ES2827012T3 - Uso de vectores virales oncolíticos en el tratamiento del retinoblastoma - Google Patents

Abstract

Composición que comprende un adenovirus oncolítico para su uso en el tratamiento del retinoblastoma en la prevención, eliminación o disminución de las metástasis, neoplasias secundarias y/o el retinoblastoma trilateral asociados al retinoblastoma, caracterizada porque dicho adenovirus oncolítico comprende: - una secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en su genoma; y - una maquinaria replicativa específica para células tumorales.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de vectores virales oncolíticos en el tratamiento del retinoblastoma

La presente invención se refiere al sector de la medicina, más concretamente al sector de la oncología.

El retinoblastoma es el tumor maligno intraocular más común en niños, con una incidencia de 1/17000 recién nacidos. Se desarrolla en la retina, dado que suele crecer debajo de ésta y hacia la cavidad vítrea, a partir de células que presentan variantes que predisponen al cáncer en sus dos copias del gen Rb1, ya sea por mutación heredada o adquirida. Se trata de una patología que normalmente ocurre antes de los cinco años de vida y que puede ser esporádica o hereditaria, si el gen Rb1 está mutado en la línea germinal.

El retinoblastoma, según su manifestación puede ser unifocal o multifocal y unilateral (representan el 65% de los casos) o bilateral (representan el 35% restante - con mutación germinal del gen Rb1). En el caso del retinoblastoma unilateral, únicamente se presenta en uno de los ojos del paciente, y la edad media en el momento del diagnóstico es de 24 meses; y en el caso del retinoblastoma bilateral, dicho retinoblastoma se presenta en ambos ojos, y la edad media en el momento del diagnóstico es de 15 meses.

El tratamiento actual del retinoblastoma se focaliza, en primera instancia, en la supervivencia del paciente y, en segunda instancia, en la preservación de la vista. El tratamiento óptimo suele ser complejo e implica a expertos de múltiples disciplinas de la medicina, tales como oftalmólogos, pediatras oncólogos, oncólogos radiólogos, entre otros. Existen diferentes opciones terapéuticas, entre las que destacan: la quimioterapia sistémica u ocular local, la radioterapia, la crioterapia, la terapia con láser y la cirugía (enucleación del ojo afectado). La elección del régimen terapéutico depende de múltiples factores, tales como estadiaje del tumor, si el tumor es unifocal o multifocal y unilateral o bilateral, localización y tamaño del tumor, entre otros. Por el impacto en el ojo y en las funciones del mismo, normalmente la terapia preferente o de elección es la quimioterapia. Sin embargo, existe el problema de que la quimioterapia a altas dosis es altamente tóxica y que en un porcentaje de casos el tumor desarrolla resistencia a dicho tratamiento. En estos casos, actualmente, la única opción terapéuticamente viable para preservar la vida del paciente es la enucleación.

Adicionalmente, pese a que el retinoblastoma como tal es una patología muy curable, el peligro radica fundamentalmente en el desarrollo de metástasis, neoplasias secundarias o retinoblastoma trilateral. En estos casos, el pronóstico es más adverso dado que no existen opciones terapéuticas claras y efectivas para su tratamiento.

La terapia génica y la viroterapia utilizan virus con propósitos terapéuticos contra el cáncer. En la terapia génica el virus se modifica para impedir su replicación y para servir de vehículo o vector de material genético terapéutico. Por el contrario, la viroterapia utiliza virus que se replican y propagan selectivamente en las células tumorales. En viroterapia, la célula tumoral muere por el efecto citopático causado por la replicación del virus en su interior más que por el efecto de un gen terapéutico. La replicación preferencial en una célula tumoral se denomina oncotropismo y la lisis del tumor se denomina oncolisis. En un sentido estricto, los virus que se replican selectivamente en tumores se denominan oncolíticos, aunque en un sentido más amplio la palabra oncolítico se puede aplicar a cualquier virus replicativo capaz de lisar células tumorales, aunque sin selectividad. En esta descripción el término oncolítico se utiliza en los dos sentidos.

La viroterapia del cáncer es muy anterior a la terapia génica. Las primeras observaciones de curaciones de tumores con virus datan de principios del siglo pasado. Ya en 1912 De Pace obtuvo regresiones tumorales tras inocular el virus de la rabia en carcinomas cervicales. Desde entonces, se han inyectado muchos tipos de virus en tumores para su tratamiento. Hay virus que presentan un oncotropismo natural como por ejemplo el parvovirus autónomo, el virus de la estomatitis vesicular y el reovirus. Otros virus se pueden manipular genéticamente para que se repliquen selectivamente en tumores. Por ejemplo el Virus del Herpes Simple (HSV, por sus siglas en inglés) se ha hecho oncotrópico al eliminar el gen de la ribonucleótido reductasa, una actividad enzimática dispensable en células en proliferación activa como las células tumorales. Sin embargo, el adenovirus, por su baja patogenicidad y alta capacidad de infectar células tumorales ha sido el virus más utilizado tanto en viroterapia como en terapia génica del cáncer.

Se han identificado 51 serotipos de adenovirus humanos y clasificado en 6 grupos diferenciados del A al F.

El adenovirus humano serotipo 5 (Ad5), que pertenece al grupo C, es un virus formado por una cápside proteica icosaédrica que encierra un ácido desoxirribonucléico (ADN) lineal de 36 kilobases. En adultos la infección con Ad5 suele ser asintomática y en niños causa un resfriado común y conjuntivitis. En general el Ad5 infecta células epiteliales, que en el curso de una infección natural son las células del epitelio bronquial. Entra en la célula por medio de la interacción de la fibra, proteína viral que se extiende a modo de antena desde los doce vértices de la cápside, con una proteína celular implicada en adhesión intercelular llamada Receptor de Coxsackie-Adenovirus (CAR, por sus siglas en inglés). Cuando el ADN viral llega al interior del núcleo empieza ordenadamente la transcripción de los genes tempranos (E1 a E4) del virus. Los primeros genes virales que se expresan corresponden a los genes de la región temprana 1A (E1A). E1A se une a la proteína celular del retinoblastoma para liberar E2F y activar así la transcripción de otros genes virales como E2, E3 y E4 y de los genes celulares que activan el ciclo celular. Por otro lado, E1B se une a la proteína p53 para activar el ciclo celular e impedir la apoptosis de la célula infectada. E2 codifica para proteínas de replicación del virus; E3 codifica proteínas que inhiben la respuesta inmune antiviral; E4 codifica para proteínas de transporte de ARN viral. La expresión de los genes tempranos conduce a la replicación del ADN viral, y una vez replicado éste, se activa el promotor tardío principal que conduce a la expresión de un transcrito de ácido ribonucléico (ARN) mensajero que por corte y empalme diferencial genera todos los ARN que codifican para las proteínas estructurales que forman la cápside.

Hay dos aspectos importantes a considerar en relación con el diseño de adenovirus oncolíticos: la selectividad y la potencia. Para conseguir selectividad hacia la célula tumoral se han usado tres estrategias: la eliminación de funciones virales que son necesarias para la replicación en células normales, pero prescindibles en células tumorales; el control de los genes virales que inician la replicación por promotores selectivos de tumor; y la modificación de las proteínas de la cápside viral implicadas en la infección de la célula huésped. Con estas modificaciones genéticas se ha conseguido un nivel de selectividad considerable, con una capacidad replicativa en célula tumoral del orden de 10000 veces superior a la capacidad replicativa en la célula normal. Con respecto a la potencia oncolítica también se han descrito diversas modificaciones genéticas para aumentarla. Estas modificaciones incluyen: a) el aumento de la liberación viral, por ejemplo mediante la eliminación de E1B19K, la sobreexpresión de E3-11.6K (ADP), o la relocalización de la proteína E3/19K en la membrana plasmática; y b) la inserción de un gen terapéutico en el genoma del adenovirus oncolítico para generar un "adenovirus oncolítico armado". En este caso, el gen terapéutico debería mediar la muerte de las células cancerígenas no infectadas mediante la activación de un profármaco con efecto adyacente (es decir, que mata a las células vecinas no infectadas), la activación del sistema inmune contra el tumor, la inducción de la apoptosis, la inhibición de la angiogénesis, o la eliminación de la matriz extracelular, entre otros. En estos casos, la forma y el tiempo de expresión del gen terapéutico serán críticos en el resultado final de la aproximación terapéutica.

Sin embargo, los principales obstáculos que ha encontrado la terapia adenoviral en su aplicación clínica son la respuesta inmune, preexistente o generada con la primera o sucesivas inyecciones del adenovirus; y la dificultad de los adenovirus de distribuirse eficientemente por toda Ia masa tumoral, es decir, de no únicamente infectar las células de la superficie del tumor sino de llegar también a las que se encuentran en el interior del mismo. Esta última dificultad se ha descrito también para otros fármacos anticancerígenos como Ia doxorubicina, el taxol [paclitaxel], Ia vincristina o el metotrexato y estaría relacionada con la matriz extracelular del tumor (implicada en Ia resistencia de las células tumorales a los fármacos quimioterapéuticos, BP Toóle et al., "Hyaluronan: a constitutive regulator of chemoresistance and malignancy in cancer cells", Seminars in cancer biology 2008, vol. 18, pp. 244-50). Las células tumorales y las del estroma del tumor producen y ensamblan una matriz de colágenos, proteoglicanos y otras moléculas que dificultan el transporte de macromoléculas por el interior del tumor. El ácido hialurónico es uno de los principales componentes de dicha matriz extracelular implicado en la resistencia de las células tumorales a los fármacos terapéuticos. El ácido hialurónico se encuentra sobreexpresado en una gran variedad de tejidos malignos, y en muchos casos los niveles de dicho ácido son un factor pronóstico de progresión tumoral. La interacción del ácido hialurónico con los receptores CD44 y RHAMM incrementa la supervivencia tumoral y la invasión. Además el ácido hialurónico puede promover las metástasis tumorales mediante la inducción de la adhesión y la migración celular, y la protección frente al sistema inmunológico.

Por otra parte, se ha descrito que la inhibición de las interacciones entre el ácido hialurónico y las células tumorales revierte la resistencia a gran cantidad de fármacos. Diferentes trabajos han indicado que las hialuronidasas, enzimas encargados de la degradación del ácido hialurónico, aumentan la actividad de diferentes quimioterapias en pacientes con melanoma, sarcoma de kaposi, cáncer de cabeza y cuello y metástasis hepáticas de colon. El mecanismo de acción de las hialuronidasas es aún desconocido, pero por Io general se atribuye a una disminución de las barreras de adhesión celular, una disminución de la presión intersticial y una mejora en la penetración del fármaco anticancerígeno en el tumor, más que a sus efectos inhibitorios de las vías de señalización relacionadas con Ia supervivencia celular.

Las enzimas hialuronidasas son una familia de enzimas encargadas de degradar el ácido hialurónico. En la especie humana actualmente se han localizado 6 genes que codifican para enzimas hialuronidasas con propiedades y localizaciones diferentes. Las isoformas Hyal1 y Hyal2 se encuentran en la mayoría de tejidos, siendo Hyal1 la forma predominante en el plasma humano. La Hyal3 se localiza en medula ósea y en los testículos, pero su función no está bien caracterizada. La enzima hialuronidasa PH20 se encuentra altamente expresada en los testículos y está implicada en el proceso de fertilización del oocito por parte del espermatozoide. La enzima hialuronidasa PH20 se encuentra anclada en la membrana plasmática y en la membrana acrosomal interna de los espermatozoides y confiere al espermatozoide la capacidad para penetrar a través de la matriz extracelular de las células del cumulus (rica en ácido hialurónico) para alcanzar la zona pelúcida del oocito. Durante la reacción acrosomal, parte de las enzimas hialuronidasas ancladas en la membrana del espermatozoide son procesadas enzimáticamente para dar lugar a una forma soluble de la proteína que es liberada de la membrana acrosomal. La proteína de membrana PH20, es la única enzima de la familia de las hialuronidasas de mamífero con actividad a pH neutro.

En vista de lo anterior, existe, la necesidad de disponer de terapias alternativas y más eficaces que las actuales para el tratamiento del retinoblastoma. Adicionalmente, dichos tratamientos alternativos son especialmente necesarios cuando el tumor desarrolla resistencia a la quimioterapia a las dosis máximas permitidas y/o las dosis a utilizar muestran niveles de toxicidad demasiado elevados, para evitar la enucleación de uno o ambos ojos (para los casos cuando las diferentes alternativas de tratamiento con quimioterapia no presentan efectos positivos). También se necesitan nuevas alternativas terapéuticas que permitan eliminar o disminuir el riesgo de que el paciente desarrolle metástasis, neoplasias secundarias o retinoblastoma trilateral.

Los inventores de la presente invención, tras extensos y exhaustivos experimentos, han descubierto sorprendentemente que es posible utilizar adenovirus oncolíticos modificados genéticamente para el tratamiento del retinoblastoma y que, dichos adenovirus oncolíticos permiten eliminar o disminuir el riesgo de metástasis, neoplasias secundarias y/o retinoblastoma trilateral. Los resultados obtenidos por los inventores de la presente invención resultan sorprendentes por varios motivos, entre los que destaca el hecho de que el citado adenovirus oncolítico modificado no resulta competente para infectar líneas celulares derivadas de algunos tumores y en cambio sí lo es para líneas celulares derivadas de retinoblastoma; y, adicionalmente, en tratamientos in vivo, pese a que el adenovirus se inyecta en un sistema teóricamente semi-cerrado o aislado (la cavidad vítrea), el adenovirus logra disminuir la capacidad de las células tumorales para formar metástasis en comparación con el efecto observado al utilizar la quimioterapia convencional, es decir, se observa un efecto fuera del ojo, que es totalmente inesperado y superior a lo observado en las terapias convencionales del estado de la técnica.

Tal como se usa en el presente documento, “adenovirus oncolítico” y su plural se refieren a adenovirus capaces de replicarse o que son competentes en replicación en la célula tumoral. Dichos adenovirus oncolíticos se diferencian de los adenovirus no replicativos porque estos últimos son incapaces de replicarse en la célula diana.

En un primer aspecto, la presente invención da a conocer el uso de una composición que comprende un adenovirus oncolítico para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del retinoblastoma en el que el citado adenovirus oncolítico comprende:

- una secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en su genoma; y

- una maquinaria replicativa específica para células tumorales.

Dicha composición se inyecta por cualquier vía que asegure la llegada de la cantidad necesaria del adenovirus al interior del globo ocular, preferentemente por inyección intraocular, aún más preferentemente intravítrea. Las inyecciones intraocular o intravítrea presentan la ventaja de que se realizan en un órgano, el ojo, que proporciona un entorno inmuno-privilegiado, permitiendo que se dé una menor o nula respuesta inmune al adenovirus oncolítico que comprende la composición. Esta situación permite asegurar en gran medida que la acción del adenovirus oncolítico va a quedar confinada al ojo dado que cualquier salida de adenovirus de dicho órgano podría ser neutralizada por el sistema inmune. Por tanto, en una realización preferente, la citada composición se encuentra en una forma adecuada para su administración o inyección intraocular o intravítrea.

Otra posible vía de administración de la composición contemplada en la presente invención es la inyección intratumoral.

En una realización preferente, el tratamiento del retinoblastoma se lleva a cabo en un mamífero, preferentemente en un humano, más preferentemente en un paciente pediátrico humano.

En otra realización preferente, el retinoblastoma tratado es un retinoblastoma resistente a los tratamientos convencionales de quimioterapia y/o radioterapia, aún más preferentemente dicho retinoblastoma es refractario o fruto de una recaída y resistente a los tratamientos convencionales de quimioterapia y/o radioterapia.

El adenovirus oncolítico que se utiliza en la presente invención es un adenovirus oncolítico con una maquinaria de replicación y una cápside que permite la infección y replicación en células cancerosas humanas. En una realización preferente, dicho adenovirus oncolítico se genera, preferentemente, a partir de adenovirus que infectan humanos, por ejemplo, a partir de un adenovirus de entre los serotipos 1 a 51 o combinaciones (recombinante híbrido de dos o más serotipos diferentes de adenovirus) de los mismos de adenovirus humanos. En la realización más preferente, el adenovirus oncolítico que se utiliza en la presente invención se genera a partir de un adenovirus humano del serotipo 5.

Cabe destacar que la enzima hialuronidasa contribuye a asegurar una mayor y más fácil dispersión y penetración del adenovirus oncolítico, de manera que se asegura que dicho adenovirus pueda alcanzar e infectar un mayor número de células del retinoblastoma.

Adicionalmente, en una realización la enzima hialuronidasa es una enzima hialuronidasa testicular de mamífero, más preferentemente, humana (GenBank Gene ID: 6677), también conocida como SPAM1 o molécula de adhesión del espermatozoide 1 o PH20. En una realización, la secuencia de dicha enzima tiene eliminada la secuencia correspondiente al dominio carboxiterminal de unión a membrana para que la enzima sea soluble. Al eliminarse este dominio carboxiterminal, la enzima resultante es secretada al medio extracelular.

En una realización preferente, la secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en el genoma del adenovirus oncolítico es SEQ ID NO: 1, a la que se le ha eliminado los nucleótidos de 1471 a 1527, correspondientes al dominio carboxiterminal.

Se contempla que la secuencia de la enzima hialuronidasa se inserte en cualquier punto del genoma del adenovirus oncolítico siempre que permita que dicho adenovirus se replique de forma selectiva en células cancerosas o tumorales y que la enzima hialuronidasa se exprese y produzca efectivamente y funcionalmente en las cantidades requeridas. De forma preferente, la secuencia de la enzima hialuronidasa se inserta en el genoma del adenovirus oncolítico después de la secuencia de nucleótidos de la fibra adenoviral.

La expresión de Ia enzima hialuronidasa está, evidentemente, controlada por un promotor operativo en las células del retinoblastoma a tratar. De forma preferente, la expresión de dicha enzima está controlada por un promotor operativo en células animales. Preferentemente, el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor del citomegalovirus, el promotor principal tardío del adenovirus, el promotor SV40, el promotor de la timidin quinasa del virus del herpes del simple, el promotor RSV, el promotor EF1 alfa, el promotor de la beta-actina, el promotor de Ia IL-2 humana, el promotor de Ia IL-4 humana, el promotor de IFN, el promotor de E2F, el promotor humano GM-CSF o combinaciones de los mismos. El promotor que regula la expresión de la enzima puede estar en el adenovirus de manera natural como es el caso del promotor principal tardío del adenovirus. El promotor también puede insertarse junto con la secuencia que codifica la enzima. En una realización preferente, el promotor es el promotor principal tardío del adenovirus y éste ya se encuentra presente en el genoma del adenovirus oncolítico. En esta última realización no hay que introducir el promotor junto con la secuencia de la enzima hialuronidasa, sino que esta última se introduce en el genoma del adenovirus oncolítico de manera que quede bajo el control de dicho promotor.

Se contempla que el adenovirus oncolítico comprenda secuencias adicionales que permitan promover u optimizar la traducción proteica de la secuencia que codifica la enzima hialuronidasa. Dichas secuencias pueden estar dentro del gen de la enzima hialuronidasa o ser externas al mismo. Por ejemplo, dichas secuencias adicionales se seleccionan del grupo que consiste en una secuencia de corte y empalme que permite el procesamiento del ARN, secuencias IRES (por sus siglas en inglés, sitio interno de entrada para el ribosoma), la secuencia 2A de picomavirus o combinaciones de las mismas.

La maquinaria replicativa específica para células tumorales comprendida por el virus oncolítico utilizado en la presente invención es una maquinaria que, tal y como se ha explicado anteriormente, hace que el adenovirus oncolítico se replique de forma específica en células tumorales y no en células sanas o normales. Dicha maquinaria puede presentar diferentes formas siempre y cuando, como resultado, proporcione adenovirus oncolíticos con capacidad replicativa únicamente en las células del retinoblastoma (tumor), es decir, adenovirus con replicación selectiva, en los que su maquinaria replicativa necesita que el virus entre en células tumorales o cancerosas para que el virus pueda replicarse. En este sentido, el adenovirus oncolítico utilizado puede tener modificaciones en su secuencia genómica que le confieran una replicación selectiva en células tumorales.

En una realización esto se consigue con Ia incorporación de un promotor específico de tejido o un promotor específico de tumor, donde dicho promotor controla la expresión de uno o más genes del grupo E1 a, E1 b, E2 y E4. Particularmente el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor de E2F, el promotor de la telomerasa hTERT, el promotor de la tirosinasa, el promotor del antígeno específico de próstata (PSA), el promotor de Ia alfa-fetoproteína, el promotor de Ia COX-2, así como promotores artificiales formados por varios sitios de unión a factores de transcripción como sitios de unión para el factor inducible por hipoxia (HIF-1), el factor de transcripción ETS, el factor citotóxico tumoral (TCF, por sus siglas en inglés), el factor de transcripción E2F o el factor de transcripción Sp1. Preferentemente, el promotor controla la expresión de E1a.

En una realización preferente, la maquinaria replicativa específica para células tumorales es una maquinaria replicativa defectiva complementable en células tumorales con ambas copias del gen Rb1 defectivas. Es decir, se trata de maquinaria replicativa mutada o modificada de manera que al entrar en células sanas (no tumorales) no se expresa o se expresa de tal forma que no conduce a replicación vírica pero, en cambio, cuando el adenovirus oncolítico entra en una célula tumoral con las características mencionadas anteriormente, la maquinaria replicativa obtiene la suficiente complementación (la célula tumoral proporciona las funciones que le faltan al virus) de manera que el virus se puede replicar (completar su ciclo, produciendo virus y conduciendo a la lisis de la célula tumoral). En esta realización, una opción para conseguir dicha replicación selectiva en células tumorales con ambas copias del gen Rb1 defectivas es Ia eliminación de funciones tempranas de E1A que bloquean Ia vía de retinoblastoma (RB). Otros genes virales que interaccionan directamente con la proteína del retinoblastoma como E4 y E4orf6/7 respectivamente, son candidatos a ser eliminados o truncados para conseguir replicación selectiva en células tumorales con ambas copias del gen Rb1 defectivas. En la realización más preferente, el adenovirus oncolítico utilizado en la presente invención se caracteriza por la eliminación A24, que afecta a la interacción de E1a con la proteína del retinoblastoma; la inserción de cuatro sitios de unión a E2F-1; y un sitio de unión a Sp1 en el promotor endógeno de E1a para controlar la expresión de E1a. Dicha secuencia de ADN se corresponde con la SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias adjunto.

Otras modificaciones que cumplan con lo arriba expuesto, es decir, que permitan una replicación específica de los adenovirus oncolíticos en las células tumorales de retinoblastoma, también quedan contempladas e incluidas en la presente invención.

Las dos estrategias explicadas para conseguir Ia replicación selectiva en retinoblastoma no son excluyentes entre sí.

Adicionalmente, se contempla que el adenovirus oncolítico utilizado en la presente invención comprenda una o más modificaciones en la cápside que permitan aumentar la afinidad de dicho adenovirus oncolítico por las células tumorales o cancerosas (modificaciones en su cápside para aumentar su infectividad hacia las células tumorales o cancerosas o dirigirlo a un receptor presente en dichas células tumorales o cancerosas). De esta manera se aumenta la proporción de adenovirus oncolítico que infecta células tumorales o cancerosas frente a los que infecta células sanas, pudiendo llegar a representar éstos últimos una cantidad despreciable frente a los primeros.

En una realización, el adenovirus oncolítico utilizado en la presente invención se ha modificado genéticamente para incluir en las proteínas de la cápside adenoviral ligandos que aumentan la infectividad o que dirigen el virus a un receptor en la célula tumoral o cancerosa. Dirigir el adenovirus al tumor también se puede conseguir con ligandos bifuncionales que unen al virus por un lado y al receptor tumoral por otro. En una realización preferente, el adenovirus oncolítico utilizado en la presente invención tiene la cápside modificada para aumentar su infectividad o dirigirlo mejor a la célula tumoral diana, de manera que se ha sustituido el dominio de unión KKTK de los heparan sulfatos presente en la fibra adenoviral por el dominio RGDK. Dicha modificación se refiere a las posiciones 91 a 94 de la fibra adenoviral, tomando como referencia la secuencia estándar de la fibra del adenovirus del serotipo 5. La secuencia SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia completa de la proteína fibra del adenovirus de tipo 5 con la versión modificada en su dominio de unión a heparán-sulfato (modificación RGDK).

Por otro lado, también es posible modificar la cápside de los virus con otros fines, por ejemplo, para aumentar Ia persistencia del adenovirus oncolítico en sangre y, así, aumentar las posibilidades de que dicho adenovirus alcance nódulos tumorales (sobre todo si dichos nódulos o focos tumorales se encuentran diseminados). Por ejemplo, la cápside puede cubrirse con polímeros como el polietilenglicol.

Por tanto, en la realización más preferente, el adenovirus oncolítico utilizado en la presente invención se genera a partir de un adenovirus humano del serotipo 5 y comprende:

- una secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en su genoma, más preferentemente la secuencia de la enzima hialuronidasa testicular de humano (PH20, SEQ ID NO: 1) a la que se le ha eliminado la secuencia correspondiente al dominio carboxiterminal de unión a membrana para que la enzima sea soluble;

- una maquinaria replicativa deficiente complementable en células tumorales con ambas copias del gen Rb1 defectivas, más preferentemente dicha maquinaria comprende la eliminación A24 que afecta a la interacción de E1a con la proteína Rb, Ia inserción de cuatro sitios de unión a E2F-1 y un sitio de unión a Sp1 en el promotor endógeno de E1 a para controlar la expresión de E1 a;

- modificación de la cápside del adenovirus para aumentar la infectividad de dicho virus o dirigir dicho adenovirus mejor a la célula tumoral, más preferentemente se ha sustituido el dominio de unión KKTK de los heparan sulfatos presente en la fibra adenoviral por el dominio RGDK.

Preferentemente, la secuencia del virus oncolítico de la presente invención se corresponde con la SEQ ID NO: 3.

El adenovirus oncolítico utilizado en la presenta invención puede comprender otros genes insertados en su genoma usados comúnmente en el campo de terapia génica del cáncer para aumentar la citotoxicidad de los adenovirus oncolíticos sobre células tumorales, por ejemplo, el gen de la timidina quinasa, el de la citosina deaminasa, genes proapoptóticos, inmunoestimuladores, supresores tumorales o activadores de prodrogas.

Para la construcción del adenovirus oncolítico a utilizar en la presente invención (es decir, según lo explicado anteriormente), se utiliza cualquiera de los métodos de construcción de adenovirus modificados genéticamente conocidos en el campo de la terapia génica y la viroterapia con adenovirus. El método más comúnmente utilizado se basa en construir primero la modificación genética deseada en un plásmido que contiene la región adenoviral a modificar, para después realizar una recombinación homóloga en bacterias con un plásmido que contiene el resto del genoma viral.

El adenovirus oncolítico utilizado en la presente invención se propaga y amplifica en líneas celulares normalmente utilizadas en el campo de la terapia génica y viroterapia como las líneas HEK-293 (Número de referencia: ATCC CRL-1573) y A549 (Número de referencia: ATCC CCL185). Un método preferente de propagación de dicho adenovirus es por infección de una línea celular permisiva a la replicación del adenovirus. La línea de adenocarcinoma pulmonar A549 es un ejemplo de línea con tales características. La propagación se realiza por ejemplo del siguiente modo: las células A549 se crecen sobre placas de cultivo celular de plástico y se infectan utilizando 100 partículas virales por célula. Dos días después el efecto citopático que refleja la producción de virus se observa como un arracimamiento de las células. Las células se recogen y se almacenan en tubos. Después de una centrifugación a 1000 g durante 5 minutos, el precipitado celular se congela y descongela tres veces para lisar las células. El extracto celular resultante se centrifuga a 1000 g durante 5 minutos y el sobrenadante, en el que se encuentran los virus, se carga encima de un gradiente de cloruro de cesio y se centrifuga durante 1 hora a 35000 g. La banda de virus obtenida del gradiente se carga de nuevo sobre otro gradiente de cloruro de cesio y se centrifuga durante 16 horas a 35000 g. La banda de virus se recoge y se dializa frente a PBS-10% glicerol. El virus dializado se alícuota y almacena a -802C. La cuantificación del número de partículas y unidades formadoras de placa se realiza siguiendo protocolos estándar conocidos en el estado de la técnica. El tampón fosfato salino (PBS) con glicerol al 5% es una formulación estándar para el almacenamiento de adenovirus. Sin embargo se han descrito nuevas formulaciones que mejoran la estabilidad del virus. Los métodos de purificación del adenovirus que contiene el gen de la hialuronidasa para su utilización en el tratamiento del cáncer son los mismos que los descritos para otros adenovirus y vectores adenovirales utilizados en el estado de la técnica en viroterapia y terapia génica del cáncer.

Se entiende que la composición utilizada en la presente invención se utiliza en un formato farmacéuticamente aceptable. Ello implica que dicha composición puede comprender adicionalmente excipientes farmacéuticamente aceptables.

La dosis necesaria de adenovirus oncolítico puede ser determinada por el experto en la materia teniendo en cuenta diversos parámetros, por ejemplo, el volumen de la cavidad vitrea, el volumen del retinoblastoma a tratar o la edad y peso del paciente a tratar. Se entiende que la dosis debe ser una cantidad terapéuticamente efectiva del adenovirus oncolítico para que produzca un efecto terapéutico positivo sobre el retinoblastoma, entendiendo como efecto terapéutico positivo el mantenimiento o la reducción del volumen del retinoblastoma.

Resulta evidente que el experto en la materia adaptará la composición dependiendo del modo particular de administración teniendo particularmente en cuenta la vía de administración que pretende se pretende utilizar.

La composición adicionalmente puede administrarse en un régimen terapéutico que comprenda la administración de uno o más otros agentes antitumorales (tales como uno o más fármacos quimio-terapéuticos) y/o uno o más de las otras terapias utilizadas convencionalmente para el tratamiento del retinoblastoma y mencionadas anteriormente. La administración de la composición utilizada en la presente invención en relación con estos otros agentes terapéuticos y/o terapias puede ser anterior, al mismo tiempo o posterior a los mismos. Cuando la composición utilizada en la presente invención se administra al mismo tiempo que uno o más otros agentes antitumorales, dichos uno o más otros agentes antitumorales pueden estar comprendidos en la composición utilizada en la presente invención o pueden administrarse en forma de composiciones separadas.

Alternativamente, la composición utilizada en la presente invención que comprende el adenovirus oncolítico de acuerdo con lo explicado anteriormente puede utilizarse sola en un régimen terapéutico para el tratamiento del retinoblastoma, es decir sin la utilización de otros agentes antitumorales y/u otras terapias convencionales.

En un segundo aspecto, la presente invención da a conocer el uso de una composición que comprende un adenovirus oncolítico para la preparación de un medicamento destinado a prevenir, eliminar o disminuir las metástasis, neoplasias secundarias y/o el retinoblastoma trilateral asociados al retinoblastoma en el que el citado adenovirus oncolítico comprende:

- una secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en su genoma; y

- una maquinaria replicativa específica para células tumorales.

Dicha composición se inyecta por cualquier vía que asegure la llegada de la cantidad necesaria del adenovirus al interior del globo ocular, preferentemente por inyección intraocular, aún más preferentemente intravítrea. Por tanto, en una realización preferente, la citada composición se encuentra en una forma adecuada para su administración o inyección intraocular o intravítrea.

Otra posible vía de administración de la composición contemplada en la presente invención es la inyección intratumoral.

En una realización preferente, la prevención, eliminación o disminución de las metástasis, neoplasias secundarias y/o el retinoblastoma trilateral asociados al retinoblastoma se lleva a cabo en un mamífero, preferentemente en un humano, más preferentemente en un paciente pediátrico humano.

En otra realización preferente, el retinoblastoma tratado es un retinoblastoma resistente a los tratamientos convencionales de quimioterapia y/o radioterapia, aún más preferentemente dicho retinoblastoma es refractario o fruto de una recaída y resistente a los tratamientos convencionales de quimioterapia y/o radioterapia.

El adenovirus oncolítico utilizado es tal cual se ha explicado anteriormente.

La composición y la forma en que dicha composición se utiliza o se puede administrar también es tal como se ha explicado anteriormente.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende un adenovirus oncolítico para su uso en el tratamiento del retinoblastoma, en la que el citado adenovirus oncolítico comprende:

- una secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en su genoma; y

- una maquinaria replicativa específica para células tumorales.

Dicha composición se inyecta por cualquier vía que asegure la llegada de la cantidad necesaria del adenovirus al interior del globo ocular, preferentemente por inyección intraocular, aún más preferentemente intravítrea. Por tanto, en una realización preferente, la citada composición se encuentra en una forma adecuada para su administración o inyección intraocular o intravítrea.

Otra posible vía de administración de la composición contemplada en la presente invención es la inyección intratumoral.

En una realización preferente, el tratamiento del retinoblastoma se lleva a cabo en un mamífero, preferentemente en un humano, más preferentemente en un paciente pediátrico humano.

En otra realización preferente, el retinoblastoma tratado es un retinoblastoma resistente a los tratamientos convencionales de quimioterapia y/o radioterapia, aún más preferentemente dicho retinoblastoma es refractario o fruto de una recaída y resistente a los tratamientos convencionales de quimioterapia y/o radioterapia.

El adenovirus oncolítico utilizado es tal cual se ha explicado anteriormente.

La composición y la forma en que dicha composición se utiliza o se puede administrar también es tal como se ha explicado anteriormente.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende un adenovirus oncolítico para su uso en la prevención, eliminación o disminución de las metástasis, neoplasias secundarias y/o el retinoblastoma trilateral asociados al retinoblastoma, en la que el citado adenovirus oncolítico comprende:

- una secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en su genoma; y

- una maquinaria replicativa específica para células tumorales.

Dicha composición se inyecta por cualquier vía que asegure la llegada de la cantidad necesaria del adenovirus al interior del globo ocular, preferentemente por inyección intraocular, aún más preferentemente intravítrea. Por tanto, en una realización preferente, la citada composición se encuentra en una forma adecuada para su administración o inyección intraocular o intravítrea.

Otra posible vía de administración de la composición contemplada en la presente invención es la inyección intratumoral.

En una realización preferente, la prevención, eliminación o disminución de las metástasis, neoplasias secundarias y/o el retinoblastoma trilateral asociados al retinoblastoma se lleva a cabo en un mamífero, preferentemente en un humano, más preferentemente en un paciente pediátrico humano.

En otra realización preferente, el retinoblastoma tratado es un retinoblastoma resistente a los tratamientos convencionales de quimioterapia y/o radioterapia, aún más preferentemente dicho retinoblastoma es refractario o fruto de una recaída y resistente a los tratamientos convencionales de quimioterapia y/o radioterapia.

El adenovirus oncolítico utilizado es tal cual se ha explicado anteriormente.

La composición y la forma en que dicha composición se utiliza o se puede administrar también es tal como se ha explicado anteriormente.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un método de tratamiento del retinoblastoma en un paciente en necesidad del mismo que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un adenovirus oncolítico en el que el citado adenovirus oncolítico comprende:

- una secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en su genoma; y

- una maquinaria replicativa específica para células tumorales.

Dicha composición se inyecta por cualquier vía que asegure la llegada de la cantidad necesaria del adenovirus al interior del globo ocular, preferentemente por inyección intraocular, aún más preferentemente intravítrea. Por tanto, en una realización preferente, la citada composición se encuentra en una forma adecuada para su administración o inyección intraocular o intravítrea.

Otra posible vía de administración de la composición contemplada en la presente invención es la inyección intratumoral.

En una realización preferente, el paciente en necesidad del tratamiento del retinoblastoma es un mamífero, preferentemente un humano, más preferentemente un paciente pediátrico humano.

En otra realización preferente, el retinoblastoma tratado es un retinoblastoma resistente a los tratamientos convencionales de quimioterapia y/o radioterapia, aún más preferentemente dicho retinoblastoma es refractario o fruto de una recaída y resistente a los tratamientos convencionales de quimioterapia y/o radioterapia.

El adenovirus oncolítico utilizado es tal cual se ha explicado anteriormente.

La composición y la forma en que dicha composición se utiliza o se puede administrar también es tal como se ha explicado anteriormente.

En un último aspecto, la presente invención se refiere a un método para prevenir, eliminar o disminuir las metástasis, neoplasias secundarias y/o el retinoblastoma trilateral asociados al retinoblastoma en un paciente en necesidad del mismo que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un adenovirus oncolítico en el que el citado adenovirus oncolítico comprende:

- una secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en su genoma; y

- una maquinaria replicativa específica para células tumorales.

Dicha composición se inyecta por cualquier vía que asegure la llegada de la cantidad necesaria del adenovirus al interior del globo ocular, preferentemente por inyección intraocular, aún más preferentemente intravítrea. Por tanto, en una realización preferente, la citada composición se encuentra en una forma adecuada para su administración o inyección intraocular o intravítrea.

Otra posible vía de administración de la composición contemplada en la presente invención es la inyección intratumoral.

En una realización preferente, el paciente en necesidad de prevenir, eliminar o disminuir las metástasis, neoplasias secundarias y/o el retinoblastoma trilateral asociados al retinoblastoma es un mamífero, preferentemente un humano, más preferentemente un paciente pediátrico humano.

En otra realización preferente, el retinoblastoma tratado es un retinoblastoma resistente a los tratamientos convencionales de quimioterapia y/o radioterapia, aún más preferentemente dicho retinoblastoma es refractario o fruto de una recaída y resistente a los tratamientos convencionales de quimioterapia y/o radioterapia.

El adenovirus oncolítico utilizado es tal cual se ha explicado anteriormente.

La composición y la forma en que dicha composición se utiliza o se puede administrar también es tal como se ha explicado anteriormente.

Por tanto, los inventores de la presente invención han logrado solucionar los problemas presentes en el estado de la técnica dado que han podido comprobar que la utilización de adenovirus oncolíticos con las características mencionadas anteriormente permite proporcionar un método terapéutico alternativo a los actualmente disponibles y que permite evitar la enucleación del ojo; y un método que previene, disminuye o evita el desarrollo de metástasis, neoplasias secundarias o retinoblastoma trilateral asociados al retinoblastoma.

Para una mejor comprensión, la presente invención se describe en más detalle a continuación en referencia a las figuras adjuntas, que se presentan a título de ejemplo, y en referencia a ejemplos ilustrativos y no limitativos. Dichos ejemplos se llevan a cabo en cultivos celulares (in vitro) y en modelos animales (ratón y conejo), ambos reconocidos y aceptados como modelos fidedignos y representativos del retinoblastoma en el mundo científico y a partir de los cuales, el experto en la materia, reconocerá la directa aplicación de los métodos y tratamientos de la presente invención en humanos.

La figura 1 muestra los resultados del Western Blot mencionado en el ejemplo 2. En dicho Western Blot se analiza la expresión de la proteína E1A en las diferentes líneas celulares analizadas. Como control general se utilizaron explantes retinales y como control de la expresión se midió la presencia de tubulina. En esta figura, la fila 1 muestra la expresión de E1A y la fila 2 la expresión de tubulina. Respecto a las diferentes columnas, la columna A se refiere a la línea celular primaria HSJD-RBT1; la columna B se refiere a la línea celular primaria HSJD-RBVS1; la columna C se refiere a la línea celular primaria HSJD-RBT2; la columna D se refiere a la línea celular primaria HSJD-RBVS2, la columna E se refiere a la línea celular primaria HSJD-RBVS3; la columna F se refiere a la línea celular primaria HSJD-RBT5; la columna G se refiere a la línea celular primaria HSJD-RBT7; la columna H se refiere a la línea celular primaria HSJD-RBT8; la columna I se refiere a la línea celular primaria HSJD-RBVS8; la columna J se refiere a la línea celular Y79; y la columna K se refiere a los explantes retinales.

La figura 2 muestra la gráfica de supervivencia de ojos tratados y ojos controles de acuerdo con el método Kaplan-Meier para el estudio descrito en el ejemplo 3. La figura 2A se refiere a los resultados obtenidos generando los tumores ortotópicos en ratones utilizando la línea celular Y79; la figura 2B se refiere a los resultados obtenidos generando los tumores ortotópicos en ratones utilizando la línea celular primaria HSJD-RBT2; la figura 2C se refiere a los resultados obtenidos generando los tumores ortotópicos en ratones utilizando la línea celular primaria HSJD-RBT5; la figura 2D se refiere a los resultados obtenidos generando los tumores ortotópicos en ratones utilizando la línea celular primaria HSJD-RBVS1; la figura 2E se refiere a los resultados obtenidos generando los tumores ortotópicos en ratones utilizando la línea celular primaria HSJD-RBT7; y la figura 2F se refiere a los resultados obtenidos generando los tumores ortotópicos en ratones utilizando la línea celular primaria HSJD-RBVS8.

La figura 3 muestra la gráfica de supervivencia de ojos tratados y ojos controles de acuerdo con el método Kaplan-Meier para el estudio descrito en el ejemplo 4. La figura 3A se refiere a los resultados obtenidos generando los tumores ortotópicos en ratones utilizando la línea celular Y79; la figura 3B se refiere a los resultados obtenidos generando los tumores ortotópicos en ratones utilizando la línea celular primaria HSJD-RBT-002; y la figura 3C se refiere a los resultados obtenidos generando los tumores ortotópicos en ratones utilizando la línea celular primaria HSJD-RBT-005.

La figura 4 muestra la gráfica de supervivencia de ojos tratados y ojos controles de acuerdo con el método Kaplan-Meier para el estudio descrito en el ejemplo 5.

La figura 5 muestra la gráfica de supervivencia de ojos tratados y ojos controles de acuerdo con el método Kaplan-Meier para el estudio descrito en el ejemplo 6.

Ejemplo 1. Generación del adenovirus oncolítico VCN-01

El ADNc de la hialuronidasa PH20 se obtuvo mediante amplificación por PCR (siglas en inglés para la técnica de amplificación en cadena de la polimerasa) de los diferentes exones de la proteína a partir del genoma de la línea celular A549 y la posterior unión de estos exones con oligonucleótidos específicos que contienen la diana del enzima de restricción Mfel. El fragmento resultante se digirió con Mfel y se clonó por ligación en el plásmido lanzadera, pNKFiberRGD (que contiene la secuencia de la fibra adenoviral modificada con RGD), para dar lugar al plásmido pNKFiberPH20. El ADNc correspondiente a la proteína PH20 clonada en el plásmido pNKFiberPH20 se muestra en la SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 1 muestra los nucleótidos codificantes para la proteína PH20 desde su inicio de transcripción (ATG) hasta la posición 1470. La secuencia nucleotídica de la región 1471 a la 1527 codifica para la cola hidrofóbica de la proteína, responsable de su anclaje a la membrana. Dicha secuencia fue eliminada. Después de la posición 1470 se ha añadió el codón de parada de la traducción TAA.

Para generar el plásmido pAdwtRGD-PH20, el gen de la fibra adenoviral del plásmido pVK50cau (que contiene la secuencia completa del Ad5 con una diana Swal en la fibra) fue reemplazado por recombinación homologa en levaduras, según procedimientos conocidos en el estado de la técnica, por el gen de la fibra seguido del gen de Ia hialuronidasa PH20 del plásmido pNKFiberPH20 digerido con Notl/Kpnl.

Para generar el adenovirus ICOVIR17 (SEQ ID NO: 17) se usó el plásmido adenoviral plCOVIR17. Para generar este plásmido, el gen de la fibra adenoviral del plásmido plCOVIR15 fue reemplazado por recombinación homologa en levaduras por el gen de la fibra seguido del gen de la hialuronidasa PH20 del plásmido pAdwtRGD-PH20 digerido con Spel/Pacl.

El adenovirus ICOVIR15 (SEQ ID NO: 4), proviene del adenovirus AdA24RGD que se caracteriza por contener la eliminación A24 en la secuencia codificante para la proteína E1a. Esta eliminación afecta a la interacción de E1a con la proteína del retinoblastoma. AdA24RGD también tiene la inserción del péptido RGD en la fibra adenoviral para aumentar Ia infectividad del virus. Estas dos modificaciones fueron descritas en K. Suzuki et al., "A conditionally replicative adenovirus with enhanced infectivity shows improved oncolytic potency", Clin Cancer Res 2001, vol. 7, pp.

120-6. A partir de AdA24RGD, se realizó la inserción de cuatro sitios de unión a E2F-1 y un sitio de unión a Sp1 en el promotor endógeno de E1a para controlar la expresión de E1a. Así se obtuvo ICOVIR15. Esta inserción se realizó mediante sustitución de la secuencia 419-422 del genoma por la secuencia con los 4 sitios de unión a E2F-1 y un sitio de unión a Sp1, de manera que la secuencia final es la que figura en la SEQ ID NO: 4. Para realizarlo se creó un sitio único de corte BsiWI por mutagénesis dirigida en el promotor E1A del pEndK/Spe (J. E. Carette et al., "Conditionally replicating adenoviruses expressing short hairpin RNAs silence the expression of a target gene in cancer cells", Cancer Res 2004, vol. 64, pp. 2663-7). El sitio de unión a Sp1 se introdujo en el plásmido pEndK/Spe con el sitio BsiWI mediante la ligación de dicho plásmido digerido con BsiWI con los oligonucleótidos Sp1F (SEQ ID NO: 5 - 5'-GTACGTCGACCACAAACCCCGCCCAGCGTCTTGTCATTGGCGTCGACGCT-3') y Sp1 R (SEQ ID NO: 6 - 5'-GTACAGCGTCGACGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGG TCGAC-3') emparejados entre sí. Los sitios de unión a E2F se introdujeron mediante la unión de los oligonucleótidos E2FF2 (SEq ID NO: 7 - 5'-GTACGTCGGCGGCTCGTGGC TCTTTCGCGGCAAAAAGGATTTGGCGCGTAAAAGTGGTTCGAA-3') y E2FR2 (SEQ ID NO: 8 - 5'-GTACTTCGAACCACTTTTACGCGCCAAATCCTTTTTGCCGCGAAAGAGCCAC GAGCCGCCGAC-3') emparejados entre sí, para crear el plásmido pEndK415Sp1 E2F2. A continuación se introdujo por recombinación homologa en levaduras la secuencia CAU, que contiene los elementos necesarios para la replicación del plásmido en levaduras: un centrómero, Ia secuencia de recombinación autónoma ARS y el marcador de selección URS3, para crear el plásmido pEndK415Sp1 E2F2CAU. Finalmente, se realizó una recombinación homologa en levaduras del plásmido pEndK415Sp1 E2F2CAU digerido con Kpnl con el genoma adenoviral del adenovirus AdA24RGD para construir el plCOVIR15cau. ICOVIR15 se obtuvo por transfección de la digestión PacI del plCOVIR15cau a células HEK293 (Número de referencia ATCC CRL-1573).

El adenovirus ICOVIR17, que contiene las mismas modificaciones que ICOVIR15, más la inserción del gen de la hialuronidasa detrás del gen de la fibra adenoviral, se generó por digestión con PacI del plásmido plCOVIR17 y transfección en células HEK293.

El adenovirus VCN-01 se generó utilizando el plásmido adenoviral plCOVIR17RGDK. En este plásmido el gen de la fibra del adenovirus serotipo 5 nativo ha sido reemplazado por una versión modificada en su dominio de unión a heparán-sulfatos (aminoácidos ⁹¹KKTK⁹⁴ de Ia secuencia polipeptídica reemplazados por ⁹¹RGDK⁹⁴). El plásmido plCOVIR17RGDK se construyó por recombinación homologa en levaduras entre el producto de la digestión parcial de plCOVIR17 con Ndel y la digestión con EcoRI del plásmido pBSattKKT, (que contiene la versión modificada de la fibra del adenovirus y que se describe en N. Bayó-Puxan et al. "Replacement of adenovirus type 5 fiber shaft heparan sulfate proteoglycan-binding domain with RGD for improved tumor infectivity and targeting". Human Gene Therapy 2009, vol. 20, pp 1214-21).

La secuencia SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia completa de la proteína fibra del adenovirus de serotipo 5 con la versión modificada en su dominio de unión a heparán-sulfato (modificación RGDK). El adenovirus ICOVIR17 contiene una versión del gen de la fibra adenoviral en la que se ha inserido el péptido RGD-4C (Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys; CDCRGDCFC; SEQ ID NO: 10) en la región Hl de la zona de la "cabeza" (dominio knob) de la proteína (bucle hiper-variable poco conservado evolutivamente y muy expuesto de la cápside adenoviral). VCN-01 es totalmente análogo a ICOVIR17 excepto en el gen de la fibra, pues en este caso la fibra de VCN-01 sólo difiere de la forma nativa del adenovirus humano serotipo 5 en que se han reemplazado los aminoácidos ⁹¹KKTK⁹⁴ por el péptido de alta afinidad por integrinas ⁹¹RGDK⁹⁴, en el dominio del "mango" de la proteína (dominio shaft).

Ejemplo 2. Citotoxicidad en cultivos primarios de retinoblastoma refractario a los tratamientos convencionales con quimioterapia y/o radioterapia.

En primer lugar se realizó un estudio de IC50 en diferentes cultivos primarios obtenidos a partir de retinoblastomas que mostraron resistencia a los tratamientos convencionales con quimioterapia y/o radioterapia. También se analizó la línea celular Y79 (Número de referencia ATCC HTB-18).

Para la obtención de los diferentes cultivos primarios se partió de muestras tumorales obtenidas a partir de ojos enucleados de pacientes con retinoblastoma en el Hospital Sant Joan de Deu (HSJD, Barcelona), bajo un protocolo aprobado por el correspondiente Comité Ético y bajo Consentimiento Informado. Los especímenes se recolectaron de dos posibles fuentes: tejido tumoral sólido en la retina (retinoblastoma tumor; RBT) o bien de las siembras tumorales en el humor vítreo (retinoblastoma vitreous seedings; RBVS). Para la obtención de las suspensiones celulares de los especímenes de RBT éstos se disgregaron usando una mezcla de colagenasa (40 unidades Kunitz/mL) y de DNAse (5 mg/mL) (Sigma, St. Louis, MO) a 37°C durante 5 min; las células de las muestras de RBVS se obtuvieron por centrifugación. Después de 2 lavados con PBS, las células tumorales se cultivaron como tumoresferas flotantes en medio para células madre neurales y libre de suero.

Para determinar los valores de IC⁵⁰ de VCN-01 realizaron ensayos con cada línea en placas de 96 pocillos en las que se habían sembrado 5000 células por pocillo. Después de ser cultivadas durante 24 horas, las células se expusieron a dosis crecientes de VCN-01 durante 11-14 días por triplicado. En ese punto se determinó la actividad metabólica de cada pocillo a través del reactivo MTS (Promega, Fitchburg, WI, USA) y según procedimientos conocidos en el estado de la técnica. A partir de estos valores y haciendo uso del software Graphpad Prism 5 software (La Jolla, CA, USA) se calculó la concentración de VCN-01 que causaba un decremento del 50% en la proliferación celular (valor IC⁵⁰).

Tabla 1. Resultados de IC⁵⁰ obtenidos en los cultivos primarios de retinoblastoma refractario a los tratamientos convencionales con uimiotera ia /o radiotera ia en la línea celular Y79.

Tal y como se observa en la tabla 1, VCN-01 mostró una gran citotoxicidad en todas las líneas celulares probadas excepto en 1 (HSJD-RBVS1), de lo cual se deduce que dicho adenovirus oncolítico no solo puede infectar correctamente un gran número de líneas celulares primarias derivadas de retinoblastoma sino que también presenta una gran actividad citotóxica en las mismas.

Adicionalmente, mediante Western Blot se analizó a las 24 horas de infectar las líneas celulares la expresión de la proteína adenoviral E1A (dicha expresión indicó que la maquinaria replicativa defectiva de VCN-01 fue correctamente complementada por la maquinaria de la célula tumoral correspondiente). Tal y como se observa en la figura 1, se observó expresión de la proteína E1A en todas las líneas celulares mencionadas anteriormente a excepción de en la línea celular HSJD-RBVS1, lo que está acorde o correlaciona con los resultados de IC⁵⁰ obtenidos y mostrados en la tabla 1.

Ejemplo 3. Actividad antitumoral en diferentes modelos ortotópicos de retinoblastoma humano en ratón tratados con una inyección de VCN-01 o vehículo.

Los ratones atímicos (Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu) hembras de 6 semanas de edad fueron inyectados con 200.000 células de la correspondiente línea celular primaria o de la línea celular Y79 en 2 pL de matrigel en la cavidad vítrea de los dos ojos. Al octavo día se procedió a aplicar una inyección intravítrea de la dosis 100x de VCN-01 (2 pL con un contenido total de 3x10⁹ partículas víricas por ojo) a los ojos derechos de cada animal. Los ojos contralaterales (izquierdos) se inyectaron por vía intravítrea con el vehículo en que se había diluido VCN-01 (20 mM Tris pH 8,0, 25 mM NaCl, 2,5% glicerol).

La distribución de ratones en cada uno de los grupos experimentales fue la indicada en la tabla 2.

T l 2 r x rim n l n m r r n r r l i l m l

En este caso lo que se estudió fue la supervivencia de los ojos tratados y control, es decir, número de días hasta que el tamaño del retinoblastoma requirió la enucleación de dicho ojo.

Tal y como se puede ver en la figura 2, los ojos tratados con el adenovirus VCN-01 sobreviven en mayor número y durante un tiempo más prolongado en todos los grupos analizados (es decir, con independencia de la línea celular utilizada para implantar el tumor ortotópico en el ojo del ratón, se observa una mejora significativa al aplicar el tratamiento con el adenovirus VCN-01).

Ejemplo 4. Actividad antitumoral en diferentes modelos ortotópicos de retinoblastoma humano en ratón tratados con dos inyecciones de VCN-01 o vehículo.

Los ratones atímicos (Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu) hembras de 6 semanas de edad fueron inyectados con 200.000 células de la correspondiente línea celular primaria o de la línea celular Y79 en 2 pL de matrigel en la cavidad vitrea de cada uno de sus ojos. Al octavo día se procedió a aplicar una inyección intravítrea de la dosis 100x de VCN-01 (2 pL con un contenido total de 3x109 partículas víricas) a los dos ojos de los ratones del grupo tratado y a los ratones del otro grupo (grupo control) se les procedió a aplicar una inyección intravítrea de vehículo (20 mM Tris pH 8,0, 25 mM NaCl, 2,5% glicerol) en cada ojo. Al vigésimo segundo día se repitió el procedimiento terapéutico, es decir, se procedió a aplicar una inyección intravítrea de la dosis 100x de VCN-01 (2 pL con un contenido total de 3x109 partículas víricas) a ambos ojos de los ratones del grupo tratado y a los ratones del otro grupo (grupo control) se les procedió a aplicar una inyección intravítrea del mismo vehículo también en ambos ojos.

La distribución de ratones en cada uno de los grupos experimentales fue la indicada en la tabla 3.

T l r x rim n l n m r r n r r l i l m l 4

En este caso también se estudió fue la supervivencia de los ojos tratados y control, es decir, número de días hasta que el tamaño del retinoblastoma requirió la enucleación de dicho ojo.

Tal y como se puede ver en la figura 3, los ojos tratados con el adenovirus VCN-01 sobreviven en mayor número y durante un tiempo más prolongado en todos los grupos analizados (es decir, con independencia de la línea celular utilizada para implantar el tumor ortotópico en el ojo del ratón, se observa una mejora significativa al aplicar el tratamiento con el adenovirus VCN-01).

Ejemplo 5. Estudio de escalado de dosis de VCN-01 en ratones.

Los ratones atímicos (Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu) hembras de 6 semanas de edad fueron inyectados con 200.000 células de la línea celular primaria HSJD-RBT2 (día 0) en 2 pL de matrigel. A continuación, dichos ratones fueron tratados de acuerdo con los siguientes grupos y el siguiente esquema:

Tabla 4. Grupos y días de tratamiento del estudio del ejemplo 5. Los días se indican tomando como día 0 el día en qu in n im l n n l l l l lín rim ri r in l m r n r r l m r r i s.

El parámetro analizado fue la supervivencia de los ojos tratados y control, es decir, número de días hasta que el tamaño del retinoblastoma requirió la enucleación de dicho ojo.

Los resultados obtenidos aparecen resumidos en la figura 4. Tal y como se observa en dicha figura, todas las dosis probadas de VCN-01 permitieron obtener resultados significativamente mejores de supervivencia del ojo en comparación con los grupos control o de tratamiento con quimioterapia. Adicionalmente, se pudo comprobar, sorprendentemente, que la dosis que proporcionó una mayor supervivencia del ojo durante un mayor tiempo fue la Ejemplo 6. Estudio de escalado de dosis de VCN-01 en ratones.

Los ratones atímicos (Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu) hembras de 6 semanas de edad fueron inyectados con 200.000 células de la línea celular primaria HSJD-RBT2 (día 0) en 2 pL de matrigel. A continuación, dichos ratones fueron tratados de acuerdo con los siguientes grupos y el siguiente esquema:

Tabla 5. Grupos y días de tratamiento del estudio del ejemplo 5. Los días se indican tomando como día 0 el día en que se inyectan o implantan las células de la línea primaria de retinoblastoma para generar los tumores ortotópicos.

El parámetro analizado fue la supervivencia de los ojos tratados y control, es decir, número de días hasta que el tamaño del retinoblastoma requirió la enucleación de dicho ojo.

Los resultados obtenidos aparecen resumidos en la figura 5. Tal y como se observa en dicha figura, todas las dosis mostraron un resultado superior en comparación con el grupo control. Adicionalmente, las dosis ALTA y BAJA también mostraron un efecto superior al final del tratamiento respecto al grupo tratado con quimioterapia intravítrea. Si bien la invención se ha descrito con respecto a ejemplos de realizaciones preferentes, éstos no se deben considerar limitativos de la invención, que se definirá por la interpretación más amplia de las siguientes reivindicaciones.

Ejemplo 7. Análisis de la influencia de VCN-01 en metástasis en cerebro en retinoblastoma en ratones.

La diseminación extraocular del retinoblastoma al sistema nervioso central (SNC) es fatal para los pacientes.

Para llevar a cabo este estudio se utilizó un modelo ortotópico de retinoblastoma. Se utilizaron cerebros provenientes de los ratones de los ejemplos 5 y 6, atímicos desnudos (cepa Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu - Harlan Laboratories, Gannat, Francia) hembras, de 6 semanas de edad, a los que se les inyectó, en el segmento posterior de cada uno de los ojos, 2x105 celulas HSJD-RBT2 (cultivo primario de células mencionado anteriormente y obtenido del ojo de un paciente con retinoblastoma resistente a la quimioterapia).

Tabla 6. Cerebros analizados en el estudio del Ejemplo 7, con detalle del tratamiento aplicado a cada uno de los ratones a los que se extrajeron los cerebros.

El régimen terapéutico aplicado a cada uno de los grupos mencionados en la tabla 6 fue (a modo de referencia, el día de inyección de las células fue el -7):

• Grupo 1 (Vehículo): inyección en los días 1 y 15.

• Grupo 2 (Quimioterapia sistémica): inyección de etopósido en los días 1, 2 y 3 e inyección de carboplatino en el día 1. Este mismo régimen de administración se repitió en los días 22, 23 y 24; y 43, 44 y 45.

• Grupos 3 a 8 (administración de diferentes dosis de VCN-01. Inyección en los días 1 y 15.

Se evaluó la presencia de células humanas de retinoblastoma en los cerebros mencionados en la tabla 6. Dicha evaluación se realizó midiendo la cantidad de acido ribonucleico mensajero (ARNm) CRX por medio de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. Para ello, el ácido ribonucleico total (ARN) de los cerebros de los ratones se extrajo utilizando TRIzol (Life Technologies, Waltham, MA, Estados Unidos). A continuación se sintetizó el ácido desoxiribonucleico complementario (ADNc) con el sistema de transcriptasa reversa M-MLV (Life Technologies, Waltham, MA, Estados Unidos) utilizando 1 pg del ARN extraído. La cantidad de ARNm de CRX se midió utilizando el protocolo común conocido en el estado de la técnica para la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, en concreto, se preparó una reacción con un volumen de 10 pL y utilizando la Mezcla Maestra SYBR® Green PCR (Life Technologies, Waltham, MA, Estados Unidos); se utilizaron los cebadores y la sonda indicados en la tabla 7; y se utilizó el aparato 7500 Sequence Detection System (Applied Biosytems, Foster City, CA, Estados Unidos) para la detección de las señales en los diferentes ciclos de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (primer paso de 10 min a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 15 s a 95 °C y 1 min a 60 °C).

Como control, para la normalización de la expresión del gen CRX se utilizó el ARNm de la proteína de unión a la caja TATA (TBP, por sus siglas en inglés). Su expresión se midió de acuerdo con el protocolo indicado anteriormente y conocido en el estado de la técnica y utilizando los cebadores y la sonda indicados en la tabla 7 a tal efecto.

Tabla 7. Cebadores y sonda utilizados en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para medir la ex resión de CRX TBP.

Las señales obtenidas fueron tratadas con el método 2ññCt con el fin de determinar las muestras de cerebro positivas y las muestras de cerebro negativas. Los resultados obtenidos aparecen resumidos en la tabla 8.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Composición que comprende un adenovirus oncolítico para su uso en el tratamiento del retinoblastoma en la prevención, eliminación o disminución de las metástasis, neoplasias secundarias y/o el retinoblastoma trilateral asociados al retinoblastoma, caracterizada porque dicho adenovirus oncolítico comprende:

- una secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en su genoma; y

- una maquinaria replicativa específica para células tumorales.

2. Composición que comprende un adenovirus oncolítico para su uso, según la reivindicación 1, caracterizada porque la composición se administra por inyección intraocular o intravítrea.

3. Composición que comprende un adenovirus oncolítico para su uso, según la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el retinoblastoma es un retinoblastoma resistente a los tratamientos convencionales de quimioterapia y/o radioterapia.

4. Composición que comprende un adenovirus oncolítico para su uso, según la reivindicación 3, caracterizada porque el retinoblastoma resistente a los tratamientos convencionales de quimioterapia y/o radioterapia es refractario o fruto de una recaída.

5. Composición que comprende un adenovirus oncolítico para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el adenovirus oncolítico se genera a partir de un adenovirus humano del serotipo 5.

6. Composición que comprende un adenovirus oncolítico para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la enzima hialuronidasa es la enzima hialuronidasa humana PH20.

7. Composición que comprende un adenovirus oncolítico para su uso, según la reivindicación 6, caracterizada porque la citada secuencia que codifica una enzima hialuronidasa es SEQ ID NO: 1, a la que se le ha eliminado los nucleótidos de 1471 a 1527, correspondientes al dominio carboxiterminal.

8. Composición que comprende un adenovirus oncolítico para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la maquinaria replicativa específica para células tumorales es una maquinaria replicativa defectiva complementable en células tumorales con ambas copias del gen Rb1 defectivas.

9. Composición que comprende un adenovirus oncolítico para su uso, según la reivindicación 8, caracterizada porque la maquinaria replicativa defectiva complementable en células tumorales con ambas copias del gen Rb1 defectivas comprende la eliminación A24 en la secuencia codificante para la proteína E1a y, la inserción de cuatro sitios de unión a E2F-1 y un sitio de unión a Sp1 en el promotor endógeno de E1a para controlar la expresión de E1a.

10. Composición que comprende un adenovirus oncolítico para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, caracterizada porque el adenovirus oncolítico utilizado en la presente invención tiene la cápside modificada de manera que se ha sustituido el dominio de unión 91KKTK94 de los heparan sulfatos presente en la fibra adenoviral por el dominio 91RGDK94.