CN109982709A - 病毒载体在治疗视网膜母细胞瘤中的用途 - Google Patents

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Abstract

包含溶瘤腺病毒的组合物用于制备意图用于治疗视网膜母细胞瘤或预防、去除或降低与视网膜母细胞瘤相关的转移、继发性恶性肿瘤和/或三侧性视网膜母细胞瘤的药物产品的用途，其中前述溶瘤腺病毒包含：编码插入其基因组的透明质酸酶的序列；和肿瘤细胞特异性的复制机制。

Description

病毒载体在治疗视网膜母细胞瘤中的用途
描述
本发明涉及医学领域，更具体地，肿瘤学领域。
视网膜母细胞瘤是在儿童中最常见的恶性眼内肿瘤，发病率为1/17,000个新生儿。视网膜母细胞瘤在视网膜中发展，通常在其下方，从具有在Rb1基因的两个拷贝中易患癌症的变体的细胞朝向玻璃体腔生长，无论是通过遗传性突变还是获得性突变。视网膜母细胞瘤是一种通常发生在五岁之前的疾病，并且如果存在Rb1基因的种系突变，它可以是散发性的或遗传性的。
取决于视网膜母细胞瘤的表现，其可以是单灶性的或多灶性的以及单侧性的(代表65％的病例)或双侧性的(代表剩余的35％-具有Rb1基因的种系突变)。单侧视网膜母细胞瘤仅发生在患者的一只眼睛中，并且诊断时的平均年龄为24个月，而双侧视网膜母细胞瘤影响双眼，诊断时的平均年龄为15个月。
目前视网膜母细胞瘤的治疗主要是针对患者的存活，以及其次针对视力的保存。最佳的治疗通常是复杂的，并且涉及多个医学学科的专家，诸如眼科医生、儿科肿瘤学家和放射肿瘤学家等。存在多种治疗选择，特别包括：全身或局部眼部化学疗法、放射疗法、冷冻法疗、激光疗法和手术(受影响眼睛的摘除术)。治疗方案的选择取决于许多因素，除其他以外，诸如肿瘤发展的阶段、肿瘤是单灶的还是多灶的以及是单侧的还是双侧的、肿瘤的部位和尺寸。由于对眼睛及其功能的影响，优选的疗法(therapy)或治疗(treatment)选择通常是化学疗法。然而，存在高剂量的化学疗法是高度毒性的并且在一定百分比的情况下肿瘤对所述治疗产生耐受性的问题。在这些情况下，目前保存患者生命的唯一治疗上可行的选择是摘除术。
另外，尽管视网膜母细胞瘤本身是一种非常可治愈的疾病，但存在发展为转移、继发性恶性肿瘤或三侧性视网膜母细胞瘤的基本风险。在这些情况下，预后不太有利，因为不存在用于治疗的明确且有效的治疗选择。
基因疗法和病毒疗法以对抗癌症的治疗目的使用病毒。在基因疗法中，病毒被修饰以便防止其复制，并且用作用于治疗性遗传物质的媒介物(vehicle)或载体(vector)。相比之下，病毒疗法使用在肿瘤细胞中选择性复制和增殖的病毒。在病毒疗法中，肿瘤细胞通过由病毒在其中的复制引起的细胞病变效应而不是通过治疗基因的作用而死亡。在肿瘤细胞中的优先复制被称为亲瘤性(oncotropism)，并且肿瘤裂解被称为溶瘤性(oncolysis)。严格地说，在肿瘤中选择性复制的病毒被称为溶瘤的(oncolytic)，尽管在更广泛的意义上，词语溶瘤可以应用于能够裂解肿瘤细胞的任何复制型病毒，甚至是非选择性的。在本说明书中，以两种含义使用术语溶瘤的。
癌症的病毒疗法远远早于基因疗法。用病毒治愈肿瘤的第一次观察追溯到上世纪初。早在1912年，De Pace在将狂犬病病毒接种到宫颈癌中后实现了肿瘤消退。从那时起，许多类型的病毒已经被注射到肿瘤中以治疗它们。存在具有天然的亲瘤性的病毒，诸如自主性细小病毒、水泡性口炎病毒和呼肠孤病毒。其他病毒可以被遗传性操作使得它们在肿瘤中选择性复制。例如，通过消除核糖核苷酸还原酶基因(一种活跃增殖的细胞(诸如肿瘤细胞)中不必要的酶活性)，已经将单纯疱疹病毒(HSV)制成亲瘤性的。然而，腺病毒已经由于其低致病性和感染肿瘤细胞的高能力成为用于癌症的病毒疗法和基因疗法两者中最常用的病毒。
51种人类腺病毒的血清型已经被鉴定出，分类为六组，区分为从A至F。
人类腺病毒血清型5(Ad5)属于C组，是由含有36千碱基线性脱氧核糖核酸(DNA)的二十面体蛋白衣壳形成的病毒。在成人中，Ad5感染通常是无症状的，并且在儿童中，它引起普通感冒和结膜炎。Ad5通常感染上皮细胞-在自然感染期间的支气管上皮细胞。Ad5通过纤维(是一种病毒蛋白，其从衣壳的12个顶点像天线一样延伸)与参与细胞间粘附的细胞蛋白(被称为柯萨奇腺病毒受体(Coxsackie-Adenovirus Receptor，CAR))的相互作用进入细胞。当病毒DNA到达细胞核内部时，它开始系统地转录病毒的早期基因(E1至E4)。待表达的第一病毒基因对应于早期区域基因1A(E1A)。E1A与视网膜母细胞瘤的细胞蛋白结合以释放E2F，并且从而激活其他病毒基因(诸如E2、E3和E4)以及活化细胞周期的细胞基因的转录。E1B，就其本身而言，与p53蛋白结合，以活化细胞周期并且防止被感染细胞的凋亡。E2编码病毒复制蛋白；E3编码抑制抗病毒免疫应答的蛋白；E4编码运输病毒RNA的蛋白。早期基因的表达导致病毒DNA的复制，并且在这被复制后，主要晚期启动子被活化，导致信使核糖核酸(RNA)转录物的表达，该信使核糖核酸(RNA)转录物通过切割和差异剪接产生编码形成衣壳的结构蛋白的所有RNA。
关于溶瘤腺病毒的设计存在两个待考虑的重要方面：选择性和效力。为了实现针对肿瘤细胞的选择性，使用了三种策略：消除在正常细胞中复制所必需但在肿瘤细胞中不必要的病毒功能；通过肿瘤选择性启动子控制启动复制的病毒基因；和修饰参与宿主细胞感染的病毒衣壳蛋白。通过这些遗传修饰，已经实现了相当水平的选择性，其中肿瘤细胞的复制能力比正常细胞中的复制能力大约10,000倍。关于溶瘤效力，也已经描述了增加其的各种遗传修饰。这些修饰包括：a)病毒释放增加，例如通过E1B19K的缺失、E3-11.6K(ADP)的过表达或蛋白E3/19K在质膜中的重新定位；和b)将治疗基因插入溶瘤腺病毒基因组以产生“武装的溶瘤腺病毒”。在这种情况下，除其他以外，治疗基因将必须通过活化具有旁观者效应的前药(换言之，它杀死未被感染的邻近细胞)、活化针对肿瘤的免疫系统、诱导凋亡、抑制血管生成或去除细胞外基质来介导未被感染的致癌细胞的死亡。在这些情况下，治疗基因表达的形式和时间将对治疗方法的最终结果至关重要。
然而，腺病毒疗法在其临床应用中遇到的主要障碍是预先存在的或是通过第一次或随后的腺病毒注射产生的免疫应答，以及腺病毒在整个肿瘤块中有效地分布的困难，即不仅感染肿瘤的表面细胞，而且还到达位于它内部的那些细胞。该后一种困难也已经针对其他抗癌药物(诸如多柔比星、Taxol[紫杉醇(paclitaxel)、长春新碱和甲氨蝶呤)进行了描述，并且被认为与肿瘤的细胞外基质(参与肿瘤细胞对化疗药物的耐受性，BP Toole等人，“Hyaluronan:a constitutive regulator of chemoresistance and malignancy incancer cells”，Seminars in Cancer Biology 2008,第18卷,第244-50页)相关。肿瘤中的肿瘤细胞和基质细胞产生并组装胶原蛋白、蛋白聚糖和阻碍肿瘤内大分子转运的其他分子的基质。透明质酸是参与肿瘤细胞对治疗药物的耐受性的所述细胞外基质的主要成分之一。透明质酸在多种恶性组织中过表达，并在许多情况下，所述酸的水平是针对肿瘤进展的预后因素。透明质酸与受体CD44和RHAMM的相互作用增加了肿瘤的存活和侵袭。此外，透明质酸可以通过诱导细胞迁移和粘附并且防范免疫系统来促进肿瘤转移。
在另一方面，已经描述了透明质酸和肿瘤细胞之间相互作用的抑制，逆转了对大量药物的耐受性。许多工作已经表明，透明质酸酶(负责透明质酸降解的酶)增加患有黑素瘤、卡波西肉瘤、头颈癌和结肠肝转移的患者中的各种类型的化学疗法的活性。透明质酸酶的作用机制尚不清楚，但通常归因于细胞粘附屏障的减少、间质压力降低和抗癌药物进入肿瘤的渗透性改进，而不是其对与细胞存活相关的信号通路的抑制作用。
透明质酸酶是负责降解透明质酸的酶家族。在人类物种中，迄今已经定位了具有不同的特性和位置的六种编码透明质酸酶的基因。在大多数组织中发现了同种型Hyal1和Hyal2，Hyal1是在人类血浆中的主要形式。Hyal3位于骨髓和睾丸中，但其功能未被良好表征。透明质酸酶PH20在睾丸中高度表达，并且参与卵母细胞被精子受精的过程。透明质酸酶PH20锚定在精子的质膜和内顶体膜上，并且给予精子渗透卵丘细胞的细胞外基质(其富集透明质酸)并到达卵母细胞的透明带的能力。在顶体反应期间，锚定在精子膜上的一些透明质酸酶被酶促加工，以产生从顶体膜中释放的可溶形式的蛋白。膜蛋白PH20是哺乳动物透明质酸酶家族中唯一在中性PH具有活性的酶。
鉴于以上，对比治疗视网膜母细胞瘤的目前的那些疗法更有效的替代疗法存在需求。另外，当肿瘤对在最大允许剂量的化学疗法产生耐受性和/或待使用的剂量显示出过高水平的毒性时，所述替代治疗是特别必要的，以避免摘除一只或两只眼睛(对于当用化学疗法的各种替代治疗没有积极作用的情况)。还需要新的治疗替代方案以允许消除或降低患者发展转移、继发性恶性肿瘤或三侧性视网膜母细胞瘤的风险。
在广泛和详尽的实验之后，本发明的发明人出乎意料地发现，使用遗传修饰的溶瘤腺病毒来治疗视网膜母细胞瘤是可能的，并且所述溶瘤腺病毒允许消除或降低转移、继发性恶性肿瘤和/或三侧性视网膜母细胞瘤的风险。由于多种原因，由本发明的发明人获得的结果证明是出乎意料的，所述多种原因包括如下事实：前述修饰的溶瘤腺病毒对感染来源于某些肿瘤的细胞系不是有效的，但对来源于视网膜母细胞瘤的细胞系是有效的；并且，此外，在体内治疗中，与当使用常规化学疗法时观察到的作用相比，即使腺病毒被注射到理论上半封闭或隔离的系统(玻璃体腔)，腺病毒也设法降低肿瘤细胞形成转移的能力。换言之，在眼睛外观察到的作用是完全出乎意料的，并且优于现有技术的常规疗法中观察到的作用。
如本文件中使用的，“溶瘤腺病毒”及其复数是指能够在肿瘤细胞中自我复制或具有复制能力的腺病毒。所述溶瘤腺病毒与非复制腺病毒不同，因为后者不能够在靶细胞中自我复制。
根据第一方面，本发明公开了包含溶瘤腺病毒的组合物用于制备意图用于治疗视网膜母细胞瘤的药物产品的用途，其中前述溶瘤腺病毒包含：
-编码插入其基因组的透明质酸酶的序列；和
-肿瘤细胞特异性的复制机制。
所述组合物通过确保必要量的腺病毒到达眼球内部的任何途径注射，优选地通过眼内注射，甚至更优选地玻璃体内注射。眼内或玻璃体内注射具有以下优点：它们是在器官即眼睛中进行的，这提供了免疫豁免环境，促进了对包含在组合物中的溶瘤腺病毒的较低免疫应答或无应答。这种情况使得在很大程度上确保溶瘤腺病毒的作用将保持局限于眼睛是可能的，因为如果腺病毒曾离开所述器官，它能够被免疫系统中和。因此，在一个优选的实施方案中，前述组合物采取用于玻璃体内或眼内施用或注射的适当形式。
用于在本发明中提供的组合物的另一种可能的施用途径是瘤内注射。
在一个优选的实施方案中，视网膜母细胞瘤的治疗发生在哺乳动物，优选地人类，更优选地人类儿科患者中。
在另一个优选的实施方案中，所治疗的视网膜母细胞瘤是对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受的视网膜母细胞瘤；甚至更优选地，所述视网膜母细胞瘤是难治性的或复发的结果并且对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受。
本发明中使用的溶瘤腺病毒是具有复制机制和允许在人类癌细胞中感染和复制的衣壳的溶瘤腺病毒。在一个优选的实施方案中，所述溶瘤腺病毒优选地由感染人类的腺病毒产生，例如由人类腺病毒的血清型1至51或其组合(两种或更多种不同血清型的腺病毒的杂交重组体)的腺病毒产生。在最优选的实施方案中，本发明中使用的溶瘤腺病毒由人类腺病毒血清型5产生。
应当注意，透明质酸酶有助于确保溶瘤腺病毒更大或更容易的扩散和渗透，从而确保所述腺病毒能够到达并感染更大数量的视网膜母细胞瘤细胞。
此外，在一个实施方案中，透明质酸酶是哺乳动物睾丸透明质酸酶，更优选地人类睾丸透明质酸酶(GenBank基因ID:6677)，也被称为SPAM1或精子粘附分子1或PH20。在一个实施方案中，所述酶的序列从该序列中缺失了对应于膜结合羧基末端结构域的序列，以便酶是可溶的。当缺失该羧基末端结构域时，所得的酶被分泌到细胞外环境中。
在一个优选的实施方案中，编码插入溶瘤腺病毒基因组的透明质酸酶的序列是从中缺失了对应于羧基末端结构域的核苷酸1471至1527的SEQ ID NO:1。
设想了透明质酸酶序列被插入在溶瘤腺病毒基因组中的任何点处，只要它允许所述腺病毒在肿瘤或癌细胞中选择性复制，并且只要透明质酸酶以所需的量有效地且功能性地表达和产生。优选地，透明质酸酶序列被插入到溶瘤腺病毒的在腺病毒纤维核苷酸序列之后的基因组中。
显然，透明质酸酶的表达受待治疗的视网膜母细胞瘤细胞中可操作的启动子控制。优选地，所述酶的表达受动物细胞中可操作的启动子控制。优选地，启动子选自由以下组成的组：巨细胞病毒启动子、腺病毒主要晚期启动子、SV40启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子、RSV启动子、EF1-α启动子、β-肌动蛋白启动子、人类IL-2启动子、人类IL-4启动子、IFN启动子、E2F启动子、人类GM-CSF启动子或其组合。调控酶表达的启动子可以是在腺病毒中天然存在的，就像腺病毒主要晚期启动子的情况一样。启动子也可以与编码酶的序列一起插入。在一个优选的实施方案中，启动子是腺病毒主要晚期启动子，并且该腺病毒主要晚期启动子已经位于溶瘤腺病毒基因组中。在该最后的实施方案中，不必将启动子与透明质酸酶序列一起引入，而是将后者以使其保持在所述启动子的控制下的方式引入溶瘤腺病毒基因组中。
设想了溶瘤腺病毒包含允许促进或优化编码透明质酸酶的序列的蛋白翻译的另外的序列。所述序列可以在透明质酸酶基因的内部或外部。例如，所述另外的序列选自由以下组成的组：允许RNA被加工的切割和剪接的序列、IRES(内部核糖体进入位点)序列、小核糖核酸病毒序列2A或其组合。
由本发明中使用的溶瘤病毒包含的肿瘤细胞特异性复制机制是如以上解释的引起溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中而不在健康细胞或正常细胞中以特定形式自我复制的机制。所述机制可以采取不同的形式，如果，作为结果，它仅提供在视网膜母细胞瘤(肿瘤)细胞中具有复制能力的溶瘤腺病毒-换言之，具有选择性复制的腺病毒，其中它们的复制机制要求病毒进入癌细胞或肿瘤细胞以便病毒自我复制。在这一方面，所使用的溶瘤腺病毒可以在其基因组序列具有给予其在肿瘤细胞中选择性复制的修饰。
在一个实施方案中，这是通过掺入特异性组织启动子或特异性肿瘤启动子来实现的，其中所述启动子控制E1a、E1b、E2和E4的组中一个或更多个基因的表达。特别地，启动子选自由以下组成的组：E2F启动子、端粒酶hTERT启动子、酪氨酸酶启动子、前列腺特异性抗原(PSA)启动子、甲胎蛋白启动子、COX-2启动子，以及由各种转录因子结合位点(诸如缺氧诱导因子(HIF-1)、ETS转录因子、肿瘤细胞毒性因子(TCF)、E2F转录因子或Sp1转录因子的结合位点)形成的人工启动子。优选地，启动子控制E1a的表达。
在一个优选的实施方案中，肿瘤细胞特异性的复制机制是可以在肿瘤细胞中被两个缺陷拷贝的Rb1基因补偿的缺陷复制机制。换言之，这是一种被突变或修饰的复制机制，使得当它进入健康(非肿瘤)细胞时它不被表达或以它不导致病毒复制的方式表达。相反，当溶瘤腺病毒进入具有以上提到的特征的肿瘤细胞时，复制机制获得足够的补偿(肿瘤细胞执行病毒中缺乏的功能)，使得病毒能够被复制(完成其周期，产生病毒并且导致肿瘤细胞裂解)。在该实施方案中，用于在具有Rb1基因的两个缺陷拷贝的肿瘤细胞中实现所述选择性复制的一种选择是消除阻断视网膜母细胞瘤(RB)途径的E1A的早期功能。与视网膜母细胞瘤蛋白直接相互作用的其他病毒基因，诸如E4和E4orf6/7，分别是用于缺失或截短的候选者，以便在具有Rb1基因的两个缺陷拷贝的肿瘤细胞中实现选择性复制。在最优选的实施方案中，本发明中使用的溶瘤腺病毒的特征在于缺失Δ24(其影响E1a与视网膜母细胞瘤蛋白的相互作用)，以及与E2F-1结合的四个位点和与Sp1结合的一个位点到内源E1a启动子中的插入以控制E1a的表达。所述DNA序列对应于所附序列表中的SEQ ID NO:2。
符合以上(即允许溶瘤腺病毒在视网膜母细胞瘤肿瘤细胞中特异性复制)的其他修饰，也被提供并包括在本发明中。
解释在视网膜母细胞瘤中实现选择性复制的两种策略并不相互排斥。
此外，设想了本发明中使用的溶瘤腺病毒包含衣壳中的一种或更多种修饰，允许所述溶瘤腺病毒对癌细胞或肿瘤细胞的亲和力增加(在其衣壳中的修饰增加其针对癌细胞或肿瘤细胞的感染性或将其导向所述癌细胞或肿瘤细胞中存在的受体)。以这种方式，感染癌细胞或肿瘤细胞的溶瘤腺病毒的比例与感染健康细胞的那些相比增加，并且后一种腺病毒与前者相比甚至可以达到可忽略的量。
在一个实施方案中，本发明中使用的溶瘤腺病毒已被遗传修饰，以便在腺病毒衣壳蛋白中包含增加感染性或将病毒导向癌细胞或肿瘤细胞中受体的配体。将腺病毒导向肿瘤也可以通过双功能配体实现，所述双功能配体在一侧与病毒结合，并且在另一侧与肿瘤受体结合。在一个优选的实施方案中，本发明中使用的溶瘤腺病毒具有修饰的衣壳，以增加其感染性或将其更好地导向靶肿瘤细胞，使得腺病毒纤维中存在的硫酸乙酰肝素的结合结构域KKTK已被结构域RGDK取代。所述修饰涉及腺病毒纤维的位置91至94，以腺病毒血清型5纤维的标准序列作为参照。序列SEQ ID NO:9示出了在其硫酸乙酰肝素结合结构域中具有修饰形式(修饰RGDK)的腺病毒5型纤维蛋白的完整序列。
此外，出于其他目的修饰病毒的衣壳，例如增加溶瘤腺病毒在血液中的持久性，并且因此增加所述腺病毒到达肿瘤结节的可能性(特别是如果所述结节或肿瘤病灶是扩散的)也是可能的。例如，衣壳可以用聚合物(诸如聚乙二醇)覆盖。
因此，在最优选的实施方案中，本发明中使用的溶瘤腺病毒由人类腺病毒血清型5产生，并且包含：
-编码插入其基因组的透明质酸酶的序列，更优选地已从中缺失了对应于膜结合羧基末端结构域的序列的人类睾丸透明质酸酶序列(PH20，SEQ ID NO:1)，，以便酶是可溶的。
-在肿瘤细胞中可以被两个缺陷拷贝的Rb1基因补偿的缺陷复制机制；更优选地，所述机制包含影响E1a与Rb蛋白相互作用的缺失Δ24，以及E2F-1的四个结合位点和Sp1的一个结合位点到内源E1a启动子中的插入以控制E1a的表达；
-修饰腺病毒衣壳，以增加所述病毒的感染性或将所述腺病毒更好地导向靶肿瘤细胞；更优选地腺病毒纤维中存在的硫酸乙酰肝素的结合结构域KKTK已被结构域RGDK取代。
优选地，本发明的溶瘤病毒序列对应于SEQ ID NO:3。
本发明中使用的溶瘤腺病毒可以已在其基因组中插入基因疗法领域中针对癌症常用的其他基因，例如胸苷激酶基因、胞嘧啶脱氨酶基因、促凋亡基因、免疫刺激剂、肿瘤抑制剂或前药活化剂，以增加溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的细胞毒性。
为了构建本发明中待使用的溶瘤腺病毒(即，如以上解释的)，使用在使用腺病毒的基因疗法和病毒疗法领域中已知的任何构建遗传修饰的腺病毒的方法。最常用的方法是基于首先在含有待被修饰的腺病毒区的质粒中构建所期望的遗传修饰，并且随后在细菌中与含有病毒基因组剩余部分的质粒进行同源重组。
将本发明中使用的溶瘤腺病毒在基因疗法和病毒疗法领域常用的细胞系，诸如株系HEK-293(参考号：ATCC CRL-1573)和A549(参考号：ATCC CCL185)中增殖和扩增。增殖所述腺病毒的优选的方法是通过感染允许腺病毒复制的细胞系。肺腺癌系A549是具有此类特征的株系的实例。例如，增殖发生如下：使A549细胞生长在塑料细胞培养板上，并且使用100个病毒颗粒/细胞感染。两天后，作为反映病毒产生的细胞病变效应，可以观察到细胞的聚集。收集细胞并储存在管中。在以1000g离心5分钟后，将细胞沉淀物冻融三次，以裂解细胞。将所得的细胞提取物以1000g离心5分钟，并且将病毒所在的上清液装载在氯化铯梯度上，并且以35,000g离心1小时。将从梯度获得的病毒条带再次装载在另一氯化铯梯度上，并且以35,000g离心16小时。收集病毒条带，并且针对PBS-10％甘油透析。将病毒透析物等分并且储存在-80℃。噬斑形成单位和颗粒的数目按照现有技术中已知的标准方案来定量。含有5％甘油的磷酸盐缓冲盐水(PBS)是用于储存腺病毒的标准制剂。然而，已经描述了提高病毒稳定性的新制剂。用于纯化用于在癌症治疗中使用的含有透明质酸酶基因的腺病毒的方法与现有技术中用于在癌症的病毒疗法和基因疗法中使用的其他腺病毒和腺病毒载体描述的那些方法相同。
应当理解，本发明中使用的组合物以药学上可接受的形式使用。这意味着所述组合物可以另外包含药学上可接受的赋形剂。
所需的溶瘤腺病毒的剂量可以由本领域技术人员确定，考虑各种参数，例如玻璃体腔的体积、待治疗视网膜母细胞瘤的体积或待治疗患者的年龄和体重。应当理解，剂量必须是溶瘤腺病毒的治疗有效量，以便对视网膜母细胞瘤产生积极的治疗作用，“积极的治疗作用”意指维持或降低视网膜母细胞瘤体积。
显然，本领域技术人员将根据特定的施用方法，特别是考虑到待使用的施用途径，来调整组合物。
组合物也可以以治疗方案施用，该治疗方案包括施用一种或更多种其他抗肿瘤剂(诸如一种或更多种化疗药物)和/或一种或更多种治疗视网膜母细胞瘤所常规使用的其他前述疗法。本发明中使用的组合物与这些其他治疗剂和/或疗法的关系，可以是在其施用之前、同时或之后施用。当本发明中使用的组合物与一种或更多种其他抗肿瘤剂同时施用时，所述一种或更多种其他抗肿瘤剂可以被包含在本发明中使用的组合物中，或者可以作为单独的组合物被施用。
可选地，本发明中使用的包含如以上解释的溶瘤腺病毒的组合物可以单独地在用于治疗视网膜母细胞瘤的治疗方案中使用，即，不使用其他抗肿瘤剂和/或其他常规疗法。
根据第二方面，本发明公开了包含溶瘤腺病毒的组合物用于制备意图用于预防、去除或降低与视网膜母细胞瘤相关的转移、继发性恶性肿瘤和/或三侧性视网膜母细胞瘤的药物产品的用途，其中前述溶瘤腺病毒包含：
-编码插入其基因组的透明质酸酶的序列；和
-肿瘤细胞特异性的复制机制。
所述组合物通过确保必要量的腺病毒到达眼球内部的任何途径注射，优选地通过眼内注射，甚至更优选地玻璃体内注射。因此，在一个优选的实施方案中，前述组合物采取用于玻璃体内或眼内施用或注射的适当形式。
用于本发明中提供的组合物的另一种可能的施用途径是瘤内注射。
在一个优选的实施方案中，预防、去除或降低与视网膜母细胞瘤相关的转移、继发性恶性肿瘤和/或三侧性视网膜母细胞瘤发生在哺乳动物，优选地人类，更优选地人类儿科患者中。
在另一个优选实施方案中，所治疗的视网膜母细胞瘤是对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受的视网膜母细胞瘤；甚至更优选地，所述视网膜母细胞瘤是难治性的或复发的结果，并且对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受。
所使用的溶瘤腺病毒与先前已解释的相同。
组合物和所述组合物被使用或可以被施用的形式也与先前已解释的相同。
根据第三方面，本发明涉及包含溶瘤腺病毒的组合物，该组合物用于其在治疗视网膜母细胞瘤中使用，其中前述溶瘤腺病毒包含：
-编码插入其基因组的透明质酸酶的序列；和
-肿瘤细胞特异性的复制机制。
所述组合物通过确保必要量的腺病毒到达眼球内部的任何途径注射，优选地通过眼内注射，甚至更优选地玻璃体内注射。因此，在一个优选的实施方案中，前述组合物采取用于玻璃体内或眼内施用或注射的适当形式。
用于本发明中提供的组合物的另一种可能的施用途径是瘤内注射。
在一个优选的实施方案中，视网膜母细胞瘤的治疗发生在哺乳动物，优选地人类，更优选地人类儿科患者中。
在另一个优选的实施方案中，所治疗的视网膜母细胞瘤是对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受的视网膜母细胞瘤；甚至更优选地，所述视网膜母细胞瘤是难治性的或复发的结果并且对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受。
所使用的溶瘤腺病毒与先前已解释的相同。
组合物和所述组合物被使用或可以被施用的形式也与先前已解释的相同。
根据第四方面，本发明涉及包含溶瘤腺病毒的组合物，所述组合物用于其在预防、去除或降低与视网膜母细胞瘤相关的转移、继发性恶性肿瘤和/或三侧性视网膜母细胞瘤中使用，其中前述溶瘤腺病毒包含：
-编码插入其基因组的透明质酸酶的序列；和
-肿瘤细胞特异性的复制机制。
所述组合物通过确保必要量的腺病毒到达眼球内部的任何途径注射，优选地通过眼内注射，甚至更优选地玻璃体内注射。因此，在一个优选的实施方案中，前述组合物采取用于玻璃体内或眼内施用或注射的适当形式。
用于本发明中提供的组合物的另一种可能的施用途径是瘤内注射。
在一个优选的实施方案中，预防、去除或降低与视网膜母细胞瘤相关的转移、继发性恶性肿瘤和/或三侧性视网膜母细胞瘤发生在哺乳动物，优选地人类，更优选地人类儿科患者中。
在另一个优选的实施方案中，所治疗的视网膜母细胞瘤是对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受的视网膜母细胞瘤；甚至更优选地，所述视网膜母细胞瘤是难治性的或复发的结果并且对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受。
所使用的溶瘤腺病毒与先前已解释的相同。
组合物和所述组合物被使用或可以被施用的形式也与先前已解释的相同。
根据第五方面，本发明涉及一种用于在有相应需要的患者中治疗视网膜母细胞瘤的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含溶瘤腺病毒的组合物，其中前述溶瘤腺病毒包含
-编码插入其基因组的透明质酸酶的序列；和
-肿瘤细胞特异性的复制机制。
所述组合物通过确保必要量的腺病毒到达眼球内部的任何途径注射，优选地通过眼内注射，甚至更优选地玻璃体内注射。因此，在一个优选的实施方案中，前述组合物采取用于玻璃体内或眼内施用或注射的适当形式。
用于本发明中提供的组合物的另一种可能的施用途径是瘤内注射。
在一个优选的实施方案中，需要治疗视网膜母细胞瘤的患者是哺乳动物，优选地人类，更优选地人类儿科患者。
在另一个优选的实施方案中，所治疗的视网膜母细胞瘤是对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受的视网膜母细胞瘤；甚至更优选地，所述视网膜母细胞瘤是难治性的或复发的结果，并且对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受。
所使用的溶瘤腺病毒与先前已解释的相同。
组合物和所述组合物被使用或可以被施用的形式也与先前已解释的相同。
根据最后一个方面，本发明涉及一种用于有相应需要的患者中预防、去除或降低与视网膜母细胞瘤相关的转移、继发性恶性肿瘤和/或三侧性视网膜母细胞瘤的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含溶瘤腺病毒的组合物，其中前述溶瘤腺病毒包含：
-编码插入其基因组的透明质酸酶的序列；和
-肿瘤细胞特异性的复制机制。
所述组合物通过确保必要量的腺病毒到达眼球内部的任何途径注射，优选地通过眼内注射，甚至更优选地玻璃体内注射。因此，在一个优选的实施方案中，前述组合物采取用于玻璃体内或眼内施用或注射的适当形式。
用于本发明中提供的组合物的另一种可能的施用途径是瘤内注射。
在一个优选的实施方案中，需要预防、切除或减少与视网膜母细胞瘤相关的转移、继发性恶性肿瘤和/或三侧性视网膜母细胞瘤的患者是哺乳动物，优选人类，更优选人类儿科患者。
在另一个优选的实施方案中，所治疗的视网膜母细胞瘤是对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受的视网膜母细胞瘤；甚至更优选地，所述视网膜母细胞瘤是难治性的或复发的结果，并且对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受。
所使用的溶瘤腺病毒与先前已解释的相同。
组合物和所述组合物被使用或可以被施用的形式也与先前已解释的相同。
因此，本发明的发明人设法解决了现有技术中存在的问题，因为他们能够确定使用具有以上提到的特征的溶瘤腺病毒使得以下是可能的：提供一种替代目前可用的那些的治疗方法，该治疗方法允许避免眼球摘除术，并且提供一种预防、降低或避免与视网膜母细胞瘤相关的转移、继发性恶性肿瘤或三侧性视网膜母细胞瘤的发展的方法。
为了更好地理解，本发明在下文参考通过实例的方式呈现的附图以及参考说明性而非限制性的实施例被更详细地描述。所述实例在细胞培养物(体外)和在动物模型(小鼠和兔)中进行，两者都被承认且接受为科学界中代表视网膜母细胞瘤的可靠模型，在此基础上，本领域技术人员将认识到本发明的方法和治疗在人类中的直接应用。
图1示出了在实施例2中提到的蛋白印迹的结果。在所述蛋白印迹中，在所分析的各种细胞系中分析了蛋白E1A的表达。视网膜外植体被用作常规对照，并且测量了微管蛋白的存在作为表达的对照。在该图中，第1行示出了E1A的表达，并且第2行示出了微管蛋白的表达。关于各列，列A涉及原代细胞系HSJD-RBT1；列B涉及原代细胞系HSJD-RBVS1；列C涉及原代细胞系HSJD-RBT2；列D涉及原代细胞系HSJD-RBVS2，列E涉及原代细胞系HSJD-RBVS3；列F涉及原代细胞系HSJD-RBT5；列G涉及原代细胞系HSJD-RBT7；列H涉及原代细胞系HSJD-RBT8；列I涉及原代细胞系HSJD-RBVS8；列J涉及细胞系Y79；且列K涉及视网膜外植体。
图2以曲线图形式示出了对于实施例3中描述的研究，治疗的眼睛和对照眼睛根据Kaplan-Meier方法的存活率。图2A涉及通过使用细胞系Y79在小鼠中产生原位肿瘤获得的结果；图2B涉及通过使用原代细胞系HSJD-RBT2在小鼠中产生原位肿瘤获得的结果；图2C涉及通过使用原代细胞系HSJD-RBT5在小鼠中产生原位肿瘤获得的结果；图2D涉及通过使用原代细胞系HSJD-RBVS1在小鼠中产生原位肿瘤获得的结果；图2E涉及通过使用原代细胞系HSJD-RBT7在小鼠中产生原位肿瘤获得的结果；以及图2F涉及通过使用原代细胞系HSJD-RBVS8在小鼠中产生原位肿瘤获得的结果。
图3以曲线图形式示出了对于实施例4中描述的研究，治疗的眼睛和对照眼睛根据Kaplan-Meier方法的存活率。图3A涉及通过使用细胞系Y79在小鼠中产生原位肿瘤获得的结果；图3B涉及通过使用原代细胞系HSJD-RBT-002在小鼠中产生原位肿瘤获得的结果；以及图3C涉及通过使用原代细胞系HSJD-RBT-005在小鼠中产生原位肿瘤获得的结果。
图4以曲线图形式示出了对于实施例5中描述的研究，治疗的眼睛和对照眼睛根据Kaplan-Meier方法的存活率。
图5以曲线图表形式示出了对于实施例6中描述的研究，治疗的眼睛和对照眼睛的根据Kaplan-Meier方法存活率。
实施例1.溶瘤腺病毒VCN-01的产生
透明质酸酶PH20的cDNA通过以下获得：用含有限制性内切酶Mfel靶的特异性寡核苷酸PCR扩增(聚合酶链式反应扩增技术)来自细胞系A549基因组的蛋白的各种外显子并且随后使这些外显子结合。将所得片段用Mfel进行消化，并且通过连接克隆在穿梭质粒pNKFiberRGD(含有用RGD修饰的腺病毒纤维序列)中，以产生质粒pNKFiberPH20。对应于克隆在质粒pNKFiberPH20中的PH20蛋白的cDNA示出在SEQ ID NO:1中。SEQ ID NO:1示出了从其转录起始(ATG)至位置1470的编码PH20蛋白的核苷酸。区域1471至1527的核苷酸序列编码蛋白的疏水尾部，该疏水尾部负责将该蛋白锚定至膜上。所述序列是缺失的。在位置1470之后，加入翻译终止密码子TAA。
为了产生质粒pAdwtRGD-PH20，根据现有技术中已知的程序，质粒pVK50cau的腺病毒纤维基因(其含有在纤维中具有SwaI靶的完整Ad5序列)通过在酵母中同源重组被在用NotI/KpnI消化的质粒pNKFiberPH20的透明质酸酶PH20基因后面的纤维基因取代。
腺病毒质粒pICOVIR17被用于产生腺病毒ICOVIR17(SEQ ID NO:17)。为了产生该质粒，质粒pICOVIR15的腺病毒纤维基因通过在酵母中同源重组被在用SpeI/PacI消化的质粒pAdwtRGD-PH20的透明质酸酶PH20基因后面的纤维基因取代。
腺病毒ICOVIR15(SEQ ID NO:4)来自腺病毒AdΔ24RGD，其特征在于在编码蛋白E1a的序列中含有缺失Δ24。该缺失影响E1a与视网膜母细胞瘤蛋白的相互作用。AdΔ24RGD还具有RGD肽在腺病毒纤维中的插入，以增加病毒的感染性。这两种修饰在K.Suzuki等人，"A conditionally replicative adenovirus with enhanced infectivity showsimproved oncolytic potency",Clin Cancer Res 2001,第7卷,第120-6页中被描述。从AdΔ24RGD开始，将E2F-1的四个结合位点和Sp1的一个结合位点插入内源E1a启动子中以控制E1a的表达。以这种方式获得ICOVIR15。该插入通过基因组的序列419至422被具有E2F-1的四个结合位点和Sp1的一个结合位点的序列取代来进行，使得最终序列是在SEQ ID NO:4中所示的序列。为此，单个裂解位点BsiWI通过针对pEndK/Spe的E1A启动子的诱变产生(J.E.Carette等人，"Conditionally replicating adenoviruses expressing shorthairpin RNAs silence the expression of a target gene in cancer cells",CancerRes 2004,第64卷,第2663-7页)。SP1的结合位点通过以下被引入到具有位点BsiWI的pEndK/Spe质粒中：通过连接用BsiWI消化的所述质粒与配对在一起的寡核苷酸Sp1F(SEQID NO:5-5'-GTACGTCGACCACAAACCCCGCCCAGCGTCTTGTCATTGGCGTCGACGCT-3')和Sp1R(SEQID NO:6-5'-GTACAGCGTCGACGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGGTCGAC-3’)。E2F的结合位点通过结合配对在一起的寡核苷酸E2FF2(SEQ ID NO:7-5'-GTACGTCGGCGGCTCGTGGCTCTTTCGCGGCAAAAAGGATTTGGCGCGTAAAAGTGGTTCGAA-3')和E2FR2(SEQ ID NO:8-5'-GTACTTCGAACCACTTTTACGCGCCAAATCCTTTTTGCCGCGAAAGAGCCAC GAGCCGCCGAC-3')引入，以产生质粒pEndK415Sp1E2F2。接下来，含有在酵母中质粒复制所需的元件-着丝粒、自主重组序列ARS和选择标志物URS3的CAU序列通过在酵母中同源重组引入，以产生质粒pEndK415Sp1E2F2CAU。最后，进行用KpnI消化的质粒pEndK415Sp1E2F2CAU与腺病毒AdΔ24RGD的腺病毒基因组在酵母中的同源重组，以构建pICOVIR15cau。通过将PacI消化的pICOVIR15cau转染至HEK293细胞(ATCC参考号CRL-1573)获得ICOVIR15。
含有与ICOVIR15相同的修饰加上在腺病毒纤维基因之后的透明质酸酶基因的插入的腺病毒ICOVIR17是通过用PacI消化pICOVIR17质粒并转染到HEK293细胞中产生。
腺病毒VCN-01是使用腺病毒质粒pICOVIR17RGDK产生的。在该质粒中，天然腺病毒血清型5纤维基因已在其硫酸乙酰肝素结合结构域中被修饰的形式代替(多肽序列的氨基酸91KKTK94被91RGDK94取代)。质粒pICOVIR17RGDK通过在NdeI对pICOVIR17的部分消化产物和用EcoRI消化的质粒pBSattKKT(含有在N.Bayó-Puxan等人，"Replacement of adenovirustype 5fiber shaft heparan sulfate proteoglycan-binding domain with RGD forimproved tumor infectivity and targeting".Human Gene Therapy 2009,第20卷,第1214-21页中描述的修饰形式的腺病毒纤维)之间在酵母中的同源重组来构建。
序列SEQ ID NO:9示出了在其硫酸乙酰肝素结合结构域中具有修饰形式(修饰RGDK)的腺病毒血清型5纤维蛋白的完整序列。腺病毒ICOVIR17含有这样的腺病毒纤维基因的形式，在该腺病毒纤维基因中肽RGD-4C(Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys；CDCRGDCFC；SEQ ID NO:10)已经被插入了蛋白的节结构域(knob domain)的HI区(腺病毒衣壳的高变环，进化上非保守且高度暴露)。除了纤维基因之外，VCN-01完全类似于ICOVIR17，因为在这种情况下，VCN-01纤维与天然形式的人类腺病毒血清型5差异仅在于在蛋白的轴结构域(shaft domain)中，氨基酸91KKTK94已被对整联蛋白具有高亲和力的肽91RGDK94取代。
实施例2.对用化学疗法和/或放射疗法的常规治疗难治性的视网膜母细胞瘤的原代培养物中的细胞毒性。
首先，在从对常规化学疗法和/或放射疗法治疗显示出耐受性的视网膜母细胞瘤中获得的各种原代培养物中研究IC50。还分析了细胞系Y79(ATCC参考号HTB-18)。
为了获得各种原代培养物，首先根据对应伦理委员会批准且具有知情同意的方案，在Sant Joan de Deu医院(HSJD,Barcelona)从患有视网膜母细胞瘤的患者的被摘除的眼睛中采集肿瘤样品。从两个可能的来源收集样本：视网膜中的实体肿瘤组织(视网膜母细胞瘤肿瘤；RBT)或来自玻璃体中的肿瘤种子(视网膜母细胞瘤玻璃体种子；RBVS)。为了获得RBT样本的细胞悬浮液，将这些使用胶原酶(5mg/mL)和DNA酶(40Kunitz单位/mL)(Sigma,StLouis,MO)的混合物在37℃解聚5分钟；通过离心从RBVS样品中收集细胞。用PBS洗涤两次后，将肿瘤细胞培养为漂浮在无血清神经干细胞培养基中的肿瘤球。
为了确定VCN-01的IC50值，对以5000个细胞/孔接种的96孔板上的每一行进行测试。培养24小时后，将细胞以一式三份暴露于递增剂量的VCN-01中持续11-14天。在此时，每一个孔的代谢活性使用试剂MTS(Promega,Fitchburg,WI,USA)并根据现有技术中已知的程序确定。基于这些值并使用Graphpad Prism 5软件(La Jolla,CA,USA)，计算引起细胞增殖减少50％的VCN-01的浓度(IC50值)。
表1.在对常规化学疗法和/或放射疗法治疗难治性的视网膜母细胞瘤的原代培养物中；和细胞系Y79中获得的IC50结果。
如在表1中可以看出，VCN-01在除了一个(HSJD-RBVS1)之外的所有被测试的细胞系中显示出很大的细胞毒性，由此可以推断，所述溶瘤腺病毒不仅可以正确感染大量来源于视网膜母细胞瘤的原代细胞系，而且在它们中它也具有高的细胞毒性活性。
此外，通过蛋白印迹分析细胞系感染24小时后的腺病毒蛋白E1A的表达(所述表达表明VCN-01的缺陷复制机制被对应的肿瘤细胞的机制正确地补偿)。如在图1中可以看出，除了细胞系HSJD-RBVS1之外，在以上提到的所有细胞系中都观察到蛋白E1A的表达，这与获得且在表1中示出的IC50结果一致或相关。
实施例3.在注射VCN-01或媒介物治疗的小鼠中的人类视网膜母细胞瘤的各种原位模型中的抗肿瘤活性。
将6周龄雌性无胸腺小鼠(Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu)用在2μLMatrigel中的对应的原代细胞系或细胞系Y79的200,000个细胞注射到双眼的玻璃体腔中。在第八天，将100×剂量的VCN-01(2μL，总含量为3×109个病毒颗粒/眼睛)的玻璃体内注射施加至每只动物的右眼。对侧(左)眼睛通过玻璃体内途径注射VCN-01在其中被稀释的媒介物(20mM TrispH 8.0，25mM NaCl，2.5％甘油)。
每一个实验组中小鼠的分布如表2所示。
表2.实施例3中的实验组和每个研究组的小鼠数目。
组(在小鼠眼睛中产生原位肿瘤的细胞系) 治疗组中小鼠数目
细胞系Y79 17
HSJD-RBT2 6
HSJD-RBT5 6
HSJD-RBVS1 6
HSJD-RBT7 6
HSJD-RBVS8 5
在这种情况下，所研究的是治疗的眼睛和对照眼睛的存活，即直到视网膜母细胞瘤的尺寸需要摘除所述眼睛的天数。
如在图2中可以看出，用腺病毒VCN-01治疗的眼睛在所有分析的组中以更大数目并且以更长持续时间存活(也就是说，不管用于在小鼠眼睛中植入原位肿瘤使用的细胞系如何，当用腺病毒VCN-01施加治疗时，观察到显著的改善)。
实施例4.用用两次注射VCN-01或媒介物治疗的小鼠中的人类视网膜母细胞瘤的各种原位模型中的抗肿瘤活性。
将6周龄雌性无胸腺小鼠(Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu)用在2μL Matrigel中的对应的原代细胞系或细胞系Y79的200,000个细胞注射到每一只眼睛的玻璃体腔中。在第八天，将100×剂量的VCN-01(2μL，总含量为3×109个病毒颗粒)的玻璃体内注射施加至治疗组中的小鼠的双眼，并且另一组(对照组)的小鼠被给予向一只眼睛中的媒介物(20mM TrispH 8.0，25mM NaCl，2.5％甘油)的玻璃体内注射。在第22天，重复该治疗程序，即将100×剂量的VCN-01(2μL，总含量为3×109个病毒颗粒)的玻璃体内注射施加至治疗组中小鼠的双眼，并且另一组小鼠(对照组)也被给予向双眼中相同媒介物的玻璃体内注射。
每一个实验组中小鼠的分布如表3中所示。
表3.实施例4中的实验组和每个研究组的小鼠数目。
组(在小鼠眼睛中产生原位肿瘤的细胞系) 对照组中小鼠数目 治疗组中小鼠数目
细胞系Y79 6 6
HSJD-RBT2 6 6
HSJD-RBT5 6 6
在这种情况下，还研究了治疗的眼睛和对照眼睛的存活，即直到视网膜母细胞瘤的尺寸需要摘除所述眼睛的天数。
如在图3中可以看出，用腺病毒VCN-01治疗的眼睛在所有分析的组中以更大数目并且以更长持续时间存活(也就是说，不管用于在小鼠眼睛中植入原位肿瘤使用的细胞系如何，当用腺病毒VCN-01施加治疗时，观察到显著的改善)。
实施例5.VCN-01在小鼠中的剂量递增研究。
将6周龄雌性无胸腺小鼠(Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu)用在2μL Matrigel中的原代细胞系HSJD-RBT2的200,000个细胞进行注射(第0天)。接下来，将所述小鼠根据以下组和以下方案进行治疗：
表4.实施例5中的研究中的组和治疗天数。通过将视网膜母细胞瘤的原代系的细胞被注射或植入以产生原位肿瘤时时的那天作为第0天来表示天数。
所分析的参数是治疗的眼睛和对照眼睛的存活，即直到视网膜母细胞瘤的尺寸需要摘除所述眼睛的天数。
将获得的结果归纳于图4中。如在所述图中可以看出，针对眼睛存活，所有被测试剂量的VCN-01给出比对照或化学疗法治疗组明显更好的结果。另外，出乎意料地，可以确定提供眼睛持续更长时间的最大存活的剂量是10×。
实施例6.VCN-01在小鼠中的剂量递增研究。
将6周龄雌性无胸腺小鼠(Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu)用在2μL Matrigel中的原代细胞系HSJD-RBT2的200,000个细胞进行注射(第0天)。接下来，将所述小鼠根据以下组和以下方案进行治疗：
表5.实施例5中的研究中的组和治疗天数。通过将视网膜母细胞瘤的原代系的细胞被注射或植入以产生原位肿瘤时的那天作为第0天来表示天数。
所分析的参数是治疗的眼睛和对照眼睛的存活，即直到视网膜母细胞瘤的尺寸需要摘除所述眼睛的天数。
将获得的结果归纳于图5中。如在所述图中可以看出，与对照组相比，所有剂量显示出优越的结果。此外，高剂量和低剂量在治疗结束时也显示出比用玻璃体内化学疗法治疗的组优越的效果。
尽管已经结合优选的实施方案描述了本发明，但是这些不应被认为是限制本发明，本发明由以下权利要求的最广泛解释限定。
实施例7.VCN-01对在小鼠中的视网膜母细胞瘤的脑转移的影响的分析。
视网膜母细胞瘤向中枢神经系统(CNS)的眼外延伸对患者来说是致命的。
为了进行该研究，使用视网膜母细胞瘤的原位模型。使用来自实施例5和6中的小鼠，接受向每只眼睛的后段的2×105个HSJD-RBT2细胞(以上文提到的并且从对化学疗法耐受的视网膜母细胞瘤患者的眼睛中获得的细胞的原代培养物)的注射的6周龄雌性无胸腺裸鼠(Hsd:AthymicNude-Foxn1nu株系–Harlan Laboratories,Gannat,France)的脑。
表6.实施例7中的研究中分析的脑，对从其提取脑的每一只小鼠施加的治疗的细节。
施加于表6中提到的每一个组的治疗方案(作为参考，细胞注射日为-7)为:
·第1组(媒介物)：在第1天和第15天注射。
·第2组(全身化学疗法)：在第1天、第2天和第3天注射依托泊苷，并在第1天注射卡铂。在第22天、第23天和第24天；以及第43天、第44天和第45天，重复相同的施用方案。
·第3至8组(施用不同剂量的VCN-01)。在第1天和第15天注射。
评价表6中提到的脑中的人类视网膜母细胞瘤细胞的存在。通过借助实时聚合酶链式反应测量CRX信使核糖核酸(mRNA)的量来进行所述评价。为此，使用TRIzol(LifeTechnologies,Waltham,MA,USA)从小鼠的脑中提取总核糖核酸(RNA)。接下来，使用1μg提取的RNA，用M-MLV反转录酶系统(Life Technologies,Waltham,MA,USA)合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)。使用现有技术中已知的用于实时聚合酶链式反应的常用方案测量CRX mRNA的量；具体地，使用Green PCR Master Mix(LifeTechnologies,Waltham,MA,USA)准备体积为10μL的反应；使用表7中所示的引物和探针；并且使用7500序列检测系统(AppliedBiosytems,Foster City,CA,USA)检测实时聚合酶链式反应的各个循环中的信号(第一阶段在95℃10min，随后是在95℃15s和在60℃1min的40个循环)。
使用TATA盒结合蛋白(TBP)的mRNA作为用于归一化CRX基因表达的对照。它的表达根据以上所示的和现有技术中已知的方案，并且为该目的使用表7中所示的引物和探针来测量。
表7.在实时聚合酶链式反应中用于测量CRX和TBP表达的引物和探针。
类型 基因 序列 SEQ ID NO:
正向引物 CRX 5’-AGGTGGCTCTGAAGATCAATCTG-3’ 11
反向引物 CRX 5’-TTAGCCCTCCGGTTCTTGAA-3’ 12
探针 CRX 5’-FAM-CTGAGTCCAGGGTTC-MGB-3’ 13
正向引物 TBP 5’-GAACATCATGGATCAGAACAACAG-3’ 14
反向引物 TBP 5’-ATTGGTGTTCTGAATAGGCTGTG-3‘ 15
探针 TBP 5’-FAM-CTGCCACCTTACGCTCAGGGCTTGG-TAMRA-3’ 16
通过2ΔΔCt方法处理所获得的信号，以便确定阳性脑样品和阴性脑样品。将获得的结果归纳于表8中。
表8.针对在实施例7中分析的各组小鼠的视网膜母细胞瘤脑转移分析中获得的结果。
组 治疗 所分析的可用脑的数目 具有转移的脑的数目
1 媒介物(阴性对照) 14 6
2 全身化学疗法(阳性对照) 5 4
3 VCN-01的参考剂量 6 0
4 VCN-01的高剂量 11 0
5 VCN-01的中等剂量 7 0
6 VCN-01的低剂量 14 3
7 VCN-01的极低剂量 6 1
8 VCN-01的超低剂量 5 0
如从表8中可以推断，在用不同剂量的VCN-01治疗的49只小鼠中仅4只(8％)显示出在CNS中转移的迹象(即，在所述小鼠的脑中可以检测到人类视网膜母细胞瘤细胞)，而43％的阴性对照和80％的用全身化学疗法治疗的小鼠具有在CNS中的转移。用中等、高和参考剂量的VCN-01治疗的小鼠都没有发展转移。
因此可以得出结论，VCN-01以一种出乎意料的方式阻止视网膜母细胞瘤向CNS的扩散。
序列表
<110> VCN生物科学有限公司
<120> 病毒载体在治疗视网膜母细胞瘤中的用途
<130> P 1500081
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1530
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 包含羧基末端结构域的完整PH20 cDNA序列。(从ATG直到终止密码子，包括两者)
<400> 1
atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta 60
tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca 120
cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180
cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga 240
ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300
tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360
caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420
ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480
aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540
ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600
gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660
tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720
gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780
ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840
cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900
tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960
cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020
accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080
atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag ccaagtgctt 1140
tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200
aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260
ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320
ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380
gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440
ttctacaatg cttcaccctc cacactatct gccacaatgt tcattgttag tattttgttt 1500
cttatcattt cttctgtagc gagtttgtaa 1530
<210> 2
<211> 1406
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在VCN-01中修饰的E1a的内源启动子+编码E1a-Δ24区的序列(包含
E2F-1的四个结合位点、Sp1的结合位点、和E1a-Δ24的编码区)
<400> 2
aataagagga agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta 60
gggccgcggg gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt 120
ttccgcgtac gtcggcggct cgtggctctt tcgcggcaaa aaggatttgg cgcgtaaaag 180
tggttcgagt acgtcggcgg ctcgtggctc tttcgcggca aaaaggattt ggcgcgtaaa 240
agtggttcga agtacgtcga ccacaaaccc cgcccagcgt cttgtcattg gcgtcgacgc 300
tgtacggggt caaagttggc gttttattat tatagtcagc tgacgtgtag tgtatttata 360
cccggtgagt tcctcaagag gccactcttg agtgccagcg agtagagttt tctcctccga 420
gccgctccga caccgggact gaaaatgaga catattatct gccacggagg tgttattacc 480
gaagaaatgg ccgccagtct tttggaccag ctgatcgaag aggtactggc tgataatctt 540
ccacctccta gccattttga accacctacc cttcacgaac tgtatgattt agacgtgacg 600
gcccccgaag atcccaacga ggaggcggtt tcgcagattt ttcccgactc tgtaatgttg 660
gcggtgcagg aagggattga cttactcact tttccgccgg cgcccggttc tccggagccg 720
cctcaccttt cccggcagcc cgagcagccg gagcagagag ccttgggtcc ggtttctatg 780
ccaaaccttg taccggaggt gatcgatcca cccagtgacg acgaggatga agagggtgag 840
gagtttgtgt tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattatcac 900
cggaggaata cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc 960
atgtttgtct acagtaagtg aaaattatgg gcagtgggtg atagagtggt gggtttggtg 1020
tggtaatttt ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt attgtgattt 1080
ttttaaaagg tcctgtgtct gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg gagcctgcaa 1140
gacctacccg ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt 1200
ctagagaatg caatagtagt acggatagct gtgactccgg tccttctaac acacctcctg 1260
agatacaccc ggtggtcccg ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc 1320
gtcgccaggc tgtggaatgt atcgaggact tgcttaacga gcctgggcaa cctttggact 1380
tgagctgtaa acgccccagg ccataa 1406
<210> 3
<211> 37607
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VCN-01 (ICOVIR-17K)的完整序列
<400> 3
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360
gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgtac 420
gtcggcggct cgtggctctt tcgcggcaaa aaggatttgg cgcgtaaaag tggttcgagt 480
acgtcggcgg ctcgtggctc tttcgcggca aaaaggattt ggcgcgtaaa agtggttcga 540
agtacgtcga ccacaaaccc cgcccagcgt cttgtcattg gcgtcgacgc tgtacggggt 600
caaagttggc gttttattat tatagtcagc tgacgtgtag tgtatttata cccggtgagt 660
tcctcaagag gccactcttg agtgccagcg agtagagttt tctcctccga gccgctccga 720
caccgggact gaaaatgaga catattatct gccacggagg tgttattacc gaagaaatgg 780
ccgccagtct tttggaccag ctgatcgaag aggtactggc tgataatctt ccacctccta 840
gccattttga accacctacc cttcacgaac tgtatgattt agacgtgacg gcccccgaag 900
atcccaacga ggaggcggtt tcgcagattt ttcccgactc tgtaatgttg gcggtgcagg 960
aagggattga cttactcact tttccgccgg cgcccggttc tccggagccg cctcaccttt 1020
cccggcagcc cgagcagccg gagcagagag ccttgggtcc ggtttctatg ccaaaccttg 1080
taccggaggt gatcgatcca cccagtgacg acgaggatga agagggtgag gagtttgtgt 1140
tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattatcac cggaggaata 1200
cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc atgtttgtct 1260
acagtaagtg aaaattatgg gcagtgggtg atagagtggt gggtttggtg tggtaatttt 1320
ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt attgtgattt ttttaaaagg 1380
tcctgtgtct gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg gagcctgcaa gacctacccg 1440
ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt ctagagaatg 1500
caatagtagt acggatagct gtgactccgg tccttctaac acacctcctg agatacaccc 1560
ggtggtcccg ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc gtcgccaggc 1620
tgtggaatgt atcgaggact tgcttaacga gcctgggcaa cctttggact tgagctgtaa 1680
acgccccagg ccataaggtg taaacctgtg attgcgtgtg tggttaacgc ctttgtttgc 1740
tgaatgagtt gatgtaagtt taataaaggg tgagataatg tttaacttgc atggcgtgtt 1800
aaatggggcg gggcttaaag ggtatataat gcgccgtggg ctaatcttgg ttacatctga 1860
cctcatggag gcttgggagt gtttggaaga tttttctgct gtgcgtaact tgctggaaca 1920
gagctctaac agtacctctt ggttttggag gtttctgtgg ggctcatccc aggcaaagtt 1980
agtctgcaga attaaggagg attacaagtg ggaatttgaa gagcttttga aatcctgtgg 2040
tgagctgttt gattctttga atctgggtca ccaggcgctt ttccaagaga aggtcatcaa 2100
gactttggat ttttccacac cggggcgcgc tgcggctgct gttgcttttt tgagttttat 2160
aaaggataaa tggagcgaag aaacccatct gagcgggggg tacctgctgg attttctggc 2220
catgcatctg tggagagcgg ttgtgagaca caagaatcgc ctgctactgt tgtcttccgt 2280
ccgcccggcg ataataccga cggaggagca gcagcagcag caggaggaag ccaggcggcg 2340
gcggcaggag cagagcccat ggaacccgag agccggcctg gaccctcggg aatgaatgtt 2400
gtacaggtgg ctgaactgta tccagaactg agacgcattt tgacaattac agaggatggg 2460
caggggctaa agggggtaaa gagggagcgg ggggcttgtg aggctacaga ggaggctagg 2520
aatctagctt ttagcttaat gaccagacac cgtcctgagt gtattacttt tcaacagatc 2580
aaggataatt gcgctaatga gcttgatctg ctggcgcaga agtattccat agagcagctg 2640
accacttact ggctgcagcc aggggatgat tttgaggagg ctattagggt atatgcaaag 2700
gtggcactta ggccagattg caagtacaag atcagcaaac ttgtaaatat caggaattgt 2760
tgctacattt ctgggaacgg ggccgaggtg gagatagata cggaggatag ggtggccttt 2820
agatgtagca tgataaatat gtggccgggg gtgcttggca tggacggggt ggttattatg 2880
aatgtaaggt ttactggccc caattttagc ggtacggttt tcctggccaa taccaacctt 2940
atcctacacg gtgtaagctt ctatgggttt aacaatacct gtgtggaagc ctggaccgat 3000
gtaagggttc ggggctgtgc cttttactgc tgctggaagg gggtggtgtg tcgccccaaa 3060
agcagggctt caattaagaa atgcctcttt gaaaggtgta ccttgggtat cctgtctgag 3120
ggtaactcca gggtgcgcca caatgtggcc tccgactgtg gttgcttcat gctagtgaaa 3180
agcgtggctg tgattaagca taacatggta tgtggcaact gcgaggacag ggcctctcag 3240
atgctgacct gctcggacgg caactgtcac ctgctgaaga ccattcacgt agccagccac 3300
tctcgcaagg cctggccagt gtttgagcat aacatactga cccgctgttc cttgcatttg 3360
ggtaacagga ggggggtgtt cctaccttac caatgcaatt tgagtcacac taagatattg 3420
cttgagcccg agagcatgtc caaggtgaac ctgaacgggg tgtttgacat gaccatgaag 3480
atctggaagg tgctgaggta cgatgagacc cgcaccaggt gcagaccctg cgagtgtggc 3540
ggtaaacata ttaggaacca gcctgtgatg ctggatgtga ccgaggagct gaggcccgat 3600
cacttggtgc tggcctgcac ccgcgctgag tttggctcta gcgatgaaga tacagattga 3660
ggtactgaaa tgtgtgggcg tggcttaagg gtgggaaaga atatataagg tgggggtctt 3720
atgtagtttt gtatctgttt tgcagcagcc gccgccgcca tgagcaccaa ctcgtttgat 3780
ggaagcattg tgagctcata tttgacaacg cgcatgcccc catgggccgg ggtgcgtcag 3840
aatgtgatgg gctccagcat tgatggtcgc cccgtcctgc ccgcaaactc tactaccttg 3900
acctacgaga ccgtgtctgg aacgccgttg gagactgcag cctccgccgc cgcttcagcc 3960
gctgcagcca ccgcccgcgg gattgtgact gactttgctt tcctgagccc gcttgcaagc 4020
agtgcagctt cccgttcatc cgcccgcgat gacaagttga cggctctttt ggcacaattg 4080
gattctttga cccgggaact taatgtcgtt tctcagcagc tgttggatct gcgccagcag 4140
gtttctgccc tgaaggcttc ctcccctccc aatgcggttt aaaacataaa taaaaaacca 4200
gactctgttt ggatttggat caagcaagtg tcttgctgtc tttatttagg ggttttgcgc 4260
gcgcggtagg cccgggacca gcggtctcgg tcgttgaggg tcctgtgtat tttttccagg 4320
acgtggtaaa ggtgactctg gatgttcaga tacatgggca taagcccgtc tctggggtgg 4380
aggtagcacc actgcagagc ttcatgctgc ggggtggtgt tgtagatgat ccagtcgtag 4440
caggagcgct gggcgtggtg cctaaaaatg tctttcagta gcaagctgat tgccaggggc 4500
aggcccttgg tgtaagtgtt tacaaagcgg ttaagctggg atgggtgcat acgtggggat 4560
atgagatgca tcttggactg tatttttagg ttggctatgt tcccagccat atccctccgg 4620
ggattcatgt tgtgcagaac caccagcaca gtgtatccgg tgcacttggg aaatttgtca 4680
tgtagcttag aaggaaatgc gtggaagaac ttggagacgc ccttgtgacc tccaagattt 4740
tccatgcatt cgtccataat gatggcaatg ggcccacggg cggcggcctg ggcgaagata 4800
tttctgggat cactaacgtc atagttgtgt tccaggatga gatcgtcata ggccattttt 4860
acaaagcgcg ggcggagggt gccagactgc ggtataatgg ttccatccgg cccaggggcg 4920
tagttaccct cacagatttg catttcccac gctttgagtt cagatggggg gatcatgtct 4980
acctgcgggg cgatgaagaa aacggtttcc ggggtagggg agatcagctg ggaagaaagc 5040
aggttcctga gcagctgcga cttaccgcag ccggtgggcc cgtaaatcac acctattacc 5100
ggctgcaact ggtagttaag agagctgcag ctgccgtcat ccctgagcag gggggccact 5160
tcgttaagca tgtccctgac tcgcatgttt tccctgacca aatccgccag aaggcgctcg 5220
ccgcccagcg atagcagttc ttgcaaggaa gcaaagtttt tcaacggttt gagaccgtcc 5280
gccgtaggca tgcttttgag cgtttgacca agcagttcca ggcggtccca cagctcggtc 5340
acctgctcta cggcatctcg atccagcata tctcctcgtt tcgcgggttg gggcggcttt 5400
cgctgtacgg cagtagtcgg tgctcgtcca gacgggccag ggtcatgtct ttccacgggc 5460
gcagggtcct cgtcagcgta gtctgggtca cggtgaaggg gtgcgctccg ggctgcgcgc 5520
tggccagggt gcgcttgagg ctggtcctgc tggtgctgaa gcgctgccgg tcttcgccct 5580
gcgcgtcggc caggtagcat ttgaccatgg tgtcatagtc cagcccctcc gcggcgtggc 5640
ccttggcgcg cagcttgccc ttggaggagg cgccgcacga ggggcagtgc agacttttga 5700
gggcgtagag cttgggcgcg agaaataccg attccgggga gtaggcatcc gcgccgcagg 5760
ccccgcagac ggtctcgcat tccacgagcc aggtgagctc tggccgttcg gggtcaaaaa 5820
ccaggtttcc cccatgcttt ttgatgcgtt tcttacctct ggtttccatg agccggtgtc 5880
cacgctcggt gacgaaaagg ctgtccgtgt ccccgtatac agacttgaga ggcctgtcct 5940
cgagcggtgt tccgcggtcc tcctcgtata gaaactcgga ccactctgag acaaaggctc 6000
gcgtccaggc cagcacgaag gaggctaagt gggaggggta gcggtcgttg tccactaggg 6060
ggtccactcg ctccagggtg tgaagacaca tgtcgccctc ttcggcatca aggaaggtga 6120
ttggtttgta ggtgtaggcc acgtgaccgg gtgttcctga aggggggcta taaaaggggg 6180
tgggggcgcg ttcgtcctca ctctcttccg catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg 6240
gtgagtactc cctctgaaaa gcgggcatga cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa 6300
acgaggagga tttgatattc acctggcccg cggtgatgcc tttgagggtg gccgcatcca 6360
tctggtcaga aaagacaatc tttttgttgt caagcttggt ggcaaacgac ccgtagaggg 6420
cgttggacag caacttggcg atggagcgca gggtttggtt tttgtcgcga tcggcgcgct 6480
ccttggccgc gatgtttagc tgcacgtatt cgcgcgcaac gcaccgccat tcgggaaaga 6540
cggtggtgcg ctcgtcgggc accaggtgca cgcgccaacc gcggttgtgc agggtgacaa 6600
ggtcaacgct ggtggctacc tctccgcgta ggcgctcgtt ggtccagcag aggcggccgc 6660
ccttgcgcga gcagaatggc ggtagggggt ctagctgcgt ctcgtccggg gggtctgcgt 6720
ccacggtaaa gaccccgggc agcaggcgcg cgtcgaagta gtctatcttg catccttgca 6780
agtctagcgc ctgctgccat gcgcgggcgg caagcgcgcg ctcgtatggg ttgagtgggg 6840
gaccccatgg catggggtgg gtgagcgcgg aggcgtacat gccgcaaatg tcgtaaacgt 6900
agaggggctc tctgagtatt ccaagatatg tagggtagca tcttccaccg cggatgctgg 6960
cgcgcacgta atcgtatagt tcgtgcgagg gagcgaggag gtcgggaccg aggttgctac 7020
gggcgggctg ctctgctcgg aagactatct gcctgaagat ggcatgtgag ttggatgata 7080
tggttggacg ctggaagacg ttgaagctgg cgtctgtgag acctaccgcg tcacgcacga 7140
aggaggcgta ggagtcgcgc agcttgttga ccagctcggc ggtgacctgc acgtctaggg 7200
cgcagtagtc cagggtttcc ttgatgatgt catacttatc ctgtcccttt tttttccaca 7260
gctcgcggtt gaggacaaac tcttcgcggt ctttccagta ctcttggatc ggaaacccgt 7320
cggcctccga acggtaagag cctagcatgt agaactggtt gacggcctgg taggcgcagc 7380
atcccttttc tacgggtagc gcgtatgcct gcgcggcctt ccggagcgag gtgtgggtga 7440
gcgcaaaggt gtccctgacc atgactttga ggtactggta tttgaagtca gtgtcgtcgc 7500
atccgccctg ctcccagagc aaaaagtccg tgcgcttttt ggaacgcgga tttggcaggg 7560
cgaaggtgac atcgttgaag agtatctttc ccgcgcgagg cataaagttg cgtgtgatgc 7620
ggaagggtcc cggcacctcg gaacggttgt taattacctg ggcggcgagc acgatctcgt 7680
caaagccgtt gatgttgtgg cccacaatgt aaagttccaa gaagcgcggg atgcccttga 7740
tggaaggcaa ttttttaagt tcctcgtagg tgagctcttc aggggagctg agcccgtgct 7800
ctgaaagggc ccagtctgca agatgagggt tggaagcgac gaatgagctc cacaggtcac 7860
gggccattag catttgcagg tggtcgcgaa aggtcctaaa ctggcgacct atggccattt 7920
tttctggggt gatgcagtag aaggtaagcg ggtcttgttc ccagcggtcc catccaaggt 7980
tcgcggctag gtctcgcgcg gcagtcacta gaggctcatc tccgccgaac ttcatgacca 8040
gcatgaaggg cacgagctgc ttcccaaagg cccccatcca agtataggtc tctacatcgt 8100
aggtgacaaa gagacgctcg gtgcgaggat gcgagccgat cgggaagaac tggatctccc 8160
gccaccaatt ggaggagtgg ctattgatgt ggtgaaagta gaagtccctg cgacgggccg 8220
aacactcgtg ctggcttttg taaaaacgtg cgcagtactg gcagcggtgc acgggctgta 8280
catcctgcac gaggttgacc tgacgaccgc gcacaaggaa gcagagtggg aatttgagcc 8340
cctcgcctgg cgggtttggc tggtggtctt ctacttcggc tgcttgtcct tgaccgtctg 8400
gctgctcgag gggagttacg gtggatcgga ccaccacgcc gcgcgagccc aaagtccaga 8460
tgtccgcgcg cggcggtcgg agcttgatga caacatcgcg cagatgggag ctgtccatgg 8520
tctggagctc ccgcggcgtc aggtcaggcg ggagctcctg caggtttacc tcgcatagac 8580
gggtcagggc gcgggctaga tccaggtgat acctaatttc caggggctgg ttggtggcgg 8640
cgtcgatggc ttgcaagagg ccgcatcccc gcggcgcgac tacggtaccg cgcggcgggc 8700
ggtgggccgc gggggtgtcc ttggatgatg catctaaaag cggtgacgcg ggcgagcccc 8760
cggaggtagg gggggctccg gacccgccgg gagagggggc aggggcacgt cggcgccgcg 8820
cgcgggcagg agctggtgct gcgcgcgtag gttgctggcg aacgcgacga cgcggcggtt 8880
gatctcctga atctggcgcc tctgcgtgaa gacgacgggc ccggtgagct tgaacctgaa 8940
agagagttcg acagaatcaa tttcggtgtc gttgacggcg gcctggcgca aaatctcctg 9000
cacgtctcct gagttgtctt gataggcgat ctcggccatg aactgctcga tctcttcctc 9060
ctggagatct ccgcgtccgg ctcgctccac ggtggcggcg aggtcgttgg aaatgcgggc 9120
catgagctgc gagaaggcgt tgaggcctcc ctcgttccag acgcggctgt agaccacgcc 9180
cccttcggca tcgcgggcgc gcatgaccac ctgcgcgaga ttgagctcca cgtgccgggc 9240
gaagacggcg tagtttcgca ggcgctgaaa gaggtagttg agggtggtgg cggtgtgttc 9300
tgccacgaag aagtacataa cccagcgtcg caacgtggat tcgttgatat cccccaaggc 9360
ctcaaggcgc tccatggcct cgtagaagtc cacggcgaag ttgaaaaact gggagttgcg 9420
cgccgacacg gttaactcct cctccagaag acggatgagc tcggcgacag tgtcgcgcac 9480
ctcgcgctca aaggctacag gggcctcttc ttcttcttca atctcctctt ccataagggc 9540
ctccccttct tcttcttctg gcggcggtgg gggagggggg acacggcggc gacgacggcg 9600
caccgggagg cggtcgacaa agcgctcgat catctccccg cggcgacggc gcatggtctc 9660
ggtgacggcg cggccgttct cgcgggggcg cagttggaag acgccgcccg tcatgtcccg 9720
gttatgggtt ggcggggggc tgccatgcgg cagggatacg gcgctaacga tgcatctcaa 9780
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gtctttgtag tagtcttgca tgagcctttc taccggcact tcttcttctc cttcctcttg 10140
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cttcacgatc ttggccttgc tagactgctc cttcagcgcg cgctgcccgt tttcgctcgt 23280
cacatccatt tcaatcacgt gctccttatt tatcataatg cttccgtgta gacacttaag 23340
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cttgtaggtc acctctgcaa acgactgcag gtacgcctgc aggaatcgcc ccatcatcgt 23460
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gctgggctct tcctcttcct cttgcgtccg cataccacgc gccactgggt cgtcttcatt 23760
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tggtgatggc gggcgctcgg gcttgggaga agggcgcttc tttttcttct tgggcgcaat 23940
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ttgtgatgag tcttcctcgt cctcggactc gatacgccgc ctcatccgct tttttggggg 24060
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aagactcggt aaacacatca ggttgattca catcggtcag tgctaaaaag cgaccgaaat 37020
agcccggggg aatacatacc cgcaggcgta gagacaacat tacagccccc ataggaggta 37080
taacaaaatt aataggagag aaaaacacat aaacacctga aaaaccctcc tgcctaggca 37140
aaatagcacc ctcccgctcc agaacaacat acagcgcttc cacagcggca gccataacag 37200
tcagccttac cagtaaaaaa gaaaacctat taaaaaaaca ccactcgaca cggcaccagc 37260
tcaatcagtc acagtgtaaa aaagggccaa gtgcagagcg agtatatata ggactaaaaa 37320
atgacgtaac ggttaaagtc cacaaaaaac acccagaaaa ccgcacgcga acctacgccc 37380
agaaacgaaa gccaaaaaac ccacaacttc ctcaaatcgt cacttccgtt ttcccacgtt 37440
acgtcacttc ccattttaag aaaactacaa ttcccaacac atacaagtta ctccgcccta 37500
aaacctacgt cacccgcccc gttcccacgc cccgcgccac gtcacaaact ccaccccctc 37560
attatcatat tggcttcaat ccaaaataag gtatattatt gatgatg 37607
<210> 4
<211> 36141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ICOVIR15的完整序列
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catcatcaat aatatacctt attttgcatc atcaataata taccttattt tggattgaag 60
ccaatatgat aatgaggggg tggagtttgt gacgtggcgc ggggcgtggg aacggggcgg 120
gtgacgtagt agtgtggcgg aagtgtgatg ttgcaagtgt ggcggaacac atgtaagcga 180
cggatgtggc aaaagtgacg tttttggtgt gcgccggtgt acacaggaag tgacaatttt 240
cgcgcggttt taggcggatg ttgtagtaaa tttgggcgta accgagtaag atttggccat 300
tttcgcggga aaactgaata agaggaagtg aaatctgaat aattttgtgt tactcatagc 360
gcgtaatatt tgtctagggc cgcggggact ttgaccgttt acgtggagac tcgcccaggt 420
gtttttctca ggtgttttcc gcgtactcgg cggctcgtgg ctctttcgcg gcaaaaagga 480
tttggcgcgt aaaagtggtt cgaagtactc ggcggctcgt ggctctttcg cggcaaaaag 540
gatttggcgc gtaaaagtgg ttcgaagtac gtcgaccaca aaccccgccc agcgtcttgt 600
cattggcgtc gacgctgtac ggggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg 660
tgtagtgtat ttatacccgg tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag 720
agttttctcc tccgagccgc tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac 780
ggaggtgtta ttaccgaaga aatggccgcc agtcttttgg accagctgat cgaagaggta 840
ctggctgata atcttccacc tcctagccat tttgaaccac ctacccttca cgaactgtat 900
gatttagacg tgacggcccc cgaagatccc aacgaggagg cggtttcgca gatttttccc 960
gactctgtaa tgttggcggt gcaggaaggg attgacttac tcacttttcc gccggcgccc 1020
ggttctccgg agccgcctca cctttcccgg cagcccgagc agccggagca gagagccttg 1080
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gatgaagagg gtgaggagtt tgtgttagat tatgtggagc accccgggca cggttgcagg 1200
tcttgtcatt atcaccggag gaatacgggg gacccagata ttatgtgttc gctttgctat 1260
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gtggtgggtt tggtgtggta attttttttt taatttttac agttttgtgg tttaaagaat 1380
tttgtattgt gattttttta aaaggtcctg tgtctgaacc tgagcctgag cccgagccag 1440
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cgacatcacc tgtgtccaga gaatgcaata gtagtacgga tagctgtgac tccggtcctt 1560
ctaacacacc tcctgagata cacccggtgg tcccgctgtg ccccattaaa ccagttgccg 1620
tgagagttgg tgggcgtcgc caggctgtgg aatgtatcga ggacttgctt aacgagcctg 1680
ggcaaccttt ggacttgagc tgtaaacgcc ccaggccata aggtgtaaac ctgtgattgc 1740
gtgtgtggtt aacgcctttg tttgctgaat gagttgatgt aagtttaata aagggtgaga 1800
taatgtttaa cttgcatggc gtgttaaatg gggcggggct taaagggtat ataatgcgcc 1860
gtgggctaat cttggttaca tctgacctca tggaggcttg ggagtgtttg gaagattttt 1920
ctgctgtgcg taacttgctg gaacagagct ctaacagtac ctcttggttt tggaggtttc 1980
tgtggggctc atcccaggca aagttagtct gcagaattaa ggaggattac aagtgggaat 2040
ttgaagagct tttgaaatcc tgtggtgagc tgtttgattc tttgaatctg ggtcaccagg 2100
cgcttttcca agagaaggtc atcaagactt tggatttttc cacaccgggg cgcgctgcgg 2160
ctgctgttgc ttttttgagt tttataaagg ataaatggag cgaagaaacc catctgagcg 2220
gggggtacct gctggatttt ctggccatgc atctgtggag agcggttgtg agacacaaga 2280
atcgcctgct actgttgtct tccgtccgcc cggcgataat accgacggag gagcagcagc 2340
agcagcagga ggaagccagg cggcggcggc aggagcagag cccatggaac ccgagagccg 2400
gcctggaccc tcgggaatga atgttgtaca ggtggctgaa ctgtatccag aactgagacg 2460
cattttgaca attacagagg atgggcaggg gctaaagggg gtaaagaggg agcggggggc 2520
ttgtgaggct acagaggagg ctaggaatct agcttttagc ttaatgacca gacaccgtcc 2580
tgagtgtatt acttttcaac agatcaagga taattgcgct aatgagcttg atctgctggc 2640
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ggaggctatt agggtatatg caaaggtggc acttaggcca gattgcaagt acaagatcag 2760
caaacttgta aatatcagga attgttgcta catttctggg aacggggccg aggtggagat 2820
agatacggag gatagggtgg cctttagatg tagcatgata aatatgtggc cgggggtgct 2880
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ggttttcctg gccaatacca accttatcct acacggtgta agcttctatg ggtttaacaa 3000
tacctgtgtg gaagcctgga ccgatgtaag ggttcggggc tgtgcctttt actgctgctg 3060
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ctgtggttgc ttcatgctag tgaaaagcgt ggctgtgatt aagcataaca tggtatgtgg 3240
caactgcgag gacagggcct ctcagatgct gacctgctcg gacggcaact gtcacctgct 3300
gaagaccatt cacgtagcca gccactctcg caaggcctgg ccagtgtttg agcataacat 3360
actgacccgc tgttccttgc atttgggtaa caggaggggg gtgttcctac cttaccaatg 3420
caatttgagt cacactaaga tattgcttga gcccgagagc atgtccaagg tgaacctgaa 3480
cggggtgttt gacatgacca tgaagatctg gaaggtgctg aggtacgatg agacccgcac 3540
caggtgcaga ccctgcgagt gtggcggtaa acatattagg aaccagcctg tgatgctgga 3600
tgtgaccgag gagctgaggc ccgatcactt ggtgctggcc tgcacccgcg ctgagtttgg 3660
ctctagcgat gaagatacag attgaggtac tgaaatgtgt gggcgtggct taagggtggg 3720
aaagaatata taaggtgggg gtcttatgta gttttgtatc tgttttgcag cagccgccgc 3780
cgccatgagc accaactcgt ttgatggaag cattgtgagc tcatatttga caacgcgcat 3840
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cctgcccgca aactctacta ccttgaccta cgagaccgtg tctggaacgc cgttggagac 3960
tgcagcctcc gccgccgctt cagccgctgc agccaccgcc cgcgggattg tgactgactt 4020
tgctttcctg agcccgcttg caagcagtgc agcttcccgt tcatccgccc gcgatgacaa 4080
gttgacggct cttttggcac aattggattc tttgacccgg gaacttaatg tcgtttctca 4140
gcagctgttg gatctgcgcc agcaggtttc tgccctgaag gcttcctccc ctcccaatgc 4200
ggtttaaaac ataaataaaa aaccagactc tgtttggatt tggatcaagc aagtgtcttg 4260
ctgtctttat ttaggggttt tgcgcgcgcg gtaggcccgg gaccagcggt ctcggtcgtt 4320
gagggtcctg tgtatttttt ccaggacgtg gtaaaggtga ctctggatgt tcagatacat 4380
gggcataagc ccgtctctgg ggtggaggta gcaccactgc agagcttcat gctgcggggt 4440
ggtgttgtag atgatccagt cgtagcagga gcgctgggcg tggtgcctaa aaatgtcttt 4500
cagtagcaag ctgattgcca ggggcaggcc cttggtgtaa gtgtttacaa agcggttaag 4560
ctgggatggg tgcatacgtg gggatatgag atgcatcttg gactgtattt ttaggttggc 4620
tatgttccca gccatatccc tccggggatt catgttgtgc agaaccacca gcacagtgta 4680
tccggtgcac ttgggaaatt tgtcatgtag cttagaagga aatgcgtgga agaacttgga 4740
gacgcccttg tgacctccaa gattttccat gcattcgtcc ataatgatgg caatgggccc 4800
acgggcggcg gcctgggcga agatatttct gggatcacta acgtcatagt tgtgttccag 4860
gatgagatcg tcataggcca tttttacaaa gcgcgggcgg agggtgccag actgcggtat 4920
aatggttcca tccggcccag gggcgtagtt accctcacag atttgcattt cccacgcttt 4980
gagttcagat ggggggatca tgtctacctg cggggcgatg aagaaaacgg tttccggggt 5040
aggggagatc agctgggaag aaagcaggtt cctgagcagc tgcgacttac cgcagccggt 5100
gggcccgtaa atcacaccta ttaccgggtg caactggtag ttaagagagc tgcagctgcc 5160
gtcatccctg agcagggggg ccacttcgtt aagcatgtcc ctgactcgca tgttttccct 5220
gaccaaatcc gccagaaggc gctcgccgcc cagcgatagc agttcttgca aggaagcaaa 5280
gtttttcaac ggtttgagac cgtccgccgt aggcatgctt ttgagcgttt gaccaagcag 5340
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tcgtttcgcg ggttggggcg gctttcgctg tacggcagta gtcggtgctc gtccagacgg 5460
gccagggtca tgtctttcca cgggcgcagg gtcctcgtca gcgtagtctg ggtcacggtg 5520
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ctgaagcgct gccggtcttc gccctgcgcg tcggccaggt agcatttgac catggtgtca 5640
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cacgaggggc agtgcagact tttgagggcg tagagcttgg gcgcgagaaa taccgattcc 5760
ggggagtagg catccgcgcc gcaggccccg cagacggtct cgcattccac gagccaggtg 5820
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tatacagact tgagaggcct gtcctcgagc ggtgttccgc ggtcctcctc gtatagaaac 6000
tcggaccact ctgagacaaa ggctcgcgtc caggccagca cgaaggaggc taagtgggag 6060
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ccctcttcgg catcaaggaa ggtgattggt ttgtaggtgt aggccacgtg accgggtgtt 6180
cctgaagggg ggctataaaa gggggtgggg gcgcgttcgt cctcactctc ttccgcatcg 6240
ctgtctgcga gggccagctg ttggggtgag tactccctct gaaaagcggg catgacttct 6300
gcgctaagat tgtcagtttc caaaaacgag gaggatttga tattcacctg gcccgcggtg 6360
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ttggtggcaa acgacccgta gagggcgttg gacagcaact tggcgatgga gcgcagggtt 6480
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tggtatttga agtcagtgtc gtcgcatccg ccctgctccc agagcaaaaa gtccgtgcgc 7560
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cgaggcataa agttgcgtgt gatgcggaag ggtcccggca cctcggaacg gttgttaatt 7680
acctgggcgg cgagcacgat ctcgtcaaag ccgttgatgt tgtggcccac aatgtaaagt 7740
tccaagaagc gcgggatgcc cttgatggaa ggcaattttt taagttcctc gtaggtgagc 7800
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atccaagtat aggtctctac atcgtaggtg acaaagagac gctcggtgcg aggatgcgag 8160
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cgggcccggt gagcttgagc ctgaaagaga gttcgacaga atcaatttcg gtgtcgttga 9000
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ccatgaactg ctcgatctct tcctcctgga gatctccgcg tccggctcgc tccacggtgg 9120
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tccagacgcg gctgtagacc acgccccctt cggcatcgcg ggcgcgcatg accacctgcg 9240
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agttgagggt ggtggcggtg tgttctgcca cgaagaagta cataacccag cgtcgcaacg 9360
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cgaagttgaa aaactgggag ttgcgcgccg acacggttaa ctcctcctcc agaagacgga 9480
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atacggcgct aacgatgcat ctcaacaatt gttgtgtagg tactccgccg ccgagggacc 9840
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agtcgcaagg taggctgagc accgtggcgg gcggcagcgg gcggcggtcg gggttgtttc 9960
tggcggaggt gctgctgatg atgtaattaa agtaggcggt cttgagacgg cggatggtcg 10020
acagaagcac catgtccttg ggtccggcct gctgaatgcg caggcggtcg gccatgcccc 10080
aggcttcgtt ttgacatcgg cgcaggtctt tgtagtagtc ttgcatgagc ctttctaccg 10140
gcacttcttc ttctccttcc tcttgtcctg catctcttgc atctatcgct gcggcggcgg 10200
cggagtttgg ccgtaggtgg cgccctcttc ctcccatgcg tgtgaccccg aagcccctca 10260
tcggctgaag cagggctagg tcggcgacaa cgcgctcggc taatatggcc tgctgcacct 10320
gcgtgagggt agactggaag tcatccatgt ccacaaagcg gtggtatgcg cccgtgttga 10380
tggtgtaagt gcagttggcc ataacggacc agttaacggt ctggtgaccc ggctgcgaga 10440
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gtagggtggc cggggctccg ggggcgagat cttccaacat aaggcgatga tatccgtaga 10620
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ggttctacat gcgcatggcg ctgaaggtgc ttaccttgag cgacgacctg ggcgtttatc 12180
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tcggcaaccg gttccagcat ggctacaacc tccgctcctc aggcgccgcc ggcactgccc 26640
gttcgccgac ccaaccgtag atgggacacc actggaacca gggccggtaa gtccaagcag 26700
ccgccgccgt tagcccaaga gcaacaacag cgccaaggct accgctcatg gcgcgggcac 26760
aagaacgcca tagttgcttg cttgcaagac tgtgggggca acatctcctt cgcccgccgc 26820
tttcttctct accatcacgg cgtggccttc ccccgtaaca tcctgcatta ctaccgtcat 26880
ctctacagcc catactgcac cggcggcagc ggcagcggca gcaacagcag cggccacaca 26940
gaagcaaagg cgaccggata gcaagactct gacaaagccc aagaaatcca cagcggcggc 27000
agcagcagga ggaggagcgc tgcgtctggc gcccaacgaa cccgtatcga cccgcgagct 27060
tagaaacagg atttttccca ctctgtatgc tatatttcaa cagagcaggg gccaagaaca 27120
agagctgaaa ataaaaaaca ggtctctgcg atccctcacc cgcagctgcc tgtatcacaa 27180
aagcgaagat cagcttcggc gcacgctgga agacgcggag gctctcttca gtaaatactg 27240
cgcgctgact cttaaggact agtttcgcgc cctttctcaa atttaagcgc gaaaactacg 27300
tcatctccag cggccacacc cggcgccagc acctgtcgtc agcgccatta tgagcaagga 27360
aattcccacg ccctacatgt ggagttacca gccacaaatg ggacttgcgg ctggagctgc 27420
ccaagactac tcaacccgaa taaactacat gagcgcggga ccccacatga tatcccgggt 27480
caacggaatc cgcgcccacc gaaaccgaat tctcttggaa caggcggcta ttaccaccac 27540
acctcgtaat aaccttaatc cccgtagttg gcccgctgcc ctggtgtacc aggaaagtcc 27600
cgctcccacc actgtggtac ttcccagaga cgcccaggcc gaagttcaga tgactaactc 27660
aggggcgcag cttgcgggcg gctttcgtca cagggtgcgg tcgcccgggc agggtataac 27720
tcacctgaca atcagagggc gaggtattca gctcaacgac gagtcggtga gctcctcgct 27780
tggtctccgt ccggacggga catttcagat cggcggcgcc ggccgtcctt cattcacgcc 27840
tcgtcaggca atcctaactc tgcagacctc gtcctctgag ccgcgctctg gaggcattgg 27900
aactctgcaa tttattgagg agtttgtgcc atcggtctac tttaacccct tctcgggacc 27960
tcccggccac tatccggatc aatttattcc taactttgac gcggtaaagg actcggcgga 28020
cggctacgac tgaatgttaa gtggagaggc agagcaactg cgcctgaaac acctggtcca 28080
ctgtcgccgc cacaagtgct ttgcccgcga ctccggtgag ttttgctact ttgaattgcc 28140
cgaggatcat atcgagggcc cggcgcacgg cgtccggctt accgcccagg gagagcttgc 28200
ccgtagcctg attcgggagt ttacccagcg ccccctgcta gttgagcggg acaggggacc 28260
ctgtgttctc actgtgattt gcaactgtcc taaccttgga ttacatcaag atctttgttg 28320
ccatctctgt gctgagtata ataaatacag aaattaaaat atactggggc tcctatcgcc 28380
atcctgtaaa cgccaccgtc ttcacccgcc caagcaaacc aaggcgaacc ttacctggta 28440
cttttaacat ctctccctct gtgatttaca acagtttcaa cccagacgga gtgagtctac 28500
gagagaacct ctccgagctc agctactcca tcagaaaaaa caccaccctc cttacctgcc 28560
gggaacgtac gagtgcgtca ccggccgctg caccacacct accgcctgac cgtaaaccag 28620
actttttccg gacagacctc aataactctg tttaccagaa caggaggtga gcttagaaaa 28680
cccttagggt attaggccaa aggcgcagct actgtggggt ttatgaacaa ttcaagcaac 28740
tctacgggct attctaattc aggtttctct agaatcgggg ttggggttat tctctgtctt 28800
gtgattctct ttattcttat actaacgctt ctctgcctaa ggctcgccgc ctgctgtgtg 28860
cacatttgca tttattgtca gctttttaaa cgctggggtc gccacccaag atgattaggt 28920
acataatcct aggtttactc acccttgcgt cagcccacgg taccacccaa aaggtggatt 28980
ttaaggagcc agcctgtaat gttacattcg cagctgaagc taatgagtgc accactctta 29040
taaaatgcac cacagaacat gaaaagctgc ttattcgcca caaaaacaaa attggcaagt 29100
atgctgttta tgctatttgg cagccaggtg acactacaga gtataatgtt acagttttcc 29160
agggtaaaag tcataaaact tttatgtata cttttccatt ttatgaaatg tgcgacatta 29220
ccatgtacat gagcaaacag tataagttgt ggcccccaca aaattgtgtg gaaaacactg 29280
gcactttctg ctgcactgct atgctaatta cagtgctcgc tttggtctgt accctactct 29340
atattaaata caaaagcaga cgcagcttta ttgaggaaaa gaaaatgcct taatttacta 29400
agttacaaag ctaatgtcac cactaactgc tttactcgct gcttgcaaaa caaattcaaa 29460
aagttagcat tataattaga ataggattta aaccccccgg tcatttcctg ctcaatacca 29520
ttcccctgaa caattgactc tatgtgggat atgctccagc gctacaacct tgaagtcagg 29580
cttcctggat gtcagcatct gactttggcc agcacctgtc ccgcggattt gttccagtcc 29640
aactacagcg acccacccta acagagatga ccaacacaac caacgcggcc gccgctaccg 29700
gacttacatc taccacaaat acaccccaag tttctgcctt tgtcaataac tgggataact 29760
tgggcatgtg gtggttctcc atagcgctta tgtttgtatg ccttattatt atgtggctca 29820
tctgctgcct aaagcgcaaa cgcgcccgac cacccatcta tagtcccatc attgtgctac 29880
acccaaacaa tgatggaatc catagattgg acggactgaa acacatgttc ttttctctta 29940
cagtatgatt aaatgagaca tgattcctcg agtttttata ttactgaccc ttgttgcgct 30000
tttttgtgcg tgctccacat tggctgcggt ttctcacatc gaagtagact gcattccagc 30060
cttcacagtc tatttgcttt acggatttgt caccctcacg ctcatctgca gcctcatcac 30120
tgtggtcatc gcctttatcc agtgcattga ctgggtctgt gtgcgctttg catatctcag 30180
acaccatccc cagtacaggg acaggactat agctgagctt cttagaattc tttaattatg 30240
aaatttactg tgacttttct gctgattatt tgcaccctat ctgcgttttg ttccccgacc 30300
tccaagcctc aaagacatat atcatgcaga ttcactcgta tatggaatat tccaagttgc 30360
tacaatgaaa aaagcgatct ttccgaagcc tggttatatg caatcatctc tgttatggtg 30420
ttctgcagta ccatcttagc cctagctata tatccctacc ttgacattgg ctggaaacga 30480
atagatgcca tgaaccaccc aactttcccc gcgcccgcta tgcttccact gcaacaagtt 30540
gttgccggcg gctttgtccc agccaatcag cctcgcccca cttctcccac ccccactgaa 30600
atcagctact ttaatctaac aggaggagat gactgacacc ctagatctag aaatggacgg 30660
aattattaca gagcagcgcc tgctagaaag acgcagggca gcggccgagc aacagcgcat 30720
gaatcaagag ctccaagaca tggttaactt gcaccagtgc aaaaggggta tcttttgtct 30780
ggtaaagcag gccaaagtca cctacgacag taataccacc ggacaccgcc ttagctacaa 30840
gttgccaacc aagcgtcaga aattggtggt catggtggga gaaaagccca ttaccataac 30900
tcagcactcg gtagaaaccg aaggctgcat tcactcacct tgtcaaggac ctgaggatct 30960
ctgcaccctt attaagaccc tgtgcggtct caaagatctt attcccttta actaataaaa 31020
aaaaataata aagcatcact tacttaaaat cagttagcaa atttctgtcc agtttattca 31080
gcagcacctc cttgccctcc tcccagctct ggtattgcag cttcctcctg gctgcaaact 31140
ttctccacaa tctaaatgga atgtcagttt cctcctgttc ctgtccatcc gcacccacta 31200
tcttcatgtt gttgcagatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgt 31260
atccatatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactcct ccctttgtat 31320
cccccaatgg gtttcaagag agtccccctg gggtactctc tttgcgccta tccgaacctc 31380
tagttacctc caatggcatg cttgcgctca aaatgggcaa cggcctctct ctggacgagg 31440
ccggcaacct tacctcccaa aatgtaacca ctgtgagccc acctctcaaa aaaaccaagt 31500
caaacataaa cctggaaata tctgcacccc tcacagttac ctcagaagcc ctaactgtgg 31560
ctgccgccgc acctctaatg gtcgcgggca acacactcac catgcaatca caggccccgc 31620
taaccgtgca cgactccaaa cttagcattg ccacccaagg acccctcaca gtgtcagaag 31680
gaaagctagc cctgcaaaca tcaggccccc tcaccaccac cgatagcagt acccttacta 31740
tcactgcctc accccctcta actactgcca ctggtagctt gggcattgac ttgaaagagc 31800
ccatttatac acaaaatgga aaactaggac taaagtacgg ggctcctttg catgtaacag 31860
acgacctaaa cactttgacc gtagcaactg gtccaggtgt gactattaat aatacttcct 31920
tgcaaactaa agttactgga gccttgggtt ttgattcaca aggcaatatg caacttaatg 31980
tagcaggagg actaaggatt gattctcaaa acagacgcct tatacttgat gttagttatc 32040
cgtttgatgc tcaaaaccaa ctaaatctaa gactaggaca gggccctctt tttataaact 32100
cagcccacaa cttggatatt aactacaaca aaggccttta cttgtttaca gcttcaaaca 32160
attccaaaaa gcttgaggtt aacctaagca ctgccaaggg gttgatgttt gacgctacag 32220
ccatagccat taatgcagga gatgggcttg aatttggttc acctaatgca ccaaacacaa 32280
atcccctcaa aacaaaaatt ggccatggcc tagaatttga ttcaaacaag gctatggttc 32340
ctaaactagg aactggcctt agttttgaca gcacaggtgc cattacagta ggaaacaaaa 32400
ataatgataa gctaactttg tggaccacac cagctccatc tcctaactgt agactaaatg 32460
cagagaaaga tgctaaactc actttggtct taacaaaatg tggcagtcaa atacttgcta 32520
cagtttcagt tttggctgtt aaaggcagtt tggctccaat atctggaaca gttcaaagtg 32580
ctcatcttat tataagattt gacgaaaatg gagtgctact aaacaattcc ttcctggacc 32640
cagaatattg gaactttaga aatggagatc ttactgaagg cacagcctat acaaacgctg 32700
ttggatttat gcctaaccta tcagcttatc caaaatctca cggtaaaact gccaaaagta 32760
acattgtcag tcaagtttac ttaaacggag acaaaactaa acctgtaaca ctaacgatca 32820
cactaaacgg tacacaggaa acaggagaca caacttgtga ctgccgcgga gactgtttct 32880
gcccatctgc atactctatg tcattttcat gggactggtc tggccacaac tacattaatg 32940
aaatatttgc cacatcctct tacacttttt catacattgc ccaagaataa agaatcgttt 33000
gtgttatgtt tcaacgtgtt tatttttcaa ttgcagaaaa tttcaagtca tttttcattc 33060
agtagtatag ccccaccacc acatagctta tacagatcac cgtaccttaa tcaaactcac 33120
agaaccctag tattcaacct gccacctccc tcccaacaca cagagtacac agtcctttct 33180
ccccggctgg ccttaaaaag catcatatca tgggtaacag acatattctt aggtgttata 33240
ttccacacgg tttcctgtcg agccaaacgc tcatcagtga tattaataaa ctccccgggc 33300
agctcactta agttcatgtc gctgtccagc tgctgagcca caggctgctg tccaacttgc 33360
ggttgcttaa cgggcggcga aggagaagtc cacgcctaca tgggggtaga gtcataatcg 33420
tgcatcagga tagggcggtg gtgctgcagc agcgcgcgaa taaactgctg ccgccgccgc 33480
tccgtcctgc aggaatacaa catggcagtg gtctcctcag cgatgattcg caccgcccgc 33540
agcataaggc gccttgtcct ccgggcacag cagcgcaccc tgatctcact taaatcagca 33600
cagtaactgc agcacagcac cacaatattg ttcaaaatcc cacagtgcaa ggcgctgtat 33660
ccaaagctca tggcggggac cacagaaccc acgtggccat cataccacaa gcgcaggtag 33720
attaagtggc gacccctcat aaacacgctg gacataaaca ttacctcttt tggcatgttg 33780
taattcacca cctcccggta ccatataaac ctctgattaa acatggcgcc atccaccacc 33840
atcctaaacc agctggccaa aacctgcccg ccggctatac actgcaggga accgggactg 33900
gaacaatgac agtggagagc ccaggactcg taaccatgga tcatcatgct cgtcatgata 33960
tcaatgttgg cacaacacag gcacacgtgc atacacttcc tcaggattac aagctcctcc 34020
cgcgttagaa ccatatccca gggaacaacc cattcctgaa tcagcgtaaa tcccacactg 34080
cagggaagac ctcgcacgta actcacgttg tgcattgtca aagtgttaca ttcgggcagc 34140
agcggatgat cctccagtat ggtagcgcgg gtttctgtct caaaaggagg tagacgatcc 34200
ctactgtacg gagtgcgccg agacaaccga gatcgtgttg gtcgtagtgt catgccaaat 34260
ggaacgccgg acgtagtcat atttcctgaa gcaaaaccag gtgcgggcgt gacaaacaga 34320
tctgcgtctc cggtctcgcc gcttagatcg ctctgtgtag tagttgtagt atatccactc 34380
tctcaaagca tccaggcgcc ccctggcttc gggttctatg taaactcctt catgcgccgc 34440
tgccctgata acatccacca ccgcagaata agccacaccc agccaaccta cacattcgtt 34500
ctgcgagtca cacacgggag gagcgggaag agctggaaga accatgtttt tttttttatt 34560
ccaaaagatt atccaaaacc tcaaaatgaa gatctattaa gtgaacgcgc tcccctccgg 34620
tggcgtggtc aaactctaca gccaaagaac agataatggc atttgtaaga tgttgcacaa 34680
tggcttccaa aaggcaaacg gccctcacgt ccaagtggac gtaaaggcta aacccttcag 34740
ggtgaatctc ctctataaac attccagcac cttcaaccat gcccaaataa ttctcatctc 34800
gccaccttct caatatatct ctaagcaaat cccgaatatt aagtccggcc attgtaaaaa 34860
tctgctccag agcgccctcc accttcagcc tcaagcagcg aatcatgatt gcaaaaattc 34920
aggttcctca cagacctgta taagattcaa aagcggaaca ttaacaaaaa taccgcgatc 34980
ccgtaggtcc cttcgcaggg ccagctgaac ataatcgtgc aggtctgcac ggaccagcgc 35040
ggccacttcc ccgccaggaa ccatgacaaa agaacccaca ctgattatga cacgcatact 35100
cggagctatg ctaaccagcg tagccccgat gtaagcttgt tgcatgggcg gcgatataaa 35160
atgcaaggtg ctgctcaaaa aatcaggcaa agcctcgcgc aaaaaagaaa gcacatcgta 35220
gtcatgctca tgcagataaa ggcaggtaag ctccggaacc accacagaaa aagacaccat 35280
ttttctctca aacatgtctg cgggtttctg cataaacaca aaataaaata acaaaaaaac 35340
atttaaacat tagaagcctg tcttacaaca ggaaaaacaa cccttataag cataagacgg 35400
actacggcca tgccggcgtg accgtaaaaa aactggtcac cgtgattaaa aagcaccacc 35460
gacagctcct cggtcatgtc cggagtcata atgtaagact cggtaaacac atcaggttga 35520
ttcacatcgg tcagtgctaa aaagcgaccg aaatagcccg ggggaataca tacccgcagg 35580
cgtagagaca acattacagc ccccatagga ggtataacaa aattaatagg agagaaaaac 35640
acataaacac ctgaaaaacc ctcctgccta ggcaaaatag caccctcccg ctccagaaca 35700
acatacagcg cttccacagc ggcagccata acagtcagcc ttaccagtaa aaaagaaaac 35760
ctattaaaaa aacaccactc gacacggcac cagctcaatc agtcacagtg taaaaaaggg 35820
ccaagtgcag agcgagtata tataggacta aaaaatgacg taacggttaa agtccacaaa 35880
aaacacccag aaaaccgcac gcgaacctac gcccagaaac gaaagccaaa aaacccacaa 35940
cttcctcaaa tcgtcacttc cgttttccca cgttacgtca cttcccattt taagaaaact 36000
acaattccca acacatacta gttactccgc cctaaaacct acgtcacccg ccccgttccc 36060
acgccccgcg ccacgtcaca aactccaccc cctcattatc atattggctt caatccaaaa 36120
taaggtatat tattgatgat g 36141
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Sp1F寡核苷酸
<400> 5
gtacgtcgac cacaaacccc gcccagcgtc ttgtcattgg cgtcgacgct 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Sp1R寡核苷酸
<400> 6
gtacagcgtc gacgccaatg acaagacgct gggcggggtt tgtggtcgac 50
<210> 7
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> E2FF2寡核苷酸
<400> 7
gtacgtcggc ggctcgtggc tctttcgcgg caaaaaggat ttggcgcgta aaagtggttc 60
gaa 63
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> E2FR2寡核苷酸
<400> 8
gtacttcgaa ccacttttac gcgccaaatc ctttttgccg cgaaagagcc acgagccgcc 60
<210> 9
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 氨基酸序列，其中已引入了RGDK修饰的腺病毒血清型5的纤维的修饰形式的氨基酸1-582
<400> 9
Met Lys Arg Ala Arg Pro Ser Glu Asp Thr Phe Asn Pro Val Tyr Pro
1 5 10 15
Tyr Asp Thr Glu Thr Gly Pro Pro Thr Val Pro Phe Leu Thr Pro Pro
20 25 30
Phe Val Ser Pro Asn Gly Phe Gln Glu Ser Pro Pro Gly Val Leu Ser
35 40 45
Leu Arg Leu Ser Glu Pro Leu Val Thr Ser Asn Gly Met Leu Ala Leu
50 55 60
Lys Met Gly Asn Gly Leu Ser Leu Asp Glu Ala Gly Asn Leu Thr Ser
65 70 75 80
Gln Asn Val Thr Thr Val Ser Pro Pro Leu Arg Gly Asp Lys Ser Asn
85 90 95
Ile Asn Leu Glu Ile Ser Ala Pro Leu Thr Val Thr Ser Glu Ala Leu
100 105 110
Thr Val Ala Ala Ala Ala Pro Leu Met Val Ala Gly Asn Thr Leu Thr
115 120 125
Met Gly Ser Gln Ala Pro Leu Thr Val His Asp Ser Lys Leu Ser Ile
130 135 140
Ala Thr Gln Gly Pro Leu Thr Val Ser Glu Gly Lys Leu Ala Leu Gln
145 150 155 160
Thr Ser Gly Pro Leu Thr Thr Thr Asp Ser Ser Thr Leu Thr Ile Thr
165 170 175
Ala Ser Pro Pro Leu Thr Thr Ala Thr Gly Ser Leu Gly Ile Asp Leu
180 185 190
Lys Glu Pro Ile Tyr Thr Gln Asn Gly Lys Leu Gly Leu Lys Tyr Gly
195 200 205
Ala Pro Leu His Val Thr Asp Asp Leu Asn Thr Leu Thr Val Ala Thr
210 215 220
Gly Pro Gly Val Thr Ile Asn Asn Thr Ser Leu Gly Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Gly Ala Leu Gly Phe Asp Ser Gln Gly Asn Met Gln Leu Asn Val Ala
245 250 255
Gly Gly Leu Arg Ile Asp Ser Gln Asn Arg Arg Leu Ile Leu Asp Val
260 265 270
Ser Tyr Pro Phe Asp Ala Gln Asn Gln Leu Asn Leu Arg Leu Gly Gln
275 280 285
Gly Pro Leu Phe Ile Asn Ser Ala His Asn Leu Asp Ile Asn Tyr Asn
290 295 300
Lys Gly Leu Tyr Leu Phe Thr Ala Ser Asn Asn Ser Lys Lys Leu Glu
305 310 315 320
Val Asn Leu Ser Thr Ala Lys Gly Leu Met Phe Asp Ala Thr Ala Ile
325 330 335
Ala Ile Asn Ala Gly Asp Gly Leu Glu Phe Gly Ser Pro Asn Ala Pro
340 345 350
Asn Thr Asn Pro Leu Lys Thr Lys Ile Ile Gly His Gly Leu Glu Phe
355 360 365
Asp Ser Asn Lys Ala Met Val Pro Lys Leu Gly Thr Gly Leu Ser Phe
370 375 380
Asp Ser Thr Gly Ala Ile Thr Val Gly Asn Lys Asn Asn Asp Lys Leu
385 390 395 400
Thr Leu Trp Thr Thr Pro Ala Pro Ser Pro Asn Cys Asp Leu Asn Ala
405 410 415
Glu Lys Asp Ala Lys Leu Thr Leu Val Leu Thr Lys Cys Gly Ser Gln
420 425 430
Ile Leu Ala Thr Val Ser Val Leu Ala Val Lys Gly Ser Leu Ala Pro
435 440 445
Ile Ser Gly Thr Val Gln Ser Ala His Leu Ile Ile Arg Phe Asp Glu
450 455 460
Asn Gly Val Leu Leu Asn Asn Ser Phe Leu Asp Pro Glu Tyr Trp Asn
465 470 475 480
Phe Arg Asn Gly Asp Leu Thr Glu Gly Thr Ala Tyr Thr Asn Ala Val
485 490 495
Gly Phe Met Pro Asn Leu Ser Ala Tyr Pro Lys Ser His Gly Lys Thr
500 505 510
Ala Lys Ser Asn Ile Val Ser Gln Val Tyr Leu Asn Gly Asp Lys Thr
515 520 525
Lys Pro Val Thr Leu Thr Ile Thr Leu Asn Gly Thr Gln Glu Thr Gly
530 535 540
Asp Thr Thr Pro Ser Ala Tyr Ser Met Ser Phe Ser Trp Asp Trp Ser
545 550 555 560
Gly His Asn Tyr Ile Asn Glu Ile Phe Ala Thr Ser Ser Tyr Thr Phe
565 570 575
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RGD-4C肽
<400> 10
Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys
1 5
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRX的正向引物
<400> 11
aggtggctct gaagatcaat ctg 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRX的反向引物
<400> 12
ttagccctcc ggttcttgaa 20
<210> 13
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRX的探针
<400> 13
ctgagtccag ggttc 15
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TBP的正向引物
<400> 14
gaacatcatg gatcagaaca acag 24
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TBP的反向引物
<400> 15
attggtgttc tgaataggct gtg 23
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TBP的探针
<400> 16
ctgccacctt acgctcaggg cttgg 25
<210> 17
<211> 37634
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ICOVIR17的完整序列
<400> 17
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360
gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgtac 420
gtcggcggct cgtggctctt tcgcggcaaa aaggatttgg cgcgtaaaag tggttcgagt 480
acgtcggcgg ctcgtggctc tttcgcggca aaaaggattt ggcgcgtaaa agtggttcga 540
agtacgtcga ccacaaaccc cgcccagcgt cttgtcattg gcgtcgacgc tgtacggggt 600
caaagttggc gttttattat tatagtcagc tgacgtgtag tgtatttata cccggtgagt 660
tcctcaagag gccactcttg agtgccagcg agtagagttt tctcctccga gccgctccga 720
caccgggact gaaaatgaga catattatct gccacggagg tgttattacc gaagaaatgg 780
ccgccagtct tttggaccag ctgatcgaag aggtactggc tgataatctt ccacctccta 840
gccattttga accacctacc cttcacgaac tgtatgattt agacgtgacg gcccccgaag 900
atcccaacga ggaggcggtt tcgcagattt ttcccgactc tgtaatgttg gcggtgcagg 960
aagggattga cttactcact tttccgccgg cgcccggttc tccggagccg cctcaccttt 1020
cccggcagcc cgagcagccg gagcagagag ccttgggtcc ggtttctatg ccaaaccttg 1080
taccggaggt gatcgatcca cccagtgacg acgaggatga agagggtgag gagtttgtgt 1140
tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattatcac cggaggaata 1200
cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc atgtttgtct 1260
acagtaagtg aaaattatgg gcagtgggtg atagagtggt gggtttggtg tggtaatttt 1320
ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt attgtgattt ttttaaaagg 1380
tcctgtgtct gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg gagcctgcaa gacctacccg 1440
ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt ctagagaatg 1500
caatagtagt acggatagct gtgactccgg tccttctaac acacctcctg agatacaccc 1560
ggtggtcccg ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc gtcgccaggc 1620
tgtggaatgt atcgaggact tgcttaacga gcctgggcaa cctttggact tgagctgtaa 1680
acgccccagg ccataaggtg taaacctgtg attgcgtgtg tggttaacgc ctttgtttgc 1740
tgaatgagtt gatgtaagtt taataaaggg tgagataatg tttaacttgc atggcgtgtt 1800
aaatggggcg gggcttaaag ggtatataat gcgccgtggg ctaatcttgg ttacatctga 1860
cctcatggag gcttgggagt gtttggaaga tttttctgct gtgcgtaact tgctggaaca 1920
gagctctaac agtacctctt ggttttggag gtttctgtgg ggctcatccc aggcaaagtt 1980
agtctgcaga attaaggagg attacaagtg ggaatttgaa gagcttttga aatcctgtgg 2040
tgagctgttt gattctttga atctgggtca ccaggcgctt ttccaagaga aggtcatcaa 2100
gactttggat ttttccacac cggggcgcgc tgcggctgct gttgcttttt tgagttttat 2160
aaaggataaa tggagcgaag aaacccatct gagcgggggg tacctgctgg attttctggc 2220
catgcatctg tggagagcgg ttgtgagaca caagaatcgc ctgctactgt tgtcttccgt 2280
ccgcccggcg ataataccga cggaggagca gcagcagcag caggaggaag ccaggcggcg 2340
gcggcaggag cagagcccat ggaacccgag agccggcctg gaccctcggg aatgaatgtt 2400
gtacaggtgg ctgaactgta tccagaactg agacgcattt tgacaattac agaggatggg 2460
caggggctaa agggggtaaa gagggagcgg ggggcttgtg aggctacaga ggaggctagg 2520
aatctagctt ttagcttaat gaccagacac cgtcctgagt gtattacttt tcaacagatc 2580
aaggataatt gcgctaatga gcttgatctg ctggcgcaga agtattccat agagcagctg 2640
accacttact ggctgcagcc aggggatgat tttgaggagg ctattagggt atatgcaaag 2700
gtggcactta ggccagattg caagtacaag atcagcaaac ttgtaaatat caggaattgt 2760
tgctacattt ctgggaacgg ggccgaggtg gagatagata cggaggatag ggtggccttt 2820
agatgtagca tgataaatat gtggccgggg gtgcttggca tggacggggt ggttattatg 2880
aatgtaaggt ttactggccc caattttagc ggtacggttt tcctggccaa taccaacctt 2940
atcctacacg gtgtaagctt ctatgggttt aacaatacct gtgtggaagc ctggaccgat 3000
gtaagggttc ggggctgtgc cttttactgc tgctggaagg gggtggtgtg tcgccccaaa 3060
agcagggctt caattaagaa atgcctcttt gaaaggtgta ccttgggtat cctgtctgag 3120
ggtaactcca gggtgcgcca caatgtggcc tccgactgtg gttgcttcat gctagtgaaa 3180
agcgtggctg tgattaagca taacatggta tgtggcaact gcgaggacag ggcctctcag 3240
atgctgacct gctcggacgg caactgtcac ctgctgaaga ccattcacgt agccagccac 3300
tctcgcaagg cctggccagt gtttgagcat aacatactga cccgctgttc cttgcatttg 3360
ggtaacagga ggggggtgtt cctaccttac caatgcaatt tgagtcacac taagatattg 3420
cttgagcccg agagcatgtc caaggtgaac ctgaacgggg tgtttgacat gaccatgaag 3480
atctggaagg tgctgaggta cgatgagacc cgcaccaggt gcagaccctg cgagtgtggc 3540
ggtaaacata ttaggaacca gcctgtgatg ctggatgtga ccgaggagct gaggcccgat 3600
cacttggtgc tggcctgcac ccgcgctgag tttggctcta gcgatgaaga tacagattga 3660
ggtactgaaa tgtgtgggcg tggcttaagg gtgggaaaga atatataagg tgggggtctt 3720
atgtagtttt gtatctgttt tgcagcagcc gccgccgcca tgagcaccaa ctcgtttgat 3780
ggaagcattg tgagctcata tttgacaacg cgcatgcccc catgggccgg ggtgcgtcag 3840
aatgtgatgg gctccagcat tgatggtcgc cccgtcctgc ccgcaaactc tactaccttg 3900
acctacgaga ccgtgtctgg aacgccgttg gagactgcag cctccgccgc cgcttcagcc 3960
gctgcagcca ccgcccgcgg gattgtgact gactttgctt tcctgagccc gcttgcaagc 4020
agtgcagctt cccgttcatc cgcccgcgat gacaagttga cggctctttt ggcacaattg 4080
gattctttga cccgggaact taatgtcgtt tctcagcagc tgttggatct gcgccagcag 4140
gtttctgccc tgaaggcttc ctcccctccc aatgcggttt aaaacataaa taaaaaacca 4200
gactctgttt ggatttggat caagcaagtg tcttgctgtc tttatttagg ggttttgcgc 4260
gcgcggtagg cccgggacca gcggtctcgg tcgttgaggg tcctgtgtat tttttccagg 4320
acgtggtaaa ggtgactctg gatgttcaga tacatgggca taagcccgtc tctggggtgg 4380
aggtagcacc actgcagagc ttcatgctgc ggggtggtgt tgtagatgat ccagtcgtag 4440
caggagcgct gggcgtggtg cctaaaaatg tctttcagta gcaagctgat tgccaggggc 4500
aggcccttgg tgtaagtgtt tacaaagcgg ttaagctggg atgggtgcat acgtggggat 4560
atgagatgca tcttggactg tatttttagg ttggctatgt tcccagccat atccctccgg 4620
ggattcatgt tgtgcagaac caccagcaca gtgtatccgg tgcacttggg aaatttgtca 4680
tgtagcttag aaggaaatgc gtggaagaac ttggagacgc ccttgtgacc tccaagattt 4740
tccatgcatt cgtccataat gatggcaatg ggcccacggg cggcggcctg ggcgaagata 4800
tttctgggat cactaacgtc atagttgtgt tccaggatga gatcgtcata ggccattttt 4860
acaaagcgcg ggcggagggt gccagactgc ggtataatgg ttccatccgg cccaggggcg 4920
tagttaccct cacagatttg catttcccac gctttgagtt cagatggggg gatcatgtct 4980
acctgcgggg cgatgaagaa aacggtttcc ggggtagggg agatcagctg ggaagaaagc 5040
aggttcctga gcagctgcga cttaccgcag ccggtgggcc cgtaaatcac acctattacc 5100
ggctgcaact ggtagttaag agagctgcag ctgccgtcat ccctgagcag gggggccact 5160
tcgttaagca tgtccctgac tcgcatgttt tccctgacca aatccgccag aaggcgctcg 5220
ccgcccagcg atagcagttc ttgcaaggaa gcaaagtttt tcaacggttt gagaccgtcc 5280
gccgtaggca tgcttttgag cgtttgacca agcagttcca ggcggtccca cagctcggtc 5340
acctgctcta cggcatctcg atccagcata tctcctcgtt tcgcgggttg gggcggcttt 5400
cgctgtacgg cagtagtcgg tgctcgtcca gacgggccag ggtcatgtct ttccacgggc 5460
gcagggtcct cgtcagcgta gtctgggtca cggtgaaggg gtgcgctccg ggctgcgcgc 5520
tggccagggt gcgcttgagg ctggtcctgc tggtgctgaa gcgctgccgg tcttcgccct 5580
gcgcgtcggc caggtagcat ttgaccatgg tgtcatagtc cagcccctcc gcggcgtggc 5640
ccttggcgcg cagcttgccc ttggaggagg cgccgcacga ggggcagtgc agacttttga 5700
gggcgtagag cttgggcgcg agaaataccg attccgggga gtaggcatcc gcgccgcagg 5760
ccccgcagac ggtctcgcat tccacgagcc aggtgagctc tggccgttcg gggtcaaaaa 5820
ccaggtttcc cccatgcttt ttgatgcgtt tcttacctct ggtttccatg agccggtgtc 5880
cacgctcggt gacgaaaagg ctgtccgtgt ccccgtatac agacttgaga ggcctgtcct 5940
cgagcggtgt tccgcggtcc tcctcgtata gaaactcgga ccactctgag acaaaggctc 6000
gcgtccaggc cagcacgaag gaggctaagt gggaggggta gcggtcgttg tccactaggg 6060
ggtccactcg ctccagggtg tgaagacaca tgtcgccctc ttcggcatca aggaaggtga 6120
ttggtttgta ggtgtaggcc acgtgaccgg gtgttcctga aggggggcta taaaaggggg 6180
tgggggcgcg ttcgtcctca ctctcttccg catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg 6240
gtgagtactc cctctgaaaa gcgggcatga cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa 6300
acgaggagga tttgatattc acctggcccg cggtgatgcc tttgagggtg gccgcatcca 6360
tctggtcaga aaagacaatc tttttgttgt caagcttggt ggcaaacgac ccgtagaggg 6420
cgttggacag caacttggcg atggagcgca gggtttggtt tttgtcgcga tcggcgcgct 6480
ccttggccgc gatgtttagc tgcacgtatt cgcgcgcaac gcaccgccat tcgggaaaga 6540
cggtggtgcg ctcgtcgggc accaggtgca cgcgccaacc gcggttgtgc agggtgacaa 6600
ggtcaacgct ggtggctacc tctccgcgta ggcgctcgtt ggtccagcag aggcggccgc 6660
ccttgcgcga gcagaatggc ggtagggggt ctagctgcgt ctcgtccggg gggtctgcgt 6720
ccacggtaaa gaccccgggc agcaggcgcg cgtcgaagta gtctatcttg catccttgca 6780
agtctagcgc ctgctgccat gcgcgggcgg caagcgcgcg ctcgtatggg ttgagtgggg 6840
gaccccatgg catggggtgg gtgagcgcgg aggcgtacat gccgcaaatg tcgtaaacgt 6900
agaggggctc tctgagtatt ccaagatatg tagggtagca tcttccaccg cggatgctgg 6960
cgcgcacgta atcgtatagt tcgtgcgagg gagcgaggag gtcgggaccg aggttgctac 7020
gggcgggctg ctctgctcgg aagactatct gcctgaagat ggcatgtgag ttggatgata 7080
tggttggacg ctggaagacg ttgaagctgg cgtctgtgag acctaccgcg tcacgcacga 7140
aggaggcgta ggagtcgcgc agcttgttga ccagctcggc ggtgacctgc acgtctaggg 7200
cgcagtagtc cagggtttcc ttgatgatgt catacttatc ctgtcccttt tttttccaca 7260
gctcgcggtt gaggacaaac tcttcgcggt ctttccagta ctcttggatc ggaaacccgt 7320
cggcctccga acggtaagag cctagcatgt agaactggtt gacggcctgg taggcgcagc 7380
atcccttttc tacgggtagc gcgtatgcct gcgcggcctt ccggagcgag gtgtgggtga 7440
gcgcaaaggt gtccctgacc atgactttga ggtactggta tttgaagtca gtgtcgtcgc 7500
atccgccctg ctcccagagc aaaaagtccg tgcgcttttt ggaacgcgga tttggcaggg 7560
cgaaggtgac atcgttgaag agtatctttc ccgcgcgagg cataaagttg cgtgtgatgc 7620
ggaagggtcc cggcacctcg gaacggttgt taattacctg ggcggcgagc acgatctcgt 7680
caaagccgtt gatgttgtgg cccacaatgt aaagttccaa gaagcgcggg atgcccttga 7740
tggaaggcaa ttttttaagt tcctcgtagg tgagctcttc aggggagctg agcccgtgct 7800
ctgaaagggc ccagtctgca agatgagggt tggaagcgac gaatgagctc cacaggtcac 7860
gggccattag catttgcagg tggtcgcgaa aggtcctaaa ctggcgacct atggccattt 7920
tttctggggt gatgcagtag aaggtaagcg ggtcttgttc ccagcggtcc catccaaggt 7980
tcgcggctag gtctcgcgcg gcagtcacta gaggctcatc tccgccgaac ttcatgacca 8040
gcatgaaggg cacgagctgc ttcccaaagg cccccatcca agtataggtc tctacatcgt 8100
aggtgacaaa gagacgctcg gtgcgaggat gcgagccgat cgggaagaac tggatctccc 8160
gccaccaatt ggaggagtgg ctattgatgt ggtgaaagta gaagtccctg cgacgggccg 8220
aacactcgtg ctggcttttg taaaaacgtg cgcagtactg gcagcggtgc acgggctgta 8280
catcctgcac gaggttgacc tgacgaccgc gcacaaggaa gcagagtggg aatttgagcc 8340
cctcgcctgg cgggtttggc tggtggtctt ctacttcggc tgcttgtcct tgaccgtctg 8400
gctgctcgag gggagttacg gtggatcgga ccaccacgcc gcgcgagccc aaagtccaga 8460
tgtccgcgcg cggcggtcgg agcttgatga caacatcgcg cagatgggag ctgtccatgg 8520
tctggagctc ccgcggcgtc aggtcaggcg ggagctcctg caggtttacc tcgcatagac 8580
gggtcagggc gcgggctaga tccaggtgat acctaatttc caggggctgg ttggtggcgg 8640
cgtcgatggc ttgcaagagg ccgcatcccc gcggcgcgac tacggtaccg cgcggcgggc 8700
ggtgggccgc gggggtgtcc ttggatgatg catctaaaag cggtgacgcg ggcgagcccc 8760
cggaggtagg gggggctccg gacccgccgg gagagggggc aggggcacgt cggcgccgcg 8820
cgcgggcagg agctggtgct gcgcgcgtag gttgctggcg aacgcgacga cgcggcggtt 8880
gatctcctga atctggcgcc tctgcgtgaa gacgacgggc ccggtgagct tgaacctgaa 8940
agagagttcg acagaatcaa tttcggtgtc gttgacggcg gcctggcgca aaatctcctg 9000
cacgtctcct gagttgtctt gataggcgat ctcggccatg aactgctcga tctcttcctc 9060
ctggagatct ccgcgtccgg ctcgctccac ggtggcggcg aggtcgttgg aaatgcgggc 9120
catgagctgc gagaaggcgt tgaggcctcc ctcgttccag acgcggctgt agaccacgcc 9180
cccttcggca tcgcgggcgc gcatgaccac ctgcgcgaga ttgagctcca cgtgccgggc 9240
gaagacggcg tagtttcgca ggcgctgaaa gaggtagttg agggtggtgg cggtgtgttc 9300
tgccacgaag aagtacataa cccagcgtcg caacgtggat tcgttgatat cccccaaggc 9360
ctcaaggcgc tccatggcct cgtagaagtc cacggcgaag ttgaaaaact gggagttgcg 9420
cgccgacacg gttaactcct cctccagaag acggatgagc tcggcgacag tgtcgcgcac 9480
ctcgcgctca aaggctacag gggcctcttc ttcttcttca atctcctctt ccataagggc 9540
ctccccttct tcttcttctg gcggcggtgg gggagggggg acacggcggc gacgacggcg 9600
caccgggagg cggtcgacaa agcgctcgat catctccccg cggcgacggc gcatggtctc 9660
ggtgacggcg cggccgttct cgcgggggcg cagttggaag acgccgcccg tcatgtcccg 9720
gttatgggtt ggcggggggc tgccatgcgg cagggatacg gcgctaacga tgcatctcaa 9780
caattgttgt gtaggtactc cgccgccgag ggacctgagc gagtccgcat cgaccggatc 9840
ggaaaacctc tcgagaaagg cgtctaacca gtcacagtcg caaggtaggc tgagcaccgt 9900
ggcgggcggc agcgggcggc ggtcggggtt gtttctggcg gaggtgctgc tgatgatgta 9960
attaaagtag gcggtcttga gacggcggat ggtcgacaga agcaccatgt ccttgggtcc 10020
ggcctgctga atgcgcaggc ggtcggccat gccccaggct tcgttttgac atcggcgcag 10080
gtctttgtag tagtcttgca tgagcctttc taccggcact tcttcttctc cttcctcttg 10140
tcctgcatct cttgcatcta tcgctgcggc ggcggcggag tttggccgta ggtggcgccc 10200
tcttcctccc atgcgtgtga ccccgaagcc cctcatcggc tgaagcaggg ctaggtcggc 10260
gacaacgcgc tcggctaata tggcctgctg cacctgcgtg agggtagact ggaagtcatc 10320
catgtccaca aagcggtggt atgcgcccgt gttgatggtg taagtgcagt tggccataac 10380
ggaccagtta acggtctggt gacccggctg cgagagctcg gtgtacctga gacgcgagta 10440
agccctcgag tcaaatacgt agtcgttgca agtccgcacc aggtactggt atcccaccaa 10500
aaagtgcggc ggcggctggc ggtagagggg ccagcgtagg gtggccgggg ctccgggggc 10560
gagatcttcc aacataaggc gatgatatcc gtagatgtac ctggacatcc aggtgatgcc 10620
ggcggcggtg gtggaggcgc gcggaaagtc gcggacgcgg ttccagatgt tgcgcagcgg 10680
caaaaagtgc tccatggtcg ggacgctctg gccggtcagg cgcgcgcaat cgttgacgct 10740
ctagaccgtg caaaaggaga gcctgtaagc gggcactctt ccgtggtctg gtggataaat 10800
tcgcaagggt atcatggcgg acgaccgggg ttcgagcccc gtatccggcc gtccgccgtg 10860
atccatgcgg ttaccgcccg cgtgtcgaac ccaggtgtgc gacgtcagac aacgggggag 10920
tgctcctttt ggcttccttc caggcgcggc ggctgctgcg ctagcttttt tggccactgg 10980
ccgcgcgcag cgtaagcggt taggctggaa agcgaaagca ttaagtggct cgctccctgt 11040
agccggaggg ttattttcca agggttgagt cgcgggaccc ccggttcgag tctcggaccg 11100
gccggactgc ggcgaacggg ggtttgcctc cccgtcatgc aagaccccgc ttgcaaattc 11160
ctccggaaac agggacgagc cccttttttg cttttcccag atgcatccgg tgctgcggca 11220
gatgcgcccc cctcctcagc agcggcaaga gcaagagcag cggcagacat gcagggcacc 11280
ctcccctcct cctaccgcgt caggaggggc gacatccgcg gttgacgcgg cagcagatgg 11340
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cctggcgcgg ctaggagcgc cctctcctga gcggcaccca agggtgcagc tgaagcgtga 11460
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cgaggagatg cgggatcgaa agttccacgc agggcgcgag ctgcggcatg gcctgaatcg 11580
cgagcggttg ctgcgcgagg aggactttga gcccgacgcg cgaaccggga ttagtcccgc 11640
gcgcgcacac gtggcggccg ccgacctggt aaccgcatac gagcagacgg tgaaccagga 11700
gattaacttt caaaaaagct ttaacaacca cgtgcgtacg cttgtggcgc gcgaggaggt 11760
ggctatagga ctgatgcatc tgtgggactt tgtaagcgcg ctggagcaaa acccaaatag 11820
caagccgctc atggcgcagc tgttccttat agtgcagcac agcagggaca acgaggcatt 11880
cagggatgcg ctgctaaaca tagtagagcc cgagggccgc tggctgctcg atttgataaa 11940
catcctgcag agcatagtgg tgcaggagcg cagcttgagc ctggctgaca aggtggccgc 12000
catcaactat tccatgctta gcctgggcaa gttttacgcc cgcaagatat accatacccc 12060
ttacgttccc atagacaagg aggtaaagat cgaggggttc tacatgcgca tggcgctgaa 12120
ggtgcttacc ttgagcgacg acctgggcgt ttatcgcaac gagcgcatcc acaaggccgt 12180
gagcgtgagc cggcggcgcg agctcagcga ccgcgagctg atgcacagcc tgcaaagggc 12240
cctggctggc acgggcagcg gcgatagaga ggccgagtcc tactttgacg cgggcgctga 12300
cctgcgctgg gccccaagcc gacgcgccct ggaggcagct ggggccggac ctgggctggc 12360
ggtggcaccc gcgcgcgctg gcaacgtcgg cggcgtggag gaatatgacg aggacgatga 12420
gtacgagcca gaggacggcg agtactaagc ggtgatgttt ctgatcagat gatgcaagac 12480
gcaacggacc cggcggtgcg ggcggcgctg cagagccagc cgtccggcct taactccacg 12540
gacgactggc gccaggtcat ggaccgcatc atgtcgctga ctgcgcgcaa tcctgacgcg 12600
ttccggcagc agccgcaggc caaccggctc tccgcaattc tggaagcggt ggtcccggcg 12660
cgcgcaaacc ccacgcacga gaaggtgctg gcgatcgtaa acgcgctggc cgaaaacagg 12720
gccatccggc ccgacgaggc cggcctggtc tacgacgcgc tgcttcagcg cgtggctcgt 12780
tacaacagcg gcaacgtgca gaccaacctg gaccggctgg tgggggatgt gcgcgaggcc 12840
gtggcgcagc gtgagcgcgc gcagcagcag ggcaacctgg gctccatggt tgcactaaac 12900
gccttcctga gtacacagcc cgccaacgtg ccgcggggac aggaggacta caccaacttt 12960
gtgagcgcac tgcggctaat ggtgactgag acaccgcaaa gtgaggtgta ccagtctggg 13020
ccagactatt ttttccagac cagtagacaa ggcctgcaga ccgtaaacct gagccaggct 13080
ttcaaaaact tgcaggggct gtggggggtg cgggctccca caggcgaccg cgcgaccgtg 13140
tctagcttgc tgacgcccaa ctcgcgcctg ttgctgctgc taatagcgcc cttcacggac 13200
agtggcagcg tgtcccggga cacataccta ggtcacttgc tgacactgta ccgcgaggcc 13260
ataggtcagg cgcatgtgga cgagcatact ttccaggaga ttacaagtgt cagccgcgcg 13320
ctggggcagg aggacacggg cagcctggag gcaaccctaa actacctgct gaccaaccgg 13380
cggcagaaga tcccctcgtt gcacagttta aacagcgagg aggagcgcat tttgcgctac 13440
gtgcagcaga gcgtgagcct taacctgatg cgcgacgggg taacgcccag cgtggcgctg 13500
gacatgaccg cgcgcaacat ggaaccgggc atgtatgcct caaaccggcc gtttatcaac 13560
cgcctaatgg actacttgca tcgcgcggcc gccgtgaacc ccgagtattt caccaatgcc 13620
atcttgaacc cgcactggct accgccccct ggtttctaca ccgggggatt cgaggtgccc 13680
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cagaccctgc tagagttgca acagcgcgag caggcagagg cggcgctgcg aaaggaaagc 13800
ttccgcaggc caagcagctt gtccgatcta ggcgctgcgg ccccgcggtc agatgctagt 13860
agcccatttc caagcttgat agggtctctt accagcactc gcaccacccg cccgcgcctg 13920
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ctcaacgacg agtcggtgag ctcctcgctt ggtctccgtc cggacgggac atttcagatc 27780
ggcggcgccg gccgctcttc attcacgcct cgtcaggcaa tcctaactct gcagacctcg 27840
tcctctgagc cgcgctctgg aggcattgga actctgcaat ttattgagga gtttgtgcca 27900
tcggtctact ttaacccctt ctcgggacct cccggccact atccggatca atttattcct 27960
aactttgacg cggtaaagga ctcggcggac ggctacgact gaatgttaag tggagaggca 28020
gagcaactgc gcctgaaaca cctggtccac tgtcgccgcc acaagtgctt tgcccgcgac 28080
tccggtgagt tttgctactt tgaattgccc gaggatcata tcgagggccc ggcgcacggc 28140
gtccggctta ccgcccaggg agagcttgcc cgtagcctga ttcgggagtt tacccagcgc 28200
cccctgctag ttgagcggga caggggaccc tgtgttctca ctgtgatttg caactgtcct 28260
aaccctggat tacatcaaga tctttgttgc catctctgtg ctgagtataa taaatacaga 28320
aattaaaata tactggggct cctatcgcca tcctgtaaac gccaccgtct tcacccgccc 28380
aagcaaacca aggcgaacct tacctggtac ttttaacatc tctccctctg tgatttacaa 28440
cagtttcaac ccagacggag tgagtctacg agagaacctc tccgagctca gctactccat 28500
cagaaaaaac accaccctcc ttacctgccg ggaacgtacg agtgcgtcac cggccgctgc 28560
accacaccta ccgcctgacc gtaaaccaga ctttttccgg acagacctca ataactctgt 28620
ttaccagaac aggaggtgag cttagaaaac ccttagggta ttaggccaaa ggcgcagcta 28680
ctgtggggtt tatgaacaat tcaagcaact ctacgggcta ttctaattca ggtttctcta 28740
gaatcggggt tggggttatt ctctgtcttg tgattctctt tattcttata ctaacgcttc 28800
tctgcctaag gctcgccgcc tgctgtgtgc acatttgcat ttattgtcag ctttttaaac 28860
gctggggtcg ccacccaaga tgattaggta cataatccta ggtttactca cccttgcgtc 28920
agcccacggt accacccaaa aggtggattt taaggagcca gcctgtaatg ttacattcgc 28980
agctgaagct aatgagtgca ccactcttat aaaatgcacc acagaacatg aaaagctgct 29040
tattcgccac aaaaacaaaa ttggcaagta tgctgtttat gctatttggc agccaggtga 29100
cactacagag tataatgtta cagttttcca gggtaaaagt cataaaactt ttatgtatac 29160
ttttccattt tatgaaatgt gcgacattac catgtacatg agcaaacagt ataagttgtg 29220
gcccccacaa aattgtgtgg aaaacactgg cactttctgc tgcactgcta tgctaattac 29280
agtgctcgct ttggtctgta ccctactcta tattaaatac aaaagcagac gcagctttat 29340
tgaggaaaag aaaatgcctt aatttactaa gttacaaagc taatgtcacc actaactgct 29400
ttactcgctg cttgcaaaac aaattcaaaa agttagcatt ataattagaa taggatttaa 29460
accccccggt catttcctgc tcaataccat tcccctgaac aattgactct atgtgggata 29520
tgctccagcg ctacaacctt gaagtcaggc ttcctggatg tcagcatctg actttggcca 29580
gcacctgtcc cgcggatttg ttccagtcca actacagcga cccaccctaa cagagatgac 29640
caacacaacc aacgcggccg ccgctaccgg acttacatct accacaaata caccccaagt 29700
ttctgccttt gtcaataact gggataactt gggcatgtgg tggttctcca tagcgcttat 29760
gtttgtatgc cttattatta tgtggctcat ctgctgccta aagcgcaaac gcgcccgacc 29820
acccatctat agtcccatca ttgtgctaca cccaaacaat gatggaatcc atagattgga 29880
cggactgaaa cacatgttct tttctcttac agtatgatta aatgagacat gattcctcga 29940
gtttttatat tactgaccct tgttgcgctt ttttgtgcgt gctccacatt ggctgcggtt 30000
tctcacatcg aagtagactg cattccagcc ttcacagtct atttgcttta cggatttgtc 30060
accctcacgc tcatctgcag cctcatcact gtggtcatcg cctttatcca gtgcattgac 30120
tgggtctgtg tgcgctttgc atatctcaga caccatcccc agtacaggga caggactata 30180
gctgagcttc ttagaattct ttaattatga aatttactgt gacttttctg ctgattattt 30240
gcaccctatc tgcgttttgt tccccgacct ccaagcctca aagacatata tcatgcagat 30300
tcactcgtat atggaatatt ccaagttgct acaatgaaaa aagcgatctt tccgaagcct 30360
ggttatatgc aatcatctct gttatggtgt tctgcagtac catcttagcc ctagctatat 30420
atccctacct tgacattggc tggaacgcaa tagatgccat gaaccaccca actttccccg 30480
cgcccgctat gcttccactg caacaagttg ttgccggcgg ctttgtccca gccaatcagc 30540
ctcgcccacc ttctcccacc cccactgaaa tcagctactt taatctaaca ggaggagatg 30600
actgacaccc tagatctaga aatggacgga attattacag agcagcgcct gctagaaaga 30660
cgcagggcag cggccgagca acagcgcatg aatcaagagc tccaagacat ggttaacttg 30720
caccagtgca aaaggggtat cttttgtctc gtaaagcagg ccaaagtcac ctacgacagt 30780
aataccaccg gacaccgcct tagctacaag ttgccaacca agcgtcagaa attggtggtc 30840
atggtgggag aaaagcccat taccataact cagcactcgg tagaaaccga aggctgcatt 30900
cactcacctt gtcaaggacc tgaggatctc tgcaccctta ttaagaccct gtgcggtctc 30960
aaagatctta ttccctttaa ctaataaaaa aaaataataa agcatcactt acttaaaatc 31020
agttagcaaa tttctgtcca gtttattcag cagcacctcc ttgccctcct cccagctctg 31080
gtattgcagc ttcctcctgg ctgcaaactt tctccacaat ctaaatggaa tgtcagtttc 31140
ctcctgttcc tgtccatccg cacccactat cttcatgttg ttgcagatga agcgcgcaag 31200
accgtctgaa gataccttca accccgtgta tccatatgac acggaaaccg gtcctccaac 31260
tgtgcctttt cttactcctc cctttgtatc ccccaatggg tttcaagaga gtccccctgg 31320
ggtactctct ttgcgcctat ccgaacctct agttacctcc aatggcatgc ttgcgctcaa 31380
aatgggcaac ggcctctctc tggacgaggc cggcaacctt acctcccaaa atgtaaccac 31440
tgtgagccca cctctcaaaa aaaccaagtc aaacataaac ctggaaatat ctgcacccct 31500
cacagttacc tcagaagccc taactgtggc tgccgccgca cctctaatgg tcgcgggcaa 31560
cacactcacc atgcaatcac aggccccgct aaccgtgcac gactccaaac ttagcattgc 31620
cacccaagga cccctcacag tgtcagaagg aaagctagcc ctgcaaacat caggccccct 31680
caccaccacc gatagcagta cccttactat cactgcctca ccccctctaa ctactgccac 31740
tggtagcttg ggcattgact tgaaagagcc catttataca caaaatggaa aactaggact 31800
aaagtacggg gctcctttgc atgtaacaga cgacctaaac actttgaccg tagcaactgg 31860
tccaggtgtg actattaata atacttcctt gcaaactaaa gttactggag ccttgggttt 31920
tgattcacaa ggcaatatgc aacttaatgt agcaggagga ctaaggattg attctcaaaa 31980
cagacgcctt atacttgatg ttagttatcc gtttgatgct caaaaccaac taaatctaag 32040
actaggacag ggccctcttt ttataaactc agcccacaac ttggatatta actacaacaa 32100
aggcctttac ttgtttacag cttcaaacaa ttccaaaaag cttgaggtta acctaagcac 32160
tgccaagggg ttgatgtttg acgctacagc catagccatt aatgcaggag atgggcttga 32220
atttggttca cctaatgcac caaacacaaa tcccctcaaa acaaaaattg gccatggcct 32280
agaatttgat tcaaacaagg ctatggttcc taaactagga actggcctta gttttgacag 32340
cacaggtgcc attacagtag gaaacaaaaa taatgataag ctaactttgt ggaccacacc 32400
agctccatct cctaactgta gactaaatgc agagaaagat gctaaactca ctttggtctt 32460
aacaaaatgt ggcagtcaaa tacttgctac agtttcagtt ttggctgtta aaggcagttt 32520
ggctccaata tctggaacag ttcaaagtgc tcatcttatt ataagatttg acgaaaatgg 32580
agtgctacta aacaattcct tcctggaccc agaatattgg aactttagaa atggagatct 32640
tactgaaggc acagcctata caaacgctgt tggatttatg cctaacctat cagcttatcc 32700
aaaatctcac ggtaaaactg ccaaaagtaa cattgtcagt caagtttact taaacggaga 32760
caaaactaaa cctgtaacac taaccattac actaaacggt acacaggaaa caggagacac 32820
aacttgtgac tgccgcggag actgtttctg cccaagtgca tactctatgt cattttcatg 32880
ggactggtct ggccacaact acattaatga aatatttgcc acatcctctt acactttttc 32940
atacattgcc caagaataaa gaatcgtttg tgttatgttt caacgtgttt atttttcaat 33000
tgtactaagc ggtgatgttt ctgatcagcc accatgggag tgctaaaatt caagcacatc 33060
tttttcagaa gctttgttaa atcaagtgga gtatcccaga tagttttcac cttccttctg 33120
attccatgtt gcttgactct gaatttcaga gcacctcctg ttattccaaa tgtgcctttc 33180
ctctgggcct ggaatgcccc aagtgaattt tgtcttggaa aatttgatga gccactagat 33240
atgagcctct tctctttcat aggaagcccc cgaataaacg ccaccgggca aggtgttaca 33300
atattttatg ttgatagact tggctactat ccttacatag attcaatcac aggagtaact 33360
gtgaatggag gaatccccca gaagatttcc ttacaagacc atctggacaa agctaagaaa 33420
gacattacat tttatatgcc agtagacaat ttgggaatgg ctgttattga ctgggaagaa 33480
tggagaccca cttgggcaag aaactggaaa cctaaagatg tttacaagaa taggtctatt 33540
gaattggttc agcaacaaaa tgtacaactt agtctcacag aggccactga gaaagcaaaa 33600
caagaatttg aaaaggcagg gaaggatttc ctggtagaga ctataaaatt gggaaaatta 33660
cttcggccaa atcacttgtg gggttattat ctttttccgg attgttacaa ccatcactat 33720
aagaaacccg gttacaatgg aagttgcttc aatgtagaaa taaaaagaaa tgatgatctc 33780
agctggttgt ggaatgaaag cactgctctt tacccatcca tttatttgaa cactcagcag 33840
tctcctgtag ctgctacact ctatgtgcgc aatcgagttc gggaagccat cagagtttcc 33900
aaaatacctg atgcaaaaag tccacttccg gtttttgcat atacccgcat agtttttact 33960
gatcaagttt tgaaattcct ttctcaagat gaacttgtgt atacatttgg cgaaactgtt 34020
gctctgggtg cttctggaat tgtaatatgg ggaaccctca gtataatgcg aagtatgaaa 34080
tcttgcttgc tcctagacaa ttacatggag actatactga atccttacat aatcaacgtc 34140
acactagcag ccaaaatgtg tagccaagtg ctttgccagg agcaaggagt gtgtataagg 34200
aaaaactgga attcaagtga ctatcttcac ctcaacccag ataattttgc tattcaactt 34260
gagaaaggtg gaaagttcac agtacgtgga aaaccgacac ttgaagacct ggagcaattt 34320
tctgaaaaat tttattgcag ctgttatagc accttgagtt gtaaggagaa agctgatgta 34380
aaagacactg atgctgttga tgtgtgtatt gctgatggtg tctgtataga tgcttttcta 34440
aaacctccca tggagacaga agaacctcaa attttctaca atgcttcacc ctccacacta 34500
tcttaataaa ctttattttt caattgcaga aaatttcaag tcatttttca ttcagtagta 34560
tagccccacc accacatagc ttatacagat caccgtacct taatcaaact cacagaaccc 34620
tagtattcaa cctgccacct ccctcccaac acacagagta cacagtcctt tctccccggc 34680
tggccttaaa aagcatcata tcatgggtaa cagacatatt cttaggtgtt atattccaca 34740
cggtttcctg tcgagccaaa cgctcatcag tgatattaat aaactccccg ggcagctcac 34800
ttaagttcat gtcgctgtcc agctgctgag ccacaggctg ctgtccaact tgcggttgct 34860
taacgggcgg cgaaggagaa gtccacgcct acatgggggt agagtcataa tcgtgcatca 34920
ggatagggcg gtggtgctgc agcagcgcgc gaataaactg ctgccgccgc cgctccgtcc 34980
tgcaggaata caacatggca gtggtctcct cagcgatgat tcgcaccgcc cgcagcataa 35040
ggcgccttgt cctccgggca cagcagcgca ccctgatctc acttaaatca gcacagtaac 35100
tgcagcacag caccacaata ttgttcaaaa tcccacagtg caaggcgctg tatccaaagc 35160
tcatggcggg gaccacagaa cccacgtggc catcatacca caagcgcagg tagattaagt 35220
ggcgacccct cataaacacg ctggacataa acattacctc ttttggcatg ttgtaattca 35280
ccacctcccg gtaccatata aacctctgat taaacatggc gccatccacc accatcctaa 35340
accagctggc caaaacctgc ccgccggcta tacactgcag ggaaccggga ctggaacaat 35400
gacagtggag agcccaggac tcgtaaccat ggatcatcat gctcgtcatg atatcaatgt 35460
tggcacaaca caggcacacg tgcatacact tcctcaggat tacaagctcc tcccgcgtta 35520
gaaccatatc ccagggaaca acccattcct gaatcagcgt aaatcccaca ctgcagggaa 35580
gacctcgcac gtaactcacg ttgtgcattg tcaaagtgtt acattcgggc agcagcggat 35640
gatcctccag tatggtagcg cgggtttctg tctcaaaagg aggtagacga tccctactgt 35700
acggagtgcg ccgagacaac cgagatcgtg ttggtcgtag tgtcatgcca aatggaacgc 35760
cggacgtagt catatttcct gaagcaaaac caggtgcggg cgtgacaaac agatctgcgt 35820
ctccggtctc gccgcttaga tcgctctgtg tagtagttgt agtatatcca ctctctcaaa 35880
gcatccaggc gccccctggc ttcgggttct atgtaaactc cttcatgcgc cgctgccctg 35940
ataacatcca ccaccgcaga ataagccaca cccagccaac ctacacattc gttctgcgag 36000
tcacacacgg gaggagcggg aagagctgga agaaccatgt tttttttttt attccaaaag 36060
attatccaaa acctcaaaat gaagatctat taagtgaacg cgctcccctc cggtggcgtg 36120
gtcaaactct acagccaaag aacagataat ggcatttgta agatgttgca caatggcttc 36180
caaaaggcaa acggccctca cgtccaagtg gacgtaaagg ctaaaccctt cagggtgaat 36240
ctcctctata aacattccag caccttcaac catgcccaaa taattctcat ctcgccacct 36300
tctcaatata tctctaagca aatcccgaat attaagtccg gccattgtaa aaatctgctc 36360
cagagcgccc tccaccttca gcctcaagca gcgaatcatg attgcaaaaa ttcaggttcc 36420
tcacagacct gtataagatt caaaagcgga acattaacaa aaataccgcg atcccgtagg 36480
tcccttcgca gggccagctg aacataatcg tgcaggtctg cacggaccag cgcggccact 36540
tccccgccag gaaccatgac aaaagaaccc acactgatta tgacacgcat actcggagct 36600
atgctaacca gcgtagcccc gatgtaagct tgttgcatgg gcggcgatat aaaatgcaag 36660
gtgctgctca aaaaatcagg caaagcctcg cgcaaaaaag aaagcacatc gtagtcatgc 36720
tcatgcagat aaaggcaggt aagctccgga accaccacag aaaaagacac catttttctc 36780
tcaaacatgt ctgcgggttt ctgcataaac acaaaataaa ataacaaaaa aacatttaaa 36840
cattagaagc ctgtcttaca acaggaaaaa caacccttat aagcataaga cggactacgg 36900
ccatgccggc gtgaccgtaa aaaaactggt caccgtgatt aaaaagcacc accgacagct 36960
cctcggtcat gtccggagtc ataatgtaag actcggtaaa cacatcaggt tgattcacat 37020
cggtcagtgc taaaaagcga ccgaaatagc ccgggggaat acatacccgc aggcgtagag 37080
acaacattac agcccccata ggaggtataa caaaattaat aggagagaaa aacacataaa 37140
cacctgaaaa accctcctgc ctaggcaaaa tagcaccctc ccgctccaga acaacataca 37200
gcgcttccac agcggcagcc ataacagtca gccttaccag taaaaaagaa aacctattaa 37260
aaaaacacca ctcgacacgg caccagctca atcagtcaca gtgtaaaaaa gggccaagtg 37320
cagagcgagt atatatagga ctaaaaaatg acgtaacggt taaagtccac aaaaaacacc 37380
cagaaaaccg cacgcgaacc tacgcccaga aacgaaagcc aaaaaaccca caacttcctc 37440
aaatcgtcac ttccgttttc ccacgttacg tcacttccca ttttaagaaa actacaattc 37500
ccaacacata caagttactc cgccctaaaa cctacgtcac ccgccccgtt cccacgcccc 37560
gcgccacgtc acaaactcca ccccctcatt atcatattgg cttcaatcca aaataaggta 37620
tattattgat gatg 37634

Claims (20)

1.包含溶瘤腺病毒的组合物用于制备意图用于治疗视网膜母细胞瘤或预防、去除或降低与视网膜母细胞瘤相关的转移、继发性恶性肿瘤和/或三侧性视网膜母细胞瘤的药物产品的用途，其特征在于，所述溶瘤腺病毒包含：
-编码插入其基因组的透明质酸酶的序列；和
-肿瘤细胞特异性的复制机制。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物通过眼内注射或玻璃体内注射施用。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其特征在于，所述视网膜母细胞瘤是对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受的视网膜母细胞瘤。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受的视网膜母细胞瘤是难治性的或复发的结果。
5.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述溶瘤腺病毒由人类腺病毒血清型5产生。
6.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述透明质酸酶是人类透明质酸酶PH20。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，前述编码透明质酸酶的序列是从中缺失了对应于羧基末端结构域的核苷酸1471至1527的SEQ ID NO.1。
8.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述肿瘤细胞特异性的复制机制是能够在肿瘤细胞中被两个缺陷拷贝的Rb1基因补偿的缺陷复制机制。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，能够在肿瘤细胞中被两个缺陷拷贝的Rb1基因补偿的所述缺陷复制机制包含编码E1a蛋白的序列中的缺失Δ24，以及E2F-1的四个结合位点和Sp1的一个结合位点到所述E1a的内源启动子中的插入以控制E1a的表达。
10.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，本发明中使用的所述溶瘤腺病毒具有修饰的衣壳，使得腺病毒纤维中存在的硫酸乙酰肝素的结合结构域91KKTK94已被结构域91RGDK94取代。
11.包含溶瘤腺病毒的组合物，其用于在治疗视网膜母细胞瘤、预防、去除或降低与视网膜母细胞瘤相关的转移、继发性恶性肿瘤和/或三侧性视网膜母细胞瘤中使用，其特征在于，所述溶瘤腺病毒包含：
-编码插入其基因组的透明质酸酶的序列；和
-肿瘤细胞特异性的复制机制。
12.根据权利要求11所述的用于其使用的包含溶瘤腺病毒的组合物，其特征在于，所述组合物通过眼内注射或玻璃体内注射施用。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的用于其使用的包含溶瘤腺病毒的组合物，其特征在于，所述视网膜母细胞瘤是对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受的视网膜母细胞瘤。
14.根据权利要求13所述的用于其使用的包含溶瘤腺病毒的组合物，其特征在于，所述对常规化学疗法和/或放射疗法治疗耐受的视网膜母细胞瘤是难治性的或复发的结果。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的用于其使用的包含溶瘤腺病毒的组合物，其特征在于，所述溶瘤腺病毒由人类腺病毒血清型5产生。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的用于其使用的包含溶瘤腺病毒的组合物，其特征在于，所述透明质酸酶是人类透明质酸酶PH20。
17.根据权利要求16所述的用于其使用的包含溶瘤腺病毒的组合物，其特征在于，前述编码透明质酸酶的序列是从中缺失了对应于羧基末端结构域的核苷酸1471至1527的SEQID NO:1。
18.根据权利要求11至17中任一项所述的用于其使用的包含溶瘤腺病毒的组合物，其特征在于，所述肿瘤细胞特异性的复制机制是能够在肿瘤细胞中被两个缺陷拷贝的Rb1基因补偿的缺陷复制机制。
19.根据权利要求18所述的用于其使用的包含溶瘤腺病毒的组合物，特征在于，能够在肿瘤细胞中被两个缺陷拷贝的Rb1基因补偿的所述缺陷复制机制包含编码E1a蛋白的序列中的缺失Δ24，以及E2F-1的四个结合位点和Sp1的一个结合位点到所述E1a的内源启动子中的插入以控制E1a的表达。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的用于其使用的包含溶瘤腺病毒的组合物，其特征在于，用于本发明中的所述溶瘤腺病毒具有修饰的衣壳，使得腺病毒纤维中存在的硫酸乙酰肝素的结合结构域91KKTK94已被结构域91RGDK94取代。
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