JP2019536468A - 腫瘍を標的にする合成アデノウイルスおよびその使用 - Google Patents

Abstract

肝臓脱標的化変異を有し、アデノウイルス３４型（Ａｄ３４）ファイバータンパク質、またはＡｄ３４ノブドメインを有するキメラファイバータンパク質を発現する合成アデノウイルスが記載される。合成アデノウイルスは腫瘍部位に移動する。診断用または治療用トランスジーンを腫瘍に送達するための合成アデノウイルスの使用も記載される。アデノウイルス３４型（Ａｄ３４）ノブドメインを有するファイバータンパク質を発現する肝臓脱標的化合成アデノウイルスは、腫瘍部位に向かうことができるという知見が、本明細書において記載される。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年１２月１２日に出願された米国仮出願番号第６２／４３３，１４０号の利益を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書に援用される。

分野
この開示は、腫瘍部位に移動するキメラファイバータンパク質および肝臓脱標的化変異を有する合成アデノウイルスに関する。この開示は、腫瘍において診断用または治療用トランスジーンを発現させるための、合成アデノウイルスの使用にさらに関する。

背景
アデノウイルス（Ａｄ）は、天然の多重遺伝子発現ビヒクルである。ウイルスのある特定のコード領域、例えば、Ｅ１、Ｅ３およびＥ４領域は、培養における複製に必要でないかまたは利用可能な細胞株によって補完され得る。したがって、これらの領域はそれぞれ、単一ウイルスから複数のトランスジーンの発現を駆動するように、非ウイルス遺伝子と置き換えることができる。６８種の異なるヒトアデノウイルス血清型が存在し、それらはそれぞれ異なる特質を有する。Ａｄ５は、基礎研究、遺伝子治療および腫瘍溶解性ウイルス療法において使用される主なＡｄベクターであった。しかし、Ａｄ５は限定された指向性を有し、ウイルス取り込みのためのコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）受容体を有する上皮細胞のみに感染する。さらに、静脈内注射されると、Ａｄ５は血液因子に結合するが、この血液因子は、肝臓においてＡｄ５が隔離される原因となるものであり、肝臓において、Ａｄ５は、潜在的に、炎症および毒性の制限を誘発することがある。したがって、静脈内投与後に特定の細胞型に感染することができる修飾されたアデノウイルスベクターに対する必要性は依然として存在する。

要旨
アデノウイルス３４型（Ａｄ３４）ノブドメインを有するファイバータンパク質を発現する肝臓脱標的化合成アデノウイルスは、腫瘍部位に向かうことができるという知見が、本明細書において記載される。合成アデノウイルスは、腫瘍間質細胞を含む腫瘍細胞において、診断用または治療用トランスジーンを送達し発現させるために使用することができる。

被験体の腫瘍細胞においてトランスジーンを発現させる方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、方法は、トランスジーン、合成アデノウイルスを肝臓から脱標的化する本来のまたは修飾されたキャプシド、ならびにＡｄ３４ファイバータンパク質、またはアデノウイルス５型（Ａｄ５）シャフトドメインおよびＡｄ３４ノブドメインを含むキメラファイバータンパク質を含む合成アデノウイルスを被験体に投与することを含む。トランスジーンは、例えば、診断用トランスジーンまたは治療用トランスジーンであり得る。

また、腫瘍を有すると被験体を診断する方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、方法は、診断用トランスジーン、合成アデノウイルスを肝臓から脱標的化する本来のまたは修飾されたキャプシド、ならびにＡｄ３４ファイバータンパク質、またはＡｄ５シャフトドメインおよびＡｄ３４ノブドメインを含むキメラファイバータンパク質を含む合成アデノウイルスを被験体に投与することを含む。一部の実施例では、診断用トランスジーンは、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）のレポーター遺伝子である。他の実施例では、診断用トランスジーンは、蛍光タンパク質または酵素をコードする。

被験体の腫瘍を処置する方法が、本明細書においてさらに提供される。一部の実施形態では、方法は、治療用トランスジーン、合成アデノウイルスを肝臓から脱標的化する本来のまたは修飾されたキャプシド、ならびにＡｄ３４ファイバータンパク質、またはＡｄ５シャフトドメインおよびＡｄ３４ノブドメインを含むキメラファイバータンパク質を含む合成アデノウイルスを被験体に投与することを含む。一部の実施例では、治療用トランスジーンは、腫瘍間質細胞を破壊または殺滅する抗がん剤または薬剤をコードする。

配列番号２または配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する合成アデノウイルスゲノムはまた、本開示によって提供される。

本開示の上述およびその他の目的および特性は、以下の詳細な説明、続いて添付の図面への参照により、さらに明らかとなろう。

ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６は膵腫瘍に向かう。（図１Ａ）Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄ／ｐ５３膵腫瘍モデルの概要。「Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３」と示されるマウスは、ＬｏｘＰ−終止コドン−ＬｏｘＰをコードする配列の下流にＫｒａｓ^Ｇ１２Ｄ発癌遺伝子をコードする。終止コドンは、Ｃｒｅリコンビナーゼの非存在下で、Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄの発現を遮断する。しかし、Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下では、終止コドンは除去され、Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄ発癌遺伝子の発現を可能とする。これらの同一マウスでは、ｐ５３遺伝子の両方の対立遺伝子にＬｏｘＰ部位が隣接している（ＬｏｘＰ−ｐ５３−ＬｏｘＰ）。「ｐ５３／ｐ５３；Ｃｒｅ」と示したマウスは、ｐ５３遺伝子の両方の対立遺伝子にＬｏｘＰ部位が隣接しており（ＬｏｘＰ−ｐ５３−ＬｏｘＰ）、また、膵臓および十二指腸ホメオボックス１（Ｐｄｘ１）プロモーターによって駆動されるＣｒｅリコンビナーゼトランスジーンも発現する。Ｐｄｘ１は、膵臓細胞において特異的に発現される遺伝子であり、したがって、ｐ５３の両方のコピーは膵臓細胞において欠失する。系統間の掛け合わせによって、Ｐｄｘ１プロモーターによって駆動されるＣｒｅが膵臓細胞における腫瘍抑制因子ｐ５３の両方の対立遺伝子の欠失および変異体Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄの活性化を媒介する子孫を生じる。「Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３；Ｃｒｅ」と示したホモ接合性マウスは、５〜７週で膵腫瘍を生じる。（図１Ｂ）Ａｄ３４ノブドメインを含むキメラファイバータンパク質を有する合成ウイルスであるＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を、Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３およびＫｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３；Ｃｒｅマウスに静脈内注射した。ウイルス注射の７２時間後、組織を収集し、ルシフェリンと共に５分間インキュベートし、次いで、ＩＶＩＳ（商標）画像化システムを使用して５分間スキャンした。Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３マウスは正常な膵臓を有し、ルシフェラーゼシグナルは主に脾臓に由来した。Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３；Ｃｒｅマウスは膵腫瘍を有し、シグナルは主に膵腫瘍に由来した。

Ｃｒｅ媒介遺伝子操作ヘテロ接合性モデルにおける尾静脈注射後のＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６感染膵腫瘍。（図２Ａ）Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３マウスは、図１Ａに記載されている通りである。「ｐ５３／＋；Ｃｒｅ」マウスと示したマウスは、１つの野生型ｐ５３対立遺伝子および１つのＬｏｘＰ部位が隣接したｐ５３対立遺伝子（ＬｏｘＰ−ｐ５３−ＬｏｘＰ）を有する。これら２つの系統間の掛け合わせによって、Ｐｄｘ１プロモーターによって駆動されるＣｒｅリコンビナーゼが膵臓細胞における腫瘍抑制因子ｐ５３の単一の対立遺伝子の欠失および変異体Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄの活性化を媒介する子孫を生じる。「Ｋｒａｓ；ｐ５３／＋；Ｃｒｅ」と示したこれらのヘテロ接合性マウスは、これらがｐ５３の１つの野生型対立遺伝子を有するという事実によって、寿命の後半（４〜９カ月齢で）腫瘍を生じる。この野生型対立遺伝子は、膵腫瘍が生じるためには、失われるかまたは変異されなければならない。（図２Ｂ）ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を、ｐ５３／＋；ＣｒｅおよびＫｒａｓ；ｐ５３／＋；Ｃｒｅマウス（４カ月齢）に静脈内注射した。ウイルス注射の７２時間後、組織を収集し、ルシフェリンと共に５分間インキュベートし、次いで、ＩＶＩＳ（商標）画像化システムを使用して１分間スキャンした。ｐ５３／＋；Ｃｒｅマウスは正常な膵臓を有し、シグナルは主に脾臓に由来した。４カ月齢のＫｒａｓ；ｐ５３／＋；Ｃｒｅマウスは膵腫瘍を有し、シグナルは主に腫瘍および肝臓に由来した。

ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６は尾静脈注射後の早期段階で膵腫瘍に感染し、診断することができる。ヘテロ接合性Ｋｒａｓ；ｐ５３／＋；Ｃｒｅマウスは、４〜９カ月で膵腫瘍を生じる。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６が腫瘍発生の非常に早期の段階で（腫瘍が目に見える前に）膵腫瘍に感染できるかどうかを試験するために、ＡｄＳｙｎ−１７６を２カ月齢のＫｒａｓ；ｐ５３／＋；Ｃｒｅマウスに注射し、ルシフェラーゼ発現を測定した。（図３Ａ）ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を２カ月齢のＫｒａｓ；ｐ５３／＋；Ｃｒｅマウスに静脈内注射した。ウイルス注射の７２時間後、組織を収集し、ルシフェリンと共に５分間インキュベートし、ＩＶＩＳ（商標）画像化システムを使用して４分間スキャンした。２カ月齢のＫｒａｓ；ｐ５３／＋；Ｃｒｅマウスの膵臓は正常に見えたが、ルシフェラーゼシグナルがこの組織において見出された。（図３Ｂ）正常な膵臓（ａ）と膵腫瘍（ｂ）の典型的組織像を示すＨ＆Ｅ染色。（図３Ｃ）膵臓の小部分が腫瘍を生じたことを示す２カ月齢のＫｒａｓ；ｐ５３／＋；Ｃｒｅマウス由来の膵臓のＨ＆Ｅ染色（多角形中に示す）。膵臓のほとんどは正常に見えた。この結果は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６は非常に早期の段階で膵腫瘍に感染することができることを示す。

ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６は膵腫瘍における間質細胞に感染する。膵腫瘍では、ほんの１０％の細胞だけががん細胞であり、残りの９０％は間質細胞である。免疫組織化学（ＩＨＣ）および免疫蛍光（ＩＦ）染色によって決定されるように、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６に感染した細胞は間質細胞である。（図４Ａ）ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６に感染した膵腫瘍のＩＨＣ染色。ＣＫ１９は腫瘍細胞のマーカーであり、一方、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）は間質細胞のマーカーである。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６から発現したＧＦＰの染色はＳＭＡ染色と重複し、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６が間質細胞を標的化することを示す。（図４Ｂ）ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６に感染した膵腫瘍のＩＦ染色。ＧＦＰ染色はＳＭＡ染色と重複し、間質細胞のＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６感染を確認した。

尾静脈注射後にＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６に感染した膠芽腫。合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を尾静脈によって膠芽腫を有するマウスに注射し、ルシフェラーゼシグナルを膠芽腫において見出した。（図５Ａ）Ｃｒｅ媒介遺伝子操作膠芽腫モデルの模式図。レンチウイルスをＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスの脳に直接注射した。グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターによって駆動されるＣｒｅリコンビナーゼは、レンチウイルスにコードされた遺伝子からＲＦＰを切断し、星状細胞において主にＨＲａｓ^Ｖ１２およびＧＦＰの発現を誘導する。レンチウイルスにコードされたＵ６−ｐ５３ ｓｈＲＮＡの発現は、ウイルスを取り込む脳細胞のｐ５３の発現をノックダウンする。ＨＲａｓ^Ｖ１２の発現およびｐ５３のノックダウンは、注射の１週間後に脳において腫瘍形成を誘導する。ＧＦＰシグナルを使用して、膠芽腫の形成を示す。（図５Ｂ）生理食塩水、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１、またはＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を、４週間早く腫瘍を誘導するレンチウイルスを受けたＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスに静脈内（ＩＶ）投与によって注射した。ウイルス注射の４８時間後、マウスを、ルシフェリンの腹腔内注射の５分後に、ＩＶＩＳ（商標）画像化システムを使用して１分間スキャンした。ルシフェラーゼシグナルをＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６に感染したマウスにおいて検出し（矢印）、一方、生理食塩水で処置したマウスまたはＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１を注射したマウスではシグナルは検出されなかった。（図５Ｃ）野生型マウス（正常な脳）およびレンチウイルスを注射したＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウス（脳腫瘍を生じる）にＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１またはＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を注射した。合成アデノウイルスの注射の７２時間後に脳組織を収集し、ルシフェリンと共に５分間インキュベートし、ＩＶＩＳ（商標）画像化システムを使用して５分間スキャンした。腫瘍を誘導するレンチウイルスを注射したＧＦＡＰ−ＣｒｅマウスのみがＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６からのルシフェラーゼシグナルを示した。このことは、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６が、腫瘍が存在する場合にのみ、脳組織に移動することを実証する。（図５Ｄ）脳組織をＧＦＰシグナルについてもスキャンした。ＧＦＰシグナルを使用して膠芽腫を特定する。腫瘍を誘導するレンチウイルスを受けたＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスの両方が脳内にＧＦＰシグナルを有したが、一方、レンチウイルスを受けなかったマウスではＧＦＰは検出されなかった。ＧＦＰシグナルは、腫瘍を誘導するレンチウイルスおよびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を受けたＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスにおけるルシフェラーゼシグナルと完全に重複した。

ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６の膠芽腫への移動は腫瘍によって駆動され、損傷によって駆動されない。腫瘍を誘導するレンチウイルスの注射は、注射部位で、脳に一時的損傷をもたらす。合成アデノウイルス（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６）をレンチウイルスの最初の注射の４週間後に注射したが、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６の膠芽腫への移動が腫瘍または注射部位の損傷によって駆動されたかどうかは依然として明らかではなかった。この疑問に答えるために、注射なし、偽の注射または腫瘍を誘導するレンチウイルスの注射のいずれかの４週間後に、ＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスに合成アデノウイルスを注射した。（図６Ａ）ＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスに、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）または腫瘍を誘導するレンチウイルスのいずれかを注射した。４週間後、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１を静脈内注射した。いずれのマウス群でも、脳内に、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１由来のルシフェラーゼシグナルは存在しなかった。（図６Ｂ）ＧＦＡＰ−ＣｒｅマウスにＨＢＳＳもしくは腫瘍を誘導するレンチウイルスを注射したか、またはＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスは注射を受けなかった。４週間後、マウスにＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を静脈内注射した。ルシフェラーゼシグナルは腫瘍を誘導するレンチウイルスを受けたマウスの脳内でのみ検出されたが、一方、ＨＢＳＳを受けたかまたは注射を受けなかったマウスはシグナルを生じなかった。これらの結果は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６の特異性は腫瘍によって駆動されるが、注射部位の損傷によっては駆動されないことを実証する。

ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６はヒト膠芽腫異種移植片腫瘍に移動することができる。（図７Ａ）ヒト膠芽腫異種移植片モデルの模式図。ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質（Ｕ８７−ｔｄＴｏｍａｔｏ）を発現するヒト膠芽腫Ｕ８７細胞をＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスに頭蓋内注射し、膠芽腫腫瘍を生じさせた。（図７Ｂ）ＮＳＧマウスがＵ８７−ｔｄＴｏｍａｔｏの頭蓋内注射を受けた４週間後に、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６をＮＳＧマウスに尾静脈注射により静脈内注射した。ウイルス注射の４８時間後に、パネルに示した組織を収集し、ルシフェリンと共に５分間インキュベートし、次いで、ＩＶＩＳ（商標）画像化システムを使用して１分間スキャンした。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を注射したマウスのみが、脳内にルシフェラーゼシグナルを示し、このシグナルはｔｄＴｏｍａｔｏ発現と完全に重複した。

治療用トランスジーンを有する合成アデノウイルスの投与。（図８Ａ）ＫＰＣＬ（Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；ｐ５３ノックアウト；Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ホタルルシフェラーゼ）マウスモデルの模式図。ＫＰＣＬマウスは、膵臓でＫｒａｓ^Ｇ１２Ｄを特異的に発現し、膵臓でのみノックアウトされたｐ５３遺伝子を有する、ホモ接合性「Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３；Ｃｒｅ」マウスと類似する。しかし、ＫＰＣＬマウスは、膵臓においてホタルルシフェラーゼも特異的に発現する。ＫＰＣＬマウスにおける腫瘍の発生は、「Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３；Ｃｒｅ」マウスに対するものとも類似する。（図８Ｂ）各処置に対するＫＰＣＬマウス（処置群当たり少なくとも４頭のマウス）の平均生存期間を示す表。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６に基づく合成アデノウイルスである。単純ヘルペスウイルス−１チミジンキナーゼ（ＴＫ）／ガンシクロビル（ＧＣＶ）自殺遺伝子をＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６にクローニングし、ホタルルシフェラーゼ／ＧＦＰ遺伝子を置き換えた。ウミシイタケルシフェラーゼをＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６のゲノムのＴＫの直後にも挿入した。対照ウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８９を、ＴＫ−Ｐ２Ａ−ウミシイタケルシフェラーゼをＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１にクローニングして元のホタルルシフェラーゼ／ＧＦＰ遺伝子を置き換えることによって生成した。ＫＰＣＬマウスに、５〜６週齢の指定のウイルスを１×１０^６プラーク形成単位（ＰＦＵ）、尾静脈を介して静脈内注射した。２日後、マウスに、ＧＣＶを腹腔内（ｉ．ｐ．）または静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。３つの対照群を使用した：ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８９＋ＧＣＶ；ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７に続いて生理食塩水を注射（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７＋生理食塩水）；およびＧＣＶ注射のみ（ｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．）。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７＋ＧＣＶによる処置は、対照と比較して、マウスの生存期間を延長した。（図８Ｃ）ホタルルシフェラーゼシグナルを示す代表的マウスの画像。ホタルルシフェラーゼシグナル（腫瘍によって発現した）を処置の間分析し、腫瘍増殖をモニタリングした。マウスＺ６１９Ｒに対する処置は、対照としての役割を果たすＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７＋生理食塩水であった。マウスＺ６０１ＲおよびＺ６０７ＲをＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７＋ＧＣＶ（ｉ．ｐ．）で処置した。ホタルルシフェラーゼシグナルの強度は対照マウスＺ６１９Ｒにおいて増加したが（腫瘍サイズの増加を示す）、一方、マウスＺ６０１ＲおよびＺ６０７Ｒにおいてはシグナルは低下した（腫瘍サイズの低減を示す）。

ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７で処置したマウスの腫瘍における組織像。（図９Ａ）膵腫瘍のＨ＆Ｅ染色の画像。マウスＺ６５５、１８０６、Ｚ６１９およびＺ６２１はすべて対照マウスであった。マウスＺ６５５を、ＧＣＶのみをｉ．ｐ．注射により処置し；マウス１８０６を、ＧＣＶのみをｉ．ｖ．注射により処置し；マウスＺ６１９を、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７＋生理食塩水で処置し；かつマウスＺ６２１は処置を受けなかった。マウスＺ６５６は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７＋ＧＣＶのｉ．ｖ．による処置を受けた。対照と比較して、Ｚ６５６由来の腫瘍は、より大きな領域の壊死を有した（矢頭によって示した）。（図９Ｂ）拡大したＺ６５６の腫瘍における壊死の代表的領域。領域は、図９Ａにおいても示す。

配列表
（配列表）
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基の標準的な略字およびアミノ酸の３文字コードを使用して示されている。それぞれの核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、提示された鎖に対する任意の参照により含まれると理解される。配列表は、２０１７年１１月３０日に作成された２１５ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出されており、参照により本明細書に組み込まれる。
添付の配列表においては、以下の通りである。

配列番号１は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１のヌクレオチド配列である。

配列番号２は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６のヌクレオチド配列である。

配列番号３は、Ａｄ５ヘキソンのアミノ酸配列である。

配列番号４は、Ａｄ５ヘキソンＥ４５１Ｑのアミノ酸配列である。

配列番号５は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７のヌクレオチド配列である。

配列番号６は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８９のヌクレオチド配列である。
詳細な説明

Ｉ．略語

ＩＩ．用語および方法

ＩＩ．用語および方法
別途注記されない限り、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓによって１９９４年に刊行されたＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ Ｖ（ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．によって１９９４年に刊行されたＫｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）；およびＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．によって１９９５年に刊行されたＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
本開示の様々な実施形態の考察を容易にするために、特定の用語の説明を、以下に提供する。

アデノウイルス：線形二本鎖ＤＮＡゲノムおよび正二十面体キャプシドを有する、非エンベロープ型ウイルスである。現在、ヒトアデノウイルスには、６８種類の血清型が公知であり、７つの種（種Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）に分類される。異なる血清型のアデノウイルスは、異なる種類の疾患と関連付けられており、一部の血清型は、呼吸器疾患（主として種ＢおよびＣ）、結膜炎（種ＢおよびＤ）、ならびに／または胃腸炎（種ＦおよびＧ）を引き起こす。

投与：被験体に、治療剤（例えば、組換えウイルス）などの薬剤を、任意の有効な経路によって提供することまたは与えることである。例示的な投与経路としては、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、腫瘍内、および静脈内など）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻内、膣、および吸入の経路が挙げられるが、これらに限定されない。

キメラ：起源が異なる少なくとも２つの部分から構成されるものである。本開示の文脈において、「キメラアデノウイルス」とは、少なくとも２つの異なる血清型に由来する（例えば、Ａｄ５および第２の血清型のアデノウイルスに由来する）遺伝物質および／またはタンパク質を有するアデノウイルスである。この文脈において、「キャプシド交換型」アデノウイルスとは、キャプシドタンパク質が、１つの血清型のアデノウイルスに由来し、残りのタンパク質が、別のアデノウイルス血清型に由来する、キメラアデノウイルスを指す。同様に、「キメラファイバー」とは、少なくとも２つの異なる血清型のアデノウイルスに由来するアミノ酸配列を有するファイバータンパク質である。例えば、キメラファイバーは、Ａｄ５由来のファイバーシャフトおよび第２の血清型のアデノウイルスに由来するファイバーノブから構成され得る。

接触させること：直接的な物理的会合におくことであり、固体形態および液体形態の両方を含む。

縮重バリアント：本開示の文脈において、「縮重バリアント」とは、遺伝子コードの結果として縮重となる配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。天然のアミノ酸が２０個あり、その大半が、１つを上回るコドンによって指定される。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされるペプチドのアミノ酸配列が変化しない限り、そのペプチドをコードするすべての縮重ヌクレオチド配列が、含まれる。

脱標的化：本開示の文脈において、「脱標的化」アデノウイルスは、特定の細胞または組織型にもはや感染しないか、またはもはや実質的に感染しないようにウイルスの指向性を変更する１つまたは複数の修飾を含む組換えまたは合成アデノウイルスである。一部の実施形態では、組換えまたは合成アデノウイルスは、ヘキソンタンパク質（例えば、Ｅ４５１Ｑ）における変異などのキャプシド変異を含む。一部の実施形態では、組換えまたは合成アデノウイルスは、特定の細胞または組織型に、自然には感染しないか、または実質的に感染しないアデノウイルス由来の本来のキャプシドを含む。本明細書における一部の実施形態では、組換えまたは合成アデノウイルスは、肝臓脱標的化および／または脾臓脱標的化される。

Ｅ１Ａ：アデノウイルス初期領域１Ａ（Ｅ１Ａ）遺伝子およびこの遺伝子から発現されるポリペプチドである。Ｅ１Ａタンパク質は、細胞を、細胞周期に入れることによって、ウイルスゲノム複製における役割を果たす。本明細書において使用されるとき、「Ｅ１Ａタンパク質」という用語は、Ｅ１Ａ遺伝子から発現されるタンパク質を指し、この用語には、あらゆるアデノウイルス血清型によって産生されるＥ１Ａタンパク質が含まれる。

ファイバー：アデノウイルスのファイバータンパク質は、細胞表面受容体への結合を媒介する、三量体タンパク質である。ファイバータンパク質は、長いＮ末端側のシャフトおよび球状のＣ末端側のノブから構成される。

融合タンパク質：少なくとも２つの異なる（異種）タンパク質またはペプチドに由来するアミノ酸配列を含有するタンパク質である。融合タンパク質は、例えば、２つの異なる（異種）タンパク質の少なくとも一部分をコードする核酸配列から操作された核酸配列の発現によって、生成することができる。融合タンパク質を作出するためには、核酸配列は、同じリーディングフレーム内になければならず、内部終止コドンを含有してはならない。融合タンパク質、特に、短い融合タンパク質は、化学的合成によって生成することもできる。

膠芽腫：脳および脊髄のグリア組織から形成する急速増殖型の中枢神経系腫瘍である。膠芽腫は、通常、成人において生じ、脊髄よりも高い頻度で脳に影響を及ぼす。膠芽腫は、脳で始まる最も一般的で、最も侵攻性のがんである。膠芽腫は、多形膠芽腫（ＧＢＭ）およびグレードＩＶ星状細胞腫としても公知である。

異種：異種タンパク質または遺伝子とは、異なる供給源または種に由来するタンパク質または遺伝子を指す。

ヘキソン：主要なアデノウイルスキャプシドタンパク質である。Ａｄ５由来の例示的ヘキソン配列は、配列番号３として本明細書において示される。Ｅ４５１Ｑ置換を含む変異ヘキソン配列は、配列番号４として本明細書において示される。

単離された：「単離された」生物学的構成要素（核酸分子、タンパク質、ウイルス、または細胞など）は、その構成要素が天然に存在する、生物の細胞もしくは組織または生物自体における他の生物学的構成要素、例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、ならびに細胞から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製されたものが含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸分子およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子およびタンパク質を包含する。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）：植物、動物およびウイルスにおける遺伝子発現を調節する一本鎖ＲＮＡ分子である。マイクロＲＮＡをコードする遺伝子が転写されて一次転写物であるマイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を形成し、これがプロセシングされて前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）と称されるショートステム−ループ分子を形成し、続いて、ヌクレオチド鎖切断されて成熟マイクロＲＮＡを形成する。成熟マイクロＲＮＡは、およそ２１〜２３ヌクレオチド長であり、１つまたは複数の標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲに対して部分的に相補的である。マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの切断を促進することによって、または細胞転写物の翻訳を遮断することによって遺伝子発現をモジュレートする。本開示の文脈において、「肝臓特異的マイクロＲＮＡ」は、肝臓においてのみ発現されるマイクロＲＮＡ、または他の器官もしくは組織型と比較して肝臓においてより顕著に発現されるマイクロＲＮＡのように、肝臓において優先的に発現されるマイクロＲＮＡである。一部の実施形態では、マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１２２である。本開示の文脈において、「脾臓特異的マイクロＲＮＡ」は、脾臓においてのみ発現されるマイクロＲＮＡ、または他の器官もしくは組織型と比較して脾臓においてより顕著に発現されるマイクロＲＮＡのように、脾臓において優先的に発現されるマイクロＲＮＡである。一部の実施形態では、マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１４２−３ｐである。

修飾：核酸の配列またはタンパク質配列における変化である。例えば、アミノ酸配列の修飾には、例えば、置換、挿入、および欠失、またはそれらの組合せが含まれる。挿入には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに配列内への単一もしくは複数のアミノ酸残基の挿入が含まれる。欠失は、タンパク質配列からの、１つまたは複数のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。本明細書における一部の実施形態では、修飾（置換、挿入、または欠失など）は、タンパク質の特定の活性の低減または強化など、機能の変化をもたらす。本明細書において使用されるとき、「Δ」または「デルタ」は、欠失を指す。置換修飾は、少なくとも１つの残基が、除去され、その場所に異なる残基が挿入されているものである。アミノ酸置換は、典型的に、単一の残基のものであるが、いくつかの異なる位置で同時に生じてもよい。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組合せを、最終的な変異体の配列に到達するように組み合わせてもよい。これらの修飾は、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの修飾によって調製することができ、それによって、この修飾をコードするＤＮＡが産生される。公知の配列を有するＤＮＡの所定の部位において、挿入、欠失、および置換の変異を行うための技法は、当該技術分野において周知である。「修飾された」タンパク質、核酸、またはウイルスは、上記に概説された１つまたは複数の修飾を有するものである。

作動可能に連結した：第１の核酸配列が、第２の核酸配列との機能的関係にある場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結している。例えば、プロモーターが、コーディング配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コーディング配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は、連続的であり、２つのタンパク質コーディング領域を接合する必要がある場合、同じリーディングフレーム内にある。

膵臓がん：膵臓の組織において始まるがんである。膵臓がんは、典型的に、急速に広がり、早期段階では稀にしか検出されず、ほとんどの診断された患者に対して予後不良をもたらす。膵臓がんの最も一般的な型は、膵臓がんの症例のおよそ８５％を占める膵臓腺癌である。

薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、従来のものである。Ｅ． Ｗ． ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、第１５版（１９７５年）は、１つまたは複数の治療用化合物、分子、または薬剤（例えば、本明細書において開示される合成ウイルス）の薬学的送達に好適な組成物および製剤について記載している。

一般に、担体の性質は、用いられる具体的な投与様式に依存することになる。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどといった、薬学的および生理学的に許容される流体を含む、注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤、またはカプセルの形態）については、従来の非毒性の固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性な担体に加えて、投与しようとする医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有してもよい。

ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質：モノマーがアミノ酸残基であり、それらが、アミド結合を通じて一緒に接合された、ポリマーである。アミノ酸が、アルファアミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれも使用することができる。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において互換可能に使用される。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。「残基」または「アミノ酸残基」という用語には、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに組み込まれているアミノ酸への参照が含まれる。

ポリペプチドにおける保存的置換は、タンパク質配列における１つのアミノ酸残基を、類似の生物学的特質を有する異なるアミノ酸残基の代わりに使用することである。典型的に、保存的置換は、結果として得られるポリペプチドの活性にほとんど影響を及ぼさないかまたは全く影響を及ぼさない。例えば、１つまたは複数の保存的置換（例えば、１つを上回らない、２つを上回らない、３つを上回らない、４つを上回らない、または５つを上回らない置換）を含むタンパク質またはペプチドは、野生型のタンパク質またはペプチドの構造および機能を保持する。ポリペプチドは、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲなどの標準的な手順を使用して、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって、１つまたは複数の保存的置換を含有するように産生させることができる。一実施例では、そのようなバリアントは、抗体の交差反応性または抗体が免疫応答を誘導する能力を試験することによって、容易に選択することができる。保存的置換の例を、以下に示す。

保存的置換は、一般に、（ａ）置換の区域における、例えば、シートコンフォメーションもしくはヘリックスコンフォメーションとしての、ポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持する。

一般に、タンパク質特質に最も大きな変化をもたらすことが予測される置換は、非保存的なもの、例えば、（ａ）親水性残基、例えば、セリルもしくはスレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニルを置換する（もしくはそれらによって置換される）変化、（ｂ）システインもしくはプロリンが、任意の他の残基を置換する（もしくはそれらによって置換される）変化、（ｃ）電気陽性の側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、もしくはヒスタジルが、電気陰性の残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルを置換する（もしくはそれらによって置換される）変化、または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有さないもの、例えば、グリシンを置換する（もしくはそれらによって置換される）変化であろう。

陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）：体内の代謝プロセスを観察するために使用される画像化技術である。ＰＥＴは、陽電子放出放射性核種によって間接的に放出されるガンマ線のペアを検出するものであり、これらの核種は、生物学的に活性な分子上に載って体内に導入される。ＰＥＴレポーター遺伝子は、ＰＥＴプローブに対する標的を提供する分子（受容体または酵素など）をコードし、次いで、画像化によって検出され得る。ＰＥＴレポーター遺伝子は、一般的に、３つの異なる群に分類される：（１）特異的ＰＥＴレポータープローブをリン酸化し、その細胞内捕捉を導く酵素をコードするレポーター遺伝子；（２）特異的ＰＥＴレポータープローブによって結合され得るタンパク質受容体をコードするレポーター遺伝子；および（３）レポーター遺伝子を発現する細胞中に放射性核種レポータープローブを輸送するタンパク質輸送体をコードするレポーター遺伝子（Ｙａｇｈｏｕｂｉら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ２巻（４号）：３７４〜３９１頁、２０１２年）。本明細書において使用されるとき、「ＰＥＴレポーター遺伝子」は、分子画像化によってプローブの検出を可能とする方式で、ＰＥＴレポータープローブと相互作用することができるタンパク質をコードする任意の遺伝子を含む。例示的なＰＥＴレポーター遺伝子としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）およびその変異形態、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＳＶ）ＴＫ、ヒトミトコンドリアＴＫおよびその変異体、デオキシシチジンキナーゼの変異体、ドーパミン２受容体変異体、ヒトエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン（ｈＥＲＬ）、ヒトソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｉｎ）受容体亜型２（ｈＳＳＴｒ２）、組換えヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、操作抗体断片、ヒト化膜アンカー抗ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、ならびにヒトノルエピネフリン輸送体（ｈＮＥＴ）が挙げられるが、これらに限定されない（ＰＥＴレポーター遺伝子および対応するレポータープローブの概要についてのＹａｇｈｏｕｂｉら（２０１２年）を参照されたい）。

疾患を予防、処置、または緩和する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）こと：疾患を「予防すること」とは、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置すること」とは、疾患または病態の発症が開始された後に、その徴候または症状を緩和する治療的介入を指す。「緩和すること」とは、疾患の徴候または症状の数または重症度の低減を指す。

プロモーター：核酸（例えば、遺伝子）の転写を導く／開始するＤＮＡの領域である。プロモーターは、転写の開始部位の近傍の必要な核酸配列を含む。典型的に、プロモーターは、転写する遺伝子の近傍に位置する。プロモーターはまた、任意選択で、転写開始部位から数千塩基対程度離れて位置し得る、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。「構成的プロモーター」は、継続的に活性であり、外部シグナルまたは分子による制御に供されないプロモーターである。対照的に、「誘導的プロモーター」の活性は、外部シグナルまたは分子（例えば、転写因子またはテトラサイクリン）によって制御される。「組織特異的プロモーター」は、特定の組織（単数または複数）においてのみ実質的に活性であるプロモーターである。

タンパク質ＩＸ（ｐＩＸ）：ヘキソンタンパク質と会合するアデノウイルスキャプシドの主要ではない構成要素である。

精製された：「精製された」という用語は、絶対的な純度を必要とするものではなく、相対的な用語として意図される。したがって、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物は、天然に会合するタンパク質および他の混入物質から、全体または部分的に単離されているものである。ある特定の実施形態では、「実質的に精製された」という用語は、細胞、細胞培養培地、または他の粗調製物から単離されており、初期調製物の様々な構成要素、例えば、タンパク質、細胞残屑、および他の構成要素を除去するために分画に供されている、ペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物を指す。

組換え：組換え核酸分子、タンパク質、またはウイルスは、天然に存在しない配列を有するもの、または他の点で別個である配列の２つのセグメントの人工的な組合せによって作製された配列を有するものである。この人工的な組合せは、化学的合成によって、または単離された核酸分子のセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子操作技法によって、達成することができる。「組換え」という用語には、天然の核酸分子、タンパク質、またはウイルスの一部分の付加、置換、または欠失のみによって変化されている、核酸、タンパク質、およびウイルスも含まれる。

配列同一性：２つもしくはそれよりも多い核酸配列間または２つもしくはそれよりも多いアミノ酸配列間における同一性または類似性は、配列間の同一性または類似性として表される。配列同一性は、同一性の割合として測定することができ、割合が高いほど、配列がより同一である。配列類似性は、類似性（保存的アミノ酸置換を考慮に入れる）の割合として測定することができ、割合が高いほど、配列がより類似している。核酸配列またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的な方法を使用してアラインメントした場合に、比較的高い程度の配列同一性／類似性を有する。この相同性は、オルソロガスなタンパク質またはｃＤＮＡが、より緊密に関連する種に由来する場合に（例えば、ヒト配列およびマウス配列）、関連性がより遠い種（例えば、ヒト配列およびＣ．Ｅｌｅｇａｎｓ配列）と比較して、より顕著である。

比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野において周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、説明されている：ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．、２巻４８２頁、１９８１年；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３頁、１９７０年；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻、２４４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、７３巻、２３７〜４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５巻、１５１〜３頁、１９８９年；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６巻、１０８８１〜９０頁、１９８８年；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ． ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、８巻、１５５〜６５頁、１９９２年；ならびにＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．、２４巻、３０７〜３１頁、１９９４年。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜１０頁、１９９０年は、配列アラインメント方法および相同性の計算に関する詳細な考察を提示している。

ＮＣＢＩのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜１０頁、１９９０年）が、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）およびインターネットを含む、複数の供給元から、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘと併せて使用するために、入手可能である。追加の情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトにおいて見出すことができる。

血清型：特徴的な抗原セットによって区別される緊密に関連する微生物（ウイルスなど）の群である。

間質：結合組織および血管からなる上皮組織または腫瘍の支持組織である。間質細胞は、間質、主に線維芽細胞および周囲細胞を構成する細胞である。腫瘍間質は、線維芽細胞、細胞外マトリックス、免疫細胞、脈管構造および基底膜を主として構成する（Ｂｒｅｍｎｅｓら、Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ ６巻：２０９〜２１７頁、２０１１年）。腫瘍間質細胞は、がんの増殖および進行において重要な役割を果たすことが公知である。

被験体：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリーの、生きた多細胞脊椎動物の生物である。

合成：研究室において人工的な手段によって産生されたものであり、例えば、合成核酸またはタンパク質は、研究室において化学的に合成され得る。

治療剤：被験体に適正に投与された場合に、所望される治療効果または予防効果を誘導することができるアンチセンス化合物、抗体、ペプチドまたは核酸分子などの化学化合物、小分子、組換えウイルスまたは他の組成物である。

治療有効量：特定の医薬品または治療剤（例えば、組換えウイルス）で処置されている被験体または細胞において、所望される効果を達成するのに十分なそれらの量である。薬剤の有効量は、処置されている被験体または細胞、ならびに治療用組成物の投与様式を含むがこれらに限定されない、複数の因子に依存し得る。

トランスジーン：異なる生物（ウイルスなど）のゲノムに挿入された遺伝子である。トランスジーンは、異種遺伝子とも称することができる。本明細書において使用されるとき、「診断用トランスジーン」は、これらに限定されないが、蛍光タンパク質、酵素またはＰＥＴレポーターなどの検出可能な産物をコードする任意のトランスジーンを指す。本明細書において使用されるとき、「治療用トランスジーン」は、治療的適用を有する産物をコードする任意のトランスジーンを指す。本開示の文脈において、治療用トランスジーンは、例えば、腫瘍間質の細胞を破壊または殺滅する抗がん剤または薬剤であり得る。

Ｕエクソン（Ｕｅｘｏｎ）：ｌ鎖（左方向への転写）において初期Ｅ３領域とファイバー遺伝子との間に位置するオープンリーディングフレームである（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、８１巻（２３号）、１２９１８〜１２９２６頁）。

ベクター：宿主細胞において複製するおよび／または組み入れるベクターの能力を破壊することなく外来核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは、宿主細胞において複製を可能にする核酸配列、例えば、複製起点を含むことができる。ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝エレメントを含むこともできる。発現ベクターは、挿入遺伝子（単数または複数）の転写および翻訳を可能にする必須の調節配列を含有するベクターである。
ＩＩＩ．いくつかの実施形態の概要

Ａｄ３４ノブドメインを有するファイバータンパク質を発現する肝臓脱標的化合成アデノウイルスが腫瘍部位に向かうことができることが本明細書において開示される。合成アデノウイルスは、例えば、腫瘍間質細胞を含む腫瘍細胞における診断用または治療用トランスジーンを送達し発現させるために使用することができる。

被験体の腫瘍細胞においてトランスジーンを発現させる方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、方法は、トランスジーン、合成アデノウイルスを肝臓から脱標的化する本来のまたは修飾されたキャプシド、ならびにＡｄ３４ファイバータンパク質、またはＡｄ５シャフトドメインおよびＡｄ３４ノブドメインを含むキメラファイバータンパク質を含む合成アデノウイルスを被験体に投与することを含む。

一部の実施形態では、トランスジーンは診断用トランスジーンである。一部の実施例では、診断用トランスジーンは、これらに限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、または橙色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ）などの蛍光タンパク質をコードする。他の実施例では、診断用トランスジーンは、ルシフェラーゼなどの酵素をコードする。さらに他の実施例では、診断用トランスジーンは、ＰＥＴレポーター遺伝子を含む。

他の実施形態では、トランスジーンは治療用トランスジーンである。一部の実施例では、治療用トランスジーンは抗がん剤をコードする。具体的実施例では、抗がん剤は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）リガンド、インターロイキン（ＩＬ）−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターフェロン、ケモカイン、Ｂ７−１、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）−１、リンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ）−３、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−β、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）または上皮増殖因子（ＥＧＦ）などの炎症促進分子またはサイトカインである。他の具体的実施例では、抗がん剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の阻害剤などの抗血管新生因子である。他の具体的実施例では、抗がん剤は、ＫＲａｓの阻害剤（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ阻害剤など）である。他の具体的実施例では、抗がん剤は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子（ＣＴＬＡ）−４の阻害剤、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）またはムチン１（ＭＵＣ１）である。一部の実施例では、治療用トランスジーンは、腫瘍間質細胞を破壊または殺滅する薬剤をコードする。具体的実施例では、抗原は、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｐ５３、ＴＮＦ−α、Ｆａｓ／ＦａｓＬ、またはジフテリア毒素Ａである。

また、腫瘍を有すると被験体を診断する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、診断用トランスジーン、合成アデノウイルスを肝臓から脱標的化する本来のまたは修飾されたキャプシド、ならびにＡｄ３４ファイバータンパク質、またはＡｄ５シャフトドメインおよびＡｄ３４ノブドメインを含むキメラファイバータンパク質を含む合成アデノウイルスを被験体に投与することを含む。

一部の実施形態では、診断用トランスジーンはＰＥＴレポーター遺伝子である。一部の実施例では、ＰＥＴレポーター遺伝子は、ウイルスまたはヒトチミジンキナーゼ（またはその変異形態）、デオキシシチジンキナーゼの変異体、ドーパミン２受容体変異体、ヒトエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン（ｈＥＲＬ）、ヒトソマトスタチン受容体亜型２（ｈＳＳＴｒ２）、組換えヒトＣＥＡ、操作抗体断片、ヒト化膜アンカー抗ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、またはヒトノルエピネフリン輸送体（ｈＮＥＴ）である。

他の実施形態では、診断用トランスジーンは蛍光タンパク質をコードする。一部の実施例では、蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、または橙色蛍光タンパク質を含む。

他の実施形態では、診断用トランスジーンは酵素をコードする。一実施例では、酵素はルシフェラーゼである。

被験体の腫瘍を処置する方法が、本明細書でさらに提供される。一部の実施形態では、方法は、治療用トランスジーン、合成アデノウイルスを肝臓から脱標的化する本来のまたは修飾されたキャプシド、ならびにＡｄ３４ファイバータンパク質、またはＡｄ５シャフトドメインおよびＡｄ３４ノブドメインを含むキメラファイバータンパク質を含む合成アデノウイルスを被験体に投与することを含む。

一部の実施形態では、治療用トランスジーンは抗がん剤をコードする。一部の実施例では、抗がん剤は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＦＬＴ３、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、インターフェロン、ケモカイン、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦまたはＥＧＦなどの炎症促進分子またはサイトカインである。他の実施例では、抗がん剤は、ＶＥＧＦの阻害剤などの抗血管新生因子である。他の実施例では、抗がん剤は、ＫＲａｓの阻害剤（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ阻害剤など）である。他の実施例では、抗がん剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＣＥＡまたはＭＵＣ１の阻害剤である。他の実施形態では、治療用トランスジーンは、腫瘍間質細胞を破壊または殺滅する薬剤をコードする。一部の実施例では、薬剤は、Ｒｅｘｉｎ−Ｇ、ＨＳＶ−ＴＫ、ｐ５３、ＴＮＦ−α、Ｆａｓ／ＦａｓＬ、またはジフテリア毒素Ａである。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、合成アデノウイルスは、ウイルスを肝臓から脱標的化する修飾されたキャプシドを含む。一部の実施例では、合成アデノウイルスは、Ｅ４５１Ｑ変異（配列番号４として本明細書において示される）などの修飾されたヘキソンタンパク質を含む。他の実施形態では、合成アデノウイルスは、合成アデノウイルスを肝臓から脱標的化する本来の（未修飾）キャプシド（例えば、自然には肝臓に感染しないアデノウイルス血清型由来のキャプシド）を有する。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、合成アデノウイルスは、肝臓特異的マイクロＲＮＡに対する、１つまたは複数の結合部位、例えば、２つまたは３つの結合部位をさらに含む。一部の実施例では、肝臓特異的マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１２２である。一部の実施例では、１つまたは複数の結合部位は、トランスジーンの３’ＵＴＲ中にある。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、合成アデノウイルスは、脾臓特異的マイクロＲＮＡに対する、１つまたは複数の結合部位、例えば、２つまたは３つの結合部位をさらに含む。一部の実施例では、脾臓特異的マイクロＲＮＡはｍｉＲ１４２−３ｐである。一部の実施例では、１つまたは複数の結合部位は、トランスジーンの３’ＵＴＲ中にある。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、トランスジーンは、膵臓において活性なプロモーターなどの組織特異的プロモーターまたは中枢神経系の細胞によって調節される。他の実施形態では、トランスジーンは、腫瘍特異的プロモーターによって調節される。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、合成アデノウイルスは、Ａｄ５ベクターゲノムから生成される。一部の実施例では、合成アデノウイルスは、Ａｄ５キャプシドタンパク質ならびにＡｄ５シャフトドメインおよびＡｄ３４ノブドメインを含むキメラファイバータンパク質を含む。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、腫瘍は膵腫瘍である。他の実施形態では、腫瘍は膠芽腫である。他の実施形態では、腫瘍は、乳がん、前立腺がん、消化管がん、骨がんまたは黒色腫腫瘍である。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、腫瘍は、ｐ５３腫瘍抑制因子活性の損失によって特徴付けられる。一部の実施例では、腫瘍は、ｐ５３において変異を示す。一部の実施例では、腫瘍は、野生型ｐ５３対立遺伝子の損失を示す。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、腫瘍は、ＫＲａｓ、ＨＲａｓまたはＮＲａｓなどのＲａｓ遺伝子における変異によって特徴付けられる。本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、腫瘍は、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２またはＨＥＲ２における変更または変異によって特徴付けられる。

本明細書において開示される方法の一部の実施形態では、合成アデノウイルスのゲノムは、配列番号２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施例では、合成アデノウイルスのゲノムは、配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。

本明細書において開示される方法の他の実施形態では、合成アデノウイルスのゲノムは、配列番号５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施例では、合成アデノウイルスのゲノムは、配列番号５のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。

配列番号２または配列番号５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する合成アデノウイルスゲノムが、本明細書においてさらに提供される。一部の実施例では、合成アデノウイルスのゲノムは、配列番号２または配列番号５のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ＩＶ．合成アデノウイルス

Ａｄｓｅｍｂｌｙ、ＡｄＳＬＩＣｒおよびＲａｐＡＤの技術は、固有の能力を有するアデノウイルスのモジュール設計および産生を可能にする（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０２４３５１号および同第ＷＯ２０１３／１３８５０５号を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。新規機能および特質を有するカスタムウイルスを設計する能力は、宿主にｉｎ ｓｉｔｕでタンパク質を産生するように促すことによって治療用タンパク質を送達するためのビヒクルとしてのアデノウイルスの有用性を拡大する可能性を広げる。これは、治療目的で製造するのが難しいヒトタンパク質を使用する特有の能力をもたらし、疾患組織へのほとんどのタンパク質の柔軟な送達を可能とする。

本明細書において開示される特異的修飾は、アデノウイルス５（Ａｄ５）のゲノム配列を参照して説明されるが、任意のアデノウイルス血清型に関して使用されてもよい。アデノウイルスは、天然の多重遺伝子発現ビヒクルである。Ｅ１、Ｅ３、およびＥ４領域は、培養における複製に必要でないか、または利用可能な細胞株に補完され得る。これらの領域はそれぞれ、選択的スプライシングによって多重遺伝子産物の発現を駆動するために必要な場合に、細胞プロモーターと置き換えることができる独立したプロモーターエレメントを有する。

本明細書において開示されるように、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用およびトランスジーン送達のためのＡｄ５発現ベクターを作出するために、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ遺伝子を欠失させ、少なくとも１つのトランスジーンで置き換えられた。一部の実施形態では、トランスジーンは、ＥＦ１αに駆動されるルシフェラーゼ−ＧＦＰ融合体である。

本明細書において開示される合成アデノウイルスは、ウイルスを肝臓から脱標的化する修飾をさらに含んでもよい。Ａｄ５ヘキソンは、血中の第Ｘ因子に結合することができ、これは、全身播種を防止し炎症を制限する、肝臓のＫｕｐｐｆｅｒ細胞によるその吸収を導くことがある。これを克服するために、以下にさらに記載するように、肝臓におけるアデノウイルスの取り込みおよびトランスジーン発現を防止するＥ１およびコアモジュールにおけるさらなるゲノム修飾を含むように、合成アデノウイルスを操作した。
Ａ．再標的化のためのＡｄ３４ファイバーおよびキメラファイバータンパク質

Ａｄ５および多くの他の血清型のファイバータンパク質が、細胞付着としてコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）に結合することが示される一方、他の血清型は、ＣＤ４６（Ｇａｇｇａｒら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ９巻：１４０８〜１４１２頁、２００３年）、デスモグレイン２（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ Ｍｅｄ １７巻：９６〜１０４頁、２０１１年）、シアル酸（Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｎａｔ Ｍｅｄ １７巻：１０５〜１０９頁、２０１１年）、またはその他（Ａｒｎｂｅｒｇ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ３３巻：４４２〜４４８頁、２０１２年）を使用することが示された。多くの血清型の受容体利用について徹底的には調査されておらず、ＣＤ４６は成熟マウスにおいて発現されるとは考えられていない。ファイバータンパク質のＣ末端における球状ノブは、典型的に、受容体結合を担うため、Ａｄ５ファイバーノブをＡｄ３４由来のものに置き換えることによってキメラが作出された（以下の実施例１を参照されたい）。合成ウイルスは、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ欠失を含有するＥ１モジュールおよびＥＦ１αプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ−ＧＦＰ融合体を含んだ。合成アデノウイルスはまた、トランスジーンのオフターゲット発現を防止するために、肝臓において特異的に発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２）に対するトランスジーンの３’ＵＴＲ中のヘキソンタンパク質（Ｅ４５１Ｑ）および結合部位における肝臓脱標的化修飾も含んだ。

本明細書において開示されるデータは、Ａｄ５ベースのベクターを改善するために、他の血清型由来の修飾された部分を組み合わせる能力を実証する。この場合、腫瘍細胞への進入のために最適化されたウイルスの急速なアセンブリが可能になる。
Ｂ．肝臓脱標的化修飾

天然のＡｄ５ベクターは、肺（吸入により）または肝臓（静脈内投与により）のみに感染する。Ａｄ５ヘキソンは血中の第Ｘ因子に結合し、これは、肝臓のＫｕｐｐｆｅｒ細胞によるその吸収を導き、全身播種を防止し、ウイルス限定炎症炎症（ｖｉｒｕｓ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を誘導する。これを克服し、腫瘍部位に全身的に移動することができるウイルスの静脈内送達を可能にするために、肝臓における取り込みおよび発現を防止するＥ１およびコアモジュールにおけるさらなるゲノム修飾を含むように、合成アデノウイルスを操作した。

ウイルスの取り込みおよび第Ｘ因子へのＡｄ５ヘキソン結合による肝臓における隔離を防止するために、肝臓取り込みを防止するヘキソン（Ｅ４５１Ｑ）におけるさらなる変異によってウイルスを操作した。例えば、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１は肝臓において蓄積せず、代わりに、脾臓およびリンパ節などの他の器官を標的化することができる。したがって、本明細書において一部の実施形態では、合成アデノウイルスは、Ｅ４５１Ｑ置換を有する修飾されたヘキソンタンパク質を含む。

肝臓におけるオフターゲットトランスジーン発現を防止するために、肝臓において特異的に発現するマイクロＲＮＡに対するトランスジーンの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中に結合部位を含むようウイルスを操作した。特定の実施形態では、ｍｉＲ１２２は、その発現および結合部位がヒトとマウスの両方の肝臓細胞中に保存される場合に、肝臓特異的マイクロＲＮＡとして選択された。一部の実施例では、肝臓特異的ｍｉＲ１２２に対する２つのマイクロＲＮＡ結合部位を、肝臓における任意の残留トランスジーン発現を防止するために、トランスジーンの３’ＵＴＲ中に挿入した。

ｍｉＲ−１２２結合部位とヘキソン変異を有する合成アデノウイルスは肝臓中に蓄積せず、代わりに、腫瘍を標的化することができることが本明細書に開示される。一部の実施形態では、肝臓特異的マイクロＲＮＡに対する１つまたは複数の結合部位が、トランスジーンの３’ＵＴＲ中に位置づけられる。一部の実施例では、肝臓特異的マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−３０またはｍｉＲ１９２である。

アデノウイルスヘキソン遺伝子に対する他の変異は、肝臓におけるアデノウイルス蓄積を防止することが本明細書において企図される。例えば、合成アデノウイルスは、ヘキソンの９個の超可変領域を異なる血清型由来のものと置き換えることによって肝臓から脱標的化することができた。

一部の実施例では、組換えアデノウイルスは、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるヘキソンタンパク質を含む。
Ｃ．中和抗体を避けるキャプシド交換

ヒト集団の大多数は、研究および治療的適用において最も頻繁に使用される血清型であるＡｄ５を認識する抗体をすでに有する。さらに、特定のアデノウイルス血清型が患者において使用されると、ウイルスキャプシドを認識する新たな抗体が生成されることになり、同じベクターの繰り返し投与が問題となる。したがって、本開示は、既存の中和抗体を避けることができるキメラウイルスを作出する天然アデノウイルスのモジュラリティを開発することをさらに企図する。例えば、本明細書において開示される組換えアデノウイルスは、前から存在する抗体に対してそれらを「不可視」にし、繰り返し接種を可能とする、完全な「キャプシド」モジュール交換（ほぼ６０％のゲノム）をさらに有してもよい。

一部の実施形態では、ゲノムのＥ１、Ｅ３およびＥ４領域は、第１のアデノウイルス血清型に由来し、ゲノムのＥ２Ｂ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｅ２ＡおよびＬ４領域は、Ａｄ３４などの第２のアデノウイルス血清型に由来する。一部の実施例では、第１のアデノウイルス血清型のＥ１領域は、第２のアデノウイルス血清型由来のｐＩＸタンパク質をコードするよう修飾され；および／または第１のアデノウイルス血清型のＥ３領域は、第２のアデノウイルス血清型由来のＵｅｘｏｎおよびファイバータンパク質をコードするよう修飾される。特定の実施例では、第１のアデノウイルス血清型はＡｄ５であり、第２のアデノウイルス血清型はＡｄ３４である。
Ｄ．診断および治療的適用のためのトランスジーンの発現

Ａｄ３４ノブドメインを有するキメラファイバータンパク質および肝臓脱標的化変異を含む組換えアデノウイルスは、腫瘍を標的化することができることが本明細書において開示される。組換えアデノウイルスが、腫瘍組織、例えば、腫瘍間質細胞においてトランスジーンを発現することができることがさらに開示される。一実施例では、トランスジーンは、ウイルスに形質導入された細胞の検出を可能とするルシフェラーゼ−ＧＦＰレポーターなどのレポーターである。別の実施例では、トランスジーンは、抗がん分子などの治療用トランスジーンである。本開示は、腫瘍の診断および処置のための診断用または治療用トランスジーンを含む合成アデノウイルスを提供する。

診断用トランスジーン、合成アデノウイルスを肝臓から脱標的化する本来のまたは修飾されたキャプシド、ならびにＡｄ３４ファイバータンパク質、またはＡｄ５シャフトドメインおよびＡｄ３４ノブドメインを含むキメラファイバータンパク質を含む合成アデノウイルスを被験体に投与することによって、腫瘍を有すると被験体を診断する方法が、本明細書において提供される。診断用トランスジーンは、例えば、ＰＥＴレポーター遺伝子、蛍光タンパク質または酵素であり得る。

また、治療用トランスジーン、合成アデノウイルスを肝臓から脱標的化する本来のまたは修飾されたキャプシド、ならびにＡｄ３４ファイバータンパク質、またはＡｄ５シャフトドメインおよびＡｄ３４ノブドメインを含むキメラファイバータンパク質を含む合成アデノウイルスを被験体に投与することによって、被験体の腫瘍を処置する方法が、本明細書において提供される。治療用トランスジーンは、例えば、腫瘍間質細胞を破壊または殺滅する抗がん剤または薬剤をコードすることができる。

一部の実施形態では、トランスジーンは、Ｅ１またはＥ３領域に挿入される。適切なトランスジーン挿入部位は、当該技術分野において周知である（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０２４３５１号を参照されたい）。

蛍光タンパク質をコードする遺伝子などのトランスジーンは、プロモーターに作動可能に連結する。一部の実施形態では、プロモーターは異種プロモーターである。一部の実施例では、プロモーターはＥＦ１αプロモーターである。プロモーターの選択は、当業者の能力の範囲内にある。一部の場合には、プロモーターは誘導可能なプロモーターまたは組織特異的プロモーターである。膵臓組織において発現するための例示的組織特異的プロモーターはＰｄｘ１である。

一部の場合には、単一のプロモーターを使用して、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチドの使用によって達成することができる、多重遺伝子の発現を調節する。
Ｖ．医薬組成物およびその投与

合成アデノウイルス（または１つもしくは複数の核酸または組換えアデノウイルスをコードするベクター）を含む組成物が、本明細書において提供される。本組成物は、任意選択で、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの製剤化および投与に好適である。任意選択で、本組成物は、組換えアデノウイルスのうちの１つまたは複数および薬学的に許容される担体を含む。好適な担体およびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２２版、Ｌｏｙｄ Ｖ． Ａｌｌｅｎら編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０１２年）に記載されている。薬学的に許容される担体としては、生物学的にもそれ以外にも望ましくないことのない材料が挙げられる。すなわち、この材料は、望ましくない生物学的作用を引き起こすことも、この材料が含有されている医薬組成物中の他の構成成分と有害な様式で相互作用することもなく、被験体に投与される。被験体に投与される場合、担体は、任意選択で、活性成分の分解を最小限に抑え、被験体における有害な副作用を最小限に抑えるように選択される。

組換えウイルス（または組換えアデノウイルスをコードする１つもしくは複数の核酸もしくはベクター）は、公知の方法に従って、例えば、静脈内投与、例えば、ボーラスまたは長期間にわたる連続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、関節内、関節滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、腫瘍内、または吸入の経路によって、投与される。投与は、局所的であっても全身的であってもよい。本組成物は、局所、経口、非経口、静脈内、関節内、腹腔内、筋肉内、皮下、体腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、経皮
、肝内、頭蓋内、噴霧化／吸入、または気管支鏡法を介した設置によるものを含む、複数の投与経路のうちのいずれかを介して投与することができる。したがって、本組成物は、局所的処置が所望されるか全身処置が所望されるかに応じて、また処置しようとする領域に応じて、いくつかの手段で投与される。

一部の実施形態では、投与のための組成物は、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解した、本明細書において記載される組換えアデノウイルス（または組換えゲノム）を含む。様々な水性担体、例えば、緩衝食塩水などを、使用することができる。これらの溶液は、滅菌であり、通常、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって、滅菌することができる。本組成物は、生理学的条件に近づけるために、必要に応じて、薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有してもよい。これらの製剤における活性な薬剤の濃度は、広範に変動し得、主として、選択された具体的な投与様式および被験体の必要性に応じて、流体の体積、粘度、体重などに基づいて、選択されるであろう。

医薬製剤、特に、組換えウイルスの医薬製剤は、所望される度合いの純度を有する組換えアデノウイルス（または組換えアデノウイルスをコードする１つもしくは複数の核酸）を、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって、調製することができる。そのような製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液であり得る。

許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度で、レシピエントにとって非毒性である。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、保存剤、低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミンもしくはゼラチン、または親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；ならびにアミノ酸、単糖類、二糖類、および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン；キレート剤；ならびにイオン性および非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート）；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤であり得る。組換えアデノウイルス（または組換えアデノウイルスをコードする１つもしくは複数の核酸）は、任意の適切な濃度の感染単位で、製剤化することができる。

経口投与に好適な製剤は、（ａ）液体溶液、例えば、希釈剤、例えば、水、生理食塩水、またはＰＥＧ ４００中に懸濁させた、有効量の組換えアデノウイルス、（ｂ）それぞれ所定の量の活性成分を液体、固体、顆粒、またはゼラチンとして含有するカプセル、サシェ剤（ｓａｃｈｅｔ）、または錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁物、および（ｄ）好適なエマルジョンからなり得る。錠剤形態には、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微晶質セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、加湿剤（ｍｏｉｓｔｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、保存剤、矯味矯臭剤、色素、崩壊剤、ならびに薬学的に適合性のある担体のうちの１つまたは複数が含まれ得る。ロゼンジ形態は、活性成分を、矯味矯臭薬、例えば、スクロース中に、ならびに活性成分に加えて当該技術分野において公知の担体を含有する、活性成分を不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアのエマルジョン、ゲルなどに含む香錠に、含み得る。

組換えアデノウイルス（または組換えアデノウイルスをコードする１つもしくは複数の核酸）は、単独または他の好適な構成成分と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる（すなわち、それらは、「噴霧化」することができる）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴霧体に入れることができる。

非経口投与、例えば、例として、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内、および皮下の経路によるものに好適な製剤としては、水性および非水性の等張性滅菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にするための溶質を含有し得る）、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁物が挙げられる。提供される方法において、組成物は、例えば、静脈内注入によって、経口、局所、腹腔内、膀胱内、腫瘍内、または髄腔内に、投与することができる。非経口投与、腫瘍内投与、および静脈内投与が、好ましい投与方法である。化合物の製剤は、単回用量または複数回用量の密封された容器、例えば、アンプルおよびバイアルで提示され得る。

注射溶液および懸濁物は、前述の種類の滅菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。医薬調製物は、好ましくは単位剤形にある。そのような形態では、調製物は、適切な量の活性な構成成分を含有する単位用量にさらに分割される。したがって、医薬組成物は、投与の方法に応じて、様々な単位剤形で投与され得る。例えば、経口投与に好適な単位剤形としては、粉末、錠剤、丸剤、カプセル、およびロゼンジが挙げられるが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、組成物は、異なるトランスジーンをコードする組換えアデノウイルスなどの、少なくとも２つの異なる組換えアデノウイルスを含む。一部の実施例では、組成物は、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの異なる組換えアデノウイルスを含む。

治療的適用において、組換えアデノウイルスまたはその組成物は、有効量または有効用量で被験体に投与される。組成物の単回または複数回投与は、必要に応じて投与されてもよい。「患者」または「被験体」には、ヒトおよび他の動物の両方、特に哺乳動物が含まれる。したがって、方法は、ヒト療法と獣医適用の両方に適用可能である。

組換えアデノウイルスの有効量は、個体ごとに決定され、少なくとも部分的に、使用される具体的な組換えアデノウイルス、個体のサイズ、年齢、性別、ならびに健康全般に基づく。例えば、ヒトへの投与については、少なくとも１０^３プラーク形成単位（ＰＦＵ）の組換えウイルスが使用され、増殖している細胞または存在する新生物の種類、サイズ、および数に応じて、例えば、少なくとも１０^４、少なくとも１０^５、少なくとも１０^６、少なくとも１０^７、少なくとも１０^８、少なくとも１０^９、少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１、または少なくとも１０^１２ＰＦＵ、例えば、およそ１０^３〜１０^１２ＰＦＵの組換えウイルスが使用される。有効量は、約１．０ｐｆｕ／体重ｋｇ〜約１０^１５ｐｆｕ／体重ｋｇ（例えば、約１０^２ｐｆｕ／体重ｋｇ〜約１０^１３ｐｆｕ／体重ｋｇ）であり得る。組換えアデノウイルスは、単回用量または複数回用量（例えば、２回、３回、４回、６回、またはそれよりも多い用量）で、投与される。複数回用量は、同時発生的または断続的に（例えば、数日間もしくは数週間の期間にわたって）投与され得る。

一部の実施形態では、提供される方法は、膵臓がんまたは膠芽腫などのがんの処置のために１つまたは複数の薬剤など、１つまたは複数の治療剤を被験体に投与することを含む。

治療用トランスジーンを有する本明細書において開示される合成アデノウイルスの投与は、他の抗がん剤または治療的処置（腫瘍の外科切除など）の投与を伴う可能性がある。任意の好適な抗がん剤は、本明細書において開示される組換えウイルスと組み合わせて投与することができる。例示的な抗がん剤としては、例えば、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、挿入抗生物質（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤（ａｎｔｉ−ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｇｅｎｔ）、生物学的応答修飾因子、抗ホルモン剤（例えば、抗アンドロゲン剤）、ＣＤＫ阻害剤および抗血管新生剤などの化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗がん処置としては、放射線療法およびがん細胞を特異的に標的化する他の抗体（例えば、生物製剤）が挙げられる。

アルキル化剤の非限定的な例としては、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタード、またはクロラムブシルなど）、アルキルスルホネート（ブスルファンなど）、ニトロソ尿素（カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジンなど）が挙げられる。

代謝拮抗物質の非限定的な例としては、葉酸類似体（メトトレキセートなど）、ピリミジン類似体（５−ＦＵまたはシタラビンなど）、およびプリン類似体、例えば、メルカプトプリンまたはチオグアニンが挙げられる。

天然産物の非限定的な例としては、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシンなど）、エピポドフィロトキシン（エトポシドまたはテニポシドなど）、抗生物質（ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシンＣなど）、および酵素（Ｌ−アスパラギナーゼなど）が挙げられる。

その他の薬剤の非限定的な例としては、白金配位錯体（シスプラチンとしても公知であるシス−ジアミン−ジクロロ白金ＩＩなど）、置換尿素（ヒドロキシ尿素など）、メチルヒドラジン誘導体（プロカルバジンなど）、および副腎皮質抑制剤（ミトタンおよびアミノグルテチミドなど）が挙げられる。

ホルモンおよびアンタゴニストの非限定的な例としては、副腎皮質ステロイド（プレドニゾンなど）、プロゲスチン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール（ｍａｇｅｓｔｒｏｌ ａｃｅｔａｔｅ）など）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールなど）、抗エストロゲン薬（タモキシフェンなど）、ならびにアンドロゲン（プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロンなど）が挙げられる。最も一般的に使用されている化学療法薬の例としては、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ−Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン、シスプラチン、シトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（または他のタキサン類、例えば、ドセタキセル）、ベルバン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６が挙げられるが、いくつかのより新しい薬物としては、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ハーセプチン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ−５７１、タキソテール、トポテカン（ハイカムチン）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼベリン（Ｚｅｖｅｌｉｎ）、およびカルチトリオールが挙げられる。

使用することができる免疫調節因子の非限定的な例としては、ＡＳ−１０１（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ−２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌａ．のＩｍｒｅｇより）、ＳＫ＆Ｆ １０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。

一部の種類のがんの別の一般的な処置は、外科処置、例えば、がんまたはその一部分の外科切除である。処置の別の例は、腫瘍を根絶させるか外科切除の前にそれを退縮させるのを補助するために、放射線療法、例えば、放射性材料またはエネルギー（外部光線療法など）を、腫瘍部位に投与することである。

ＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤は、ＣＤＫの機能を阻害する薬剤である。提供される方法において使用するためのＣＤＫ阻害剤の非限定的な例としては、ＡＧ−０２４３２２、ＡＴ７５１９、ＡＺＤ５４３８、フラボピリドール、インジスラム、Ｐ１４４６Ａ−０５、ＰＤ−０３３２９９１、およびＰ２７６−００が挙げられる（例えば、Ｌａｐｅｎｎａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、８巻、５４７〜５６６頁、２００９年を参照されたい）。他のＣＤＫ阻害剤としては、ＬＹ２８３５２１９、パルボシクリブ、ＬＥＥ０１１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、汎ＣＤＫ阻害剤ＡＴ７５１９、セリシクリブ（ｓｅｌｉｃｉｃｌｉｂ）、ＣＹＣ０６５、ブチロラクトンＩ、ヒメニアルジシン（ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ）、ＳＵ９５１６、ＣＩＮＫ４、ＰＤ０１８３８１２、またはファスカプリシン（ｆａｓｃａｐｌｙｓｉｎ）が挙げられる。

一部の実施例では、ＣＤＫ阻害剤は、広範囲阻害剤（フラボピリドール、オロモウシン、ロスコビチン、ケンパウロン、ＳＮＳ−０３２、ＡＴ７５１９、ＡＧ−０２４３２２、（Ｓ）−ロスコビチン、またはＲ５４７など）である。他の実施例では、ＣＤＫ阻害剤は、特異的阻害剤（ファスカプリシン、リュビジン（ｒｙｕｖｉｄｉｎｅ）、プルバラノール（ｐｕｒｖａｌａｎｏｌ）Ａ、ＮＵ２０５８、ＢＭＬ−２５９、ＳＵ ９５１６、ＰＤ０３３２９９１、またはＰ−２７６−００など）である。

薬剤および投薬量の選択は、処置されている所与の疾患に基づいて、当業者によって容易に決定することができる。薬剤または組成物の組合せは、並行して（例えば、１つの混合物として）、別個であるが同時に（例えば、別個の静脈ラインを介して）、または順次に（例えば、１つの薬剤がまず投与され、その後に第２の薬剤が投与される）のいずれかで投与され得る。したがって、組合せという用語は、２つまたはそれよりも多い薬剤または組成物の並行投与、同時投与、または順次投与を指して使用される。

以下の実施例は、ある特定の具体的な特性および／または実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、本開示を、記載される特定の特性または実施形態に限定するとみなされるものではない。

（実施例１）
Ａｄ５／Ａｄ３４キメラファイバータンパク質および肝臓脱標的化修飾を発現する合成アデノウイルス
Ａｄ５のファイバータンパク質および多くの他の血清型は、細胞付着のためにＣＡＲに結合することが示される一方、他の血清型は、ＣＤ４６（Ｇａｇｇａｒら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ９巻：１４０８〜１４１２頁、２００３年）、デスモグレイン２（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ Ｍｅｄ １７巻：９６〜１０４頁、２０１１年）、シアル酸（Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｎａｔ Ｍｅｄ １７巻：１０５〜１０９頁、２０１１年）、またはその他（Ａｒｎｂｅｒｇ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ３３巻：４４２〜４４８頁、２０１２年）を使用することが示される。多くの血清型の受容体利用について徹底的には調査されておらず、ＣＤ４６は成熟マウスにおいて発現されるとは考えられていない。

Ａｄｓｅｍｂｌｙ／ＡｄＳＬＩＣ（参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ ２０１２／０２４３５１号を参照されたい）を使用して、キメラファイバータンパク質を有する合成アデノウイルスを生成した。ファイバータンパク質のＣ末端における球状ノブは、典型的に、受容体結合を担うため、キメラファイバータンパク質を有するウイルスを、Ａｄ５ファイバーノブをＡｄ３４由来のファイバーノブと置き換えることによって作出した（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６）。対照ウイルス（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１）はＡｄ５ファイバータンパク質を含有する（すなわち、シャフトおよびノブドメインの両方がＡｄ５に由来する）。両ウイルスを、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ欠失を含有する同一のＥ１モジュールとＥＦ１αプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ−ＧＦＰ融合体を用いて作出した（表１）。組換えウイルスはまた、肝臓脱標的化修飾も含む。天然Ａｄ５ベクターは、肺（吸入による）または肝臓（静脈内投与による）のみに感染する。Ａｄ５ヘキソンは、血中の第Ｘ因子に結合し、これは、肝臓におけるＫｕｐｐｆｅｒ細胞によるその吸収を導き、全身播種を防止し、炎症の制限を誘導する。これを克服し、代わりの細胞型への全身投与を可能にするために、肝臓における取り込みおよび発現を防止するＥ１およびコア領域にさらなるゲノム修飾を含むよう合成アデノウイルスを操作した。具体的には、両ウイルスは、肝臓において特異的に発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２）に対するトランスジーンの３’ＵＴＲ中における結合部位、およびヘキソン中におけるＥ４５１Ｑ変異を含む。

（実施例２）
Ａｄ３４ノブドメインを発現する合成アデノウイルスは、腫瘍間質に対する指向性を示す
この実施例は、Ａｄ３４ノブドメインを有するキメラファイバータンパク質を発現するＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６が、腫瘍間質に特異的に移動するという知見について説明する。
膵腫瘍モデル

図１Ａは、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄ／ｐ５３膵腫瘍モデルの概略図を示す。「Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３」と示されるマウスは、ＬｏｘＰ−終止コドン−ＬｏｘＰをコードする配列の下流にＫｒａｓ^Ｇ１２Ｄ発癌遺伝子をコードする。終止コドンは、Ｃｒｅリコンビナーゼの非存在下で、変異体Ｋｒａｓ（Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄ）の発現を遮断する。しかし、Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下では、終止コドンは除去され、Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄ発癌遺伝子の発現を可能とする。これらの同一マウスでは、ｐ５３遺伝子の両方の対立遺伝子にＬｏｘＰ部位が隣接している（ＬｏｘＰ−ｐ５３−ＬｏｘＰ）。「ｐ５３／ｐ５３；Ｃｒｅ」と示したマウスも、ｐ５３遺伝子の両方の対立遺伝子にＬｏｘＰが隣接しており（ＬｏｘＰ−ｐ５３−ＬｏｘＰ）、これらは膵臓および十二指腸ホメオボックス１（Ｐｄｘ１）プロモーターによって駆動されるＣｒｅリコンビナーゼトランスジーンを発現する。Ｐｄｘ１は、膵臓細胞において特異的に発現される遺伝子であり、したがって、ｐ５３の両方のコピーは膵臓細胞において欠失する。系統間の掛け合わせによって、Ｐｄｘ１プロモーターによって駆動されるＣｒｅが膵臓細胞における腫瘍抑制因子ｐ５３の両方の対立遺伝子の欠失および変異体Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄの活性化を媒介する子孫を生じる。「Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３；Ｃｒｅ」と示したホモ接合性マウスは、５〜７週で膵腫瘍を生じる。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を、Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３およびＫｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３；Ｃｒｅマウスに静脈内注射した。ウイルス注射の７２時間後、組織を収集し、ルシフェリンと共に５分間インキュベートし、次いで、ＩＶＩＳ（商標）画像化システムを使用して５分間スキャンした。図１Ｂに示すように、Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３マウスは正常な膵臓を有し、ルシフェラーゼシグナルは主に脾臓に由来した。対照的に、Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３；Ｃｒｅマウスは膵腫瘍を有し、シグナルは主に膵腫瘍に由来した。

別の研究は、Ｃｒｅ媒介遺伝子操作ヘテロ接合性モデルにおいて実施した（図２Ａ）。「ｐ５３／＋；Ｃｒｅ」と示したマウスは、１つの野生型ｐ５３対立遺伝子および１つのＬｏｘＰ部位が隣接したｐ５３対立遺伝子（ＬｏｘＰ−ｐ５３−ＬｏｘＰ）を有する。Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３とｐ５３；＋；Ｃｒｅ系統の間の掛け合わせによって、Ｐｄｘ１プロモーターによって駆動されるＣｒｅリコンビナーゼが膵臓細胞における腫瘍抑制因子ｐ５３の単一の対立遺伝子の欠失および変異体Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄの活性化を媒介する子孫を生じる。「Ｋｒａｓ；ｐ５３／＋；Ｃｒｅ」と示したこれらのヘテロ接合性マウスは、これらがｐ５３の１つの野生型対立遺伝子を有するという事実によって、寿命の後半（４〜９カ月齢で）腫瘍を生じる。この野生型対立遺伝子は、膵腫瘍が生じるためには、失われるかまたは変異されなければならない。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を、４カ月齢のｐ５３／＋；ＣｒｅおよびＫｒａｓ；ｐ５３／＋；Ｃｒｅマウスに静脈内注射した。ウイルス注射の７２時間後、組織を収集し、ルシフェリンと共に５分間インキュベートし、次いで、ＩＶＩＳ（商標）画像化システムを使用して１分間スキャンした。ｐ５３／＋；Ｃｒｅマウスは正常な膵臓を有し、シグナルは主に脾臓に由来した。対照的に、４カ月齢のＫｒａｓ；ｐ５３／＋；Ｃｒｅマウスは膵腫瘍を有し、シグナルは主に腫瘍および肝臓に由来した。

ヘテロ接合性Ｋｒａｓ；ｐ５３／＋；Ｃｒｅマウスは、４〜９カ月で膵腫瘍を生じる。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６が腫瘍発生の非常に早期の段階で（腫瘍が目に見える前に）膵腫瘍に感染できるかどうかを試験するために、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を２カ月齢のＫｒａｓ；ｐ５３／＋；Ｃｒｅマウスに静脈内注射した。ウイルス注射の７２時間後、組織を収集し、ルシフェリンと共に５分間インキュベートし、ＩＶＩＳ（商標）画像化システムを使用して４分間スキャンした。２カ月齢のＫｒａｓ；ｐ５３／＋；Ｃｒｅマウスの膵臓は正常に見えたが、ルシフェラーゼシグナルがこの組織において見出された（図３Ａ）。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６に感染した後の膵臓の組織像を評価するためにＨ＆Ｅ染色を実施した。比較として、図３Ｂは、正常な膵臓組織と膵腫瘍組織の典型的組織像を示す。２カ月齢のＫｒａｓ；ｐ５３／＋；Ｃｒｅマウスの膵臓のＨ＆Ｅ染色は、膵臓の小部分が腫瘍を生じたことを示したが（図３Ｃ、多角形によって示した）、一方、膵臓組織のほとんどは正常に見えた。この結果は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６は非常に早期の段階で膵腫瘍に感染することができることを示した。

膵腫瘍では、ほんの１０％の細胞だけががん細胞であり、残りの９０％は間質細胞である。どの細胞型がＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６によって標的化されたかを決定するために、ＩＨＣおよびＩＦ染色を実施した。ＣＫ１９は腫瘍細胞のマーカーであり、一方、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）は間質細胞のマーカーである。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６に感染した膵腫瘍のＩＨＣ染色は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６から発現したＧＦＰがＳＭＡ染色と重複したことを示し、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６が間質細胞を標的化したことを示した（図４Ａ）。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６に感染した膵腫瘍のＩＦ染色はまた、ＧＦＰがＳＭＡ染色と重複したことを実証し（図４Ｂ）、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６が間質細胞に感染することを確認した。
膠芽腫モデル

図５Ａに示されるのは、Ｃｒｅ媒介遺伝子操作膠芽腫モデルの模式図である。レンチウイルスをＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスの脳に直接注射した。グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターによって駆動されるＣｒｅリコンビナーゼは、レンチウイルスにコードされた遺伝子からＲＦＰを切断し、星状細胞において主にＨＲａｓ^Ｖ１２およびＧＦＰの発現を誘導する。レンチウイルスにコードされたＵ６−ｐ５３ ｓｈＲＮＡの発現は、ウイルスを取り込む脳細胞のｐ５３の発現をノックダウンする。ＨＲａｓ^Ｖ１２の発現およびｐ５３のノックダウンは、注射の１週間後に脳において腫瘍形成を誘導する。ＧＦＰシグナルを使用して、膠芽腫の形成を示す。生理食塩水、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１、またはＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を、４週間早く腫瘍を誘導するレンチウイルスを受けたＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスに静脈内（ＩＶ）投与によって注射した。ウイルス注射の４８時間後、マウスを、ルシフェリンの腹腔内注射の５分後に、ＩＶＩＳ（商標）画像化システムを使用して１分間スキャンした（図５Ｂ）。ルシフェラーゼシグナルをＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６に感染したマウスにおいて検出したが、生理食塩水またはＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１を注射したマウスでは検出されなかった。

野生型マウス（正常な脳）および腫瘍を誘導するレンチウイルスの注射を受けたＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスに、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１またはＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を注射した。合成アデノウイルスの注射の７２時間後に脳組織を収集し、ルシフェリンと共に５分間インキュベートし、ＩＶＩＳ（商標）画像化システムを使用して５分間スキャンした（図５Ｃ）。腫瘍を誘導するレンチウイルスを注射したＧＦＡＰ−ＣｒｅマウスのみがＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６からのルシフェラーゼシグナルを示した。このことは、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６が、腫瘍が存在する場合にのみ、脳組織に移動することを実証する。脳組織をＧＦＰシグナルについてもスキャンした（図５Ｄ）。ＧＦＰシグナルを使用して膠芽腫を特定する。腫瘍を誘導するレンチウイルスを受けたＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスの両方が脳内にＧＦＰシグナルを有したが、一方、野生型マウスではＧＦＰは検出されなかった。ＧＦＰシグナルは、腫瘍を誘導するレンチウイルスおよびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を受けたＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスにおけるルシフェラーゼシグナルと完全に重複した。

腫瘍を誘導するレンチウイルスの注射は、注射部位で、脳に一時的損傷をもたらす。合成アデノウイルス（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６）をレンチウイルスの最初の注射の４週間後に注射したが、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６の膠芽腫への移動が腫瘍または注射部位の損傷によって駆動されたかどうかは依然として明らかではなかった。この疑問に答えるために、注射なし、偽の注射または腫瘍を誘導するレンチウイルスの注射のいずれかの４週間後に、ＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスに合成アデノウイルスを注射した。ＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスに、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）または腫瘍を誘導するレンチウイルスのいずれかを注射した。４週間後、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１を静脈内注射した。図６Ａに示すように、いずれのマウス群でも、脳内に、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１由来のルシフェラーゼシグナルは存在しなかった。ＧＦＡＰ−ＣｒｅマウスにＨＢＳＳもしくは腫瘍を誘導するレンチウイルスを注射したか、またはＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスは注射を受けなかった。４週間後、マウスにＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を静脈内注射した。図６Ｂに示すように、ルシフェラーゼシグナルは腫瘍を誘導するレンチウイルスを受けたマウスの脳内でのみ検出されたが、一方、ＨＢＳＳを受けたかまたは注射を受けなかったマウスはシグナルを生じなかった。これらの結果は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６の特異性は腫瘍によって駆動されるが、注射部位の損傷によっては駆動されないことを実証する。
（実施例３）
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６は、異種移植片モデルにおいてヒト膠芽腫腫瘍に移動する

この実施例は、Ａｄ３４ノブドメインを有するキメラファイバータンパク質を発現する合成アデノウイルスがヒト膠芽腫腫瘍を標的化することができるという知見について説明する。

Ｕ８７−ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞株は、腫瘍増殖のモニタリングを可能とするレポーターとしてｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質を発現するヒト膠芽腫細胞株である。Ｕ８７−ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞をＮＳＧマウスに頭蓋内注射し、膠芽腫腫瘍を生じさせると、典型的に、腫瘍が生じるのに４〜８週間かかる（図７Ａ）。この膠芽腫異種移植片モデルを使用して、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６がヒト膠芽腫腫瘍に移動することができるかどうかを決定した。マウスがＵ８７−ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞の頭蓋内注射を受けた４週間後に、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１（配列番号１）およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６（配列番号２）を、尾静脈注射によって、ＮＳＧマウスに静脈内注射した。ウイルス注射の４８時間後に、肝臓、脾臓および脳組織を収集し、ルシフェリンと共に５分間インキュベートし、次いで、ＩＶＩＳ（商標）画像化システムを使用して１分間スキャンした。図７Ｂに示すように、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６を注射したマウスのみが、脳内にルシフェラーゼシグナルを示し、このシグナルはｔｄＴｏｍａｔｏ発現と完全に重複した。したがって、これらの結果は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６はヒト膠芽腫腫瘍に移動することができるが、一方、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１は移動できないことを実証する。
（実施例４）
腫瘍間質を標的化し、治療用トランスジーンを発現する合成アデノウイルスは、動物モデルの腫瘍サイズを低減する

この実施例は、Ａｄ３４ノブドメインおよび治療ペイロードを有するキメラファイバータンパク質を発現する合成アデノウイルスが腫瘍間質を追跡し、腫瘍サイズを低減することができることを実証する。

腫瘍の処置を可能にするために、治療用トランスジーンがＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６（配列番号２）に組み込まれ得るどうかを決定するために研究を実施した。この研究を行うために、ＫＰＣＬ（Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；ｐ５３ノックアウト；Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ホタルルシフェラーゼ）マウスモデルを使用した（図８Ａ）。ＫＰＣＬマウスは、膵臓でＫｒａｓ^Ｇ１２Ｄを特異的に発現し、膵臓でのみノックアウトされたｐ５３遺伝子を有する、ホモ接合性「Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３；Ｃｒｅ」マウスと類似する。しかし、ＫＰＣＬマウスは、膵臓においてホタルルシフェラーゼも特異的に発現する。ＫＰＣＬマウスにおける腫瘍の発生は、「Ｋｒａｓ；ｐ５３／ｐ５３；Ｃｒｅ」マウスに対するものとも類似する。

２つのさらなる合成アデノウイルス、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７（配列番号５）およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８９（配列番号６）を生成した。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６に基づく合成アデノウイルスである。単純ヘルペスウイルス−１チミジンキナーゼ（ＴＫ）／ガンシクロビル（ＧＣＶ）自殺遺伝子をＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６にクローニングし、ホタルルシフェラーゼ／ＧＦＰ遺伝子を置き換えた。ウミシイタケルシフェラーゼをＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７６のゲノムのＴＫの直後にも挿入した。対照ウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８９を、ＴＫ−Ｐ２Ａ−ウミシイタケルシフェラーゼをＡｄＳｙｎ−ＣＯ１７１にクローニングして元のホタルルシフェラーゼ／ＧＦＰ遺伝子を置き換えることによって生成した。

ＫＰＣＬマウスに、５〜６週齢のＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７またはＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８９を１×１０^６ＰＦＵ、尾静脈を介して静脈内注射した。２日後、マウスに、ＧＣＶをｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．注射した。３つの対照群を使用した：ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８９＋ＧＣＶ；ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７に続いて生理食塩水を注射（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７＋生理食塩水）；およびＧＣＶ注射のみ（ｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．）。図８Ｂは、各処置群に対するＫＰＣＬマウスの平均生存期間を示す表を提供する。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７＋ＧＣＶによる処置は、対照と比較して、マウスの生存期間を延長した。

腫瘍によって発現したホタルルシフェラーゼシグナルを処置の間分析し、腫瘍増殖をモニタリングした。結果を図８Ｃに示す。マウスＺ６１９Ｒに対する処置は、対照としての役割を果たすＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７＋生理食塩水であった。マウスＺ６０１ＲおよびＺ６０７ＲをＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７＋ＧＣＶ（ｉ．ｐ．）で処置した。ホタルルシフェラーゼシグナルの強度は対照マウスＺ６１９Ｒにおいて増加したが（腫瘍サイズの増加を示す）、一方、マウスＺ６０１ＲおよびＺ６０７Ｒにおいてはシグナルは低下した（腫瘍サイズの低減を示す）。

膵腫瘍の組織像をＨ＆Ｅ染色によっても評価した（図９Ａ）。マウスＺ６５５、１８０６、Ｚ６１９およびＺ６２１はすべて対照マウスであった。マウスＺ６５５を、ＧＣＶのみをｉ．ｐ．注射により処置し；マウス１８０６を、ＧＣＶのみをｉ．ｖ．注射により処置し；マウスＺ６１９を、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７＋生理食塩水で処置し；かつマウスＺ６２１は処置を受けなかった。マウスＺ６５６は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９８７＋ＧＣＶのｉ．ｖ．による処置を受けた。対照と比較して、Ｚ６５６由来の腫瘍は、より大きな領域の壊死を有した（図９Ｂ）。

本開示の原理を適用することができる多数の可能性のある実施形態を考慮して、例示された実施形態が、本発明の例にすぎず、本発明の範囲を限定するものとして捉えられるものではないことを認識されたい。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定められる。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および趣旨の範囲内のものすべてに関して、本発明者らの発明として権利を主張する。

Claims (37)

1. 被験体の腫瘍細胞においてトランスジーンを発現させる方法であって、
   前記トランスジーン、
   合成アデノウイルスを肝臓から脱標的化する本来のまたは修飾されたキャプシド、ならびに
   アデノウイルス３４型（Ａｄ３４）ファイバータンパク質、またはアデノウイルス５型（Ａｄ５）シャフトドメインおよびＡｄ３４ノブドメインを含むキメラファイバータンパク質
   を含む前記合成アデノウイルスを前記被験体に投与することを含む、方法。
2. 前記トランスジーンが診断用トランスジーンである、請求項１に記載の方法。
3. 前記診断用トランスジーンが蛍光タンパク質をコードする、請求項２に記載の方法。
4. 前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、または橙色蛍光タンパク質を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記診断用トランスジーンが酵素をコードする、請求項２に記載の方法。
6. 前記酵素がルシフェラーゼである、請求項５に記載の方法。
7. 前記診断用トランスジーンが、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）レポーター遺伝子を含む、請求項２に記載の方法。
8. 前記トランスジーンが治療用トランスジーンである、請求項１に記載の方法。
9. 前記治療用トランスジーンが抗がん剤をコードする、請求項８に記載の方法。
10. 前記治療用トランスジーンが、腫瘍間質細胞を破壊または殺滅する薬剤をコードする、請求項８に記載の方法。
11. 腫瘍を有すると被験体を診断する方法であって、
    診断用トランスジーン、
    合成アデノウイルスを肝臓から脱標的化する本来のまたは修飾されたキャプシド、ならびに
    アデノウイルス３４型（Ａｄ３４）ファイバータンパク質、またはアデノウイルス５型（Ａｄ５）シャフトドメインおよびＡｄ３４ノブドメインを含むキメラファイバータンパク質
    を含む前記合成アデノウイルスを前記被験体に投与することを含む、方法。
12. 前記診断用トランスジーンが、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）レポーター遺伝子を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記診断用トランスジーンが蛍光タンパク質をコードする、請求項１１に記載の方法。
14. 前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、または橙色蛍光タンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記診断用トランスジーンが酵素をコードする、請求項１１に記載の方法。
16. 前記酵素がルシフェラーゼである、請求項１５に記載の方法。
17. 被験体の腫瘍を処置する方法であって、
    治療用トランスジーン、
    合成アデノウイルスを肝臓から脱標的化する本来のまたは修飾されたキャプシド、ならびに
    アデノウイルス３４型（Ａｄ３４）ファイバータンパク質、またはアデノウイルス５型（Ａｄ５）シャフトドメインおよびＡｄ３４ノブドメインを含むキメラファイバータンパク質
    を含む前記合成アデノウイルスを前記被験体に投与することを含む、方法。
18. 前記治療用トランスジーンが抗がん剤をコードする、請求項１７に記載の方法。
19. 前記治療用トランスジーンが、腫瘍間質細胞を破壊または殺滅する薬剤をコードする、請求項１７に記載の方法。
20. 前記合成アデノウイルスが、前記合成アデノウイルスを前記肝臓から脱標的化する修飾されたキャプシドを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記合成アデノウイルスが修飾されたヘキソンタンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記修飾されたヘキソンタンパク質がＥ４５１Ｑ変異を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記合成アデノウイルスが、肝臓特異的マイクロＲＮＡに対する１つまたは複数の結合部位をさらに含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記肝臓特異的マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１２２である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記１つまたは複数の結合部位が、前記トランスジーンの３’ＵＴＲ中にある、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
26. 前記合成アデノウイルスが、脾臓特異的マイクロＲＮＡに対する１つまたは複数の結合部位をさらに含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記脾臓特異的マイクロＲＮＡがｍｉＲ１４２−３ｐである、請求項２６に記載の方法。
28. 前記１つまたは複数の結合部位が、前記トランスジーンの３’ＵＴＲ中にある、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
29. 前記トランスジーンの発現が、組織特異的プロモーターによって調節される、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記合成アデノウイルスが、Ａｄ５ベクターゲノムから生じる、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記合成アデノウイルスが、Ａｄ５キャプシドタンパク質ならびにＡｄ５シャフトドメインおよびＡｄ３４ノブドメインを含むキメラファイバータンパク質を含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記腫瘍が膵腫瘍である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記腫瘍が膠芽腫である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記合成アデノウイルスのゲノムが、配列番号２または配列番号５に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記合成アデノウイルスの前記ゲノムが、配列番号２または配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載の方法。
36. 配列番号２または配列番号５に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む合成アデノウイルスゲノム。
37. 配列番号２または配列番号５を含む、請求項３６に記載の合成アデノウイルスゲノム。

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