CN109715813A - 腺病毒载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及腺病毒载体，用于生成腺病毒载体的细胞，生成腺病毒载体的方法，以及腺病毒载体在基因治疗、肿瘤治疗和作为疫苗中的治疗用途。

Description

腺病毒载体

发明领域

本发明涉及腺病毒载体，用于生成腺病毒载体的细胞，生成腺病毒载体的方法，以及腺病毒载体在基因治疗、肿瘤治疗和作为疫苗中的治疗用途。

发明背景

腺病毒(Ad)是无包膜的双链DNA(dsDNA)病毒，通常长度为26-46kb，两端侧翼为反向末端重复序列(ITR)。越来越多的人类和非人类腺病毒类型正在被不断发现。腺病毒是免疫功能减弱患者中新出现的病原体，除此之外，它们还代表了在肿瘤治疗、基因治疗方法和疫苗接种研究中最常用的载体类型，这主要归因于其强大的基因传递效率和转导多种细胞类型的能力。然而，由于缺乏有效的高通量克隆(HTC)系统，对完整天然腺病毒多样性的广泛应用的探索长期缺失。

近年来，腺病毒作为人类和兽医病原体以及新兴疗法受到越来越多的关注。作为病原体，腺病毒引起多种感染，死亡人数不断增加。尚无有效的治疗方法，并且在免疫减弱患者中致死率达70％。作为治疗药物，腺病毒属于先进治疗药品(ATMP)中目前最具前景的候选药物，其在作为溶瘤病毒治疗恶性肿瘤，作为抗传染性疾病的基因疫苗，以及作为基因治疗应用的基因转移载体等方面均具有很高的潜力。越来越多的新型腺病毒类型正在被鉴定出来，并且已经清楚腺病毒具有庞大的数百个实体天然多样性。然而，尽管许多腺病毒类型的序列多样性会反映在它们的生物学差异(例如向性(tropism)、感染周期、宿主相互作用、持久性、免疫逃避)以及它们毒性的差异上，但大多数关于腺病毒病毒学的科学知识却是基于极少数的人类C型腺病毒，特别是人类腺病毒5(HAdV-C5)，。类似地，尽管有证据表明其治疗功效非常有限，但是HAdV-C5还是用于许多临床肿瘤治疗和基因治疗，。

基因治疗是一个新兴领域，它将治疗性核酸递送到目标靶细胞中。近期的成功案例包括治疗维斯科特-奥尔德里奇综合征¹、B型血友病²和异染性脑白质营养不良³等罕见遗传性疾病。基于腺病毒的载体代表了用于肿瘤治疗、基因治疗和疫苗接种研究的世界上最常用的载体类型^4,5，这主要是因为它们具有强健的基因传递特性和转导多种细胞类型的能力。利用重组腺病毒治疗囊性纤维化的首次临床试验始于1993年⁶。当今又生(Gendicine)被中国食品和药品监督管理局于2003年批准用于治疗头颈癌时，腺病毒载体作为基因治疗剂获得了全球关注⁷。治疗恶性肿瘤的另一选择是使用肿瘤特异性复制能力的腺病毒进行溶瘤病毒疗法。与化学疗法相结合并进一步改进，生物制品诸如溶瘤病毒正在进行临床试验评估，其可能预示着应用不断增长⁸。

尽管目前为止已经鉴定了约70种类型的人类腺病毒和许多非人类腺病毒(>200)，但一直缺少有效的用于腺病毒基因组克隆和操作的系统。先前的研究已经建议使用基于同源重组的技术将腺病毒基因组克隆到质粒中(Chartier,C.et al.(1996)Efficientgeneration ofrecombinant adenovirus vectors by homologous recombination inEscherichia coli.J.Virol.70,4805–4810；Renaut,L.et al.(2002)A rapid and easymethod forproduction and selection ofrecombinant adenovirus genomes.J VirolMethods 100,121-31)。然而，在这些研究中使用的细菌菌株中的同源重组非常低效，于是这些系统需要长同源臂和纯浓缩形式的腺病毒DNA。因此，大多数重组腺病毒载体(AdV)仍仅基于一小部分腺病毒类型及其变体^9,10,13。然而，预定的组织向性和预先存在的免疫性极大地限制了它们的应用。基于HAd5的载体和溶瘤病毒的局限性包括细胞向性和人群中预先存在的针对HAd5的免疫。HAd5在小鼠中以及当静脉递送时在人类中具有强烈的肝脏向性，这与先天免疫毒性较高的特性和肝脏中病毒的隔离有关。HAd5在人群中的高血清阳性率导致了基于该血清型诱导的针对载体和溶瘤病毒的强健的适应性免疫应答，这阻碍了它们的有效性。这些载体和病毒的免疫应答和肝脏隔离也意味着经常需要高剂量施用以避免这些问题，从而具有肝损伤和炎性休克综合征的风险。

本发明解决了现有腺病毒载体和溶瘤腺病毒预先存在的免疫和有限的细胞向性的问题。通过提供新型人腺病毒基因组工程化文库，本发明人已经促进了大量新的腺病毒载体和溶瘤病毒的开发，其可以用于大大扩展可能的应用范围，并具有提高治疗功效的潜力。

发明概述

本发明基于通过新型重组工程技术生成的新型工程化全基因组、类型特异性人类腺病毒(HAdV)文库。该文库提供了用于病毒基因组的任意遗传修饰的工具，并且允许生成新的例如具有改善的功效和安全性的腺病毒载体、疫苗和溶瘤病毒。

本发明人已经确定腺病毒基因组可以通过使用先进的线性-线性同源重组(LLHR)和线性-环状同源重组(LCHR)技术高通量克隆(HTC)并标记^11,12。繁殖了包括约一半目前已知的腺病毒类型在内的来自临床分离株的野生型腺病毒，并应用了直接高通量克隆。通过DNA限制酶图谱和病毒重建证实了克隆的腺病毒基因组的完整性，并进行了下一代测序(NGS)和系统发育分析。重组TurboGFP荧光/NanoLuc荧光素酶双报告标记的AdV促进载体表征和体内成像。这种新的工程化腺病毒文库将促进分子医学的广泛应用，包括基因治疗和疫苗接种研究，以及基础病毒学。本发明人提供的克隆基因组文库促进可以使用本文公开的方法而实现的各种载体类型的生成、遗传修饰、转基因插入和用各种不同血清型的腺病毒的报告基因标记。而这种可用于直接操作腺病毒基因组的系统曾长期缺失。

该文库提供了增进的对病毒和宿主因子的科学认识，这些因子决定了腺病毒与其宿主的类型特异性相互作用，例如组织向性、病毒持续性、发病机制和毒力，以及提供解决与新进化的腺病毒相关的潜在风险所必需的那些因子。该文库还可用于筛选抗腺病毒治疗策略的潜在新药靶标。

在一个方面，本发明提供具有来源于文库中新克隆的腺病毒基因组序列的腺病毒载体。包含这些新型序列的载体具有多种治疗潜力的优势，包括相对于基于HAdV5的载体改变了的细胞向性，因此促进靶向不同细胞类型，和/或避免针对HAdV5血清型的预先存在的免疫。例如，在一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其包含一个序列，所述序列来源于SEQ ID NO 1-32和/或1411中任一个内含有的腺病毒基因组序列，例如，SEQ ID NO 1-15、17-32和/或1411中任一个内含有的或SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25和27-32和/或1411中任一个内含有的，或SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25和27-32中任一个内含有的腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％同一性的序列。在另一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其包含SEQ ID NO：1-32和/或1411中任一个内含有的全长腺病毒基因组序列，例如，SEQ ID NO：1-15和17-32和/或1411中任一个内含有的或SEQ IDNO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25和27-32和/或1411中任一个内含有的，或SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25和27-32中任一个内含有的全长腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％同一性的序列。优选地，序列同一性程度为至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。

在另一个实施方式中，腺病毒载体缺少E1区域。例如，在一些实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其包含在SEQ ID NO：1-32和/或1411中列出的任一序列内含有的腺病毒基因组序列，例如，SEQ ID NO 1-15和17-32和/或1411中任一个内含有的，或SEQ IDNO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25和27-32和/或1411中任一个内含有的腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％同一性的序列，所述序列缺少E1区域。在一个实施方式中，本发明提供腺病毒载体，其包含选自SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25和27-32的序列，或与其具有至少50％同一性的序列，上述序列缺少E1区域。优选地，序列同一性程度为至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。

在另一个实施方式中，腺病毒载体缺少E1区域和E3区域。例如，在一些实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其包含在SEQ ID NO：1-32和/或1411中列出的任一序列内含有的腺病毒基因组序列，例如，SEQ ID NO：1-15和17-32和/或1411中任一个内含有的或SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15和17-32和/或1411中任一个内含有的腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％同一性的序列，所述序列缺少E1区域和E3区域。在另一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其包含选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15和17-32的序列，或与其具有至少50％同一性的序列，所述序列缺少E1区域和E3区域。优选地，序列同一性程度为至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。

在另一个实施方式中，腺病毒载体缺少E3区域。例如，在一些实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其包含SEQ ID NO：1-32和/或1411中列出的任一序列内含有的腺病毒基因组序列，例如，SEQ ID NO：1-15和17-32和/或1411中任一个内含有的或SEQ ID NO：1-3、5-12、14-15和17-32和/或1411中任一个内含有的腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％同一性的序列，所述序列缺少E3区域。在另一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其包含选自SEQ ID NO：1-3、5-12、14-15和17-32的序列，或与其具有至少50％同一性的序列，所述序列缺少E3区域。优选地，序列同一性程度为至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。

在另一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体文库，其包含至少2个(例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个)SEQ ID NO：1-32和1411中描述的腺病毒基因组序列，例如，SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25和27-32和/或1411中描述的腺病毒基因组序列，和/或本文描述的其他腺病毒载体。在一些实施方式中，这些腺病毒序列包含在质粒骨架内。

在另一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其包含来自本文公开的腺病毒基因组序列的5’和3’反向末端重复(ITR)序列。优选地，5’和3’ITR区域取自相同的腺病毒基因组，并分别存在于载体的5’末端和3’末端。这种载体与根据本发明的腺病毒辅助载体联合使用。例如，在一些实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其在5’末端包含SEQID NO：1-32和/或1411中列出的任一序列内含有的5’ITR序列，或与5’ITR序列具有至少80％同一性的序列，并且在3’末端包含SEQ ID NO：1-32和/或1411中列出的任一个序列内含有的3’ITR序列，或与3’ITR序列具有至少80％同一性的序列。例如，在一些实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其在5’末端包含SEQ ID NO：1-15和17-32和/或1411中列出的任一序列内含有的或SEQ ID NO：1-13和18-32和/或1411中任一个内含有的5’ITR序列，或与5’ITR序列至少80％同一性的序列，并且在3’末端包含SEQ ID NO 1-15和17-32和/或1411中列出的任一个序列内含有的或SEQ ID NO：1-13和18-32和/或1411中任一个内含有的3’ITR序列，或与3’ITR序列具有至少80％同一性的序列。例如，在一些实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其在5’末端包含选自SEQ ID NO：1-32和/或1411中任一个内含有的序列中由表1第4列中定义的位置的序列，或与其具有至少80％同一性的序列，且在3’末端包含选自SEQ ID NO 1-32和/或1411中任一个内含有的序列中由表1第5列中定义的位置的序列，或与其具有至少80％同一性的序列。在一些这样的实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其在5’末端包含选自SEQ ID NO：1-15和17-32和/或1411中任一个内含有的或SEQ ID NO：1-13和18-32和/或1411中任一个内含有的序列中由表1第4列中定义的位置的序列，或与其具有至少80％同一性的序列，且在3’末端包含选自SEQ ID NO：1-15和17-32和/或1411中任一个内含有的或SEQ ID NO：1-13和18-32和/或1411中任一个内含有的序列中由表1第5列中定义的位置的序列，或与其具有至少80％同一性的序列。

表1–反向末端重复序列(ITR)在基因组序列中的位置

在另一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其在5’末端包含选自SEQ IDNO：33-45和50-64的序列，或与其具有至少80％同一性的序列，且在3’末端包含选自SEQ IDNO：97-109和114-128的序列，或与其具有至少80％同一性的序列。所述载体与根据本发明的腺病毒辅助载体联合使用。例如，在一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其在5’末端包含表3第2栏(标题为“500bp 5’UTR”)中提供的选自B3、B16、C1、C2、C5、C6、D10、D13、D20、D24、D25、D26、D27、D33、D37、D69和E4的腺病毒的序列，或与其具有至少80％同一性的序列，并在3’末端包含表3第4栏(标题“150bp 3’ITR”)中提供的选自B3、B16、C1、C2、C5、C6、D10、D13、D20、D24、D25、D26、D27、D33、D37、D69和E4的腺病毒的序列，或与其具有至少80％同一性的序列。优选地，所述5’和3’序列来源于相同的腺病毒。

在另一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其包含纤维基因，所述纤维基因来自本文提供的基因组序列。例如，本发明提供一种腺病毒载体，其包含选自SEQ ID NO：129-160和1443中任一个的纤维基因，例如SEQ ID NO：129-160中任一个的纤维基因，或与其具有至少70％同一性的序列。在另一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其包含选自SEQ ID NO：130-131、135、138-140、142、145-146、149、151、153、155和158-160的纤维基因，或与其具有至少70％同一性的序列。在一些实施方式中，所述腺病毒载体不含有除这些纤维蛋白之外的任何其他编码腺病毒蛋白的区域。本发明还提供具有相同特征的腺病毒辅助载体。

所述载体可以进一步或可选地包含选自SEQ ID NO：161-192和1426中任一个的五邻体(penton)基因，例如选自SEQ ID NO：161-192中任一个的五邻体基因，例如选自SEQ IDNO：161-175和177-192的五邻体基因，或与其具有至少70％同一性的序列，和/或选自SEQID NO：193-224和1431中任一个的六邻体(hexon)基因，例如SEQ ID NO：193-224中任一个的六邻体基因，例如选自SEQ ID NO：193-207和209-224的六邻体基因，或与其具有至少70％同一性的序列。

本发明的腺病毒载体可用作腺病毒疫苗载体，其包含编码抗原的基因，例如来自人类免疫缺陷病毒(HIV)、埃博拉病毒、寨卡病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌或恶性疟原虫。

本发明还提供一种腺病毒辅助载体，其包含SEQ ID NO：1-32和/或1411中任一个内含有的腺病毒基因组序列，例如，SEQ ID NO：1-13和18-32和1411中任一个内含有的或SEQ ID NO：1-13和18-32中任一个内含有的腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％同一性的序列，所述序列缺少E1区域并包含loxP位点(SEQ ID NO：221)或FRT位点(SEQ ID NO：222)，其中loxP或FRT位点这样定位：使得第一个位点位于对应于5’ITR的序列部分的下游和包装信号的上游(表1第4列)，第二个位点位于缺失的E1区域的位置的上游和对应于5’ITR和包装信号的序列部分的下游(表1第4列)。

本发明还提供一种腺病毒辅助载体，其包含选自SEQ ID NO：1-13和18-32的序列，或与其具有至少50％同一性的序列，所述序列缺少E1区域并包含loxP位点(SEQ ID NO：221)或FRT位点(SEQ ID NO：222)，其中loxP或FRT位点这样定位：使得第一个位点位于分别对应于SEQ ID NO：65-77和82-96的序列部分的下游，并且第二个位于缺失的E1区域的位置的上游和分别对应于SEQ ID NO：33-45和50-64的序列部分的下游。

本发明还提供一种细胞，其编码并能够表达SEQ ID NO：1-32和/或1411中任一个内含有的腺病毒E1区域，或与所述E1区域具有至少70％同一性的序列。在一些实施方式中，本发明提供一种细胞，其编码并能够表达选自SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25、27-32和1411中任一个内的腺病毒E1区域，例如选自SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25或27-32的腺病毒E1区域，或与所述E1区域具有至少70％同一性的序列。所述细胞可以进一步表达Cre重组酶或Flp重组酶。所述细胞用于产生根据本发明所述的腺病毒载体。

在另一个实施方式中，本发明提供一种溶瘤腺病毒载体，其包含选自SEQ ID NO：1-32和1411的E1区域，例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25、27-32或1411，或例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的E1区域，或与所述E1区域具有至少70％同一性的序列。所述溶瘤载体可进一步包含：

a)来源于SEQ ID NO：1-32和1411的E2区域，例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25、27-32或1411，或例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的E2区域，或与所述E2区域具有至少70％同一性的序列；

b)来源于SEQ ID NO：1-32和1411的E4区域，例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25、27-32或1411，或例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的E4区域，或与所述E4区域具有至少70％同一性的序列；

c)来源于SEQ ID NO：1-32和1411的L1区域，例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25、27-32或1411，或例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的L1区域，或与所述L1区域具有至少70％同一性的序列；

d)来源于SEQ ID NO：1-32和1411的L2区域，例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25、27-32或1411，或例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的L2区域，或与所述L2区域具有至少70％同一性的序列；

e)来源于SEQ ID NO：1-32和1411的L3区域，例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25、27-32或1411，或例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的L3区域，或与所述L3区域具有至少70％同一性的序列；

f)来源于SEQ ID NO：1-32和1411的L4区域，例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25、27-32或1411，或例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的L4区域，或与所述L4区域具有至少70％同一性的序列；和

g)来源于SEQ ID NO：1-32和1411的L5区域，例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25、27-32或1411，或例如选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的L5区域，或与所述L5区域具有至少70％同一性的序列。

可以突变或部分缺失溶瘤载体的E1和/或E2区域以增强复制活性和/或肿瘤特异性。

在所述载体包含多个不同区域的实施方式中，所述的多个区域可以来源于相同的腺病毒基因组或不同的腺病毒基因组。

本发明的溶瘤腺病毒载体可进一步包含：

a)增强复制的基因；

b)免疫调节转基因；

c)自杀基因或增强细胞杀伤的干扰核酸；

d)使细胞对细胞凋亡或用其他药物治疗更敏感的基因或干扰核酸；

e)肿瘤或组织选择性启动子；和/或

f)用于调节肿瘤微环境的基因。

本发明的腺病毒载体可用于治疗用途。本发明还提供了一种治疗方法，包括对患者施用本发明的所述腺病毒载体。在一些实施方式中，所述腺病毒载体包含转基因。在一些实施方式中，本发明包括用于治疗癌症，包括施用如本文所述的对癌症细胞溶瘤的腺病毒载体。

本发明还提供一种方法，用于生成如上文所定义的腺病毒载体或辅助载体、细胞或溶瘤腺病毒载体。

本发明进一步提供一种方法，用于将一个或多个转基因插入根据本发明所述的腺病毒载体或辅助载体或溶瘤腺病毒载体中。

本发明还提供一种腺病毒基因组序列，其选自SEQ ID NO：1-32和1411中任一个内的序列，例如，选自SEQ ID NO：1-3、5-12、14-15、17-32和1411中任一个内的，或选自SEQ IDNO：1-3、5-12、14-15和17-32中任一个内的序列，其包含一个或多个报告基因及其表达方式，并替换部分或全部E3区域。例如，本发明提供一种选自SEQ ID NO：1-3、5-12、14-15和17-32的腺病毒序列，其包含一个或多个报告基因及其表达方式，并替换部分或全部E3区域。还提供包含这种序列的载体。

本发明还提供一种筛选抗腺病毒药物的方法，包括：

a)在存在和不存在目标药物的情况下，用包含选自SEQ ID NO：1-3、5-12、14-15和17-32的任一序列内的腺病毒序列的载体感染细胞，所述序列包含一个或多个报告基因及其表达方式，并替换部分或全部E3区域；

b)在存在和不存在所述药物的情况下检测所述报告基因产物的表达水平；和

c)在存在和不存在所述药物的情况下比较所述报告基因产物的表达水平。

定义

为了便于理解本说明书，下面将解释本发明上下文中的一些术语和表述的含义。必要时，在整个说明书中将包括进一步的定义。

如本文所定义的“序列同一性”是指通过Smith-Waterman同源性检索算法确定的序列同一性，其在MPSRCH程序(Oxford Molecular)中使用参数的仿射间隙检索来实现：空位罚分10，空位延伸罚分0.5。

术语“高容量腺病毒载体”是指仅包含非编码腺病毒序列，并且缺少所有腺病毒编码区的腺病毒载体。

“第一代腺病毒载体”是指缺少E1和/或E3区域的腺病毒载体。

“腺病毒辅助载体”是一种腺病毒载体，其提供复制必需的早期和晚期蛋白质，并与高容量或“辅助依赖性”载体结合使用以使得它们构建和繁殖。

术语“转基因”是指来自异源生物体或病毒的基因或遗传物质。插入腺病毒载体或溶瘤腺病毒中的转基因不是来源于该特定腺病毒的基因。该基因可以来源于任何其他生物体或病毒。

术语“表达盒”(与转基因或抗原有关)是指待表达的转基因或抗原，连同其表达方式(例如启动子)。

术语“抗原”在本文公开内容中是指非目标腺病毒内源性的免疫原性蛋白质，即它由来源于异源生物体或病毒的转基因编码。

术语“免疫调节”是指抑制或降低免疫系统的一种或多种生物活性，包括但不限于免疫应答和炎症状态的下调以及细胞因子谱(cytokine profile)、细胞毒活性和抗体生产的变化。

术语“疗法”或“治疗”是指疾病或疾病病理学的治疗，并且包括治疗性和预防性治疗。该术语不限于治愈性治疗，并且涵盖对疾病过程的任何有益效果(例如降低疾病过程的风险、减缓疾病过程、停止疾病过程或逆转疾病过程)。

术语“约”是指所述值的±10％的范围。

术语“包含”涵盖“包括”以及“由…组成”，例如“包含”X的组合物可以仅由X组成，或者可以包括其他附加物质，例如X+Y。

当本发明涉及与另一序列具有至少X％序列同一性的序列时，在替代实施方式中，本发明进一步包含与该序列具有更高水平的序列同一性的序列。例如，如果说一个序列与另一序列具有至少50％的序列同一性，则在替代实施方式中，还提供具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％的序列。

当提及腺病毒类型时，这可以是物种和数量的形式，例如腺病毒C5，或简单地通过“Ad”后跟数字，例如Ad5。这些术语可互换使用并具有相同的含义。

发明详述

如下所述，本发明人生成的腺病毒文库为生成新的腺病毒载体、疫苗和溶瘤腺病毒提供了基础。在多数情况下，新克隆的腺病毒的新型序列赋予载体和溶瘤病毒以改善的性质。

新克隆的腺病毒基因组的序列在序列表中给出。表2总结了对应于每个克隆基因组的序列编号(SEQ ID NO)。

表2：克隆的腺病毒基因组序列

除了表1中列举的克隆的腺病毒外，SEQ ID NO：1411对应于新克隆的F41腺病毒基因组的序列。B11、D8和D17腺病毒的序列变体分别包含在SEQ ID NO：1413、1414和1415中。应当理解，如果需要，也可以外推涉及SEQ ID NO：9、18和22的本发明所述的任何实施方式可以分别涵盖SEQ ID NO：1413、1414和1415。

序列表中还提供来自新克隆的腺病毒的各个转录单位和特别重要的基因的序列。这些基因的序列编号(SEQ ID NO)列于下表中，并附有相关基因功能的指示。鉴定SEQ IDNO：1-32和1411中的基因组序列的5’和/或3’末端含有的任何质粒序列对于本领域技术人员而言是直接的，因为他们将简单地鉴定腺病毒基因组的ITR，这是本领域已知的并且已知用于定义腺病毒基因组的末端。

高容量腺病毒载体的非编码区

来自腺病毒基因组的5’和3’非翻译区的非编码区对于生成本发明的高容量腺病毒载体是重要的(见下文)。高容量腺病毒载体包含5’和3’反向末端重复序列(ITR)，其包括在高容量腺病毒载体中。他们位于病毒基因组每端约150bp内。5’区域还包含包装信号(ψ)。这确保了DNA被包装到病毒颗粒中。包装信号位于5’ITR下游的基因组5’末端的500bp内。含有5’ITR、5’ITR和包装信号以及3’ITR的SEQ ID 1-32和1411中的区域的位置示于表1中。

包含SEQ ID NO：1-32的5’-末端的500bp和150bp以及3’-末端的150bp的序列示于表3中。这些序列中的一些包含质粒序列。然而，对应于表3中的B3、B16、C1、C2、C5、C6、D10、D13、D20、D24、D25、D26、D27、D33、D37、D69和E4腺病毒的150bp 5’UTR和150bp 3’ITR序列编号(SEQ ID NO)确实包含分别如表1中所定义的5’ITR和3’ITR。

表3–关键的非编码区域

晚期转录单位和衣壳蛋白

晚期转录单位(L1-L5)编码结构蛋白，其负责病毒向性。形成病毒衣壳的主要结构蛋白是六邻体、五邻体基底和纤维。纤维蛋白从衣壳表面突出并且主要负责细胞向性，尽管病毒衣壳的其他部分(例如五邻体基底)在一些情况下也可以有贡献¹⁷。纤突结(fiberknob)与某些细胞表面上的受体结合，以介导细胞附着和细胞进入的第一步。五邻体基底通过与细胞的整联蛋白相互作用参与病毒颗粒的内化¹³。六邻体蛋白含有高度可变区(HVR)，其是血清型特异性的，因此被认为是主要的免疫决定簇。大多数针对HAd5的中和抗体与六邻体HVR序列结合，在较小程度上结合纤突结¹⁴。

衣壳蛋白还负责诱导宿主免疫应答例如中和抗体。病毒体表面的抗原主要是类型特异性的¹³。因此，用表4中列出的一种或多种衣壳蛋白构建载体或溶瘤病毒可有助于避免基于HAdV5的载体和病毒遇到的预先存在的免疫问题，例如，所述衣壳蛋白的来源病毒与HAdV5相比，在人群中的血清阳性率较低。除了表4中的衣壳蛋白外，SEQ ID NO：1443、1426和1431分别对应于新克隆的F41腺病毒基因组的纤维、五邻体和六邻体基因，并且本发明同样涵盖用这些序列构建载体或溶瘤病毒。

当载体包括L1区域时，这意味着它包含所有的形成L1区域的开放阅读框(ORF)部分，以及任何间插序列(编码或非编码)。所述载体还包括参与L1基因表达的任何侧翼序列(例如，从上游转录起始位点开始)。类似的规定适用于L2、L3、L4和L5区域。对于每种克隆病毒，来自这些区域中的每一个的ORF在表5中提供。

表4–衣壳蛋白

表5–L1、L2、L3、L4和L5区域中的ORF

细胞向性

目前使用或开发的大多数腺病毒载体和溶瘤腺病毒基于HAdV5。基于HAdV5的载体和病毒的一个局限是当静脉内施用时HAdV5有强的肝细胞向性。

本发明人克隆的腺病毒基因组序列为制备载体和溶瘤病毒提供了一个广泛的序列库。并且基于载体或溶瘤病毒序列来源病毒的细胞向性，这些载体和溶瘤病毒当中的许多将具有不同于HAdV5的细胞向性的优点。如果所述载体或溶瘤病毒由来自不同病毒的序列的杂交体制成，其细胞向性将由衣壳基因来源病毒的向性(特别是纤维轴(fiber shaft)和纤突结(fiber knob))决定。

例如，17型人类腺病毒(HAdV17)显示内皮细胞向性(见实施例3)。B物种病毒在上皮细胞(HeLa和A549细胞)和内皮细胞中表现出高转导效率，而Ad5在其他人和鼠细胞类型(肝细胞、淋巴细胞、神经母细胞瘤细胞和成肌细胞)中仍显示出最高的转导率。对天然腺病毒多样性的探索揭示了显著不同的体内向性(实施例1；图2)。

表6总结了克隆的腺病毒的细胞和/或组织向性，克隆的腺病毒的任何已知细胞受体，以及由这些腺病毒引起的感染类型。组织向性和所引起的感染类型为可能的细胞向性提供一些指导。

表6还列出了来源于这些腺病毒基因组的载体或溶瘤病毒的可能的治疗用途，这些治疗用途的推测是基于它们的向性。

表6–向性

改自参考文献15和16(通过引用并入本文)的信息。

hCAR：人柯萨奇病毒和腺病毒受体

DSG-2：桥粒芯糖蛋白2是钙结合跨膜糖蛋白，并且形成钙粘蛋白家族的一部分。DSG-2是上皮细胞中细胞-细胞粘附结构的组分，并且在各种上皮癌中过表达，包括胃癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、转移性前列腺癌和膀胱癌¹⁷。

因此，本发明提供用根据本发明所述的腺病毒载体感染细胞的一种方法，其中所述细胞是上皮细胞或内皮细胞。还提供一种用根据本发明所述的腺病毒载体感染组织的方法，其中所述组织选自肠、扁桃体、呼吸道、造血细胞、肾、膀胱和眼。在一些实施方式中，本发明提供一种治疗表4中列举的一种或多种疾病的方法，例如，其中所述治疗包括感染表4中列举的相应细胞和/或组织。例如，本发明提供一种治疗上皮肿瘤的方法，包括施用本发明所述的腺病毒载体。类似地，本发明提供一种治疗内皮疾病或功能障碍的方法，例如凝血障碍，包括施用本发明所述的腺病毒载体。本发明进一步提供治疗影响胃肠道、呼吸道或泌尿道或角膜结膜或肝炎感染的疾病的方法，包括施用本发明所述的腺病毒载体。

在一些实施方式中，本发明提供一种用于治疗骨肉瘤的溶瘤腺病毒载体，其中所述溶瘤腺病毒载体来源于腺病毒B21。类似地，本发明提供一种治疗骨肉瘤或胶质母细胞瘤的方法，包括施用来源于腺病毒B21的溶瘤腺病毒载体(B21与Ad21相同)。

在其他实施方式中，本发明提供一种用于治疗肺癌的溶瘤腺病毒载体，其中所述溶瘤腺病毒载体来源于腺病毒B35或D69。类似地，本发明提供一种治疗肺癌的方法，包括施用来源于腺病毒B35或D69的溶瘤腺病毒载体。

类似地，本发明提供一种靶向人呼吸道上皮的方法，包括施用来源于腺病毒B21、D37或D69的腺病毒载体。

在一些实施方式中，本发明提供一种用于感染肺细胞或组织的腺病毒载体。在一些实施方式中，所述腺病毒载体来源于Ad21、Ad3、Ad37或Ad69。在一些实施方式中，所述腺病毒病毒载体用于治疗肺部疾病，例如肺癌或囊性纤维化。类似地，本发明提供一种治疗肺部疾病的方法，包括施用来源于腺病毒Ad21的腺病毒载体。在一些实施方式中，所述腺病毒载体是溶瘤的。在一些实施方式中，所述腺病毒载体包含能够治疗所述疾病的转基因。在一些实施方式中，所述腺病毒载体携带CRISPR/Cas9组分，并且所述治疗涉及校正突变的基因序列。

在一个实施方式中，本发明提供一种转导骨肉瘤细胞或来源于骨肉瘤的细胞系的方法，包括使所述细胞与本发明所述的质粒或腺病毒载体接触，优选其中所述腺病毒序列来源于腺病毒B21。

在另一个实施方式中，本发明提供一种转导上皮细胞或来源于上皮的细胞系的方法，包括使所述细胞与本发明所述的质粒或腺病毒载体接触，优选其中所述腺病毒序列来源于腺病毒B3、B14、B16、B35或B50。

在另一个实施方式中，本发明提供一种转导内皮细胞或来源于内皮的细胞系的方法，包括使所述细胞与本发明所述的质粒或腺病毒载体接触，优选其中所述腺病毒序列来源于腺病毒B16或B50。

在另一个实施方式中，本发明提供一种转导乳腺癌细胞或来源于乳腺癌的细胞系的方法，包括使所述细胞与本发明所述的质粒或腺病毒载体接触，优选其中所述腺病毒序列来源于腺病毒D37。本发明还提供一种治疗乳腺癌的方法，包括施用来源于腺病毒D37的腺病毒载体。在一些实施方式中，所述腺病毒载体是溶瘤的。在一些实施方式中，所述腺病毒载体包含能够治疗所述疾病的转基因。

在另一个实施方式中，本发明提供一种转导肝细胞或来源于肝的细胞系的方法，包括使所述细胞与本发明所述的质粒或腺病毒载体接触，优选其中所述腺病毒序列来源于腺病毒C5或B50。

在另一个实施方式中，本发明提供一种转导肺细胞或来源于肺的细胞系的方法，包括使所述细胞与本发明所述的质粒或腺病毒载体接触，优选其中所述腺病毒序列来源于腺病毒Ad21、Ad37或Ad69。

在一个实施方式中，本发明还提供一种用于治疗骨肉瘤的本发明所述的腺病毒载体，优选其中所述腺病毒序列来源于腺病毒B21。

本发明提供一种筛选细胞向性的方法，其包括：

a)使细胞与如本文所述的腺病毒载体接触；和

b)确定所述载体是否感染所述细胞。

类似地，本发明提供一种筛选细胞向性的方法，其包括：

a)使细胞与来自如本文所述的两种或更多种腺病毒载体的文库的腺病毒载体接触；

b)确定所述载体是否感染所述细胞；和

c)对所述文库的至少一个其他成员(例如至少2、3、4、5、6、7或更多)或所述文库的每个成员重复步骤a)和b)；和

d)任选地使用不同的细胞类型重复步骤a)至c)。

有利地，所述载体可以包含报告基因，其是荧光蛋白或荧光素酶，并且步骤b)可以包括确定所述细胞是否由于荧光蛋白或荧光素酶的表达而发荧光或发光。例如，步骤b)可以包括添加荧光素酶底物，诸如furimazine或荧光素，并测量发光单位。

在一些实施方式中，所述筛选细胞向性的方法在体外进行。在一些实施方式中，所述筛选细胞向性的方法在体内进行，并且包括分析由所述转基因表达水平和/或病毒基因组水平而检测到的生物分布。例如，体内方法可以在小鼠、大鼠、兔或豚鼠中进行。

本发明进一步提供一种筛选细胞向性的方法，其包括：

a)使细胞与根据本文所述的腺病毒载体接触；和

b)确定所述载体是否裂解所述细胞。

类似地，本发明提供一种筛选细胞向性的方法，其包括：

a)使细胞与根据本文所述的两种或更多种腺病毒载体的文库的腺病毒载体接触；

b)确定所述载体是否裂解所述细胞；和

c)对所述文库的至少一个其他成员(例如至少2、3、4、5、6、7或更多)或所述文库的每个成员重复步骤a)和b)；和

d)任选地使用不同的细胞类型重复步骤a)至c)。

在一些实施方式中，确定所述载体是否裂解所述细胞的步骤包括用结晶紫或亚甲蓝对所述细胞染色。

有利地，使用根据本文所述的筛选细胞向性的方法可以鉴定用于疾病特异性靶向的病毒候选物。这使得可以通过使用本文所述的方法进行进一步的修饰所述病毒的步骤来开发新的治疗剂，例如使其含有转基因。因此，本发明还提供一种用于疾病特异性靶向的病毒候选物，其通过根据本文所述的筛选细胞向性的方法鉴定或可通过其鉴定。因此，本发明提供了一种治疗影响一种细胞类型的疾病的方法，该方法包括施用根据本文所述的腺病毒载体，该载体已通过根据本文所述的筛选细胞向性的方法鉴定(或可以鉴定)为感染该细胞类型，其中所述载体已经被修饰以并入一个或多个可用于治疗疾病的转基因和/或其中所述载体对于所述细胞类型是溶瘤的。在一些实施方式中，一个或多个转基因包含治疗剂。在一些实施方式中，一个或多个转基因是CRISPR/Cas9系统。

本发明还提供一种通过使细胞与根据本文所述的腺病毒载体接触来靶向细胞的方法，其中所述细胞类型已使用根据本文所述的筛选细胞向性的方法鉴定(或可以鉴定)为被所述腺病毒载体感染的细胞类型。在一些实施方式中，所述载体已经修饰以掺入一种或多种转基因。在一些实施方式中，所述载体对于所述细胞类型是溶瘤的。因此，本文所述的靶向方法为将目标转基因递送至细胞提供了一种手段。

早期转录单位

早期转录单位是E1、E2、E3和E4。E1、E2和E4主要参与腺病毒的复制循环。

E1转录单位包含E1A和E1B，并且是负责在细胞感染后启动复制的主要单位。E1A激活许多病毒基因以及宿主细胞基因的转录。E1B的蛋白编码基因具有多种功能，例如抑制细胞凋亡。可以在本发明所述的载体中缺失E1区域以使它们复制缺陷并因此更安全地用于治疗。缺失E1区域(以及任选地还有病毒基因组的其他区域)也提供容纳转基因的空间。

E2转录单位编码DNA聚合酶(Pol)、末端蛋白(TP)和DNA结合蛋白(DBP)，它们参与腺病毒DNA的复制和扩增。

E4转录单位的产物参与转录、细胞凋亡、细胞周期控制、DNA修复、细胞信号传导和翻译后修饰。

E3转录单位表现出免疫调节功能：它保护细胞免受由细胞毒性T细胞和死亡诱导细胞因子介导的杀伤，并可以预防细胞凋亡。该区域在不同的腺病毒血清型之间显著变化，并且可以含有不同数量的蛋白编码基因。

表7列出了每个克隆的腺病毒基因组的每个早期转录单位中的开放阅读框(ORF)。

当提及E1区域的缺失时，这意味着表7中列出的形成E1区域的一部分的所有ORF至少都缺失，并且优选地也缺失任何间插序列，例如非编码序列或任何其他编码序列。还可以缺失一些侧翼序列(例如转录起始位点)。

类似地，当提及E3区域的缺失时，这意味着表7中列出的E3区域形成部分的所有ORF至少都缺失，并且优选地也缺失任何间插序列，例如非编码序列或任何其他编码序列。还可以缺失一些侧翼序列(例如转录起始位点)。

当一种载体包括E1区域时，这意味着它包含表7中列出的E1区域形成部分的所有ORF，包括任何间插序列(编码或非编码)。所述载体还包括参与E1基因表达的任何侧翼序列(例如，从上游转录起始位点开始)。类似的规定适用于所述E2、E3和E4区域。

表7–E1、E2、E3和E4区域中的ORF

腺病毒载体

腺病毒载体可以是复制缺陷型(RD)或可复制型(RC)。载体缺失腺病毒基因组的某些区域以为外来DNA(例如转基因)提供空间。

通过缺失腺病毒基因组中的E1区域(其包含E1A和E1B必要早期基因)形成复制缺陷型腺病毒载体，其确保细胞中病毒复制的完全抑制。如果以反式的形式在辅助细胞中提供必要的病毒组分，则扩增含有非病毒来源DNA的复制缺陷型腺病毒载体是可行的。这可以通过生成对缺少基因补充的稳定细胞系来实现(见下文)。

可复制型腺病毒载体通常缺少E3区域，因为E3基因对于细胞培养或体内腺病毒复制不是必需的。关于RD和RC载体的进一步细节可以在参考文献25中找到，其通过引用并入本文。

如上所述，腺病毒细胞和组织向性主要由纤维衣壳蛋白决定，特别是该蛋白的轴(stalk)和突结(knob)区域。其他病毒衣壳蛋白也可能有助于细胞进入。

因此，在一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其包含选自SEQ ID NO：130-131、135、138-140、142、145-146、149、151、153、155和158-160的纤维基因，或与其具有至少70％同一性的序列。

优选地，该序列与选自SEQ ID NO：130-131、135、138-140、142、145-146、149、151、153、155和158-160的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。

所述载体可以进一步包含选自SEQ ID NO：161-175和177-192的五邻体(penton)基因，或与其具有至少70％同一性的序列。优选地，该序列与选自SEQ ID NO：161-175和177-192的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。

所述载体可以进一步包含选自SEQ ID NO：193-207和209-224的六邻体基因，或与其具有至少70％同一性的序列。优选地，该序列与选自SEQ ID NO：193-207和209-224的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。

所述纤维基因、五邻体基因和六邻体基因优选全部来源于相同的病毒血清型(见表4)。

可以构建杂合载体，其包含选自SEQ ID NO：130-131、135、138-140、142、145-146、149、151、153、155和158-160的纤维基因或与其具有至少70％的同一性，但包含来自不同腺病毒血清型的其他病毒序列(编码和/或非编码)的序列。所述其他病毒序列来自另一种腺病毒血清型，其形成本文公开的新文库的一部分(选自SEQ ID NO：1-15和17-32)，并且优选不来自人类腺病毒5(登录号Accession No.M73260)。可以并入本发明的不同类型载体中的腺病毒非编码和编码序列在下面进一步详细讨论。

本发明的该实施方式可以与本文所述的任何病毒载体类型组合，包括第一代载体，包括疫苗载体。根据该实施方式的载体也可以是辅助载体。

第一代腺病毒载体

在本发明的第一代载体中缺失E1区域和/或E3区域。缺失这些区域(以及任选地还有病毒基因组的其他区域)提供了容纳转基因的空间。缺失E1区域使载体复制缺陷，因此能更安全地用于治疗。由于E1基因产物是病毒生长所必需的，因此它们以反式的形式由特殊的细胞系提供，以允许载体的产生和扩增。仅缺失E3区域的载体为可复制型。

因此，在一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其包含选自SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25和27-32的序列，或与其具有至少50％同一性的序列，上述序列缺少E1区域。

优选地，该序列与选自SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25和27-32的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。

在另一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其包含选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15和17-32的序列，或与其具有至少50％同一性的序列，上述序列缺少E1区域和E3区域。

优选地，该序列与选自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15和17-32的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。

在另一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其包含选自SEQ ID NO：1-3、5-12、14-15和17-32的序列，或与其具有至少50％同一性的序列，上述序列缺少E3区域。

优选地，该序列与选自SEQ ID NO：1-3、5-12、14-15和17-32的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。

如上所述，可以构建具有来自不同血清型的纤维蛋白的杂合载体。因此，第一代载体的纤维基因可以用来自不同腺病毒血清型的纤维基因替换，前述用以替换的纤维基因选自SEQ ID NO：129-143和145-160，或与其具有至少70％同一性(优选至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％相同)的序列。

E1缺失的载体可以接受长达约5.1kb的DNA插入。缺少E1和E3区域的载体可以容纳长达约8.2kb的外源DNA¹⁹。因此，如果缺失E1，插入到本发明的第一代腺病毒载体中的转基因(或一个或多个转基因)则大小总共可以达到约5.1kb，或者如果缺失E1和E3，则大小总共可以达到约8.2kb。

在一些情况下保留E3区域可能是有益的，因为E3基因产物中包括这样一些蛋白质，它们促进病毒颗粒从细胞中释放并降低细胞毒性T细胞针对用载体转导的细胞的应答。

上述载体可用作例如辅助载体、溶瘤载体或疫苗载体。辅助载体应是复制缺陷型的。溶瘤载体是可复制型。疫苗载体可以是复制缺陷型，但优选是可复制型，因为这可以导致更好的免疫应答诱导。

高容量腺病毒载体

高容量腺病毒载体缺少所有病毒编码序列。这种载体的益处在于，比起仅缺失一些编码序列的第一代载体，它们可以容纳大得多的转基因或多个转基因。

来自病毒基因组的唯一必需序列是位于腺病毒DNA分子两端的顺式作用元件，其应包括位于基因组5’末端的包装信号(Ψ)和腺病毒基因组两端的反向末端重复序列(ITR)。对于常用的5型腺病毒，ITR长度为103bp，包装/增强子序列跨越位于腺病毒基因组左臂的核苷酸194-458bp。通常，基因组5’末端的500bp将包含5’ITR和包装信号，基因组3’末端的150bp将包含3’ITR。

由于高容量腺病毒载体缺少所有病毒编码区域，因此它们与腺病毒辅助载体一起构建和繁殖，所述腺病毒辅助载体以反式提供所需的病毒功能(复制所需的早期和晚期蛋白质)(见下文)。可以将高容量载体与辅助载体分离，例如通过在氯化铯密度梯度超速离心和/或阴离子交换和尺寸排阻色谱。

高容量腺病毒载体可以容纳长达约37kb的外源遗传物质(例如一个大转基因，或多于一个转基因)，因此它们可用于携带大的转基因或多个转基因(例如2、3、4、5或更多个转基因)和/或其他异源DNA序列。

因此，在一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其在5’末端包含一个序列，所述选自表1第4列中定义的位置的SEQ ID NO：1-13和18-32内含有的序列，或与其具有至少80％同一性的序列，并且在3’末端包含一个序列，所述序列选自表3第5列中定义的位置的SEQ ID NO：1-13和18-32内含有的序列，或与其具有至少80％同一性的序列。

优选地，该序列与在表1第4栏中定义的位置和表1第5列中定义的位置的SEQ IDNO：1-13和18-32内含有的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。

在一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其在5’末端包含一个序列，所述序列选自SEQ ID NO：33-45和50-64的序列，或与其具有至少80％同一性的序列，并且在3’末端包含一个序列，所述序列选自SEQ ID NO：97-109和114-128的序列，或与其具有至少80％同一性的序列。

优选地，所述序列与SEQ ID NO：33-45、50-64、97-109和114-128具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。

HCAdV应用–CRISPR/Cas9

有利地，本发明所述的基因缺失的高容量腺病毒载体(HCAdV)可以提供将一个或多个大基因递送至目标细胞的能力。例如，在一些实施方式中，一种基因缺失的高容量腺病毒载体具有至少15kb(例如至少20、25、30、35、40或45kb)的包装容量。例如，在一些实施方式中，所述基因缺失的高容量腺病毒载体包含至少15kb(例如至少20、25、30、35、40或45kb)的DNA，其是非腺病毒基因组序列。本发明所述的高容量腺病毒载体可用于递送CRISPR/Cas9系统的组分。为此目的使用高容量腺病毒载体的优点是可以使用单一病毒载体，任选地具有多个向导RNA。它们还可用于递送类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶(ZFN)。这些载体的一个实用的应用是体内基因校正以治疗遗传疾病。在切割宿主基因组中受影响的靶基因位点后，并在相应的供体DNA(可以通过腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体递送)存在下，可以通过同源定向DNA修复(homology-directed DNA repair)来修复突变的基因。此外，这种载体可用于治疗传染性疾病，例如作为切割和破坏病毒基因组的抗病毒方法。相应的，本发明提供这些用途。

成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统使得直接的体内基因组编辑成为可能。然而，使用单一病毒载体递送所有所需组分(包括Cas9和一个或多个向导RNA(gRNA)表达单元)的方法尚未充分开发。基因缺失的高容量腺病毒载体(HCAdV)可以使用单一病毒载体将完整CRISPR/Cas9机制的所有表达单元(包括多种gRNA)有效地递送到多种靶细胞中。然而，大的DNA构建体的复杂处理和耗时的生产过程阻碍了HCAdV在为基因组编辑方法递送CRISPR/Cas9系统的应用。本发明人已提供了一种用于HCAdV基因组操作的工具箱，用于快速且简单地引入定制的CRISPR/Cas9机制，以提供改进哺乳动物细胞中的体细胞基因组编辑方法的新工具。

本发明人生成了含有利用组成型或诱导型启动子的Cas9核酸酶基因和gRNA表达单元的新CRISPR/Cas9穿梭质粒工具箱，其能够定制CRISPR/Cas9以获得所需的靶序列。这使得在一个步骤中将所有CRISPR/Cas9组分克隆或重组到HCAdV基因组中成为可能。为了使用几个gRNA表达单元来复用(multiplexing)CRISPR/Cas9系统，可以很容易地追加其他gRNA表达单元在其中。可以通过重组工程²⁰或常规克隆进行CRISPR/Cas9机制的插入。关于CRISPR/Cas9系统的进一步细节，包括Cas9基因和gRNA的设计，可以在参考文献²¹(通过引用并入本文)中找到。

因此，在一个实施方式中，本发明提供一种质粒，其与目标腺病毒序列共享至少两个序列同源性区域，并且包含Cas9基因和向导RNA表达单元。在一些实施方式中，所述Cas9基因在组成型启动子的控制下。在一些实施方式中，所述Cas9基因在诱导型启动子的控制下。可以设计所述序列同源性区域以允许所述Cas9基因插入所述腺病毒序列中的选定位置。例如，在一些实施方式中，设计至少两个序列同源性区域，使得所述Cas9基因和所述gRNA表达单元插入所述腺病毒序列的E3区域。在一些实施方式中，所述质粒是pAdV-FTC质粒。这种质粒可作为本文所述的第二核酸分子用于本文所述的插入一个或多分转基因的方法中。

因此，在一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其在5’末端包含一个序列，所述序列是在表1第4列中定义的位置的选自SEQ ID NO：1-13和18-32内含有的序列，或与其具有至少80％同一性的序列，并且在3’末端包含一个序列，所述序列是在表1第5列中定义的位置的选自SEQ ID NO：1-13和18-32内含有的序列，或与其具有至少80％同一性的序列，并进一步包含Cas9基因和至少一个向导RNA。优选地，序列同一性程度为至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。

在一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其在5’末端包含选自SEQ IDNO：33-45和50-64的序列，或与其具有至少80％同一性的序列，并且在3’末端包含选自SEQID NO：97-109和114-128的序列，或与其具有至少80％同一性的序列，并进一步包含Cas9基因和至少一个向导RNA。

优选地，序列同一性程度为至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。

所述载体可包含一个以上的向导RNA，例如两个、三个、四个、五个、八个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个或更多个向导RNA。

所述Cas9基因可以在组成型或诱导型启动子的控制下表达。

在一个实施方式中，本发明提供一种根据本文所述的腺病毒载体，其进一步包含编码类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶的基因。

在一些实施方式中，本文公开的腺病毒载体包含至少1kb的非腺病毒序列，例如至少2、5、10、15、20、25、30、35或40kb的非腺病毒序列。在一些实施方式中，所述非腺病毒序列编码一个或多个目标转基因。在一些实施方式中，所述非腺病毒序列不是质粒序列。

HCAdV应用程序-转换子

本发明所述的高容量腺病毒载体可以与睡美人(Sleeping Beauty)转座子系统或其他转座子系统例如PiggyBAC²²结合使用，以促进转导的靶细胞的稳定修饰。任何细胞类型(包括干细胞)都可以通过腺病毒-睡美人混合载体系统进行修饰²³。

因此，在一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其在5’末端包含一个序列，所述序列是在表1第4列中定义的位置的选自SEQ ID NO：1-13和18-32内含有的序列，或与其具有至少80％同一性的序列，并且在3’末端包含一个序列，所述序列是在表1第5列中定义的位置的选自SEQ ID NO：1-13和18-32内含有的序列，或与其具有至少80％同一性的序列，并进一步包含睡美人转座酶基因(SEQ ID NO：223)和侧翼为睡美人转座子的反向重复序列(SEQ ID NO：224和225)的转基因，或包含PIGGYBac转座酶基因(SEQ ID NO：226)和侧翼为PIGGYBac转座子的反向重复序列的转基因。

优选地，该序列与在表1第4栏中定义的位置和表1第5栏中定义的位置的SEQ IDNO：1-13和18-32内含有的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。

在一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒载体，其在5’末端包含选自SEQ IDNO：33-45和50-64的序列，或与其具有至少80％同一性的序列，并且在3’末端包含选自SEQID NO：97-109和114-128的序列，或与其具有至少80％同一性的序列，并进一步包含睡美人转座酶基因(SEQ ID NO：223)和侧翼为睡美人转座子的反向重复序列(SEQ ID NO：224和225)的转基因，或包含PIGGYBac转座酶基因(SEQ ID NO：226)和侧翼为PIGGYBac转座子的反向重复序列的转基因。

优选地，所述序列与SEQ ID NO：33-45、50-64、97-109和114-128具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。

在优选的实施方式中，所述转座酶在诱导型启动子的控制下表达。特别优选的是，所述启动子应该是细胞特异性启动子，使得转基因仅在目标靶细胞中表达。

本发明所述的腺病毒-睡美人或腺病毒-PiggyBac杂合载体可用于将转基因稳定整合到干细胞，例如造血干细胞中。该策略的主要优点是避免了通常转化造血干细胞所需的复杂的体外转导程序。相反，在从骨髓动员并随之进行系统性施用所述杂合载体后，这些干细胞可以在体内直接转导。可以稳定整合到这些干细胞中的转基因包括编码凝血因子VIII、凝血因子IX、冯维勒布兰德因子、血红蛋白的基因和参与衍生自HSC的遗传疾病的其他基因。

包含在腺病毒载体中的转基因

本发明所述的腺病毒载体可包括任何转基因(或多于一个转基因)。优选具有治疗效用的转基因。

下面通过实例列出对人基因治疗特定目标转基因，但是其他转基因也可以包括在本发明的腺病毒载体中。

冯维勒布兰德病(VWD)–编码冯维勒布兰德因子(vWF；登录号AccessionNo.FLJ75522)的大转基因由于其大小而不能通过例如腺相关病毒载体进行递送。本发明所述的腺病毒载体可用于实现内皮细胞特异性vWF表达(内皮细胞是天然产生vWF的细胞类型)。例如，基于具有内皮细胞向性的HAdV D17的载体可用于内皮细胞特异性vWF表达。

凝血因子VIII(FVIII)缺乏/甲型血友病–编码FVIII的大转基因(登录号Accession No.NM_000132)可以使用本发明所述的高容量腺病毒载体递送。随后可以使用所述高容量腺病毒/睡美人杂交载体将所述转基因动员用于体细胞整合到宿主基因组中。

β-地中海贫血–血红蛋白基因(登录号Accession No.NC_000023)可以包括在本发明所述的腺病毒载体中以治疗引起β-地中海贫血的血红蛋白缺乏。

肌营养不良症–肌营养不良蛋白基因(DMD)(登录号Accession No.NC_000023)。

囊性纤维化–囊性纤维化(CF)基因(登录号Accession No.NM_000492)。

腺病毒辅助载体

腺病毒辅助载体与本发明所述的高容量腺病毒载体结合使用，以促进它们的构建和繁殖。所述辅助腺病毒提供复制所需的全部或大部分所需的早期和晚期蛋白质。

通常，所述辅助载体具有位于包装信号侧翼的loxP位点或FRT位点，从而避免了辅助载体的包装，导致所述高容量腺病毒基因组的优先包装。

在一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒辅助载体，其包含选自SEQ ID NO：1-13和18-32的序列，或与其具有至少50％同一性的序列，其缺少E1区域并包含loxP位点(SEQID NO：221)或FRT位点(SEQ ID NO：222)，其中loxP或FRT位点这样定位：使得第一个位于分别对应于表1第3列中定义的位置的序列部分的下游，并且第二个位于缺失的E1区域的位置的上游和分别对应于表1第4列中定义的位置的序列部分的下游。

在一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒辅助载体，其包含选自SEQ ID NO：1-13和18-32的序列，或与其具有至少50％同一性的序列，其缺少E1区域并包含loxP位点(SEQID NO：221)或FRT位点(SEQ ID NO：222)，其中定位loxP或FRT位点，使得第一个位于分别对应于SEQ ID NO：65-77和82-96的序列部分的下游，并且第二个位于缺失的E1区域的位置的上游和分别对应于SEQ ID NO：33-45和50-64的序列部分的下游。

优选地，该序列与选自SEQ ID NO：1-13和18-32的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。

可以根据如上所述构建杂合辅助载体用于本发明所述的第一代载体。

腺病毒疫苗载体

腺病毒载体也可用作疫苗载体以递送和表达来自病原体的转基因以产生免疫应答。腺病毒载体倾向于诱导对表达的抗原的强的体液应答和特别强的T细胞应答²⁵。

所述腺病毒疫苗载体可以是可复制型或复制缺陷型。所述免疫应答根据所述腺病毒血清型而变化，因此可以使用基于来自本文公开文库的形成部分的不同血清型的腺病毒的腺病毒载体，改善针对疫苗抗原的保护效率²⁴。

可复制型腺病毒载体缺失E3基因并被异源DNA替换。所述抗原可以表达为抗原表达盒的一部分(例如在组成型或诱导型启动子的控制下)，或者在早期或晚期腺病毒转录单位的背景下通过双顺反子IRES序列或P2A肽表达。优选地，将抗原表达盒插入所述E3区域。这种插入可以使用例如实施例1中描述的GFP/荧光素酶标记腺病毒的策略进行。关于用于疫苗接种的腺病毒载体的进一步信息可参见参考文献²⁵，其通过引用并入本文。

因此，在一个实施方式中，本发明提供一种腺病毒疫苗载体，其包含编码并能够表达抗原的基因。所述疫苗载体可以是如上所述的第一代腺病毒载体，或如上所述的高容量腺病毒载体。

所述抗原可以来自任何病原体，但优选来自人类免疫缺陷病毒(HIV)、埃博拉病毒、寨卡病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌或恶性疟原虫。

合适的HIV抗原包括(但不限于)Gag、Pol和Nef ²⁶。合适的埃博拉病毒抗原包括EBOV糖蛋白²⁷。合适的寨卡病毒抗原包括寨卡病毒糖蛋白。合适的乙型肝炎抗原包括表面抗原(HBsAg)。合适的丙型肝炎抗原包括NS3-5B²⁸。合适的流感病毒抗原包括神经氨酸酶(NA)、血凝素(HA)、核蛋白(NP)和基质蛋白(MP)。

病毒生产细胞系

本发明所述的腺病毒载体和辅助载体可缺少E1区域。然而，该区域含有病毒复制所必需的基因，因此需要E1表达细胞系以生成用于将载体递送至细胞的腺病毒颗粒。

因此，在一个实施方式中，本发明提供一种编码并能够表达来源于SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25或27-32的腺病毒E1区域，或与所述E1区域具有至少70％同一性的序列的细胞。这种细胞用于产生根据本发明所述的腺病毒载体。

优选地，该序列与来源于SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25或27-32的腺病毒E1区域具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。

在一些实施方式中，本发明提供一种真核细胞，其已经用本文所述的腺病毒载体转染，所述腺病毒载体已通过限制酶消化从腺病毒质粒中释放。

进一步地，所述细胞能够表达Cre重组酶(登录号Accession No.P06956)或Flp重组酶(登录号Accession No.P03870)。当使用包装信号侧翼为loxP或FRT位点的辅助载体时，如上文所讨论的一样，这可以使得辅助依赖性载体相对于辅助载体优先包装。

优选的细胞系包括HEK293、HeLa和A549，但也可以使用其他细胞。

溶瘤腺病毒载体

溶瘤腺病毒可用于癌症治疗。这些病毒在癌细胞中的选择性复制可导致通过病毒介导的细胞溶解而杀死受感染的细胞，并扩散到邻近的肿瘤细胞以继续溶瘤过程。

溶瘤腺病毒载体应是可复制型的。即，溶瘤腺病毒应仍能够组装和释放新的病毒颗粒以感染相邻细胞。因此，它应至少含有所有必需基因(转录单位E1、E2、E4和L1-L5)。主要负责病毒复制的E1和E2可以突变或部分缺失，以提高复制效率或使重组病毒具有肿瘤特异性。

在一个实施方式中，本发明提供一种溶瘤腺病毒载体，其包含来源于SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的E1区域，或与所述E1区域具有至少70％同一性的序列。优选地，该序列与所述E1区域具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。

优选地，溶瘤载体进一步包含：

a)来源于SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的E2区域，或与所述E2区域具有至少70％同一性的序列；

b)来源于SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的E4区域，或与所述E4区域具有至少70％同一性的序列；

c)来源于SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的L1区域，或与所述L1区域具有至少70％同一性的序列；

d)来源于SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的L2区域，或与所述L2区域具有至少70％同一性的序列；

e)来源于SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的L3区域，或与所述L3区域具有至少70％同一性的序列；

f)来源于SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的L4区域，或与所述L4区域具有至少70％同一性的序列；和

g)来源于SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的L5区域，或与所述L5区域具有至少70％同一性的序列。

优选地，对于每个区域，序列同一性程度为至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。

可以突变或部分缺失所述溶瘤载体的所述E1和/或E2区域以增强复制效率和/或肿瘤特异性(例如肿瘤细胞中复制的特异性)。例如，为了实现肿瘤细胞特异性，可以在使p53失活的早期基因E1B中进行缺失。基于HAd5的载体(ONYX-015和H101)中已经进行了合适的缺失；然而，E1B中能使p53失活的任何缺失都可以使用。这种病毒可用于具有p53功能的细胞。或者，或附加的，溶瘤腺病毒可在E1A区域的CR2区域(如在AdΔ24中)中含有24bp缺失。该突变有助于将复制限制在pRb(视网膜母细胞瘤蛋白)突变的癌细胞。可以在参考文献²⁹和其中引用的参考文献(通过引用并入本文)中找到此类和其他突变以增强复制特异性的进一步细节。

也可以突变或缺失部分或全部或E3区域以增强抗肿瘤效果。例如，E3B基因的缺失增强在具有免疫活性的小鼠中的抗肿瘤作用³⁰。

还可以通过选择病毒序列来源的血清型以最大化复制。例如，本文公开的基于hAd6序列的载体显示出相对于人腺病毒5具有增强的溶瘤活性(见实施例6)。在没有任何特定理论的约束的情况下，可以认为这种增强的溶瘤活性可能是复制增强的结果。特别优选相对于人腺病毒5具有增强的复制或增强的溶瘤活性的载体。因此，本发明涵盖包含Ad6序列的载体在包含溶瘤作用的实施方式中的用途。

除了如上文所讨论的直接在遗传上修饰腺病毒基因外，还可以使用增强肿瘤细胞杀伤或复制的基因来装备病毒。因为在许多情况下病毒诱导的细胞杀伤效率不足，所以增强复制以及产生后代就非常可取。

本发明所述的溶瘤载体可以进一步包含：

a)增强复制的基因；

b)免疫调节转基因；

c)自杀基因或增强细胞杀伤的干扰核酸；

d)使细胞对细胞凋亡或用其他药物治疗更敏感的基因或干扰核酸；

e)肿瘤或组织选择性启动子；和/或

f)用于调节肿瘤微环境的基因。

a)增强复制的基因

通过将例如P19基因(登录号Accession No.Q712F9)添加到本发明的溶瘤载体中可以增强复制³¹。

b)免疫调节转基因

免疫刺激基因可以将免疫细胞募集到肿瘤中并激活它们。招募免疫系统有助于破坏原发肿瘤，以及有可能作用于和清除转移细胞。编码细胞因子诸如单核细胞趋化蛋白3(MCP3)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的基因可包括在所述溶瘤载体中。其他细胞因子也导致增强的免疫应答和抗肿瘤毒性，例如肿瘤坏死因子α(TNFα)和干扰素γ(IFNγ)。还可以使用各种白细胞介素和热休克蛋白³³。

c)自杀基因和增强细胞杀伤的干扰核酸

增强细胞杀伤作用的基因可以产生更大的功效，因为病毒可以更容易地从受感染的细胞中逃逸并感染邻近的肿瘤细胞。编码将无毒前药转化为有毒产物的前药转化酶的“自杀基因”特别有效，因为有毒产物可导致邻近的未感染细胞的杀灭。例如，单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)可以与更昔洛韦组合使用，和/或胞嘧啶脱氨酶(CD)可以与5’氟胞嘧啶³³组合使用。

d)使细胞对细胞凋亡或用其他药物治疗更敏感的基因或干扰核酸

使细胞对细胞凋亡更敏感的基因可以在杀死肿瘤细胞方面具有更大的功效。例如，可以将人肿瘤抑制基因诸如p53或刺激细胞衰老的病毒基因诸如腺病毒死亡蛋白(E3-11.6K)掺入本发明所述的载体中。腺病毒死亡蛋白也可增强病毒传播。可以使用的其他人类基因包括细胞因子信号传导抑制因子3(socs3)、第二线粒体半胱天冬酶激活因子(Smac)、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)相关因子1(XAF1)、抗氧化酶锰超氧化物歧化酶(MnSOD)和TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)。也可以使用干扰抗凋亡蛋白的核酸。例如，针对细胞检查点蛋白(例如polo样激酶1(plk1)、检查点激酶1(chk1)和检查点激酶2(chk2))的反义RNA，或针对癌基因K-ras的小干扰RNA(siRNA)曾用来增强抗肿瘤作用³³。当与化学治疗剂例如5-氟尿嘧啶和顺铂³³组合时，所述基因和干扰核酸中的一些导致诱导的协同溶瘤作用。

e)肿瘤或组织选择性启动子

肿瘤或组织选择性启动子使得肿瘤细胞中复制可以有进一步特异性。例如，CN706具有由前列腺特异性抗原启动子驱动的E1盒，其使得(所述载体)可以选择性的、雄激素依赖性的在前列腺细胞中进行复制³²。

f)用于调节肿瘤微环境的基因

肿瘤依赖于例如血管生成和细胞外基质调节的过程，因此这些过程的破坏可具有抗肿瘤作用。因此，所述溶瘤载体可携带作用于细胞外基质组分的转基因，例如金属蛋白酶组织抑制剂3(TIMP3)，或抑制血管生成的转基因，例如内皮抑素、Flt-1(VEGF抑制剂)，或靶向血管生成促进因子(如VEGF)的干扰RNA。

上述转基因可以置于内源病毒基因控制元件的控制之下，或者可以在外源启动子的控制下。外源启动子可以是组成型或诱导型的。如上文所讨论的合适的转基因和启动子的进一步细节可在参考文献²⁹和³³及其中引用的参考文献(通过引用并入本文)中找到。

如上所述，所述纤维基因区域主要负责细胞向性。如果靶肿瘤细胞表达来自所述腺病毒文库的纤维蛋白结合的受体，则溶瘤载体可以基于该腺病毒血清型，或者可以构建仅包含来自如上所述的腺病毒血清型的纤维基因(或其轴突和突结区域)的杂合溶瘤载体，用于本发明的第一代载体。

药物组合物

本发明还提供包含本发明所述的腺病毒载体的药物组合物，包括用于基因治疗的载体、疫苗载体和溶瘤载体。所述药物组合物包含本发明所述的载体和药学上可接受的载体。

本发明的药物组合物可包含其他赋形剂。

例如，包含本发明所述的溶瘤腺病毒载体的药物组合物可包含用于溶瘤载体的聚合物或聚乙二醇涂层。这可能有助于免疫逃避并增加向肿瘤的传递^34,35。

除所述腺病毒载体外，本发明所述的组合物还可包含其他治疗剂。例如，包含溶瘤载体的组合物可包含一种或多种其他化学治疗剂(例如5-氟尿嘧啶和顺铂)，特别是在所述溶瘤载体增加对用其他药物治疗的易感性的情况下。

治疗方法/治疗用途

本发明所述的腺病毒载体或溶瘤腺病毒可用于治疗。本发明还提供一种治疗方法，包括向患者施用本发明所述的腺病毒载体。

例如，本发明所述的腺病毒载体可用于基因治疗。这种载体包括转基因，例如上文所讨论的用于治疗冯维勒布兰德病(von Willebrand disease)、A型血友病、β地中海贫血、肌营养不良和囊性纤维化的转基因。然而，本发明不限于治疗这些疾病，并且原则上，本发明所述的载体可用于治疗任何可以通过将突变等位基因用非突变拷贝替换并恢复生理功能的遗传疾病。用于基因治疗的载体包括所述第一代腺病毒载体和高容量腺病毒载体。在转基因稳定整合有益的情况下，可以使用本发明所述的腺病毒-睡美人杂交载体。如上文所讨论的，所述CRISPR/Cas9高容量载体可用于促进体内基因校正以治疗遗传疾病。

此外，本发明所述的CRISPR/Cas9载体可用于治疗感染性疾病，例如作为切割和破坏病毒基因组的抗病毒方法。

本发明所述的腺病毒疫苗载体可用作预防性和/或治疗性疫苗。疫苗载体可用于预防各种疾病，例如包括HIV、埃博拉病毒、寨卡病毒病、乙型肝炎、丙型肝炎、流感、结核病或疟疾。

本发明所述的溶瘤载体可用于治疗涉及良性和/或恶性肿瘤(包括癌症)形成所致的病症。例如，所述溶瘤载体可用于治疗癌(carcinoma)(例如鳞状细胞癌或鼻咽癌)、结肠直肠癌、肝细胞癌、肺癌、间皮瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、神经胶质瘤等。

本发明所述的载体可以局部或全身施用。全身施用可以包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、肌肉内或皮下施用。所述载体可以粘膜施用(例如口服或经鼻)。局部施用可以包括例如局部递送至靶组织用于基因治疗(例如胸膜内)，或溶瘤腺病毒的肿瘤内或腔内递送。

用于治疗的载体可以与其他治疗剂结合施用，作为相同组合物的一部分或作为一起或依次给药的单独组合物。例如，用溶瘤载体治疗可以与其他化学治疗剂(例如5-氟尿嘧啶和顺铂)结合施用，或者可以与例如放射疗法结合使用。

本发明还提供诊断方法。有利地，如本文所述，确定样品中是否存在腺病毒的方法可用于确定疾病是否由腺病毒感染引起。因此，本发明进一步提供一种用于诊断由腺病毒引起的疾病(例如感染)的方法，包括实施如上所述的方法，其中所述样品是来自患者的临床样品(例如血液、唾液、尿液或血清)或来源于所述样品的基因组DNA。在一些实施方式中，患者选自人或非人哺乳动物，例如马、狗、猫、牛、山羊、绵羊、兔、小鼠、大鼠或豚鼠。在一些实施方式中，患者是人。本发明进一步提供一种通过进行如上所述的方法确定患者样品中腺病毒的类型的方法。在一些实施方式中，所述疾病选自呼吸道、眼、肠、泌尿道和神经系统的疾病。在一些实施方式中，所述呼吸道疾病是呼吸道感染，例如细支气管炎、哮吼或病毒性肺炎。在一些实施方式中，所述肠疾病是胃肠炎或腹泻。在一些实施方式中，所述眼疾病是结膜炎、咽喉结膜热或角膜结膜炎。在一些实施方式中，所述泌尿道疾病是尿路感染或出血性膀胱炎。在一些实施方式中，所述疾病是脑膜炎或脑炎。在一些实施方式中，所述疾病是发热性呼吸道疾病。

生成腺病毒载体的方法

本发明提供一种产生如上文所定义的腺病毒载体或辅助载体的方法。这包括产生如上文所定义的疫苗载体或溶瘤载体的方法。

在一个实施方式中，一种生成腺病毒载体的方法包括使用线性至线性同源重组(linear to linear homologous recombination,LLHR)克隆腺病毒序列。在一个实施方式中，本发明提供一种克隆腺病毒序列的方法，包括：

a)提供包含第一线性核酸分子的样品，所述第一线性核酸分子是腺病毒基因组；

b)提供线性化质粒，其共享至少两个与与所述第一核酸分子序列同源的区域；和

c)使所述第一核酸分子和所述线性化质粒在5’至3’外切核酸酶和退火蛋白存在下接触，使得所述第一线性核酸和所述线性化质粒重组形成含有腺病毒序列的环状质粒。

在一些实施方式中，所述腺病毒序列是如本文中公开的腺病毒序列。

在一个实施方式中，包含腺病毒序列的所述第一线性核酸分子存在于获自人类或其他非人类哺乳动物的生物体液中。在一些实施方式中，所述样品是血液、血清、脊髓液、唾液和/或尿液。在一些实施方式中，所述样品是混合物。在一些实施方式中，所述样品是临床样品。在一些实施方式中，该混合物可包含腺病毒基因组DNA和真核基因组DNA，例如人类基因组DNA。有利地，本发明所述的方法允许直接从生物样品克隆腺病毒，而不需要在进行克隆步骤之前纯化DNA的步骤。例如，可以使用从细胞/病毒裂解物中分离的DNA混合物，而非使用纯化的腺病毒基因组。在一些实施方式中，该方法进一步包括在裂解细胞之前在该细胞系中扩增腺病毒的步骤。因此，在一些实施方式中，所述第一线性核酸分子存在于细胞/病毒裂解物中或存在于从细胞/病毒裂解物中分离的DNA混合物中。在一些实施方式中，该方法涉及将存在于从细胞/病毒裂解物分离的混合物中的所述第一线性核分子与步骤b)所述的质粒共同电穿孔到宿主细胞中，使得它们可以发生同源重组。在一些实施方式中，该方法包括苯酚-氯仿提取步骤以从样品中分离腺病毒DNA。在一些实施方式中，所述酚-氯仿提取涉及获取间期蛋白质-DNA复合物。在一些实施方式中，用蛋白酶K处理所述包含腺病毒DNA的混合物。在一些实施方式中，通过添加蛋白酶K，随后酚-氯仿提取和乙醇沉淀，从例如纯化的颗粒中提取病毒基因组DNA。

在一些实施方式中，在所述克隆方法中使用小于2μg(例如小于1.75ug、小于1.5μg、小于1.25μg)的病毒基因组DNA。在一些实施方式中，在克隆方法中使用超过200ng(例如超过300ng、500ng、700ng、800ng、900ng)的病毒基因组DNA。在一些实施方式中，所述克隆方法中使用的质粒载体的量与病毒基因组DNA的量大致相同。例如，在一些实施方式中，在所述克隆方法中使用约1μg病毒基因组DNA和约1μg质粒载体。如图2所示，使用这些量获得了非常好的同源重组效率。

在需要克隆未知序列的腺病毒的实施方式中，该方法可以包括在细胞系中扩增所述腺病毒，裂解细胞并从粗细胞裂解物中纯化所述病毒(例如通过CsCl梯度)，随后进行病毒基因组分离和序列验证。一旦获得了ITR区域的序列，本文所述的克隆方法可用于克隆全长腺病毒。然而，由于不同腺病毒的ITR区域之间通常存在一定程度的序列同源性，因此可以使用设计为与一种腺病毒的ITR具有序列同源性的质粒来克隆不同的腺病毒，并且本发明还涵盖这种实施方式。

本文所述的直接克隆方法有利地提供了比先前可获得的克隆全长腺病毒基因组的更有效和更快速的方法。以前，大多数腺病毒克隆技术涉及模块化克隆腺病毒基因区域并在BAC载体中将它们拼接在一起。使用基于同源重组的技术将腺病毒基因组克隆到质粒中的其他研究需要长同源臂和纯浓缩形式的腺病毒DNA，其所使用的技术非常低效。例如，Renault等人(Virol.Methods 2002)使用大肠杆菌Top10F’，所述菌株是利用内源recA负重组(minus recombination)的大肠杆菌菌株，效率非常低。

优选地，设计线性化质粒，使其包含与所述第一线性核酸分子中腺病毒序列的5’ITR具有序列同源性的区域和与所述第一线性核酸序列中腺病毒序列的3’ITR具有序列同源性的区域。在一些实施方式中，所述同源性区域的长度为约50nt，例如长度为50nt、50-55nt、50-60nt、50-70nt、45-50nt、40-50nt、30-50nt、45-55nt、40-60nt、30-70nt或40-80nt。本领域技术人员将理解如何设计具有足够量的序列同源性的序列同源性区域以发生同源重组。在一些实施方式中，所述序列同源性区域与所述腺病毒序列的相应区域具有100％同一性。在一些实施方式中，存在较低程度的序列同一性(例如，大于90％、大于95％、大于98％)，但是存在足够的序列同源性以发生同源重组。这使得设计克隆第一种腺病毒的质粒载体能够用于克隆第二种腺病毒，所述第二种腺病毒的ITR区域与所述第一种腺病毒具有足够的序列同源性。在一些实施方式中，所述同源性区域仅是ITR序列的一部分而不是全长ITR序列。在一些实施方式中，所述同源性区域是ITR序列的全长。5’ITR和3’ITR序列在所述腺病毒基因组的5’和3’ITR处，因此设计所述线性化质粒使得这些区域发生重组确保了全长基因组能够克隆到质粒骨架中。本领域技术人员可以很容易地从腺病毒基因组序列获得所述5’和3’ITR序列，例如，从本文公开的腺病毒基因组序列。在一些实施方式中，所述5’和3’ITR序列来自分别如表1第3列和第5列中所示的腺病毒基因组序列。

因此，在一些实施方式中，所述第一线性核酸分子包含全长腺病毒基因组序列。在一些实施方式中，由于样品中存在腺病毒，这种序列将存在于所述样品中。优选地，所述腺病毒序列是SEQ ID NO：1-32和/或1411中的任一个内含有的，例如，SEQ ID NO：1-15、17-32和/或1411中的任一个内含有的，或SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25和27-32和/或1411中的任一个内含有的，或SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25和27-32中的任一个内含有的全长腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％同一性的序列。

在优选的实施方式中，步骤c)中形成的所述环状质粒包含全长腺病毒基因组序列。然而，在一些实施方式中，在步骤c)中克隆到所述环状质粒中的所述腺病毒基因组序列在其5’和/或3’末端缺失一个或多个核苷酸，因为具有序列同源性的一个或两个区域没有一直分别延伸到ITR序列的5’和/或3’末端。例如，在一些实施方式中，所述腺病毒基因组序列从其5’和/或3’末端缺失少于3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、125或135个核苷酸。

因此，在优选的实施方式中，提供一种克隆腺病毒基因组序列的方法，包括：

a)提供包含第一线性核酸分子的样品，所述第一线性核酸分子是腺病毒，其中所述样品未经过DNA纯化步骤；

b)提供线性化质粒，其与所述第一核酸分子具有至少两个序列同源性区域，其中第一和第二同源性区域是a)部分所述腺病毒的5’ITR和3’ITR；和

c)使所述第一核酸分子和所述线性化质粒在5’至3’外切核酸酶和退火蛋白存在下接触，使得所述第一线性核酸和所述线性化质粒重组形成含有所述腺病毒基因组的环状质粒序列。

任何合适的线性化质粒都可以使用。在一些实施方式中，所述线性化质粒包含用于定向克隆的含有5’和3’ITR序列的同源臂(HA)、一种或多种选择标记和复制起点。在一些实施方式中，所述线性化质粒包含用于定向克隆的含有5’和3’ITR序列的同源臂(HA)、一种或多种选择标记(例如氯霉素抗性基因)和复制起点(例如p15a起点)。在一些实施方式中，所述线性化质粒包含用于定向克隆的含有5’和3’ITR序列的同源臂(HA)、一种或多种选择标记(例如，用于高级阳性选择和反向选择(counter selection)的ccdB10和氨苄青霉素)、复制起点(例如p15A)和抗生素抗性基因(例如氯霉素抗性基因)。在一些实施方式中，所述线性化质粒选自基于p15A起点的载体、基于pBR322起点的载体、fosmid、基于pUC起点的载体或基于ColE1起点的载体。优选中等拷贝质粒，例如，p15A、pBR322、pR6K、pRK2、pBBR1和基于Inc的质粒，特别是基于p15A起点的载体。在一些实施方式中，所述中等拷贝质粒是p15A-cm-adHA，如本文所述。在一些实施方式中，所述质粒在每个细胞中以约10个拷贝存在，例如10个拷贝，9-11、8-12、8-11或6-12个拷贝。优选地，用于克隆所述腺病毒基因组序列的质粒不是细菌人工染色体(BAC)。在一些实施方式中，所述质粒是穿梭载体。在一些实施方式中，所述质粒的长度小于4kb，例如，长度小于3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb或1kb。

与涉及将所述腺病毒序列克隆到低拷贝BAC中的现有技术方法相比，将所述腺病毒基因组克隆到中等拷贝质粒中提供了许多优点。例如，使用本发明所述的腺病毒质粒可以获得更高浓度的腺病毒载体，并提高释放的腺病毒载体转染到细胞中的效率。本文所述的质粒骨架比现有技术的骨架更稳定，并且使得可以以高通量方式克隆完整的腺病毒基因组，而不会在克隆的病毒基因组中引入重组或突变。本发明方法的效率提高意味着与通常需要筛选约400个克隆的现有技术方法相比，找到正确重组体所需要筛选的克隆数量大大减少。有利地，本文所述的克隆方法使得可以创建腺病毒基因组序列和腺病毒载体的文库，而使用先前的技术这是根本不可行的。

与BAC相比，使用中等拷贝质粒诸如p15A起源质粒具有许多优点。例如，中等拷贝质粒诸如p15A可以比BAC更稳定。作为另一个实例，中等拷贝质粒使得第一克隆步骤变得更容易，因为同源臂可以通过定制寡核苷酸并通过经一步或两步PCR附加到质粒上，反之，在使用BAC的情况下，每个同源臂必须单独克隆到BAC中以生成专门的质粒，然后还必须线性化。此外，与使用BAC相比，使用中等拷贝质粒例如p15A可使从大肠杆菌细菌分离的质粒产量提高至少10倍。与BAC纯化程序相比，质粒纯化后产量的提高使得病毒产生的第一步(＝将DNA转染到生产病毒的细胞系中)更可行，因为该步骤需要足够的DNA量。通常，提高的稳定性和效率使得高通量工作成为可能，这与用于腺病毒基因组克隆的常规方法形成鲜明对比。

在一些实施方式中，步骤b)所述的质粒在电穿孔进入发生同源重组的宿主细胞之前进行线性化。在其他实施方式中，步骤b)所述的质粒在体内线性化，例如，使用稀有位点序列特异性切割酶，例如参考文献20中所述。

可以使用任何合适的5’至3’外切核酸酶和退火蛋白。优选地，5’至3’外切核酸酶是如参考文献20(通过引用并入本文)中所述的全长RecE(SEQ ID NO：1412)，或与全长形式具有至少70％(优选至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％)序列同一性的保留5’至3’外切核酸酶活性的蛋白质。退火蛋白优选为RecT。

在一些实施方式中，该方法包括将所述第一线性核酸分子和所述线性化质粒共电穿孔到表达全长RecE和RecT的宿主细胞中。在一些实施方式中，该方法在宿主细胞中进行，其中全长RecE在诱导型启动子的控制下表达。在一些实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌菌株GBRed。合适的宿主细胞的实例是本领域熟知的，并在参考文献20中详细描述。在一些实施方式中，所述宿主细胞表达RecA和/或Redγ。

利用全长RecE和RecT的直接克隆方法在参考文献20中详细描述，该文献通过引用整体并入本文。先前使用直接克隆来克隆疱疹病毒的尝试已经失败，因此直接克隆对腺病毒有效是让人意想不到的。

在一些实施方式中，在克隆所述腺病毒基因组的步骤之后，进行测序步骤以确定所述腺病毒的序列。

在一些实施方式中，在克隆所述腺病毒基因组的步骤之后，该方法进一步包括检查所述克隆的腺病毒基因组的完整性，例如，使用诊断性限制酶消化和/或下一代测序。

在另一方面，本发明提供一种根据本文所述的克隆方法，用于克隆病毒基因组序列，优选双链DNA病毒基因组序列。在一些实施方式中，所述病毒不是腺病毒。在一些实施方式中，所述病毒的基因组长度小于70kb，例如长度小于65kb、60kb、55kb、50kb、45kb、40kb或35kb。在一些实施方式中，所述病毒的基因组长度大于10kb，例如，长度大于12kb、15kb、20kb、25kb或30kb。例如，在一些实施方式中，所述病毒的长度为10-70kb，例如长度为15-70kb、15-60kb、20-60kb、20-55kb、20-45kb、25-55kb、25-45kb或35-45kb。类似地，其他方法和载体可用于其他类型的病毒。本领域技术人员将理解如何使本文所述的方法和产品适应不同类型的病毒。

本发明进一步提供一种包含全长腺病毒基因组序列的质粒载体。优选地，质粒已通过本文所述的方法获得或可通过其获得。因此，本文所述方法中提供的腺病毒序列和质粒载体的描述可外推至本发明的该方面，该方面是包含所述克隆的腺病毒序列的质粒载体。在一些实施方式中，所述质粒包含如本文所述的全长腺病毒基因组序列。例如，在一些实施方式中，质粒包含SEQ ID NO：1-32或1411中任一个内含有的全长腺病毒基因组序列，或与其具有至少70％(优选至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％)同一性的序列。在一些实施方式中，质粒包含SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25、27-32和1411中任一个内含有的基因组序列，或至少与其70％(优选至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％)同一性的序列。在一些实施方式中，所述质粒包含先前未测序的腺病毒基因组。

在一些实施方式中，所述含有腺病毒序列的质粒是中等拷贝质粒，其包含复制起点和选择标记例如抗生素抗性基因。在一些实施方式中，所述质粒包含p15A起点。在一些实施方式中，所述质粒是中等拷贝质粒，其包含复制起点、选择标记和全长腺病毒基因组序列，其中所述质粒另外包含腺病毒基因组序列的紧邻上游和紧邻下游的一个或多个限制性位点，使得所述腺病毒基因组载体可以从所述质粒载体中释放出来。如上所述，在本发明的替代方面，所述质粒包含全长病毒基因组序列，在一些实施方式中，其不是腺病毒序列。例如，所述全长病毒基因组序列可以来自多瘤病毒或乳头瘤病毒。

本发明进一步提供一种克隆的腺病毒基因组的文库。优选地，所述腺病毒基因组是全长腺病毒基因组。因此，本发明提供一种含有两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多种)质粒载体的文库，每种质粒载体包含一种全长腺病毒基因组序列。优选地，所述两种或更多种质粒载体已通过本文所述的克隆方法获得或可通过其获得。在一些实施方式中，所述文库包含至少两种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20种)不同腺病毒的序列。例如，在一些实施方式中，提供一种包含两种或更多种质粒载体的文库，所述质粒载体包含本文所述的全长腺病毒基因组序列。在一些实施方式中，所述文库中克隆的腺病毒用报告基因标记。

在另一方面，本发明提供一种适用于所述克隆方法的步骤b)的质粒。所述质粒可以以环状形式或线性形式提供。例如，在一些实施方式中，本发明提供包含复制起点、选择标记和与腺病毒基因组序列的ITR区域同源的两个区域的质粒，其中一个区域与5’ITR具有同源性，第二个区域与3’ITR具有同源性。对用于本发明所述克隆方法的质粒的描述可以外推到本发明的该方面。例如，在一些实施方式中，所述质粒是中等拷贝质粒例如p15A、pBR322、pR6K、pRK2、pBBR1或基于Inc的质粒。在一些实施方式中，本发明该方面的质粒将含有少于1000nt的腺病毒序列，例如，少于900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50、25、15或10nt。

本发明进一步提供一种用于确定样品中是否存在腺病毒的方法，包括使所述样品或来源于所述样品的基因组DNA与如本文所述的线性化质粒在5’至3’外切核酸酶和退火蛋白存在下接触，所述线性化质粒包含至少两个与腺病毒序列具有序列同源性的区域，使得如果样品中存在腺病毒基因组序列，它将与所述线性质粒重组以形成含有所述腺病毒序列的环状质粒，并进一步包括确定是否已形成含有所述腺病毒序列的环状质粒的步骤。有利地，这种方法可以使用克隆根据本文所述的腺病毒序列的方法进行。在一些实施方式中，所述线性化质粒含有一个区域与腺病毒序列的5’ITR具有序列同源性，并含有与腺病毒序列的3’ITR具有序列同源性的另一个区域。在一些实施方式中，该方法进一步包括确定所述克隆的腺病毒序列的类型的步骤，例如，通过测序全部或部分所述克隆的腺病毒序列和/或使用限制酶消化分析所述克隆的腺病毒序列。

在一些实施方式中，该方法包括使样品与线性化质粒文库接触，所述线性化质粒包含设计用于靶向不同腺病毒的同源性区域。在一些实施方式中，该方法包括同时使所述样品与所述文库的所有成员接触。在一些实施方式中，该方法包括使用所述文库的各个成员进行多个实验。因此，本发明进一步提供一种适用于本文所述克隆方法的步骤b)的质粒文库，其中所述文库的各个成员具有与不同腺病毒的5’ITR和3’ITR具有序列同源性的区域。在一些实施方式中，所述文库具有至少2、3、4、5、10、15、20、25或30个成员。

本发明还提供一种腺病毒载体，其已经例如通过根据本文所述的限制性消化从含有所述腺病毒基因组序列的环状质粒中以线性形式释放。

生成载体的方法通常使用线性至环状同源重组(linear to circularhomologous recombination,LCHR)以缺失如上文所讨论的腺病毒基因组的一个或多个区域。因此，在一个实施方式中，本发明提供一种生成腺病毒载体或辅助载体的方法，包括：

a)提供包含选自SEQ ID NO：XX-XX的腺病毒序列的第一环状核酸分子，例如包含选自SEQ ID NO 1-32和1411中任一个内，或选自SEQ ID NO：1-15和17-32和1411中的任一个内，或选自SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25和27-32中任一个内的完整腺病毒基因组序列，或与其具有至少70％同一性的序列(优选至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％)；

b)提供第二线性核酸分子，其与所述第一核酸分子共享至少一个序列同源性区域；和

c)使所述第一和第二核酸分子在5’至3’外切核酸酶和退火蛋白存在的情况下接触，使得在所述第一核酸分子中引入缺失、突变和/或插入。

优选地，已使用上述LLHR直接克隆方法生成步骤a)中描述的第一环状核酸分子。因此，对于所述克隆方法所述的腺病毒序列和质粒载体的描述可以外推到本发明的该方面。因此，还提供一种根据本文所述的质粒载体，其包含通过本发明的该方法获得或可通过其获得的经修饰的腺病毒基因组序列。在一些实施方式中，所述质粒载体包含如本文所述的腺病毒载体的序列。

所述腺病毒载体可以例如通过限制性消化从所述第一环状核酸分子中以线性形式释放。为了通过限制性消化释放所述基因组，所述环状核酸分子将在所述腺病毒序列的5’和3’端包含限制性位点。因此，在一些实施方式中，所述用于克隆方法的线性化质粒在两个序列同源性区域的5’和3’端包含限制性位点(即，使得包含克隆的腺病毒序列的所得环状核酸分子包含腺病毒序列5’和3’端的限制性位点)。因此，在一些实施方式中，所述释放的腺病毒载体不包含任何质粒序列。在一些实施方式中，所述释放的腺病毒载体在5’和/或3’末端包含小于1000nt的质粒序列，例如，小于900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50、25、15或10nt。

以上讨论了关于载体(例如，E1区域和/或E3区域，和/或其他早期基因区域)合适的缺失。对于所述高容量载体，缺失所有编码序列。对于所述溶瘤载体，可以缺失非必需序列(例如E3序列)。或者，可以使用所述第二线性核酸进行突变，例如在E1和/或E2区域。还可以进行插入，例如插入转基因或其他非腺病毒DNA，例如如上所讨论的。通常，如果插入DNA，则应缺失至少一些所述腺病毒基因组的非必需区域以为插入的DNA创造编码能力。

对于缺失或突变，所述线性核酸的长度可小于180个核苷酸(例如，150个核苷酸或更少、130个核苷酸或更少、110个核苷酸或更少、100个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、60个核苷酸或少于或55个核苷酸或更少)。

在一些实施方式中，所述第二线性核酸分子与所述第一核酸分子共享至少两个序列同源性区域，其中设计序列同源性区域以除去存在于所述腺病毒序列中的间插序列。例如，所述序列同源性可以是对于E3区域的任一侧以缺失整个E3区域。

或者，所述第二核酸分子可以更长并且包含异源(非腺病毒)DNA，例如在两个同源性区域(“同源臂”)之间包含一个或多个转基因。这导致所述第一核酸分子中的同源臂之间的缺失序列用所述第二核酸分子中的同源臂之间的异源DNA替换。这种方法通常与将一个或多个转基因插入本发明所述的载体中的方法一起进行，如下所述。

所述第一环状核酸分子可以是例如细菌人工染色体(BAC)、基于p15A起点的载体、基于pBR322起点的载体、fosmid、基于pUC起点的载体或基于ColE1起点的载体。然而，优选中等拷贝质粒，例如，p15A、pBR322、pR6K、pRK2、pBBR1和基于Inc的质粒，特别是基于p15A起点的载体。

合适的5’至3’外切核酸酶包括RecE²⁰和Redα³⁶。这些外切核酸酶分别与退火蛋白RecT和Redβ一起使用。RecE可以是全长的(SEQ ID NO：1412)或截短的形式(例如RecE588或RecE602)，如参考文献20(通过引用并入本文)中所述，或与全长或截短形式具有至少70％(优选至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％)序列同一性的蛋白质。优选Redα/Redβ系统。如果使用RecE，则优选截短的RecE。

在一些使用线性至环状同源重组(LCHR)生成载体以缺失所述腺病毒基因组的一个或多个区域的替代实施方式中，上述包含所述腺病毒序列的所述第一核酸分子是线性的(例如使用本文所述的LLHR克隆方法生成的环状核酸分子的线性化形式，其中所述第一核酸在具有重组能力的宿主细胞中体内线性化，或在体外线性化)，并且所述第二核酸以环状形式提供。本文所述的各种实施方式可以适用于该替代实施方式。

在一些实施方式中，如上所述，使用LLHR克隆的方法和使用LCHR缺失腺病毒基因组的一个或多个区域的方法在相同的宿主细胞中进行。在一些实施方式中，所述宿主细胞在诱导型启动子的控制下表达全长RecE，并且在一种或多种不同的诱导型启动子的控制下表达截短的RecE和/或Redα。另外，在这种实施方式中，所述宿主细胞还分别表达相应的退火蛋白RecT和Redβ。有利地，这种宿主细胞允许全长RecE/RecT系统和Redα/Redβ或截短的RecE/RecT系统的独立时间表达，使得所述的重组蛋白可以在需要它们的时间点被激活。

生成细胞的方法

本发明还提供一种生成如上文所定义的细胞的方法。该方法包括用DNA转化细胞，所述DNA编码并能够表达至少一个腺病毒E1区域，其选自SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25或27-32的腺病毒E1区域，或与其具有至少70％(优选至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％)同一性的序列。

通常，编码所述E1区域的DNA也编码选择标记(例如新霉素、嘌呤霉素、潮霉素等)。所述选择标记使得已稳定整合了携带E1区域的DNA的细胞可以被检测到。

用于表达所述E1区域的方式和所述选择标记包括例如IRES或启动子。

该方法还可以包括用编码并且能够表达Cre重组酶(登录号AccessionNo.P06956)或Flp重组酶(登录号Accession No.P03870)的DNA转化细胞。当需要辅助载体时使用这些细胞系。

插入转基因的方法

本发明提供将一个或多个转基因插入根据本发明所述的腺病毒载体或辅助载体(包括例如溶瘤或疫苗载体)中的方法。该方法可以与生成如上所述的腺病毒载体的方法结合进行。

在一个实施方式中，本发明提供将一个或多个转基因插入腺病毒载体或辅助载体中的方法，包括：

a)提供第一环状核酸分子，其包含选自SEQ ID NO：1-15和17-32的腺病毒序列，或例如包含选自SEQ ID NO：1-32和1411中任一个内的，或选自SEQ ID NO：1-15和17-32和1411中任一个内的，或选自SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25和27-32中任一个内的全长腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％(优选至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％)同一性的序列；

b)提供第二线性核酸分子，其与所述第一核酸分子共享至少两个序列同源性区域；和

c)使所述第一和第二核酸分子在5’至3’外切核酸酶和退火蛋白存在的情况下接触，使得所述第二核酸分子中同源性区域之间的序列被引入到所述第一核酸分子。

优选地，已使用上述LLHR直接克隆方法生成步骤a)中描述的第一环状核酸分子。因此，对于所述克隆方法描述的腺病毒序列和质粒载体的描述可以外推到本发明的这个方面。因此，本发明还提供了一种根据本文所述的质粒载体，其包含通过本发明的该方法获得或可通过其获得的经修饰的腺病毒基因组序列。

为了生产载体，所述腺病毒载体可以从所述第一环状核酸分子以线性形式释放，例如通过限制性消化。为了通过限制性消化释放所述基因组，所述环状核酸分子将在所述腺病毒序列的5’和3’端包含限制性位点。

所述方法还可以包括缺失部分腺病毒序列，如上文所讨论。

所述第二线性核酸分子可包含目标转基因，使得所述转基因在一个步骤中插入所述第一核酸分子中。或者，该方法可以是两步或多步过程，其中所述第二线性核酸分子包含例如选择标记，其在第一步中插入所述第一环状核酸分子中。然后进行第二步，其包括上述(a)至(c)，但用第三线性核酸分子代替第二线性核酸分子。所述第三线性核酸分子携带目标转基因，并且包含至少两个与中间环状核酸分子(其对应于包含从第二线性核酸分子插入的序列的第一环状核酸分子)具有序列同源性的区域。

在一些实施方式中，所述第二线性核酸分子上的至少两个同源性区域经设计以将转基因靶向至所述腺病毒基因组序列的E3区域。在一些实施方式中，插入转基因的同时导致所述腺病毒基因组序列(例如E3区域)内的序列缺失。在一些实施方式中，将所述转基因插入对应于所述腺病毒序列中缺失序列的区域，例如缺失的E3区域。在一些实施方式中，将所述转基因插入所述腺病毒序列中而不缺失任何腺病毒序列。

有利地，使用插入转基因的方法可以生成带标记的腺病毒载体。在一些实施方式中，所述第二线性核酸分子被设计为包含与腺病毒序列之间保守的区域同源的区域，例如E3区域中的保守区域，使得可以使用相同的质粒载体以高通量方式标记不同的腺病毒基因组。

合适的5’至3’外切核酸酶和退火蛋白包括上述用于生成本发明所述的腺病毒载体的方法中所使用的的那些。

在一些插入一个或多个转基因的替代实施方式中，上述包含所述腺病毒序列的第一核酸分子是线性的(例如使用本文所述的LLHR克隆方法生成的环状核酸分子的线性化形式，其中所述第一核酸在体内在具备重组能力的宿主细胞中被线性化，或在体外被线性化)，并且所述第二核酸以环状形式提供。本文所述的各种实施方式可以适用于该替代实施方式。

获得包装载体或溶瘤病毒的方法

所述腺病毒载体可以如上所述从环状核酸分子中以线性形式释放，并且所述DNA载体可以使用标准方法纯化。可以将所述线性DNA转染到靶细胞中用于载体扩增。如果所述载体是复制缺陷型，则所述细胞系将是如上所述的“病毒生产细胞系”，其补充腺病毒载体中缺失的一种或多种必需基因。如果所述载体是辅助依赖性的，则所述辅助载体也被转染到所述病毒生产细胞系中。

包装的载体或溶瘤病毒可以从所述细胞中获得，例如通过细胞裂解和使用标准方法的颗粒纯化。

辅助病毒可以从包装的高容量载体中分离，例如通过在氯化铯密度梯度超速离心和/或阴离子交换和尺寸排阻色谱。

筛选抗腺病毒治疗策略的潜在新药靶标的方法

本文公开的腺病毒文库也可用于筛选抗腺病毒治疗策略的潜在新药物靶标。目前，尚没有可用的抗腺病毒药物，并且由于缺少克隆的腺病毒基因组，迄今为止还没有用于针对多种不同血清型的药物筛选系统。为此目的，本发明基于本文公开的腺病毒文库构建了包含报告基因的腺病毒基因组序列。

因此，本发明提供一种选自SEQ ID NO：1-3、5-12、14-15和17-32的腺病毒序列，其包含一个或多个报告基因及其表达方式，并替换部分或全部E3区域。

合适的报告基因包括编码荧光蛋白的基因，例如绿色荧光蛋白(GFP)基因和/或荧光素酶基因。也可以插入多个报告基因，以便可以进行不同的测定。因此，这些报告基因可以鉴定所述腺病毒的向性，因为它们可用于确定该腺病毒在来源于不同组织的细胞系中的感染性水平。

本发明还提供一种包含这种序列的载体。优选地，携带上述序列的载体是中等拷贝质粒，例如p15A、pBR322、pR6K、pRK2、pBBR1或基于Inc的质粒。特别优选的是具有p15A来源的质粒。

在一个实施方式中，本发明提供一种筛选潜在抗腺病毒药物的方法，包括：

a)如上所述，在存在和不存在目标药物的情况下，用包含一个或多个报告基因及其表达方式的载体感染细胞；

b)在存在和不存在所述药物的情况下检测所述报告基因产物的表达水平；和

c)在存在和不存在药物的情况下，比较所述报告基因产物的表达水平。

在存在与不存在所述药物的情况下报告基因产物的相对表达水平给出了所述药物是否降低腺病毒感染性(即具有抗腺病毒活性)的指示。如果相对于所述药物不存在时，在存在所述药物的情况下表达水平降低，则表明在存在所述药物的情况下感染性较低，因此表明受试药物可能具有抗腺病毒活性。

上述方法可用于高通量药物筛选。

在本文公开的各个方面的一些实施方式中，所述腺病毒序列不是来源于选自B3、B11、B35、C5和D26的腺病毒中的至少一种(例如，1、2、3、4或全部5种)的序列。例如，在本文公开的各个方面的一些实施方式中，所述腺病毒序列不是来源于选自B11、B35和C5的腺病毒中的至少一种(例如，1、2或全部3种)的序列。例如，在本文公开的各个方面的一些实施方式中，所述腺病毒序列不是来源于选自B3、B35和C5的腺病毒中的至少一种(例如，1、2或全部3种)的序列。例如，在本文公开的各个方面的一些实施方式中，所述腺病毒序列不是来源于C5腺病毒的序列。然而，在本发明的各个方面的一些实施方式中，本发明确实扩展到来源于选自B3、B11、B35、C5和D26的腺病毒中的至少一种(例如，1、2、3、4或全部5种)的腺病毒序列。

附图简要说明

图1–野生型腺病毒扩增和病毒基因组分离的示意图

a)来自临床分离的野生型人类腺病毒首先在个体感受态细胞系(50～80％汇合，2％FBS)中预先扩增，所述细胞系经历反复的侵染循环，以实现90％的细胞病变效应(CPE)。然后每种病毒在10-20个15cm组织培养皿中大规模扩增。使用粗细胞裂解物通过CsCl梯度纯化病毒，随后进行病毒基因组分离和序列验证。

b)通过琼脂糖凝胶观察到的不同腺病毒类型的基因组分离。

图2–通过LLHR直接克隆(HTC)腺病毒基因组

a)通过LLHR直接克隆腺病毒基因组的原型策略。穿梭载体p15A-cm-adHA通过将共享的末端同源臂(HA)的四个DNA片段共电穿孔到表达RecET的大肠杆菌菌株GBred-gyrA462中进行构建，所述大肠杆菌菌株在DNA回旋酶的GyrA亚基中具有R462C突变，此突变赋予所述菌种对CcdB的表达抗性。最终载体p15A-cm-AdV通过在表达RecET的大肠杆菌菌株GBred中的第二个LLHR步骤生成，在所述步骤中将所述线性化穿梭载体和线性双链腺病毒DNA(线性dsDNA)共电穿孔至所述大肠杆菌菌株。通过使用NdeI和BamHI限制性消化将环状质粒线性化。

b)在四个实验设置中使用不同量的PCR产物进行穿梭载体构建的重组工程效率。

c)使用不同量的病毒基因组DNA(0至1μg)和1μg线性化穿梭载体进行病毒基因组克隆的重组工程效率。误差线，s.d.；n＝3。

d)基于单次PCR的腺病毒基因组克隆。通过单次PCR修饰质粒p15A-cm-MCs2.0生成载体骨架p15A-cm。通过引物设计将～50bp同源臂(HA)并入个体腺病毒基因组中。

e)基于细胞/病毒裂解物的直接Ad基因组克隆。将从细胞/病毒裂解物中分离的DNA混合物或者临床样品代替纯化的腺病毒基因组进行共同电穿孔。

f)左栏：拯救工程化腺病毒的策略。用于不同的病毒拯救策略的基于限制酶(RE)消化的不同分子形式。右栏：DNA转染到感受态细胞后基因组释放状态对病毒拯救效率的影响。Y轴表示从每次传代后收集的细胞/病毒裂解物中分离的病毒基因组拷贝数。X轴是转染后的传代数。dd，通过双消化释放完全暴露的腺病毒基因组；sc，通过单切释放的线性化腺病毒基因组；p，环状质粒。Amp，氨苄青霉素；cm，氯霉素；ccdB，反向选择标记物。

图3–腺病毒基因组标记和体外/体内表征

a)通过线性-环状同源重组(LCHR)进行高通量腺病毒基因组标记的策略。首先通过整合spect盒来缺失E3区域，然后用多顺反子/三重表达盒(GLN)替换。

b)标记的腺病毒的体外表征。将不同腺病毒类型的转基因表达效率与常用的Ad5进行比较，并表示为倍数变化。通过添加furimazine底物测量荧光素酶表达，并用发光单位(RLU)表示。

c)标记的腺病毒在转基因小鼠中的生物分布研究。

图4–用于腺病毒基因组标记的重组工具包，包括质粒图谱和pR6K-spect-adapter和pR6K-GLN的序列

a)pR6K-spect-adapter用作PCR模板以扩增选择标记物壮观霉素腺苷转移酶(spect)，其侧翼为与报告盒GLN相同的同源臂(HAR和HAL)(如b所示)。EcoRI限制酶消化释放PCR模板。R6K骨架用于避免质粒污染。

b)pR6K-GLN提供通过EcoRI限制酶消化并释放的报告基因盒GLN。在ybcC基因座2处携带阿拉伯糖诱导型gbaA操纵子(redγ、redβ、redα和recA)的大肠杆菌菌株GB05-Red介导高效LCHR。大肠杆菌菌株GBred-gyrA462由GB05-Red生成，其Arg462编码密码子CGT被改变为Cys编码密码子TGC，使得该菌株对CcdB表达产生抗性³⁷。本研究中使用的所有质粒图谱均用SnapGene软件创建。

图5–研究天然腺病毒多样性和生成工程化腺病毒文库(包括标记病毒基因组)的完整途径概述

该过程从野生型腺病毒在各感受态细胞系(例如HeLa、HEK、A549)中扩增开始。在病毒体纯化后，分离腺病毒基因组DNA并通过测序和限制酶消化验证。穿梭载体p15A-cm-adHA根据序列鉴定结果通过计算而设计，并将含有同源臂(HA)的四个DNA片段彼此共电穿孔到表达RecET的大肠杆菌菌株中通过发生LLHR来构建。在下一步中，将上述腺病毒基因组通过LLHR引入到含有在各ITR端含有HA的线性化的所述穿梭载体中。将携带腺病毒基因组的经过序列验证的质粒收集在一起构建工程化的腺病毒文库。进行拯救实验证明克隆的腺病毒基因组的完整性。基因GFP/LUC的标记由线性-环状同源重组(LCHR)介导。首先通过整合ccdB-Amp盒缺失E3区域，然后将其替换为表达Turbo Green荧光蛋白和NanoLuc荧光素酶(tGFP-Nluc)的P2A肽介导的双顺反子表达盒以生成p15A-cm-AdV-tGFP-Nluc。标记的腺病毒AdV-delE3-tGFP-Nluc可以在其感受态细胞系中重建并在体内进一步评估。

图6–克隆的腺病毒的基因组组织结构

图7–HCAdV-CRISPR/Cas9途径(1)

在构建型或诱导型启动子的控制下，将可被表达的三种向导RNA和Cas9编码序列克隆到穿梭载体中。

图8–HCAdV-CRISPR/Cas9途径(2)

在构建型或诱导型启动子的控制下，将可被表达的三种向导RNA和Cas9编码序列克隆到高容量腺病毒载体中。

图9–HCAdV-CRISPR/Cas9途径(3)

含有CRISPR/Cas9机制的高容量腺病毒载体的生产。

图10–用于构建腺病毒-睡美人转座子杂交载体的重组工程方案

在将目标基因克隆到穿梭载体pHM5-FRT-IR中后，可以通过重组工程将其转移到高容量腺病毒载体中。

图11–HAdV17在体外具有内皮细胞向性

A.体外细胞系筛选。在感染前一天将HEK293、A549、Hela、Huh7、Jurkat、MMDH3、SKHep、SKOV3和EA.hy926细胞接种在24孔板中。当90％呈汇合状时，用HAdV5GFP和HAdV17GFP以各种感染复数(每个细胞0.1、1、10或100)转导细胞2h。在感染后24h通过FACS分析GFP表达。未感染细胞(阴性对照)用于将背景域设定为大约1％。得出GFP阳性细胞的百分比。

B.野生型HAdV17和HAdV5之间的生长曲线比较。在感染前一天将HEK293、A549、Hela和EA.hy926接种在24孔板中。当80％呈汇合状时，用野生型HAdV5和HAdV17以感染复数(MOI)为10转导细胞。在不同时间点(2、10、24、48、72小时)收获细胞，并在细胞内DNA分离后进行定量PCR以检测病毒复制。

C.通过定量PCR进行病毒内化分析。用HAdV5GFP和HAdV17GFP以MOI为0.1、1、10、100在24孔板中对HEK293、A549、Hela和EA.hy926感染2h。然后用5％胰蛋白酶处理细胞3min，以500g离心3min并用DPBS洗涤两次以确保仅分析内化的病毒颗粒。提取总细胞DNA(包括腺病毒DNA)，并进行定量实时PCR以检测病毒基因组。数据点代表基于三次独立实验(n＝3)的平均标准误差。

图12–原代人脐静脉细胞(HUVEC)的转导

原代人脐静脉细胞(HUVEC)的转导。以不同的感染复数(每个细胞0.1、1、10或100)用HAdV5GFP和HAdV17GFP转导原代HUVEC 2小时。(A)GFP阳性细胞数和(B)在感染后24h通过FACS分析平均荧光强度。未感染细胞(阴性对照)用于将背景域设定为大约1％。(C)直方图显示通过流式细胞术检测HEK293、HeLa、EA.hy926和HUVEC上的表面标记物hCAR。(D)细胞表面上CAR表达的平均荧光强度的定量。HeLa、EA.hy926和HUVEC细胞用标记有FITC的抗CAR抗体染色，并通过流式细胞术测量。作为阴性对照，每个细胞系进行了不补充一抗的培养。数据点代表平均标准误差(n＝3)。

图13–通过功能获得研究验证依赖于CD46和HAdV17纤维之间相互作用的内皮向性

(A)并入HAdV5衣壳的嵌合纤维蛋白和嵌合纤维基因(突结、轴突和尾)结构的示意图。白色代表来源于HAdV5GFP的纤维，黑色代表来源于HAdV17GFP的纤维。HAdV5GFP/17knob含有来自HAdV5的轴突和尾以及来自HAdV17的突结。HAdV5GFP/17fiber含有来自HAdV5的尾以及来自HAdV17的轴突和突结。(B)在感染前一天将HEK293和EA.hy926细胞接种在24孔板中。当90％呈汇合状时，用HAdV5GFP、HAdV5GFP/17fiber、HAdV5GFP/17knob和HAdV17GFP以各种感染复数(每个细胞0.1、1、10或100)转导细胞2h。在感染后24h通过FACS分析GFP表达。未感染细胞(阴性对照)用于将背景域设定为大约1％。百分比表示GFP阳性细胞的百分比。MFI＝平均荧光强度。数据点代表平均标准误差(n＝3)。

图14–HAdV17GFP载体的体内生物分布

将CD46转基因小鼠和野生型小鼠以每只小鼠2x10⁹个转导单位全身施用HAdV17GFP，在72小时后收获的各种器官(肝脏、心脏、肺、动脉、肾脏、胰腺、脾脏、肠和脑)中通过实时定量PCR检测病毒基因组。将HAdV5GFP施用于野生型小鼠作为对照(每组n＝3只小鼠)。

图15–肝切片的免疫荧光分析

在注射载体3天后处死小鼠，并切除肝脏用于组织学分析。(A)顶栏显示病毒转基因(GFP)表达(绿色)与注射了HAdV17GFP的CD46转基因小鼠的内皮标记物(CD31，红色)的共定位。所呈现的图像为20X放大率下的单一染色和合并图像。图像比例尺为100μm。

从顶部开始的第4栏来自注射HAdV17GFP的野生型小鼠。从顶部开始的第5栏为来自注射HAdV5GFP的野生型小鼠。PBS处理的转基因小鼠(从顶部开始的第3栏)和PBS处理的野生型小鼠(从顶部开始的第6栏)是对照。从顶部开始的第2栏是来自注射HAdV17GFP的未经CD31一抗处理的CD46转基因小鼠。(B)从顶部开始的第7和第8栏是第一栏的更高放大率(60x)的视图。图像代表多个视野。图像比例尺为25μm。

图16–HadV17的中和抗体测定

(A)将稀释倒数的HAdV-5免疫的狗血清用HAdV17GFP和HAdV5GFP培养。血清-病毒混合物用于感染HEK293细胞，并在感染后24小时，测定GFP表达水平。(B)患者中预先存在的对HAdV17的免疫力。在来自19名患者的血清样品中进行转导测定。如果与无血清对照相比，观察到转导减少超过90％(低于10％残留转导)，则认为样品被中和。

图17–实施例3中使用的不同病毒载体的示意结构

(A)构建第一代p15a-HAdV17GFP的ccdB重组工程图。(B)具有来自HAdV17的突结或纤维的假型化HAdV5GFP的示意性结构。

图18–使用质粒pIRES-neo基于HEK293和A549细胞生成稳定的互补细胞系

(A)通过PCR扩增来自HAdV17(2808bp)的E1盒并连接到pIRESneo3(clontech)的多克隆位点以构建载体pCMV-HAdV17E1-IRES-neo。(B)以进行亚甲蓝染色以标记阳性细胞克隆。(C)对细胞克隆进行PCR和RT-PCR分析。从每个细胞克隆中分离基因组DNA，并在dH₂O中洗脱。分离总RNA并重悬于无RNase的H₂O中。进行逆转录，并取5μl cDNA用于PCR。设置不含逆转录酶的阴性对照。

图19–通过流式细胞术显示的在各种细胞系中hCAR和CD46表面标记物的表达水平直方图

将0.5×10⁶个细胞(HEK293、A549、HeLa、EA.hy926、MMDH3和HCT116)用补充有1％BSA的PBS洗涤，离心(1500g，3min)，并重悬于100μl PBS/BSA和2.5μl抗hCAR抗体(SantaCruz，sc-56892)中，随后在4℃培养1小时。然后用PBS/BSA再次洗涤细胞以除去未结合的抗体，重悬于100μl PBS/BSA和0.5μl APC标记的山羊抗小鼠二抗(Santa Cruz，sc-3818)中，并在4℃连续摇动培养1.5小时。然后用PBS/BSA再次洗涤细胞，最后重悬于400μl PBS中用于流式细胞术(使用FACS(BD))。作为阴性对照，培养各个细胞系而不补充一抗。数据点代表平均标准误差(n＝3)。

图20–一组人肿瘤细胞中报告子标记的人类腺病毒文库的高通量筛选(HTS)

在一组疾病特异性细胞系中测试不同腺病毒类型(Ad型号)的转基因表达效率。将表达水平与常用的5型腺病毒(Ad5)进行比较，并表示为倍数变化。通过添加Furimazine底物测量荧光素酶表达并表示为相对光单位(RLU)。除在A549和MG-63中误差线代表平均值±SEM以外，在所有其他细胞系中，其代表平均值±SD。

图21–高通量筛选(HTS)以鉴定骨肉瘤细胞中具有高溶瘤效力的病毒候选物

(A)两种骨肉瘤细胞系的转导。在三次独立实验中施加200vp/细胞。误差线表示标准误差。通过双尾非配对t检验分析数据。如果没有另外说明，与Ad5相比，分析的病毒类型的P值<0.05。NS，不显著；vp，病毒颗粒。

(B)三种骨肉瘤细胞系中的病毒内化效率。用2,000vp/细胞的单个病毒感染细胞3小时以确定病毒基因组拷贝数(VCN)，其通过qPCR定量并表示为每10ng总DNA的VCN。误差线代表平均值±SD。每组n＝3。通过双尾非配对t检验分析数据。如果没有另外说明，与Ad5相比，分析的病毒类型的P值>0.05。*，显著(p<0.05)。

(C)感染后2天GFP表达的可视化。以每个细胞1,000个病毒颗粒(vp)感染细胞。

(D)活细胞的结晶紫染色用于评估感染后7天的溶瘤活性。

图22-高通量筛选(HTS)以鉴定具有高溶瘤效力的病毒候选物

在A549细胞中进行溶瘤测定作为溶瘤测定对照。活细胞的结晶紫染色用于评估感染后7天的溶瘤活性。

图23-以每细胞2000个病毒颗粒(vp/c)感染的RG2[D74]细胞系中不同腺病毒类型(Ad型号)的转基因表达效率

尽管没有显著性，但Ad5、Ad21和Ad37显示了高荧光素酶(26hs p.i.)和GFP表达(2ds p.i.)。所有三种病毒都达到了大致相同的效率维度。此外，Ad20达到了Ad5效率的20％以上。通过添加Furimazine底物测量荧光素酶表达并表示为相对光单位(RLU)。将转基因表达水平与常用的5型腺病毒(Ad5)进行比较，并表示为倍数变化。误差线表示平均值的标准误差(SEM)。通过双尾非配对t检验分析数据。如果没有另外说明，与Ad5相比，分析的病毒类型的P值<0.05。“NS”表示“不显著(p>＝0.05)”。

关于本发明的进一步描述请参考以下非限制性实施例：

实施例

实施例1–克隆腺病毒基因组

野生型(WT)腺病毒的临床分离物经过连续扩增步骤在感受态细胞系(例如HeLa、HEK、A549)中扩增。大规模扩增后，通过氯化铯梯度纯化腺病毒(图1)。为了验证腺病毒类型，进行多重六邻体特异性PCR并确认其DNA序列。分离纯化后的腺病毒颗粒的病毒基因组(图1)，并如图2所示应用LLHR直接克隆分离到的病毒基因组。我们首先建立了一种快速可靠的策略，基于一步完成4个PCR片段的退火，生成用于直接腺病毒基因组克隆的主克隆。这些具有用于定向克隆的同源臂(HA)的PCR片段含有5’和3’ITR序列、用于高级阳性和反向选择的已发表的选择标记ccdB10和氨苄青霉素、具有p15A复制起点和氯霉素抗性基因的质粒骨架(图1)。上述PCR产物在不同的比例下进行了测试，并在表达RecET的大肠杆菌菌株中进行同源重组(HR)后，得到新的中等拷贝质粒p15A-cm-adHA。其中当4个PCR片段等量时获得最高的克隆效率(图2b)。

接下来，分离到的线性腺病毒基因组使用LLHR克隆到该质粒中。图2c显示了使用不同量的病毒DNA(0至1μg)和1μg线性化穿梭载体的直接病毒基因组克隆的重组工程效率。用于直接克隆大dsDNA病毒的质粒骨架含有p15A复制起点，其导致克隆效率显著提高，并且与常用的细菌人工染色体(BAC)相比更容易处理。由于许多病毒基因组在其ITR序列中显示出高度的序列同源性，因此可以同时使用含有相同HA的相同穿梭载体p15A-cm-adHA克隆病毒基因组。仅需50bp HA，可实现快速可靠的直接HTC。相同的策略也用于腺病毒种类D、B2和C。

所有克隆的腺病毒基因组的完整性通过诊断性限制酶消化来查验，并与来自病毒体的最初分离的腺病毒基因组进行比较(图2)。所有含腺病毒质粒的确切序列由NGS进行确定。本发明进行了广泛的拯救实验，并通过测试不同的分子形式(精确切除腺病毒基因组、含有线性化腺病毒的质粒和含有环状腺病毒基因组的质粒)来优化策略(图3)。在将病毒DNA导入腺病毒感受态细胞系后，通过定量PCR(qPCR)在超过5个连续传代步骤中监测病毒复制，并从质粒中精确切除腺病毒DNA分子通常足以拯救Ad腺病毒。该策略随后应用于所有克隆的人类腺病毒。

为了进一步探索克隆的人类腺病毒文库，病毒基因组用2A肽介导的多顺反子表达盒(GLN，SEQ ID NO：227)进行了标记，其中GLN提供了TurboGFP荧光蛋白作为体外标记、NanoLuc荧光素酶用于体内研究和卡那霉素/新霉素作为选择标记。如图3中所示意性概述的，LCHR用于将标记物插入文库中克隆的腺病毒基因组的早期基因E3区域。在第一步中，通过HR将大肠杆菌菌株GB05-Red中的壮观霉素腺苷酰转移酶插入腺病毒基因组中，随后进行GLN克隆。通过使用E3区域中的保守区域，可以针对不同腺病毒类型使用相同的穿梭载体以高通量方式标记不同的腺病毒基因组(图4)。在感受态细胞系中拯救标记的腺病毒。

腺病毒的标记使得能够在体外和体内表征所选择的腺病毒类型。感染来源于不同器官(上皮、内皮、肌肉、血液、肝脏)的不同细胞类型的细胞系并测量荧光素酶和GFP表达后，标记的腺病毒显示出不同的向性(图3)。通过将标记的HAdV-B3、HAdV-B16、HAdV-B50、HAdV-C5和HAdV-E4系统性注射到C57Bl/6小鼠中分析体内向性。如图3所示，通过转基因表达水平和病毒基因组水平所检测，病毒也显示出明显的生物分布。图5显示了研究天然腺病毒多样性和生成工程化腺病毒文库(包括标记病毒基因组)的完整途径的总结。

实施例1和其他实施例的方法

细胞培养-人Hela细胞、A549细胞、HEK293和EA.hy926细胞在补充有10％FBS(GEHealthcare)、100U ml-1青霉素(PAN BIOTECH)和100μg ml-1链霉素(PAN BIOTECH)的高葡萄糖Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(DMEM，PAN BIOTECH)中培养。对于人肝细胞Huh7，添加非必需氨基酸(NEAA)。对于Jurkat细胞，使用补充有10％FBS、100U ml-1青霉素和100μg ml-1链霉素的基于RPMI-1640的培养基。对于鼠细胞系Neuro2a(N2a)细胞，使用补充有10％FBS、100U ml-1青霉素和100μg ml-1链霉素的Eagle’s最低必需培养基(EMEM，GEHealthcare)。对于鼠成肌细胞C2C12细胞，使用补充有10％FBS、100U ml-1青霉素和100μgml-1链霉素的DMEM。

野生型腺病毒–HAdV-C5(VR5^TM)菌株和HAdV-F41(VR930^TM)获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。HAdV-A12、-A18、-A31、-B3、-B16、B21、-B11、-B14、-B35、-C6、-D9、-D10、-D13、-D17、-D20、-D24、-D25、-D26、-D27、-D33、-D37、-D69和-E4是获自德国慕尼黑Ludwig-Maximilians-University的Max vonPettenkofer-Institute(病毒学系)诊断组的临床分离株。HAdV-B7、-B50、-B34、-C1、-C2、-D8和-G52由德国汉堡的Heinrich Pette Institut(HPI)友情提供。

Ad扩增、纯化和滴定–来自临床分离株的WT人类腺病毒首先在具有连续感染环的单独的感受态细胞系(50～80％汇合)中预扩增，以实现90％细胞病变效应(CPE)。每种病毒在10-20个15cm组织培养皿中大规模扩增。使用补充有2％FBS的DMEM用于病毒扩增。粗细胞裂解物通过CsCl梯度超速离心法(Beckman Coulter)，和随后的一次性PD-10脱盐柱(GEHealthcare)脱盐来纯化病毒。将纯化的病毒等分并在-80℃储存以备进一步使用。通过测量260nm处的光密度来确定腺病毒颗粒浓度并以每毫升的病毒颗粒(VPs)表示。

从病毒体中分离腺病毒基因组DNA–为了克隆病毒基因组，通过添加蛋白酶K，随后进行苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀，从纯化的颗粒中提取病毒基因组DNA。分离病毒基因组DNA的详细方案见于实施例7。为了确认基因组水平上的腺病毒类型，使用扩增病毒基因组的六邻体区域的引物对hexon-fwd(ATGGCCACCCCATCGATGATGC)和hexon-rev(TTATGTGGTGGCGTTGCCGGCC)进行多重PCR和测序。为了验证用于以下同源重组工程步骤的腺病毒基因组的末端序列，将引物设计为可以读入ITR区域。

质粒构建–p15A-cm-MCS；P15A-AMP-ccdB；pR6K-spect-adapter；pR6K-GLN；线性-线性同源重组(LLHR)介导的腺病毒基因组克隆。线性-环状同源重组(LCHR)介导的腺病毒基因组标记。

PCR-用高保真DNA聚合酶(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)根据制造商方案进行含有同源臂(HA)的长引物介导的PCR。值得注意的是，仅使用引物结合序列(～20bp)来计算退火温度。用SV凝胶和PCR Clean-Up System(Promega，Mannheim，Germany)纯化并在ddH2O中洗脱的PCR产物用于电穿孔。根据制造商的标准方案使用2X Master Mix(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)检查病毒重建和扩增。

NGS和生物信息学分析-对于质粒的测序，将200ng纯化的DNA进行标准IlluminaDNA文库制备。简而言之，DNA用酶剪切(NEBnext dsDNA Fragmentase，New EnglandBiolabs)。在XP珠纯化(Beckman Coulter)后，将末端抛光并添加A(A尾)并连接通用衔接子(Ultra Directional DNA Library Prep Kit，New England Biolabs)。对于衔接子连接，使用定制衔接子(衔接子-Oligo 1：5’-ACA-CTC-TTT-CCC-TAC-ACG-ACG-CTC-TTC-CGA-TCT-3’，衔接子-Oligo 2：5’-P-GAT-CGG-AAG-AGC-ACA-CGT-CTG-AAC-TCC-AGT-CAC-3’)。连接后，通过XP珠纯化(Beckman Coulter)去除衔接子。在接下来的PCR富集中进行样品索引(15个循环)。对于Illumina流通池生产，将样品等摩尔合并并分布在两个Illumina MiSeq流动池上进行300bp配对末端测序。Illumina TruSeq衔接子和低质量区域(phred质量<20)用要求最小长度为50bp的cutadapt修剪。将修剪的读数用BWA定位到载体的参考序列上，并丢弃完全由载体序列组成的读数，而保留不含或仅含有部分载体序列的读数。每个腺病毒数据集也使用相应的GenBank序列作为锚使用IVA从头组装。基于序列的数量、总长度和在组装序列的侧翼处的载体序列的存在来选择更好的组装。用BLAT鉴定剩余的载体序列，并用内部Perl脚本除去，并根据相应的GenBank参考序列定向最终组装的序列。编码序列(CDS)的注释用Glimmer分两步完成。首先，将来自GenBank的已知腺病毒CDS与使用exonerate的组装序列进行比较。得到的比对作为Glimmer的训练集，然后预测最终的CDS区域。CDS的功能鉴定是基于针对来自GenBank的已知腺病毒蛋白序列的BLASTP。为了使NGS获得的腺病毒序列与它们各自的GenBank参考序列比对和可视化，我们使用zPicture程序(网页：http://zpicture.dcode.org/)。用BLASTZ进行腺病毒序列和GenBank参考之间的序列比对。作为临界值，我们使用99％的最小序列同一性，其最小化假阳性比对，但仍允许研究腺病毒序列和相应的GenBank参考之间的单核苷酸变体。使用具有默认参数的clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)生成保守E3和ITR序列的多序列比对，并且为了可视化对齐序列中的保守程度，我们使用WebLogo(网页：http://weblogo.berkeley.edu/ logo.cgi)。

质粒DNA转染和病毒拯救–10μg含有基于p15A的腺病毒基因组的质粒用两种限制酶(PmeI/SbfI或PacI/SwaI)的组合消化，释放腺病毒骨架，或用限制酶I-SceI消化，线性化基于p15A的Ad基因组。为了纯化和浓缩消化的DNA，对用PmeI/SbfI和PacI/SwaI消化的DNA进行乙醇沉淀，对I-SceI消化的DNA进行苯酚-氯仿提取，随后进行乙醇沉淀。

将A549细胞接种在6孔板中，并在50-80％汇合时，根据制造商的方案，使用Superfect转染试剂(Qiagen)转染3μg消化的病毒DNA。24-48hr后，当细胞生长至高达>90％汇合度时，将培养基更换为2％FBS补充的DMEM。将细胞培养维持长达两周，直至观察到细胞病变效应(CPE)。如果没有获得CPE，则收集细胞/病毒裂解物，并使用1/2或1/3的裂解物在90-95％汇合时感染一个A549细胞的新孔。为了从感染的细胞中释放病毒，将粗裂解物在液氮和37℃水浴中进行三次冷冻/循环。收集一小份细胞用于qPCR分析。

qPCR分析-为了监测拯救期间的病毒复制，使用CFX96Touch^TM实时PCR检测系统(Bio-Rad)进行定量实时PCR(qPCR)。先前描述的与腺病毒的六邻体结合的引物对和探针(Damen,M等人，2008，JoCM)用于确定感染细胞中腺病毒基因组的拷贝数。PCR基于以下程序：在95℃预培养/活化5min，在40个循环(95℃持续15s，60℃持续30s)期间进行扩增和数据收集。Fast^TMProbes Supermix(Bio-Rad)用于这些PCR。

标记的腺病毒在体外和体内的表征–所有重建的GLN标记的病毒通过分离的腺病毒基因组的hexon-PCR证实。通过测量260nm处的光密度来确定腺病毒颗粒浓度并表示为病毒颗粒(vps)/毫升。

Nano-Glo荧光素酶测定–将单个测试的细胞在96孔组织培养板中培养至汇合，并用不同的病毒颗粒(VP)/细胞感染。感染后26h用Nano-Glo测定系统(Promega)测量NLuc活性，并用平板读数器(Tecan)检测发光。

通过内化测定测量的基因组摄取-为了量化细胞进入效率，使用确定数量的腺病毒颗粒(vp)感染预接种的肿瘤细胞并培养2小时。消化细胞单层并用胰蛋白酶冲洗，随后用PBS充分洗涤。通过在含有0.5％SDS和0.5mg/ml蛋白酶K的TE缓冲液(10mM Tris-HCl，10mMEDTA，pH 8.0)中培养来提取基因组DNA。随后进行酚-氯仿提取和乙醇沉淀。为了监测病毒基因组摄取效率，用定量实时PCR(qPCR)检测转基因(GLN基因盒)。

最有前景的腺病毒候选物的溶瘤测定-在24孔板中进行溶瘤测定。用新制备的单个腺病毒的10倍稀释系列感染预接种的癌细胞。每天检查细胞病变效应(CPE)，直到至少一种病毒在一个平板上的最低剂量下显示CPE或直至最大14天。首先用3.7％甲醛固定细胞，然后用结晶紫溶液染色。

统计–使用Microsoft Excel进行统计分析。通过Student单尾t检验(假设方差相等)评估实验差异。

实施例2–基因注释

使用Gene Locator和Interpolated Markov ModelER(Glimmer)³⁸预测基因。对于每个已测序的基因组，将来自GenBank的相应参考序列的已知基因的蛋白质序列与组装基因组序列用exonerate³⁹比对。然后使用最佳命中的坐标(coordinate)构建Glimmer模型，该模型随后用于预测已测序的基因组中基因的位置和方向。

接下来，比较病毒基因组之间的蛋白序列。该分析的结果在图6中给出。图6显示了28种已测序的人腺病毒的基因组组织结构。基因及其方向在基因组的两条链上显示为灰色阴影形状(实线)。所有基因组都显示了哺乳动物腺病毒属的典型组织结构。

基因的阴影反映了它通过全对比Blast分析所确定的所有28种病毒的最大序列差异。

实施例3–人类腺病毒D17的细胞向性

基于人类腺病毒D17的新的第一代腺病毒根据实施例1所示的重组工程技术构建，其中用绿色荧光蛋白(GFP)标记物进行标记。早期E1基因在HAdV17载体中缺失，并构建了相应的E1缺失的GFP标记的HAdV5载体用于比较。

在互补的表达E1的稳定细胞系中拯救病毒，然后通过荧光激活细胞分选(FACS)分析和定量PCR针对一组不同细胞系筛选病毒。本研究发现HAdV17对内皮细胞具有向性，而内皮细胞通常对HAdV5感染难以控制。使用原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进一步验证了这一发现。

用基于可溶性重组纤维突结阻断试剂^40,17(5knob、17knob、JO4、Augmab)的竞争测定来表征受体与这些载体在体外的相互作用。本研究发现HAdV17可以利用CD46(在所有有核细胞上表达的膜辅因子蛋白)和CAR(柯萨奇病毒和腺病毒受体)作为细胞附着受体。其内皮细胞向性为CD46依赖性，并且可被CD46阻断试剂Augmab所阻断。

在将重组病毒静脉内注射到正常小鼠和CD46转基因小鼠中后，进行体内生物分布分析。这些研究显示，与正常小鼠相比，CD46转基因小鼠的各种器官中的载体基因组拷贝(VCN)显著增加，这表明CD46作为受体参与其中。通过定量PCR(qPCR)和免疫组织学分析证实了这些结果。

中和抗体测定揭示，与人类中的HAdV5相比，HAdV17的血清阳性率较低。

因此，可以使用hCAR和CD46作为受体并显示内皮细胞向性的基于HAdV17的载体在内皮疾病的基因治疗中很有前景。

另参见图11-19。

实施例4–使用高容量腺病毒载体递送CRISPR/Cas9系统的所有组分

本发明生成了一种新的CRISPR/Cas9穿梭质粒工具箱，其含有使用构建型或诱导型启动子的Cas9核酸酶基因，和gRNA表达单元。该工具箱允许在一个步骤中将所有CRISPR/Cas9组分克隆或重组到HCAdV基因组中。为了使用几个gRNA表达单元来复用CRISPR/Cas9系统，可以容易地包括其他gRNA表达单元。为了实现重组CRISPR-HCAdV基因组的快速装配，本发明使用了DNA重组工程将所有CRISPR/Cas9表达单元引入细菌人工染色体pBHCA中包含的HCAdV基因组中。为了将多个gRNA表达单元插入HCAdV基因组中，将已建立的pAdV-FTC质粒与归巢核酸内切酶定向克隆一起使用。使用缩短的扩增和纯化步骤生成CRISPR-HCAdV。

该工具箱用于产生几种CRISPR-HCAdV，其携带对不同靶标(包括hCCR5、hDMD及HPV16-和HPV18-E6基因)特异的单一和多重gRNA单位，以在短时间内产生足够的效价。T7E1测定⁴¹用于证明CRISPR/Cas9介导的各靶标的切割。用各自对应的CRISPR-HCAdV感染培养的人细胞产生了有效的位点特异性基因编辑。

总之，这个新平台能够在短时间内为单一或多重方法定制、克隆和生产CRISPR-HCAdV载体。它仅使用一种单一病毒载体简化了CRISPR/Cas9机制的递送。诱导型Cas9表达有助于避免在载体生产期间靶向生产细胞系的基因组，并且可能对不需要的组成型表达的特殊方法有益。

实施例5–由新型基于人腺病毒6型的载体介导的增强的溶瘤活性

大多数现有的溶瘤腺病毒(AdV)基于人类AdV 5型(hAdV-5)。基于溶瘤病毒的hAdV-5的临床功效受到不同肿瘤细胞中柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)的可变表达水平以及复制速率不足的限制。另外，针对hAdV-5的中和抗体的高流行性导致了较低的效率，使得hAdV-5不是一个适合的全身应用候选物。最近的研究突出显示了人腺病毒6型(hAdV-6)作为溶瘤和疫苗载体是一个有前景的候选物。因此，基于hAdV-6开发新型溶瘤AdV可有助于克服这些限制。如先前对hAdV-5³¹的讨论那样，可通过RNAi抑制蛋白P19的表达来增强候选病毒的溶瘤功效。在该实施例中，一种新型的基于hAdV-6且含P19的溶瘤腺病毒作为溶瘤应用的候选在不同的肿瘤细胞系中进行了评估。

一种含有P19的基于hAdV-6的病毒(hAdV-6FP19)通过新型无缝重组工程技术克隆获得(见实施例1)。为了使来自腺病毒载体基因组的P19获得表达，P19cDNA通过内部核糖体进入位点(IRES)与晚期纤维基因融合。对应的重组腺病毒基因组从含有完整DNA分子的质粒中释放后，将线性化的病毒DNA转染到HEK 293细胞中用于病毒重建。在通过病毒特异性PCR监测的初始扩增步骤后，使用氯化铯密度梯度超速离心进行放大和病毒纯化。拯救和扩增效率与常用的基于hAdV-5的载体相当。

将不同来源的各种癌细胞系用于进行溶瘤测定，包括：A549(肺癌)、HCT 116(结肠癌)、HeLa(宫颈癌)和Huh7(肝细胞癌)。以各种感染复数(MOI)用hAdV-6FP19、hAdV-6和hAdV-5感染细胞。感染后2至3天，将细胞固定并用亚甲蓝染色。与相同MOI的hAdV-5和6相比，hAdV-6FP19感染的细胞观察到高得多的细胞裂解(高达100倍)。与野生型病毒相比，更高的hAdV-6FP19细胞裂解率存在于所有评估的细胞系中，这表明hAdV-6FP19具有显著增强的溶瘤潜力。总之，基于hAdV6的载体在溶瘤应用中具有很大的前景，并且通过RNAi抑制可以进一步改善其溶瘤效果。

实施例6–作为疾病特异性靶向新资源的腺病毒文库的高通量筛选(HTS)

为了充分探索我们克隆的腺病毒文库作为新型转化方法资源的发展，我们使用HTS方法在一组细胞系上进一步测试了该文库。将来源于不同细胞类型的细胞系用腺病毒文库中报告基因标记的病毒类型感染。将通过荧光素酶表达水平测量的转导效率与常用的5型腺病毒载体(Ad5)进行比较。初步筛选揭示，B类腺病毒在上皮细胞(A549、HCT 116、ARPE-19)和内皮细胞(EA.hy926)中具有高转导效率。而在肝脏来源的细胞系SK-HEP-1和Huh-7中，常用的载体5型(Ad5)的感染效率最高(图20)。本测试还包括骨肉瘤来源的细胞系(MG-63)和来源于三阴性乳腺癌(TNBC)的乳腺癌来源的细胞系Hs 578T。在TNBC 207细胞系中，Ad37被鉴定为最有效的腺病毒类型，而与常用的Ad5相比，B类的其他腺病毒类型(Ad16、50和35)揭示出改善的效率(图20)。在对骨肉瘤来源的MG-63细胞进行HTS后，发现Ad21显示出最高的转导效率(图20)。

因此，Ad21作为一种治疗骨肉瘤的潜在溶瘤剂做了进一步的探寻，因为这种类型的癌症是最常见的原发性骨癌，其主要发生在生命的第二个十年。关于15-19岁的年龄组，骨肉瘤占所有实体癌的>10％。因此，本发明进一步检查了一组具有不同分级相关特征的骨肉瘤细胞系，包括Saos-2和U-2OS细胞。

如图21a所示并且与MG-63细胞中获得的结果一致(图20)，Ad21被鉴定为一种有希望的转导骨肉瘤细胞系的替代腺病毒类型，这一结论还通过标记的腺病毒同时表达的GFP(图21b)和病毒内化测定法测量感染后3hr病毒基因组的摄取(图21c)而证实。所选腺病毒类型的溶瘤效力在所有三种骨肉瘤细胞中都进行了分析，并且发现Ad21在所测试的不同MOI下始终具备导致各细胞系有效溶瘤的作用(图21d)。为了显示不同癌细胞系之间的溶瘤潜力不同，我们还在肺癌来源的A549细胞上测试了标记的腺病毒文库，揭示了不同于骨肉瘤细胞系，Ad35和-69显示出最高的溶瘤效力(图22)。该原理验证实验证明，通过HTS可以鉴定用于疾病特异性靶向的新型病毒候选物，从而可使其在接下来的步骤中作为新型治疗剂进行开发。

使用相同的方法，图23显示了胶质母细胞瘤来源的细胞系RG2[D74]中Ad5、Ad21和Ad37腺病毒的高感染率。这表明来源于这些腺病毒类型的腺病毒载体可有效靶向胶质母细胞瘤细胞。

实施例7-分离用于克隆步骤的腺病毒基因组DNA的方案

1.一定体积的纯化病毒与蛋白酶K-SDS溶液pH 7.5-8(TE缓冲液，0.5％SDS，100～500μg/ml蛋白酶K)在低速摇晃(300rpm)下于56℃培养2小时(或过夜)。

2.向步骤1的样品中添加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)混合物。在此过程中，取液时要进入混合物内部，而不要取表面层。为了提高回收率，使用锁相凝胶管(PhaseLock Gel Heavy 1.5ml，https://uk.vwr.com/store/product/826754/phase-lock-gel)

3.室温下在微量离心机中全速(15,000g)离心5min，然后将水相转移到另一个干净的eppendorf管中。

4.添加1/10体积的3M乙酸钠(pH 5)、2μg糖原和2.5～3倍预冷的乙醇(≥99.8％；在-20℃保存)来沉淀病毒DNA。反转管数次轻柔混合。为提高回收率，可将混合物置于-20℃保持30min。

5.室温下在微量离心机中全速(15,000g)离心10min并通过移液管丢弃上清液。

6.添加600μl 70％乙醇，并反转管数次轻柔混合。室温下以15,000g离心5min后，移除上清液。

7.重复步骤6

8.短暂地风干DNA沉淀，并重悬于20～50μl灭菌的dH2O中，并在室温下低速摇晃(300rpm)15min。

在如实施例所示的本方案中，分离过程切忌涡旋震荡或剧烈吹吸基因组DNA。

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Claims (73)

1.一种腺病毒载体，其包含SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25和27-32中所列的任一序列内含有的腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％同一性的序列，上述序列缺少E1区域。

2.一种腺病毒载体，其包含SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15和17-32中所列的任一序列内含有的腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％同一性的序列，上述序列缺少E1区域和E3区域。

3.一种腺病毒载体，其包含SEQ ID NO：1-3、5-12、14-15和17-32中所列的任一序列内含有的腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％同一性的序列，上述序列缺少E3区域。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的腺病毒载体，其中纤维基因用来自不同腺病毒血清型的选自SEQ ID NO：129-143和145-160，或与其具有至少70％同一性的序列的纤维基因替换。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的腺病毒载体，其为辅助载体、溶瘤载体或疫苗载体。

6.一种腺病毒载体，其在5’末端包含来自SEQ ID NO：1-13、18-32和1411中任一个所列的腺病毒基因组序列的5’反向末端重复序列和5’包装信号序列，或与其具有至少80％同一性的序列，且在3’末端包含来自SEQ ID NO：1-13、18-32和1411中任一个所列的腺病毒基因组序列的3’反向末端重复序列，或与其具有至少80％同一性的序列，其中所述5’和3’反向末端重复序列来自相同的腺病毒基因组序列。

7.根据权利要求6所述的腺病毒载体，进一步包含Cas9基因和至少一种向导RNA。

8.根据权利要求6所述的腺病毒载体，进一步包含睡美人转座酶基因(SEQ ID NO：223)和侧翼为睡美人转座子的反向重复序列(SEQ ID NO：224和225)的转基因，或包含PIGGYBac转座酶基因(SEQ ID NO：226)和侧翼为PIGGYBac转座子的反向重复序列的转基因。

9.一种腺病毒载体，其包含选自SEQ ID NO：130-131、135、138-140、142、145-146、149、151、153、155和158-160的纤维基因，或与其具有至少70％同一性的序列。

10.根据权利要求9所述的腺病毒载体，进一步包含选自SEQ ID NO：161-188的五邻体基因，或与其具有至少70％同一性的序列，和/或选自SEQ ID NO：189-203和205-220的六邻体基因，或与其具有至少70％同一性的序列。

11.根据权利要求1-4、6或9-10中任一项所述的腺病毒载体，其是包含编码并能够表达抗原的基因的腺病毒疫苗载体。

12.根据权利要求11所述的腺病毒疫苗载体，其中所述抗原来自人免疫缺陷病毒(HIV)、埃博拉病毒、寨卡病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌或恶性疟原虫。

13.一种腺病毒辅助载体，其包含SEQ ID NO：1-13和18-32中所列的任一序列内含有的腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％同一性的序列，所述序列缺少E1区域并包含loxP位点(SEQ ID NO：221)或FRT位点(SEQ ID NO：222)，其中所述loxP或FRT位点这样定位：使得第一个位点位于分别对应于来自SEQ ID NO：1-13和18-32的5’ITR序列的序列部分的下游，并且各自的第二个位点位于所述缺失的E1区域的位置的上游和分别对应于来自SEQ IDNO：1-13和18-32的5’ITR和包装序列的序列部分的下游。

14.一种细胞，其编码并能够表达衍生自SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25或27-32的腺病毒E1区域，或与所述E1区域具有至少70％同一性的序列。

15.根据权利要求14所述的细胞系，其进一步编码并能够表达Cre重组酶或Flp重组酶。

16.一种溶瘤腺病毒载体，其包含衍生自SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的E1区域，或与所述E1区域具有至少70％同一性的序列。

17.根据权利要求16所述的溶瘤腺病毒载体，其进一步包含：

a)来源于SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的E2区域，或与所述E2区域具有至少70％同一性的序列；

b)来源于SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的E4区域，或与所述E4区域具有至少70％同一性的序列；

c)来源于SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的L1区域，或与所述L1区域具有至少70％同一性的序列；

d)来源于SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的L2区域，或与所述L2区域具有至少70％同一性的序列；

e)来源于SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的L3区域，或与所述L3区域具有至少70％同一性的序列；

f)来源于SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的L4区域，或与所述L4区域具有至少70％同一性的序列；和

g)来源于SEQ ID NO：1-8、10-12、14-15、18-25或27-32的L5区域，或与所述L5区域具有至少70％同一性的序列。

18.根据权利要求16或17所述的溶瘤腺病毒载体，其中使所述E1和/或E2区域突变或部分缺失以增强复制活性和/或肿瘤特异性。

19.根据权利要求16-18中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其进一步包含：

a)增强复制的基因；

b)免疫调节转基因；

c)自杀基因或增强细胞杀伤的干扰核酸；

d)使细胞对细胞凋亡或用其他药物治疗更敏感的基因；

e)肿瘤或组织选择性启动子；和/或

f)用于调节肿瘤微环境的基因。

20.根据权利要求1-12或16-19中任一项所述的腺病毒载体，其用于治疗的用途。

21.根据权利要求20所述的腺病毒载体，其中所述载体用于：

a)基因治疗，任选地用于冯维勒布兰德病、血友病A、β地中海贫血、肌营养不良或囊性纤维化的治疗；

b)疫苗接种，任选地用于抗HIV、埃博拉、寨卡病毒病、乙型肝炎、丙型肝炎、流感、肺结核或疟疾的治疗；

c)肿瘤治疗，任选地用于癌(例如鳞状细胞癌或鼻咽癌)、结肠直肠癌、肝细胞癌、

肺癌、间皮瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌或神经胶质瘤的治疗；

d)传染性疾病，例如病毒性疾病的治疗。

22.一种方法，其用于生成根据权利要求1-13中任一项所述的腺病毒载体或辅助载体、根据权利要求14或15所述的细胞或根据权利要求16-19中任一项所述的溶瘤腺病毒载体。

23.一种方法，其用于将一个或多个转基因插入根据权利要求1-13中任一项所述的腺病毒载体或辅助载体、或根据权利要求16-19中任一项所述的溶瘤腺病毒载体中。

24.一种腺病毒序列，其包含选自SEQ ID NO：1-3、5-12、14-15和17-32的任一序列内的腺病毒序列，其包含一个或多个报告基因及其表达方式，并替换部分或全部E3区域。

25.根据权利要求24所述的腺病毒序列，其中所述一个或多个报告基因包括编码荧光蛋白的基因和/或荧光素酶基因。

26.一种载体，其包含根据权利要求24或25所述的腺病毒序列。

27.一种筛选抗腺病毒药物的方法，包括：

a)在存在和不存在目标药物的情况下用根据权利要求26所述的载体感染细胞；

b)在存在和不存在所述药物的情况下检测报告基因产物的表达水平；和

c)在存在和不存在所述药物的情况下比较报告基因产物的表达水平。

28.一种克隆腺病毒序列的方法，包括：

a)提供包含腺病毒序列的第一线性核酸分子；

b)提供线性化质粒，其与所述第一核酸分子共享具有至少两个序列同源性区域；和

c)使所述第一核酸分子和所述线性化质粒在5’至3’外切核酸酶和退火蛋白存在的情况下接触，使得所述第一线性核酸和所述线性化质粒重组以形成含有腺病毒序列的环状质粒。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一线性核酸分子以混合物形式存在。

30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述线性化质粒包含与所述第一线性核酸分子中的腺病毒序列的5’ITR具有序列同源性的区域和与所述第一线性核酸分子中的腺病毒序列的3’ITR具有序列同源性的区域。

31.根据权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述腺病毒序列是全长腺病毒基因组序列，所述5’至3’核酸外切酶是全长RecE，或与全长RecE具有至少70％序列同一性的蛋白，并且所述退火蛋白是RecT。

32.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述线性化质粒是中等拷贝质粒，例如，基于p15A起点的载体。

33.一种质粒，其包含全长腺病毒基因组序列。

34.根据权利要求33所述的质粒，其包含SEQ ID NO 1-32或1411中任一个内含有的全长腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％同一性的序列。

35.根据权利要求34所述的质粒，其中所述基因组序列包含在SEQ ID NO：1-3、5-8、10-12、14-15、17-25、27-32和1411中的任一个内，或为与其具有至少50％同一性的序列。

36.根据权利要求33-35中任一项所述的质粒，其是中等拷贝质粒。

37.根据权利要求33-36中任一项所述的质粒，其可通过根据权利要求28-32中任一项所述的方法获得或已通过所述的方法获得。

38.根据权利要求33-37中任一项所述的两种或更多种质粒的文库，其包含两个或更多个全长腺病毒基因组序列，例如其中所述序列选自SEQ ID NO：1-32和1411，或与其具有至少50％同一性的序列。

39.根据权利要求38所述的文库，其包含五个或更多个全长腺病毒基因组序列，例如，其中所述序列选自SEQ ID NO：1-32和1411，或与其具有至少50％同一性的序列。

40.一种生成腺病毒载体或辅助载体的方法，包括：

a)提供第一环状核酸分子，其包含SEQ ID NO：1-32和1411中任一个内含有的腺病毒基因组序列或与其具有至少70％同一性的序列；

b)提供第二线性核酸分子，其与所述第一核酸分子共享至少一个具有序列同源性的区域；和

c)使第一和第二核酸分子在5’至3’外切核酸酶和退火蛋白存在的情况下接触，使得在所述第一核酸分子中引入缺失、突变和/或插入。

41.一种将一个或多个转基因插入腺病毒载体或辅助载体中的方法，包括：

a)提供第一环状核酸分子，其包含SEQ ID NO：1-32和1411中任一个内含有的腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％同一性的序列；

b)提供第二线性核酸分子，其与所述第一核酸分子共享至少两个具有序列同源性的区域；和

c)使第一和第二核酸分子在5’至3’外切核酸酶和退火蛋白存在的情况下接触，使得所述第二核酸分子中同源性区域之间的序列引入到所述第一核酸分子中。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述第二线性核酸包含目标转基因。

43.根据权利要求41或42所述的方法，其中步骤a)中使用的所述第一环状核酸分子已经被修饰以缺失所述腺病毒基因序列中的一个或多个区域，例如E3区域，例如使用根据权利要求40所述的方法，并且其中将所述转基因插入缺失的E3区域中。

44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中至少一个转基因是报告基因。

45.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中所述第一环状核酸分子是通过根据权利要求28-32中任一项所述的方法获得或可通过其获得的，和/或是根据权利要求33-37中任一项所述的质粒。

46.一种包含腺病毒基因组序列的质粒，所述腺病毒基因组序列已经被修饰以缺失腺病毒基因序列的一个或多个区域和/或其已经被修饰以包含一个或多个转基因。

47.根据权利要求46所述的质粒，其通过根据权利要求40-45中任一项所述的方法获得或可通过其获得。

48.根据权利要求33-37和46-47中任一项所述的质粒，其包含紧邻腺病毒序列上游和下游的限制性位点。

49.一种腺病毒载体，其通过限制酶消化从根据权利要求48所述的质粒释放腺病毒序列获得或可通过其获得。

50.根据权利要求49所述的腺病毒载体，其是根据权利要求1-13、20-21和24-26中任一项所述的载体。

51.一种腺病毒载体，其包含：

a)SEQ ID NO：1411的腺病毒基因组，或与其具有至少50％同一性的序列；

b)SEQ ID NO：1443的纤维基因，或与其具有至少70％同一性的序列；

c)SEQ ID NO：1426的五邻体基因，或与其具有至少70％同一性的序列；和/或

d)SEQ ID NO：1431的六邻体基因，或与其具有至少70％同一性的序列；

任选地，其中所述腺病毒载体缺少E3区域。

52.一种腺病毒载体，其包含：

a)SEQ ID NO：1413、1414和1415中任一个所述的腺病毒基因组，或与其具有至少50％同一性的序列；

b)SEQ ID NO：1413、1414和1415中任一个内发现的纤维基因，或与其具有至少70％同一性的序列；

c)SEQ ID NO：1413、1414和1415中任一个内发现的五邻体基因，或与其具有至少70％同一性的序列；和/或

d)SEQ ID NO：1413、1414和1415中任一个内发现的六邻体基因，或与其具有至少70％同一性的序列；

任选地，其中所述腺病毒载体缺少E3区域。

53.根据权利要求1-13、20-21、24-26和49-52中任一项所述的两种或更多种腺病毒载体的文库。

54.根据权利要求53所述的文库，其包含选自SEQ ID NO：1-32和1411的两种或更多种腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％同一性的序列，任选地其中所述腺病毒序列已经被修饰为包括报告基因例如荧光蛋白或荧光素酶。

55.根据权利要求54所述的文库，其包含选自SEQ ID NO：1-32和1411的五种或更多种腺病毒基因组序列，或与其具有至少50％同一性的序列。

56.根据权利要求54或55所述的文库，其中已缺失所述E3区域，并且所述报告基因位于所述缺失的E3区域。

57.一种筛选方法，其包括使细胞与权利要求53-56中任一项所述的文库接触。

58.根据权利要求57所述的筛选方法，其是用于筛选抗腺病毒药物的方法，包括：

a)在存在和不存在目标药物的情况下用根据权利要求1-13、20-21、24-26和49-52中任一项所述的载体感染细胞；

b)在存在和不存在所述药物的情况下检测报告基因产物的表达水平；

c)在存在和不存在所述药物的情况下比较报告基因产物的表达水平；和

d)对至少另一个成员或所述文库的每个成员重复步骤a)至c)。

59.根据权利要求57所述的筛选方法，其是用于筛选细胞向性的方法，并且其包括：

a)使细胞与来自根据权利要求53-56中任一项所述的文库的载体接触；

b)确定所述载体是否感染所述细胞；和

c)对至少另一个成员或所述文库的每个成员重复步骤a)和b)；和

d)任选地使用不同的细胞类型重复步骤a)至c)。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述载体包含报告基因，所述报告基因是荧光蛋白或荧光素酶，并且步骤b)包括确定所述细胞是否由于荧光蛋白或荧光素酶的表达而发荧光或发光。

61.根据权利要求57所述的筛选方法，其是用于筛选细胞向性的方法，并且其包括：

a)使细胞与来自根据权利要求51-54中任一项所述的文库的载体接触；

b)确定所述载体是否溶解所述细胞；和

c)对至少另一个成员或所述文库的每个成员重复步骤a)和b)；和

d)任选地使用不同的细胞类型重复步骤a)至c)。

62.一种治疗骨肉瘤或胶质母细胞瘤的方法，包括施用来源于腺病毒B21的溶瘤腺病毒载体。

63.一种治疗肺癌的方法，包括施用来源于腺病毒B35或D69的溶瘤腺病毒载体。

64.一种靶向人呼吸道上皮的方法，包括施用来源于腺病毒B21、D37或D69的腺病毒载体。

65.一种转导细胞的方法，包括使所述细胞与根据前述权利要求中任一项所述的质粒或腺病毒载体接触。

66.一种质粒，其包含复制起点、选择标记和与腺病毒基因组序列的ITR区域同源的两个区域，其中一个区域与5’ITR具有同源性，第二个区域与3’ITR具有同源性。

67.根据权利要求66所述的质粒，其是中等拷贝质粒。

68.根据权利要求59-61中任一项所述的筛选细胞向性的方法在用于鉴定疾病特异性靶向的病毒候选物的用途。

69.根据权利要求1-13、20-21、24-26或49-52中任一项所述的腺病毒载体，其用于靶向细胞，其中所述腺病毒载体已使用根据权利要求59-61或68中任一项所述的筛选细胞向性的方法鉴定为靶向细胞或可使用其鉴定为靶向细胞。

70.一种通过使细胞与根据权利要求1-13、20-21、24-26、49-52或69中任一项的腺病毒载体接触来靶向细胞的方法，其中所述细胞类型已使用如权利要求59-61或68中任一项所述的筛选细胞向性的方法鉴定为被腺病毒载体感染的细胞类型或可使用所述方法鉴定为被腺病毒载体感染的细胞类型。

71.一种治疗影响一种细胞类型的疾病的方法，包括施用根据权利要求1-13、20-21、24-26、49-52或69中任一项所述的腺病毒载体，其已通过根据权利要求59-61或68中任一项所述的筛选细胞向性的方法鉴定为影响该细胞类型或可通过其鉴定为影响该细胞类型，其中所述载体已经被修饰以并入一个或多个可用于治疗所述疾病的转基因和/或其中所述载体对于所述细胞类型是溶瘤的。

72.一种用于确定样品中是否存在腺病毒的方法，包括在5’至3’外切核酸酶和退火蛋白存在的情况下使所述样品或来源于所述样品的基因组DNA与线性化质粒接触，所述线性化质粒包含至少两个与腺病毒序列具有序列同源性的区域，使得如果所述样品中存在腺病毒基因组序列，则其将与所述线性质粒重组以形成含有腺病毒序列的环状质粒，并进一步包括确定是否已形成含有腺病毒序列的环状质粒的步骤。

73.一种诊断由腺病毒引起的疾病的方法，其中所述方法包括在5’至3’外切核酸酶和退火蛋白存在的情况下使临床样品或来源于临床样品的基因组DNA与线性化质粒接触，所述线性化质粒包含至少两个与腺病毒序列具有序列同源性的区域，使得如果所述临床样品中存在腺病毒基因组序列，则其将与所述线性质粒重组以形成含有腺病毒序列的环状质粒，并进一步包括确定是否已形成含有腺病毒序列的环状质粒的步骤。