CN107841513B - 基于M2e表位的广谱型流感疫苗 - Google Patents

基于M2e表位的广谱型流感疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于M2e表位的广谱型流感疫苗，在重组腺病毒表面展示来自于H1N1，H5N1和H7N2三种不同流感亚型的M2e表位。本发明建立的重组腺病毒疫苗能在动物体内诱导M2e特异的免疫反应。在不加佐剂的情况下，本发明建立的重组腺病毒疫苗可完全保护动物抗击同源的H1N1攻击感染，对异源的H9N2和H5N1感染也有良好的保护效果。

Description

基于M2e表位的广谱型流感疫苗
技术领域
本发明属于免疫学和病毒学领域，更具体地，本发明涉及基于M2e表位的广谱型流感疫苗。
背景技术
流感病毒(IV)是一种持续进化的呼吸道致病原，时常引起流行，严重威胁生命安全，并对医疗卫生造成巨大的负担。流感病毒可以在不同宿主间传播，并引起季节性爆发。预防流感最有效的手段是接种疫苗。目前最广泛使用的三价裂解苗(TIV)是基于对即将到来的流感季节中流行株进行预测后设计。2009年，新型甲型流感病毒H1N1席卷了世界，其抗原与当时流行的季节性流感的HA有较大差异。研究表明，当季流感疫苗诱导的抗体对2009年H1N1几乎没有交叉反应。在2014-2015年，在美国流行的80％以上的H3N2与疫苗株抗原不匹配。据估计，针对H3N2疫苗的有效性大约只有18％，然而抗原匹配的B型流感病毒疫苗有效性可达到45％。此外，不断出现的禽流感病毒感染人的病例给流感疫苗研发带来了更大的挑战。
研发广谱流感疫苗的一个基本策略就是寻找保守的表位作为免疫原。流感病毒基质蛋白2的胞外段(M2e)高度保守，其中十七个氨基酸在不同亚型间同源性达94％，使其成为理想的通用流感疫苗候选抗原之一。M2e在流感病毒表面形成四聚体，并充当离子通道。但由于M2e蛋白分子量小、病毒表面含量少、加上其他表面蛋白(如HA)的遮蔽作用，导致了其免疫原性较弱。在自然感染中，人体几乎不产生特异针对M2e的抗体。因此，开发以M2e为基础的广谱流感疫苗的主要难点在于如何提高其免疫原性。
以往的研究中，采用了诸如化学或生物偶联的方法来增强M2e的免疫原性，部分M2e偶联物可完全或部分的保护小鼠抗击流感感染。然而，这些M2e疫苗需要辅以尚处于试验阶段的佐剂来提高免疫原性，例如弗氏完全佐剂和单磷酰脂质A等，而这些佐剂往往有着严重的副作用，并不适用于临床应用。
因此，本领域亟待开发免疫原性提高的以M2e为基础的广谱流感疫苗，特别是无需佐剂的、无需鸡胚扩增的通用流感疫苗，以满足临床所需。
发明内容
本发明的目的在于提供基于重组腺病毒纤突蛋白展示流感病毒M2e表位的流感疫苗。
在本发明的第一方面，提供一种重组腺病毒质粒，所述的重组腺病毒质粒是表达融合的流感病毒M2e表位的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体；其中，所述融合的流感病毒M2e表位包括：H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位。
在一个优选例中，所述的重组腺病毒质粒中，所述的H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位之间以连接序列连接。
在另一优选例中，所述的连接序列的氨基酸序列为：Gly Ala Ala。
在另一优选例中，所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体包括改造的黑猩猩腺病毒AdC68基因组序列，其中E1缺失。
在另一优选例中，E1的大部份编码序列由连接序列替换；所述的连接序列中设置酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I。
在另一优选例中，述的质粒中，融合的流感病毒M2e表位的编码序列插入在复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体纤突蛋白的HI loop区域。
在另一优选例中，所述的融合的流感病毒M2e表位的编码序列插入到复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体纤突蛋白的HI loop区域中两个PmeI之间的位置。
在另一优选例中，所述融合的流感病毒M2e表位，按照N端→C端的顺序，依次为：H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位。
在另一优选例中，该重组腺病毒质粒具有SEQ ID NO:2所述的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供所述的重组腺病毒质粒的用途，用于制备重组腺病毒，所述的重组腺病毒用于诱导M2e特异性免疫反应，或用于制备防治流感病毒感染的疫苗组合物。
在一个优选例中，所述的流感病毒包括但不限于：H1N1亚型流感病毒、H5N1亚型流感病毒、H7N2亚型流感病毒、PR8流感病毒、H5N1亚型流感病毒、H9N2亚型流感病毒。
在本发明的另一方面，提供一种重组腺病毒，述重组腺病毒由所述的重组腺病毒质粒包装获得。
在本发明的另一方面，提供一种制备所述的重组腺病毒的方法，所述方法包括：
(1)制备所述的重组腺病毒质粒；
(2)将(1)的重组腺病毒质粒转染病毒生产细胞，从而包装获得重组腺病毒。
在一个优选例中，所述的病毒生产细胞是可以实现病毒包装的细胞；较佳地包括：HEK293细胞，293T细胞。
在本发明的另一方面，提供所述的重组腺病毒的用途，用于诱导M2e特异性免疫反应；或用于制备防治流感病毒感染的重组腺病毒疫苗组合物。
在本发明的另一方面，提供一种重组腺病毒疫苗组合物，所述的疫苗组合物包括：
有效量的所述的重组腺病毒；以及
药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供一种药盒，所述的药盒中含有所述的重组腺病毒疫苗组合物。
在本发明的另一方面，提供一种用于制备重组腺病毒疫苗的试剂盒，所述试剂盒包括：所述的重组腺病毒质粒；较佳地，其中还包括病毒生产细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、纤突蛋白呈递M2e的重组黑猩猩腺病毒载体构建。
A：本发明中展示的M2e来源及氨基酸序列；
B：AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)的克隆示意图。
图2、Western Blot检测整合M2e的纤突蛋白三聚化。分别在非还原(A)和还原(B)条件下对纯化的重组腺病毒AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)进行Western Blot检测。1010vp的AdC68-empty经同样处理后作为阴性对照。
MW，分子量标准；
泳道1，1010vp的AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)；
泳道2，109vp的AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)；
泳道3，1010vp的AdC68-empty。
图3、Western Blot检测重组腺病毒体外表达M2e。以1010vp/孔、109vp/孔、108vp/孔的AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)感染HEK293细胞，24小时后收样品进行Western Blot检测，以β-actin作为内参。1010vp AdC68-empty感染的细胞作为阴性对照。
图4、ELISA检测纤突蛋白展示的M2e亲和性。以5*109vp/孔的AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)或AdC68-empty包板，以半比梯度稀释的14C2为一抗，HRP标记的抗鼠IgG为二抗检测。所有结果表示为平均吸光值±标准方差(SD)，是三次独立重复实验中的一次结果。
图5、AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)在BALB/C小鼠上引起的M2e特异的抗体反应。BALB/C小鼠加强免疫后2周采集血清，通过ELISA测定M2e特异的抗体反应。包被抗原量为50ng/孔，血清稀释度为1：100，分别测定血清中的总IgG(a)、IgG2a(b)和IgG1(c)。统计分析采用One-way ANOVA，所有结果表示为平均吸光值±标准方差(SD)，是三次独立重复实验中的一次结果。
图6、BALB/C小鼠模型上检测AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)免疫后对H1N1、H5N1、H9N2流感攻击感染的保护效果。BALB/C小鼠(PR8实验n＝9，其他实验n＝10)两次肌肉免疫2.5*1010vp AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)，加强免疫2周后以5LD50的H1N1(a，b)、H5N1(c，d)、H9N2(e，f)攻击感染。AdC68-empty和PBS免疫组作为对照(n＝5)。每组小鼠攻毒后连续观察14天存活率(a、c、e)和体重丢失(b、d、f)。所有结果表示为平均体重±标准方差(SD)，生存率的统计分析采用卡方检验。
图7、被动保护实验检测体液免疫在AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)诱导保护中的作用。未经免疫的BALB/C小鼠(PBS组n＝6，其他组n＝5)腹腔注射500μL免疫的小鼠血清，24小时后以5LD50H1N1病毒攻击感染，连续14天观察生存率(a)和体重丢失(b)。所有结果表示为平均体重±标准方差(SD)，生存率的统计分析采用卡方检验。
具体实施方式
流感病毒属于分节段的负链RNA病毒，在进化中通过抗原不断的突变和漂变来逃避机体的免疫反应，因而研发新型广谱流感疫苗成为当前疫苗研发的热点，但也是难点。本发明人致力于疫苗呈递体系的研究，在广泛研究筛选后，首次提出在重组腺病毒表面展示来自于H1N1，H5N1和H7N2三种不同流感亚型的M2e表位。本发明建立的重组腺病毒疫苗能在动物体内诱导M2e特异的免疫反应。更重要的是，在不加佐剂的情况下，本发明建立的重组腺病毒疫苗可完全保护动物抗击同源的H1N1攻击感染，对异源的H9N2和H5N1感染也有80％的保护效果。
流感病毒M2e高度保守，是理想的广谱流感疫苗的候选抗原之一，但其免疫原性较弱，为了增强M2e的免疫原性，M2e表位免疫需要大剂量的抗原量和非临床的佐剂，例如氏佐剂等，这样的疫苗不能推向临床。因此如何安全的增加M2e免疫原性，是构造广谱流感疫苗的关键技术之一，本发明人将来自三种流感病毒的M2e表位串联，以黑猩猩腺病毒纤突蛋白为平台进行融合表达，将流感表位展示于腺病毒表面。
基于本发明人的新发现，提供了一种重组腺病毒质粒，该重组腺病毒质粒表达融合的流感病毒M2e表位。其中，所述融合的流感病毒M2e表位包括：H1N1亚型流感病毒M2e表位、H1N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位。本发明人发现，将上述三个M2e表位融合表达，可以获得广谱有效的疫苗，所述的疫苗可以对抗多种亚型的流感病毒感染，具有良好的临床应用价值。
所述的H1N1亚型流感病毒M2e表位、H1N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位之间串联连接。较佳地，以连接序列相互连接。所述的连接序列例如包括1-20个氨基酸；较佳地为1-10个氨基酸；更佳地2-5个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响融合蛋白的表达及其免疫原性。
作为本发明的一种优选方式，所述的连接序列的氨基酸序列为：Gly Ala Ala。
作为本发明的一种优选方式，在进行融合表达时，所述融合的流感病毒M2e表位，按照N端→C端的顺序，依次为：H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位。如此排列，本发明人的研究显示其效果优于其它排列方式。
作为本发明的优选方式，所述的重组腺病毒质粒的骨架质粒是复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，所述的质粒中，融合的流感病毒M2e表位的编码序列插入在复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体纤突蛋白的HI loop区域。
作为一种优选方式，所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体包括改造的黑猩猩腺病毒AdC68基因组序列，其中E1缺失；较佳地，E1的大部份编码序列由连接序列替换；所述的连接序列中设置酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I。针对腺病毒AdC68基因组，应用酶切位点I-CeuI和PI-Sce I作为外源基因的插入位点，从而不会导致在腺病毒表达载体的其它位置造成剪切。较佳地，包括改造的黑猩猩腺病毒AdC68基因组序列的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的制备方法为：将黑猩猩腺病毒AdC68基因组分成4个片段，依次装入到骨架载体中，并且，用连接序列替换AdC68基因组中E1的大部份编码序列；所述的4个片段分别是：黑猩猩腺病毒AdC68基因组第1-6025位；黑猩猩腺病毒AdC68基因组第6026-17279位；黑猩猩腺病毒AdC68基因组第17280-34196位；和黑猩猩腺病毒AdC68基因组第34197-36519位。
本发明以复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体为展示载体，对其纤突蛋白进行改造，在HI loop区域插入来自三种流感病毒的M2e基因。本发明人发现，M2e表位与腺病毒纤突蛋白融合表达，可被高效呈递在腺病毒表面，并对纤突蛋白自身的三聚化无影响。
本发明构建的重组腺病毒质粒可在病毒生产细胞中包装、制备重组腺病毒，所述的重组腺病毒能诱导M2e特异的免疫反应。
制备所述的重组腺病毒的方法包括：(1)制备所述的重组腺病毒质粒；(2)将(1)的重组腺病毒质粒转染病毒生产细胞，从而包装获得重组腺病毒。所述的病毒生产细胞是可以实现病毒包装的细胞；较佳地包括：HEK293细胞，293T细胞。所述的重组腺病毒质粒转染病毒生产细胞后的一段时间后，可以收获病毒。收获的病毒可反复感染病毒生产细胞，持续传代。病毒滴度的测定可以根据本领域常规方法进行。
本发明还提供了一种用于制备疫苗的试剂盒，所述试剂盒包括所述的重组腺病毒质粒。所述的试剂盒还可包括病毒生产细胞，如HEK293细胞。此外，所述的试剂盒中还可包括说明疫苗制备方法的使用说明书。
本发明所述的重组腺病毒可用于制备防治流感病毒感染的重组腺病毒疫苗组合物。所述的流感病毒包括但不限于：H1N1亚型流感病毒、H1N1亚型流感病毒、H7N2亚型流感病毒、PR8流感病毒、H5N1亚型流感病毒、H9N2亚型流感病毒等等；根据预期，本发明的疫苗对于表达类似于本发明的重组腺病毒表达的M2e接近的抗原的流感病毒均是有防治作用的。
本发明还提供一种具有免疫原性的疫苗组合物，其是预防性或治疗性疫苗，所述的组合物包含：有效量的本发明所述的重组腺病毒或其加工产物(如经灭活的病毒)，和药学上可接受的载体。本发明的重组腺病毒直接免疫动物就可获得理想的免疫效果。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。
可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。
动物实验表明，利用本发明的重组腺病毒制成的疫苗免疫后，小鼠的肿瘤生长速度减慢，体积缩小，有效提高了被接种肿瘤的小鼠的存活率。
在使用时，是将安全有效量的本发明所述的重组腺病毒疫苗施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明还提供了一种药盒，所述的药盒中含有所述的重组腺病毒疫苗组合物。较佳地，所述的药盒中还可包含说明所述的重组腺病毒疫苗组合物的使用方法的使用说明书。
本发明首次提出改造黑猩猩型腺病毒纤突蛋白，并表达三种流感病毒的M2e蛋白，获得了一种广谱型流感疫苗，具有良好的临床应用价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
主要试剂、菌株及实验动物
所有的工具酶均购自New England Biolabs；LipofectatimeTM 2000购自Invitrogen。
引物、基因合成于金斯瑞生物科技有限公司。
质粒小量提取纯化试剂盒、DNA纯化试剂盒、DNA凝胶回收和纯化试剂盒：均购自天根生化科技有限公司。
DMEM培养基、胎牛血清、0.25％胰酶、双抗：购自Hyclone。
抗M2e单抗(14C2)：购自Santa Cruz，β-actin抗体、抗鼠lgG-HRP购自Sigma，抗鼠IgG1-HRP、IgG2a-HRP购自Southern Biotech。
大肠杆菌菌株Stbl 2：购自Invitrogen。
HEK 293细胞：购自ATCC。
实验小鼠：6-8周龄BALB/C雌性小鼠，购自上海灵畅生物技术有限公司。
流感病毒
本发明涉及的流感病毒包括A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)，A/environment/Hunan/6-69/2008(H5N1)和A/Chicken/Jiangsu/7/2002(H9N2)，所有病毒均在9日龄SPF鸡胚尿囊腔中扩增，并通过小鼠鼻腔接种计算半致死剂量(LD50)[Zhou,D.,et al.,Mol Ther,2010.18(12):p.2182-9]。
重组腺病毒质粒pAdC68-F3M2e(H1-H5-H7)的构建
纤突蛋白修饰的重组腺病毒载体采用等温组装的方法构建[Gibson,D.G.,etal.,Nature Methods,2009.6(5):p.343-U41]，pAdC68纤突蛋白HI loop中存在两个PmeI酶切位点，用PmeI酶切载体进行线性化。串联的M2e序列由金斯瑞生物科技有限公司(南京，江苏)合成，序列如下：
H1N1-H5N1-H7N2(H1-H5-H7)：
Figure BDA0001115593550000091
其中，单下划线标示A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)M2e序列，
Figure BDA0001115593550000092
标示A/Hong Kong/483/1997(H5N1)M2e序列，
Figure BDA0001115593550000093
标示A/Duck/Tasmania/277/2007(H7N2)M2e序列，框线标示为linker序列，斜体的序列为AdC68同源臂。
合成的序列经PmeI酶切，琼脂糖凝胶电泳切胶回收后与线性化的载体pAdC68(参见201310362921.8专利中的E1缺失的复制缺陷型腺病毒载体pAdC68(pAdC68-E1-deleted)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1)用等温重组法连接，反应体系20μL，包含10μLGibson 
Figure BDA0001115593550000101
 Master Mix，50ng片段，50ng载体，ddH2O，在50℃孵育60分钟。转化入Stbl2感受态细胞中，挑取阳性克隆，采用酶切、测序等方法进行鉴定，得到阳性重组质粒，命名为pAdC68-F3M2e(H1-H5-H7)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
重组腺病毒的制备
用限制性内切酶PacI分别线性化重组腺病毒质粒pAdC68-F3M2e(H1-H5-H7)，按LipofectatimeTM 2000说明书上的方法将质粒转染HEK 293细胞，37℃、5％CO2培养8-12天，出现明显噬斑。待细胞变圆、悬浮后收集细胞，反复冻融三次后取病毒上清感染HEK 293细胞(25cm2细胞培养瓶)。然后重复以上步骤，收毒后，按1：3扩增病毒(感染1个75cm2细胞培养瓶)，而后按1：6扩增病毒(感染3个150cm2细胞培养瓶)，最后按约1：9扩增病毒(约25-30个150cm2细胞培养瓶)，利用氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒，测OD260值，加入终浓度为10％的甘油存于-80℃。
提取AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)病毒基因组，通过酶切、测序鉴定。
Western blot检测M2e表达
为检测M2e是否与纤突蛋白融合表达于腺病毒表面，本发明人在还原和非还原条件下通过Western blot检测纯化后腺病毒表面M2e的表达。取1010vp、109vp的AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)加入RIPA裂解10分钟，非还原性SDS-PAGE组加入非还原性上样缓冲液(碧云天)直接上样；还原性SDS-PAGE组加入还原性上样缓冲液(碧云天)，煮样10分钟后上样，1010vp的AdC68-emtpy经同样处理作为对照。所有样品经10％SDS-PAGE分离，转膜，5％脱脂牛奶封闭。加入抗M2e的单抗14C2 4℃孵育过夜，HPR标记的抗鼠IgG孵育1小时后ECL(Sigma)显色。
为检测M2e在体外的表达量，本发明人将处于对数生长期的HEK 293细胞铺于6孔板中，37℃、5％CO2培育24h，待细胞密度长至80％时，分别以1010vp、109vp、108vp/孔的重组腺病毒AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)感染细胞，1010vp AdC68-emtpy处理组作为阴性对照，感染24h后收样检测M2e的表达。以β-actin的表达作为内参。
小鼠免疫与攻毒
取4-6周龄BALB/C小鼠，将小鼠随机分为3组：AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)，AdC68-empty和PBS。第0周时，每只小鼠肌肉免疫2.5*1010vp/100μL重组腺病毒；2周后，同种腺病毒以同样剂量加强免疫一次(肌肉免疫)。PBS组小鼠用100μl PBS处理。免疫2周、4周后采集小鼠血清用于检测体液免疫反应。加强免疫2周后，小鼠麻醉，并通过滴鼻感染30μL 5LD50剂量的流感病毒。攻毒后14天内每天监测小鼠体重以及生存率，体重丢失大于25％的小鼠予以安乐死。
被动免疫
取4-6周龄BALB/C小鼠，同上文所述免疫两次，加强免疫2周后采集小鼠血清。另取新的4-6周BALB/C小鼠，腹腔注射500μL血清，注射后1天滴鼻感染5LD50剂量的PR8病毒，并如上所述进行观察。
ELISA
本发明人采用ELISA方法检测腺病毒表面的M2e表位，具体如下；取5*109vp的AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)和AdC68-empty包被ELISA板，4℃过夜。用脱脂牛奶在37℃封闭1小时，而后以半比梯度稀释的14C2为一抗(稀释度从1：100到1：12800)，37℃孵育2小时，加入HRP标记的IgG作为二抗反应1小时。最后加入TMB显色，1M磷酸终止反应，读取OD450。
腺病毒免疫后小鼠的针对M2e的体液反应也采用ELISA检测。以合成的H1、H5、H7的M2e多肽作为抗原包被ELISA板，包板量为每孔50ng。以免疫后的小鼠血清作为一抗，半比梯度稀释(稀释度从1：100到1：12800)，HRP标记的IgG，IgG1，IgG2a作为二抗进行测试，其他反应条件如上文所述。
实施例1、纤突蛋白改造的腺病毒载体构建
根据实验比较，M2e表位按H1-H5-H7顺序连接能够实现良好的表达且获得免疫原性理想的表达产物。以Gly-Ala-Ala作为不同表位间的连接氨基酸。
M2e的氨基酸序列以及重组腺病毒基因组示意图如图1所示。
实施例2、经修饰的重组腺病毒纤突蛋白维持三聚体结构
在天然条件下，腺病毒的纤突蛋白在病毒颗粒表面形成三聚体。为探究在纤突蛋白上插入H1-H5-H7外源基因是否会影响其蛋白三聚化，本发明人分别在还原性和非还原性的条件下，以Western Blot的方法检测纯化的腺病毒表面纤突蛋白结构，并以同样处理的AdC68-empty作为阴性对照。
结果如图2所示，在非还原条件下，融合了M2e的重组腺病毒纤突蛋白呈现三聚体结构，而加入还原剂DTT处理后，三聚体解聚为约51KD的单体。阴性对照组未表达外源的M2e表位，因而以14C2为一抗检测时无任何条带。
以上Western Blot结果表明，在腺病毒纤突蛋白HI loop区域插入75个外源氨基酸并不影响其三聚体结构。
实施例3、Western blot检测重组腺病毒表达流感M2e表位
1010vp/孔、109vp/孔、108vp/孔重组腺病毒AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)感染HEK 293细胞，以1010vp/孔AdC68-empty为阴性对照，24h后RIPA裂解细胞，加入还原性上样缓冲液，煮样后，通过还原型Western blot方法检测M2e在细胞中的表达。
结果见图3，可以看到AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)感染后的细胞样品在51KD左右有一条特异性条带，即融合了M2e的纤突蛋白，而阴性对照组则无。并且，M2e的表达量与AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)的感染剂量呈现正相关。
实施例4、ELISA证明M2e表位呈递于重组腺病毒表面
此前有文献报道，整合于腺病毒衣壳蛋白上的抗原表位有可能并不暴露于腺病毒表面，因而不能被免疫系统识别[Krause,A.,et al.,J Virol,2006.80(11):p.5523-30]。为了证明本发明构建的重组腺病毒能有效在病毒表面呈递抗原，本发明人分别以5*109vp/孔的AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)、AdC68-empty包被ELISA板，孵育以对比梯度稀释的14C2单抗(稀释度1：100到1：12800)来测定其抗原亲和力。
结果如图4所示，AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)可被14C2抗体识别，并且OD450随抗体稀释倍数增加而下降，对照组AdC68-empty则不能被14C2识别。
以上结果说明，M2e表位暴露于腺病毒表面，并可被相应的抗体特异识别。
实施例5、AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)在小鼠体内诱导M2e特异的体液免疫反应
为检测腺病毒纤突蛋白呈递能否增强M2e的免疫原性，本发明人将BALB/C小鼠随机分为三组，进行免疫：AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)组，AdC68-empty组和PBS组。腺病毒组的免疫剂量为2.5*1010vp，分别在第0周和第2周肌肉免疫，同时在第2周和第4周采集小鼠血清用于测定M2e特异的抗体反应。
第一次免疫后2周，用ELISA法检测小鼠血清中针对H1、H5和H7M2e的抗体反应后发现，AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)组小鼠产生的针对不同M2e的总IgG均较低，与对照组相比没有显著差异。而经过第二次加强免疫后，AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)组针对H1和H7M2e的总IgG水平显著提高，针对H5M2e的IgG增幅较小。
图5a为各组小鼠加强免疫2周后体内总IgG水平，AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)组针对H1M2e总IgG的平均吸光值为1.09(较之对照组P<0.0001)，针对H7M2e的平均吸光值为0.48(较之对照组P<0.05)，其余对照组的吸光值均较低，均值小于0.11。但是AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)组针对H5M2e的总IgG在加强免疫后仍几乎未升高，这个现象可能是由于不同M2e本身免疫原性差异造成。
为进一步阐释纤突蛋白修饰的腺病毒所引起的免疫反应类型，本发明人检测了分型抗体的表达量(IgG2a和IgG1)，由于针对H5M2e的总IgG含量较低，故H5M2e的分型抗体并未测定。如图5b、5c所示，AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)两次免疫的小鼠体内产生了H1M2e特异的IgG2a抗体(较之对照组P<0.0001)，而相对的，IgG1分型抗体则没有显著提高。H7M2e特异的IgG2a均值高于对照组，但并无显著差异。
分型抗体的结果表明，AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)主要诱导机体产生Th1免疫反应。
实施例6、在小鼠模型上检测纤突蛋白修饰的重组腺病毒对同源流感病毒的保护效果
为证明重组腺病毒诱导的M2e特异的抗体反应能起保护效果，本发明人对免疫后的BALB/C小鼠进行了PR8流感病毒的攻击感染，感染剂量为5LD50。BALB/C小鼠分为三组，其中AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)组9只，AdC68-empty组和PBS组分别5只。小鼠滴鼻感染后连续14天监测其生存率和体重变化，体重丢失超过25％的小鼠出于人道考虑进行安乐死。
结果如图6a、6b所示，AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)和对照组在感染后4天内呈现了相似的体重变化，体重略下降。AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)免疫的小鼠在4到7天时最多丢失了12％的体重，而后体重逐渐回复，该组所有的小鼠在攻击感染后都存活(较之对照组P＝0.005)。相应的，两个对照组的小鼠体重持续下降，到9天时，所有对照组小鼠均死亡或安乐死。
以上结果表明，在BALB/C小鼠模型上，AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)对同源的PR8流感病毒攻击感染有100％的保护效果。
实施例7、检测重组腺病毒对于异源流感病毒(H5N1和H9N2)感染的保护效果
近年来H5N1和H9N2都出现了感染人的病例，有引起疫情的风险，因此本发明人选取了异源的H5N1和H9N2病毒对候选疫苗的免疫效果进行检测。
BALB/C小鼠分为三组，AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)组(n＝10)，AdC68-empty组(n＝5)和PBS组(n＝5)，以5LD50的H5N1或H9N2攻击感染。
在H5N1攻击感染实验中，AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)组的8只小鼠存活，其在第10天体重丢失最多，丢失达原体重的20％(图6c、6d)。AdC68-empty组和PBS组的存活率分别为0％(P＝0.007)和20％(P＝0.089)。
H9N2攻击感染后，AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)组小鼠症状显著缓解，保护率达80％(相较对照组P＝0.007)，而两组对照组小鼠在感染后8天全部死亡(图6e、6f)。
以上结果表明，在小鼠模型上，AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)的免疫可对不同禽流感感染产生保护。
实施例8、被动保护实验检测AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)免疫后体液免疫的作用
为证明AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)主要通过体液免疫来产生保护，本发明人对未免疫的BALB/C小鼠腹腔注射500μL抗血清，24小时后以5LD50的PR8病毒攻击感染。AdC68-empty和PBS免疫后的抗血清注射组作为对照。
结果如图7所示，尽管存在体重丢失，80％AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)血清处理的小鼠面对致死剂量的PR8攻击感染存活，对照组小鼠在第6天全部死亡。
被动保护结果说明，体液免疫在AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)诱导的保护中起重要作用。
讨论
传统的流感疫苗需要每年更新，其生产也依赖于鸡胚，在流感爆发时往往供不应求。M2e相对保守，并有研究证明M2e的单抗能在体内外的实验中限制流感病毒的复制，因而可能成为通用流感疫苗的免疫原。在M2e疫苗研发中，最需解决的问题在于如何增强其免疫原性。此前已有的研究中，将M2e分别与谷胱甘肽巯基转移酶或CTA1-DD融合，辅以弗式佐剂等来诱导免疫反应。这些疫苗虽有保护效果，但依赖于较高的免疫剂量和非临床使用的佐剂。
本发明中，本发明人选取复制缺陷型的黑猩猩腺病毒作为平台展示M2e表位。腺病毒作为疫苗载体有以下优势：可感染不同类型的细胞，有较高的转导效率，能诱导强烈的免疫反应，无需佐剂，相对安全，容易制备等。此外，基于腺病毒的流感疫苗生产不依赖于鸡胚，据估计腺病毒载体疫苗的生产周期一般为11至13周，远远少于传统流感疫苗的生产周期(约半年)。因此，本发明人选取腺病毒其中一个结构蛋白-纤突蛋白，将M2e表位表达在其HI loop区。M2e表位被暴露于腺病毒颗粒表面，且外源基因的插入并不影响纤突蛋白的三聚化。肌肉免疫两次后(2.5*1010vp，无佐剂)，BALB/C小鼠体内产生了针对H1和H7M2e的抗体反应，对同源的PR8病毒、异源的禽流感病毒感染都有保护作用。
腺病毒结构蛋白展示外源表位这一策略中的难点在于如何构建重组腺病毒克隆。此前的研究采取了多轮的PCR扩增、酶切连接的方法，需要构建多个亚克隆，表达后的外源表位很难直接进行修饰。本发明中，本发明人在pAdC68的HI loop区插入了PmeI酶切位点，通过PmeI酶切即可线性化载体，外源的表位两端连上一定长度的同源臂后仅需一步的等温重组，即完成了重组腺病毒载体的克隆，大大简化了克隆构建的步骤。
因此，本发明所述的重组腺病毒纤突蛋白展示M2e表位为广谱流感疫苗的研发提供了一种有效的新手段。
此外，重组腺病毒AdC68-F3M2e(H1-H5-H7)两次免疫BALB/C小鼠后，可诱导机体产生针对M2e特异的抗体反应，并可保护小鼠对抗同源的H1N1和异源的H5N1、H9N2致死剂量的攻击感染。
综上所述，本发明的结果证明，通过纤突蛋白展示多个M2e表位的重组黑猩猩腺病毒可作为新型通用流感疫苗。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (9)

1.一种重组腺病毒质粒在制备重组腺病毒中的用途，所述的重组腺病毒用于诱导M2e特异性免疫反应及用于制备防治流感病毒感染的疫苗组合物，所述的重组腺病毒质粒是表达融合的流感病毒M2e表位的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体；所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体包括改造的黑猩猩腺病毒AdC68基因组序列，其中E1缺失；
其中，所述融合的流感病毒M2e表位为H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位；所述融合的流感病毒M2e表位的编码序列插入在复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体纤突蛋白的HI loop区域；
该重组腺病毒质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位之间以连接序列连接。
3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的连接序列的氨基酸序列为：Gly AlaAla。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述融合的流感病毒M2e表位，按照N端→C端的顺序，依次为：H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述疫苗组合物所防治的流感病毒包括：H1N1亚型流感病毒、H5N1亚型流感病毒、H7N2亚型流感病毒、PR8流感病毒、H9N2亚型流感病毒。
6.一种制备重组腺病毒的方法，其特征在于，所述重组腺病毒由重组腺病毒质粒包装获得，所述方法包括：
(1) 制备重组腺病毒质粒；所述的重组腺病毒质粒是表达融合的流感病毒M2e表位的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体；所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体包括改造的黑猩猩腺病毒AdC68基因组序列，其中E1缺失；其中，所述融合的流感病毒M2e表位为H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位；所述融合的流感病毒M2e表位的编码序列插入在复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体纤突蛋白的HI loop区域；该重组腺病毒质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；
(2) 将(1)的重组腺病毒质粒转染病毒生产细胞，从而包装获得重组腺病毒。
7. 重组腺病毒在制备诱导M2e特异性免疫反应、防治流感病毒感染的重组腺病毒疫苗组合物中的用途；其中所述重组腺病毒由重组腺病毒质粒包装获得；所述的重组腺病毒质粒是表达融合的流感病毒M2e表位的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体；所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体包括改造的黑猩猩腺病毒AdC68基因组序列，其中E1缺失；所述融合的流感病毒M2e表位为H1N1亚型流感病毒M2e表位、H5N1亚型流感病毒M2e表位和H7N2亚型流感病毒M2e表位；所述融合的流感病毒M2e表位的编码序列插入在复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体纤突蛋白的HI loop区域；该重组腺病毒质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的疫苗组合物包括：
有效量的所述的重组腺病毒；以及药学上可接受的载体。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的疫苗组合物被包含在药盒中。
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