JP2007525456A - ウマ2型インフルエンザウイルスのha1を発現するdnaワクチン - Google Patents
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Abstract
本発明は、ウマ2型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素(HA1)遺伝子を発現するDNAワクチンに関する。HA1内に停止コドンを操作して作成することによって、HA1の発現を確実にする。リポソーム内にDNAワクチンを被包し、そして鼻腔内接種すると、全長HA遺伝子を発現するDNAワクチンに比較して、有意により低い投薬量で、防御免疫を誘発するのに十分である。投薬量がより低ければ、抗DNA抗体の誘導のリスクが減少する。呼吸器上皮細胞に直接、鼻腔内接種することによって、DNA組込みのリスクが減少する。ワクチンを更新するのに、コード配列を新規ウイルスで置換しさえすればよいため、本発明のワクチンは、現在の不活性化ワクチンまたは生弱毒化ワクチンより好適である。
Description
発明の背景
技術分野:
本発明は、ウマ・インフルエンザウイルスのワクチン、そしてより詳細には、優れた粘膜免疫を誘発する、典型的な投薬量より低い投薬量の鼻腔内投与可能なウマ2型インフルエンザウイルスのHA1コード配列を含むDNAワクチンに関する。
技術分野:
本発明は、ウマ・インフルエンザウイルスのワクチン、そしてより詳細には、優れた粘膜免疫を誘発する、典型的な投薬量より低い投薬量の鼻腔内投与可能なウマ2型インフルエンザウイルスのHA1コード配列を含むDNAワクチンに関する。
背景:
ウマ・インフルエンザウイルス(EIV)は、ウマにおいて、上気道感染の主要病原体である。該ウイルスは、何世紀にも渡るウマの呼吸器疾患の集団発生の原因に関係するとされてきている。該ウイルスの蔓延は迅速であり、そして罹患率は非常に高い。感染したウマは、典型的な「流感」症状:呼吸器の苦痛、咳、発熱、および粘液分泌の迅速な開始を発展させる。稀な症例では、二次的な細菌性気管支肺炎から死に至る。死亡率は低いが、ウマ・インフルエンザウイルス感染の影響は重大である。1992年の香港の大発生では、競馬が中止された結果、収益が1億2千USドル減少したと概算される。他のウマ競技における経済的重要性はこれより低い可能性があるが、ウマ・インフルエンザの大発生のため、何度か、国際的なウマのイベントが中断されたことがある。臨床的な徴候を示さないが、激しいトレーニングを経た感染馬は、肺機能の減少などの長期の結果に苦しむ可能性もある。臨床的に不健康なウマは、トレーニングの時間を失うという、明白な不都合を被る。
ウマ・インフルエンザウイルス(EIV)は、ウマにおいて、上気道感染の主要病原体である。該ウイルスは、何世紀にも渡るウマの呼吸器疾患の集団発生の原因に関係するとされてきている。該ウイルスの蔓延は迅速であり、そして罹患率は非常に高い。感染したウマは、典型的な「流感」症状:呼吸器の苦痛、咳、発熱、および粘液分泌の迅速な開始を発展させる。稀な症例では、二次的な細菌性気管支肺炎から死に至る。死亡率は低いが、ウマ・インフルエンザウイルス感染の影響は重大である。1992年の香港の大発生では、競馬が中止された結果、収益が1億2千USドル減少したと概算される。他のウマ競技における経済的重要性はこれより低い可能性があるが、ウマ・インフルエンザの大発生のため、何度か、国際的なウマのイベントが中断されたことがある。臨床的な徴候を示さないが、激しいトレーニングを経た感染馬は、肺機能の減少などの長期の結果に苦しむ可能性もある。臨床的に不健康なウマは、トレーニングの時間を失うという、明白な不都合を被る。
ウマ・インフルエンザウイルスは、A型インフルエンザウイルスであり、オルソミクソウイルス科のメンバーである。ウイルス・ゲノムは、マイナス鎖RNAの8つのセグメントからなる。ウイルス・キャプシドは、2つの表面ウイルス糖タンパク質:赤血球凝集素(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)を係留する脂質エンベロープに封入されている。HAは、EIVの最も抗原性の高いウイルス・タンパク質と考えられている。HAは、およそ77kDの分子量を有する。このウイルス・タンパク質は、HA0として合成され、そしてプロテアーゼ作用によって切断され、そして続いて単一のジスルフィド結合が還元されて、アミノ末端HA1部分(50kD)およびカルボキシ末端HA2部分(27kD)になる。HA2部分は、膜の脂質二重層上に係留され、そしてHA1部分は、非共有連結によってHA2に結合している。この赤血球凝集素は、ウイルスが、宿主細胞膜の受容体に結合し、続いて侵入につながり、そしてウイルスが脱殻し、したがってウイルス複製を開始するのに関与する。ワクチン接種の主な目的は、ウイルスがコードするこの分子に向かう免疫を誘導することである。
ウマ・インフルエンザウイルスには2つのサブタイプがある。1型、またはウマ1型インフルエンザウイルス(H7N7)は、この15年間、先進国で単離されていない。しかし、ウマ2型インフルエンザウイルス(H3N8)は、大規模なワクチン接種プログラムにもかかわらず、世界中に出回り続けている。H3N8ウイルスが成功しているのは、おそらく、アミノ酸置換によってHAの抗原性が連続的に変化する、抗原性ドリフトのためである[1]。ウマ2型インフルエンザウイルスの最近の単離体は、「アメリカ」系統または「ユーラシア」系統いずれかに分類可能である。さらに、より最近のウマ2型インフルエンザウイルスは、多数の系統に分かれてきており[2]、そして少なくとも北米では、2つの進化系統が、隔年で出回る[3]。
現在のEIVワクチンは、典型的には、ホルマリンまたはβ−プロピオラクトンで不活性化された全ウイルスからなる。抗原性構成要素は、ウマ・インフルエンザウイルス1型および2型で構成されている。A/Eq/プラハ/56は、1型の唯一のワクチン株であり、一方、2型の構成要素は、原型のA/Eq/マイアミ/63、およびA/Eq/ケンタッキー/81またはA/Eq/フォンテンブロー/79などのより最近の株である。ウマ・インフルエンザの抑制に関するWHO/OIE協議の最近の会議では、ワクチンは、「アメリカ」ウイルス(A/Eq/ケンタッキー/94)および「ユーラシア」ウイルス(A/Eq/ニューマーケット/2/93)両方を含むべきであり、そして原型A/Eq/マイアミ/63は使用中止すべきであるという以前の提案が確認された[4]。
最近の前向き研究において、Morleyら[5]は、現在の商業的ワクチンがウイルス感染に対して防御せず、そして臨床的症状の抑制に最低限の効果を有するのみであることを示している。現在の商業的ワクチンが提供する防御に不足があるのは、以下の要因:
・免疫原性が欠如している;
・ワクチン株の選択肢が乏しい;および/または
・不適切な免疫を誘発する
の1つ、またはそれより多くの組み合わせによる。
・免疫原性が欠如している;
・ワクチン株の選択肢が乏しい;および/または
・不適切な免疫を誘発する
の1つ、またはそれより多くの組み合わせによる。
ウマ2型インフルエンザウイルス(H3N8)は、進化し続けており、防御免疫を誘発するには、ワクチン株を定期的に更新することが必要である。しかし、異なるワクチン製造者の間で、多種多様なワクチン株が選択されている。
以前のEIVによって生成される免疫は、アミノ酸置換の結果、HAの抗原性が変化する(抗原性ドリフト)ため、より最近の単離体に対しては、防御しないであろう。該ウイルスのこの特性は、「失敗がない(fail−proof)」有効なワクチンを作成するには大きな障害である。より最近のウイルス株で、そしてより頻繁な間隔で置換することによって、ワクチンを更新することが推奨されてきた[6]。製品中に旧型の(outdated)ウイルス株をなお使用し続けている製造者もある。ウマ・インフルエンザウイルスに特異的な抗体は誘発されるが、これらのワクチンには問題が多い。第一に、血清抗体レベルは、防御の指標として劣っている。第二に、出回っているウイルス株がワクチン株とは十分に異なるため、最低限の交差反応性しかない。こうした旧型のワクチンに誘発される「部分的」免疫は、感染宿主を無症候性キャリアーにし、すなわち、この宿主は感染するが、部分的免疫のため、臨床症状が抑制される。これらの感染宿主は認識されず、これによってウイルスの蔓延が促進される。
インフルエンザウイルスは、上気道の繊毛上皮細胞に付着することによって感染を開始する。したがって、粘膜抗体は、ウイルスに対する有効な防御を提供する。実際、ウマ・インフルエンザウイルスに対する防御における鼻抗体の重要性が長年認識されてきている。マウスモデルにおいて、IgAの移入によって、インフルエンザウイルス感染に対する防御が与えられることが示されている[7]。
現在のワクチンは血清抗体を誘発するが、粘膜免疫をターゲットとするものはない。抗原および抗体両方の測定値が標準化されていないため、血清抗体レベルおよびワクチン有効性の間の相関は不明である[8]。
ウマ・インフルエンザウイルスの現在のワクチンに対する粘膜免疫応答を後押しするため、免疫刺激複合体(ISCOM)の使用[9]、および粘膜領域への直接接種[10]を含む、いくつかの戦略が用いられてきている。しかし、これらの戦略を用いた結果、わずかな改善しか示されなかった。
最近認可された、低温に適応し(温度感受性突然変異体)そして弱毒化された組換えウマ・インフルエンザウイルスに基づく、Heska Corp.(コロラド州フォートコリンズ)のワクチンは、粘膜免疫を誘発する試みである。該ワクチンは、粘膜免疫を誘発するため、鼻腔内接種によって投与される。低温適応弱毒化ウイルスを、粘膜部位に直接、鼻腔内接種すると、粘膜に会合するリンパ系組織(MALT)の強い刺激が提供される。したがって、このワクチンは、非常に免疫原性であり、そして粘膜免疫を誘発する。しかし、該ワクチンは、再集合(re−assortment)を通じた組換えウイルスに基づくため、ワクチンを更新するには、低温適応弱毒化ウイルスの再操作が必要である。更新されたワクチンが認可可能となる前に、必要な安全性試験および有効性試験をすべて行わなくてはならない。
DNAワクチン、または遺伝子免疫の分野は、迅速に浮上しつつある技術である。タンパク質のコード配列を含有するDNAプラスミドをマウスに筋内注射すると、抗原が発現されるだけでなく、該抗原に対する免疫応答もまた誘発されるという発見は、予期せぬものであった[11、12]。in vitroでのDNAトランスフェクションと類似の方式で、細胞がin vivoでDNAプラスミドを取り込むと考えられている。DNAプラスミドは宿主細胞内で複製はしないが、コードされる抗原は、宿主細胞によって転写され、そして翻訳される。抗原は細胞表面上で発現されるかまたは分泌されるかいずれかであり、そして免疫応答が誘発される[13]。この新たな免疫方法論は、多くの研究者によって、そしてインフルエンザウイルス一般[14]を含む広い範囲の感染性病原体に対して、そしてウマ・インフルエンザウイルスに特異的に[15]、有効であることが示されている。A/Eq/ケンタッキー/81のHA遺伝子を発現するDNAワクチンを、皮膚および粘膜を介して投与した後、相同ウイルス曝露に対して、ウマが防御されることが示された[15]。
特許の当該技術分野において、EIVに対するワクチンおよび方法論が、米国特許第6,482,414号;第6,436,408号;第6,398,774号;第6,177,082号;第6,045,790号;第4,920,213号;第4,693,893号;第4,689,224号;第4,683,137号;第4,631,191号;および第4,619,827号に記載されており、これらの特許はすべて、本明細書に援用される。米国特許第4,920,213号および第4,631,191号は、ウマ・インフルエンザウイルスに対してウマを免疫する組換えウイルスに関する。2つの株由来のHA糖タンパク質およびNA糖タンパク質をコードするDNA配列を用いて、ワクシニア所持ワクチンを構築し、初回抗原刺激投与および追加免疫投与のための合成ペプチドを設計し、そしてHAタンパク質および/またはNAタンパク質に基づくワクチンの組換え合成を可能にした。
ウマ・インフルエンザウイルスの理想的なワクチンは、現在のワクチンの上記欠陥に対処して、非常に免疫原性であり、粘膜免疫を誘発し、そして容易な「更新」を行いやすいものでなければならない。
発明の概要
本発明は、ウマ2型インフルエンザウイルス由来のHA糖タンパク質のHA1セグメントをコードする配列を含有するDNAワクチンを鼻腔内投与した際に、防御免疫が与えられるという発見に基づく。HA1を発現しているDNAワクチンをリポソームベクターに被包し、そしてBalb/cマウスの鼻腔に接種した。2回の追加免疫ワクチン接種後、致死未満用量の感染性相同ウイルスにマウスを曝露した。非免疫対照群では、7.9%の最大体重損失が観察された。DNAワクチン免疫群および陽性対照群(不活性化相同ウイルスで免疫)では、観察される体重損失は、それぞれ1.8%および1.6%であった。さらに、ウイルス特異的IgG抗体およびIgA抗体が誘発された。HAの前駆体は、HA1およびHA2に切断される。抗原性部位は、ウイルス・タンパク質のHA1部分に位置するため、HA1は免疫原性ウイルス糖タンパク質である。上述のこれらの結果によって、防御免疫を誘発するには、HA1のみの発現で十分であることが示された。さらに、全長HA遺伝子を発現するDNAワクチンに比較した際、HA1 DNAワクチンが防御を与えるのに必要な投薬量は、はるかにより少ないことが発見された。
本発明は、ウマ2型インフルエンザウイルス由来のHA糖タンパク質のHA1セグメントをコードする配列を含有するDNAワクチンを鼻腔内投与した際に、防御免疫が与えられるという発見に基づく。HA1を発現しているDNAワクチンをリポソームベクターに被包し、そしてBalb/cマウスの鼻腔に接種した。2回の追加免疫ワクチン接種後、致死未満用量の感染性相同ウイルスにマウスを曝露した。非免疫対照群では、7.9%の最大体重損失が観察された。DNAワクチン免疫群および陽性対照群(不活性化相同ウイルスで免疫)では、観察される体重損失は、それぞれ1.8%および1.6%であった。さらに、ウイルス特異的IgG抗体およびIgA抗体が誘発された。HAの前駆体は、HA1およびHA2に切断される。抗原性部位は、ウイルス・タンパク質のHA1部分に位置するため、HA1は免疫原性ウイルス糖タンパク質である。上述のこれらの結果によって、防御免疫を誘発するには、HA1のみの発現で十分であることが示された。さらに、全長HA遺伝子を発現するDNAワクチンに比較した際、HA1 DNAワクチンが防御を与えるのに必要な投薬量は、はるかにより少ないことが発見された。
ワクチンを更新する際に、新規ウイルス由来のHA1コード配列を挿入することによって、抗原を置換することだけが必要である限り、本発明のDNAワクチンは、現在の不活性化ワクチンまたは生弱毒化ワクチンに勝る、他の利点を所持する。さらに、ワクチンを鼻腔内接種して、粘膜免疫をターゲットとすることも可能である。ワクチンを操作して、発現される抗原の免疫原性を最適化することもまた、可能である。
先行技術に勝る、本発明の発見の別の大きな利点は、遺伝子銃、筋内注射または皮内注射によってDNAワクチンを搬送する場合、導入されたDNAが宿主細胞の染色体に組み込まれるリスクがあることである。不都合な結果または癌の発展を伴う突然変異が、潜在的に起こるリスクがある。リポソーム被包後に鼻腔内接種すると、DNAワクチンは、気道の上皮細胞に直接搬送される。上皮細胞は高速で入れ替わるため、染色体組込みのリスクは、有意に減少する。さらに、以下に記載するように、HA1のみを使用する(操作された停止コドンを用いる)と、必要な投薬量が減少し、組込みのリスクがさらに減少するとともに、抗DNA抗体が誘発されるリスクも減少する。
したがって、本発明の1つの態様において、ウマ2型インフルエンザウイルスのHA1またはそのエピトープのDNAコード配列を含むDNAワクチン組成物であって、薬理学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤をさらに含む、前記DNAワクチン組成物を提供する。HA1コード配列は、ウマ2型インフルエンザウイルスの既知の株から選択可能であり、そして1つの態様において、好ましくは、株A/Eq/ケンタッキー/98由来である。特定の例において、HA1コード配列は配列番号1のヌクレオチド配列を含む。
本発明の別の態様において、免疫応答を増進するため、そして/または接種後の適切な吸収率を促進するため、DNAワクチンをアジュバントと合わせる。
本発明のさらなる態様において、ウマ・インフルエンザウイルス感染を防御するかまたはその重症度を減少させるため、ウマにおいて免疫応答を誘導する方法であって、潜在的に危険な状態にある動物に、有効免疫量の本発明のワクチンを、単独で、あるいはアジュバントまたはさらなる抗原性構成要素もしくはコード配列と組み合わせて投与して、ウマ・インフルエンザウイルス感染を抑制する手段を提供することを含み、該ワクチンが、薬理学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤をさらに含む、前記方法を提供する。
本発明のさらなる態様において、ウマ・インフルエンザウイルス感染を防御するかまたはその重症度を減少させるため、ウマにおいて免疫応答を誘導する方法であって、潜在的に危険な状態にある動物に、有効免疫量の本発明のワクチンを、単独で、あるいはアジュバントまたはさらなる抗原性構成要素もしくはコード配列と組み合わせて投与して、ウマ・インフルエンザウイルス感染を抑制する手段を提供することを含み、該ワクチンが、薬理学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤をさらに含む、前記方法を提供する。
好ましくは、DNAワクチンはベクターを含み、そして最も好ましくは、DNAはリポソームに被包され、そして優れた粘膜免疫を誘発するため、被験者の気道に鼻腔内搬送される。
本発明のより優れた理解、並びに本発明の目的および利点は、以下の詳細な説明から当業者には明らかであり、この説明は、本発明を実行するために意図される、最適の様式を単に例示する目的で、本発明の好ましい態様のみを記載する。理解されるであろうように、本発明は、すべて本発明の範囲および精神から逸脱することなく、多様な明白な観点で修飾が可能である。したがって、本説明は、例示の性質のものと見なすべきであり、そして制限と見なしてはならない。
発明の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、本発明が、本明細書に例示する構築物の詳細および記載する工程への適用に限定されないことを理解することが重要である。本発明は、他の態様および多様な方式で実施するかまたは実行することが可能である。本明細書に使用する言葉遣いおよび専門用語は、説明の目的のためであり、そして限定するものではないことを理解しなければならない。
本発明を詳細に説明する前に、本発明が、本明細書に例示する構築物の詳細および記載する工程への適用に限定されないことを理解することが重要である。本発明は、他の態様および多様な方式で実施するかまたは実行することが可能である。本明細書に使用する言葉遣いおよび専門用語は、説明の目的のためであり、そして限定するものではないことを理解しなければならない。
本発明は、EIVに対して防御するように設計された、新規DNAワクチンおよび方法を提供する。本発明は、DNA仲介ワクチン接種に関し、そして好ましくは、最新の株いずれかから選択されるHA1またはそのエピトープをコードする単離DNAのベクターを介して直接導入し、該DNAが次いで、接種されたウマの細胞内で発現されることを含む。本発明のワクチンを、単独で、あるいは当業者に知られる、さらなる抗原性構成要素もしくはコード配列と組み合わせて、または他のワクチンと組み合わせて、投与することも可能である。
好ましくは、単離HA1コード配列は、株A/Eq/ケンタッキー/98、A/Eq/マイアミ/63、A/Eq/ケンタッキー/81、A/Eq/フォンテンブロー/79、A/Eq/サスカトゥーン/90、A/Eq/ケンタッキー/92、A/Eq/ケンタッキー/94およびA/Eq/ニューマーケット/2/93、A/Eq/ニューヨーク/99、A/Eq/オクラホマ/00からなる群より選択され、そしてより好ましくは株A/Eq/ケンタッキー/98由来である。最も好ましくは、HA1コード配列は、ケンタッキー/98由来の配列番号1のヌクレオチド配列を含む。しかし、本明細書に意図するように、本発明は、他の株のHA1コード配列、並びにHA1、そのエピトープ、および/または模倣体(mimetics)を有効にコードする、その類似体、断片、突然変異体、置換体、合成物、または変異体を含む(HA1遺伝子のヌクレオチド配列を得ることも可能な、多様なウイルス株と、対応するGenBank寄託番号のリストに関しては、例えば、本明細書に援用される、以下の参考文献[2]の表1および3を参照されたい)。その結果、本発明は、全長抗原、抗原断片、抗原誘導体、あるいはこうした抗原、抗原断片または抗原誘導体と別のタンパク質との融合産物であることも可能なタンパク質をコードし、そして/または適切な形質転換細胞で発現する、DNA配列を含む。本発明はまた、本明細書に記載する株を含む、最新の株の免疫原特性を持つ、単離組換え株を有するDNAワクチンも意図する。
本明細書において定義するような、「単離」DNAは、天然配列に天然に付随する他の細胞構成要素から実質的に分離されているものである。該用語は、天然存在環境から取り出されている核酸配列を含み、そして組換えDNA単離体またはクローニングされたDNA単離体、および化学的に合成された類似体または生物学的に合成された類似体を含む。
用語「ベクター」は、一般的に、多くのものが当該技術分野に知られ、それ自体では「不活性」である(それ自体に対する免疫を誘発しない)、DNAワクチンベクターいずれかを指し、レシピエントに容易に導入可能であり(挿入物に対する免疫を誘発する)、そして宿主染色体に組み込まれない。本明細書に援用され、そして当該技術分野に知られる多様なベクターおよび搬送系を概説する、米国特許第6,468,984号および第6,339,068号を参照されたい。好ましいベクターは、Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッドから商業的に入手可能なpVAX1およびpcDNA3.1/V5−His−TOPO真核生物発現ベクターである。
本発明のワクチンは、機能可能であるように連結されたHA1コード配列の発現を制御する核酸配列を含むことも可能である。発現調節配列は、該発現調節配列が、核酸配列の転写、および必要に応じて翻訳を調節し、そして制御する場合、該核酸配列に機能可能であるように連結されている。したがって、発現調節配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子直前の開始コドン(すなわちATG)、mRNAの適切な翻訳を可能にする遺伝子の正しい読み枠を維持するイントロンのスプライシングシグナル、および停止コドンを含むことも可能である。
本発明のワクチンは、薬理学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤をさらに含む。ワクチンに適したキャリアーは当業者に周知であり、そして限定されるわけではないが、タンパク質、糖などが含まれる。こうしたキャリアーは、水性または非水性溶液、懸濁物、およびエマルジョンであることも可能である。非水性キャリアーの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルである。水性キャリアーには、水、アルコール性/水性溶液、エマルジョンまたは懸濁物が含まれ、生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース溶液、デキストロースおよび塩化ナトリウム溶液、乳酸加リンゲル溶液または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体補充剤および栄養補充剤、リンゲルのデキストロース溶液に基づくものなどの電解質補充剤等が含まれる。保存剤および他の添加剤もまた存在可能であり、例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガス等がある。好ましい保存剤には、ホルマリン、チメロサール、ネオマイシン、ポリミキシンBおよびアンホテリシンBが含まれる。
用語「アジュバント」は、接種後、免疫応答を増進し、そして/または適切な吸収率を促進する、化合物または混合物を指し、そして本明細書において、いかなる取り込み促進剤も含む。許容しうるアジュバントには、限定されるわけではないが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオールなどの界面活性物質、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョンまたは炭化水素エマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノールなどが含まれる。好ましいアジュバントは、Fort Dodge Animal HealthのMETASTIM(登録商標)アジュバントである。
該方法は、本発明のワクチンの有効免疫用量を動物に投与することを含む。本発明の目的のため、本発明のワクチンの「有効免疫量」は、体重1キログラムあたり少なくとも0.001μgのDNAであり、そして好ましくは、体重1キログラムあたり0.001μgのDNA〜体重1グラムあたり0.01μgのDNAの範囲内である。望ましい粘膜免疫を誘発するため、ワクチンは、上述のようなリポソーム/アジュバント中に被包された後、好ましくは、鼻腔内投与されるが、望ましいならば、当業者に周知の方法いずれかによって、例えば筋内、皮下、腹腔内、静脈内、経口、皮内、または眼球によって、別の方式で、投与されることも可能である。
本発明を以下の実施例によってさらに例示し、この実施例は、本発明の理解を補助することを意図するが、請求項に示すような本発明を、いかなる点でも制限することを意図せず、そしてそのように見なしてはならない。
(実施例)
材料および方法
ウイルスおよびウイルス増幅:
ウマ2型インフルエンザウイルス、A/Eq/ケンタッキー/98は、Thomas Chambers博士、ケンタッキー大学から寛大に寄贈された。先に記載されるように[2]、ウイルス増幅および性質決定を行った。簡潔には、9〜11日齢の孵化鶏卵中、ウイルスを37℃で72時間培養した。Mahrら[16]に記載されるように、尿膜液を採取した。1000gで15分間遠心分離することによって清澄にした後、ニワトリ赤血球を用いた赤血球凝集アッセイによって、ウイルス力価を決定した。
材料および方法
ウイルスおよびウイルス増幅:
ウマ2型インフルエンザウイルス、A/Eq/ケンタッキー/98は、Thomas Chambers博士、ケンタッキー大学から寛大に寄贈された。先に記載されるように[2]、ウイルス増幅および性質決定を行った。簡潔には、9〜11日齢の孵化鶏卵中、ウイルスを37℃で72時間培養した。Mahrら[16]に記載されるように、尿膜液を採取した。1000gで15分間遠心分離することによって清澄にした後、ニワトリ赤血球を用いた赤血球凝集アッセイによって、ウイルス力価を決定した。
DNAワクチンの構築:
クローニング用のDNAテンプレートを合成するため、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって、HA1オープンリーディングフレームを調製した。ウイルスRNAを抽出し、そして単一12プライマー(5’AGCAAAAGCAGG3’)(配列番号2)およびMMLV逆転写酵素(Stratagene、カリフォルニア州ラホヤ)を用いてcDNAを合成した。プライマーEH3−29+(5’CATGAAGACAACCATTATTTT3’)(配列番号3)およびEH3−1061−(5’TCTGATTTGCTTTTCTGGTA3’)(配列番号4)またはEH3−29+およびEH3−1061STOP(5’TCATCTGATTTGCTTTTCTGGTA3’)(配列番号5)を用いたPCRによって、テンプレートを合成した。95℃1分間、45℃2分間、および72℃3分間を25周期で、そしてTaq DNAポリメラーゼ(Stratagene、カリフォルニア州ラホヤ)を用いて、PCRを行った。製造者の指示にしたがって、PCR産物をpcDNA3.1/V5−His−TOPO真核生物ベクターに連結した。2つのクローンを同定し、そして続く実験に用いた:pTOPO/KY98−6およびpTOPO/KY98−11(逆方向プライマー中に構築された停止コドンを含む)。感染したウマ由来の回復期血清を用い、PCRによって、そしてウェスタンブロットハイブリダイゼーションによって、HA1の発現を確認した。pTOPO/KY98−11をBamHIおよびXhoIで制限エンドヌクレアーゼ消化して、HA1挿入物を切り出し、その後、pVAX1のBamHIおよびXhoI部位に挿入物を連結することによってさらなるクローンを構築し、その結果、pVAX/KY89−11を生成した。
クローニング用のDNAテンプレートを合成するため、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって、HA1オープンリーディングフレームを調製した。ウイルスRNAを抽出し、そして単一12プライマー(5’AGCAAAAGCAGG3’)(配列番号2)およびMMLV逆転写酵素(Stratagene、カリフォルニア州ラホヤ)を用いてcDNAを合成した。プライマーEH3−29+(5’CATGAAGACAACCATTATTTT3’)(配列番号3)およびEH3−1061−(5’TCTGATTTGCTTTTCTGGTA3’)(配列番号4)またはEH3−29+およびEH3−1061STOP(5’TCATCTGATTTGCTTTTCTGGTA3’)(配列番号5)を用いたPCRによって、テンプレートを合成した。95℃1分間、45℃2分間、および72℃3分間を25周期で、そしてTaq DNAポリメラーゼ(Stratagene、カリフォルニア州ラホヤ)を用いて、PCRを行った。製造者の指示にしたがって、PCR産物をpcDNA3.1/V5−His−TOPO真核生物ベクターに連結した。2つのクローンを同定し、そして続く実験に用いた:pTOPO/KY98−6およびpTOPO/KY98−11(逆方向プライマー中に構築された停止コドンを含む)。感染したウマ由来の回復期血清を用い、PCRによって、そしてウェスタンブロットハイブリダイゼーションによって、HA1の発現を確認した。pTOPO/KY98−11をBamHIおよびXhoIで制限エンドヌクレアーゼ消化して、HA1挿入物を切り出し、その後、pVAX1のBamHIおよびXhoI部位に挿入物を連結することによってさらなるクローンを構築し、その結果、pVAX/KY89−11を生成した。
DNA免疫およびウイルス曝露:
大腸菌中でプラスミドDNAを増幅し、MaxiPrepキット(Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)を用いて、該DNAを抽出し、そして精製した。分光解析によって、そして制限エンドヌクレアーゼ消化後のアガロースゲル電気泳動によって、DNA調製物の濃度および純度を決定した。DNAワクチン接種のため、DNA調製物を、ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)(Roche Applied Science、インディアナ州インディアナポリス)中で、20μg/mlに希釈した。接種前に、等体積のリポフェクタミン(Roche)溶液(DMEM中20μg/ml)と懸濁物を、室温で20分間混合した。
大腸菌中でプラスミドDNAを増幅し、MaxiPrepキット(Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)を用いて、該DNAを抽出し、そして精製した。分光解析によって、そして制限エンドヌクレアーゼ消化後のアガロースゲル電気泳動によって、DNA調製物の濃度および純度を決定した。DNAワクチン接種のため、DNA調製物を、ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)(Roche Applied Science、インディアナ州インディアナポリス)中で、20μg/mlに希釈した。接種前に、等体積のリポフェクタミン(Roche)溶液(DMEM中20μg/ml)と懸濁物を、室温で20分間混合した。
4〜8週齢のメスBalb/cマウス(Jackson Laboratories、メイン州バーハーバー)を4匹の群に分けた。鼻腔内接種のため、各マウスをイソフルラン(フォーレン、1−クロロ−2,2,2−トリフルオロエチルジフルオロメチルエーテル)で麻酔した。マイクロピペットを用いて、25.0μlのDNA懸濁物(0.01μg/g体重の投薬量)を鼻腔にしみこませた。2群のマウスには、DNAワクチンを投与し、一方にはpTOPO/KY98−6を、そして第二の群にはpTOPO/KY98−11を投与した。2つの陰性対照群も含んだ。1群にはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を接種し、そして第二の群には、緑色蛍光タンパク質を発現する非関連プラスミドDNAベクター(pGFP/グリーンランタン、Gibco, BRL)を接種した。さらなる群には、陽性対照群として、マウスあたり、8.0HA単位(1.6x107の50%鶏卵感染用量[EID50]、または1x106疫病(plague)形成単位[pfu]と同等)のUV不活性化A/Eq/ケンタッキー/98を接種した。第21日および第35日に、同じ投薬量で、2回の追加免疫ワクチン接種を投与した。第50日にウイルス曝露を行った(第二の追加免疫の15日後)。各マウスに、16HA単位(3.2x107 EID50、または2x106pfuと同等)の相同ウイルス(A/Eq/ケンタッキー/98)を鼻腔内接種し、そして続く10日間、各マウスの体重を測定した。
さらに、DNAワクチン接種が特異的抗体を誘発するかどうか調べるため、第0日、第21日、第35日、第50日および第65日に、後眼窩出血(麻酔後)によって、血清を収集した。これらの時点は、それぞれ、「プレ出血」、第一の追加免疫ワクチン接種および第二の追加免疫ワクチン接種、ウイルス曝露、および曝露15日後に相当する。
ウイルス特異的IgGおよびIgAの力価測定(titration):
スクロース勾配で精製した相同ウマ・インフルエンザウイルス、A/Eq/ケンタッキー/98の懸濁物を用いて、ELISAプレートを調製した。50mM NaHCO3緩衝液中で、0.6HA単位/mlにウイルスを希釈し、そしてこのウイルス懸濁物100μlをELISAプレートの各ウェルに添加した。抗原がプレート上に「コーティング」されるように、プレートを室温で24時間放置した。ELISAプレートをPBSで3回洗浄した後、ブロッキング緩衝液[2.0%ウシ血清アルブミン(BSA)および1.0%スキムミルクを含有するPBS]を添加し、そして室温でさらに1時間インキュベーションした。PBSで再び洗浄した後、100μlの希釈マウス血清(2.0% BSAを含むPBS中、1:10)を添加し、そして上述のようにインキュベーションした。室温で1時間インキュベーションし、そしてPBSで洗浄した後、100μlの希釈(2%BSAを含むPBS中で1:2000)アルカリホスファターゼ・コンジュゲート化ウサギ抗ネズミIgGまたはIgA抗血清(Sigma、ミズーリ州セントルイス)を添加した。室温で1時間インキュベーションした後、プレートを再びPBSで洗浄し、そして100μlの「基質」を添加した[1.0mg/mlの4−ニトロフェニルリン酸溶液(pNPP)、Sigma]。室温で2.5時間インキュベーションした後、マイクロプレート読取装置(Biotek Instruments、バーモント州ウィヌースキ)を用いて、405nmでの吸光度を測定した。すべての血清試料を3つ組でアッセイした。「プレ出血」血清の平均吸光度を、免疫血清の吸着値から減じ、そして結果を405nmでの光学密度の増加(ΔO.D.405)として表した。
スクロース勾配で精製した相同ウマ・インフルエンザウイルス、A/Eq/ケンタッキー/98の懸濁物を用いて、ELISAプレートを調製した。50mM NaHCO3緩衝液中で、0.6HA単位/mlにウイルスを希釈し、そしてこのウイルス懸濁物100μlをELISAプレートの各ウェルに添加した。抗原がプレート上に「コーティング」されるように、プレートを室温で24時間放置した。ELISAプレートをPBSで3回洗浄した後、ブロッキング緩衝液[2.0%ウシ血清アルブミン(BSA)および1.0%スキムミルクを含有するPBS]を添加し、そして室温でさらに1時間インキュベーションした。PBSで再び洗浄した後、100μlの希釈マウス血清(2.0% BSAを含むPBS中、1:10)を添加し、そして上述のようにインキュベーションした。室温で1時間インキュベーションし、そしてPBSで洗浄した後、100μlの希釈(2%BSAを含むPBS中で1:2000)アルカリホスファターゼ・コンジュゲート化ウサギ抗ネズミIgGまたはIgA抗血清(Sigma、ミズーリ州セントルイス)を添加した。室温で1時間インキュベーションした後、プレートを再びPBSで洗浄し、そして100μlの「基質」を添加した[1.0mg/mlの4−ニトロフェニルリン酸溶液(pNPP)、Sigma]。室温で2.5時間インキュベーションした後、マイクロプレート読取装置(Biotek Instruments、バーモント州ウィヌースキ)を用いて、405nmでの吸光度を測定した。すべての血清試料を3つ組でアッセイした。「プレ出血」血清の平均吸光度を、免疫血清の吸着値から減じ、そして結果を405nmでの光学密度の増加(ΔO.D.405)として表した。
結果
DNAワクチンの検証:
3つのDNAワクチンベクターを構築し、そして同定した。これらを、PCRによって、そして制限消化によって、両方で性質決定した。PCRおよび制限解析によって、挿入物が正しいサイズ(およそ1.0kb)であり、そして図1に示すようなpcDNA3.1/V5−His−TOPOおよびpVAX1ベクター中のCMVプロモーターに関して正しい方向であることが示された。EH3−1061STOPプライマーに含有される停止コドンは、HA1遺伝子挿入物の翻訳が、ベクターpTOPO/KY98−11のV5エピトープおよびHis6タグをコードする配列の前で終結するようにする。pVAX/KY98−11は、HA1内の「内蔵」停止コドンを利用する。一方、ベクターpTOPO/KY98−6では、挿入物の終結は、ベクター中の停止コドンに依存し、したがって産物は、カルボキシ末端で、V5およびHis6「タグ」に連結される。回復期ウマ血清を用いたウェスタンブロット・ハイブリダイゼーションによって、どちらのベクターも、MDBK細胞にトランスフェクションした後、HA1抗原の正しい発現と一致する、およそ50kDのタンパク質を産生することが立証された(データ未提示)。
DNAワクチンの検証:
3つのDNAワクチンベクターを構築し、そして同定した。これらを、PCRによって、そして制限消化によって、両方で性質決定した。PCRおよび制限解析によって、挿入物が正しいサイズ(およそ1.0kb)であり、そして図1に示すようなpcDNA3.1/V5−His−TOPOおよびpVAX1ベクター中のCMVプロモーターに関して正しい方向であることが示された。EH3−1061STOPプライマーに含有される停止コドンは、HA1遺伝子挿入物の翻訳が、ベクターpTOPO/KY98−11のV5エピトープおよびHis6タグをコードする配列の前で終結するようにする。pVAX/KY98−11は、HA1内の「内蔵」停止コドンを利用する。一方、ベクターpTOPO/KY98−6では、挿入物の終結は、ベクター中の停止コドンに依存し、したがって産物は、カルボキシ末端で、V5およびHis6「タグ」に連結される。回復期ウマ血清を用いたウェスタンブロット・ハイブリダイゼーションによって、どちらのベクターも、MDBK細胞にトランスフェクションした後、HA1抗原の正しい発現と一致する、およそ50kDのタンパク質を産生することが立証された(データ未提示)。
DNA免疫およびウイルス曝露:
マウスは、インフルエンザウイルス感染に特徴的な明白な呼吸器症状を発展させないため、体重損失モデルを使用して、DNAワクチンの有効性を評価した。ウイルス曝露およびそれに続く回復後の体重損失を、症状の重症度、そしてしたがって、DNAワクチンによって与えられる防御レベルを比較する基準とした。ウイルス曝露後、各マウスの体重を毎日測定し、そして結果を、ウイルス曝露前の体重に対する体重変化パーセントとして表した。各群に関して、平均体重損失に加えて平均の標準誤差(SEM)を、感染後の日数に対してプロットし、これを図2に示す。
マウスは、インフルエンザウイルス感染に特徴的な明白な呼吸器症状を発展させないため、体重損失モデルを使用して、DNAワクチンの有効性を評価した。ウイルス曝露およびそれに続く回復後の体重損失を、症状の重症度、そしてしたがって、DNAワクチンによって与えられる防御レベルを比較する基準とした。ウイルス曝露後、各マウスの体重を毎日測定し、そして結果を、ウイルス曝露前の体重に対する体重変化パーセントとして表した。各群に関して、平均体重損失に加えて平均の標準誤差(SEM)を、感染後の日数に対してプロットし、これを図2に示す。
ワクチン接種したマウス(両方のDNAワクチンベクターまたはUV不活性化ウイルスを用いる)は、ウイルス曝露後、無食欲、「ふわふわした外皮(fluffy coat)」の外観(発熱の指標)、および無活動などの臨床的症状をほとんどまたはまったく発展させないことは、注目に値した。PBSで免疫した陰性対照群は、重症感染の徴候を示し、そして第1日に体重を失い始め、ウイルス曝露後、第8日に、最大7.9%の体重を失った。体重損失は、10日より長く持続した。第二の陰性対照群(pGFP)もまた、最初の3日間、有意な体重損失(4.6%体重)を示し、次いで、回復し始めた。対照的に、免疫群はいずれも、いかなる有意な体重損失も示さなかった。
体重の変化に対して、ペアード・スチューデントt検定を行って、統計的有意性があるかどうかを決定した。PBS対照群にpTOPOKY98−6およびpTOPOKY98−11を比較したP値は、それぞれ、0.001および0.006であった。これは、陽性対照群(UV不活性化ウイルスで免疫)およびPBS群間のP値が0.0001であるのに匹敵する。したがって、どちらのDNAワクチンベクターに関しても、これらは、不活性化ウイルスに誘発されるものと類似の防御免疫を誘発した。
ウイルス特異的IgGおよびIgAの力価測定:
ELISAの結果を図3Aおよび図3Bに示す。上述のように、対照血清のO.D.405nmを推定し、そして結果を、3つ組ウェルの増加したO.D.405nmの平均として標準誤差を加えて表す。第21日および第35日に、追加免疫ワクチン接種を投与し、そして第50日に、マウスを生ウイルスに曝露した。ウイルス曝露15日後にもまた、血清を試験した。
ELISAの結果を図3Aおよび図3Bに示す。上述のように、対照血清のO.D.405nmを推定し、そして結果を、3つ組ウェルの増加したO.D.405nmの平均として標準誤差を加えて表す。第21日および第35日に、追加免疫ワクチン接種を投与し、そして第50日に、マウスを生ウイルスに曝露した。ウイルス曝露15日後にもまた、血清を試験した。
UV不活性化ウイルスで免疫したマウス(陽性対照群)では、ウイルス特異的IgGは、早くも第21日に検出され、増加したO.D.は0.49であった(図3A)。しかし、IgAは、わずかにしか検出されず、増加したO.D.は0.09であった(図3B)。第35日、第一の追加免疫の2週間後、IgGレベルは、3倍より多く増加した。興味深いことに、第二の追加免疫ワクチン接種によって、IgGレベルがさらに増加するのでなく、第50日のIgGレベルは、第35日のものより、実際に低かった。しかし、生ウイルス曝露後、期待通りに、IgGレベルの増加があり、O.D.は1.2から約1.7になった。IgAでも同様のパターンが観察された。しかし、そのレベルは有意に低かった。
DNAワクチン免疫群に関しては、どちらも検出可能なウイルス特異的IgGおよびIgA応答を有し、そしてそのパターンは、UV不活性化ウイルスに誘発されるものと類似である。第一の追加免疫ワクチン接種後、IgGおよびIgAの1.5〜2倍の増加があった(pTOPO/KY98−6ワクチン接種群では、増加はそれぞれ、0.31から0.55、そして0.17から0.36)。同様に、第二の追加免疫ワクチン接種は、IgGまたはIgAのレベルをさらには上昇させなかった。しかし、IgGは、ウイルス曝露後、3倍より多く増加した。IgAもまた上昇したが、2倍未満であった。
興味深いことに、非特異的ベクター、pGFPをワクチン接種した陰性対照群では、ウイルス曝露前に、ウイルス特異的IgGまたはIgAが「検出」された。しかし、0.2 O.D.未満の増加は、非特異的結果である可能性もある。ウイルス曝露後、初感染で期待されるように、IgGおよびIgA両方が検出された(図3Aおよび図3B)。同様に、PBS免疫群に関しては、ウイルス曝露15日後のIgGおよびIgAのO.D.は、それぞれ、1.68±0.12および0.35±0.03であった(データ未提示)。
考察
防御のためのより少ないDNA
インフルエンザウイルスは、DNAワクチン研究において、モデル生物として用いられてきている。早くも1993年には、HA発現プラスミドがインフルエンザに対する防御を与えることが示されていた[17][18][19][13]。しかし、これらの研究は、全長HA遺伝子からなるDNA構築物を用いて行われた。HAは、受容体結合および膜融合のためのウイルス糖タンパク質であり、そしてHA2分子の大半は、膜内在性タンパク質である。赤血球凝集素は、HA0前駆体として合成され、次いでタンパク質分解的にHA1およびHA2に切断される。HA1は主な防御抗原性部位を含有し、そしてウイルス・エンベロープに係留されているHA2に、非共有的に連結される[20]。本明細書において、HA1単独の発現が、防御免疫を誘発するのに十分であることを報告する。前駆体HA0をHA1およびHA2に切断するには、組織特異的プロテアーゼが必要であるため、HA2を除くと、酵素プロセシングの必要性が回避可能である。さらに、HA2の非存在下では、合成されるHA1は膜結合性でなく、そしてしたがってより多くのHA1分子が遊離し、そして抗原提示細胞に取り込まれて、より強い免疫応答を誘発することが可能になる。したがって、このDNAワクチンの免疫原性は、有意に増進する。さらに、このDNAワクチンは、免疫のため、より少ない量しか必要でない。体重1グラムあたりわずか0.01μg DNAによって防御免疫が誘発され、これはWongら[21]に報告されるより10倍低く、そして遺伝子銃接種で用いられるより2倍低い[17]。Fynanらに報告されるのと同じ投薬量を、平均400kgのウマに適用する場合、必要なDNA量は、接種あたり4.0mgであろうことに注目すべきである。
防御のためのより少ないDNA
インフルエンザウイルスは、DNAワクチン研究において、モデル生物として用いられてきている。早くも1993年には、HA発現プラスミドがインフルエンザに対する防御を与えることが示されていた[17][18][19][13]。しかし、これらの研究は、全長HA遺伝子からなるDNA構築物を用いて行われた。HAは、受容体結合および膜融合のためのウイルス糖タンパク質であり、そしてHA2分子の大半は、膜内在性タンパク質である。赤血球凝集素は、HA0前駆体として合成され、次いでタンパク質分解的にHA1およびHA2に切断される。HA1は主な防御抗原性部位を含有し、そしてウイルス・エンベロープに係留されているHA2に、非共有的に連結される[20]。本明細書において、HA1単独の発現が、防御免疫を誘発するのに十分であることを報告する。前駆体HA0をHA1およびHA2に切断するには、組織特異的プロテアーゼが必要であるため、HA2を除くと、酵素プロセシングの必要性が回避可能である。さらに、HA2の非存在下では、合成されるHA1は膜結合性でなく、そしてしたがってより多くのHA1分子が遊離し、そして抗原提示細胞に取り込まれて、より強い免疫応答を誘発することが可能になる。したがって、このDNAワクチンの免疫原性は、有意に増進する。さらに、このDNAワクチンは、免疫のため、より少ない量しか必要でない。体重1グラムあたりわずか0.01μg DNAによって防御免疫が誘発され、これはWongら[21]に報告されるより10倍低く、そして遺伝子銃接種で用いられるより2倍低い[17]。Fynanらに報告されるのと同じ投薬量を、平均400kgのウマに適用する場合、必要なDNA量は、接種あたり4.0mgであろうことに注目すべきである。
さらに、DNAワクチンを被包し、より少ないDNAで免疫し、そして粘膜部位に接種することによって、体細胞または生殖系列細胞にDNAが組み込まれる潜在的可能性のリスクが、有意に減少する。
IgAの役割
インフルエンザウイルスは、気道で感染を開始する。多くの先の研究が示すように、インフルエンザウイルスまたは他の呼吸器感染に対する防御では、粘膜免疫が重要である[22、23]。分泌性IgAは、粘膜免疫に重要な役割を果たす。IgAは、インフルエンザウイルス感染に対する防御に関与することが示されている[24]。さらに、インフルエンザ特異的IgAの受動移入によって、インフルエンザウイルス感染からレシピエントマウスが防御される[7]。Lunnらは、ポニーにおいて、ウマ・インフルエンザウイルスに対するDNAワクチンを調べた[15]。遺伝子銃を用いて、舌、結膜、および瞬膜を含む、いくつかの粘膜部位にDNAワクチンを搬送した。各場合で、強いIgG応答が刺激された。しかし、誘発されたIgA応答は劣っていた。
インフルエンザウイルスは、気道で感染を開始する。多くの先の研究が示すように、インフルエンザウイルスまたは他の呼吸器感染に対する防御では、粘膜免疫が重要である[22、23]。分泌性IgAは、粘膜免疫に重要な役割を果たす。IgAは、インフルエンザウイルス感染に対する防御に関与することが示されている[24]。さらに、インフルエンザ特異的IgAの受動移入によって、インフルエンザウイルス感染からレシピエントマウスが防御される[7]。Lunnらは、ポニーにおいて、ウマ・インフルエンザウイルスに対するDNAワクチンを調べた[15]。遺伝子銃を用いて、舌、結膜、および瞬膜を含む、いくつかの粘膜部位にDNAワクチンを搬送した。各場合で、強いIgG応答が刺激された。しかし、誘発されたIgA応答は劣っていた。
結果によって、DNAワクチンをリポソームに被包し、そしてDNAワクチンを気道に搬送すると、よりよい粘膜免疫が誘発されることが示される。血清ウイルス特異的IgAに対応する増加があったため、防御はおそらく、気道(粘膜部位)のIgAによって仲介されるのであろう。
追加免疫および非特異的免疫
結果によって、第二の追加免疫はウイルス特異的IgGまたはIgAの力価の増加を生じないため、不要である可能性もあることが示唆される。おそらく、第一の追加免疫ワクチン接種後の力価は、数週間残ることも可能であり、第二の追加免疫を不要にするのであろう。あるいは、ウイルス特異的抗体の存在が、第二の追加免疫ワクチン接種によって導入されるさらなる抗原を中和した可能性もある。
結果によって、第二の追加免疫はウイルス特異的IgGまたはIgAの力価の増加を生じないため、不要である可能性もあることが示唆される。おそらく、第一の追加免疫ワクチン接種後の力価は、数週間残ることも可能であり、第二の追加免疫を不要にするのであろう。あるいは、ウイルス特異的抗体の存在が、第二の追加免疫ワクチン接種によって導入されるさらなる抗原を中和した可能性もある。
興味深いことに、どちらのDNAワクチン接種群でも、ウイルス曝露後、IgGレベルは3倍より多く増加した(図3A、pTOPOKY98−6およびpTOPOKY98−11両方)。対照的に、UV不活性化ウイルスでは、増加は1倍未満であった。この観察は、DNAワクチンが優れた初回抗原刺激応答を誘発するという、他の研究者による先の報告に匹敵する。DNAワクチンによるこの「非アムネスティー(anamnesty)」応答は、おそらく、不活性化抗原に誘発される応答とは、動力学および抗原提示経路が異なることによるのであろう。さらに、DNAワクチンによる免疫応答の誘導に利用可能な抗原の真の量を決定するのは困難であり、DNAワクチンによるこの「初回抗原刺激効果」増進の機構は解明されていないままである。
pGFPで免疫したマウス(陰性対照として用いる)の体重損失が第3日にピークとなり、そして他の陰性対照群(PBS)より有意に早い、第4日には回復し始めたことに注目することもまた、興味深い。PBS群に対するペアード・スチューデントt検定は、0.033のP値を生じた。しかし、これらのマウスは、PBS対照群と類似の臨床的特徴を有した。さらに、体重損失は、ウイルス曝露後の最初の3日間はPBS群に匹敵した。真の防御の基準が、臨床的症状がまったくないことであるならば、P値が有意であったとしても、これらのマウスは「防御」されていない。ウイルス曝露前に、ウイルス特異的抗体はまったく検出されなかった(吸光度値がバックグラウンドレベルの境界であった)ため、「より早期の回復」は、特異的免疫のためではない。DNAワクチンベクターの特定のモチーフが、非特異的免疫を誘発することが周知である。粘膜部位でリポソームを導入することもまた、非特異的免疫を誘導しうる。
さらなるデータ
ウマにおける粘膜免疫のプロトコルを確立するため、数頭のウマに、本発明のDNAワクチンを鼻腔内接種し、そして数週間後に鼻洗浄液を収集すると、ウイルス特異的抗体に対する陽性シグナルが明らかになった。
ウマにおける粘膜免疫のプロトコルを確立するため、数頭のウマに、本発明のDNAワクチンを鼻腔内接種し、そして数週間後に鼻洗浄液を収集すると、ウイルス特異的抗体に対する陽性シグナルが明らかになった。
参考文献
以下の刊行物を本明細書に援用する:
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上記を考慮すると、本発明のいくつかの目的が達成され、そして他の好適な結果が得られたことがわかるであろう。本発明の範囲から逸脱することなく、多様な変化を作成可能であるため、上記説明に含有されるか、または付随する図に示されるすべての事柄は、例示として解釈すべきであり、そして限定した意味で解釈してはならないことが意図される。本発明は、特定の度合いの具体性を持って記載されているが、本発明は、例示の目的で本明細書に示した態様(単数または複数)には限定されず、請求項の各要素が権利を与えられるのと同等の完全な範囲を含めて、付随する単数または複数の請求項の範囲によってのみ限定されることが理解される。
Claims (19)
- ウマ・インフルエンザウイルスのワクチンであって、ウマ2型インフルエンザウイルスの株のHA1コード配列を含む単離DNAの有効免疫量、および薬理学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤を含む、前記ワクチン。
- HA1コード配列が、株A/Eq/ケンタッキー/98、A/Eq/マイアミ/63、A/Eq/ケンタッキー/81、A/Eq/フォンテンブロー/79、A/Eq/ケンタッキー/94、A/Eq/ニューマーケット/2/93、A/Eq/ニューヨーク/99、およびA/Eq/オクラホマ/2000からなる群より選択される、請求項1記載のワクチン。
- HA1コード配列が株A/Eq/ケンタッキー/98のものである、請求項1記載のワクチン。
- HA1コード配列が配列番号1のヌクレオチド配列を含む、請求項1記載のワクチン。
- さらなる抗原性構成要素、さらなる抗原性構成要素のコード配列、および他のワクチンからなる群の1以上をさらに含む、請求項1記載のワクチン。
- HA1コード配列を含有するベクターをさらに含む、請求項1記載のワクチン。
- ベクターが真核発現ベクターである、請求項6記載のワクチン。
- ベクターが、pcDNA3.1/V5−His−TOPOおよびpVAX1からなる群より選択される、請求項7記載のワクチン。
- アジュバントをさらに含む、請求項1記載のワクチン。
- アジュバントが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、サポニン、ミネラルゲル、表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョンまたは炭化水素エマルジョン、キーホール・リンペット(keyhole limpet)・ヘモシアニン、およびジニトロフェノールからなる群より選択される、請求項9記載のワクチン。
- アジュバントがMETASTIM(登録商標)である、請求項9記載のワクチン。
- HA1コード配列が被包されているリポソームをさらに含む、請求項1記載のワクチン。
- ウマ・インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、ウマに、請求項1のワクチンの有効免疫量を投与することを含む、前記方法。
- HA1コード配列をベクターに挿入し、そしてワクチンを気道に鼻腔内搬送する工程をさらに含む、請求項13記載の方法。
- ベクターが真核生物ベクターである、請求項14記載の方法。
- ベクターが、pcDNA3.1/V5−His−TOPOおよびpVAX1からなる群より選択される、請求項15記載の方法。
- ベクターがリポソームである、請求項15記載の方法。
- 体重1グラムあたり少なくとも0.01μgのDNAの投薬量でワクチンを投与する、請求項13記載の方法。
- 体重1キログラムあたり0.001μgのDNA〜体重1グラムあたり0.01μgのDNAの範囲内の投薬量でワクチンを投与する、請求項13記載の方法。
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