CN103732249A - 含有经修饰腺病毒载体的流感疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通用流感疫苗，该疫苗可提供长达数年的保护，提供抵抗循环流感株的经改善保护，所述毒株无法精确预测以用于每年的疫苗生产，并提供保护抵御可能带来全球性大流行的新出现流感病毒株。

Description

含有经修饰腺病毒载体的流感疫苗
本申请要求2011年5月23日提交的序列号61/488,904的权益，并通过引用将其纳入。
该申请通过引用纳入2012年5月21日创建并命名为“00048600038sequencelisting.txt的”8.67kb文本文件的内容，其为用于本申请的序列表。
本发明引用的每个参考文献通过引用全文纳入本文。
发明背景
甲型流感病毒每年导致全球3～5百万人患严重疾病并与250,000～500,000例死亡相关。两个流感疫苗原型-用于肌内注射的三价灭活疫苗（TIV）和用于鼻内应用的减毒病毒（如
Figure BDA0000420036110000011
）可用于儿童和最高至49岁成年人的疫苗接种。只有TIV被批准用于50岁和更年长的个体。虽然对易感人群例如儿童和老年人强烈推荐流感疫苗，但流感疫苗仅提供有限的保护,如疫苗试验的统计分析所示。病毒表面蛋白是中和抗体的靶标和疫苗诱导保护的主要关联物，所述蛋白快速突变并在主要循环毒株间错配，且疫苗组分还会降低疫苗功效。不同毒株间的基因重配（re-assortment）可导致新毒株的出现，而且如果它们持续在人之间传播，会进而导致全球性大流行。这种大流行在极端情况下可导致上百万人死亡。对流感病毒的遗传修饰或重配病毒的选择在技术上是可行的，能开发潜在的高毒力病毒以用作生物武器。一旦分离并鉴定一种新流感病毒，可在约6～8个月内开发出基于所批准原型的疫苗。由于新流感病毒株在少于3个月的时间内就能从局部爆发传播到各地，这种新高毒力流感病毒大流行情况中的延迟会使上百万人丧失生命。
因此，仍然需要通用流感疫苗来提供基线保护抵御多种流感病毒，包括新出现毒株。
附图简要说明
图1.图中显示初次接种两周后抗M2e的抗体水平。C57BL/6小鼠（n=10,6-8周龄）用1010vp(病毒颗粒)的AdC68-3M2eNP（本图中的名称，在序列号61/488,904中称为AdC68M2e(3)NP）初次免疫。与异源加强载体组合，用10LD50的流感A/PR/8刺激后该方案提供80-90%存活率。平行注射相同剂量的具有和不具有转基因的衣壳修饰载体，产生显著提高的抗体应答。
图2.六邻体修饰的载体的构建物。流程图显示六邻体R1或R4修饰、缺失E1的AdC68载体的克隆。图上方显示缺失E1的AdC68分子克隆的完整序列，其包含用于切除六邻体编码基因的Mlu I位点。图下方从左到右显示了含有病毒六邻体的pcDNA3.1克隆，该六邻体包含用于向R1或R4插入M2e序列的位点；M2e的插入位点；以及六邻体修饰的分子克隆。
图3.在非还原的条件下从HEK293细胞中分离蛋白，该细胞被携带天然(AdC68-rab.gp)、R1-[AdC68-HxM2eS(R1)]或R4-[AdC68-HxM2eS(R4)]修饰六邻体的AdC68载体感染，并用抗六邻体的单克隆抗体通过蛋白质印迹分析。抗β肌动蛋白的单克隆抗体用作加样对照。
图4A-C.M2e的表达。用102或103vp载体/细胞感染HeLa细胞。24小时后，用M2e抗体（灰点）或阴性对照抗体（黑点）对细胞染色，然后用PE标记的二抗染色并用流式细胞术分析。直方图显示随着事件数的M2e表达水平。图4A，AdC68-HxM2eS(R1)；图4B,AdC68-HxM2eS(R4)；图4C,AdC68-rab.gp。
图4D.用不同量的表达3M2eNP融合蛋白（作为转基因产物的）的载体感染细胞，并用抗M2e的单克隆抗体通过蛋白质印迹分析融合蛋白的表达。抗β肌动蛋白的抗体用作加样对照。
图4E用纯化的AdC68载体包被板，该载体携带天然六邻体或在R1或R4中含有M2e的六邻体。封闭平板，用抗M2e的单克隆抗体处理，然后用碱性磷酸酶偶联抗体和底物孵育。用ELISA酶标仪测定颜色变化。图显示孔中底物的平均吸光度(±SD)，该孔中加入了不同稀释度的抗M2e的单克隆抗体。
图5.用在六邻体R1或R4中携带M2e的载体或具有天然六邻体的载体（AdC68-rab.gp）免疫小鼠。测试血清中具有原初六邻体的AdC68载体的中和情况，该六邻体表达增强的绿色荧光蛋白（EGFP）。图中通过六邻体修饰载体诱导的抗体显示了具有天然六邻体的AdC68的中和效价倒数。
图6A-B显示针对M2e的体液应答。图6A，使用M2e肽ELISA以测定ICR小鼠（n=10）血清中M2e特异性抗体效价。初次免疫5周后（黑色柱）或加强免疫5周后（白色柱）收集血清。图6B,使用细胞ELISA以测定接种疫苗的C57Bl/6小鼠(n=5)中的抗体。初次免疫2周后收集血清。图显示就单克隆M2e特异性抗体归一化的平均效价±SD。*P<0.05。
图7.初次免疫5周后或加强免疫5周后，通过四聚体染色评价血液中NP特异性CD8+T细胞频率。图中显示单独小鼠的NP特异性CD8+T细胞平均频率±SD。*P<0.05。
图8A-D显示测试抵抗A/PR8/34攻击的保护实验结果。C57Bl/6小鼠(n=5,图8A和图B)或ICR小鼠(n=10,图8C和图8D)用不同载体免疫两次。经AdC68-3M2eNP初次免疫的小鼠用AdC6-3M2eNP加强免疫。用AdC68-rab.gp免疫的对照小鼠用AdC6-rab.gp加强免疫。其它组的小鼠用与初次免疫相同的载体加强免疫。加强免疫2个月后用10LD50的A/PR8/34病毒攻击小鼠。图8A和图8C，图中显示攻击后的平均下降体重。图8B和8D，图中显示攻击后的存活率。
发明详述
本发明描述了抵抗流感病毒的强效通用疫苗，其提供了以下优点：用提供长达数年保护的疫苗取代每年的流感疫苗。另外，所述疫苗可提供抵抗循环流感毒株的经改善保护，该毒株无法精确预测以用于每年的疫苗生产。所述通用流感疫苗还可提供保护抵御可能会带来全球性大流行的新出现流感病毒株。
所述疫苗组合物基于衍生自黑猩猩的腺病毒（Ad）载体，例如AdC68（也称为Sad-V25）。人体中仅发现抗这些病毒的预存在中和抗体具有低效价。所述AdC载体在载体颗粒主要外壳蛋白即六邻体（其在AdC病毒表面上以740个拷贝存在）的易接近环上表达线性和保守的B细胞表位，优选基质蛋白胞外域表位（M2e）。B细胞最优选由在颗粒上重复表达并以有序方式表达的抗原所诱导。以该形式排列的抗原与B细胞受体交联，从而启动B细胞活化并能引发强效的抗体应答。可溶性抗原可活化B细胞，但认为这需要较高浓度的抗原并且所得抗体应答在其特异性和结合强度方面可能质量较低。
M2e可衍生自任何甲型流感毒株，包括但不限于：H1N1（如A/PuertoRico/8/1934;A/Fort Monmouth/1/1947）、H5N1（如A/Hong Kong/483/1997）、H7N2（如A/Duck/Tasmania/277/2007）、H1N2（如A/Swine/Korea/CY02/02）、H2N2（如A/Leningrad/134/17/57）、和H3N2（如A/New York/392/2004)。
在一些实施方式中，M2e插入六邻体蛋白。在一些实施方式中，M2e插入六邻体蛋白的高变区1（R1）。在一些实施方式中，示于SEQ ID NO:6的六邻体蛋白氨基酸142～144被删除，并在该位置插入M2e。在一些实施方式中，M2e插入六邻体蛋白的高变区4（R4）。在一些实施方式中，M2e插入示于SEQ ID NO:6的六邻体蛋白氨基酸253和254之间。可用标准的重组DNA方法删除六邻体蛋白的编码序列并在该删除位置插入M2e的编码序列。参见下述特定实施例。
因为AdC衣壳只在相对较短时间内可接近直至病毒进入细胞，此时六邻体被降解，在一些实施方式中，Ad载体还编码融合蛋白，包括额外的M2e表位，优选衍生自多至三种不同的甲型流感病毒株，其由置于AdC载体中已删除E1结构域内的表达盒以串联形式表达。表达盒的M2e抗原表达可有助于延长B细胞应答。抵抗甲型流感感染的保护水平可随CD8+T细胞针对流感病毒保守蛋白（例如腺病毒核蛋白（NP））的伴随活化而提高。因此，在一些实施方式中，AdC载体还编码NP，其表达为与M2e表位相连的融合蛋白。可使用标准重组核酸技术（例如下文实施例所述）来构建编码融合蛋白的核酸分子(核糖核酸或脱氧核糖核酸)。
在一些实施方式中，融合蛋白包括(1)来自第一甲型流感病毒株的第一基质蛋白胞外域(M2e1)；和(2)来自第二甲型流感病毒株的核蛋白（NP）。在一些实施方式中，融合蛋白还包含来自第二甲型流感病毒株的第二基质蛋白胞外域(M2e2)。在包含两个基质蛋白胞外域和一个核蛋白的实施方式中，三个组分中至少两个来自不同的甲型流感病毒株。在其它实施方式中，所有三个组分来自不同的甲型流感病毒株。两个（或三个）组分可任意排序。在一些实施方式中，融合蛋白的M2e组分衍生自与插入六邻体蛋白的M2e相同的甲型流感病毒株。在一些实施方式中，融合蛋白的M2e组分衍生自与插入六邻体蛋白的M2e不同的甲型流感病毒株。
在一些实施方式中，融合蛋白包含四个组分，所述组分衍生自至少两个不同甲型流感病毒株：(1)来自第一甲型流感病毒株的第一基质蛋白胞外域(M2e1)；(2)来自第二甲型流感病毒株的第二基质蛋白胞外域(M2e2)；(3)来自第三甲型流感病毒株的第三基质蛋白胞外域(M2e3)；以及(4)来自第四甲型流感病毒株的核蛋白（NP）。
可获得融合蛋白组分的合适甲型流感病毒包括：H1N1（如A/PuertoRico/8/1934;A/Fort Monmouth/1/1947）、H5N1（如A/Hong Kong/483/1997）、H7N2（如A/Duck/Tasmania/277/2007）、H1N2（如A/Swine/Korea/CY02/02）、H2N2（如A/Leningrad/134/17/57）、和H3N2（如A/New York/392/2004)。
在一些实施方式中，第一毒株是H1N1毒株。在一些这类实施方式中，H1N1毒株是A/Fort Monmouth/1/1947。在其它实施方式中，H1N1毒株是A/PuertoRico/8/1934。
在一些实施方式中，第一毒株是H5N1毒株。在一些这类实施方式中，H5N1毒株是A/Hong Kong/483/1997。
在一些实施方式中，第一毒株是H7N2毒株。在一些这类实施方式中，H7N2毒株是A/Duck/Tasmania/277/2007。
在一些实施方式中，第四毒株是H1N1毒株。在一些实施方式中，第一和第四毒株是H1N1毒株且可以相同或不同。在一些这类实施方式中，第一H1N1毒株是A/Fort Monmouth/1/1947。在其它实施方式中，第一H1N1毒株是A/PuertoRico/8/1934。
在一些实施方式中，四个组分从N至C末端排序为：M2e1—M2e2—M2e3—NP。在一些实施方式中，NP和M2e1来自A/Puerto Rico/8/1934；M2e1来自A/HongKong/483/1997；且M2e3来自A/Duck/Tasmania/277/2007。在其它实施方式中，来自三个毒株的M2e组分按H1N1—H5N1—H7N2排序。
在任何实施方式中，插入衣壳中的M2e可衍生自与第一毒株(例如H1N1,H7N2,H5N1,或H7N2)、第二毒株或第三毒株相同的毒株，或可从第四毒株获得。
在其它实施方式中，Ad载体编码融合蛋白但不包括修饰的六邻体蛋白。
已完善Ad载体的生成、纯化和质量控制方法（Tatsis和Ertl,MolTher10:616-29,2004）。Ad载体诱导先天免疫应答，缓解了添加佐剂的需求。它们也诱导极强的B细胞和CD8+T细胞应答，该应答由于载体低水平的持久性可显著维持（Tatsiset等，Blood110:1916-23,2007）。针对Ad病毒的普通人血清型（如血清型5）的预存在中和抗体会影响疫苗功效，这可通过使用来自其他物种例如黑猩猩的血清型（该血清型通常不在人类中传播，也不与人血清型交叉反应）容易地避免（Xiang等，Emerg Infect Dis12:1596-99,2006）。在需要初免-加强方案来实现足够效力的免疫应答的情况中，可使用基于不同Ad血清型的载体（Tatsis和Ertl,2004）。Ad病毒和Ad载体已广泛用于临床，其中所述病毒和载体良好耐受。它们可经多种途径施予，包括粘膜途径，如气道（Xiang等，J Virol77:10780-89,2003）或甚至在包封后口服，如美国军队使用的针对Ad病毒4和7的疫苗所示（Lyons等，Vaccine26:2890-98,2008）。
可使用标准技术配制免疫原性组合物，除上述腺病毒载体以外,所述组合物还可包括药学上可接受的载剂例如磷酸盐缓冲液盐水（PBS）或其它缓冲液，以及其它组分例如抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂、佐剂等。在一些实施方式中，该组合物是疫苗组合物并可与一种或更多种其它疫苗联合给予，所述其它疫苗包括其它流感疫苗（例如季节性疫苗）。在一些实施方式中，其它流感疫苗是基于肽的通用流感疫苗（例如美国专利7,354,589和美国专利7,527,798）。
可将所述免疫原性组合物和疫苗给予需要的个体，包括人、猪、狗、雪貂和其它哺乳动物，从而诱导针对衍生所述组分的毒株以外的甲型流感病毒株的免疫应答。在一些实施方式中，根据“初免－加强”方案给予，其中至少第二剂量（“加强”）疫苗在第一剂量的一段时间后（例如第一剂量后1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周或更久，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更久）提供。可用相同剂量或不同剂量加强免疫。在任何这些实施方式中，可给予相同的免疫原性组合物或不同的免疫原性组合物。例如，融合蛋白或修饰的六邻体蛋白可用于初次和加强免疫。在其它实施方式中，融合蛋白用于初次免疫，修饰的六邻体蛋白用于加强免疫。在其它实施方式中，修饰的六邻体蛋白用于初次免疫，融合蛋白用于加强免疫。在一些实施方式中，用修饰的六邻体蛋白和融合蛋白实施初次免疫，用修饰的六邻体蛋白或融合蛋白或两者实施加强免疫。
在一些实施方式中，给予包含经修饰六邻体蛋白和/或融合蛋白的Ad载体。所给予的一般病毒剂量范围为107～1011病毒颗粒（如107、5x107、108、5x108、109、5x109、1010、5x1010、1011）。在一些实施方式中，给予融合蛋白或编码该融合蛋白的核酸分子。
给予方法包括但不限于：粘膜（例如鼻内）、腹膜内、肌内、静脉内和口服给予。免疫应答可用本领域已知的合适方法评估，包括下述具体实施例中教导的那些。
本领域的技术人员应理解，对上述实施方式的许多变化和变换在所附权利要求的范围之内。
实施例1
载体的构建和体外筛选
1.1.载体的构建和质量控制
可用标准技术制备在病毒六邻体中携带M2e序列的AdC6和AdC68载体。用标准克隆方法和序列鉴定完成Ad六邻体的修饰，随后在E1中插入表达盒并用Southern印迹方法或测序确认。通过该分子可用的晶体结构引导将M2e表位置于AdC68六邻体中。AdC6属于相同血清型，但对于可变区，与AdC68具有较高程度的序列同源性，这能鉴定下文所示的R1（序列号61/488,904中称为“VR1”），比较了AdC6和AdC68的R1（序列号61/488,904称为“VR1”）六邻体序列和其侧翼区域。R1（序列号61/488,904中称为“Vr1”）用粗体表示，AdC68六邻体中的插入位点用下划线表示。
AdC68(SEQ ID NO:1)
YNSLAPKGAPNTCQWTYKADGETATEKTYTYGNAPVQGINITKDGIQLGTD
AdC6(SEQ ID NO:2)
YNSLAPKGAPNSSQWEQAKTGNGGTMETHTYGVAPMGGENITKDGLQIGTD
该分子病毒克隆可在HEK293细胞上拯救。一旦可观察到病毒空斑（一般5～14天后），收集细胞并通过冻融释放病毒。然后病毒可在HEK293细胞中增殖数代。产生大规模母液后（40～50个T75烧瓶），病毒可纯化、滴定并进行质量控制。
1.1.2.纯化
Ad载体可通过两轮CsCl梯度的浮力密度超离心进行纯化，随后进行柱纯化（Bio-Gel P-6DG），之后用补充有10％甘油的PBS稀释并在–80oC下保存。
1.1.3.滴定
病毒颗粒（vp）含量可通过分光光度计在260nm和280nm检测，后者检测制品的纯度。病毒滴度(vp/ml)可用以下公式测定：OD260x稀释度x1.1x1012。FDA要求根据测定载体毒性的vp给予腺病毒载体。另一方面载体免疫原性取决于能感染细胞并转录转基因产物的病毒颗粒数。通常，通过采用琼脂糖涂覆的空斑试验或终点稀释试验（测定细胞病变效应）测定感染性病毒颗粒数。两种实验都能在反式提供E1的细胞系中实施。空斑形成取决于病毒因子数而不能可靠地反映细胞系和缺失E1的AdC载体间的相互关系。
可采用两个替代性实验来测定腺病毒批次的感染性。用标准空斑实验检测实验有效性，两个实验都显示出相同的敏感性。该实验的一种形式中，通过以下方式测定感染性病毒颗粒含量：用转基因或Ad（六邻体）特异性引物对分离自HEK293细胞的RNA进行嵌套式RT-PCR，该细胞用连续稀释的载体感染5～7天。纳入控制实验的标准。该实验针对所有AdC载体。
在第二个实验中，用不同浓度的载体对HEK293细胞感染7天，然后用抗六邻体保守区域的抗体染色，并用经碱性磷酸酶标记的二抗复染。该实验用于检测具有未修饰六邻体的Ad载体。不适于检测具有R1（序列号61/488,904中称为“VR1”）修饰六邻体的Ad载体。
在其它实施方式中，用抗M2e的单克隆抗体染色以检测M2e修饰载体的六邻体。用不同浓度的M2e六邻体修饰载体感染HEK293细胞。根据上文所示完成实验，但用抗M2e的单克隆抗体取代抗六邻体的抗体。
1.1.4.常规质量控制（QC）
载体可在就动物试验进行释放前接受一系列质量控制。可在A549细胞上检测载体批次的复制型Ad（RCA）。由于HEK293细胞和载体间的重叠病毒序列发生重组，复制型腺病毒（RCA）会在HEK293细胞中E1缺失复制缺陷型Ad载体的创建及增殖期间出现。根据载体制备中的RCA水平，其会显著影响体内实验的载体性能、宿主免疫应答和毒性概况。因此，对于Ad载体的基因转移和基于病毒的疫苗应用而言，鉴定载体制备是否存在高水平RCA污染尤其重要。
简而言之，用2x109、2x1010和2x1011vp的载体处理6孔板中的细胞。对照孔用10或50空斑形成单位（pfu）的相应野生型Ad病毒感染。第三组孔中，加入具有感染病毒（1,10,和100pfu）的复制缺陷型载体（2x1011vp）以确保形成不受到所用载体空斑剂量的抑制。细胞可用琼脂糖覆盖。4天和8天后读板。RCA通常污染在HEK293细胞中生长的缺失E1的人血清型5Ad(AdHu5)载体，但由于E1侧翼区域的序列差异，用AdHu5的E1反式补充的E1缺失AdC载体没有检测到。
可测试批次以检测和定量测定测试物中的革兰氏阴性菌内毒素水平。例如，可使用鲎变形细胞裂解物(LAL)凝胶法和市售试剂盒进行。可设置用于大型动物实验的载体批次释放标准，例如<5内毒素单元(EU)/kg动物体重，其为FDA的人设置参数。
也可评价载体无菌性。该实验目的是通过接种/扩增和平板接种方法测试Ad载体制品的无菌性。简而言之，先接种对照和测试制品，并在LB培养基中过夜搅拌培养。然后将培养物接种于LV琼脂平板上孵育48小时以检测细菌克隆的形成和真菌生长。对照可以是连续稀释并在相同条件下培养的菌株DH5α。
大规模载体批次的遗传完整性和和特性可通过病毒DNA分离评估。用一组限制性酶（与分子克隆平行）消化重组DNA并用凝胶电泳分析。因为所述载体通过构建分子克隆并在HEK293细胞中拯救/扩增而产生，用于产生分子克隆的原始分子克隆和穿梭质粒可在有提取自载体制剂的病毒DNA的并行限制性消化中使用从而通过溴化乙啶染色琼脂糖凝胶电泳来比较标签带型。另外，分析可包括不含转基因盒的载体骨架的分子克隆。通常选择至少两组限制性酶用于分析。一组聚焦于检测转基因盒的存在和完整性；另一组重点在载体骨架。载体遗传稳定性可在HEK293细胞中连续传代12～15代后通过Southern印迹测试。
可在用1,000和10,000vp/细胞的新载体感染CHO细胞后通过蛋白质印迹或免疫沉淀测试转基因产物的表达，所述CHO细胞稳定转染从而表达柯萨奇腺病毒受体(CHO-CAR)。用相同剂量的表达不相关转基因产物的Ad载体感染对照细胞。用抗M2e的单克隆抗体通过纯化病毒的蛋白质印迹测定修饰的六邻体表达。可建立早期传代主病毒库（40瓶各0.5ml+10瓶0.1ml），并从该库获得载体。该主病毒库耗尽后，可从分子克隆中重新获得感染性Ad载体来建立新的主病毒库。遗传稳定性可通过连续扩增（15）载体然后Southern印迹测试以确保载体未经重组。
1.1.5.释放标准
大规模载体制备的产率通常>每批次1013vp（约108个HEK细胞）。AdC载体的Vp与感染单位之比通常高于人血清型Ad载体，通常范围为1:20～1:200，但最高>1:400。
实施例2
载体在幼鼠中的免疫原性和效力
在年幼（6～8周龄）的C57Bl/6小鼠组（组规模：每组8只小鼠）中评价免疫原性。不具有六邻体修饰的原型AdC68-3M2eNP和AdC6-3M2eNP载体（序列号61/488,904中分别称为“AdC68M2e(3)NP和AdC6M2e(3)NP载体”）已被广泛测试并用于比较。
2.1.原初小鼠中的免疫原性
在剂量递增实验中测试4种载体，即有和没有六邻体修饰的AdC68-3M2eNP和AdC6-3M2eNP（序列号61/488,904中分别称为“AdC68M2e(3)NP和AdC6M2e(3)NP载体），其中对8只幼鼠经肌内注射108、109或1010vp的载体。表达不相关抗原（即狂犬病病毒糖蛋白）的载体用作阴性对照。小鼠在免疫后2、4、8周取血。
分离外周血单核细胞(PBMC)并采用对NP免疫优势表位特异的I类MHC四聚体染色来测试NP-特异性CD8+T细胞的频率。免疫接种三个月后对小鼠实施安乐死。通过以下方法就NP特异性T细胞频率测试从血液、脾脏和肺中分离的淋巴细胞群：在布雷菲德菌素存在下用携带免疫优势I类MHC结合表位的NP肽刺激细胞，然后进行胞内细胞因子染色。具体地，测试细胞中IFN-γ、IL-2、TNF-α、MIP-1α和穿孔蛋白的产生。胞内染色前，对细胞表面染色CD3、CD8、CD4、CD44和CD62L。染色细胞用BD稳定固定剂（BD Stabilizing Fixative）（BD生物科技公司（BD Biosciences），加利福尼亚州圣何塞）固定，并通过FACS用LSRII台式流式细胞仪（BD生物科技公司，加利福尼亚州圣何塞）和FACSDIVATM软件分析。在至少100,000事件中进行样品的流式细胞术采集和分析。用FlowJo(树星公司（TreeStar），俄勒冈州艾士兰)做采集后分析。有BDTMCompBeads抗小鼠Igκ（BD生物科技公司，加利福尼亚州圣何塞）的单色控制用做补偿。
通过在包被有M2e肽的平板和包被有经全长M2转染细胞或假转染细胞的平板上进行ELISA来测试血浆中抗M2e的抗体。为进一步定量分析B细胞应答，测试分离自脾脏和骨髓的细胞中的抗体分泌细胞（ASC）。96孔板（
Figure BDA0000420036110000101
膜;MAIPN4510;密理博（Millipore），马塞诸塞州比尔瑞卡）用溶于磷酸盐缓冲盐水的10μg/ml浓度M2e肽在4℃包被过夜，以检测M2e特异性ASC，或用溶于PBS的4μg/ml浓度的亲和纯化羊抗人免疫球蛋白A（IgA）加gG和IgM（H+L;KP公司（Kirkegaard&Perry），马里兰州盖瑟斯堡）包被以测定ASC的总频率。用PBS包被的平板作为阴性对照。平板在4℃下孵育过夜，并用补充有10%胎牛血清的RPMI1640培养基37℃封闭2小时。在补充有10%FBS和0.5μg/ml磷酸盐偶联羊抗人IgG(H+L)抗体的RPMI培养基中重悬PBMC。以2x105细胞/孔向平板加入细胞。在37℃下孵育过夜。次日清洗平板并用碱性磷酸酶底物处理。通过自动ELISpot读板仪计数斑点来测定每孔的ASC数。数据按每106个细胞的斑点记录。M2e特异性ASC记录为分泌抗任一甲型流感病毒株的抗体的细胞相对分泌Ig的细胞的百分数。
根据Crotty等(17)所述进行ELISpot实验来测试记忆B细胞。将PBMC以5×105细胞/孔接种在补充有伴刀豆球蛋白提取物、6μg/ml CpG寡核苷酸ODN-2006（英维杰公司（Invivogen），加利福尼亚州圣地亚哥）和1/10,000稀释的固定金黄色葡萄球菌Cowan（西格玛公司（Sigma））的培养基内。对照孔不加入促分裂原。细胞培养5天，然后根据上文所述用ELISpot实验测试分泌IgG的B细胞和M2e特异性、分泌IgG的B细胞。从促分裂原刺激的孔的斑点中减去含对照细胞的孔的斑点。根据上文所述记录其它数据并做质量控制。在实施安乐死时收集血浆，再用肽ELISA测试抗M2e的抗体。测定抗体的同种型。通过
Figure BDA0000420036110000111
亲和测试分析抗体质量。测试血浆中针对野生型Ad载体和六邻体修饰Ad载体的中和抗体。
2.2初免加强方案的免疫原性
为选择两组载体（即具有或不具有六邻体修饰）中更强的免疫原性，通过以下方式进行初免加强方案：用AdC68初次免疫然后AdC6加强免疫以及AdC6初次免疫然后AdC68加强免疫的相反方案。表达狂犬病糖蛋白的AdC载体作用阴性对照。用108～1010vp的载体经肌内对小鼠初次免疫；两个月后用异源载体对它们进行加强免疫。根据2.1所述评价免疫应答。
2.3经历过流感病毒的小鼠的免疫原性
在多数成人中，流感疫苗接种引发大量针对更保守抗原的B细胞和T细胞回忆应答，其由之前的感染或疫苗接种所诱导。由于次级应答相比初始应答遵循不同规则且一般能由较低剂量抗原引发，根据上述方法（只使用其中一个方案，即先用AdC68再用AdC6或其相反方案）在小鼠中进行初免加强，该小鼠在6周龄时接受105TCID50的流感病毒A/X31（一种小鼠减毒H3N2株，只引起上呼吸道感染因此不会导致疾病）免疫接种。两个月后用AdC疫苗对它们进行初次免疫，随后用异源AdC载体进行加强免疫。根据2.2的结果选择载体剂量以及初次和加强免疫的间隔。根据2.1所述监控免疫应答。
2.4幼鼠中的疫苗效力
单一剂量疫苗的保护。在以下两个鼠品系中进行这些测试：C57Bl/6小鼠，能测试T和B细胞应答；和ICR小鼠，经杂交后不能测试CD8+T细胞应答但提供更实际的人用模型。小鼠经肌内免疫接种。在原初小鼠和用A/X31预感染的小鼠中测试单次免疫方案，并测定保护持续时间。攻击使用异源H1N1病毒-甲型流感病毒Mammoth Fort Worth，(A/FM)，其已在小鼠中滴定测定了平均致死剂量。攻击病毒的量可变。在初始实验中以10LD50使用病毒。若得到针对该剂量的保护，可将攻击剂量提高至1000LD50以测定保护的稳健性。通过测量体重下降和伦理性（一旦减少其原始体重的30％就对幼仔实施安乐死）以及氧饱和度在攻击后3、5和7天评价保护。攻击后4天和7天测定肺病毒滴度。同时评价肺叶组织学情况以测定病理程度。
初免－加强的保护。用不同浓度的所选AdC载体以2个月间隔对小鼠经肌内免疫接种。后续实验中该间隔变为4～6个月。一组在接种疫苗2个月后用10LD50流感病毒A/FM攻击；另一组在接种疫苗8个月后攻击。接种疫苗后，测定抗M2e的抗体效价和NP特异性CD8+T细胞的频率。检测重量下降和伦理性。若保护到达两个时间点（即至少80％接种过疫苗的小鼠存活，同时至少80％对照小鼠死亡），以接种疫苗8个月后进行攻击的方式重复测试。
攻击后第4和7天对小鼠实施安乐死，并通过以下方式测定肺病毒滴度：在MDCK细胞中滴定肺匀浆上清液，然后根据Rowe等，J Clin Microbiol.37:937-43,1999所述进行血凝实验。一个肺切片用于组化分析。用PBS灌注肺并用200μL的10%福尔马林溶液通过30g针头使其温和膨胀。将一个膨胀的肺叶在10％福尔马林中4℃浸没24小时以用于固定组织。经福尔马林固定的肺样品用石蜡包埋并以4μm切片以安装在显微镜载玻片上。用H&E对切片染色，检测每个肺的两个切片。由对样品来源不知情的研究人员检测组织病理学变化。按照下述方法对肺病理学情况打分：1–无病变；2–血管周围浸润；3–影响＜20％肺叶的血管周围和间质浸润；4–影响＜20-50％肺叶的血管周围和间质浸润；5–影响＞50％肺叶的血管周围和间质浸润。在年幼ICR小鼠中测试诱导C57Bl/6小鼠内保护的方案（与阳性和阴性对照载体一起）以确保能在杂交小鼠中实现保护。
A/X31预接触小鼠的保护
由于先前的感染/疫苗接种，多数人有用流感病毒的免疫经历。为评价预接触A/X31对疫苗功效的影响，用1000TCID50的该病毒鼻内感染ICR小鼠；然后用包括对照载体的单次剂量方案对其免疫接种，并用高剂量A/FM病毒攻击小鼠。通过测量体重下降、存活率和氧饱和度评价保护。
年老小鼠中的免疫原性和功效。流感在年长者中的致死性不均一，这缘于其免疫系统的总体损伤不能产生足够的应答。不幸的是，可用的流感疫苗也在年长者中显示功效有限。在19～21月龄的年老C57Bl/6小鼠中测试疫苗方案。为模拟人体中活流感病毒的预接触，用低剂量（1000TCID50)的A/X31(H3N2)病毒感染8～9月龄的C57Bl/6小鼠。在一些实施方式中，在19月龄时对小鼠初次免疫，在21月龄时加强免疫，在23或25月龄时攻击小鼠。如上所述对每组10只小鼠进行免疫原性研究，刺激实验用每组20只小鼠。用低剂量A/FM攻击病毒(3LD50)进行初始测试。在一些实施方式中逐渐递增攻击病毒剂量(10,100,1000LD50)。
实施例3
大型动物中的疫苗效力
雪貂对人流感毒株高度易感，并被视为合适的流感病毒感染预临床模型。其它模型是非人的灵长类攻击模型。使用当代H1N1病毒的雪貂实验以生物安全水平2使用；用于攻击非人类灵长类的病毒是高度致病性H5N1病毒，以生物安全水平3+进行，所述生物安全水平经CDC和USDA批准。
3.1.雪貂模型
根据上述方式对年幼雪貂(n=6)接种疫苗。对另外6只对照动物接种表达狂犬病毒糖蛋白的AdC载体。以1010vpi.m给予疫苗。初免－加强方案的情况中，对动物进行初次和加强免疫。根据小鼠实验的结果确定初次和加强免疫之间的时间。以2周的间隔监控血清中抗M2e的抗体。作为阳性对照，在初次免疫其它动物同时，对额外6只雪貂接种1/10人剂量的季节性流感疫苗(TIV)。给予最终AdC疫苗剂量2个月后，用2009H1N1病毒攻击雪貂，这会在该种类中引起疾病但不致死。攻击后，监控雪貂疾病情况（发热，体重下降）。在攻击后第5和7天从支气管灌洗液中测定病毒滴度，用血清测定对M2e和攻击病毒的抗体应答。
3.2非人类灵长类模型
先对印度来源的猕猴（每组6只）测试抗疫苗载体的中和抗体。只有缺乏该抗体的动物可纳入实验。用1011vp的AdC疫苗（表达流感病毒抗原或狂犬病毒糖蛋白）对动物接种。如果小鼠实验显示用异源载体可提高疫苗效力，则对它们进行加强免疫。根据小鼠实验的结果确定初次和加强免疫之间的时间。将另外6只动物纳入实验并在实验动物初次免疫同时接种人剂量的当代流感疫苗（TIV）。用A/Vietnam/1203/2004(H5N1)株攻击所有动物，以浓度为1x10650%的蛋感染剂量气管内给予镇静动物。一天两次监控体重、温度和食物摄入，在第2、4、6和8天从气管灌洗液中测定病毒滴度。在动物发展出必需实施安乐死的症状时，从HE染色肺切片中评价组织病理学情况。
接种疫苗并在攻击后第5天和第10天如下评价免疫应答。在各疫苗剂量后第0、7、21、42和84天采集血液。就抗M2e的抗体测试血清。通过微中和实验监控来自阳性对照动物的血清中抗相应毒株的抗体。通过ELISpot测试第0天和第7天收集的PBMC中的M2e特异性抗体分泌细胞。根据下文用ICS测试在其它时间点（接种疫苗前）所采集PBMC中针对NP的T细胞应答。用NP肽库刺激PBMC（以每毫升各2μg肽的浓度使用重叠10个氨基酸的15聚体肽）。对细胞初始冷冻，从而可平行进行各单独动物的实验。解冻冷冻细胞并立即用补充有2单位/ml DNase I的HBSS清洗，重悬于RPMI培养基并用抗CD28(克隆CD28.2)、抗CD49d(克隆9F10)和Brefeldin A.14刺激6小时。用紫色荧光活性染料太平洋蓝(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)、抗CD14太平洋蓝(克隆M5E2),、抗CD16太平洋蓝(克隆3G8),、抗CD8-APC-H7(克隆SK1)、抗CD4-Alexa700(克隆OKT4)、抗CD95-PE-Cy5(克隆DX2)、和抗CD28-德克萨斯红(克隆CD28.2，贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter），加州富勒敦)在4℃下染色细胞30分钟。另外，用抗CCR7-PE(克隆150503)对细胞染色（冷冻细胞）。
用
Figure BDA0000420036110000141
(BD生物科技公司，加州圣何塞)在4℃固定并透化30分钟后，细胞用抗IFN-γ-APC(克隆B27)、抗IL-2-FITC(克隆MQ1-17H12)、抗TNF-α-PE-Cy7(克隆MAb11,安迪生物（R&D System）)和抗CD3-PerCp-Cy5.5(克隆SP34-2)在4℃染色30分钟。对细胞清洗两次，用BD稳定固定剂（BD生物科技公司，加州圣何塞）固定然后用LSR II台式流式细胞仪(BD生物科技公司，加州圣何塞)和FACSDIVATM软件通过FACS分析。在至少400,000事件中进行样品的流式细胞术采集和分析。用FlowJo(树星公司（TreeStar），俄勒冈州艾士兰)做采集后分析。病毒感染后第10天测试攻击后的血清中抗攻击病毒的中和抗体。
实施例4
实施例5～9的材料和方法
1.构建六邻体修饰的AdC6载体
如下生成表达六邻体中M2e肽的AdC68载体：从AdC68的E1缺失病毒分子克隆中释放编码大部分六邻体序列并侧接有MluI的片段，克隆到pcDNA3.1载体（英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德）中。删除六邻体残基142～144（ETA）后，将编码LTEVETPIRNEWG(SEQ ID NO:3)的A/PR8/34病毒的M2e序列部分克隆到六邻体的R1中。为了产生R4修饰载体，在六邻体残基253和254之间插入相同的M2e序列。
通过测序鉴定编码碱基对的M2e的正确插入后，从pcDNA3.1载体切除六邻体序列并克隆回病毒分子克隆。对于相同载体，将含有上述3M2eNP序列（42）的表达盒在CMV早期启动子的控制下置入E1中。使用重组病毒分子克隆在HEK293细胞中拯救病毒。病毒在HEK293细胞中扩增，通过氯化铯密度梯度离心纯化并用分光光度法在260nm测定病毒颗粒(vp)含量。用基于PCR的方法滴定载体从而测定感染单位（IU）。
表1列出了本说明书全文所用的新载体和名称以及相关生长特性例如每108HEK293细胞的产率及vp与IU之比。其它Ad载体例如C68-rab.gp载体，表达GFP的Ad载体或表达3M2eNP融合蛋白的AdC载体已在上文中描述（37，38）
或用上文所述克隆技术产生（43）。
表1
2.AdC68修饰六邻体的结构建模
AdC68,AdC68-HxM2eS(R1)和AdC68-HxM2eS(R4)六邻体模型通过使用瑞士模型服务器（Swiss-Model server）(http网址,swissmodel.expasy.org/)产生。使用PyMOL V1.3(俄勒冈州波特兰的薛定谔公司（
Figure BDA0000420036110000161
），http网址,pymol.org)生成AdC68六邻体结构的定制3D图像。
3.M2e在病毒六邻体中的表达
用Ad载体以102～103vp/细胞感染HeLa细胞。感染24小时后，收集细胞并用抗M2e的单克隆抗体（14C2-S1-4.2）染色。用PBS清洗后，用PE标记的羊抗鼠二抗(西格玛公司，纽约州朗肯科玛)孵育细胞。然后通过流式细胞仪测定细胞中的M2e表达。
作为测定六邻体上M2e表达的替代方法，用含有1010vp Ad载体/孔的100μl包被缓冲液（15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,和3mM NaN3,pH9.6）在4oC下过夜包被Nunc96孔板。平板用含有5%BSA的PBS在室温下封闭1小时。然后用连续稀释的M2e单克隆抗体（14C2-S1-4.2）在室温下处理平板1小时，接着用碱性磷酸酶偶联羊抗鼠免疫球蛋白和之后的底物孵育。
4.鉴定编码的转基因产物
为鉴定3M2eNP融合蛋白的存在，制备被病毒感染的HEK293细胞裂解物，通过凝胶电泳分离蛋白并转到膜上，然后用抗M2e的单克隆抗体（14C2-S1-4.2）印迹。
5.流感病毒
流感病毒A/PR/8/34在胚胎鸡蛋的尿囊液中生长，并在鼻内感染后在成年小鼠中滴定以测定平均致死剂量（LD50）。
6.小鼠
从ACE动物公司（ACE Animals）（宾西法尼亚州波伊尔）购买6～8周龄的雌性C57Bl/6和ICR小鼠。本发明所报道的全部动物实验都基于批准的机构方案。
7.小鼠的免疫接种
向含有5～10只小鼠的组经肌内接种总共1×1010vp的Ad载体。两个月后，用相同或异源载体以相同剂量对一些组的小鼠经肌内加强免疫。
8.针对M2e的抗体应答。
用之前公开的方法（23）通过M2e肽ELISA测定单独小鼠的血清中对M2e特异的抗体应答。简而言之，由Cys-(Gly-Lys)3-Ala骨架(CGKGKGKA;SEQ IDNO:4)组成的多抗原性肽与两个结合的M2e(2–24)肽一起用于包被Nunc96孔板（赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific），纽约罗切斯特）的孔，这是通过在0.02M NaCl中4oC过夜孵育85nM50μl肽稀释物。用含有5%BSA的PBS封闭平板2～18小时。清洗后，用溶于PBS+5%BSA的连续稀释物孵育平板1小时，随后用碱性磷酸酶偶联羊抗鼠免疫球蛋白（卡佩尔公司（Cappel），美国加利福尼亚州爱尔文）的1:200稀释物在室温下孵育1小时。清洗后，平板用底物（溶于10ml1mM MgCl2,3mM NaN3和0.9M二乙醇胺的10mg d-硝基苯磷酸二钠盐，pH9.8）孵育20分钟，然后用自动ELISA酶标仪在405nm读数。用抗M2e的单克隆抗体(14C2-S1-4.2)对实验标准化。
通过上述细胞ELISA（42）测定抗体效价。简而言之，用表达A/PR8/34病毒全长M2序列的慢病毒感染293T细胞以产生稳定的M2+细胞系。通过用空的慢病毒感染293T细胞来产生对照细胞系。根据（42）所述，这些细胞系用作酶联免疫吸附实验中的免疫吸附物。用14C2-S1-4.2抗体对实验标准化。
9.针对Ad载体的抗体应答
根据上文(37)所述，在HEK293细胞中测定Ad特异性中和效价，该HEK293细胞用表达EGFP的AdC68载体(AdC68-EGFP)感染。简而言之，选择24小时内引起70％～90%细胞表达EGFP的AdC68EGFP（有或没有六邻体修饰）剂量。经1×1010vp载体接种的小鼠的血清在接种5周后收集，并在55oC下灭活30分钟。然后将连续稀释的血清与合适剂量的AdC68EGFP混合并在室温下孵育60分钟。载体-血清混合物与等体积的HEK293细胞以106细胞/ml混合，该混合物转移至平底96孔板内。将平板在37℃下孵育过夜，然后在UV显微镜下肉眼筛选绿色荧光细胞。效价测定为相比仅用载体感染的对照孔所见引起50％荧光细胞减少的血清稀释度的倒数。
10.T细胞的四聚体染色
TCF公司（Tetramer Core Facility）(艾莫利大学（Emory University），佐治亚州亚特兰大)提供与APC偶联的I类MHC NP肽四聚体(ASNENTETM;SEQ IDNO:5)。淋巴细胞用NP四聚体、PerCP-Cy5.5标记的抗CD8抗体以及活细胞染料（两者都来自加州圣何塞的BD生物科技公司）在4℃染色30分钟。对至少500,000个事件进行样品的流式细胞术采集和分析。用FlowJo7.1.1(树星公司（TreeStar），俄勒冈州艾士兰)处理采集后数据。
11.流感病毒攻击
疫苗接种2个月后，麻醉小鼠然后用10LD50的稀释于30μl磷酸盐缓冲盐水的流感A/PR/8/34病毒经鼻内攻击小鼠。攻击后每天监控小鼠体重下降和存活率。一旦体重下降超过攻击前体重的30％，对小鼠实施安乐死。
12.统计学分析。
用ELISA和中和试验一式两份测试来自单独小鼠的样品。对来自单独小鼠的淋巴细胞进行四聚体染色。通过方差分析测定不同组的均值对比。使用菲希尔精确检验（Fisher’s exact test）测定接种疫苗组的保护相较对照组的统计学显著性。P≤0.05的数据视为具有统计学显著差异。
实施例5
构建六邻体修饰的AdC68载体。
如图2所示，通过直接将M2e序列克隆到病毒分子克隆区段中来修饰六邻体。简而言之，用Mlu I消化AdC68分子克隆，释放含有大部分六邻体序列的5.1kb片段。将片段连接到pcDNA3.1的Mlu I位点，产生pcDNA3.1-MM质粒。含有六邻体Cla I位点的5′寡核苷酸和之后的相邻六邻体序列及六邻体142-144位点中的M2e序列；以及含有六邻体Nde I位点的3′引物用于扩增片段，该片段随后用Cla I和Nde I切割并克隆到pcDNA3.1-MM相应位点，产生在六邻体R1中含有M2e的质粒。为构建R4修饰六邻体，含有六邻体Nde I位点的5′寡核苷酸和之后的六邻体253至254位点中的M2e以及含有Sca I位点的3′寡核苷酸和pcDNA3相邻序列用于扩增pcDNA3.1-MM片段。用Nde I和Sca I切割扩增子并克隆到pcDNA3.1-MM相应位点产生六邻体R4中含有M2e的质粒。对部分载体测序以确保M2e序列的插入。然后用Mlu I将六邻体序列克隆回病毒分子克隆。新载体基因组用Southern印迹分析以确保序列的正确插入。
实施例6
M2e修饰的AdC68六邻体的结构建模
天然结构的AdC68六邻体形成有可变环的三聚体，该可变环由分子顶部展示的R1～R5编码。为评估M2e插入六邻体R1或R4的影响，我们构建了野生型AdC68六邻体的结构，其已通过X射线晶体学（39）相较M2e修饰的六邻体进行深度表征。结构建模预测天然六邻体和含有R1M2e插入的六邻体将形成三聚体，而预测R4中插入M2e会破坏结构并阻碍六邻体三聚化。
为进一步评价结构预测的可靠性，我们在非还原条件下从AdC68（有和没有六邻体修饰）感染细胞中分离六邻体，并用Ad六邻体特异性抗体进行了蛋白质印迹。如图3所示，大部分天然六邻体例如上述AdC68ab.gp载体（携带天然六邻体）所示或R1修饰的六邻体形成三聚体，仅分离到小部分的单体或二聚体形式。另一方面，具有R4修饰的六邻体分子仅仅分离到单体形式，出乎意料且感兴趣地是它们没有阻碍载体在HEK293细胞中扩增（表1）。
实施例7
M2e在六邻体中的表达
我们用三种方法测定M2e表达，该M2e由六邻体表达或由转基因编码，其也含有NP。第一种方法中，用不同量的Ad载体感染细胞然后用抗M2e的抗体和抗小鼠免疫球蛋白的PE标记二抗染色。用流式细胞术分析细胞。该方法仅检测在细胞表面表达的M2e，因此有利于检测由六邻体携带的M2e而非转基因产物上呈现的M2e，这是由于细胞分泌信号序列。如图4A所示，M2e能在AdC68-HxM2eS(R1)转导的细胞表面上检测，经AdC68-HxM2eS(R4)感染的细胞上的水平显著较低，但仍高于用对照载体感染的细胞的水平。由含有天然六邻体的AdC68-3M2eNP载体转导的细胞没有用抗体染色。
为进一步在病毒颗粒上定量M2e表达，我们在平板上实施ELISA，该平板用六邻体修饰的或天然六邻体AdC68载体包被，用抗M2e的单克隆抗体探测该平板。如图4B所示，M2e抗体对R1修饰的载体衣壳表现出较高的反应活性，但对R4修饰的衣壳表现相对较低的活性，因此证实了流式细胞术获得的结果。M2e抗体与R1修饰六邻体的较高结合说明R1编码的环更易接近抗体，这与以下发现一致：该区域含有AdC68的主要中和B细胞表位（25）。
为评价转基因产物表达，用表达3M2eNP融合蛋白的Ad载体（有或没有六邻体修饰）感染细胞。次日，通过蛋白质印迹用M2e抗体测试细胞裂解物。如图4C所示，载体表达相同量的M2e抗体结合蛋白，该蛋白具有预测尺寸的转基因产物。
实施例8
六邻体R1修饰逃离抗天然AdC68的抗体的中和
为测试R1或R4六邻体修饰是否扰乱结合抗天然六邻体的中和抗体，对小鼠免疫接种表达天然或M2e修饰六邻体的AdC68载体。然后测试小鼠血清中表达天然六邻体的AdC68载体的中和情况。如图5A所示，用表达天然六邻体的AdC68载体(AdC68-rab.gp)或表达修饰R4六邻体的AdC68载体免疫的小鼠血清易中和野生型AdC68病毒，但用R1六邻体修饰载体免疫的小鼠血清中和同源载体但不中和含有天然六邻体的载体。
在第二组实验中，我们测试了用表达天然六邻体的AdC68载体免疫的小鼠血清中六邻体修饰载体的中和情况。血清显示，当用表达天然或R4修饰六邻体的AdC68载体探测时效价相同，但不能中和含有R1六邻体修饰的AdC68载体。这些结果证实我们之前的实验（25），其鉴定了由R1编码的序列作为中和抗体与该病毒的结合位点。
实施例9
M2e特异性抗体应答
用1×1010vp重组AdC68载体接种各组ICR小鼠，2个月后用相同载体相同剂量加强免疫。为进行比较，用相同剂量AdC68-3M2eNP接种小鼠；这些小鼠用表达相同转基因产物的异源AdC6载体加强免疫。异源载体用来防止初次免疫后由载体特异性中和抗体诱导的回忆应答的钝化。初次和加强免疫5周后分别从单独小鼠中收集血清。用表达狂犬病毒糖蛋白的载体免疫的小鼠血清作为对照。通过肽ELISA测试血清中抗M2e的抗体。参见图6A.
在六邻体中或是从转基因产物表达M2e的所有载体诱导抗M2e的抗体。用R1六邻体修饰载体免疫后的应答高于用在R4中或作为转基因表达M2e的载体免疫后的应答。用R1六邻体修饰载体免疫的小鼠在加强免疫后抗体效价显著提高，而用R4六邻体修饰载体免疫的小鼠中小幅提高。用AdC68-HxM2eS(R1)载体免疫两次相比异源AdC68-3M2eNP/AdC6-3M2eNP疫苗方案产生更高的针对M2e肽的抗体应答。如我们所预料，在转基因产物中M2e的存在提高了针对M2e的抗体应答。为确保该疫苗可在不同遗传学鼠系中诱导应答，用相同疫苗方案测试杂交C57Bl/6小鼠；结果相似。
抗M2e肽的抗体不必定结合由流感病毒表达或在流感病毒感染细胞上表达的天然M2e（23）。因此我们还在细胞ELISA中就抗体测试C57Bl/6小鼠血清，该小鼠用1010vp的AdC68-3M2eNP、AdC68-HxM2eS(R1)或AdC68-3M2eNP-HxM2eS(R1)免疫接种，这可以更可靠地检测抗六邻体中表达的抗M2e抗体。参见图6B。AdC68-3M2eNP载体仅诱导＜每毫升血清2μg M2e特异性抗体的边际抗体应答。相比之下，R1六邻体修饰载体诱导约10μg/ml的效价。由M2e R1六邻体修饰载体共同表达的3M2eNP融合蛋白不能提高抗体应答。
实施例10
NP-特异性CD8+T细胞应答
用AdC68-3M2eNP-HxM2eS(R1)或AdC68-3M2eNP-HxM2eS(R4)载体接种C57Bl/6小鼠后的不同时间点，通过血液测试针对NP的CD8+T细胞应答。初次免疫后，所有小鼠发展出可检测频率的NP-特异性CD8+T细胞，这与之前就六邻体未修饰AdC68-3M2eNP载体(42)免疫小鼠所报道的情况相当。初次免疫2个月后用相同载体加强免疫未能提高循环的NP-特异性CD8+T细胞频率，这说明抗疫苗运载体的抗体削弱了载体的摄入并因此减少转基因产物的表达。参见图7。
实施例11
抵御A/PR8/34攻击的保护
我们实施了两组实验来测定疫苗效力。第一个实验中，对杂交C57Bl/6小鼠接种含或不含3M2eNP融合蛋白的六邻体修饰载体。第二个实验中，在ICR小鼠中测试相同载体以及携带天然六邻体的AdC68-3M2eNP载体。两个实验中都用接种AdC68rab.gp载体的小鼠作为对照。
第一个实验中，加强免疫2个月后，用10LD50的A/PR8/34病毒感染接种C57Bl/6的小鼠（每组5只）。接种疫苗的小鼠的体重下降在攻击后6～8天达到峰值，然后大部分小鼠开始恢复体重。到攻击后21天，大部分受保护的小鼠恢复到它们攻击前的体重。接种假疫苗的对照小鼠在攻击后体重继续下降直至死亡或实施安乐死（图8A）。攻击后，80%接种AdC68-3M2eNP-HxM2eS(R1)的小鼠(p=0.0238)存活，而60%接种AdC68-HxM2eS(R1)或AdC68-3M2eNP-HxM2eS(R4)的小鼠存活(p>0.05，图8B)。AdC68-HxM2eS(R4)疫苗和对照组的所有小鼠死亡。
用ICR小鼠(n=10)重复该实验。该实验包括接受之前所述方案的一组以用作对照，该方案包括用AdC68-3M2eNP载体初次免疫然后用AdC6-3M2eNP载体加强免疫（42）。AdC68-3M2eNP-HxM2eS(R1)载体免疫两次或用AdC68-3M2eNP/AdC6-3M2eNP组合免疫的小鼠显示最小的约10％体重下降，并且所有小鼠都存活(p=0.0001)。AdC68-HxM2eS(R1)和AdC68-3M2eNP-HxM2eS(R4)疫苗也分别对80%(p=0.0004)和70%(p=0.0015)小鼠提供显著保护。只有一个dC68-HxM2eS(R4)免疫小鼠存活，对照组中所有小鼠都死于感染。体重下降总体上对应于针对死亡的保护水平，除了AdC68-HxM2eS(R1)载体免疫的小鼠，其平均下降体重大于AdC68-3M2eNP-HxM2e(R4)载体的免疫小鼠。
讨论
腺病毒六邻体是形成二十四面衣壳表面上总共240个三聚体的最丰富的病毒衣壳蛋白。六邻体分子含有锚定在衣壳上的假六边形基底，这是一种保守的桶状结构域且随后是含有柔性环的分子顶部的塔尖（28）。Ad病毒的不同血清型显示了主要在这些环中的序列变化（29）。AdC68六邻体已通过X射线晶体学表征（39），其含有在分子顶部形成5个不同环的5个可变区（R1～5）。由R1编码的环定义为AdC68中和抗体的主要靶标（25）。
上文已描述了衍生自普通人血清型5(AdHu5)的Ad载体展示来自其六邻体中其它病原体的B细胞表位，该载体在小鼠中呈现免疫原性（21，36）。抗AdHu5病毒的中和抗体在人体中常见并抑制对AdHu5载体的摄取，因此抑制针对载体编码转基因产物的免疫应答（13），虽然不必定预期它们影响针对病毒六邻体中所展示表位的B细胞应答。已表明Ad六邻体可变区的修饰阻碍抗体与野生型病毒的中和（1），但该结果仍有争议（6，26）。抗M2e的抗体针对甲型流感病毒的异型保护通过同时刺激针对NP的CD8+T细胞得到提高，我们选择基于黑猩猩Ad载体（即AdC68）的疫苗，大部分人类缺乏针对该疫苗的中和抗体（38）。我们在AdC68六邻体的R1或R4中插入M2e表位。构建携带M2e六邻体修饰和表达融合蛋白的其它载体，该融合蛋白包括作为转基因产物的NP和3个不同的M2e序列。在小鼠中相比携带野生型六邻体的载体测试载体的免疫原性和抵抗甲型流感病毒的功效。
上述实施例证实具有野生型或修饰六邻体的载体在小鼠中诱导相当的CD8+T细胞应答。用在R1中携带M2e的六邻体修饰载体接种免疫后，针对M2e的抗体应答显著较高。
由于R1修饰六邻体仍然在病毒衣壳上形成三聚体，在R1中插入表位似乎不会改变六邻体总体结构。相反，在R4中插入相同序列阻碍三聚体形成。R1中存在M2e相比R4中存在相同序列诱导更强效的M2e特异性抗体应答。不受该解释的限制，我们认为R1编码的环相比R4编码的环更易接近抗体，因为前者也携带大部分针对天然六邻体的中和抗体的结合位点（25）。然而，我们不能排除其它解释，例如三聚体结构在优化B细胞应答中的作用或置于任一环中的M2e表位二级结构的差异。
在R1编码的环中携带M2e序列的AdC68载体与包括3个M2e序列和NP的融合蛋白的转基因产物相比诱导更高的抗体应答，尤其针对其在M2中的天然构型。强CMV启动子调控下至少产生7～10天（直至载体转导的细胞被免疫系统清除）的转基因产物量（40）可能远远超过通过E1缺失Ad载体不会或仅少量体内合成的衣壳上所存在的抗原量。M2e在病毒衣壳上表现出的较高免疫原性可反映：正如以前在水泡性口炎病毒系统中所述（2），针对严格排列表位的B细胞应答较少地依赖于T辅助细胞，以及T辅助细胞在AdC载体免疫后受到限制。考虑到AdC载体携带许多具有II类MHC表位的抗原（34），我们倾向于另一种解释，即更结构化的抗原展示相对主要以无序形式呈现的抗原更有利于B细胞刺激。意想不到地是，我们不能通过在六邻体上和在编码M2e(作为一部分转基因产物)的相同载体中展示M2e来进一步提高M2e特异性抗体应答。在R1和R4六邻体修饰载体中都观察到这点，因此不太可能反映抗原饱和度，因为R4六邻体修饰载体仅诱导针对M2e的低抗体应答。由R1中的M2e诱导的B细胞应答可简单地通过相同载体的二次免疫来加强，这可能意味着M2e取代了AdC68中主要的中和B细胞表位。相比之下，R4六邻体修饰载体仅引发边际抗体记忆应答，这可能归因于抗天然六邻体部分的中和抗体的干扰。在无细胞免疫应答的情况下，AdC载体诱导的抗M2e抗体提供了抵抗A/PR8/34攻击的部分保护。如之前所报道（42），可通过经转基因产物同时活化NP特异性CD8+T细胞应答来改进保护。用同源衣壳修饰Ad载体加强免疫无法提高NP特异性CD8+T细胞应答频率。
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Figure IDA0000420036150000011

Claims (24)

1.一种经修饰的腺病毒六邻体蛋白，所述蛋白包含来自第一甲型流感病毒株的第一基质蛋白胞外域(M2e1)，所述M2e1插入所述六邻体蛋白的高变区中。
2.如权利要求1所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白，其特征在于，所述M2e1插入高变区1中。
3.如权利要求1所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白，其特征在于，所述M2e1取代高变区1中的三个连续氨基酸。
4.如权利要求1所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白，其特征在于，所述M2e1取代SEQ ID NO:6所示六邻体蛋白中的氨基酸142～144。
5.如权利要求1所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白，其特征在于，所述M2e1插入高变区4中。
6.如权利要求1所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白，其特征在于，所述M2e插入SEQ ID NO:6所示六邻体蛋白的氨基酸253和254之间。
7.如权利要求1～6中任一项所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白，其特征在于，所述第一流感病毒株选自H1N1株、H5N1株、H7N2株、H1N2株、H2N2株和H3N2株。
8.一种融合蛋白，所述蛋白包含：
来自第二甲型流感病毒株的第二基质蛋白胞外域（M2e2）；和
来自第三甲型流感病毒株的第三基质蛋白胞外域（M2e3）；和
来自第四甲型流感病毒株的第四基质蛋白胞外域（M2e4）；
其中所述第二、第三和第四毒株中至少两个是不同的毒株。
9.如权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白还包含来自第五甲型流感病毒株的核蛋白(NP)。
10.如权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述述融合蛋白的组分从N至C末端排序为：M2e2—M2e3—M2e4—NP。
11.如权利要求8～10中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二流感病毒株选自H1N1株、H5N1株、H7N2株、H1N2株、H2N2株和H3N2株。
12.一种编码权利要求1～7中任一项所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白或权利要求8～11中任一项所述融合蛋白的核酸分子。
13.一种包含如权利要求1～7中任一项所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白的腺病毒。
14.一种包含如权利要求12所述核酸分子的腺病毒。
15.如权利要求14所述的腺病毒，其特征在于，所述腺病毒还包含如权利要求1～7中任一项所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白。
16.一种免疫原性组合物，所述组合物包含：
免疫原性组分；和
药学上可接受的载剂，
其中所述免疫原性组分选自权利要求1～7中任一项所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白；权利要求8～11中任一项所述的融合蛋白；权利要求12所述的核酸分子；和权利要求13～15中任一项所述的腺病毒。
17.一种诱导针对甲型流感病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向需要所述组合物的个体首次给予权利要求16所述的免疫原性组合物。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法还包括再次给予所述组合物。
19.如权利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述首次给予或再次给予选自下组：粘膜、口服、肌内、静脉内和腹膜内给予。
20.如权利要求17～19中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包括抗体形成。
21.如权利要求17～19中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包括CD8+T细胞活化。
22.权利要求16所述免疫原性组合物在针对甲型流感病毒的免疫接种中的应用。
23.权利要求16所述免疫原性组合物在治疗或预防疾病中的应用。
24.权利要求1～7中任一项所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白；权利要求8～11中任一项所述的融合蛋白；权利要求12所述的核酸分子；或权利要求13～15中任一项所述的腺病毒在制造用于诱导针对甲型流感病毒的免疫应答的药物中的应用。
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