva y los ejemplos se consideren unicamente como ejemplares. Otros modos de realizacion seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la consideracion de la memoria descriptiva o la puesta en practica de los procedimientos, las formulaciones y los kits divulgados en el presente documento.

10 En particular, aunque el analisis anterior se ha centrado en el atrapamiento de anffgenos, se debe entender que, en general, los procedimientos se pueden usar para atrapar cualquier sustancia sea antigenica o no antigenica. Por lo tanto, en algunos modos de realizacion, los procedimientos de la presente divulgacion se pueden usar para atrapar uno o mas polipeptidos, polinucleotidos o polisacaridos que pueden ser o no antigenicos. Las clases espedficas de sustancias incluyen, pero no se limitan a, coadyuvantes, enzimas, receptores, neurotransmisores, hormonas, 15 citocinas, modificadores de la respuesta celular tales como factores de crecimiento y factores quimiotacticos, anticuerpos, haptenos, toxinas, interferones, ribozimas, agentes antisentido, plasmidos, ADN y ARN. En algunos modos de realizacion, el polipeptido puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo humanizado. La tabla 4 proporciona una lista no limitante de sustancias ejemplares que se podnan atrapar usando los procedimientos de la presente divulgacion.

20 Tabla 4

Sustancia

Farmaco de referencia

interferon gamma-lb

Actimmune®

alteplasa

Activase®/Cathflo®

factor antihemofflico

Advate

albumina humana

Albutein®

laronidasa

Aldurazyme®

interferon alfa-n3

Alferon N®

factor antihemofflico humano

Alfanate®

factor de coagulacion humano IX filtrado con virus

AlfaNine® SD

alefacept

Amevive®

bivalirudina

Angiomax®

darbepoetina alfa

Aranesp™

bevacizumab

Avastin™

interferon beta-la

Avonex®

factor de coagulacion IX

BeneFIX™

interferon beta-lb

Betaseron®

tositumomab

Bexxar®

factor antihemofflico

Bioclate™

hormona del crecimiento humano

BioTropin™

toxina botulmica de tipo A

Botox®

alemtuzumab

Campath®

Sustancia

Farmaco de referencia

acritumomab; tecnecio-99 marcado

CEA-Scan®

alglucerasa

Ceredase®

imiglucerasa

Cerezyme®

Fab inmunitario polivalente de Crotalidae

CroFab™

Fab de anticuerpos antidigoxmicos

DigiFab™

rasburicasa

ELITEK®

etanercept

Enbrel®

epoetina alfa

Epogen®

cetuximab

Erbitux™

algasidasa beta

Fabrazyme®

urofolitropina

Fertinex™

folitropina beta

Follistim™

teriparatida

Forteo®

somatropina humana

Genotropin®

glucagon

GlucaGen®

folitropina alfa

Gonal-F®

factor antihemofflico

Helixate®

factor XIII

Hemofil®

insulina

Humalog®

complejo humano factor antihemofflico/factor von Willebrand

Humate-P®

somatotropina

Humatrope®

adalimumab

Humira™

insulina humana

Humulina®

hialuronidasa humana recombinante

Hilenex™

interferon alfacon-1

Infergen®

eptifibatida

Integrilin™

interferon alfa

Intron A®

palifermina

Kepivance

anakinra

Kineret™

factor antihemofflico

Kogenate®FS

insulina glargina

Lantus®

factor estimulador de colonias de granulocitos-macrofagos

Leukine®

lutropina alfa, inyectable

Luveris

ranibizumab

Lucentis®

Sustancia

Farmaco de referencia

gemtuzumab ozogamicina

Milotarg™

galsulfasa

Naglazyme™

nesiritida

Natrecor®

pegfilgrastim

Neulasta™

oprelvecina

Neumega®

filgrastim

Neupogen®

fanolesomab

NeutroSpec™

somatropina

Norditropin®/Norditropin NordiFlex®

insulina; suspension de cinc

Novolin L®

insulina; suspension de isofano

Novolin N®

insulina, regular

Novolin R®

insulina

Novolin®

factor de coagulacion Vila

NovoSeven®

somatropina

Nutropin®

inmunoglobulina intravenosa

Octagam®

L-asparaginasa pegilada

Oncaspar®

abatacept

Orencia™

muromomab-CD3

Ortoclonc OKT3®

gonadotropina corionica humana

Ovidrel®

interferon alfa-2a pegilado

Pegasys®

interferon alfa-2b pegilado

PEG-Intron™

abarelix

Plenaxis™

epoetina alfa

Procrit®

aldesleucina

Proleukin, IL-2®

somatrem

Protropin®

dornasa alfa

Pulmozyme®

efalizumab

Raptiva™

interferon beta-la

Rebif®

factor antihemofflico

Recombinate®

rAHF/factor antihemofflico

ReFacto®

lepirudina

Refludin®

infliximab

Remicade®

abciximab

ReoPro™

reteplasa

Retavase™

Sustancia

Farmaco de referencia

rituximab

Rituxan™

interferon alfa-2a

Roferon-A®

somatropina

Saizen®

secretina porcina sintetica

SecreFlo™

basiliximab

Simulect®

eculizumab

Soliris®

pegvisomant

Somavert®

palivizumab

Synagis™

tirotropina alfa

Thyrogen®

tenecteplasa

TNKase™

natalizumab

Tysabri®

interferon alfa-n1

Wellferon®

drotrecogina alfa

Xigris™

omalizumab

Xolair®

daclizumab

Zenapax®

ibritumomab tiuxetan

Zevalin™

somatotropina

Zorbtive™ (Serostim®)

Ademas, aunque se considera que los procedimientos de la presente divulgacion son particularmente aplicables a sustancias termolabiles que son sensibles a su entorno qmmico y/o ffsico (por ejemplo, sustancias biologicas tales como microbios, polipeptidos, polinucleotidos, polisacaridos, etc.) se debe entender que, en algunos modos de 5 realizacion, los procedimientos tambien se pueden usar para atrapar sustancias mas estables incluyendo productos terapeuticos de moleculas pequenas tradicionales.

Claims (20)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento que comprende:

   proporcionar una mezcla fundida de Ifpidos formadores de vesmulas; y

   anadir la mezcla fundida a una solucion acuosa que comprende un antfgeno de modo que se forman vesmulas que contienen antigeno.
2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que los Ifpidos formadores de vesmulas son fosfoKpidos, o tensioactivos no ionicos, por ejemplo 1-monopalmitoilglicerol.
3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, en el que la mezcla de lfpidos formadores de vesmulas comprende ademas:

   un tensioactivo ionico tal como dicetilfosfato, acido fosfatfdico o fosfatidilserina; o un esteroide, tal como colesterol.
4. 4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la solucion acuosa comprende un lioprotector tal como sacarosa.
5. 5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende ademas liofilizar las vesmulas que contienen antigeno.
6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 5, que comprende ademas rehidratar las vesmulas que contienen antfgeno despues de que se hayan liofilizado.
7. 7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la mezcla de lfpidos formadores de vesmulas comprende un coadyuvante tal como un agonista de TLR-4, preferentemente un derivado de lfpido A atenuado, tal como un monofosforil derivado de lfpido A, o un 3-desacil monofosforil derivado de lfpido A.
8. 8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende ademas anadir un coadyuvante, tal como un agonista de TLR-3, preferentemente con un lioprotector, despues de que se formen las vesfculas que contienen antfgeno,

   en el que el agonista de TLR-3 es preferentemente acido polirriboinosmico:polirribocitidflico, estabilizado opcionalmente con poli-L-lisina carboximetilcelulosa; y

   en el que el lioprotector es preferentemente sacarosa, trehalosa, polietilenglicol (PEG), tampon dimetil-succinato (DMS), seroalbumina bovina (BSA), manitol o dextrano.
9. 9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la solucion acuosa que comprende un antfgeno se controla por temperatura.
10. 10. El procedimiento de la reivindicacion 9, en el que la solucion acuosa que comprende un antfgeno se mantiene a una temperatura de menos de aproximadamente 50 °C, por ejemplo, menos de aproximadamente 40 °C o menos de aproximadamente 30 °C, durante la formacion de las vesfculas que contienen antfgeno.
11. 11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la mezcla lipfdica fundida comprende ademas un potenciador del transporte que facilita el transporte de lfpidos a traves de las membranas mucosas.
12. 12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la mezcla lipfdica fundida carece de un potenciador del transporte que facilita el transporte de lfpidos a traves de las membranas mucosas.
13. 13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el antfgeno es un virus, tal como un virus atenuado o un virus inactivado.
14. 14. El procedimiento de la reivindicacion 13, en el que el virus es hepatitis A o gripe.
15. 15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el antfgeno se selecciona del grupo que consiste en un polipeptido, un polinucleotido y un polisacarido.
16. 16. El procedimiento de la reivindicacion 15, en el que el polipeptido es un polipeptido vmco.
17. 17. El procedimiento de la reivindicacion 16, en el que el polipeptido vmco es un polipeptido de la hepatitis B, un polipeptido de la hepatitis C, un polipeptido del VIH o un polipeptido de la gripe.
18. 18. El procedimiento de la reivindicacion 17, en el que el polipeptido de la hepatitis B es HBsAg.
19. 19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que el antfgeno es termolabil.

    Distribution de tamano de partfcula (^m)

    imagen1

    Tiempo despues de la hidratacion (horas)

    Procedimiento de fundido en 3 etapas

    Procedimiento de fundido en 2 etapas invertido

    Figura 1

    Valores de punto final invertido

    Respuesta de anticuerpos frente al antigeno vmco de hepatitis A

    imagen2

    Figura 2

    CD86-PE

    NISV

    NISV +

    NISV +

    (0,1x BA)

    (0,5x BA) (+) Control - TNFa

    imagen3

    Figura 3

    * $

    (A). Fundido invertido

    ifi

    /V
20. 5 . /

    *

    vv

    ^VV^s/VAju

    ppm \V.)

    10,0

    5,0 0,0 -5,0 -10,0 -15,0

    imagen4

    Figura 4